RU2708068C2

RU2708068C2 - Лечение судорог с использованием рекомбинантной щелочной фосфатазы

Info

Publication number: RU2708068C2
Application number: RU2017123540A
Authority: RU
Inventors: Андре МАРОЖАН; Дэниз ДЕВОР; Сьюзан ЛЮ-ЧЭНЬ
Original assignee: Алексион Фармасьютикалз, Инк.
Priority date: 2014-12-05
Filing date: 2015-12-04
Publication date: 2019-12-04
Also published as: CN107405390A; US11224638B2; AU2015357551B2; CA2967851C; US20200093898A1; AU2015357551A1; RU2017123540A3; CO2017005034A2; JP6787894B2; BR112017011900A2; KR20240045379A; JP2018502836A; EP3226891A1; KR20170095278A; WO2016090251A1; US10449236B2; MX2017007392A; US20170360899A1; RU2017123540A; CA2967851A1

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается лечения судорог у субъекта-человека, имеющего отклоняющиеся от нормы уровни по меньшей мере одного субстрата щелочной фосфатазы, выбранного из пиридоксаль-5'-фосфата (PLP), неорганического пирофосфата (PPi) и фосфоэтаноламина (PEA). Для этого субъекту вводят терапевтически эффективное количество по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы, имеющей последовательность SEQ ID NO: 1, при этом субъект является невосприимчивым к лечению судорог витамином В6. 28 з.п. ф-лы, 14 ил., 5 табл., 7 пр.

Description

Перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит Перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и, таким образом, включен в данный документ путем ссылки во всей своей полноте. Указанная копия ASCII, созданная 1 декабря 2015г., получила название 0239PCT_SL.txt и ее размер составляет 19,449 байт.

Область изобретения

Настоящее раскрытие относится к способу лечения судорог у пациентов, страдающих ГФФ или не страдающих ГФФ. В частности, настоящее раскрытие относится к выявлению субпопуляции пациентов с ГФФ или пациентов без ГФФ, имеющих отклоняющиеся от нормы уровни и/или функционирование по меньшей мере одного из субстратов щелочной фосфатазы, но имеющих нормальный или непораженный фенотип минерализации, и лечения такой субпопуляции пациентов с использованием по меньшей мере одной из рекомбинантных щелочных фосфатаз.

Предпосылки изобретения

Гипофосфатазия (ГФФ) - редко встречающаяся наследственная форма рахита или остеомаляции, которая наблюдается у одного из 2500 новорожденных у канадских меннонитов и у одного из 100000 новорожденных у остального населения для случаев более тяжелой формы заболевания. Более распространены менее тяжелые формы. Это "врожденное нарушение обмена веществ" вызвано мутацией(ями) с потерей функции в гене (ALPL), который кодирует тканенеспецифический изофермент щелочной фосфатазы (TNALP; также известный, как печеночный/костный/почечный тип ALP). Характерным биохимическим признаком является уровень активности ALP в сыворотке ниже нормального (гипофосфатемия), что приводит к повышению уровней в крови и/или моче трех фосфорилированных субстратов: неорганического пирофосфата (PPi), фосфоэтаноламина (PEA) и пиридоксаль-5'-фосфата (PLP).

ГФФ включает перинатальную, инфантильную, детскую, взрослую и одонтогипофосфатазную формы, исторически классифицированные в зависимости от возраста при постановке диагноза. Фенотип варьируется от почти полного внутриутробного отсутствия минерализации костей и последующего мертворождения, до спонтанных переломов и заболеваний зубов, впервые возникающих во взрослом возрасте. Перинатальная летальная ГФФ (перинатальная ГФФ или ПЛ-ГФФ) проявляется на внутриутробном этапе и может вызывать мертворождение. Некоторые новорожденные живут несколько дней, но у них развивается дыхательная недостаточность вследствие гипоплазии и рахитической деформации грудной клетки. При инфантильной ГФФ, которая диагностируется в возрасте до шести месяцев, постнатальное развитие выглядит нормальным пока не начинаются проблемы с кормлением, недостаточное прибавление веса, и появляются проявления рахита. Рентгенологические особенности характерны и демонстрируют нарушение скелетной минерализации, иногда с прогрессирующей скелетной деминерализацией, приводящей к переломам ребер и деформации грудной клетки. Детская ГФФ имеет в высшей степени различные клинические проявления. Преждевременная потеря молочных зубов является результатом аплазии, гипоплазии или дисплазии цементного вещества зубов, которое соединяет корень зуба с периодонтальной связкой. Рахит вызывает низкорослость и деформации скелета, в том числе, например, кривоногость, увеличение запястий, коленей и лодыжек в результате расширения метафизов. Взрослая форма ГФФ обычно обнаруживается в среднем возрасте, хотя часто в анамнезе уже присутствует рахит и/или раннее выпадение зубов, с последующим хорошим здоровьем в подростковом и молодом совершеннолетнем возрасте. Часто наблюдаются повторяющиеся стресс-переломы плюсневых костей, а отложение дигидрата пирофосфата кальция вызывает приступы артрита и пирофосфат-артропатии. Диагноз одонтогипофосфатазии ставится, когда единственной клинической аномалией является стоматологическое заболевание, а рентгенологические исследования и даже биопсии кости не обнаруживают признаков рахита или остеомаляции.

Тяжелые клинические формы ГФФ обычно наследуются как аутосомно-рецессивные признаки, при этом у родителей таких пациентов наблюдаются уровни активности АП в сыворотке ниже нормы. В случаях менее тяжелых форм ГФФ, например, взрослой формы или одонтогипофосфатазии, документально установлена аутосомно-доминантная модель наследования.

Поскольку случаи ГФФ редки, диагноз ГФФ обычно не устанавливают на ранних стадиях болезни. Кроме того, большинство симптомов ГФФ, такие как аномальная форма черепа, боль в спине, переломы костей, костные шпоры (утолщения вокруг суставов), кривоногость, утолщения в грудной клетке, снижение роста с течением времени/низкорослость и боль в суставах, похожи на симптомы, вызванные другими, более распространенными заболеваниями, такими как несовершенный остеогенез, пищевой рахит, остеоартрит и остеопороз. Другие факторы, которые иногда используются для диагностики ГФФ, включают, например, низкий уровень щелочной фосфатазы (ALP) в крови, выше нормального уровень кальция в крови и моче, изменения в костях (в том числе изгиб (искривление) костей рук и ног), задержка роста, толстые запястья и лодыжки, ослабленные связки, боль в костях, переломы, преждевременная потеря зубов, семейная история ГФФ и мутации в гене ALPL.

Поскольку у пациентов с ГФФ могут развиваться симптомы (например, нарушения минерализации) различной степени тяжести, существует невыявленная субпопуляция пациентов с ГФФ, у которых наблюдаются незначительные типичные симптомы ГФФ или их отсутствие, и которым традиционно устанавливался неправильный диагноз и/или не проводилось лечение (например, замещение фермента рекомбинантным TNALP). Кроме того, многим пациентам с ГФФ свойственны дополнительные симптомы (такие, как судороги) в дополнение к характерным для них нарушениям минерализации. Таким образом, существует потребность в распознавании таких популяций пациентов не только с целью наблюдения (и вследствие этого - лечения на ранних стадиях) возможного ухудшения симптомов ГФФ, но также лечения симптомов помимо нарушения минерализации с использованием рекомбинантного TNALP.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

В настоящем раскрытии предложен способ выявления популяции субъектов, имеющих мутации в гене щелочной фосфатазы (например, ALPL у людей и Akp2 у мышей). Такая популяция субъектов может иметь ранее установленный диагноз ГФФ или такой диагноз может все еще отсутствовать. Такие мутации генов могут приводить к сниженным уровням содержания белка щелочной фосфатазы и/или функционирования белка (например, ферментативных функций в отношении PPi, PLP и/или PEA или других субстратов, таких как пара-нитрофенилфосфат (pNPP)). Такие мутации генов можно обнаруживать хорошо известными в данной области техники способами. После выявления такой популяции проводится тщательное наблюдение за прогрессированием их заболевания, протекающего с судорогами и/или с другими симптомами ГФФ. Для такой популяции будет предоставляться рекомбинантная щелочная фосфатаза для лечения или предотвращения судорог и/или других симптомов.

В одном аспекте настоящего раскрытия предложен способ выявления популяции субъектов, имеющих мутации в гене щелочной фосфатазы и по меньшей мере один симптом. В некоторых вариантах осуществления субъекты в такой популяции могут иметь ранее установленный диагноз ГФФ, но имеют незначительные, непораженные или неопределяемые нарушения минерализации костей и/или зубов. В других вариантах осуществления субъекты в такой популяции не имеют ранее установленного диагноза ГФФ. В одном варианте осуществления субъекты в такой популяции не имеют ранее установленного диагноза ГФФ, и у них не наблюдаются характерные симптомы ГФФ (такие, как нарушения минерализации костей и/или зубов). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одним симптомом, не характерным для ГФФ, является судорога. Такие судороги могут быть восприимчивы или невосприимчивы к лечению витамином В6 и/или другим(ими) традиционным(ыми) противосудорожным(ыми) препаратом(ами). Термин "неопределяемый" в настоящем описании относится к случаю, когда фенотип (например, один из фенотипов минерализации костей и/или зубов) у пациента является слишком незначительным, чтобы его мог обнаружить обычный специалист в данной области с использованием общепринятой технологии, известной в данной области, или случаю, когда такой специалист в данной области не может отличить фенотип этого пациента от фенотипа обычного здорового человека или обычного пациента без заболевания или расстройства, при котором фенотип является общепринятым диагнозом (например, ГФФ). Термин "непораженный" в настоящем описании относится к случаю, когда фенотип (например, фенотипы минерализации костной ткани и/или зубов) у пациента невозможно определить или его можно определить, но он слишком незначителен, чтобы соответствовать общепринятому порогу диагностики, так что пациент с таким фенотипом рассматривается специалистом в данной области техники как пациент с заболеванием или расстройством, в котором фенотип является общепринятым стандартом диагностики (например, ГФФ).

В настоящем раскрытии предложен способ выявления субпопуляции субъектов, имеющих ГФФ, включающий измерение степени минерализации костей и/или зубов этих субъектов и сравнение такой степени с таковыми у нормальных здоровых субъектов, причем такие субъекты в субпопуляции имеют незначительные, непораженные или неопределяемые нарушения минерализации по сравнению с нормальными здоровыми субъектами. В некоторых вариантах осуществления у таких субъектов в субпопуляции наблюдаются судорожные состояния. Такие судорожные состояния могут быть восприимчивы или невосприимчивы к лечению витамином В6 и/или другим(ими) традиционным(ыми) противосудорожным(ыми) препаратом(ами).

В настоящем раскрытии предложен способ выявления субпопуляции субъектов, не имеющих ранее установленного диагноза ГФФ, включающий измерение уровней содержания щелочной фосфатазы и/или ферментативных функций у такой субпопуляции, где такие субъекты в субпопуляции имеют отличающиеся от нормальных уровни содержания щелочной фосфатазы и/или ферментативных функций по сравнению с нормальными здоровыми субъектами. В некоторых вариантах осуществления у таких субъектов в субпопуляции наблюдаются судорожные состояния. Такие судорожные состояния могут быть восприимчивы или невосприимчивы к лечению витамином В6 или другим(ими) традиционным(ыми) противосудорожным(ыми) препаратом(ами). Для измерения уровней содержания щелочной фосфатазы у этих субъектов можно применять общепринятую в уровне техники технологию. Например, уровни ДНК/РНК щелочной фосфатазы можно проверять методами ПЦР или гибридизации (например, Саузерн/Нозерн-блоттингом), используемыми при генетическом обследовании. Уровни содержания белка щелочной фосфатазы можно исследовать с помощью PAGE/SDS-PAGE, Вестерн блоттинга, ELISA или других иммунных анализов с использованием антител к щелочной фосфатазе. Ферментативные функции щелочной фосфатазы можно исследовать in vitro или in vivo, используя субстраты щелочной фосфатазы PPi, PLP и/или PEA или другие субстраты, такие как пара-нитрофенилфосфат (pNPP). В одном варианте осуществления такие субъекты в популяции имеют незначительные, непораженные или неопределяемые нарушения минерализации.

В качестве одного аспекта в настоящем раскрытии предложен способ выявления популяции или субпопуляции субъектов, как описано выше. В качестве другого аспекта в настоящем раскрытии предложен способ лечения по меньшей мере одного симптома у этих субъектов в выявленной популяции или субпопуляции путем добавки рекомбинантного ALP. В некоторых вариантах осуществления такой по меньшей мере один симптом представляет собой судороги, которые либо восприимчивы, либо невосприимчивы к лечению витамином В6 и/или другим(ими) противосудорожным(ыми) препаратом(ами).

В некоторых вариантах осуществления в настоящем раскрытии предложен способ лечения судорог у субъекта, имеющего отклоняющиеся от нормы уровни активности щелочной фосфатазы, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы. Такие отклоняющиеся от нормы уровни активности щелочной фосфатазы могут быть вызваны отклоняющимися от нормы уровнями содержания белка и/или функционирования по меньшей мере одной щелочной фосфатазы у субъекта. Уровни активности щелочной фосфатазы, раскрываемые в данном документе, можно измерять по ферментативной активности в физиологических условиях по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы в отношении фосфоэтаноламина (PEA), неорганического пирофосфата (PPi) и/или пиридоксаль-5'-фосфата (PLP) или других субстратов, таких как пара-нитрофенилфосфат (pNPP). В одном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один субстрат щелочной фосфатазы выбирают из группы, состоящей из PLP, PPi и PEA.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем раскрытии предложен способ лечения судорог у субъекта, у которого уровни содержания по меньшей мере одного субстрата щелочной фосфатазы выше нормы, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы. В одном варианте осуществления по меньшей мере один субстрат щелочной фосфатазы выбирают из группы, состоящей из PLP, PPi, PEA и других субстратов, таких как пара-нитрофенилфосфат (pNPP). В одном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один субстрат щелочной фосфатазы выбирают из группы, состоящей из PLP, PPi и PEA.

В настоящем описании различные термины, такие как "выше нормы", "ниже нормы", "выше чем норма" или аналогичные им относятся к уровням содержания и/или активности по меньшей мере одной молекулы у конкретного субъекта (например, человека), которые выше, ниже или выше чем уровни содержания и/или активности указанной по меньшей мере одной молекулы (или ее эндогенного(ых) аналога(ов)) у здорового ("нормального") субъекта (например, здорового человека). Самый очевидный пример здорового человека - это человек, у которого нет ГФФ или симптомов ГФФ, и у него нет мутаций или модификаций гена ALPL и белков ALP, которые могут приводить к симптомам, обусловленными ГФФ. В другом случае, относящемуся к функционированию ALP, область "нормального" человека в настоящем раскрытии может быть расширена за счет включения любых людей, не имеющих отклоняющихся от нормы уровней эндогенной щелочной фосфатазной активности (которую можно протестировать, например, с помощью субстрата (PPi, PEA, PLP или pNPP), по сравнению с соответствующей активностью у других здоровых или нормальных людей).

В других вариантах осуществления в настоящем раскрытии предложен способ лечения судорог у субъекта, включающий:

(i) выявление субпопуляции субъектов с отклоняющимися от нормы уровнями активности щелочной фосфатазы (например, вследствие отклоняющихся от нормы уровней содержания и/или функционирования белка), которые страдают или могут страдать от судорог; и

(ii) введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы субъекту из этой субпопуляции. Уровни активности щелочной фосфатазы, раскрываемые в данном документе, в физиологических условиях можно измерять по ферментативной активности по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы в отношении фосфоэтаноламина (PEA), неорганического пирофосфата (PPi) и/или пиридоксаль-5'-фосфата (PLP) или других субстратов, таких как пара-нитрофенилфосфат (pNPP). В одном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один субстрат щелочной фосфатазы выбирают из группы, состоящей из PLP, PPi и PEA.

В некоторых вариантах осуществления в настоящем раскрытии предложен способ лечения судорог у субъекта, включающий:

(i) выявление популяции субъектов с уровнями содержания по меньшей мере одного субстрата щелочной фосфатазы выше нормы, которые страдают от судорог, или для которых существует опасность возникновения судорог; и

(ii) введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы субъекту из этой популяции. В одном варианте осуществления по меньшей мере один субстрат щелочной фосфатазы выбирают из группы, состоящей из PLP, PPi, PEA и других субстратов, таких как пара-нитрофенилфосфат (pNPP). В одном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один субстрат щелочной фосфатазы выбирают из группы, состоящей из PLP, PPi и PEA.

