JPS60500358A - マウスの細胞内で組み換えｄｎａによって生産されたヒト成長ホルモン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 マウスの細胞内で組み換えＤＮＡによって産生されたヒト成長ホルモン １１蕊Ｉ ゴーデル他（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｔ、）の米国特許第４，３４２゜８３２ 号では、バクテリアにおいてヒト成長ホルモンをつくり出すために合成遺伝子を 使用する。

サーバー他（Ｓａｒｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）が表した、１９８１年６月発行「分 子細胞生物学１」（“ＭＯ１ｅｃｔ＋Ｉａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉ ｏｌ。

ａｙ”）第６＠、第４８６−４９６ページ掲載の「ウシ乳頭腫ウィルスＤＮＡ　 ：新しい成熟核クローニングベクター」　（”Ｂｏｖｉｎｅ　Ｐａｐｉｌｌｏｍ ｄ　ｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ：Ａ　ｎｏｖｅｌ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒ”）には、ＢＰＶクローニングベクターについて記載されて おり、ベクターはプレプロインシュリンに付着されている。　プリンスター他（ ＢｒｉｎＳｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）が表した１９８２年３月発行「ネイチ？　− Ｊ　（”Ｎａｔｕｒｅ”　）第２９６号、第３９−４２ページ掲載の「マウス卵 に注入された金属チオネイン−サイミゾイン・キナーゼ融合プラズマの調整（” Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ　Ｔｈｙｍｉｄ ｉｎｅ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｆｕｓｉｏｎ　Ｐｌａｓｍａ　Ｉｎｊｅｃｔｅｄ　１ｎ ｔｏ　Ｈｏｕｓｅ　Ｅ（ＩＱｓ”）では、ヘルペス・ウィルス・サイミゾイン・ キナーゼに融合された金属チオネイン−１遺伝子プロモータ達が、キナーゼ遺伝 子の発現を行なうためニ使用される。マウス卵は同プラスミツトに顕微注入され ている。

ヘイマー他（ｌａｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）が表した、１９８２年ニューヨーク州 のコールド・スプリング・ハーバ−研究所（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）発行「成熟ｔｅ、ウイ）し；Ｌへ’）９−」（“ ｔｕｈａｒｙｏｔｔｃ　Ｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒｓ″第７−１２ページ（アブ ストラクト）に掲載の「動物ウイルネベクターにおけるマウス金属チオネイン− ■遺伝子の導入”　（”　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ１４ｏｕｓｅ　Ｈｅｔａｌ ｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ−Ｉ　Ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｖｉｒｕｓ　Ｖｅ ｃｔｏｒＳ　″）。

ｔ＜７５’Ｆストバーｖ　−（Ｐａｖｌａｋｉｓ　ａｎ、ｄ　ｌａｍｅｒ）が表 した、ＱＣ，Ｎａｔｌ、ＡＣａｄ　、　ＳＣｉ、”　）　（７）論評に掲載サレ ｌ＝　ｒウシ乳１１ｍウィルスにおける金属チオネイン−成長ホルモン雑種遺伝 子ノｇｍ整」　（“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｈｅｔａｌｌｏｔｈｉｏ ｎｅｉｎ−Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｓｏｎｅ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｂ ｏｖｉｎｅ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａ　Ｖｉｒｕｓ”　）　。

メイヨ他（Ｈａｙｏ　ｅｔ　ａｌ、）による、１９８２年５月発行［セコ９８２ 年発行「細胞生化学ジャーナル」　（“Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣｅｌｌｕｌａｒ 　Ｂｉｏｃｈｅｓｌｓｔｒｙ”）補遺第６号３４６ページ記載のｒｉｌｃＬＡシ ンボジア抄録Ｊ　（ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉａ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ”）１１ 立１１ ｅ　）　＊　ｎｔ　’ｆ　＞、　成長ホルモン（以下ｈＧＨとも言短小発育症が 生ずる。この短小発育症が重い症状のときは、ヒトの死体から分離されたヒト成 長ホルモンで治療される。

この場合、採取される分量はわずかで、分離精製が複雑かつ高価である。ｈＧＨ のアミノ酸鎖がよく知られているが、合成化学法が実用的でない。

組み換え合成遺伝子を使用してバクテリアにｈＧＨを産生する方法が、ゴーデル 他（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、）の米国特許第４３４２．８３２号に記載さ れている。この方法の欠点は、分離と精製が困難であることと、得られたＩＩＩ 物に、正常成長ホルモンには見られない、人体に対して免疫原となり得るアミノ ・ターミナル・フオルミルーメチニオン残留物が含まれていることである。

金属メチオニン。　金属メチオニンはシスチンに富む小重金属結合たん白質であ る。また、金属メチオニンは今まで検査されたすべての成熟核種ならびに各種の 器官および細胞類型に存在する。この金属メチオニンは細胞を重金属に被毒され ないように保護するとともに、亜鉛および銅による動的平衡作用も行なう。

最近、りＯン化された金属チオネイン−１遺伝子は、顕微注入、共変換あるいは 組み換えサル・ビールス４０　（ＳＶ４０）との転移によって細胞内に導入され た場合、カドミウムに誓うてその誘導性が保たれることが分った。この発明では 、まず、金属チオネイン（ＭＴ）−ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の雑種遺伝子を 形成し、次に、この雑種遺伝子をウシ乳頭腫は、デキサメタソンではなく、カド ゛ミウムによって調整される。また一方で、同細胞内における染色体遺伝子は両 者によって誘導される。ｈＧＨポリペプチド合成物は変換された細胞内でカドミ ウムにより誘導可能であり、高水準のたん白質が集められる。

シ　頭　イルスベクター　ウシ乳頭腫ウィルスＤＮＡをベクターとして利用する ことによって、各種の遺伝子を組織培養しだ哺乳類の細胞に導入している（サー バー他、１９８１年）。

この発明においては、ウシ乳頭腫ウィルス（以下ＢＰＶとモ言つ）をベクターと して利用して、マウスの金属チオネイン（以下ＭＴとも言う）遺伝子を培養した マウス細胞内に移し換えている。この組み換えＢＰＶ−ＭＴは細胞にカドミウム （以下ｃｄとも言う）に対する抵抗性を与える大量の金属チオネイン合成物を支 配するのでマーカーとしての役割を果た１゜サラに、ｃｄ抵抗剤は、他の非選択 性遺伝子を哺乳類の細胞に共変換するに際して優性選択として利用される。ヒト 成長ホルモンのミニ遺伝子がＢＰＶ−ＭＴベクター内に挿入されて選択されたの ち、Ｃｄ抵抗剤クローンは媒体中に大量のヒト成長ホルモンを産生分泌する。こ の単純な優性選択によりＢＰＶ７Ａ択性遺伝子を各種の細胞類型に導入すること ガＶ膨″ｒ−あろ− この発明では、ウシ乳頭腫ウィルスの変換域のうち６９％を含むこのベクターと 、プラスミドｐＭＬ２．．（サーバー他）Ｓａｒｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　、　 １’９８２年輪評；ラスキーおよびボウチャン（Ｒｕｓｋｙ　、ａｎｄ　’Ｂｏ ｔｃｈａｎ）　、　１９８１年）においてクローン化されたウシ乳ａＩｌｌウィ ルス分子の全量を含むベクターを利用して、ヒト成長ホルモンを培養したマウス の細胞内に導入する。この発明は大量のｈＧＨを産生分泌する細胞ラインを単離 する。このため、（１）使用するマウス金属チオネイン−■プロモータの強度と Ｍ導性が増すとともに、山マウス細胞内に導入された組み換えＤＮＡ分子の安定 度と増殖数が増すことになる。

