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BR112021004266A2 - conjugados, população de conjugados, composição farmacêutica e métodos para o tratamento de um sujeito com uma infecção viral e para o tratamento profilático - Google Patents

conjugados, população de conjugados, composição farmacêutica e métodos para o tratamento de um sujeito com uma infecção viral e para o tratamento profilático Download PDF

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BR112021004266A2
BR112021004266A2 BR112021004266-0A BR112021004266A BR112021004266A2 BR 112021004266 A2 BR112021004266 A2 BR 112021004266A2 BR 112021004266 A BR112021004266 A BR 112021004266A BR 112021004266 A2 BR112021004266 A2 BR 112021004266A2
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BR
Brazil
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conjugate
pharmaceutically acceptable
acceptable salt
optionally substituted
formula
Prior art date
Application number
BR112021004266-0A
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English (en)
Inventor
James M. Balkovec
Thanh Lam
Alain Noncovich
Leslie W. Tari
Daniel C. BENSEN
Allen Borchardt
Thomas P. Brady
Zhi-Yong CHEN
Jason Cole
Quyen-Quyen Thuy Do
Simon DOEHRMANN
Wanlong Jiang
Original Assignee
Cidara Therapeutics, Inc.
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Publication date
Application filed by Cidara Therapeutics, Inc. filed Critical Cidara Therapeutics, Inc.
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Abstract

conjugados, população de conjugados, composição farmacêutica e métodos para o tratamento de um sujeito com uma infecção viral e para o tratamento profilático. composições e métodos para o tratamento de infecções virais incluem conjugados contendo inibidores da neuraminidase viral (por exemplo, zanamivir, peramivir ou análogos dos mesmos) ligados a um monômero fc, um domínio fc e um peptídeo de ligação a fc, uma proteína de albumina ou peptídeo de ligação à albumina. em particular, os conjugados podem ser usados no tratamento de infecções virais (por exemplo, infecções virais de influenza).

Description

“CONJUGADOS, POPULAÇÃO DE CONJUGADOS, COMPOSIÇÃO
FARMACÊUTICA E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE UM SUJEITO COM UMA INFECÇÃO VIRAL E PARA O TRATAMENTO PROFILÁTICO” Fundamentos
[001] A necessidade de novos tratamentos antivirais para influenza é significativa e especialmente crítica no campo médico. O vírus da influenza, o agente causador da influenza, ou gripe, é responsável por três a cinco milhões de casos de doenças graves anualmente e aproximadamente
500.000 mortes em todo o mundo. Enquanto a maioria das pessoas se recupera completamente da influenza em cerca de uma a duas semanas, outras desenvolvem complicações com risco de vida, como a pneumonia. Portanto, a influenza pode ser mortal, especialmente para os jovens, idosos ou doentes crônicos. Pessoas com sistema imunológico fraco ou comprometido, como pessoas com infecção avançada por HIV ou pacientes transplantados, cujo sistema imunológico está clinicamente suprimido para evitar a rejeição de órgãos transplantados, correm maior risco de complicações relacionadas à influenza.
Mulheres grávidas e crianças pequenas também apresentam alto risco de complicações.
[002] O desenvolvimento de tratamentos antivirais para influenza tem sido um desafio contínuo. Vários agentes antivirais para influenza foram aprovados para uso na clínica e esses agentes desempenham papéis importantes na modulação da gravidade da doença e no controle de pandemias enquanto as vacinas são preparadas. No entanto, surgiram cepas resistentes à drogas para os inibidores mais comumente usados.
[003] Os agentes antivirais da influenza visam amplamente as proteínas apresentadas na superfície da partícula do vírus da influenza. O envelope do vírus influenza contém duas glicoproteínas imunodominantes, hemaglutinina e neuraminidase, que desempenham papéis importantes na infecção e disseminação viral. A hemaglutinina afeta a fixação do vírus à célula hospedeira por meio de sua interação com os ácidos siálicos de superfície, iniciando assim a entrada. A neuraminidase é uma enzima exo-glicosidase que cliva ácidos siálicos (resíduos de ácido neuramínico terminal) das estruturas de glicano na superfície das células hospedeiras infectadas, liberando a progênie de vírus e permitindo a disseminação do vírus da célula hospedeira para as células vizinhas não infectadas. A inibição da neuraminidase , portanto, serve como um alvo farmacológico para drogas antivirais. Foram identificados inibidores da neuraminidase viral usados para reduzir a disseminação viral, incluindo oseltamivir (TamifluTM), zanamivir (RelenzaTM), e peramivir (RapivabTM).
[004] No entanto, a influenza em receptores de transplantes permanece caracterizada por disseminação viral prolongada, aumentando a probabilidade de desenvolvimento de cepas resistentes à droga. São necessárias novas terapias mais eficazes para o tratamento da influenza.
Sumário
[005] A divulgação se refere a conjugados, composições e métodos para inibir o crescimento viral e métodos para o tratamento de infecções virais. Em particular, tais conjugados contêm monômeros ou dímeros de uma porção que inibe a neuraminidase do vírus influenza (por exemplo, zanamivir, peramivir ou análogos dos mesmos) conjugados com monômeros Fc, domínios Fc, peptídeos de ligação a Fc, proteínas de albumina ou peptídeos de ligação de proteína de albumina. O inibidor da neuraminidase (por exemplo, zanamivir, peramivir ou análogos dos mesmos) nos conjugados direciona a neuraminidase na superfície da partícula viral. Os monômeros Fc ou domínios Fc nos conjugados se ligam a FcγRs (por exemplo, FcRn, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa e FcγRIIIb) em células imunes, por exemplo, neutrófilos, para ativar a fagocitose e funções efetoras, como células dependentes de anticorpos citotoxicidade mediada (ADCC), levando assim ao engolfamento e destruição de partículas virais por células imunes e intensificando ainda mais a atividade antiviral dos conjugados. A albumina ou o peptídeo de ligação à albumina pode estender a meia-vida do conjugado, por exemplo, pela ligação da albumina ao receptor Fc neonatal de reciclagem. Essas composições são úteis em métodos para a inibição do crescimento viral e em métodos para o tratamento de infecções virais, tais como aquelas causadas por um vírus influenza A, vírus influenza B e vírus influenza C.
[006] Em um aspecto, a divulgação apresenta um conjugado descrito pela fórmula (1): (1) em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII):
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são cada um independentemente selecionado de -H, -
OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; Xé selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , , , , , , , , , , e ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; cada E compreende um monômero de domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68); L em cada A1-L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em cada E e a cada um de A1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), e as duas linhas onduladas conectadas aos dois Es indicam que cada A1-L-A2 está covalentemente ligada (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) a um par de átomos de enxofre de duas cisteínas de dobradiça nos dois Es, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A1-L-A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A 1-L-A2 aqui descritas).
[007] Em outro aspecto, a divulgação apresenta um conjugado descrito pela fórmula (1):
(1)
em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V):
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são cada um independentemente selecionado de -H, -
OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; Xé selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; cada E compreende um monômero de domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68); L em cada A1-L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em cada E e a cada um de A1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20
(por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20),
e as duas linhas onduladas conectadas aos dois Es indicam que cada A 1-L-A2 está covalentemente ligada (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) a um par de átomos de enxofre de duas cisteínas de dobradiça nos dois Es, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A1-L-A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A 1-L-A2 aqui descritas).
[008] Em outro aspecto, a divulgação apresenta um conjugado descrito pela fórmula (1): (1) em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX): , , , ; (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são cada um independentemente selecionado de -H, - OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; Xé selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; cada E compreende um monômero de domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68); L em cada A1-L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em cada E e a cada um de A1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), e as duas linhas onduladas conectadas aos dois Es indicam que cada A 1-L-A2 está covalentemente ligada (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) a um par de átomos de enxofre de duas cisteínas de dobradiça nos dois Es, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A1-L-A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A1-L-A2 aqui descritas).
[009] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (2): (2) em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII): , , , , , (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-
V) , , , , (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) , , ; (A-X) (A-XI) (A-XII)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
cada E compreende um monômero de domínio Fc (por exemplo,
um monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID
NOs: 1-68); L em cada L-A1 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre em uma cisteína de dobradiça em E e para A1; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), e as duas linhas onduladas conectadas aos dois átomos de enxofre indicam que cada L-A1 é covalentemente (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) ligado a um par de átomos de enxofre de duas cisteínas de dobradiça nos dois Es, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) , cada A1 pode ser selecionado independentemente a partir de qualquer uma das fórmulas (A-I) - (A-XII).
[0010] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (2): (2) em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): , , , , ; (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V) em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; cada E compreende um monômero de domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68); L em cada L-A1 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre em uma cisteína de dobradiça em E e para A1; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), e as duas linhas onduladas conectadas aos dois átomos de enxofre indicam que cada L-A1 é covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) a um par de átomos de enxofre de duas cisteínas de dobradiça nos dois Es, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) , cada A 1 pode ser selecionado independentemente a partir de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V).
[0011] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (2): (2) em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX):
, , , ; (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
cada E compreende um monômero de domínio Fc (por exemplo,
um monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID
NOs: 1-68); L em cada L-A1 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre em uma cisteína de dobradiça em E e para A1; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), e as duas linhas onduladas conectadas aos dois átomos de enxofre indicam que cada L-A1 é covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) a um par de átomos de enxofre de duas cisteínas de dobradiça nos dois Es, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) , cada A 1 pode ser selecionado independentemente a partir de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX).
