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CN101802197A - 单链FC（ScFc）区、包含其的结合多肽及与其相关的方法 - Google Patents

单链FC（ScFc）区、包含其的结合多肽及与其相关的方法 Download PDF

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CN101802197A
CN101802197A CN200880024709A CN200880024709A CN101802197A CN 101802197 A CN101802197 A CN 101802197A CN 200880024709 A CN200880024709 A CN 200880024709A CN 200880024709 A CN200880024709 A CN 200880024709A CN 101802197 A CN101802197 A CN 101802197A
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polypeptide
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antibody
binding
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格雷厄姆·K·法林顿
阿姆纳·西德-科瑟
埃伦·加伯
亚历克西·A·卢戈夫斯科伊
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Biogen MA Inc
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Biogen Idec MA Inc
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Abstract

除其它以外，本发明特征为包含含有遗传融合的Fc部分的Fc区的多肽。此外，本发明提供例如通过向受治疗者施用本发明结合多肽而治疗或预防所述受治疗者的疾病或病症的方法。

Description

单链FC(ScFc)区、包含其的结合多肽及与其相关的方法
相关申请
本申请要求2007年5月14日提交的题为“含有遗传融合的FC区的结合多肽及与其的相关方法”的美国临时申请第60/930,227号、代理人案号BGN-A247-1的优先权，其完整内容通过引用并入此处。此外，本说明书中引用的任何专利、专利申请和参考文献的内容以其完整内容通过引用并入此处。
发明背景
免疫球蛋白的Fc区介导效应子功能，这些功能被划分成两类。第一类是独立于抗原结合而发生的功能；这些功能赋予在循环中的持久性和通过胞吞转运作用跨细胞屏障转移的能力(参见Ward和Ghetie，TherapeuticImmunology 2：77-94，1995，Capon等人.Nature 1989)。IgG亚类免疫球蛋白的循环半衰期由Fc区对新生Fc受体或FcRn的亲和性调节(参见Ghetie等人，Nature Biotechnol.15：637-640，1997；Kim等人Eur.J.Immunol.24：542-548，1994；Dall’Acqua等人.(J.Immunol.169：5171-5180，2002)。第二大类效应子功能包括免疫球蛋白与抗原结合后运转的功能。在IgG的情况，这些功能涉及补体级联或携带Fcγ受体(FcγR)的细胞的参与。Fc区对FcγR的结合导致某些免疫效应，例如，免疫复合体的胞吞作用，吞入和破坏免疫球蛋白包被的颗粒或微生物(也称为抗体依赖性吞噬作用或ADCP)，清除免疫复合体，杀伤细胞裂解免疫球蛋白包被的靶细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或ADCC)，释放免疫介质，调节免疫系统细胞活化，并调节免疫球蛋白产生。
某些工程化的结合多肽(如，抗体变体(如，scFv)或抗体片段(如，Fab片段))，虽然从其较小的分子尺寸和/或一价获益，也因为不存在功能Fc区而有多种缺陷。例如，Fab片段具有短的体内半衰期，因为其缺少结合FcRn所需的Fc区，并因为其小的尺寸而很快地被肾脏从血液滤出。尽管可能产生一价、含有Fc的结合多肽，现有方法要求共表达二聚的Fc区的两个重链部分或化学结合二聚的Fc区于结合位点(如，Fab结构域)。这些方法是无效的，因为共表达产生的产物是复杂的混合物，代表包括聚集体和无活性蛋白的起始材料的所有可能的配对。因此，期望的功能结合多肽产率低。另外，使用现有技术方法不可能有效地产生具有异聚的Fc区的结合分子(即，其中二聚的Fc区的重链部分序列不同)。
因此，需要含有Fc的结合多肽，其可有效地和强有力地产生并保持期望的Fc效应子功能。
发明概述
除其它以外，本发明特征为包含一个或多个遗传融合的Fc区的Fc多肽(如，Fc结合多肽)。尤其是，本发明多肽包含单链Fc区(“scFc”)，其中组成性Fc部分在单个多肽链中遗传融合以使形成功能性、二聚的Fc区。在某些实施方案中，scFc的组成性Fc部分经由Fc部分之间的多肽接头(如，Fc连接肽)串联遗传融合。因此，本发明scFc多肽包含单个连续氨基酸序列形成的scFc区，该单个连续(contiguous)氨基酸序列在作为一个连续核苷酸序列部分的单个可读框(ORF)中编码。相反，常规Fc多肽(如，常规免疫球蛋白)的Fc区是专性同二聚体，包含分开的多肽链中的分开的(即，未连接的)Fc结构域或部分，其在翻译后二聚化但不是串联地共价连接。
本发明单链Fc(scFc)多肽提供优于常规Fc多肽的多种益处。在某些方面，scFc多肽的遗传融合的Fc区(即，scFc区)可以可操作地连接于结合多肽的结合位点(如，连接于抗原结合片段(如，Fab)或scFv分子)以形成scFc结合多肽，从而对结合多肽赋予效应子功能或改变现有的效应子功能。本发明scFc结合多肽可为单体或多聚的(如，二聚的)。本发明新颖的scFc结合多肽具有一价结合多肽的益处(如，缺少可导致错误细胞信号传导和/或胞吞作用的细胞表面受体交联)，至少在一个实施方案中还具有Fc-介导的效应子功能的益处(如由于被FcRn结合而半衰期增加，赋予FcγRI、FcγRII和FcγRIII结合和补体活化)，在一个实施方案中还具有能够细调这种效应子功能的益处。而且，本发明scFc结合多肽可易于以易于放大规模高产率生产的高度同质的制品表达。例如，包含一个或多个靶结合位点(如，抗原结合位点，诸如一个或多个scFv或Fab片段)的结合多肽可连接到遗传融合的Fc区(即，scFc区)的N-或C-末端之一或两者，并在单个遗传构建体中编码，从而避免共表达两个或多个链造成的多个分子的复杂混合物。
本发明scFc多肽还提供产生在高度同质的制品中具有异聚的scFc区的分子的机会。目前很难产生和纯化含有异聚Fc的分子，其中构成常规Fc区的两个Fc部分互相不同，例如其中两个Fc部分只有一个包含氨基酸修饰(如，单个CH2和/或CH3结构域中的单个点突变)。在本申请教导下，异聚的scFc结合多肽中少于全部的scFc区Fc部分包含突变时，这种多肽现在可易于从单个遗传构建体获得。这种分子易于放大规模来制造。
一方面，本发明涉及包含(i)第一靶结合位点，和(ii)包含至少两个遗传融合的Fc部分的第一单链Fc(scFc)区域的scFc结合多肽，其中scFc区的Fc部分是经由置于所述Fc部分之间的多肽接头序列遗传融合的；且其中该scFc区赋予所述结合多肽至少一种效应子功能。
在一个实施方案中，本发明还涉及包含scFc区的scFc结合多肽，其中所述scFc区包含选自FcRn结合部分、FcγR结合部分和补体结合部分组成的组的结构域(如，效应子结构域)。在另一个实施方案中，该结构域是蛋白A或蛋白G结合部分。
在某些实施方案中，所述scFc区是异聚的scFc区。在一个实施方案中，所述异聚的Fc区是半糖基化的。
在一个实施方案中，该scFc区是异聚的scFc区。在另一个实施方案中，该scFc区是同聚的scFc区。
在一个实施方案中，该scFc区是完全糖基化的。在另一个实施方案中，该scFc区是无糖基化的。在另一个实施方案中，所述scFc区是无岩藻糖基化的(afucosylated)。
在某一实施方案中，所述多肽的scFc区是嵌合Fc区。例如，该scFc区可包含多个来自IgG2分子的CH2结构域和多个来自IgG4分子的CH3结构域。在其它实施方案中，所述scFc区可包含来自IgG2分子的CH2部分和来自IgG4分子的CH2部分。在其他的实施方案中，该scFc可包含修饰的或嵌合铰链区，如，包含来自IgG4分子的中部铰链区和来自IgG1分子的上部和下部铰链区的嵌合铰链。在其它实施方案中，铰链区的一个或多个半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代。
在一个实施方案中，该scFc区包含两个或多个Fc结构域或部分。
在一个实施方案中，所述Fc部分的一个或多个是选自缺失CH2结构域的Fc部分、缺失CH3结构域的Fc部分和缺失铰链的Fc部分组成的组的缺失结构域的Fc部分。
在一个实施方案中，所述Fc部分的至少一个在所述Fc部分中EU约定(convention)氨基酸位置包含至少一个Fc突变。
在另一个实施方案中，所述Fc部分的两个或多个在所述Fc部分中EU约定氨基酸位置包含一个或多个Fc突变。
在一个实施方案中，结合分子的至少一个Fc部分中选自234、236、239、241、246-252、254-256、275、277-288、294、296-298、301、303-307、309、310、312、313、315、328、332、334、338、342、343、350、355、359、360、361、374、376、378、381-385、387、389、413、415、418、422、426、428、430-432、434、435、438和441-446(EU编号公约)组成的组的至少一个氨基酸位置被突变。
在一个实施方案中，至少一个Fc突变位于结合分子至少一个Fc部分的铰链结构域。在另一个实施方案中，至少一个Fc突变位于CH2结构域。在另一个实施方案中，至少一个Fc突变位于CH3结构域。
在一个实施方案中，该CH3结构域在独立地选自结合分子的至少一个Fc部分的根据EU编号索引的350、355、361、389、415、441、443和446b组成的组的一个或多个氨基酸位置包含工程化的半胱氨酸或其含硫醇(thiol)的类似物。
在一个实施方案中，本发明结合分子在至少一个Fc部分的EU位置297具有减少的糖基化。在另一个实施方案中，该结合多肽在EU位置297是无岩藻糖基化的。
在一个实施方案中，该多肽接头的长度是约50至约500个氨基酸。在另一个实施方案中，该多肽接头的长度是约50至约200个氨基酸。在另一个实施方案中，该多肽接头的长度是约1至约50个氨基酸。在另一个实施方案中，该多肽接头的长度是约10至约20个氨基酸。在一个实施方案中，该多肽接头包含铰链区或其部分。在一个实施方案中，该铰链区是嵌合铰链区。在一个实施方案中，该多肽接头包含gly/ser肽。在一个实施方案中，该gly/ser肽具有式(Gly4Ser)n，其中n是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组的正整数。
在一个实施方案中，该(Gly4Ser)n scFc接头是(Gly4 Ser)4。在另一个实施方案中，该(Gly4 Ser)n scFc接头是(Gly4 Ser)3。
在一个实施方案中，该多肽接头包含所述第一靶结合位点。在一个实施方案中，该多肽接头包含生物学相关的肽或其部分。在一个实施方案中，该生物学相关的多肽是抗排斥或抗炎肽。在另一个实施方案中，该生物学相关的多肽选自细胞因子抑制肽、细胞粘附抑制肽、凝血酶抑制肽和血小板抑制肽组成的组。在另一个实施方案中，该细胞因子抑制肽是IL-1抑制肽。
在一个实施方案中，该第一结合位点遗传融合于scFc区的N-末端。在另一个实施方案中，该第一结合位点遗传融合于scFc区的C-末端。
在一个实施方案中，本发明结合分子还包含第二靶结合位点。在一个实施方案中，该第二靶结合位点可操作地连接于scFc区的N-末端。在另一个实施方案中，该第二靶结合位点可操作地连接于scFc区的C-末端。在另一个实施方案中，该结合位点贴(veneer onto)在scFc区的Fc部分(如，1、2或更多CH2结构域和/或1、2或更多CH3结构域)上。
在一个实施方案中，至少一个靶结合位点选自抗原结合位点、受体的配体结合部分和配体的受体结合部分组成的组。
在一个实施方案中，该抗原结合位点衍生自抗体。在一个实施方案中，该抗体选自单克隆抗体、嵌合抗体、人类抗体和人源化抗体组成的组。在另一个实施方案中，该抗原结合位点衍生自选自scFv、Fab、微型抗体(minibody)、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、纳米抗体(nanobody)、骆驼抗体(camelid)和Dab组成的组的抗体变体。在另一个实施方案中，该结合位点衍生自非免疫球蛋白的结合分子，如，非免疫球蛋白的结合分子选自adnectin、亲和体(affibody)、DARPin和抗运载蛋白(anticalin)组成的组。
在一个实施方案中，本发明结合多肽包含包括来自选自利妥昔单抗(Rituximab)、达克珠单抗(Daclizumab)、加利昔单抗(Galiximab)、CB6、Li33、5c8、CBE11、BDA8、14A2、B3F6、2B8、Lym 1、Lym 2、LL2、Her2、5E8、B1、MB1、BH3、B4、B72.3、CC49和5E10组成的组的抗体的至少一个CDR、可变区、或抗原结合位点的至少一个结合位点。
在一个实施方案中，受体的配体结合部分衍生自选自免疫球蛋白(Ig)超家族的受体、TNF受体超家族的受体、G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(ligand-gated，LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族、神经胶质衍生的神经营养因子(GDNF)受体家族的受体和细胞因子受体超家族组成的组的受体。在一个实施方案中，TNF受体超家族的所述受体是LTβR。在另一个实施方案中，TNF受体超家族的所述受体结合TNFα。在另一个实施方案中，GDNF受体家族的所述受体是GFRα3。
在一个实施方案中，配体的受体结合部分衍生自抑制配体。在一个实施方案中，配体的受体结合部分衍生自活化配体。在一个实施方案中，该配体结合选自免疫球蛋白(Ig)超家族的受体、TNF受体超家族的受体、G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族和细胞因子受体超家族组成的组的受体。在一个实施方案中，结合细胞因子受体超家族的受体的配体是β-干扰素。
在一个实施方案中，第一和第二靶结合位点具有不同的结合特异性。在另一个实施方案中，第一和第二靶结合位点具有相同的结合特异性。
在一个实施方案中，本发明结合分子还包含两个或多个scFc区。
在一个实施方案中，本发明结合分子结合于至少一个功能性部分。
在一个实施方案中，该功能性部分选自封闭部分、可检测部分、诊断部分和治疗部分组成的组。
在一个实施方案中，该封闭部分选自半胱氨酸加合物(cysteine adduct)、混合的二硫化物(mixed disulfide)、聚乙二醇和聚乙二醇马来酰亚胺组成的组。
在一个实施方案中，该可检测部分选自荧光部分和同位素部分组成的组。
在一个实施方案中，该诊断部分能够揭示疾病或病症的存在。
在一个实施方案中，该治疗部分选自抗炎剂、抗癌剂、抗神经变性剂和抗传染剂(anti-infective agent)组成的组。
在一个实施方案中，该功能性部分结合于所述多肽接头。
在一个实施方案中，该功能性部分是经由二硫键结合的。在另一个实施方案中，该功能性部分是经由异双官能接头结合的。
在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明scFc结合多肽和第二多肽的多聚的结合多肽。
在一个实施方案中，第二多肽是结合多肽(如，scFc结合多肽)。在一个实施方案中，第二结合多肽包含(i)至少第一抗原结合部分，和(ii)至少第一scFc区，其中所述scFc区包含至少两个Fc部分，且其中所述scFc区赋予所述结合多肽至少一种效应子功能。在一个实施方案中，第二结合多肽的scFc区包含scFc区的两个Fc部分之间的接头多肽(如，Fc连接多肽)。
在一个实施方案中，该多聚的结合多肽是二聚的结合多肽。
在一个实施方案中，本发明结合分子的第一或第二结合部分结合于免疫细胞或肿瘤细胞上存在的抗原。
在一个实施方案中，本发明结合分子的至少一个Fc部分属于IgG同种型。
在一个实施方案中，该IgG同种型属于IgG1亚类。
在一个实施方案中，本发明结合分子的至少一个Fc部分衍生自人类抗体。
一方面，本发明涉及包含本发明结合分子的药物组合物。
另一方面，本发明涉及包含编码本发明多肽的核苷酸序列的核酸分子。
在一个实施方案中，该核酸分子是在表达载体中。
在一个实施方案中，本发明涉及包含含有本发明核酸分子的表达载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及产生结合多肽的方法，包括培养宿主细胞。
另一方面，本发明涉及治疗或预防受治疗者的疾病或病症的方法，包括施用本发明结合分子。
在一个实施方案中，该疾病或病症选自炎性病症、神经病症、自身免疫病症和肿瘤病症组成的组。
附图简述
图1A-D是示例性本发明scFc结合多肽的示意图。结合多肽包含抗原结合位点(如Fab区)，其(通过例如人类IgG1铰链)连接于遗传融合的Fc区(即，单链Fc或“scFc”区)，所述Fc区包含经由多肽接头连接的两个Fc部分(图1A)。Fab区、人类IgG1铰链和scFc区都在单个连续基因或遗传构建体中编码。表达该构建体可产生scFc结合多肽的二聚形式(“dc”；图1B)或单体(“sc”；图1C)形式。包含单体scFc的重和轻链的结构域组织描述于图1D。
图2A-D显示分离单体(“sc”)和二聚形式(“dc”)的scFc结合多肽的两步骤纯化方法的结果。纯化方法采用亲合层析随后是凝胶过滤层析。图2A显示从蛋白A亲合柱在低pH洗脱的级分的吸收谱。图2B显示在非还原条件下，包含二聚的(“dc”)和单体(“sc”)形式的结合多肽的那些洗脱级分的相应的SDS PAGE分析。单体和二聚的形式两者基本上以单峰形式从蛋白A柱洗脱。图2C显示在Superdex 200凝胶过滤柱上对汇集的蛋白A洗脱液进行大小排阻层析，将该混合物分离为两个不同的峰。图2D显示凝胶过滤级分相应的非还原SDS PAGE分析。峰分别代表纯化的单体(“sc”)和二聚(“dc”)形式。
图3显示在非还原(组A)和还原(组B)条件下以制备规模纯化的二聚(“dc”)和单体(“sc”)形式的scFc结合多肽的SDS-PAGE。各图中，泳道1和2分别包含二聚形式(“ds”；205kDa)和单体(“sc”；105kDa)形式。泳道3包含对照人类IgG1抗体(Hu5c8；150kDa)。
图4A-B表征单体(sc)或二聚的(dc)scFc多肽结合于同三聚的shCD40L抗原的复合体。图4A显示从SEC-LS实验获得的大小排阻层析的合成图，进行该实验以确定各单独成分和形成的各自复合体的分子量。在图4B中，基于以SEC-LS获得的单独质量、和复合体各自的计算分子量，预测因单体(i)或二聚化(ii)scFc多肽分别结合于shCD40L后形成的复合体。
图5显示在单体(“sc”)scFc多肽或常规人类IgG1抗-CD40L mAb hu5C8存在下形成的含有shCD40L的复合体的洗脱谱合成图。由在线LS确定分子量并标在对复合体获得的各峰上方。分别对单体scFc(“sc”)、5C8 IgG1和shCD40L确定分子量是101.5kDa、150kDa和51kDa。
图6显示ELISA结合测定的结果，比较单体scFc(sc)、二聚的scFc(dc)和常规人类IgG1抗-CD40L抗体(Hu 5C8)对包被在板上的抗原shCD40L的表观结合亲和性。一价scFc具有比WT mAb弱大约2倍的EC50，所述WTmAb由于其二价地结合配体的能力而具有显著的亲和力优势。
图7A显示ELISA结合测定的结果，比较二聚的(“dc”)和单体(“sc”)形式的scFc结合多肽与常规IgG1抗体(Hu 5C8)的表观FcRn结合亲和性。使用生物素化人和大鼠FcRn-Fc融合构建体两者确定FcRn结合。该测定中，降每一种含有Fc的构建体包被在板上，以链霉抗生物素蛋白HRP检测生物素化的大鼠或人类FcRn-Fc构建体的结合。经测定，人类FcRn-Fc(不是大鼠FcRn-Fc)结合于单体scFc多肽(“sc”)的c-值比Hu5C8或二聚的(“dc”)scFc多肽的低3至4倍。图7B显示大鼠FcRn-Fc(“rFcRn-Fc”)、半糖基化的(“hemiglyscFc”)和完全糖基化的(“fully gly scFc”)5c8scFc以及将大鼠FcRn-Fc与所述scFc混合后形成的复合体的分析性SEC洗脱谱。用光散射分析确定各个峰中包含的单独成分和复合体各自的分子量。对获得的复合体确定的质量表明，各scFc上的两个FcRn结合位点是功能性的，预测它们形成如所示的包含2FcRnFc：2scFc的复合体。
图8描绘包含由接头区串联连接的两个Fc部分的示例性单体形式(sc)的scFc结合多肽的分子模型。该模型提供异聚的scFc区的实例。scFc结合多肽包含在一个Fc部分(“Fc部分#2”)造成去糖基化并在第二Fc部分(“Fc部分#1”)的CH2结构域造成糖基化(“糖#1”)的单个位点特异性Fc突变。
图9是分辨率为
Figure G2008800247098D00091
的scFc晶体结构的前视图和侧视图。获得不存在F(ab)结构域的scFc区的晶体。scFc显示为叠加在岩藻糖基化的IgG1 Fc(pdb编码2DTQ；黑色)上的灰色。重叠表示对417α-碳原子偏移0.489A rmsd，这基本上是相同的骨架构象。仅有的显著差异是，scFc包括部分有序的(partially ordered)铰链区和在一半scFc包含不存在于岩藻糖基化的IgG1 Fc结构的另外的半乳糖。对scFc结构解析至
Figure G2008800247098D00092
分辨率，Rfree为35％，R因子为25％。
图10描绘使用本发明scFc多肽筛选双特异性抗体功能时的益处。scFc区阻止结合结构域的不希望的异质组合。这种异质性将造成为筛选双特异性抗体独特活性设计的复杂测定。“路径1”是异质的结合结构域组合的实例，其通常在以下三个基因在真核体系中共表达以形成双特异性抗体时发生：(A)融合于Fc结构域N-末端的单链F(ac)、scF(ab)；(B)融合于Fc的CH3的C-末端的F(ab)片段；(C)包含CL和VL结构域的轻链。“路径2”描绘通过置于其间的接头序列将(A)和(B)融合成单个连续的遗传构建体如何造成两个Fc部分遗传融合以形成scFc多肽(D)的实例。共表达(C)和(D)造成同质表达单个双特异性mAb。
图11A-I是本发明示例性scFc结合多肽的图解。图11A是在N-末端包含结合位点的scFc结合多肽的图解。图11B是在C-末端包含结合位点的scFc结合多肽的图解。图11C是在N-末端CH2-CH3域间区(interdomain region)包含结合位点的scFc结合多肽的图解。图11D是在C-末端CH2-CH3域间区包含结合位点的scFc结合多肽的图解。图11E是在接头多肽中包含结合位点的scFc结合多肽的图解。图11F是包含贴在N-末端CH2结构域上的结合位点的scFc结合多肽的图解。图11G是包含贴在N-末端CH3结构域上的结合位点的scFc结合多肽的图解。图10H是包含贴在C-末端CH2结构域上的结合位点的scFc结合多肽的图解。图11I是包含贴在C-末端CH3结构域上的结合位点的scFc结合多肽的图解。本领域技术人员认识到，本发明scFc结合多肽可包含描述于图11A-I的特征的任意组合。
图12比较含有2种不同长度G4S接头(1xG4S相比于3xG4S，即，5相比于15个氨基酸)的scFc的蛋白表达谱。发现接头长度与scFc产率正相关，以致从包含更长接头的构建体表达蛋白时，scFc产量比dcFc多。
图13描绘在大鼠中2周时间段内测量的1xG4S和3xG4S连接的scFc多肽相对于野生型人类IgG1抗体(hu5c8)的血清浓度。3xG4S scFc具有长的β-相半衰期(12天)，与WT IgG1(14天)相似。
图14A和B描绘进行Alphascreen测定以评价scFc多肽的FcγR结合活性的结果。显示半糖基化的和完全糖基化的5c8scFc对人类和猕猴Fcγ受体的结合与野生型(WT)和无糖基化的5c8IgG1的比较。scFc和WT IgG1对这些受体的体外结合表现非常相似，说明scFc应同样能够体内接合Fcg受体。
图15显示3xG4S连接的半糖基化的scFc在PNGaseF处理(以去糖基化)之前和之后的去卷积质谱(deconvoluted mass spectra)。得到scFc轻链在去糖基化之前(图15A)和之后(图15B)的质谱。对去糖基化的轻链确定的质量是23,854Da。图15C和D描绘去糖基化之前(图15C)和之后(图15D)scFc重链的质谱。对去糖基化的scFc重链确定的质量是75,703Da。
图16显示由差示扫描量热法(DSC)测量的，scFc分子与WT huIgG1 mAb和Fc相比的热稳定性。完全糖基化的scFc(ASK048)的CH2结构域的稳定性类似于WT IgG1。半糖基化的scFc具有略低的稳定性，很可能归因为由第二Fc部分的无糖基化的CH2造成的结构域柔性增加。
图17描绘(G4S)1-连接的半糖基化的5C8 scFc IgG1抗体构建体的重链氨基酸序列(pEAG2066；SEQ ID NO：1)。构建体具有VH-CH1-铰链结构域-CH2(1)-CH3(1)-G4S接头-铰链结构域-CH2(2)-CH3(2)的通式结构，尽管第一个更N-末端的Fc部分(残基222-447，SEQ ID NO：2)的糖基化模式是野生型，第二个更C-末端的Fc部分(残基458-683，SEQ ID NO：3)包含氨基酸取代(T299A，EU编号)，产生无糖基化的Fc。此外，该scFc在铰链结构域中包含C220S取代(EU编号)。T299A和C220S突变的位置以粗体表示。在序列中，铰链结构域是斜体，CH1和CH3恒定结构域加下划线。
图18描绘对应于图17中pEAG2066重链序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：4)。抗体信号序列加下划线。
图19A描绘示例性5C8抗体构建体的轻链氨基酸序列(pEAG2027；SEQID NO：5)。图19B描绘相应的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)。抗体信号序列加下划线。
图20描绘包含同聚的scFc区的示例性完全糖基化的、1xG4S-连接的5C8 IgG1 scFc抗体构建体的重链氨基酸序列(pEAG2146；SEQ ID NO：7)，其中N-末端(残基22-447)和C-末端(残基458-683)Fc部分两者都是糖基化的。构建体的组成性Fc部分如图17中的注解。
图21描绘对应于图17中pEAG2146重链序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：8)。抗体信号序列加下划线。
图22描绘包含半糖基化的、1xG4S-连接的scFc区的示例性scFc hu5C8IgG1抗体构建体的重链氨基酸序列(pEAG2147；SEQ ID NO：9)，其中第二个更C-末端的Fc部分(残基458-683；SEQ ID NO：10)包含改变的铰链结构域(GSEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGPSVFLF，SEQ ID NO：11)，其中铰链半胱氨酸残基已被丝氨酸取代。序列如图17中的注解。
图23描绘对应于图22中pEAG2147重链序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：12)。抗体信号序列加下划线。
图24描绘在人类IgG1 mAb 5C8中包含半糖基化的、(G4S)3连接的scFc区的示例性scFc抗体构建体的重链氨基酸序列(pASK043；SEQ ID NO：13)。构建体的组成结构域在图中以各自的序列标识符注解。
图25描绘对应于图24中pASK043重链序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：14)。抗体信号序列加下划线。
图26描绘包含完全糖基化的、(G4S)3连接的scFc区的示例性scFc 5C8IgG1抗体构建体的重链氨基酸序列(ASK048；SEQ ID NO：15)，其中两个Fc部分都是糖基化的。构建体的组成结构域在图中以各自的序列标识符注解。
图27描绘对应于图26中ASK048重链序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：16)。抗体信号序列加下划线。
图28描绘包含无糖基化的、(G4S)3连接的scFc区的示例性scFc 5C8IgG1抗体构建体的重链氨基酸序列(ASK052；SEQ ID NO：17)。构建体的组成结构域在图中以各自的序列标识符注解。
图29描绘对应于图29中ASK052重链序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：18)。抗体信号序列加下划线。
图30描绘包含无糖基化的、(G4S)1连接的scFc区的示例性scFc 5C8IgG1抗体构建体的重链氨基酸序列(pASK053；SEQ ID NO：19)。构建体的组成结构域在图中以各自的序列标识符注解。
图31描绘对应于图30中pASK053重链序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：20)。抗体信号序列加下划线。
图32描绘在人类抗-LINGO IgG1 mAb Li33中包含半糖基化的、1xG4S-连接的scFc区的示例性抗-LINGO scFc抗体构建体的重链氨基酸序列(pEAG2148；SEQ ID NO：21)。尽管第一个更N-末端的Fc部分(残基223-448)的糖基化模式是野生型，第二个更C-末端的Fc部分(残基549-684)包含氨基酸取代，产生无糖基化的Fc。构建体的组成结构域如图17中的注解。
图33描绘对应于图32中pEAG2148重链序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：22)。抗体信号序列加下划线。
图34A描绘示例性Li33scFc抗体构建体的轻链氨基酸序列(pXW435；SEQ ID NO：23)。图34B描绘相应的核苷酸序列(SEQ ID NO：24)。抗体信号序列加下划线。
图35描绘在人类抗-LINGO IgG1 mAb Li33中包含无糖基化的、3xG4S-连接的scFc区的示例性抗-LINGO scFc抗体构建体的重链氨基酸序列(ASK050；SEQ ID NO：25)。
图36描绘对应于图35中ASK050重链序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：26)。抗体信号序列加下划线。
图37描绘在人类抗-LINGO IgG1 mAb Li33中包含无糖基化的、1xG4S-连接的scFc区的示例性抗-LINGO scFc抗体构建体的重链氨基酸序列(ASK051；SEQ ID NO：27)。
图38描绘对应于图37中ASK051重链序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：28)。抗体信号序列加下划线。
图39显示抗-LINGO的scFc抗体分子(EAG2148)的改进的蛋白浓度依赖性溶解度特征。
图40A描绘在抗-CD2嵌合IgG 1mAb CB6中包含完全糖基化的、3xG4S-连接的scFc区的示例性抗-CD2嵌合CB6 scFc IgG1抗体构建体的重链氨基酸序列(ASK058；SEQ ID NO：29)。图40B描绘CB6 scFc IgG1抗体构建体的轻链氨基酸序列(EAG2276；SEQ ID NO：56)。
图41描绘对应于图40中ASK058重链序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：30)。抗体信号序列加下划线。图41b描绘对应于图40B中EAG2276重链序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：)。
图42描绘在抗-CD2嵌合IgG1 mAb CB6中包含完全糖基化的、4xG4S-连接的scFc区的示例性抗-CD2嵌合CB6 scFc IgG1抗体构建体的重链氨基酸序列(ASK062；SEQ ID NO：31)。
图43描绘对应于图42中ASK062重链序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：32)。抗体信号序列加下划线。
图44描绘在抗-CD2嵌合IgG1 mAb CB6中包含完全糖基化的、5xG4S-连接的scFc区的示例性抗-CD2嵌合CB6 scFc IgG1抗体构建体的重链氨基酸序列(ASK063；SEQ ID NO：33)。
图45描绘对应于图44中ASK063重链序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：34)。抗体信号序列加下划线。
图46描绘在抗-CD2嵌合IgG1 mAb CB6中包含完全糖基化的、6xG4S-连接的scFc区的示例性抗-CD2嵌合CB6 scFc IgG1抗体构建体的重链氨基酸序列(ASK064；SEQ ID NO：35)。
图47描绘对应于图46中ASK064重链序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：36)。抗体信号序列加下划线。
图48描绘包含(G4S)3-连接的、完全糖基化的、融合于neublastin受体GFRα3胞外结构域的scFc区的示例性GFRα3免疫粘附素蛋白的氨基酸序列(ASK-057；SEQ ID NO：37)。
图49描绘对应于图48中ASK-057氨基酸序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：38)。信号序列加下划线。
图50显示非还原SDS-PAGE和分析性SEC-LS表征2-步骤纯化后获得的GFRα3：scFc融合蛋白。
图51描绘包含半糖基化的、1xG4S-连接的融合于干扰素-β的scFc区(残基1-67)的示例性干扰素-β免疫粘附素构建体的氨基酸序列(pEAG2149；SEQID NO：39)。尽管第一个更N-末端的Fc部分(残基168-393)的糖基化模式是野生型，第二个更C-末端的Fc部分(残基404-629)包含氨基酸取代，产生无糖基化的Fc。构建体的组成结构域如图17中的注解。
图52描绘对应于图52中pEAG2149序列的核苷酸序列(SEQ ID NO：40)。信号序列加下划线。
图53描绘包含半糖基化的、3xG4S-连接的融合于LTβR的scFc区的示例性LTβR免疫粘附素构建体的氨基酸序列(EAG2190；SEQ ID NO：41)。
图54描绘对应于图54中EAG2190的序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：42)。信号序列加下划线。
图55描绘包含半糖基化的、3xG4S-连接的融合于LTβR的scFc区的示例性LTβR免疫粘附素构建体的氨基酸序列(EAG2191；SEQ ID NO：43)。
图56描绘对应于图56中EAG2191的序列的核苷酸序列(SEQ IDNO：44)。信号序列加下划线。
图57描绘LTβR：scFc融合多肽(EAG2190)的SDS-PAGE(图58A)和分析性凝胶过滤(图58B)。图58A的泳道1和2是非还原的并分别包含1和2ug蛋白，而泳道4和5包含还原剂和分别2和1ug的LI33 scFc。泳道3包含分子量标准，相关标准的质量如所示的。
图58描绘N-去糖基化的还原的LTβR：scFc的质谱测定(MS)。
图59描绘评价单体LTβR：scFc对LTa1b2的结合亲和性的ELISA(图59A)和FACS分析(图59B)结果。
图60描绘本发明示例性半糖基化的、1xG4S-连接的scFc区(EAG2181)的氨基酸序列(图60A；SEQ ID NO：45)和核苷酸序列(图60B；SEQ IDNO：46)。所述scFc区的N和/或C-末端可融合于任何本领域公认的结合位点。
图61描绘本发明示例性完全糖基化的、3xG4S-连接的scFc区(ASK054)的氨基酸序列(图61A；SEQ ID NO：47)和核苷酸序列(图61B；SEQ IDNO：48)。所述scFc区的N和/或C-末端可融合于任何本领域公认的结合位点。
图62描绘本发明示例性完全糖基化的、1xG4S-连接的scFc区(ASK055)的氨基酸序列(图62A；SEQ ID NO：49)和核苷酸序列(图62B；SEQ IDNO：50)。所述scFc区的N和/或C-末端可融合于任何本领域公认的结合位点。
图63描绘示例性抗-LTβR抗体(BDA8)的重链(ASK016)的氨基酸序列(图63A；SEQ ID NO：51)和核苷酸序列(图63B；SEQ ID NO：52)。在某些实施方案中，本发明scFc结合多肽包含BDA8的结合位点。
图64描绘FDA-批准的抗体或其它抗体的列表。在某些实施方案中，本发明scFc结合多肽可包含衍生自这些抗体中一种抗体的抗原结合位点。
发明详述
本发明通过提供例如结合多肽而推动本领域，所述结合多肽包含例如(i)至少一个结合位点或结合结构域；和(ii)至少一个遗传融合的Fc区(即，单链Fc(“scFc”)区)。在优选的实施方案中，scFc区包含经由置于Fc部分之间的接头多肽(如，Fc连接肽)遗传融合的至少两个Fc部分。在一个实施方案中，结合位点可包含抗体分子的抗原结合片段(如，F(ab)或scFv)，其融合(如，经由Fab或scFv的VH或VL)于scFc区的N-和C-末端之一或两者。在另一个实施方案中，结合结构域可包含融合于遗传融合的Fc区的N-和C-末端之一或两者的受体融合蛋白。这种融合可C-末端地或N-末端地融合于期望的结合位点。
从单个连续遗传构建体表达本发明结合多肽具有超出常规蛋白表达方法的多种益处，常规蛋白表达方法包括共表达两个基因，一个表达第一Fc结构域，分开的第二基因由融合于第二Fc结构域、以二硫键连接两个多肽链的结合位点组成。这种常规构建体的问题包括所得分子群体中显著的异质性，以使期望的分子必须与不期望的分子纯化分离，从而造成期望的分子总产率下降。本发明多肽与采用传统Fc区或缺少这种区的其它分子相比的益处在以下讨论，使用抗体分子或示例性其片段来示例：
通过表达融合于scFc的结合结构域避免杂化(scrambling)：难以构建具有仅一个F(ab)臂的抗体、或具有仅一个融合的功能多肽的Fc融合蛋白。现有方法要求共表达两个基因：一个编码包含第一Fc部分(Fc1如，VH、CH1、铰链、CH2和CH3结构域)的Ab的一条重链，第二基因编码第二Fc部分(Fc2如，铰链、CH2和CH3结构域)以获得期望的分子。共表达造成分子的不期望地复杂的混合物，预测为Fc1+Fc1∶Fc1+Fc2∶Fc2+Fc2的1∶2∶1混合物，但比例可与该理论预测大大不同，造成期望蛋白的次优产率。以连接于常规、二聚的Fc的单个融合分子表达一价融合蛋白可尤其重要地阻止当两个相同分子接近地折叠时可发生的不恰当折叠事件。这些错误折叠的Fc融合蛋白难以与正确折叠的二价Fc蛋白分开，因为两者之间仅有的区别通常是异源的错折叠事件。本发明的scFc融合蛋白不会经历蛋白结构域杂化，因为该构建在折叠过程期间不将分子彼此接近地固定。
通过增加FcRn结合来延长抗体片段(如，F(ab))的半衰期：通常期望抗体片段(如，F(ab))的治疗应用，因为其能够封闭细胞表面受体而无靶受体交联，因此没有随后的不期望的信号传导，诸如当受体被二价抗体接合时可发生信号传导。表面受体的这种交联可导致受体聚集并下调细胞表面的靶受体。F(ab)构建体基本上是一价，因此不会导致受体交联或聚集。
体内应用抗体片段诸如F(ab)的一个显著缺点是，其血清持久性或半衰期差。向F(ab)片段加入Fc区造成类似完整mAb的药代动力学半衰期。通常F(ab)的半衰期通过在制备和纯化F(ab)后化学加入PEG部分到特定硫醇而延长。PEG化反应对产物的制备增加了显著的复杂性。PEG化化学反应必须对各F(ab)优化，并减少产率。PEG化还使最终产物分析复杂化，因为PEG化的材料具有不同分子量。
给抗体片段(如，F(ab))增加FcγRI、FcγRII和FcγRIII功能：抗体片段诸如F(ab)和PEG化的F(ab)缺少与FcγRI、FcγRII和FcγRIII相互作用的能力。在某些情况期望接合Fc受体。例如抗-CD20抗体依赖ADCC依赖性清除不想要的癌性B-细胞的Fc官能性。此外，在抗体交联受体将造成受体内在化的情形，一价F(ab)比二价mAb优选。如果药物效力取决于Fc依赖性ADCC清除机制，这种内在化可是不期望的。因此F(ab)片段连接于scFc本发明多肽代表最佳构建体，因为其实现期望的一价和Fcγ受体接合的特征。
ScFc分子允许产生异聚的Fc区。Fc区内的位点特异性突变已用于产生具有改进的Fc官能性的Fc-变体mAb。实例是增强对如，各种FcγRI、FcγRII和/或FcγRIII的亲和性的突变。本发明的单链Fc(scFc)分子可用于产生在仅一个Fc部分含有特定点突变或在scFc区两部分中含有不同的点突变组合的异聚的scFc区。一个实例将是表达在两个Fc部分中的仅一个含有Asn 297糖基化的scFc构建体。该分子显示略微降低的FcR亲和性，但对于FcγRIII结合无活性。
为了提供对说明书和权利要求的清楚理解，下面方便地提供以下定义。
I.定义
本文所用的术语“多肽”是指两个或多个天然氨基酸或非天然氨基酸的聚合物。
术语“氨基酸”包括丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(Ile或I)；亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；以及缬氨酸(Val或V)。非传统氨基酸也在本发明范围中，并包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，例如Ellman等人Meth.Enzym.202：301-336(1991)中描述的那些。为了制备这些非天然存在的氨基酸残基，可以使用例如Noren等人Science244：182(1989)和Ellman等人(同上引文)的方法。简言之，这些方法包括用非天然存在氨基酸残基化学活化抑制型tRNA之后体外转录和翻译该RNA。引入非传统氨基酸还可使用本领域已知的肽化学反应实现。本文所用的术语“极性氨基酸”包括具有净零电荷，但在其侧链的不同部分具有非零的部分电荷的氨基酸(如M、F、W、S、Y、N、Q、C)。这些氨基酸可参与疏水相互作用和静电相互作用。本文所用的术语“带电荷氨基酸”包括在其侧链上可具有非零的净电荷的氨基酸(如R、K、H、E、D)。这些氨基酸可参与疏水相互作用和静电相互作用。本文所用的术语“具有足够立体容积的氨基酸”包括具有占据较大3维空间的侧链的氨基酸。具有足够立体容积的侧链化学的示例性氨基酸包括酪氨酸、色氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和甲硫氨酸、或其类似物或模拟物。
″氨基酸取代″是指以第二、不同的″取代″氨基酸残基取代预确定的氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中至少一个现有的氨基酸残基。″氨基酸插入″是指添加至少一个另外的氨基酸到预确定的氨基酸序列中。尽管插入通常由插入一个或两个氨基酸残基构成，可进行本文的较大的″肽插入″，如插入约三至约五个或甚至达约十、十五或二十氨基酸残基。插入的残基可以是天然存在的或非天然存在的，如上所述的。″氨基酸缺失″是指从预确定的氨基酸序列除去至少一个氨基酸残基。
本文所用的术语“蛋白”是指多肽或包含多于一个多肽的组合物。因此，蛋白可为单体或多聚体。例如，在一个实施方案中，本发明的结合蛋白是二聚体。在一个实施方案中，本发明的二聚体是同二聚体，包含两个相同单体亚基或多肽(如，两个相同scFc多肽)。在另一个实施方案中，本发明的二聚体是异二聚体，包含两个不相同的单体亚基或多肽(如，两个不相同的scFc多肽)。二聚体的亚基可包含一条或多条多肽链(如，包含scFc分子的靶结合链)。例如，在一个实施方案中，该二聚体包含至少两条多肽链(如，至少两条scFc多肽链)。在一个实施方案中，该二聚体包含两条多肽链。在另一个实施方案中，该二聚体包含三条多肽链。在另一个实施方案中，该二聚体包含四条多肽链。
在某些优选实施方案中，本发明多肽是scFc多肽。本文所用的术语scFc多肽是指包含单链Fc(scFc)区的多肽。
在其它优选实施方案中，本发明多肽是结合多肽。本文所用的术语“结合多肽”是指包含至少一个特异性结合于靶分子(诸如抗原或结合伴侣)的靶结合位点或结合结构域的多肽。例如，在一个实施方案中，本发明结合多肽包含免疫球蛋白抗原结合位点或受体分子负责配体结合的部分或配体分子负责受体结合的部分。本发明结合多肽优选地还包含衍生自一个或多个免疫球蛋白(Ig)分子的至少两个Fc部分。例如，在优选的实施方案中，结合多肽是包含遗传融合的至少两个Fc部分的scFc多肽。在一个实施方案中，本发明结合多肽包含另外的修饰。示例性修饰在以下详述。例如，在某些优选实施方案中，本发明多肽可任选地包含遗传融合的Fc区(即，scFc区)的至少两个Fc部分之间的柔性多肽接头。在另一个实施方案中，结合多肽可被修饰以加入功能性部分(如，PEG、药物或标记)。
本发明结合多肽包含至少一个结合位点。在一个实施方案中，本发明结合多肽包含至少两个结合位点。在一个实施方案中，结合多肽包含两个结合位点。在另一个实施方案中，结合多肽包含三个结合位点。在另一个实施方案中，结合多肽包含四个结合位点。在一个实施方案中，结合位点彼此串联连接。在其它实施方案中，结合位点位于结合多肽的不同位置。例如，一个或多个结合位点可连接到遗传融合的Fc区(即，单链Fc(scFc)区)的一端或两端。
本文所用的术语“结合结构域”或“结合位点”指结合多肽中介导与靶分子(例如抗原、配体、受体、底物或抑制剂)的特异性结合的部分、区或位点。示例性结合结构域包括抗原结合位点、配体的受体结合结构域、受体的配体结合结构域或酶结构域。术语“配体结合结构域”在本文中指天然受体(例如细胞表面受体)或其保留了至少定性的配体结合能力以及优选地相应天然受体的生物学活性的区域或衍生物。术语“受体结合结构域”在本文中指天然配体或其保留了至少定性的受体结合能力以及优选地相应天然配体的生物学活性的区域或衍生物。在一个实施方案中，本发明结合多肽具有至少一个对靶向降低或消除的分子(例如细胞表面抗原或可溶性抗原)具有特异性的结合结构域。在优选实施方案中，结合结构域包含抗原结合位点或由抗原结合位点组成(如，包含置入可选构架区(如，任选地包含一个或多个氨基酸取代的人类构架区)的抗体的可变重链序列和可变轻链序列或六个CDR)。
术语“结合亲和性”在本文中包括结合相互作用的强度并由此包括实际的结合亲和性和表观结合亲和性。实际结合亲和性是结合速率与解离速率的比。因此，赋予或优化结合亲和性包括改变这些成分之一或两者以得到期望水平的结合亲和性。表观亲和性可以包括例如相互作用的亲和力。
术语“结合自由能”或“结合的自由能”在本文中包括其本领域公认的意义，并尤其应用于溶剂中结合位点-配体或Fc-FcR相互作用。结合自由能的降低将增强亲和性，而结合自由能的增加将降低亲和性。
术语“特异性”包括特异性结合(如，与其免疫反应)指定靶的可能结合位点数目。结合多肽可为单特异性的并包含特异性结合相同靶(如，相同表位)的一个或多个结合位点，或结合多肽可为多特异性的并包含特异性结合相同靶的不同区(如，不同表位)或不同靶的两个或多个结合位点。在一个实施方案中，可制备具有对多于一个靶分子(如，多于一个抗原或相同抗原上多于一个表位)的结合特异性的多特异性结合多肽(如，双特异性多肽)。在另一个实施方案中，多特异性结合多肽具有对靶向于减少或消除的分子特异性的至少一个结合结构域和对细胞上靶分子特异性的至少一个结合结构域。在另一个实施方案中，多特异性结合多肽具有对靶向于减少或消除的分子特异性的至少一个结合结构域和对药物特异性的至少一个结合结构域。在另一个实施方案中，该多特异性结合多肽具有对靶向于减少或消除的分子特异性的至少一个结合结构域和对前药特异性的至少一个结合结构域。在另一个实施方案中，多特异性结合多肽是四价抗体，具有对一个靶分子特异性的两个结合结构域和对第二靶分子特异性的两个结合位点。
本文所用的术语“价”是指结合多肽或蛋白中可能的结合结构域的数目。各结合结构域特异性结合一个靶分子。当结合多肽包含多于一个结合结构域时，各结合结构域可特异性结合相同或不同分子(如，可结合于不同配体或不同抗原、或相同抗原上的不同表位)。在一个实施方案中，本发明结合多肽是一价。在另一个实施方案中，本发明结合多肽是多价。在另一个实施方案中，本发明结合多肽是二价。在另一个实施方案中，本发明结合多肽是三价。在另一个实施方案中，本发明结合多肽是四价。
