KR101867134B1

KR101867134B1 - 포유류 세포를 이용하여 목적 물질을 고효율로 생산하기 위한 세포 배양 배지, 이를 이용한 세포 배양 방법 및 목적 물질의 생산 방법

Info

Publication number: KR101867134B1
Application number: KR1020150040175A
Authority: KR
Inventors: 박홍우; 김봉균
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2015-03-23
Filing date: 2015-03-23
Publication date: 2018-06-12
Also published as: CN107660232A; US20180072986A1; US20200216800A1; KR20160113880A; WO2016153191A1

Abstract

본 발명은 포유류 세포를 이용하여 상기 세포에서 목적 물질을 고효율로 생산하기 위한 세포 배양 배지 및 이를 이용한 세포 배양 방법 및 목적 물질의 생산 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 배지 중에 30 μM 이상의 농도로 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물을 포함하는 세포 배양 배지 및 이를 이용한 세포 배양 방법 및 목적 물질의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 어떠한 세포 성장 저해 효과를 나타내지 않으면서도, 탁월한 항체 생산 향상 효과를 거둘 수 있는 포유류 세포를 이용한 재조합 단백질 생산용 세포 배양 배지를 제공할 수 있다.

Description

포유류 세포를 이용하여 목적 물질을 고효율로 생산하기 위한 세포 배양 배지, 이를 이용한 세포 배양 방법 및 목적 물질의 생산 방법 {Cell culture media for production of target material with high yield using mammalian cell, method for culturing cells and production of target material using the cell culture media}

본 발명은 포유류 세포를 이용하여 상기 세포에서 목적 물질을 고효율로 생산하기 위한 세포 배양 배지 및 이를 이용한 세포 배양 방법 및 목적 물질의 생산 방법에 관한 것이다.

중국 햄스터 난소 세포 (Chinese Hamster Ovary cells, CHO cells)는 재조합 치료 단백질들을 생산하기 위해서 바이오약학 분야에서 폭넓게 사용되고 있는 바, 이는 이러한 세포들이 매우 빠른 성장 속도, 높은 안정성 및 효과적인 전이유전자 발현 능력을 갖기 때문이다. 이 경우, 단클론 항체의 대량 생산용으로서 높은 세포 밀도 및 높은 생산율을 보유한 화학 조성 배지 (Chemically Defined Media, CDM)가 선호되는데, 이는 경제적 이유 및 전염성 스펀지형 뇌병증 및 다른 오염원들과 관련된 안전성의 문제 때문이다. 그러나, 모든 재조합 CHO (rCHO) 세포주들에 대해서 적합한 공통의 화학 조성 배지에 대해서 보고된 바는 없는 바, 이는 다양한 세포주들에 대해서 다른 영양 요구조건들을 만족시켜야 하기 때문이다.

종래 rCHO 세포들의 현탁 배양물 중에서 단클론 항체의 생산을 증가시키기 위한 많은 연구들이 보고된 바 있다. 예를 들어, 부티레이트, 디메틸 설폭사이드, 및 펜타노익 산을 rCHO 세포 배양 배지에 첨가하여, 재조합 단백질 생산을 증가시키고자 한 연구가 보고된 바 있다 (Mimura Y, Lund J, Church S, Dong S, Li J, Goodall M, Jefferis R (2001) Butyrate increases production of human chimeric IgG in CHO-K1 cells whilst maintaining function and glycoform profile. J Immunol methods 247:205-216; Liu CH, Chu IM, Hwang SM (2001) Enhanced expression of various exogenous genes in recombinant Chinese hamster ovary cells in presence of dimethyl sulfoxide. Biotechnol Lett 23:1641-1645). 상기 연구들에서는 비록 재조합 단백질 생산에 있어서 긍정적인 효과들이 관찰되었지만, 상기 화합물들이 rCHO 세포들에 대해서 갖는 독성 효과들로 인해서, 단백질 생산을 최대화하기 위해서 상기 화합물들을 고농도로 사용하는 데에는 한계가 있다.

해밀턴 및 햄 연구진들은 MCDB 301 및 MCDB 302와 같은 무단백 배지 (Protein-Fee Media, PFM)에서 CHO 세포들을 최적으로 성장시키기 위해서는 미량 원소들을 첨가하는 것이 중요하다는 점을 보고한 바 있다 (Hamilton WG, Ham RG (1977) Clonal growth of Chinese hamster cell lines in protein-free media. In Vitro 13:537-547). 또한, CHO 세포들의 유가식 (fed-batch) 현탁 배양에 있어서, 농축 첨가물 중 미량의 금속 원소들을 첨가해 줄 경우, 세포 수명연장 촉진에 의해서 단클론 항체의 생산이 현저하게 증가되는 것으로 보고된 바도 있다 (Huang YM, Hu W, Rustandi E, chang K, Yusuf-Makagiansar H, Ryll T (2010) Maximizing productivity of CHO cell-based fed-batch culture using chemically defined media conditions and typical manufacturing equipment. Biotechnol Prog 26:1400-1410). 그러나, 농축 첨가물 중 금속 이온 조성에 대해서는 알려진 바가 없다.

