JP2930380B2 - ブタ由来新規生理活性ペプチド（ｃｎｐ―５３） - Google Patents
ブタ由来新規生理活性ペプチド（ｃｎｐ―５３）Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ブタ由来でCNP（Ｃ−type natriuretic pe
ptide）に属する新規生理活性ペプチドに関し、更に詳
細には53個のアミノ酸残基から成るペプチド及びそのペ
プチド誘導体に関する。
ptide）に属する新規生理活性ペプチドに関し、更に詳
細には53個のアミノ酸残基から成るペプチド及びそのペ
プチド誘導体に関する。
発明の背景 近年、哺乳類の心房及び脳から、体液及び血圧の恒常
性を調節しているホルモンとして、心房性ナトリウム利
尿ペプチド（atrial natriuretic peptide:ANP）と脳ナ
トリウム利尿作用ペプチド（brain natriuretic peptid
e:BNP）と呼ばれる２種類のタイプの異なるペプチドホ
ルモン類が発見され、その構造及び生合成機構が明らか
にされると共に、それらの生理作用についても明らかに
されてきた。
性を調節しているホルモンとして、心房性ナトリウム利
尿ペプチド（atrial natriuretic peptide:ANP）と脳ナ
トリウム利尿作用ペプチド（brain natriuretic peptid
e:BNP）と呼ばれる２種類のタイプの異なるペプチドホ
ルモン類が発見され、その構造及び生合成機構が明らか
にされると共に、それらの生理作用についても明らかに
されてきた。
ANP発見への最初の手がかりは、1981年de Boldらによ
り報告された。すなわち、彼らはラット心房粗抽出液を
他のラットに静注すると著しい利尿を生ずることを見い
だし、心房中にナトリウム利尿を促進する因子が存在し
ていることを報告した（de Bold A.J.et al,Life Sci.,
28 89,1981）。その後、この因子は寒川らによりヒト心
房より単離、その構造が明らかにされ、心房性ナトリウ
ム利尿ペプチド（ANP）と命名された（Kangawa,K.et a
l,Biochem.Biophys.Res.Commun.,118 131,1984;Kangaw
a,K.et al,Nature,313 397,1985）。ヒトANP（hANP）は
心房において分子量の異なる３種類、すなわちα型、β
型、およびγ型が存在しており、α型hANP（α−hANP）
は分子内に１個のＳ−Ｓ結合を有した28個のアミノ酸か
らなる一本鎖ペフチドであること、β型hANP（β−hAN
P）はα−hANPが分子間でＳ−Ｓ結合を形成した逆平行
２量体であること、γ型hANP（γ−hANP）は126個のア
ミノ酸からなる高分子蛋白質で、そのＣ−末端部分にα
−hANPを含んでいることが明らかにされた。さらに、hA
NPに対応するcDNAが単離され、この解析からα−、β
−、γ−hANPの生合成経路が判り、これらはいずれも共
通の前駆体タンパクから生合成されることが判った（Oi
kawo,S.et al,Nature,309 724,1984）。
り報告された。すなわち、彼らはラット心房粗抽出液を
他のラットに静注すると著しい利尿を生ずることを見い
だし、心房中にナトリウム利尿を促進する因子が存在し
ていることを報告した（de Bold A.J.et al,Life Sci.,
28 89,1981）。その後、この因子は寒川らによりヒト心
房より単離、その構造が明らかにされ、心房性ナトリウ
ム利尿ペプチド（ANP）と命名された（Kangawa,K.et a
l,Biochem.Biophys.Res.Commun.,118 131,1984;Kangaw
a,K.et al,Nature,313 397,1985）。ヒトANP（hANP）は
心房において分子量の異なる３種類、すなわちα型、β
型、およびγ型が存在しており、α型hANP（α−hANP）
は分子内に１個のＳ−Ｓ結合を有した28個のアミノ酸か
らなる一本鎖ペフチドであること、β型hANP（β−hAN
P）はα−hANPが分子間でＳ−Ｓ結合を形成した逆平行
２量体であること、γ型hANP（γ−hANP）は126個のア
ミノ酸からなる高分子蛋白質で、そのＣ−末端部分にα
−hANPを含んでいることが明らかにされた。さらに、hA
NPに対応するcDNAが単離され、この解析からα−、β
−、γ−hANPの生合成経路が判り、これらはいずれも共
通の前駆体タンパクから生合成されることが判った（Oi
kawo,S.et al,Nature,309 724,1984）。
なお、これらhANPのうちα−hANPが主に血中に分泌さ
れていることが判っている。
れていることが判っている。
hANPの構造が明らかにされて以来、現在までに他の哺
乳類のANP構造も明らかにされてきている。この結果、A
NPのアミノ酸配列は、げっ歯類からヒトまで哺乳類動物
において広い範囲で類似しており、特にα型ANP（α−A
NP）はヒト・イヌ・ブタを含む高等哺乳類においては同
一のアミノ酸配列を持つこと、また、ラット及びウサギ
ではα−hANPの12位のメチオニン残基がイソロイシン残
基に置換している一箇所以外全く同一のアミノ酸配列を
有していることが判ってきている（Oikawa,S.et al,Bio
chem.Biophys.Res.Commun.,132 892,1985;Forssmann,W.
G.et al,Anat.Embryol.,168 307,1983）。
乳類のANP構造も明らかにされてきている。この結果、A
NPのアミノ酸配列は、げっ歯類からヒトまで哺乳類動物
において広い範囲で類似しており、特にα型ANP（α−A
NP）はヒト・イヌ・ブタを含む高等哺乳類においては同
一のアミノ酸配列を持つこと、また、ラット及びウサギ
ではα−hANPの12位のメチオニン残基がイソロイシン残
基に置換している一箇所以外全く同一のアミノ酸配列を
有していることが判ってきている（Oikawa,S.et al,Bio
chem.Biophys.Res.Commun.,132 892,1985;Forssmann,W.