在某些方面，本发明结合多肽采用多肽接头。本文所用的术语“多肽接头”是指连接多肽链的线性氨基酸序列中的两个结构域的肽或多肽序列(如，合成的肽或多肽序列)。例如，多肽接头可用于连接结合位点到遗传融合的Fc区。优选地，这种多肽接头对多肽分子提供柔性。例如，在一个实施方案中，VH结构域或VL结构域经由多肽接头融合或连接于遗传融合的Fc区(即，scFc区)(多肽接头的N-或C-末端连接于遗传融合的Fc区的C-或N-末端，多肽接头的N-末端连接于VH或VL结构域的N-或C-末端)。
在某些实施方案中，多肽接头用于连接(如，遗传融合)两个Fc部分或结构域。这种多肽接头在本文也称为Fc连接多肽。本文所用的术语“Fc连接多肽”具体地指连接(如，遗传融合)两个Fc部分或结构域的连接多肽。
本发明结合分子可包含多于一个肽接头。
本文所用的术语“正确折叠的多肽”包括其中多肽包含的所有功能结构域都明确地有活性的多肽(如，本发明结合多肽)。本文所用的术语“不正确折叠的多肽”包括其中多肽的至少一个功能结构域不是活性的多肽。本文所用的“正确折叠的Fc多肽”或“正确折叠的Fc区”包含遗传融合的Fc区(即，scFc区)，其中至少两个组成性Fc部分正确折叠以使所得scFc区包含至少一个效应子功能。
多肽或氨基酸序列″衍生自″指定的多肽或蛋白是指多肽的来源。优选地，衍生自特定序列的多肽或氨基酸序列具有与该序列或其部分基本相同的氨基酸序列，其中该部分由至少10-20氨基酸、优选地至少20-30氨基酸、更优选地至少30-50氨基酸组成，或否则由于具有其序列来源而可被本领域技术人员鉴定。
衍生自另一肽的多肽可具有相对于起始多肽的一个或多个突变，如，一个或多个氨基酸残基被另一氨基酸残基取代，或具有一个或多个氨基酸残基插入或缺失。优选地，该多肽包含不是天然存在的氨基酸序列。这种变体必然与起始抗体具有少于100％的序列同一性或相似性。在优选的实施方案中，该变体的氨基酸序列与起始多肽的氨基酸序列例如在变体分子长度内有从约75％到少于100％的氨基酸序列同一性或相似性，更优选地从约80％到少于100％，更优选地从约85％到少于100％，更优选地从约90％到少于100％(如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)，最优选地从约95％到少于100％。在一个实施方案中，起始多肽序列和从其衍生的序列之间存在一个氨基酸差异。关于此序列的同一性或相似性在本文中定义为在序列比对和在必要时引入缺口以达到最大序列同一性百分数后，候选序列中与起始氨基酸残基相同的氨基酸残基(即，相同残基)的百分数。
优选的本发明结合多肽包含衍生自人类免疫球蛋白序列的氨基酸序列(如，至少一个Fc部分或结构域)。然而，多肽可包含来自另一哺乳动物物种的一个或多个氨基酸。例如，灵长类Fc结构域或结合位点可包括在本发明多肽中。可选地，一个或多个鼠氨基酸可存在于多肽中。优选的本发明多肽不是免疫原性的。
本领域技术人员还应理解的是，本发明结合多肽可被改变以使其氨基酸序列与其所衍生自的天然存在或天然多肽不同，但保持天然多肽的期望活性。例如，可进行在″″非必需″氨基酸残基造成保守取代或变化的核苷酸或氨基酸取代。通过引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失到免疫球蛋白(如，Fc结构域、部分或抗原结合位点)的核苷酸序列以使一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入到编码的蛋白中，可产生编码衍生自免疫球蛋白的结合多肽的非天然变体的分离的核酸分子。可通过标准技术引入突变，诸如定点诱变和PCR-介导的诱变。
本发明结合多肽可在一个或多个氨基酸残基包含保守氨基酸取代，如，在必需或非必需氨基酸残基。″保守氨基酸取代″是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已定义，包括碱性侧链(如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，结合多肽中的非必需氨基酸残基优选地被相同侧链家族的另一氨基酸残基代替。在另一个实施方案中，一串氨基酸可被结构相似、侧链家族成员顺序和/或组成不同的串代替。可选地，在另一个实施方案中，突变可随机地沿着编码序列全部或部分引入，诸如通过饱和诱变，所得的突变体可并入本发明结合多肽，并筛选其结合期望的靶的能力。
在多肽背景中，″线性序列″或″序列″是氨基酸在多肽中以氨基到羧基末端的方向的顺序，其中序列中彼此相邻的残基在多肽的初级结构中是连续的。
本文所用的术语“连接”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语指两个以上的元件或者组分通过任何方式(包括化学结合或重组方法)连接在一起。化学结合方法(如，使用异双官能交联剂)是本领域已知的。
本文所用的术语″遗传融合的″或“遗传融合”是指经由其单独肽构架共-线性、共价键合或连接两个或多个蛋白、多肽或其片段，通过遗传表达编码该蛋白、多肽或片段的单个多核苷酸分子。这种遗传融合导致表达单个连续遗传序列。优选的遗传融合符合读框，即，两个或多个可读框(ORF)以保持这些原始ORF的正确阅读框的方式融合以形成一个连续的更长ORF。因此，所得的重组融合蛋白是含有两个或多个蛋白区段的单个多肽，其中所述蛋白区段相应于原始ORF编码的多肽(这些区段在天然状态下正常不如此连接)。尽管由此制备的阅读框在整个融合遗传区段上是连续的，但是蛋白区段可能在物理上或者空间上由例如符合读框的多肽接头分隔开。
本文所用的术语“Fc区”应定义为天然免疫球蛋白中由其两个重链的各自Fc结构域(或Fc部分)形成的部分。天然Fc区是同二聚的。相反，本文所用的术语“遗传融合的Fc区”或“单链Fc区”(scFc区)是指包含在单个多肽链(即，在单个连续遗传序列中编码)中遗传连接的Fc结构域(或Fc部分)的合成的Fc区。因此，遗传融合的Fc区(即，scFc区)是单体。
本文所用的术语“Fc结构域”是指单个免疫球蛋白重链中开始于木瓜蛋白酶切割位点上游的铰链区(即IgG的残基216，重链恒定区的第一残基作为114)，并结束于抗体C-末端的部分。因此，完整Fc结构域包含至少铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。
本文所用的术语“Fc结构域部分”或“Fc部分”包含Fc结构域的氨基酸序列或衍生自Fc结构域。在某些实施方案中，Fc部分包含以下至少一个：铰链(如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、或其变体、部分或片段。在其它实施方案中，Fc部分包含完整Fc结构域(即，铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在一个实施方案中，Fc部分包含融合于CH3结构域(或其部分)的铰链结构域(或其部分)。在另一个实施方案中，Fc部分包含融合于CH3结构域(或其部分)的CH2结构域(或其部分)。在另一个实施方案中，Fc部分由CH3结构域或其部分组成。在另一个实施方案中，Fc部分由铰链结构域(或其部分)和CH3结构域(或其部分)组成。在另一个实施方案中，Fc部分由CH2结构域(或其部分)和CH3结构域组成。在另一个实施方案中，Fc部分由铰链结构域(或其部分)和CH2结构域(或其部分)组成。在一个实施方案中，Fc部分缺少至少部分的CH2结构域(如，全部或部分CH2结构域)。在一个实施方案中，本发明的Fc区(scFc区)包含Fc分子的至少本领域已知结合FcRn所需的部分。在另一个实施方案中，本发明的Fc区(scFc区)包含Fc分子的至少本领域已知结合FcγR所需的部分。在一个实施方案中，本发明的Fc区(scFc区)包含Fc分子的至少本领域已知结合蛋白A所需的部分。在一个实施方案中，本发明的Fc区(scFc区)包含Fc分子的至少本领域已知结合蛋白G所需的部分。
如本文所述的，本领域普通技术人员应理解的是任何Fc结构域可被修饰以使其氨基酸序列与天然存在免疫球蛋白分子的天然Fc结构域不同。在某些示例性实施方案中，该Fc部分保留效应子功能(如，FcγR结合)。
本发明多肽的Fc结构域或部分可衍生自不同免疫球蛋白分子。例如，多肽的Fc结构域或部分可包含衍生自IgG1分子的CH2和/或CH3结构域和衍生自IgG3分子的铰链区。在另一实例，Fc结构域或部分可包含部分地衍生自IgG1分子和部分地衍生自IgG3分子的嵌合铰链区。在另一实例，Fc结构域或部分可包含部分地衍生自IgG1分子和部分地衍生自IgG4分子的嵌合铰链。
本文所用的术语″免疫球蛋白″包括具有两个重链和两个轻链的组合的多肽，无论其是否具备任何相关的特异性免疫反应性。本文所用的术语″抗体″是指对目标抗原(如肿瘤相关抗原)具有显著的已知特异性免疫反应活性的这样的组件(如，完整抗体分子、抗体片段或其变体)。抗体和免疫球蛋白包含轻链和重链，在它们之间带有或不带有链间的共价键合。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构相对较好地理解。
如以下更详细地讨论的，通用术语“抗体”包括五类不同抗体，其可生化地区分。每类抗体的Fc部分明确地在本发明范围内，以下讨论将通常针对IgG类的免疫球蛋白分子。对于IgG，免疫球蛋白包含两个分子量大约23,000道尔顿的相同的多肽轻链，和两个分子量53,000-70,000的相同重链。四条链由二硫键以″Y″构型连接，其中轻链位于开始于″Y″口并持续经过可变结构域的重链的外侧。
免疫球蛋白的轻链分为kappa或lambda(κ、λ)。每类重链可与κ轻链或λ轻链结合。大体上，当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞、或遗传工程化的宿主细胞产生时，轻链和重链彼此共价结合，两个重链的″尾″部分通过共价二硫键或非共价键合而彼此结合。重链中，氨基酸序列从Y构型叉端的N-末端开始，到各链底部的C-末端。本领域技术人员将明了，重链分为γ、μ、α、δ或ε(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些亚类(如，γ1-γ4)。该链的性质决定抗体的″类″分别是IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等是充分表征的，并已知赋予功能特化。各种这些类和同种型的修饰版本是参考本公开内容的本领域技术人员易于辨别的，因此在本发明范围中。
轻链和重链两者分为结构和功能同源性的区。术语“区”是指单个免疫球蛋白(在术语“Fc区”的情形)或单个抗体链的组分或部分，并包括恒定区或可变区，以及所述结构域的更不连续的组分或部分。例如，轻链可变结构域包括散布在“构架区”或“FR”中的“互补决定区”或“CDR”，如本文定义的。
免疫球蛋白的某些区可定义为“恒定”(C)区或“可变”(V)区，基于在“恒定区”的情形下各类成员的区中相对缺少序列变化，或在“可变区”的情形下各类成员的区中显著变化。术语″恒定区″和″可变区″还可功能性地使用。在这方面，应理解免疫球蛋白或抗体的可变区决定抗原识别和特异性。相反，免疫球蛋白或抗体的恒定区赋予重要的效应子功能诸如分泌、经胎盘的流动性、Fc受体结合、补体结合和类似功能。各类免疫球蛋白的恒定区的亚基结构和三维构型是已知的。
免疫球蛋白重链和轻链的恒定区和可变区折叠为结构域。术语“结构域”是指重链或轻链多肽的独立地折叠的球形区，包含例如经由β-折叠片和/或链内二硫键稳定的肽环(如，包含3至4个肽环)。免疫球蛋白轻链上的恒定区结构域可互换地称为“轻链恒定区结构域”、“CL区”或“CL结构域”。重链上的恒定结构域(如铰链、CH1、CH2或CH3结构域)可互换地称为“重链恒定区结构域”、“CH”区结构域或“CH结构域”。轻链上的可变结构域可互换地称为“轻链可变区结构域”、“VL区结构域或“VL结构域”。重链上的可变结构域可互换地称为“重链可变区结构域”、“VH区结构域”或“VH结构域”。
按照惯例可变和恒定区结构域的编号随它们更远离免疫球蛋白或抗体的抗原结合位点或氨基-末端而增大。每个重和轻免疫球蛋白链的N-末端是可变区，C-末端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重和轻链的羧基-末端。因此，轻链免疫球蛋白的结构域以VL-CL方向排列，而重链的结构域以VH-CH1-铰链-CH2-CH3方向排列。
重链恒定区中的氨基酸位置，包括CH1、铰链、CH2和CH3结构域中的氨基酸位置，在本文中根据EU索引编号系统(参见Kabat等人，在“Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学重要蛋白的序列)”，U.S.Dept.Health and Human Services，第5版，1991)编号。相反，轻链恒定区(如CL结构域)中的氨基酸位置在本文中根据Kabat索引编号系统(参见Kabat等人，同前)编号。
根据Kabat索引编号系统，本文所用的术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语“VL结构域”包括免疫球蛋白轻链的氨基末端可变结构域。
本文所用的术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(最氨基末端)恒定区结构域，其例如从约EU位置118-215延伸。CH1结构域与免疫球蛋白重链分子的VH结构域和铰链区的氨基末端相邻，不形成免疫球蛋白重链Fc区的一部分。在一个实施方案中，本发明结合多肽包含衍生自免疫球蛋白重链分子(如，人类IgG1或IgG4分子)的CH1结构域。
如本文所用，术语“铰链区”包括重链分子中连接CH1结构域和CH2结构域的部分。该铰链区包含大约25个残基，并具有柔性，由此允许两个N端抗原结合区独立地移动。铰链区可以细分成三个不同结构域：上、中和下铰链结构域(Roux等人J.Immunol.1998，161：4083)。
如本文所用，术语“CH2结构域”包括重链免疫球蛋白分子中从例如从大约EU位置231-340延伸的部分。CH2结构域是独特的，因为其不与另一结构域紧密配对。相反地，两个N连接的分支糖链置于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。在一个实施方案中，本发明结合多肽包含衍生自IgG1分子(如人类IgG1分子)的CH2结构域。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含衍生自IgG4分子(如，人类IgG4分子)的CH2结构域。在示例性实施方案中，本发明多肽包含CH2结构域(EU位置231-340)或其部分。
如本文所用，术语“CH3结构域”包括重链免疫球蛋白分子中自CH2结构域的N端延伸大约110个残基的部分，例如大约位置341-至446b(EU编号系统)。CH3结构域典型地形成抗体的C端部分。然而，在一些免疫球蛋白中，可以从CH3结构域延伸出额外的结构域以形成该分子的C端部分(例如，IgM的μ链和IgE的ε链中的CH4结构域)。在一个实施方案中，本发明结合多肽包含衍生自IgG1分子(如，人类IgG1分子)的CH3结构域。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含衍生自IgG4分子(如，人类IgG4分子)的CH3结构域。
本文所用的术语“CL结构域”包括免疫球蛋白轻链的第一(最氨基末端)恒定区结构域，其延伸如从约Kabat位置107A-216。CL结构域与VL结构域相邻。在一个实施方案中，本发明结合多肽包含衍生自κ轻链(如，人类κ轻链)的CL结构域。
本文所用的术语“效应子功能”指Fc区或其部分结合免疫系统的蛋白质和/或细胞并介导各种生物学效应的功能性能力。效应子功能可以是抗原依赖性的或者抗原非依赖性的。效应子功能减少是指一个或多个效应子功能减少，而保持抗体可变区(或其片段)的抗原结合活性。效应子功能如Fc对Fc受体或补体蛋白的结合的增加或减少，可以倍数改变的方式表示(如，改变1倍、2倍等等)并可基于，如，使用本领域已知的测定确定的结合活性的改变百分比而计算。
本文所用的术语“抗原依赖性效应子功能”指正常在抗体结合相应抗原后诱导的效应子功能。典型的抗原依赖性效应子功能包括结合补体蛋白质(如C1q)的能力。例如，补体C1组分与Fc区的结合可以激活经典补体系统，导致调理作用和细胞病原体的裂解，该过程称作补体依赖性细胞毒性(CDCC)。补体的激活也刺激炎症反应，并还可能涉及自身免疫超敏反应。
其它抗原依赖性效应子功能由抗体通过其Fc区和细胞上的某些Fc受体(“FcR”)的结合所介导。有多种对不同抗体类型具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体或IgγR)、IgE(ε受体或IgεR)、IgA(α受体或IgαR)和IgM(μ受体或IgμR)。抗体与细胞表面上Fc受体的结合触发许多重要的不同生物学反应，包括免疫复合物的胞吞、抗体包被的颗粒或微生物的吞入和破坏(也称作抗体依赖性吞噬作用，或ADCP)、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包被的靶细胞的裂解(称作抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎性介质的释放、免疫系统细胞活化的调节、免疫球蛋白产生的胎盘转移和控制。
某些Fc受体，Fcγ受体(FcγR)，在取消或增强免疫募集方面扮演着关键角色。FcγR表达在白细胞上，由三个不同类型组成：FcγRI、FcγRII和FcγRIII(Gessner等人，Ann.Hematol.，(1998)，76：231-48)。结构上，这些FcγR均是免疫球蛋白超家族的成员，具有结合IgG的α链，该α链具有由两个或三个Ig样结构域组成的胞外部分。人类FcγRI(CD64)表达在人单核细胞上，表现出对单体IgG1、IgG3和IgG4的高亲和性结合(Ka＝108-109M-1)。人类FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)对IgG1和IgG3具有低亲和性(Ka＜107M-1)，并仅能够结合这些IgG同种型的复合形式或者多聚体形式。此外，FcγRII和FcγRIII类包含“A”和“B”两种形式。FcγRIIa(CD32a)和FcγRIIIa(CD16a)通过跨膜结构域结合在巨噬细胞、NK细胞和一些T细胞表面，而FcγRIIb(CD32b)和FcγRIIIb(CD16b)通过磷脂酰肌醇聚糖(GPI)锚选择性地结合在粒细胞(例如嗜中性粒细胞)的细胞表面。人类FcγRI、FcγRII和FcγRIII的相应鼠同系物是FcγRIIa、FcγRIIb/1和FcγRlo。
本文所用的术语“抗原非依赖性效应子功能”指无论抗体是否已结合其相应抗原均可以被抗体诱导的效应子功能。典型的抗原非依赖性效应子功能包括免疫球蛋白的细胞转运、循环半衰期和清除速率以及便于纯化。结构独特的Fc受体“新生Fc受体”或“FcRn”，也称作拯救受体(salvage receptor)，在调节半衰期和细胞转运方面具有关键作用。从微生物细胞纯化的其它Fc受体(如葡萄球菌蛋白A或G)能够以高亲和性结合Fc区并可用于促进含有Fc的多肽的纯化。
与属于免疫球蛋白超家族的FcγR不同，人类FcRn在结构上类似于I型主要组织相容性复合物(MHC)的多肽(Ghetie和Ward，Immunology Today，(1997)，18(12)：592-8)。FcRn典型地以异二聚体形式表达，该异二聚体由跨膜α链或重链与可溶性β链或轻链(β2微球蛋白)形成的复合物组成。FcRn与I型MHC分子有22-29％序列同一性，具有非功能性形式的MHC肽结合沟(Simister和Mostov，Nature，(1989)，337：184-7)。与MHC一样，FcRn的α链由三个胞外域(α1、α2、α3)组成，一个短的胞质尾将蛋白锚定在细胞表面。α1和α2结构域与抗体Fc区中的FcR结合位点相互作用(Raghavan等人，Immunity，(1994)，1：303-15)。FcRn在哺乳动物的母体胎盘或者卵黄囊中表达，并且参与IgG自母体向胎儿的转移。FcRn也在新生啮齿动物的小肠中表达，在此处FcRn参与母体IgG自摄入的初乳或乳跨刷状缘上皮的转移。FcRn也表达在许多物种的许多其它组织中，以及各种内皮细胞系中。其也在成人血管内皮、肌肉脉管系统和肝窦状隙(hepatic sinusoid)中表达。据认为FcRn通过结合IgG并将IgG回收至血清而在维持IgG的循环半衰期或血清水平中起额外作用。FcRn与IgG分子的结合是严格地pH依赖性的，在小于7.0的pH时具有最佳结合。
本文所用的术语“半衰期”指特定结合多肽在体内的生物学半衰期。半衰期可以通过从动物的循环和/或其它组织中清除掉施用给受治疗者的半数量所需要的时间来表示。在以时间函数的形式构建了给定的结合多肽的清除曲线时，曲线通常是双相的，具有快速的α相和较长的β相。α相典型地表示施用的Fc多肽在血管内间隙和血管外间隙之间的平衡，其部分地取决于多肽的大小。β相典型地表示结合多肽在血管内间隙中的代谢。因此，在优选的实施方案中，本文所用的术语“半衰期”指β相的结合多肽的半衰期。人类抗体在人类的典型β相半衰期是21天。
如上所示，抗体的可变区允许其选择性地识别并特异性结合抗原上的表位。即，抗体的VL结构域和VH结构域组合形成定义三维抗原结合位点的可变区(Fv)。四级抗体结构形成存在于Y各臂末端的抗原结合位点。更具体地，抗原结合位点由各重链和轻链可变区上的三个互补决定区(CDR)定义。
本文所用的术语“抗原结合位点”包括特异性结合(与之免疫反应)抗原诸如细胞表面或可溶抗原的位点。在一个实施方案中，结合位点包括免疫球蛋白重链和轻链可变区，且这些可变区形成的结合位点决定抗体的特异性。抗原结合位点由可变区形成，在多肽之间不同。在一个实施方案中，本发明结合多肽包含含有抗体分子(如，其序列是本领域已知的或本文所述的)的至少一个重或轻链CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含含有一个或多个抗体分子的至少两个CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含含有一个或多个抗体分子的至少三个CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含含有一个或多个抗体分子的至少四个CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含含有一个或多个抗体分子的至少五个CDR的抗原结合位点。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含含有抗体分子的六个CDR的抗原结合位点。可包括在本发明结合多肽中的包含至少一个CDR的示例性抗体分子是本领域已知的，示例性分子如本文所述。
本文所用的术语″CDR″或″互补决定区″是指见于重链和轻链多肽两者的可变区中的不连续抗原组合位点。这些具体区已描述于Kabat等人，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)和Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest.(免疫学重要蛋白的序列)(1991)，和Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)以及MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996)，其中该定义包括彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。列出包含如上引用的参考文献各自定义的CDR的氨基酸残基用于比较。优选地，术语“CDR”是基于序列比较如Kabat定义的CDR。
Figure G2008800247098D00291
1残基编号遵循Kabat等人(前述)的命名法
2残基编号遵循Chothia等人(前述)的命名法
3残基编号遵循MacCallum等人(前述)的命名法
本文所用的术语“构架区”或“FR区”包括是可变区部分但不是CDR(如，使用Kabat定义的CDR)部分的氨基酸残基。因此，可变区构架的长度是约100-120氨基酸但只包括CDR之外的那些氨基酸。对于重链可变区的具体实例和对于Kabat等人定义的CDR，构架区1对应含有氨基酸1-30的可变区结构域；构架区2对应含有氨基酸36-49的可变区结构域；构架区3对应含有氨基酸66-94的可变区结构域，构架区4对应氨基酸103到可变区末端的可变区结构域。轻链的构架区相似地被各轻链可变区CDR间隔。相似地，使用Chothia等人或McCallum等人对CDR的定义，构架区边界被如上所述的各自CDR末端间隔。在优选的实施方案中，CDR如由Kabat定义的。
在天然存在的抗体中，各单体抗体上存在的六个CDR是短的不连续的氨基酸序列，当抗体在水环境中呈现其三维构型时特异性地定位以形成抗原结合位点。重和轻可变结构域的其余部分的氨基酸序列显示较少的分子间变化性，称为构架区。构架区主要采用β-片层构象，CDR形成环，该环连接β-片层结构，并在一些情况形成β-片层结构的部分。因此，这些构架区作用为形成支架，通过链间非共价相互作用对六个CDR提供正确方向的定位。定位的CDR形成的抗原结合位点限定与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体对免疫反应性抗原表位的非共价结合。CDR的位置易于被本领域技术人员鉴定。
在某些实施方案中，本发明结合多肽包含至少两个抗原结合结构域(如，在相同结合多肽中(如，在单个多肽的N-和C-末端两者)或连接到本发明多聚结合蛋白的各组成结合多肽)，提供结合多肽与所选抗原的缔合。抗原结合结构域不必衍生自相同免疫球蛋白分子。在这方面，可变区可或可不衍生自可被诱导以引起体液应答并针对期望的抗原产生免疫球蛋白的任何类型动物。如此，可变区可为例如哺乳动物来源的，如，可为人类、鼠、非人类的灵长类(诸如猕猴、短尾猴等)、狼、骆驼科动物(如，骆驼、美洲驼和相关物种)。
术语“抗体变体”或“修饰的抗体”包括不是天然产生的抗体，因为如本文所述的至少一个氨基酸或氨基酸修饰具有不同于天然衍生的抗体的氨基酸序列或氨基酸侧链化学反应。本文所用的术语“抗体变体”包括合成形式的抗体，其被改变以使其不是天然存在的，如，包含至少两个重链部分但不是两个完整重链的抗体(诸如，结构域缺失的抗体或微型抗体)；多特异性形式的抗体(如，双特异性、三特异性、等)被改变以结合两个或多个不同抗原或结合单个抗原上的不同表位)；与scFv分子连接的重链分子；单链抗体；双链抗体；三链抗体；和具有改变的效应子功能的抗体，以及类似抗体。
本文所用的术语“scFv分子”包括由轻链可变结构域(VL)或其部分和重链可变结构域(VH)或其部分组成的结合分子，其中各可变结构域(或其部分)衍生自相同或不同抗体。scFv分子优选地包含介于VH结构域和VL结构域之间的scFv接头。ScFv分子是本领域已知的，并描述于如，美国专利第5,892,019号、Ho等人1989.Gene 77：51；Bird等人1988 Science 242：423；Pantoliano等人1991.Biochemistry 30：10117；Milenic等人1991.CancerResearch 51：6363；Takkinen等人1991.Protein Engineering 4：837。
本文所用的“scFv接头”是指介于scFv的VL和VH结构域之间的部分。scFv接头优选地保持scFv分子在抗原结合构象。在一个实施方案中，scFv接头包含scFv接头肽或由scFv接头肽组成。在某些实施方案中，scFv接头肽包含gly-ser多肽接头或由gly-ser多肽接头组成。在其它实施方案中，scFv接头包含二硫键。
本文所用的术语“gly-ser多肽接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性gly/ser多肽接头包含氨基酸序列(Gly4Ser)n。在一个实施方案中，n＝1。在一个实施方案中，n＝2。在另一个实施方案中，n＝3，即，(Gly4 Ser)3。在另一个实施方案中，n＝4，即，(Gly4 Ser)4。在另一个实施方案中，n＝5。在另一个实施方案中，n＝6。在另一个实施方案中，n＝7。在另一个实施方案中，n＝8。在另一个实施方案中，n＝9。在另一个实施方案中，n＝10。另一示例性gly/ser多肽接头包含氨基酸序列Ser(Gly4Ser)n。在一个实施方案中，n＝1。在一个实施方案中，n＝2。在优选的实施方案中，n＝3。在另一个实施方案中，n＝4。在另一个实施方案中，n＝5。在另一个实施方案中，n＝6。
本文所用的术语“蛋白稳定性”是指蛋白响应于环境条件(如升高的温度或降低的温度)保持一种或多种物理性质的领域公认的量度。在一个实施方案中，该物理性质是保持蛋白的共价结构(如不存在蛋白水解裂解、不想要的氧化或脱酰胺)。在另一个实施方案中，该物理性质是存在正确折叠状态的蛋白(如，不存在可溶或不溶的聚集体或沉淀)。
术语“糖基化”是指共价连接一个或多个糖类到多肽。通常，糖基化是翻译后事件，可发生在胞内、细胞周围或其提取物。术语糖基化包括，例如，N-连接的糖基化(其中一个或多个糖连接到天冬酰胺残基)和/或O-连接的糖基化(其中一个或多个糖连接到具有羟基基团的氨基酸残基(如，丝氨酸或苏氨酸)。
本文所用的术语“天然半胱氨酸”应指在多肽的特定氨基酸位置天然发生的半胱氨酸氨基酸，其还未被人工修饰、引入或改变。术语“工程化的半胱氨酸残基或其类似物”或“工程化的半胱氨酸或其类似物”应指非天然半胱氨酸残基或半胱氨酸类似物(如，含有硫醇的类似物诸如噻唑啉-4-羧酸和噻唑烷-4羧酸(硫代脯氨酸，Th))，其通过合成手段(如通过重组技术、体外肽合成、通过酶促或化学偶合肽或这些技术的一些组合)引入到多肽不天然包含半胱氨酸残基或其类似物的氨基酸位置。
本文所用的术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可与第二硫醇基形成二硫键或桥的硫醇基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区被天然二硫键连接，两个重链被对应于使用Kabat编号系统的位置239和242(EU编号系统的位置226或229)的两个天然二硫键连接。
本文所用的术语“结合的半胱氨酸”应指多肽中天然或工程化的半胱氨酸残基，其与相同或不同多肽中存在的第二天然或工程化的半胱氨酸或其它残基形成二硫键或其它共价键。“链内结合的半胱氨酸”应指共价结合于相同多肽中存在的第二半胱氨酸的结合的半胱氨酸(即链内二硫键)。“链间结合的半胱氨酸”应指共价结合于不同多肽中存在的第二半胱氨酸的结合的半胱氨酸(即链间二硫键)。
本文所用的术语“游离半胱氨酸”是指多肽序列中的天然或工程化的半胱氨酸氨基酸残基(和其类似物或模拟物，如噻唑啉-4-羧酸和噻唑烷-4羧酸(硫代脯氨酸，Th))，其以基本还原形式存在。游离半胱氨酸优选地能够被本发明效应子部分修饰。
术语“硫醇修饰剂”应指能够选择性地与结合多肽中工程化的半胱氨酸残基或其类似物(如，在结合多肽的多肽接头中)的硫醇基反应的化学剂，并从而提供将效应子部分位点特异性化学添加或交联于结合多肽的手段，从而形成修饰的结合多肽。优选地该硫醇修饰剂利用自由半胱氨酸残基中存在的硫醇或巯基官能团。示例性硫醇修饰剂包括马来酰亚胺、卤代烷和芳基卤、α-酰基卤和吡啶二硫化物。
术语“功能性部分”包括优选地向结合多肽添加期望功能的部分。优选地，添加功能而不显著改变多肽的内在期望活性，例如不显著地改变分子的抗原结合活性。本发明结合多肽可以包含一个或多个功能性部分，这些部分可以相同或不同。有用的功能性部分的例子包括但不限于效应子部分、亲和性部分和封闭部分。
示例性封闭部分包括，具有足以减少糖基化的立体容积和/或电荷的部分，例如，通过封闭糖苷酶使多肽糖基化的能力。封闭部分可另外地或可选地减少效应子功能，例如通过抑制Fc区结合受体或补体蛋白的能力。优选的封闭部分包括半胱氨酸加合物、胱氨酸、混合的二硫化物加合物和PEG部分。示例性可检测部分包括荧光部分、放射性同位素部分、不透射线部分(radiopaque moieties)和类似部分。
关于化学部分的结合，术语“连接部分”包括能够连接功能性部分与结合多肽其余部分的部分。可选择连接部分以使其可裂解或不可裂解。不可裂解的连接部分通常具有高的系统稳定性，但也可能具有不利的药代动力学。
术语“间隔子部分”是设计以引入间隔到分子中的非蛋白部分。在一个实施方案中，间隔子部分可为任选地取代的0至100原子的链，所述原子选自碳、氧、氮、硫等。在一个实施方案中，选择间隔子部分以使其可水溶。在另一个实施方案中，间隔子部分是聚(亚烷基)二醇，如，聚乙二醇或聚丙二醇。
术语“PEG化部分”或“PEG部分”包括聚(亚烷基)二醇化合物或其衍生物，其具有或不具有偶联剂或被偶联或活化部分衍生化(例如，使用硫醇基、三氟甲磺酸醋、三氟乙磺酸酯(tresylate)、氮杂环丙烷、氧杂环丙烷、或优选地具有马来酰亚胺部分，例如PEG-马来酰亚胺)。其它合适的聚(亚烷基)二醇化合物包括但不限于马来酰亚胺基一甲氧基PEG、活化的PEG聚丙二醇、以及带电荷的或中性的如下类型的聚合物：葡聚糖、多聚乙酰神经氨酸、或其它基于糖的聚合物、氨基酸的聚合物、及生物素衍生物。
本文所用的术语“效应子部分”(E)可包含具有生物或其它功能活性的诊断和治疗剂(如蛋白、核酸、脂质、药物部分和其片段)。例如，与未结合的多肽相比，包含结合于结合多肽的效应子部分的结合多肽具有至少一个另外的功能或性质。例如，细胞毒性药物部分(如，效应子部分)结合于结合多肽(如，经由其多肽接头)造成形成具有药物细胞毒性作为第二功能(即除了抗原结合以外)的修饰的多肽。在另一实例，第二结合多肽结合于第一结合多肽可赋予另外的结合性质。
一方面，其中效应子部分是遗传编码的治疗或诊断蛋白或核酸，效应子部分可合成或通过肽合成或重组DNA方法表达，这是本领域已知的。另一方面，其中效应子是非遗传编码的肽或药物部分，效应子部分可人工合成或从天然来源纯化。
本文所用的术语“药物部分”包括抗炎、抗癌、抗-感染(如，抗真菌、抗细菌、抗寄生虫、抗病毒等)和麻醉治疗剂。在进一步实施方案中，药物部分是抗癌或细胞毒性剂。相容的药物部分还可包含前药。
本文所用的术语“前药”是指药物活性剂的前体或衍生物形式，与母本药物相比活性较低、反应性较低或不易发生副作用，并能够酶促活化或以其它方式体内转变为更活性的形式。与本发明相容的前药包括但不限于，含有磷酸酯的前药、含有氨基酸的前药、含有硫代磷酸酯的前药、含有硫酸酯的前药、含有肽的前药、含有β-内酰胺的前药、任选地取代的含有苯氧基乙酰胺的前药或任选地取代的含有苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和可转变为细胞毒性更高的游离型药物的其它5-氟尿苷前药。本领域技术人员可对期望的药物部分或其前药进行化学修饰以使该化合物的反应更便于制备本发明修饰的结合蛋白的目的。药物部分还包括本文所述的药物部分的衍生物、药学可接受的盐、酯、酰胺和醚。衍生物包括对本文鉴定的药物的修饰，所述修饰可改进或不显著降低特定药物的期望的治疗活性。
本文所用的术语“抗癌剂”包括损害赘生性细胞或肿瘤细胞的生长和/或增殖并可以用于降低、抑制或破坏恶性肿瘤的药剂。此类药剂的例子包括但不限于细胞抑制剂、烷化剂、抗生素、细胞毒性核苷、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂及类似物。可以起到阻滞或减缓免疫反应性细胞或恶性细胞生长的作用的任何药剂均在本发明范围内。
“亲和性标签”或“亲和性部分”是连接于一个或多个结合多肽、多肽接头或效应子部分的化学部分以便在纯化过程中将其与其它组分分离。示例性亲和性结构域包括His标签、甲壳质结合结构域、麦芽糖结合结构域、生物素和类似结构域。
“亲和性树脂”是能够以高亲和性结合亲和性结构域以便将结合于亲和性结构域的蛋白与反应混合物的其它组分分离的化学表面。亲和性树脂可包被到固体支持物或其部分表面上。可选地，亲和性树脂可包含固体支持物。这种固体支持物可包括适当地修饰的层析柱、微滴定板、珠或生物芯片(如玻璃晶片)。示例性亲和性树脂包含镍、甲壳质、淀粉酶和类似物。
术语“载体”或“表达载体”在本文中用来指根据本发明用作将期望多核苷酸引入细胞并使该期望多核苷酸在细胞中表达的运载体的载体。本领域技术人员已知，该载体可以容易地选自：质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。一般地，与本发明相容的载体包含选择标记、适当的限制性位点以利于期望基因的克隆、以及进入真核或原核细胞并/或在其中复制的能力。
为了本发明的目的，可采用多种表达载体系统。例如，一类载体利用衍生自动物病毒诸如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。其它载体涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。示例性载体包括美国专利第6,159,730和6,413,777号、美国专利申请第2003 0157641 A1号中描述的载体。另外，已将DNA整合进染色体的细胞可通过引入一个或多个允许选择转染的宿主细胞的标记而选择。标记可提供对营养缺陷宿主的原养型、杀生物剂抗性(如，抗生素)或对重金属诸如铜的抗性。选择标记基因可直接连接于待表达的DNA序列，或可通过共转化引入同一细胞。在一个实施方案中，可使用诱导型表达系统。还可需要其它元件以最佳合成mRNA。这些元件可包括信号序列、剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。在一个实施方案中，分泌信号，如，多种确立的细菌前导肽的任一种(如，pelB、phoA或ompA)可符合读框地融合于本发明多肽N末端以获得多肽的最佳分泌。(Lei等人(1988)，Nature，331：543；Better等人(1988)Science，240：1041；Mullinax等人，(1990).PNAS，87：8095)。
术语“宿主细胞”指已被载体转化的细胞，其中所述载体利用重组DNA技术构建并编码至少一个异源基因。在描述从重组宿主分离蛋白的方法时，除非另行清楚规定，否则术语“细胞”和“细胞培养物”可以互换使用以指蛋白的来源。换言之，从“细胞”回收蛋白可以指从离心沉淀的完整细胞，或者从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物回收。用于蛋白表达的宿主细胞系最优选地是哺乳动物来源；本领域技术人员有能力优先确定最适于本文待表达的期望的基因产物的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于，DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR-)、HELA(人类宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人类淋巴细胞)和293(人类肾细胞)。CHO细胞是特别优选的。宿主细胞系通常可从商业机构、美国组织培养物保藏中心或公开文献获得。本发明多肽还可在非哺乳动物细胞诸如细菌或酵母或植物细胞表达。在这方面，应理解的是，各种单细胞非哺乳动物微生物诸如细菌也可被转化；即能够在培养物或发酵中生长的微生物。易于转化的细菌包括肠杆菌科的成员，诸如大肠杆菌或沙门氏菌的株系；芽孢杆菌科，诸如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌；链球菌、和流感嗜血杆菌。应进一步理解的是，当在细菌中表达时，多肽通常是包涵体的部分。多肽必须被分离、纯化，随后组装为功能分子。
除了原核生物，还可使用真核微生物。酿酒酵母或普通面包酵母是最常用的真核微生物，而多种其它株系通常也可获得，包括巴斯德毕赤酵母。对于在酵母中表达，通常使用质粒YRp7，例如(Stinchcomb等人，(1979)，Nature，282：39；Kingsman等人，(1979)，Gene，7：141；Tschemper等人，(1980)，Gene，10：157)。该质粒已包含TRP1基因，其为缺少在色氨酸中生长的能力的酵母突变株例如ATCC No.44076或PEP4-1提供选择标记(Jones，(1977)，Genetics，85：12)。作为酵母宿主细胞基因组特征，trpl损伤的存在则提供有效环境来通过在不存在色氨酸时生长检测转化。
体外生产允许放大规模以获得大量期望的本发明改变结合多肽。组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术是本领域已知的，并包括均一的悬浮培养，如在气升式反应器或连续搅拌反应器中，或固定或捕获的细胞培养，如在空心纤维、微囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷芯上。如果需要和/或期望，多肽溶液可通过常规层析方法纯化，例如凝胶过滤、离子交换层析、疏水相互作用层析(HIC)、DEAE-纤维素上的层析或亲合层析。
本文所用的″肿瘤相关抗原″指一般地与肿瘤细胞相关(即，与正常细胞相比，以相同或更大程度存在)的任何抗原。更一般地，肿瘤相关抗原包含提供在赘生性细胞定位免疫反应性抗体的任何抗原，不考虑其在非恶性细胞上的表达。该抗原可以是相对地肿瘤特异性的，其表达限制于恶性细胞表面。可选地，该抗原见于恶性细胞和非恶性细胞两者上。在某些实施方案中，本发明结合多肽优选地结合于肿瘤相关抗原。因此，本发明结合多肽可以来源于、产生自或形成自与肿瘤相关分子反应的多种抗体的任何一种。
如本文所用，术语“恶性肿瘤”指非良性的肿瘤或癌。本文所用的术语“癌’，包括以去调节的或失控的细胞生长为特征的恶性肿瘤。示例性癌包括：癌瘤、肉瘤、白血病和淋巴瘤。术语“癌”包括原发性恶性肿瘤(例如，其细胞尚未向受治疗者身体内非原始肿瘤所在地的位点迁移的恶性肿瘤)和继发性恶性肿瘤(例如，由肿瘤转移-肿瘤细胞向不同于原始肿瘤所在地的第二位点迁移-引起的恶性肿瘤)。
如本文所用，短语“将得益于结合多肽的施用的受治疗者”包括将从下述受益的受治疗者，例如哺乳动物受治疗者：用于例如检测本发明结合多肽所识别的抗原的结合多肽的施用(例如，用于诊断方法)和/或用结合多肽进行治疗以减少或消除结合多肽所识别的靶。例如，在一个实施方案中，受治疗者可以由可溶分子或颗粒分子(例如毒素或病原体)自循环或血清中的减少或清除而受益，或者由表达靶的细胞(例如肿瘤细胞)群体的减少或消除而受益。如上所述的，结合多肽可以以非结合形式使用，或者可以例如与药物、前药或同位素结合以形成修饰的结合多肽来施用于所述受治疗者。
II.包含单链Fc(“scFc”)区的结合多肽
在某些方面，本发明提供在单个多肽链中包含至少一个遗传融合的Fc区或其部分的结合多肽(即，包含单链Fc(scFc)区的结合多肽)。优选的本发明多肽在同一线性多肽链中包含至少两个Fc部分(如，2、3、4、5、6或更多Fc部分)或Fc部分。优选地，至少两个(更优选地所有)Fc部分能够折叠(如，分子内或分子间折叠)以形成至少一个赋予多肽效应子功能的功能scFc区。例如，在一个优选实施方案中，本发明结合多肽能够经由其scFc区结合于Fc受体(如FcRn、FcγR受体(如，FcγRIII)、或补体蛋白(如C1q))以激发免疫效应子功能(如，抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、或补体-依赖性细胞毒性(CDCC))。
在某些实施方案中，遗传融合的Fc区(即，scFc区)的至少两个Fc部分在连续线性氨基酸序列中彼此直接融合以使第一Fc部分的C-末端与第二Fc部分的N-末端之间没有介入的氨基酸或肽。然而在更优选的实施方案中，遗传融合的Fc区(即，scFc区)的至少两个Fc部分(更优选地所有)经由介于至少两个Fc部分之间的多肽接头(如，合成的接头)遗传融合。多肽接头确保至少两个Fc部分的最佳折叠、排列和/或并置以使scFc区能够以适当的亲和性结合Fc受体，从而激发效应子功能。例如，在某些实施方案遗传融合的Fc区(即，scFc区)能够分子内折叠(参见如，图1中的单体(“sc”)scFc构建体)，而在其它实施方案中，遗传融合的Fc区(即，scFc区)能够形成二聚的scFc构建体。在某些实施方案中，遗传融合的Fc区(即，scFc区)能够以至少10-7M(如，至少10-8M、至少10-9M、至少10-10M、至少10-11M或至少10-12M)的结合亲和性结合Fc受体。
在某些实施方案中，本发明多肽可包含含有序列组成相同或大致相同的的Fc部分的scFc区(本文称为“同聚的scFc区”)。在其它实施方案中，本发明多肽可包含含有序列组成不同的至少两个Fc部分的scFc区(即，本文称为“异聚的scFc区”)。在某些实施方案中，本发明结合多肽包含含有至少一个插入或氨基酸取代的scFc区。在一个示例性实施方案中，异聚的scFc区在第一Fc部分包含氨基酸取代(如，在EU位置297的天冬酰胺氨基酸取代)，但在第二Fc部分不包含。
在某些实施方案中，scFc区是半糖基化的。例如，异聚的scFc区可包含第一糖基化的Fc部分(如，糖基化的CH2区)和第二无糖基化的Fc部分(如，无糖基化的CH2区)，其中接头介于糖基化的Fc部分和无糖基化的Fc部分之间。在其它实施方案中，scFc区是完全糖基化的，即，所有Fc部分是糖基化的。在又进一步的实施方案中，scFc区可为无糖基化的，即，Fc部分都不是糖基化的。
本发明结合多肽可组装在一起或与其它多肽组装以形成多聚的结合多肽或蛋白(本文中也称为“多聚体”)。本发明多聚的结合多肽或蛋白包含至少一个本发明结合多肽。因此，本发明是指而不限于单体以及多聚的(如，二聚、三聚、四聚、和六聚)结合多肽或蛋白和类似物。在某些实施方案中，所述多聚体的组成结合多肽是相同的(即同聚的多聚体，如同二聚体、同三聚体、同四聚体)。在其它实施方案中，本发明多聚的蛋白的至少两个组成多肽不同(即异聚的多聚体，如异二聚体、异三聚体、异四聚体)。
在某些实施方案中，至少两个本发明结合多肽能够形成二聚体。例如，在某些实施方案结合多肽的遗传融合的Fc区(即，scFc区)保持未折叠，以使其组成性Fc部分不互相缔合，但与另一结合多肽中相应Fc部分缔合(参见如，图1B中二聚的(“dc”)scFc构建体)。
多种可选设计的结合多肽也在本发明范围中。例如，一个或多个结合位点可以多种方向融合于、连接于或并入(如，贴在其上)本发明scFc区。图11描绘这种scFc结合多肽的多种非限制性实例。在一个示例性实施方案中，本发明结合多肽包含融合于scFc区N-末端的结合位点(图11A)。在另一示例性实施方案中，结合多肽在scFc区的C-末端包含结合位点(图11B)。本发明结合多肽可在scFc区的C-末端和N-末端两者包含结合位点。在其他的实施方案中，本发明结合多肽可在scFc区的N-末端和/或C-末端域间区(如，第一N-末端的Fc部分(图11C)或第二C-末端的Fc部分(图11D)的CH2和CH3结构域之间)包含结合位点。可选地，结合位点可并入Fc部分的铰链和CH2结构域之间的域间区。在其它实施方案中，结合多肽可在scFc区的接头多肽中包含一个或多个结合位点(图11E)。
在又进一步的实施方案中，本发明的结合多肽包含引入scFc区的Fc部分的结合位点。例如，结合位点可贴入N-末端CH2结构域(图1F)、N-末端CH3结构域(图1G)、C-末端CH2结构域(图1H)、和/或C-末端CH3结构域(图1I)。在一个实施方案中，抗体的CDR环贴入scFc区的CH3结构域之一或两者。将CDR环和其它结合部分贴入Fc区的CH2和/或CH3结构域的方法公开于例如，国际PCT公布第WO 08/003116号，其以引用的方式并入本文。
本领域技术人员认识到，本发明scFc结合多肽可包含两个或多个结合位点(如，2、3、4或更多结合位点)，它们使用描述于图11A-I的方向的任意组合连接、融合、或整合(如，贴在其上)到本发明的scFc区。
A.Fc部分
用于产生本发明结合多肽的Fc部分可从许多不同来源获得。在优选的实施方案中，结合多肽的Fc部分衍生自人类免疫球蛋白。然而应理解，Fc部分可衍生自另一哺乳动物物种的免疫球蛋白，包括例如，啮齿类(如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人类的灵长类(如黑猩猩、短尾猴)物种。而且，结合多肽Fc结构域或其部分可衍生自任何免疫球蛋白类，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何免疫球蛋白同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在优选的实施方案中，使用人类同种型IgG1。
多种Fc部分基因序列(如人类恒定区基因序列)以公众可取得的保藏形式可获得。可选择包含Fc部分序列的恒定区结构域为具有特定效应子功能(或缺少特定效应子功能)或带有特定修饰以减少免疫原性。已公开了抗体和编码抗体的基因的许多序列，适当的Fc部分序列(如铰链、CH2、和/或CH3序列、或其部分)可使用领域公认技术衍生自这些序列。随后使用前述任一种方法可改变或合成获得的遗传材料以获得本发明多肽。应进一步理解，本发明的范围包括恒定区DNA序列的等位基因、变体和突变。
