DE3588219T2

DE3588219T2 - T-Zellenrezeptor, spezifisch für Antigenpolypeptide und verwandte Polynukleotide

Info

Publication number: DE3588219T2
Application number: DE3588219T
Authority: DE
Inventors: Mark M. Davis; Stephen M. Hedrick
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1984-03-01
Filing date: 1985-02-28
Publication date: 2000-05-18
Anticipated expiration: 2005-03-01
Also published as: JPH07274976A; JPH06225765A; ATE188251T1; JPH09121871A; DE3584209T2; EP0174366A1; EP0609901A1; JPH10114672A; DE3588219D1; JPH10210992A; HK1006855A1; EP0174366B1; DE570027T1; EP0570027A1; SG70553A1; US6180104B1; EP0570027B1; JPH1067675A; US5316925A; WO1985003947A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Das hämatopoletische System ist außerordentlich komplex, was in Hinsicht auf die zentrale Rolle nicht überrascht, welche die Blutzellen für die Aurechterhaltung der Existenz und das überleben des Trägers (Hosts) spielen. Ein Aspekt großer Bedeutung ist die Art, in welcher sich der Träger selbst vor verschiedenen Pathogenen schützt. Zwei Zellfamilien spielen eine herausragende Rolle für den Schutz des Trägers, B-Zellen und T-Zellen.
Das Geheimnis, wie die B-Zellen in der Lage sind, eine außerordentliche Vielzahl von Immunglobulinen zu produzieren, ist im wesentlichen geklärt. Von der DNA der Keimbahn weiß man heute, daß sie sich rekombiniert bzw. rearrangiert, um verschiedene Exons zusammenzufügen, wodurch eine variable Region gebildet wird, die dann für die reifen Strukturen der B-Zelle an verschiedene konstante Regionen gebunden ist. Der Mechanismus, mit dessen Hilfe sich die DNA dem Rearrangement unterzieht und das folgende Transkript unter Bildung einer messenger-RNA gespleißt wird, welche für ein spezifisches Immuglobulin codiert, hat sich als aufregendes Abenteuer erwiesen, welches die Potenz der Mittel aufzeigt, welche durch die Entwicklungen in dar Molekularbiologie aufgebracht werden.
Eine andere für das Immunsystem des Trägers wichtige Klasse von Zellen sind die T-Zellen. Diese Zellen unterscheiden sich von den B-Zellen dadurch, daß sie keine Immunglobuline sezernieren, obwohl sie einen ähnlichen Umfang antigener Spezifitäten zu besitzen scheinen. Insbesondere die Helfer-T-Zeilen, die an der Stimulation der B-Zell-Proliferation beteiligt sind, können eine Spezifität besitzen, die der von β-Zellen analog ist, mit dem zusätzlichen Erfordernis, daß sie gleichzeitig die "major histocompatibility" Determinanten erkennen können müssen.
Die Spezifität von T-Zellen kann in einer großen Verschiedenheit von Situationen Anwendung finden. Wenn man eine Helfer-T-Zelle durch Einführen einer fremden Rezeptorbindungsstelle modifizieren könnte, könnte man die Antwort des Trägers (Hosts) auf ein fremdes Antigen verändern. Darüberhinaus kann es in vielen Situationen von Interesse sein, zu bestimmen, ob eine Zelle eine Helfer-T-Zelle oder ein anderer Zelltyp ist, Zusätzlich hat man die Möglichkeit, Monoklonalität im Träger zu bestimmen, was für die Diagnose von T-Zell-Leukämien wertvoll sein kann. Auch dann, wenn man DNA-Sequenzen, die für Teile des antigen-spezifischen T-Zell-Rezeptors kodieren, in der Hand hätte, würde dies Konstruktionen ermöglichen, die die Kombination nativer T-Zell-Sequenzen mit fremden Sequenzen umfaßten, wodurch neue Proteine hergestellt werden könnten, die als Rezeptoren fungieren könnten. Auch könnten Antiseren und monoklonale Antikörper gegen spezifische Teile des Proteins erzeugt werden, entweder unter Verwendung von synthetischen Peptiden oder durch Produktion des Proteins in einem Expressionsvektor. Durch den Einsatz von Hybridisierung mit DNA-Sequenzen können Subsets von T-Zellen wie auch genetische Unterschiede und Defekte bestimmt werden.

Beschreibung des Stands der Technik

Es ist gezeigt worden, daß die zweite Domäne von HLA-DC homolog zu Immunglobulin ist. Auffray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79 : 6337-6341. Die Sequenz um die innerhalb der Kette liegende Disulfidbrücke in der variablen Immunglobulinregion wird von Kabat et al., in Sequences of Immunological Interest, U. S. Dept. of Health and Human Services, Washington, D. C. (1983) diskutiert. Kreuz-Reaktivität zwischen B-Zell-anti-idiotypischen Antiseren und T-Zellen wird von Eichmann und Rajewsky, Eur. J. Immunol. (1975) 5: 661-666; Binz und Wigzell, J. Exp. Med. (1975) 142: 197-211 und Augustin et al. in Regulatory T Lymphocyte (Herausgeber Pernis und Vogel), 171-184, Academic Press, N. Y., 1980, berichtet. Fehlen von Ähnlichkeit der Nukleosidsequenz zwischen für T-Zellen spezifische Gene und für Immunglobuline kodierende Gene wird unter anderem von Kronenberg et al., J. Exp. Med. (1980) 152: 1745-1761 und Kronenberg et al., ibid. (1983) 158: 210-227 berichtet. Über für murine T-Zellen spezifische Proteine wird von Kappier et al., Cell (1983) 34: 727-737 und McIntyre and Allison, ibid. (1983) 34: 739-746, berichtet. Allison et al J. Immunol. (1982) 129: 2293-2300; Haskins et al., J. Exp. Med. (1983) 157: 1149-1169; Meuer et al., Nature (1983) 303: 808-810 und Samuelson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 801 : 6972-6976 berichten über die Immunpräzipitation eines disulfidverbrückten Heterodimeren, zusammengesetzt aus zwei verschiedenen Glykoproteinen von 37-50 kD Größe, aus T-Zellen. McIntyre und Allison, oben (1983), und Acuto et al., Cell (1983) 34: 717-726 berichten, daß das Heterodimere gemäß Peptidkartenanalysen variable und konstante Teile zu besitzen scheint. Heber-Katz et al., J. Exp. Med. (1982) 155: 1086-1099 und Hedrick et al., Cell (1982) 30: 141-152 berichten von der Produktion MHC- geschnittener T-Helfer-Hybridomas, wobei diese Offenbarung durch die Angabe des Zitats vorliegend umfaßt ist. Davis et al. berichten in B und T Cell Tumors, UCLA Symposium Band 24 (Herausgeber Vitteta und Fox) 215-220, Academic Press, N. Y. 1982, daß sich T- und B-Lymphozyten durch eine sehr kleine Fraktion ihrer Genexpression unterscheiden.
Saito, Nature (1984) 309: 757-762 berichtet von einem T-Zell-spezifischen cDNA-Klon, der in cytotoxischen T-Zell-DNAs rekombiniert wird und zur variablen, konstanten und Bindungsregion (joining region) homologe Elemente besitzt. Siu et al., Cell (1984) 37: 393-401 und Kavaler et al., Nature (1984) 310: 421-423 berichten vom Vorliegen von Diversitätselementen in der β-Kette. Über die α-Kette der T-Zell-Rezeptormoleküle wurde mitgeteilt, daß sie genauso unterschiedlich ist wie die β-Kette (Kappler et al., Cell (1983) 35: 295-302).
EP-A-0149548 ist Teil des Standes der Technik nach Artikel 54(3) EPC. Sie offenbart Nukleotid- und Polypeptidsequenzen für eine T-Zell-Antigenrezeptor-Untereinheit wie auch Verfahren zum Erhalt dieser Sequenzen. EP-A-0149548 beansprucht ein isolierte Polypeptid, das mindestens 312 Aminosäuren umfaßt, Teil eine Säugetier-T-Zell-Antigenrezeptors ist und von einer Nukleinsäure, die mindestens 936 Nukleotide umfaßt, oder abgeleitet ist, wobei die Nukleinsäure
(i) DNA ist, die die folgende Deoxyribonukleotid- Sequenz mit 174 Resten umfaßt:
oder
(ii) RNA ist, die eine Ribonukleotid-Sequenz mit 174 Resten, die der (i) oben definierten Deoxyribonukleotid- Sequenz mit 174 Resten entspricht, umfaßt, oder
(iii) zu einer Nukleinsäure, wie sie (i) oder (ii) oben definiert ist, oder zu dem Komplement derselben hybridisierbar ist.
EP-A-0149548 beansprucht auch einen isolierten monoklonalen oder aus Serum stammenden Antikörper, der auf eine T-Zell- Antigenrezeptor-spezifische-Antigen-Determinante gerichtet ist, auf den oben definierten isolierten Polypeptid und beansprucht ferner ein Verfahren zur Bestimmung, ob eine unbekannte Zelle eine T-Zell ist, das ein In-Kontakt-Bringen der unbekannten Zelle mit dem oben definierten isolierten Anti körper unter Bedingungen, die eine Bildung eines Antigen- Antikörper-Komplexes zulassen, und Nachweisen, ob der Komplex vorliegt; und ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines T-Zell-Antigenrezeptors in einer Probe, das ein In-Kontakt- Bringen der Probe mit dem oben definierten isolierten Antikörper unter Bedingungen, die eine Bildung eines Antigen- Antikörper-Komplexes zulassen und Nachweisen, ob der Komplex vorliegt, umfaßt.
Es wird eine Technik bereitgestellt, wodurch seltene Messenger-RNA isoliert wird. Mit Hilfe dieser Technik werden DNA-Sequenzen, die Antigen-spezifische Rezeptoren in T-Zellen kodieren, wie auch andere T-Zell-spezifische Gen-Produkte erhalten. Die DNA wird in einer Reihe von Wegen eingesetzt, z. B. als Nukleotid-Sonden, die sich mit fremden DNA-Sequenzen unter Herstellung neuer T-Zell-Rezeptoren kombinieren, die in analoger Weise als Antikörper eingesetzt werden können; oder es können Konstrukte bereitgestellt werden, die für extrachromosomale Elemente oder für einen Einbau in ein Wirtsgenom sorgen, wo die Hybridproteine exprimiert und zu der Membran transportiert werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Peptid oder Polypeptid bereit, das T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit- Aktivität hat, umfassend mindestens 8 aufeinanderfolgende Aminosäuren einer T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit, wobei die Untereinheit dadurch gekennzeichnet ist, daß:
(i) sie von T-Zell-spezifischer mRNA exprimiert wird;
(ii) sie von einer Nukleinsäure kodiert wird, die einem T-Zell-spezifischen Rearrangement unterworfen wird; und
(iii) sie von einer Nukleinsäure kodiert wird, die unter Standardbedingungen zu einer Sonde hybridisierbar ist, welche mindestens 30 Nukleotide der konstanten Region, wie sie in Fig. 2 dargestellt ist, von Kodon 134 bis Kodon 306 oder eine dazu komplementäre Sequenz umfaßt;
unter der Voraussetzung, daß das Peptid oder Polypeptid kein isoliertes Polypeptid ist, das
(a) mindestens 312 Aminosäuren umfaßt und
(b) Teil eines Säugetier-T-Zell-Antigenrezeptors ist, und
(c) durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die mindestens 936 Nukleotide umfaßt, wobei die Nukleinsäure
(i) DNA ist, die die folgenden Desoxyribonukleotid-Sequenz mit 174 Resten umfaßt:
oder
(ii) RNA ist, die eine Ribonukleotid-Sequenz mit 174 Resten umfaßt, die der in (i) oben definierten Desoxyribonukleotid-Sequenz mit 174 Resten entspricht, oder
(iii) zu einer Nukleinsäure, wie sie in (i) oder (ii) oben definiert ist, oder dem Komplement derselben hybridisierbar ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen Antikörper bereit, der sich spezifisch an ein Peptid oder Polypeptid bindet, wie es oben definiert ist, vorausgesetzt, daß der Antikörper kein monoklonaler oder aus Serum stammender Antikörper, der unter Verwendung bekannter Verfahren angewendet wird, auf ein isoliertes Polypeptid ist, welches
(a) mindestens 312 Aminosäuren umfaßt und
(b) Teil eines Säugetier-T-Zell-Antigenrezeptors ist, und
(c) durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die mindestens 936 Nukleotide umfaßt, wobei die Nukleinsäure
(i) DNA ist, die die folgenden Desoxyribonukleotid-Sequenz mit 174 Resten umfaßt:
oder
(ii) RNA ist, die eine Ribonukleotid-Sequenz mit 174 Resten umfaßt, die der in (i) oben definierten Desoxyribonukleotid-Sequenz mit 174 Resten entspricht, oder
(iii) zu einer Nukleinsäure, wie sie in (i) oder (ii) oben definiert ist, oder dem Komplement derselben hybridisierbar ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Hybridpeptid oder -polypeptid bereit, das ein Peptid oder Polypeptid, wie es oben definiert ist, umfaßt; und stellt ferner ein isoliertes Peptid oder Polypeptid bereit, das T-Zell-Antigenrezeptor-β- Untereinheiten-Aktivität hat und das eine Aminosäuresequenz der folgenden Formel umfaßt:
(S. L.)c-(V-seq)-J-C-(TM)d-(Cy)e
hat, worin:
"S. L." eine sekretorische Leader-Sequenz einer T-Zell- Antigenrezeptor-β-Untereinheit bedeutet;
"V-seq" ein Polypeptid, das die variable Region einer T- Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit ist, bezeichnet oder ein anderes Polypeptid als die variable Region einer T-Zell- Antigenrezeptor-β-Untereinheit bedeutet;
"J" eine bindende Region einer T-Zell-Antigenrezeptor-β- Untereinheit bedeutet;
"C" eine konstante Region einer T-Zell-Antigenrezeptorβ-Untereinheit bezeichnet;
"TM" eine Transmembran-Sequenz einer T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit bezeichnet;
"Cy" eine zytoplasmatische Region einer T-Zell- Antigenrezeptor-β-Untereinheit bezeichnet; und
c, d und e jeweils unabhängig voneinander 0 oder 1 darstellen, und worin
eine T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit wie oben definiert ist, und das Peptid oder Polypeptid der obigen Voraussetzung unterworfen ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Restriktionsschnittstellenkarte von T-Zell-Antigenrezeptor-Bruchstücken, worin die schattierten Bereiche größere Homologien zwischen den unterschiedlichen cDNA-Klonen anzeigen. Die Sequenzierung erfolgte durch das Verfahren von Maxam und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74: 560, wobei die dicken Pfeile das Markieren des 3'-Endes (Klenow) und die Pfeile das Markieren des 5'-Endes (Polynucleotidkinase) darstellen.
Die Fig. 2 zeigt die vollständige Nucleotidsequenz von 86T1 und Teilsequenzen der anderen cDNA-Klone, worin die 5'-untranslatierte Region (UT), das Leader-Polypeptid, variable, bindende (joining) und konstante Regionen angezeigt sind, wobei man bezüglich der Numerierung der Aminosäuresequenz von 86T1 folgte, und worin mögliche Kohlehydrat-Bindungssteilen (CHO) (N-X-S oder N-X-T) angegeben sind.
Die Fig. 3 zeigt die Sequenzierungsstrategie der TT11 cDNA- Klone, worin die dünnen Linien das Markieren des 5'-Endes mit Polynucleotidkinase anzeigen und die dicken Linien das Markieren des 3'-Endes mit dem Klenow-Fragment von DNA Polymerase I anzeigen. Es zeigt ferner die Aminosäuresequenz, vorhergesagte Aminosäuren, und gibt im allgemeinen die einzelnen Regionen an. "CHO" weist auf die potentiellen Signalsequenzen für N-verknüpfte Glykosylierung.