Субъекты в популяции или субпопуляции, раскрываемых в данном документе, могут быть пациентами, страдающими гипофосфатазией (ГФФ), имеющими незначительные или неопределяемые нарушения минерализации костей и/или зубов, пациентами, не страдающими ГФФ, или субъектами, у которых не установлен диагноз ГФФ.

У субъектов в популяции или субпопуляции, раскрываемых в данном документе, может наблюдаться повышенный уровень содержания пиридоксаль-5'-фосфата (PLP) в сыворотке и/или пониженное содержание внутриклеточного пиридоксаль-5'-фосфата (PLP).

У субъектов в популяции или субпопуляции, раскрываемых в данном документе, могут наблюдаться пониженные уровни содержания по меньшей мере одного из гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) и серина в головном мозге и/или других тканях/органах. У субъектов в популяции или субпопуляции, раскрываемых в данном документе, может наблюдаться по меньшей мере один из повышенных уровней содержания цистатионина в головном мозге и других тканях/органах (например, определяемого в моче). В одном варианте осуществления у субъекта по меньшей мере одно из содержания ГАМК в головном мозге и содержания серина в головном мозге понижено. В другом варианте осуществления у субъекта повышен по меньшей мере один из уровней цистатионина в головном мозге и моче.

В некоторых вариантах осуществления субъектам из субпопуляции вводят непрерывно в течение по меньшей мере одной недели, одного месяца, трех месяцев, шести месяцев или одного года по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу, раскрываемую в данном документе. Например, по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу можно вводить один раз в день в течение 3 дней, одной недели, двух недель, одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев, семи месяцев, восьми месяцев, девяти месяцев, десяти месяцев, одиннадцати месяцев, одного года, пятнадцати месяцев, восемнадцати месяцев, двух лет, тридцати месяцев, трех лет или в течение более длительного периода.

В одном варианте осуществления введение по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы повышает уровни содержания ГАМК и/или серина в головном мозге. В другом варианте осуществления введение по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы понижает уровни цистатионина в головном мозге и/или моче.

В некоторых вариантах осуществления субъекту из популяции или субпопуляции, раскрываемых в данном документе, вводят терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства в сочетании с по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазой, описанной в данном документе. В одном варианте осуществления такое по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство включает по меньшей мере один противосудорожный препарат. Такой по меньшей мере один противосудорожный препарат может представлять собой одно или несколько лекарств и включать, но не ограничиваясь этим, например, витамин B6 и его варианты, любое противосудорожное лекарство, блокирующее натриевые каналы или повышающее функционирование γ-аминомасляной кислоты (ГАМК), ГАМК_A-рецепторов, GAT-1 ГАМК-транспортера, ГАМК-трансаминазы, любое противосудорожное лекарство, блокирующее потенциалозависимые кальциевые каналы, гликопротеин синаптических пузырьков 2A (SV2A), α2δ-альдегиды (например, паральдегид), ароматические аллильные спирты (например, стирипентол), барбитураты (например, фенобарбитал, метилфенобарбитал и барбексаклон), бензодиазепины (например, клобазам, клоназепам, клоразепат, диазепам, мидазолам, лоразепам, нитразепам, темазепам и ниметазепам), бромиды (например, калия бромид), карбаматы (например, фелбамат), карбоксамиды (например, карбамазепин, окскарбазепин и эсликарбазепин ацетат), жирные кислоты (например, вальпроаты, вигабатрин, прогабид и тиагабин), производные фруктозы (например, топирамат), аналоги ГАМК (например, габапентин и прегабалин), гидантоины (например, этотоин, фенитоин, мефенитоин и фосфенитоин), оксазолидиндионы (например, параметадион, триметадион, диметадион и этадоин), пропионаты (например, бекламид), пиримидиндионы (например, примидон), пирролины (например, бриварацетам, леветирацетам и селетрацетам), сукцинимиды (например, этосуксимид, фенсуксимид и месуксимид), сульфонамиды (например, ацетазоламид, сультиам, метазоламид и зонисамид), триазины (например, ламотригин), мочевины (например, фенетурид и фенацемид), вальпроиламиды (амидные производные вальпроата) (например, вальпромид и вальноктамид) или другие (например, перампанел). Термин "в сочетании с" в данном раскрытии означает, что по меньшей мере два действия (например, по меньшей мере два введения любой рекомбинантной щелочной фосфатазы и/или любого дополнительного противосудорожного препарата, раскрываемого здесь) происходят одновременно в одном местоположении, включая, но не ограничиваясь этим: в одном и том же составе для введения, в разных составах, но вводимых одновременно, в разных составах, вводимых один после другого с временным интервалом, достаточно коротким для того, чтобы специалист в данной области расценивал его как одновременное введение, и в разных составах, вводимых один после другого с временным интервалом, равным не менее чем, например, 30 мин, одному часу, двум часам, четырем часам, шести часам, восьми часам, двенадцати часам, восемнадцати часам, одному дню, двум дням, трем дням, одной неделе, двум неделям, или более длительному периоду, при условии, что такой временной интервал расценивается специалистом в данной области как одновременное введение в одном местоположении, а не как разные времена введения в терапевтическом лечении.

В качестве другого аспекта данное раскрытие предлагает способ лечения судорог, как раскрыто в данном документе, дополнительно включающий:

осуществление совместного введения по меньшей мере одного дополнительного противосудорожного препарата и по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы в течение заранее определенного периода времени; и

прекращение введения по меньшей мере одного дополнительного противосудорожного препарата, но продолжение введения по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы субъекту.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный противосудорожный препарат и по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу, раскрываемые в данном документе, совместно вводят субъекту в течение не менее одного месяца, не менее шести месяцев или не менее одного года. Например, заранее определенный период времени совместного введения может быть не менее 3 дней, одной недели, двух недель, одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев, шести месяцев, семи месяцев, восьми месяцев, девяти месяцев, десяти месяцев, одиннадцати месяцев, одного года, пятнадцати месяцев, восемнадцати месяцев, двух лет, тридцати месяцев, трех лет или более длительным периодом. В одном варианте осуществления по меньшей мере один дополнительный противосудорожный препарат представляет собой по меньшей мере одно из витамина В (пиридоксина) или его вариантов.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза, описанная в данном документе для лечения, является физиологически активной в отношении фосфоэтаноламина (РЕА), неорганического пирофосфата (РPi) и/или пиридоксаль-5'-фосфата (PLP) или других субстратов, таких как пара-нитрофенилфосфат (pNPP). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна такая рекомбинантная щелочная фосфатаза включает в себя тканенеспецифическую щелочную фосфатазу (TNALP), плацентарную щелочную фосфатазу (PALP), щелочную фосфатазу зародышевых клеток (GCALP), кишечную щелочную фосфатазу (IALP) или их функциональные фрагменты, слияния или химерные конструкции. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна такая рекомбинантная щелочная фосфатаза представляет собой растворимый фрагмент TNALP, PALP, GCALP или IALP, или их функциональные фрагменты, слияния или химерные конструкции. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна такая рекомбинантная щелочная фосфатаза представляет собой составной или химерный белок, содержащий фрагменты или участки из по меньшей мере одного, двух, трех или четырех различных типов щелочных фосфатаз, такой как химерная конструкция TNALP-IALP, химерная конструкция IALP-PALP и другие химерные или составные белки TNALP. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего изобретения включает в себя аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2. В некоторых других вариантах осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего раскрытия включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна такая рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего изобретения включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего изобретения включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего изобретения включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего изобретения включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего изобретения включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего изобретения кодируется полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2. В некоторых других вариантах осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего раскрытия кодируется полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего раскрытия кодируется полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего раскрытия кодируется полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего раскрытия кодируется полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего раскрытия кодируется полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего раскрытия кодируется полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего раскрытия кодируется полинуклеотидной молекулой, которая гибридизируется в особо жестких условиях с по меньшей мере одной полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 95% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 2, где особо жесткие условия включают: предварительную гибридизацию и гибридизацию в 6 X SSC, 5 X реагента Денхардта, 0,5% SDS и 100 мг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при 68°C; и промывание в 2 X SSC и 0,5% SDS при комнатной температуре 10 мин; в 2 X SSC и 0,1% SDS при комнатной температуре 10 мин; и в 0,1 X SSC и 0,5% SDS при 65°C три раза по 5 минут.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза, описанная в данном документе для лечения, представляет собой составной белок. В такой составной белок может быть введен по меньшей мере один линкер, известный в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза присоединена к молекуле иммуноглобулина. В одном варианте осуществления молекула иммуноглобулина представляет собой область кристаллизующегося фрагмента (Fc). В другом варианте осуществления Fc включает в себя аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3. В некоторых других вариантах осуществления Fc включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 3. В некоторых других вариантах осуществления Fc кодируется полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 3. В одном варианте осуществления Fc кодируется полинуклеотидной молекулой, которая гибридизируется в особо жестких условиях с по меньшей мере одной полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 95% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 3, где особо жесткие условия включают: предварительную гибридизацию и гибридизацию в 6 X SSC, 5 X реагента Денхардта, 0,5% SDS и 100 мг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при 68°C; и промывание в 2 X SSC и 0,5% SDS при комнатной температуре 10 мин; в 2 X SSC и 0,1% SDS при комнатной температуре 10 мин; и в 0,1 X SSC и 0,5% SDS при 65°C три раза по 5 минут.

В других вариантах осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза, описанная в данном документе для лечения, слита с отрицательно заряженным пептидом. Такой отрицательно заряженный пептид может включать полиаспартат или полиглютамат любой длины, например, от 6 до 20 аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженный пептид представляет собой D10, D8, D16, E10, E8 или E16. В некоторых вариантах осуществления отрицательно заряженный пептид представляет собой D10, D16, E10 или E16. В одном предпочтительном варианте осуществления отрицательно заряженный пептид представляет собой D10.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза, описанная в данном документе, включает растворимый составной белок ALP (sALP), включающий в себя структуру sALP-Fc-D10, или структуру sALP-Fc, Fc-sALP, Fc-sALP-D10, D10-sALP-Fc или D10-Fc-sALP. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза, описанная в данном документе, включает в себя структуру sALP-Fc-D10. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза включает в себя аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1 или 4. В некоторых других вариантах осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 1 или 4. В некоторых других вариантах осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза кодируется полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 1 или 4. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза кодируется полинуклеотидной молекулой, которая гибридизируется в особо жестких условиях с по меньшей мере одной полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 95% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 1 или 4, где особо жесткие условия включают: предварительную гибридизацию и гибридизацию в 6 X SSC, 5 X реагента Денхардта, 0,5% SDS и 100 мг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при 68°C; и промывание в 2 X SSC и 0,5% SDS при комнатной температуре 10 мин; в 2 X SSC и 0,1% SDS при комнатной температуре 10 мин; и в 0,1 X SSC и 0,5% SDS при 65°C три раза по 5 минут.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу, описанную в данном документе, можно вводить в дозе от примерно 0,1 мг/кг/день до примерно 20 мг/кг/день, от примерно 0,1 мг/кг/день до примерно 10 мг/кг/день, от примерно 0,1 мг/кг/день до примерно 8 мг/кг/день, от примерно 0,1 мг/кг/день до примерно 5 мг/кг/день, от примерно 0,1 мг/кг/день до примерно 1 мг/кг/день, от примерно 0,1 мг/кг/день до примерно 0,5 мг/кг/день, от примерно 0,5 мг/кг/день до примерно 20 мг/кг/день, от примерно 0,5 мг/кг/день до примерно 10 мг/кг/день, от примерно 0,5 мг/кг/день до примерно 8 мг/кг/день, от примерно 0,5 мг/кг/день до примерно 5 мг/кг/день, от примерно 0,5 мг/кг/день до примерно 1 мг/кг/день, от примерно 1 мг/кг/день до примерно 20 мг/кг/день, от примерно 1 мг/кг/день до примерно 10 мг/кг/день, от примерно 1 мг/кг/день до примерно 8 мг/кг/день, от примерно 1 мг/кг/день до примерно 5 мг/кг/день, или в сравнимой недельной дозировке (например, 6 мг/кг/неделю сравнима с 1 мг/кг/день). Путь введения по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы, описанной в данном документе, может включать любые известные способы в данной области, включая, по меньшей мере, внутривенное, внутримышечное, подкожное, подъязычное, интратекальное и/или внутрикожное введение. В одном варианте осуществления по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят внутривенно. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят в нескольких дозах через одинаковые или различные пути. В других вариантах осуществления по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят в нескольких дозах различными путями одновременно или последовательно. Например, по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу можно вводить сначала внутривенно, а затем при последующих дозах - подкожно. В альтернативном случае, внутривенное введение также можно применять при последующих дозах с целью быстрого терапевтического эффекта. Выбор путей для нескольких доз может быть определен специалистом в данной области техники для достижения наибольшей действенности, стабильности (например, период полувыведения по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы и/или по меньшей мере одного дополнительного противосудорожного препарата), эффективности и/или экономически эффективных целей. Никакое конкретное ограничение выбора путей введения и/или применения различных путей введения при различных дозировках не предусматривается настоящим описанием.

В качестве другого аспекта в настоящем раскрытии предложен способ лечения судорог у субъекта, имеющего отклоняющиеся от нормы уровни активности щелочной фосфатазы, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы, где по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза включает в себя структуру sALP-Fc-D10. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна такая рекомбинантная щелочная фосфатаза включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна такая рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего раскрытия кодируется полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза кодируется полинуклеотидной молекулой, которая гибридизируется в особо жестких условиях с по меньшей мере одной полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 95% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 2, где особо жесткие условия включают: предварительную гибридизацию и гибридизацию в 6 X SSC, 5 X реагента Денхардта, 0,5% SDS и 100 мг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при 68°C; и промывание в 2 X SSC и 0,5% SDS при комнатной температуре 10 мин; в 2 X SSC и 0,1% SDS при комнатной температуре 10 мин; и в 0,1 X SSC и 0,5% SDS при 65°C три раза по 5 минут.

В качестве другого аспекта в настоящем раскрытии предложен способ лечения судорог у субъекта, у которого уровни содержания по меньшей мере одного субстрата щелочной фосфатазы выше нормы, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы, где по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза включает в себя структуру sALP-Fc-D10. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна такая рекомбинантная щелочная фосфатаза включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего раскрытия кодируется полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза кодируется полинуклеотидной молекулой, которая гибридизируется в особо жестких условиях с по меньшей мере одной полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 95% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 2, где особо жесткие условия включают: предварительную гибридизацию и гибридизацию в 6 X SSC, 5 X реагента Денхардта, 0,5% SDS и 100 мг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при 68°C; и промывание в 2 X SSC и 0,5% SDS при комнатной температуре 10 мин; в 2 X SSC и 0,1% SDS при комнатной температуре 10 мин; и в 0,1 X SSC и 0,5% SDS при 65°C три раза по 5 минут.

В качестве другого аспекта в настоящем раскрытии предложен способ лечения судорог у субъекта, включающий:

(i) выявление популяции субъектов с отклоняющимися от нормы уровнями активности щелочной фосфатазы, которые страдают от судорог, или для которых существует опасность возникновения судорог; и

(ii) введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы субъекту из этой популяции,

где по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза включает в себя структуру sALP-Fc-D10. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна такая рекомбинантная щелочная фосфатаза включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна такая рекомбинантная щелочная фосфатаза настоящего раскрытия кодируется полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна рекомбинантная щелочная фосфатаза кодируется полинуклеотидной молекулой, которая гибридизируется в особо жестких условиях с по меньшей мере одной полинуклеотидной молекулой, кодирующей полипептид, включающий в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, 95% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 2, где особо жесткие условия включают: предварительную гибридизацию и гибридизацию в 6 X SSC, 5 X реагента Денхардта, 0,5% SDS и 100 мг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при 68°C; и промывание в 2 X SSC и 0,5% SDS при комнатной температуре 10 мин; в 2 X SSC и 0,1% SDS при комнатной температуре 10 мин; и в 0,1 X SSC и 0,5% SDS при 65°C три раза по 5 минут.