한편, 아연 (Zn) 이온은 DNA 합성, 단백질 합성, 세포 분열, 세포 증식, 세포 사멸, 에너지 생산 등에 관여하는 300개 이상의 생물학적 작용을 조절하는 조효소로 알려져 있다. 지난 20년 동안, Zn 이온과 세포 배양과의 관련성을 연구한 몇몇 논문들이 존재하며, 이 중 항산화 작용 관련 논문이 약 24%로 가장 큰 비중을 차지하고, 다음으로 인슐린 유사 효과 또는 세포 사멸 억제와 관련된 연구들이 높은 비중을 차지한다. 종래 Zn 이온 관련 주요 연구 내용은 Zn 이온의 세포막 구조 및 기능 유지, 항산화 (설프히드릴기 방어 및 하이드록실 라디칼 생성 억제, 항산화 단백질 메탈로티오인 생성 유도), 항염증, 면역반응조절, 세포 사멸 억제 (MAP 키나아제 경로를 통한 세포 분열 촉진, 카스파아제-3 활성 억제, Bcl-2/Bax 비율 증가), mRNA의 안정성 증가, 인슐린 대체 효과 (하이브리도마 (CRL1606), 미엘로마 (NS0), CHO 세포 (CHO-K1)), 리보뉴클레아제의 활성 억제 등에 관한 것이었다. 그러나, CHO 세포를 포함하는 포유류 세포들의 현탁 배양을 이용하여 재조합 단백질을 생산하기 위한 배양 배지에 있어서 Zn 이온이 미치는 영향에 대한 연구는 전무한 실정이다.

따라서, 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하여, CHO 세포를 포함하는 포유류 세포를 이용하여 목적 물질을 생산하기 위한 배양 배지에 있어서, 세포 독성을 나타내지 않으면서도, 목적 물질의 생산을 최대화할 수 있는 세포 배양 배지, 이를 이용한 세포 배양 방법 및 목적 물질의 생산 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서, 포유류 세포를 이용한 목적 물질 생산용 세포 배양 배지로서, 30 μM 이상의 농도로 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물을 포함하는 세포 배양 배지를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 포유류 세포는 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포, 유햄스터 신장 (Baby Hamster Kidney, BHK) 세포, 인간 배아 신장 (Human Embryonic Kidney, HEK) 세포, 쥐 미엘로마 (NS0 또는 SP2/0) 세포 및 인간 망막 (PerC6) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 목적 물질은 단클론 항체, 재조합 항체 및 그 단편을 포함하는 면역글로불린; 항체의 불변 영역 (Fc)에 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 단백질; 호르몬; 사이토카인; 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포 배양 배지는 무단백 배지 또는 화학 조성 배지일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 Zn 이온의 염은 ZnSO₄, ZnSO₃, Zn(NO₃)₂, Zn(H₂PO₄)₂, Zn₃(PO₄)₂, Zn(NO₃)₂, (C₆H₅O₇)₂Zn₃, Zn₃BO₆, ZnBr₂, ZnF₂, ZnCl₂, ZnI₂, (C₂H₃O₂)₂Zn, [ZnCO₃]₂·[Zn(OH)₂]₃, Zn(CIO₄)₂, ZnMoO₄, ZnTiO₃, ZnSeO₃, Zn(CN)₂, ZnSiF₆·6H₂O, (C₄H₅O₂)₂Zn, ZnC₂O₄, Zn(BF₄)₂, (C₇H₇O₃S)₂Zn 등으로 이루어진 염들의 무수화물 또는 수화물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 Zn 이온의 킬레이트 화합물은 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA), 데스페록사민 메실레이트, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DPTA), 트랜스-1,2-디아미노시클로헥산-N,N,N',N'-테트라아세트산 (CDTA), N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (TMEDA), 프탈로시아닌, 피리치온, 메소-테트라페닐포피린, 8-하이드록시퀴놀레이트, 비스(헥사메틸디실라지드), 디[비스(리플루오로메틸설폰닐)이미드]로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물과 Zn 이온의 킬레이트 화합물일 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 세포 배양 배지를 이용한 세포 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 세포 배양 배지 중 상기 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물은 세포 배양 전 상기 배지에 30 μM 이상의 농도로 첨가할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 세포 배양 배지 중 상기 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물은 세포 배양 도중 상기 배지에 30 μM 이상의 농도로 첨가할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포 배양 배지 중 상기 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물은 세포 배양 도중 상기 배지에 간헐적으로 첨가하되, 최종 농도 30 μM 이상의 농도로 첨가할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포 배양 배지 중 상기 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물은 세포 배양 도중 상기 배지에 연속적으로 첨가하되, 최종 농도 30 μM 이상의 농도로 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 세포 배양 배지를 이용한 목적 물질의 생산 방법으로서,

상기 세포 배양 배지 중에서 세포를 배양하는 단계;

