PT1807504E - Meio de cultura de células sem soro para células de mamíferos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MEIO DE CULTURA DE CÉLULAS SEM SORO PARA CÉLULAS DE MAMÍFEROS"

ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção é no âmbito da cultura de células de mamíferos sob condições de cultura sem soro, em particular de cultura de células que produzem proteínas recombinantes tais como e.g. hormona de crescimento humano (hGH).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção usa um meio sem soro para o crescimento e manutenção de células de mamífero em cultura. A cultura de células é largamente usada hoje em dia para a produção de vários produtos biologicamente activos, tais como vacinas virais, anticorpos monoclonais, imunoreguladores que não anticorpos, factores de crescimento polipeptídicos, hormonas, enzimas, antigénios específicos para tumores, etc. Estes produtos são produzidos por células normais ou transformadas e geneticamente manipuladas.

Para cultivar células, no passado o meio de cultura era suplementado com soro, o que servia como um nutriente universal para o crescimento e manutenção de todas as linhas de células de mamífero que produzem produtos biologicamente activos. 0 soro contém hormonas, factores de crescimento, proteínas transportadoras, factores de fixação e distribuição, nutrientes, oligoelementos, etc. Os meios de cultura normalmente continham até cerca de 10% de soro animal, tais como soro fetal de bovino (FBS), também chamado soro fetal de vitelo (FCS) . 2

Embora largamente usado, o soro tem muitas limitações.

Contem altos niveis de numerosas proteínas que interferem com as quantidades limitadas da proteína de interesse desejada produzidas pelas células. Estas proteínas derivadas do soro têm de ser separadas do produto em processamentos seguintes tal como purificação da proteína de interesse, o que complica o processo e aumenta os custos. 0 advento da BSE (Encefalopatia espongiforme bovina), uma doença neurodegenerativa transmissível do gado com um longo período de latência ou incubação, fez nascer questões de regulação sobre o uso de soros derivados de animais na produção de produtos biologicamente activos. Há portanto uma grande necessidade de desenvolvimento de meios alternativos sem soro animal que assegurem o crescimento celular e que mantenha as células durante a produção de produtos biologicamente activos. Geralmente, os meios de cultura de células compreendem muitos componentes de categorias diferentes, tais como aminoácidos, vitaminas, sais, ácidos gordos, e outros compostos: - Aminoácidos: Por exemplo, a US 6,048,728 (Inlow et al.) divulga que os seguintes aminoácidos podem ser usados num meio de cultura de células: Alanina, Arginina, Ácido aspártico, Cisteína, Ácido glutâmico, Glutamina, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenilalanina, Prolina, Serina, Triptofano, Tirosina, Treonina, e Valina. - Vitaminas: A US 2003/0096414 (Ciccarone et al.) ou A US 5,811,299 (Renner et al.) por exemplo descrevem que as seguintes vitaminas podem ser usadas num meio de 3 cultura de células: Biotina, Pantotenato, Cloreto de colina, Ácido fólico, Mio-inositol, Niacinamida, Piridoxina, Riboflavina, Vitamina B12, Tiamina,

Putrescina. - Sais: Por exemplo, a US 6, 399,381 (Blum et al.) divulga um meio compreendendo CaCl2, KC1 MgCl2, NaCl, Fosfato de sódio monobásico, Fosfato de sódio dibásico, Selenito de sódio, CuS04, ZnCl2. Outro exemplo de um documento que divulga os sais inorgânicos que podem ser usados num meio de cultura é a US 2003/0153042 (Arnold et al.), descrevendo um meio compreendendo CaCl2, KC1, MgCl2, NaCl, Fosfato de sódio monobásico, Fosfato de sódio dibásico, CuCl2.2H20, ZnCl2. - Ácidos gordos: Ácidos gordos que são conhecidos para serem usados em meios são Ácido araquidónico, Ácido linoleico, Ácido oleico, Ácido láurico, Ácido mirístico, assim como Metil-beta-Ciclodextrina, ver e.g. a US 5,045,468 (Darfler). Note-se que a ciclodextrina não é um lipido per se, mas tem a capacidade de formar um complexo com lipidos e é portanto usada para solubilizar lipidos no meio de cultura de células. - Outros Componentes, usados em particular na âmbito de meios de cultura de células sem soro, são compostos tais como glucose, glutamina, piruvato de Na, insulina ou etanolamina (e.g. EP 274 445), ou um agente protector tal como Pluronic F68. O Pluronic® F68 (também conhecido como Poloxamer 188) é um copolimero de bloco de óxido de etileno (EO) e óxido de propileno (PO) . 4 "Meios básicos" padrão são também conhecidos da pessoa especialista na técnica. Estes meios já contêm vários dos componentes do meio mencionados acima. Exemplos de tais meios que são largamente aplicados são o Meio de Eagle modificado da Dulbecco (DMEM), DMEM F12 (1:1), Mistura de nutrientes F-10 da Ham, Meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI), MCDB 131, ou Meio E de William. Estes meios comerciais estão disponíveis e.g. na Gibco, Invitrogen.

Metais tais como Zinco (Zn) e Cobre (Cu) estão envolvidos em reacções metabólicas (Vallee e Falchuk, 1993, ou Lindner, 1991). O zinco é essencial para a estrutura e função de um vasto número de macromoléculas e para muitas reacções enzimáticas. Desempenha um papel catalítico, co-catalítico ou estrutural na dobragem correcta das proteínas, o Zn-ATP é necessário para a síntese de piridoxal-5-fosfato e do dinucleótido flavina adenosina (FAD), duas coenzimas essenciais para a síntese de aminas biogénicas e do metabolismo da monoamina oxidase. A actividade do Zinco na protecção de estruturas biológicas contra os danos causados pelos radicais livres pode ser devida a vários factores: manutenção do nível adequado de metaloproteínas, as quais são também captadores de radicais livres, como um componente essencial da superóxido dismutase, como um agente protector para tióis, e na prevenção da interacção de grupos químicos com o Ferro para formar radicais livres. Adicionalmente a isto, a presença de Zn previne a peroxidação de lípidos. 0 Zinco é também um operador da polimerização da tubulina e actua in vitro na formação e estabilização dos filamentos de actina. 0 Zinco 5 é também um componente do domínio de dedos de Zinco das proteínas que se ligam a DNA, o qual é um domínio comum em proteínas de transcrição.

Os iões de Zinco existem primariamente na forma de complexos com proteínas e ácidos nucleicos e participam em todos os aspectos do metabolismo intermediário, transmissão e regulação da expressão da informação genética, armazenamento, síntese e acção das hormonas peptídicas e manutenção estrutural da cromatina e bio-membranas. 0 Cobre é também um importante oligoelemento para a função de muitas enzimas celulares. Os Iões de Cobre podem adoptar distintos estados redox, Cu (II) oxidizado, ou Cu (I) reduzido, permitindo ao metal desempenhar um papel essencial na fisiologia da célula como cofactor catalítico na química redox das enzimas. Funciona num grupo de oxidases de cobre, que incluem citocromo c oxidase, tirosinase, dopamina-p-monooxigenase, amina oxidases e lisil oxidase. 0 Cobre também participa na respiração mitocondrial, na homeostase do ferro como um componente da ceruloplasmina, na captação de radicais livres e no cruzamento da elastina.

Meios sem soro compreendendo iões metálicos tais como iões de zinco ou de Cobre são conhecidos na técnica, e.g. da US 6,048,728 (Inlow et al.), a US 4,767,704 (Cleveland et al.) ou a WO 01/16294 (Life Technologies Inc.). No entanto, estes documentos não descrevem um efeito de aumento de produtividade destes iões quando adicionados em concentrações específicas a um meio de produção padrão.