G.et al,Anat.Embryol.,168 307,1983）。
最初ANPは心房より単離されたが、ANPに対する抗体を
作製し、生体内における分布を調べたところ、ANPは心
房以外にも脳にも存在していることが判った。脳では視
床下部、橋被蓋（pontine tegmentum）にANP含有ニュー
ロンの存在が報告されていることから（Cantin,M.et a
l,Histochemistry,80 113,1984;Saper,C.B.et al,Scien
ce,227,1047,1985）、ANPは現在脳において心血管系の
調節にかかわる神経伝達物質としても作用しているので
はないかと考えられている。
作製し、生体内における分布を調べたところ、ANPは心
房以外にも脳にも存在していることが判った。脳では視
床下部、橋被蓋（pontine tegmentum）にANP含有ニュー
ロンの存在が報告されていることから（Cantin,M.et a
l,Histochemistry,80 113,1984;Saper,C.B.et al,Scien
ce,227,1047,1985）、ANPは現在脳において心血管系の
調節にかかわる神経伝達物質としても作用しているので
はないかと考えられている。
ANPの生理作用は前にも述べたが、顕著なナトリウム
利尿作用を示すのみならず、血液降下作用さらには副腎
皮質のアルドステロン産生を抑制することが判ってき
た。従って、現在ANPは心房から血中に分泌され、体液
及び血圧の恒常性を調節するホルモンとして作用するの
みならず、脳では神経系の神経伝達物質として作用し、
体液及び血圧の恒常性を調節していることが判ってき
た。
利尿作用を示すのみならず、血液降下作用さらには副腎
皮質のアルドステロン産生を抑制することが判ってき
た。従って、現在ANPは心房から血中に分泌され、体液
及び血圧の恒常性を調節するホルモンとして作用するの
みならず、脳では神経系の神経伝達物質として作用し、
体液及び血圧の恒常性を調節していることが判ってき
た。
一方、BNPは1988年Sudohらによりブタ脳から単離・同
定されたペプチドである（Sugon,T.et al,Nature,332 7
8,1988）。
定されたペプチドである（Sugon,T.et al,Nature,332 7
8,1988）。
Sudohらにより最初にブタ脳から単離されたBNP（pBNP
−26）は分子内に１個のＳ−Ｓ結合を持つアミノ酸26残
基より成るペプチドであり、その構造、すなわちアミノ
酸一次配列、及びＳ−Ｓ結合様式（アミノ酸17残基で構
成される環状構造）はANPと似ているが、ANPとは明らか
に区別されるペプチドである。さらにこのペプチドはAN
Pと同様、ナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を示す
ことが確認されたことから、このペプチドは脳ナトリウ
ム利尿ペプチド（BNP）と命名れた。その後、ブタ脳か
らpBNP−26のＮ−末端に６個のアミノ酸が付加した32ア
ミノ酸残基よりなるpBNP−32も単離され（Sudoh,T.et a
l,Biochem.Biophys,Res.Commun,,155 726,1988）、さら
にはブタ心房よりγ−BNPと命名されたアミノ酸106個か
らなるペプチドも単離・同定されている（Minamino,N.e
t al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,157 402,1988）。
−26）は分子内に１個のＳ−Ｓ結合を持つアミノ酸26残
基より成るペプチドであり、その構造、すなわちアミノ
酸一次配列、及びＳ−Ｓ結合様式（アミノ酸17残基で構
成される環状構造）はANPと似ているが、ANPとは明らか
に区別されるペプチドである。さらにこのペプチドはAN
Pと同様、ナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を示す
ことが確認されたことから、このペプチドは脳ナトリウ
ム利尿ペプチド（BNP）と命名れた。その後、ブタ脳か
らpBNP−26のＮ−末端に６個のアミノ酸が付加した32ア
ミノ酸残基よりなるpBNP−32も単離され（Sudoh,T.et a
l,Biochem.Biophys,Res.Commun,,155 726,1988）、さら
にはブタ心房よりγ−BNPと命名されたアミノ酸106個か
らなるペプチドも単離・同定されている（Minamino,N.e
t al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,157 402,1988）。
これらの結果、これらBNPペプチド類はANPとは全く異
なった前駆体から生合成されることが判った。さらに現
在までにヒト及びラットBNPのcDNAが単離され、これら
のBNPの前駆体構造も明らかになっている（Sudoh,T.et
al,Biochem,Biophy.Res.Commun.,159 1427,1989;Kojim
a,M.et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,159 1420,198
9）。
なった前駆体から生合成されることが判った。さらに現
在までにヒト及びラットBNPのcDNAが単離され、これら
のBNPの前駆体構造も明らかになっている（Sudoh,T.et
al,Biochem,Biophy.Res.Commun.,159 1427,1989;Kojim
a,M.et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,159 1420,198
9）。
前述したように、BNPは最初脳より単離されたが、ブ
タ脳においてBNPはANPに比べ10倍量存在していること、
さらにはANPと同様心房にも存在し（ただし、心房でのB
NPの存在量はANPの２〜３％）、心房から血中へ分泌さ
れていることが判った（Minamino,N.et al,Biochem.Bio
phys.Res.Commun.,155 740,1988;Aburaya,M.et al,Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.,165 872,1989）。これらの事
実から、BNPはANPと同様、脳においては神経伝達物質と
して、また心房から血中へ分泌されるホルモンとして作
用し、体液及び血液の恒常性を調節していることが判っ
た。
タ脳においてBNPはANPに比べ10倍量存在していること、
さらにはANPと同様心房にも存在し（ただし、心房でのB
NPの存在量はANPの２〜３％）、心房から血中へ分泌さ
れていることが判った（Minamino,N.et al,Biochem.Bio
phys.Res.Commun.,155 740,1988;Aburaya,M.et al,Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.,165 872,1989）。これらの事
実から、BNPはANPと同様、脳においては神経伝達物質と
して、また心房から血中へ分泌されるホルモンとして作
用し、体液及び血液の恒常性を調節していることが判っ
た。
以上をまとめると、現在までのところ哺乳動物におい
ては、少なくともタイプの明らかに異なる２種類（ANP
ファミリー,BNPファミリー）のペプチド類が存在し、こ
れらはいずれも心房から血中に分泌され、体液及び血圧
の恒常性を調節するホルモンとして作用しているのみな
らず、これらは脳でも生合成され、神経系の神経伝達物
質として作用し、体液及び血圧の恒常性を調節している
ことが判ってきた。
ては、少なくともタイプの明らかに異なる２種類（ANP
ファミリー,BNPファミリー）のペプチド類が存在し、こ
れらはいずれも心房から血中に分泌され、体液及び血圧
の恒常性を調節するホルモンとして作用しているのみな
らず、これらは脳でも生合成され、神経系の神経伝達物
質として作用し、体液及び血圧の恒常性を調節している
ことが判ってきた。
ところで、ナトリウム利尿ペプチドのように、生体に
おけるある生理的作用（例えば、体液及び血圧の恒常
性）の調節に単一ペプチドではなく、複数のペプチドが
関与している例として、現在までにオピオイドペプチド
（Opoid peptide）、タヒキニン（tachykinin）さらに
はエンドセリン（endothelin）などが知られている。こ
れらの例では、いずれも３種類の異なるペプチドファミ
リーが存在してることが知られている（Hollt,V.Trend
Neuro Sci.,６,24,1983;Nakanishi,S.Physiol.Review,6
7 1117,1987;Inoue,A.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.,86 2863,1989）。このことから、ナトリウム利尿作
用を示すペプチドも現在までに判っているANP,BNPファ
ミリー以外に第３のファミリーに属するペプチド類が存
在している可能性が持たれた。この点に関し、本発明者
らは、ごく最近ブタ脳からナトリウム利尿ペプチドの第
３のファミリーに属する新規ペプチドを単離・同定する
ことに成功し、このペプチドをCNP（Ｃ−type natriure
tic peptide）と命名した（以後、本発明でこのペプチ
ドをCNP−22と略す）。CNP−22はアミノ酸残基22個から