ヒト成長ホルモンを細胞内に導入するための方法として初期の段階では（主とし てサーバー他、１９８１年に記載がある）、ヒト成長ホルモン遺伝子を発現でき る細胞が、変更された表現型を基準として選択された。この細胞が増殖されてｈ ＧＨを発現分泌する能力が組織培養媒体をラジオイムノアッセイによってテスト された。

この発明にする方法と得られた生成物の新規な面は、（１）変換された細胞内の 組織培養媒体において大量のｈＧＨが集められることである。すなわち、たん白 質の量は従来行なわれた実験（サーバー他、１９８１年）と比べて少なくとも１ ００倍に遅する。理由としては２つあげられる。（ａ）この発明で用いられるマ ウスＭＴ−１プロモータは、ＢＰＶベクター中にあっては、特にカドミウム等の 重金属によって誘導されると、強力なプロモータとなることが分った。（ｂ）使 用されたＭＴ−ｈＧＨＩ掻遺伝子は、ベクターを安定させる鎖を含むことが分っ た。従来用いられたベクターはこの鎖を含んんでおらず不安定であった。この方 法による雑種遺伝子の圧出量は、このプロモータに関する従来の研究（プリンス ター他、１９８２年；メイヨ他、１９８２年）から予測されえた以上に大きいも のである。（２）　ＩＩＪ胞り０−ンの種類によっては培養液で増殖させたので 、大量の細胞を増殖させることが容易に匂った。培養液に導入されることによっ て、ｈＧＨを産止するクローンの能力は最初低下した。したがって、液体培地お よび単層培地の両方で成長し、ｈＧＨを直レベルで産生ずることのできるドータ 細胞ラインが選択された。これが、組み換えＢＰＶで変換された細胞を培養液で 成長させて、良好な圧出を維持することができた最初の例である。（３）この発 明による方法で産生されたｈＧＨは、補乳類のホスト細胞によって処理されて分 泌されている。したがって、アミノ端に異質のアミノ酸が含まれるようなことは ない。これは、アミン・ターミナル・フォルミルメチオニンを含むバクテリアの ホスト細胞（米国特許第４．３４２．８３２Ｎ＞によって産生されたｈＧＨと比 べて対照的である。

使用された第２の方法では、マウス金属チオネイン遺伝子全体がＢＰＶベクター に対して結さつされた。ＢＰＶ上の金属メチオニン遺伝子は、細胞に有害濃度の カドミウムに対すしたがって、組み換えＤＮＡ分子を維持し圧出する細胞の単離 は簡単になっている。すなわち、組み換え遺伝子を細胞内に導入したのち、有害 濃度のｃｄｃＩ２が組織培Ｉｍ体中に入れられた。組み換えＤＮ−Ａ分子を含ま ない細胞はＣｄによって殺されて、一方でＢＰＶ上に新しく導入された金属メチ オニンを圧出する細胞は正常に成長する。

このＢＰＶ−ＭＴベクターは、他の非選択性遺伝子をマウスの細胞内に導入する のに利用される。例えば、介在鎖を含まないヒト成長ホルモンの“ミニ遺伝子” が前述のベクターに挿入された。得られた組み換え分子はマウス細胞内に導入さ れて、　Ｃｄに対して抵抗性を有する細胞ラインが単離されて増殖された。これ らの細胞ラインで検査されたもののうち数ラインは、挿入された遺伝子によって コード化された高レベルのｈＧＨを産生分泌することが分った。この方法の新規 なところは、ＭＴ遺伝子が組み換えＢＰＶに対するマーカーとして使われた最初 である点である。このベクターは、他の非選択性遺伝子を培養細胞内に導入する ために使用できる。この種の非選択性遺伝子の例としては、インシュリン、カル シトニン等のホルモン用遺伝子およびハバチチスＢ・表面アンチゲン等の、ワク チンとして使用できるウィルス遺伝子生成物用の遺伝子があげられる。

１１亘旦」 第１−Ａ図 マウスの金属チオネイン遺伝子、ヒト成長ホルモンのミニ遺伝子およ°びＩｖｌ Ｔ−ｈＧＨ９１に種遺伝子の構造を示す。なお、各遺伝子の下方には、予想され るメツセンジャーＲＮＡ分子が示されている。

第１−８図 組み換えウィルスＢＰＶＭＧ６およびＢＰＶＭＧ７の構造を示す。これらのウィ ノ１スはこの明細書に示すような方法で形成され、マウスの０１２７細胞に導入 される。

第１−０図 異なる方向に非損傷マウス（ｌｉｌｌＴ−１遺伝子を含む組み換えプラスミドＢ ＰＶを示す。これらの分子は、ＭＴ−１ブＯモータのコントロールの下で他の構 造鎖を形成したり、変換細胞にカドミウム耐性を付与するために使用することが できる。