[0012] Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades anteriores, cada E inclui um monômero de domínio Fc com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68.
[0013] Em algumas modalidades, cada E compreende a sequência MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS
RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH (SEQ ID NO: 10).
[0014] Em algumas modalidades, cada E compreende a sequência MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS
RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11).
[0015] Em algumas modalidades, pelo menos um do par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) uma cisteína de dobradiça de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11, ou seja, Cys10, Cys13, Cys16, ou Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre são os átomos de enxofre correspondentes a (por exemplo, os átomos de enxofre de) Cys10 e Cys13 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11, Cys10 e Cys16 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11, Cys 30 e Cys18 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11, Cys13 e Cys 36 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11, Cys13 e Cys 38 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 e / ou Cys 36 e Cys 38 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:
11.
[0016] Em algumas modalidades, quando T é 2, o par de átomos de enxofre são (por exemplo, os átomos de enxofre correspondentes a) Cys10 e Cys13 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 ou Cys 36 e Cys 38 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11.
[0017] Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre inclui um átomo de enxofre de uma cisteína de cada E, ou seja, L-A, juntamente com os átomos de enxofre aos quais está ligado, forma uma ponte entre dois domínios Fc (por exemplo, dois domínios Fc compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondendo a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E.
[0018] Em algumas modalidades, quando T é 2, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E. Em algumas modalidades, quando T é 2, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondendo a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondendo a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o enxofre átomo de) Cys16 de SEQ I D NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E. Em algumas modalidades, quando T é 2, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E.
[0019] Em algumas modalidades, quando T é 2, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E. Em algumas modalidades, quando T é 2, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o enxofre átomo de) Cys18 de SEQ I D NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E.
[0020] Em algumas modalidades, quando T é 2, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E.
[0021] Em algumas modalidades, quando T é 3, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ
ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E.
Em algumas modalidades, quando T é
3, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO : 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ
ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a
(por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:
11 de outro E; e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ
ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E.
Em algumas modalidades, quando T é
3, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO : 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; o átomo de enxofre correspondendo a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ
ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondendo a
(por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:
11 de outro E; e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ
ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E.
Em algumas modalidades, quando T é
3, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO : 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; o átomo de enxofre correspondendo a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ
ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondete a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E.
[0022] Em algumas modalidades, quando T é 3, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondendo a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E.
[0023] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura:
em que cada um de a, b, c e d é, independentemente, 0 ou 1 e em que quando a, b, c ou d é 0, os dois átomos de enxofre formam uma ligação dissulfeto.
[0024] Em algumas modalidades, a é 1 e b, c e d são 0. Em algumas modalidades, a e b são 1 e c e d são 0. Em algumas modalidades, a e c são 1 e b e d são 0. Em algumas modalidades, a e d são 1 e b e c são 0. Em algumas modalidades, a, b e c são 1 e d é 0. Em algumas modalidades, a, b e d são 1 e c é 0. Em algumas modalidades, a, c e d são 1 e b é 0. Em algumas modalidades, b e c são 1 e a e d são 0. Em algumas modalidades, b e d são 1 e a e c são 0. Em algumas modalidades, b, c e d são 1 e a é 0. Em algumas modalidades, c e d são 1 e a e b são 0. Em algumas modalidades, a, b, c e d são
1.
[0025] Em algumas modalidades, cada E compreende a sequência
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV
SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4).
[0026] Em algumas modalidades, cada E compreende a sequência
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV
SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 33).
[0027] Em algumas modalidades, pelo menos um do par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) uma cisteína de dobradiça de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33, ou seja, Cys10 e / ou Cys13. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre são os átomos de enxofre correspondentes a (por exemplo, os átomos de enxofre de) Cys10 e Cys13 na SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33.
[0028] Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre inclui um átomo de enxofre de uma cisteína de cada E, ou seja, L-A, juntamente com os átomos de enxofre aos quais está ligado, forma uma ponte entre dois domínios Fc (por exemplo, dois domínios Fc compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33). Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o enxofre átomo de) Cys10 da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de outro E. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de outro E. Em algumas modalidades, quando T é 2, o pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de outro E.
[0029] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura:
em que cada um de a e b é, independentemente, 0 ou 1 e em que quando a ou b é 0, os dois átomos de enxofre formam uma ligação dissulfeto.
Em algumas modalidades, a é 1 e b é 0. Em algumas modalidades, a é 0 e b é
1. Em algumas modalidades, a e b são 1.
[0030] Em algumas modalidades, cada E compreende a sequência
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV
SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH (SEQ ID NO: 8).
[0031] Em algumas modalidades, pelo menos um do par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) uma cisteína de dobradiça de SEQ ID NO: 8, ou seja, Cys10 e / ou Cys13. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre são os átomos de enxofre correspondentes a (por exemplo, os átomos de enxofre de) Cys10 e Cys13 na SEQ ID NO: 8.
[0032] Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre inclui um átomo de enxofre de uma cisteína de cada E, ou seja, L-A, juntamente com os átomos de enxofre aos quais está ligado, forma uma ponte entre dois domínios Fc (por exemplo, dois domínios Fc compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 8 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o enxofre átomo de) Cys10 da SEQ ID NO: 8 de outro E. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 8 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 de SEQ ID NO: 8 de outro E. Em algumas modalidades, quando T é 2, o pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 8 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 8 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 de SEQ ID NO: 8 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 8 de outro E.
[0033] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura: em que cada um de a e b é, independentemente, 0 ou 1 e em que quando a ou b é 0, os dois átomos de enxofre formam uma ligação dissulfeto.
Em algumas modalidades, a é 1 e b é 0. Em algumas modalidades, a é 0 e b é
1. Em algumas modalidades, a e b são 1.
[0034] Em outro aspecto, a invenção também apresenta uma população de conjugados descritos em qualquer um dos aspectos anteriores, em que o valor médio de T é de 1 a 20 (por exemplo, o valor médio de T é de 1 a 2, 1 a 3, 1 a 4, 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15 ou 15 a 20). Em algumas modalidades, o valor médio de T é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 .
[0035] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (3):
(3)
em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-VII):
, , , ,
, (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V) , , , , (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) , , ; (A-X) (A-XI) (A-XII)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc tendo, independentemente, a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68); L em cada A1-L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em E e a cada um de A1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ), e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A 1-L-A2 é covalentemente (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A 1-L-A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A1-L-A2 aqui descritas).
[0036] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (3): (3)
em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V):
, , , ,
; (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc tendo, independentemente, a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68); L em cada A1-L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em E e a cada um de A1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A1-L-A2 está covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A 1-L- A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A1-L-A2 aqui descritas).
[0037] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (3): (3) em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX): , , , ; (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de - H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc tendo, independentemente, a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68); L em cada A1-L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em E e a cada um de A1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A 1-L-A2 está covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A1-L- A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A1-L-A2 aqui descritas).
[0038] Em algumas modalidades, cada E inclui um monômero de domínio Fc com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68.
[0039] Em algumas modalidades, cada E compreende a sequência MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS
RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH (SEQ ID NO: 10).
[0040] Em algumas modalidades, cada E compreende a sequência MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS
RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11).
[0041] Em algumas modalidades, pelo menos um do par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) uma cisteína de dobradiça de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11, ou seja, Cys10, Cys13, Cys16, ou Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre são os átomos de enxofre correspondentes a (por exemplo, os átomos de enxofre de) Cys10 e Cys13 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11, Cys10 e Cys16 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11, Cys 30 e Cys18 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11, Cys13 e Cys 36 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11, Cys13 e Cys 38 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 e / ou Cys 36 e Cys 38 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO:
11.
[0042] Em algumas modalidades, quando T é 2, o par de átomos de enxofre são os átomos de enxofre correspondentes a (por exemplo, os átomos de enxofre de) Cys10 e Cys13 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 e Cys 36 e Cys 38 em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11.
[0043] Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre inclui um átomo de enxofre de uma cisteína de cada E, ou seja, L-A, juntamente com os átomos de enxofre aos quais está ligado, forma uma ponte entre dois domínios Fc (por exemplo, dois domínios Fc compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondendo a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E.
[0044] Em algumas modalidades, quando T é 2, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E. Em algumas modalidades, quando T é 2, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondendo a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondendo a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o enxofre átomo de) Cys16 de SEQ I D NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E. Em algumas modalidades, quando T é 2, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ
ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E.
[0045] Em algumas modalidades, quando T é 2, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E. Em algumas modalidades, quando T é 2, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o enxofre átomo de) Cys18 de SEQ I D NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E.
[0046] Em algumas modalidades, quando T é 2, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO:
10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E.
[0047] Em algumas modalidades, quando T é 3, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E. Em algumas modalidades, quando T é 3, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO : 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E. Em algumas modalidades, quando T é 3, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO : 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; o átomo de enxofre correspondendo a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondendo a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E. Em algumas modalidades, quando T é 3, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO : 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; o átomo de enxofre correspondendo a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondete a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E.
[0048] Em algumas modalidades, quando T é 3, os pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondendo a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys16 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E; e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 de outro E.
[0049] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura: em que cada um de a, b, c e d é, independentemente, 0 ou 1 e em que quando a, b, c ou d é 0, os dois átomos de enxofre formam uma ligação dissulfeto.