상기 세포가 목적 물질을 발현하는 단계; 및

상기 세포로부터 목적 물질을 분리하는 단계를

포함하는 목적 물질의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 어떠한 세포 성장 저해 효과를 나타내지 않으면서도, 탁월한 항체 생산 향상 효과를 거둘 수 있는 포유류 세포를 이용한 목적 물질 생산용 세포 배양 배지 및 이를 이용한 세포 배양 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 미량 원소들의 첨가 농도에 따른 HY-PFM 배지에서 rCHO-1 세포의 최대세포농도와 항체 생산량 변화를 도시한 그래프이다 (n=3).
도 2는 미량 원소들을 각각 20 배씩 개별적으로 첨가한 경우, HY-PFM 배지에서 rCHO-1 세포의 최대세포농도와 항체 생산량 변화를 도시한 그래프이다 (n=3).
도 3은 HY-PFM에서 Zn 이온 농도에 따른 rCHO-1 세포의 최대세포농도와 항체 생산량 변화를 도시한 그래프이다 (n=3).
도 4는 HY-CDM에서 Zn 이온 농도에 따른 rCHO-1 세포 (n=2)의 최대세포농도와 항체 생산량 변화를 도시한 그래프이다.
도 5는 HY-CDM에서 Zn 이온 농도에 따른 rCHO-2 세포 (n=2)의 최대세포농도와 항체 생산량 변화를 도시한 그래프이다.
도 6a 및 6b는 Zn 이온 농도를 60 μM로 강화하였을 때, 4 가지 상용 CDM 배지에서 rCHO-1 세포의 최대세포농도 (도 6a) 및 최대항체농도 (도 6b)가 어떻게 변화하는지를 나타낸 그래프이다.
도 7a 및 7b는 HY-PFM 배지 (도 7a) 및 HY-CDM 배지 (도 7b) 중에서 rCHO-1 세포를 현탁 배양할 경우, 세포 성장 및 항체 생산에 대한 결과를 나타낸 그래프이다 (n=2).

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 하기와 같다.

용어 "배지(media)"는 세포의 유지, 전개 및/또는 미분화를 돕는 영양 조성물을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "화학 조성 배지 (Chemically Defined Media, CDM)"는 모든 성분이 그들의 화학식으로 기재될 수 있고, 공지된 농도로 존재하는 배지를 의미한다. 또한, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "무단백 배지 (Protein-Free Media, PFM)"는 실질적으로 폴리펩타이드를 포함하지는 않지만, 동물 또는 식물로부터 유래된 확인되지 않은 일부 올리고펩타이드를 포함하기도 하는 배지를 의미한다.

용어 "세포"는 세포 집단을 의미한다. 세포는 야생형이거나 재조합될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "세포배양" 또는 "세포배양 기술" 또는 "세포배양 공정"은 세포의 생존 및/또는 성장 및/또는 미분화에 적합한 방법 및 조건을 의미한다.

용어 "목적 물질" 은 연구, 진단 또는 치료 목적에 유용할 수 있는 임의의 단백질, 세포, 바이러스 또는 유전체를 지칭한다. 단백질로는 포유류 단백질 또는 비-포유류 단백질을 포함할 수 있고, 선택적으로는 수용체 또는 리간드를 포함할 수 있다. 목적 물질의 예시는, 이에 제한되지 않으나, 레닌과 같은 분자; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 파라티로이드 호르몬; 흉선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-안티트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 모낭 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 혈병형성 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 본 빌레브란트 (von Willebrands) 인자; 혈병형성방지 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨배설 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 유로키나아제, 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 헤모포이에틴 성장 인자; TNF 및 TNF 수용체 (TNFR) 패밀리의 구성원들, 예컨대 종양 괴사 인자-알파 및 -베타, CD40 리간드, Apo-2 리간드/TRAIL, DR4, DR5, DcRl, DcR2, DcR3, OPG, Fas 리간드; 엔케팔리나아제; RANTES (발현 및 분비된 정상적 T-세포의 활성화시 조절됨); 인간 마크로파지 염증 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러관 억제 물질 (Muellerian-inhibiting substance); 릴렉신 A-사슬; 릴렉신 B-사슬; 프로릴렉신; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마아제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양성 인자, 예컨대 뼈-유도성 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-유도성 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 전환 성장 인자 (TGF), TGF-알파 및 예컨대 TGF-β1, TGF-β2, TG-P3, TGF-P4 또는 TGF-P5를 포함하는 TGF-베타; 인슐린형 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌n IGF-I), 인슐린형 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도성장 인자; 면역독소; 뼈 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSFs), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 트롬보포이에틴 (TPO); 인터류킨 (ILs), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥사이드 디스뮤타아제; T-세포 수용체; 표면 멤브레인 단백질; 부패 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대 AIDS 껍질의 일부분, gpl20; 수송 단백질; 귀환 수용체; 아드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 열거된 임의의 폴리펩티드의 변이체 및/또는 절편; 및 CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 및 CD34와 같은 다양한 단백질 항원에 대한 항체; ErbB 수용체 패밀리의 구성원, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, Macl, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 그의 α 또는 β 서브유닛을 포함하는 αν/β3_인테그린 (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 예컨대 VEGF; IgE; 혈액군 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C; Apo-2L 수용체, 예컨대 Apo-2 (DR5), DR4, DcR1, DcR2, DcR3; 및 상기 밝혀낸 항체의 변이체 및/또는 절편; 융합 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR), CTLA-4, 혈관 내피 성장 인자 수용체-1 (VEGFR-1), 혈관 내피 성장 인자 수용체-2 (VEGFR-2), IL-1 수용체, 트롬보포이에틴 결합 펩타이드, 림프구기능관련항원3 (LFA-3) 등의 단백질과 인간 면역글로블린 G-1의 Fc 절편 융합 단백질 등을 포함할 수 있다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 기재된 구성은 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