В некоторых вариантах осуществления субъект(ы), описанный(ые) в данном документе, представляет(ют) собой человека или млекопитающее, отличное от человека. В одном варианте осуществления субъект(ы) представляет(ют) собой человека.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фигуре 1 представлена конструкция и схематическая структура рекомбинантной ALP настоящего раскрытия на примере человеческого растворимого слитого с TNALP белка hsTNALP-FcD10. На рисунке А представлен схематический вид полного первичного продукта трансляции человеческого гена тканенеспецифической щелочной фосфатазы (TNALP), включая N-концевой сигнальный пептид и переходный закрепленный на мембране сигнал для GPI-сложения. На рисунке В представлен первичный продукт трансляции составного белка. На рисунке С представлен первичный продукт трансляции, не содержащий расщепляемого сигнального пептида TNALP;

На Фигуре 2 представлена белковая последовательность для hsTNALP-FcD10 с N-концевым пептидным сигналом (SEQ ID NO: 1). В этой последовательности N-концевой пептидный сигнал 17-aa выделен курсивом и подчеркнут. Часть hsTNALP (SEQ ID NO: 2) выделена курсивом, но не подчеркнута. Часть Fc (SEQ ID NO: 3) подчеркнута, но не выделена курсивом. Остатки аспарагина (N), соответствующие предполагаемым сайтам N-гликозилирования обозначены жирными строчными буквами. Жирные заглавные буквы (т.е., LK и DI) соответствуют линкерам между hsTNALP частью и Fc частью и между Fc частью и C-концевым D10, соответственно. Эти линкеры получены из сайтов эндонуклеаз рестрикции, введенными в ходе конструирования кДНК.

На Фигуре 3 представлена белковая последовательность для hsTNALP-FcD10 без N-концевого пептидного сигнала (SEQ ID NO: 4). Часть hsTNALP (SEQ ID NO: 2) выделена курсивом, но не подчеркнута. Часть Fc (SEQ ID NO: 3) подчеркнута, но не выделена курсивом. Остатки аспарагина (N), соответствующие предполагаемым сайтам N-гликозилирования обозначены жирными строчными буквами. Жирные заглавные буквы (т.е., LK и DI) соответствуют линкерам между hsTNALP частью и Fc частью и между Fc частью и C-концевым D10, соответственно.

На Фигуре 4 представлены рентгеновские снимки, показывающие минерализацию костей ног у мышей дикого типа (WT), Akp2 ^+/- гетерозиготных мышей (HET) и Akp2 ^-/- гомозиготных мышей (HOM). У Akp2 ^-/- гомозиготных мышей была обнаружена разная степень нарушения минерализации (от тяжелого до непораженного фенотипов).

На Фигуре 5 представлена сводная таблица распределения фенотипов среди разных колоний Akp2 ^-/- гомозиготных мышей (с использованием оценки по шкале рентгеновских изображений).

На Фигуре 6 показано, что вес тела Akp2 ^-/- гомозиготных мышей (обозначение поколения: F4) коррелировал с тяжестью их заболевания (т.е., имели ли они тяжелое или незначительное нарушение минерализации или непораженную/нормальную минерализацию). Мышей дикого типа (Akp2 ^+/+) использовали в качестве контроля.

На Фигуре 7 показано, что вес тела Akp2 ^-/- гомозиготных мышей коррелировал с тяжестью заболевания их фенотипа минерализации. Две крайние слева группы данных (Akp2 ^-/-) представляют собой данные для всех Akp2 ^-/- гомозиготных мышей с разной (например, тяжелой или непораженной) степенью тяжести заболевания. Мышей дикого типа и Akp2 ^+/- гетерозиготных мышей использовали в качестве контроля.

На Фигуре 8 показано, что длина костей (бедренной и большеберцовой) у Akp2 ^-/-гомозиготных мышей (обозначение поколения: F10) коррелировала с тяжестью их заболевания. Крайние слева группы данных (Akp2 ^-/-) представляют собой данные для всех Akp2 ^-/- гомозиготных мышей с разной (например, тяжелой или непораженной) степенью тяжести заболевания. Мышей дикого типа и Akp2 ^+/- гетерозиготных мышей использовали в качестве контроля.

На Фигуре 9 приведено сравнение продолжительности жизни Akp2 ^-/- гомозиготных мышей, имеющих различные фенотипы минерализации. Все Akp2 ^-/- гомозиготные мыши характеризовались значительно сниженной продолжительностью жизни вне зависимости от фенотипов минерализации.

На Фигуре 10 показано, что у Akp2 ^-/- гомозиготных мышей снижена концентрация гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) в головном мозге, которая поддавалась корректировке с помощью ежедневной обработки с использованием ALP (sTNALP-FcD10 или асфотазы альфа). Мышей дикого типа, проходивших или не проходивших обработку, использовали в качестве контроля. Рисунок слева: концентрации ГАМК измеряли на день 10 у (слева направо) нокаутных мышей, проходивших обработку контрольным носителем ежедневно до дня 9 ("GRP 1"), нокаутных мышей, проходивших обработку с использованием sTNALP-FcD10 (8,2 мг/кг) ежедневно до дня 9 ("GRP 2"), и мышей дикого типа, не подвергавшихся какой-либо обработке ("GRP 3"). Рисунок справа: концентрации уистатионина измеряли на день 48 у (слева направо) нокаутных мышей, проходивших обработку с использованием sTNALP-FcD10 (8,2 мг/кг) ежедневно до дня 35, а затем обработку только контрольным носителем (т.е., прерванная обработка) ежедневно до дня 47 ("GRP 1"), нокаутных мышей, проходивших обработку с использованием sTNALP-FcD10 ежедневно до дня 47 ("GRP 2"), мышей дикого типа, не подвергавшихся какой-либо обработке ("GRP 3"), и мышей дикого типа, проходивших обработку с использованием sTNALP-FcD10 ежедневно до дня 35, а затем обработку только контрольным носителем ежедневно до дня 47 ("GRP 4").

На Фигуре 11 показано, что у Akp2 ^-/- гомозиготных мышей значительно повышена концентрация цистатионина в головном мозге, которая поддавалась корректировке с помощью ежедневной обработки с использованием ALP (sTNALP-FcD10 или асфотазы альфа). Мышей дикого типа, проходивших или не проходивших обработку, использовали в качестве контроля. Рисунок слева: концентрации цистатионина измеряли на день 10 у (слева направо) нокаутных мышей, проходивших обработку контрольным носителем ежедневно до дня 9 ("GRP 1"), нокаутных мышей, проходивших обработку с использованием sTNALP-FcD10 (8,2 мг/кг) ежедневно до дня 9 ("GRP 2"), и мышей дикого типа, не подвергавшихся какой-либо обработке ("GRP 3"). Рисунок справа: концентрации ГАМК измеряли на день 48 у (слева направо) нокаутных мышей, проходивших обработку с использованием sTNALP-FcD10 (8,2 мг/кг) ежедневно до дня 35, а затем обработку только контрольным носителем ежедневно до дня 47 ("прерывание") ("GRP 1"), нокаутных мышей, проходивших обработку с использованием sTNALP-FcD10 ежедневно до дня 47 ("GRP 2"), мышей дикого типа, не подвергавшихся какой-либо обработке ("GRP 3"), и мышей дикого типа, проходивших обработку с использованием sTNALP-FcD10 ежедневно до дня 35, а затем обработку только контрольным носителем ежедневно до дня 47 ("GRP 4").

На Фигуре 12 показано, что у Akp2 ^-/- гомозиготных мышей значительно снижена концентрация серина в головном мозге, которая поддавалась корректировке с помощью ежедневной обработки с использованием ALP (sTNALP-FcD10 или асфотазы альфа). Мышей дикого типа, проходивших или не проходивших обработку, использовали в качестве контроля. Рисунок слева: концентрации серина измеряли на день 10 у (слева направо) нокаутных мышей, проходивших обработку контрольным носителем ежедневно до дня 9 ("GRP 1"), нокаутных мышей, проходивших обработку с использованием sTNALP-FcD10 ежедневно до дня 9 ("GRP 2"), и мышей дикого типа, не подвергавшихся какой-либо обработке ("GRP 3"). Рисунок справа: концентрации серина измеряли на день 48 у (слева направо) нокаутных мышей, проходивших обработку с использованием sTNALP-FcD10 (8,2 мг/кг) ежедневно до дня 35, а затем обработку только контрольным носителем ежедневно до дня 47 ("прерывание") ("GRP 1"), нокаутных мышей, проходивших обработку с использованием sTNALP-FcD10 ежедневно до дня 47 ("GRP 2"), мышей дикого типа, не подвергавшихся какой-либо обработке ("GRP 3"), и мышей дикого типа, проходивших обработку с использованием sTNALP-FcD10 ежедневно до дня 35 и обработку только контрольным носителем ежедневно до дня 47 ("GRP 4").

На Фигуре 13 приведено сравнение продолжительности жизни Akp2 ^-/- гомозиготных мышей (имевших тяжелое нарушение минерализации или нормальную минерализацию), получавших 325 м.д. диетической добавки пиридоксина.

На Фигуре 14 приведено сравнение концентраций ГАМК и цистатионина в головном мозге мышей дикого типа (WT) или Akp2 ^-/- гомозиготных мышей, имевших тяжелое нарушение минерализации (KO-тяжелое) или нормальную минерализацию (KO-норма), все из которых получали 325м.д. диетической добавки пиридоксина. Заштрихованная площадь относится к случаю, когда мыши имели относительно низкую концентрацию ГАМК в головном мозге, но относительно высокую концентрацию цистатионина в головном мозге.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

У многих пациентов с ГФФ встречаются судороги в качестве дополнительных симптомов их характерного нарушения минерализации. У Akp2 ^-/- мышей также развиваются судороги, которые в итоге приводят к гибели. См. Waymire et al. 1995 Nature Genetics 11:45-51. Поскольку витамин В6 (пиридоксин) является традиционным лечением судорог, многие пациенты с ГФФ при наличии судорог получают лечение витамином В6 в качестве профилактикой терапии. Однако, некоторые пациенты с ГФФ невосприимчивы к лечению пиридоксином. Даже для восприимчивых к пиридоксину пациентов с ГФФ высокие дозы витамина В6 могут со временем стать токсичными и приводить к повреждению нервов, или потере чувствительности, или покалыванию в конечностях, которые со временем могут стать необратимыми. Наиболее распространенные симптомы токсичности витамина B6 включают, например, головную боль, сильную усталость, изменение настроения, изменение нервной системы и т. д. Согласно публикации о безопасности витамина B6 (пиридоксина), размещенную Mayo Clinic Health System на их сайте в Интернете (http://www.mayoclinic.org/drugs-supplements/vitamin-b6/safety/hrb-20058788), избыток витамина B6 может вызывать нарушения сердечного ритма, угревую сыпь, аллергические реакции, увеличение или болезненность груди, изменение уровней фолиевой кислоты, снижение мышечного тонуса, сонливость или седативный эффект, ощущение клубка в горле, чувство покалывания на коже, головную боль, изжогу, потерю аппетита, тошноту, сыпь, рецидив язвенного колита (воспалительное заболевание кишечника), дискомфорт или боль в желудке, чувствительность к солнечному свету, рвоту, обострение астмы, низкое кровяное давление, изменение уровня сахара в крови и повышенный риск кровотечения. Витамин В6 может также взаимодействовать с другими медикаментозными лечениями. Например, он может снижать эффективность лечения леводопой, которая используется для лечения болезни Паркинсона. Лица, принимающие пеницилламин, используемый для лечения болезни Вильсона, отравления свинцом, почечных камней и артрита, могут принимать витамин В6 только под непосредственным наблюдением лечащего врача. Эстрогенные травы и пищевые добавки, включая противозачаточные таблетки, могут взаимодействовать с витамином В6.

В настоящем раскрытии предложен способ выявления популяции субъектов, у которых наблюдаются отклоняющийся от нормы (например, недостаточный) уровень активности щелочной фосфатазы (ALP) (например, имеют дефектную аллель(и) гена ALPL у людей или Akp2 (ортолог ALPL) гена у мышей) или отличающийся от нормального ген и/или содержание белка субстратов ALP (например, PPi, PEA и PLP). Используемый в данном контексте термин "отличающийся от нормального" или "отклоняющийся от нормы" означает, что уровни экспрессии и/или ферментативная активность белка (например, ALP) или его биологически активных слияний или их фрагментов отличаются от нормальных, правильных или ожидаемых. Например, субъект (например, человек или животное, отличное от человека, включая, но без ограничения, мышь) с "отличающимся от нормального" уровнем активности ALP означает, что у такого субъекта наблюдается отличающийся от нормального уровень активности ALP, что может происходить вследствие, например, дефектного или отсутствующего гена ALP или белкового продукта и/или дефектного или утратившего функцию гена ALP или белкового продукта, по сравнению с уровнем экспрессии и/или активности такого белка ALP у здорового субъекта или субъекта без симптомов ГФФ или болезни или состояния расстройства, характеризующихся отличающимися от нормы уровнями белка и/или активности по меньшей мере одного из субстратов ALP (например, PPi, PLP и PEA). В частности, уровни экспрессии белка или активность ALP недостаточна, отсутствует или нарушена, если такие уровни экспрессии или активность ниже (например, ниже чем 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% или ниже), чем уровень экспрессии или активность такого белка ALP у здорового субъекта или у субъекта без симптомов ГФФ или болезни или состояния расстройства, характеризующихся отличающимися от нормы уровнями белка и/или активности по меньшей мере одного из субстратов ALP (например, PPi, PLP и PEA). Популяция субъектов может быть выявлена вне зависимости от того, был ли у них ранее установлен диагноз гипофосфатазии (ГФФ) или нет. Популяцию выявляют, например, основываясь на сниженных уровнях активности ALP вследствие, например, отсутствия или сниженных уровней содержания белка(ов) ALP и/или наличия дефектных белков ALP со сниженной или отсутствующей ферментативной активностью. Причины сниженных уровней активности ALP включают, например, мутации в генах, которые кодируют ALP, что приводит к дефектным аллелям таких генов, нарушения в сигнальных молекулах, которые регулируют экспрессию ALP, ненормальную экспрессию или регуляцию кофактора фермента, и/или отличающуюся от нормальной экспрессию факторов, находящихся ранее или далее по положению в последовательности, которые регулируют активность ALP. Определенные аллели ALPL могут приводить, например, к пониженным уровням содержания белка щелочной фосфатазы и/или функционирования белка. Такие аллели можно определять способами, известными в области техники. За членами выявленной популяции должно вестись наблюдение с целью определения прогрессирования заболевания (ГФФ) и других симптомов, например, судорог. Рекомбинантная щелочная фосфатаза, например, может быть предоставлена выявленной популяции с целью лечения или предотвращения судорог и/или других симптомов, например, симптомов, относящихся к ГФФ или сниженному уровню активности ALP.

Термины "индивидуум", "субъект" или "пациент" являются взаимозаменяемыми и относятся к любому субъекту, особенно человеку, которому требуется диагностика, лечение или терапия. Другие субъекты могут включать, например, крупный рогатый скот, собак, кошек, морских свинок, кроликов, крыс, мышей, лошадей и т.п. В данном контексте субъект, для которого "существует опасность", представляет собой такого субъекта, в отношении которого выявлена опасность развития заболевания, расстройства или симптомов, связанных, например, с отличающимся от нормального уровнем активности ALP.

Пациентов с ГФФ традиционно определяют по характерным для них нарушениям минерализации костей и/или зубов. Однако пациенты с ГФФ различаются по степени нарушения минерализации в пределах от тяжелой степени до неопределяемой. Очевидно, что в случаях пациентов с ГФФ с незначительным нарушением минерализации или его отсутствием, вероятно неправильное диагностирование или задержка в лечении, если оно вообще наступит, например, рекомбинантной щелочной фосфатазой. Здесь описаны материалы и способы выявления субпопуляции пациентов с ГФФ с незначительными, непораженными или неопределяемыми нарушениями минерализации костей и/или зубов для проведения заместительной терапии щелочной фосфатазой. У таких пациентов может быть ранее установленный диагноз ГФФ, но вследствие незначительных, непораженных или неопределяемых нарушений минерализации они не получали лечение щелочной фосфатазой. В настоящее раскрытие включено предоставление материалов и способов для лечения таких субъектов в субпопуляции, например, щелочной фосфатазой или средством(ами), которые повышают уровень активности эндогенной щелочной фосфатазы. Такое лечение может, например, лечить или предотвращать симптомы помимо нарушений минерализации и/или предотвратить нарушения минерализации вследствие прогрессирования заболевания в будущем.