可如，使用聚合酶链式反应和被选择以扩增目标结构域的引物克隆Fc部分的序列。为了从抗体克隆Fc部分的序列，可从杂交瘤、脾、或淋巴细胞分离mRNA，逆转录为DNA，PCR扩增抗体基因。PCR扩增方法详细描述于美国专利第4,683,195；4,683,202；4,800,159；4,965,188号；以及如，“PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications(PCR方案：方法和应用指导)”Innis等人编辑，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Ho等人1989.Gene77：51；Horton等人1993.Methods Enzymol.217：270)。PCR可以通用恒定区引物开始或以基于公开的重和轻链DNA和氨基酸序列的更特异性引物开始。如上所述，PCR还可用于分离编码抗体轻和重链的DNA克隆。这种情况可通过通用引物或更大的同源探针诸如小鼠恒定区探针筛选文库。适于扩增抗体基因的许多引物组是本领域已知的(如，基于纯化的抗体的N-末端序列的5’引物(Benhar和Pastan.1994.Protein Engineering 7：1509)；快速扩增cDNA末端(Ruberti，F.等人1994.J.Immunol.Methods 173：33)；抗体前导序列(Larrick等人1989 Biochem.Biophys.Res.Commun.160：1250)。抗体序列的克隆进一步描述于Newman等人，1995年1月25日提交的美国专利第5,658,570号，其以引用的方式并入本文。
本发明结合多肽可包含两个或多个Fc部分(如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多Fc部分)。这些两个或多个Fc部分可形成Fc区。在一个实施方案中，Fc部分可为不同类型。在一个实施方案中，结合多肽中存在的至少一个Fc部分包含铰链结构域或其部分。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含至少一个包含至少一个CH2结构域或其部分的Fc部分。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含至少一个包含至少一个CH3结构域或其部分的Fc部分。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含至少一个包含至少一个CH4结构域或其部分的Fc部分。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含至少一个包含至少一个铰链结构域或其部分和至少一个CH2结构域或其部分(如，以铰链-CH2方向)的Fc部分。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含至少一个包含至少一个CH2结构域或其部分和至少一个CH3结构域或其部分(如，以CH2-CH3方向)的Fc部分。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含至少一个包含至少一个铰链结构域或其部分、至少一个CH2结构域或其部分、和至少一个CH3结构域或其部分，例如以铰链-CH2-CH3、铰链-CH3-CH2、或CH2-CH3-铰链的方向的Fc部分。
在某些实施方案中，结合多肽包含至少一个衍生自一个或多个免疫球蛋白重链的完整Fc区(如，包括铰链、CH2和CH3结构域的Fc结构域，尽管这些不必衍生自相同抗体)。在其它实施方案中，结合多肽包含至少两个衍生自一个或多个免疫球蛋白重链的完整Fc区。在优选的实施方案中，完整Fc部分衍生自人类IgG免疫球蛋白重链(如，人类IgG1)。
在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含至少一个包含完整CH3结构域(根据EU编号抗体Fc区的约氨基酸341-438)的Fc部分。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含至少一个包含完整CH2结构域(根据EU编号抗体Fc区的约氨基酸231-340)的Fc部分。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含至少一个包含至少CH3结构域和至少一个铰链区(根据EU编号抗体Fc区的约氨基酸216-230)、以及CH2结构域的Fc部分。在一个实施方案中，本发明结合多肽包含至少一个包含铰链和CH3结构域的Fc部分。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含至少一个包含铰链、CH2和CH3结构域的Fc部分。在优选的实施方案中，Fc部分衍生自人类IgG免疫球蛋白重链(如，人类IgG1)。
构成本发明结合多肽的Fc部分的恒定区结构域或其部分可衍生自不同免疫球蛋白分子。例如，本发明多肽可包含衍生自IgG1分子的CH2结构域或其部分和衍生自IgG3分子的CH3区或其部分。在另一实例，结合多肽可包含包含部分地衍生自IgG1分子和部分地衍生自IgG3分子的铰链结构域的Fc部分。如本文所述，本领域技术人员应理解的是，Fc部分可被改变以使其氨基酸序列不同于天然存在的抗体分子。
在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含包含一个或多个截短的，但足以赋予Fc区Fc受体(FcR)结合特性的Fc部分的scFc区。例如，结合于FcRn的Fc结构域部分(即，FcRn结合部分)包含IgG1的EU编号约氨基酸282-438。因此，本发明结合多肽的Fc部分可包含FcRn结合部分或由FcRn结合部分组成。FcRn结合部分可衍生自任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链。在一个实施方案中，使用来自人类同种型IgG1的抗体的FcRn结合部分。在另一个实施方案中，使用来自人类同种型IgG4的抗体的FcRn结合部分。
在一个实施方案中，本发明结合多肽缺少完整Fc区的一个或多个恒定区结构域，即，它们是部分或完全缺失的。在某些实施方案中，本发明结合多肽将缺少全部CH2结构域(ΔCH2构建体)。本领域技术人员将理解，由于CH2结构域对抗体代谢率的调节性质，这种构建体可为优选的。在某些实施方案中，本发明结合多肽包含衍生自编码IgG1人类恒定区结构域的载体(如，来自IDEC Pharmaceuticals，San Diego)的CH2结构域缺失的Fc区(参见如，WO 02/060955A2和WO02/096948A2)。该示例性载体被工程化以缺失CH2结构域并提供表达结构域-缺失的IgG1恒定区的合成的载体。应理解，这些示例性构建体优选地被工程化以将结合CH3结构域直接融合于各自Fc结构域的铰链区。
在其它构建体中可能期望提供一个或多个组成性Fc部分之间的肽间隔子。例如，肽间隔子可置于铰链区和CH2结构域之间和/或CH2和CH3结构域之间。例如，可表达相容的构建体，其中CH2结构域已被缺失，剩余的CH3结构域(合成的或非合成的)以5-20氨基酸肽间隔子连接于铰链区。可加入这种肽间隔子，例如，以确保恒定区结构域的调节元件保持自由和可接近，或铰链区保持柔性。优选地，与本发明相容的任何接头肽将是相对非免疫原性的，并不阻止正确折叠scFc区。
i)对Fc氨基酸的改变
在某些实施方案中，本发明结合多肽中采用的Fc部分是改变的，如，通过氨基酸突变(如，添加、缺失、或取代)。本文所用的术语“Fc部分变体”是指与Fc部分衍生自的野生型Fc相比具有至少一个氨基酸取代的Fc部分。例如，其中Fc部分衍生自人类IgG1抗体，与野生型氨基酸相比，变体在人类IgG1Fc区的相应位置包含至少一个氨基酸突变(如，取代)。
Fc变体的氨基酸取代可位于Fc部分中的位置，该位置被提及为对应于以抗体中Fc区提供的残基位置编号(如上述使用EU编号公约)。本领域技术人员可易于进行比对以确定对应于Fc部分中位置的是什么EU编号。
在一个实施方案中，Fc变体在位于铰链结构域或其部分的氨基酸位置包含取代。在另一个实施方案中，Fc变体在位于CH2结构域或其部分的氨基酸位置包含取代。在另一个实施方案中，Fc变体在位于CH3结构域或其部分的氨基酸位置包含取代。在另一个实施方案中，Fc变体在位于CH4结构域或其部分的氨基酸位置包含取代。
在某些实施方案中，本发明结合多肽包含包含多于一个氨基酸取代的Fc变体。本发明结合多肽可包含，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多氨基酸取代。优选地，氨基酸取代在空间上定位为彼此间隔至少1氨基酸位置或更多，例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10氨基酸位置或更多。更优选地，工程化的氨基酸在空间上定位为彼此间隔至少5、10、15、20或25氨基酸位置或更多。
在某些实施方案中，Fc变体赋予在包含所述野生型Fc结构域的Fc区赋予的至少一个效应子功能的改进(如，Fc区结合Fc受体(如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)或补体蛋白(如C1q)的能力、或激发抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、或补体-依赖性细胞毒性(CDCC)的能力上的改进)。在其它实施方案中，Fc变体提供工程化的半胱氨酸残基。
本发明结合多肽可采用已知赋予效应子功能和/或FcR结合的改进的领域公认的Fc变体。具体地，本发明结合分子可包括，例如，在以下公开的氨基酸位置的一个或多个的改变(如，取代)：国际PCT公布WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A 1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2和WO06/085967A2；美国专利公布第US2007/0231329、US2007/0231329、US2007/0237765、US2007/0237766、US2007/0237767、US2007/0243188、US20070248603、US20070286859、US20080057056号；或美国专利第5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；7,083,784；和7,317,091号，其各自以引用的方式并入本文。在一个实施方案中，在公开的氨基酸位置的一个或多个可进行特定改变(如，特定取代本领域公开的一个或多个氨基酸)。在另一个实施方案中，在公开的氨基酸位置的一个或多个可进行不同改变(如，不同取代本领域公开的一个或多个氨基酸位置)。
在优选的实施方案中，本发明结合多肽可包含在对应于Fc部分的“15埃接触区”中的EU氨基酸位置的氨基酸位置包含氨基酸取代的Fc部分变体。15埃接触区包括位于全长野生型Fc部分的EU位置243至261、275至280、282-293、302至319、336至348、367、369、372至389、391、393、408和424-440的残基。
在某些实施方案中，本发明结合多肽包含对Fc部分的氨基酸取代，这改变抗体的抗原-不依赖性效应子功能，尤其是抗体的循环半衰期。与缺少这些取代的结合多肽相比，这种结合多肽表现出对FcRn的结合增加或减少，并因此分别具有血清中增加的或减少的半衰期。预料对FcRn有改进的亲和性的Fc变体具有更长的血清半衰期，且这种分子在期望施用的多肽半衰期长的哺乳动物治疗方法中具有有用的应用，如，治疗慢性疾病或病症。相反，预料具有减少的FcRn结合亲和性的Fc变体具有短的半衰期，这种分子可用于例如，施用于短的循环时间可为有益的哺乳动物，如用于体内诊断成像或起始多肽长时间存在于循环中时具有毒副作用的情况。具有减少的FcRn结合亲和性的Fc变体也较不可能穿过胎盘，因此，可用于治疗孕妇的疾病或紊乱。此外，期望减少的FcRn结合亲和性的其它应用包括其中期望定位脑、肾和/或肝的那些应用。在一个示例性实施方案中，本发明结合多肽表现出从脉管系统跨肾小球上皮的转运减少。在另一个实施方案中，本发明结合多肽表现从脑跨血脑屏障(BBB)进入血管空间的转运减少。在一个实施方案中，具有改变的FcRn结合的结合多肽包含在Fc部分的“FcRn结合环”中具有一个或多个氨基酸取代的至少一个Fc部分(如，一个或两个Fc部分)。FcRn结合环包含野生型全长Fc部分的氨基酸残基280-299(根据EU编号)。在其它实施方案中，具有改变的FcRn结合亲和性的本发明结合多肽包含在
Figure G2008800247098D00441
FcRn“接触区”中具有一个或多个氨基酸取代的至少一个Fc部分(如，一个或两个Fc部分)。本文所用的术语
Figure G2008800247098D00442
FcRn“接触区”包括在野生型全长Fc部分的以下位置的残基：243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、393、408、424、425-440(EU编号)。在优选的实施方案中，具有改变的FcRn结合亲和性的本发明结合多肽包含在对应以下EU位置任何一个的氨基酸位置具有一个或多个氨基酸取代的至少一个Fc部分(如，一个或两个Fc部分)：256、277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(如，N434A或N434K)、和438。改变FcRn结合活性的示例性氨基酸取代公开于国际PCT公布第WO05/047327号，其以引用的方式并入本文。
在其它实施方案中，本发明结合多肽包含包含例如与野生型Fc区相比改变多肽的抗原-依赖性效应子功能(尤其是如ADCC或补体活化)的氨基酸取代的Fc变体。在示例性实施方案中，所述结合多肽表现对Fcγ受体(如，CD16)改变的结合。当与野生型多肽相比时，这种结合多肽表现对FcRγ的结合增加或减少，并因此分别介导增强的或减少的效应子功能。预料对FcγR具有增强的亲和性的Fc变体将增强效应子功能，且这种分子在期望破坏靶分子的哺乳动物治疗方法中具有有用的应用，如肿瘤治疗。相反，预期具有减少的FcγR结合亲和性的Fc变体将减少效应子功能，这种分子也可用于例如治疗其中不期望破坏靶细胞的情况，如，当正常细胞可表达靶分子，或当长期施用多肽可能造成不想要的免疫系统活化。在一个实施方案中，与包含野生型Fc区的多肽相比，包含scFc的多肽表现至少一种改变的抗原-依赖性效应子功能，所述功能选自调理作用、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性、抗原-依赖性细胞毒性(ADCC)、或效应子细胞调节组成的组。在一个实施方案中，结合多肽表现对活化FcγR(如FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)改变的结合。在另一个实施方案中，结合多肽表现对抑制性FcγR(如FcγRIIb)改变的结合亲和性。在其它实施方案中，具有增加的FcγR结合亲和性(如增加的FcγRIIIa结合亲和性)的本发明结合多肽包含在对应于一个或多个以下位置的氨基酸位置具有氨基酸取代的至少一个Fc部分(如，一个或两个Fc部分)：239、268、298、332、334和378(EU编号)。在其它实施方案中，具有减少的FcγR结合亲和性(如减少的FcγRI、FcγRII或FcγRIIIa结合亲和性)的本发明结合多肽包含在对应于一个或多个以下位置的氨基酸位置具有氨基酸取代的至少一个Fc部分(如，一个或两个Fc部分)：234、236、239、241、251、252、261、265、268、293、294、296、298、299、301、326、328、332、334、338、376、378和435(EU编号)。在其它实施方案中，具有增加的补体结合亲和性(如增加的C1q结合亲和性)的本发明结合多肽包含在对应于一个或多个以下位置的氨基酸位置具有氨基酸取代的Fc部分(如，一个或两个Fc部分)：251、334、378和435(EU编号)。在其它实施方案中，具有减少的补体结合亲和性(如减少的C1q结合亲和性)的本发明结合多肽包含在对应于一个或多个以下位置的氨基酸位置具有氨基酸取代的Fc部分(如，一个或两个Fc部分)：239、294、296、301、328、333和376(EU编号)。改变FcγR或补体结合活性的示例性氨基酸取代公开于国际PCT公布第WO05/063815号，其以引用的方式并入本文。在某些优选实施方案中，本发明结合多肽可包含一个或多个以下特定取代：S239D、S239E、M252T、H268D、H268E、I332D、I332E、N434A和N434K(即，在对应于抗体Fc区中一个或多个这些EU编号位置的氨基酸位置的一个或多个这些取代)。
本发明结合多肽还可包含改变结合多肽的糖基化的氨基酸取代。例如，结合多肽的scFc区可包含具有造成减少的糖基化(如，N-或O-连接的糖基化)的突变的Fc部分，或可包含野生型Fc部分的改变的糖形(如，低岩藻糖或无岩藻糖的聚糖)。在示例性实施方案中，Fc部分包含N-连接的聚糖减少的糖基化，通常见于氨基酸位置297(EU编号)。在另一示例性实施方案中，Fc部分在氨基酸位置297(EU编号)包含低岩藻糖或无岩藻糖的聚糖。在另一个实施方案中，结合多肽具有或靠近糖基化基序或糖基化基序中的氨基酸取代，例如，包含氨基酸序列NXT或NXS的N-连接的糖基化基序。在特定实施方案中，结合多肽在对应于Fc的299的氨基酸位置(EU编号)包含氨基酸取代。减少或改变糖基化的示例性氨基酸取代公开于国际PCT公布第WO05/018572号和美国专利公布第2007/0111281号，其以引用的方式并入本文。
在其它实施方案中，本发明结合多肽包含具有位于溶剂暴露表面的工程化的半胱氨酸残基或其类似物的至少一个Fc部分。优选地工程化的半胱氨酸残基或类似物不干扰scFc区赋予的效应子功能。更优选地，该改变不干扰scFc区结合Fc受体(如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)或补体蛋白(如C1q)、或激发免疫效应子功能(如，抗体-依赖性细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、或补体-依赖性细胞毒性(CDCC))的能力。在优选的实施方案中，本发明结合多肽包含包含至少一个工程化的自由半胱氨酸残基或其类似物的Fc部分，该工程化的自由半胱氨酸残基或其类似物基本上不与第二半胱氨酸残基成二硫键。在优选的实施方案中，本发明结合多肽可包含在CH3结构域的一个或多个以下位置具有工程化的半胱氨酸残基或其类似物的Fc部分：349-371、390、392、394-423、441-446和446b(EU编号)。在更优选的实施方案中，本发明结合多肽包含在以下任一位置具有工程化的半胱氨酸残基或其类似物的Fc变体：350、355、359、360、361、389、413、415、418、422、441、443和EU位置446b(EU编号)。任何上述工程化的半胱氨酸残基或其类似物随后可使用领域公认的技术(如，以硫醇-反应性异双官能接头结合)结合于功能性部分。
在一个实施方案中，本发明结合多肽可包含具有两个或多个独立选自本文所述的Fc部分的组成性Fc部分的遗传融合的Fc区(即，scFc区)。在一个实施方案中，Fc部分相同。在另一个实施方案中，至少两个Fc部分不同。例如，本发明结合多肽的Fc部分包含相同数目的氨基酸残基或其可长度可相差一个或多个氨基酸残基(如，约5个氨基酸残基(如，1、2、3、4或5个氨基酸残基)、约10个残基、约15个残基、约20个残基、约30个残基、约40个残基或约50个残基)。在其他的实施方案中，本发明结合多肽的Fc部分的序列可在一个或多个氨基酸位置不同。例如，至少两个Fc部分可在约5个氨基酸位置(如，1、2、3、4或5个氨基酸位置)、约10个位置、约15个位置、约20个位置、约30个位置、约40个位置或约50个位置)不同。
B.多肽接头
在某些方面，期望采用多肽接头来遗传融合本发明结合多肽scFc区的两个或多个Fc结构域或部分。这种多肽接头本文称为“Fc连接多肽”。在一个实施方案中，多肽接头是合成的。关于多肽接头本文所用的术语“合成的”包括肽(或多肽)，其包含在线性氨基酸序列中连接于自然界中不天然连接的序列(可天然存在或不存在)(如，Fc部分序列)的氨基酸序列(可天然存在或不存在)。例如，所述多肽接头可包含非天然存在的多肽，其是天然存在多肽的修饰的形式(如，包含突变诸如添加、取代或缺失)或包含第一氨基酸序列(可天然存在或不存在)。可采用本发明的多肽接头，例如，以确保遗传融合的Fc区(即，scFc区)的Fc部分或结构域并置以确保功能性scFc区的正确折叠和形成。优选地，与本发明相容的多肽接头将是相对非免疫原性的，不抑制结合蛋白的单体亚基之间的任何非共价缔合。
在某些实施方案中，本发明结合多肽采用多肽接头以在单个多肽链中符合读框地连接任何两个或多个Fc部分或结构域。在一个实施方案中，两个或多个Fc部分或结构域可独立地选自前述段落A中讨论的任何Fc部分。例如，在某些实施方案中，多肽接头可用于融合相同Fc部分，从而形成同聚的scFc区。在其它实施方案中，多肽接头可用于融合不同Fc部分(如野生型Fc部分和Fc部分变体)，从而形成异聚的scFc区。在其它实施方案中，本发明的多肽接头可用于将第一Fc部分(如铰链结构域或其部分、CH2结构域或其部分、完整CH3结构域或其部分、FcRn结合部分、FcγR结合部分、补体结合部分、或其部分)的C-末端遗传融合于第二Fc部分(如，完整Fc结构域)的N-末端。
在一个实施方案中，合成的多肽接头包含Fc部分的部分。例如，在一个实施方案中，多肽接头可包含IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4抗体的免疫球蛋白铰链结构域。在另一个实施方案中，多肽接头可包含IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4抗体的CH2结构域。在其它实施方案中，多肽接头可包含IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4抗体的CH3结构域。还可使用免疫球蛋白(如人类免疫球蛋白)的其它部分。例如，多肽接头可包含CH1结构域或其部分、CL结构域或其部分、VH结构域或其部分、或VL结构域或其部分。所述部分可衍生自任何免疫球蛋白，包括例如IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4抗体。
在示例性实施方案中，多肽接头可包含至少部分的免疫球蛋白铰链区。在一个实施方案中，多肽接头包含上部铰链结构域(如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4上部铰链结构域)。在另一个实施方案中，多肽接头包含中部铰链结构域(如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中部铰链结构域)。在另一个实施方案中，多肽接头包含下部铰链结构域(如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4下部铰链结构域)。示例性铰链结构域部分列在下表1。此外，可采用这些示例性铰链的任何亚-部分(如，IgG3中部区的重复部分(即，EPKSCDTPPPCPRCP)。
表1：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4铰链结构域
在其它实施方案中，可构建组合衍生自相同或不同抗体同种型的铰链元件的多肽接头。在一个实施方案中，多肽接头包含包含至少部分的IgG1铰链区和至少部分的IgG2铰链区的嵌合铰链。在一个实施方案中，多肽接头包含包含至少部分的IgG1铰链区和至少部分的IgG3铰链区的嵌合铰链。在另一个实施方案中，多肽接头包含包含至少部分的IgG1铰链区和至少的部分IgG4铰链区的嵌合铰链。在一个实施方案中，多肽接头包含包含至少的部分IgG2铰链区和至少的部分IgG3铰链区的嵌合铰链。在一个实施方案中，多肽接头包含包含至少部分的IgG2铰链区和至少部分的IgG4铰链区的嵌合铰链。在一个实施方案中，多肽接头包含包含至少部分的IgG1铰链区、至少部分的IgG2铰链区和至少部分的IgG4铰链区的嵌合铰链。在另一个实施方案中，多肽接头可包含IgG1上部和中部铰链和单个IgG3中部铰链重复基序。在另一个实施方案中，多肽接头可包含IgG4上部铰链、IgG1中部铰链和IgG2下部铰链。
在另一个实施方案中，多肽接头包含gly-ser接头或由gly-ser接头组成。本文所用的术语“gly-ser接头”是指一种由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性gly/ser接头包含式(Gly4Ser)n的氨基酸序列，其中n是正整数(如，1、2、3、4或5)。优选的gly/ser接头是(Gly4Ser)4。另一优选的gly/ser接头是(Gly4Ser)3。另一示例性gly-ser接头是GGGSSGGGSG(SEQ ID NO：24)。在某些实施方案中，所述gly-ser接头可插入多肽接头(如，本文所述的任何多肽接头序列)的两个其它序列之间。在其它实施方案中，gly-ser接头连接在多肽接头(如，本文所述的任何多肽接头序列)的另一序列的一端或两端。在其他的实施方案中，两个或多个gly-ser接头连续地并入多肽接头。在一个实施方案中，本发明的多肽接头包含至少部分的上部铰链区(如，衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子)、至少部分的中部铰链区(如，衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4分子)和一连串gly/ser氨基酸残基(如，gly/ser接头诸如(Gly4Ser)n)。
在另一个实施方案中，多肽接头包含诸如WO 02/060955所述的氨基酸序列。在另一个实施方案中，多肽接头包含氨基酸序列IGKTISKKAK。另一示例性多肽接头包含序列(G4S)4GGGAS。
特别优选的多肽接头包含氨基酸序列SLSLSPGGGGGSEPKSS。另一优选的多肽接头包含人类IgG1铰链序列，如，DKTHTCPPCPAPELLGG。另一优选的多肽接头包含两者的序列。
在一个实施方案中，本发明的多肽接头包含非天然存在的免疫球蛋白铰链区结构域，如，不是天然见于包含该铰链区结构域的多肽的铰链区结构域和/或已被改变以使其氨基酸序列不同于天然存在的免疫球蛋白铰链区结构域的铰链区结构域。在一个实施方案中，可对铰链区结构域突变以制备本发明的多肽接头。在一个实施方案中，本发明的多肽接头包含不包含天然存在数目的半胱氨酸的铰链结构域，即，多肽接头包含比天然存在的铰链分子更少的半胱氨酸或更多数目的半胱氨酸。在本发明一个实施方案中，多肽接头包含在对应于氨基酸位置230(EU编号系统)的氨基酸位置包含脯氨酸残基的铰链区结构域。在一个实施方案中，多肽接头在对应于位置231(EU编号系统)的氨基酸位置包含丙氨酸残基。在另一个实施方案中，本发明的多肽接头在对应于位置232(EU编号系统)的氨基酸位置包含脯氨酸残基。在一个实施方案中，多肽接头在对应于位置226(EU编号系统)的氨基酸位置包含半胱氨酸残基。在一个实施方案中，多肽接头在对应于位置226(EU编号系统)的氨基酸位置包含丝氨酸残基。在一个实施方案中，多肽接头在对应于位置229(EU编号系统)的氨基酸位置包含半胱氨酸残基。在一个实施方案中，多肽接头在对应于位置229(EU编号系统)的氨基酸位置包含丝氨酸残基。
在其它实施方案中，本发明的多肽接头包含生物相关的肽序列或其序列部分。例如，生物相关的肽序列可包括但不限于衍生自抗排斥肽或抗炎肽的序列。所述抗排斥肽或抗炎肽可选自细胞因子抑制肽、细胞粘着抑制肽、凝血酶抑制肽和血小板抑制肽组成的组。在一个优选实施方案中，多肽接头包含选自IL-1抑制或拮抗剂肽序列、促红细胞生成素(EPO)-模拟肽序列、促血小板生成素(TPO)-模拟肽序列、G-CSF模拟肽序列、TNF-拮抗剂肽序列、整联蛋白-结合肽序列、选择蛋白拮抗剂肽序列、抗-病原肽序列、血管活性肠肽(VIP)模拟肽序列、钙调蛋白拮抗剂肽序列、巨细胞拮抗剂、SH3拮抗剂肽序列、尿激酶受体(UKR)拮抗剂肽序列、生长激素抑制素或皮质抑素模拟肽序列、巨噬细胞和/或T-细胞抑制肽序列组成的组的肽序列。任何一种可采用作为多肽接头的示例性肽序列公开于美国专利第6,660,843号，其以引用的方式并入本文。
在其它实施方案中，多肽接头包含一个或多个任何一个下述结合位点(如，Fab、scFv分子、配体的受体结合部分、受体的配体结合部分等)。
应理解，通过引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失到编码多肽接头的核苷酸序列以使一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入多肽接头，可产生这些示例性多肽接头的变体形式。例如，可通过标准技术，诸如定点诱变和PCR-介导的诱变引入突变。″保守氨基酸取代″是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域定义，包括碱性侧链(如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-支链侧链(如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基优选地被相同侧链家族的另一氨基酸残基代替。在另一个实施方案中，一串氨基酸可被结构相似的而侧链家族成员的顺序和/或组成不同的一串氨基酸代替。
本发明的多肽接头的长度为至少一个氨基酸并可有不同长度。在一个实施方案中，本发明的多肽接头的长度是从约1至约50氨基酸。在该上下文中所用的术语约表示+/-两个氨基酸残基。因为接头长度必须是正整数，长度为从约1至约50氨基酸的长度，是指长度从1至48-52氨基酸的长度。在另一个实施方案中，本发明的多肽接头的长度是从约10-20氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的多肽接头的长度是从约15至约50氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的多肽接头的长度是从约20至约45氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的多肽接头的长度是从约15至约25氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的多肽接头的长度是从约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50或60氨基酸。
可使用本领域已知的技术引入多肽接头到多肽序列。修饰可由DNA序列分析证实。质粒DNA可用于转化宿主细胞用于稳定地产生所产生的多肽。
C.靶结合位点
在某些方面，本发明结合多肽包含至少一个靶结合位点。因此，本发明结合多肽通常包含至少一个结合位点和至少一个遗传融合的Fc区(即，scFc区)。
在一个实施方案中，结合位点可操作地连接(如，化学结合或遗传融合(如，直接或经由多肽接头))于遗传融合的Fc区的N-末端。在另一个实施方案中，结合位点可操作地连接(如，化学结合或遗传融合(如，直接或经由多肽接头))于遗传融合的Fc区的C-末端。在其它实施方案中，结合位点是经由遗传融合的Fc区的氨基酸侧链可操作地连接的(如，化学结合或遗传融合的(如，直接或经由多肽接头))。在某些示例性实施方案中，结合位点经由人类免疫球蛋白铰链结构域或其部分(如，人类IgG1序列，如，DKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ ID NO：81))融合于遗传融合的Fc区(即，scFc区)。
在某些实施方案中，本发明结合多肽包含两个结合位点和至少一个遗传融合的Fc区。例如，结合位点可以可操作地连接于单个遗传融合的Fc区的N-末端和C-末端两者。在其它示例性实施方案中，结合位点可以可操作地连接于多个遗传融合的Fc区(如，两个、三个、四个、五个或更多scFc区)的N-和C-末端两者，所述多个遗传融合的Fc区串联连接在一起以形成遗传融合的Fc区的串联队列。
在其它实施方案中，两个或多个结合位点彼此串联连接(如，经由多肽接头)，结合位点的串联队列可操作地连接(如，化学结合或遗传融合(如，直接或经由多肽接头))于单个遗传融合的Fc区(即，单个scFc区)或遗传融合的Fc区串联队列(即，串联scFc区)的C-末端或N-末端。在其它实施方案中，结合位点串联队列可操作地连接于单个遗传融合的Fc区或遗传融合的Fc区串联队列的C-末端和N-末端两者。
在其它实施方案中，本发明结合多肽是三价结合多肽，包含三个结合位点。示例性三价本发明结合多肽是双特异性或三特异性。例如，三价结合多肽可对一种特异性是二价(即，具有两个结合位点)，对第二特异性是一价。
在其他的实施方案中，本发明结合多肽是四价结合多肽，包含四个结合位点。示例性四价本发明结合多肽是双特异性。例如，四价结合多肽可对每种特异性是二价(即，具有两个结合位点)。
如上所述，在其它实施方案中，一个或多个结合位点可插入遗传融合的Fc区(即，scFc区)的两个Fc部分之间。例如，一个或多个结合位点可形成全部或部分的本发明结合多肽接头。
优选的本发明结合多肽包含至少一个抗原结合位点(如，抗体的抗原结合位点、抗体变体或抗体片段)、配体的受体结合部分、或受体的配体结合部分。
在其它实施方案中，本发明结合多肽包含至少一个包含一个或多个任何一种前述生物相关肽的结合位点。
在某些实施方案中，本发明结合多肽具有至少一个对介导生物效应的靶分子特异性的结合位点。在一个实施方案中，结合位点调节细胞活化或抑制(如，通过结合细胞表面受体并造成传输活化或抑制信号)。在一个实施方案中，结合位点能够起始信号转导，这造成细胞死亡(如，通过细胞信号诱导的途径，通过补体固定或暴露于结合分子上存在的有效载荷(如，毒性有效载荷))，或调节受治疗者的疾病或病症(如，通过介导或促进细胞杀伤，通过促进裂解纤维蛋白块或促进血块形成，或通过调节生物可获得的物质的量(如，通过增强或减少受治疗者中配体诸如TNFα的量))。在另一个实施方案中，本发明结合多肽具有至少一个对靶向为减少或消除的抗原特异性的结合位点，如，细胞表面抗原或可溶抗原，并具有至少一个遗传融合的Fc区(即，scFc区)。
在另一个实施方案中，本发明结合多肽结合靶分子(如抗原)造成如从组织或从循环减少或消除靶分子。在另一个实施方案中，结合多肽具有至少一个对靶分子特异性的结合位点，这可用于检测靶分子的存在(如，以检测污染物或诊断病症或紊乱)。在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含至少一个将该分子靶向受治疗者中的特定部位(如，肿瘤细胞、免疫细胞或血块)的结合位点。
在某些实施方案中，本发明结合多肽可包含两个或多个结合位点。在一个实施方案中，这些结合位点相同。在另一个实施方案中，这些结合位点不同。
在其它实施方案中，本发明结合多肽可组装在一起或与其它多肽组装以形成具有两个或多个多肽的结合蛋白(“结合蛋白”或“多聚体”)，其中多聚体的至少一个多肽是本发明结合多肽。示例性多聚的形式包括二聚的、三聚的、四聚的、和六聚的改变的结合蛋白和类似物。在一个实施方案中，结合蛋白的多肽相同(即同聚的改变的结合蛋白，如同二聚体、同四聚体)。在另一个实施方案中，结合蛋白的多肽不同(如异聚的)。
i.抗原结合位点
(a)抗体
在某些实施方案中，本发明结合多肽包含抗体的至少一个抗原结合位点。本发明结合多肽可包含使用领域公认方案衍生自抗体的可变区或其部分(如VL和/或VH结构域)。例如，可变结构域可衍生自非人类的哺乳动物如，鼠、豚鼠、灵长类、兔或大鼠中产生的抗体，通过以抗原或其片段免疫该哺乳动物。参见前述的Harlow & Lane，为所有目的通过引用并入。可通过多次皮下或腹膜内注射相关抗原(如，纯化的肿瘤相关抗原或细胞或包含这种抗原的细胞提取物)和佐剂产生免疫球蛋白。这种免疫通常引发免疫应答，包括从活化的脾细胞或淋巴细胞产生抗原-反应性抗体。
尽管可变区可衍生自从免疫的哺乳动物血清中收获的多克隆抗体，但常常期望从脾、淋巴结或外周血中分离单独淋巴细胞以提供同质的单克隆抗体(MAb)制品，从其衍生期望的可变区。通常使用兔或豚鼠制备多克隆抗体。小鼠通常用于制备单克隆抗体。单克隆抗体可以针对片段、通过将抗原片段注射入小鼠中、制备“杂交瘤”和筛选杂交瘤获得特异地结合抗原的抗体以制备。在此熟知的方法(Kohler等人，(1975)，Nature，256：495)中，将来自注射了抗原的小鼠的相对短寿命的或必死的淋巴细胞与永生的肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，由此产生永生的且能够产生B细胞遗传编码的抗体的杂交细胞或“杂交瘤”。通过选择、稀释、和重新培养含有形成单一抗体的特异基因的各单个株，将所得杂种分离成单个遗传株。这些单个遗传株产生针对期望抗原的同质抗体，该抗体由于其纯遗传血统被称作“单克隆的”。
在适宜培养基中接种并培养由此制备的杂交瘤细胞，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。本领域技术人员明了，可以通过商业途径从多种渠道获得用于形成、选择和培养杂交瘤的试剂、细胞系和培养基，而且标准化方案已经成熟建立。一般地，分析培养杂交瘤细胞的培养基中抗期望抗原的单克隆抗体的产生。优选地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或体外试验，例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。鉴定到产生具有期望特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释方法对这些克隆进行亚克隆并通过标准方法(Goding，Monoclonal Antibodies：Principlesand Practice(单克隆抗体的原理和操作)，第59-103页(Academic Press，1986))培养。还可以理解，可以从培养基、腹水或血清中，通过常规纯化方法，例如，亲合层析(如，蛋白-A、蛋白-G或蛋白-L亲合层析)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳或透析，分离这些亚克隆分泌的单克隆抗体。
任选地，可以筛选与抗原的特定区域或期望片段结合但不与抗原的其它不相重叠片段结合的抗体。后一筛选可以通过确定抗体与抗原的一系列缺失突变体的结合并确定何种缺失突变体与抗体结合来实现。结合可以通过例如Westem印迹或ELISA评价。显示出与抗体特异结合的最小片段定义为该抗体的表位。可选地，可以利用竞争试验确定表位特异性，在竞争试验中被测抗体和参照抗体竞争结合抗原。当被测抗体和参照抗体竞争时，则它们所结合的表位相同，或者充分接近以致一个抗体的结合干扰另一抗体的结合。
编码期望单克隆抗体的DNA可以容易地使用上述用于分离恒定区结构域序列的任何常规方法(例如，通过使用能够特异地结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序。所分离的和亚克隆的杂交瘤细胞是该DNA的优选来源。更特别地，分离的DNA(可为合成的，如本文所述)可用于克隆期望的可变区序列以并入本发明结合多肽。
在其它实施方案中，结合位点衍生自完全人类抗体。可在不能产生内源性免疫球蛋白的转基因动物(例如小鼠)中产生人类抗体或基本上人类抗体(见例如美国专利第6,075,181、5,939,595、5,591,669和5,589,369号，所有均并入本文作为参考)。例如，已经描述过，在嵌合的种系突变小鼠中纯合缺失抗体重链连接区将导致完全抑制内源性抗体的产生。将人免疫球蛋白基因阵列转移至该种系突变小鼠中将导致在抗原攻击后产生人类抗体。使用SCID小鼠产生人类抗体的另一优选方法公开在美国专利第5,811,524号中，此文献并入本文作为参考。应理解，与这些人类抗体相关的遗传物质也可以按本文中所述进行分离和操作。
制备重组抗体的另一高度有效的方法公开在Newman，Biotechnology，10：1455-1460(1992)。具体地，该技术导致产生灵长类动物源化抗体，该抗体含有猴可变结构域和人类恒定序列。此参考文献完整地并入本文作为参考。此外，该技术也描述在共同转让的美国专利第5,658,570、5,693,780和5,756,096号中，所有这些专利并入本文作为参考。
在另一个实施方案中，可以通过显微操作选择淋巴细胞并分离可变基因。例如，可以从免疫的哺乳动物分离外周血单核细胞，并体外培养大约7天。可以筛选培养物中符合筛选标准的特异IgG。可分离来自阳性孔的细胞。产生个体Ig的B细胞可以通过FACS或通过在补体介导的溶血蚀斑试验中鉴定它们而被分离。可以通过显微操作将产生Ig的B细胞加入试管中，并可以使用例如RT-PCR扩增VH和VL基因。可以将VH和VL基因克隆入抗体表达载体中并将其转染入细胞(例如真核或原核细胞)以表达。
可选地，可以从来自所选动物的可变基因序列文库获得可变(V)结构域。可以用期望抗原筛选表达随机组合的结构域(例如，VH和VL结构域)的文库，以鉴定具有期望的结合特征的元件。此类筛选方法是本领域熟知的。例如，可以将所有抗体基因组成成分克隆至λ噬菌体表达载体(Huse，WD等人(1989).Science，2476：1275)。此外，可以筛选在其表面上表达抗体的细胞(Francisco等人(1994)，PNAS，90：10444；Georgiou等人(1997)，Nat.Biotech.，15：29；Boder和Wittrup(1997)Nat.Biotechnol.15：553；Boder等人(2000)，PNAS，97：10701；Daugtherty，P.等人(2000)J.Immunol.Methods.243：211)或病毒(如，Hoogenboom，HR.(1998)，Immunotechnology 4：1；Winter等人(1994).Annu.Rev.Immunol.12：433；Griffiths，AD.(1998).Curr.Opin.Biotechnol.9：102)。
本领域技术人员也明了，编码抗体可变结构域的DNA也可以使用本领域已知的方法而衍生自噬菌体、酵母或细菌中表达的抗体文库。示例性方法列在例如，EP 368 684 B1；美国专利第5,969,108号；Hoogenboom等人，(2000)Immunol.Today 21：371；Nagy等人(2002)Nat.Med.8：801；Huie等人(2001)，PNAS，98：2682；Lui等人(2002)，J.Mol.Biol.315：1063，所有这些文献均并入本文作为参考。几份出版物(如，Marks等人(1992)，Bio/Technology 10：779-783)已经描述了通过链改组以及组合感染和体内重组作为构建大噬菌体文库的策略以产生高亲和性人类抗体。在另一个实施方案中，可以使用核糖体展示代替噬菌体作为展示平台(参见如，Hanes，等人(1998)，PNAS 95：14130；Hanes和Pluckthun.(1999)，Curr.Top.Microbiol.Immunol.243：107；He和Taussig.(1997)，Nuc.Acids Res.，25：5132；Hanes等人(2000)，Nat.Biotechnol.18：1287；Wilson等人(2001)，PNAS，98：3750；或Irving等人(2001)J.Immunol.Methods248：31)。
用于筛选的优选文库是人类可变基因文库。也可以使用来自非人类来源的VL和VH结构域。文库可以是未进行过实验的、来自于已免疫的受治疗者的、或半合成的(Hoogenboom和Winter.(1992).J.Mol.Biol.227：381；Griffiths等人(1995)EMBO J.13：3245；de Kruif等人(1995).J.Mol.Biol.248：97；Barbas等人(1992)，PNAS，89：4457)。在一个实施方案中，可以突变免疫球蛋白结构域以产生具有更大异质性的核酸分子文库(Thompson等人(1996)，J.Mol.Biol.256：77；Lamminmaki等人(1999)，J.Mol.Biol.291：589；Caldwell和Joyce.(1992)，PCR Methods Appl.2：28；Caldwell和Joyce.(1994)，PCR Methods Appl.3：S136)。可以使用标准筛选方法选择高亲和性变体。在另一个实施方案中，可以例如使用获自晶体结构的信息，利用本领域已知技术，改变VH和VL序列以增加抗体亲和力。
而且，可用于产生本发明结合多肽的可变区序列可从许多不同来源获得。例如，如上讨论的，许多人类基因序列可以公众可得到的保藏形式获得。已公开了许多抗体和编码抗体的基因的序列，可使用领域公认技术从这些序列化学合成适当的可变区序列(如VL和VH序列)。
在另一个实施方案中，本发明结合多肽中存在的至少一个可变区结构域具催化性(Shokat和Schultz.(1990).Annu.Rev.Immunol.8：335)。具有催化性结合特异性的可变区结构域可以使用本领域已知技术制备(见例如，美国专利第6,590,080号、美国专利第5,658,753号)。催化性结合特异性可以通过许多与针对酶而鉴定的用于稳定过渡态由此降低活化自由能的那些机制相似的基本机制起作用。例如，可以最佳地放置一般的酸性和碱性残基以便参与催化活性位点中的催化反应；可以形成共价的酶-底物中间体；催化抗体也可以具有对反应合适的定向并增加反应物有效浓度至少7个数量级(Fersht等人，(1968)，J.Am.Chem.Soc.90：5833)并由此极大地降低化学反应的熵。最后，催化抗体可以转化底物结合和/或随后稳定过渡态中间体时获得的能量以驱动反应。
可以通过使用带互补电荷的分子作为免疫原，将酸性或碱性残基引入抗原结合位点中。该技术已经被证实可以成功地利用含有带正电荷的铵离子的半抗原引发抗体(Shokat，等人，(1988)，Chem.Int.Ed.Engl.27：269-271)。在另一方法中，可以针对类似于期望反应的过渡态中间体的尺寸、形状和电荷的稳定化合物(即，过渡态类似物)引发抗体。见美国专利第4,792,446号和美国专利第4,963,355号，这两份专利描述了应用过渡态类似物免疫动物和产生催化抗体。这两份专利特此并入作为参考。这些分子可以作为免疫结合物的一部分，例如和免疫原性载体分子例如KLH一起施用。
在另一个实施方案中，改变的本发明抗体的可变区结构域由无VL链存在下稳定的例如来源于骆驼科动物的VH结构域组成(Hamers-Casterman等人(1993).Nature，363：446；Desmyter等人(1996).Nat.Struct.Biol.3：803；Decanniere等人(1999).Structure，7：361；Davies等人(1996).Protein Eng.，9：531；Kortt等人(1995).J.Protein Chem.，14：167)。
进一步，本发明结合多肽可包含衍生自完全鼠、完全人类、嵌合、人源化、非人类的灵长类或灵长类动物源化抗体的可变结构域或CDR。可以使用本领域已知的技术，改变非人类抗体或其片段或结构域，以降低其免疫原性。人源化的抗体是来源于非人类抗体的抗体，该抗体被修饰以保留或基本上保留亲本抗体的结合性质，但是在人体中具有比亲本非人类抗体低的免疫原性。对于人源化靶抗体，可以通过各种方法实现，包括(a)将完整非人类可变结构域嫁接在人类恒定区上以产生嵌合靶抗体；(b)将一个或多个非人类互补决定区(CDR)的至少一部分嫁接在人构架区和恒定区上并保留或不保留关键的框架残基；(c)移植完整的非人类可变结构域，但是通过置换表面残基用人类样部分对其进行“掩饰”。这些方法公开在Morrison等人，(1984)，PNAS.81：6851-5；Morrison等人，(1988)，Adv.Immunol.44：65-92；Verhoeyen等人，(1988)，Science 239：1534-1536；Padlan，(1991)，Molec.Immun.28：489-498；Padlan，(1994)，Molec.Immun.31：169-217；以及美国专利第5,585,089、5,693,761和5,693,762号，所有这些文献均特此完整地并入作为参考。
也可以使用去免疫化来减少本发明结合多肽的免疫原性。如本文所用，术语“去免疫化”包括修饰T细胞表位(参见，如WO9852976A1、WO0034317A2)。例如，分析VH和VL序列，从每个V区“作图”人类T细胞表位，显示产生表位相对于互补决定区(CDR)及序列中其它关键残基的位置。分析T细胞表位图中的单个T细胞表位以鉴定导致最终抗体活性改变的风险最低的可选氨基酸替代。设计一系列可选的VH和VL序列以包含氨基酸替代组合，随后将这些序列掺入一系列本发明多肽中，以进行功能检查。通常，制备和检测12-24个变体抗体。之后，将包含修饰的V和人类C区的完整重链和轻链基因克隆至表达载体中，将所得质粒引入细胞系以产生完整抗体。然后在适当的生物化学和生物学试验中比较这些抗体，鉴定最佳的变体。
在一个实施方案中，通过至少部分取代一个或多个CDR改变本发明结合多肽采用的可变结构域。在另一个实施方案中，可任选地改变可变结构域，如，通过部分构架区取代和序列改变。制备人源化可变区时，CDR可衍生自构架区衍生自的抗体的相同类或甚至亚类抗体，然而设想CDR将衍生自不同类的抗体，优选地衍生自不同物种的抗体。不必以来自供体可变区的完整CDR代替所有CDR以转移一个可变结构域的抗原结合能力到另一个可变结构域。而是，可能仅需要转移保持结合结构域活性所必需的那些残基。考虑列在美国专利第5,585,089、5,693,761和5,693,762号中的解释，通过进行常规实验或通过试错测试(trial and error testing)以获得具有减少的免疫原性的功能抗原结合位点在本领域技术人员能力内。