이하, 도면 및 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명자들은 포유류 세포 배양 배지 중에서 다양한 성분들이 세포 성장 및 목적 물질 생산에 미치는 영향들을 다각도로 분석하였으며, 그 결과 배지 중에 소정 농도의 Zn 이온이 존재할 경우, 세포 성장에 아무런 독성을 나타내지 않으면서도 목적 물질 생산을 최대화할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

체내에서 Zn 이온은 DNA 합성, 단백질 합성, 세포 분열, 세포 증식, 세포 사멸, 에너지 생산 등에 관여하는 300개 이상의 생물학적 작용을 조절하는 조효소로 알려져 있다. 그러나, 현재 상용화된 대부분의 세포배양 배지에는 기본 성분으로서 Zn 이온이 포함되지는 않으며, 존재한다 하더라도 3 μM 이하의 소량으로 존재하고, 예를 들어, MCDB 계열의 경우 0.1 ~ 3.0 μM, Ham's F-10의 경우 0.1 μM, Ham's F-12의 경우 3 μM 등의 함량으로 존재한다. 또한, 배지 첨가물로서 첨가되는 경우에도 그 함량은 10 μM 이하의 함량으로 소량 첨가되며, 예를 들어, 혈청의 경우 기본 배지에 0.1 ~ 3.1 μM의 농도로 첨가되고, 무단백 배지의 경우 기본 배지에 3.02 ~ 9.10 μM의 농도로 첨가되며, 상용화된 화학 조성 배지에서도 대부분 10 μM 이하의 함량으로 첨가된다 (예를 들어, Power CHO2 (9.2 μM), HyCell CHO (11.9 μM), CDM4CHO (7.1 μM), Excell CD CHO (<1.5 μM), ProCHO5 (8.3 μM), CD OpriCHO (6.4 μM).

본 발명자들은 하기 실시예로부터도 알 수 있는 바와 같이, 무단백 배지 및 화학 조성 배지에서 다양한 미량 원소들의 배지 중 농도를 조절하며 세포 배양을 진행한 다음, 최대세포농도와 생산된 목적 물질의 농도를 측정하였으며, 그 결과, 다른 미량 원소들의 경우 그 농도 또는 함량이 변화하더라도 최대세포농도와 목적 물질의 농도에 유의미한 변화를 일으키지 못하였으나, Zn 이온의 경우 현저한 변화를 야기함을 발견하게 되었다. 또한, 다양한 농도의 Zn 이온을 첨가하였을 때, 특히 Zn 이온이 배지 중에 30 μM 이상의 농도로 존재하는 경우, 항체 비생산속도의 현저한 향상을 야기하며, 특히 배지 중에 30 μM 내지 90 μM의 농도로 존재하는 경우, 어떠한 세포 성장 저해 효과를 나타내지 않으면서도, 탁월한 목적 물질 생산 향상 효과를 거둘 수 있다는 점을 파악하게 되었다.

이에, 본 발명은, 포유류 세포를 이용한 목적 물질 생산용 세포 배양 배지로서, 30 μM 이상의 농도로 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물을 포함하는 세포 배양 배지를 제공한다.

본 발명에 따른 세포 배양 배지는 포유류 세포의 배양에 적합하며, 성장 속도, 안정성 및 전이유전자 발현 능력 등을 고려할 때 중국 햄스터 난소 세포를 배양하는 경우에 사용될 수도 있지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 유햄스터 신장 (Baby Hamster Kidney, BHK) 세포, 인간 배아 신장 (Human Embryonic Kidney, HEK) 세포, 쥐 미엘로마 (NS0 또는 SP2/0) 세포 및 인간 망막 (PerC6) 세포 등과 같은 다양한 포유류 세포들의 배양에도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 세포 배양에 의해서 목적 물질을 생산하기 위한 것인 바, 본 발명에 따라서 궁극적으로 수득하고자 하는 목적 물질은 상기 용어의 정의에서 열거된 바와 같은 다양한 물질들이 포함되며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 단클론 항체, 재조합 항체 및 그 단편을 포함하는 면역글로불린; 항체의 불변 영역 (Fc)에 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 단백질; 호르몬; 사이토카인; 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질일 수 있다.

한편, 본 발명에서와 같이 Zn 이온을 소정 농도로 강화시킴으로써 목적 물질 생산 향상 효과가 나타나는 현상은, 무단백 배지 (protein-free medium)에서 뿐만 아니라 화학 조성 배지 (chemically defined medium)에서도 나타났다.