図中斜線部はＢＰＶ鎖を示し、実線部および枠部はＭＴ−１鎖を示し、破線部は ｐＢ　Ｒ３２２鎖を示す。なお、記号Ｅ、Ｂ。

Ｈ，ＢＱ、に、ＳおよびＡは、それぞれ制限酵素ＥＣ０ＲＩ。

ＢａｍＨＩ、Ｈｉ　ｎｄｌｌｒ、Ｂａ　Ｉ　Ｉｆ、ＫｐｎＩ、５ａｃＩおよびＡ Ｖａ■を示している。

第２図 ＭＴ−ｈＧＨ雑種遺伝子の構造およびそのＢＰＶベクターへの導入について示す 。すべてのマウスＭＴ−１遺伝子を含む４ＫｂＥｃｏＲＩブラグメントおよびｈ ＧＨミニ道伝子を含む２．ＩＫ　ｂ　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩブラグメントがｐＢＲ３ ２２ｓＶ４０ベクター内に導入される。ｈＧＨミニ遺伝子は除去されたｈＧ）− １ｎ伝子の４つの介在列のうち３つを有し、サルの腎細胞伝子のキャップサイト からｐＢ　Ｒ！）２２の１３ａｍＨＩサイトに向って延びる。この２）（ｂ３ａ ｍＨＩブラグメントはｐＳｖＧ　Ｈ３Ｇ　２　（Ｌ）から単離され、ＭＴ−１遺 伝子の第１エキソン内のＢＱＩＩＩサイトへ導入される。Ｍ−Ｔ−１３ｉＩ伝子 として同一の転写方位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉ ｏｎ）のｈＧＨプた。このプラスミドをＨｉｎｄｌで切断すると、２ｋｂのＭＴ −Ｉ　５’　フランキング列（ｆｌａｎｋｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）およびｈ ＧＨミニ遺伝子のキャップサイトに融合されたＭＴ遺伝子の第１エキソンの一部 を含むプラグメントを生じる。このプラグメントは）ｌｉｎｄｌ［でリニアライ ズしたプラスミドｐＢＰＶ６９ＴＤ内に導入される。このベクターはｌ）　Ｂ　 Ｒ３２２にクローニングされたウシ乳頭腫ウィルス−１の変換９ａｍＨＩ−Ｈ， １ｎｄＩ［［ブラグメントを６９％含む。なお、次の操作を容易に行なうために 、少量のｐＢ　Ｒ３２２のＨｉ　ｎｄｌｌ−ＢａｍＨｌブラグメントはこのベク ター内で培地される。大ＩＩＩ内でクローニングした後、方向の異なる４つ組み 換えプラスミドが単離された。そのうち、ｐＢＰＶＭＧ６とｐＢＰＶＭＧ７にお いては、ＢａｍＨｌによって完全に切断することによって、Ｄ　Ｂ　Ｒ３２２列 が創出された。これによって、２つの分子ＢＰＶＭＧ６とＢＰＶＭＧ７を生じる 。そして、この場合雑種遺伝子は二つの可能な方向でＢＰＶベクターに組み込ま れている。

第３図 ＳＶ４０−ＭＴ−Ｉプラスミドを示す。マウスＭＴ−Ｉ遺伝子を含む４０００ｂ 　ｐ　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩブラグメントは完全なＳＶ４０ゲノムを含む″海性隙性 ”ｐＢ　Ｒ３２２ベクター内に導入される０図中点描枠部はＭＴ−１構成列を示 し、斜線枠部はＭＴ−１介在（Ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｏ）鎖を示し、無地枠部は ＭＴ−１フランキング列を示し、太線はＳＶ４０列を示し、細線はｐＢＲ３２２ 鎖を示す。なお、記号Ｑｒ　ｉ、Ｅ、Ｌ、ＰおよびＢは、それぞれ５Ｖ４０ＤＮ Ａ複製のオリジ＞　（ｏｒｉｏｉｎ）　、ＳＶ４０の初期転写（ｅａｒｌｙ　ｔ ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）の方向、ＳＶ４０の末期転写、（１ａｔｅ　ｔｒａ ｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、ＰｓｔＩおよびＢａｍＨｌを示す。

第４図 組み換えウシ乳頭腫金属チオネイン−ヒト成長ホルモンを示す。この組み換え分 子はｈＧＨのミニ遺伝子をマウス細胞内に導入するために使用される。これらの 組み換え分子は、ベクタ”ｌＢＰＶＭＴ５から誘導される完全なＭＴ３ｍ伝子と 共にＢＰＶ（斜線部）の変換ＤＮＡプラグメントを６９％含む、介在列をもたな いｈＧＨのミニ遺伝子は、ＤＮＡ複製の起ＩＩ（Ｏｒｉ）を含む５Ｖ４０ＤＮＡ ブラグメントと共にこのベクター内に組み込まれた。このような組み換え分子は 、マウス細胞内およびサルのｃｏｓ−１細胞内のいずれにおいても培養できる。

なお、図中Ｂ、Ｅ、Ｈ，にはそれぞれ［３ａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉ　ｎｄｌ およびＫｐｎＩを示す。

第５図 ウシ乳頭−ウィルスと金属チオネインとの輯み換え分子を示す。この組み換え分 子は他の非選択性遺伝子をマウス細胞内へ導入するためのベクターとして使用さ れる。これらはＢａｍＨＩサイトで切断された全ＢＰＶ分子（斜線部）、マウス の金属チオネインエ遺伝子、およびｐＢ　Ｒ３２２複製オリジンおよびベニシリ ナーゼ遺伝子（波線）を含むｐＭＬ２ＤＮＡフラクションを含む。これらの分子 は、大腸菌（アンピシリン耐性のあるもの）内でも増殖可能であるし、動物の細 胞（カドミウム等の重金属に対する耐性のあるもの）内で増殖可能である。ベク ターｐＢＭＴＨ１およびｐＢＭＴＨｌｌは、いずれもＢＰＶＤＮＡのＨｉｎｄｌ ｌｌサイトに導入されたＭＴ遺伝子の１つもしくは２つのコピーを含む。したが って、それらは不連続ＢＰＶＤＮＡ分子を含むことになる。ベクター１）ＢＭＴ Ｋ６１は制限酵素ＢａｍＨＬ　Ｓａ　Ｉ　ＩおよびＳａｃＩに対して適した制限 サイトをもつので、他の遺伝子を導入できる。

第６図 ＢＰＶＭＧ変換細胞ラインによるｈＧＨの生成状態を示す。

細胞の培養には２４穴組織培養プレートを使用した。また、この細胞は塩化カド ミウム（ＣｄＣ１２）またはデキサメタソンによって１６時ｍ＋＊導され、培地 内のｈＧＨはラジオイムノアッセイによって定量された。図中（−）、（Ｃ）お よび（Ｄ）はそれぞれ非誘導細胞、１ｕＭのＣｄＣｌ２によって誘導された細胞 、および５０ｎＭのデキサメタソンによって誘導された細胞を示す。分析の結果 、コントロールライン（Ｃ１２７、ＩＤ１３、ＮＳ８　）の値は１　ｎｏ／　ｍ ｌより大きがった。

第７図 ＢＰＶ組み換え分子および生成したｂＧＨを含む１２のクローンからの緻細胞Ｄ ＮＡのゲルトランスファー雑種形成を示す。緻細１１ＤＮＡはＡ　（ＢａｍＨＩ ）　、Ｂ　（ＳａｃＩ）もしくはＣ（ＫｐｎＩ）で切断され、１％の寒天ゲル内 で電気泳動され、ニトロセルローズフィルタに吸収された。そして、雑種形成操 作によって切断変換ＢＰＶプローブが形成された。