在一个实施方案中，本发明结合多肽包含至少一个来自识别期望的靶的抗体的CDR。在另一个实施方案中，本发明的改变的抗体包含至少两个来自识别期望的靶的抗体的CDR。在另一个实施方案中，本发明的改变的抗体包含至少三个来自识别期望的靶的抗体的CDR。在另一个实施方案中，本发明的改变的抗体包含至少四个来自识别期望的靶的抗体的CDR。在另一个实施方案中，本发明的改变的抗体包含至少五个来自识别期望的靶的抗体的CDR。在另一个实施方案中，本发明的改变的抗体包含所有六个来自识别期望的靶的抗体的CDR。
可从其衍生结合位点以用于本发明结合分子的示例性抗体是本领域已知的。例如，当前FDA批准的抗体可用于衍生结合位点。示例性的这种抗体列在图64。
在一个实施方案中，本发明结合多肽中采用的抗原结合位点可以与一种或多种肿瘤相关抗原免疫反应。例如，为了治疗癌症或瘤形成，结合多肽的抗原结合结构域优选与选定的肿瘤相关抗原结合。考虑到与瘤形成有关的已报道的抗原的数目和相关抗体的数目，本领域技术人员将明了本发明结合多肽可包含来源于多种完整抗体中的任何一种的可变区序列或其部分。更一般地，这种可变区序列可以获自或者来源于任何可以和与选定的状况相关的抗原或标记反应的抗体(包括文献中先已报道的那些抗体)。本发明结合多肽结合的示例性肿瘤相关抗原包括例如，panB抗原(例如，在恶性和非恶性B细胞(例如非何杰金淋巴瘤中的B细胞)表面上发现的CD20)和panT细胞抗原(如CD2、CD3、CD5、CD6、CD7)。其它示例性肿瘤相关抗原包括但不限于MAGE-1、MAGE-3、MUC-1、HPV 16、HPV E6 & E7、TAG-72、CEA、α-Lewisy、L6-抗原、CD19、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD37、CD44、CD52、CD56、CD80、间皮素(mesothelin)、PSMA、HLA-DR、EGF受体、VEGF、VEGF受体、Cripto抗原和HER2受体。
在其它实施方案中，本发明结合多肽可包含来自以前报道的与肿瘤相关抗原反应的抗体的完整抗原结合位点(或可变区或其CDR序列)。能够与肿瘤相关抗原反应的示例性抗体包括：2B8、Lym 1、Lym 2、LL2、Her2、B1、BR96、MB1、BH3、B4、B72.3、5E8、B3F6、5E10、α-CD33、α-CanAg、α-CD56、α-CD44v6、α-Lewis和α-CD30。更特别地，这些示例性抗体包括但不限于2B8和C2B8(
Figure G2008800247098D00601
和
Figure G2008800247098D00602
，Biogen Idec，Cambridge)、Lym 1和Lym 2(Techniclone)、LL2(Immunomedics Corp.，New Jersey)、曲司珠单抗(
Figure G2008800247098D00603
，Genentech Inc.，South San Francisco)、托西莫单抗(，
Figure G2008800247098D00604
Coulter Pharm.，San Francisco)、阿仑珠单抗(Alemtzumab)(，
Figure G2008800247098D00605
Millennium Pharmaceuticals，Cambridge)、吉妥珠单抗奥佐米星(，
Figure G2008800247098D00606
Wyeth-Ayerst，Philadelphia)、阿巴莫单抗(Abagovomab)(Menarini，Italy)、CEA-ScarTM(Immunomedics，Morris Plains，NJ)、卡罗单抗(，Cytogen Corp.)、依决洛单抗(
Figure G2008800247098D00608
，Johnson & Johnson，New Brunswick，NJ)、伊戈伏单抗(CIS Bio Intl.，France)、米妥莫单抗(BEC2，Imclone Systems，Somerville，NJ)、若莫单抗(
Figure G2008800247098D00609
，Boehringer Ingleheim，Ridgefield，CT)、OvaRex(Altarex Corp.，Waltham，MA)、沙妥莫单抗(
Figure G2008800247098D006010
，CytogenCorp.)、阿泊珠单抗(REMITOGEN TM，Protein Design Labs，Fremont，CA)、拉贝珠单抗(CEACIDE TM，Immunomedics Inc.，Morris Plains，NJ)、帕妥珠单抗(OMNITARG  TM ，Genentech Inc.，S.San Francisco，CA)、帕尼木单抗(，Amgen，Thousand Oaks，CA)、西妥昔单抗(，ImcloneSystems，New York)、贝伐珠单抗(
Figure G2008800247098D006013
，Genentech Inc.，South SanFrancisco)、BR96、BL22、LMB9、LMB2、MB1、BH3、B4、B72.3(CytogenCorp.)、SS1(NeoPharm)、CC49(National Cancer Institute)、Cantuzumabmertansine(ImmunoGen，Cambridge)、MNL 2704(Milleneum Pharmaceuticals，Cambridge)、比伐珠单抗mertansine(Boehringer Ingelheim，Germany)、曲司珠单抗-DM1(Genentech，South San Francisco)、My9-6-DM1(ImmunoGen，Cabridge)、SGN-10、-15、-25和-35(Seattle Genetics，Seattle)、和5E10(University of Iowa)。在其他的实施方案中，结合多肽可包含抗-CD23抗体(如，鲁昔单抗)、抗-CD80抗体(如，加利昔单抗)或抗-VL5/α5β1-整联蛋白抗体(如，Volociximab)的结合位点。在其它实施方案中，本发明的结合多肽将与刚在上面列举的抗体结合相同的肿瘤相关抗原。在特别优选的实施方案中，多肽将衍生自Y2B8、C2B8、CC49和C5E10或与Y2B8、C2B8、CC49和C5E10结合相同抗原。
可并入本发明结合分子的其它结合位点包括见于以下分子中的结合位点：Orthoclone OKT3(抗-CD3)(Johnson & Johnson，Brunswick，NJ)、(抗-GpIIb/gIIa)(Centocor，Horsham，PA)、
Figure G2008800247098D00612
(抗-CD25)(Roche，Basel，Switzerland)、
Figure G2008800247098D00613
(抗-TNFα)(Centocor，Horsham，PA)、
Figure G2008800247098D00614
(抗-CD25)(Novartis，Basel，Switzerland)、(抗-RSV)(Medimmune，Gaithersburg，MD)、
Figure G2008800247098D00616
(抗-TNFα)(Abbott，Abbott Park，IL)、
Figure G2008800247098D00617
(抗-IgE)(Genentech，South San Francisco，CA)、
Figure G2008800247098D00618
(抗-CD 11a)(Genentech)、
Figure G2008800247098D00619
(BiogenIdec，Cambridge，MA)、
Figure G2008800247098D006110
(抗-VEGF)(Genentech)和(Alexion Pharmaceuticals，Cheshire，CT)。
在一个实施方案中，本发明结合分子可具有一个或多个衍生自一个或多个以下抗体的结合位点：托西莫单抗(
Figure G2008800247098D006112
)、莫罗莫那(
Figure G2008800247098D006113
)和替伊莫单抗(
Figure G2008800247098D006114
)、西妥昔单抗(ERBITUXTM)、利妥昔单抗(
Figure G2008800247098D006115
)、英夫利昔单抗(
Figure G2008800247098D006116
)、阿昔单抗(
Figure G2008800247098D006117
)和巴利昔单抗(
Figure G2008800247098D006118
)、依法珠单抗(
Figure G2008800247098D006119
，贝伐珠单抗()、阿仑珠单抗(
Figure G2008800247098D006121
)、曲司珠单抗(
Figure G2008800247098D006122
)、吉妥珠单抗(
Figure G2008800247098D006123
)、帕利珠单抗()、奥马珠单抗(
Figure G2008800247098D006125
)、达克珠单抗(
Figure G2008800247098D006126
)、那他珠单抗(
Figure G2008800247098D006127
)和雷珠单抗(
Figure G2008800247098D006128
)、阿达木单抗(
Figure G2008800247098D006129
)和帕尼木单抗(
Figure G2008800247098D006130
)。
在一个实施方案中，结合多肽与
Figure G2008800247098D006131
结合相同的肿瘤相关抗原。(也称作利妥昔单抗、IDEC-C2B8和C2B8)是FDA批准的第一个用于治疗人类B细胞淋巴瘤的单克隆抗体(见，美国专利第5,843,439；5,776,456和5,736,137号，均并入此处作为参考)。Y2B8(90Y标记的2B8；；
Figure G2008800247098D006133
替伊莫单抗)是C2B8的鼠亲本抗体。
Figure G2008800247098D006134
是嵌合的抗-CD20单克隆抗体，其具有生长抑制性并且据报道可以体外敏化某些淋巴瘤细胞系使其对化疗剂引起的细胞凋亡作用易感。该抗体有效地结合人类补体，具有强的FcR结合，可以通过补体依赖性(CDC)和抗体依赖性(ADCC)机制在体外有效地杀伤人淋巴细胞(Reff等人，Blood 83：435-445(1994)))。本领域技术人员明了，本发明结合多肽可包含C2B8或2B8的可变区或CDR，以提供在治疗表现CD20+恶性肿瘤的患者时具有甚至更大效果的结合多肽。
在本发明其它实施方案中，本发明结合多肽将与CC49结合相同的肿瘤相关抗原。CC49结合人肿瘤相关抗原TAG-72，该抗原与人类来源的某些肿瘤细胞(尤其是LS174T肿瘤细胞系)表面结合。LS174T是LS180结肠腺癌系的变体。
本发明结合多肽可包含已经开发的许多对TAG-72具有结合特异性的鼠单克隆抗体衍生的抗原结合位点。这些单克隆抗体之一称作B72.3，其是由杂交瘤B72.3产生的鼠IgG1。B72.3是使用人类乳腺癌提取物作为免疫原开发的第一代单克隆抗体(见Colcher等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，78：3199-3203(1981)；和美国专利第4,522,915和4,612,252号，所有文献均并入本文作为参考)。其它抗TAG-72的单克隆抗体称作″CC″(代表结肠癌)。如schlom等(美国专利第5,512,443号，并入本文作为参考)所述，CC单克隆抗体是使用以B72.3纯化的TAG-72制备的第二代鼠单克隆抗体家族。由于它们对TAG-72相对良好的结合亲和力，以下CC抗体是优选的：CC49、CC83、CC46、CC92、CC30、CC11和CC15。Schlom等人还制备了人源化CC49抗体(公开在PCT/US99/25552中)和单链Fv(scFv)构建体(公开在美国专利第5,892,019号中)的变体，所有这些文献也并入本文作为参考。本领域技术人员将明了，所有前述抗体、构建体或重组体及其变体均可以是合成的并用于为产生根据本发明的结合多肽提供结合位点。
除了以上讨论的抗TAG-72抗体，不同研究组还报道了对缺失结构域的CC49和B72.3抗体的构建和部分表征(例如，Calvo等人Cancer Biotherapy，8(1)：95-109(1993)，Slavin-Chiorini等人Int.J.Cancer 53：97-103(1993)和Slavin-Chiorini等人Cancer.Res.55：5957-5967(1995)。因此，结合多肽还可包含衍生自这些抗体的抗原结合位点、可变区或CDR。
在一个实施方案中，本发明结合多肽包含与CD23抗原结合的抗原结合位点(美国专利第6,011,138号)。在一个优选实施方案中，本发明结合多肽与5E8抗体结合相同表位。在另一实施方案中，本发明结合多肽包含至少一个来自抗CD23抗体(例如5E8抗体(如，鲁昔单抗))的CDR(例如，1、2、3、4、5或6个CDR)。
在一个实施方案中，本发明结合多肽与CRIPTO-I抗原(WO02/088170A2或WO03/083041A2)结合。在一个更优选的实施方案中，本发明结合多肽与B3F6抗体结合相同表位。在另一实施方案中，本发明改变的抗体包含至少一个来自抗CRIPTO-I抗体，例如B3F6抗体的CDR(如，1、2、3、4、5或6个CDR)。
在另一个实施方案中，本发明结合多肽结合于TNF受体(“TNFR”)超家族成员的抗原。在另一个实施方案中，本发明的结合分子结合至少一个对细胞转导信号的靶，如，通过结合于细胞表面受体，诸如TNF家族受体。“转导信号”是指通过结合细胞，结合分子将对细胞表面受体的胞外影响转变为细胞响应，如，通过调节信号转导途径。术语“TNF受体”或“TNF受体家族成员”是指属于肿瘤坏死因子(“TNF”)受体超家族的任何受体。TNF受体超家族(“TNFRSF”)的成员特征是胞外区具有两个或多个富含半胱氨酸的结构域(各～40氨基酸)，布置为半胱氨酸结(参见Dempsey等人，Cytokine GrowthFactor Rev.(2003).14(3-4)：193-209)。结合其同族TNF配体后，TNF受体通过直接或间接地与称为TRAF(TNF受体相关因子)的细胞质适体蛋白相互作用而转导信号。TRAF可引起多种激酶级联的活化，最终造成活化信号转导途径诸如NF-KB、JNK、ERK、p38和PI3K，这反过来调节从免疫功能和组织分化到凋亡的细胞过程。多种TNF受体家族成员的核苷酸和氨基酸序列是本领域已知的并包括至少29个人类基因：TNFRSF1A(TNFR1，也称为DR1、CD120a、TNF-R-I p55、TNF-R、TNFRI、TNFAR、TNF-R55、p55TNFR、p55R或TNFR60，GenBank GI No.4507575；还参见美国专利第5,395,760号))，TNFRSF1B(CD120b，也称为p75、TNF-R、TNF-R-II、TNFR80、TNFR2、TNF-R75、TNFBR或p75TNFR；GenBank GI No.4507577)，TNFRSF3(淋巴毒素β受体(LTβR)，也称为TNFR2-RP、CD18、TNFR-RP、TNFCR或TNF-R-III；GI No.4505038和20072212)，TNFRSF4(OX40，也称为ACT35、TXGP1L或CD134抗原；GI No.4507579和8926702)，TNFRSF5(CD40，也称为p50或Bp50；GI No.4507581和23312371)，TNFRSF6(FAS，也称为FAS-R、DcR-2、DR2、CD95、APO-1或APT1；GenBank GI No.4507583、23510421、23510423、23510425、23510427、23510429、23510431和23510434))，TNFRSF6B(DcR3、DR3；GenBank GI No.4507569、23200021、23200023、23200025、23200027、23200029、23200031、23200033、23200035、23200037和23200039)，TNFRSF7(CD27，也称为Tp55或S152；GenBank GINo.4507587)，TNFRSF8(CD30，也称为Ki-1或D1S166E；GenBank GI No.4507589和23510437)，TNFRSF9(4-1-BB，也称为CD137或ILA；GI No.5730095和728738)，TNFRSF10A(TRAIL-R1，也称为DR4或Apo2；GenBankGI No.21361086)，TNFRSF10B(TRAIL-R2，也称为DR5、KILLER、TRICK2A或TRICKB；GenBank GI No.22547116和22547119)，TNFRSF10C(TRAIL-R3，也称为DcR1、LIT或TRID；GenBank GI No.22547121)，TNFRSF10D(TRAIL-R4，也称为DcR2或TRUNDD)，TNFRSF11A(RANK；GenBank GI No.4507565；参见美国专利第6,562,948；6,537,763；6,528,482；6,479,635；6,271,349；6,017,729号)，TNFRSF11B(骨保护素(OPG)，也称为OCIF或TR1；GI No.38530116、22547122和33878056)，TNFRSF12(移位链-相关膜蛋白(TRAMP)，也称为DR3、WSL-1、LARD、WSL-LR、DDR3、TR3、APO-3、Fn14或TWEAKR；GenBank GI No.7706186；美国专利申请公布第2004/0033225A1号)，TNFRSF12L(DR3L)，TNFRSF13B(TACI；GI No.6912694)，TNFRSF13C(BAFFR；GI No.16445027)，TNFRSF14(疱疹病毒进入介导子(HVEM)，也称为ATAR、TR2、LIGHTR或HVEA；GenBank GINo.23200041、12803895和3878821)，TNFRSF16(低亲和性神经生长因子受体(LNGFR)，也称为神经营养蛋白受体或p75(NTR)；GenBank GI No.128156和4505393)，TNFRSF17(BCM，也称为BCMA；GI No.23238192)，TNFRSF18(AITR，也称为GITR；GenBank GI No.4759246、23238194和23238197)，TNFRSF19(Troy/Trade，也称为TAJ；GenBank GI No.23238202和23238204)，TNFRSF20(RELT，也称为FLJ14993；GI No.21361873和23238200)，TNFRSF21(DR6)，TNFRSF22(SOBa，也称为Tnfrh2或2810028K06Rik)和TNFRSF23(mSOB，也称为Tnfrh1)。其它TNF家族成员包括EDAR1(外胚叶发育不全A受体，也称为Downless(DL)、ED3、ED5、ED1R、EDA3、EDA1R、EDA-A1R；GenBank GI No.11641231；美国专利第6,355,782号)、XEDAR(也称为EDA-A2R；GenBank GI No.11140823)；和CD39(GI No.2135580和765256)。在另一个实施方案中，本发明改变的抗体结合于缺少死亡结构域的TNF受体家族成员。在一个实施方案中，缺少死亡结构域的TNF受体牵涉在组织分化中。在更特定实施方案中，组织分化中牵涉的TNF受体选自LTβR、RANK、EDAR1、XEDAR、Fn14、Troy/Trade和NGFR组成的组。在另一个实施方案中，缺少死亡结构域的TNF受体牵涉在免疫调节中。在更特定实施方案中，免疫调节中牵涉的TNF受体家族成员选自TNFR2、HVEM、CD27、CD30、CD40、4-1BB、OX40和GITR组成的组。
在另一个实施方案中，本发明结合多肽结合于属于TNF配体超家族的TNF配体。TNF配体结合TNF受体超家族的不同受体并表现彼此15-25％的氨基酸序列同源性(Gaur等人，Biochem.Pharmacol.(2003)，66(8)：1403-8)。许多TNF受体(配体)超家族(“TNFSF”)成员的核苷酸和氨基酸序列是本领域已知的并包括至少16个人类基因：TNFSF1(也称为淋巴毒素-α(LTA)、TNFβ或LT，GI No.：34444和6806893)，TNFSF2(也称为TNF、TNFα或DIF；GINo.25952111)，TNFSF3(也称为淋巴毒素-β(LTB)、TNFC或p33)，TNFSF4(也称为OX-40L、gp34、CD134L或tax-转录活化的糖蛋白1、34kD(TXGP1)；GI No.4507603)，TNFSF5(也称为CD40LG、IMD3、HIGM1、CD40L、hCD40L、TRAP、CD154或gp39；GI No.4557433)，TNFSF6(也称为FasL或APT1LG1；GenBank GI No.4557329)，TNFSF7(也称为CD70、CD27L或CD27LG；GI No.4507605)，TNFSF8(也称为CD30LG、CD30L或CD 153；GI No.4507607)，TNFSF9(也称为4-1BB-L或ILA配体；GI No.4507609)，TNFSF10(也称为TRAIL、Apo-2L或TL2；GI No.4507593)，TNFSF11(也称为TRANCE、RANKL、OPGL或ODF；GI No.4507595和14790152)，TNFSF12(也称为Fn14L、TWEAK、DR3LG或APO3L；GI No.4507597和23510441)，TNFSF13(也称为APRIL)，TNFSF14(也称为LIGHT、LTg或HVEM-L；GI No.25952144和25952147)，TNFSF15(也称为TL1或VEGI)，或TNFSF16(也称为AITRL、TL6、hGITRL或GITRL；GI No.4827034)。其它TNF配体家族成员包括EDAR1 & XEDAR配体(ED1；GI No.4503449；Monreal等人(1998)Am J Hum Genet.63：380)、Troy/Trade配体、BAFF(也称为TALL1；GI No.5730097)和NGF配体(如NGF-β(GI No.4505391)、NGF-2/NTF3；GI No.4505469)、NTF5(GI No.5453808))、BDNF(GI No.25306267、25306235、25306253、25306257、25306261、25306264；IFRD1(GINo.4504607))。
在一个实施方案中，本发明结合多肽结合于LTβR抗体(如与CBE11或BDA8抗体结合相同表位(即，与之竞争))。示例性抗-LTβR抗体列在WO98/017313和WO 02/30986，其以引用的方式并入本文。在另一实施方案中，本发明的改变的抗体包含来自抗-LTβR抗体如，CBE11抗体或BDA8抗体的至少一个CDR(如，1、2、3、4、5或6个CDR)。
在另一优选实施方案中，本发明的结合多肽结合TRAIL-R2(如与14A2抗体结合相同表位(即，与之竞争))。在另一实施方案中，本发明多肽包含来自抗-TRAIL-R2抗体如，14A2抗体的至少一个CDR(如，1、2、3、4、5或6个CDR)。
在另一优选实施方案中，本发明的结合多肽与抗-CD2抗体(如，嵌合CB6(“chB6”)抗体)结合相同表位。可从其衍生本发明结合多肽的示例性抗-CD2抗体包括小鼠抗体CB6以及其嵌合版本，如，实施例中公开的IgG1chCB6抗体。在特定实施方案中，本发明抗-CD2结合多肽包含选自SEQ IDNO：29(ASK058)、SEQ ID NO：31(ASK062)、SEQ ID NO：33(ASK063)和SEQID NO：35(ASK064)组成的组的重链序列。
本发明的又一些其它实施方案包含衍生自C5E10或与C5E10结合相同肿瘤相关抗原的改变的抗体。如列在共同待决申请第09/104,717号的，C5E10是识别表现为对前列腺肿瘤细胞系(如DU145、PC3或ND1)特异性的大约115kDa的糖蛋白决定子的抗体。因此，结合本发明，特异性结合C5E10抗体识别的相同肿瘤相关抗原的多肽可单独使用或由本发明方法与效应子部分结合，从而提供可用于改进地治疗肿瘤病症的修饰的多肽。在特别优选的实施方案中，起始多肽将衍生自具有ATCC登录号PTA-865的杂交瘤细胞系或包含从具有ATCC登录号PTA-865的杂交瘤细胞系分泌的C5E10抗体的抗原结合区的所有或部分。所得多肽随后可结合于下述的治疗效应子部分并根据本文方法施用于患有前列腺癌的患者。
在其他实施方案中，本发明结合多肽结合于可用于治疗自身免疫或炎性疾病或病症的分子。例如，结合多肽可结合免疫细胞(如，B或T细胞)上存在的抗原或负责自身免疫疾病或病症的自身抗原。与自身免疫或炎性病症相关的抗原可为前述的肿瘤相关抗原。因此，肿瘤相关抗原也可是自身免疫或炎性相关病症。本文所用的术语“自身免疫疾病或病症”是指受治疗者的病症或状态，其中免疫系统攻击身体自身的细胞，导致组织破坏。自身免疫疾病包括一般性自身免疫疾病，即，其中自身免疫反应同时发生在许多组织的自身免疫疾病，或器官特异性自身免疫疾病，即，其中自身免疫反应靶向单个器官的自身免疫疾病。本发明方法和组合物可诊断、预防或治疗的自身免疫疾病的实例包括但不限于，Crohn氏疾病；炎性肠病(IBD)；系统性红斑狼疮；溃疡性结肠炎；类风湿性关节炎；Goodpasture氏综合征；Grave氏病；桥本甲状腺炎；寻常性天疱疮；重症肌无力；硬皮病；自身免疫性溶血性贫血；自身免疫性血小板减少性紫瘢；多肌炎和皮肌炎；恶性贫血；
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氏综合征；强直性脊柱炎；脉管炎；I型糖尿病；神经病症，多发性硬化症，和自身免疫疾病导致的继发性疾病。
在其它实施方案中，本发明结合多肽结合与炎性疾病或病症相关的靶分子。本文所用的术语“炎性疾病或病症”包括因炎症而引起的(至少部分地)或恶化的病症或病症，例如血流增加、水肿、免疫细胞的活化(例如增生、细胞因子产生或增强的吞噬作用)。例如，本发明的结合多肽可以异常量例如可有利于改变例如有益于受治疗者的量结合区域中的涉及或存在的炎性因子(例如，基质金属蛋白酶(MMP)、TNFα、白介素、血浆蛋白、细胞因子、脂质代谢物、蛋白酶、毒性自由基、线粒体蛋白、细胞凋亡蛋白、粘附分子等)或炎性因子。发炎过程是活组织对损伤的应答。炎症的原因可以是由于物理损伤、化学物质、微生物、组织坏死、癌症或其它因素。急性炎症持续时间短，例如，仅仅持续数天。然而，如果其持续较长时间，则可以称作慢性炎症。
炎性病症包括急性炎性病症、慢性炎性病症、和复发性炎性病症。急性炎性病症一般具有相对短的持续期，并且持续大约数分钟至大约1到2天，但它们也可以持续几周。急性炎性病症的主要特征包括血流增加、体液和血浆蛋白渗出(水肿)以及白细胞如嗜中性粒细胞渗出。慢性炎性病症一般有较长的持续期，例如数周至数月至数年或甚至更长，并且在组织学上其与淋巴细胞和巨噬细胞的存在以及血管和结缔组织的增生有关。复发性炎性病症包括在一段时间后复发的或周期性发作的病症。复发性炎性病症的例子包括哮喘和多发性硬化。一些病症可以落入一种或多种分类中。炎性病症一般的特征在于发热、潮红、肿大、疼痛和丧失功能。炎性病症的示例性原因包括但不限于微生物感染(例如细菌、病毒和真菌感染)、物理因素(例如，烧伤、辐射和创伤)、化学因素(例如，毒素和腐蚀性物质)、组织坏死和各种类型的免疫反应。炎性病症的例子包括但不限于骨关节炎，类风湿性关节炎，急性和慢性感染(细菌、病毒和真菌)；急性和慢性支气管炎，鼻窦炎和其它呼吸感染，包括普通感冒；急性和慢性肠胃炎和结肠炎；急性和慢性膀胱炎和尿道炎；急性呼吸窘迫综合征；囊性纤维化；急性和慢性皮炎；急性和慢性结膜炎；急性和慢性浆膜炎(心包炎、腹膜炎、滑膜炎、胸膜炎和腱炎)；尿毒症性心包炎；急性和慢性胆囊炎；急性和慢性阴道炎；急性和慢性眼色素层炎；药物反应；和烧伤(热的、化学的和电的)。
在一个优选实施方案中，本发明结合多肽结合于CD40L抗体(如，与5C8抗体结合相同表位(即，与之竞争))。在另一实施方案中，本发明多肽包含来自抗-CD40L抗体(如5C8抗体)的至少一个抗原结合位点、一个或多个CDR(如，1、2、3、4、5、或6个CDR)、或一个或多个可变区(VH或VL)。CD40L(CD154、gp39)是一种跨膜蛋白，表达在活化的CD4+T细胞、巨细胞、嗜碱细胞、嗜酸性细胞、天然杀伤(NK)细胞和活化的血小板。CD40L对于T-细胞依赖性B-细胞应答是重要的。CD40L的一种显著功能即同种型转换由其中CD40L是天生缺乏的高免疫球蛋白M(IgM)综合征证实。CD40L-CD40的相互作用(在抗原-呈递细胞诸如树突状细胞上)对于引发T-细胞和T-细胞-依赖性体液免疫应答是必需的。因此，基于上述信息和对动物的研究，以抗-CD40L单克隆抗体(mAb)破坏CD40-CD40L相互作用已被认为是对人类自身免疫疾病的可能治疗策略。可从其衍生本发明结合多肽的示例性抗-CD40L抗体包括美国专利第5,474,771号中公开的小鼠抗体5C8，其以引用的方式并入本文，以及其人源化版本，如，实施例中公开的IgG1Hu5C8抗体。其它抗-CD40L抗体是本领域已知的(参见如，美国专利第5,961,974号和国际公布第WO 96/23071号)。在特定实施方案中，本发明抗-CD40L结合多肽包含选自SEQ ID NO：1(EAG2066)、SEQ ID NO：7(EAG2146)、SEQ ID NO：9(EAG2147)、SEQ ID NO：13(ASK043)、SEQ IDNO：15(ASK048)、SEQ ID NO：17(ASK052)和SEQ ID NO：19(ASK053)组成的组的重链序列。
在其他的实施方案中，本发明结合多肽结合于可用于治疗神经疾病或病症的分子。例如，结合多肽可结合神经细胞(如，神经元、神经胶质细胞或)上存在的抗原。在某些实施方案中，与抗原相关的神经病症可为前述自身免疫或炎性病症。本文所用的术语“神经疾病或病症”包括受治疗者的疾病或病症，其中神经系统退化(如，神经退化病症，以及其中神经系统不能适当地发展或不能在损伤如脊索损伤后再生的病症。本发明方法和组合物可诊断、预防或治疗的神经病症的实例包括但不限于，多发性硬化、亨廷顿氏病、阿尔茨海默病、帕金森病、神经痛、创伤性脑损伤、格-巴二氏综合征和慢性炎性脱鞘性多神经病(CIDP)。
在一个优选实施方案中，本发明结合多肽与抗-LINGO抗体(如，Li33抗体)结合于相同表位。在另一实施方案中，本发明多肽包含来自抗-LINGO抗体(如Li33抗体)的至少一个抗原结合位点、一个或多个CDR或一个或多个可变区(VH或VL)。在特定实施方案中，本发明的抗-LINGO结合多肽包含选自SEQ ID NO 21(EAG2148)、SEQ ID NO：22(ASK050)和SEQ ID NO：23(ASK051)的重链序列。
(b)抗原结合片段
在其它实施方案中，本发明结合多肽的结合位点可包含抗原结合片段。术语“抗原-结合片段”是指免疫球蛋白、抗体或抗体变体结合抗原或与完整抗体(即，与其所衍生自的完整抗体)竞争抗原结合(即，特异性结合)的多肽片段。例如，所述抗原结合片段可衍生自前述任何抗体或抗体变体。可通过本领域已知的重组或生物化学方法产生抗原结合片段。示例性抗原-结合片段包括Fv、Fab、Fab’和(Fab’)2。
在示例性实施方案中，本发明结合多肽包含可操作地连接(如，化学结合或遗传融合的(如，直接融合或经由多肽接头融合))于遗传融合的Fc区(即，scFc区)的C-末端和/或N-末端的至少一个抗原结合片段。在一个示例性实施方案中，本发明结合多肽包含经由铰链结构域或其部分(如，IgG1铰链或其部分，如，人类IgG1铰链)可操作地连接于至少一个遗传融合的Fc区的N-末端(或C-末端)的抗原结合片段(如，Fab)。示例性铰链结构域部分包含序列DKTHTCPPCPAPELLGG。
(c)单链结合分子
在其它实施方案中，本发明结合分子可包含来自单链结合分子(如，单链可变区或scFv)的结合位点。所述为产生单链抗体的技术(美国专利第4,694,778号；Bird，Science 242：423-442(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；和Ward等人，Nature 334：544-554(1989))可适于产生单链结合分子。通过经由氨基酸桥连接Fv区的重和轻链片段形成单链抗体，造成单链抗体。还可使用在大肠杆菌中组装功能Fv片段的技术(Skerra等人，Science 242：1038-1041(1988))。
在某些实施方案中，本发明结合多肽包含一个或多个包含单链可变区序列(scFv)或由单链可变区序列(scFv)组成的结合位点或区。单链可变区序列包含具有一个或多个抗原结合位点的单个多肽，如，由柔性接头连接于VH结构域的VL结构域。VL和/或VH结构域可衍生自前述任何抗体或抗体变体。可以VH-接头-VL方向或VL-接头-VH方向构建ScFv分子。连接形成抗原结合位点的VL和VH结构域的柔性接头优选地包含从约10至约50个氨基酸残基。在一个实施方案中，多肽接头是gly-ser多肽接头。一种示例性gly/ser多肽接头是式(Gly4Ser)n，其中n是正整数(如，1、2、3、4、5或6)。其它多肽接头是本领域已知的。具有单链可变区序列的抗体(如单链Fv抗体)和制备所述单链抗体的方法是本领域已知的(参见如，Ho等人1989.Gene 77：51；Bird等人1988 Science 242：423；Pantoliano等人1991.Biochemistry 30：10117；Milenic等人1991.Cancer Research 51：6363；Takkinen等人1991.ProteinEngineering 4：837)。
在某些实施方案中，本发明结合多肽采用的scFv分子是稳定化的scFv分子。在一个实施方案中，稳定化的scFv分子可包含介于VH结构域和VL结构域之间的scFv接头，其中VH和VL结构域由VH中的氨基酸与VL结构域中的氨基酸之间的二硫键连接。在其它实施方案中，稳定化的scFv分子可包含具有优化的长度或组成的scFv接头。在其他的实施方案中，稳定化的scFv分子可包含具有至少一个稳定氨基酸取代的VH或VL结构域。在另一个实施方案中，稳定化的scFv分子可具有至少两个上述稳定特征。稳定化的scFv分子具有改进的蛋白稳定性或对其可操作地连接的结合多肽赋予改进的蛋白稳定性。与常规结合多肽相比，本发明优选的scFv接头改进本发明结合多肽的热稳定性至少约2℃或3℃。可在例如本发明的scFv分子之间进行比较。在某些优选实施方案中，稳定化的scFv分子包含(Gly4Ser)4scFv接头和连接VH氨基酸44和VL氨基酸100的二硫键。本发明结合多肽中可采用的其它示例性稳定化的scFv分子描述于2006年12月8日提交的美国临时专利申请第60/873,996号或2007年3月19日提交的美国专利申请第11/725,970号，其各自以引用的方式全文并入本文。
在某些示例性实施方案中，本发明结合多肽包含可操作地连接(如，化学结合或遗传融合的(如，直接融合或经由多肽接头融合)于遗传融合的Fc区(即，scFc区)的C-末端和/或N-末端的至少一个scFv分子。在一个示例性实施方案中，本发明结合多肽包含经由铰链结构域或其部分(如，IgG1铰链或其部分，如，人类IgG1铰链)可操作地连接于至少一个遗传融合的Fc区的N-末端(或C-末端)的至少一个scFv分子(如，一个或多个稳定化的scFv分子)。示例性铰链结构域部分包含序列DKTHTCPPCPAPELLGG。
在某些实施方案中，本发明结合多肽包含通过成串地融合两个或多个scFv分子形成的四价结合位点或区。例如，在一个实施方案中，组合scFv分子以使第一scFv分子在其N-末端(如，经由多肽接头(如，gly/ser多肽接头))可操作地连接于具有相同或不同结合特异性的至少一个另外scFv分子。scFv分子的串联队列可操作地连接于至少一个遗传融合的Fc区(即，scFc区)的N-末端和/或C-末端以形成本发明结合多肽。
在另一个实施方案中，本发明结合多肽包含通过可操作地连接scFv分子(如经由多肽接头)于抗原结合片段(如，Fab片段)形成的四价结合位点或区。所述四价结合位点或区可操作地连接于至少一个遗传融合的Fc区(即，scFc区)的N-末端和/或C-末端以形成本发明结合多肽。
(d)修饰的抗体
在其它方面，本发明结合多肽可包含衍生自抗体的修饰形式的抗原结合位点或其部分。示例性这种形式包括，如，微型抗体、双链抗体、三链抗体、纳米抗体、骆驼抗体、Dab、四价抗体、内双链抗体(intradiabodies)(如，Jendreyko等人2003.J.Biol.Chem.278：47813)、融合蛋白(如，抗体细胞因子融合蛋白、融合于至少部分的Fc受体的蛋白)、和双特异性抗体。其它修饰的抗体描述于例如美国专利第4,745,055号；EP 256,654；Faulkner等人，Nature298：286(1982)；EP 120,694；EP 125,023；Morrison，J.Immun.123：793(1979)；Kohler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980)；Raso等人，Cancer Res.41：2073(1981)；Morrison等人，Ann.Rev.Immunol.2：239(1984)；Morrison，Science 229：1202(1985)；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984)；EP 255,694；EP 266,663；和WO 88/03559。再分类的免疫球蛋白链也是已知的。参见例如，美国专利第4,444,878号；WO 88/03565；和EP 68,763以及其中引用的参考文献。
在一个实施方案中，本发明的结合多肽包含是微型抗体的抗原结合位点或区或从其衍生的抗原结合位点。微型抗体是两条多肽链组成的二聚的分子，每条多肽链包含经由多肽接头融合于CH3结构域或其部分的scFv分子。可通过使用本领域所述的方法连接scFv成分和多肽接头-CH3成分而制备微型抗体(参见如，美国专利第5,837,821号或WO 94/09817A1)。这些成分可从分开的质粒作为限制性片段分离，随后连接并再克隆到合适的载体(如，表达载体)中。适当的组装(如，组装编码单体微型抗体多肽链的可读框(ORF))可通过限制性消化和DNA序列分析证实。在一个实施方案中，本发明结合多肽包含可操作地连接于至少一个遗传融合的Fc区(即，scFc区)的微型抗体的scFv成分。在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含四价微型抗体作为结合位点或区。四价微型抗体可以与微型抗体相同的方式构建，除了两个scFv分子使用多肽接头连接。随后连接的scFv-scFv构建体可操作地连接于遗传融合的Fc区(即，scFc区)以形成本发明结合多肽。
在另一个实施方案中，本发明的结合多肽包含是双链抗体的抗原结合位点或区或从其衍生的抗原结合位点。双链抗体是二聚的四价分子，各具有与scFv分子相似的多肽，但通常具有短的(如，少于10并优选地1-5)氨基酸残基接头，连接两个可变结构域，以使同一多肽链上的VL和VH结构域不能相互作用。相反地，一条多肽链的VL和VH结构域与第二多肽链上的VH和VL结构域(分别地)相互作用(参见例如，WO 02/02781)。在一个实施方案中，本发明结合多肽包含可操作地连接于至少一个遗传融合的Fc区(即，scFc区)的N-末端和/或C-末端的双链抗体。
在某些实施方案中，结合分子包含连接于scFc的单个结构域结合分子(如单个结构域抗体)。示例性单个结构域分子包括抗体的分离的重链可变结构域(VH)(即，重链可变结构域，无轻链可变结构域)，和抗体的分离的轻链可变结构域(VL)(即，轻链可变结构域，无重链可变结构域)。本发明结合分子采用的示例性单个结构域抗体包括，例如，骆驼抗体重链可变结构域(约118至136氨基酸残基)，如Hamers-Casterman等人，Nature 363：446-448(1993)和Dumoulin，等人，Protein Science 11：500-515(2002)所述的。其它示例性单个结构域抗体包括单个VH或VL结构域，也称为
Figure G2008800247098D00721
(Domantis Ltd.，Cambridge，UK)。其他的单个结构域抗体包括鲨鱼抗体(如，鲨鱼Ig-NAR)。鲨鱼Ig-NAR包含一个可变结构域(V-NAR)和五个C-样恒定结构域(C-NAR)的同二聚体，其中多样性集中在长度从5至23残基的延伸CDR3区。在骆驼科动物物种(如，美洲驼)，称为VHH的重链可变区形成完整抗原-结合结构域。骆驼抗体VHH可变区与衍生自常规抗体的可变区(VH)的主要区别包括(a)与VHH中相应区相比，VH的轻链接触表面中疏水氨基酸更多，(b)VHH中CDR3更长，和(c)VHH中频繁出现CDR1和CDR3之间的二硫键。制备单个结构域结合分子的方法描述于美国专利第6.005,079和6,765,087号，两者以引用的方式并入本文。示例性包含VHH结构域的单个结构域抗体包括
Figure G2008800247098D00722
(Ablynx NV，Ghent，Belgium)。
(e)非免疫球蛋白的结合分子
在一些其它实施方案中，本发明结合多肽包含一个或多个衍生自非免疫球蛋白的结合分子的结合位点。本文所用的术语“非免疫球蛋白的结合分子”是其结合位点包含衍生自免疫球蛋白以外的多肽但可被工程化(如，诱变)以赋予期望的结合特异性的部分(如，支架或构架)的结合分子。
包含不是衍生自抗体分子的结合位点的结合分子的其它实例包括受体结合位点和配体结合位点，在以下详细讨论。
非免疫球蛋白的结合分子可包含衍生自不是免疫球蛋白的免疫球蛋白超家族成员(如T-细胞受体或细胞粘附蛋白(如，CTLA-4、N-CAM、端蛋白))的结合位点部分。这种结合分子包含保持免疫球蛋白折叠的构象并能够特异性结合IGF1-R表位(eptitope)的结合位点部分。在其它实施方案中，本发明的非免疫球蛋白的结合分子还包含具有不是基于免疫球蛋白折叠的蛋白拓扑(如诸如锚蛋白重复蛋白或纤连蛋白)但能够特异性结合靶(如IGF-1R表位)的结合位点。
非免疫球蛋白的结合分子可通过从具有人工变化的结合位点的结合分子文库选择或分离靶结合变体而鉴定。变化的文库可使用完全随机方法(如，易错PCR、外显子改组或定向进化)产生或由领域公认的设计策略辅助。例如，当结合位点与其同族靶分子相互作用时通常牵涉的氨基酸位置可通过在编码结合位点的核酸的相应位置插入简并密码子、三核苷酸、随机肽、或完整环而随机化(参见如，美国专利公布第20040132028号)。通过研究复合体与靶分子结合位点的晶体结构，可鉴定氨基酸位置的定位。随机化的候选位置包括环、平表面、螺旋和结合位点的结合腔。在某些实施方案中，结合位点中可能候选用于变化的氨基酸可通过与折叠的免疫球蛋白的同源性来鉴定。例如，纤连蛋白的CDR样环中的残基可随机化以产生纤连蛋白结合分子文库(参见如，Koide等人，J.Mol.Biol.，284：1141-1151(1998))。可随机化的结合位点的其它部分包括平表面。随机化后，随后可对变化的文库进行选择或筛选步骤以获得具有期望的结合特征的结合分子，如特异性结合前述IGF-1R表位。例如，选择可通过领域公认的方法诸如噬菌体展示、酵母展示或核糖体展示来实现。
在一个实施方案中，本发明结合分子包含来自纤连蛋白结合分子的结合位点。纤连蛋白结合分子(如，包含纤连蛋白I、II或III型结构域的分子)展示CDR样环，其不同于免疫球蛋白，不依赖于链内二硫键。制备纤连蛋白结合多肽的方法描述于例如，WO 01/64942和美国专利第6,673,901、6,703,199、7,078,490和7,119,171号，其以引用的方式并入本文。在一个示例性实施方案中，纤连蛋白结合多肽如
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(Adnexus Therpaeutics，Waltham，MA)。
在另一个实施方案中，本发明结合分子包含来自亲和体亲和
Figure G2008800247098D00742
(Abcam，Cambridge，MA)的结合位点。亲和体亲和体衍生自葡萄球菌蛋白A(SPA)的免疫球蛋白结合结构域(参见如，Nord等人，Nat.Biotechnol.，15：772-777(1997))。通过诱变衍生自SPA结构域(如，结构域B)的SPA-相关蛋白(如，蛋白Z)并选择对IGF-1R表位具有结合亲和性的突变的SPA-相关多肽，可合成本发明采用的亲和体亲和体结合位点。制备亲和体亲和体结合位点的其它方法描述于美国专利第6,740,734和6,602,977号以及WO00/63243，其以引用的方式并入本文。
在另一个实施方案中，本发明结合分子包含来自抗运载蛋
Figure G2008800247098D00743
(Pieris AG，Friesing，Germany)的结合位点。抗运载蛋白(也称为脂笼蛋白)是多样β-筒蛋白家族的成员，功能是在其筒/环区结合靶分子。脂笼蛋白结合位点可被工程化以结合IGF-1R表位，通过将连接筒链的环序列随机化(参见如，Schlehuber等人，Drug Discov.Today，10：23-33(2005)；Beste等人，PNAS，96：1898-1903(1999)。本发明结合分子采用的抗运载蛋白结合位点可从脂笼蛋白家族的多肽开始获得，将脂笼蛋白家族的多肽在对应于包含大菜粉蝶(Pieris brassica)的后胆色素-结合蛋白(BBP)的氨基酸位置28至45、58至69、86至99以及114至129的线性多肽序列的序列位置的四个区段突变。制备抗运载蛋白结合位点的其它方法描述于WO99/16873和WO 05/019254，其各以引用的方式并入本文。
在另一个实施方案中，本发明结合分子包含来自富含半胱氨酸的多肽的结合位点。本发明实践中采用的富含半胱氨酸的结构域通常不形成α-螺旋、β片层或β-筒结构。通常，二硫键促进结构域折叠成为三维结构。通常，富含半胱氨酸的结构域具有至少两个二硫键，更通常至少三个二硫键。一种示例性富含半胱氨酸的多肽是A结构域蛋白。A-结构域(有时称为″补体型重复″)包含约30-50或30-65氨基酸。在一些实施方案中，该结构域包含约35-45氨基酸，在一些情况包含约40氨基酸。在30-50氨基酸中，有约6半胱氨酸残基。六个半胱氨酸中，二硫键通常见于以下半胱氨酸之间：C1和C3、C2和C5、C4和C6。A结构域构成配体结合部分。结构域的半胱氨酸残基被二硫键连接以形成紧凑的、稳定的功能独立部分。这些重复的簇形成配体结合结构域，不同的簇集可赋予配体结合的特异性。含有A-结构域的示例性蛋白包括，如，补体成分(如，C6、C7、C8、C9和因子I)、丝氨酸蛋白酶(如，肠肽酶、matriptase和corin)、跨膜蛋白(如，ST7、LRP3、LRP5和LRP6)和内吞受体(如，选蛋白相关受体、LDL受体、VLDLR、LRP1、LRP2和ApoER2)。制备期望的结合特异性的结构域蛋白的方法公开于，例如WO02/088171和WO 04/044011，其各以引用的方式并入本文。
在其它实施方案中，本发明结合分子包含来自重复蛋白的结合位点。重复蛋白是包含堆叠在一起形成连续结构域的小(如，约20至约40氨基酸残基)结构单元的连续拷贝或重复的蛋白。通过调整蛋白中重复的数目，重复蛋白可被修饰以适合特定靶结合位点。示例性重复蛋白包括设计的锚蛋白重复蛋白(即，，Molecular Partners，Zurich，Switzerland)(参见如，Binz等人，Nat.Biotechnol.，22：575-582(2004))或富含亮氨酸的重复蛋白(即，LRRP)(参见如，Pancer等人，Nature，430：174-180(2004))。所有目前确定的锚蛋白重复单元三级结构共有特征是包含β-发夹，随后是两个逆平行的α-螺旋，并结束于连接重复单元与下一个重复单元的环。锚蛋白重复单元建立的结构域通过堆叠重复单元为延伸和弯曲的结构而形成。来自海洋八目鳗和其它无颚纲鱼类的适应性免疫系统的部分的LRRP结合位点类似抗体，因为它们通过在淋巴细胞成熟期间重组一套富含亮氨酸的重复基因而形成。制备DARpin或LRRP结合位点的方法描述于WO 02/20565和WO 06/083275，其各以引用的方式并入本文。