Para o desenvolvimento e fornecimento de produtos biologicamente activos, tais como proteínas terapêuticas ou vacinas, têm que ser produzidas grandes quantidades. 6 Células adequadas que são larqamente usadas para a produção de polipéptidos são as células de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

As células CHO foram primeiro cultivadas por Puck (J. Exp. Med. 108, 945, 1958) a partir de uma biopsia de um ovário de uma fêmea de hamster Chinês. A partir destas células originais foi preparada uma quantidade de sub-linhas com várias caracteristicas. Uma dessas linhas de células CHO, a CHO-K1, requer prolina e é diplóide para o gene da dihidrofolato reductase (DHFR). Outra linha derivada desta linha celular é uma linha de células CHO deficiente em DHFR (CHO DUK Bll) (PNAS 77, 1980, 4216-4220), a qual é caracterizada pela perda da função DHFR como consequência de uma mutação no gene DHFR e a subsequente perda do outro gene.

Outras células que são frequentemente usadas para a produção de proteínas destinadas a administração em humanos são linhas celulares humanas tais como a linha de células de fibrosarcoma humano HT1080 ou a linha de células de rim embrionário humano 293. A linha celular C127 de murino é também altamente adequada para a produção de proteínas recombinantes (Cárter et al., 1989; Oka e Rupp, 1990).

Uma proteína terapêutica de interesse é a hormona de crescimento. A hormona de crescimento humana (hGH), também conhecida como somatropina (INN) ou somatotropina, é uma hormona proteica produzida e secretada pelas células somatotrópicas da pituitária anterior. A hormona de crescimento humana desempenha um papel chave no crescimento somático na infância e no metabolismo na idade adulta 7 através dos seus efeitos no metabolismo das proteínas, hidratos de carbono e lípidos. A hormona de crescimento humana é uma cadeia polipeptídica simples de 191 aminoácidos (Bewly et al. 1972) tendo duas ligações dissulfureto, uma entre Cys-53 e Cys-165, formando uma grande ansa na molécula, e a outra entre Cys-182 e Cys-189, formando uma pequena ansa perto da terminação C. A sequência de DNA que confirmou a sequência de aminoácidos foi referida por Martial et al (1979) . A hGH purificada é um pó branco amorfo na sua forma liofilizada. É rapidamente solúvel (concentrações >10 mg/L) em tampões aquosos a pH numa gama de 6,5 até 8,5.

Em solução, a hGH existe predominantemente como um monómero, com uma pequena fracção como dímeros e oligómeros de maior peso molecular. Sob determinadas condições, a hGH pode ser induzida para formar maiores quantidades de dímeros, trímeros e oligómeros maiores. Vários derivados de hGH são conhecidos, incluindo derivados de ocorrência natural, variantes e produtos metabólicos, produtos de degradação primariamente da hGH biossintética e derivados modificados da hGH produzidos por métodos genéticos. Um exemplo de derivados de hGH de ocorrência natural é GH-V, uma variante da hormona de crescimento encontrada na placenta. Outros membros do local do gene são descritos em Chen et al. (1939). Qualquer derivado de hGH, incluindo derivados concebidos para serem de longa permanência no organismo, podem ser usados para os fins da presente invenção desde que retenham a actividade biológica da hGH. A hGH metionilo foi a primeira forma de hGH a ser produzida através de tecnologia de DNA recombinante. Este composto é actualmente um derivado de hGH tendo um resíduo de metionina adicional na sua terminação N (Goeddel et al, 1979).

Foi descrito que uma variante da hGH de ocorrência natural chamada 20-K-hGH ocorre na pituitária assim como na corrente sanguínea (Lewis et al, 1978; Lewis et al, 1980). Este composto, que não tem os 15 resíduos de aminoácidos desde Glu-32 até Gln-46, surge a partir de um "splicing" alternativo do ácido ribonucleico mensageiro {DeNoto et al, 1981). Este composto partilha muitas, mas não todas, das propriedades biológicas da hGH. A 20-K-hGH é feita na pituitária e secretada para o sangue. Ela perfaz cerca de 5% da produção de hormona de crescimento em adultos, e cerca de 20% da produção de hormona de crescimento em crianças. Tem a mesma actividade promotora do crescimento que a hormona de crescimento de 22 kD, e foi referida como tendo a mesma ou mais quantidade de actividade lipolítica que a forma de 22 kD. Liga-se aos receptores da hormona de crescimento com a mesma afinidade que a hormona de crescimento de 22 kD, e tem um décimo da bioactividade lactogénica (tipo prolactina) da hormona de 22 kD. Ao contrário da 22 kD, a 20-k-hGH tem fraca actividade anti-insulina. Vários derivados da hGH surgem de modificações proteolíticas da molécula. A via primária para o metabolismo da hGH envolve proteólise. A região da hGH à volta dos resíduos 130-150 é extremamente susceptível à proteólise, e foram descritos muitos derivados da hGH que têm cortes ou deleções nesta região (Thorlacius-Ussing, 9 1987) . Esta região está na ansa grande da hGH, e a clivagem de uma ligação peptidica nesse sitio, resulta na formação de duas cadeias que estão ligadas através de uma ligação dissulfureto em Cys-53 e Cys-165. Muitas destas formas com duas cadeias são descritas como tendo actividade biológica aumentada (Singh et al, 1974). Muitos derivados da hormona de crescimento humana têm sido produzidos artificialmente através do uso de enzimas. As enzimas tripsina e subtilisina, assim como outras, têm sido usadas para modificar a hGH em vários pontos ao longo da molécula (Lewis et al, 1977; Graff et al, 1982). Um desses derivados, chamado proteína anabólica com 2 cadeias (2-CAP), foi formado através da proteólise controlada da hGH usando tripsina (Becker et al, 1989). Verificou-se que a 2-CAP tem propriedades biológicas muito diferentes das da molécula de hGH intacta, sendo que a actividade promotora do crescimento da hGH foi mantida em grande parte e a maior parte dos efeitos no metabolismo do hidratos de carbono foi abolida.

Os resíduos de asparagina e glutamina em proteínas são susceptíveis a reacções de desamidação sob condições adequadas. Verificou-se que a hGH da pituitária é submetida a este tipo de reacção, resultando na conversão do Asn-152 em ácido aspártico e também, em menor grau, a conversão da Gln-137 em ácido glutâmico (Lewis et al, 1981). Verificou-se que a hGH desaminada tem uma susceptibilidade alterada à proteólise com a enzima subtilisina, sugerindo que a desamidação pode ter importância fisiológica na condução da clivagem proteolítica da hGH. A hGH biossintética é conhecida por se degradar sob determinadas condições de armazenamento, resultando em desamidação numa asparagina diferente (Asn-149). Este é o sítio principal de desamidação, mas também acontece desamidação na Asn-152 10 (Becker et al, 1988) . Não foi registada desamidação na Gln-137 em hGH biossintética.

Os residuos de metionina em proteínas são susceptiveis a oxidação, principalmente ao sulfóxido. Tanto a hGH derivada da pituitária como a hGH biossintética sofrem sulfoxidações na Met-14 e Met-125 (Becker et al, 1988). Oxidação na Met-170 foi também registada na pituitária mas não na hGH biossintética. Verificou-se que tanto a hGH desamidada como a hGH sulfóxido Met-14 apresentam actividade biológica completa (Becker et al, 1988).

Formas truncadas da hGH foram produzidas, quer através das acções de enzimas quer por métodos genéticos. A 2-CAP, produzida por acções controladas da tripsina, tem os primeiros oito residuos na terminação N da hGH removidos. Outras versões truncadas da hGH foram produzidas modificando o gene antes da expressão num hospedeiro adequado. Os primeiros 13 residuos foram removidos para formar um derivado com propriedades biológicas distintas (Gertler et al, 1986) no qual a cadeia polipeptídica não é clivada.