レーンＢは同一の酵素で切断されたｐＢＰＶＭＧ６ＤＮＡである。

第８図 変換細胞からの低分子量Ｈｉｒｔ上ｆｆ１ＤＮＡのゲルトランスファー雑種形成 を示す。ライン１はワイルド型（ｗｉ　Ｉｄ−ｔｙｐｅ）Ｂ　Ｐ　Ｖを含むｌ［ ）１３細胞のコントロールラインである。ライン２はＢＰＶＭＧ−６および生成 したｈＧＨを含む細胞のクローン（０８ＭＧ６−９）である。ＤＮＡは未切断（ −）または５ａｃＩもしくはＫｐｈＩで切断されている。スーパーコイル分子（ ｌ）、切断された円形分子（ＩＩ）および単位長線形分子（Ｉ）の近似位置が示 されている。ここで、注意すべきはＢＰＶＤＮＡはＢＰｖＭＧ６ＤＮＡより小さ いことである。ゲル上のＸで示される高いバンドはフリーマルチマー（ｆｒｅｅ 　ｍｕｌｔｉｍｅｒ）もしくは鎖状分子である。

第９図 マウスの０１２７細胞に対するＣｄＣｌ２の毒性を示す、１１胞は２４穴組織培 養プレートで培養され、各種濃度のＣｄＣｌ２で処理された。Ｃｄ１１度が１５ ｕＭ以上では生存する細胞はなかった。

第１０図 マウス細胞Ｃ１２７にＢＰＶ−ＭＴ−ｂＧＨ組み換え分子の導入がそれらにＣｄ 耐性を与えることを示す。マウスのＣ１２７細胞はＢＰＶ−ＭＴ−ｈＧＨをｌ入 ＬＰ：後、２０ｕＭ（７）ＣｄＣＩ２で処理された。Ａ、ＢおよびＣはそれぞれ 未処理のＣ１２７１１胞、ＣｄＣｌ２　（２ｏ　ｕ　Ｍ　）で処理したＣ１２１ 細胞およびＢＰＶ−ＭＴ−ｈＧＨを導入した後ＣｄＣｌ□（２０ｕ　Ｍ　）で処 理したＣ１２７細胞を示す。

第１１図 個々のクローンのＣｄ耐性を示す。２０ｕＭのＣｄＣｌ２内で生存している個々 の部分（ｆｏｃｉ）を採取して培養した。そして、２４穴組織培養プレートに等 数の細胞を採取し、２０゜４０．８０およヒ１１００ｕノＣｄＣｌ２テ処理した 。８０ｕＭのＣｄＣｌ２内でも生存細胞が見られた。クローン０２〜Ｇ５はＢＰ Ｖ−ＭＴ−ＧＨ１１１１分子を含み、りｏ−ンＭ３、Ｍ２ＳはＢＰＶ−ＭＴ組み 換え分子を含む。そして、クローンＧ４、Ｇ５は多量のｈＧＨを生成する。

第１２図 ＭＴタンパクおよびｈＧＨの誘導について示す。誘導もしくは非誘導細胞は、７ 時間の銹ｍ時ｌ［Ｉ軽過後、３５３−　ＣＶ　Ｓで１時ｌｉｌＷＡｇＩされた。

細胞質および媒介タンパクは２０％アクリルアミドグルにおける電気泳動および オートラジオグラフィーで分析した。第１２−Ａ図はコントロールラインＩＤ１ ３（ＢＰｖ−■ウィルス使用）　、！：クロー’ン７−４　（ＢＰＶＭ０７使用 ）とから得られた媒介タンパクの比較を示す。真正な脳下垂体ｈＧＨと共に移動 するバンドはクローン７−４にのみ見られる。第１２−Ｂ図は、それぞれＩＬｊ ＭのｃｄｃＩ２（Ｃ）　、５０ｕＭのデキサメタソン（Ｄ）で、または誘導剤な しで７時間処理した細胞からの総媒介タンパクを示す。第１２−Ｃ図は、Ｂで分 析されたものと同一の細胞からの緻細胞質タン゛バクを示す。デキサメタソンで 処理すると総タンパクの合成が抑制されるが、金属チオネインの生成が誘起され る。

ｔｍ亘亙且Ｉ ＭＴ−金属チオネイン Ｅ−制限酵素ＥＣ０ＲＩ Ｂ−制限酵素３ａｍＨＩ Ｈ−制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ［ ５ｏ−ｓＱ　ｌ　［ Ｋ−制限酵素ＫｐｎＩ Ｓ−８ａｃ”（ −ＡＶａｍ ｈＧＨ−ヒト成長ホルモン ＢＰＶ−ウシ乳頭腫ウィルス ＢＰＶ６９−ＢａｍＨｔサイトおよびＨｉｎｄｌ［［サイトで切り裂かれたりブ ゲ°ツムＢＰＶ ミニ遺伝子−ｈＧＨ遺伝子よりサイズが小さく制限サイトが数個所ない遺伝子 非選択遺伝子−例として、インシュリン、カルシトニン等のホルモンを含む遺伝 子もしくはバパチチスＢ°・表面アンチグン等のウィルス遺伝子生成物を含む遺 伝子 １１監立五旦１ 大腸菌菌種ＨＢ１０１（ボイヤおよびロイランドーデュソワ（Ｂｏｙｅｒ　ａｎ ｄ　Ｒｏｙｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ）、「分子生化学ジャーナル」（Ｊ、Ｈｏ １．Ｂｉｏｌ、　）　、４１　、４５９．１９６９）　、プラスミドＥ）ＢＰＶ ＭＧ７１１人、ＡＴＣＣ受理番受理番号第３９鍔４２ ＴＣＣ受理番号第３９２３９号 大１１１１１１ＨＢ１０１　、７５スミドｐＢＰＶＭＴＫ６導入、ＡＴＣＣ受理 番号第３９２４０＠ 大腸菌菌種ＨＢ１０１、プラスミドｐＢＰＶＭＴＨ１１１人、ＡＴＣＣ受理番号 第３９２４１号 細胞ラインＣＢＭＧ６−９、ＡＴＣＣ受理番号第ＣＲＬ８１８９号 細胞ラインＣＢＭＧ７−４Ｌ２、ＡＴＣＣ受理番号第ＣＲ１８１８７＠ 細胞ラインＣＢＭ５Ｇ５、ＡＴＣＣ受理番号第ＣＲＬ８１８８号 よびＩ）ＢＰＶＭＧ７の構成は三段階からなっている（第３図参照）。まず、ｈ ＧＨ“ミニ遺伝子”が構成される。このためエクソン２　（ｅｘｏｎ２　）のＰ ｖｕＩ［サイトとエクソン５（ｅｘｏｎ５）のＢＱＩＩ［サイトの間のゲノム鎖 がｈＧＨ　ｃＤＮＡクローンの対応するプラグメントに置き換えられる（１９７ ９年マーシャル他（Ｍａｒｔｉａｌ　ｅｔ　ａｌ．）。このようにして得られつ かの制限サイトが失われているのでさらに操作が可能となっている。このような “ミニ遺伝子”は不変遺伝子に関して説明したように、Ｓ■４０ベクトル中でサ ルの細胞で発現テストされた（１９８１年バブラキス（Ｐａｖｌａｋｉｓ　ｅｔ ’ａ１．　）　）が、多量のｈＧＨの合成をもたらすことが見い出された。