Beschreibung der einzelnen Ausführungsformen

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neue DNA-Sequenzen zur Verfügung gestellt, umfassend vollständig oder teilweise codierende Sequenzen für antigenspezifische T-Zell-Rezeptoren oder Bruchstücke davon, die spezifisch funktionale Regionen beinhalten, welche auf einem oder mehreren Exons in der Keimlinien-DNA und der rearrangierten DNA oder im Gesamten oder in Teilen als cDNA einer reifen messenger-RNA gefunden werden können.
Die T-Zell-Rezeptoren von Säugern scheinen 80-90kDa1 schwere Heterodimere zu sein, die über Disulfide verbrückt sind und aus zwei unterschiedlichen Glycoproteinen von etwa 40 bis 50 kD (Kilodalton) zusammengesetzt sind, bezeichnet als α- und β-Untereinheit. Die beiden Glycoproteine besitzen gemäß der Peptidkartenanalyse variable und konstante Regionen oder Domänen.
Die DNA-Sequenzen, die für die Glycoproteine des Heterodimeren codieren, können in variable, bindende ("joining") und konstante Regionen unterteilt werden, analog zu Immunglobulinen, was durch die Sequenzen mit signifikanter Homologie zu den Immunglobulin- Sequenzen und durch die unabhängige Assortierung bzw. Anordnung der J-artigen Elemente gesichert werden konnte. Jede der Untereinheiten scheint Diversitätregionen ("diversity regions") (D) zu besitzen, vergleichbar mit der schweren Kette der Immmunglobuline.
Die α- und β-Untereinheiten besitzen untereinander und mit T- Zell-Membranproteinen und Immunglobulinen oder B-Zell-Rezeptorproteinen viele Ähnlichkeiten. Meistenteils ist die Gesamthomologie gering, wobei wenige Ähnlichkeiten in entweder der Aminosäuresequenz oder der Nucleotidsequenz in den konstanten Regionen besteht. (Das Methionin des Leader-Peptids wird als 1 für die Aminosäuresequenz benutzt.) Es hat sich gezeigt, daß der Cystein-Abstand in der variablen Region zwischen etwa 65 bis 70 Aminosäuren beträgt (α-65; β-69; Igλ oder κ-65). Darüberhinaus findet die Sequenz "WYRQ" in der variablen Region der a-Kette bei ungefähr dem Rest 55 Analogie in der β-Kette in "WYKQ" und analogen Sequenzen an vergleichbaren Positionen in Immunglobulinen. In den variablen Regionen wird die Sequenz "DSA-Y-CAV" im Bereich der Reste von etwa 100-115 gefunden, mit ein oder zwei Unterschieden bei den Aminosäuren.
Die J-Region scheint die am stärksten konservierte Region zu sein, wobei 7 von 16 Resten der α-Kette identisch sind mit denen der β-Kette und signifikante Homologie mit Konsensus-Sequenzen von murinen schweren und leichten Ketten besteht.
Ebenfalls charakteristisch für die T-Zell-Rezeptorsequenzen ist die Sequenz "ILLXK" worin X L oder G ist, mit einer basischen Aminosäure in der Transmembran-Region.
Als Bestätigung für eine D- oder Diversitäts-Region ("diversity region") befindet sich 5' zur "SGN"-Sequenz ungefähr bei den Re sten 115 bis 120 die Nucleotidsequenz "Gs". In 7 von 14 vermuteten D-Regionen der β-Kette befinden sich auf der 3'-Seite "G&sub3;- &sub7;"-Folgen, zu denen sich in den D-Regionen der schweren Ketten der Immunglobuline Analogien finden.
Die α- und β-Ketten sind in der Keimbahn-DNA kodiert, die einem Rearrangement unterworfen wird, so daß ein Transkript entsteht, das weiter prozessiert werden kann. Für die hier im folgenden beschriebenen Zwecke kann entweder die genomische DNA oder cDNA des maturen Transkripts verwendet werden.
Jede der Ketten besitzt 3 bis 5, gewöhnlich 4 bis 5 Orte für N- Glycosylierung, die teilweise oder alle verwendet werden können.
Die beiden Ketten des Heterodimeren sind unterschiedlich und scheinen aus verschiedenen Genorten zu stammen. Die Sequenzen für eine β-Kette und eine α-Kette sind in den Fig. 2 bzw. 3 dargestellt. Die Ketten können durch Analogie mit Immunglobulinen in Regionen aufgeteilt werden, die mit spezifischen Exons assoziiert sind. Die primären Regionen sind die Leader-Region, variable Region (V), Diversitätsregion ("diversity region") (D), die ein Teil von V sein kann, die bindende Region ("joining region") (J), die konstante Region (C), die Transmembranregion (TM) und die cytoplasmatische Region (Cy).
Die nicht glycosylierten α-Ketten sind ungefähr 25 bis 30 kD (Kilodalton) schwer, während dis β-Ketten etwa gleich oder größer sind, im Bereich von etwa 25 bis 35 kD. Mit Glycosylierung weisen die Untereinheiten jeweils etwa 35 bis 50 kD, gewöhnlich jeweils 40 bis 50 kD auf, was zu einem Sulfhydryl-verknüpften Heterodimeren von 80 bis 90 kD führt.
Für jede der Untereinheiten beträgt die rekombinierte DNA in Helfer-T-Zellen, einschließlich Introns, im allgemeinen 6 bis 8kBp, wobei einzelne Exons, die wesentlich kleiner sind und annähernd die Größe von cDNA-Sequenzen für Domänen plus eventueller flankierender Regionen besitzen, umfaßt sind.
Die DNA-Sequenz, die für die konstante Region codiert (einschließlich der Transmembranregion und der cytoplasmatischen Region) wird im allgemeinen etwa 400 bis 600 Nt (Nucleotide) umfassen, plus ungefähr 300 Nt der 3'-untranslatierten Regionen. Diese Sequenzen werden dadurch charakerisiert, daß sie Kodons besitzen, die für Disulfid-Brücken zwischen Cysteinen innerhalb der Kette codieren, welche etwa 100 bis 200 Nt, gewöhnlich etwa 100 bis 150 Nt voneinander entfernt angeordnet sind.
Verknüpft mit der konstanten Region ist eine mögliche Transmembransequenz, die primär hydrophobe Aminosäuren umfaßt und etwa 45 bis 105 Nt aufweist. Diese Sequenz definiert den 3'-Terminus der konstanten Region und kann etwa 5 bis 15 Codons (15 bis 45 Nt) für Aminosäuren umfassen, welche in das Cytoplasma der Zelle hineinragen.
Die nächste Region oder Domäne, die eine funktionelle Bedeutung zu besitzen scheint, ist diejenige Region, die der J-Region von Immunglobulinen analog ist. Wie es von Immunglobulinen bekannt ist, gibt es eine Vielzahl von J-Regionen, benachbart zu einer gegebenen C-Region im Bereich einer Anzahl von etwa 1 bis 6, häufiger etwa 4 bis 5. Die J-Regionen codieren für etwa 15 bis 20 Aminosäuren, wobei die β-Kette mit 16 Aminosäuren eine größere Ähnlichkeit mit den J-Regionen der schweren Immunglobulinketten aufweist, da die J-Regionen der schweren Ketten typischerweise 17 Aminosäuren aufweisen, während die J-Regionen der leichten Kette typischerweise 13 Aminosäuren aufweisen.
Die J-Regionen können in Verbindung mit konstanten Regionen verwendet werden, welche die Transmembran-Sequenz und die cytoplasmatische Sequenz enthalten oder auch nicht enthalten können, um mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft zu werden, z. B. mit Sequenzen, die nicht vom Wildtyp sind, wobei Hybridsequenzen erzeugt werden, welche neue Hybridproteine auf Oberflächen von T-Zellen möglich machen. (Mit dem Ausdruck "nicht vom Wildtyp" ist eine Sequenz gemeint, die sich von der Sequenz des Wildtyps oder na tiven Sequenz unterscheidet, während "fremd" aus einer Quelle stammend bedeuten soll, welche normalerweise keine genetische Information mit der Quelle der DNA-Sequenz des T-Zell-Antigenrezeptors austauscht.)
Um den Transport der Hybridproteine an die Oberfläche zu ermöglichen, wird die sekretorische Leader-Sequenz, die mit dem T- Zell-Antigenrezeptor vorliegt, als 5'-Terminus verwendet. Die Sequenz besitzt etwa 15 bis 25 Aminosäuren, häufiger 18 bis 24 Aminosäuren. So können Konstrukte hergestellt werden, in denen verschiedene Domänen der DNA-Sequenz des T-Zell-Antigenrezeptors, die nicht codierende flankierende Regionen enthalten können, durch DNA, die nicht vom Wildtyp ist, getrennt sind.
Neue DNA-Konstruktionen können für das Klonieren und/oder Exprimieren des T-Zell-Antigenrezeptors, einzelner Untereinheiten, von Fragmenten davon oder von Kombinationen von Fragmenten mit DNA, die nicht vom Wildtyp ist, einschließlich fremder DNA zur Bildung von Hybridproteinen verwendet werden. Die Fragmente weisen mindestens etwa 15 Nt, gewöhnlicherweise mindestens etwa 50 Nt auf. Diese Konstruktionen werden meistens die folgende Formel aufweisen:
(RS)a-(M)b-(tis)-(eis)-(T-AgR)-(ets)-(tts)
worin:
"RS" ein Replikationssystem bedeutet, das von Prokaryonten oder Eukaryonten, Plasmiden, Phagen oder Viren stammen kann, wobei ein oder mehrere Replikationssysteme umfaßt sein können, die die Replikation in verschiedenen Wirten, beispielsweise einzelligen Mikroorganismen, und die Erhaltung als extrachromosomale Elemente ermöglichen; beispielhafte Replikationssysteme oder Vektoren umfassen Lambda, Simianvirus, Papillomavirus, Adenovirus, 2mu Hefeplasmid, ColEI, pRK290, pBR322, pUC6 oder dergleichen, wobei das Replikationssystem vollständig oder nur Teil eines Replikationssystems sein kann, welches mit einem Helferplasmid oder einem oder mehreren Genen interagiert, die im Genom vorhanden sind, z. B. COS-Zellen; für das Klonieren wird ein Replikationssystem verwendet, beispielsweise ein Plasmid-Replikationssystem oder ein virales solches System, das vom einzelligen Wirt, beispielsweise Bakterien, Hefe etc., insbesondere E. coli, erkannt wird;