[0050] Em algumas modalidades, a é 1 e b, c e d são 0. Em algumas modalidades, a e b são 1 e c e d são 0. Em algumas modalidades, a e c são 1 e b e d são 0. Em algumas modalidades, a e d são 1 e b e c são 0. Em algumas modalidades, a, b e c são 1 e d é 0. Em algumas modalidades, a, b e d são 1 e c é 0. Em algumas modalidades, a, c e d são 1 e b é 0. Em algumas modalidades, b e c são 1 e a e d são 0. Em algumas modalidades, b e d são 1 e a e c são 0. Em algumas modalidades, b, c e d são 1 e a é 0. Em algumas modalidades, c e d são 1 e a e b são 0. Em algumas modalidades, a, b, c e d são
1.
[0051] Em algumas modalidades, cada E compreende a sequência
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV
SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4).
[0052] Em algumas modalidades, cada E compreende a sequência
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV
SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 33).
[0053] Em algumas modalidades, pelo menos um do par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) uma cisteína de dobradiça de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33, ou seja, Cys10 e / ou Cys13. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre são os átomos de enxofre correspondentes a (por exemplo, os átomos de enxofre de) Cys10 e Cys13 na SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33.
[0054] Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre inclui um átomo de enxofre de uma cisteína de cada E, ou seja, L-A, juntamente com os átomos de enxofre aos quais está ligado, forma uma ponte entre dois domínios Fc (por exemplo, dois domínios Fc compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33). Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o enxofre átomo de) Cys10 da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de outro E. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de outro E. Em algumas modalidades, quando T é 2, o pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33 de outro E.
[0055] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura: em que cada um de a e b é, independentemente, 0 ou 1 e em que quando a ou b é 0, os dois átomos de enxofre formam uma ligação dissulfeto.
Em algumas modalidades, a é 1 e b é 0. Em algumas modalidades, a é 0 e b é
1. Em algumas modalidades, a e b são 1.
[0056] Em algumas modalidades, cada E compreende a sequência
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV
SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH (SEQ ID NO: 8).
[0057] Em algumas modalidades, pelo menos um do par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) uma cisteína de dobradiça de SEQ ID NO: 8, ou seja, Cys10 e / ou Cys13. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre são os átomos de enxofre correspondentes a (por exemplo, os átomos de enxofre de) Cys10 e Cys13 na SEQ ID NO: 8.
[0058] Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre inclui um átomo de enxofre de uma cisteína de cada E, ou seja, L-A, juntamente com os átomos de enxofre aos quais está ligado, forma uma ponte entre dois domínios Fc (por exemplo, dois domínios Fc compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 da SEQ ID NO: 8 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o enxofre átomo de) Cys10 da SEQ ID NO: 8 de outro E. Em algumas modalidades, o par de átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 8 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 de SEQ ID NO: 8 de outro E. Em algumas modalidades, quando T é 2, o pares de átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 8 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 de SEQ ID NO: 8 de outro E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 de SEQ ID NO: 8 de um E e o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys13 da SEQ ID NO: 8 de outro E.
[0059] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura:
em que cada um de a e b é, independentemente, 0 ou 1 e em que quando a ou b é 0, os dois átomos de enxofre formam uma ligação dissulfeto.
Em algumas modalidades, a é 1 e b é 0. Em algumas modalidades, a é 0 e b é
1. Em algumas modalidades, a e b são 1.
[0060] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (4): (4) em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII): , , , , , (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V)
, , , , (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) , , ; (A-X) (A-XI) (A-XII)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc tendo, independentemente, a sequência de qualquer uma das SEQ
ID NOs: 1-68); L em cada L-A1 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em E e a A1; T é um número inteiro de
1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
ou 20); e a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A1 está covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) ao átomo de enxofre da cisteína de dobradiça em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) , cada A 1 pode ser selecionado independentemente a partir de qualquer uma das fórmulas (A-I) - (A-XII).
[0061] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (4): (4) em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): , , , , ; (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V) em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de - H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , , , , , , , , ,e ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc tendo, independentemente, a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68); L em cada L-A1 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em E e a A1; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20); e a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A1 está covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) ao átomo de enxofre da cisteína de dobradiça em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) , cada A 1 pode ser selecionado independentemente a partir de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V).
[0062] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (4): (4)
em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX):
, , , ; (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc tendo, independentemente, a sequência de qualquer uma das SEQ
ID NOs: 1-68); L em cada L-A1 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em E e a A1; T é um número inteiro de
1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
ou 20); e a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A1 está covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) ao átomo de enxofre da cisteína de dobradiça em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) , cada A1 pode ser selecionado independentemente a partir de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX).
[0063] Em algumas modalidades, cada E inclui um monômero de domínio Fc com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68.
[0064] Em algumas modalidades, cada E compreende a sequência
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV
SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4).
[0065] Em algumas modalidades, cada E compreende a sequência
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV
SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 33).
[0066] Em algumas modalidades, pelo menos um dos átomos de enxofre é o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) uma cisteína de dobradiça de SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33, ou seja, Cys10 e / ou Cys13. Em algumas modalidades, os átomos de enxofre são o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 na SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, o átomo de enxofre correspondente a (por exemplo, o átomo de enxofre de) Cys10 na SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 33.
[0067] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura:
em que cada um de a e b é, independentemente, 0 ou 1 e em que quando a ou b é 0, os átomos de enxofre são um tiol. Em algumas modalidades, a é 1 e b é 0. Em algumas modalidades, a é 0 e b é 1. Em algumas modalidades, a e b são 1.
[0068] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma população de conjugados, em que o valor médio de T é de 1 a 20 (por exemplo, o valor médio de T é de 1 a 2, 1 a 3, 1 a 4, 1 a 5, 5 a 10 , 10 a 15 ou 15 a 20). Em algumas modalidades, o valor médio de T é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 .
[0069] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (3): (3) em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII): , , , ,
, (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V) , , , , (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) , , ; (A-X) (A-XI) (A-XII)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc tendo, independentemente, a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68); L em cada A1-L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a cada um de A1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ), e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A1-L-A2 está covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A 1-L- A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A1-L-A2 aqui descritas).
[0070] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (3): (3) em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): , , , ,
; (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc tendo, independentemente, a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68); L em cada A1-L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a cada um de A1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ), e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A 1-L-A2 está covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A1-L- A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A1-L-A2 aqui descritas).
[0071] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (3): (3) em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX): , , , ; (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de - H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc tendo, independentemente, a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68); L em cada A1-L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a cada um de A1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ), e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A 1-L-A2 está covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A 1-L- A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A1-L-A2 aqui descritas).
[0072] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (4): (4) em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII): , , , , , (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V)
, , , , (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) , , ; (A-X) (A-XI) (A-XII)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc tendo, independentemente, a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68); L em cada L-A1 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a A1; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ), a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A1 está covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) , cada A pode ser selecionado independentemente a partir de qualquer uma das fórmulas (A-I) - (A-XII).
[0073] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (4): (4) em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): , , , , ; (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V) em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de - H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc tendo, independentemente, a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68); L em cada L-A1 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a A1; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ), a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A1 está covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) , cada A 1 pode ser selecionado independentemente a partir de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V).
[0074] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (4): (4) em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX):
, , , ; (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc tendo, independentemente, a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68); L em cada L-A1 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a A; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ), a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A1 está covalentemente ligado (por exemplo,
por meio de uma ligação covalente ou um ligante) ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A 1 pode ser selecionado independentemente a partir de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX).
[0075] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (5): (5) em que cada Int é independentemente selecionado de qualquer um dos intermediários da Tabela 1; E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc tendo, independentemente, a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68); L em cada L-Int é um ligante covalentemente ligado a um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e em Int; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), a linha ondulada conectada a E indica que cada L-Int está covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação covalente ou um ligante) ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície ou ao átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) , cada Int pode ser independentemente selecionado de qualquer um dos intermediários da Tabela 1.
[0076] Os intermediários da Tabela 1 podem ser conjugados a um domínio Fc ou monômero de domínio Fc (por exemplo, por meio de um ligante) por quaisquer métodos adequados conhecidos pelos versados na técnica, incluindo qualquer um dos métodos descritos ou exemplificados neste documento. Em algumas modalidades, o conjugado (por exemplo, um conjugado descrito pela fórmula (5)) compreende E, em que E é um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc ou um domínio
Fc, cada monômero de domínio Fc tendo, independentemente, a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68). Em modalidades preferidas, um ou mais átomos de nitrogênio de um ou mais resíduos de lisina expostos à superfície de E ou um ou mais átomos de enxofre de uma ou mais cisteínas expostas à superfície em E são covalentemente conjugados a um ligante (por exemplo, um ligante PEG2-PEG20 ). O ligante conjugado a E pode ser funcionalizado de modo que possa reagir para formar uma ligação covalente com qualquer um dos Ints aqui descritos (por exemplo, um Int da Tabela 1). Em modalidades preferidas, E é conjugado a um ligante funcionalizado com um grupo azido e o Int (por exemplo, um Int da Tabela 1) é funcionalizado com um grupo alquino. A conjugação (por exemplo, por química de clique) do ligante-azido de E e ligante- alquino do Int forma um conjugado da invenção, por exemplo, um conjugado descrito pela fórmula (5). Em ainda outras modalidades, E é conjugado a um ligante funcionalizado com um grupo alquino e o Int (por exemplo, um Int da Tabela 1) é funcionalizado com um grupo azido. A conjugação (por exemplo, por química de clique) do ligante-alquino de E e ligante-azido do Int forma um conjugado da invenção, por exemplo, um conjugado descrito pela fórmula (5).