또한, 본 발명에서 Zn 이온은 상기 농도를 만족시키는 한, 염의 형태 또는 킬레이트 화합물 등과 같은 다양한 형태로 배지 중에 첨가될 수 있는 바, 이에 제한되는 것은 아니지만, Zn 이온의 약학적으로 허용가능한 모든 형태의 염으로서, 예를 들어, ZnSO₄, ZnSO₃, Zn(NO₃)₂, Zn(H₂PO₄)₂, Zn₃(PO₄)₂, Zn(NO₃)₂, (C₆H₅O₇)₂Zn₃, Zn₃BO₆, ZnBr₂, ZnF₂, ZnCl₂, ZnI₂, (C₂H₃O₂)₂Zn, [ZnCO₃]₂·[Zn(OH)₂]₃, Zn(CIO₄)₂, ZnMoO₄, ZnTiO₃, ZnSeO₃, Zn(CN)₂, ZnSiF₆·6H₂O, (C₄H₅O₂)₂Zn, ZnC₂O₄, Zn(BF₄)₂, (C₇H₇O₃S)₂Zn 등으로 이루어진 염들의 무수화물 또는 수화물, 또는 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA), 데스페록사민 메실레이트, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DPTA), 트랜스-1,2-디아미노시클로헥산-N,N,N',N'-테트라아세트산 (CDTA), N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (TMEDA), 프탈로시아닌, 피리치온, 메소-테트라페닐포피린, 8-하이드록시퀴놀레이트, 비스(헥사메틸디실라지드), 디[비스(리플루오로메틸설폰닐)이미드] 등과 Zinc 이온의 킬레이트 화합물의 형태로 첨가될 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 세포 배양 배지를 이용한 세포 배양 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 회분식 배양, 유가식 배양 및 연속식 배양 모두에 적합하며, 전술한 바와 같이 상기 세포 배양 배지 중에 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물의 최종 농도가 30 μM 이상이 되는 한, 다양한 방식으로 세포를 배양하는 것이 가능하다.

예를 들어, 상기 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물을 세포 배양 전 상기 배지에 30 μM 이상의 농도로 첨가하거나, 세포 배양 도중 상기 배지에 30 μM 이상의 농도로 첨가할 수도 있다. 또한, 세포 배양 도중 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물을 첨가하는 경우, 이를 간헐적 또는 연속적으로 첨가하여 최종 농도가 30 μM 이상이 되도록 할 수 있다. 특히, 이러한 배양 방법은 고농도의 Zn 이온, 예를 들어 90 μM 이상의 농도에서 나타날 수 있는 세포성장 저해 효과를 최소화할 수 있는 방법으로서, 유가식 배양으로 활용될 수 있는 장점이 있다.

더 나아가, 본 발명은 상기 세포 배양 배지를 이용한 목적 물질의 생산 방법을 제공하며, 이는 상기 세포 배양 배지 중에서 세포를 배양하는 단계; 상기 세포가 목적 물질을 발현하는 단계; 및 상기 세포로부터 목적 물질을 분리하는 단계를 포함한다.

특히, 상기 세포 배양 배지 중에서 세포를 배양하는 단계에 있어서는, 선별된 세포에 적합한 배양 공정 및 배지 선정, 또한 배양 온도, 배양 배지 조성, 배지 첨가물의 첨가 시기 및 첨가량 등과 같은 배양 조건 확립이 매우 중요한 사항이며, 단위 배지 당 고생산성을 달성할 수 있도록 선택되어야 한다. 이는 목적 물질의 안정적인 생산을 야기하는 세포주를 이용하여 세포의 농도 증가 및 배양기간 향상을 통해서 달성될 수 있으며, 이를 위해서는 세포 배양 배지와 배지 조성의 선정이 가장 중요한 요소이다. 전술한 바와 같이, 본 발명자들은 포유류 세포 배양 배지 중에서 다양한 성분들이 세포 성장 및 목적 물질 생산에 미치는 영향들을 다각도로 분석하였으며, 세포 배양 배지 중에 30 μM 이상의 농도로 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물이 존재하는 경우, 세포 성장에 아무런 독성을 나타내지 않으면서도 목적 물질의 생산이 최대화할 수 있다는 사실을 발견하였는 바, 본 발명에 따르면 종래기술에 비해서 더욱 우수한 생산성으로 목적 물질을 생산해낼 수 있다.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

세포주

단클론 항체 (mAB)를 생산하는 2 종의 재조합 CHO DG44 세포주를 사용하였고, 이하 각각을 rCHO-1과 rCHO-2로 표기하기로 한다. 각각의 세포주는 무단백 배지 HY-PFM (in-house) 또는 화학 조성 배지 HY-CDM (in-house)에서 8 계대 이상 현탁 적응시킨 후, 미량원소들의 농도에 따른 영향, 유효 미량원소 선별 및 ZnSO₄·7H₂O (Zn)의 농도에 따른 영향 및 상용 화학 조성 배지에서 세포 성장 및 항체 생산에 대한 영향을 평가하였다.

세포 현탁 배양법

세포주는 4 × 10⁵ cells/ml의 접종농도로, 30 ml/125 ml Erl. flask의 작업 부피, 교반 속도 120 rpm의 회전 교반기, 배양온도 37℃, 5% CO₂, 습윤하 조건에서 배양하였으며, 각각의 실험 조건에서 세포 접종 및 계대는 1,000 rpm (×162 g)에서 5 분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 가온된 배지로 단일 세포로 분산 후, 접종 세포로 사용하였다. 각각의 상용 배지 및 실험조건에서 잔존 배지의 영향을 최소화하고자 각각의 조건에서 3 계대 배양하여 평가하였다.