Здесь описаны способы выявления популяции субъектов с нарушениями ALP, у которых либо наблюдается ГФФ и/или относящиеся к ГФФ симптомы, или для которых существует опасность развития ГФФ и/или относящихся к ГФФ симптомов. Выявленная популяция может включать субъектов, у которых ранее была обнаружена ГФФ или относящиеся к ГФФ симптомы, или у которых симптомы не наблюдаются и диагноз ранее установлен не был. Сниженный уровень активности ALP в сыворотке приводит, например, к повышенным уровням содержания белка и/или функционирования по меньшей мере одного из субстратов щелочной фосфатазы (например, пирофосфата (PPi), пиридоксаль-5'-фосфата (PLP) или фосфоэтаноламина (PEA)). Способы выявления популяции субъектов включают, например, обнаружение дефектных аллелей щелочной фосфатазы (либо до, либо после рождения), измерение уровней экспрессии белка или функциональной активности in vivo, измерение в образце содержания определяемых при анализе соответствующих маркеров, или другие способы определения уровня активности ALP, известные в уровне техники.

У выявленной популяции с отличающимся от нормального уровнем активности ALP могут быть другие симптомы, отличающиеся от нарушений минерализации костей и зубов. Однако вследствие незначительного или отсутствия нарушения минерализации у таких субъектов маловероятно установление диагноза ГФФ или проведение у них лечения, например, щелочной фосфатазой. Поэтому здесь описаны материалы и способы выявления и лечения субъектов, для которых существует опасность развития заболевания, расстройства или симптомов, связанных с отличающимся от нормального уровнем активности ALP, особенно тех, у которых не наблюдаются некоторые обычные симптомы ГФФ (например, нарушения костной минерализации).

В настоящем раскрытии предложена субпопуляция нокаутных по щелочной фосфатазе мышей (Akp2 ^-/-), которые имеют незначительные, непораженные или неопределяемые нарушения минерализации, но, тем не менее, продолжительность жизни у них снижена. Исследование, проведенное на этих мышах, показало, что недостаточность щелочной фосфатазы значительно снижала уровни концентрации белка гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) - основного ингибиторного нейромедиатора в центральной нервной системе млекопитающих. Наблюдаемое снижение содержания ГАМК в головном мозге было восстановлено с помощью лечения рекомбинантной щелочной фосфатазой. Поскольку у популяции субъектов нарушена щелочная фосфатаза, но нарушения минерализации минимальны или отсутствуют, то существует популяция субъектов, для которой существует опасность развития ALP-обусловленных болезни(ей), расстройства(расстройств) или симптомов, например, судорог, которые восприимчивы, например, к заместительной терапии щелочной фосфатазой или другим терапиям, повышающим уровень активности ALP.

В дополнение к тому, что у пациентов с ГФФ часто наблюдаются судороги, в данном документе приведены данные, показывающие, что даже у пациентов, у которых не наблюдаются некоторые из наиболее сильных симптомов ГФФ (например, нарушения костной минерализации), отсутствие активности ALP или снижение ее уровня активности в сыворотке приводит к судорогам. Эта популяция испытывает или для нее существует опасность возникновения судорог и других заболеваний, расстройств или симптомов, связанных с уменьшением или отменой активности ALP (например, опасность развития ГФФ или симптомов ГФФ).

Судорожное состояние или судороги в настоящем раскрытии можно широко классифицировать как эпилептические припадки, включающие краткий эпизод признаков и/или симптомов вследствие неномальной чрезмерной или синхронной активности нейронов в головном мозге, и неэпилептические припадки, которые являются приступообразными событиями, которые имитируют эпилептический припадок, но не связаны с неномальными ритмическими выделениями кортикальных нейронов. Внешние проявления судорог могут варьироваться от неконтролируемого подергивающегося движения (тонико-клонические судороги (ранее известные как генерализованные тонико-клонические судороги), иногда называемые "конвульсиями") до таких малозаметных, как мгновенная потеря осознания (малый эпилептический припадок). (Fisher et al., 2005 Epilepsia 46:470-2 и Ricker 2003 Differential Diagnosis in Adult Neuropsychological assessment. Springer Publishing Company. p. 109. ISBN 0-8261-1665-5). В данном контексте термин "судорожное состояние" или "судороги" относится к любому проявлению судорог или конвульсии вследствие любых физиологических или внешних причин, включая, но не ограничиваясь этим, эпилептические припадки, неэпилептические припадки, судороги, восприимчивые к витамину В6, судороги, невосприимчивые к витамину В6 и т.д. Термин "судорожное состояние" часто взаимозаменяемо используется с термином "конвульсия". Конвульсии происходят, когда тело субъекта быстро и бесконтрольно дрожит. Во время конвульсий мышцы человека попеременно сокращаются и расслабляются. Существует много разных типов судорог. Некоторые характеризуются мягко выраженными симптомами без дрожи.

У мышей, у которых не функционирует щелочная фосфатаза (например, Akp2 ^-/-) развиваются судорожные состояния, которые приводят к гибели (Waymire 1995). Судороги вызваны нарушением метаболизма пиридоксаль-5'-фосфата (PLP) щелочной фосфатазой, аналогичным тому, которое обнаружено у пациентов с ГФФ. Обычно пиридоксин (витамин В6) может всасываться в виде трех различных витамеров: PLP, пиридоксамин-P и пиридоксин-глюкозид (Plecko 2009 Can J Neurol Sci 36:S73-S77). Однако в печени два последних перерабатываются в только один активный кофактор PLP под действием пиридокс(ам)ин-5-фосфат оксидазы (PNPO). PLP затем в кровообращении дефосфорилируется щелочной фосфатазой в пиридоксаль (PL), который беспрепятсвенно проходит через клеточную мембрану и повторно фосфорилируется пиридоксаль киназой во внутриклеточный PLP. Попав внутрь клетки, PLP представляет собой кофактор в различных ферментативных реакциях в аминокислоте и нейромедиатор метаболизма, такого как, например, превращение глутамата в гамма-аминомасляную кислоту (ГАМК), система расщепления глицина, допамина, гистамина, D-серина, сероводорода и декарбоксилазы ароматической кислоты в синтезе серотонина и гомованилиновой кислоты. В мышах Akp2 ^-/-, вследствие нарушения в щелочной фосфатазе, невозможно образование PL из PLP, что приводит к повышенным уровням содержания PLP в плазме, но сниженным внутриклеточным концентрациям PLP. Недостаток содержания внутриклеточного PLP отключает последующую цепочку метаболизма, включая, например, выработку ГАМК глутаматдекарбоксилазой (GAD) в головном мозге.

ГАМК действует на ингибирующие синапсы в головном мозге позвоночных путем связывания с определенными трансмембранными рецепторами в плазматической мембране как до-, так и постсинаптических нейронных процессов. Это связывание открывает ионные каналы для потока либо отрицательно заряженных ионов хлорида в клетку, либо положительно заряженных ионов калия из клетки. Это действие приводит к отрицательному изменению трансмембранного потенциала, обычно вызывающему гиперполяризацию. Известно, что рецепторы ГАМК делятся на два общих класса: ГАМК_A, в котором рецептор является частью комплекса управляемых лигандами ионных каналов, и ГАМК_B метаботропных рецепторов, которые представляют собой рецепторы, связанные с G-белком, которые открывают или закрывают ионные каналы с помощью посредников. Было обнаружено, что уровни ГАМК понижались на примерно 50% у мышей Akp2 ^-/- по сравнению с контрольными однопометниками, что укорачивает продолжительность жизни у этих нокаутных мышей (Waymire 1995). Кроме того, путем введения дополнительного количества витамина B6 (пироксидаля или PL, но не PN), фенотип судорог корректировали у примерно 67% мышей Akp2 ^-/- с гибридным генетическим фоном, хотя у мышей, прошедших коррекцию, впоследствии развивалось нарушение зубной системы. Остальные 33% плохо реагировали на инъекции PL или были невосприимчивы к ним. Напротив, все мыши Akp2 ^-/- с инбредным генетическим фоном плохо реагируют или даже полностью невосприимчивы к добавке PL.

Щелочные фосфатазы (ALP)

Известны четыре изофермента ALP, а именно, тканенеспецифическая щелочная фосфатаза (TNALP, см. обсуждение ниже), плацентарная щелочная фосфатаза (PALP) (NCBI эталонные последовательности [NP_112603] и [NP_001623]), щелочная фосфатаза зародышевых клеток (GCALP) (NCBI эталонная последовательность [P10696]) и кишечная щелочная фосфатаза (IALP) (NCBI эталонная последовательность [NP_001622]). Эти ферменты имеют очень похожие трехмерные структуры. Каждый из их каталитических сайтов содержит четыре связывающих металл домена для ионов металлов (два Zn²⁺ и один Mg²⁺), которые необходимы для ферментной активности. Эти ферменты катализируют гидролиз моноэфиров фосфорной кислоты, а также катализируют реакцию трансфосфорилирования при наличии высоких концентраций акцепторов фосфата. Например, PALP физиологически активен в отношении PEA, PPi и PLP - известных природных субстратов TNALP (Whyte, 1995; Zhang, 2004).

Основываясь на схожести структур ALP, можно было бы предположить, что для них также характерно хотя бы частичное перекрывание их функций. У людей и грызунов, получавших рацион с высоким содержанием жира, например, наблюдали повышенные уровни содержания ALP в кровообращении, которые образовывались из IALP (Langman 1966 и Gould 1944 Biochem. 4:175-181). Так, повышение прима с пищей может повысить IALP и, таким образом, скомпенсировать функцию TNALP путем снижения содержания PLP в кровообращении мышей Akp2 ^-/-. Сходным образом было показано, что PALP, экспрессируемая в женщинах-носителях ГФФ в ходе беременности, компенсирует недостаточность TNALP (Whyte 1995 J. Clin. Invest. 95:1440-1445).

Выявленная популяция субъектов с пониженным уровнем или отсутствием активности ALP, может впоследствии получать лечение, например, терапевтически эффективным количеством рекомбинантной TNALP или другими изоферментами ALP. Разные изоферменты можно вводить сами по себе, взаимозаменяемо или в сочетании друг с другом. Выявленных субъектов можно лечить, например, используя рекомбинантные TNALP, PALP, IALP и/или GCALP. Эти ALP могут представлять собой белки млекопитающих (например, человека), белки не млекопитающих или составные белки, включающие в себя по меньшей мере частично участки белков млекопитающих.

TNALP и варианты

TNALP представляет собой связанный с мембраной белок, закрепленный посредством гликолипида со стороны своего C-конца (Swiss-Prot, P05186). Этот связывающий гликозилфосфатидилинозитол (GPI) присоединяют посттрансляционно вслед за удалением гидрофобного С-концевого конца, который выполняет роль и временной мембранной связки, и действует в качестве сигнала к присоединению GPI. Рекомбинантная TNALP, описанная в данном документе, включает в себя, например, растворимую часть TNALP. Более конкретный пример представляет собой рекомбинантную TNALP, которая включает в себя человеческую TNALP, где первая аминокислота гидрофобной C-концевой последовательности, а именно, аланин, замещена стоп-кодоном. Растворимая TNALP (называемая здесь sTNALP), образованная таким образом, содержит все аминокислоты нативной анкерной формы TNALP, необходимые для образования каталитического сайта, но не содержит мембраносвязывающий фрагмент GPI. Известные TNALP включают, например, человеческий TNALP [NCBI эталонные последовательности NP_000469, AAI10910, AAH90861, AAH66116, AAH21289 и AAI26166]; резус TNALP [XP_001109717]; крысиный TNALP [NP_037191]; собачий TNALP [AAF64516]; свиной TNALP [AAN64273], мышиный [NP_031457], бычий [NP_789828, NP_776412, AAM 8209, AAC33858] и кошачий [NP_001036028]. Термин "дикого типа" или "последовательность дикого типа", используемый для TNALP или других генов или белков в настоящем раскрытии, относится к типичной форме таких генов или белков, как она встречается в природе у нормальных людей, млекопитающих, отличных от человека или других живых организмов. Последовательность дикого типа может относиться к стандартному "нормальному" аллелю в локусе для гена или стандартной "нормальной" первичной аминокислотной последовательности (необязательно со стандартными "нормальными" посттрансляционными модификациями и/или межцепочечными связями и/или взаимодействиями между аминокислотными остатками) для полипептида или белка, в отличие от продуцируемого нестандартной "мутантной" аллелью или аминокислотной последовательностью/модификацией/взаимодействием. "Мутантные" аллели могут варьироваться в значительной степени и даже стать диким типом, если генетический сдвиг происходит внутри популяции. В настоящее время признается, что большинство или все генные локусы (и реже, но все же возможно для большинства полипептидных последовательностей) существуют во множестве аллельных форм, которые различаются по частоте в пределах географического диапазона вида, и что единообразный дикий тип может и не существовать. Однако в общем случае наиболее распространенной аллелью или аминокислотной последовательностью, то есть той, которая наиболее часто встречается среди нормальных отдельных людей или других организмов, является та, которая считается диким типом в настоящем описании. Термин "нормальный", используемый в данном описании в отношении человека или других организмов, относится к, если не указано иное, человеку или другим организмам, не страдающим какими-либо заболеваниями (например, ГФФ), расстройствами и/или симптомами или физиологическими последствиями (например, нарушениями минерализации, судорогами и т.д.), вызванными или связанными с отличающимся от нормального уровнем активности (который может быть следствием, например, недостатка или отсутствия гена или белкового продукта и/или дефектного или утратившего функцию гена или белкового продукта) соответствующего гена или полипептида/белка. Самый очевидный пример здорового ("нормального") человека - это человек, у которого нет ГФФ или ГФФ, и у него нет мутаций или модификаций гена ALPL и белков ALP, которые могут приводить к симптомам, обусловленными ГФФ. В другом случае, относящемуся к функционированию ALP, область "нормального" человека в настоящем раскрытии может быть расширена за счет включения любых людей, не имеющих отклоняющихся от нормы уровней эндогенной щелочной фосфатазной активности (которую можно протестировать, например, с помощью субстрата (PPi, PEA и PLP), по сравнению с соответствующей активностью у других здоровых или нормальных людей).

Рекомбинантные TNALP, описываемые в данном документе, могут включать последовательности, замещенные либо на нуклеотидном, либо на аминокислотном уровне последовательностями в одном или нескольких положениях последовательности TNALP, в двух или более положениях последовательности TNALP, в 3 или более положениях последовательности TNALP, в 5 или более положениях последовательности TNALP, в 10 или более положениях последовательности TNALP или в 15-20 или более положениях последовательности TNALP. Замены могут включать, например, консервативные замены, замены ортологичными последовательностями и/или разрывающие замены. Последовательности TNALP также могут содержать делеции или перестановки.

Специалист в данной области поймет, что консервативные замены могут быть сделаны на нуклеотидном уровне для кодирования последовательностей, которые приводят к функциональным продуктам экспрессии. Как таковые, последовательность и фрагменты TNALP (необязательно включающие экзоны и регуляторные последовательности) могут быть последовательностями TNALP дикого типа, или они могут быть вариантными последовательностями, для которых характерна высокая степень гомологичности с последовательностями дикого типа. В данном раскрытии предложено применение последовательностей, которые по меньшей мере примерно на 70%, примерно на 71%, примерно на 72%, примерно на 73%, примерно на 74%, примерно на 75%, примерно на 76%, примерно на 77%, примерно на 78%, примерно на 79%, примерно на 80%, примерно на 81%, примерно на 82%, примерно на 83%, примерно на 84%, примерно на 85%, примерно на 86%, примерно на 87%, примерно на 88%, примерно на 89%, примерно на 90%, примерно на 91%, примерно на 92%, примерно на 93%, примерно на 94%, примерно на 95%, примерно на 96%, примерно на 97%, примерно на 98%, примерно на 99% или примерно на 100% или более идентичны требуемым последовательностям дикого типа. Используемый здесь термин "примерно" означает плюс или минус 10% от численного значения величины, с которой он используется.

Термины "гомологичность" или "идентичность" или "подобие" относятся к отношениям последовательных положений между двумя последовательностями и могут быть определены путем сравнения положения нуклеотида или положения аминокислоты в каждой последовательности, если они выровнены для целей сравнения. Термин "гомологичность" относится к соотносимости двух последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей. Термин "идентичность" относится к степени, в которой сравниваемые последовательности являются одинаковыми. Термин "подобие" относится к степени, в которой две последовательности являются одинаковыми, но включают нейтральные вырожденные нуклеотиды, которые можно заменить внутри кодона без изменения аминокислотной идентичности кодона.