"a" ist eine ganze Zahl von 0 bis 3, gewöhnlicherweise 1 bis 3, deren Wert dann 0 ist, wenn Integration in das Chromosom gewünscht wird, obwohl Integration mit nativen oder fremden Replikationssystemen erreicht werden kann.
"M" steht für ein strukturelles Gen oder Cistron, welches als Marker oder Markierung bezeichnet wird, mit seinen transkriptionalen und translationalen regulatorischen Signalen, welches Mittel zum Selektionieren von Wirtszellen, die das Konstrukt enthalten, aufweist; Marker enthalten biocide Resistenzen, beispielsweise Resistenz gegenüber Antibiotika, z. B. Ampicillin, Chloramphenicol, Neomycin, G418 oder dergleichen, Toxine, Schwermetalle etc.; Immunität, Komplementation, welche einem auxotrophen Wirt Prototrophie verleiht, oder derartiges;
"b" ist eine ganze Zahl von 0 bis 3, üblicherweise 0 bis 2, vorzugsweise 1 bis 2;
"tis" steht für die transkriptionalen Initiationssequenzen für die Regulierung der transkriptionalen Initiation und umfaßt einen oder mehrere Promotoren einschließlich des nativen Promotors selbst oder in Kombination mit anderen Promotoren, z. B. viralen Promotoren oder fremden Promotoren, wie auch Sequenzen, die auf den Promotor einwirken, beispielsweise Operatoren, Aktivatoren, Beschleuniger, Kappen-Sequenzen ("capping sequences") TATA- und CAAT-Sequenzen oder dergleichen, wobei die Sequenzen in dem Konstrukt so organisiert sind, daß sie fähig sind, ihre Funktionen auszuüben;
"eis" steht für die Expressions-Initiationssequenzen zum Regulieren der Expression und umfaßt eine beliebige ribosomale Bindungsstelle, das geeignete Initiationscodon, Oligonucleotide, die die ribosomale Bindungsstelle und das Initiationscodon trennen, wobei solche Sequenzen auf die Expression einwirken, und dergleichen;
LT-AgR" steht für den T-Zell-Antigenrezeptor oder eine hybride DNA-Sequenz, die Fragmente des T-Zell-Antigenrezeptors und hybride DNA-Sequenzen umfaßt, wobei die Sequenzen zusammen einen offenen Leserahmen bilden, der für den Antigenrezeptor oder das hybride Protein codiert;
"ets" steht für Terminationssequenzen der Expression, welche ein oder mehrere Stop-Kodons und solche anderen Sequenzen umfassen können, die sich dafür eignen; und
"tts" steht für transkriptionale Terminationssequenzen, die den transkriptionalen Terminator enthalten können, normalerweise mit dem transkriptionalen Promotor im Gleichgewicht, und die ein oder mehrere Terminatoren in Kombination mit einem oder mehreren Stop-Codons, Polyadenylations-Signalsequenz oder dergleichen sein können.
Die T-Zell-Antigenrezeptor-Untereinheit oder der hybride T-Zell- Antigenrezeptor wird in den meisten Fällen die folgende Formel aufweisen:
(S.L)c-(V-seq)-J-C-(TM)d-(Cy)e
worin:
"S.L." eine sekretorische Leader-Sequenz bedeutet, die für etwa 15 bis 25 Aminosäuren, in eher üblicher Weise für etwa 17 bis 24 Aminosäuren und vorzugsweise für etwa 19 bis 23 Aminosäuren codiert und 45 bis 75 Nt, gewöhnlich 51 bis 72 Nt, vorzugsweise 57 bis 69 Nt aufweist;
"c" 0 oder 1 ist;
"V-seq" steht für eine DNA-Sequenz, die für die variable Region der T-Zell-Antigenrezeptor-Untereinheit codiert oder durch eine Sequenz ersetzt sein kann, die für ein anderes Polypeptid codiert, wobei diese DNA-Sequenz in geeigneter Weise im Leserahmen mit der sekretorischen Leader-Sequenz (S.L.) steht oder in Abwesenheit der sekretorischen Leader-Sequenz ihr eigenes Initiations-Codon besitzen kann; die variable Sequenz wird im allgemeinen mindestens etwa 60 Nt, und nicht mehr als etwa 600 Nt, gewöhnlich nicht mehr als etwa 400 Nt aufweisen; wenn die Sequenz für eine variable Region des T-Zell-Rezeptors codiert, wird die Sequenz im allgemeinen einen Bereich von etwa 270 bis 330 Nt, gewöhnlich von etwa 285 bis 312 Nt aufweisen;
"J" steht für die bindende Region ("joining region") und wird im allgemeinen etwa 42 Nt bis etwa 60 Nt, gewöhnlich etwa 45 Nt bis 57 Nt und häufig etwa 48 bis 54 Nt aufweisen, wobei die J-Region aus einer begrenzten Anzahl von Sequenzen ausgewählt wird, die mit den Exons der bindenden Regionen ("joining regions") der T- Zell-Antigenrezeptor-Untereinheit assoziiert sind;
"TM" steht für die Transmembran-Integratorsequenz, welche eine hydrophobe Sequenz von etwa 51 bis 90 Nt, in eher üblicher Weise von etwa 84 bis 96 Nt sein wird;
"d" beträgt 0 oder 1.
"Cy" steht für die Sequenz, die sich aus der Membran heraus in das Cytoplasma erstreckt und normalerweise etwa 12 bis 30 Nt, gewöhnlich etwa 15 bis 24 Nt, insbesondere etwa 15 bis 18 Nt besitzen wird; und
"e" ist eine ganze Zahl von 0 bis 1.
Jede der beiden Untereinheiten, α- und β-, kann unabhängig von der anderen in unterschiedlichen Wirten oder im selben Wirt exprimiert werden. Wenn die beiden Untereinheiten im selben Wirt exprimiert werden, wird in Abhängigkeit davon, ob ein Mikroorganismus als Wirt oder ein Säuger-Wirt verwendet wird, dies das Prozessieren der Untereinheiten und die Zusammenfügung der Untereinheiten zum T-Zell-Rezeptor beeinflussen. Eingeschlossen in das Prozessieren ist Faltung, Glycosylierung, Transport durch das endoplasmatische Reticulum und den Golgiapparat, Spaltung unter Entfernung der sekretorischen Leader-Sequenz, wie auch das Capping oder Blockieren des N-Terminus durch Acetylierung. Als Teil des Prozessierens oder unabhängig vom Prozessieren muß das Falten der Untereinheiten und das Sich-Zusammenfügen der Untereinheiten zum T-Zeil-Rezeptor erfolgen. Bei Säugetierzellen ist es zu erwarten, daß das gebildete Protein mit dem natürliche auftretenden T-Zell-Rezeptor in seinen chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften im wesentlichen übereinstimmt. Bei niederen Eukaryonten und Prokaryonten ist es jedoch möglich, daß verschiedene Prozessierungsstufen ganz oder teilweise, unterschiedlich oder überhaupt nicht vorkommen, Deshalb können die Sequenzen durch Ersetzen der sekretorischen Leader- Sequenz des Wildtyps durch eine sekretorische Leader-Sequenz modifiziert werden, die vom Expressionswirt erkannt wird, oder sie weisen ein Initiations-Codon am Beginn der variablen Region auf. Die Untereinheiten können dann im Cytoplasma isoliert und der Rezeptor dadurch gebildet werden, daß die α- und β-Untereinheiten unter renaturierenden Bedingungen zusammengegeben werden. DNA, die für Untereinheitsfragmente des Rezeptors kodiert, sollte für ein Polypeptid von mindestens 8 Aminosäuren, gewöhnlich mindestens 15 Aminosäuren (24 Nt bzw. 45 Nt) codieren, um Polypeptide mit biologischer, beispielsweise immunologischer Aktivität bereitzustellen.
Die Konstruktionen können wie angegeben durch Insertieren von DNA hergestellt werden, die nur für einen Teil einer T-Zell-An tigenrezeptor-Untereinheit codiert, wobei der Vektor eine oder mehrere geeignete Restriktionsschnittstellen aufweist, oder sie können modifiziert werden, beispielsweise durch Adapter, um Insertion an einer passenden Stelle im Verhältnis zu einem Promotor und der assoziierten regulatorischen Sequenz, beispielsweise der RNA-Polymerase-Bindungsstelle für die Transkription, und zu geeigneten translationalen regulatorischen Sequenzen, beispielsweise ribosomalen Bindungsstellen, zu ermöglichen, oder um mit einer Leader-Sequenz im Leserahmen zu sein.
Die Domänen oder Regionen des T-Zell-Antigenrezeptors können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Wenn man cDNA einsetzt, kann man das Gen im offenen Leserahmen erhalten, der für das Präprotein codiert, also für das Protein vor dem Prozessieren, beispielsweise dem Entfernen des sekretorischen Leaders, Glykosylieren oder dergleichen. Durch Restriktionskartierung der cDNA kann man das Vorhandensein geeigneter, in Nachbarschaft zu den Grenzen zwischen den einzelnen Domänen, wie sie in der obigen Formei angegeben sind, vorliegender Restriktionsschnittstellen bestimmen. Wenn eine Restriktionsschnittstelle nicht auf der Grenze liegt, kann man noch an einer Schnittstelle in der Nähe der Grenze spalten, wobei man je nach Bedarf mit dem entsprechenden Restriktionsenzym eine entweder teilweise oder vollständige Verdauung vornimmt. Wenn Nucleotide entfernt wurden, um eine Rumpfsequenz zu erhalten, kann man das/die Nucleotid(e) ersetzen, indem man geeignete Adapter verwendet, die das Verknüpfen der in Rede stehenden Domäne an eine andere Nucleotidsequenz im richtigen Leserahmen ermöglichen. Wenn darüberhinaus Nucleotide vorhanden sind, kann man diese durch Resektion, beispielsweise unter Verwendung von Bal31, durch Primer-Reparatur oder dergleichen entfernen. Alternativ kann dann, wenn im Codon bezüglich einer bestimmten Aminosäure Degenerativität besteht, Mutagenese in vitro verwendet werden, um eines oder mehrere dieser Nucleotide zu modifizieren, die dann die passende Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym liefern würde(n). Diese Techniken sind in der Literatur ausführlich beschrieben und erfordern hier keine weitere Erläuterung.