Embora a hormona de crescimento humana fosse obtida originalmente a partir de glândulas da pituitária de cadáveres, estas preparações não eram electroforeticamente homogéneas, e apareceram anticorpos no soro de doentes tratados com preparações na ordem dos 50% de pureza, sendo a imunogenicidade atribuída a componentes inactivos. A tecnologia de DNA recombinante permitiu a produção de um fornecimento ilimitado de hGH em vários sistemas diferentes. A purificação da hGH em relação ao meio de cultura é facilitada pela presença apenas de baixas quantidades de proteínas contaminantes. De facto, 11 verificou-se que a hGH pode ser purificada em escala laboratorial com um único passo de purificação numa coluna de HPLC de fase reversa (Hsiung et al (1989). A hormona de crescimento humana recombinante, rhGH, é produzida por Serono International S.A. como SEROSTIM®, a cujo produto foi dada aprovação acelerada pela FDA para tratamento da perda de peso e enfraquecimento em doentes de SIDA. SAIZEN® é a hormona de crescimento humana recombinante indicada para a deficiência de GH em crianças, para o sindrome de Turner em raparigas, assim como insuficiência renal crónica em crianças. A PROTROPIN®, produzida por Genentech, Inc. (South San Francisco, CA), difere ligeiramente na estrutura em relação à sequência natural da hGH, tendo um resíduo de metionina adicional na terminação N. A hGH recombinante é geralmente comercializada em frascos contendo hGH mais excipientes adicionais, e.g., glicina e manitol, numa forma liofilizada. É fornecido um frasco diluente associado, permitindo ao doente reconstituir o produto até à concentração desejada antes da administração da dose. A hGH recombinante pode também ser comercializada de outras maneiras bem conhecidas, tais como seringas pré-carregadas, etc.

Em geral, não foram observadas diferenças significativas nas actividades farmacocinéticas ou biológicas na hGH de sequência natural recombinante, N-metionil-hGH recombinante, ou em material derivado da pituitária em humanos (Moore et al, 1988; Jorgensson et al, 1988) .

Tendo em vista as várias indicações médicas para as quais a hormona de crescimento é usada, há necessidade de um meio eficiente e seguro de produzir quantidades suficientes dela 12 numa cultura de células, em particular num processo de cultura de células sem soro.

Os meios sem soro têm sido descritos na técnica.

Por exemplo, a US 6,162,643 descreve um meio basal sem soro designado HECK-109, contendo quantidades vestigiais de Sulfato de Cobre e Cloreto de Zinco. Este meio é especificamente concebido para culturas primárias e secundárias de células humanas normais tais como queratinócitos com o objectivo da produção de tecidos para transplantes humanos. A expressão de proteínas humanas recombinantes em linhas de células in vitro não é mencionada nesta patente US. A US 5,324,656 divulga um meio basal sem soro chamado MCDB120 e MCDB 131M, compreendendo quantidades vestigiais de Sulfato de Cobre e Cloreto de Zinco. Este meio é especificamente concebido para a cultura in vitro de células satélite de músculo humano com o objectivo de prevenir a diferenciação destas células. A produção de proteínas humanas recombinantes não é considerada no âmbito deste documento. A GB 2 196 348 descreve um meio sintético para a cultura in vitro de células de hibridoma e mieloma. 0 meio contém iões de Cobre, Zinco e Férricos. 0 cultivo de células de hibridoma ou de mieloma neste meio é exclusivamente para fins de produção de anticorpos monoclonais. A US 6,103,529 fornece uma formulação de meio de cultura de células sem soro para o cultivo de células animais in vitro. As células animais podem ser usadas para a produção de vírus, anticorpos monoclonais, hormonas ou factores de 13 crescimento. No entanto, a produção da hormona de crescimento não é mencionada neste documento. A US 6,048,728 divulga um meio de cultura de células sem proteínas compreendendo iões Co, Zn e Fe para o cultivo de células animais de modo a produzir e.g. produtos naturais ou recombinantes, tais como anticorpos. Esses produtos a serem produzidos pelas células cultivadas não incluem hormonas de crescimento ou factores de crescimento, que são exclusivamente mencionados como constituintes do meio sem soro de modo a melhorar o crescimento celular em cultura. A US 5,316,938 divulga um meio de cultura bioquimicamente definido para células de ovário de hamster chinês (CHO) compreendendo citrato Férrico, sulfato de Zinco e sulfato de Cobre, chamado WCM5. O meio é especificamente concebido para a produção de anticorpos e tPA em células de CHO. A US 5,122,459 descreve um método para a produção de proteínas recombinantes num meio de cultura sem soro contendo iões de Zinco e Férricos, particularmente adequado para a cultura de células de CHO. A produção da hormona de crescimento não é mencionada neste documento. A WO 98/08934 descreve um meio sem soro compreendendo 1-ΙΙμΜ de Zinco e 4-26 nM de Cobre. Um meio separado é descrito compreendendo 1-6μΜ de Ferro e 3-500nM de Zinco. A US 2003/0096402 divulga um meio de cultura sem componentes derivados de soro animal para linhas celulares que expressam proteínas terapêuticas. Este contém 2-40nM de Cobre, 3,5 nM-0,35 μΜ de Ferro e 27 nM-0,34 μΜ de Zinco. O documento não divulga a expressão da hormona de crescimento. 14 A US 4,767,704 divulga um meio de cultura sem proteínas compreendendo 2,5-10nM de Cobre, 0,8-3,2 μΜ de Ferro e 0,8-2,9 μΜ de Zinco.

Deste modo, o problema subjacente à presente invenção é fornecer um meio de cultura de células sem soro para a produção eficiente de Hormona de Crescimento, em particular da hormona de crescimento humana (hGH).

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção é baseada no desenvolvimento de um meio de cultura de células que é livre de componentes derivados de soro animal e que ao mesmo tempo é altamente eficaz para o crescimento celular e manutenção de células de mamífero em cultura, permitindo particularmente a produção de proteínas recombinantes. É descrito um meio de cultura de células sem componentes derivados de soro animal, compreendendo Zinco e Cobre, assim como iões Férricos em quantidades vestigiais.

Num primeiro aspecto, a invenção relaciona-se com um processo de produção da hormona de crescimento compreendendo o passo de cultivar uma célula que expressa a hormona de crescimento no meio da invenção.

Um segundo aspecto da invenção relaciona-se com o uso de um meio de acordo com a invenção para a produção de hormona de crescimento.

Um terceiro aspecto da invenção relaciona-se com o uso de um meio de acordo com a invenção para a manutenção de 15 células em cultura durante a fase de produção da hormona de crescimento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Fig. 1 mostra o perfil de produtividade de rhGH obtido

Fig. 2 na fase de produção sob adição continua de diferentes elementos a 10 μΜ em meio de cultura DMEM (RB = frasco rotativo, H1-H14 = dias 1 a 14 da fase de produção); mostra a média dos valores de produtividade da rhGH, expressa em mg de rhGH por frasco rotativo, obtida na fase de produção sob adição continua de metais (Níquel, Bário, Cobalto, Crómio) a 10 μΜ em meio de cultura DMEM; Fig. 3 mostra o aumento dos valores médios de produtividade da rhGH quando comparado com o controlo, obtido na experiência de design factorial para testar combinações de zinco (Zn 0,5 μΜ) , cobre (Cu 0,02 μΜ), selénio (Se 0,050 μΜ) , manganês (Mn 0,001 μΜ) e citrato férrico (4,8 μΜ); Fig. 4 mostra os resultados de uma experiência de design factorial para determinar o resultado de uma mistura de oligoelementos metálicos (Zn 0,5 μΜ, Cu 0,02 μΜ e citrato férrico 4,8 μΜ) e os aminoácidos glutamina (Gin 4,8 mM), serina (Ser 0,49 mM) e cistina (Cys 0,29 mM); Fig. 5 mostra o efeito de diferentes concentrações de cobre combinadas com zinco e citrato férrico (Zn 16 0,5 μΜ, Citrato de Fe 4,8 μΜ) na produtividade de rhGH em DMEM;