なるペプチドで、ANP・BNP同様分子内に１個のＳ−Ｓ結
合を持つ環状構造を形成している。この環状構造はANP
・BNPと同様17アミノ酸残基で構成されており、さらに
この環状構造を形成しているアミノ酸一次配列の相同性
はCNP−22とα−ANP・BNP−32の間で高い。しかし、CNP
−22のＣ−末端部分の構造はANP・BNPのそれとは大きく
異なっている。すなむち、ANP・BNPのＣ−末端部分の構
造は、環状構造を形成しているシステイン残基にさらに
数個のアミノ酸残基が付加したtail構造を持っているの
に対し、CNP−22のＣ−末端は22位システィン残基であ
り、CNP−22はこのtail構造が欠如している。これらの
ことから、CNP−22は構造的にANPまたはBNPと似ている
が、これとは明らかに異なったファミリーに属するペプ
チドであることが判った。さらに、CNP−22をラットに
静注すると、ANP・BNPと同様にナトリウム利尿作用及び
血圧降下作用を示すこが確認されたことから、CNP−22
は生体内におけるナトリウム利尿ペプチドの第３のファ
ミリーに属する新規ペプチドであることが判った（特願
平２−105047号）。しかし、CNP−22の脳における含量
はANP・BNPのそれに比べ極めて少ないことから、現在の
ところCNP−22の生合成機構、生体内分布及び生理作用
の詳細に関しては、まだ不明な点が多い。
おけるある生理的作用（例えば、体液及び血圧の恒常
性）の調節に単一ペプチドではなく、複数のペプチドが
関与している例として、現在までにオピオイドペプチド
（Opoid peptide）、タヒキニン（tachykinin）さらに
はエンドセリン（endothelin）などが知られている。こ
れらの例では、いずれも３種類の異なるペプチドファミ
リーが存在してることが知られている（Hollt,V.Trend
Neuro Sci.,６,24,1983;Nakanishi,S.Physiol.Review,6
7 1117,1987;Inoue,A.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.,86 2863,1989）。このことから、ナトリウム利尿作
用を示すペプチドも現在までに判っているANP,BNPファ
ミリー以外に第３のファミリーに属するペプチド類が存
在している可能性が持たれた。この点に関し、本発明者
らは、ごく最近ブタ脳からナトリウム利尿ペプチドの第
３のファミリーに属する新規ペプチドを単離・同定する
ことに成功し、このペプチドをCNP（Ｃ−type natriure
tic peptide）と命名した（以後、本発明でこのペプチ
ドをCNP−22と略す）。CNP−22はアミノ酸残基22個から
なるペプチドで、ANP・BNP同様分子内に１個のＳ−Ｓ結
合を持つ環状構造を形成している。この環状構造はANP
・BNPと同様17アミノ酸残基で構成されており、さらに
この環状構造を形成しているアミノ酸一次配列の相同性
はCNP−22とα−ANP・BNP−32の間で高い。しかし、CNP
−22のＣ−末端部分の構造はANP・BNPのそれとは大きく
異なっている。すなむち、ANP・BNPのＣ−末端部分の構
造は、環状構造を形成しているシステイン残基にさらに
数個のアミノ酸残基が付加したtail構造を持っているの
に対し、CNP−22のＣ−末端は22位システィン残基であ
り、CNP−22はこのtail構造が欠如している。これらの
ことから、CNP−22は構造的にANPまたはBNPと似ている
が、これとは明らかに異なったファミリーに属するペプ
チドであることが判った。さらに、CNP−22をラットに
静注すると、ANP・BNPと同様にナトリウム利尿作用及び
血圧降下作用を示すこが確認されたことから、CNP−22
は生体内におけるナトリウム利尿ペプチドの第３のファ
ミリーに属する新規ペプチドであることが判った（特願
平２−105047号）。しかし、CNP−22の脳における含量
はANP・BNPのそれに比べ極めて少ないことから、現在の
ところCNP−22の生合成機構、生体内分布及び生理作用
の詳細に関しては、まだ不明な点が多い。
本発明が解決すべき課題 従って、本発明では哺乳類におけるナトリウム利尿ペ
プチドの第３のファミリー、すなわちCNPに属し、先に
単離・同定したCNP−22以外の新規ペプチドを見いだす
ことを目的とする。この新規ペプチドの単離によりCNP
の生合成機構、生体内分布、さらには生理作用を明らか
にすることに役立つと考えられる。
プチドの第３のファミリー、すなわちCNPに属し、先に
単離・同定したCNP−22以外の新規ペプチドを見いだす
ことを目的とする。この新規ペプチドの単離によりCNP
の生合成機構、生体内分布、さらには生理作用を明らか
にすることに役立つと考えられる。
課題を解決するための手段 本発明者らは、先にブタ脳から単離、同定したCNP−2
2の構造がANP及びBNPファミリーに属するペプチドの構
造と明らかに異なっていることに着目し、CNP−22の構
造を特異的に認識する抗体（CNP−22の構造は認識する
が、ANP・BNPの構造は認識しない）を作製し、この抗体
を用いたラジオイムノアッセイ（RIA）系を構築するこ
とにより、このRIAを指標にブタの脳からCNPファミリー
に属する新規ペプチドを見つけ出すことを計画した。
2の構造がANP及びBNPファミリーに属するペプチドの構
造と明らかに異なっていることに着目し、CNP−22の構
造を特異的に認識する抗体（CNP−22の構造は認識する
が、ANP・BNPの構造は認識しない）を作製し、この抗体
を用いたラジオイムノアッセイ（RIA）系を構築するこ
とにより、このRIAを指標にブタの脳からCNPファミリー
に属する新規ペプチドを見つけ出すことを計画した。
本発明では、まず化学合成したCNP−22を用い抗CNP−
22抗血清を作製し、この抗体を用いてRIA系を構築し
た。なおこのRIAの系はアッセイチューブあたりfmol単
位のCNP−22が検出でき、α−ANP及びBNP−26に対する
交叉活性（crossreactivity）は極めて少ない。次に、
ブタの脳を氷酢酸中でホモジネートし、得られるペプチ
ド粗抽出画分をペプチド精製に常用される各種精製法を
組合せ、前記したRIAを指標に精製したところ、分子量
約4000〜5000を示すペプチド画分から、最終的には第３
図ｂに示すように、抗CNP−22抗血清に免疫活性（immun
oreactivity）を示すペプチドを、単一で純粋な状態ま
でに精製することに成功した。
22抗血清を作製し、この抗体を用いてRIA系を構築し
た。なおこのRIAの系はアッセイチューブあたりfmol単
位のCNP−22が検出でき、α−ANP及びBNP−26に対する
交叉活性（crossreactivity）は極めて少ない。次に、
ブタの脳を氷酢酸中でホモジネートし、得られるペプチ
ド粗抽出画分をペプチド精製に常用される各種精製法を
組合せ、前記したRIAを指標に精製したところ、分子量
約4000〜5000を示すペプチド画分から、最終的には第３
図ｂに示すように、抗CNP−22抗血清に免疫活性（immun
oreactivity）を示すペプチドを、単一で純粋な状態ま
でに精製することに成功した。
ここで得たペプチドの構造決定は、以下に示す方法で
行った。まず、このペプチドのアミノ酸一次配列をエド
マン法を用いて解析したところ、第４図に示すように、
エドモン分解により生ずるPTH（phenylthiohydantoin）
−アミノ酸は45サイクル目まで検出・同定することがで
きた。すなわち、この解析により、このペプチドのＮ−
末端から45番目までのアミノ酸一次配列を決定すること
ができた。ただし、この解析で37サイクル目のPTH−ア
ミノ酸は検出されないことから、本発明者はこのアミノ
酸をシスティン残基（Cys）と同定した。なお、この解
析で45サイクル以後のPTH−アミノ酸は検出することは
できたが、同定するには至らなかった。次に、このペプ
チドのＣ−末端構造は、以下に述べる事実からCNP−22
と同一であると結論した。すなわち、先ず前記した方法
で得られたこのペプチドのＮ−末端アミノ酸一次配列、
CNP−22と比較したところ、このペプチドの32番目から4
5番目までのアミノ酸一次配列は、CNP−22のＮ−末端か
ら14番目までのアミノ酸一次配列と完全に一致している
ことが判った。次に、本発明で単離したペプチドのヒヨ
コ直腸弛緩活性（chick rectum relaxant activity）を
測定したところ、CNP−22と同等な活性を示すことが判
った。すでにこの生物活性発現にはCys残基の分子内Ｓ
−Ｓ結合形成に基づくアミノ酸17残基よりなる環状構造
が必須であることが判っていることから、本発明で単離
したペプチドのＣ−末端構造には、少なくともこの環状
構造が存在していなければならない。さらに、本発明に
おけるペプチドが、CNP−22をＣ−末端に含む53アミノ
酸残基よりなるペプチドであるとするならば、本発明に
おけるペプチドの抗CNP−22抗血清に対する１分子あた
りの免疫活性が、CNP−22のそれと同等である事実をよ
く説明することができる。
行った。まず、このペプチドのアミノ酸一次配列をエド
マン法を用いて解析したところ、第４図に示すように、
エドモン分解により生ずるPTH（phenylthiohydantoin）
−アミノ酸は45サイクル目まで検出・同定することがで