Die DNA-Sequenzen, die verwendet werden, können identisch mit den Sequenzen sein, die gemäß vorliegender Erfindung isoliert werden, oder sich von ihnen unterscheiden. Wenn die Sequenzen der J- oder C-Domänen entweder als solche oder in Kombination mit anderen Sequenzen, z. B. Transmebransequenzen, verwendet werden, können die den Gegenstand bildenden Sequenzen als Sonden zum Bestimmen des Vorliegens homologer Sequenzen in derselben oder anderen Spezies und zum Isolieren von Sequenzen mit äquivalenten Funktionen verwendet werden. Auf diese Weise kann ein Repertoir von Sequenzen erhalten werden, das miteinander verknüpft werden kann, um eine Vielzahl von Cistrons zur Verfügung zu stellen, welche für T-Zell-Antigenrezeptoren oder für Hybrid- Proteine codieren, indem variierende Kombinationen von Fragmenten von T-Zell-Antigenrezeptoren verwendet werden.
Durch das Verknüpfen der sekretorischen Leader-Sequenz des T- Zell-Antigenrezeptors mit einer DNA-Sequenz, die nicht vom Wildtyp ist, kann man die Sekretion eines hybriden Proteins in das Nährmedium und das Prozessieren ermöglichen, so daß man ein reifes Proteinprodukt aus einem Säugetier-Wirt erhält. Wenn das Protein ein eurkaryontisches Protein ist, kann es auf geeignete Weise prozessiert werden, um ein Produkt zur Verfügung zu stellen, welches identisch oder im wesentlichen identisch mit dem natürlich auftretenden eurkaryontischen Protein ist. Alternativ kann man, wenn man spezifische Proteine auf der T-Zell-Oberfläche oder der Oberfläche einer anderen Säugetierzelle zur Verfügung stellen möchte, anstelle der Sequenzen, die für die variablen, J- und konstanten Regionen der T-Zell-Antigenrezeptoruntereinheit codieren, die für das fremde Protein codierende fremde Sequenz zwischen die sekretorische Leader-Sequenz und die Transmembran-Sequenz plazieren. Auf diese Weise kann man ein vollständig anderes Oberflächenmembranprotein auf der Zelloberfläche zur Verfügung stellen und damit die Oberflächeneigenschaften der Zelle verändern.
Durch die Verwendung der Expressionsprodukte der vorliegenden Konstrukte kann man Antikörper gegen die Expressionsprodukte gewinnen, die dann für das Auffinden des Vorhandenseins von T- Zell-Antigenrezeptoren oder individuellen Untereinheiten verwendet werden können, als Folge gemeinsamer idiotypischer Determinanten oder gewöhnlicher Determinaten für die J- oder C- Regionen.
Die klonierten ONA-Sequenzen, insbesondere derjenigen Sequenzen, die sich vom b'-Ende der C-Region zum 3'-Ende der cytoplasmatischen Region erstrecken, können als Sonden verwendet werden. Gewöhnlich werden die Sonden mindestens etwa 15 Nt, üblicherweise mindestens etwa 30 Nt aufweisen und im allgemeinen nicht über 1500 Nt, gewöhnlich nicht über etwa 1000 Nt, vorzugsweise nicht über 500 Nt hinaus an homologer Sequenz aufweisen. Weiterhin können nicht-homologe, flankierende Sequenzen vorhanden sein, die bis zu 5 kNt oder darüber lang sein können.
Die als Sonden verwendeten Nucleotidsequenzen können RNA oder DNA sein und können auf eine Vielzahl von Arten markiert sein. Üblicherweise werden Sonden mit 32P markiert, und sie können durch Autoradiographie aufgefunden werden. Alternativ können Biotin, neue Zucker oder ein beliebiges anderes Molekül mit Hilfe des Einsatzes synthetischer Techniken einbezogen werden, um die Oligonucleotide herzustellen. So kann eine beliebige terminale Gruppe auf einfache Weise eingeführt werden, um als Quelle für ein detektierbares Signal zu fungieren. Diese Gruppen können direkt oder indirekt eingeführt werden, d. h. durch kovalente Bindung, Ligand-Rezeptor-Bindung, z. B. Haptene und Antikörper, oder dergleichen. Beispielhafte Markierungen, die ein detektierbares Signal erzeugen, umfassen fluoreszierende Substanzen, chemilumineszierende Substanzen, Enzyme, radioaktive Markierungen, magnetische Teilchen und dergleichen.
Zwei verschiedene Methoden zum Gewinnen wenig vorhandener messenger-RNA wurden verwendet, um die mit den T-Zell-Antigenrezeptor-Untereinheiten assoziierten, wenig vorhandenen messenger- RNAs zu isolieren. Das für die β-Untereinheit verwendete Verfahren umfaßte das Trennen von membrangebundener polysomaler RNA von nicht membrangebundener RNA. Die membrangebundene polysomale Fraktion von RNA wurde dann revers zu einzelsträngiger (ss) cDNA umgeschrieben. Dann wurde die cDNA mit ³²P markiert und wiederholt mit B-Zell-mRNA hybridisiert und auf Hydroxyapatit fraktioniert. Verbliebene ss-cDNA, die durch die Säule durchlief, wurde isoliert. Ein zweites T-Helfer-Hybridom wurde dann verwendet, um eine cDNA-Bibliothek herzustellen, und mit den aus dem ersten T- Helfer-Hybridom hergestellten cDNA-Sonden gescreened. Das führte zu einer wesentlichen Anreichung von T-Zell-spezifischen membranassoziierten Sequenzen (etwa 200-fach).
Die verringerte Anzahl selektierter Klone wurde unter Verwendung der anfänglich hergestellten Sonden nochmals gescreened. Die positiven Klone wurden dann nick-translatiert und unter Northern- Blot-Bedingungen mit B-Zell-mRNA hybridisiert. Diejenigen Klone, die nicht mit den B-Zell-mRNAs hybridisierten, wurden als T- Zell-spezifisch selektioniert.
Die Klone wurden dann verwendet, um wie folgt somatische Rekombinationen (Rearrangements) zu untersuchen, Diejenigen, die mit RNAs mit mehr als 1000 Nt hybridisieren, wurden auf Southern Blots von genomischer DNA aus verschiedenen Quellen einschließlich eines Helfer-T-Zell-Hybridoms und eines Thymoms hybridisiert. Die DNAs wurden nach Standardmethoden hergestellt, mit einem bestimmten Restriktionsenzym verdaut, in diesem Fall mit PvuII, durch 0,9%-ige Agarose elektrophoretisiert und auf Nitrocellulose geblottet. Mäßige bis strikte Stringenz wurde angewandt, und es wurde gefunden, daß sowohl das Thymom als auch das Hybridom wesentlich andere Muster als andere nicht-T-Zell-DNA ergaben.
Das für die α-Untereinheit verwendete Verfahren umfaßte eine in der variablen Region spezifische cDNA-Sonde, subtrahiert mit 1- Zellen verschiedener Spezifitäten. Random-geprimte markierte cDNA wurde aus der mRNA eines Helfer-Hybridoms synthetisiert.
Nach dem Fragmentieren auf eine durchschnittliche Größe von etwa 300 bis 400 Nt wurden die Sequenzen mit mRNA aus mindestens 2 verschiedenen T-Helfer-Hybridom- oder T-helferartigen Lymphom- Linien subtraktiv hybridisiert, wobei Hydroxyapatit verwendet wurde, um einzelsträngige von doppelsträngiger Nucleinsäure zu trennen. Die verbliebene einzelsträngige cDNA wurde dann mit einer cDNA-Bibliothek hybridisiert, die aus der die ursprüngliche cDNA liefernden Zell-Linie hergestellt worden war. Weiteres Eliminieren von irrelevanten Sequenzen kann durch erneutes Screening der positiven Klone mit oligo-dT-geprimter cDNA vom selben T-Helfer-Hybridom erzielt werden, wobei die cDNA aus membrangebundener polysomaler mRNA, welche mit mRNA aus einem Makrophagen oder einer anderen Lymphozyten-Linie subtraktiv hybridisiert wurde, revers transkribiert ist. Es wurde gefunden, daß die hybridisierenden Klone Verwandtschaft mit der variablen Region des T-Zell-Rezeptors aufweisen.
Unter Verwendung von Hybrid-DNA-Technologie können die α- und β- Untereinheiten einzeln oder zu einem Rezeptor kombiniert hergestellt werden, der hohe Spezifität und Affinität für spezifische Konformationen organischer Moleküle besitzt, beispielsweise Polypeptide, Polysaccharide, Lipide, Haptene und Kombinationen davon. Analog zu den Immunglobulinen wird eine Klasse von Rezeptoren bereitgestellt, die in im wesentlichen gleicher Weise eingesetzt werden kann, der jedoch mit Immunglobulinen verbundene Eigenschaften fehlen, beispielsweise Fc-Determinanten, komplementassoziierte Cytotoxizität oder andere Eigenschaften, die spezifisch mit Immunglobulinen verbunden sind. Die vorliegenden Rezeptoren können verwendet werden, um in vivo im Blut mit oberflächenmembrangebundenen T-Zell-Rezeptoren zu kompetitieren, um die Proliferation von durch das homologe Antigen aktivierten Helferzellen zu inhibieren.
Die T-Zell-Rezeptoren können in den meisten der Situationen verwendet werden, in denen Immunglobuline Anwendung finden, beispielsweise in diagnostischen Bestimmungen, Affinitätschromatographie, Schnittstellen-gerichteter Therapie oder Diagnose, wo bei der T-Zell-Rezeptor direkt oder indirekt mit Radionucliden, NMR-aktiven Verbindungen, fluoreszierenden Substanzen, Toxinen, z. B. Abrin, Ricin etc. oder dergleichen verbunden sein kann. Durch die Verfügbarkeit der Gene für die α- und β-Ketten können die Ketten und deshalb die Rezeptoren in großen Mengen aus anderen Zellen als menschlichen Zellen hergestellt werden, die bezüglich ihrer Wachstumsbedürfnisse weniger heikel sind als menschliche Zellen. Die T-Zell-Rezeptoren können in Bakterien, z, B. E. coli, B. subtilis etc., in Eucaryonten, z. B. in Hefe, Fadenpilz, Mäusezellen, etc. hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung und nicht zur Einschränkung vorgebracht:

Experimentelles

Das Verfahren zur Genisolierung von Genen, die für die Antigenspezifischen Rezeptor-Untereinheiten α- und β- (TH-Ag-Rezeptor, α- oder β-Untereinheit) von Helfer-T-Zellen kodieren, ist das folgende:
Die Isolierung der β-Untereinheit soll zuerst erörtert werden. Sonden von Membran-gebundener cDNA aus T-Nelfer-Zellen wurden mit B-Zell-messenger-RNA subtraktiv hybridisiert und verwendet, um eine cDNA-Bibliothek durchzutesten, die das Produkt einer anderen TH-B-Zell-Lymphomkombination war. Die Bibliothek wurde wie unten für eine B-Zell-spezifische Bibliothek beschrieben (Davis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (im Druck)) und nach einem ähnlichen Verfahren für eine für das Embryonalstadium von Xenopus spezifische Bibliothek (Sargent und Dawid, Science (1983) 222: 135-139) unter Verwendung von TH-Hybridomen M12 oder 2B4 (Hedrick et al., Cell (1982) 30: 141-152) konstruiert. Die B- Zell-mRNA wurde aus den B-Zell-Lymphomen L10A und Ba117 gewonnen (Kim et al., J. Immunol. (1979) 122: 549-554). Die cDNA wurde für die Detektion ³²P markiert. Die TH-B-Bibliothek war an T-Zellspezifischen Sequenzen 20-fach angereichert, gefolgert aus der Tatsache, daß 95% cDNA-Masse in der Subtraktion auf der Hydroxyapatit-Stufe entfernt wurde.
(Das beispielhafte Verfahren für die B-Zell-Bibliothek folgt. Die Zelllinien Ba117, B-Zell-Lymphom (IgM&spplus;IgD&spplus;Ia&spplus;) (Kim et al., J. Immunol. (1979) 122: 549-554) und Ba14, T-Zell-Thymom (Thy1&spplus;Lyt1&supmin;Lyt2&spplus;TL&spplus;) (Kim et al., ibid. (1978) 121: 339-344) wurden in RPMI, Glutamin, 70%-igem fötalem Kälberserum und 5 · 10&supmin;&sup5; M β-Mercaptoethanol in einer 5%-igen CO&sub2;-Atmosphäre gezüchtet. Nach dem Heranwachsen zu einer hohen Dichte (1-2 · 10&supmin;&sup6; /ml), aufgefrischt mit neuen Medien für 2 bis 4 Stunden, wurden die Zellen mit PBS abgeschreckt und geerntet. Die Zellen wurden mehrmals in kaltem PBS gewaschen, in 0,14 M KCl, 0,02 M Tris, pH 8,0, 0,0015 M MgCl&sub2; resuspendiert, unter Zusatz von NP-40 auf 1% lysiert, und die Nuclei wurden pelletisiert. Die cytoplasmatische Fraktion wurde auf 0,5% SDS, 5 mM EDTA gebracht und 2-3 · mit gesättigtem Phenol, einmal mit Sevag (CHC1&sub3; : Isoamylalkohol 24 : 1) extrahiert, mit Ethanol gefällt (Mushinski et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA (1980) 77: 7405-7409), und die polyA&spplus;-RNA wurde auf oligo-dT-Cellulose selektiert (1-2 Passagen).
cDNA aus dem B-Zell-Lymphom wurde aus 1 bis 5 ug eines polyA&spplus;- RNA-Templates in 50 mM Tris, pH 8,3, 6 mM MgCl&sub2;, 70 mM KCl, 1 mM von jeweils dNTP, ³²P-dCTP unter Erreichen einer Erststrang-Spezifität von 10&sup5; cpm/ug), 10 ug/ml oligo-dT, 20 mM Dithiothreitol, 100 ug/ml Actinomycin "D" in einer 100 ul fassenden Reaktionsmischung synthetisiert. Zehn Einheiten AMV-reverse Transkriptase wurden pro ug polyA&spplus;-RNA zugesetzt, und es wurde 2 Stunden lang bei 42ºC inkubiert. Nach dem Zugeben eines gleichen Volumens 0,2 M NaOH wurde die Mischung 20 Minuten lang bei 70ºC inkubiert, auf Eis gekühlt, mit 1 M HCl und Natriumacetat (pH 6,5) neutralisiert, und es wurde SDS auf 0,2 M bzw. 0,1% zugegeben. Bei Raumtemperatur wurde die cDNA von G-50F-Sephadex in einer Pasteurpipettensäule mit einem Durchlaufpuffer von 100 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA und 0,02% SDS ausgeschlossen. Fünfzig ug tRNA wurden als Träger zugesetzt, und die cDNA wurde in einem silanisierten Eppendorfröhrchen (1,5 ml) ausgefällt, Das Präzipitat wurde einmal mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 0,5M Phosphatpuffer, 5 mM EDTA, 0,1% SDS resuspendiert und in verschlossenen Glaskapillaren mit der T-Zell-Thymom-RNA in 10-fachem Überschuß mit 1 bis 1,5 mg/ml hybridisiert. Um repetitive Sequenzen zu absorbieren, wurde genomische DNA von der Maus (1,2 mg/ml, 10 ug pro Reaktion), die einer Scherung unterworfen worden war, zugesetzt. Nach 60-sekündigem Kochen wurde die Mischung 16 bis 20 Stunden bei 60ºC inkubiert. Hydroxyapatit-Chromatographie wurde dann verwendet, um das Material in 0,12 M Phosphatpuffer, 0,1% SDS, 60ºC zur fraktionieren.
Die einzelsträngige Fraktion wurde mit DNA-Polymerase I (Klenow- Fragment) doppelsträngig gemacht, mit S1 Nukease passend gerichtet und G-C-schwanzendig in die PstI-Schnittstelle von pBR322 eingeführt. Dann wurden die Plasmide in E. coli mit hoher Effizienz kloniert (50-400 · 10³ ug/Insert) mit einer durchschnittlichen Insert-Größe von etwa 500 Nt.)
Die Bibliothek von 5000 selektionierten Klonen wurde mit Hilfe von Standardverfahren (Maniatis et al. in Molecular Cloning, Cold Spring Habour Press, Cold Spring Habour, 1982) gescreened und wieder gescreened, wobei die Sonden aus membrangebundener T- Helferzell-cDNA aus dem T-Hybridom 284 verwendet wurde, von welcher Sequenzen, die den B-Zell-Messengers aus der B-Zelle L10A eigen sind, subtrahiert worden waren (MBT2B4-BL10A). Fünfunddreißig definitiv Positive resultierten, was etwa 10% der Bibliothek entsprach. Um zu bestimmen, welche vom selben Gen stammten und welche unterschiedlich waren, wie auch um nur Falschpositive zu entfernen, wurde jeder dieser Plasmid-Klone nick-translatiert und auf repräsentative Northern-Blots hybridisiert. Fünf waren mit B-Zell-mRNA reaktiv, und die übrigen 30 ordneten sich unter eines der 10 unterschiedlichen Muster an mRNA-Größe und Expression, die in der folgenden Tabelle dargestellt sind. TABELLE
* T-Hybridom, 2B4 und C10; T-Lymphom, Ba14 und Ba113; B-Lymphom, L10A und Ba117.
TM8 ergab eine starke Kreuzhybridisierung mit einem thy-1 cDNA- Rattenklon. thy-1 ist ein klassisches T-Zellmembran-Antigen.
Nun wurde eine cDNA Bibliothek aus dem Hybridom 3.3T hergestellt (Heber-Katz et al., oben).
Jeder der sieben Klone, der mit Messengers von mindestens 1000 Nt hybridisierte, wurde markiert und mit genomischen Southern- Blots hybridisiert, die aus DNA des Thymoms BW5147 (des Mäusestamms AKR, Heber-Katz et al., oben), AKR-Leber, der antigenspezifischen T-Zelle 2B4 (einer Fusion von T-Zellen aus B10.A-Mäusen mit BW5147) und 810.A-Leber zusammengesetzt waren. Die DNAs wurden nach Standardmethoden hergestellt (Maniatis et al., oben), mit einem Restriktionsenzym, PvuII, verdaut, durch 0,9% Agarose elektrophoretisiert und auf Nitrocellulose geblottet. Die Autoradiogramme der Southern-Blots zeigten, daß mit Ausnahme des Restriktionspolymorphismus zwischen AKR und B10.A, den man mit TM8 (thy-1) beobachtete, die Hybridisierungsmuster mit jedem Klon bei allen DNA-Quellen identisch waren, mit Ausnahme des Falles TM86. Dort gab es im Vergleich zu Leber-DNA aus einem der beiden Elternstämme ein auffällig anderes Muster der PvuII- Fragmente, die mit dem Klon von jeweils entweder BW5147 oder 2B4 hybridisierten. Die Klone, die beobachet wurden, wurden auch mit EcoRI- und HindIII-Verdauungen genomischer DNA hybridisiert, und es zeigte jeweils nur TM86 einen signifikanten Unterschied zwischen den T-Zell-DNAs und Leber-DNAs. Der TM86-Klon kann mit PstI aus pBR322 herausgeschnitten werden.
Um zu testen, ob die genomischen Rearrangements eines Rezeptorgens spezifisch bzw. einzigartig für T-Zellen verschiedener Antigen-Spezifitäten sind, wurden genomischen Blots, bestehend aus DNA von 5 Antigen-spezifischen T-Zell-Hybridomen, mit einem nick-translatierten Insertionsstück aus Klon TM86 hybridisiert. Die Ergebnisse waren, daß DNA aus jeder dieser Antigen-spezifischen T-Zellen ein spezifisches bzw. einzigartiges Muster lieferte. Drei verschiedene B-Zell-Lymphom-Tumor-DNAs lieferten mit denen aus der Leber identische Muster, was anzeigt, daß das Rearrangement offensichtlich für die T-Zellen einzigartig bzw. spezifisch ist.
Auch eine Reihe von cytotoxischen Linien exprimieren messenger- RNAs, die denen von T-Helferzellen ähnlich sind (durch Kreuzreaktion mit den hier beschriebenen Genen) und weisen ebenfalls Rekombination ihrer genomischen DNA auf.
Um andere cDNA-Klone zu erhalten, die unabhängig aus verschiedenen T-Lymphozyten stammten, wurde eine Thymozyten-cDNA-Bibliothek hergestellt, wobei der lambda-Vektor gt10 verwendet wurde (im allgemeinen zu beziehen von Ronald Davis, Stanford Univer sity, Stanford, California). Die Bibliothek wurde unter Einsatz von Standardbedingungen (Maniatis et al. in Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Press) Cold Spring Harbor, New York (1982)) mit dem TM86-Klon gescreent. Die Bibliothek wurde aus der gesamten Thymozyten-polyA&spplus;-RNA von jungen Mäusen des Balb/C-Stammes konstruiert. Die cDNA wurde mit Hilfe AMV-reverser Transcriptase (Amersham) hergestellt. Die cDNA wurde nicht methy- Viert, was die Erklärung für die Spaltung innerhalb der mRNA-Sequenz auf der 3'-Seite ist. Nach dem Auffüllen mit DNA-Polymerase I wurden an jedes Ende EcoRI-Linker gebunden. Die resultierenden Fragmente wurden dann in den gewünschten Größenbereich fraktioniert und in die einzige EcoRI-Restriktionsschnittstelle insertiert, die im Phagen-Repressor-Gen des lambda-Vektors gt10 vorhanden ist. Das Einführen eines DNA-Fragments in das Repressor-Gen erzeugt cV-Phagen, der einen klaren Plaque bildet. Der cI&spplus;-Phage bildet einen trüben Plaque, was die Selektion des Hybridphagen erlaubt. Um den Stammphagen aus den gt10-Bibliotheken zu entfernen, war der eingesetzte bakterielle Wirt Ceoork mk&spplus;hfI, auf dem der Stammphage mit nur geringer Wirksamkeit Plaques bildet. Der clt-Stammphage wird supprimiert, während der cI-Hybridphage normal plattiert.