생세포 농도 분석

생세포 농도는 혈구계 (hemocytometer) (Neubauer improved bright-line, Marienfeld, Germany), 역상 현미경 (CK30, Olympus, Japan) 및 트리판 블루 염료 배제법 (trypan blue dye exclusion)을 이용하여 분석하였다.

항체 농도 분석

항체의 분석을 위한 시료는 각각의 실험 조건에서 세포 접종한 후 4, 6, 8, 10, 12일에 세포 배양액을 분취하고, 1,000 rpm (×162 g)에서 5 분간 원심분리하여 상등액을 분석 전까지 -20℃에서 보관하였다. 항체 농도는 샌드위치 효소 연결 면역흡착 분석법 (sandwich enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)에 의해 측정하였다. ELISA에서는 mAB의 검출을 위해 1차 항체로서 항-인간 IgG (Fab 특이적) (I5260, Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하였고, 발색을 위한 항체로서 인간 IgG (Fc 특이적)-호스래디시 퍼옥시다아제 (A0170, Sigma)를 사용하였다. 블록킹 과정은 1% (w/v) 우혈청 알부민/포스페이트 완충 식염수를 사용하였고 3, 3', 5, 5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액 (KPL, Gaithersburg, MD, USA)을 발색시약으로 이용하여, 2 M H₂SO₄를 사용함으로써 발색 반응을 정지시켰다. 항체 농도 분석을 위한 흡광도는 동적 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450 nm 파장에서 측정하였다.

실시예 1. HY - PFM 배지를 이용한 rCHO -1 세포주의 현탁 배양에서 항체 생산을 향상시키는 미량원소들의 유효 농도 범위 평가

HY-PFM 배지에서는 미량 원소로서, 0.01 μM CuSO₄·5H₂O (Cu), 3 μM ZnSO₄·7H₂O (Zn), 0.03 μM Na₂SeO₃ (Se), 0.01 μM NH₄VO₃ (V), 0.001 μM MnSO₄·H₂O (Mn) 및 0.01 μM (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O (Mo)을 대조군으로 사용하였고, 항체 생산에 효과적인 농도 범위를 평가하고자 상기 미량 원소 혼합물을 1~40 배 농도 범위에서 세포 배양을 진행하고 최대세포농도와 항체 농도를 측정하였다.

도 1에는 미량 원소들의 첨가 농도에 따른 HY-PFM 배지에서 rCHO-1 세포의 최대세포농도와 항체 생산량 변화를 그래프로 도시하였다 (n=3). 도 1을 참조하면, 미량 원소가 10 배 농도로 첨가된 조건에서는 대조군과 유사한 최대세포농도로 성장하고, 이후 농도가 증가할수록 최대세포농도는 감소하나, 미량 원소가 15~20 배로 첨가된 조건에서는 1.2×10⁷ cells/ml으로 대조군 대비 약 80% 이상 성장하며, 최대항체농도는 미량 원소 15~25 배 첨가 조건에서 대조군 대비 1.9 배 이상 향상되어 약 240 mg/L 이상 생산된다는 사실을 알 수 있다.

실시예 2. 미량 원소들 중 항체 생산을 향상시키는 성분에 대한 선별 평가

미량 원소들 중에서 항체 생산을 향상시키는 성분을 선별하기 위해서, HY-PFM 배지에서 rCHO-1 세포주를 현탁 배양하였다. HY-PFM 배지에서 사용된 Cu, Zn, Se, V, Mn, Mo의 미량 원소를 각각 20 배씩 첨가하여 전체 미량 원소를 20 배 첨가한 조건과 최대세포농도와 항체 농도를 비교 평가하였다.

도 2에는 미량 원소들을 각각 20 배씩 개별적으로 첨가한 경우, HY-PFM 배지에서 rCHO-1 세포의 최대세포농도와 항체 생산량 변화를 그래프로 도시하였다 (n=3). 도 2를 참조하면, 전체 미량 원소들이 20 배 첨가된 조건과 비교할 때, Zn 20 배 조건에서만 최대세포농도와 항체 생산농도가 각각 1.1×10⁷ cells/ml과 260 mg/L으로서 유사한 값이 얻어졌으나, 나머지 미량 원소들이 각각 20 배 첨가된 조건들에서는 대조군과 유사한 결과가 얻어짐을 알 수 있다. 따라서, 미량 원소 고농도 첨가에 따른 항체 생산 효과는 Zn에 의한 것이라는 것을 확인할 수 있다.

실시예 3. HY - PFM 배지를 사용한 rCHO -1 세포주 현탁 배양에서 Zn 첨가에 따라 항체 생산을 향상시키는 Zn 의 유효 농도 평가

HY-PFM 배지에서 사용된 미량 원소들 중 Zn 만을 3~120 μM 농도 범위로 첨가하여 Zn 농도에 따른 최대세포농도와 항체 생산에 대한 영향을 비교 평가하였다.