Fig. 6 mostra o efeito de diferentes concentrações de zinco combinadas com cobre e citrato férrico (Cu 0,02 μΜ, Citrato de Fe 4,8 μΜ) na produtividade de rhGH em DMEM; e

Fig. 7 mostra o resumo do efeito do aumento de produtividade de rhGH obtido quando se adiciona cobre, zinco e citrato férrico (Zn: 1,5 e 0,5 μΜ, Cu: 0,02 μΜ e citrato férrico: 4,8 μΜ) como suplementos do DMEM a partir de diferentes experiências com células C127 produtoras de rhGH.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é baseada no desenvolvimento de um meio de cultura de células que não tem soro animal. O meio de cultura de células sem soro animal compreende:

Zinco (Zn) numa concentração variando desde 0,2 até 1,75 μΜ, e

Cobre (Cu) numa concentração variando desde 10 até 75 nM, e Iões Férricos (Fe) numa concentração de 5 ou 6 μΜ.

Conforme mostrado nos Exemplos a seguir, a adição de Zn e/ou Cu em quantidades vestigiais a um meio padrão resultou num aumento de produtividade das células expressando uma proteína de interesse secretada. A adição tanto de Zn como Cu nas concentrações acima identificadas conduziu a um aumento na produtividade da 17 hormona de crescimento humana recombinante (GH) nas células C127 de mais de 60% do controlo (as mesmas células cultivadas em DMEM padrão). Quando as células que expressam GH foram cultivadas num meio compreendendo iões Zn, Cu e, Fe nas concentrações acima identificadas, a produtividade foi aumentada em cerca de 70% em comparação com o controlo.

As gamas de concentrações preferidas dos iões metálicos do meio da invenção são como segue: - Zinco a cerca de 0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,5, 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1, 1,05, 1,1 , 1,15, 1,2, 1,25, 1,3, 1,35, 1,4, 1,45, 1,5, 1,55, 1, 6, 1,65, 1,7 1,75 μΜ.

Preferencialmente, o zinco é compreendido a cerca de 0,5 μΜ ou cerca de 1,5 μΜ. É também preferido que o zinco seja compreendido como sulfato de zinco. - Cobre a cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, ou 75 nM.

Preferencialmente, o cobre é compreendido a cerca de 25 nM. É também preferido que o Cobre seja compreendido como sulfato de cobre. - Iões Férricos são compreendidos a cerca de 5 ou 6 μΜ.

Os iões férricos podem preferencialmente ser compreendidos como citrato férrico e/ou nitrato férrico, e é ainda mais preferido que o citrato férrico contribuam para a maioria dos iões férricos compreendidos no meio de cultura de 18 células. 0 meio pode compreender, por exemplo, cerca de 5 μΜ de citrato férrico e cerca de 1 μΜ de nitrato férrico.

Numa forma de realização preferida, o meio compreende ainda os componentes de um meio básico. É preferido que o meio contenha Meio Eagle Modificado da Dulbecco (DMEM) como meio básico. A composição do DMEM padrão é referida no exemplo a seguir. 0 primeiro aspecto da presente invenção relaciona-se com um processo para produção de uma proteína compreendendo o passo de cultivar uma célula expressando hormona de crescimento no meio da invenção. 0 passo de cultivar do processo da invenção pode ser realizado em qualquer ambiente adequado, tal como placas de Petri, frascos T ou frascos rotativos, mas podem também ser realizados em recipientes tendo maiores volumes tais como e.g. um biorreactor. A proteína da Invenção pode ser expressa usando qualquer promotor que seja adequado no tipo de célula particular usada. Numa forma de realização altamente preferida, a proteína é expressa a partir do promotor metalotioneína (MT). Se forem usadas células de murino para produção de proteína, o promotor é preferencialmente o promotor MT-1 de murino.

Preferencialmente, o processo compreende ainda o passo de colheita do meio compreendendo a proteína de interesse.

Numa forma de realização preferida, o processo compreende ainda isolar a proteína de interesse. 19

Numa outra forma de realização preferida o processo compreende ainda formular a proteína isolada com um transportador farmaceuticamente aceitável para obter uma composição farmacêutica.

Num segundo aspecto, a invenção relaciona-se com o uso do meio de acordo com a invenção para a produção de hormona de crescimento.

Num terceiro aspecto, a invenção relaciona-se com o uso de um meio da invenção para manutenção de células em cultura durante a fase de produção da hormona de crescimento.

As células a usar no âmbito dos vários aspectos da presente invenção são preferencialmente células de mamífero. Elas podem ser de origem humana ou animal. Exemplos de células de mamífero que podem ser cultivadas no processo de acordo com a presente invenção incluem, e.g., células C127 de murino, células 3T3, células COS, células de osteosarcoma humano, células MRC-5, células BHK, células VERO, células CHO (ovário de hamster Chinês), células HEK 293, células rHEK 293, células de fibroblasto humano normais, células de Estroma, células de Hepatócitos, ou células PER.C6. Exemplos de hibridomas que podem ser cultivados no processo de acordo com a presente invenção incluem, e.g., células DA4.4, células 123A, células 127A, células GAMMA e células 67-9-B. É preferido cultivar células C127 de murino de acordo com a presente invenção.

As células cultivadas de acordo com a presente invenção podem crescer em suspensão ou, por ancoragem das células dependentes, ligadas a um suporte sólido. Microtransportadores e discos Fibra-Cel® são usados em 20 cultura de células de mamíferos para o crescimento de células dependentes de ancoragem e estão entre as plataformas tecnológicas estabelecidas para a produção industrial de proteínas (ver, e.g., Bohak et al. 1987; Petti et al. 1994) . O processo da invenção serve para produzir a hormona de crescimento. O meio da invenção é portanto usado para a produção de hormona de crescimento. A hormona de crescimento pode ser de qualquer origem. Hormonas de crescimento preferidas são as de origem humana.

Caso a hormona de crescimento que é produzida no processo da invenção seja formulada com um transportador farmaceuticamente aceitável, o resultado do processo é uma composição farmacêutica. A definição de "farmaceuticamente aceitável" é entendida para abranger quaisquer transportadores, que não interfiram com a eficiência da actividade biológica do componente activo e que não sejam tóxicos para o hospedeiro ao qual é administrado. Por exemplo, para administração parentérica, a(s) proteína(s) activa(s) pode(m) ser formulada(s) numa forma de dosagem unitária para injecção em veículos tais como soro fisiológico, solução de dextrose, soro de albumina e solução de Ringer. A composição farmacêutica formulada de acordo com a invenção pode depois ser administrada a um indivíduo numa variedade de modos. As vias de administração incluem as vias intradérmica, transdérmica (e.g. em formulações de libertação lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, oral, intracranial, epidural, 21 tópica, rectal, e intranasais. Qualquer outra via de administração terapeuticamente eficaz pode ser usada, por exemplo absorção através de tecidos epitelial ou endotelial ou por terapia génica em que uma molécula de DNA que codifica o agente activo é administrada ao doente (e.g. por via de um vector), o que faz com que o agente activo seja expresso e secretado in vivo. Adicionalmente, a(s) proteina(s) de acordo com a invenção pode(m) ser administrada(s) em conjunto com outros componentes de agentes biologicamente activos tais como tensoactivos, excipientes, transportadores, diluentes e veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Para administração parentérica (e.g. intravenosa, subcutânea, intramuscular), a(s) proteína(s) activas pode(m) ser formulada(s) como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação com um veículo parentérico farmaceuticamente aceitável (e.g. água, soro fisiológico, solução de dextrose) e aditivos que mantêm isotonicidade (e.g. manitol) ou estabilidade química (e.g. conservantes e tampões). A formulação é esterilizada por técnicas usadas comummente.