きた。すなわち、この解析により、このペプチドのＮ−
末端から45番目までのアミノ酸一次配列を決定すること
ができた。ただし、この解析で37サイクル目のPTH−ア
ミノ酸は検出されないことから、本発明者はこのアミノ
酸をシスティン残基（Cys）と同定した。なお、この解
析で45サイクル以後のPTH−アミノ酸は検出することは
できたが、同定するには至らなかった。次に、このペプ
チドのＣ−末端構造は、以下に述べる事実からCNP−22
と同一であると結論した。すなわち、先ず前記した方法
で得られたこのペプチドのＮ−末端アミノ酸一次配列、
CNP−22と比較したところ、このペプチドの32番目から4
5番目までのアミノ酸一次配列は、CNP−22のＮ−末端か
ら14番目までのアミノ酸一次配列と完全に一致している
ことが判った。次に、本発明で単離したペプチドのヒヨ
コ直腸弛緩活性（chick rectum relaxant activity）を
測定したところ、CNP−22と同等な活性を示すことが判
った。すでにこの生物活性発現にはCys残基の分子内Ｓ
−Ｓ結合形成に基づくアミノ酸17残基よりなる環状構造
が必須であることが判っていることから、本発明で単離
したペプチドのＣ−末端構造には、少なくともこの環状
構造が存在していなければならない。さらに、本発明に
おけるペプチドが、CNP−22をＣ−末端に含む53アミノ
酸残基よりなるペプチドであるとするならば、本発明に
おけるペプチドの抗CNP−22抗血清に対する１分子あた
りの免疫活性が、CNP−22のそれと同等である事実をよ
く説明することができる。
尚、このCNP−53においてエドマン法によって解析で
きなかったＣ末端部分の８個のアミノ酸配列について
は、CNP−53をコードするcDNAのクローニングにより確
認された（第６図）。このクローニングに関しては発明
者等の同日出願の明細書に記述した。
きなかったＣ末端部分の８個のアミノ酸配列について
は、CNP−53をコードするcDNAのクローニングにより確
認された（第６図）。このクローニングに関しては発明
者等の同日出願の明細書に記述した。
以上の事実により、本発明者らは最終的に、本発明で
単離したペプチドの構造は以下のアミノ酸一次配列で示
される新規ペプチドであると結論した。
単離したペプチドの構造は以下のアミノ酸一次配列で示
される新規ペプチドであると結論した。
（式中、（１）と（２），（３）と（４），（５）と
（６），（７）と（８），（９）と（10）は直接結合し
ており、37位と53位のシスティン残基（Cys）は分子内
でＳ−Ｓ結合を形成している。） なお、本明細書においてこのペプチドをCNP−53と称
する。
（６），（７）と（８），（９）と（10）は直接結合し
ており、37位と53位のシスティン残基（Cys）は分子内
でＳ−Ｓ結合を形成している。） なお、本明細書においてこのペプチドをCNP−53と称
する。
CNP−53の構造は、第５図に示すように、Ｃ末端部分
にCNP−22と同一のアミノ酸配列を持っている。言い換
えれば、CNP−53は先に単離・同定したCNP−22のＮ−末
端に31アミノ酸残基が付加したペプチドである。さら
に、CNP−53のCNP−22に対応する部分のすぐＮ−末端部
分（CNP−53の30位と31位）にLys−Lys配列が存在して
いることから（この配列は多くのペプチドホルモンの生
合成において、前駆体タンパクから最終ペプチドホルモ
ンが生ずる場合のプロセッシング酵素の認識及び切断部
位であることが知られている）、本発明において単離・
同定したCNP−53は、プタ脳においてただ単にCNP−22の
前駆体ペプチドとして存在している可能性がある。しか
し、本発明の実施例で示すように、ブタ脳におけるCNP
−53の含量は、CNP−22より多く存在していることか
ら、CNP−53はただ単にCNP−22の前駆体ペプチドとして
脳内に存在しているだけでなく、CNP−53それ自身が直
接脳内で体液や血圧の恒常性を調節している可能性が高
い。
にCNP−22と同一のアミノ酸配列を持っている。言い換
えれば、CNP−53は先に単離・同定したCNP−22のＮ−末
端に31アミノ酸残基が付加したペプチドである。さら
に、CNP−53のCNP−22に対応する部分のすぐＮ−末端部
分（CNP−53の30位と31位）にLys−Lys配列が存在して
いることから（この配列は多くのペプチドホルモンの生
合成において、前駆体タンパクから最終ペプチドホルモ
ンが生ずる場合のプロセッシング酵素の認識及び切断部
位であることが知られている）、本発明において単離・
同定したCNP−53は、プタ脳においてただ単にCNP−22の
前駆体ペプチドとして存在している可能性がある。しか
し、本発明の実施例で示すように、ブタ脳におけるCNP
−53の含量は、CNP−22より多く存在していることか
ら、CNP−53はただ単にCNP−22の前駆体ペプチドとして
脳内に存在しているだけでなく、CNP−53それ自身が直
接脳内で体液や血圧の恒常性を調節している可能性が高
い。
CNP−53のペプチドのＮ末端から31個のアミノ酸のう
ち塩基性アミノ酸はプロセシングを受け易い。従って、
CNP−22のＮ末端に更にアミノ酸が付加した何種類かの
ペプチド誘導体が生成されるものと考えられる。
ち塩基性アミノ酸はプロセシングを受け易い。従って、
CNP−22のＮ末端に更にアミノ酸が付加した何種類かの
ペプチド誘導体が生成されるものと考えられる。
これらのペプチド誘導体としては下記のアミノ酸配列
で表わされるペプチド類が含まれる。
で表わされるペプチド類が含まれる。
〔式中、（１）と（２），（３）と（４）は直接結合し
ており、６位と22位とのシスティン残基（Cys）は分子
内でＳ−Ｓ結合を形成しており、Ｘは次式 （式中、（１′）と（２′），（３′）と（４′），
（５′）と（６′）は直接結合しているものとする）で
表わされるいずれかのペプチドである〕。
ており、６位と22位とのシスティン残基（Cys）は分子
内でＳ−Ｓ結合を形成しており、Ｘは次式 （式中、（１′）と（２′），（３′）と（４′），
（５′）と（６′）は直接結合しているものとする）で
表わされるいずれかのペプチドである〕。
以上述べたように、本発明では、ブタの脳から抗CNP
−22抗血清をも用いたRIA系を指標にCNPファミリーに属
する新規ペプチドの単離・同定を行った結果、抗CNP−2
2抗血清に対し免疫活性を示すペプチドを、単一で純粋
な状態まで精製することに成功し、さらにこのペプチド
の構造解析を行ったところ、このペプチドがCNP−22を
Ｃ−末端部分に含むアミノ酸53残基よりなり利尿作用及
びナトリウム利尿作用を有するペプチドであることを見
いだし、本発明を完成した。
−22抗血清をも用いたRIA系を指標にCNPファミリーに属
する新規ペプチドの単離・同定を行った結果、抗CNP−2
2抗血清に対し免疫活性を示すペプチドを、単一で純粋
な状態まで精製することに成功し、さらにこのペプチド
の構造解析を行ったところ、このペプチドがCNP−22を
Ｃ−末端部分に含むアミノ酸53残基よりなり利尿作用及
びナトリウム利尿作用を有するペプチドであることを見
いだし、本発明を完成した。
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例1.抗CNP−22抗血清の作製及びRIA系の構築 A.抗CNP−22抗血清の作製 6mgの化学合成したCNP−22とウシ・サイログロブリン
（thyroglobulin,シグマ社製）15mgとを2mlの0.1Mリン
酸バッファー（ph7.4）に溶解し、この溶液に100μの
５％グルタルアルデヒドを加え、０℃で20分間撹拌する
ことにより、CNP−22をサイクログロブリンに結合させ
る。次に、この溶液を水（500ml）に対し５回、80mM Na
Clを含む50mMリン酸バッファー（ph7.4）500mlに対し２
回透析することにより、反応溶液中の過剰の塩及び試薬
を除いた。さらに、この反応液に80mMのNaClを含む50mM
リン酸バッファーを加え、全量を12mlとした後、等量の
Freund'sコンプリート アジュバントを加えエマルジョ
ンを形成し、これをウサギ（New Zealand White）に20
日おきに繰り返し免疫することにより、抗CNP−22抗血
清を得た。
（thyroglobulin,シグマ社製）15mgとを2mlの0.1Mリン
酸バッファー（ph7.4）に溶解し、この溶液に100μの
５％グルタルアルデヒドを加え、０℃で20分間撹拌する
ことにより、CNP−22をサイクログロブリンに結合させ
る。次に、この溶液を水（500ml）に対し５回、80mM Na
Clを含む50mMリン酸バッファー（ph7.4）500mlに対し２
回透析することにより、反応溶液中の過剰の塩及び試薬
を除いた。さらに、この反応液に80mMのNaClを含む50mM
リン酸バッファーを加え、全量を12mlとした後、等量の
Freund'sコンプリート アジュバントを加えエマルジョ
ンを形成し、これをウサギ（New Zealand White）に20
日おきに繰り返し免疫することにより、抗CNP−22抗血
清を得た。
なお、このようにして得た抗CNP−22抗血清は＃171−
４と命名した。
４と命名した。
B.RIA系の構築 まず、〔Tyr゜〕CNP−22（CNP−22のＮ−末端にタイ
ロシン残基（Try）を付加したペプチド）を化学合成
し、このＮ−末端Try残基にMiyataらの方法（Miyata,A.