゛ミニ遺伝子”は組み換えプラスミドｐＳ　Ｖ　Ｇ　Ｈ　３　Ｃ　２　（Ｌ）（ 第２図参照）を備えた大ｌ１ｌ）（８１０１で増殖された。このようなミニ遺伝 子は純化の後、ＢａｍＨＩによりプラスミドから切除され、Ｂａｍｔ−＋ｔは遺 伝子の下側のプラス−ミドＤＮＡ内にエクソン１　（ｅｘｏｎｌ　）の末端５′ で割り込む。次段階として、このようなブラグメントはｐＪＹＭＭＴ（Ｅ）中の マウスＭＴ−　Ｉ遺伝子の非翻訳域５′のＢＣＩＩＩＩサイトにサブクローン化 される（１９８２年へイマ−（　Ｈａｉｅｒ）およびウオ１，−υ１１」７目＋ ｈ＾い　ｌ゛館９Ｍ会詔）−７のよろか段階によって、１．９ｋ　ｂ　ｐのＭＴ −　Ｉ　５’　フランキング（　ｆｌａｎｋｉｎｇ）鎖、６　８　ｂｐのＭＴ− 　１　５’の非翻゛訳鎖７０ｂｐのｈＧＨ遺伝子第１エクソン（ｅｘｏｎ）　、 ２　５　０　ｂｐのｈＧＨイントロン（　１ｒｌｔｒＯｎ）、残りの７５０ｂｐ のｈＧＨｌ造金具および４５０ｂｐのｈＧＨ３’　フランキング鎖からなる雑種 遺伝子が生成される。

第三の段階として、このような雑種遺伝子は＠　ｉ　ｎｄｌｌの取り込みにより 回収され、）−１ｉｎｄｌｌ［を部分的に取り込んだｐＢＰＶ６９ＴＤに挿入さ れた。プラスミドｐＢＰＶ６９ＴＤはｐＢ　Ｒ　３２２でクローン化されたＢＰ Ｖ−Ｉブラグメントを変形した６９％のＢａｍＨ　Ｉ−Ｈ　ｉ　ｎｄｌから成り ている（１９８０年ロウイ他（Ｌｏｗｙ　ｅｔ　ａｌ．））　、第２図に示した ２つの興なる配向はｐＢＰＶＭＧ６がｐＢＰＶＭＧ７と命名され、大腸菌Ｈ　８ 　１０１で増殖された。

ＢＰＶＭＧ６およびＢＰＶＭＧ７のＡ ＢＰＶＭＧ６およびＢＰＶＭＧ７は［３ｏｍＨＩを用いてｐＢ　Ｒ　３２２を割 り込ませかつＤＮＡリガーゼにより再環化することにより、それぞれｐＢＶＭＧ ６およびｐＢＶＭＧ７から構成された（第２図参照）。

ｐＢＰＶＭＴｌおよび　ＢＰＶＭＴ５のＡ組み換え体ｐＢＰＶＭＴ１およびｐＢ ＰＶＭＴ５を合成するため、プラスミドｐＪＹＭＭＴ（Ｅ）（第３図参照）がＨ ｉｎｄｌおよびマウスＭＴ−１遺伝子を含む３．３ｋｂプラグメントにより取り 込まれ、５′のフランキング鎖がＨ　ｉ　ｎｄｌｌに部分的に取り込まれた１） ＢＰＶ６９ＴＤにクローン化された。

第Ｃ図に示した組み換え体は大腸１ｉ　Ｈ８１０１で増殖され、これから単離さ れた。

■　の１ ＢＰＶＭＴｌおよびＢＰＶＭＴ５はＨｉｎ、ｄｌｌ［を、用いてＰＢ　Ｒ３２２ 鎖を割り込ませることによりプラスミドｐｓｐｖＭＴ１およびｐＢＰＶＭＴ５゜ （第１０図参照）から合成されたの４　４　１、） これらの組み換えウィルスを合成するには二つの方法が利ＪｌすｔＬｆ、　（１ ）　Ｈ，ｉ　ｎ　ｄ　ｍ直線化ＢＰＶＭＴ５分子が（ａ）介在鎖を有しないｈＧ Ｈミニ遺伝子と（ｂ）ＳＶ４０複製原（ヌクレオチド５１７１〜３４６）を含む ５ｖ４０ＤＮ八部分とからなる）ｌ　ｉ　ｎｄｌｌ［プラグメントに結紮された 。（２）第２の方法は組み換えプラスミドＤＢＰＶＭ５Ｇ１およびｐＢＰＶＭ５ Ｇ２の合成を含んでいる。プラスミドｐＢＰＶＭＳはＨｉｎｄｌｌの組み込みに よって直線化され、上記と同様なｈＱＨ−８Ｖ４０プラグメントに結紮された。

大腸菌は結紮混合物によけ変形δれ、組み換えプラスミドｐＢＰＶＭ５Ｇ１およ びｐＢＰＶＭ５Ｇ２は分離されてＨｉ　ｎｄｍの割り込みを受けた。結果として 得られた分子ＢＰＶＭ５Ｇ１およびｐＢＶＭ５Ｇ２はＤＮＡリガーゼにより環化 された。

ｐＢＭＴＫ６および　ＢＭＴＫ６１のＡ５全マウスＭＴ−１遺伝子１ｋｂのＫｐ ｎＩ−ＢａｍＨＩＢＰＶＤＮＡ部分とを含むＫｐｎＩブラグメントがＫｐｎＩ直 線１）ＭＬ２−ＢＰＶ　１４；Ｌｌ）ＢＲ３２２ｖＡ１体ｐＭＬ　２　チク０− ＞化されたＢＰＶ１ゲノムを全体として含んでいる（１９８１年ラスキー（Ｌｕ ｓｋｙ　）およびボウチャン（ｂｏｔｃｈａｎ））　＠’　（＋　（７）ように して得られたプラスミドｐＢＭＴＫ６は１ｋｂの直線状反ｔｌＢＰＶＤＮＡを側 部に有するマウスＭＴ−１３ｍ仏子合金んでいる。またこれは５ａｌＩサイトか ら）ｌｉｎｄｌサイトに至るＰＭＬ２ＤＮＡ部分を含んでいる。プラスミドｐＢ ＭＴＫ６１はＰＢＭＴＫ６の銹導体であり、ＰＢＭＴＫ６は直線状反ＩＢＰＶＤ ＮＡが失われている。