本发明结合分子可采用的其它非免疫球蛋白结合位点包括衍生自Src同源性结构域(如SH2或SH3结构域)、PDZ结构域、β-内酰胺酶、高亲和性蛋白酶抑制剂、或小二硫化物结合蛋白支架诸如蝎毒素的结合位点。制备衍生自这些分子的结合位点的方法已公开于本领域，参见如，Silverman等人，Nat.Biotechnol.，23(12)：1493-4(2005)；Panni等人，J.Biol.Chem.，277：21666-21674(2002)，Schneider等人，Nat.Biotechnol.，17：170-175(1999)；Legendre等人，Protein Sci.，11：1506-1518(2002)；Stoop等人，Nat.Biotechnol.，21：1063-1068(2003)；和Vita等人，PNAS，92：6404-6408(1995)。其他结合位点可衍生自选自由以下组成的组的结合结构域：EGF-样结构域、Kringle-结构域、PAN结构域、Gla结构域、SRCR结构域、Kunitz/牛胰蛋白酶抑制剂结构域、Kazal-型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域、三叶草(P型)结构域、血管假性血友病因子C型结构域、过敏毒素-样结构域、CUB结构域、甲状腺球蛋白I型重复蛋白、LDL-受体A类结构域、Sushi结构域、Link结构域、血小板反应蛋白I型结构域、免疫球蛋白-样结构域、C-型凝集素结构域、MAM结构域、血管假性血友病因子A型结构域、生长调节素B结构域、WAP-型四个二硫化物核结构域、F5/8C型结构域、血液结合素结构域、层粘连蛋白-型EGF-样结构域、C2结构域、CTLA-4结构域、和本领域技术人员已知的其它这种结构域，以及其衍生物和/或变体。其它非免疫球蛋白结合多肽包括(Avidia，Inc.，Mountain View，CA-参见国际PCT公布第WO06/055689号和美国专利公布第2006/0234299号)、
Figure G2008800247098D00762
(BiotechStudio，Cambridge，MA)、(Evogenix，Sydney，Australia-参见美国专利第7,166,697号)、和(Nascacell Technologies，Munich，Germany)。
ii.受体和配体的结合部分
在其它方面，本发明结合多肽包含受体的配体结合位点和/或配体的受体结合部分，其可操作地连接于至少一个遗传融合的Fc区。
在某些实施方案中，结合多肽是受体的配体结合部分和/或配体的受体结合部分与遗传融合的Fc区(即，scFc区)的融合体。配体结合受体的任何跨膜区或脂质或磷脂锚识别序列优选地在融合前被失活或缺失。编码配体或配体结合伴侣的DNA在编码期望的ORF区段的DNA的5’和3’端或附近被限制性酶裂解。随后所得的DNA片段易于插入(如，符合读框连接)到编码遗传融合的Fc区的DNA。可根据经验选择进行融合的确切位点以优化可溶融合蛋白的分泌或结合特征。随后编码融合蛋白的DNA亚克隆到合适的表达载体，然后可转染到宿主细胞来表达。
在一个实施方案中，本发明结合多肽组合配体或受体的结合位点(如受体的胞外结构域(ECD))与至少一个遗传融合的Fc区(即，scFc区)。在一个实施方案中，配体或受体结构域的结合结构域将可操作地连接(如经由多肽接头融合)于遗传融合的Fc区的C-末端。N-末端融合也是可能的。在示例性实施方案中，可在遗传融合的Fc区的C-末端、或刚好在遗传融合的Fc区的铰链结构域的N-末端进行融合。
在某些实施方案中，受体的配体结合部分的结合位点或结构域可衍生自前述抗体或抗体变体结合的受体。在其它实施方案中，受体的配体结合部分衍生自选自免疫球蛋白(Ig)超家族的受体(如，可溶T-细胞受体，如，
Figure G2008800247098D00771
(Medigene AG，Munich，Germany)、前述TNF受体超家族的受体(如，免疫粘附素的可溶TNFα受体，如，
Figure G2008800247098D00772
(Wyeth，Madison，NJ))、神经胶质细胞-衍生的神经营养因子(GDNF)受体家族的受体(如，GFRα3)、G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体-门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族和细胞因子受体超家族组成的组的受体。
在其它实施方案中，配体的受体结合部分的结合位点或结构域可衍生自前述抗体或抗体变体结合的配体。例如，配体可结合选自免疫球蛋白(Ig)超家族的受体、TNF受体超家族的受体、G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体-门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族和细胞因子受体超家族组成的组的受体。在一个示例性实施方案中，配体的受体-结合部分的结合位点衍生自属于前述TNF配体超家族的配体(如，CD40L)。
在其它示例性实施方案中，本发明结合多肽可包含衍生自一种或多种以下蛋白的一个或多个配体结合结构域或受体结合结构域：
1.细胞因子和细胞因子受体
细胞因子对淋巴细胞的增殖、分化和功能活化具有多效性作用。各种细胞因子或其受体结合部分均可以用于本发明融合蛋白中。示例性细胞因子包括白介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13和IL-18)，集落刺激因子(CSF)(例如，粒细胞CSF(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)，和单核细胞巨噬细胞CSF(M-CSF))，肿瘤坏死因子(TNF)α和β，细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)，及干扰素如干扰素-α、β或γ(美国专利第4,925,793和4,929,554号)。
细胞因子受体典型地由配体特异的α链和共同的β链组成。示例性细胞因子受体包括GM-CSF、IL-3(美国专利第5,639,605号)、IL-4(美国专利第5,599,905号)、IL-5(美国专利第5,453,491号)、IL10受体、IFNγ(EP0240975)的受体，和TNF受体家族(如，TNFα(如，TNFR-1(EP 417,563)、TNFR-2(EP417,014)淋巴毒素β受体)。
2.粘附蛋白
粘附分子是允许细胞彼此相互作用的膜结合蛋白。各种粘附蛋白，包括白细胞归巢受体和细胞粘附分子，或其受体结合部分，均可以掺入本发明融合蛋白中。白细胞归巢受体在炎症期间表达在白细胞表面上，包括介导与细胞外基质成分结合的β-1整联蛋白(如VLA-1、2、3、4、5和6)、和与血管内皮上的细胞粘附分子(CAM)结合的β2-整联蛋白(例如，LFA-1、LPAM-1、CR3和CR4)。示例性CAM包括ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1和MAdCAM-1。其它CAM包括选择蛋白家族的那些，包括E-选择蛋白、L-选择蛋白和P-选择蛋白。
3.趋化因子
趋化因子-刺激白细胞向感染位点迁移的趋化蛋白-也可以掺入本发明融合蛋白中。示例性趋化因子包括巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α和MIP-1-β)、嗜中性粒细胞趋化因子和RANTES(受活化调节的、正常由T细胞表达分泌的)。
4.生长因子和生长因子受体
生长因子或其受体(或其受体结合部分或配体结合部分)可以掺入本发明融合蛋白中。示例性生长因子包括血管内皮生长因子(VEGF)和其同种型(美国专利第5,194,596号)；成纤维细胞生长因子(FGF)，包括aFGF和bFGF；心房钠尿肽(ANF)；肝生长因子(HGF；美国专利第5,227,155和6,099,541号)、神经营养因子例如骨衍生的神经营养因子(BDNF)、神经胶质细胞衍生的神经营养因子配体(如，GDNF、neuturin、artemin和persephin)、神经营养蛋白-3、-4、-5、或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)、或神经生长因子例如NGF-β血小板衍生生长因子(PDGF)(美国专利第4,889,919、4,545,075、5,910,574和5,877,016号)；转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β(WO 90/14359)，骨诱导因子包括骨形成蛋白(BMP)；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II；美国专利第6,403,764和6,506,874号)；促红细胞生成素(EPO)；血小板生成素(TPO)；干细胞因子(SCF)，血小板生成素(TPO，c-Mpl配体)，和Wnt多肽(美国专利第6,159,462号)。
可以用作本发明靶向受体结构域的示例性生长因子受体包括EGF受体；VEGF受体(如，Flt1或Flk1/KDR)、PDGF受体(WO 90/14425)；HGF受体(美国专利第5,648,273和5,686,292号)，和神经营养受体包括结合NGF、BNDF和NT-3的低亲和受体(LNGFR)，也称作p75NTR或p75，以及作为受体酪氨酸激酶trk家族成员的高亲和受体(如trkA、trkB(EP 455,460)、trkc(EP522,530))。
5.激素
用作本发明融合蛋白中靶向剂的示例性生长激素包括肾素、人生长激素(HGH；美国专利第5,834,598号)、N-甲硫氨酰基人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素(PTH)；甲状腺刺激激素(TSH)；甲状腺素；胰岛素原和胰岛素(美国专利第5,157,021和6,576,605号)；滤泡刺激激素(FSH)、降钙素、黄体生成素(LH)、瘦蛋白、胰高血糖素；铃蟾肽(bombesin)；促生长素；Mullerian抑制物；松弛素和松弛素原；促性腺激素相关肽；催乳素；胎盘催乳激素；OB蛋白；或mullerian抑制物。
6.凝血因子
在本发明融合蛋白中用作靶向剂的示例性血液凝结因子包括凝血因子(例如因子V、VII、VIII、IX、X、XI、XII和XIII、von Willebrand因子)；组织因子(美国专利第5,346,991、5,349,991、5,726,147和6,596,84号)；凝血酶和凝血酶原；纤维蛋白和纤维蛋白原；纤溶酶和纤溶酶原；纤溶酶原激活物，例如尿激酶或人类尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)。
在一种示例性实施方案中，本发明结合多肽是包含可溶LTβR受体和scFc区的融合蛋白或免疫粘附素。例如，结合多肽可包含SEQ ID NO：37(ASK057)的重链序列。
在另一示例性实施方案中，本发明结合多肽是包含干扰素(如，β-干扰素)和scFc区的融合蛋白或免疫粘附素。例如，结合多肽可包含SEQ ID NO：39(EAG2149)的重链序列。
在另一示例性实施方案中，本发明结合多肽是包含可溶LTβR受体和scFc区的融合蛋白或免疫粘附素。例如，结合多肽可包含SEQ ID NO：41(EAG2190)或SEQ ID NO：43(EAG2191)的重链序列。
III.多特异性结合多肽
在某些特定方面，本发明的结合多肽是多特异性的，即，具有结合于第一分子或分子表位的至少一个结合位点和结合于第二分子或第一分子的第二表位的至少一个第二结合位点。本发明的多特异性结合分子可包含至少两个结合位点，其中至少一个结合位点衍生自来自前述结合分子的结合位点或包含来自前述结合分子的结合位点。在某些实施方案中，本发明多特异性结合分子的至少一个结合位点是抗体的抗原结合区或其抗原结合片段(如前述抗体或抗原结合片段)。
(a)双特异性分子
在一个实施方案中，本发明结合多肽是双特异性的。双特异性结合多肽可以与例如相同靶分子上的或不同靶分子上的两个不同靶位点结合。例如，在本发明结合多肽的情况下，其双特异性变体可以与例如相同抗原或两个不同抗原上的两个不同表位结合。双特异结合多肽可以用于例如诊断和治疗应用。例如，它们可以用固定酶以在免疫测定中使用。它们还可以，例如通过与肿瘤相关分子和可检测标记(例如紧密地结合放射性核素的螯合剂)结合，用于诊断和治疗癌症。双特异性结合多肽还可以，例如通过使细胞毒性指向特异靶标(例如通过与病原体或肿瘤细胞和细胞毒性触发分子，例如T细胞受体或Fcγ受体结合)，用于人类治疗。双特异性结合多肽还可以用作例如纤维蛋白溶解剂或疫苗佐剂。
双特异性结合多肽的例子包括具有至少两个针对不同肿瘤细胞抗原的臂的双特异性结合多肽；具有至少一个针对肿瘤细胞抗原的臂和至少一个针对细胞毒性触发分子的臂的双特异性改变的结合蛋白(诸如抗-Fc.γ.RI/抗-CD15、抗-p185.sup.HER2/Fc.γ.RIII(CD16)、抗CD3/抗恶性B细胞(1D10)、抗CD3/抗p185.sup.HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗肾细胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗结肠癌)、抗CD3/抗刺激黑素细胞的激素类似物、抗EGF受体/抗CD3、抗CD3/抗CAMAl、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相关抗原(anti-pan carcinoma associated antigen)(AMOC-31)/抗CD3)；具有至少一个特异地与肿瘤抗原结合的臂和至少一个与毒素结合的臂的双特异性结合多肽(例如，抗皂草素/抗Id-1、抗CD22/抗皂草素、抗CD7/抗皂草素、抗CD38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒素A链、抗-干扰素-.α.(IFN-.α.)/抗杂交瘤独特型、抗CEA/抗长春花生物碱)；用于转化酶激活的前药的双特异性结合多肽(例如，抗CD30/抗碱性磷酸酶(该酶催化丝裂霉素磷酸酯前药转化成丝裂霉素醇))；可以用作纤维蛋白溶解剂的双特异性结合多肽(例如，抗纤维蛋白/抗组织纤溶酶原激活物(tPA)、抗纤维蛋白/抗尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA))；使免疫复合物定向于细胞表面受体的双特异性结合多肽(例如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fc受体(如Fc.γ.RI、Fc.γ.RII或Fc.γ.RIII))；用于治疗感染性疾病的双特异性结合多肽(例如，抗CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T细胞受体：CD3复合物/抗流感病毒、抗-Fc.γ.R/抗-HIV)；用于体外或体内检测肿瘤的双特异性结合多肽例如抗-CEA/抗-EOTUBE、抗-CEA/抗-DPTA、抗-p185HER2/抗-半抗原)；作为疫苗佐剂的双特异性结合多肽(见Fanger等人，同上引文)；和作为诊断工具的双特异性结合多肽(例如抗兔IgG/抗铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生长素抑制素/抗P物质、抗-HRP/抗-FITC、抗-CEA/抗-.β.-半乳糖苷酶(见Nofan等人，同上引文))。三特异性多肽的例子包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。
在优选的实施方案中，本发明双特异性结合多肽具有结合于CRIPTO-I的一条臂。在另一优选实施方案中，本发明的双特异性结合多肽具有结合于ITβR的一条臂。在另一优选实施方案中，本发明的双特异性结合多肽具有结合于TRAIL-R2的一条臂。在另一优选实施方案中，本发明双特异性结合多肽具有结合于LTβR的一条臂和结合于TRAIL-R2的一条臂。
本发明多特异性结合多肽可以对每种特异性而言是单价的，或者可以对每种特异性而言是多价的。例如，本发明结合多肽可以包含一个与第一靶分子反应的结合位点和一个与第二靶分子反应的结合位点，或者其可以包含两个与第一靶分子反应的结合位点和两个与第二靶分子反应的结合位点。
本发明结合多肽可具有至少两个来自配体或受体的两个或多个结合结构域的结合特异性。它们可组装为异二聚体、异三聚体或异四聚体，基本如公开于WO 89/02922(1989年4月6日公开)、EP 314,317(1989年5月3日公开)、和1992年5月2日授权的美国专利第5,116,964号的。实例包括CD4-IgG/TNF受体-IgG和CD4-IgG/L-选择蛋白-IgG。最后提到的分子联合淋巴细胞归巢受体(LHR、L-选择蛋白)的淋巴结结合功能和CD4的HIV结合功能，可能应用于预防或治疗HIV感染、相关病症，或作为诊断剂。
(b)含有scFv的多特异性结合分子
在一个实施方案中，本发明的多特异性结合分子是包含至少一个scFv分子例如前述的scFv分子的多特异性结合分子。在其它实施方案中，本发明的多特异性结合分子包含两个scFv分子，如双特异性scFv(Bis-scFv)。在某些实施方案中，scFv分子是常规scFv分子。在其它实施方案中，scFv分子是前述的稳定化的scFv分子。在某些实施方案中，多特异性结合分子可通过连接scFv分子(如，稳定化的scFv分子)与包含scFc分子的结合分子支架而产生。在一个实施方案中，起始分子选自前述结合分子，scFv分子和起始结合分子具有不同结合位点。例如，本发明结合分子可包含连接于第二scFv分子或非scFv结合分子、具有第一结合特异性的scFv分子，该第二scFv分子或非scFv结合分子赋予第二结合特异性。在一个实施方案中，本发明结合分子是天然存在抗体，已融合了稳定化的scFv分子。
当稳定化的scFv连接于母体结合分子时，稳定化的scFv分子的键合优选地改进结合分子的热稳定性至少约2℃或3℃。在一个实施方案中，与常规结合分子相比，含有scFv的本发明结合分子具有1℃的改进的热稳定性。在另一个实施方案中，与常规结合分子相比，本发明结合分子具有2℃的改进的热稳定性。在另一个实施方案中，与常规结合分子相比，本发明结合分子具有4、5、6℃的改进的热稳定性。
在一个实施方案中，本发明多特异性结合分子包含至少一个scFv(如2、3或4scFv，如，稳定化的scFv)。关于scFv分子的进一步细节可见于USSN11/725,970，以引用的方式并入本文。
在一个实施方案中，本发明结合分子是多特异性多价结合分子，具有带有第一结合特异性的至少一个scFv片段和带有第二结合特异性的至少一个scFv。在优选的实施方案中，至少一个scFv分子是稳定化的。
在另一个实施方案中，本发明结合分子是scFv四价结合分子。在优选的实施方案中，至少一个scFv分子是稳定化的。
(c)多特异性结合分子片段
在某些实施方案中，本发明结合多肽可包含来自多特异性结合分子片段的结合位点。多特异性结合分子片段包括双特异性Fab2或多特异性(如三特异性)Fab3分子。例如，多特异性结合分子片段可包含具有不同特异性的Fab或scFv分子的化学结合的多聚体(如二聚体、三聚体或四聚体)。
(d)串联可变结构域结合分子
在其它实施方案中，本发明多特异性结合分子可包含含有串联抗原结合位点的结合分子。例如，可变结构域可包含被工程化以包含直接融合或成串连接的至少两个(如，两个、三个、四个或更多)可变重结构域(VH结构域)的抗体重链和被工程化以包含直接融合或成串连接的至少两个(如，两个、三个、四个或更多)可变轻结构域(VL结构域)的抗体轻链。VH结构域与相应VL结构域相互作用以形成一串抗原结合位点，其中至少两个结合位点结合不同表位。串联可变结构域结合分子可包含两个或多个重或轻链并具有更高级的价(如，二价或四价)。制备串联可变结构域结合分子的方法是本领域已知的，参见如WO 2007/024715。
(e)双重特异性结合分子
在其它实施方案中，本发明多特异性结合分子可包含具有双重结合特异性的单个结合位点。例如，本发明的双重特异性结合分子可包含与两个表位交叉反应的结合位点。产生双重特异性结合分子的领域公认的方法是本领域已知的。例如，双重特异性结合分子可通过筛选结合第一表位两者的结合分子并反筛选(counter screening)分离的结合分子结合第二表位的能力而分离。
(f)多特异性融合蛋白
在另一个实施方案中，本发明多特异性结合分子是多特异性融合蛋白。本文所用的术语″多特异性融合蛋白″指定具有至少两个结合特异性且还包含scFc的融合蛋白(如上定义的)。多特异性融合蛋白可组装为如，异二聚体、异三聚体或异四聚体，基本如公开于WO 89/02922(1989年4月6日公开)、EP 314,317(1989年5月3日公开)和1992年5月2日授权的美国专利第5,116,964号。优选的多特异性融合蛋白是双特异性的。在某些实施方案中，多特异性融合蛋白的至少结合特异性包含scFv，如，稳定化的scFv。
本领域技术人员使用常规重组DNA技术可开发多种其它多价抗体构建体，例如描述于PCT国际申请第PCT/US86/02269号；欧洲专利申请第184,187号；欧洲专利申请第171,496号；欧洲专利申请第173,494号；PCT国际公布第WO 86/01533号；美国专利第4,816,567号；欧洲专利申请第125,023号；Better等人(1988)Science 240：1041-1043；Liu等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Liu等人(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：214-218；Nishimura等人(1987)Cancer Res.47：999-1005；Wood等人(1985)Nature 314：446-449；Shaw等人(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-1559)；Morrison(1985)Science229：1202-1207；Oi等人(1986)BioTechniques 4：214；美国专利第5,225,539号；Jones等人(1986)Nature 321：552-525；Verhoeyan等人(1988)Science 239：1534；Beidler等人(1988)J.Immunol.141：4053-4060；以及Winter和Milstein，Nature，349，第293-99页(1991))。优选地非人类的抗体通过连接非人类的抗原结合结构域与人类恒定结构域而被“人源化”(如Cabilly等人，美国专利第4,816,567号；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，第6851-55页(1984))。
可用于制备多价抗体构建体的其它方法描述在以下出版物：Ghetie，Maria-Ana等人(2001)Blood 97：1392-1398；Wolff，Edith A.等人(1993)CancerResearch 53：2560-2565；Ghetie，Maria-Ana等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.94：7509-7514；Kim，J.C.等人(2002)Int.J.Cancer 97(4)：542-547；Todorovska，Aneta等人(2001)Journal of Immunological Methods 248：47-66；Coloma M.J.等人(1997)Nature Biotechnology 15：159-163；Zuo，Zhuang等人(2000)ProteinEngineering(增刊.)13(5)：361-367；Santos A.D.，等人(1999)Clinical CancerResearch 5：3118s-3123s；Presta，Leonard G.(2002)Current PharmaceuticalBiotechnology 3：237-256；van Spriel，Annemiek等人，(2000)ReviewImmunology Today 21(8)391-397。
IV.制备结合多肽
选择了为了并入scFc支架的结合位点后，许多方法可用于产生本发明结合分子。连接衍生自抗体或其它分子的期望的靶结合位点于scFc支架的方法是本领域已知的。
应理解的是，因为密码子的简并性，多种核酸序列将编码结合多肽的氨基酸序列。通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变此前制备的编码靶多肽的多核苷酸，可产生期望的多核苷酸。
寡核苷酸-介导的诱变是一种制备取代、符合读框的插入或改变(如，改变的密码子)以引入编码氨基酸取代的密码子(如，引入到Fc变体部分)的方法。例如，通过将编码期望的突变的寡核苷酸与单链DNA模板杂交而改变起始多肽DNA。杂交后，DNA聚合酶用于合成并入寡核苷酸引物的模板的全长第二互补链。在一个实施方案中，遗传工程如，基于引物的PCR诱变，足以并入本文定义的改变以产生编码本发明结合多肽的多核苷酸。
编码结合多肽的多核苷酸序列随后可插入适当的表达载体并转染到本来不产生所述蛋白的原核或真核宿主细胞诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞以重组表达。
为了本发明的目的，可采用多种表达载体系统。这些表达载体通常在宿主生物体中作为游离基因或作为宿主染色体DNA的整合部分可复制。表达载体可包括表达控制序列，包括但不限于启动子(如，天然伴随的或异源启动子)、增强子、信号序列、剪接信号、增强子元件、和转录终止序列。优选地，表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统。表达载体还可利用衍生自动物病毒诸如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)、巨细胞病毒(CMV)或SV40病毒的DNA元件。其它载体涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。
通常，表达载体包含选择标记(如，氨苄西林抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以允许检测以期望的DNA序列转化的那些细胞(参见如，Itakura等人，美国专利第4,704,362号)。已将DNA整合进其染色体的细胞可通过引入一个或多个允许选择转染的宿主细胞的标记而选择。标记可提供对营养缺陷宿主的原养型、杀生物剂抗性(如，抗生素)或对重金属诸如铜的抗性。选择标记基因可直接连接于待表达的DNA序列，或可通过共转化引入同一细胞。
一种优选的表达载体是NEOSPLA(美国专利第6,159,730号)。该载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β球蛋白主启动子、SV40复制原点、牛生长激素多腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已发现，在该载体中引入可变和恒定区基因，转染CHO细胞，然后在含有G418的培养基中进行挑选和氨甲蝶呤扩增会造成抗体的高水平表达。美国专利第5,736,137和5,658,570号中也有关于载体系统的教导，这两篇专利均以参考的方式全文并入本文。该系统提供高水平表达，如，＞30pg/细胞/天。其它示例性载体系统描述于如，美国专利第6,413,777号。
当本发明结合多肽包含抗体的抗原结合位点时，任选地连接于遗传融合的Fc区(即，scFc区)的编码另外的轻和重链可变区的多核苷酸，可插入到相同或不同表达载体。编码免疫球蛋白链的DNA区段可操作地连接于表达载体中的控制序列，这确保免疫球蛋白多肽的表达。
在其它优选实施方案中，本发明的结合多肽可以用多顺反子构建体来表达。在这些表达系统中，多个目的基因产物，比如多聚结合蛋白的多个结合多肽可以由单个多顺反子构建体产生。这些系统有利地利用了一个内部核糖体进入位点(IRES)来提供在真核宿主细胞内相对高水平表达本发明多肽。适用的IRES序列在美国专利第6,193,980号中公开，该专利同样引入本文。本领域技术人员能够意识到，可以利用这类表达系统来高效地产生本申请公开的各种多肽。
更一般地，在制备编码结合多肽的载体或DNA序列之后，可以将表达载体导入合适的宿主细胞。即可以转化宿主细胞。质粒可以通过本领域技术人员所熟知的多种技术导入宿主细胞。这些技术包括但不限于，转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、与包被DNA进行的细胞融合、显微注射以及用完整病毒进行感染。参见，Ridgway，A.A.G.″MammalianExpression Vectors(哺乳动物表达载体)″第24.2章，第470-472页Vectors(载体)，Rodriguez和Denhardt，编辑.(Butterworths，Boston，Mass.1988)。最优选地，质粒借助电穿孔导入宿主。将转化细胞在适合产生轻链和重链的条件下生长，测定重链和/或轻链蛋白合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附检定法(ELISA)、放射免疫分析(RIA)或荧光激活的细胞分选法(FACS)、免疫组织化学法及类似测定技术。
本文所用的术语“转化”广义上用来指DNA导入受体宿主细胞，其改变基因型从而造成了受体细胞的变化。
依此类推，“宿主细胞”是指转化了利用重组DNA技术构建的编码至少一种异源基因的载体的细胞。在描述从重组宿主中分离结合多肽的过程时，术语″细胞″和″细胞培养物″可以交换使用来指示结合多肽的来源，除非另外清楚地说明。换句话说，从“细胞”中回收多肽可能意味着从离心沉淀的完整细胞，或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物中回收。
用于蛋白表达的宿主细胞系最优选是来源于哺乳动物的；本领域技术人员有能力优先确定最适合期望的基因产物在其中表达的具体宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括，但不限于DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR-)、HELA(人类宫颈癌细胞)、CVI(猴肾细胞系)、COS(带有SV40T抗原的CVI衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3.×63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人类淋巴细胞)和293(人类肾细胞)。尤其优选CHO细胞。宿主细胞系通常可以得自商业服务机构、美国组织培养物保藏中心或公开文献。
编码本发明多肽的基因也可以在非哺乳动物细胞内进行表达，比如细菌或酵母或植物细胞。就此而言，应该意识到各种单细胞非哺乳动物微生物比如细菌也可以被转化；即那些能够在培养基中或发酵生长的。易于被转化的细菌，包括肠杆菌科的成员，比如大肠杆菌或沙门氏菌菌株；芽孢杆菌科，比如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌；链球菌和流感嗜血杆菌。还应该意识到，在细菌中进行表达时，多肽通常成为内涵体的一部分。多肽必须被分离、纯化，然后组装成功能性分子。
除了原核生物，还可使用真核微生物。酿酒酵母或普通面包酵母是最常用的真核微生物，而多种其它株系通常也可用。对于在酵母中表达，通常使用质粒YRp7，例如(Stinchcomb等人，(1979)，Nature，282：39；Kingsman等人，(1979)，Gene，7：141；Tschemper等人，(1980)，Gene，10：157)。该质粒已包含TRP1基因，其为缺少在色氨酸中生长的能力的酵母突变株例如ATCC No.44076或PEP4-1提供选择标记(Jones，(1977)，Genetics，85：12)。作为酵母宿主细胞基因组特征，trpl损伤的存在随后提供有效环境来通过在不存在色氨酸时生长检测转化。也可采用其它酵母宿主如毕赤酵母。期望酵母表达载体具有表达控制序列(如，启动子)、复制起点、终止序列和类似序列。典型启动子包括3-磷酸甘油酯激酶和其它糖解酶。诱导型酵母启动子包括，除了其它以外，来自乙醇脱氢酶、异细胞色素C以及负责甲醇、麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
替代地，可以将编码多肽的核苷酸序列掺入转基因中用于导入转基因动物的基因组和随后在转基因动物的奶中表达(见例如，Deboer等人，US5,741,957，Rosen，US 5,304,489和Meade等人，US 5,849,992)。适宜的转基因包括可操作地与来自乳腺特异基因如酪蛋白或β乳球蛋白的启动子和增强子连接的结合多肽的编码序列。
体外生长允许放大规模以获得大量期望的多肽。组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术是本领域已知的，并包括均一的悬浮培养，如在气升式反应器或连续搅拌反应器中，或固定或捕获的细胞培养，如在空心纤维、微囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷芯上。如果需要和/或期望，多肽溶液可通过常规层析方法纯化，例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE-纤维素上的层析或(免疫-)亲合层析，如，在优先生物合成合成的铰链区多肽之后或在本文所述的HIC层析步骤之前或之后。亲和性标签序列(如His(6)标签)可任选地附加或包括在多肽序列中以便于下游纯化。
在其中本发明的结合多肽形成多聚的蛋白或多聚体(如，二聚的结合多肽)的情况，多聚的蛋白可使用单个载体或两个载体表达。当结合多肽在不同表达载体上克隆时，共转染载体以获得表达和组装完整全蛋白。表达后，全蛋白、其二聚体、单独多肽(如结合多肽)、或其它形式可以根据本领域标准方法，包括硫酸铵沉淀、亲和柱层析、HPLC纯化、凝胶电泳及类似方法纯化(一般见Scopes，Protein Purification(蛋白纯化)(Springer-Verlag，N.Y.，(1982))。对于制药应用，至少约90至95％均质性的大致纯的蛋白是优选的，98至99％或更高均质性最优选。
V.纯化结合分子
在一个实施方案中，本发明涉及从包含遗传融合的Fc区的单链(即，单体)scFc结合分子纯化表达为包含遗传融合的Fc区(即，scFc区)的双链(即，二聚的)scFc结合分子的本发明结合分子的方法。在其它实施方案中，本发明提供从单链scFc结合分子纯化双链scFc结合分子的方法。
在一个实施方案中，包含单链scFc蛋白和双链scFc蛋白两者的群体可通过大小排阻层析纯化。例如，单链scFc结合分子可从聚集体和双链scFc分子分离，如，使用Superdex 200凝胶过滤柱。如通过还原和非还原SDS-PAGE可分析凝胶过滤级分，并组合合适的级分以获得单链Fc和双链Fc群体的均一的池。这些池可进一步表征以确定分子的均质性和分子质量，如，通过连线光散射分析的分析性SEC(TSK-Gel G3000 SWXL柱)。本发明还涉及包含遗传融合的Fc结构域的双链scFc结合分子(即，二聚的scFc结合分子)的纯化群体以及包含遗传融合的Fc结构域的单链scFc结合分子(即，单体scFc结合分子)的纯化群体。
VI.标记或结合功能性部分
本发明结合多肽可以以非结合形式来使用，或者可结合多种功能性部分中的至少一种，从而例如便于检测靶或者给患者成像或治疗。本发明多肽可以在纯化之前或之后，或进行纯化时被标记或结合。具体地，本发明多肽可结合(如，经由工程化的半胱氨酸残基)于功能性部分。功能性部分优选地附着于结合多肽的结合位点以外的部分(如，多肽接头或遗传融合的Fc区(即，scFc区)的Fc部分)。
示例性功能性部分包括亲和性部分和效应子部分。示例性效应子部分包括细胞毒素(比如放射性同位素、细胞毒性药物或毒素)、治疗剂、细胞抑制剂、生物毒素、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、药剂、免疫活性配体(例如淋巴因子或其它抗体，其中所得分子既能结合赘生性细胞，又结合效应细胞，比如T细胞)、PEG或用于成像的可检测部分。在另一个实施方案中，本发明多肽可以结合到能降低肿瘤血管形成的分子。在其它实施方案中，公开的组合物可包含偶联了药物或前药的本发明多肽。本发明的其他实施方案包括结合了特异性生物毒素(比如蓖麻毒蛋白、白树毒蛋白(gelonin)、假单胞菌外毒素或白喉毒素)或其细胞毒性片段的本发明多肽的用途。选择使用结合或未结合多肽取决于癌症的类型和发展阶段、所用的辅助治疗(例如化疗或外部放疗)以及患者的状态。应当意识到，本领域技术人员根据本文的教导可以容易地作出这类选择。
应当意识到，在以前的研究中，标记了同位素的抗肿瘤抗体已被成功地用于在动物模型中，在一些情形在人类中破坏实体瘤的细胞以及淋巴瘤/白血病细胞。示例性放射性同位素包括：90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。放射性核素通过产生电离辐射，引起核DNA多处链断裂，导致细胞死亡而作用。用于产生治疗结合物的同位素典型地产生具有短路径长度的高能α或β粒子。这些放射性核素杀伤其邻近的细胞，例如该结合物所附着的或已经进入的赘生性细胞。它们对非被定位的细胞很少或无作用。放射性核素基本上是无免疫原性的。
在与本发明相关的放射标记结合物的使用方面，本发明结合多肽可以直接标记(比如通过电离)或利用螯合剂来间接标记。本文所用的短语“间接标记”和“间接标记方法”均意味着螯合剂共价地连接结合多肽，而至少一种放射性核素与该螯合剂相关联。这些螯合剂通常是指双功能螯合剂，因为它们既能结合多肤，又能结合放射性同位素。特别优选的螯合剂包括1-异硫氰酸苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(″MX-DTPA″)和环己基二乙三胺五乙酸(″CHX-DTPA″)衍生物。其它螯合剂包括P-DOTA和EDTA衍生物。特别优选的用于间接标记的放射性核素包括111In和90Y。
本文所用的短语“间接标记”和“间接标记方法”均意味着放射性核素直接共价地连到多肽上(通常借助氨基酸残基)。更具体的说，这些连接技术包括随机标记和定点标记。在后一种情况中，标记定点到多肽上的特定位点，比如仅存在于结合物Fc部分的N-连接的糖残基。此外，各种直接标记技术和实验方案是适用于本发明的。例如，锝-99m标记的多肽可以通过配体交换过程来制备，即通过用锡离子溶液还原锝酸盐(Pertechnate)(TcO4-)，将被还原的锝鳌合到Sephadex柱上，将多肽上样到该柱子上；或者通过批量标记技术，例如将锝酸盐、还原剂(比如SnCl2)、缓冲液(比如邻苯二甲酸钠钾溶液)，以及抗体一起孵育。在任何情况中，用于直接标记抗体的优选放射性核素是本领域公知的，特别优选用于直接标记的放射性核素是通过酪氨酸残基共价连接的131I。根据本发明的多肽可以用例如放射性碘化钠或碘化钾和化学氧化剂(比如次氯酸钠、氯胺T或类似物)，或者酶学氧化剂(例如，乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖)来进行衍生。但是，为了本发明的目的，特别优选的是间接标记方法。
关于螯合剂和螯合剂结合物的专利是本领域已知的。例如，Gansow的美国专利第4,831,175号涉及多重取代的二乙三胺五乙酸螯合物，和含有该螯合物的蛋白结合体，以及它们的制备方法。Gansow的美国专利第5,099,069、5,246,692、5,286,850、5,434,287和5,124,471号还涉及到多重取代的DTPA螯合物。这些专利均全文引入本文。其它适用的金属螯合剂的例子是乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DPTA)、1，4，8，11-四氮杂十四烷、1，4，8，11-四氮杂十四烷-1，4，8，11-四乙酸、1-氧代-4，7，12，15-四氮杂十七烷-4，7，12，15-四乙酸及类似物。环己基-DTPA或CHX-DTPA是特别优选的，在下文有大量的例子。还有其它一些适用的螯合剂，包括有待发现的，可很容易地被技术人员识别，显然在本发明的范围内。
优选共同待决申请序列号08/475,813、08/475,815和08/478,967中用于协助螯合的相容螯合剂，包括特异性双官能螯合剂来提供对三价金属的高亲和性，显示升高的肿瘤对非肿瘤比率，骨吸收下降以及更高的放射性核素在体内目标部位(即B细胞淋巴瘤肿瘤位点)的累积。但是，可具备或可以不具备所有这些特点的其他双官能螯合剂也是本领域已知的，并且有益于肿瘤治疗。
还应当意识到，与本文的教导一致的，为了诊断和治疗目的，结合多肽可以结合不同的放射性标记。为了这个目的，前面提到的共同待决申请(以参考的方式全文引入本文)公开了放射性标记的治疗结合物，其用于在施用治疗抗体前进行肿瘤诊断“成像”。“In2B8”结合物包含鼠单克隆抗体2B8，该抗体对人类CD20抗原具有特异性，借助双官能螯合剂连接于111In，其中所述螯合剂是包含1：1混合的1-异硫氰酸苄基-3-甲基-DTPA和1-甲基-3-异硫氰酸苄基-DTPA的MX-DTPA(二乙三胺五乙酸)。111In是特别优选的诊断放射性核素，因为在约1到10mCi可以安全地施用而没有可检测到的毒性；成像数据通常可以预测后续的90Y标记的抗体分布。多数成像研究使用5mCi111In标记的抗体，因为这个剂量既安全又比更低剂量具有增加的成像效率，最佳成像出现在施用抗体后的3到6天。参见，例如Murray，J.Nuc.Med.26：3328(1985)和Carraguillo等人，J.Nuc.Med.26：67(1985)。
如上文所述，有许多放射性核素可以用于本发明，本领域技术人员可以容易地确定各种情况下，哪种放射性核素是最合适的。例如，131I是公知用于靶向免疫治疗的放射性核素。然而，131I的临床应用可能受到几个因素的限制，包括：物理半衰期为8天；碘化抗体在血液和肿瘤部位的脱卤作用；以及发射特性(例如，γ成分高)，这对肿瘤局部剂量蓄积可能是次优的。随着更佳螯合剂的出现，在蛋白上连接金属螯合基团的机会提高了利用其它放射性核素诸如111In和90Y的机会。90Y提供了几个用于放射免疫治疗应用的优势：90Y的半衰期是64小时长，足够抗体在肿瘤部位的积累；并且与例如131I不同，90Y是纯的高能β射线源，在衰变过程中无伴随的γ辐射；于100到1,000细胞直径的组织范围内。另外，最低贯穿辐射量使得可以门诊施用90Y-标记的抗体。此外，细胞杀伤不要求标记抗体内在化，电离辐射的局部发射对没有靶分子的临近肿瘤细胞是致死的。
本领域技术人员会意识到，这些非放射活性的结合物也可以根据选择的要结合的试剂利用多种技术来组装。例如，通过例如将多肽与生物素的活化酯(比如生物素N-羟基琥珀酰胺酯)进行反应来制备生物素的结合物。类似的，带有荧光标记的结合物可以在有偶联剂(例如前面列举的)的情况下制备，或者通过与异硫氰酸酯，优选异硫氰酸荧光素进行反应来制备。本发明多肽与细胞抑制剂/细胞毒性物质以及金属鳌合剂的结合物可以通过类似的方式制备。
许多效应子分子缺少可以连接结合多肽的适当的官能基团。在一个实施方案中，效应子分子例如药物或前药通过连接分子连到结合多肽上。在一个实施方案中，所述连接分子含有能够在特定位点激活细胞毒性的化学键。合适的化学键是本领域公知的，包括二硫键、酸敏感性键、光敏感性键、肽酶敏感性键、在巯基和马来酰亚胺之间形成的硫醚键，以及酯酶敏感性健。最优选地，所述连接分子包含二硫键或硫醚键。与本发明一致的，所述连接分子优选包含活性化学基团。特别优选的活性化学基团是N-琥珀酰亚胺酯和N-琥珀酰亚胺酯。在优选的实施方案中，所述活性化学基团可以借助硫醇基之间的二硫键共价结合到效应子上。在一个实施方案中，效应物分子被修饰以便含有硫醇基。本领域普通技术人员明白，硫醇基含有与氢原子结合的硫原子，通常在本领域又称为巯基，可以用″--SH″或″RSH″表示。
在一个实施方案中，可以用连接分子将效应子分子与本发明结合多肽连接起来。本发明的连接分子可以是可切割的或不可切割的。在一个实施方案中，可切割连接分子是氧化还原可切割的连接分子，以使该连接分子在较低氧还电势的环境中是可切割的，这种环境比如细胞质和游离巯基的分子浓度较高的其它区域。因为氧还电势的改变而可被切割的连接分子的例子包括那些含有二硫键的。切割刺激可以在本发明结合蛋白被吸收到胞内时提供，在这里细胞质的较低氧还电势促使连接分子被切割。在另一个实施方案中，pH降低引发美登木素生物碱释放到靶细胞内。在许多生理和病理过程中涉及到pH的下降，比如内体转运、肿瘤生长、发炎和心肌局部缺血。pH由生理值7.4下降到内体中的5-6或者溶酶体中的4-5。可以用来靶向癌细胞的溶酶体或内体的酸敏感性连接分子的例子包括带有比如见于乙缩醛、缩酮、原酸酯、腙、三苯甲基、顺aconityl或硫代氨甲酰的酸敏感性键的那些(参见例如，Willner等人，(1993)，Bioconj.Chem.，4：521-7；美国专利第4,569,789、4,631,190、5,306,809和5,665,358号)。其它示例性酸敏感性连接分子包含二肽序列Phe-Lys和Val-Lys(King等人，(2002)，J.Med.Chem.，45：4336-43)。切割刺激可以由摄取到胞内并运输到低pH的内体区室(例如溶酶体)来提供。其它示例性酸切割连接分子是含有两个或多个供两个或多个美登木素生物碱附着的酸切割键的分子(King等人，(1999)，Bioconj.Chem.，10：279-88；WO98/19705)。
可切割的连接分子可以是对生物供应的与特定靶细胞相关的切割试剂(例如，溶酶体或肿瘤相关酶)敏感。可以酶促切割的连接分子的例子包括，但不限于肽和酯。示例性可酶切连接分子包括对肿瘤相关蛋白酶，比如组织蛋白酶B或血纤蛋白溶酶敏感的那些(Dubowchik等人，(1999)，Pharm.Ther.，83：67-123；Dubowchik等人，(1998)，Bioorg.Med.Chem.Lett.，8：3341-52；deGroot等人，(2000)，J.Med.Chem.，43：3093-102；de Groot等人，(1999)m 42：5277-83)。组织蛋白酶B可切割的位点包括二肽序列缬氨酸-瓜氨酸和苯丙氨酸-赖氨酸(Doronina等人，(2003)，Nat.Biotech.，21(7)：778-84)；Dubowchik等人，(2002)，Bioconjug.Chem.，13：855-69)。其它示例性酶切位点包括由4到16个氨基酸的寡肽序列形成的那些(例如，Suc-β-Ala-Leu-Ala-Leu)，该位点可以被trouse蛋白酶，比如甲拌磷寡肽酶(TOP)识别，该酶优先由嗜中性粒细胞、巨噬细胞和其它粒细胞释放。
在进一步实施方案中，本发明结合多肽与下式连接分子反应：
X-Y-Z
其中：
X是附着分子；
Y是间隔子分子；且
Z是效应子附着部分。
术语“附着分子”包括使得连接分子能共价附着到本发明结合多肽的分子。所述附着分子可以包含，例如1-60个碳、氧、氮、硫原子的共价链，任选以氢原子和其它使得结合分子能行使其预期功能的取代基取代。附着分子可以包含肽、酯、烷基、烯基、炔基、芳基、醚、硫醚等官能基团。优选的，选择附着分子以使它能与包含至少一个抗原结合位点的多肽上的活性官能基团发生反应，形成本发明的结合分子。附着部分的例子包括，例如氨基、羧基和硫醇附着分子。
氨基附着分子包括与结合多肽上的氨基反应，从而形成修饰的多肽的分子。氨基附着分子是本领域已知的。氨基附着分子的例子包括，活化脲(例如，与结合分子上的氨基发生反应形成包含脲基团的连接分子)、醛(例如，能与结合分子上的氨基发生反应)，以及活化异硫氰酸酯(其能与结合多肽上的氨基发生反应形成包含脲基团的连接分子)。氨基附着分子的例子包括，但不限于N-琥珀酰亚胺基、N-磺基琥珀酰亚胺基、N-对酞内酰胺基(phthahmidyl)、N-磺基对酞内酰胺基、2-硝基苯基、4-硝基苯基、2，4-二硝基苯基、3-磺酰基-4-硝基苯基或3-羧基-4-硝基苯基分子。
羧基附着分子包括能与结合多肽上的羧基基团发生反应，从而形成修饰的本发明结合多肽的分子。羧基附着分子是本领域已知的。羧基附着分子的例子包括但不限于活化的酯中间体和活化的羰基中间体，它们能与结合多肽上的COOH基团发生反应，形成包含酯、硫酯或酰胺基团的连接分子。
硫醇附着分子包括能与多肽上的硫醇基发生反应，从而形成本发明结合分子的分子。硫醇附着分子是本领域已知的。硫醇附着分子的例子包括但不限于活化的酰基(能与结合分子上的巯基发生反应形成包含硫酯的连接分子)、活化的烷基(能与结合分子上的巯基发生反应形成包含硫酯分子的连接分子)、Michael受体，比如马来酰亚胺或丙烯酸基团(能与结合分子上的巯基发生反应形成Michael型加成产物)、经由氧化还原反应与巯基发生反应的基团、活化的二硫化物基团(能与结合分子上的巯基基团发生反应形成，例如包含二硫化物分子的连接分子)。其它硫醇附着分子包括丙烯酰胺、α-碘乙酰胺以及环丙烷-1，1-二羰基化合物。此外，硫醇附着分子可能含有这样的部分，其能将结合分子上的硫醇修饰形成另外的活性物质，连接分子可结合其上形成本发明的结合分子。
间隔子分子Y是含有一或多个氨基酸残基的共价键或共价原子链。它还可能包含0-60个碳、氧、硫或氮原子，任选被氢或其它使得结合分子能行使其预期功能的取代基所取代。在一个实施方案中，Y包含烷基、烯基、炔基、酯、醚、羰基或酰胺分子。