et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,129 248−255,198
5）を用いてI125を導入し、I125でラベルされたmonoiod
o〔Tyr゜〕CNP−22を逆相HPLCを用いて分離・単離し
た。
ロシン残基（Try）を付加したペプチド）を化学合成
し、このＮ−末端Try残基にMiyataらの方法（Miyata,A.
et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,129 248−255,198
5）を用いてI125を導入し、I125でラベルされたmonoiod
o〔Tyr゜〕CNP−22を逆相HPLCを用いて分離・単離し
た。
次に、このようにして作製したI125でラベルした〔Ty
r゜〕CNP−22と実施例1.Aで作製した抗体（＃171−４）
を用いRIAの系を以下に示す方法で構築した。
r゜〕CNP−22と実施例1.Aで作製した抗体（＃171−４）
を用いRIAの系を以下に示す方法で構築した。
すなわち、RIA系のbufferは、80mM NaCl,0.1％ Trito
nX−100,25mM EDTA,0.05％NaN3,3.1％デキストランＴ−
40,0.25％BSA（Ｎ−エチルマレインイミド（Ｎ−ethylm
aleimige）処理したもの）を含む、50mMリン酸バッファ
ー（pH7.4）を用いた。スタンダードCNP−22溶液または
アッセイサンプル（100μ）と前記した方法で作製し
た抗体＃171−４（60000倍希釈したものを100μ）を
加え、４℃で24時間反応する。24時間後、トレーサー
（I125でラベルした〔Tyr゜〕CNP−22）100μを加え
４℃で36時間反応した後、ポリエチレングリコールを加
え、生じた沈澱のラジオアクティビティ（radioactivit
y）をgammaカウンター（ARC−600,Aloka）で測定した。
nX−100,25mM EDTA,0.05％NaN3,3.1％デキストランＴ−
40,0.25％BSA（Ｎ−エチルマレインイミド（Ｎ−ethylm
aleimige）処理したもの）を含む、50mMリン酸バッファ
ー（pH7.4）を用いた。スタンダードCNP−22溶液または
アッセイサンプル（100μ）と前記した方法で作製し
た抗体＃171−４（60000倍希釈したものを100μ）を
加え、４℃で24時間反応する。24時間後、トレーサー
（I125でラベルした〔Tyr゜〕CNP−22）100μを加え
４℃で36時間反応した後、ポリエチレングリコールを加
え、生じた沈澱のラジオアクティビティ（radioactivit
y）をgammaカウンター（ARC−600,Aloka）で測定した。
このRIA系を用いると、１〜100fmol/tubeのCNP−22が
測定でき、抗体＃171−４のα−ANP、pBNP−26に対する
交叉活性（crossreactivity）は、それぞれ0.015％、0.
46％であった。
測定でき、抗体＃171−４のα−ANP、pBNP−26に対する
交叉活性（crossreactivity）は、それぞれ0.015％、0.
46％であった。
実施例2.CNP−53の単離・精製 ブタ480匹から40kgの脳を摘出し、細断した後、プロ
テアーゼを不活化するために２容量の沸騰水で５分間処
理する。冷却後氷酢酸を最終濃度が1Mになるように加
え、この組織をポリトロンミキサーを用いてネモジナイ
ズする。次に、このホモジネイトを遠心分離することに
より、沈澱画分と上清画分に分け、この上清画分をpell
icon cassette（PCAC ＃000−05,Millipore）を用いて
濃縮する。この濃縮液にアセトンを加え（最終濃度66
％）、生じた沈澱を遠心操作で除去し、上清を減圧濃縮
した。ここで得られた濃縮液を0.5M酢酸に溶かし、４回
に分けてＣ−18シリカゲルカラム（1.5容量、LC−SOR
B SPW−Ｃ−ODS,Chemco）にかけ、カラムに吸着したペ
プチドを水・アセトニトリル（CH3CN）・10％トリフル
オロ酢酸（TFA）が40:60:1（V/V）になるように調製し
た溶液で溶出し、この溶出液を濃縮することにより、乾
燥重量26gのペプチドを含有する残渣を得た。このうち1
/2量を1M酢酸に溶かし、1M酢酸で平衡化したSP−セファ
デックスＣ−25カラム（H+−form,3×38cm）を用いたイ
オン交換クロマトグラフィーにかけ、カラムに吸着した
ペプチドを1M酢酸、2Mピリジン及び2Mピリジン−酢酸
（pH5.0）を用いて順次溶出した。このようにして得ら
れた各画分は、それぞれ、SP−Ｉ、SP−II、SP−III画
分と名付け、凍結乾燥した。本発明におけるCNP−53の
精製はこのSP−III画分を出発原料として用いた。な
お、前記したRIAの系で抗CNP−22抗血清に免疫活性を示
すペプチドのほとんどは、このSP−IIIに含まれている
ことが判った。
テアーゼを不活化するために２容量の沸騰水で５分間処
理する。冷却後氷酢酸を最終濃度が1Mになるように加
え、この組織をポリトロンミキサーを用いてネモジナイ
ズする。次に、このホモジネイトを遠心分離することに
より、沈澱画分と上清画分に分け、この上清画分をpell
icon cassette（PCAC ＃000−05,Millipore）を用いて
濃縮する。この濃縮液にアセトンを加え（最終濃度66
％）、生じた沈澱を遠心操作で除去し、上清を減圧濃縮
した。ここで得られた濃縮液を0.5M酢酸に溶かし、４回
に分けてＣ−18シリカゲルカラム（1.5容量、LC−SOR
B SPW−Ｃ−ODS,Chemco）にかけ、カラムに吸着したペ
プチドを水・アセトニトリル（CH3CN）・10％トリフル
オロ酢酸（TFA）が40:60:1（V/V）になるように調製し
た溶液で溶出し、この溶出液を濃縮することにより、乾
燥重量26gのペプチドを含有する残渣を得た。このうち1
/2量を1M酢酸に溶かし、1M酢酸で平衡化したSP−セファ
デックスＣ−25カラム（H+−form,3×38cm）を用いたイ
オン交換クロマトグラフィーにかけ、カラムに吸着した
ペプチドを1M酢酸、2Mピリジン及び2Mピリジン−酢酸
（pH5.0）を用いて順次溶出した。このようにして得ら
れた各画分は、それぞれ、SP−Ｉ、SP−II、SP−III画
分と名付け、凍結乾燥した。本発明におけるCNP−53の
精製はこのSP−III画分を出発原料として用いた。な
お、前記したRIAの系で抗CNP−22抗血清に免疫活性を示
すペプチドのほとんどは、このSP−IIIに含まれている
ことが判った。
まず、SP−III画分（乾燥重量5.2g）をセファデック
スＧ−50カラム（fine,7.5×145cm,ファルデックスＧ−
50カラム）（fine,7.5×145cm,ファルマシア）を用いた
ゲル濾過にかけることにより、分子量約1000〜5000のペ
プチド含有画分を乾燥重量として2.96g得た。次に、こ
のうち半量（1.48g）をセファデックスＧ−25のカラム
（fine,7.5×150cm,ファルマシア）を用い、さらに分画
し、各溶出画分を前記したRIAを用いて抗CNP−22抗血清
に対する免疫活性を調べた。
スＧ−50カラム（fine,7.5×145cm,ファルデックスＧ−
50カラム）（fine,7.5×145cm,ファルマシア）を用いた
ゲル濾過にかけることにより、分子量約1000〜5000のペ
プチド含有画分を乾燥重量として2.96g得た。次に、こ
のうち半量（1.48g）をセファデックスＧ−25のカラム
（fine,7.5×150cm,ファルマシア）を用い、さらに分画
し、各溶出画分を前記したRIAを用いて抗CNP−22抗血清
に対する免疫活性を調べた。
この結果、第１図に示すように、抗CNP−22抗血清に
対し免疫活性を示す画分が２つに別れ（第１図、分子量
約4000〜5000のＢ画分と分子量約2000〜3000のＣ画
分）、抗CNP−22抗血清に反応するペプチドの存在量比
はＢ画分とＣ画分で約4:3であった。なお、本発明者ら
によりすでに単離・同定したCNP−22はＣ画分に含まれ
ていることが判っている。本発明ではこのＢ画分を以下
に示す方法でさらに精製した。
対し免疫活性を示す画分が２つに別れ（第１図、分子量
約4000〜5000のＢ画分と分子量約2000〜3000のＣ画
分）、抗CNP−22抗血清に反応するペプチドの存在量比
はＢ画分とＣ画分で約4:3であった。なお、本発明者ら
によりすでに単離・同定したCNP−22はＣ画分に含まれ
ていることが判っている。本発明ではこのＢ画分を以下
に示す方法でさらに精製した。
まず、前記した方法で分画した分子量約4000〜5000の
Ｂ画分（乾燥重量740mg）をCM（CM−52,2.4×52.5cm,Wh
atman）イオン交換クロマト〔溶出液A;10mM HCOONH4（p
H6.6）:CH3CN＝90:10（V/V），溶出液B;0.6M HCOONH
4（pH6.6）:CH3CN＝90:10（V/V），溶出条件；溶出液Ａ