ＭＴＨよび　ＢＭＴＨｌｌの合成（５参照）ＭＴ−ＩＤＮＡを全体として含むＨ ｉ　ｎｄｌ［［ブラグメントはＨｉ　ｎｄｌｌ［一直線化ｐＭＬ２−ＢＰＶ１に Ｍ紮さｈ７：。このようにして得られた、１つもしくは２つのＭＴ遺伝子をそれ ぞれ含むプラスミドｐＢＭＴＨ１およびｐＢＭＴＩ−１１１は大ｍ菌ＨＢ　１０ １から単離された状態で増殖された。

ＢＰＶＭＧ６およびＢＰＶＭＧ７を　むマ　ス　−　ンの倉羞 上記のようにして合成された再環化ＢＰＶＭＧ６もしくはＵユは燐酸カルシウム 共沈テクニック（１９７３年グラハム（Ｇｒａｈａｍ　）およＵｌｐ＞−デル・ ニブ（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ）を用いてマウスＣ１２７細胞（１９７８年ロウイ 他（ｔｏｗｙ　ｅｔａｌ、））に導入された。二連間の後、個々の病巣は採取さ れて２４枚の組織培養プレートに入れられ、１０％の子牛胎児血清を含むダルベ コ（Ｄｕｌｂｅｃｏ　）の最小必須媒体内で成長された。このような媒体は特定 ｈＧＨラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によりそのｈＧＨの存在をテストされた 。テストされた２５のクローンは全てさまざまな量のｈＧＨの生成および分泌を 示し、これらはＲＩＡにより簡単に検出された。クローン化細胞ラインはＢＰＶ ＭＧ６組み換え体を有するものにライてはＣＭＢＧ６−ｎ　（ｎ−１，２，３， −）と、ＢＰＶＭＧ７組み換え体を有するものについてはＣＭＢＧ７−ｎ（ｎ− １，２，３，・・・）と命名された。転換ラインにおける組み換え分子の状態を 確認するため、それらの全ＤＮＡが抽出され、ＢＰＶプローブに対するゲル転換 雑種形成により分析された。第７図は１２のクローンについての結果を示し、こ れらのクローンは３ａｍＨＩもしくは５ａＣＩを用いたものについては１回、Ｋ ｐｎＩを用いたものについては２回切り離されている。１２のクローンのうち１ ０のクローンはＢａｍＨＩおよびＳａＣ工を用いたものでは非常に単純な単位長 さのバンドを、ＫｐｎＩを用いたものでは過当な長さの２本のバンドを与えた。

これは、先の結果に合致して、組み換え分子が主として、すなわち、専らエピゾ ームとして保たれていることを示している。プラスミドＤＮＡ標準と比較すると 、変換体は１０〜１００コピー／セルの組み換え分子を含んでいるものと見積ら れる。いくつかの切離体に見られるぼやけたバンドの存在はＤＮＡの僅かな転位 もしくは１個以上のｉ＋ｕｉｉタイプ（ｃｅｌｌ　ｔｙｐｅ）の存在を表してい る。二つのクローン（６−２および６−３）は著しい転位を示す異なる制限パタ ーンを与えた。これらのラインのうちの一つ（６−３）は不適当なものであり、 ５ケ月の培養の・後ｈＧＨの増殖が停止した。これとは対照的に予期したＤＮＡ Ｉ造を有する１０のクローンは全て一年の経過後もひき続きｈＧＨの増殖を行な った。１０ケ月成長したいくつかのクローンを低分子ｉｌ！ハート（旧ｒｔ）上 澄みＤＮＡ分析（１９６９年ハート（Ｈｉｒｔ））シたところ、ＤＮＡＩ造に何 ら変化のないことが示され、スーパーコイルド・エピゾーマル分子（Ｓｕｌ）ｅ ｒｃＯｉｌｅｄ　ｅｌ）ｉｓＯｍａｔ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の存在が１ｉ１認 された。ｈＧＨ鎖の存在によってベクターが安定化され、従って組み換え分子が マウスの細胞内で安定的に増殖され、多量のｈＧＨが生産されることとｈＧＨ生 産セルラインの成長のために、これから多量のｈＧＨ生産を可能とするスピナー 培養を適用するにあたり、Ｇｘｉｏ６ａのセルがトリプシン処理され、１リツト ルのスピナー培養媒体［１０％の子牛胎児血清で懸濁培養するための調整された アールズ塩（Ｅａｒｌｅ’ｓ　５ａｌｔｓ）（ＧＩＢＣＯ）を含む最少必須媒体 （イーグル（Ｅａａｌｅ）］に接種された。二連間の培養の後に検出された成長 はほんの僅がであった。これらの細胞は次いで１０４セル／１の密度で新規なス ピナー培養媒体内で別培養された。このような第２段階の後、これらの細胞は約 ４０時間の倍の時間スピナー培養による成長に供される。

懸濁培養を受けると、いくつかのＣＢＭＧ細胞クローンのｈＧＨ生産能力は消失 する。セルはスピナー培養から採取されてプラスチック叡の組織培養ディツシュ （ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ））に戻され、媒体のＲＩＡに°よりｈＧ）−１の 発現を観察された。ＣＢＭＧ７−４１２で示したクローンはそのセル組織の変化 にもかかわらず多量のｈＧｌ−（を生産することが見い出された。

ＢＰＶＭ５　Ｍ　Ｇ１　Ｍ５　Ｖ　− ＢＰＶＭＴＨ（７）Ａ 上記のようにして合成された組み換え分子はａｍカルシウム共沈法（１９’７３ 年グラハムおよびファン・デル、ニブ）によりマウスＣ１２７細胞内に導入され た。５０〜７０％の融合性Ｃ１２７細胞は６０Ｍの組織培養ディツシュについて １１の共沈液中で、０．１〜０．５ｕｇの組み換えＤＮＡを含む２０ｓｇの鮭の 精子のＤＮＡにより処理することにより得られた。２４時間後、これらのセルは トリプシン処理され、３枚の６０ｓｍ組繊細胞ディツシュに分配された。５〜１ ０時間の後、媒体このような選択媒体は２〜３日毎に交換された。この条件下で マウス０１２７１１胞はカドミウムにより殺されるが（第９図および第１０図参 照）、挿入マウスＭＴ−１遺伝子を表す変型細胞は抗性を持つこととなる（第１ ０図参照）。