De acordo com a presente invenção, o meio é usado na produção de hormona de crescimento. A GH pode ser nativa, i.e. GH de ocorrência natural. Preferencialmente, a GH a ser produzida é de origem humana. Uma vez que a GH é uma proteína secretada, solúvel, ela é libertada para o sobrenadante da cultura celular, quer através do seu péptido de sinal natural, ou através de um péptido de sinal heterólogo, i.e. um péptido de sinal derivado de outra proteína secretada que pode ser mais eficiente no sistema de expressão específico usado. 22 0 termo "hormona de crescimento" é aqui usado como sinónimo de "GH". Este termo inclui GH natural ou nativa, GH produzidas de forma recombinante assim como as variantes GH apresentadas em pormenor nos "Antecedentes da invenção". 0 termo "GH", como aqui usado, inclui ainda muteínas, derivados funcionais, fracções activas, proteínas fundidas, proteínas circularmente permutadas e sais de GH. A GH é preferencialmente humana, mas pode também ser derivada de outras espécies, em particular mamíferos.

Como aqui usado o termo "muteínas" refere-se a análogos de uma GH, em que um ou mais resíduos dos aminoácidos de uma GH natural são substituídos por diferentes resíduos de aminoácido, ou são deletados, ou um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados à sequência natural de uma GH, sem diminuir consideravelmente a actividade dos produtos resultantes em comparação com o tipo selvagem de GH. Estas muteínas são preparadas por síntese conhecida e/ou por técnicas de mutagénese dirigidas ao sítio, ou qualquer outra técnica adequada para tal.

As muteínas de acordo com a presente invenção incluem proteínas codificadas por um ácido nucleico, tal como DNA ou RNA, as quais hibridizam em DNA ou RNA, que codifica uma GH sob condições rigorosas. Os DNAs que codificam a GH são conhecidos da técnica anterior. 0 termo "condições rigorosas" refere-se a hibridização e subsequentes condições de lavagem, a que os peritos comuns na técnica referem convencionalmente como "rigoroso". Ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscienoe, N.Y., §§6.3 e 6.4 (1987, 1992). Sem limitação, os exemplos das condições rigorosas incluem condições de lavagem 12-20°C abaixo da Tm calculada do 23 híbrido em estudo em, e.g., 2 x SSC e 0,5% de SDS durante 5 minutos, 2 x SSC e 0,1% de SDS durante 15 minutos; 0,1 x SSC e 0,5% de SDS a 37°C durante 30-60 minutos e então, um 0,1 x SSC e 0,5% de SDS a 68°C durante 30-60 minutos. Os peritos comuns nesta técnica compreendem que as condições rigorosas também dependem do comprimento das sequências de DNA, sondas de oligonucleótidos (tais como 10-40 bases) ou sondas de misturas de oligonucleótidos. Se são usadas sondas de misturas, é preferido usar cloreto de tetrametil amónio (TMAC) em vez de SSC. Ver Ausubel, supra. A identicidade reflecte uma relação entre duas ou mais sequências de polipéptidos ou duas ou mais sequências de polinucleótidos, determinada por comparação das sequências. Em geral, a identicidade refere-se a uma correspondência exacta de nucleótido a nucleótido ou de aminoácido a aminoácido dos dois polinucleótidos ou das duas sequências de polipéptidos, respectivamente, ao longo do comprimento das sequências a serem comparadas.

Para sequências onde não há uma correspondência exacta, uma "% de identicidade" pode ser determinada. Em geral, as duas sequências a serem comparadas são alinhadas para dar uma correlação máxima entre as sequências. Isto pode incluir a inserção de espaços (gaps) numa ou em ambas as sequências, para aumentar o grau de alinhamento. A % de identicidade pode ser determinada ao longo de todo o comprimento de cada uma das sequências a serem comparadas (chamado alinhamento global), que é particularmente adequado para sequências do mesmo ou de comprimento muito semelhante, ou sobre comprimentos definidos mais curtos (chamado alinhamento local) , que são mais adequados para sequências de comprimento desigual. 24 Métodos para comparar a identicidade e homologia de duas ou mais sequências são bem conhecidos na técnica. Assim, por exemplo, programas disponíveis no Wisconsin Sequence Analysis Package, versão 9.1 (Devereux J et al., 1984), por exemplo os programas BESTFIT e GAP, podem ser usados para determinar a % de identicidade entre dois polinucleótidos e a % de identicidade e a % de homologia entre duas sequências de polipéptidos. O BESTFIT usa o algoritmo de "homologia local" de Smith e Waterman (1981) e encontra a melhor região simples de similaridade entre duas sequências. Outros programas para determinar a identicidade e/ou semelhança entre sequências são também conhecidos na técnica, por exemplo a família de programas BLAST (Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, acessíveis através da página inicial da NCBI em www.ncbi.nlm.nih.gov) e FASTA (Pearson W R, 1990).

Qualquer das muteínas tem preferencialmente uma sequência de aminoácidos suficientemente duplicativa da de uma GH, tal como tem substancialmente actividade semelhante à GH. Uma actividade de GH é a sua capacidade de se ligar ao receptor GH. Desde que a muteína tenha actividade de ligação substancial ao receptor da GH (GHR), pode ser considerada como tendo actividade substancialmente semelhante à da GH. Assim, pode ser determinado se uma dada muteína tem substancialmente a mesma actividade que a GH por meios de experimentação de rotina compreendendo sujeitar essa muteína, e.g., a uma ensaio de competição de "sanduíche" simples para determinar se se liga ou não a um GHR adequadamente marcado ou a células de expressão de GHR, tais como radioimunoensaio ou ensaio ELISA.

Numa forma de realização preferida, cada uma dessas muteínas tem pelo menos 40% de identicidade ou homologia com a sequência de aminoácidos ou de DNA de uma GH. Estas 25 sequências são conhecidas na técnica, e.g. em DeNoto et al, 1981 ou Martial et al., 1979.

Mais preferencialmente, tem pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou, mais preferencialmente, pelo menos 90% ou 95% de identicidade ou homologia.

Alterações Preferidas para as muteinas de acordo com a presente invenção são as que são conhecidas como substituições "conservativas". As substituições conservativas de aminoácidos de polipéptidos da GH, podem incluir aminoácidos sinónimos dentro de um grupo que tem propriedades fisico-quimicas suficientemente semelhantes para que a substituição entre membros do grupo preserve a função biológica da molécula (Grantham, 1974). É claro que as inserções e deleções de aminoácidos podem também ser feitas nas sequências acima definidas sem alterar a sua função, particularmente se as inserções ou deleções envolverem apenas poucos aminoácidos, e.g., menos de trinta, e preferencialmente menos de dez, e não removem ou deslocam aminoácidos que são críticos para a conformação funcional, e.g., resíduos de cisteína. As proteínas e muteinas produzidas por essas deleções e/ou inserções vêm no âmbito da presente invenção. O termo "proteína fundida" refere-se a um polipéptido compreendendo GH, ou uma muteína ou seu fragmento, fundido com outra proteína, que, e.g. tem um tempo de permanência prolongado nos fluidos corporais. A GH pode assim ser fundida a outra proteína, polipéptido ou afins, e.g., uma imunoglobulina ou um fragmento seu. As porções Fc das IgQs são adequadas para a preparação das proteínas de fusão de imunoglobulina. As proteínas de fusão de Ig são descritas 26 por exemplo na EP 314 317 Al (Genentech) ou EP 0 325 224 A2 (Zymogenetics Inc.).