도 3에는 HY-PFM에서 Zn 농도에 따른 rCHO-1 세포의 최대세포농도와 항체 생산량 변화를 그래프로 도시하였다 (n=3). 도 3을 참조하면, 항체 생산에 있어서 Zn은 45~60 μM 농도에서 대조군 대비 2.0 배 이상 향상된 360 mg/L 이상으로 최대값을 나타내며, 세포 성장에 있어서는 Zn 45 μM 까지 대조군과 유사한 세포 농도를 나타낸다는 사실을 알 수 있다.

실시예 4. HY - CDM 배지를 사용한 rCHO -1 세포주 및 rCHO -2 세포주 현탁 배양에서 Zn 첨가에 따라 항체 생산을 향상시키는 Zn 의 유효 농도 평가

본 실시예는 HY-PFM 배지에 첨가된 복합 물질인 효모 유래의 가수 분해물에 의한 영향을 배제하기 위해서, 화학적으로 규명된 성분으로만 이루어진 HY-CDM 배지를 사용하여, 실시예 3과 같은 실험을 수행하였다.

도 4 및 5에는 각각 HY-CDM에서 Zn 농도에 따른 rCHO-1 세포 (도 4) (n=2) 및 rCHO-2 세포 (도 5) (n=2)의 최대세포농도와 항체 생산량 변화를 그래프로 도시하였다. 도 4 및 5를 참조하면, 항체 생산에 있어서, Zn 60~75 μM 농도 근처에서 대조군 대비 각각 6.6 배 (rCHO-1) 및 1.3 배 (rCHO-2) 이상 향상된 440 mg/L 및 210 mg/L 이상으로 최대값을 나타냄을 알 수 있다. 또한, 세포 성장에 있어서, rCHO-2 세포주는 Zn 45 μM 까지 대조군과 유사한 세포 농도를 나타내지만, rCHO-1 세포주는 대조군 대비 약 1.2 배 향상된 세포 성장을 나타냄을 알 수 있다.

실시예 5. 상용 화학 조성 배지를 사용한 rCHO -1 세포주 현탁 배양에서, Zn 첨가에 따른 항체 생산성 향상 효과

60 μM Zn 이온 농도에 대한 항체 생산성 향상 효과의 범용성을 평가해보고자, 하기 표 1에 열거된 상용 화학 조성 배지 4 종을 선정하고 Zn 보강 유무에 따른 효과를 평가하였다.

배지	카타로그 번호 (제조사)	Zinc 함량 (μM)^a	주요특징
PowerCHO-2 CD (CDM-1)	BE12-771Q (Lonza)	9	혈청, 동물 유래 성분, 가수분해물이 배제된 화학 조성 배지로서, 재조합 인간 인슐린이 소량 포함됨
CDM4CHO (CDM-2)	SH30557.02 (Hyclone)	7	혈청, 동물 유래 성분이 배제된 화학 조성 배지
Ex-CELL CD CHO (CDM-3)	14360C (SAFC)	<1.5^b	혈청, 동물 유래 성분이 배제된 화학 조성 배지로서, 재조합 단백질이 0.1 mg/L 첨가됨
CD OptiCHO (CDM-4)	12681-011 (Gibco)	6	혈청, 단백질, 동물 유래 성분, 가수분해물, 기타 알려지지 않은 조성의 성분이 배제된 화학 조성 배지

^a: 배지 중 Zn 이온의 함량은 한국기초과학지원연구원 서울분소에서 분석되었다.

^b: 배지 중 Zn 이온의 함량은 검출한계 1.5 μM 이하로 분석되었다.

도 6a 및 6b는 Zn 이온 농도를 60 μM로 강화하였을 때, 표 1에 기재된 네 가지 상용 CDM 배지에서 rCHO-1 세포의 최대세포농도 (도 6a) 및 최대항체농도 (도 6b)가 어떻게 변화하는지를 나타낸 그래프이다. 도 6a 및 6b를 참조하면, 4종의 상용 화학 조성 배지에서 Zn 이온의 함량을 60 μM로 조절한 결과, CDM-1, 2 및 3의 세 가지 배지에서는 1.1 ~ 1.3 배 이상으로 항체가 생산되었으며, 세포 성장 저해와 같은 문제점은 나타나지 않음을 알 수 있었고, 또한, CDM-4 배지에서는 Zn 이온이 60 μM로 조절된 조건에서만 연속적인 세포 성장과 항체 생산이 가능함을 알 수 있었다.

실시예 6. rCHO -1 세포의 현탁 배양에서 Zn 60 μM 농도 보강에 따른 세포 성장 및 항체 생산 분석

본 실시예에서는, 배지 조성 중 Zn 농도를 60 μM로 보강한 HY-PFM 및 HY-CDM 배지에서 rCHO-1 세포를 현탁 배양한 다음, 항체 생산에 주요 인자들인 항체의 비생산속도 (q_mAB) 및 세포 생존율 유지 기간 (cell longevity)을 분석하였다.