在另一个实施方案中，结合多肽上的硫醇基被转化为活性基团，比如活性羰基基团，比如酮或醛。然后所述附着分子与酮或醛反应形成修饰的结合多肽。羰基活性附着分子的例子包括，但不限于肼、酰肼、O-取代的羟胺、α-β-不饱和酮，以及H2C＝CH-CO-NH-NH2。修饰可用于形成修饰的结合多肽的硫醇分子的附着分子和方法的其它实例描述在Pratt，M.L.等人J Am ChemSoc.2003 May 21；125(20)：6149-59；和Saxon，E.Science.2000 Mar17；287(5460)：2007-10。
连接分子可以是能与效应子分子或其衍生物发生反应，形成本发明结合分子的分子。例如，效应子分子可以借助二硫键连接到分子的其它部分。在这种情况中，选择连接分子以使它能与合适的效应子部分衍生物发生反应，从而使得该效应子部分附着到本发明结合多肽上。
优选用于本发明的细胞毒性效应子分子是细胞毒性药物，特别是用于癌症疗法的那些。如本文所用，“细胞毒素或细胞毒性剂”指任何对细胞生长和增殖有害并可作用以减少、抑制或破坏细胞或恶性肿瘤的剂。示例性的细胞毒素包括但不限于，放射性核素、生物毒素、酶活性毒素、细胞抑制剂或细胞毒性治疗剂、前药、免疫活性配体和生物应答调节剂(比如细胞因子)。任何阻滞或减慢免疫反应性细胞或恶性肿瘤细胞生长的细胞毒素均在本发明范围内。
示例性细胞毒素通常包括，细胞抑制剂、烷化剂、抗代谢物、抗增殖剂、微管蛋白结合剂、激素和激素拮抗剂、和类似的细胞毒素。与本发明相容的示例性细胞抑制剂包括烷化物质，比如双氯乙基甲胺(mechiorethamine)、三亚乙基磷酰胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑或三亚胺醌，还有亚硝基脲化合物，比如卡莫司汀、洛莫司汀或司莫司汀。
用于结合的示例性分子是美登木素生物碱。美登木素生物碱最初分离自属于美登木属的东非灌木，但后来发现它也是土壤细菌如珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)的代谢物(参见如，美国专利第3,896,111号)。本领域已知美登木素生物碱包括美登素(maytansine)、美登木醇(maytansinol)、美登木醇的C-3酯以及其它美登木醇类似物和衍生物(参见如，美国专利第5,208,020和6,441,163号)。美登木醇的C-3酯可以是天然存在的或合成衍生的。并且，天然存在的和合成的C-3美登木醇酯可以归类为简单羧酸的C-3酯，或与N-甲基-L-丙氨酸衍生物的C-3酯，后者比前者细胞毒性更强。合成的美登木素生物碱类似物是本领域已知的，在例如Kupchan等人，J.Med.Chem.，21，31-37(1978)中有描述。制备美登醇及其类似物和衍生物的方法描述在例如美国专利第4,151,042号。
适合作为结合物的美登木素生物碱可以用本领域已知的方法从天然来源分离，合成制备，或者半合成制备。此外，可以通过任何合适的方式对美登木素生物碱进行修饰，只要最后的结合分子保留了足够的细胞毒性。
特别优选的包含连接分子、含有活性化学基团的美登木素生物碱是美登木醇的C-3酯和它们的类似物，其中连接分子含有二硫键，附着分子包含N-琥珀酰亚胺或N-磺基琥珀酰亚胺酯。美登木素生物碱上的许多位点可以作为例如通过效应子附着分子化学连接连接分子的位置。例如，带有羟基的C-3位点、羟甲基修饰的C-14位点、羟基修饰的C-15位点以及带有羟基基团的C-20位点都很有用。连接分子最优选与美登木醇的C-3位点连接。最优选的，与发明所述组合物一起使用的美登木素生物碱是N.sup.2′-去乙酰-N.sup.2′-(-3-巯基-1-氧代丙基)-美登木素(DM1)或N.sup.2′-去乙酰-N.sup.2′-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登木素(DM4)。
带有其它化学键的连接分子也可以用于本发明的情况，其它美登木素生物碱也可以。可以引入所述连接分子的其它化学键的特定例子包括以上描述的那些，比如酸敏感性键、硫醚键、光敏感性键、肽酶敏感性键和酯酶敏感性键。制备带有连接分子和/或效应子附着分子的美登木素生物碱的方法描述在例如美国专利第5,208,020、5,416,064和6,333,410号。。
美登木素生物碱的连接分子(和/或效应子附着分子)通常，并且优选是更大的肽分子的一部分，所述肽分子是用来将结合多肽与美登木素生物碱连在一起的。任何合适的肽分子都可以用于本发明，只要该连接分子分别保留美登木素生物碱和抗体的细胞毒性和靶向特点。连接分子通过化学键(如上所述)将美登木素生物碱连到结合多肽上，以使美登木素生物碱和结合多肽彼此化学偶联(例如，共价结合)。希望连接分子通过二硫键或硫醚键将美登木素生物碱化学偶联到结合多肽上。最优选的，结合多肽借助二硫键化学偶联到美登木素生物碱。
其它优选的细胞毒试剂种类包括，例如蒽环族药物、长春花药物、丝裂霉素、博莱霉素、细胞毒性核苷、蝶啶族药物、diynenes以及鬼臼毒素。这些种类中特别有用的成员包括，例如阿霉素、洋红霉素(carminomycin)、柔红霉素(道诺霉素)、多柔比星(doxorubicin)、氨基喋呤(aminopterin)、氨甲蝶呤、甲氨蝶呤(methopterin)、普卡霉素(mithramycin)、链黑菌素(streptonigrin)、二氯甲氨蝶呤、丝裂霉素C、放线菌素D、泊非霉素(porfiromycin)、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、喃氟啶(ftorafur)、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞嘧啶(cytosinearabinoside)，鬼臼毒素(podophyllotoxin)或鬼臼毒素衍生物，比如依托泊苷(etoposide)或磷酸依托泊苷，美法仑(melphalan)，长春花碱(vinblastine)，长春新碱(vincristine)，异长春碱(leurosidine)，长春地辛(vindesine)，环氧长春碱(leurosine)及类似物。与本文的教导相容的其他细胞毒素包括紫杉醇、紫杉烷(taxane)，松胞菌素B(cytochalasin B)，短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭、吐根碱(emetine)，鬼臼噻吩甙(tenoposide)，秋水仙碱(colchicin)、二羟基炭疽菌素、二酮(dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、心得安(propranolol)和嘌呤霉素(Puromycin)以及它们的类似物或同系物。激素和激素拮抗剂，比如皮质类固醇激素，例如泼尼松(Prednisone)；孕激素，例如羟基孕酮或甲羟孕酮(medroprogesterone)；雌激素，例如己烯雌酚(diethylstilbestrol)；抗雌激素，例如他莫昔芬；雄激素，例如睾酮，以及芳香酶抑制剂，例如氨鲁米特(aminogluthetimide)也与本文的教导相容。正如前面提到的，本领域技术人员可以对所需化合物进行修饰，以使得该化合物的反应更方便制备发明所述结合物。
其它示例性细胞毒素包含烯二炔族抗肿瘤抗生素的成员或衍生物，包括calicheamicin、esperamicin或dynemicin。这些毒素非常强力，通过切割核DNA起作用，导致细胞死亡。与能被体内切割产生许多无活性但是有免疫原性的多肽片段的蛋白毒素不同，象calicheamicin、esperamicin和其它烯二炔类毒素是基本没有免疫原性的小分子。这些非肽毒素是通过以前用于标记单克隆抗体和其它分子的技术化学连接到二聚体或四聚体上的。这类连接技术包括经由存在于本发明结合多肽Fc部分上的N-连接的糖残基发生的位点特异性连接。这种定点连接技术的益处是减少了连接对构建体的结合特性的可能影响。
应当意识到，除了其它细胞毒素，多肽也可以与生物毒素相关联，所述生物毒素比如蓖麻毒蛋白(ricin)亚基A、相思豆毒素(abrin)、白喉毒素、肉毒毒素(botulinum)、蓝藻毒素(cyanginosin)、石房蛤毒素(saxitoxin)、志贺毒素(shigatoxin)、破伤风、河豚毒素(tetrodotoxin)、单端孢霉毒素(trichothecene)、致震颤真菌毒素(verrucofogen)或毒性酶。优选的，利用允许直接表达抗体-毒素构建体的遗传工程技术来制备这些构建体。其它能与本发明多肽相关联的生物应答调节剂包含细胞因子，比如淋巴因子和干扰素。参考本说明书公开内容，本领域技术人员应当能很容易地利用常规技术制成这类构建体。
另一类可以与所公开多肽联合使用的相容生物毒素是放射增敏药物，其可能能被有效地定向到肿瘤或免疫反应性细胞。这类药物增加了对电离辐射的敏感性，从而提高放疗的效力。被肿瘤细胞内在化的结合多肽结合物会将放射增敏剂递送到细胞核附近，那里的放射增敏作用最强。未结合的连接有放射增敏剂的本发明多肽会很快从血液中清除，使其余的放射增敏剂局限于目标肿瘤中，而在正常组织中只有最低的摄取。从血液中迅速清除后，以三种方式之一进行辅助放疗：1)特异针对肿瘤的体外照射，2)直接植入肿瘤的放射性或3)用相同的靶向抗体进行系统放射免疫疗法。这个方法的一个很有吸引力的变化是将治疗放射性同位素附着到放射增敏的免疫结合物上，从而给患者提供了施用单种药物的方便。
在一个实施方案中，可结合增强多肽稳定性或效力的分子。例如，在一个实施方案中，PEG可结合于本发明多肽以增加其体内半衰期。Leong，S.R.，等人2001.Cytokine 16：106；2002；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531；或Weir等人2002.Biochem.Soc.Transactions 30：512。
如前面提到的，相容细胞毒素可以包含前药。本文所用的术语“前药”是指药物活性物质的前体或衍生物形式，与亲本药物相比，它们对肿瘤细胞的细胞毒性低，能被酶促活化或转化成活性更高的亲本形式。与本发明相容的前药包括但不限于，含磷酸酯的前药、含硫代磷酸酯的前药、含硫酸酯的前药、含肽的前药、含β-内酰胺的前药，含有任选地取代的苯氧基乙酰胺的前药或含有任选地取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药，它们能被转化为活性更高的细胞毒性游离型药物。在一个实施方案中，细胞毒性剂，比如美登木素生物碱以前药的形式施用，在二硫键被水解后释放。可以衍生成前药形式用于本发明的细胞毒性药物的进一步例子包括上面描述过的那些化疗剂。
VI.本发明多肽的应用方法
本发明多肽可用于许多应用，例如在筛选测定中以及用于诊断或治疗目的。本发明优选的实施方案提供诊断和/或治疗需要这种治疗的哺乳动物受治疗者的病症，如，肿瘤病症的药盒和方法。优选地，受治疗者是人类。
A.筛选方法
本发明结合分子还可用于筛选方法。当作为双特异性分子合成时，本发明结合分子有优于现有技术的双特异性分子的多种益处，包括作为筛选测定中用的试剂。图9描绘与使用常规双特异性抗体相比，使用本发明scFc结合分子在筛选双特异性抗体功能中的益处。使用scFc区阻止结合结构域的不想要的异质性。这种异质性将造成设计以筛选双特异性抗体独特活性的复杂测定。“路径1”是异质的结合蛋白组合的实例，当以下三个基因在真核体系中共表达以形成双特异性抗体时通常将发生：(A)融合于Fc N-末端的scF(ab)；(B)融合于Fc CH3结构域C-末端的F(ab)重链；和(C)包含CL和VL结构域的轻链。“路径2”是如何融合两个基因((A)和(B))到单个遗传构建体的实例，造成Fc部分被多肽接头连接，scFc(D)。共表达(C)和(D)造成均一表达单个双特异性mAb。因此，当例如，使用本领域已知的方法筛选，如，双特异性抗体结合于其一个或多个靶的能力时，本发明结合分子呈现益处。
另一方面，本发明提供筛选活化靶蛋白或抑制靶蛋白的活化的多特异性结合蛋白(如双特异性结合蛋白诸如双特异性抗体)的方法。具体地，具有第一结合特异性的本发明结合多肽可与具有不同特异性的一种或多种多肽共表达或共价连接以形成多特异性结合蛋白。在特别优选的实施方案中，本发明结合多肽可作为单个遗传构建体表达，包含在其N-和C-末端具有不同特异性的结合位点(如，scFv或Fab)的遗传融合的Fc区(即，scFc区)。可在测量针对一个或多个目标靶蛋白的相对活性的测定(如，基于细胞的测定)中筛选结合蛋白。大体上，这种筛选方案包括将本发明多特异性结合多肽与靶蛋白接触以观察结合、功能反应的刺激或抑制。如果相对于相应的单特异性结合多肽表现刺激或抑制，可选择多特异性结合蛋白。
可采用适于测量靶蛋白活性(如，生物化学或生物活性)的领域公认的测定。例如，当靶蛋白是激酶时，合适的测定可包括测量激酶底物磷酸化状态的抑制或活化。在其它示例性实施方案中，当靶蛋白是G-蛋白偶联受体(GPCR)时，合适的测定可测量胞外pH变化以确定多特异性结合多肽是活化还是抑制受体。当靶蛋白是受体时，筛选测定可包括确定标记的配体对在其表面上具有受体的细胞的相对结合。可如，通过放射活性标记配体。测量与受体结合的标记的配体的量，如，通过测量受体的放射活性。如果化合物结合于受体，如由结合于受体的标记的配体减少确定的，则标记的配体对受体的结合被抑制了。
在一个示例性实施方案中，测定包括抑制LTβR蛋白(如，LTα1β2蛋白)。因为LTβR分子是三聚体，包含由三个裂缝分开的三个不同亚基，期望封闭三个裂缝的多于一个以最佳地灭活LTβR活性。例如，期望获得对LTβR的第一裂缝具有第一特异性和对LTβR的第二裂缝有第二特异性的多特异性结合多肽。因此，可在LTβR活性测定中筛选对LTβR具有多于一个结合特异性的多特异性结合蛋白，以确定相对于相应单特异性抗体其是否表现改进的活性。
B.抗肿瘤治疗
本发明多肽将可用于多种不同应用。例如，在一个实施方案中，本发明结合多肽应可用于减少或消除携带结合多肽识别的表位的细胞。在另一个实施方案中，本发明结合多肽有效地减少循环中的可溶抗原浓度或消除循环中的可溶抗原。
在一个实施方案中，识别肿瘤相关抗原的本发明结合多肽可以减小肿瘤体积、抑制肿瘤生长和/或延长携带肿瘤的动物的存活时间。因此，本发明还涉及在人类或其它动物治疗肿瘤的方法，通过向这种人类或动物施用有效无毒量的所述结合多肽。本领域技术人员能够通过常规实验确定修饰的结合多肽用于治疗恶性肿瘤目的的有效无毒量。例如，结合多肽的治疗有效量可以根据因素例如受治疗者的疾病阶段(例如I期对IV期肿瘤)、年龄、性别、医学并发症(例如，免疫抑制状况或疾病)和体重，以及结合多肽在受治疗者引发期望响应的能力而变化。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗响应。例如，可以每日分几次施用，或者可以随着治疗情况的紧急性而按比例减少剂量。然而，通常预料有效剂量在在约0.05至100毫克/千克体重/天的范围，更优选地从约0.5至10毫克/千克体重/天。
一般地，本发明多肽可以用于预防性或治疗性地处理任何包含如下抗原标志的赘生物，所述抗原标志允许修饰的抗体靶向癌细胞。可以治疗的示例性癌症包括但不限于前列腺癌、胃癌如结肠癌、皮肤癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胰腺癌。更特别地，本发明结合多肽可以用于治疗Kaposi肉瘤、CNS瘤形成(毛细血管性成血管细胞瘤、脑膜瘤和脑转移癌)、黑素瘤、胃肠道的和肾的肉瘤、横纹肌肉瘤、成神经胶质细胞瘤(优选地多形性成神经胶质细胞瘤)、平滑肌肉瘤、成视网膜细胞瘤、卵巢的乳头状囊腺癌、Wilm氏肿瘤或小细胞肺癌。可以理解，鉴于本发明公开，无需过度实验即可以针对与前述各种瘤形成有关的肿瘤相关抗原，衍生出适当的靶结合多肽。
适于使用本公开发明治疗的示例性血液癌症包括霍奇金和非霍奇金淋巴瘤以及白血病，包括ALL-L3(伯基特型白血病(Burkitt′s type leukemia))、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和单核细胞性白血病。可以理解，本发明的化合物和方法尤其可以有效地治疗各种B细胞淋巴瘤，包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、细胞淋巴瘤(FCC)、套细胞淋巴瘤(MCL)、扩散性大细胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴细胞(SL)型NHL、中级/滤泡性NHL、中级扩散性NHL、高级成免疫细胞NHL、高级成淋巴细胞NHL、高级小无裂细胞性NHL、巨大肿块(bulky disease)NHL和Waldenstrom氏巨球蛋白血症。本领域技术人员应当明了，这些淋巴瘤由于正在变化的分类系统而常常具有不同的名称，而且，患有分类于不同名称下的淋巴瘤的患者也可以得益于本发明的联合治疗方案。除了上述瘤形成病症，可以理解本发明还可以有利地用于治疗带有相容的肿瘤相关抗原的其它恶性肿瘤。
C.免疫疾病治疗
除了肿瘤病症外，本发明多肽在治疗自身免疫病或异常免疫应答方面也尤其有效。在此方面，可以明了，本发明多肽可以用于控制、阻抑、调节或消除对外部抗原和自身抗原的不期望的免疫应答。例如，一个实施方案中，抗原是自身抗原。另一实施方案中，抗原是变应原。在其它实施方案中，抗原是同种抗原或异种抗原。本发明结合多肽在降低针对同种抗原和异种抗原的免疫应答中的用途尤其可以用于移植中，例如以抑制移植受体对供体移植物例如组织或器官移植物或骨髓移植物的排斥。此外，抑制或消除骨髓移植物中的供体T细胞也可以用于抑制移植物抗宿主疾病。
在其它实施方案中，本发明多肽可以用于治疗免疫病症，包括但不限于，变应性支气管肺曲霉病；变应性鼻炎；自身免疫性溶血性贫血；棘皮症；过敏性接触性皮炎；Addison氏病；特应性皮炎；斑秃；普秃；淀粉状蛋白病；过敏性紫瘢；类过敏反应；再生障碍性贫血；遗传性血管性水肿；特发性血管性水肿；强直性脊柱炎(Ankylosingspondylitis)；颅动脉炎(arteritis，cranial)；巨细胞性动脉炎(arteritis，giant cell)；Takayasu氏动脉炎；颞动脉炎；哮喘；毛细血管扩张-运动共济失调症(ataxia-telangiectasia)；自身免疫性卵巢炎；自身免疫性睾丸炎；自身免疫性多内分泌衰竭；Behcet氏病；Berger氏病；Buerger氏病；支气管炎；大疱性天疱疮；慢性皮肤粘膜念珠菌病(candidiasis，chronic mucocutaneous)；Caplan氏综合征；心肌梗塞后综合征；心包切开术后综合征；心脏炎；口炎性腹泻；Chagas氏病；Chediak-Higashi综合征；Churg-Strauss病；cogan氏综合征；冷凝集素病(cold agglutinin disease)；CREST综合征；Crohn氏病；冷球蛋白血症；隐源性致纤维化肺泡炎；疱疹样皮炎；皮肌炎；糖尿病；Diamond-Blackfan综合征；DiGeorge综合征；盘状红斑狼疮；嗜酸性筋膜炎；巩膜外层炎；持久隆起性红斑(Drythema elevatumdiutinum)；边缘性红斑；多形红斑；结节性红斑(erythema nodosum)；家族性地中海热(Familial Mediterranean fever)；Felty氏综合征；肺纤维化(fibrosispulmonary)；过敏样肾小球性肾炎(glomerulonephritis，anaphylactoid)；自身免疫性肾小球肾炎；链球菌感染后肾小球肾炎；移植后肾小球肾炎；膜性肾小球病；Goodpasture氏综合征；免疫介导的粒性白细胞减少症；环状肉芽肿；变应性肉芽肿病；肉芽肿性肌炎；Grave氏病；桥本甲状腺炎(Hashimoto’sThyroiditis)；新生儿溶血病；特发性血色病(hemochromatosis，idiopathic)；Henoch-schoenlein紫瘢；慢性活动性和慢性进行性肝炎；组织细胞增生症X(histiocytosis X)；嗜酸细胞增多综合征(hypereosinophilic syndrome)；特发性血小板减少性紫瘢(idiopathic thrombocytopenic purpura)；Job氏综合征；幼年型皮肌炎(juvenile dermatomyositis)；幼年型类风湿关节炎(幼年型慢性关节炎)；Kawasaki氏病；角膜炎；干燥性角膜结膜炎(keratoconjunctivitis sicca)；Landry-Guilain-Barre-Strohl综合征；瘤型麻风(Leprosy，lepromatous)；Loeffier氏综合征；狼疮；Lyell氏综合征；Lyme氏疏螺旋体病(Lyme disease)；淋巴瘤样肉芽肿病(lymphomatoid granulomatosis)；全身性肥大细胞增生症(mastocytosis，systemic)；混合性结缔组织病(mixed connective tissue disease)；多发性单一神经炎(Mononeuritis multiplex)；Muckle-Wells综合征；粘膜皮肤淋巴结综合征(mucocutaneous lymph node syndrome)；粘膜皮肤淋巴结综合征；多中心性网状组织细胞增生症(multicentric reticulohistiocytosis)；多发性硬化；重症肌无力；蕈样肉芽肿病；全身性坏死性血管炎(necrotizing vasculitis，systemic)；肾病综合征(nephrotic syndrome)；重叠综合征(overlap syndrome)；脂膜炎；阵发性寒冷性血红蛋白尿症(paroxysmal cold hemoglobinuria)；阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria)；类天疱疮；天疱疮；红斑性天疱疮(pemphigus erythematosus)；落叶性天疱疮(pemphigusfoliaceus)；寻常性天疱疮(pemphigus vulgaris)；饲鸽者病(pigeon breeder’sdisease)；过敏性肺炎(Pneumonitis，hypersensitivity)；结节性多动脉炎；风湿性多肌痛；多肌炎；特发性多发性神经炎(polyneuritis，idiopathic)；葡萄牙型家族性多发性神经病(portuguese familial polyneuropathy)；先兆子痫/子痫；原发性胆汁性肝硬变；进行性全身性硬化(硬皮病)；银屑病；银屑病性关节炎；肺泡蛋白沉着症；肺纤维化、Raynaud氏现象/综合征；Reidel氏甲状腺炎；Reiter氏综合征，复发性多软骨炎(relapsing polychrondritis)；风湿热；类风湿性关节炎；结节病；巩膜炎；硬化性胆管炎；血清病(serum sickness)；Sezary综合征；Sjogren氏综合征；Stevens-Johnson综合征；Still氏病；亚急性硬化性全脑炎；交感性眼炎；系统性红斑狼疮；移植排斥；溃疡性结肠炎；未分化结缔组织病；慢性荨麻疹；冷激性荨麻疹(urticaria，cold)；眼色素层炎；白瘢风；Weber-Christian病；Wegener氏肉芽肿；和Wiskott-Aldrich综合征。
D.抗炎治疗
在其他实施方案中，本发明多肽可以用于治疗因炎症而引起的(至少部分地)或恶化的炎性病症，例如血流增加、水肿、免疫细胞的活化(例如增生、细胞因子产生或增强的吞噬作用)。示例性炎性病症包括其中炎症或炎性因子(例如，基质金属蛋白酶(MMP)、一氧化氮(NO)、TNF、白介素、血浆蛋白、细胞防御系统、细胞因子、脂质代谢物、蛋白酶、毒性自由基、线粒体、细胞凋亡、粘附分子等)被涉及或以异常量(例如，可以有利地改变例如有益于受治疗者的量)存在于给定区域中的那些病症。发炎过程是活组织对损伤的应答。炎症的原因可以是由于物理损伤、化学物质、微生物、组织坏死、癌症或其它因素。急性炎症持续时间短，仅仅持续数天。然而，如果其持续较长时间，则可以称作慢性炎症。
炎性病症包括急性炎性病症、慢性炎性病症、和复发性炎性病症。急性炎性病症一般具有相对短的持续期，并且持续大约数分钟至大约1到2天，但它们也可以持续几周。急性炎性病症的主要特征包括血流增加、体液和血浆蛋白渗出(水肿)以及白细胞如嗜中性粒细胞渗出。慢性炎性病症一般有较长的持续期，例如数周至数月至数年或甚至更长，并且在组织学上其与淋巴细胞和巨噬细胞的存在以及血管和结缔组织的增生有关。复发性炎性病症包括在一段时间后复发的或周期性发作的病症。复发性炎性病症的例子包括哮喘和多发性硬化。一些病症可以落入一种或多种分类中。
炎性病症一般的特征在于发热、潮红、肿大、疼痛和丧失功能。炎性病症的示例性原因包括但不限于微生物感染(例如细菌、病毒和真菌感染)、物理因素(例如，烧伤、辐射和创伤)、化学因素(例如，毒素和腐蚀性物质)、组织坏死和各种类型的免疫反应。炎性病症的例子包括但不限于骨关节炎，类风湿性关节炎，急性和慢性感染(细菌、病毒和真菌)；急性和慢性支气管炎，鼻窦炎和其它呼吸感染，包括普通感冒；急性和慢性肠胃炎和结肠炎；急性和慢性膀胱炎和尿道炎；急性呼吸窘迫综合征；囊性纤维化；急性和慢性皮炎；急性和慢性结膜炎；急性和慢性浆膜炎(心包炎、腹膜炎、滑膜炎、胸膜炎和腱炎)；尿毒症性心包炎；急性和慢性胆囊炎；急性和慢性阴道炎；急性和慢性眼色素层炎；药物反应；和烧伤(热的、化学的和电的)。
E.神经病症
在其他的实施方案中，本发明结合多肽可用于治疗神经疾病或病症。例如，如上所述，结合多肽可结合神经细胞(如，神经元或神经胶质细胞)上存在的抗原。在某些实施方案中，与抗原相关的神经病症可为前述自身免疫或炎性病症。本文所用的术语“神经疾病或病症”包括受治疗者的疾病或病症，其中神经系统退化(如，神经退化病症，以及其中神经系统不能适当地发展或不能再损伤如脊索损伤后再生的病症。本发明方法和组合物可诊断、预防或治疗的神经病症的实例包括但不限于，多发性硬化、亨廷顿氏病、阿尔茨海默病、帕金森病、神经痛、创伤性脑损伤、格-巴二氏综合征和慢性炎性脱鞘性多神经病(CIDP)、脑血管疾病和脑炎。
VIII.本发明多肽的施用方法
制备并将本发明多肽施用受治疗者的方法是本领域技术人员所熟知或容易确定的。本发明多肽的施用途径可以是口服、肠胃外、经吸入或局部。本文所用的术语肠胃外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道施用。通常优选静脉内、动脉内、皮下和肌内形式的肠胃外施用方式。虽然所有这些施用方式都明显被认为是本发明范围内的，但一种施用形式是用于注射，特别是静脉内或动脉内注射或点滴的溶液。一般来说，适用于注射的药物组合物可以包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨酸酯)，任选稳定剂(例如人类白蛋白)等。但是，在与本文教导相容的其它方法中，可以将多肽直接递送到有害细胞群体的部位，从而提高患病组织与治疗剂的接触。
用于肠胃外施用的制剂包括无菌水或非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油(比如橄榄油)以及可注射的有机酯(比如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲的培养基。在本发明中，药学可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M，优选0.05M磷酸缓冲液或0.8％盐水。其它常见肠胃外载体包括磷酸钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸化的林格氏溶液，或者不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，比如基于林格氏右旋糖的那些，及类似物。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体，及类似物。
更具体地说，适用于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液(当是水溶性的时)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在这些情况中，所述组合物必须是无菌的，应该处于容易进行注射器操作的流体。其应当在制造和储存条件下是稳定的，优选抗微生物(比如细菌和真菌)污染作用地保存。载体可以是溶剂或分散体介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇，及类似物)，和其合适混合物。可以利用包被比如卵磷脂、在分散体的情况中维持所需颗粒大小，以及使用表面活性剂来保持合适的流动性。
预防微生物作用可以用各种抗细菌和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞及类似物。在许多情况中，优选组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(比如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以将注射组合物的吸收延长。
在任何情况中，可将适当溶剂中的所需量活性化合物(例如，结合多肽自身或联合其它活性试剂)与所需的如本文所列的一或多种成分组合，随后过滤除菌制得无菌注射液。通常将活性化合物引入含有基本分散体介质和以上列举的其它所需成分的无菌载体，制得分散体。对于制备无菌注射液的无菌粉末来说，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些方法由先前无菌过滤溶液产生出活性成分和任何其它所需成分的粉末。用于注射的制剂根据本领域已知的方法加工、装入容器(比如安瓿、袋子、瓶子、针筒或小瓶)，在无菌条件下封口。进一步，可以将制剂包装，以药盒的形式出售，象共同待决的U.S.S.N.09/259,337和U.S.S.N.09/259,338中描述的那些，这两份申请以参考的方式引入本文。这类产品优选带有标签或包装在内的说明书，表明相关组合物用于治疗患有或易患自身免疫或肿瘤病症的受治疗者。
对于上述病症的治疗，本发明组合物的有效剂量随着许多不同因素而变化，所述因素包括施用方式、靶位点、患者的生理学状况、患者是人类还是动物、施用的其它药物、和治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人类，但是也可以治疗非人类哺乳动物包括转基因哺乳动物。可使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量以优化安全性和效力。
对于用本发明抗体进行被动免疫，剂量范围可从宿主体重的大约0.0001至100mg/kg、更通常是0.01至5mg/kg(如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，优选地至少1mg/kg。上述范围中的中间剂量也意为在本发明范围内。可以每日、隔日、每周、或根据任何其它通过经验性分析确定的方案，向受治疗者施用此剂量。一个示例性疗法需要长期，例如至少6个月，多剂量施用。其它示例性治疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用1次。示例性剂量方案包括连续每日1-10mg/kg或15mg/kg、隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，具有不同结合特异性的两种或多种结合多肽同时施用，在此情况下各结合多肽的施用剂量落在所指明的范围内。
可多次施用本发明的多肽。单剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。通过测量患者中修饰结合多肽或抗原的血液水平所指示的，间隔也可以是不规则的。一些方法中，调整剂量以达到1-1000μg/ml的血浆修饰结合多肽浓度，而一些方法中调整以达到25-300μg/ml的血浆修饰结合多肽浓度。或者，可以以缓释制剂的形式施用多肽，在此情况下需要较低的施用频率。剂量和频率随着多肽在患者中的半衰期而变化。
施用剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，含有本发明多肽或其混合物的组合物被施用给尚未处于疾病状态的患者以便增强患者的抵抗力。该量被定义为“预防有效剂量”。在此应用中，准确的量同样取决于患者的健康状况和一般免疫状况，但是通常为0.1至25mg/剂，尤其是0.5至2.5mg/剂。可以以相对不频繁的间隔长期施用相对低的剂量。一些患者可以在其剩余生命期中持续接受治疗。
在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔施用相对高的剂量(例如，大约1至400mg/kg结合多肽/剂，对于放射免疫结合物更通常使用5至25mg剂量，对于细胞毒素-药物修饰的结合多肽使用更高剂量)，直到减缓或终止疾病进程，优选地直到患者显示部分或完全的疾病症状改善。之后，患者可以接受预防性方案。
本发明多肽可任选地与其它对需要治疗(例如，预防性或治疗性)的病症或状况有效的剂一起联合施用。
90Y标记的修饰的本发明结合多肽的有效单次治疗剂量(即治疗有效量)范围在约5到约75mCi，更优选在约10到约40mCi。131I修饰的抗体的单次治疗非骨髓清除有效剂量在约5到约70mCi，更优选约5到约40mCi。131I标记的抗体的单次治疗清除有效剂量(即，可能需要自体骨髓移植)在约30到约600mCi，更优选在约50到少于约500mCi。就嵌合抗体而言，由于其在循环系统的半衰期比鼠抗体长，碘-131标记的嵌合抗体的单次治疗非骨髓清除有效剂量在约5到约40mCi，更优选少于约30mCi。对于例如111In标记，成像要求的标准通常少于5mCi。
尽管可以如上文所述施用本发明的多肽，但必需强调的是，在其它实施方案中，可以将多肽施用于健康患者作为一线治疗。在此实施方案中，可以向具有正常或平均红骨髓储备的患者和/或向没有且现在没有经历的患者，施用多肽。如本文中所用，本发明多肽与辅助疗法的联合或组合施用意味着相继的(sequential)、同时的(simutaneous)、同延的(coextensive)、共存的(concurrent)、伴随的(concomitant)、或同时期的(contemporaneous)施用或应用所述疗法和本发明公开的结合多肽。本领域技术人员明了，可以安排联合治疗方案中各成分的施用或应用时间以增强治疗的整体效力。例如，可以按标准的熟知疗程与本发明结合分子联合施用化疗剂或生物剂。本领域技术人员(例如医师)基于选定的辅助治疗和本说明的教导，无需过度实验能够容易地鉴别有效的联合治疗方案。
在此方面，可以理解，多肽和药剂的联合可以以任何顺序并在向患者提供治疗益处的任何时间框内施用。即，药剂和多肽可以以任何顺序或同时施用。在选定的实施方案中，本发明多肽向之前已经进行过化疗的患者施用。在其它实施方案中，结合多肽和化疗基本上同时或共存地施用。例如，可以给予正在经历化疗疗程的患者结合多肽。在优选实施方案中，在任何药剂或治疗的1年内施用结合多肽。在其它优选实施方案中，在任何药剂或治疗的10、8、6、4或2个月内施用结合多肽。在其它优选实施方案中，在任何药剂或治疗的4、3、2、或1周内施用结合多肽。在其他优选实施方案中，在选定的药剂或治疗的5、4、3、2或1天内施用结合多肽。还可以理解，两种药剂或治疗可以在大约数小时或数分钟内(即，基本上同时地)施用。
还可以理解，本发明的多肽可以和任何能够体内消除、减少、抑制或控制瘤形成细胞生长的任何药剂组合或联合使用(例如，以提供联合治疗方案)。与本发明相容的示例性化疗剂包括烷化剂、长春花生物碱(例如，长春花新碱、长春花碱)、甲基苄肼、氨甲蝶呤和强的松。四药物联合MOPP(双氯乙基甲胺(氮芥)、长春花新碱(oncovin)、甲基苄肼和强的松)可以非常有效地治疗各种类型的淋巴瘤，并包含本发明的优选实施方案。在耐受MOPP的患者中，可以使用ABVD(例如，阿霉素、博来霉素、长春花新碱和达卡巴嗪)、ChlVPP(苯丁酸氮芥、长春花新碱、甲基苄肼和强的松)、CABS(洛莫司汀、阿霉素、博来霉素和链脲霉素)、MOPP加ABVD、MOPP加ABV(阿霉素、博来霉素和长春花新碱)或BCVPP(卡莫司汀、环磷酰胺、长春花新碱、甲基苄肼和强的松)联合。对于标准给药剂量和时间安排，可参见Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler，Malignant Lymphomas(恶性淋巴瘤)，在Harrison′sPrinciples of Internal Medicine 1774-1788(Kurt J.Isselbacher等人编辑，第13版.1994)和V.T.DeVita等人，(1997)和其中引用的参考文献。这些疗法可以不经变化或根据具体患者按照需要经过变化后与本文所述一种或多种本发明多肽联合使用。
可用于本发明范畴的其它治疗方案包括使用单独烷化剂例如环磷酰胺或苯丁酸氮芥、或药物联合如CVP(环磷酰胺、长春花新碱和强的松)、CHOP(CVP和阿霉素)、C-MOPP(环磷酰胺、长春花新碱、强的松和甲基苄肼)、CAP-BOP(CHOP加甲基苄肼和博来霉素)、m-BACOD(CHOP加氨甲蝶呤、博来霉素和甲酰四氢叶酸)、ProMACE-MOPP(强的松、氨甲蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷和甲酰四氢叶酸加标准MoPP)、ProMACE-CytaBOM(强的松、阿霉素、环磷酰胺、依托泊苷、阿糖胞苷、博来霉素、长春花新碱、氨甲蝶呤和甲酰四氢叶酸)以及MACOP-B(氨甲蝶呤、阿霉素、环磷酞胺、长春花新碱、固定剂量的强的松、博来霉素和甲酰四氢叶酸)。本领域技术人员能够容易地确定用于这些方案之中每一个的标准剂量和时间安排。CHOP也已经与博来霉素、氨甲蝶呤、甲基苄肼、氮芥、胞嘧啶阿拉伯糖苷和依托泊苷联合。其它相容的化疗剂包括但不限于2-氯脱氧腺苷(2-CDA)、2′-脱氧助间型霉素(Deoxycoformycin)和氟达拉滨。
对于不能实现疾病缓解或复发的中级和高级NHL患者，使用拯救性治疗(salvage therapy)。拯救性治疗使用药物，例如胞嘧啶阿拉伯糖苷、卡铂、顺铂、依托泊苷和异环磷酰胺(单独地或联合地给予)。在某些肿瘤病症的复发或侵袭性形式中，常常使用以下方案：IMVP-16(异环磷酰胺、氨甲蝶呤和依托泊苷)、MIME(甲基-gag、异环磷酰胺、氨甲蝶呤和依托泊苷)、DHAP(地塞米松、高剂量阿糖胞苷和顺铂)、ESHAP(依托泊苷、甲基强的松龙(methylpredisolone)、HD阿糖胞苷、顺铂)、CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、甲基苄肼、强的松和博来霉素)和CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和强的松)(每个均有熟知的给药速率和时间安排)。
在一个实施方案中，本发明结合多肽可联合生物制剂施用。术语“生物制剂”或“生物剂”是指将用作治疗剂的从活的生物体和/或其产物制备的任何药物活性剂。在本发明的一个实施方案中，可联合包含scFc的结合分子使用的生物剂包括但不限于如，抗体、核酸分子，如，反义核酸分子、多肽或蛋白。这种生物制剂可联合结合分子施用，通过如，在结合分子施用前、与结合分子同时、或结合分子施用后施用生物剂。
可以与本发明多肽联合使用的剂的量可以随着受治疗者而变化，或者可以根据本领域熟知的施用。见例如，Bruce A Chabner等人，AntineoplasticAgents(抗肿瘤剂)，在Goodman & Gilman′s THE PHARMACOLOGICAL BASIS OFTHERAPEUTICS(治疗的药理学基础)1233-1287((Joel G.Hardman等人编辑，第9版.1996)。在另一个实施方案中，施用这种剂的量与治疗标准一致。
如前文所述，可以将本发明多肽以药物有效量施用用于体内治疗哺乳动物病症。在这方面，应当意识到本发明多肽可配制成便于活性剂的施用并提高其稳定性的形式。优选的，根据本发明的药物组合物包含药学可接受的无毒、无菌载体，比如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂及类似物。为了本申请的目的，结合或未结合治疗剂的本发明多肽的药学有效量应该理解为这样的用量，其足够实现与抗原的有效结合，并取得益处，例如减轻疾病或病症的症状或者检测物质或细胞。在肿瘤细胞的情况中，优选所述多肽能与赘生性或免疫反应性细胞上的选定免疫反应性抗原发生相互作用，并能引起这些细胞的死亡增加。当然，可以将本发明的药物组合物以单剂量或多剂量施用，从而提供药学有效量的多肽。
在本公开的范围内，可以将本发明多肽按照前面提到的治疗方法以足够产生治疗或预防效果的量施用于人类或其它动物。可以将本发明多肽以通过将多肽与常规药学可接受的载体或稀释剂按照已知技术结合在一起制备的常规剂型给予这样的人类或其它动物。本领域技术人员会意识到，药学可接受的载体或稀释剂的形式和特点由将与之结合使用的活性成分的量、给药途径和其它公知变量确定。本领域技术人员还会意识到，包含一或多种本发明多肽的混合物可能证明特别有效。
本发明进一步通过以下实施例举例说明，这些实施例不应理解为限制性的。在整个本申请中引用的所有参考文献、专利和出版的专利申请的内容均在此并入作为参考。
实施例
除非另外指明，否则实施例中使用以下材料和方法。
一般材料和方法
大体上，除非另外指明，实施本发明采用化学、生物物理学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(尤其是如，抗体技术)和电泳标准技术的常规技术。参见如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning(分子克隆)：Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology)(抗体工程实验方案(分子生物学方法))，510，Paul，S.，Humana Pr(1996)；Antibody Engineering：A Practical Approach(Practical Approach Series，169)(抗体工程实用方法(实用方法系列，169))，McCafferty编辑，Irl Pr(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual(实验室抗体手册)，Harlow等人，C.S.H.L.Press，Pub.(1999)；和Current Protocols inMolecular Biology(分子生物学最新实验方案)，Ausubel等人编辑，John Wiley& Sons(1992)。
实施例1.表达和纯化scFc
根据此前所述的方法，将包含遗传融合的Fc区(即，单链(scFc)区)的人类5C8 IgG1抗体在DG44 CHO细胞中表达。为了对重组表达的单链和双链scFc蛋白进行亲和纯化(参见图1的图解)，将CHO细胞发酵培养基(1L)调整到pH 7.0，将蛋白亲和性地捕获到预先在结合缓冲液(100mM NaPO4，pH 7，150mM NaCl)中平衡的5ml HiTrap rProteinA FF柱(GE Healthcare)。在结合缓冲液中洗涤柱，直到A280检测值达到基线，在25mM甘氨酸pH 2.8，100mM氯化钠中洗脱结合的蛋白。通过加入0.1体积的1M Tris缓冲液，pH 8，立即中和级分。通过还原和非还原SDS-PAGE分析A280吸收级分中的蛋白，汇集并浓缩用于以大小排阻层析进一步纯化。在Superdex 200凝胶过滤柱上、PBS，pH 7中从聚集体和双链(即，二聚的)scFc多肽分离单链(即，单体)scFc多肽。通过还原和非还原SDS-PAGE分析凝胶过滤级分，组合合适的级分以获得单链和双链scFc抗体群体的均一的池。通过带有连线光散射分析的分析性SEC(TSK-Gel G3000 SWXL柱)进一步表征这些池以确定蛋白的均质性和分子量。通过对非还原的去糖基化的sc-和dc-Fc池的质谱分析，进行完整质量测量和链间和链内二硫键的绘图。
图2A-D显示分离单体(“sc”)和二聚(“dc”)的scFc蛋白的两步骤纯化方法结果。纯化方法采用亲和层析随后是凝胶过滤层析。图2A显示从蛋白A亲和柱在低pH洗脱的柱级分的吸收谱。图2B显示对包含二聚的(“dc”)和单体(“sc”)形式的scFc结合多肽的洗脱级分的相应的SDS PAGE分析。单体和二聚的形式两者基本上以单个峰从蛋白A柱洗脱。图2C显示Superdex 200凝胶过滤柱洗脱物可将该混合物分为两个不同峰。图2D显示对凝胶过滤洗脱物相应的SDS-PAGE分析。峰分别代表纯化的单体(“sc”)和二聚(“dc”)形式的人类5C8 scFc IgG1抗体。
图3显示二聚(“dc”)和单体(“sc”)形式的scFc结合多肽在非还原(组A)和还原(组B)条件下制备规模的SDS-PAGE。各图中，泳道1和2分别包含各自二聚形式(“ds”；205kDa)和单体(“sc”；105kDa)形式。泳道3包含对照人类5C8 IgG1抗体(5C8；150kDa)。
实施例2.确定单体和二聚的scFc抗体的功能相互作用的测定
(a)shCD40L结合测定
为了检测单体(“sc”)和二聚的(“dc”)scFc抗体的直接抗原结合，将可溶的人类CD40L(CD154)以PBS，pH 7中2μg/ml包被在Nunc MaxiSorp 96孔板上，在4℃过夜，每孔100μL。将IgG溶液摇出板，在室温在含有10mMNaPi、0.362M NaCl、0.05％Tween-20、0.1％酪蛋白、5％FBS，pH 7的封闭缓冲液(300μL每孔)中封闭孔2hr。倒空板，在封闭缓冲液中滴定生物素化的WT 5c8 hIgG1、sc或dc scFc，从1μg/ml开始在板上进行一系列1∶3稀释，每孔100μL。在室温培养2hr后，在PBS，0.05％Tween-20中洗涤板四次。在封闭缓冲液中按1∶10,000稀释辣根过氧化物酶结合的链霉抗生物素蛋白，按每孔100μL加到板上，在室温1hr以检测结合的生物素化的scFc。洗涤板，在底物四甲基联苯胺(TMB，100μL每孔)存在下允许显色反应进行大约5min。每孔加入100μL 0.5M H2SO4而终止反应，在450nm读取吸光度。图6显示ELISA结合测定的结果，比较单体(“sc”)scFc抗体、二聚的(“dc”)scFc抗体和常规IgG1抗体(Hu 5C8)的抗原结合亲和性。
还进行Biacore分析来确定由Biacore测量的5c8IgG1二价mAb、一价Fab和一价3xG4S-连接的半糖基化的scFc与抗原CD40L结合的亲和性和解离速率(参见表2)。发现scFc对其靶抗原的亲和性比mAb弱，但与Fab相当。
表2.Biacore分析
  分子   KD(pM)   kd(x10-4.s-1)
  5C8mAb   ＜46   0.8
  5C8F(ab)   560   4.5
  5C8scFc   200   3.6
(b)FcRn结合ELISA
为了检测对人类和大鼠FcRn的直接结合，将野生型(WT)5C8hIgG1、单体(“sc”)和二聚的(“dc”)scFc抗体以PBS，pH 6中5μg/ml包被在NuncMaxiSorp 96孔板上，在4℃过夜。将IgG溶液摇出板，在室温在含有0.1M磷酸钠、0.1M氯化钠、0.05％Tween 20和0.1％明胶，pH 6的封闭缓冲液中封闭孔2hr。在PBS pH 6中洗涤板，在封闭缓冲液中滴定生物素化的人类或大鼠FcRn-Fc从1μg/ml起始在板上进行1∶3系列稀释。在室温培养2hr后，在PBS，pH 6中洗涤板，在封闭缓冲液中1∶10,000稀释的辣根过氧化物酶结合的链霉抗生物素蛋白，加到各孔，在室温1.5hr以检测结合的生物素化的FcRn-Fc。洗涤板，在底物四甲基联苯胺(TMB)存在下允许显色反应进行大约15min。加入0.5M H2SO4而猝灭反应，在450nm读取各板。
图7显示FcRn结合测定的结果，比较二聚的和单体形式的scFc结合多肽与常规IgG1抗体(Hu 5C8)的FcRn结合亲和性。使用生物素化的形式的人类和大鼠FcRn-Fc构建体两者确定FcRn结合。该测定中，每个含有Fc的构建体被包被在板上并检测生物素化的大鼠或人类FcRn-Fc构建体与链霉抗生物素蛋白HRP的结合。单体scFc对人类FcRn(不是大鼠FcRn)的结合的确定的c-值比Hu5C8或二聚的scFc抗体的低大约四倍。
(c)FcγR结合测定
以此前所述的基于细胞的搭桥测定(Ferrant JL等人，InternationalImmunology，2004)测量WT 5C8 hIgG1抗体、单体(“sc”)和二聚的(“dc”)scFc抗体对FcγRI(CD64)的结合。FcγRI(CD64)搭桥测定在96-孔Maxisorb ELISA板(Nalge-Nunc，Rochester，NY，USA)上进行，该板包被有10μg/ml的人类重组可溶CD40L(CD154)以捕获测试抗体。将测试抗体滴定到各孔，从1μg/ml开始，在板上进行1∶3系列稀释。以激发波长485nm/发射波长530nm测量荧光标记的CD64+CD32+U937细胞(ATCC)的抗体-依赖性结合。
还以放大的发光近端均一测定(Amplified Luminescent ProximityHomogeneous Assay)(
Figure G2008800247098D01121
；Perkin Elmer)评价包含GGGGS(“1x-G4S”)或(GGGS)3(“3x-G4S”)接头的scFc抗体接合Fcγ受体的能力。供体珠的激光发射(680nm)产生单氧，氧接近受体珠时引发级联事件，最终造成在520-620nm发射荧光。供体珠和受体珠分别饰以配体和受体蛋白，仅当受体和配体变成功能性接合时，供体珠和受体珠才靠得足够近。