Como "fracções activas" de uma GH, ou muteínas e proteínas fundidas, a presente invenção inclui quaisquer fragmentos ou precursores da cadeia de polipéptidos da molécula de proteína sozinha ou em conjunto com moléculas associadas ou resíduos aí ligados, e.g., resíduos de fosfato ou açúcar, ou agregados da molécula de proteína ou dos resíduos de açúcar por si só, desde que a referida fracção tenha substancialmente actividade semelhante à da GH.

Se a GH da invenção for usada como uma composição farmacêutica, essa composição farmacêutica pode ser usada para tratamento e/ou prevenção de várias doenças ou distúrbios. Essas doenças ou distúrbios são preferencialmente relacionados com a produção insuficiente de GH endógena. A GH purificada pode ser usada e.g. para tratamento e/ou prevenção de deficiência de GH, enfraquecimento por SIDA, lipodistrofia (também chamada HARS - sindrome dismetabólica/de distrofia associada a HIV) , ou sindrome do intestino curto, em particular pediátrico. Outras doenças em cuja administração de hormona de crescimento pode estar indicada incluem cirrose hepática, deficiência de crescimento em adultos, aterosclerose, doença de Crohn e Colite Ulcerosa, osteoartrite, caquexia cardíaca, insuficiência cardíaca congestiva, insuficiência renal crónica, reconstituição ou mobilização das células sanguíneas, infertilidade masculina, mobilização de células estaminais hematopoéticas, esclerose múltipla, enfarte, Atrofia multisistémica, ou cancro. 27

EXEMPLO: Desenvolvimento de um novo meio de produção sem soro para células C127 expressando hGH 1. Introdução

Este estudo descreve o trabalho experimental relacionado com o desenvolvimento de um meio de cultura de produção (DMEM, "Meio de Eagle Modificado da Dulbecco) por adição de elementos metálicos vestigiais. Como resultado deste desenvolvimento, foi obtido um aumento assinalável de produtividade de r-hGH em culturas de células C127. A tabela 1 a seguir resume a composição do DMEM e o desenvolvimento que vai ser apresentado no enquadramento deste exemplo.

Tabela 1: Formulação do meio de crescimento, DMEM e meio de produção. COMPONENTES Meio de crescimento mg/mL DMEM mg/L Meio de Produção mg/L AMINOÁCIDOS L-ALANINA 49,45 L-ARGININA HCL 227,5 84,0 84,0 L-ASPARAGINA H20 27,50 L-ASPARTATO 21,65 L-CISTEÍNA HC1 H20 17,56 L-CISTEÍNA 2HC1 31,29 62,0 62,0 L-GLUTAMATO 40,35 L-GLUTAMINA 693,5 584,0 584,0 GLICINA 43,75 30,0 30,0 L-HISTIDINA HC1, H20 41,48 42,0 42,0 L-HIDROXIPROLINA 6,50 L-ISOLEUCINA 114,5 105,0 105, 0 L-LEOCINA 119,1 105,0 105, 0 L-LISINA HC1 151,3 146,0 146, 0 L-METIONINA 52,24 30,0 30,0 L-FENILALANINA 70,48 66,0 66,0 28 L-PROLINA 37,25 L-SERINA 39,25 42,0 42,0 L-TREONINA 93,45 95,0 95,0 L-TRIPTOFANO 15, 02 16,0 16,0 L-TIROSINA 2Na 2H20 75, 79 104,0 104,0 L-VALINA 92,85 93,0 93,0 SAIS CLORETO DE CÁLCIO 121,0 200 200 Fe (N03) 3.9H20 0,050 0,1 0,1 SULFATO FERROSO 7H20 1,251 KC1 334,2 400 400 CLORETO DE MAGNÉSIO 40,94 MgS04 ANIDRO 48,84 97 97 Na2HP04 71,02 SELENITO DE SÓDIO 5H20 0,030 NaCl 7500 6400 6400 NaH2P04 H20 62,5 125 125 NaHC03 1200 3700 3700 CLORETO DE LÍTIO 1,00 ZnS04.7H20 0,432 0,144 HIDARTOS DE CARBONO D-GLUCOSE 3650 4500 4500 VITAMINAS ÁCIDO ASCÓRBICO 0,500 BIOTINA 0,1035 CLORETO DE COLINA 11,48 4,00 4,00 VITAMINA BI2 1,68 D PANTOTENATO de Ca 2,34 4,00 4,00 ÁCIDO FÓLICO 3, 65 4,00 4,00 COMPONENTES Meio de crescimento mg/mL DMEM mg/L Meio de produção mg/L I-INOSITOL 17,1 7,00 7,00 NIACINAMIDA 2,27 O o O o ÁCIDO PARA-AMINO-BENZÓICO 1,00 PIRIDOXAL-HC1 0,25 4,00 4,00 PIRIDOXINA HC1 4,531 RI BOFLAVINA 0,419 0,40 0,40 TIAMINA HC1 2,92 O o O o LÍPIDOS ÁCIDO LINOLEICO 0,042 ÁCIDO LIPÓICO 0,205 LINOLEATO DE METILO 0,1 MISCELÂNEA CITRATO FÉRRICO 122,5 1,22 HEPES 3600 HIPOXANTINA 2,900 d-GLUCONATO DIHIDRATO DE FERRO (II) 4,820 29 L-GLUTATIONA 0,500 MERCAPTOETANOL 0,234 PIRUVATO DE SÓDIO 57,00 110,0 110.0 PUTRECINA, 2HC1 0,241 TIMIDINA 0,505 DETERGENTES ETANOLAMINA (como base) 6,25 OLIGOELEMENTOS CLORETO DE PRATA 0,0000044 CLORETO DE BÁRIO 2H20 0,002 CLORETO DE COBALTO 6H20 0,002 SULFATO CRÓMICO DE POTÁSSIO 0,001 BROMETO DE POTÁSSIO 0,0001 IODETO DE POTÁSSIO 0,0001 ÁCIDO MOLÍBDICO (Molibdato de amónio 4H20) 0,0001 FLUORETO DE SÓDIO 0,004 METAVANADATO DE AMÓNIO 0,0006 NITRATO DE NÍQUEL 6H20 0,0002 CLORETO DE RUBÍDIO 0,00001 CLORETO DE ESTANHO 2H20 0,0001 SULFATO DE COBRE.5H20 0,0064 0,0064 CLORETO DE MANGANÊS 4H20 0,0001 ÓXIDO DE ΤΙΤΑΝΙΟ 0,001 SUPLEMENTOS INSULINA RECOMBINANTE HUMANA 10 mg/L AJUSTAMENTOS FÍSICOS PH 7,110,1 7,010,2 7,010,2 OSMOLARIDADE (mosm/kg) 325125 330130 330130 2. Materiais e Métodos

REAGENTES E SOLUÇOES

Todos os reagentes químicos foram obtidos da Merck®: sulfato de Zinco (ZnS04.7H2O), Sulfato de Cobre (CUSO4.5H20), Cloreto de Bário (BaCl2.2H2O), Cloreto de Cobalto (C0CI2.6H20), Sulfato de Potássio e Crómio (K[Cr (S06H4)2 (H20) 2] .6H2O), Nitrato de Níquel (Ni (N03) 2 . 6H20), Selenito de Sódio (Na2SeC>3.5H20), Citrato Férrico (FeC6H507 número F3388 do catálogo da Sigma®) foi usado como fonte de Ferro. 30 A mistura de oligoelementos do meio de crescimento (100.000X) foi fornecida por JRH® Biosciences.