Специалист в данной области техники поймет, что отдельные замены, делеции или вставки в последовательностях нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида или белка, которые изменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот в кодируемой последовательности, является "консервативно модифицированным вариантом". Такие варианты могут быть полезными, например, для изменения физических свойств пептида, например, для повышения стабильности или эффективности пептида. Таблицы консервативных замещений, предлагающие функционально подобные аминокислоты, известны специалистам в данной области техники. Такие консервативно модифицированные варианты дополняют, а не исключают полиморфные варианты, межвидовые гомологи и альтернативные аллели. В следующих группах даны неограничивающие примеры аминокислот, которые могут консервативно заменять друг друга: 1) аланин (А), глицин (G); 2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E); 3) аспарагин (N), глутамин (Q); 4) аргинин (R), лизин (K); 5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (М), валин (V); 6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); 7) серин (S), треонин (Т); и 8) цистеин (С), метионин (М).

Без привлечения какой-либо конкретной теории, рекомбинантная ALP, описываемая в данном документе, охватывает последовательности, содержащие консенсусную последовательность, полученную из ALP внеклеточного домена человеческих изоферментов ALP и известных функциональных ALP (например, ALP, полученных от человека, млекопитающего, отличного от человека, мыши, крысы, крупного скота, кошки, собаки, свиньи и т.п.). В данном контексте термин "внеклеточный домен" относится к любой функциональной внеклеточной части нативного белка (например, без сигнального пептида). Рекомбинантные sTNALP, сохраняющие исходные аминокислоты от 1 до 501 (от 18 до 501, если учитывать секретирующий сигнальный пептид) (Oda et al., J. Biochem 126: 694-699, 1999), аминокислоты от 1 до 504 (от 18 до 504 при секретировании) (Bernd et al., патент США № 6905689) и аминокислоты от 1 до 505 (18-505 при секретировании) (Tomatsu et al., US 2007/0081984), являются ферментативно активными. Кроме того, рекомбинантная sTNALP, сохраняющая аминокислоты от 1 до 502 (от 18 до 502 при секретировании) (Фигура 3) исходного TNALP, является ферментативно активной (см. публикацию патентной заявки PCT № WO 2008/138131). Это указывает на то, что возможно удаление аминокислотных остатков из C-концевого участка нативных щелочных фосфатаз без влияния на их ферментативную активность. Кроме того, настоящее раскрытие также включает любые варианты ALP, содержащие по меньшей мере одно замещение, делецию, вставку и/или модификацию (например, гликозилирование, ПЭГилирование, глутатионилирование, убиквитинирование, сиалирование ацетилирование, амидирование, блокирование, формилирование, гидроксилирование гамма-карбоксиглутаминовой кислоты, метилирование, фосфорилирование, пирролидонкарбоновая кислота и/или сульфатирование) аминокислотных остатков ALP дикого типа. Такие варианты, чтобы быть полезными в настоящем раскрытии, должны сохранять только некоторый уровень (например, более чем или примерно 30%, примерно 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 100%, примерно 150%, примерно 200%, примерно 300% или более) активности in vitro и/или in vivo по сравнению с ALP дикого типа.

Составные белки, содержащие ALP

В способах, описанных в данном документе, можно использовать составной белок рекомбинантной ALP (например, TNALP) для лечения выявленной(ых) популяции(й) субъектов. Составные белки могут включать полную длину или фрагменты ALP или вариантов, раскрытых в данном документе, и сохранять биологическую активность. Без привлечения какой-либо конкретной теории, составные белки могут содержать другие фрагменты, такие как любые полипептиды, липиды, нуклеотиды или другие части, для поддержания или улучшения, например, функционирования щелочной фосфатазы. Например, составные белки могут содержать область кристаллизующегося фрагмента (Fc), или другие полноразмерные иммуноглобулины или их фрагменты для увеличения стабильности или времени удерживания (например, более продолжительный период полувыведения) ALP in vivo. Сходным образом, технологию слияния альбумина можно использовать для улучшения периода полувыведения циркулирующей ALP (Schulte 2011 Thromb Res. 128:S9-12). Более того, составные белки могут содержать часть нацеливания для направления ALP к специфической ткани, органу или клеткам.

Настоящее изобретение также охватывает составные белки, содержащие прошедшие посттрансляционные модификации белки ALP или их фрагменты, которые модифицированы с помощью, например, гликозилирования, ПЭГилирования, глутатионилирования, убиквитинирования, сиалирования ацетилирования, амидирования, блокирования, формилирования, гидроксилирования гамма-карбоксиглутаминовой кислоты, метилирования, фосфорилирования, пирролидонкарбоновой кислоты и/или сульфатирования.

Термин "рекомбинантный белок" или "рекомбинантный полипептид" относится к белку, кодируемому генетически измененной нуклеиновой кислотой. Нуклеиновую кислоту обычно помещают в вектор, такой как плазмида или вирус, в зависимости от клетки-хозяина. Несмотря на то что клетки яичника китайского хомячка (СНО) использовались в качестве хозяина для экспрессии некоторых описанных здесь рекомбинантных белков, обычный специалист в данной области поймет, что ряд других хозяев и экспрессионных систем, например модифицированные клетки СНО, включая, но не ограничиваясь ими, CHO-DG44 и CHO/dhfr- (также обозначаемые как CHO duk^-), клетки HEK293, PerCβ, клетки почки новорожденного хомяка (BHK), бактериальные клетки, системы in vitro, L-клетки, клетки C127, клетки 3T3, клетки COS-7 и т.д., могут быть использованы для получения рекомбинантных белков. "Рекомбинантный расщепляемый" белок или полипептид относится к рекомбинантному белку, который может быть расщеплен ферментом клетки-хозяина с целью получения модифицированной активности, например, превращения рекомбинантного белка или полипептида в секретируемый или растворимый белок.

Фрагменты области кристаллизующегося фрагмента (Fc)

Полезные для настоящего раскрытия Fc-фрагменты включают Fc-фрагменты IgG, содержащие шарнирный участок, домены CH₂ и CH₃. Например, можно использовать IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-3 и IgG-4. Аминокислотная последовательность для Fc-фрагмента, используемого в составленном с ALP белке в настоящем описании, приведена в SEQ ID NO: 3 в качестве примера. Сходным образом, другие аминокислотные последовательности Fc-фрагмента, такие как аминокислотная последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше идентична последовательности в SEQ ID NO: 3, также включены в настоящее раскрытие.

Отрицательно заряженные пептиды

Составные белки ALP настоящего раскрытия могут включать в себя нацеленный на костную ткань полипептид, такой как, например, отрицательно заряженный пептид. Отрицательно заряженный пептид может представлять собой полиаспартат или полиглутамат, выбранные из группы, состоящей из D10, D8, D11, D12, D13, D14, D15, D16, E10, E8, E11, E12, E13, E14, E15 и E16, или любые другие варианты, известные в области техники, например, как описано в публикации PCT № WO 2008/138131.

Образование составных белков

В настоящем раскрытии предложена конструкция рекомбинантного ALP или составной белок ALP для лечения выявленных популяций и субпопуляций субъектов, например, пациентов с ГФФ. Такая конструкция рекомбинантной ALP или составной белок могут включать полную длину или фрагменты растворимого ALP (sALP, например, sTNALP) изофермента и Fc-фрагмент, далее с отрицательно заряженным пептидом или без него. Эти компоненты могут быть присоединены друг к другу в любой последовательности от 5'-конца к 3'-концу, при условии что полученный составной белок сохраняет неизмененной активность щелочной фосфатазы или улучшает ее. Иллюстративные варианты составных белков включают, без ограничения, sALP-Fc-D10, sALP-Fc, D10-Fc-sALP, Fc-sALP, D10-sALP-Fc, Fc-sALP-D10, Fc-D10-sALP и т.д. В этих вариантах D10 может быть необязательно заменен на любой другой отрицательно заряженный пептид или фрагмент для направленной транспортировки, а Fc-фрагмент может быть замещен любым функциональным IgG или иммуноглобулином.

В настоящем раскрытии предложен способ лечения судорог с помощью конструкций рекомбинантной ALP, включая sALP с присоединением Fc и/или меток отрицательно заряженного пептида или без них. Хотя в данной области хорошо известно, что отрицательно заряженные пептидные метки (такие как D10) могут нацеливать ALP на костные ткани (см., например, публикацию заявки PCT № WO 2008/138131), оказалось неожиданным то, что нацеленная на костные ткани конструкция sALP-Fc-D10 (также называемая асфотаза альфа) хорошо влияет на улучшение выживаемости Akp2 ^-/- мышей и облегчает физиологические параметры, связанные с судорогами, например, восстанавливая уровни содержания ГАМК и серина и снижая уровни концентрации цистатионина в головном мозге.

Спейсер

Различные компоненты (например, фрагменты или части) составного белка ALP могут быть соединены вместе через разделительный линкер или спейсер. В некоторых вариантах осуществления спейсер может представлять собой короткий полипептид, содержащий не менее 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот. В одном варианте осуществления Fc-фрагмент в составном белке sALP (например, sTNALP) выполняет роль спейсера, который способствует более эффективному сворачиванию белка. Это подтверждается открытием того, что экспрессия sTNALP-Fc-D10 выше, чем экспрессия sTNALP-D10 (Пример 2 в публикации заявки PCT № WO 2008/138131). Без привлечения какой-либо теории, Fc-фрагмент может действовать, ослабляя силы отталкивания, возникающие вследствие присутствия сильных отрицательных зарядов, которые последовательность D10 привносит на C-конец последовательности sALP. Другие полезные спейсеры включают, но не ограничиваются этим, полипептиды, способные ослаблять силы отталкивания, возникающие вследствие присутствия сильно отрицательно заряженной последовательности (например, полиаспартата, такого как D10), присоединенной к последовательности sALP.

Спейсер может быть сконструирован, например, для облегчения пространственного затруднения, которое может препятствовать взаимодействию двух доменов sALP из двух мономеров sALP. Кроме того, если необходимо, спейсер можно вставлять между sALP-частью и Fc-частью, например, конструкции sTNALP-Fc-D10 проиллюстрированы на Фигурах 2 и 3 со спейсерами между sTNALP. Fc и D10 содержат две аминокислоты (LK и DI, соответственно).

Нацеленная на костную ткань sALP (например, sTNALP-Fc-D10) может дополнительно необязательно содержать одну или несколько дополнительных аминокислот 1) ниже по отсчету от положения полиаспартата или полиглутамата; и/или 2) между полиаспартатом и Fc-фрагментом; и/или 3) между спейсером, каким является Fc-фрагмент, и sALP-фрагментом. В таком случае, например, в стратегии клонирования, используемой для получения конъюгата для доставки в костную ткань, в эти положения производятся вставки экзогенных аминокислот. Однако экзогенные аминокислоты следует выбирать так, чтобы не получить дополнительного сигнала привязки GPI. Вероятность того, что сконструированная последовательность отщепляется трансамидазой клетки-хозяина, можно предсказать, как описано у Ikezawa (Ikezawa 2002 Biol Pharm. Bull. 25(4):409-417).

Условия, подходящие для экспрессии sALP или его составного белка, могут быть оптимизированы, как было бы понятно специалисту в данной области. Такие условия включают использование, например, культуральной среды, которая позволяет получить sALP или его составной белок. Такая среда может быть приготовлена с использованием буфера, содержащего, например, бикарбонат и/или HEPES; ионы, включая, например, хлорид, фосфат, кальций, натрий, калий и/или магний; железо; источники углерода, включая, например, простые сахара и/или аминокислоты; липиды, нуклеотиды, витамины и/или факторы роста, включая, например, инсулин. В продаже доступны среды, пригодные для использования, такие как альфа-MEM, DMEM, Ham's-F12 и IMDM с добавкой 2-4 мM L-глутамина и 5% эмбриональной бычьей сыворотки. В продаже доступны небелковые среды животного происхождения, которые можно использовать, например, Hyclone™ SFM4CHO, Sigma CHO DHFR^-, Cambrex POWER™ CHO CD с добавкой 2-4 мM L-глутамина. Желательно, чтобы эти среды были получены без тимидина, гипоксантина и L-глицина для поддержания селективного давления, обеспечивающего стабильную экспрессию белкового продукта.

Термин "костная ткань" в данном контексте обозначает ткань, синтезируемую остеобластами, состоящую из органической матрицы, содержащей, главным образом, коллаген и минерализованной путем отложения кристаллов гидроксиапатита.

Составные белки, входящие в состав конъюгатов настоящего раскрытия для доставки в костную ткань, полезны для терапевтического лечения состояний, связанных с нарушением костной ткани, путем обеспечения доставки эффективного количества составного белка в костную ткань. Составные белки предлагаются в форме фармацевтических композиций в любых стандартных фармацевтически приемлемых носителях и вводятся путем любой стандартной процедуры, например, путем внутривенной инъекции.

В данном контексте термин "фенотип ГФФ" в общем случае должен относиться, если не указано иное, к любому характерному фенотипу субъекта, страдающего ГФФ, такому как, но не ограничиваясь им, фенотип, относящийся к нарушениям минерализации костей или зубов. Фенотипы ГФФ могут также включать "симптомы ГФФ" в дополнение к нарушениям минерализации костей, включая, но не ограничиваясь этим, например, рахит (нарушение роста хрящевой пластины), остеомаляцию, повышенные уровни в крови и/или моче неорганического PPi, PEA или PLP, судороги, боли в костях, отложения кристаллов пирофосфата кальция дигидрата (CPPD) в суставах, приводящего к хондрокальцинозу и преждевременной смерти. Говоря в общем, фенотип ГФФ может быть определен по замедлению роста при уменьшении длины длинной кости (такой как, например, бедренная кость, голень, плечевая кость, лучевая кость, локтевая кость), снижению средней плотности всей костной ткани и уменьшению костной минерализации в таких костях, как, например, бедра, голени, ребра и плюсны, а также фаланги, снижению минерализации зубов, преждевременной потере молочных зубов (например, аплазии, гипоплазии или дисплазии цементного вещества зубов). Говоря в общем, исправление или предотвращение дефекта костной минерализации можно наблюдать по одному или нескольким из следующего: увеличению длины длинной кости, увеличению минерализации костей и/или зубов, коррекции искривления ног, уменьшению боли в костях и уменьшению отложения кристаллов CPPD в суставах.

Под "субъектом, не относящимся к ГФФ" подразумевается любой субъект, у которого 1) нет ранее установленного диагноза ГФФ и нет признаков фенотипа ГФФ; 2) установлено отсутствие ГФФ; или 3) нет отличающегося от нормального уровня активности щелочной фосфатазы.

"Лечение" относится к введению терапевтического средства или выполнению медицинских процедур в отношении пациента или субъекта либо в целях профилактики (предотвращения), либо для лечения или уменьшения симптомов недуга или болезни, если пациент испытывает их. Профилактика заболевания, расстройства или симптомов, связанных с отличающимся от нормального уровнем активности ALP, входит в объем лечения. Способы и композиции, описанные в данном документе, или выявленные с помощью способов, описанных в данном документе, могут быть использованы как часть схемы лечения в терапевтически эффективных количествах. "Терапевтически эффективное количество" представляет собой количество, достаточное для уменьшения, предотвращения или улучшения симптомов, связанных с медицинским состоянием.

Другие противосудорожные препараты

Общепринятые противоэпилептические препараты могут блокировать натриевые каналы или усиливать функционирование ГАМК. Помимо потенциалозависимых натриевых каналов и компонентов системы ГАМК, другие цели включают ГАМК_A-рецепторы, GAT-1 ГАМК-транспортер и ГАМК-трансаминазу. Дополнительные цели включают потенциалозависимые кальциевые каналы, SV2A и α2δ. Иллюстративные противосудорожные препараты включают, например, альдегиды (например, паральдегид), ароматические аллильные спирты (например, стирипентол), барбитураты (например, фенобарбитал, метилфенобарбитал и барбексаклон), бензодиазепины (например, клобазам, клоназепам, клоразепат, диазепам, мидазолам, лоразепам, нитразепам, темазепам и ниметазепам), бромиды (например, калия бромид), карбаматы (например, фелбамат), карбоксамиды (например, карбамазепин, окскарбазепин и эсликарбазепин ацетат), жирные кислоты (например, вальпроаты, вигабатрин, прогабид и тиагабин), производные фруктозы (например, топирамат), аналоги ГАМК (например, габапентин и прегабалин), гидантоины (например, этотоин, фенитоин, мефенитоин и фосфенитоин), оксазолидиндионы (например, параметадион, триметадион и этадион), пропионаты (например, бекламид), пиримидиндионы (например, примидон), пирролины (например, бриварацетам, леветирацетам и селетрацетам), сукцинимиды (например, этосуксимид, фенсуксимид и месуксимид), сульфонамиды (например, ацетазоламид, сультиам, метазоламид и зонисамид), триазины (например, ламотригин), мочевины (например, фенетурид и фенацемид), вальпроиламиды (амидные производные вальпроата) (например, вальпромид и вальноктамид) и другие (например, перампанел).