とＢを用いた直線濃度勾配、流速;40ml/h,画分サイズ;2
0ml/tube〕でさらに分画し、各溶出画分の抗CNP−22抗
血清に対する免疫活性を測定した。
Ｂ画分（乾燥重量740mg）をCM（CM−52,2.4×52.5cm,Wh
atman）イオン交換クロマト〔溶出液A;10mM HCOONH4（p
H6.6）:CH3CN＝90:10（V/V），溶出液B;0.6M HCOONH
4（pH6.6）:CH3CN＝90:10（V/V），溶出条件；溶出液Ａ
とＢを用いた直線濃度勾配、流速;40ml/h,画分サイズ;2
0ml/tube〕でさらに分画し、各溶出画分の抗CNP−22抗
血清に対する免疫活性を測定した。
この結果、第２図に示すように、フラクション番号99
−102及び111−113に抗CNP−22抗血清に対する免疫活性
が認められ、これらの画分をそれぞれ集め凍結乾燥し
た。次に、前記CN−52クロマトのフロクション番号111
−113の画分（乾燥重量8.5mg）を抗−ANP抗体を用いた
イムノアフィニティクロマトグラフィー（このカラムの
作製に関しては本発明者等の報告に詳細に記載されてい
る;Ueda,S.et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,149 10
55−1062,1987）にかけ、カラムに吸着したペプチドを1
0％CH3CNを含む1M酢酸溶液で溶出し、この溶出画分をＣ
−18カラム（Hi−Pore RP−318,4.6×250mm,Bio−Rad）
を用いた逆相HPLC〔流速;1.5ml/min,溶出液;H2O:CH3CN:
10％ TFA＝（Ａ）90:10:1,（Ｂ）40:60:1（V/V），溶出
条件；溶出液ＡとＢを用いた直線濃度勾配、溶出時間;1
20min〕で分離・精製し、各溶出画分の抗CNP−22抗血清
に対する免疫活性を調べた。
−102及び111−113に抗CNP−22抗血清に対する免疫活性
が認められ、これらの画分をそれぞれ集め凍結乾燥し
た。次に、前記CN−52クロマトのフロクション番号111
−113の画分（乾燥重量8.5mg）を抗−ANP抗体を用いた
イムノアフィニティクロマトグラフィー（このカラムの
作製に関しては本発明者等の報告に詳細に記載されてい
る;Ueda,S.et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,149 10
55−1062,1987）にかけ、カラムに吸着したペプチドを1
0％CH3CNを含む1M酢酸溶液で溶出し、この溶出画分をＣ
−18カラム（Hi−Pore RP−318,4.6×250mm,Bio−Rad）
を用いた逆相HPLC〔流速;1.5ml/min,溶出液;H2O:CH3CN:
10％ TFA＝（Ａ）90:10:1,（Ｂ）40:60:1（V/V），溶出
条件；溶出液ＡとＢを用いた直線濃度勾配、溶出時間;1
20min〕で分離・精製し、各溶出画分の抗CNP−22抗血清
に対する免疫活性を調べた。
この結果、第３図ａの矢印に示す位置に、抗CNP−22
抗血清に対し免疫活性を持ち、かつ210nmのUV吸収が最
大値を示す画分が得られた。
抗血清に対し免疫活性を持ち、かつ210nmのUV吸収が最
大値を示す画分が得られた。
本発明における新規ペプチド（CNP−53）の最終精製
は、前記Ｃ−18カラムクロマトで分画した画分（第３図
ａの矢印）をさらに、ジフェニルカラム（219TP54,4.6
×250mm,Vydac）を用いた逆相HPLC〔流速:1ml/min,溶出
液;H2O:CH3CN;10％TFA＝（Ａ）90:10:1,（Ｂ）40:60:1
（V/V），溶出条件；溶出液ＡとＢを用いた直線濃度勾
配，溶出時間;120min〕で分離・精製し、各溶出画分を
抗CNP−22抗血清に対する免疫活性を調べた。この結
果、第３図ｂに示すごとく、CNP−22抗血清に対し免疫
活性を示すペプチドを、単一ピークを示すまでに精製す
ることに成功し、このペプチドをCNP−53と命名した。
は、前記Ｃ−18カラムクロマトで分画した画分（第３図
ａの矢印）をさらに、ジフェニルカラム（219TP54,4.6
×250mm,Vydac）を用いた逆相HPLC〔流速:1ml/min,溶出
液;H2O:CH3CN;10％TFA＝（Ａ）90:10:1,（Ｂ）40:60:1
（V/V），溶出条件；溶出液ＡとＢを用いた直線濃度勾
配，溶出時間;120min〕で分離・精製し、各溶出画分を
抗CNP−22抗血清に対する免疫活性を調べた。この結
果、第３図ｂに示すごとく、CNP−22抗血清に対し免疫
活性を示すペプチドを、単一ピークを示すまでに精製す
ることに成功し、このペプチドをCNP−53と命名した。
なお、本発明における精製法で得られるCNP−53の収
量は、ブタ脳40kgから約130pmol（700ng）であった。
量は、ブタ脳40kgから約130pmol（700ng）であった。
実施例3.CNP−53の構造決定 A.CNP−53のアミノ酸一次配列の解析 実施例２で得たCNP−53の3/4量（約525ng）をアミノ
酸配列自動分析機（Applied Biosystems 470A/120A）に
供し、エドマン分解法によりアミノ酸一次配列を分析し
た結果、第４図に示す結果が得られ、この結果よりCNP
−53のＮ−末端から45番目までのアミノ酸一次配列は以
下に示す配列であると決定した。ただし、この解析で37
サイクル目のPTH−アミノ酸は検出されないことから、
本発明者は、このアミノ酸はシスティン残基と同定し
た。
酸配列自動分析機（Applied Biosystems 470A/120A）に
供し、エドマン分解法によりアミノ酸一次配列を分析し
た結果、第４図に示す結果が得られ、この結果よりCNP
−53のＮ−末端から45番目までのアミノ酸一次配列は以
下に示す配列であると決定した。ただし、この解析で37
サイクル目のPTH−アミノ酸は検出されないことから、
本発明者は、このアミノ酸はシスティン残基と同定し
た。
（式中、（１）と（２），（３）と（４），（５）と
（６），及び（７）と（８）は直接結合している。） なお、この解析で45サイクル目以後のPTH−アミノ酸
は検出することはできたが、同定するには至らなかっ
た。
（６），及び（７）と（８）は直接結合している。） なお、この解析で45サイクル目以後のPTH−アミノ酸
は検出することはできたが、同定するには至らなかっ
た。
B.CNP−53のＮ−末端アミノ酸一次配列とCNP−22のアミ
ノ酸一次配列の相同性の比較 実施例３のＡで決定したCNP−53のＮ−末端から45番
目までのアミノ酸一次配列を、先に同定したCNP−22の
アミノ酸一次配列と比較したところ、第５図に示すよう
に、CNP−53の32番目から45番目までのアミノ酸一次配
列は、CNP−22のＮ−末端から14番目までのアミノ酸一
次配列を完全に一致することが判った。
ノ酸一次配列の相同性の比較 実施例３のＡで決定したCNP−53のＮ−末端から45番
目までのアミノ酸一次配列を、先に同定したCNP−22の
アミノ酸一次配列と比較したところ、第５図に示すよう
に、CNP−53の32番目から45番目までのアミノ酸一次配
列は、CNP−22のＮ−末端から14番目までのアミノ酸一
次配列を完全に一致することが判った。
C.CNP−53のヒヨコ直腸弛緩活性 （chich rectum relaxant activiti） ヒヨコ直腸弛緩活性はCurrie等の方法（Currie et a
l.Nature,221 1−13,1983）に従い測定した。このアッ
セイ系でCNP−53はCNP−22と同様な活性を示した。
l.Nature,221 1−13,1983）に従い測定した。このアッ
セイ系でCNP−53はCNP−22と同様な活性を示した。
D.CNP−53の抗CNP−22抗血清に対する免疫活性 実施例１で作成したRIA系を用い、CNP−53の抗CNP−2
2抗血清に対する１分子あたりの免疫活性を求めたとこ
ろ、CNP−53の構造をCNP−22をＣ−末端に含む53個のア
ミノ酸残基からなるペプチドとして求めた値は、CNP−2
2のそれと同等であった。
2抗血清に対する１分子あたりの免疫活性を求めたとこ
ろ、CNP−53の構造をCNP−22をＣ−末端に含む53個のア
ミノ酸残基からなるペプチドとして求めた値は、CNP−2
2のそれと同等であった。
以上の解析結果から、本発明者はCNP−53の構造は以
下のアミノ酸一次配列で示される新規ペプチドであると
結論した。
下のアミノ酸一次配列で示される新規ペプチドであると
結論した。
（式中、（１）と（２），（３）と（４），（５）と
（６），（７）と（８）及び（９）と（10）は直接結合
しており、37位と53位のシスティン残基（Cys）は分子
内でＳ−Ｓ結合を形成している。） 発明の効果 以上のように、本発明では、まず先に単離・同定した
CNP−22の構造を特異的に認識する抗体を作製し、これ
を用いたRIA系を構築した。次に、このRIA系を指標に、