Todas as soluções de oligoelementos a serem analisadas foram preparadas como soluções concentradas em água destilada e esterilizadas por filtração através de um filtro de 0,2 pm. A adição dos diferentes suplementos analisados (soluções de metal etc.) em diferentes experiências foi realizada directamente no meio de cultura fresco.

CULTURAS CELULARES Células de murino C127 geneticamente modificadas (ATCC CRL 1616) foram usadas para a expressão da hormona de crescimento humana recombinante (rhGH). O vector é baseado em BPV69T compreendendo o sitio de clonagem múltiplo pBR322 e compreendendo 1,6 kb do minigene de rhGH sob controlo do promotor metalotioneina (MT-1) de ratinho. Culturas derivadas de um Banco de Células de Trabalho obtidas de diferentes lotes de produção de rhGH foram usadas nas experiências.

As culturas celulares foram mantidas incubadas a 36°C ±0,5 °C e 0,4 rpm em frascos rotativos de 2125 cm2 contendo 375 mL ± 15 mL de meio de cultura ou em frascos rotativos de 1700 cm cm2 contendo 300 mL de meio de cultura.

MEIO DE CULTURA O meio de cultura usado para a fase de produção de rhGH foi DMEM com 4,5 g/L de glucose tamponado com bicarbonato de sódio (3,7 g/L).

TITULAÇÃO DA RHGH 31 A medição da rhGH no meio de cultura foi realizada diariamente por titulação por HPLC de fase reversa:

Materiais

Synchropak RP4, 100 x 4,6 mm i.d. 300 Â Cat# C4R103-10 (Eichrom).

Recurso RPC 1 mL, 30 mm x 6,4 mm i.d., 15 ym, art 17-1181-01, Amersham Biosciences.

Symmetry300, 50 mm x 4,6 i.d., C4 5ym, P/N 186000287 (Waters).

Reagentes Ácido trifluoroacético (TFA) (Pierce, Cat#28904 ou equivalente).

Acetonitrilo (ACN) (Merck 1.00030 ou equivalente). Água Purificada, PW (e.g. água MilliQ, ou equivalente). Hélio

Soluções

Fase móvel A: TFA 0,08% em H20 (v/v)

Medir num frasco graduado o volume da água PW e adicionar TFA de acordo com a seguinte tabela. Agitar e rotular.

VOLUME DA FASE A VOLUME de Água MILIQ. VOLUME DE TFA 1 L 1 L 0,8 mL 0,5 L 0,5 L 0,4 mL 0,25 L 0,25 L 0,2 mL

Fase móvel B: TFA 0,08% em acetonitrilo (v/v)

Medir num balão volumétrico o volume de água PW e adicionar TFA de acordo com a tabela seguinte. Agitar e rotular.

VOLUME DA FASE B VOLUME DE ACN VOLUME DE TFA 1 L 1 L 0,8 mL 0,5 L 0,5 L 0,4 mL

32 0,25 L

0,25 L

0,2 mL

As condições da cromatografia são: - Eluição por gradiente: começando com uma mistura de fase A/fase B 60/40 e acabando em fase A/fase B 20/80. Gradiente completo em 5 minutos (ligeiramente variável dependendo dos instrumentos em uso). - Volume de injecção 50 ylitros. - Detecção: absorvância UV a 215 nm. - Curva de calibração: r-hGH padrão a 10, 50, 100, 120 e 150 yg/mL. A concentração de r-hGH de uma amostra é determinada por comparação com concentrações padrão de r-hGH.

PRODUTIVIDADE DE 6H A produtividade é expressa como mg de rhGH por frasco rotativo. Os dados brutos são a concentração de rhGH na colheita (conforme medido por HPLC) e número total de frascos rotativos colhidos. Tipicamente, um frasco de colheita durante a fase de colheita contém cerca de 109 células. 3. Resultados

Numa primeira série de experiências, foi analisado o efeito da elevada concentração de cobalto (20 μΜ de CoCl2.6H20) quando adicionado intermitentemente ao meio de cultura. A adição foi realizada durante a mudança dos dois meios no passo inicial {lavagem e PM = meio de produção, i.e. ponto 0 da fase de colheita) e no passo intermédio (colheitas 6 e 7) da fase de produção de um lote. Os resultados (não mostrados) sugerem que o promotor é activo e pode ser modulado. 33 A elevada produtividade foi também confirmada como outros elementos metálicos. Foram realizados ensaios com concentrações de 10 μΜ de bário (BaCl2.2H20), Cobalto (CoCl2.6H20) , Crómio (K [Cr (S06H4) 2 (H20) 2] . 6H20) e Níquel (Ni (NO3) 2.6H2O), adicionados continuamente ao meio, respectivamente. Os resultados desta experiência são ilustrados nas Figs. 1 e 2. A Fig. 1 mostra a quantidade de hGH secretada pelas células C127 que expressam hGH quando cultivadas em meio contendo os elementos analisados durante o tempo da experiência (14 dias). A Fig. 2 mostra os valores de produtividade média alcançados para cada elemento analisado. As percentagens de aumento médio da produtividade obtidas comparadas com um valor controlo, sem oligoelementos, variaram entre 1,1% para o Bário e 32,4 % para o Cobalto. Foi também verificado que a produtividade de rhGH aumentou de 9% até 32,5% comparado com os valores controlo quando analisados com indução continuada versus intermitente com cobalto. Nem o Bário nem 0 Crómio apresentaram aumento de produtividade nas concentrações analisadas em DMEM.

Medição dos oligoelementos individuais O DMEM foi suplementado com oligoelementos de Zn, Cu, Se e Co nas concentrações registadas a seguir na tabela 2. Estas concentrações correspondem às concentrações dos elementos metálicos no meio de crescimento. O aumento na produtividade de rhGH alcançado suplementando o DMEM com os oligoelementos está indicado na Tabela 2.

Tabela 2: percentagem de aumento da produtividade de rhGH quando se analisa os iões metálicos em DMEM nas concentrações de μΜ indicadas. 34 Ião CONCENTRAÇÃO (μΜ) % AUMENTO DE PRODUTIVIDADE Zn 1,50300 12,10% Cu 0,02560 37,50% Se 0,11400 -3,10% Co 0,00840 -3,20%

Deve notar-se que, no caso do Zinco, a concentração analisada de 1,5 μΜ provocou um fenómeno de "descolamento", i.e. uma separação da monocamada de células em relação ao substrato de plástico dos frascos rotativos. Em alguns casos, este descolamento conduziu a uma perda das culturas nos últimos passos de colheita (normalmente entre as colheitas 12-14) . o fenómeno de descolamento pode ser evitado usando recipientes de cultura de células adequados, tais como os frascos rotativos disponíveis pela Corning® sob o nome comercial Cellbind®.

Medição das interacções entre metais

Com base nos efeitos do Cobre e do Zinco na produtividade da produção de hGH, foram realizadas experiências de design factorial para analisar o possível efeito combinado dos metais. A análise estatística dos resultados é mostrada na tabela 3. Foi observado um forte efeito sinérgico na produtividade (p < 0,0001) usando Cu e Zn juntos.

Tabela 3: Análise estatística do ensaio de design factorial de factor 3.

Análise de Variância para a Produtividade Valor de Origem Soma dos Df Quadrado Proporção P-

Quadrados da média F A:Cobre 406,143 1 406,143 350,74 35 0,0000 B:Zinco 84,6308 1 84,6308 73,09 0,0000 C:Ctrl água 0,626472 1 0,626472 0,54 0,4807 AB 47,7896 1 47,7896 41,27 0,0001 AC 2,49008 1 2,49008 2,15 0,1766 BC 0,438906 1 0,438906 0,38 0,5534 Erro total 10,4215 9 1,15795 Total (corr.) 552,541 15 R - quadrado - - 98,1139 por cento R - quadrado (ajustado para d. f) - 96,8565 por cento Foi observado descolamento em todas as culturas tratadas com Zinco numa concentração de 1,5 μΜ, quer o Cobre estivesse presente ou não.