Tabela 1: Intermediários Intermediário Estrutura Int-1 Int-2
Int-3
Int-4
Int-5
Int-6
Int-7
Int-9
Int-12
Int-13
Int-14
Int-15
Int-16
Int-17
Int-18
Int-19
Int-20
Int-21
Int-22
Int-23
Int-24
Int-25
Int-26
Int-27
Int-28
Int-30
Int-31
Int-34
Int-38
Int-39
Int-40
Int-42
Int-43
Int-44
Int-45
Int-46
Int-47
Int-48
Int-49
Int-50
Int-52
Int-53
Int-54
Int-55
Int-57
Int-58
Int-59
Int-60
Int-61
Int-62
Int-63
Int-64
Int-65
Int-67
Int-68
Int-69
Int-70
Int-71
Int-72
Int-73
Int-74
Int-75
Int-76
Int-77
Int-78
Int-79
Sal TFA
Int-80
Int-81
Int-82
Int-83
Int-84
Int-85
Int-86
Int-87
Int-88
Int-89
Int-90
[0077] Em algumas modalidades, cada E inclui um monômero de domínio Fc com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68.
[0078] Em algumas modalidades, E inclui a sequência
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV
SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4).
[0079] Em algumas modalidades, cada E inclui a sequência
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV
SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 33).
[0080] Em algumas modalidades, E inclui a sequência MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS
RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH (SEQ ID NO: 10).
[0081] Em algumas modalidades, cada E compreende a sequência MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS
RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11).
[0082] Em algumas modalidades dos três aspectos anteriores, o átomo de nitrogênio é o nitrogênio de uma lisina exposta à superfície, por exemplo, o átomo de nitrogênio correspondente a (por exemplo, o átomo de nitrogênio de) Lys35, Lys63, Lys77, Lys79, Lys106, Lys123, Lys129, Lys181, Lys203, Lys228 ou Lys236 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, o átomo de nitrogênio é o átomo de nitrogênio correspondente a (por exemplo, o átomo de nitrogênio de) Lys65, Lys79, Lys108, Lys230 e / ou Lys238 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11.
[0083] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura: em que cada um de a, b, c, d e e é, independentemente, 0 ou 1 e em que quando a, b, c, d ou e é 0, os dois átomos de nitrogênio são NH2. Em algumas modalidades, a é 1 e b, c, d e e são 0. Em algumas modalidades, b é 1 e a, c, d e e são 0. Em algumas modalidades, c é 1 e a, b, d e e são 0. Em algumas modalidades, d é 1 e a, b, c e e são 0. Em algumas modalidades, e é 1 e a, b, c e d são 0. Em algumas modalidades, a e b são 1 e c, d e e são 0. Em algumas modalidades, a e c são 1 e b, d e e são 0. Em algumas modalidades, a e d são 1 e b, c e e são 0. Em algumas modalidades, a e e são 1 e b, c e d são
0. Em algumas modalidades, b e c são 1 e a, d e e são 0. Em algumas modalidades, b e d são 1 e a, c e e são 0. Em algumas modalidades, b e e são 1 e a, c e d são 0. Em algumas modalidades, c e d são 1 e a, b e e são 0. Em algumas modalidades, c e e são 1 e a, b e d são 0. Em algumas modalidades, d e e são 1 e a, b e c são 0. Em algumas modalidades, a, b e c são 1 e d e e são
0. Em algumas modalidades, a, b e d são 1 e c e e são 0. Em algumas modalidades, a, b e e são 1 e c e d são 0. Em algumas modalidades, a, c e d são 1 e b e e são 0. Em algumas modalidades, a, c e e são 1 e b e d são 0. Em algumas modalidades, a, d e e são 1 e b e c são 0. Em algumas modalidades, b, c e d são 1 e a e e são 0. Em algumas modalidades, b, d e e são 1 e a e c são
0. Em algumas modalidades, c, d e e são 1 e a e b são 0.
[0084] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma população de conjugados descritos em qualquer um dos aspectos anteriores, em que o valor médio de T é de 1 a 20 (por exemplo, o valor médio de T é de 1 a 2, 1 a 3, 1 a 4, 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15 ou 15 a 20). Em algumas modalidades, o valor médio de T é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 .
[0085] Em algumas modalidades dos conjugados aqui descritos, o conjugado forma um homodímero incluindo um domínio Fc.
[0086] Em algumas modalidades dos conjugados aqui descritos, E homodimeriza com outro E para formar um domínio Fc.
[0087] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (3): (3) em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII): , , , , ,
(A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V) , , , , (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) , , ; (A-X) (A-XI) (A-XII)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; E compreende uma proteína de albumina (por exemplo, uma proteína de albumina tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-
71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc; L em cada A1-L-A2 é um ligante independentemente covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície ou um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a cada um de A 1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A1-L-A2 é independentemente covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação ou um ligante) ao átomo de enxofre de uma cisteína exposta ao solvente ou ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta ao solvente em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A1-L-A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A1-L-A2 aqui descritas).
[0088] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (3): (3) em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): , , , ,
; (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
E compreende uma proteína de albumina (por exemplo, uma proteína de albumina tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-
71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc; L em cada A1-L-A2 é um ligante independentemente covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície ou um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a cada um de A 1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A1-L-A2 é independentemente covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação ou um ligante) ao átomo de enxofre de uma cisteína exposta ao solvente ou ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta ao solvente em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Quando T é maior que
1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A1-L-A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A 1-L-A2 aqui descritas).
[0089] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (3): (3) em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX): , , , ; (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de - H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
E compreende uma proteína de albumina (por exemplo, uma proteína de albumina tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69- 71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc; L em cada A1-L-A2 é um ligante independentemente covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície ou um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a cada um de A1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A1-L-A2 é independentemente covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação ou um ligante) ao átomo de enxofre de uma cisteína exposta ao solvente ou ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta ao solvente em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A1-L-A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A1-L-A2 aqui descritas).
[0090] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (4): (4) em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII): , , , ,
, (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V) , , , , (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) , , ; (A-X) (A-XI) (A-XII)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
E compreende uma proteína de albumina (por exemplo, uma proteína de albumina tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69- 71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc; L em cada L-A1 é um ligante independentemente covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície ou um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a A1; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20); e a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A1 é independentemente covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação ou um ligante) ao átomo de enxofre da cisteína exposta ao solvente ou ao átomo de nitrogênio da lisina exposta ao solvente em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) , cada A pode ser selecionado independentemente a partir de qualquer uma das fórmulas (A-I) - (A-XII).
[0091] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (4): (4) em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): , , , ,
; (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
E compreende uma proteína de albumina (por exemplo, uma proteína de albumina tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-
71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc; L em cada L-A1 é um ligante independentemente covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície ou um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a A1; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, ou 20); e a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A está independentemente covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação ou um ligante) ao átomo de enxofre da cisteína exposta ao solvente ou ao átomo de nitrogênio da lisina exposta ao solvente em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Quando T é maior que 1 (por exemplo,
T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) , cada A 1 pode ser selecionado independentemente a partir de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V).
[0092] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (4): (4) em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX): , , , ; (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de - H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
E compreende uma proteína de albumina (por exemplo, uma proteína de albumina tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-
71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc; L em cada L-A1 é um ligante independentemente covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície ou um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a A1; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20); e a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A1 é independentemente covalentemente ligado (por exemplo, por meio de uma ligação ou um ligante) ao átomo de enxofre da cisteína exposta ao solvente ou ao átomo de nitrogênio da lisina exposta ao solvente em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A pode ser selecionado independentemente a partir de qualquer uma das fórmulas (A- VI)-(A-IX).
[0093] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (5): (5) em que cada Int é independentemente selecionado de qualquer um dos intermediários da Tabela 1; E compreende uma proteína de albumina (por exemplo, uma proteína de albumina tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc; L em cada L-Int é um ligante independentemente covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície ou um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a Int; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20); e a linha ondulada conectada a E indica que cada L-Int está independentemente covalentemente ligado ao átomo de enxofre da cisteína exposta ao solvente ou ao átomo de nitrogênio da lisina exposta ao solvente em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) , cada Int pode ser independentemente selecionado de qualquer um dos intermediários da Tabela 1.
[0094] Os intermediários da Tabela 1 podem ser conjugados a uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc (por exemplo, por meio de um ligante) por quaisquer métodos adequados conhecidos pelos versados na técnica, incluindo qualquer um dos métodos descritos ou exemplificados aqui. Em algumas modalidades, o conjugado (por exemplo, um conjugado descrito pela fórmula (5)) compreende E, em que E é uma proteína de albumina (por exemplo, uma proteína de albumina com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc. Em modalidades preferidas, um ou mais átomos de nitrogênio de um ou mais resíduos de lisina expostos à superfície de E ou um ou mais átomos de enxofre de uma ou mais cisteínas expostas à superfície em E são covalentemente conjugados a um ligante (por exemplo, um ligante PEG 2-PEG20 ). O ligante conjugado a E pode ser funcionalizado de modo que possa reagir para formar uma ligação covalente com qualquer um dos Ints aqui descritos (por exemplo, um Int da Tabela 1). Em modalidades preferidas, E é conjugado a um ligante funcionalizado com um grupo azido e o Int (por exemplo, um Int da Tabela 1) é funcionalizado com um grupo alquino. A conjugação (por exemplo, por química de clique) do ligante-azido de E e ligante-alquino do Int forma um conjugado da invenção, por exemplo, um conjugado descrito pela fórmula (5). Em ainda outras modalidades, E é conjugado a um ligante funcionalizado com um grupo alquino e o Int (por exemplo, um Int da Tabela 1) é funcionalizado com um grupo azido.