По меньшей мере один из общепринятых противосудорожных препаратов можно вводить субъекту одновременно с одной или несколькими рекомбинантными ALP, описанными в данном документе, для лечения или облегчения судорожных состояний. В частности, такую(ие) комбинированную(ые) терапию(ии) можно использовать для лечения субъектов, страдающих от невосприимчивых к витамину В6 судорог, и их можно использовать для лечения популяции, выявленной как описано в данном документе, у субъектов которой наблюдается пониженный уровень активности ALP, вне зависимости от того, есть ли у них другие присущие ГФФ симптомы. Такие общепринятые противосудорожные препараты можно вводить одновременно с рекомбинантной ALP (в течение заранее определенного периода времени) или до, или после введения ALP.

Путь введения

Терапевтические средства, описанные в данном документе, например, рекомбинантные ALP, можно вводить, например, перорально, назально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, подъязычно, интратекально или внутрикожно. Путь введения может зависеть от целого ряда факторов, таких как окружающая среда и терапевтические цели.

В качестве примера, фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть в виде жидкости, раствора, суспензии, пилюли, капсулы, таблетки, желатиновой капсулы, порошка, геля, мази, крема, распыляемого тумана, тумана, распыленного пара, аэрозоля или фитосомы. Биологически активные добавки, как раскрыто в данном документе, при необходимости могут содержать фармацевтически приемлемые добавки, такие как суспендирующие агенты, эмульгаторы, неводные носители, консерванты, буферные соли, ароматизаторы, красители и подсластители. Составы для перорального введения также можно составлять соответствующим образом для обеспечения контролируемого высвобождения активных ингредиентов.

Дозировка

Конкретные дозировки будут зависеть от многих факторов, включая способ введения, возраст и вес пациента. Как правило, количество нацеленного на костную ткань или немеченого ALP, содержащегося в разовой дозе, представляет собой количество, которое эффективно предотвращает, задерживает или корректирует судороги, не вызывая значительной токсичности. Как правило, sALP или ее составной белок в соответствии с настоящим раскрытием можно вводить субъектам в дозах в пределах от 0,001 до 500 мг/кг/день, а в более конкретном варианте осуществления - от примерно 0,1 до примерно 100 мг/кг/день, и в еще более определенном варианте осуществления - от примерно 0,2 до примерно 20 мг/кг/день. Аллометрический метод масштабирования (Mahmood et al. 2003 Clin. Pharmacol., 43(7):692-7 и Mahmood 2009 J. Pharma. Sci., 98(10):3850-3861) может быть использован для экстраполяции дозы от мышей к человеку. Лечащий врач может адаптировать дозировку в соответствии с общепринятыми факторами, такими как степень заболевания и различные характеристики пациента.

Терапевтически эффективное количество sALP или ее составного белка также можно измерять непосредственно. Эффективное количество можно вводить ежедневно или еженедельно или по частям. Как правило, фармацевтическую композицию, раскрытую в данном документе, можно вводить в количестве от примерно 0,001 мг вплоть до примерно 500 мг на кг веса тела в день (например, 0,05, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,7, 0,8, 1 мг, 2 мг, 3 мг, 4 мг, 5 мг, 8 мг, 10 мг, 15 мг, 16 мг, 20 мг, 30 мг, 50 мг, 100 мг или 250 мг). Схема дозирования может быть предоставлена либо с одной либо с несколькими дозами. Например, в некоторых вариантах осуществления эффективное количество sALP или ее составного белка представляет собой дозу в пределах от примерно 0,1 до примерно 100 мг/кг/день, от примерно 0,2 мг до примерно 20 мг в день, от примерно 1 мг до примерно 5 мг в день, от примерно 1 мг до примерно 6 мг в день, от примерно 1 мг до примерно 7 мг в день, от примерно 1 мг до примерно 8 мг в день, от примерно 1 мг до примерно 10 мг в день, от примерно 0,7 мг до примерно 210 мг в неделю, от примерно 1,4 мг до примерно 140 мг в неделю, от примерно 0,3 мг до примерно 300 мг каждые три дня, от примерно 0,4 мг до примерно 40 мг через день, и от примерно 2 мг до примерно 20 мг через день.

Это всего лишь рекомендации, поскольку фактическая доза должна быть тщательно выбрана и оттитрована лечащим врачом или диетологом на основе клинических факторов, специфичных для данного пациента. Оптимальная суточная доза будет определяться методами, известными в данной области, и на нее будут влиять такие факторы, как возраст пациента, как указано выше, и другие клинически значимые факторы. Кроме того, пациенты могут в тот момент принимать лекарства в связи с другими заболеваниями или состояниями. Прием других лекарств можно продолжать в ходе приема sALP или ее составного белка пациентом, но в таких случаях настоятельно рекомендуется начинать с низких доз, чтобы определить, не возникают ли неблагоприятные побочные эффекты.

Переносчики/носители

Составы, содержащие sALP или ее составной белок, могут быть предоставлены пациентам в сочетании с фармацевтически приемлемыми стерильными водными или неводными растворителями, суспензиями или эмульсиями. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, рыбий жир и пригодные для инъекции органические сложные эфиры. Водные носители включают воду, водно-спиртовые растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и буферные медицинские парентеральные носители, включая раствор хлорида натрия, раствор декстрозы Рингера, раствор декстрозы плюс хлорид натрия, раствор Рингера, содержащий лактозу, или нелетучие масла. Внутривенные носители могут включать в себя жидкость и питательные вещества, пополняющие электролиты, например, основанные на декстрозе Рингера, и тому подобное.

Описанные здесь фармацевтические композиции можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением. В одном варианте осуществления можно использовать полимерные материалы, включая полимолочную кислоту, полиортоэфиры, сшитые амфипатические блок-сополимеры и гидрогели, полигидроксимасляную кислоту и полидигидропираны (см. также Smolen and Ball, Controlled Drug Bioavailability, Drug product design and performance, 1984, John Wiley & Sons; Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems, pharmacology and toxicology series, 2003, 2nd edition, CRRC Press), в других вариантах осуществления могут использоваться помпы (Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574).

Терапевтические средства настоящего раскрытия могут быть в форме лиофилизованного порошка с использованием подходящих растворов наполнителей (например, сахарозы) в качестве разбавителей.

Кроме того, нуклеотидные сегменты белков в соответствии с настоящим изобретением можно вводить индивидуальным лицам несколькими способами. Например, остеобласты могут быть выделены у пораженного индивидуального лица, трансформированы с помощью описанной здесь нуклеотидной конструкции и повторно введены пораженному индивидуальному лицу разными способами, включая внутривенную инъекцию. Альтернативно, нуклеотидную конструкцию можно вводить непосредственно пораженному индивидуальному лицу, например, путем инъекции. Нуклеотидную конструкцию можно также доставлять через носитель, такой как липосома, который может быть сконструирован так, чтобы нацеливаться на конкретный тип клеток, и приспособлен для введения различными путями.

Составные белки настоящего раскрытия могут также предпочтительно доставляться посредством генной терапии. Подходящие способы генной терапии включают способы, описанные в PCT публикации № WO 2006/060641, патенте США № US 7179903 и PCT публикации № WO 2001/036620, в которых используются, например, вектор аденовируса для терапевтического белка, и целевые гепатоциты в качестве клеток, вырабатывающих белок.

"Средство доставки генов" определяется как любая молекула, которая может нести вставленные полинуклеотиды в клетку-хозяина. Примерами средств доставки гена являются липосомы, биосовместимые полимеры, включая природные полимеры и синтетические полимеры; липопротеины; полипептиды; полисахариды; липополисахариды; искусственные вирусные оболочки; металлические частицы; и бактерии или вирусы, такие как бакуловирус, аденовирус и ретровирус, бактериофаг, космида, плазмида, грибковые векторы и другие рекомбинантные носители, обычно используемые в данной области, которые были описаны для экспрессии в различных эукариотических и прокариотических хозяевах, и могут быть использованы для генной терапии, а также для простой экспрессии белка. "Доставка гена", "перенос гена" и т.п. используются в данном контексте в качестве терминов, относящихся к введению экзогенного полинуклеотида (иногда называемого "трансгеном") в клетку-хозяина вне зависимости от способа, используемого для введения. Такие способы включают в себя различные методы, такие как, например, опосредованный вектором перенос генов (например, вирусная инфекция/трансфекция или различные другие комплексы доставки гена на основе белков или липидов), а также методы, облегчающие доставку "голых" полинуклеотидов (такие как электропорация, доставка с помощью "генной пушки" и различные другие методы, используемые для введения полинуклеотидов).

Введенный полинуклеотид может стабильно или временно поддерживаться в клетке-хозяине. Стабильное поддержание обычно требует, чтобы введенный полинуклеотид либо содержал источник репликации, совместимый с клеткой-хозяином, либо интегрировался в репликон клетки-хозяина, такой как внехромосомный репликон (например, плазмиду) или ядерную или митохондриальную хромосому. Ряд векторов способны осуществлять перенос генов в клетки млекопитающих.

"Вирусный вектор" определяется как рекомбинантно продуцированный вирус или вирусная частица, которая включает полинуклеотид, предназначенный для доставки в клетку-хозяина. Примеры вирусных векторов включают ретровирусные векторы, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы (например, см. публикацию PCT № WO 2006/002203), альфавирусные векторы и т.п.

В аспектах, где перенос генов осуществляется вирусным вектором ДНК, таким как аденовирус (Ad) или аденоассоциированный вирус (MV), векторная конструкция относится к полинуклеотиду, содержащему вирусный геном или его часть, и трансген. Ad представляют собой относительно хорошо охарактеризованную, гомогенную группу вирусов, включающую более 50 серотипов (WO 95/27071). Ad легко выращивать, и они не требуют включения в геном клетки-хозяина. Также были сконструированы векторы, полученные из рекомбинантного Ad, особенно те, которые уменьшают способность к рекомбинации и формированию вируса дикого типа (WO 95/00655 и WO 95/11984). В данной области известны векторы, которые содержат как промотор, так и сайт клонирования, с которыми полинуклеотид может быть функционально связан. Такие векторы способны транскрибировать РНК in vitro или in vivo. Для оптимизации экспрессии и/или транскрипции in vitro может потребоваться удалить, добавить или изменить 5' и/или 3' нетранслируемые участки клонов, чтобы устранить дополнительные, потенциально неподходящие кодоны альтернативной инициации трансляции или другие последовательности, которые могут влиять или уменьшать экспрессию или на стадии транскрипции, или трансляции.

sALP или ее составной белок настоящего изобретения можно также применять в сочетании с по меньшей мере другим активным ингредиентом для коррекции нарушения минерализации костей или других нежелательных симптомов ГФФ, например, судорог. Ее также можно использовать в сочетании с по меньшей мере одним с по меньшей мере одним другим активным ингредиентом для коррекции нарушения цементного вещества зубов.

Наборы

Настоящее изобретение также относится к набору для выявления популяции субъектов, у которых наблюдается пониженный уровень активности ALP и/или лечения выявленной популяции. С помощью набора можно, например, выявлять субъектов, у которых не наблюдается нарушение минерализации костей, и он может включать, например, терапевтические средства и составы для лечения судорог (например, лечения судорог, невосприимчивых к витамину В6, применяя, например, рекомбинантную ALP, например, рекомбинантную TNALP). Набор может дополнительно включать инструкции по введению композиции или вектора субъекту для коррекции или предотвращения заболевания, расстройства или симптомов, ассоциированных с пониженным уровнем активности ALP, например, ГФФ и связанных с ГФФ симптомов.

Такие наборы могут дополнительно содержать по меньшей мере еще одно активное средство, способное предотвращать или корректировать фенотип субъекта (такое, как другие противосудорожные препараты).

Кроме того, разделенный на ячейки набор в соответствии с настоящим описанием включает любой набор, в котором реагенты содержатся в отдельных контейнерах. Такие контейнеры включают маленькие стеклянные контейнеры, пластиковые контейнеры или полоски из пластика или бумаги. В таких контейнерах можно производить эффективный перенос реагентов из одного отсека в другой отсек так, чтобы образцы и реагенты не подвергались перекрестному загрязнению, а агенты или растворы в каждом контейнере могли быть добавлены количественным образом из одного отсека в другой.

Все ссылки, цитируемые в настоящем документе, включены сюда посредством ссылки во всей их полноте и для всех целей в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка была конкретно и индивидуально указана для включения в качестве ссылки целиком для всех целей. В той мере, в какой публикации и патенты или патентные заявки, включенные посредством ссылки, противоречат раскрытию, содержащемуся в спецификации, предполагается, что спецификация будет заменять их собой и/или иметь преимущество перед любым таким противоречащим материалом.

Все числа, выражающие количества ингредиентов, условия реакции и т.д., используемые в описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином "примерно". Соответственно, если не указано иное, численные параметры, указанные в описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приближенными значениями, которые могут варьироваться в зависимости от желаемых свойств, которые должны быть получены в соответствии с настоящим описанием. По крайней мере, а не как попытка ограничить применение доктрины эквивалентов к объему формулы изобретения, каждый числовой параметр должен толковаться в свете числа значимых цифр и подходов обычного округления.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1 Экспрессия и очистка рекомбинантной sTNALP-FcD10

С целью облегчения экспрессии и очистки рекомбинантной TNALP, удаляли гидрофобную C-концевую последовательность, которая устанавливает присоединение анкерного GPI в TNALP, чтобы сделать ее секретируемым растворимым ферментом (Di Mauro et al. 2002 Journal of Bone and Mineral Research 17:1383-1391). Кодирующую последовательность внеклеточной части TNALP также надстраивали, используя Fc фрагмент человеческого IgG1 (γ1) (Swiss-Prot P01857). Это позволило ускорить очистку рекомбинантного фермента с использованием хроматографии Protein A и неожиданно повысило экспрессию. Кроме того, для целевой доставки рекомбинантной TNALP в костную ткань, к С-концу Fc фрагмента присоединяли последовательность дека-аспартата (D10). Эта химерная форма TNALP, обозначаемая как sTNALP-FcD10, сохраняет полную ферментативную активность как при анализе при pH 9,8 с использованием искусственного субстрата п-нитрофенилфосфата, так и при анализе при pH 7,4 с использованием неорганического пирофосфата (PPi) в качестве физиологического субстрата. Как и во встречающейся в природе форме TNALP, N-концевой сигнальный пептид расщепляется в ходе ко-трансляционной транслокации белка в грубый эндоплазматический ретикулум. Его конструкция и структура схематически показаны на Фигуре 1. Аминокислотная последовательность составного белка (включая сигнальный пептид) показана на Фигуре 2. Аминокислотная последовательность составного белка в секретируемом виде (т.е. без сигнального пептида) показана на Фигуре 3. Полное описание процесса экспрессии и свойства иллюстративного составного белка sTNALP-FcD10 см., например, в публикации заявки PCT № WO 2008/138131.

ПРИМЕР 2 Субпопуляция мышей с "непораженной" ГФФ

У мышей Akp2 ^-/- в общем случае наблюдаются физиологические проявления, сходные с таковыми у людей - пациентами с ГФФ. Например, у таких мышей 1) может быть значительно более низкий (например, менее 1%) уровень активности ALP в плазме; 2) может быть нормальный вид при рождении, но далее развивается очевидное заболевание скелета в возрасте от 6 до 11 дней (в зависимости от фенотипа); 3) могут быть повышенные уровни содержания по меньшей мере одного из PPi, PLP и PEA в плазме; 4) могут наблюдаться прогрессивные рахитические изменения, остеопения и предрасположенность к переломам костей; 5) могут наблюдаться эпилептические припадки и угнетение дыхания; 6) может быть нарушено кормление и/или недостаточная прибавка в весе; и/или 7) может наступать гибель в возрасте 21 дня. Однако, у мышей Akp2 ^-/- могут быть различные степени выраженности фенотипа. Например, в Waymire 1995 ни у одной из мышей Akp2 ^-/- не наблюдались нарушения минерализации. Кроме того, введение добавки B6 (в виде пиридоксаля или PL, но не PN) также корректировало фенотип судорог и способствовало выживаемости у примерно 67% мышей Akp2 ^-/- с гибридным генетическим фоном C57BL/6, 129/Sv (B6129), хотя у выживших мышей впоследствии развивалось нарушение зубной системы. Остальные 33% плохо реагировали на инъекции PL или были невосприимчивы к ним. Однако, все мыши Akp2 ^-/- с инбредным генетическим фоном 129/Sv плохо реагировали на инъекции PL или были невосприимчивы к ним.