Ｃｄ−抗性細胞の病巣は個々に、２４穴の組織培養プレートに移され、増殖され た。ＭＳｏｌおよびＭ５Ｇ２で変換されたクローンに関しては、増殖病巣の媒体 はＲＩＡによりｈＧＨの存在の分析がなされた。カドミラ・ム抗性を有しがっ挿 入マウスＭＴ−１遺伝子を表すいくつかのクローンは隔絶され、０８Ｍ５Ｇｎ　 （ｎ−１，２，３，・）と命名された。このようなりローンは高濃度のカド′Ｌ 、ラム（８０ｕＨに至る。第１１図参照）に対する抗性を有しており、ラジオイ ム／アッセイによる測定では極めて多量のｈＧＨを有している。

江旦旦ユ１ ｈＧＨは、分泌中に除去される疎水性のアミノ末端鎖を含むプレホルモンとして 脳下重体で合成される。５Ｖ４０−ｈＧＨ組み換え体を混入させた舅の腎臓の培 養セルはｈＧＨの加工および分泌の双方が可能である。（バブラキス他（ＰａＶ ｌａｋｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）　、　１９８１年プロセス・ナショナル・アカデミ ツク・サイエンス・ニーニスニー誌（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、 ＵＳＡ））。このことがＢ、ＰＶＭＧの変換についても真実であるがを検討する ため、細胞には３５ｓ−システィンが加えられ、媒体中の分泌蛋白はゲル電気泳 動により分析された。真正なｈＧＨ共移住する蛋白はＢＰＶＢＧ変換セルからの 媒体中には観察されたが、コントロールＩＤ１３セルからの媒体中には観察され なかった（Ｍ１２図参照）。ざらに、セルをカドミウムもしくはデキサメタソン で８時間Ｍｓすると、このような蛋白の量はカドミウムにより２倍に増加したが 、デキサメタソンでは何ら影響がなかった。変換ａｍはさまざまな量の高分子重 量バンドがまた観察された。同様な細胞がらＳ＋＊された細胞内蛋白を平行分析 したところ、金属チオネイン合成がカドミウムおよびデキサメタソンの双方によ りＩ！導されることが示された。従って、変換細胞の内生的な金属チオネイン遺 伝子は重金属およびグルココルチコイドの双方に対して０反応性を保持した。こ のようなゲルを走査すれば、変ＭｋＩＢＩ１２１がＭＴの２０〜６０倍のｈＧＨ を生、産することが示される（ＭＴはシスティンの残留物を２０含むに対し、ｈ ＧＨはほんの４含むにすぎない）。

変換マウス細胞により分泌されたｈＧＨの量はラジオイムノアッセイによって計 測された。基底レベルは０．２〜２．５υΩ／１の範囲にわたっており、これら のレベルはデキサメタソンによってではなく、カドミウムによる処理によって１ ．３〜２．５倍増加した。このようなｈＧＨ生産レベルは、セルが１０ケ月を経 過しても一定に保たれ、もしくは実際的に増加した。細胞数と１０ケ月間培養さ れたＩｌ＆！の媒体ｈＧＨを測定すると、ｈＧＨ生産の基底レベルが４つの異な るクローンについて、２〜６×１０８分子／細胞／日の範囲にわたることが示さ れる。

金　−カドミ　ムによる誘導 以上ノセクションではカドミウムによりセルを８時間誘導すると、組織の蛋白の 量が２倍に増加する結果が示された。

実験テはカドミウムを用いたがその他の重金属例えば亜鉛、銅および水銀等を用 いてもよく、金属チオネイン遺伝子はこらのすべての金属で誘導可能であること が示されている。

浄書イ内容に変更なし） ＡＩ！ｌ＋セライン ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、７＠；Ｓ：２ユ＝：誌：：１蚕８ａｃｌ　にｐｎｌ　− 手続補正書（方式） 昭和９５年（２月２１日廖 特許庁長官古賀　学殿 １、事件の表示 ３、　補正をする者 ５、補正命令の日付ｎ’￥ｐＳへ町ｈ９８（養舌凪Ｓ名ヤ抗等＋１　’？＋’２ −”Ｉ　Ｅｌ）明　細　書 マウスの細胞内で組み換えＤＮＡによって生産されたヒト成長ホルモン 友丘且薯 ゴーデル他（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、）の米国特許第４．３４２゜８３２ 号では、バクテリアにおいてヒト成長ホルモンをつくり出すために合成遺伝子を 使用する。

サーバー他（ｓａｒｖｅｒ　ｅｔ　ａｔ、）が表した、１９８１年６月発行「分 子細胞生物学１」（“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏ ｌ。

ｇｙ”）第６号、第４８６−４９６ページ掲載の「ウシ乳頭腫ウィルスＤＮＡ　 ：新しい成熟核クローニングベクター」　（“Ｂｏｖｉｎｅ　Ｐａｐｉｌｌｏｍ ｄ　ｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ；Ａ　ｎｏｖｅｌ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒ”）には、ＢＰＶクローニングベクターについて記載されて おり、ベクターはプレプロインシュリンに付着されている。　プリンスター他（ Ｂｒｉｎｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）が表した１９８２年３月発行［ネイチｔ−Ｊ （“Ｎａｔｕｒｅ”　）　第２９６号、第３９−４２ページ掲載の「マウス卵に 注入された金属チオネイン−サイミゾイン・キナーゼ融合プラズマの調整（Ｒｅ ｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ　Ｔｈｙｍｉｄｉｎ ｅ　Ｋｉｎａｓｅ　Ｆｕｓｉｏｎ　Ｐｌａｓｍａ　Ｉｎｊｅｃｔｅｄ　１ｎｔｏ 　Ｈｏｕｓｅ　Ｅｇｇｓ”）では、ヘルペス・ウィルス・サイミゾイン・キナー ゼに融合された金属チオネイン−■遺伝子プロモータ連が、キナーゼ遺伝子の発 現を行なうために使用される。マウス卵は同プラスミツドに顕微注入されている 。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）金属チオネイン−ヒト成長ホルモン（１４Ｔ−ｈＧ旧の雑種遺伝子を形成 する段階と、前記雑種遺伝子をウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）ベクター内に組み 込んで、組み換えプラスミドを形成する段階と、バクテリアのＤＮＡ鎖を取、り 除いて、　ＨＴ−ｈＧＨ−ＢＰＶ組み換え分子を形成する段階と、前記組み換え 分子を培養したマウスの細胞内に導入する段階と、前記組み換え分子を含む変換 細胞を単離増殖させる段階と、前記変換細胞に対し有害とならない濃度のカドミ ウム−を添加する段階と、前記変１ＩｋＩ［胞から分泌されたヒト成長ホルモン を分ａｇ製する段階とから成ることを特徴とするヒト成長ホルモンの収率増大方 法。 （２）金属チオネイン−非選択性遺伝子の雑種遺伝子を形成する段階と、前記雑 種遺伝子をウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）ベクター内に組み込んで、組み換えプ ラスミドを形成する段階と、バクテリアのＤＮＡ鎖を取り除いて、ＨＴ−非選択 性遺伝子−ｅｐｖ組み換え分子を形成する段階と、前記組み換え分子を培養した マウスの細胞内に導入する段階と、前記組み換え分子を含む変換細胞を単離増殖 きせる段階と、前記変換細胞に対し有害とならない濃度のカドミウムを添加する 段階と、生成した非選択性遺伝子を分離精製する段階とから成ることを特徴とす る非選択性遺伝子の収率増大方法。 、（３）前記組み換えプラスミドがＢＰＶＨＧ６であることを特徴と（４）前記 組み換えプラスミドが、ＢＰＶＨＧ７であることを特徴とする請求の範囲第１項 記載のヒト成長ホルモンの収率増大方法。 （５）前記カドミウムに代えて、銅および水銀より成る群から選択される少なく とも１つの金属が使用されることを特徴とする請求の範囲第２項記載の非選択性 遺伝子の収率増大方法。 （６）マウスの金属チオネイン−１（ＨＴ−１）３１伝子を単離し、その遺伝子 を適切な第１プラスミドＰＳＶＨＴ（１）に導入する段階と、ヒト成長ホルモン の構成鎖より成る第２遺伝子を単離して、その第２遺伝子を組み換えプラスミド 、５ＶＧ８３Ｃ２（［）に導入し、そのプラスミドを大ｍ　ｌ　ＨＢ１０１内で 増殖させる段階と、制限酵素ＢａｍＨＩを使用して前記第２遺伝子をプラスミド ＰＳＶＧ８３Ｃ２（Ｌ）から切除し、その第２遺伝子を第１プラスミド内のマウ スのＨＴ−１遺伝子のＢ（１１１１サイトにサブクローニングして、プラスミド 、５ＶＨＴＧ１１８内で雑種遺伝子ＨＴ−ｈ’ＧＨを生成させる段階と、前記雑 種遺伝子を採取するために・Ｈｉｎｄｌｌｌを使用してプラスミド、５ＶＨＴＧ Ｈ８を切除する段階と、前記雑種遺伝子を適切なプラスミド−ウシ乳頭腫ウィル ス（ｅｐｖ）ベクター、ＢＰシロ９ＴＯ内に導入する段階と、前記プラスミド− ＢＰＶベクターを大臨菌１１８１０１内で増殖させる段階と、プラスミド鎖をＢ ａｗ＋ＨＩを使用して切断し、ＢＰＶ−ＨＴ−ｈＧＨの組み換え分子をＤＮＡリ ガーゼによって再環化する段階と、組瘍快慟　由　じ　訣け　ス　ヒ　ト　−　 区　本　１１２手　ゝノ　山　肚　向　し−毫高　１．を−憤普マ　向ス細胞内 に前記ＢＰＶ−ＨＴ−ｈＧＨの組み換え分子を導入する段階とから成ることを特 徴とするヒト成長ホルモン等の非選択性遺伝子の生成方法。 （７）請求の範囲第１項の方法によって得られた変換マウス細胞ラインであって 、ＣＢＨＧ　６−９およびＣＢＨＧ７−４Ｌ２より成る群から選択される変換マ ウス細胞ライン。 （８）　ＨＴ遺伝子を適切なプラスミド−〇ＰＶベクター内に導入する段階と、 そのベクター内にｈＧＨ遺伝子を導入して組み換え分子を形成する段階と、この 組み換え分子をマウス細胞内に導入する段階と、この細胞を有害１１度のカドミ ウムで処理する段階と、１存細胞をｌ＄１離する段階と、これらの細胞中ｈＧＨ を効率よく生成する細胞を増殖させる段階とから成ることを特徴とする効率のよ いｈＧｌ（の産生方法。 （９）　ＨＴ遺伝子を適切なプラスミド−ＢＰシベクター内に導入する段階と、 そのベクター内に非選択性遺伝子を導入しτ細胞内に導入する段階と、この細胞 を有害８１度のカドミウムで処理する段階と、生存細胞を単離する段階と、これ らの細胞中非選択性遺伝子を効率よく生成する細胞を増殖させる段階とから成る ことを特徴とする効率のよい非選択性遺伝子の産生方法。 （１０）ウシ乳頭腫ウィルス−金属チオネインＩ　（ＢＰＶ−ＨＴ）組み換えプ ラスミドベクターを形成する段階と、前記ＢＰＶ−ＨＴベクターに非選択性遺伝 子列を導入する段階と、ＲＰＶ−ＨＴ−非選択性遺伝子ベクターをマウス細胞内 に導入する段階と、その細胞に有害濃度のカドミウムを添加する段階と、生存細 胞を単離し、その細胞中非選択性遺伝子を効率よく生成する細胞を増殖させる段 階とから成ることを特徴とする効率のよい非選択性遺伝子の産生方法。 （１月非選択性遺伝子がヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）であることを特徴とする請 求の範囲第１０項記載の効率のよい非選択性遺伝子の産生方法。 （１２）前記カドミウムに代えて、銅および水銀より成る群から選択される少な くとも１つの金属が使用されることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の効率 のよい非選択性遺伝子の産生方法。 （１３）請求の範囲第１０項記載の効率のよい非選択性遺伝子の産生方法におい て使用されるプラスミドであって１．ＢＰＶＨＴｌ、ＰＢＰＶＨＴ５．　ＰＢＨ ＴＫ６　、ＢＨＴＫ６１．　、ＢＨＴＨｌ　、および、ＢＮ２ ＴＨｌｌ、より成る群から選択されるプラスミド。 （１４）ＣＢＨＧ６−９で表わされるほぼ純粋なマウス細胞ライン。 （１５）ＣＢＨＧ７−４Ｌ２で表わされるほぼ純粋なマウス細胞ライン。 （１６）ＣＢＨ５Ｇ５で表わされるほぼ純粋なマウス細胞ライン。 （１７）組み換えプラスミド、ＢＰＶＨＧ６゜（１８）組み換え７−）　スミト 、ＢＰＶＨＧ７゜（１９）組み換えｙ　５　スミＦ　、ＢＰＶＨＴ５゜（２０） 組み換えプラスミド、ＢＰＶＨＴに６゜（２１）組み換エフ　７　スミトｐＢＰ ＶＨＴＨ１１。 （２２）変換細胞を撹拌培養器内に連続的に投入することによって、その変換細 胞を撹拌培養器内で成長させた後、ｈＧｌｌを高レベルで生成する細胞を単離増 殖させることを特徴とする請求の範囲第１項記載のヒト成長ホルモンの収率増大 方法。 （２３）変換ｌ１ｌｖｉを撹拌培養器内に連続的に投入することによって、その 変換細胞を撹拌培養器内で成長させた後、非選択性遺伝子を高レベルで生成する 細胞を単離増殖させることを特徴とする請求の範囲第２項記載の非選択性遺伝子 の収率増大方法。