进行竞争式测定，其中系列稀释的测试抗体(WT IgG1或scFc)与人类FcγRIII-GST(CD16a，V158)和抗-GST受体珠在4℃在96-孔白板中培养过夜。链霉抗生物素蛋白供体珠和生物素化的野生型IgG1也在分开的管中在4℃培养过夜，随后次日加到测定板。在室温伴随轻微摇动培养两小时后，在
Figure G2008800247098D01132
读板器(Perkin Elmer)对板读数。与完全糖基化的WT人类IgG1相比，显示半糖基化的3x-和1x-G4S连接的scFc对低亲和性人类FcγRIII的高亲和性变体(V158)分别具有低4-倍和57-倍的亲和性(参见图14A)。
进行Alphascreen测定来评价半糖基化的或完全糖基化的scFc多肽相对于野生型人类IgG1抗体(5c8)和工程化的无糖基化的人类IgG1变体(“Agly5c8 scFc”)的FcγR-结合活性，预料工程化的无糖基化的人类IgG1变体表现对Fcγ受体显著减弱的结合。在该测定确定对人类和猕猴FcγR IIa(CD32a)、IIb(CD32b)和III(CD16a)的结合。半糖基化的以及完全糖基化的3xG4S连接的scFc变体两者以与WT IgG1相当的表观亲和性结合受体，而1xG4S连接的scFc对FcγRIII的结合比WT IgG1测量值弱大约60-倍(参见图14B)。
(d)scFc抗体与人类CD40L的复合体的SEC-LS
设定带有连线光散射实验的非平衡的分析性凝胶过滤，以确定当单链(“sc”；即，单体)或双链(“dc”；即，二聚的)scFc抗体以及三聚配体CD40L以不同摩尔比混合时形成的复合体的大小和化学计量。WT人类IgG1抗-人类CD40L mAb(5C8)在这些研究中用作对照分子。各种scFc抗体与配体混合以获得结合位点的近等摩尔比(1∶1)以及三聚配体3-倍过量(1∶3)的比例。混合蛋白，在PBS中形成终体积，并允许平衡≥4hr。可溶性人CD40L的浓度在代表等摩尔结合位点的混合物中保持恒定在3μM，在代表3-倍过量配体结合位点的混合物中加到6μM。将复合体以40μl体积、0.6ml/min注入到TSK-GEL G4000SWXL柱(7.8mmx30cm，Tosoh)。用于这些研究的HPLC系统(Waters 2690)装备有连线UV光散射(PD2000DLS，Precision Detectors)和RI检测器，以使易于确定复合体的分子量和化学计量。
图4A-B显示表征单链(“sc”)或双链(“dc”)scFc抗体结合于同三聚的shCD40L抗原的复合体。图4A显示从SEC-LS实验获得的大小排阻层析的合成图，进行该实验以确定各复合体的分子量。图4B显示(i)单链(“sc”)和(ii)双链(“dc”)scFc抗体分别结合于shCD40L后形成的预测复合体的图解，以及这些复合体的理论分子量。
图5显示在有单链(“sc”)scFc抗体或常规人类IgG1抗-CD40L mAb(5C8)存在时形成的含有shCD40L的复合体的比较。各复合体确定的分子量标在各峰上方。单链(“sc”)scFc、5C8和shCD40L预测的分子量分别是101.5kDa、150kDa和51kDa。
实施例3.具有特异性多肽接头的scFc多肽的增强的表达
用特异性多肽接头可对单链-(即，单体)或双链(即，二聚的)scFc构建体的优先表达进行选择。图12显示scFc构建体在其scFc区的组成性Fc部分之间含有1xG4S或3xG4S接头时，经蛋白-A亲和纯化后的特征。对1xG4S(图12A)和3xG4S(图12B)scFc的蛋白A池进行制备级大小排阻层析，结果显示，增加的接头长度与单体(“sc”)相比于二聚体(“dc”)scFc的蛋白百分比明显相关。由所示级分的SDS-PAGE分析洗脱物质中包含的sc-和dc-scFc群体。对蛋白A亲和纯化的包含1xG4S或3xG4S接头的scFc构建体进行分析性大小排阻层析，将图谱重叠还显示，1xG4S连接的scFc构建体包含所需单体scFc(“sc”)与可观量的二聚scFc多肽(“dc”)的混合群体，而3xG4S接头构建体显著地富集单体scFc群体(图12C i和ii)。1x和3xG4S连接的scFc蛋白经2-步纯化后进行分析性SEC-LS，分析显示，两种scFc蛋白都可制为均一制品，这些制品包含预计分子量(100kDa)的物质。因此，当scFc多肽中有经1xG4S接头遗传融合的Fc部分时，其包含所需单链(“sc”)scFc多肽与可观量的双链(“dc”)scFc多肽的混合分子群体。相反，3x-G4S连接的scFc构建体显著地富集单链(“sc”)scFc多肽群体。
实施例4.确定scFc多肽的药代动力学(PK)特征
在大鼠中确定WT人类IgG1(5C8)和含有1x-和3x-G4S接头的scFc构建体的终末半衰期。各种构建体在PBS pH 7中以2.5mg/kg静脉内施用于三只动物。在预确定的时间点收集血清样品，冷冻储存在-80℃用于分析。由ELISA确定各种构建体的血清浓度随时间变化的过程。简单地说，将重组、可溶的人类CD40L(CD154)以PBS pH7中5μg/ml包被到Nunc
Figure G2008800247098D01141
96-孔板上，在4℃过夜。以封闭缓冲液(10mM PBS pH 7中1％酪蛋白水解物，300μl/孔，室温(RT)2h)封闭板。在10mM PBS pH 7、0.362M NaCl、0.05％Tween-20、0.1％酪蛋白、5％FBS中制备在各时间点获得的血清样品的系列稀释，并在RT施加到相应孔维持2hr。以PBS和0.05％Tween-20洗涤板4次，与辣根过氧化物酶结合的驴抗-人类IgG二抗(JacksonImmunoresearch 709-035-149)孵育2hr后，在450nm检测捕获的IgG和scFc多肽。使用
Figure G2008800247098D01151
软件包分析WT和scFc多肽血清浓度的时间依赖性变化。WT人类IgG1和3x-G4S连接的scFc多肽表现相似的β-相半衰期，分别是14天和12天。1x-G4S连接的scFc的半衰期是4.2天，显著短于WTmAb的(参见图13)。
实施例5.制备半糖基化的scFc多肽
示例性本发明scFc多肽是3xG4S-连接的半糖基化的5c8scFc多肽，在其scFc区的两个Fc部分之一具有单个聚糖。为了证实发生了半糖基化，在酶促除去半聚糖之前和之后，对scFc多肽进行去卷积的质谱测定(MS)。图15显示对蛋白以PNGaseF去糖基化之前和之后获得的去卷积的质谱。scFc多肽去糖基化(并还原)后的重链和轻链质量经确定分别是75,703Da和23,854Da。完整的去糖基化的分子因此应具有99,557Da的质量，这与计算的质量100kDa很好地一致。因此，去糖基化的scFc多肽的分子量符合半糖基化的特征。
实施例6.生物物理分析scFc多肽
本发明scFc多肽优选地具有与常规多肽相当的生物物理特征(如，热稳定性)。由差示扫描量热法(DSC)比较5c8scFc多肽的热稳定性和WT huIgG1mAb和Fc的热稳定性。发现scFc的Fab和CH3结构域的解链谱与IgG1的mAb和Fc片段的解链谱很好地一致(参见图16)。尤其，半糖基化的scFc(ASK043)的CH2结构域具有与无糖基化的IgG1相似的Tm(分别为61.9℃和61℃)，而完全糖基化的scFc(ASK048)比WT IgG1 CH2结构域的稳定性高。
实施例7.具有改进的溶解度的抗-LINGO scFc抗体
LINGO-1是CNS特异性膜结合糖蛋白，它与NgR1/p75和NgR1/TAJ(TROY)一起形成信号传导复合体，该复合体结合髓磷脂抑制剂并介导轴突长出。拮抗LINGO-1结合的可溶LINGO-1(LINGO-1-Fc)在脊束(spinal tract)损伤模型中可显著促进功能恢复。
根据本发明方法合成多种抗-LINGO scFc抗体。示例性抗-LINGO抗体(EAG2148)的重链的氨基酸和核苷酸序列显示在图32、33和图35-38。各抗体轻链的氨基酸和核苷酸序列显示在图34。图39显示分析抗-Lingo scFc抗体分子的蛋白浓度依赖性溶解度特征，如由分析性SEC(A & B)和超速离心(C)确定。Li33是一种抗-LINGO人类IgG1抗体，容易聚集，因此产生其更可溶的人类IgG2形式。然而，甚至与更可溶的IgG2构建体(B)比较，1xG4S连接的半糖基化的Li33scFc(A)显示显著更好的溶解度特征，因为，随着蛋白浓度增加，IgG2单体峰而不是scFc的曲线下面积减少。(C)通过用分析性超速离心测沉降速率，评价抗-LINGO Li33scFc在20mM Tris、150mM NaCl，pH 8中在0.7mg/ml的均质性。尽管Li33scFc制品在该浓度可检出不超过1％的聚集材料，Li33 IgG2 mAb制品在PBS，pH 7中浓度低至0.3mg/ml时包含4％-16％的聚集蛋白。
实施例8.抗-CD2scFc抗体
CD2是肿瘤相关的泛T细胞抗原，见于T-细胞和天然杀伤(NK)细胞，与多种T-细胞相关病症有关，所述病症包括某些自身免疫病症(如，移植物抗宿主病、银屑病、肾移植)和T-细胞癌(如，非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma))。示例性抗-CD2scFc抗体可根据本发明方法合成。chCB6是人类CD2-特异性嵌合单克隆抗体(IgG1，κ)。根据本发明合成包含3xG4S、4xG4S、5xG4S或6XG4S接头的完全糖基化的chCB6嵌合scFc抗体。示例性重链氨基酸和核苷酸序列显示在图40-47。
实施例9.抗-LTβR scFc抗体
淋巴毒素β受体(LTβR)是受体的肿瘤坏死因子(TNF)家族成员，已牵涉在细胞凋亡和癌症中。示例性抗-LTβR scFc抗体可根据本发明方法合成。例如，BDA8的结合位点可融合于本发明的scFc区。BDA8抗体的示例性重链氨基酸和核苷酸序列显示在图64。
实施例10.GFRα3：scFc融合多肽
GFRα3是神经胶质-衍生的神经营养因子(GDNF)受体家族的成员。由于其生理作用，可溶神经营养因子可用于治疗许多神经退化疾病中发生的神经细胞退化和失去分化功能。例如，保持配体结合(优选地GDNF结合)和受体信号传导功能(经由Ret受体酪氨酸激酶)两者的可溶GDNFRα可用于赋予、恢复或增强GDNFRα-配体(优选地GDNF)对神经元或其它细胞的响应性。
根据本发明方法合成示例性GFRα3：scFc融合蛋白(ASK057)。ASK057的氨基酸和核苷酸序列显示在图48和图49。图50显示融合蛋白表达后的非还原SDS-PAGE和分析性SEC-LS。汇集从蛋白A柱洗脱的物质(L)，上样到Superdex 200凝胶过滤柱以分离单体(sc)和二聚的(dc)scFc群体(凝胶的泳道1)，随后是泳道2中的分子量标准品(M)。经SEC汇集的GFRα3：scFc级分被括在两个虚线之间。2-步纯化后获得的GFRα3：scFc经SEC-LS分析表明是均一的制品，分子量是114.8kDa。GFRα3：scFc结合于同二聚的neublastin的化学计量由溶液相Biacore实验确定为2GFRα3：scFc：1neublastin二聚体。
实施例11.IFN-β：scFc融合多肽
干扰素β-1a(如，
Figure G2008800247098D01171
)可用于治疗多发性硬化。示例性IFN-β：scFc免疫粘附素(EAG2149)根据本发明方法合成。EAG2149分子包含1xG4S接头并被修饰以便于半糖基化。ASK057的氨基酸和核苷酸序列显示在图51和图52。
实施例12.LTβR：scFc融合多肽
示例性LTβR：scFc免疫粘附素(EAG2190和EAG2191)根据本发明方法合成。EAG2190分子包含3xG4S接头，并被修饰以便于半糖基化。这些分子的氨基酸和核苷酸序列显示在图53-56。对纯化的LTβR：scFc融合蛋白进行4-12％梯度SDS-PAGE，揭示对应于对DLI33scFc预料分子量75kD的单条带。在Phenomonex Biosep-S-3000柱上在20mM磷酸钠pH 7.2、150mMNaCl(PBS)中以0.5mL/min进行纯化蛋白的分析性凝胶过滤。在280nM监测洗脱液。随后确定纯化的LTβR：scFc的均质性和对已知配体LTα1β2的结合活性。纯化的LTβRscFc的还原和非还原的SDS PAGE显示于图57A。分析性大小排阻层析显示纯化LTβR：scFc的单个高均质性峰(图57B)。
以PNGaseF去糖基化、以DTT还原并在室温培养12h后，在LCZ质谱仪上由质谱测定分析LTBR：scFc(参见图58)。对还原和N-去糖基化的分子的质谱测定显示，73,844.5的理论分子量与实验值73,846一致。在表达的LTβR：scFc的前四个氨基酸观察到N-末端蛋白水解不均质性，且N-1和N-3部分两者的第一残基是焦谷氨酸。在质谱测定中观察到低水平的O-糖基化，反映在74726和74820的峰。
图59A描绘ELISA的结果，评价单体LTβR：scFc对LTα1β2的结合亲和性。将ELISA板以PBS中5ug/ml LTα1β2包被，在4℃过夜。随后以10mMPBS，pH 7.0中1％酪蛋白封闭板，随后以10mM PBS，pH 7.0，0.1％Tween 20(洗涤缓冲液)洗涤三次。将LTβR：IgG或LTBβ：scFc系列稀释到10mM PBS、362mM NaCl、0.055Tween-20、0.1％酪蛋白、5％FBS pH 7.0(测定稀释液)并孵育1h，随后以洗涤缓冲液洗涤。向各孔加入在测定稀释液中1∶5000稀释的驴抗-人类重链和轻链特异性HRP(Jackson Labs)结合的二抗，维持60min，随后用PBS洗涤。几分钟后，使用四甲基联苯胺和过氧化氢在100mM乙酸钠pH 4.0中将HRP显色，加入100uL 1N硫酸终止测定，在450nM读取样品吸光度。ELISA分析显示，与LTβR：IgG相比，LTβR：scFc具有减少的结合亲和性。这一结果反映单体LTβR：scFc相对于二聚的LTβR：IgG亲和力的减少。此前显示，二聚的LTβRIgG(＜0.10nM)和单体LTβR(40nM)的Kd值差别超过400倍(Eldredge，Berkowitz等人2006)。
还由FACS分析评价单体LTβR：scFc的结合亲和性(图59B)。根据Eldredge等人的方法对II-23细胞进行FACS(Eldredge，Berkowitz等人2006)。使用流式细胞术，根据此前所述的方法进行FACS结合测定(Force，Walter等人1995)。简要地说，在直接结合测定中，在带有不同浓度的LTβRIgG或生物素化LTβRIgG(bLTβRIgG)的FACS缓冲液中，在经豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯活化的II-23细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC)Manassas，VA)上检测人类LTα1β2。细胞在冰上保温1-2h，随后以PBS洗涤并离心。加入合适的FACS缓冲液中的链霉抗生物素蛋白(steptavidin)藻红蛋白或抗-hFc藻红蛋白标记的二抗(Molecular Probes，Eugene，OR)，并与细胞一起再保温1h，再次洗涤。将II-23细胞上结合的LTβRIgG的荧光染色，通过由FACS确定的平均通道荧光(mean channel fluorescence)来定量。FACS和ELISA两者都显示，与LTβRIgG相比，LTβRscFc具有减少的结合亲和性。这一结果是预计到的，因为单体蛋白缺少LTβRIgG的亲和力。此前显示，二聚的LTβRIgG(＜0.10nM)和单体LTβR(40nM)的Kd值差别超过400倍(Eldredge，Berkowitz等人2006)。

Claims (88)

1.一种结合多肽，其包含(i)第一结合位点和(ii)单个连续遗传序列中编码的第一Fc区，其中：
a.所述Fc区包含至少两个Fc部分，
b.所述Fc区经由置于所述Fc部分之间的多肽接头序列融合；且
c.所述Fc区赋予所述结合多肽至少一种效应子功能。
2.根据权利要求1所述的结合多肽，其中所述Fc区包含选自由FcRn结合部分、FcγR结合部分、补体结合部分、蛋白G结合部分和蛋白A结合部分组成的组的结构域。
3.根据权利要求1或2所述的结合多肽，其中所述Fc区是异聚的Fc区。
4.根据权利要求3所述的结合多肽，其中所述异聚的Fc区是半糖基化的。
5.根据权利要求1或2所述的结合多肽，其中所述Fc区是同聚的Fc区。
6.根据权利要求1或2所述的结合多肽，其中所述Fc区是完全糖基化的。
7.根据权利要求1或2所述的结合多肽，其中所述Fc区是无糖基化的。
8.根据权利要求1或2所述的结合多肽，其中所述Fc区是无岩藻糖基化的。
9.根据前述权利要求任一项所述的结合多肽，其中所述Fc区是嵌合Fc区。
10.根据权利要求9所述的结合多肽，其中所述Fc区包含多个来自IgG2分子的CH2结构域和多个来自IgG4分子的CH3结构域。
11.根据权利要求9所述的结合多肽，其中所述Fc区包含来自IgG2分子的CH2部分和来自IgG4分子的CH2部分。
12.根据权利要求9所述的结合多肽，其包含修饰的铰链区。
13.根据权利要求9所述的结合多肽，其包含来自IgG4分子的中部铰链区和来自IgG1分子的上部和下部铰链区。
14.根据权利要求9所述的结合多肽，其中所述铰链区的一个或多个半胱氨酸残基被丝氨酸残基取代。
15.根据权利要求1所述的结合多肽，其中所述Fc区包含两个或多个Fc部分。
16.根据权利要求1所述的结合多肽，其中所述Fc区包含缺少选自由CH2结构域、CH3结构域和铰链结构域组成的组的部分的Fc结构域。
17.根据权利要求1所述的结合多肽，其中所述Fc部分的至少一个包含至少一个氨基酸突变。
18.根据权利要求17所述的结合多肽，其中所述Fc部分的两个或多个包含氨基酸突变。
19.根据权利要求17或18所述的结合多肽，其中所述突变在对应于由根据EU编号索引234、236、239、241、246-252、254-256、275、277-288、294、296-298、301、303-307、309、310、312、313、315、328、332、334、338、342、343、350、355、359、360、361、374、376、378、381-385、387、389、413、415、418、422、426、428、430-432、434、435、438和441-446组成的组中所列的Fc氨基酸位置的一个或多个位置。
20.根据权利要求17或18所述的结合多肽，其中所述突变位于CH2结构域。
21.根据权利要求17或18所述的结合多肽，其中所述突变位于CH3结构域。
22.根据权利要求21所述的结合多肽，其中所述CH3结构域在对应于选自由根据EU编号索引350、355、361、389、415、441、443和446b组成的组的Fc氨基酸位置的一个或多个氨基酸位置包含工程化的半胱氨酸或其含硫醇类似物。
23.根据权利要求17所述的结合多肽，其在EU位置297具有减少的糖基化。
24.根据权利要求23所述的结合多肽，其在EU位置297是无岩藻糖基化的。
25.根据权利要求1所述的结合多肽，其中所述多肽接头的长度是约50至约500个氨基酸。
26.根据权利要求25所述的结合多肽，其中所述多肽接头的长度是约50至约200个氨基酸。
27.根据权利要求26所述的结合多肽，其中所述多肽接头的长度是约1至约50个氨基酸。
28.根据权利要求27所述的结合多肽，其中所述多肽接头的长度是约10至约20个氨基酸。
29.根据权利要求28所述的结合多肽，其中所述多肽接头包含铰链区或其部分。
30.根据权利要求29所述的结合多肽，其中所述铰链区是嵌合铰链区。
31.根据权利要求1所述的结合多肽，其中所述多肽接头包含gly/ser肽。
32.根据权利要求31所述的结合多肽，其中所述gly/ser肽具有式(Gly4Ser)n，其中n是选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10组成的组的正整数。
33.根据权利要求31任一项所述的结合多肽，其中所述(Gly4Ser)n接头是(Gly4Ser)3。
34.根据权利要求1所述的结合多肽，其中所述第一结合位点遗传融合于所述Fc区的N-末端。
35.根据权利要求1所述的结合多肽，其中所述第一结合位点遗传融合于所述Fc区的C-末端。
36.根据权利要求1所述的结合多肽，其中所述第一结合位点贴在所述Fc区的Fc部分上。
37.根据权利要求1所述的结合多肽，其中所述多肽接头包含所述第一结合位点。
38.根据权利要求1所述的结合多肽，其中所述结合位点并入所述Fc区的一个或多个Fc部分中。
39.根据权利要求1所述的结合多肽，其还包含第二结合位点。
40.根据权利要求39所述的结合多肽，其中所述第二结合位点可操作地连接于所述Fc区的N-末端。
41.根据权利要求39所述的结合多肽，其中所述第二结合位点可操作地连接于所述Fc区的C-末端。
42.根据权利要求1所述的结合多肽，其包含至少三个结合位点。
43.根据权利要求42所述的结合多肽，其包含至少四个结合位点。
44.根据权利要求1所述的结合多肽，其中所述多肽接头包含生物学相关的肽或其部分。
45.根据权利要求44所述的结合多肽，其中所述生物学相关的多肽是抗排斥或抗炎肽。
46.根据权利要求44所述的结合多肽，其中所述生物学相关的多肽选自由细胞因子抑制肽、细胞粘附抑制肽、凝血酶抑制肽和血小板抑制肽组成的组。
47.根据权利要求46所述的结合多肽，其中所述细胞因子抑制肽是IL-1抑制肽。
48.根据权利要求1所述的结合多肽，其中至少一个结合位点选自由抗原结合位点、受体的配体结合部分和配体的受体结合部分组成的组。
49.根据任何权利要求48所述的结合多肽，其中所述结合位点是衍生自抗体的抗原结合位点。
50.根据权利要求49所述的结合多肽，其中所述抗体选自由单克隆抗体、嵌合抗体、人类抗体和人源化抗体组成的组。
51.根据权利要求50所述的结合多肽，其中所述结合位点衍生自选自由scFv、Fab、微型抗体、双链抗体、三链抗体、纳米抗体、骆驼抗体和Dab组成的组的修饰的抗体。
52.根据权利要求1所述的结合多肽，其中所述结合位点衍生自非免疫球蛋白的结合分子。
53.根据权利要求52所述的结合多肽，其中所述非免疫球蛋白的结合分子选自由adnectin、亲和体亲和体、DARPin和抗运载蛋白组成的组。
54.根据前述权利要求任一项所述的结合多肽，其中至少一个结合位点包含来自选自由利妥昔单抗、达克珠单抗、加利昔单抗、CB6、Li33、5c8、CBE11、BDA8、14A2、B3F6、2B8、Lym 1、Lym 2、LL2、Her2、5E8、B1、MB1、BH3、B4、B72.3、CC49和5E10组成的组的抗体的六个CDR、可变重链区和可变轻链区、或抗原结合位点。
55.根据权利要求48所述的结合多肽，其中所述受体的配体结合部分衍生自选自由免疫球蛋白(Ig)超家族的受体、TNF受体超家族的受体、G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族、神经胶质衍生的神经营养因子(GDNF)受体家族的受体、和细胞因子受体超家族组成的组的受体。
56.根据权利要求55所述的结合多肽，其中所述TNF受体超家族的受体是LTβR。
57.根据权利要求55所述的结合多肽，其中所述TNF受体超家族的受体结合TNFα。
58.根据权利要求55所述的结合多肽，其中所述GDNF受体家族的受体是GFRα3。
59.根据权利要求45所述的结合多肽，其中所述配体的受体结合部分衍生自抑制配体。
60.根据权利要求48所述的结合多肽，其中所述配体的受体结合部分衍生自活化配体。
61.根据权利要求59或60所述的结合多肽，其中所述配体结合选自由免疫球蛋白(Ig)超家族的受体、TNF受体超家族的受体、G-蛋白偶联受体(GPCR)超家族的受体、酪氨酸激酶(TK)受体超家族的受体、配体门控(LG)超家族的受体、趋化因子受体超家族的受体、IL-1/Toll样受体(TLR)超家族和细胞因子受体超家族组成的组的受体。
62.根据权利要求61所述的结合多肽，其中结合所述细胞因子受体超家族的受体的配体是β-干扰素。
63.根据权利要求28所述的结合多肽，其中所述第一结合位点和第二结合位点具有不同的结合特异性。
64.根据权利要求28所述的结合多肽，其中所述第一结合位点和第二结合位点具有相同的结合特异性。
65.根据权利要求1所述的结合多肽，所述结合分子包含两个或多个遗传融合的Fc区。
66.根据权利要求1所述的结合多肽，其结合于至少一个功能性部分。
67.根据权利要求66所述的结合多肽，其中所述功能性部分选自由封闭部分、可检测部分、诊断部分和治疗部分组成的组。
68.根据权利要求67所述的多肽，其中所述封闭部分选自由半胱氨酸加合物、混合的二硫化物、聚乙二醇和聚乙二醇马来酰亚胺组成的组。
69.根据权利要求67所述的多肽，其中所述可检测部分选自由荧光部分和同位素部分组成的组。
70.根据权利要求67所述的多肽，其中所述诊断部分能够揭示疾病或病症的存在。
71.根据权利要求67所述的多肽，其中所述治疗部分选自由抗炎剂、抗癌剂、抗神经变性剂和抗传染剂组成的组。
72.根据权利要求66任一项所述的结合多肽，其中所述功能性部分结合于所述多肽接头。
73.根据权利要求66任一项所述的结合多肽，其中所述功能性部分是经由二硫键结合的。
74.根据权利要求66任一项所述的结合多肽，其中所述功能性部分是经由异双官能接头结合的。
75.根据权利要求1所述的结合多肽，其还包含第二多肽并且是多聚的。
76.根据权利要求75所述的结合多肽，其中所述第二多肽是包含(i)至少第二结合位点，和(ii)至少第二遗传融合的Fc区的结合多肽，其中所述第二遗传融合的Fc区包含至少两个Fc部分并赋予所述结合多肽至少一种效应子功能。
77.根据权利要求76所述的多聚结合多肽，其是二聚的结合多肽。
78.根据权利要求77所述的结合多肽，其中所述第一结合位点或第二结合位点结合于免疫细胞或肿瘤细胞上存在的抗原。
79.根据权利要求1所述的结合多肽，其中至少一个Fc部分属于IgG同种型。
80.根据权利要求79所述的结合多肽，其中所述IgG同种型属于IgG1亚类。
81.根据权利要求1所述的结合多肽，其中至少一个Fc部分衍生自人类抗体。
82.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的多肽。
83.一种核酸分子，其包含编码权利要求1所述的多肽的核苷酸序列。
84.根据权利要求83所述的核酸分子，其在表达载体中。
85.一种宿主细胞，其包含权利要求84所述的表达载体。
86.一种产生结合多肽的方法，其包括在培养物中培养权利要求85所述的宿主细胞以致产生所述结合多肽。
87.一种治疗或预防受治疗者的疾病或病症的方法，其包括施用权利要求86所述的药物组合物。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述疾病或病症选自由神经学病症、炎性病症、自身免疫病症和肿瘤病症组成的组。
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Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103842380A (zh) * 2011-07-27 2014-06-04 葛兰素集团有限公司 融合至Fc结构域的抗VEGF单可变结构域
CN103857700A (zh) * 2011-08-26 2014-06-11 梅里麦克制药股份有限公司 串联fc双特异性抗体
CN104105711A (zh) * 2012-02-10 2014-10-15 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单链抗体及其他异多聚体
CN104870055A (zh) * 2012-10-17 2015-08-26 利物浦热带医学院 免疫调节蛋白
CN105051069A (zh) * 2013-01-14 2015-11-11 Xencor股份有限公司 新型异二聚体蛋白
CN106191072A (zh) * 2016-08-04 2016-12-07 沈沭彤 重组人源嵌合GcFc基因片段及融合蛋白
CN107172880A (zh) * 2014-03-24 2017-09-15 癌症研究技术有限公司 含有修饰IgG2结构域的引起激动或拮抗特性的修饰抗体及其用途
CN107428830A (zh) * 2015-01-05 2017-12-01 依奈特制药公司 单体fc结构域
CN107835693A (zh) * 2015-06-12 2018-03-23 联亚药业股份有限公司 免疫球蛋白融合蛋白及其用途
US9994646B2 (en) 2009-09-16 2018-06-12 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
CN109096398A (zh) * 2012-08-22 2018-12-28 瑞泽恩制药公司 GFRα3的人抗体及其使用方法
US10633457B2 (en) 2014-12-03 2020-04-28 Hoffmann-La Roche Inc. Multispecific antibodies
CN111182915A (zh) * 2017-08-15 2020-05-19 金德雷德生物科学股份有限公司 兽药用IgG Fc变体
CN113234168A (zh) * 2021-06-04 2021-08-10 浙江大学 一种融合蛋白、基因及应用
CN113406320A (zh) * 2021-08-18 2021-09-17 南京立顶医疗科技有限公司 基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法及应用
TWI746491B (zh) * 2015-12-03 2021-11-21 財團法人國家衛生研究院 異質雙聚體型血管內皮生長因子及其應用
TWI754628B (zh) * 2016-02-03 2022-02-11 德商安美基研究（慕尼黑）公司 雙特異性t細胞嚙合抗體構築體
CN114195895A (zh) * 2015-02-03 2022-03-18 Als治疗发展学会 抗cd40l抗体和用于治疗cd40l相关疾病或病症的方法

Families Citing this family (242)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5992710A (ja) * 1982-11-16 1984-05-29 関西電力株式会社 直接水冷線路の立坑部の布設方法
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
DK2348114T3 (en) 2004-04-21 2018-09-03 Alexion Pharma Inc BONE DELIVERY CONJUGATES AND PROCEDURE TO USE IT FOR TARGETING PROTEINS AGAINST BONE
CA2616395C (en) 2005-07-25 2016-10-04 Trubion Pharmaceuticals B-cell reduction using cd37-specific and cd20-specific binding molecules
EP3056568B1 (en) 2006-03-31 2021-09-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
EP3805269A1 (en) 2006-06-12 2021-04-14 Aptevo Research and Development LLC Single-chain multivalent binding proteins with effector function
GB0614780D0 (en) * 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
CN101951940A (zh) * 2007-03-15 2011-01-19 比奥根艾迪克Ma公司 自身免疫病的治疗
CN107011445B (zh) 2007-06-01 2021-06-29 马里兰大学巴尔的摩分校 免疫球蛋白恒定区Fc受体结合剂
AU2008287195A1 (en) * 2007-07-06 2009-02-19 Emergent Product Development Seattle, Llc Binding peptides having a C-terminally disposed specific binding domain
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
TW200944231A (en) * 2007-11-30 2009-11-01 Glaxo Group Ltd Antigen-binding constructs
KR20110013391A (ko) 2008-04-11 2011-02-09 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 Ｃｄ37 면역치료제 및 이작용성 화학치료제와 이의 병용물
HRP20240722T1 (hr) 2008-04-11 2024-08-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Molekula koja se veže na antigene, koja se može ponavljano vezati na dvje ili više molekula antigena
EP2344546A1 (en) * 2008-10-13 2011-07-20 Zymogenetics, Inc. Single chain fc type iii interferons and methods of using same
WO2010065578A2 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 Leukosight Inc. POLYPEPTIDES COMPRISING Fc FRAGMENTS OF IMMUNOGLOBULIN G (IgG) AND METHODS OF USING THE SAME
JP5985826B2 (ja) 2008-12-16 2016-09-06 ノバルティス アーゲー 酵母ディスプレイ系
ES2712732T3 (es) 2009-02-17 2019-05-14 Cornell Res Foundation Inc Métodos y kits para el diagnóstico de cáncer y la predicción de valor terapéutico
CA2777242A1 (en) * 2009-10-14 2011-04-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents targeting igf-1r and erbb3 signalling and uses thereof
TW201120210A (en) * 2009-11-05 2011-06-16 Hoffmann La Roche Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates
EP2506876B1 (en) 2009-12-02 2016-10-12 Imaginab, Inc. J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (psma) and methods for their use
SG181938A1 (en) 2009-12-25 2012-07-30 Pharmalogicals Res Pte Ltd Method for searching and screening for target of anti-cancer agent using non-human animal model having nog established cancer cell line transplanted therein
ES2678143T3 (es) 2010-01-19 2018-08-09 President And Fellows Of Harvard College Opsonina obtenida por ingeniería genética para la detección y el tratamiento de microorganismos patógenos
WO2011100565A2 (en) * 2010-02-12 2011-08-18 Research Corporation Technologies Multimeric proteins comprising immunoglobulin constant domains
US10472426B2 (en) * 2010-03-25 2019-11-12 Ucb Biopharma Sprl Disulfide stabilized DVD-Ig molecules
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
MX340683B (es) 2010-04-16 2016-07-21 Biogen Ma Inc Anticuerpos anti-vla-4.
HUE044419T2 (hu) 2010-07-09 2019-10-28 Bioverativ Therapeutics Inc Feldogozható egyetlen láncú molekulák és ezek alkalmazásával készült peptidek
PT2598533T (pt) 2010-07-28 2019-05-08 Gliknik Inc Proteínas de fusão de fragmentos de proteínas humanas naturais para criar composições fc de imunoglobulina multimerizada de forma ordenada
CN105585630B (zh) 2010-07-29 2020-09-15 Xencor公司 具有修改的等电点的抗体
EP2626414B1 (en) 2010-10-06 2020-07-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cancer stem cell mass and process for production thereof
WO2012064792A2 (en) 2010-11-09 2012-05-18 Altimab Therapeutics, Inc. Protein complexes for antigen binding and methods of use
RU2658504C9 (ru) 2010-11-30 2018-08-21 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул
SG191153A1 (en) 2010-12-23 2013-07-31 Hoffmann La Roche Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
AU2011350066A1 (en) 2010-12-27 2013-07-11 Alexion Pharma International Sarl Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
PL3489255T3 (pl) 2011-02-10 2021-11-22 Roche Glycart Ag Zmutowane polipeptydy interleukiny-2
SG192945A1 (en) 2011-02-25 2013-09-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcgriib-specific fc antibody
HUE033008T2 (hu) 2011-04-13 2017-11-28 Bristol Myers Squibb Co FC fúziós proteinek, amelyek tartalmaznak új linkereket
EA201892619A1 (ru) * 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
US9738707B2 (en) * 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
JP2014523914A (ja) 2011-07-18 2014-09-18 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 操作された微生物標的化分子およびその使用
CN103906535B (zh) 2011-08-15 2017-07-14 芝加哥大学 与葡萄球菌蛋白a的抗体相关的组合物和方法
AU2012296961B2 (en) 2011-08-17 2017-02-16 Glaxo Group Limited Modified proteins and peptides
JP6077997B2 (ja) 2011-09-07 2017-02-08 中外製薬株式会社 癌幹細胞の分離
EP3939996A1 (en) 2011-09-30 2022-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
PT2760471T (pt) 2011-09-30 2017-03-22 Dana Farber Cancer Inst Inc Péptidos terapêuticos
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
TR201809151T4 (tr) * 2011-10-11 2018-07-23 Hoffmann La Roche Bispesifik antikorların geliştirilmiş birleşmesi.
WO2013062083A1 (ja) * 2011-10-28 2013-05-02 ファーマロジカルズ・リサーチ プライベート リミテッド 癌幹細胞特異的分子
CN113416257A (zh) 2011-11-30 2021-09-21 中外制药株式会社 包含进入细胞内以形成免疫复合体的搬运体(载体)的药物
US8961971B2 (en) 2011-12-22 2015-02-24 Development Center For Biotechnology Bispecific T-cell activator antibody
US11147852B2 (en) 2011-12-23 2021-10-19 Pfizer Inc. Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
JP6247226B2 (ja) 2012-01-10 2017-12-13 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 血液脳関門を越える治療分子の輸送の向上
WO2013158217A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Thomas Jefferson University Engineered antibody for inhibition of fibrosis
US9969794B2 (en) 2012-05-10 2018-05-15 Visterra, Inc. HA binding agents
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
AU2013271428B2 (en) * 2012-06-07 2016-08-04 Duke University Human bispecific EGFRvIII antibody engaging molecules
JP2015525222A (ja) 2012-06-08 2015-09-03 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． キメラ性凝固因子
EP2858659B1 (en) 2012-06-08 2019-12-25 Bioverativ Therapeutics Inc. Procoagulant compounds
ES2597228T3 (es) 2012-06-27 2017-01-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Procedimiento para la selección y la producción de entidades de objetivación, como dianas, altamente selectivas y multiespecíficas, personalizadas, las cuales contienen por lo menos dos entidades de unión diferentes, y utilización de éstas
EP2867254B1 (en) 2012-06-27 2017-10-25 F. Hoffmann-La Roche AG Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
PL2867251T3 (pl) * 2012-06-29 2020-03-31 Bristol-Myers Squibb Company Sposoby zmniejszania agregacji glikoprotein
MX365382B (es) * 2012-08-07 2019-05-31 Roche Glycart Ag Una combinación de inmunoconjugado y anticuerpo para usarse en el tratamiento de cáncer.
KR20150058236A (ko) * 2012-08-20 2015-05-28 글리크닉 인코포레이티드 항원 결합 및 다가 fc 감마 수용체 결합 활성을 가진 분자
JP6501521B2 (ja) 2012-08-24 2019-04-17 中外製薬株式会社 ＦｃγＲＩＩｂ特異的Ｆｃ領域改変体
EP2925779A1 (en) * 2012-11-30 2015-10-07 Institut Pasteur Use of anti-fcyri and/or anti-fcyriia antibodies for treating arthritis, inflammation, thrombocytopenia and allergic shock
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) * 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9738722B2 (en) 2013-01-15 2017-08-22 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
TWI635098B (zh) * 2013-02-01 2018-09-11 再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
ES2751735T3 (es) 2013-02-12 2020-04-01 Bristol Myers Squibb Co Métodos de replegado de proteínas a elevado pH
US10183967B2 (en) 2013-02-12 2019-01-22 Bristol-Myers Squibb Company Tangential flow filtration based protein refolding methods
HUE053136T2 (hu) 2013-02-15 2021-06-28 Bioverativ Therapeutics Inc Optimizált VIII. faktor gén
WO2014138449A1 (en) * 2013-03-06 2014-09-12 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Anti-c-met tandem fc bispecific antibodies