В настоящем раскрытии предложена группа мышей Akp2 ^-/- (с тем же гибридным генетическим фоном, что и в Waymire 1995, но из других поколений) с разными степенями тяжести фенотипов минерализации, но с похожей укороченной продолжительностью жизни. Интересно, что рекомбинантная TNALP позволяла выжить всем мышам KO и восстанавливала уровни содержания ГАМК, серина и цистатионина до уровней WT без введения добавки B6.

Разные субпопуляции мышей Akp2 ^-/- характеризовались тяжелой, умеренной, легкой или даже непораженной степенью тяжести фенотипов по сравнению с однопометниками дикого типа. На Фигуре 4 показаны различные нарушения минерализации у мышей Akp2 ^-/- . На Фигуре 5 показано, что в различных колониях мышей с одинаковым генотипом наблюдалось широкое распределение степени тяжести фенотипа. У примерно 30% нокаутных мышей в каждой колонии наблюдались "непораженные" фенотипы (например, отсутствовали значительные нарушения минерализации костей, как видно из Фигуры 4, отсутствовали значительные нарушения веса тела, как видно из Фигуры 6, и отсутствовали значительные нарушения длины костей, как видно из Фигуры 8). Неожиданно оказалось, что у нокаутных мышей с "непораженными" фенотипами (минерализации) по-прежнему наблюдается значительно сниженная продолжительность жизни по сравнению с другими нокаутными мышами с более тяжелыми фенотипами (Фигура 9 демонстрирует, что почти все нокаутные мыши (мыши с тяжелой степенью поражения и непораженные) погибли примерно на 25 день после рождения).

Было проанализировано влияние на трансмембранный перенос витамина B6 в мозге мышей Akp2 ^-/- , как при профилактическом лечении с использованием рекомбинантной TNALP, так и при его изъятии. В исследовании профилактического лечения мышам Akp2 ^-/- с гибридным фоном C57BL/6, 129/Sv (B6129) колонии разведения HPP-M2h_F4 делали подкожные инъекции либо 8,2 мг/кг (также известные как 8,2 mpk) рекомбинантной TNALP, либо носителя раз в день в течение 9 дней, начиная с рождения. Мышей дикого типа с тем же фоном не обрабатывали, и они выполняли роль контрольной группы. В исследовании с изъятием, мышей Akp2 ^-/- с тем же гибридным фоном и из поколения F4 ежедневно обрабатывали с момента рождения сходной дозой рекомбинантной TNALP в течение 35 дней, а затем 12 дней обрабатывали либо носителем (изъятие), либо продолжали обработку рекомбинантной TNALP. Контрольные группы включали как мышей дикого типа, которых не обрабатывали, так и мышей, которых обрабатывали рекомбинантной TNALP в течение первых 35 дней, а затем переходили на носитель в течение дополнительных 12 дней. У всех мышей был свободный доступ к сертифицированному коммерческому лабораторному корму для грызунов (Charles River Rodent Diet 5075-US), в который не добавляли пиридоксин. При вскрытии мозг собирали, замораживали в жидком азоте и хранили при -80˚C.

В случае продолжающейся ежедневной обработки с использованием sTNALP-FcD10 у мышей Akp2 ^-/- (включая мышей с "непораженным" фенотипом) продолжительность жизни была намного выше по сравнению с мышами, не проходившими обработку. Как показано на Фигурах 10-12, рисунки справа, такие "непораженные" нокаутные мыши выживали по меньшей мере до 48 дня (когда всех мышей умерщвляли).

Открытие субпопуляции "непораженных" мышей Akp2 ^-/- находится в соответствии с более ранними сообщениями о субпопуляции пациентов с ГФФ, у которых наблюдаются судороги, невосприимчивые к витамину В6, но отсутствуют нарушения в костях (например, см. de Roo et al., 2014 Molecular Genetics and Metabolism 111:404-407 и Baumgartner-Sigl et al., 2007 Bone 40:1655-1661). Очевидно, что для такой субпопуляции пациентов с ГФФ существует опасность того, что им не будет своевременно и эффективно поставлен диагноз, если лечащие врачи будут ограничивать диагностику ГФФ способами, основанными на традиционном выявлении деформации костей или нарушений минерализации. Пациенты с нормальной минерализацией костей также должны быть учтены, т.к. у них возможно проявление других симптомов, относящихся к ГФФ. Если у пациента наблюдаются судороги и/или отличающиеся от нормы уровни содержания белка/активности ALP (например, повышенное содержание субстратов ALP, таких как PPi, PLP и PEA), следует точно определить, относятся ли такие пациенты к "непораженной" субпопуляции, и показано ли им лечение с использованием добавки ALP. Вообще, если у пациента наблюдаются судороги, и особенно судороги, не поддающиеся лечению витамином B6, следует предпринять дополнительные шаги, чтобы протестировать наличие у пациента нарушенного функционирования ALP или повышенных уровней содержания субстратов ALP, т.е. определить, показано ли лечение добавкой ALP.

ПРИМЕР 3 Пониженное содержание гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) в мозге у мышей Akp2 ^-/- корректируется ежедневной обработкой рекомбинантной sTNALP-FcD10

Щелочные фосфатазы, такие как TNALP, PLALP, GALP и IALP, обладают физиологической активностью в отношении их субстратов фосфоэтаноламина (PEA), неорганического пирофосфата (PPi) и пиридоксаль-5'-фосфата (PLP). Сниженный уровень активности щелочной фосфатазы, такой как у субъекта с нокаутной или мутантной TNALP, приводит к накоплению внеклеточных PLP и PPi. Системное накопление PLP приводит к сопутствующему снижению содержания внутриклеточного PLP, поскольку PLP в его фосфорилированном виде не может проходить через плазматическую мембрану и проникать в клетку. PLP представляет собой каталитически активную форму витамина B6 и действует как кофактор в более чем 140 различных ферментативных реакциях, происходящих при метаболизме аминов и аминокислот (Percudani, R. & Peracchi, A., EMBO Rep., 4:850 4, 2003). Например, низкое содержание внутриклеточного PLP может приводить к сниженному ГАМК ЦНС, что далее может приводить к судорогам. Кроме того, высокая концентрация PPi может приводить к рахиту (остеомаляции), краниосиностозу, дыхательной недостаточности, нефрокальцинозу или слабости мышц. В особо тяжелых случаях эти осложнения могут привести к смертельному исходу. Ненормальный метаболизм аминов и аминокислот вследствие сниженной активности щелочной фосфатазы способствует патогенезу и характерным признакам фенотипа ГФФ.

Для измерений концентраций аминокислот в головном мозге головной мозг мышей, хранившийся при -80˚C, целиком, гомогенизировали в 2,5 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (pH 7,4, с добавкой коктейля ингибитора протеазы, Roche Diagnostics Кат. № 05892970001) на миллиграмм ткани. На суспензии тканей воздействовали ультразвуком 15 секунд и осветляли путем трех последовательных центрифугирований при 21000 x g в течение 15 мин при 4°C для удаления грубых примесей. Надосадочные экстракты замораживали при -80˚C до анализа. Общий белок измеряли с использованием микропланшетного анализа Coomassie Plus Bradford (Thermo Scientific Кат. № PI23236).

Количественную оценку концентраций аминокислот делали с помощью аминокислотного анализа Biochrom 30+ (Biochrom Ltd., Великобритания) в соответствии с литиевой высокоэффективной программой с использованием L-норлейцина (NORL) (Sigma Кат. № N8513) в качестве внутреннего стандарта (ISTD). Экстракты головного мозга освобождали от белка разведением 1: 4 в мастер-смеси, содержащей NORL-ISTD и дигидрат 5-сульфосалициловой кислоты (SSA) (Sigma Кат. № S7422) с конечной концентрацией 250 μмоль/л и 2,5%, соответственно. Белковые осадки удаляли путем трех последовательных центрифугирований при 10000 x g, 4°C. Стандартную смесь готовили путем добавления кислотного, нейтрального и основного аминокислотных стандартов (Sigma Кат. № A6407 и A6282), а также NORL-ISTD до конечного объема, равного 250 μмоль/л (с SSA 2,5%). 40 мкл стандартной смеси и освобожденных от белка образцов инжектировали в анализатор и аминокислоты разделяли согласно инструкции в "Accelerated Analysis of Amino Acids in Physiological Samples," Biochrom Application Note: 90 (в соответствии с инструкциями производителя Biochrom Ltd. (Cambridge, Великобритания)). Концентрации аминокислот (μмоль/л) определяли, используя программное обеспечение EZChrom. Конечные концентрации выражали в μмоль аминокислоты/грамм влажного веса головного мозга.

Как показано на рисунке слева Фигуры 10, у мышей Akp2 ^-/- наблюдается сниженная концентрация ГАМК по сравнению с мышами дикого типа, которую корректировали с помощью непрерывной ежедневной обработки с использованием sTNALP-FcD10. На рисунке справа Фигуры 10 видно, что восстановленный с помощью такой непрерывной обработки уровень ГАМК поддерживался по меньшей мере до дня 48, что значительно дольше, чем 25-дневная продолжительность жизни нокаутных мышей. Однако прерывание обработки с использованием sTNALP-FcD10 после дня 35 снова снижало концентрацию ГАМК у мышей Akp2 ^-/-.

С целью дальнейшего исследования действия sTNALP-FcD10 (SEQ ID NO: 1), измеряли концентрации цистатионина и серина в головном мозге (о которых известно, что их выработка регулируется посредством PLP), эти показатели у мышей Akp2 ^-/- и мышей дикого типа сравнивали между собой. Как видно из Фигур 11 и 12, соответственно, у мышей Akp2 ^-/- уровни содержания серина в головном мозге были значительно ниже, а уровни содержания цистатионина в головном мозге были значительно выше по сравнению с этими показателями у мышей дикого типа. Непрерывная обработка с использованием sTNALP-FcD10, однако, повышала уровни содержания серина и снижала уровни содержания цистатионина у этих нокаутных мышей до уровня, сравнимого с таковым у мышей дикого типа. Аналогично, после прерывания обработки с использованием sTNALP-FcD10 после дня 35 коррекция с использованием sTNALP-FcD10 исчезала (см. рисунок справа на Фигурах 11 и 12).

Ежедневная обработка с использованием sTNALP-FcD10 улучшала функционирование щелочной фосфатазы in vivo и повышала концентрацию ГАМК в головном мозге. Такая обработка восстановила баланс в нарушенном метаболизме аминов и аминокислот у мышей Akp2 ^-/-, что указывает на действенность такой обработки для лечения судорог и связанных с судорогами фенотипов.

Интересно, что нацеленная на костную ткань сигнальная D10 в исследуемой конструкции не препятствовала ее действию в отношении улучшения выживаемости нокаутных мышей и улучшение связанных с судорогами физиологических параметров, таких как восстановление уровней содержания ГАМК и серина и снижение уровней содержания цистатионина в мозге.

ПРИМЕР 4 Улучшение в клинических испытаниях

В клинических испытаниях hsTNALP-FcD10 (асфотазой альфа, SEQ ID NO: 1) исследовали: улучшает ли его использование судорожное состояние у пациентов с ГФФ. У всех пациентов с восприимчивыми к витамину B6 судорогами в анамнезе была тяжелая форма ГФФ, и два из них умерли после начала лечения с использованием hsTNALP-FcD10. У одного из пациентов наблюдались судороги после рождения и смерть наступила через несколько лет в ходе лечения с использованием hsTNALP-FcD10. Пациент получал витамин В6, но этого было недостаточно, чтобы предотвратить судорожные состояния. Несмотря на введение клоназепама пациент умер после наступления судорог в сочетании с отеком мозга, лихорадкой, дифференциальным дисбалансом ионов и потенциальной кардиомиопатией.

Шесть пациентов с восприимчивыми к B6 судорогами в анамнезе, которые профилактически принимали В6 перед началом лечения с использованием hsTNALP-FcD10, не испытывали судороги в ходе лечения с использованием hsTNALP-FcD10. Еще у одного пациента, у которого, по-видимому, были восприимчивые к B6 судороги в анамнезе, и который прекратил профилактический примем В6 сразу после начала лечения с использованием hsTNALP-FcD10, наблюдались судороги, которые прекратились при возобновлении комбинированной с профилактическим приемом В6 терапии. Другой пациент с восприимчивыми к B6 судорогами в анамнезе, который продолжал профилактический прием B6 в сочетании с лечением с использованием hsTNALP-FcD10, прекратил профилактический прием B6 через один год после начала комбинированного лечения и продолжал лечение с использованием только hsTNALP-FcD10. У этого пациента судороги не наблюдались после прекращения профилактического приема В6.

Данные предварительных клинических испытаний показали лечебный эффект hsTNALP-FcD10 на судороги у пациентов с ГФФ. Данные клинических испытаний показали, что монотерапия с использованием hsTNALP-FcD10 эффективна, и добавка витамина В6 необязательна, по меньшей мере после совместного введения двух молекул в течение определенного периода времени (например, одного года у одного пациента). Терапевтическое действие hsTNALP-FcD10 после прекращения приема B6 очевидно, поскольку восприимчивые к B6 судороги обычно полностью не предотвращаются только добавкой В6 (например, только часть мышей Akp2 ^-/- может выжить благодаря введению добавки витамина B6). Однако при отсутствии стадии совместного введения (B6 и hsTNALP-FcD10) (например, отсутствие совместного введения у одного пациента) или, возможно, если период совместного введения был недостаточно продолжительным, лечения с использованием только hsTNALP-FcD10 было недостаточно, чтобы на постоянной основе предотвратить восприимчивые к B6 судороги.

Пациентов с ГФФ оценивали в ретроспективном исследовании естественной истории и клинических испытаниях II Фазы лечения асфотазой альфа. Собирали и сравнивали клинические данные для аналогичных пациентов (например, младенцы и маленькие дети с тяжелой формой перинатальной или инфантильной ГФФ) из различных испытаний (отобранные в соответствии с их медицинской историей рахитической груди, дыхательной недостаточности и/или судорог, восприимчивых к витамину B6), получавших или не получавших лечение асфотазой альфа. Были выявлены сорок восемь (48) пациентов из исследования естественной истории и 37 пациентов были выявлены из исследований лечения асфотазой альфа, их демографические данные показаны в Таблице 1.

Таблица 1 Демографические данные пациентов, участвовавших в клинических исследованиях

	Исторический контроль (N=48)	Прошедшие лечение (N=37)
Возраст в начале Среднее ± SD Медиана (min, max)	НП	23 ± 24 месяца 9 (0, 71)
Возраст начала проявления ГФФ Среднее ± SD Медиана (min, max)	n=47 1 ± 2 месяца 0 (0, 6)	n=26* 1 ± 2 месяца 1 (0, 6)
Пол, % (n) Муж. Жен.	54% (26) 46% (22)	43% (16) 57% (21)
Раса, % (n) Белая Азиатская Другие	83% (40) 4% (2) 13% (6)	78% (29) 16% (6) 5% (2)
Продолжительность лечения Медиана (min, max)	НП	2 (0, 5) лет

НП: не применимо. *: Не собрано в одном испытании

Признаки/симптомы тяжелой ГФФ у этих пациентов в начале испытаний (т.е., до начала лечения асфотазой альфа в случае пациентов из II Фазы испытаний) фиксировались и обобщались (Таблица 2). Пациентов из исследований естественной истории и из II Фазы испытаний лечения ("прошедшие лечение" в Таблице 2, для соответствия с Таблицей 1) отбирали по сходному проценту признаков/симптомов тяжелой ГФФ. У десяти из 48 пациентов из исследований естественной истории и у 13 из 37 пациентов из II Фазы испытаний лечения наблюдались восприимчивые к витамину B6 судороги.

Таблица 2. Сводная таблица исследования популяции с признаками тяжелой ГФФ

Признаки тяжелой ГФФ	Исторический контроль (N=48)	"Прошедшие лечение" (N=37)	P -значение
Рахитическая грудь	83% (40)	81% (30)	0,78
Дыхательная недостаточность	83% (40)	73% (27)	0,29
Судороги, восприимчивые к витамину B₆	21% (10)	35% (13)	0,22
Все вышеуказанное	17% (8)	22% (8)	0,59

Выживаемость отобранных пациентов из исследований естественной истории и из II Фазы лечения асфотазой альфа сравнивали и обобщали в Таблице 3. Большинство пациентов (примерно 58%) из исследований естественной истории не дожили до возраста одного года, при этом их выживаемость продолжала снижаться и достигла своего минимума, равного примерно 27%, при возрасте от одного года до трех с половиной лет. Однако большинство пациентов (примерно 89%), прошедшие лечение асфотазой альфа, выжили до возраста свыше 5 лет.