A conjugação (por exemplo, por química de clique) do ligante-alquino de E e ligante-azido do Int forma um conjugado da invenção, por exemplo, um conjugado descrito pela fórmula (5).
[0095] Em algumas modalidades, cada E inclui uma proteína de albumina com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71.
[0096] Em algumas modalidades, T é 1 e L-A está covalentemente ligado ao átomo de enxofre correspondente a Cys34 da SEQ ID NO: 69.
[0097] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma população de conjugados descritos em qualquer um dos aspectos anteriores, em que o valor médio de T é de 1 a 20 (por exemplo, o valor médio de T é de 1 a 2, 1 a 3, 1 a 4, 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15 ou 15 a 20). Em algumas modalidades, o valor médio de T é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 .
[0098] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado incluindo (i) uma primeira fração, A1; (ii) uma segunda fração, A2; (iii) um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc; e (iv) um ligante covalentemente ligado a A1 e A2, e ao monômero do domínio Fc ou ao domínio Fc; em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII): , , , , , (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V)
, , , , (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) , , ; (A-X) (A-XI) (A-XII)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e R6 é selecionado de , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , e ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos;
[0099] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado incluindo (i) uma primeira fração, A1; (ii) uma segunda fração, A2; (iii) um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc; e (iv) um ligante covalentemente ligado a A1 e A2, e ao monômero do domínio Fc ou ao domínio Fc; em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas
(A-I)-(A-V):
, , , ,
; (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , e ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos;
[00100] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado incluindo (i) uma primeira fração, A1; (ii) uma segunda fração, A2; (iii) um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc; e (iv) um ligante covalentemente ligado a A1 e A2, e ao monômero do domínio Fc ou ao domínio Fc; em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX):
, , , ; (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , e ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos;
[00101] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado incluindo (i) uma primeira fração, Int; (ii) um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc; e (iv) um ligante covalentemente ligado a Int e ao monômero do domínio Fc ou ao domínio Fc; em que cada Int é independentemente selecionado de qualquer um dos intermediários da Tabela 1.
[00102] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado incluindo (i) uma primeira fração, A1; (ii) uma segunda fração, A2; (iii) uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc; e (iv) um ligante covalentemente ligado a A 1 e A2, e para a proteína de albumina, o peptídeo de ligação à proteína de albumina ou o peptídeo de ligação a Fc; em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I) - (A-XII):
, , , ,
, (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V) , , , , (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) , , ; (A-X) (A-XI) (A-XII)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
[00103] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado incluindo (i) uma primeira fração, A1; (ii) uma segunda fração, A2; (iii) uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc; e (iv) um ligante covalentemente ligado a A 1 e A2, e para a proteína de albumina, o peptídeo de ligação à proteína de albumina ou o peptídeo de ligação a Fc; em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): , , , , ; (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V) em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de - H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
;
R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
[00104] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado incluindo (i) uma primeira fração, A1; (ii) uma segunda fração, A2; (iii) uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc; e (iv) um ligante covalentemente ligado a A 1 e A2, e para a proteína de albumina, o peptídeo de ligação à proteína de albumina ou o peptídeo de ligação a Fc; em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX): , , , ; (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de - H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
[00105] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (D-I): (D-I) em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII): , , , , , (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V) , , , ,
(A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) , , ; (A-X) (A-XI) (A-XII)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , e ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 hetroaril; cada E compreende um monômero de domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68), uma proteína de albumina (por exemplo, uma proteína de albumina tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc; n é 1 ou 2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, T é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , ou 20); e L é um ligante covalentemente ligado a cada um de E, A 1, e A2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A 1-L- A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A1-L-A2 aqui descritas).
[00106] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (D-I):
(D-I)
em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V):
, , , ,
; (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 hetroaril; cada E compreende um monômero de domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68), uma proteína de albumina
(por exemplo, uma proteína de albumina tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc; n é 1 ou 2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, T é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , ou 20); e L é um ligante covalentemente ligado a cada um de E, A1, e A2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A 1-L- A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A1-L-A2 aqui descritas).
[00107] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (D-I): (D-I) em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX): , , , ; (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de - H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
;
R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 hetroaril; cada E compreende um monômero de domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68), uma proteína de albumina (por exemplo, uma proteína de albumina tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc; n é 1 ou 2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, T é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , ou 20); e L é um ligante covalentemente ligado a cada um de E, A 1, e A2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A1-L- A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A1-L-A2 aqui descritas).
[00108] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-II): (D-II) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00109] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-II-1):
(D-II-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00110] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-II-2): (D-II-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00111] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-II-3):
(D-II-3) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio.
[00112] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura selecionado de ,
, ou
[00113] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-II-4): (D-II-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00114] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-II-5): (D-II-5)
em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio.
[00115] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura selecionado de , , ou
, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00116] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura selecionado de , , , ou
, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00117] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-II-6): , (D-II-6) em que R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00118] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-II-7): (D-II-7)
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00119] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-II-8): ; (D-II-8) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio.
[00120] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura ,
ou , ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00121] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura , ,
, ou , ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00122] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura , ,
, ou , ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00123] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-II-9): ; (D-II-9) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00124] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-II-10):
; (D-II-10) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio.
[00125] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura , ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura de , ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00126] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-III): (D-III) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00127] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-III-1):
(D-III-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00128] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-III-2): (D-III-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00129] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-III-3):
(D-III-3) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio.
[00130] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-III-4): (D-III-4)
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00131] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-III-5): (D-III-5) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio.
[00132] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-III-6):
(D-III-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00133] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-III-7): (D-III-7) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio.
[00134] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-III-8): (D-III-8) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00135] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-III-9): (D-III-9) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio.
[00136] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-IV): (D-IV) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00137] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-IV-1): (D-IV-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00138] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-IV-2): (D-IV-2) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio.Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-V): (D-V) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00139] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-V-1): (D-V-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00140] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-V-2): (D-V-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00141] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-V-3): (D-V-3) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio. Em algumas modalidades y 1 e y2 são cada 1, y1 e y2 são cada 2, ou y1 e y2 são cada 3.
[00142] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-V-4): (D-V-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00143] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-V-5): (D-V-5) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio. Em algumas modalidades y1 e y2 são cada 1, y1 e y2 são cada 2, ou y1 e y2 são cada 3.
[00144] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-V-6): (D-V-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00145] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-V-7): (D-V-7) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00146] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-V-8): (D-V-8) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio. Em algumas modalidades y1 e y2 são cada 1, y1 e y2 são cada 2, ou y1 e y2 são cada 3.
[00147] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-V-9): (D-V-9) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00148] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-V-10): (D-V-10) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio. Em algumas modalidades y 1 e y2 são cada 1, y1 e y2 são cada 2, ou y1 e y2 são cada 3.
[00149] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VI): (D-VI) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00150] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VI-1): (D-VI-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00151] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VI-2): (D-VI-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00152] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VI-3): (D-VI-3) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio. Em algumas modalidades y 1 e y2 são cada 1, y1 e y2 são cada 2, ou y1 e y2 são cada 3.
[00153] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VI-4): (D-VI-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00154] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VI-5): (D-VI-5)
em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio. Em algumas modalidades y 1 e y2 são cada 1, y1 e y2 são cada 2, ou y1 e y2 são cada 3.
[00155] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VI-6): (D-VI-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00156] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VI-7): (D-VI-7)
em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio. Em algumas modalidades y 1 e y2 são cada 1, y1 e y2 são cada 2, ou y1 e y2 são cada 3.
[00157] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VI-8): (D-VI-8) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00158] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VI-9):
(D-VI-9) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio. Em algumas modalidades y1 e y2 são cada 1, y1 e y2 são cada 2, ou y1 e y2 são cada 3.
[00159] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VII): (D-VII) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00160] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, R1 é OH. Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos aqui descritos, R1 é NH2. Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos aqui descritos, R1 é -NHC(=NH)NH2 .
[00161] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VIII):
(D-VIII) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00162] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VIII-1): (D-VIII-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00163] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VIII-2): (D-VIII-2)
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00164] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VIII-3): (D-VIII-3) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio.
[00165] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura selecionado de , , ou
, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00166] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VIII-4): (D-VIII-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00167] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VIII-5): (D-VIII-5) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio.
[00168] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura selecionado de , ,
ou ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00169] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela estrutura ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00170] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VIII-6): (D-VIII-6)
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00171] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VIII-7): (D-VIII-7) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio.
[00172] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VIII-8):
(D-VIII-8) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00173] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VIII-9): (D-VIII-9) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio.
[00174] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VIII-10): (D-VIII-10)
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00175] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-VIII-11): (D-VIII-11) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são, cada um, independentemente, um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 e y2 são, cada um, independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio.Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-IX): (D-IX)
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00176] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-IX-1): (D-IX-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00177] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-IX-2): (D-IX-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00178] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-IX-3):
(D-IX-3) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00179] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-IX-4): (D-IX-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00180] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-IX-5):
(D-IX-5) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00181] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-IX-6): (D-IX-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00182] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-X): (D-X) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00183] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-X-1): (D-X-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00184] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-X-2):
(D-X-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00185] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (D-X-3): (D-X-3) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00186] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, L ou L' inclui um ou mais C1-C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2- C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído, C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído, O, S, NRi, P, carbonil, tiocarbonil, sulfonil, fosfato, fosforil ou imino, em que Ri é H, C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1- C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído, C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4- C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído.