US10858417B2 (en) * 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9138455B2 (en) 2013-03-15 2015-09-22 Mead Johnson Nutrition Company Activating adiponectin by casein hydrolysate
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9352020B2 (en) 2013-03-15 2016-05-31 Mead Johnson Nutrition Company Reducing proinflammatory response
WO2014145907A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Xencor, Inc. Targeting t cells with heterodimeric proteins
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US8889633B2 (en) 2013-03-15 2014-11-18 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional compositions containing a peptide component with anti-inflammatory properties and uses thereof
US10551379B2 (en) 2013-03-15 2020-02-04 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for improving detection and/or capture of a target entity
EP3666886A1 (en) 2013-03-15 2020-06-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Therapeutic peptides
US9289461B2 (en) 2013-03-15 2016-03-22 Mead Johnson Nutrition Company Reducing the risk of autoimmune disease
US9345727B2 (en) 2013-03-15 2016-05-24 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional compositions containing a peptide component and uses thereof
US9345741B2 (en) 2013-03-15 2016-05-24 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional composition containing a peptide component with adiponectin simulating properties and uses thereof
CN105246914B (zh) 2013-04-02 2021-08-27 中外制药株式会社 Fc区变体
AU2014268603B2 (en) 2013-05-21 2018-03-22 President And Fellows Of Harvard College Engineered heme-binding compositions and uses thereof
KR101654890B1 (ko) * 2013-07-10 2016-09-07 한국과학기술원 면역글로불린 g에 대한 리피바디 및 그 용도
FR3012453B1 (fr) * 2013-10-31 2015-11-13 Lab Francais Du Fractionnement Proteine chimerique dans le traitement de l’amylose
KR20160090904A (ko) 2013-12-06 2016-08-01 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 치료 펩티드
EP3546474B1 (en) 2013-12-18 2021-07-07 President and Fellows of Harvard College Crp capture/detection of gram positive bacteria
KR102452173B1 (ko) 2013-12-24 2022-10-17 더 보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 Fcrn 길항제 및 사용방법
IL296754A (en) 2013-12-27 2022-11-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method for isolating an antibody with a low isoelectric point
ES2784238T3 (es) * 2014-02-02 2020-09-23 Medimmune Ltd Proteína quimérica compuesta por un dominio antagonista del NGF y un dominio antagonista del TNFalfa
CN106068274A (zh) 2014-03-05 2016-11-02 Ucb生物制药私人有限公司 多聚体Fc蛋白
CN106456728A (zh) 2014-03-14 2017-02-22 达纳－法伯癌症研究所公司 恢复对抗癌症的nkg2d通路功能的疫苗组合物和方法
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
PT3122781T (pt) 2014-03-28 2020-03-05 Xencor Inc Anticorpos biespecíficos que se ligam a cd38 e cd3
EP3137506B1 (en) 2014-05-02 2023-08-30 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods related to engineered fc constructs
JP6666267B2 (ja) 2014-05-29 2020-03-13 メディミューン，エルエルシー Ｏｘ４０ｌ融合タンパク質およびその使用
WO2016004113A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Biogen Ma Inc. Optimized factor ix gene
WO2016007873A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating craniosynostosis
WO2016011264A1 (en) * 2014-07-16 2016-01-21 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using tigit inhibitors and anti-cancer agents
BR112017008011A2 (pt) * 2014-10-20 2017-12-19 Scripps Research Inst métodos baseados em proximidade para seleção de parceiros de ligação
MA40835A (fr) 2014-10-23 2017-08-29 Biogen Ma Inc Anticorps anti-gpiib/iiia et leurs utilisations
MA40861A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Anticorps anti-glycoprotéines iib/iiia
JP6681396B2 (ja) 2014-11-17 2020-04-15 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｃｄ３ｘｃｄ２０二特異性抗体を用いて腫瘍を治療する方法
CN104403004B (zh) * 2014-11-24 2017-10-13 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗体‑干扰素异二聚体的制备和用途
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
AU2015353409B2 (en) 2014-11-26 2019-05-09 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
TN2017000222A1 (en) 2014-11-26 2018-10-19 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd38
EP3226891A1 (en) 2014-12-05 2017-10-11 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating seizure with recombinant alkaline phosphatase
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
EP3250227A2 (en) 2015-01-28 2017-12-06 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
EP4006051A1 (en) 2015-03-09 2022-06-01 Argenx BVBA Methods of reducing serum levels of fc-containing agents using fcrn antagonists
US10556952B2 (en) 2015-03-30 2020-02-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to Fc gamma receptors
FI3283524T3 (fi) 2015-04-17 2023-05-05 Amgen Res Munich Gmbh Bispesifisiä vasta-ainekonstrukteja cdh3:lle ja cd3:lle
EP3313871A1 (en) 2015-06-26 2018-05-02 Institute for Research in Biomedicine Proteins comprising a mutated lair-1 fragment and uses thereof
JP6937737B2 (ja) 2015-07-24 2021-09-22 グリックニック インコーポレイテッド 改良された補体結合を有する高次多量体化免疫グロブリンｆｃ組成物を作製するためのヒトタンパク質断片の融合タンパク質
TWI796283B (zh) * 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
CN108289928B (zh) 2015-08-06 2024-09-17 哈佛大学校长及研究员协会 改进的微生物-结合分子和其用途
SG10201913625XA (en) 2015-08-07 2020-03-30 Imaginab Inc Antigen binding constructs to target molecules
EP3337894A1 (en) 2015-08-17 2018-06-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of alkaline phosphatases
JP7002446B2 (ja) 2015-09-21 2022-03-04 アプティーボ リサーチ アンド デベロップメント エルエルシー Ｃｄ３結合ポリペプチド
WO2017058822A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Identifying effective dosage regimens for tissue non-specific alkaline phosphatase (tnsalp)-enzyme replacement therapy of hypophosphatasia
WO2017059878A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Humabs Biomed Sa Antibodies that potently neutralize hepatitis b virus and uses thereof
JP2018533571A (ja) 2015-10-30 2018-11-15 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 患者の頭蓋縫合早期癒合症を治療するための方法
KR20180083874A (ko) 2015-11-04 2018-07-23 사울 제이. 프라이스맨 Her2를 표적화하는 키메라 항원 수용체
US10513553B2 (en) 2015-11-13 2019-12-24 Visterra, Inc. Compositions and methods for treating and preventing influenza
KR20180085800A (ko) 2015-12-07 2018-07-27 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 psma에 결합하는 이종이합체성 항체
PL3411478T3 (pl) 2016-02-01 2022-10-03 Bioverativ Therapeutics Inc. Geny zoptymalizowanego czynnika VIII
AU2017216237B2 (en) * 2016-02-03 2024-04-04 Amgen Research (Munich) Gmbh PSMA and CD3 bispecific T cell engaging antibody constructs
CN109219617A (zh) 2016-02-03 2019-01-15 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 Bcma和cd3双特异性t细胞接合抗体构建体
WO2017147248A1 (en) 2016-02-24 2017-08-31 Visterra, Inc. Formulations of antibody molecules to influenza virus
US11065306B2 (en) 2016-03-08 2021-07-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in children
CN109312000A (zh) * 2016-03-30 2019-02-05 Ab生物科学有限公司 重组静脉内免疫球蛋白(rIVIG)组合物及其生产和使用方法
EP3436020A4 (en) 2016-04-01 2019-12-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHOD FOR TREATING HYPOPHOSPHATASIE IN TEENS AND ADULTS
WO2017173413A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating muscle weakness with alkaline phosphatases
US10723857B1 (en) * 2016-04-15 2020-07-28 United States Of America As Represented By The Administrator Of National Aeronautics And Space Administration Polyimide aerogels with reduced shrinkage from isothermal aging
KR101685532B1 (ko) * 2016-04-26 2016-12-13 한국프라임제약주식회사 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질
US11623964B2 (en) 2016-05-23 2023-04-11 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods related to engineered Fc constructs
US10988744B2 (en) 2016-06-06 2021-04-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of producing alkaline phosphatase
CA3026420A1 (en) 2016-06-07 2017-12-14 Gliknik Inc. Cysteine-optimized stradomers
HUE068801T2 (hu) 2016-06-14 2025-01-28 Xencor Inc Bispecifikus kontrollpont-gátló antitestek
EP4050032A1 (en) 2016-06-28 2022-08-31 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
WO2018005954A2 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Resolve Therapeutics, Llc Optimized binuclease fusions and methods
WO2018010789A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 Humabs Biomed Sa Novel antibodies specifically binding to zika virus epitopes and uses thereof
JP7018933B2 (ja) 2016-08-18 2022-02-14 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 気管気管支軟化症の治療方法
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CA3039930A1 (en) 2016-10-14 2018-04-19 Xencor, Inc. Bispecific heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ralpha fc-fusion proteins and pd-1 antibody fragments
PE20191354A1 (es) 2016-12-09 2019-10-01 Gliknik Inc Optimizacion de fabricacion de gl-2045, un stradomer multimerizante
WO2018112362A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Biogen Ma Inc. Stabilized proteolytically activated growth differentiation factor 11
CN110650748B (zh) 2017-01-06 2024-01-02 动量制药公司 与经工程改造的Fc构建体相关的组合物和方法
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
CA3053010A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
EP4273258A3 (en) 2017-02-20 2024-01-17 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding her2, nkg2d and cd16
CA3057502A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia (hpp) in adults and adolescents
UA129243C2 (uk) 2017-04-19 2025-02-26 Інстітьют Фо Рісьорч Ін Біомедцін Антитіло, що зв'язується зі спорозоїтами p. falciparum
JP2020521745A (ja) 2017-05-24 2020-07-27 エイエルエス・セラピー・デベロップメント・インスティテュートＡＬＳ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ 治療用抗ｃｄ４０リガンド抗体
JP2020529832A (ja) 2017-06-30 2020-10-15 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒαおよび抗原結合ドメインを含む標的化ヘテロダイマーＦｃ融合タンパク質
WO2019024979A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Institute For Research In Biomedicine FUNCTIONAL DOMAIN ANTIBODIES IN THE ELBOW REGION
AU2018313921B2 (en) 2017-08-09 2024-12-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof
CN111065649A (zh) * 2017-08-16 2020-04-24 蜻蜓疗法股份有限公司 结合nkg2d、cd16和egfr、hla-e、ccr4或pd-l1的蛋白质
MX2020002070A (es) 2017-08-22 2020-03-24 Sanabio Llc Receptores solubles de interferon y usos de los mismos.
WO2019042555A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Humabs Biomed Sa MULTISPECIFIC ANTIBODIES SPECIFICALLY BINDING TO ZIKA VIRUS EPITOPES AND USES THEREOF
US11364303B2 (en) 2017-09-29 2022-06-21 Pfizer Inc. Cysteine engineered antibody drug conjugates
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
WO2019094637A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
US12240875B2 (en) 2017-12-08 2025-03-04 argenx BV Use of FCRN antagonists for treatment of generalized myasthenia gravis
KR102722731B1 (ko) 2017-12-19 2024-10-25 젠코어 인코포레이티드 조작된 il-2 fc 융합 단백질
CN111448217A (zh) 2017-12-22 2020-07-24 阿根思公司 双特异性抗原结合构建体
CN111918674A (zh) 2018-02-01 2020-11-10 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 表达因子viii的慢病毒载体的用途
FI3749346T3 (fi) 2018-02-08 2024-09-04 Dragonfly Therapeutics Inc Nkg2d-reseptoriin kohdistuvat vasta-aineen vaihtelevan domeenin yhdistelmät
GB201802487D0 (en) 2018-02-15 2018-04-04 Argenx Bvba Cytokine combination therapy
KR20200132875A (ko) 2018-02-20 2020-11-25 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Cd33, nkg2d, 및 cd16에 결합하는 다중-특이적 결합 단백질, 및 이의 사용 방법
JP2021519590A (ja) 2018-03-30 2021-08-12 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 糖タンパク質の製造
CN112469477A (zh) 2018-04-04 2021-03-09 Xencor股份有限公司 与成纤维细胞活化蛋白结合的异源二聚体抗体
CN112437777A (zh) 2018-04-18 2021-03-02 Xencor股份有限公司 包含IL-15/IL-15RA Fc融合蛋白和TIM-3抗原结合结构域的靶向TIM-3的异源二聚体融合蛋白
CN112867734A (zh) 2018-04-18 2021-05-28 Xencor股份有限公司 包含IL-15/IL-15Ra Fc融合蛋白和PD-1抗原结合结构域的靶向PD-1的异源二聚体融合蛋白及其用途
WO2019236417A1 (en) 2018-06-04 2019-12-12 Biogen Ma Inc. Anti-vla-4 antibodies having reduced effector function
JP2021526026A (ja) 2018-06-08 2021-09-30 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 翻訳後修飾が低減したペプチドリンカー
CA3101462A1 (en) 2018-06-08 2019-12-12 Argenx Bvba Compositions and methods for treating immune thrombocytopenia
JP7602454B2 (ja) 2018-08-09 2024-12-18 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 核酸分子及び非ウイルス遺伝子治療のためのそれらの使用
MA53495A (fr) 2018-08-31 2021-12-08 Regeneron Pharma Stratégie de dosage permettant d'atténuer le syndrome de libération de cytokines pour des anticorps bispécifiques cd3/c20
BR112021004266A2 (pt) 2018-09-06 2021-08-03 Cidara Therapeutics, Inc. conjugados, população de conjugados, composição farmacêutica e métodos para o tratamento de um sujeito com uma infecção viral e para o tratamento profilático
US11358999B2 (en) 2018-10-03 2022-06-14 Xencor, Inc. IL-12 heterodimeric Fc-fusion proteins
TW202039855A (zh) 2018-12-06 2020-11-01 美商百歐維拉提夫治療公司 表現因子ｉｘ之慢病毒載體的用途
SG11202106483WA (en) 2018-12-19 2021-07-29 Humabs Biomed Sa Antibodies that neutralize hepatitis b virus and uses thereof
SG11202106489RA (en) 2018-12-20 2021-07-29 Vir Biotechnology Inc Combination hbv therapy
WO2020168298A2 (en) * 2019-02-15 2020-08-20 University Of Southern California Lym-1 and lym-2 antibody compositions and improved car constructs
MX2021010390A (es) 2019-03-01 2021-11-17 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen a enpp3 y cd3.
JP2022521819A (ja) 2019-03-25 2022-04-12 ビステラ， インコーポレイテッド インフルエンザを処置および予防するための組成物および方法
BR112021020668A2 (pt) 2019-04-17 2022-01-11 Codiak Biosciences Inc Composições de exossomos e aav
WO2020221451A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 Humabs Biomed Sa Antibodies binding to plasmodium circumsporozoite protein and uses thereof
PH12021552847A1 (en) 2019-06-07 2023-01-16 Argenx Bvba PHARMACEUTICAL FORMULATIONS OF FcRn INHIBITORS SUITABLE FOR SUBCUTANEOUS ADMINISTRATION
EP3757127A1 (en) 2019-06-28 2020-12-30 Institute for Research in Biomedicine Deimmunized antibodies binding to alpha-4 integrin and uses thereof
CA3147690A1 (en) * 2019-07-19 2021-01-28 WuXi Biologics Ireland Limited Polypeptide complex for conjugation and use thereof
JP2022545106A (ja) * 2019-08-22 2022-10-25 シダラ セラピューティクス インコーポレーテッド バリアントｆｃドメイン及びその使用
KR20220063188A (ko) 2019-08-29 2022-05-17 비르 바이오테크놀로지, 인코포레이티드 B형 간염 바이러스 감염을 치료하기 위한 항체 조성물 및 방법
TWI861205B (zh) 2019-09-06 2024-11-11 美商席達拉醫療有限公司 用於治療病毒感染之組合物及方法
JP2023500869A (ja) * 2019-11-06 2023-01-11 アムジェン リサーチ （ミュニック） ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 増殖性疾患での使用のための多重標的化抗原結合分子
MX2022007207A (es) 2019-12-11 2022-07-12 Visterra Inc Composiciones y metodos para tratar y prevenir la influenza.
WO2021140202A1 (en) 2020-01-08 2021-07-15 argenx BV Methods for treating pemphigus disorders
WO2021226193A1 (en) 2020-05-06 2021-11-11 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and clec12a
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
WO2021262840A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Vir Biotechnology, Inc. Engineered hepatitis b virus neutralizing antibodies and uses thereof
CA3183557A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods for the removal of free factor viii from preparations of lentiviral vectors modified to express said protein
BR112023008317A2 (pt) 2020-11-02 2024-02-06 Attralus Inc Proteínas de fusão sap fc e métodos de uso
EP4259654A1 (en) 2020-12-08 2023-10-18 Humabs Biomed SA Antibodies binding to f-protein of metapneumovirus and uses thereof
WO2022122788A1 (en) 2020-12-09 2022-06-16 Institute For Research In Biomedicine Multispecific antibodies against severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
WO2022161598A1 (en) 2021-01-26 2022-08-04 Eth Zurich Antibodies broadly targeting coronaviruses and uses thereof
WO2022162012A2 (en) 2021-01-26 2022-08-04 Eth Zurich Antibodies broadly targeting coronaviruses and uses thereof
US20240092872A1 (en) 2021-01-26 2024-03-21 Vir Biotechnology, Inc. Compositions and methods for treating hepatitis b virus infection
WO2022173987A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Alkaline phosphatase polypeptides and methods of use thereof
IL305736A (en) 2021-03-09 2023-11-01 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind CD3 and CLDN6
KR20230154994A (ko) 2021-03-10 2023-11-09 마빌론 아게 Tdp-43에 대한 항체 및 이의 용도
JP2024509274A (ja) 2021-03-10 2024-02-29 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｇｐｃ３に結合するヘテロ二量体抗体
JP2024535124A (ja) 2021-09-07 2024-09-26 インスティテュート・フォー・リサーチ・イン・バイオメディシン 破傷風毒素に結合する抗体およびその使用
US20240425597A1 (en) * 2021-09-16 2024-12-26 Gt Biopharma, Inc. Pd-l1 targeting fusion proteins and methods of use thereof
CN118556187A (zh) 2022-01-17 2024-08-27 阿根思有限公司 用于治疗患有自身抗体介导的疾病的患者的方法
KR20240151809A (ko) 2022-02-21 2024-10-18 아르젠엑스 비브이 Fcrn 길항제를 사용하여 근염을 치료하는 방법
WO2023213400A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Institute For Research In Biomedicine Antibodies against chemokines, method for identifying said antibodies and uses thereof
WO2023222214A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Mabylon Ag Anti-allergen antibodies and uses thereof
AU2023291783A1 (en) 2022-06-15 2024-12-12 argenx BV Fcrn binding molecules and methods of use
TW202428303A (zh) 2022-11-07 2024-07-16 比利時商阿根思公司 使用ｆｃｒｎ拮抗劑治療原發性膜性腎病變之方法
WO2024114906A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Mabylon Ag Antibodies against apoptosis-associated speck-like protein containing a card (asc) and uses thereof
WO2024121798A1 (en) 2022-12-08 2024-06-13 Csl Behring Llc Dissociable envelope binding proteins and uses thereof
TW202432178A (zh) 2023-01-06 2024-08-16 比利時商阿根思公司 使用ｆｃｒｎ拮抗劑治療ｐｏｔｓ之方法
WO2024150073A1 (en) 2023-01-12 2024-07-18 argenx BV Methods for treating primary sjogren's syndrome using fcrn antagonists
WO2024189430A1 (en) 2023-03-14 2024-09-19 argenx BV Methods for vaccination of a subject treated with an fcrn antagonist
WO2024251358A1 (en) 2023-06-07 2024-12-12 Mabylon Ag Anti-allergen antibodies and uses thereof
WO2025017368A1 (en) 2023-07-16 2025-01-23 argenx BV Methods of treating chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy
WO2025035176A1 (en) * 2023-08-14 2025-02-20 The Bionics Institute Of Australia A fusion protein

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989006692A1 (en) * 1988-01-12 1989-07-27 Genentech, Inc. Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function
US5681566A (en) * 1988-10-24 1997-10-28 3I Research Exploitation Limited Antibody conjugates with two or more covalently linked FC regions
GB9009106D0 (en) * 1990-04-23 1990-06-20 3I Res Expl Ltd Processes and intermediates for synthetic antibody derivatives
WO1993022332A2 (en) * 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5731168A (en) * 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
JP4271850B2 (ja) * 1998-01-23 2009-06-03 イミュネックス・コーポレーション Ｉｌ−１８受容体
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
PL206701B1 (pl) * 2001-03-07 2010-09-30 Merck Patent Gmbh Immunoglobulinowe białko fuzyjne, kodujący je kwas nukleinowy, replikujący wektor ekspresji zawierający taki kwas nukleinowy, eukariotyczna komórka gospodarza zawierająca taki wektor ekspresji oraz sposób zwiększania ekspresji takiego białka fuzyjnego
PL1718677T3 (pl) * 2003-12-19 2012-09-28 Genentech Inc Jednowartościowe fragmenty przeciwciała stosowane jako środki lecznicze
EP1697520A2 (en) * 2003-12-22 2006-09-06 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel fc ligand binding sites
US7833979B2 (en) * 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
US7666622B2 (en) * 2005-10-19 2010-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Monomeric self-associating fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
GB0614780D0 (en) * 2006-07-25 2006-09-06 Ucb Sa Biological products
US20080260738A1 (en) * 2007-04-18 2008-10-23 Moore Margaret D Single chain fc, methods of making and methods of treatment

Cited By (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9994646B2 (en) 2009-09-16 2018-06-12 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
CN103842380A (zh) * 2011-07-27 2014-06-04 葛兰素集团有限公司 融合至Fc结构域的抗VEGF单可变结构域
CN103857700A (zh) * 2011-08-26 2014-06-11 梅里麦克制药股份有限公司 串联fc双特异性抗体
CN104105711B (zh) * 2012-02-10 2018-11-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单链抗体及其他异多聚体
CN104105711A (zh) * 2012-02-10 2014-10-15 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单链抗体及其他异多聚体
CN109096398A (zh) * 2012-08-22 2018-12-28 瑞泽恩制药公司 GFRα3的人抗体及其使用方法
CN104870055A (zh) * 2012-10-17 2015-08-26 利物浦热带医学院 免疫调节蛋白
CN110894231A (zh) * 2012-10-17 2020-03-20 康诺贝林伦瑙有限公司 免疫调节蛋白
CN105051069A (zh) * 2013-01-14 2015-11-11 Xencor股份有限公司 新型异二聚体蛋白
CN105051069B (zh) * 2013-01-14 2019-12-10 Xencor股份有限公司 新型异二聚体蛋白
CN107172880A (zh) * 2014-03-24 2017-09-15 癌症研究技术有限公司 含有修饰IgG2结构域的引起激动或拮抗特性的修饰抗体及其用途
US10633457B2 (en) 2014-12-03 2020-04-28 Hoffmann-La Roche Inc. Multispecific antibodies
US11999801B2 (en) 2014-12-03 2024-06-04 Hoffman-La Roche Inc. Multispecific antibodies
CN107428830B (zh) * 2015-01-05 2021-12-14 依奈特制药公司 单体fc结构域
CN107428830A (zh) * 2015-01-05 2017-12-01 依奈特制药公司 单体fc结构域
CN114195895A (zh) * 2015-02-03 2022-03-18 Als治疗发展学会 抗cd40l抗体和用于治疗cd40l相关疾病或病症的方法
CN107835693A (zh) * 2015-06-12 2018-03-23 联亚药业股份有限公司 免疫球蛋白融合蛋白及其用途
TWI746491B (zh) * 2015-12-03 2021-11-21 財團法人國家衛生研究院 異質雙聚體型血管內皮生長因子及其應用
TWI754628B (zh) * 2016-02-03 2022-02-11 德商安美基研究（慕尼黑）公司 雙特異性t細胞嚙合抗體構築體
CN106191072A (zh) * 2016-08-04 2016-12-07 沈沭彤 重组人源嵌合GcFc基因片段及融合蛋白
CN111182915A (zh) * 2017-08-15 2020-05-19 金德雷德生物科学股份有限公司 兽药用IgG Fc变体
CN113234168A (zh) * 2021-06-04 2021-08-10 浙江大学 一种融合蛋白、基因及应用
CN113406320A (zh) * 2021-08-18 2021-09-17 南京立顶医疗科技有限公司 基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法及应用
CN113406320B (zh) * 2021-08-18 2021-11-02 南京立顶医疗科技有限公司 基于重组基因工程抗体和微球的定向偶联方法及应用

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