도 7a, 7b 및 표 2에는 HY-PFM 배지 (도 7a) 및 HY-CDM 배지 (도 7b) 중에서 rCHO-1 세포를 현탁 배양할 경우, 세포 성장 및 항체 생산에 대한 결과를 나타내었다 (n=2). 도 7a, 7b 및 표 2를 참조하면, q_mAB는 세포 배양 초기 (배양일: 0 ~ 4일)에서 각각 9.4와 5.1 pcd로 대조군 대비 1.7 배 이상, 그리고 세포 배양 후기 (배양일: 4 ~ 8일)에서는 두 배지에서 모두 대조군 대비 2.1 배 이상 향상되었다. 또한, 세포 생존율이 80% 이상 나타내는 세포 생존율 유지 기간의 경우, 대조군과 대비할 때, HY-PFM과 HY-CDM에서 각각 1.4 배 및 1.8 배 향상되었으며, 생세포농도 역시 9 × 10⁶ cells/ml 이상으로, 세포 배양 9일 이상 유지하였다. 이러한 Zn의 효과는 최종적으로 항체 생산 농도를 대조군 대비 2 배 이상 향상시키는 결과로 이어졌다.

Zn (μM)	q_mAB (pcd, 0-4일)	q_mAB (pcd, 4-8일)	μ (일^-1)	세포 생존율 유지 기간 (일/80% 생존율)	배양 배지
3	4.99±0.13	1.75±0.01	0.87±0.01	6.2±0.0	PFM
60	9.35±0.11	3.74±0.04	0.90±0.02	8.5±0.2	PFM
3	3.07±0.19	1.47±0.10^a	1.01±0.04	5.1±0.0	CDM
60	5.06±0.07	3.30±0.01	1.00±0.00	9.3±0.4	CDM

^a: q_mAB는 세포 배양일 4-6일에서 얻어진 결과로 계산되었다.

종합하면, 상기 실시예의 내용으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 배지 조성물은, 무단백 배지 및 화학 조성 배지 모두에서, 재조합 CHO 세포주들을 현탁 배양할 경우, 상기 배지 조성물 중의 Zn 이온 농도를 30 μM 이상으로 보강해 주게 되면, 항체 비생산속도의 향상된 결과를 보인다. 특히, Zn 이온 농도를 30 ~ 60 μM로 보강해 주게 되면 어떠한 세포 성장 저해 효과도 나타내지 않고, Zn 이온 농도를 30 ~ 90 μM로 보강해 주게 되면 회분식 배양에서 탁월한 항체 생산량 향상 효과를 거둘 수 있게 한다.

Claims

포유류 세포를 이용한 목적 물질 생산용 세포 배양 배지로서, 30 μM 이상의 농도로 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물을 포함하고,
상기 세포 배양 배지는 세포 현탁 성장이 이루어지는 무단백 배지 또는 화학 조성 배지이며,
상기 포유류 세포는 CHO DG44 세포이고, 상기 목적 물질은 단클론 항체(mAB)인 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 Zn 이온의 염은 ZnSO₄, ZnSO₃, Zn(NO₃)₂, Zn(H₂PO₄)₂, Zn₃(PO₄)₂, Zn(NO₃)₂, (C₆H₅O₇)₂Zn₃, Zn₃BO₆, ZnBr₂, ZnF₂, ZnCl₂, ZnI₂, (C₂H₃O₂)₂Zn, [ZnCO₃]₂·[Zn(OH)₂]₃, Zn(CIO₄)₂, ZnMoO₄, ZnTiO₃, ZnSeO₃, Zn(CN)₂, ZnSiF₆·6H₂O, (C₄H₅O₂)₂Zn, ZnC₂O₄, Zn(BF₄)₂, (C₇H₇O₃S)₂Zn으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염들의 무수화물 또는 수화물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염인 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
제1항에 있어서, 상기 Zn 이온의 킬레이트 화합물은 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산 (EGTA), 데스페록사민 메실레이트, 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DPTA), 트랜스-1,2-디아미노시클로헥산-N,N,N',N'-테트라아세트산 (CDTA), N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민 (TMEDA), 프탈로시아닌, 피리치온, 메소-테트라페닐포피린, 8-하이드록시퀴놀레이트, 비스(헥사메틸디실라지드), 디[비스(리플루오로메틸설폰닐)이미드]로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물과 Zn 이온의 킬레이트 화합물인 것을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
제1항에 따른 세포 배양 배지를 이용한 세포 배양 방법.
제7항에 있어서, 세포가 현탁 성장되는 상기 세포 배양 배지 중 상기 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물은 세포 배양 전 상기 배지에 30 μM 이상의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
제7항에 있어서, 세포가 현탁 성장되는 상기 세포 배양 배지 중 상기 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물은 세포 배양 도중 상기 배지에 30 μM 이상의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
제7항에 있어서, 세포가 현탁 성장되는 상기 세포 배양 배지 중 상기 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물은 세포 배양 도중 상기 배지에 간헐적으로 첨가하되, 최종 농도 30 μM 이상의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
제7항에 있어서, 세포가 현탁 성장되는 상기 세포 배양 배지 중 상기 Zn 이온, 그 염 또는 그 킬레이트 화합물은 세포 배양 도중 상기 배지에 연속적으로 첨가하되, 최종 농도 30 μM 이상의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
제1항에 따른 세포 배양 배지를 이용한 목적 물질의 생산 방법으로서,
상기 세포 배양 배지 중에서 세포를 배양하는 단계;
상기 세포가 목적 물질을 발현하는 단계; 및
상기 세포로부터 목적 물질을 분리하는 단계를
포함하는 목적 물질의 생산 방법.