Positiv hybridisierende Rekombinanten wurden in die EcoRI- Schnittstelle von pUC9 (Viera und Messing, Gene (1982) 19: 259- 268) subkloniert. Drei Thymus-derivierte Klone wurden erhalten und mit 86T1, 86T3 und 86T5 bezeichnet. Eine Teilrestriktionskarte ist in Fig. 1 dargestellt. Die Moleküle der 86T-Serie enden alle an derselben 3'-Position in Folge einer internen EcoRI- Erkennungsstelle nahe bei dem 3'-Ende der kodierenden Sequenz. Die Variation am 5'-Ende ist wahrscheinlich verursacht durch eine ungeordnete (random) Kettentermination während der Bibliothekskonstruktion.
Basierend auf der Tatsache, daß die längste mRNA, die in Northern Blots zu sehen ist, 1300 Nt aufweist, liefert das Subtrahieren eines polyA-Schwanzes von 150-250 Nucleotiden eine erwartete Klongröße von 1050-1150 Nt. Daraus kann der Schluß gezo gen werden, daß die Länge von 938 Nucleotiden von 86T1 den größten Teil der Sequenz der codierenden Region für ein Thymozyten-Molekül enthalten sollte. 86T1 wurde vollständig sequenziert und mit den Teilsequenzen der anderen Klone wie in Fig. 2 dargestellt verglichen.
Auf der Grundlage der Vergleiche läßt sich eine Anzahl von Schlußfolgerungen ziehen: (1) Keine zwei 5'-Enden unter den vier cDNA-Klonen sind einander ähnlich, doch besitzen alle identische 2'-Enden, mit Ausnahme der Darstellung in Fig. 1. Die gesamte konstante Region von 86T3 wurde sequenziert und erwies sich als identisch mit der für 86T1 gezeigten, mit Ausnahme eines Nucleotids. Diese Struktur mit 5'-variabler'und 3'-konstanter Region ist analog zu Immunglobulin-cDNA-Klonen. (2) Direkt im Anschluß an das Methionin-Initiationskodon erstreckt sich ein Bereich von hydrophoben Aminosäuren, der dem vermutlichen Leader-Polypeptid entspricht. Insbesondere die Sequenz Leu-Leu-Leu ist den Leader- Polypeptiden in leichten Kappa-Ketten eigen. (3) Ein 16 Aminosäuren langes Element zwischen der variablen und der konstanten Region ist auf der Nucleotid-Ebene Teil von sowohl 86T1 als auch von 86T5, jedoch nicht von 86T3 oder TM86, was eine unabhängige Assortierung der J-artigen Region nahelegt. (4) Die Anordnung von Cystein und anderen Resten legt eine signifikante strukturelle Ähnlichkeit zu Immunglobulinen und verwandten Molekülen nahe. (5) Die offensichtlich variable Region von 86T3 scheint wegen der vielen (fünf) Stop-Codons innerhalb des Leserahmens mit der ansonsten normalen konstanten Region nicht funktionell zu sein, und tatsächlich besitzt dieser Klon Stop-Codons im Leserahmen, was zeigt, daß nicht alle Transkripte dieses Gens erfolgreich ein lebensfähiges Molekül produzieren, zumindest im Thymus.
Um die Sequenz dieses cDNA-Klons auf seine evolutionäre Verwandtschaft mit bekannten Proteinen hin zu analysieren, wurde die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz mit der Dayhoff-Proteinsequenz-Datenbank verglichen, wobei das schnelle Vergleichsprogramm von Wilbur und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80: 726-730, verwendet wurde. Aus der Dayhoff-Bank von annähernd 2300 Sequenzen ergab sich, daß die Homologien von 25 Sequenzen größer als oder gleich groß wie fünf Standardabweichungen von der mittleren Homologie der Datenbank waren. Unter diesen 25 Sequenzen waren 24 Immunglobulinsequenzen aus der konstanten oder variablen Region, und eine war ein menschliches Histokompatibilitätsmolekül der Klasse II. Darüberhinaus liegen Matches im variablen Teil von 86T1 mit variablen Regionen von Immunglobulinen vor, während jene im konstanten Teil mit konstanten Regionen von Immunglobulin matchen. Von 18 invariablen Resten in den variablen kappa-Regionen der Maus (Kabat et al., oben) finden sich 13 in der Sequenz von 86T1, und unter den zehn invariablen Resten der variablen Regionen der schweren Kette finden sich sechs in 86T1. Der Abstand zwischen den Cystein-Resten, der die Disulfid-Loops der variablen Immunglobulin-Regionen bildet, beträgt typischerweise 65 Aminosäuren für sowohl die leichten kappa- als auch die leichten lambda-Ketten und 70 Aminosäuren für diejenigen der schweren Ketten. Der Abstand zwischen den äußersten beiden Cysteinen der variablen Region von 86T1 ist ein Zwischenstück von 68 Aminosäuren. Die Anordnung der verschiedenen Immunglobulin-V-Regionen erlaubt die Voraussage, daß das Leader-Peptid von 86T1 direkt vor dem Asparagin in Position 20 gespalten werden wird.
Ausgesprochene Homologie zu Immunglobulinen wurde durchgehend dort beobachtet, wo sich wahrscheinlich die Domäne der ersten konstanten Region befindet, insbesondere rund um das Cystein in Postion 164. In dieser Region war es interessant zu bemerken, daß die unmittelbar in 5'-Richtung auf das Cystein folgende Sequenz homolog zu leichten Ketten und die Sequenz in 3'-Richtung zu schweren Ketten ist. Rund um das letzte Cystein (Position 260) in der 86T1-Sequenz wird auch substantielle Homologie zu sowohl den leichten kappa- als auch den leichten lambda-Ketten beobachtet.
Bei den vier Klonen finden sich 16 Aminosäuren sowohl in 86T1 als auch 86T5, nicht aber in den anderen beiden sequenzierten Klonen 86T3 und TM86. Diese Homologie fällt präzise in den Bereich, der in Immunglobulinen von den Elementen der Bindungsregionen ("joining region") (J) besetzt ist. Die vermutliche J-Region von sowohl 86T1 als auch TM86 zeigt wesentliche Homologien mit allen J-Regionen von Immunglobulinen. Größenordnungsmäßig sind die vermutlichen J-Regionen mehr den schweren Ketten (mit durchschnittlich 17 Aminosäuren) als den leichten Ketten (13 Aminosäuren) verwandt.
Zusätzlich zum J-Element weist die benachbarte 5'-Region zwischen den Aminosäuren 103-115 wesentliche Homologie zwischen 86T5 und TM86 auf. Insbesondere die 17 Nucleotide und 9 Nucleotid-Identitäten zwischen diesen zwei dDNA-Klonen läßt andere mögliche "Mini-Gen"-Elemente vermuten, die möglicherweise der D- Region der schweren Immunglobulin-Ketten analog sind. Alternativ können diese Homologien einige hochkonservierte Bereiche von in der variablen Region verwandten Genen repräsentieren.
Ein Hydropathizitäts-Plot (Kyte und Doolittle, J. Mol. Biol. (1982) 157: 105-132) wurde durchgeführt und zeigte an, daß: das 86T1-Molekül die alternierenden hydrophob-hydrophilen Bereiche aufweist, die für globuläre Proteine charakteristisch sind; das vorausgesagte Leader-Polypeptid in einer hydrophoben Umgebung auftritt; eine die transmembrane Region umspannende Region am Ende der 86T1-Sequenz indiziert ist, gefolgt von einer Aufreihung positiver Ladungen (lys-arg-lys), charakteristisch für den cytoplasmatischen Teil einer Anzahl von Oberflächenmarkern von Lymphozytenzellen.
Als Schlußfolgerung besteht die Struktur von 86T1 aus einem Leader-Polypeptid von 19 Aminosäuren, einer 98 Aminosäuren langen variablen Region, einer 16 Aminosäuren langen J-Region und einer einzelnen globulären Domäne als konstanter Region, gefolgt von transmembranalen und cytoplasmatischen Teilen. In Analogie zu Immunglobulinen sollten die zwei äußersten Cysteine in jeder globulären Domäne verknüpft sein, und das letzte Cystein in Po sition 260 sollte an die andere Kette des Rezeptor-Heterodimeren gebunden sein.
Es wurde weiterhin gefunden, daß gegen synthetische Peptidfragmente von 86T1 erzeugte Antiseren in signifikanter Weise die Antigen-abhängige Freisetzung von IL-2 durch T-Helfer-Hybridome inhibieren können. Es wird deshalb geschlossen, daß der oben beschriebene Locus den Typus eines Immunglobulin-Gens repräsentiert, auf spezifische Weise rekombiniert (rearrangiert) und exprimiert in zumindest einem Subset von T-Lymphozyten, und daß er eine Rolle bei der Erkennung von Antigen durch T-Zellen spielt.
Die Isolierung und Charakterisierung der α-Einheit des TH-Ag-Rezeptors wird im folgenden beschrieben. Verfahren, die voranstehend bei der Isolierung und der Charakterisierung der β-Untereinheit beschrieben wurden, werden nicht wiederholt werden.