ブタ脳からCNP−22以外のCNPファミリーに属する新規ペ
プチドを探したところ、CNP−22とは明らかに異なる新
規ペプチド（CNP−53）を単一で純粋な状態までに精製
することに成功した。
（６），（７）と（８）及び（９）と（10）は直接結合
しており、37位と53位のシスティン残基（Cys）は分子
内でＳ−Ｓ結合を形成している。） 発明の効果 以上のように、本発明では、まず先に単離・同定した
CNP−22の構造を特異的に認識する抗体を作製し、これ
を用いたRIA系を構築した。次に、このRIA系を指標に、
ブタ脳からCNP−22以外のCNPファミリーに属する新規ペ
プチドを探したところ、CNP−22とは明らかに異なる新
規ペプチド（CNP−53）を単一で純粋な状態までに精製
することに成功した。
さらに、このペプチドの構造解析を行い、CNP−53はC
NP−22をＣ−末端に含むアミノ酸53残基よりなるペプチ
ドであることを明らかにし、このペプチドがCNPファミ
リーに属する新規ペプチドであることを見いだした。
NP−22をＣ−末端に含むアミノ酸53残基よりなるペプチ
ドであることを明らかにし、このペプチドがCNPファミ
リーに属する新規ペプチドであることを見いだした。
本発明により、CNP−53の構造が明らかにされたこと
から、今後CNP−53は化学合成または遺伝子操作を用
い、大量に入手することが可能になり、これを用いて種
々の薬理試験を行えば生体内におけるCNP−53の生理的
作用を明らかにすることができる。また、第５図に示す
CNP−53のアミノ酸一次配列で１番目から32番目の間に
は、５個のリジン（Lys）残基（7,24,26,30及び31番
目）と４個のアルギニン（Arg）残基（3,9,14及び23番
目）が存在していることから、生体内において、CNP−5
3はプロセッシング酵素により、これらの塩基性アミノ
酸残基のＣ−末端が特異的に切断を受け、CNP−22以外
にCNP−22のＮ−末端にさらにアミノ酸が付加した種々
のペプチド類（例えば、第５図に示すアミノ酸一次配列
で４から53番目、８から53番目、10から53番目、15から
53番目、25から53番目及び27から52番目に対応するペプ
チド）に変換され、これらが生体内においてCNP−53,CN
P−22とは異なった生理活性を示す可能性が高い。これ
らの可能性は、本発明でCNP−53の構造が明らかにされ
たことから、これらのペプチド類を化学合成または遺伝
子操作を用いて作製し、これらを用いて種々の薬理試験
を行えば確かめることができる。さらに、CNP−53のア
ミノ酸一次配列の情報から、CNP−53に対応するDNAプロ
ーブを作製し、これを用いてCNP−53をコードいている
遺伝子及びcDNAを単離・解析すれば、CNP−22,CNP−53
の前駆体タンパクの構造を明らかにすることができる。
従って、以上のことから、本発明は今後CNPファミリー
に属するペプチドの生合成機構、生体内分布、及び生理
作用を明らかにする上で、また、CNPファミリーに属す
るペプチドを医薬品として開発する上で、大いに貢献す
るものである。
から、今後CNP−53は化学合成または遺伝子操作を用
い、大量に入手することが可能になり、これを用いて種
々の薬理試験を行えば生体内におけるCNP−53の生理的
作用を明らかにすることができる。また、第５図に示す
CNP−53のアミノ酸一次配列で１番目から32番目の間に
は、５個のリジン（Lys）残基（7,24,26,30及び31番
目）と４個のアルギニン（Arg）残基（3,9,14及び23番
目）が存在していることから、生体内において、CNP−5
3はプロセッシング酵素により、これらの塩基性アミノ
酸残基のＣ−末端が特異的に切断を受け、CNP−22以外
にCNP−22のＮ−末端にさらにアミノ酸が付加した種々
のペプチド類（例えば、第５図に示すアミノ酸一次配列
で４から53番目、８から53番目、10から53番目、15から
53番目、25から53番目及び27から52番目に対応するペプ
チド）に変換され、これらが生体内においてCNP−53,CN
P−22とは異なった生理活性を示す可能性が高い。これ
らの可能性は、本発明でCNP−53の構造が明らかにされ
たことから、これらのペプチド類を化学合成または遺伝
子操作を用いて作製し、これらを用いて種々の薬理試験
を行えば確かめることができる。さらに、CNP−53のア
ミノ酸一次配列の情報から、CNP−53に対応するDNAプロ
ーブを作製し、これを用いてCNP−53をコードいている
遺伝子及びcDNAを単離・解析すれば、CNP−22,CNP−53
の前駆体タンパクの構造を明らかにすることができる。
従って、以上のことから、本発明は今後CNPファミリー
に属するペプチドの生合成機構、生体内分布、及び生理
作用を明らかにする上で、また、CNPファミリーに属す
るペプチドを医薬品として開発する上で、大いに貢献す
るものである。
第１図は、ブタ脳からの抽出物（SP−III分画をさらにS
ephadex G−50を用い分画した分子量約1000〜5000のペ
プチド画分）をSephadex G−25を用いてさらに精製した
ときの溶出経過、及び各画分の抗CNP−22抗血清に対す
る免疫活性を示すグラフである。なお、矢印1,2,3,4,5
はこのカラムにおける１）bovine serum albumin,2）BN
P−32,3）BNP−26,4）α−ANP（４−28）及び５）neuro
tensinの溶出位置を示す。 第２図は、第１図に示したＢ画分をCM−52イオン交換ク
ロマトグラフィーを用いてさらに精製したときの溶出経
過、及び各画分の抗CNP−22の抗血清に対する免疫活性
を示す。 第３図は、CNP−53の最終精製に用いた逆相HPLCの溶出
経過、及び各画分の抗CNP−22抗血清に対する免疫活性
を示す。なお、ａ）は第２図のCM−52クロマトグラフィ
ーの溶出画分番号111−113をAnti−α−ANP IgGを用い
たimmunoaffinityクロマトグラフィーにかけ、このカラ
ムに吸着したペプチド画分をHi−Pore RP−318カラムを
用いてさらに精製したときの溶出経過を示し、ｂ）は第
３図ａの矢印の位置に溶出するペプチド画分を、219 TP
54 diphenylカラムを用いてさらに精製したときの溶出
経過を示す。 第４図は、CNP−53のエドマン分解法による各サイクル
ごとに生ずるPTH−アミノ酸の収率及びアミノ酸配列を
示すグラフである。なお、各アミノ酸は一文字表記で表
され、右上枠はCNP−53のエドマン分解における30〜45
サイクル目のPTH−アミノ酸収率を４倍に拡大し、表示
したものである。 第５図は、CNP−53のＮ−末端から45番目までのアミノ
酸一次配列とCNP−22のアミノ酸一次配列の相同性を示
す表である。 第６図は、CNP−53を含む前駆体をコードするcDNA配列
を示す表である。
ephadex G−50を用い分画した分子量約1000〜5000のペ
プチド画分）をSephadex G−25を用いてさらに精製した
ときの溶出経過、及び各画分の抗CNP−22抗血清に対す
る免疫活性を示すグラフである。なお、矢印1,2,3,4,5
はこのカラムにおける１）bovine serum albumin,2）BN
P−32,3）BNP−26,4）α−ANP（４−28）及び５）neuro
tensinの溶出位置を示す。 第２図は、第１図に示したＢ画分をCM−52イオン交換ク
ロマトグラフィーを用いてさらに精製したときの溶出経
過、及び各画分の抗CNP−22の抗血清に対する免疫活性
を示す。 第３図は、CNP−53の最終精製に用いた逆相HPLCの溶出
経過、及び各画分の抗CNP−22抗血清に対する免疫活性
を示す。なお、ａ）は第２図のCM−52クロマトグラフィ
ーの溶出画分番号111−113をAnti−α−ANP IgGを用い
たimmunoaffinityクロマトグラフィーにかけ、このカラ
ムに吸着したペプチド画分をHi−Pore RP−318カラムを
用いてさらに精製したときの溶出経過を示し、ｂ）は第
３図ａの矢印の位置に溶出するペプチド画分を、219 TP
54 diphenylカラムを用いてさらに精製したときの溶出
経過を示す。 第４図は、CNP−53のエドマン分解法による各サイクル
ごとに生ずるPTH−アミノ酸の収率及びアミノ酸配列を
示すグラフである。なお、各アミノ酸は一文字表記で表
され、右上枠はCNP−53のエドマン分解における30〜45
サイクル目のPTH−アミノ酸収率を４倍に拡大し、表示
したものである。 第５図は、CNP−53のＮ−末端から45番目までのアミノ
酸一次配列とCNP−22のアミノ酸一次配列の相同性を示
す表である。 第６図は、CNP−53を含む前駆体をコードするcDNA配列