[00187] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, a espinha dorsal de L ou L' consiste em um ou mais de C1-C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2- C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído, C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído, O, S, NRi, P, carbonil, tiocarbonil,
sulfonil, fosfato, fosforil ou imino, em que Ri é H, , C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído, C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído.
[00188] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, L ou L' é oxo substituído. Em algumas modalidades, a espinha dorsal de L ou L' compreende não mais que 250 átomos. Em algumas modalidades, L ou L' é capaz de formar uma ligação amida, carbamato, sulfonil ou ureia. Em algumas modalidades
[00189] L ou L' é uma ligação. Em algumas modalidades, L ou L' é um átomo.
[00190] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, cada L é descrito pela fórmula (D-L-I): (D-L-I) em que LA é descrito pela fórmula GA1-(ZA1)g1-(YA1)h1-(ZA2)i1-(YA2)j1- (ZA3)k1-(YA3)l1-(ZA4)m1-(YA4)n1-(ZA5)o1-GA2; LB é descrito pela fórmula GB1-(ZB1)g2- (YB1)h2-(ZB2)i2-(YB2)j2-(ZB3)k2-(YB3)l2-(ZB4)m2-(YB4)n2-(ZB5)o2-GB2; LCé descrito pela fórmula GC1-(ZC1)g3-(YC1)h3-(ZC2)i3-(YC2)j3-(ZC3)k3-(YC3)l3-(ZC4)m3-(YC4)n3-(ZC5)o3- GC2; GA1 é uma ligação ligada a Q; GA2 é uma ligação ligada a A1; GB1 é uma ligação ligada a Q); GB2 é uma ligação ligada a A2; GC1 é uma ligação ligada a
Q; GC2 é uma ligação ligada a E ou um grupo funcional capaz de reagir com um grupo funcional conjugado a E (por exemplo, maleimida e cisteína, amina e ácido carboxílico ativado, tiol e maleimida, ácido sulfônico ativado e amina, isocianato e amina, azida e alquino , e alqueno e tetrazina); cada um de ZA1, ZA2, ZA3, ZA4,
ZA5, ZB1, ZB2, ZB3, ZB4, ZB5, ZC1, ZC2, ZC3, ZC4, e ZC5 é, independentemente, C1-
C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2-
C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído,
C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído,
C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído; cada um de YA1, YA2, YA3, YA4, YB1, YB2,
YB3, YB4, YC1, YC2, YC3, e YC4 é, independentemente, O, S, NRi, P, carbonil,
tiocarbonil, sulfonil, fosfato, fosforil ou imino; Ri é H, C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído,
C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído; cada um de g1, h1, i1, j1, k1, l1, m1, n1, o1, g2, h2, i2, j2, k2, l2, m2, n2, o2, g3, h3, i3, j3, k3, l3, m3, n3, e o3 é,
independentemente, 0 ou 1; Q é um átomo de nitrogênio, C1-C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2- C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído.
[00191] Em algumas modalidades, LC pode ter dois pontos de ligação ao domínio Fc, peptídeo de ligação a Fc, proteína de albumina ou peptídeo de ligação à proteína de albumina (por exemplo, dois GC2).
[00192] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, L inclui um ligante de polietileno glicol (PEG). Um ligante PEG inclui um ligante tendo a estrutura de unidade de repetição (-CH2CH2O-)n, em que n é um número inteiro de 2 a 100. Um ligante de polietileno glicol pode unir covalentemente a um inibidor de neuraminidase e E (por exemplo, em um conjugado de qualquer uma das fórmulas (M-I) - (M-X)). Um ligante de polietileno glicol pode unir covalentemente a um primeiro inibidor de neuraminidase e a um segundo inibidor de neuraminidase (por exemplo, em um conjugado de qualquer uma das fórmulas (D-I)-(D-X)). Um ligante de polietileno glicol pode unir covalentemente um dímero inibidor de neuraminidase e E (por exemplo, em um conjugado de qualquer uma das fórmulas (D-I)-(D-X)). Um ligante de polietileno glicol pode selecionar qualquer um de PEG2 to PEG100 (por exemplo, PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG5-PEG10, PEG10-PEG20, PEG20-PEG30, PEG30-PEG40, PEG50-PEG60, PEG60-PEG70, PEG70-PEG80, PEG80-PEG90, PEG90-PEG100). Em algumas modalidades, Lc inclui um ligante PEG, onde LC está covalentemente ligado a cada um de Q e E.
[00193] Em algumas modalidades, L é , , , , , , , , , , , , , ,
, ,
, ,
, ,
, ,
, ,
, ,
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,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
, , ; ; ; ; ; ; ; ;ou , em que z1 e z2 são cada um, independentemente, e inteiros de 1 a 20; e R9 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril.
[00194] Em algumas modalidades, L é
,
,
,
, ,
, ,
, , ,
, ,
, ,
, , ,
, , , ,
, , , ,
, ,
, ,
,
, ,
, ,
, ,
, ,
, ,
, ;
, ;
, ;
, ;
, , ou em que R* é um ligação ou inclui um ou mais de C1-C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído,
C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2-
C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído, C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído, O, S, NRi, P, carbonil, tiocarbonil, sulfonil, fosfato, e imino, e em que Ri é H, , C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído, C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído,
C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4- C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído.
[00195] Em algumas modalidades, Y é: (- NH(C=O)O-) e L é: .
[00196] Em algumas modalidades, Y é: (- NH(C=O)O-) e L é: .
[00197] Em algumas modalidades, Y é: (- NH(C=O)O-) e L é: .
[00198] Em algumas modalidades, Y é: (-O-) e L é: .
[00199] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (M-I):
(M-I)
em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII):
, , , ,
, (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V) , , , , (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) , , ; (A-X) (A-XI) (A-XII)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , e ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 hetroaril; cada E compreende um monômero de domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68), uma proteína de albumina (por exemplo, uma proteína de albumina tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc; n é 1 ou 2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, T é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , ou 20); e L é um ligante covalentemente ligado a cada um de E e A1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) , cada A 1 pode ser selecionado independentemente a partir de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII).
[00200] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (M-I):
(M-I)
em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V):
, , , ,
; (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 hetroaril; cada E compreende um monômero de domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68), uma proteína de albumina
(por exemplo, uma proteína de albumina tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc; n é 1 ou 2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, T é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , ou 20); e L é um ligante covalentemente ligado a cada um de E e A 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) , cada A 1 pode ser selecionado independentemente a partir de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V).
[00201] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (M-I): (M-I) em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX): , , , ; (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de - H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 hetroaril; cada E compreende um monômero de domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68), uma proteína de albumina (por exemplo, uma proteína de albumina tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc; n é 1 ou 2; T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, T é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , ou 20); e L é um ligante covalentemente ligado a cada um de E e A1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), cada A 1 pode ser selecionado independentemente a partir de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX).
[00202] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-II): (M-II) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00203] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-II-1):
(M-II-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00204] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-II-2): (M-II-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00205] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-II-3):
(M-II-3) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00206] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-II-4): (M-II-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00207] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-II-5): (M-II-5) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00208] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura , ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00209] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-II-6): ; (M-II-6) em que R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00210] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-II-7):
(M-II-7) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00211] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-II-8): ; (M-II-8) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00212] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura .
[00213] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-II-9): ; (M-II-9) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00214] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-II-10):
; (M-II-10) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00215] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00216] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-III): (M-III)
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00217] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-III-1): (M-III-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00218] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-III-2): (M-III-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00219] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-III-3): (M-III-3) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00220] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-III-4): (M-III-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00221] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-III-5): (M-III-5) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00222] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-III-6): (M-III-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00223] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-III-7): (M-III-7) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00224] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-III-8): (M-III-8) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00225] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-III-9): (M-III-9) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00226] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-IV): (M-IV) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00227] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-IV-1): (M-IV-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00228] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-IV-2): (M-IV-2) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00229] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-V):
(M-V) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00230] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-V-1): (M-V-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00231] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-V-2): (M-V-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00232] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-V-3): (M-V-3) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00233] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-V-4): (M-V-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00234] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-V-5): (M-V-5) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00235] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-V-6): (M-V-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00236] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-V-7): (M-V-7) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00237] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-V-8): (M-V-8) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00238] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-V-9):
(M-V-9) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00239] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-V-10): (M-V-10) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00240] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VI): (M-VI)
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00241] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VI-1): (M-VI-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00242] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VI-2): (M-VI-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00243] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VI-3): (M-VI-3) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00244] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VI-4): (M-VI-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00245] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VI-5): (M-VI-5) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00246] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VI-6): (M-VI-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00247] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VI-7): (M-VI-7) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00248] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VI-8): (M-VI-8) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00249] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VI-9): (M-VI-9) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00250] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VII): (M-VII) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00251] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, R1 é OH. Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos aqui descritos, R1 é NH2. Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos aqui descritos, R1 é -NHC(=NH)NH2.