Таблица 3. Выживаемость пациентов, отобранных в различных исследованиях и в разном возрасте

	Выживаемость
Возраст пациента (лет)	Исторический контроль	Прошедшие лечение
1	42%	95%
3,5	27%	89%
5	27%	89%

Выживших пациентов из разных исследований анализировали на предмет признаков тяжелой ГФФ после достижения возраста одного года. Как показано в Таблице 4, из 48 пациентов из группы исследования естественной истории, выжило 33% пациентов с рахитической грудью (13 из 40) и 18% пациентов с дыхательной недостаточностью (7 из 40). Однако, не выжил ни один пациент (0 из 10) с судорогами, восприимчивыми к витамину B6. Напротив, в группах II Фазы испытаний лечения выжило 90% пациентов (27 из 30) с рахитической грудью и 89% пациентов (24 из 27) с дыхательной недостаточностью. В частности, выжило 85% пациентов (11 из 13) с судорогами, восприимчивыми к витамину B6. Таким образом, лечение асфотазой альфа значительно повысило выживаемость пациентов с судорогами, восприимчивыми к витамину B6, в то время как только один витамин B6 (в случае пациентов из группы исследования естественной истории) редко способствовал выживаемости путем подавления судорог.

Таблица 4. Сводная таблица исследования популяции с признаками тяжелой ГФФ после лечения

Признаки тяжелой ГФФ	Исторический контроль (N=48)	Прошедшие лечение (N=37)
Рахитическая грудь	33% (13/40)	90% (27/30)
Дыхательная недостаточность	18% (7/40)	89% (24/27)
Судороги, восприимчивые к витамину B₆	0% (0/10)	85% (11/13)
Все вышеуказанное	0% (0/8)	88% (7/8)

Несмотря на то что в качестве основного параметра для анализа принималась выживаемость пациентов, в качестве вторичного аналитического параметра была установлена выживаемость без инвазивной искусственной вентиляции. Сходным образом, в Таблице 5, только 31% пациентов из исследований естественной истории дожили до возраста одного года без инвазивной искусственной вентиляции, при этом их выживаемость без инвазивной искусственной вентиляции продолжала снижаться и достигла своего минимума, равного примерно 25%, при возрасте от одного года до трех с половиной лет. Однако большинство пациентов (примерно 83%), прошедшие лечение асфотазой альфа, выжили даже более 5 лет.

Таблица 5. Возрастная выживаемость пациентов без инвазивной искусственной вентиляции

	Выживаемость без инвазивной искусственной вентиляции
Возраст пациента (лет)	Исторический контроль	Прошедшие лечение
1	31%	96%
3,5	25%	83%
5	25%	83%

Лечение асфотазой альфа младенцев с тяжелой формой ГФФ значительно улучшало минерализацию их скелета, причем улучшение произошло в среднем уже через 3 месяца, продолжалось и в основном поддерживалось в течение более чем 3-х лет. У пациентов наблюдалось общее улучшение моторных навыков, мелкой моторики и когнитивных функций.

В заключение, по сравнению с историческими контролями, лечение асфотазой альфа помогло пациентам с тяжелой формой перинатальной и инфантильной ГФФ (с высокой опасностью наступления смертельного исхода) повысить как в целом их выживаемость (89% по сравнению с 27%, P<0,0001), так и выживаемость без инвазивной искусственной вентиляции.

ПРИМЕР 5 Лечение судорожного состояния у мышей и людей

Мышей Akp2 ^-/- незначительными, непораженными или неопределяемыми нарушениями минерализации и их однопометников дикого типа обрабатывали, используя растворимую рекомбинантную конструкцию ALP (например, sTNALP, sTNALP-Fc, sTNALP-FcD10 или другие рекомбинантные конструкции изофермента). Судороги до и после обработки записывали на видео камеру или с помощью других физиологических способов. Концентрации ГАМК, серина и цистатионина в головном мозге (также могли быть получены из сыворотки или мочи) исследовали и сравнивали с известными способами. Терапевтический эффект от использования рекомбинантной ALP продемонстрирован на примере уменьшенных случаев судорог и/или восстановленных концентраций ГАМК/серина после обработки мышей Akp2 ^-/-. Были исследованы разные схемы дозировок и проведено их сравнение. Также был исследован витамин В6 сам по себе и в комбинированной терапии с целью обнаружения потенциального синергического эффекта.

Аналогично, пациенты с ГФФ с незначительными, непораженными или неопределяемыми нарушениями минерализации и здоровые волонтеры получали растворимую конструкцию рекомбинантной ALP, раскрываемую в настоящем документе. Судороги, наблюдаемые до и после лечения, учитывали и сравнивали. Физиологические параметры, такие как содержание цистатионина в плазме и/или моче (или концентрации ГАМК, серина и/или цистатионина головном мозге) измеряли и записывали. Терапевтический эффект от использования рекомбинантной ALP продемонстрирован на примере более редких случаев судорог и/или восстановленной концентрации цистатионина в плазме/моче после лечения. Также был исследован витамин В6 сам по себе и в комбинированной терапии с целью обнаружения потенциального синергического эффекта. Была исследована комбинированная терапия различной продолжительности с целью оптимизации процесса комбинированной терапии с последующей терапией с использованием только добавки ALP.

С помощью генетического обследования или других известных методов выявлена также новая субпопуляция пациентов, которым ранее не был поставлен диагноз ГФФ, у которой установлены отличающиеся от нормальных уровни содержания белка щелочной фосфатазы и/или ее функционирования. Одним характерным симптомом у такой субпопуляции пациентов являются судороги, которые восприимчивы или не восприимчивы к витамину В6. Пациентов в такой субпопуляции затем лечили с использованием конструкций рекомбинантной ALP, раскрываемых в данном документе, в сочетании с добавкой В6 или без нее. Если добавку В6 вводят совместно, то ее введение прерывают после определенного периода времени (определяемого лечащим врачом или лицом, ответственным за введение лекарства, в соответствии с индивидуальным состоянием каждого пациента), после чего проводят терапию с использованием только ALP.

ПРИМЕР 6 Получение максимального эффекта при лечения судорог путем мониторинга биомаркеров у пациентов

Определенная субпопуляции пациентов, у которой наблюдаются судороги, была выявлена по их характерному уровню выше нормы субстратов щелочной фосфатазы (например, PPi, PEA и PLP). Такие повышенные уровни содержания ДНК, РНК и/или белка этих субстратов определяются с помощью обычных методов, известных в области техники, включая, например, количественную ПЦР, Саузерн блоттинг, Нозерн блоттинг, PAGE, SDS-PAGE, Вестерн блоттинг и т.д. После выявления этой определенной субпопуляции пациентов ей вводят конструкции рекомбинантной ALP, раскрываемые в данном документе, для облегчения симптомов судорог. Необязательно можно осуществлять совместное введение одного или нескольких противосудорожных средств, таких как витамеры витамина В6, в течение, по меньшей мере, некоторого времени. При такой заместительной терапии с использованием одной ALP или комбинированной терапии, ведут постоянное наблюдение за эндогенными биомаркерами пациентов до, в ходе и после лечения. Например, если витамин B6 вводится одновременно, лечащие врачи или медперсонал, осуществляющий введение лекарства, будут следить за уровнями биомаркеров у пациентов, получающих лечение, с целью определения, предпочтительно основанном на индивидуальном состоянии каждого из пациентов, соответствующего момента времени для совместного введения витамина B6, схемы дозирования B6 и/или рекомбинантной ALP, продолжительности периода совместного введения и момента времени для прекращения совместного введения витамина B6, и т.п.

Биомаркеры, по которым можно вести наблюдение в данном изобретении, включают, по меньшей мере, субстраты щелочной фосфатазы (PPi, PEA и/или PLP) или другие биомаркеры, на которые влияют эти субстраты щелочной фосфатазы (например, ГАМК, цистатионин, серин, допамин, серотонин, гистамин, D-серин и сероводород, и т.п.). Такие биомаркеры можно исследовать, используя сыворотку или мочу пациента, или с помощью любого другого стандартного метода исследования, известного в области техники.

ПРИМЕР 7 Неэффективность витамина B6 в лечении судорог у мышей Akp2 ^-/-

Лечение витамином В6 является стандартным лечением судорог. Однако у многих пациентов с ГФФ и мышей Akp2 ^-/- судороги невосприимчивы к B6, что делает невозможной их корректировку введением витамина B6, и может привести к смертельному исходу. Было проведено дополнительное исследование, чтобы подтвердить отсутствие действенности витамина B6 у мышей Akp2 ^-/- . В этом исследовании мышам Akp2 ^-/- давали 325 м.д. витамина B6 (пиридоксина) в качестве добавки к рациону. Однако по-прежнему наблюдали судороги у мышей Akp2 ^-/- как с нормальной минерализацией костей, так и с тяжелыми нарушениями минерализации. Ни одна из нокаутных мышей с тем или другим фенотипом минерализации не выжила дольше 25 дней (Фигура 13).

Для подтверждения того, что профили биомаркеров не могут быть скорректированы у мышей Akp2 ^-/- добавкой пиридоксина, измеряли концентрации аминокислот в головном мозге с использованием того же способа, который раскрыт в Примере 3, за исключением того, что использовали S-(2-аминоэтил)-L-цистеин (AEC) (Sigma Кат. № A2636) (вместо L-норлейцина (NORL)) в качестве внутреннего стандарта (ISTD), и наконец, того, что анализировали 15 мкл, а не 40 мкл стандартной смеси и освобожденных от белка образцов. Как показано на Фигуре 14, у мышей дикого типа возраста 17-19 дней, получавших добавку пиридоксина с кормом, была относительно высокая концентрация ГАМК и низкая концентрация цистатионина в головном мозге, в то же время у мышей Akp2 ^-/- с тяжелыми нарушениями минерализации (например, типичная группа с невосприимчивой к витамину B6 ГФФ, у которой биомаркеры расположены в заштрихованной области) наблюдалась сравнительно низкая концентрация ГАМК и высокая концентрация цистатионина в головном мозге (показано в заштрихованной области), несмотря на добавку 325 м.д. пиридоксина в корме. В случае мышей Akp2 ^-/- с нормальной минерализацией костей, у некоторых из них концентрации ГАМК и цистатионина подвергались коррекции с помощью добавки пиридоксина, в то же время в другой подгруппе эти биомаркеры не подверглись коррекции добавкой пиридоксина (показано в заштрихованной области).

В заключение, было подтверждено, что у подгруппы мышей Akp2 ^-/- нормальная минерализация костей, но наличествуют угрожающие жизни невосприимчивые к витамину B6 судороги. Соответственно, сходная субпопуляция пациентов также существует (с поставленным диагнозом ГФФ или его отсутствием), у которых наблюдаются нарушения ALP и судороги, но минерализация костей нормальная. Таким образом, предложен новый протокол диагностики (основанный на функционировании ALP, таком как уровни содержания PLP/PPi/PEA или биомаркеров, описанных в данном документе) для выявления такой субпопуляции пациентов с целью своевременного эффективного лечения их симптомов. Кроме того, добавку ALP (такую как асфотаза альфа) (либо саму по себе, либо в сочетании с витамином B6), в отличие от одного витамина B6, следует вводить такой субпопуляции пациентов для обеспечения улучшенного лечения.

Многие модификации и варианты, раскрытые в данном документе, могут быть выполнены без отступления от его сущности и объема, что будет очевидно специалистам в данной области техники. Конкретные варианты осуществления, описанные здесь, предлагаются только в качестве примера и не предназначены для ограничения каким-либо образом. Предполагается, что спецификация и примеры должны рассматриваться только как иллюстративные, а истинный объем и сущность изобретения указаны в следующей далее формуле изобретения.

Claims

1. Способ лечения судорог у субъекта-человека, имеющего отклоняющиеся от нормы уровни по меньшей мере одного субстрата щелочной фосфатазы, выбранного из пиридоксаль-5'-фосфата (PLP), неорганического пирофосфата (PPi) и фосфоэтаноламина (PEA), включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы, имеющей последовательность SEQ ID NO: 1, где определено, что субъект является невосприимчивым к лечению судорог витамином В6.

2. Способ по п. 1, дополнительно включающий:

(i) выявление популяции субъектов с отклоняющимися от нормы уровнями активности щелочной фосфатазы, которые страдают от судорог, или для которых существует опасность возникновения судорог; или

(ii) выявление популяции субъектов с уровнями содержания по меньшей мере одного субстрата щелочной фосфатазы выше нормы, которые страдают от судорог, или для которых существует опасность возникновения судорог.

3. Способ по п. 1 или 2, где у субъекта ранее был установлен диагноз гипофосфатазии (ГФФ).

4. Способ по п. 1 или 2, где у субъекта не был ранее установлен диагноз ГФФ.

5. Способ по п. 3, где активность щелочной фосфатазы измеряют посредством ферментативной активности щелочной фосфатазы в отношении по меньшей мере одного из пиридоксаль-5'-фосфата (PLP), неорганического пирофосфата (PPi) и фосфоэтаноламина (PEA).

6. Способ по любому из пп. 1-5, где у субъекта наблюдается повышенное содержание пиридоксаль-5'-фосфата (PLP) в сыворотке.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где у субъекта наблюдается пониженное содержание внутриклеточного пиридоксаль-5'-фосфата (PLP).

8. Способ по любому из пп. 1-7, где у субъекта наблюдается по меньшей мере одно из пониженного содержания гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) в головном мозге и пониженного содержания серина в головном мозге.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где у субъекта наблюдается по меньшей мере одно из повышенного содержания цистатионина в головном мозге или в моче.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где субъекту вводят по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу ежедневно в течение по меньшей мере одной недели, одного месяца, трех месяцев, шести месяцев или одного года.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где введение по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы повышает содержание ГАМК в головном мозге.

12. Способ по любому из пп. 1-11, где субъекту параллельно вводят терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства.

13. Способ по п. 12, где по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство представляет собой противосудорожный препарат.

14. Способ по п. 12, дополнительно включающий:

осуществление совместного введения по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства и по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы; и

прекращение введения по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, при продолжающемся введении субъекту по меньшей мере одной рекомбинантной щелочной фосфатазы.

15. Способ по п. 13, где по меньшей мере один дополнительный противосудорожный препарат и по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу совместно вводят субъекту в течение не менее одного месяца, не менее шести месяцев или не менее одного года.

16. Способ по любому из пп. 12-15, где по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство представляет собой по меньшей мере одно из витамина В6 (пиридоксина) или витамера витамина В6.

17. Способ по любому из пп. 1-16, где по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят в дозе от 0,1 мг/кг/день до 20 мг/кг/день или в сравнимой недельной дозировке.

18. Способ по п. 17, где по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят в дозе от 0,5 мг/кг/день до 20 мг/кг/день или в сравнимой недельной дозировке.

19. Способ по п. 17, где по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят в дозе от 0,5 мг/кг/день до 10 мг/кг/день или в сравнимой недельной дозировке.

20. Способ по п. 17, где по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят в дозе от 0,5 мг/кг/день до 8 мг/кг/день или в сравнимой недельной дозировке.

21. Способ по п. 17, где по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят в дозе от 0,5 мг/кг/день до 5 мг/кг/день или в сравнимой недельной дозировке.

22. Способ по п. 17, где по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят в дозе от 0,1 мг/кг/день до 0,5 мг/кг/день или в сравнимой недельной дозировке.

23. Способ по п. 17, где по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят в дозе от 0,1 мг/кг/день до 1 мг/кг/день или в сравнимой недельной дозировке.

24. Способ по п. 17, где по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят в дозе от 1 мг/кг/день до 5 мг/кг/день или в сравнимой недельной дозировке.

25. Способ по п. 17, где по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят в дозе от 1 мг/кг/день до 8 мг/кг/день или в сравнимой недельной дозировке.

26. Способ по п. 17, где по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят в дозе от 1 мг/кг/день до 10 мг/кг/день или в сравнимой недельной дозировке.

27. Способ по любому из пп. 1-26, где по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят по меньшей мере одним из внутривенного, внутримышечного, подкожного, подъязычного, интратекального и внутрикожного путей.

28. Способ по п. 27, где по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят внутривенно.

29. Способ по п. 28, где по меньшей мере одну рекомбинантную щелочную фосфатазу вводят внутривенно, а затем подкожно.