を示す表である。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−74199（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍ．，Ｖｏｌ．168，Ｎｏ. ２（1990．Ａｐｒ）ｐ．863−870 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍ．，Ｖｏｌ．157，Ｎｏ. １（1988）ｐ．402−409 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/58 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列で表わされるペプチ
ド。 （式中、（１）と（２），（３）と（４），（５）と
（６），（７）と（８），（９）と（10）は直接結合し
ており、37位と53位のシスティン残基（Cys）は分子内
でＳ−Ｓ結合を形成している。） - 【請求項２】下記のアミノ酸配列で表わされるペプチ
ド。 〔式中、（１）と（２），（３）と（４）は直接結合し
ており、６位と22位とのシスティン残基（Cys）は分子
内でＳ−Ｓで結合を形成しており、Ｘは次式 （式中、（１′）と（２′），（３′）と（４′），
（５′）と（６′）は直接結合しているものである）で
表わされるいずれかのペプチドである〕。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2186582A JP2930380B2 (ja) | 1990-07-13 | 1990-07-13 | ブタ由来新規生理活性ペプチド（ｃｎｐ―５３） |
| AT91111629T ATE154641T1 (de) | 1990-07-13 | 1991-07-12 | Neues physiologisch aktives schweinepeptid (cnp- 53) |
| DK91111629.1T DK0466174T3 (da) | 1990-07-13 | 1991-07-12 | Hidtil ukendt fysiologisk aktivt svinepeptid (CNP-53) |
| US07/728,221 US5340920A (en) | 1990-07-13 | 1991-07-12 | Physiologically active porcine peptide (CNP-53) |
| EP91111629A EP0466174B1 (en) | 1990-07-13 | 1991-07-12 | Novel physiologically active porcine peptide (CNP-53) |
| DE69126568T DE69126568T2 (de) | 1990-07-13 | 1991-07-12 | Neues physiologisch aktives Schweinepeptid (CNP-53) |
| ES91111629T ES2104635T3 (es) | 1990-07-13 | 1991-07-12 | Nuevo peptido porcino con una actividad fisiologica (cnp-53). |
| GR970402223T GR3024581T3 (en) | 1990-07-13 | 1997-08-29 | Novel physiologically active porcine peptide (CNP-53) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2186582A JP2930380B2 (ja) | 1990-07-13 | 1990-07-13 | ブタ由来新規生理活性ペプチド（ｃｎｐ―５３） |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0474198A JPH0474198A (ja) | 1992-03-09 |
| JP2930380B2 true JP2930380B2 (ja) | 1999-08-03 |
Family
ID=16191066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2186582A Expired - Lifetime JP2930380B2 (ja) | 1990-07-13 | 1990-07-13 | ブタ由来新規生理活性ペプチド（ｃｎｐ―５３） |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5340920A (ja) |
| EP (1) | EP0466174B1 (ja) |
| JP (1) | JP2930380B2 (ja) |
| AT (1) | ATE154641T1 (ja) |
| DE (1) | DE69126568T2 (ja) |
| DK (1) | DK0466174T3 (ja) |
| ES (1) | ES2104635T3 (ja) |
| GR (1) | GR3024581T3 (ja) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1118329A4 (en) * | 1998-09-28 | 2004-12-15 | Santen Pharmaceutical Co Ltd | LACRYMAL SECRETION PROMOTERS OR OPHTHALMOLOGICAL DROPS CONTAINING NATRIURETIC PEPTIDES AS ACTIVE INGREDIENTS FOR TREATING KERATOCONJUNCTIVITY |
| BRPI0203172B8 (pt) | 2001-09-28 | 2021-05-25 | Nakao Kazuwa | composição farmacêutica para acondroplasia |
| CN1960758B (zh) * | 2004-03-31 | 2014-10-22 | 中外制药株式会社 | 关节炎的治疗剂或预防剂 |
| CN1960757A (zh) | 2004-03-31 | 2007-05-09 | 中尾一和 | 身高增加用组合物 |
| DK2348114T3 (en) | 2004-04-21 | 2018-09-03 | Alexion Pharma Inc | BONE DELIVERY CONJUGATES AND PROCEDURE TO USE IT FOR TARGETING PROTEINS AGAINST BONE |
| AU2008326327A1 (en) | 2007-11-21 | 2009-05-28 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Variants of C-type natriuretic peptide |
| DK2432489T3 (en) | 2009-05-20 | 2017-01-16 | Biomarin Pharm Inc | VARIETIES OF C-TYPE NATRIURETIC PEPTID |
| AU2011350066A1 (en) | 2010-12-27 | 2013-07-11 | Alexion Pharma International Sarl | Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof |
| WO2013058833A1 (en) | 2011-10-19 | 2013-04-25 | Enobia Canada Limited Partnership | Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof |
| US10052366B2 (en) | 2012-05-21 | 2018-08-21 | Alexion Pharmaceuticsl, Inc. | Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof |
| WO2016007873A1 (en) | 2014-07-11 | 2016-01-14 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating craniosynostosis |
| EP3226891A1 (en) | 2014-12-05 | 2017-10-11 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Treating seizure with recombinant alkaline phosphatase |
| EP3250227A2 (en) | 2015-01-28 | 2017-12-06 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency |
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