[00252] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VIII): (M-VIII) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00253] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VIII-1): (M-VIII-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00254] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito por (M-VIII-2):
(M-VIII-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00255] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VIII-3): (M-VIII-3) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00256] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VIII-4):
(M-VIII-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00257] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VIII-5): (M-VIII-5) em que L 'é o restante de L e y1 é um número inteiro de 1-20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00258] Em algumas modalidades, o conjugado tem a estrutura de ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00259] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VIII-6): (M-VIII-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00260] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VIII-7):
(M-VIII-7) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00261] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VIII-8): (M-VIII-8) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00262] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VIII-9): (M-VIII-9) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00263] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VIII-10): (M-VIII-10)
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00264] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-VIII-11): (M-VIII-11) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20 (por exemplo, y1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00265] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-IX): (M-IX) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00266] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-IX-1): (M-IX-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00267] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-IX-2): (M-IX-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00268] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-IX-3):
(M-IX-3) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00269] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-IX-4): (M-IX-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00270] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-IX-5): (M-IX-5) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00271] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-IX-6): (M-IX-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00272] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-X): (M-X) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00273] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-X-1): (M-X-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00274] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-X-2): (M-X-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00275] Em algumas modalidades, o conjugado é descrito pela fórmula (M-X-3):
(M-X-3) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00276] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, L ou L' compreende um ou mais C1-C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2- C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído, C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído, O, S, NRi, P, carbonil, tiocarbonil, sulfonil, fosfato, fosforil ou imino, em que Ri é H, C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1- C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído, C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4-
C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído.
[00277] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, a espinha dorsal de L ou L' consiste em um ou mais de C1-C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2- C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído, C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído, O, S, NRi, P, carbonil, tiocarbonil, sulfonil, fosfato, fosforil ou imino, em que Ri é H, , C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído, C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído.
[00278] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, L ou L' é oxo substituído. Em algumas modalidades, a espinha dorsal de L ou L' compreende não mais que 250 átomos. Em algumas modalidades, L ou L' é capaz de formar uma ligação amida, carbamato, sulfonil ou ureia. Em algumas modalidades, L ou L' é uma ligação. Em algumas modalidades, L ou L' é um átomo. Em algumas modalidades, L' é um átomo de nitrogênio.
[00279] Em algumas modalidades, cada L é descrito pela fórmula (M-L-1): J1-(Q1)g-(T1)h-(Q2)i-(T2)j-(Q3)k-(T3)l-(Q4)m-(T4)n-(Q5)o-J2 em que: J1 é uma ligação ligada a A1; J2 é uma ligação ligada a E ou um grupo funcional capaz de reagir com um grupo funcional conjugado a E (por exemplo, maleimida e cisteína, amina e ácido carboxílico ativado, tiol e maleimida, ácido sulfônico ativado e amina, isocianato e amina, azida e alquino, e alqueno e tetrazina); cada um de Q1, Q2, Q3, Q4, e Q5 é, independentemente, C1-C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2- C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído; cada um de T1, T2, T3, T4 é, independentemente, O, S, NRi, P, carbonil, tiocarbonil, sulfonil, fosfato, fosforil ou imino; Ri é H, C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído, C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8- C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído; e cada um de g, h, i, j, k, l, m, n e o é, independentemente, 0 ou 1; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00280] Em algumas modalidades, J2 pode ter dois pontos de ligação ao domínio Fc, peptídeo de ligação a Fc, proteína de albumina ou peptídeo de ligação à proteína de albumina (por exemplo, dois J2).
[00281] Em algumas modalidades, L é , , , , ou , em que d é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, d é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20).
[00282] Em algumas modalidades, L é , , , , , , , , ,
, , , , , , ou , em que cada um de d e e é, independentemente, um número inteiro de 1 a 26; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00283] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, L inclui um ligante de polietileno glicol (PEG). Um ligante PEG inclui um ligante tendo a estrutura de unidade de repetição (-CH2CH2O-)n, em que n é um número inteiro de 2 a 100. Um ligante de polietileno glicol pode unir covalentemente a um inibidor de neuraminidase e E (por exemplo, em um conjugado de qualquer uma das fórmulas (M-I) - (M-X)). Um ligante de polietileno glicol pode unir covalentemente a um primeiro inibidor de neuraminidase e a um segundo inibidor de neuraminidase (por exemplo, em um conjugado de qualquer uma das fórmulas (D-I)-(D-X)). Um ligante de polietileno glicol pode unir covalentemente um dímero inibidor de neuraminidase e E (por exemplo, em um conjugado de qualquer uma das fórmulas (D-I)-(D-X)). Um ligante de polietileno glicol pode selecionar qualquer um de PEG2 to PEG100 (por exemplo, PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG5-PEG10, PEG10-PEG20, PEG20-PEG30, PEG30-PEG40, PEG50-PEG60, PEG60-PEG70, PEG70-PEG80, PEG80-PEG90, PEG90-PEG100). Em algumas modalidades, Lc inclui um ligante PEG, onde LC está covalentemente ligado a cada um de Q e E.
[00284] Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos aqui descritos, R1 é -NHC(=NH)NH2. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, R2 é -F. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, R3 é -F. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, R4 é –CO2H. Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos aqui descritos, R5 é –COCH3.
[00285] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos descritos neste documento, L é covalentemente ligado ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície de E ou L é covalentemente ligado ao átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície de E.
[00286] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E é um monômero de domínio Fc. Em algumas modalidades, n é 2 e cada E dimeriza para formar um domínio Fc.
[00287] Em algumas modalidades, n é 2, cada E é um monômero de domínio Fc, cada E dimeriza para formar um domínio Fc e o conjugado é descrito pela fórmula (D-I-1): (D-I-1) em que J é um domínio Fc; e T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, T é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00288] Em algumas modalidades, n é 2, cada E é um monômero de domínio Fc, cada E dimeriza para formar um domínio Fc e o conjugado é descrito pela fórmula (M-I-1): (M-I-1) em que J é um domínio Fc; e T é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, T é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00289] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E tem a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68.
[00290] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E é uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc. Em algumas modalidades, onde E é uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc, n é 1.
[00291] Em algumas modalidades, n é 1, E é uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc e o conjugado é descrito pela fórmula (D-I-2): (D-I-2) em que E é uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina ou peptídeo de ligação a Fc; e T é um número inteiro de 1 a 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00292] Em algumas modalidades, n é 1, E é uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc e o conjugado é descrito pela fórmula (M-I-2):
(M-I-2) em que E é uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina ou peptídeo de ligação a Fc; e T é um número inteiro de 1 a 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00293] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E é uma proteína de albumina com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71.
[00294] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, T é 1, 2, 3, 4 ou 5.
[00295] Em outro aspecto, a invenção fornece uma população de conjugados com a estrutura de qualquer um dos conjugados descritos neste documento (por exemplo, uma população de conjugados com a fórmula de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)), em que o valor médio de T é de 1 a 20 (por exemplo, o valor médio de T é de 1 a 2, 1 a 3, 1 a 4, 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15 ou 15 a 20). Em algumas modalidades, o valor médio de T é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 .
[00296] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 18, 19,2 19, ou 20), cada A1-L-A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A 1-L-A2 descritas aqui). Em algumas modalidades, E pode ser conjugado a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais frações A1-L-A2 diferentes. Em algumas modalidades, E é conjugado a uma primeira fração A1-L-A2 , e uma segunda fração A1-L-A2. Em algumas modalidades, A1 e A2 da primeira fração A1-L-A2 são independentemente selecionados de qualquer uma das fórmulas (A-III)-(A-V):
, , ; (A-III) (A-IV) (A-V)
e A1 e A2 da segunda fração A1-L-A2 são independentemente selecionados de qualquer uma das fórmulas (A-I), (A-II), (A-VI), (A-VII), (A-VIII),
e (A-IX):
, , , ,
, (A-I) (A-II) (A-VI) (A-VII) (A-VIII)
.
(A-IX)
[00297] Em algumas modalidades, cada uma das primeiras fraçõesA1-L-A2 é conjugada especificamente a um resíduo de lisina de E (por exemplo, o átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina exposto à superfície de E) e cada uma das segundas frações A1-L-A2 é conjugada especificamente a um resíduo de cisteína de E (por exemplo, o átomo de enxofre de um resíduo de cisteína exposto à superfície de E). Em algumas modalidades, cada uma das primeira frações A1-L-A2 é conjugada especificamente a um resíduo de cisteína de E (por exemplo, o átomo de enxofre de um resíduo de cisteína exposto à superfície de E) e cada uma das segundas frações A1-L-A2 é conjugada especificamente a um resíduo de lisina de E (por exemplo, o átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina de exposto à superfície de E).
[00298] Em algumas modalidades, o número das primeiras frações A1-L-A2 conjugada a E é um número inteiro de 1 a 10 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10). Em algumas modalidades, o número de segundas frações A1-L-A2 conjugadas a E é um número inteiro de 1 a 10 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10).
[00299] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), cada A 1-L pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A1-L descritas aqui). Em algumas modalidades, E pode ser conjugado a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais frações A1-L diferentes.