As experiências de design factorial subsequentes foram realizadas de modo a estudar o efeito da adição tanto de Zinco como do Cobre quando a concentração de Zinco foi diminuida (Zn 0,5 μΜ) e adicionando outros oligoelementos ao meio de crescimento, tais como Manganês, Selénio ou Citrato Férrico, o que poderia aumentar a produtividade e a aderência das culturas ao substrato.

Foi conseguido um crescimento continuo a partir de um ponto de partida de produtividade comum, de cerca de 20 mg de rhGH por frasco, com valores finais próximos de 70 mg de rhGH/RB comparado com 30 mg de rhGH da cultura de controlo com o DMEM padrão (não mostrado) . Os valores médios de aumento na produtividade da GH (i.e. a produtividade medida em mg/RB ao dia 14) comparados com o controlo são mostrados na Fig. 3. 36

Nesta série de experiências, o fenómeno de descolamento foi diminuído.

Adição de Aminoácidos

Foi realizada uma análise de aminoácidos de forma a determinar se o aumento na produtividade de hGH estava limitado pela disponibilidade de algum aminoácido. A Tabela 4 mostra a percentagem de aminoácidos em colheitas após dois dias em cultura, em meio com e sem adição de Zinco e Cobre.

Tabela 4: Percentagem da concentração de aminoácidos no meio bruto, colhido após dois dias em cultura, originado em culturas mantidas com culturas de DMEM padrão ou DMEM suplementado com 0,5 μΜ de Zn, 0,02 μΜ de Cu e 4,8 μΜ de citrato férrico. AMINOÁCIDOS DMEM PADRÃO DMEM SUPLEMENTADO L-Glutamina 31% 13% L-Serina 28% 11% L-Cistina 20% 13% L-Aminoácidos 50-100% 39-86% restantes

Uma mistura de Cobre, Zinco e citrato férrico (0,5 μΜ de Zn, 0,02 μΜ de Cu e 4,8 μΜ de Citrato Férrico) foi analisada com combinações dos aminoácidos consumidos em maior proporção: L-glutamina (Gin 4,8 mM), L-serina (Ser 0,49 mM) e L-cistina (Cys 0,29 mM) . Os resultados são mostrados na Fig. 4. Não foi observado nenhum efeito positivo na produtividade para nenhum dos aminoácidos testados, nem separadamente nem combinados. 37

Quando os metais foram adicionados em conjunto com os aminoácidos, só foram observados pequenos efeitos na produtividade: um efeito ligeiramente positivo da glutamina (desde 78,2% até 81,1%) e um efeito negativo da cistina (desde 78,2% até 69,9 %) . Essas diferenças não foram consideradas significativas. A produtividade difere claramente entre culturas tratadas com uma mistura de metais em DMEM (valor médio de cerca de 50 mg de rhGH/RB por colheita) em relação às que não compreendem os metais (cerca de 30 mg de rhGH/RB por colheita) . À luz destes resultados, não se considerou necessário modificar a composição original de aminoácidos do meio de produção.

Titulação do efeito do cobre e do zinco

De forma a medir a concentração óptima de cobre, foi realizada uma experiência, mantendo a concentração de Citrato Férrico (4,8 μΜ) e a concentração de Zinco (0,5 μΜ) constantes, e variando as concentrações de Cobre (Fig. 5).

Conforme mostrado na Fig. 5, a experiência de dose-resposta confirmou que a concentração de suplementação óptima para o cobre no DMEM é 25,6 nM quando analisado nas concentrações de Zinco e de Citrato Férrico indicadas.

Noutra experiência, a concentração de Citrato Férrico (4,8 μΜ) e as concentrações de Cobre (0,025 μΜ) foram mantidas constantes e a concentração de Zinco variou (Fig. 6). Foi observado um nível máximo de produtividade (plateau) com concentrações de Zinco acima de 200 nM, estabilizando a produtividade a cerca de 60% acima do valor de controlo médio. 38 RESUMO dos resultados A Fig. 7 resume os resultados obtidos com iões de Zn e Cu em concentrações vestigiais, em conjunto com ou sem iões férricos.

Os seguintes valores foram obtidos com base em dados obtidos para o aumento na produtividade adicionando os oligoelementos metálicos ao meio DMEM:

Zinco 1,5 μΜ: 10,3% ±5,0%, Zinco 0,5 μΜ; 16,8% ±1,6%.

Cobre 0,02 μΜ: 32,1 % ±9,4%,

Zinco 1,5 μΜ + Cobre 0,02 μΜ: 66,3% ±16%

Zinco 0,5 μΜ + Cobre 0,02 μΜ: 61,2% (±10%)

Zinco 0,5 μΜ ± Cobre 0,02 μΜ + Citrato Férrico 4,8 μΜ: 69,4% ±19%. À luz destes dados, a seguinte mistura é óptima como aditivo para o meio DMEM: • Cobre como sulfato de cobre (CuS04.5H20) a 25 nM. • Zinco como sulfato de zinco (ZnS04.7H20), entre 50 nM e 1500 nM, com concentrações preferidas a variarem desde 200 até 500 nM. • Citrato Férrico, numa concentração de 4,8 μΜ até uma concentração final de cerca de 6 μΜ do ião, desde que o Nitrato Férrico já esteja presente no DMEM.

Conclusão: O uso de iões de Cobre, Zinco e Férricos em quantidades vestigiais como suplementos do meio DMEM aumentou a produtividade de rhGH em mais de 50% comparado com o DMEM padrão. 39

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Lisboa, 28 de Fevereiro de 2011

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a produção da hormona de crescimento compreendendo o passo de cultivo de células de uma linha celular que expressa a hormona de crescimento num meio de cultura de células sem componentes derivados de soro animal, o meio compreendendo Zinco numa concentração variando desde 0,2 μΜ até 1,75 μΜ e Cobre numa concentração variando desde 10 nM até 75 nM e iões Férricos numa concentração de 5 ou 6 μΜ.

2. O processo de acordo com a reivindicação 1, em que o meio compreende Zinco a 0,2 μΜ.

3. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o meio compreende Zinco a 0,5 μΜ.

4. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o meio compreende Zinco como sulfato de Zinco.

5. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o meio compreende Cobre a 25 nM.

6. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o meio compreende Cobre como sulfato de cobre.

7. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o meio compreende 2 iões Férricos como citrato Férrico e/ou nitrato Férrico.

8. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o meio compreende ainda os componentes de um meio básico. 9. 0 processo de acordo com a reivindicação 8, em que o meio básico é Meio de Eagle Modificado da Dulbecco (DMEM). 10. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a hormona de crescimento é expressa sob o controlo de um promotor de metalotioneina (MT). 11. 0 processo de acordo com a reivindicação 10, em que o promotor de metalotioneina é o promotor MT-1 de rato.

12. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda o passo de recolher a hormona de crescimento da cultura de células.

13. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda purificar a hormona de crescimento.

14. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda formular a hormona de crescimento purificada com um transportador farmaceuticamente aceitável para obter uma composição farmacêutica. 15. 3 0 processo ou uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a hormona de crescimento é a hormona de crescimento humana. 16. Uso de um meio conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 até 9 para a produção da hormona de crescimento. 17. Uso de um meio conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 até 9 para a manutenção de células em cultura durante a fase de produção da hormona de crescimento. 18. Uso de acordo com a reivindicação 16 ou 17, em que a hormona de crescimento é a hormona de crescimento humana. 19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 até 18, em que as células são células C127 de rato. Lisboa, 28 de Fevereiro de 2011 1/5 Ο Hiquel-*· Bário —gf caJialto -*>- Crómio

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