Kalbsthymus-DNA wurde verwendet, um mit Hilfe von Standardverfahren (Maniatis et al., oben) ³²P-markierte "random prime" cDNA aus cytoplasmatischer polyAt-284-mRNA zu synthetisieren. Die cDNA besaß anfänglich eine durchschnittliche Länge von 700 Nt, und man ließ sie durch Autoradiolyse über eine 2-wöchige Periode hinweg auf etwa 300-400 Nt Länge fragmentieren. Subtraktive Hybridisierung wurde dann durchgeführt, wobei Hybridisierung und Hydroxyapatit-Selektion mit TH Hybridom-C10-mRNA und im Anschluß daran mit mRNA aus der TH-artigen Lymphom-Zellinie EL-4 verwendet wurde. Die zweimal verkürzte Sonde wurde dann auf einen Filter mit einer 284-cDNA-Bibliothek im Vektor lambda-gt10 hybridisiert. Es wurden ungefähr 20.000 Plaques durchgetestet. Sieben Positiva wurden aufgenommen und mit einer Sonde von oligo-dT-geprimter cDNA, hergestellt aus membrangebundener polysomaler mRNA aus 2B4, subtraktiv hybridisiert mit mRNA aus der P388D1-Makrophagenlinie (MBT*"-Mac) nochmals gescreent. Drei der sieben Positiva waren mit der MBT*H-Mac-Sonde positiv, und zwei von diesen dreien waren untereinander kreuzreaktiv. Einer der kreuzhybridisierenden Sonden wurde mit TT11 bezeichnet und für weitere Untersuchungen ausgewählt. Der cDNA-Klon TT11 wurde durch Nick-Translation markiert und auf ein Northern-Blot mit einer Anordnung von mRNAs in Feldern wie folgt hybridisiert: a) Ba117, B-Zell-Lymphom; b) M104e Plasmacytom; c) 3T3, Fibroblastenlinie; d) P338Di, Makrophagenlinie; e) 2B4; f) EL-4; g) BW5147. Alle diese sind cytoplasmatische polyAt-RNAs, hergestellt nach Standardverfahren. Eine einzelne Bande wurde bei etwa 1,8 kB für 284 beobachtet, während für EL-4 zwei Banden beobachtet wurden, eine schwächere Bande bei 1,8 kB und eine zweite Bande bei 1,3 kB in der EL-4-Spur.
Um zu zeigen, daß das für die Sequenz von TT11 codierende Gen wie das Ergebnis eines Rearrangements (angeordnet) war, wurden genomische DNAs aus den Lebern verschiedener Mäusestämme, verschiedene T-Zellinien und Hybride des B-Zellen-Lymphoms L10A mit a) HindIII, b) EcoRV; c) XbaI; d) BglII verdaut und durch 0,7% Agarose elektrophoretisiert, auf Nitrocellulose geblottet und mit Hilfe von Standardverfahren auf eine Sonde der 5'-Hälfte von TT11 (EcoRI-EcoRV, Fig. 3) hybridisiert. Zwei der Spuren, bezeichnet mit FN1 und FN13, stammten aus KLH-reaktiven TH-Hybridomen, die vom Mäusestamm BALB/c x C57B/6 und der Thymom-Linie BW5147 des AKR-Stamms abgeleitet waren. Eine neue Bande erscheint in einer HindIII-Verdauung von FN1 in Hinblick auf die Stamm-DNAs, während eine Bande in einer EcoRV-Verdauung von AKR- Leber-DNA in BW5147 verschwindet, und eine EcoRI-Verdauung zeigt eine neue Bande, die in BW5147 in Gegenüberstellung zur elterlichen Leber-DNA auftaucht. Es werden zwei Banden beobachtet, die für eine XbaI-Verdauung von C57B/6-DNA polymorph sind. Diese Banden sind beide im FN1-Hybrid vorhanden, jedoch erscheint nur eine in FN13, was nur das Ergebnis eines Rearrangements oder einer Teildeletion des Chromosoms sein könnte. Eine neue Bande in FN1 im Vergleich zu den Stamm-DNAs wird bei einer BqlII-Verdauung beobachtet. Obwohl in allen T-Zell-DNAs keine einzige Verdauung den Beweis eines Rearrangements liefert, gibt es genügend Anhaltspunkte für solche Ereignisse, um zu glauben, daß TT11 ein Gen von der Art des T-Zellrezeptors ist.
Der TT11-cDNA-Klon wurde nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert, Meth. Enzym: (1980) 65: 499-560, teilweise sequenziert, wobei die in Fig. 3 dargestellten Strategien und die in Fig. 3 dargestellten Sequenzen verwendet wurden. Der Klon wurde mit Hilfe eines polyA-Abschnitts (etwa 150 Nt) am 3'-Ende ausgerichtet, und das Sequenzieren der 5'-Hälfte ergab einen langen offenen Leserahmen von 810 Nt mit einem Initiationscodon (ATG) innerhalb der ersten 12 Nt. Diese Sequenz besitzt Regionen, die der Leader-Region, der variablen Region, der bindenden ("joining") (J-Region) und der konstanten Region von Ig ähnlich sind, genauso wie die β-Kette des T-Zellrezeptors und der HDS4-Gen- Klon von Saito et al., Nature (1984) 309: 757-762.
Merkmale der Sequenz sind ein weiteres Cystein außerhalb der vermutlichen innerhalb der Domäne befindlichen Cysteine in der konstanten Region (den letztgenannten beiden T-zellspezifischen Genen eigen), gefolgt von einer Transmembran-Region und einer cytoplasmatischen Region, die alle als separate Exons in den Genen der β-Kette codiert sind. Es gibt vier potentielle N-verknüpfte Glycosylierungsstellen, ähnlich den vier oder fünf Stellen, die in verschiedenen β-Kettensequenzen gefunden wurden. Es scheint so, daß nur drei dieser vier potentiellen Stellen für die Glycosylierung verfügbar sind, da die am weitesten carboxyterminal Gelegene in der Transmembran-Region eingebettet ist.
Die exakte Position für das Prozessieren der T-Zell-Rezeptor-α- Untereinheit ist bisher nicht gesichert worden, doch in Analogie zu Immunglobulin-Typen sollte sie direkt vor dem Glutamin bei +1, gezeigt in Fig. 3, angeordnet sein. Alternativ würde auf der Grundlage der N-terminalen Aminosäuresequenz der menschlichen β- Kette aus der REX T-Zellinie (Acuto et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 3851-3855) der Prozessierungspunkt direkt vor dem Asparagin bei +3 liegen. An der ersten Stelle würde das Molekulargewicht 27,8 kD betragen, was mit dem von Allison et al. beobachteten Molekulargewicht übereinstimmt, der aus einer Mäuse-α-Kette, die mit endo F von N-verknüpften Zuckern befreit war, ein Molekulargewicht von 27 kD erhielt.
Die Gesamthomologie mit den V- und C-Regionen von Ig-Gegenstücken ist realtiv gering (10-26%). Es sind jedoch viele der konservierten Reste vorhanden, die sich in allen fünf bekannten Ig-artigen Genen finden, insbesondere in den Elementen der V-Region und der J-Region. Der Abstand der Cysteine in der variablen TT11-Region beträgt 65 Aminosäuren, was identisch mit dem in den leichten Ketten ist, und die Sequenzen "WYRQ", die bei Rest 35 beginnt, und "DSA-Y-CAV" bei den Resten 83-91 sind ebenfalls in den meisten I-, G- und T-Zellrezeptor-V-Regionen konserviert. Wie es bei der β-Kette und HDS4 der Fall ist, ist die J-Region der am meisten konservierte Teil mit 7/16 Resten, die zur Consensussequenz der β-Kette (Gascoigne et al., Nature (1984), 310: 387-891) homolog sind, und 9/16 identisch mit JT3 (Gascoigne et al., oben). TT11 besitzt die Sequenz "ILLLK" in der Transmembranregion, charakteristisch für T-Zell-Rezeptorsequenzen, während die Konservierung einer geladenen Aminosäure (Lysin oder Arginin) in einer Transmembran bei anderen Mitgliedern der Immunglobulin-Superfamilie ungewöhnlich ist und nicht gefunden wird.
Während sie nicht gesichert werden konnte, scheint es doch eine starke Stütze für die Vermutung zu geben, daß in der a-Untereinheit eine D-Region vorhanden ist. Insbesondere gibt es gerade 5' zu der "SGN"-Aminosäuresequenz der J-Region (die die 5'-Grenze von JT3 im β-Genkomplex markiert) eine Nucleotidsequenz "GGGGG". Dies ist für D-Genregionen der β-Untereinheit charakteristisch, wo 7 von 14 Abfolgen von zwischen 3-7 Gs auf ihrer 3'-Seite enthalten (Tonegawa, Nature (1983) 302: 575-581). Die früher beschriebenen Werte für Northern-Blots unterstützen weiterhin die Vermutung des Vorhandenseins einer D-Region. Die beiden Banden, die in der EL-4-Spur deutlich sichtbar sind und in anderen TH- Linien beobachtet werden, sind charakteristisch für das DJC- Transcript der β-Kette, die um 300 Nt kürzer als das VDJC-Transcript ist (Kavaier et al.; Nature (1984) 310: 421-423).
Um den Anteil der mRNAs für die α- und β-Untereinheiten zu bestimmen, wurden Thymozyten-, mit conA (Concanavilin A) stimulierte Milzzellen- und 2B4-cDNA-Bibliotheken mit TT11, HDS4 und CTβ-Sonden durchgemessen. Während TT11 und CTβ in ungefähr ähnlicher Häufigkeit vorhanden sind, 1 : 1-1 : 3 in den 284- bzw. conA-Milz-Bibliotheken, ist HDS4 viel seltener. Eine merkliche Änderung im Verhältnis von TT11 zu β-Kette in unreifen im Vergleich zu reifen T-Zellen wurde beobachtet, was nahelegt, daß die TT11-Genexpression nach der Expression der β-Kette erfolgen könnte, analog zur Expression der leichten Kette von Immunglobulin in B-Zellen, der die der schweren Kette folgt.
Aus den obigen Ergebnissen geht hervor, daß neue DNA-Sequenzen und Konstrukte zur Verfügung gestellt werden, die die Expression von T-Zell-Antigenrezeptoren, Untereinheiten und Fragmenten davon ermöglichen. Die DNA-Sequenzen können auf eine Vielzahl von Arten verwendet werden, um hybride Proteine herzustellen, die als Oberflächen-Membranproteine erhalten werden können, sie können markiert werden, um als Sonden für die Bestimmung des Ursprungs oder der Art von Lymphozyten zu dienen, zum Isolieren von DNA-Sequenzen aus T-Zellen, für die Verwendung als Primer zur Herstellung von DNA-Sequenzen, die für die T-Zell-Rezeptor- Untereinheiten codieren, oder für die Verwendung für die Sekretion fremder Proteine aus einer Säugetier-Wirtszelle. Die Peptide können für die Herstellung von Antikörpern zum Isolieren von T-Zell-Antigenrezeptoren, zum Entfernen von T-Zellen aus Zellmischungen, für die Identifizierung von T-Zellen oder für die Bindung an T-Zellen in vivo oder in vitro verwendet werden, um deren Lebensfähigkeit, Proliferation, Sekretion von Faktoren oder dergl, zu beeinflussen.
Obwohl die voranstehende Erfindung durch Erläuterungen und Beispiele zum Zweck der Deutlichkeit des Verständnisses in gewissen Einzelheiten beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß bestimmte Änderungen und Modifizierungen innerhalb des Rahmens der beigefügten Ansprüche ausgeführt werden können.

Claims

1. Isoliertes Peptid oder Polypeptid, das T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit-Aktivität hat, umfassend mindestens 8 aufeinanderfolgende Aminosäuren einer T- Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit, wobei die Untereinheit

dadurch gekennzeichnet ist, daß

(i) sie von T-Zell-spezifischer mRNA

exprimiert wird;

(ii) sie von einer Nukleinsäure kodiert wird, die einer T-Zell-spezifischen Umordnung unterliegt; und

(iii) sie von einer Nukleinsäure kodiert wird, die unter Standardbedingungen mit einer Sonde hybridisierbar ist, welche mindestens 30 Nukleotide der konstanten Region, wie sie in Fig. 2 dargestellt ist, von Kodon 134 bis Kodon 306 oder eine dazu komplementäre Sequenz umfaßt;

unter der Voraussetzung, daß das Peptid oder Polypeptid kein isoliertes Polypeptid ist, das

(a) mindestens 312 Aminosäuren umfaßt und

(b) Teil eines Säugetier-T-Zell-Antigenrezeptors ist, und

(c) durch eine Nukleinsäure kodiert wird, die mindestens 936 Nukleotide umfaßt, wobei die Nukleinsäure

(i) DNA ist, die die folgende Desoxyribonukleotid-Sequenz mit 174 Resten umfaßt:

oder

(ii) RNA ist, die eine Ribonukleotid-Sequenz mit 174 Resten umfaßt, die der oben in (i) definierten Desoxyribonukleotid-Sequenz mit 174 Resten entspricht, oder

(iii) mit einer Nukleinsäure, wie sie oben in (i) oder (ii) definiert ist, oder dem Komplement derselben hybridisierbar ist.

2. Isoliertes Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit-Aktivität immunologisch ist.

3. Isoliertes Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, das mindestens 15 aufeinanderfolgende Aminosäuren einer T-Zell-Rezeptor-β-Untereinheit umfaßt.

4. Isoliertes Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die aufeinanderfolgenden Aminosäuren der T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit aufeinanderfolgende Aminosäuren einer Region einer T-Zell- Antigenrezeptor-β-Untereinheit sind, die unter einer Sekretions-Leaderregion, einer variablen Region, einer konstanten Region, einer Diversitätsregion, einer verbindenden Region, einer Transmembranregion und einer zytoplasmatischen Region ausgewählt ist.

5. Isoliertes Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 4, wobei die aufeinderfolgenden Aminosäuren der T-Zell-Antigen rezeptor-β-Untereinheit zu einer variablen Region einer T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit gehören.

6. Isoliertes Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend mindestens eine Region einer T- Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit, wobei diese Region unter einer Sekretions-Leaderregion., einer variablen Region, einer konstanten Region, einer Diversitätsregion, einer verbindenden Region, einer Transmembranregion und einer zytoplasmatischen Region ausgewählt ist.

7. Isoliertes Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 6, das mindestens eine variable Region einer T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit umfaßt.

8. Isoliertes Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Aminosäuren der T-Zell- Rezeptor-β-Untereinheit von einer Nukleinsäure nach Fig. 2 kodiert werden.

9. Isoliertes Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Peptid oder Polypeptid glykosyliert oder unglykosyliert ist.

10. Isoliertes Peptid oder Polypeptid, das T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit-Aktivität und eine Aminosäuresequenz der Formel:

(S. L.)c-(V-seq)-J-C-(TM)d-(CY)e

hat, worin:

"S. L." eine Sekretions-Leadersequenz einer T-Zell- Antigenrezeptor-β-Untereinheit bedeutet

"V-seq" ein Polypeptid, das die variable Region einer T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit ist, be zeichnet oder ein anderes Polypeptid als die variable Region einer T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit bedeutet;

"J" eine verbindende Region einer T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit bedeutet;

"C" eine konstante Region einer T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit bezeichnet;

"TM" eine Transmembransequenz einer T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit bezeichnet;

"Cy" eine zytoplasmatische Region einer T-Zell- Antigenrezeptor-β-Untereinheit bezeichnet; und

c, d und e jeweils unabhängig voneinander 0 oder 1 darstellen;

und worin

eine T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit dadurch gekennzeichnet ist, daß

(i) sie von T-Zell-spezifischer mRNA exprimiert wird;

(a) mindestens 312 Aminosäuren umfaßt und (b) Teil eines Säugetier-T-Zell-Antigenrezeptors ist, und

oder

11. Isoliertes Hybridpeptid oder -polypeptid, das ein Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfaßt.

12. Hybridpeptid oder -polypeptid nach Anspruch 11, das eine konstante Region einer T-Zell-Antigenrezeptor-β- Untereinheit und/oder eine Sequenz einer verbindenden Region einer T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit umfaßt.

13. Hybridpeptid oder -polypeptid nach Anspruch 11, das eine Transmembranregion einer T-Zell-Antigenrezeptor-β- Untereinheit und gegebenenfalls auch eine zytoplasmatische Region einer T-Zell-Antigenrezeptor-β-Untereinheit umfaßt.

14. Hybridpeptid oder -polypeptid nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das Peptid oder Polypeptid an der Oberfläche einer Zelle vorliegt.

15. Isoliertes Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Peptid oder Polypeptid nachweisbar markiert ist.

16. Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 15, das mit einem Radionuklid oder mit einer NMR-aktiven Verbindung markiert ist.

17. Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 15, das mit einem fluoreszierenden Rest markiert ist.

18. Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Peptid oder Polypeptid mit einem Toxin konjugiert ist.

19. Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Verwendung als therapeutisches Mittel.

20, Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur immunologischen Verwendung.

21. Verwendung eines Peptids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und 15 bis 17 als in vitro anwendbares diagnostisches Mittel.

22. Verwendung eines Peptids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 13 in der Affinitäts-Chromatographie.

23. Verwendung eines Peptids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 13 auf zur Verwendung von Immunoglobin in vitro analoge Weise.

24. Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Verwendung als ortsgerichtetes diagnostisches Mittel.

25. Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Verwendung als ortsgerichtetes therapeutisches Mittel.

26. Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Verwendung auf zu Immunoglobin in vivo analoge Weise.

27. Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Verwendung für die Hemmung der Proliferation von T- Zellen in vivo.

28. Verwendung eines Peptids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Arzneimittels, daß analog zu Immunoglobulinen verwendet wird.

29. Verwendung eines Peptids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder nach Anspruch 18, zur Herstellung eines Mittels für eine ortsgerichtete Therapie.

30. Verwendung eines Peptids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Mittels zur ortsgerichteten Diagnose.

31. Verwendung eines Peptids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Proliferation von T-Zellen in vivo.

32. Verwendung eines Peptids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Arzneimittels zur immunologischen Verwendung.

33. Verfahren zur Herstellung einer rekombinierten Wirtszelle, die ein Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 exprimieren kann, umfassend die Schritte:

(a) Einführen eines rekombinierten Nukleinsäure-Konstrukts, das das Peptid oder Polypeptid kodiert, in eine Wirtszelle, wobei das rekombinierte Nukleinsäure-Konstrukt

(1) einen selektierbaren Marker und

(2) Transkriptions- und Translations-Signale und eine cDNA-Sequenz unter der Transkriptions- und Translations-Kontrolle dieser Signale, wobei die cDNA- Sequenz das Peptid oder Polypeptid kodiert, umfaßt; und

(b) Selektieren von Wirtszellen mit Hilfe eines solchen selektierbaren Markers.

34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Wirtszelle ein Bakterium ist.

35. Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Wirtszelle eine Hefezelle ist.

36. Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist.

37. Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 13, das Kultivieren einer rekombinierten Wirtszelle, die nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 33 bis 36 erhalten wird, und Gewinnen des Peptids oder Polypeptids aus der Zelle und/oder aus dem Kulturmedium umfaßt.

38. Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und 10 bis 13, das chemisches Synthetisieren des Peptids oder Polypeptids umfaßt.

39. Antikörper, der spezifisch an ein Peptid oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bindet, unter der Voraussetzung, daß

der Antikörper kein monoklonaler oder aus Serum stammender Antikörper, der nach bekannten Verfahren hergestellt wird, gegen ein isoliertes Polypeptid ist, welches

(a) mindestens 312 Aminosäuren umfaßt und

(b) Teil eines Säugetier-T-Zell-Antigenrezeptors ist, und

oder

40. Antikörper nach Anspruch 39, wobei der Antikörper gemeinsame idiotypische Determinanten oder gemeinsame Determinanten der J- oder C-Regionen erkennt.

41. Antikörper nach Anspruch 39 oder Anspruch 40, der gegen ein Peptid oder Polypeptid nach Anspruch 9 erzeugt wird.

42. Antikörper nach einem der Ansprüche 39 bis 41, der ein monoklonaler Antikörper ist.

43. Hybridomzelle, die einen monoklonalen Antikörper, wie er in Anspruch 42 beansprucht wird, produziert.

44. Antikörper, der spezifisch an ein Peptid oder Polypeptid, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht wird, bindet, zur Verwendung zum Binden an T- Zellen in vivo.

45. Antikörper, der spezifisch an ein Peptid oder Polypeptid, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht wird, bindet, zur Verwendung zum Binden an T- Zellen in vivo, um ihre Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen.

46. Antikörper, der spezifisch an ein Peptid oder Polypeptid, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht wird, bindet, zur Verwendung zum Binden an T- Zellen in vivo, um ihre Proliferation zu beeinträchtigen.

47. Antikörper, der spezifisch an ein Peptid oder Polypeptid, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht wird, bindet, zur Verwendung zum Binden an T- Zellen in vivo, um ihre Sekretion von Faktoren zu beeinträchtigen.