Em algumas modalidades, E é conjugado a uma primeira fração A 1-L e uma segunda fração A1-L. Em algumas modalidades, A1 da primeira fração A1-L é selecionada de qualquer uma das fórmulas (A-III)-(A-V):
, , ; (A-III) (A-IV) (A-V) e A1 da segunda fração A1-L é selecionado de qualquer uma das modalidades (A-I), (A-II), (A-VI), (A-VII), (A-VIII), ou (A-IX): , , , , , (A-I) (A-II) (A-VI) (A-VII) (A-VIII) . (A-IX)
[00300] Em algumas modalidades, cada uma das primeiras frações A1-L é conjugada especificamente a um resíduo de lisina de E (por exemplo, o átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina exposto à superfície de E) e cada uma das segundas frações A1-L é conjugada especificamente a um resíduo de cisteína de E (por exemplo, o átomo de enxofre de um resíduo de cisteína exposto à superfície de E). Em algumas modalidades, cada uma das primeiras frações A1-L é conjugada especificamente a um resíduo de cisteína de E (por exemplo, o átomo de enxofre de um resíduo de cisteína exposto à superfície de E) e cada uma das segundas frações A1-L é conjugada especificamente a um resíduo de lisina de E (por exemplo, o átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina de exposto à superfície de E).
[00301] Em algumas modalidades, o número das primeiras frações A1-L conjugada a E é um número inteiro de 1 a 10 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10). Em algumas modalidades, o número de segundas frações A1-L conjugadas a E é um número inteiro de 1 a 10 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10).
[00302] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (D'-I): (D’-I) em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-III)-(A-V):
, , ; (A-III) (A-IV) (A-V)
em que cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I), (A-II), (A-VI), (A-VII), (A-VIII) e (A-IX):
, , , ,
, (A-I) (A-II) (A-VI) (A-VII) (A-VIII) ; (A-IX)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , , , , , , , e ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; cada E compreende um monômero de domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68), uma proteína de albumina (por exemplo, uma proteína de albumina tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc; n é 1 ou 2; T1 é um número inteiro de 1 a 10 (por exemplo, T1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); L1 é um ligante covalentemente conjugado a E e a cada A1; T1 é um número inteiro de 1 a 10 (por exemplo, T1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); L2 é um ligante covalentemente conjugado a E e cada A2; T2 é um número inteiro de 1 a 10 (por exemplo, T 2 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00303] Em algumas modalidades, cada A1-L-A1 é conjugado especificamente a um resíduo de lisina de E (por exemplo, o átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina exposto à superfície de E) e cada A2-L-A2 é conjugado especificamente a um resíduo de cisteína de E (por exemplo, o átomo de enxofre de um resíduo de cisteína exposto à superfície de E). Em algumas modalidades, cada fração A1-L-A1 é conjugada especificamente a um resíduo de cisteína de E (por exemplo, o átomo de enxofre de um resíduo de cisteína exposto à superfície de E) e cada fração A2-L-A2 é conjugada especificamente a um resíduo de lisina de E (por exemplo, o átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina de exposto à superfície de E).
[00304] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjugado descrito pela fórmula (M'-I): (M’-I) em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer um (M-IX) das fórmulas (A-III)-(A-V): , , ; (A-III) (A-IV) (A-V) em que cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I), (A-II), (A-VI), (A-VII), (A-VIII) e (A-IX): , , , ,
, (A-I) (A-II) (A-VI) (A-VII) (A-VIII) ; (A-IX)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e
; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; cada E compreende um monômero de domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68), uma proteína de albumina (por exemplo, uma proteína de albumina tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71), um peptídeo de ligação à proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc; n é 1 ou 2; T1 é um número inteiro de 1 a 10 (por exemplo, T1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); L1 é um ligante covalentemente conjugado a E e A1; T1 é um número inteiro de 1 a 10 (por exemplo, T1 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); L2 é um ligante covalentemente conjugado a E e A2; T2 é um número inteiro de 1 a 10 (por exemplo, T2 é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00305] Em algumas modalidades, cada A1-L é conjugado especificamente a um resíduo de lisina de E (por exemplo, o átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina exposto à superfície de E) e cada A 2-L é conjugado especificamente a um resíduo de cisteína de E (por exemplo, o átomo de enxofre de um resíduo de cisteína exposto à superfície de E). Em algumas modalidades, cada fração A1-L é conjugada especificamente a um resíduo de cisteína de E (por exemplo, o átomo de enxofre de um resíduo de cisteína exposto à superfície de E) e cada fração A2-L é conjugada especificamente a um resíduo de lisina de E (por exemplo, o átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina de exposto à superfície de E).
[00306] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo qualquer um dos conjugados aqui descritos (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D- I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00307] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento de um sujeito com uma infecção viral ou que se presume ter uma infecção viral, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer um dos conjugados ou composições aqui descritos (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D- I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)).
[00308] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento profilático de uma infecção viral em um sujeito em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de qualquer um dos conjugados ou composições aqui descritos (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’- I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)).
[00309] Em algumas modalidades, a infecção viral é causada pelo vírus influenza ou vírus parainfluenza. Em algumas modalidades, a infecção viral é o vírus da influenza A, B ou C ou o vírus da parainfluenza.
[00310] Em algumas modalidades, o sujeito é imunocomprometido.
[00311] Em algumas modalidades, o sujeito foi diagnosticado com deficiência imunológica humoral, deficiência de células T, neutropenia, asplenia ou deficiência de complemento.
[00312] Em algumas modalidades, o sujeito está sendo tratado ou prestes a ser tratado com uma terapia imunossupressora.
[00313] Em algumas modalidades, o sujeito foi diagnosticado com uma doença que causa imunossupressão. Em algumas modalidades, a doença é câncer ou síndrome de imunodeficiência adquirida. Em algumas modalidades, o câncer é leucemia, linfoma ou mieloma múltiplo.
[00314] Em algumas modalidades, o sujeito foi submetido ou está prestes a sofrer transplante de células-tronco hematopoiéticas.
[00315] Em algumas modalidades, em que o sujeito foi submetido ou está prestes a sofrer um transplante de órgão.
[00316] Em algumas modalidades, o conjugado da composição é administrado por via intramuscular, intravenosa, intradérmica, intra-arterial, intraperitoneal, intralesional, intracraniana, intra-articular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal,
intrarretal, tópica, intratumoral, peritoneal, subcutânea, subconjuntiva, intravesicular, mucosa, intrapericardial, intraumbilical, intraocular, oral, local, por inalação, por injeção ou por infusão.
[00317] Em algumas modalidades, o sujeito é tratado com um segundo agente terapêutico. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um agente antiviral. Em algumas modalidades, o agente antiviral é selecionado de oseltamivir, zanamivir, peramivir, laninamivir, amantadina ou rimantadina. Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é uma vacina viral. Em algumas modalidades, a vacina viral provoca uma resposta imune no sujeito contra o vírus influenza A, B ou C ou o vírus parainfluenza.
[00318] Em algumas modalidades, uma composição contendo domínio Fc pode ser substituída por um domínio Fc e uma composição contendo monômero Fc domínio pode ser substituída por um monômero de domínio Fc em qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M- X), ou (M’-I) (por exemplo, qualquer uma das fórmulas (1), (2), (3), (4), (5), (D-I), (D-II), (D-II-1), (D-II-2), (D-II-3), (D-II-4), (D-II-5), (D-II-6), (D-II-7), (D-II-8), (D-II- 9), (D-II-10), (D-III), (D-III-1), (D-III-2), (D-III-3), (D-III-4), (D-III-5), (D-III-6), (D-III- 7), (D-III-8), (D-III-9), (D-IV), (D-IV-1), (D-IV-2), (D-V), (D-V-1), (D-V-2), (D-V-3), (D-V-4), (D-V-5), (D-V-6), (D-V-7), (D-V-8), (D-V-9), (D-V-10), (D-VI), (D-VI-1), (D-VI-2), (D-VI-3), (D-VI-4), (D-VI-5), (D-VI-6), (D-VI-7), (D-VI-8), (D-VI-9), (D- VII), (D-VIII), (D-VIII-1), (D-VIII-2), (D-VIII-3), (D-VIII-4), (D-VIII-5), (D-VIII-6), (D- VIII-7), (D-VIII-8), (D-VIII-9), (D-VIII-10), (D-VIII-11), (D-IX), (D-IX-1), (D-IX-2), (D- IX-3), (D-IX-4), (D-IX-5), (D-IX-6), (D-X), (D-X-1), (D-X-2), (D-X-3), (D’-I), (M-I), (M-II), (M-II-1), (M-II-2), (M-II-3), (M-II-4), (M-II-5), (M-II-6), (M-II-7), (M-II-8), (M- II-9), (M-II-10), (M-III), (M-III-1), (M-III-2), (M-III-3), (M-III-4), (M-III-5), (M-III-6), (M-III-7), (M-III-8), (M-III-9), (M-IV), (M-IV-1), (M-IV-2), (M-V), (M-V-1), (M-V-2), (M-V-3), (M-V-4), (M-V-5), (M-V-6), (M-V-7), (M-V-8), (M-V-9), (M-V-10), (M-VI), (M-VI-1), (M-VI-2), (M-VI-3), (M-VI-4), (M-VI-5), (M-VI-6), (M-VI-7), (M-VI-8), (M-
VI-9), (M-VII), (M-VIII), (M-VIII-1), (M-VIII-2), (M-VIII-3), (M-VIII-4), (M-VIII-5), (M- VIII-6), (M-VIII-7), (M-VIII-8), (M-VIII-9), (M-VIII-10), (M-VIII-11), (M-IX), (M-IX-1), (M-IX-2), (M-IX-3), (M-IX-4), (M-IX-5), (M-IX-6), (M-X), (M-X-1), (M-X-2), (M-X-3), ou (M’-I)). Em qualquer uma das fórmulas aqui descritas (por exemplo, qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)), quando n é 1, E é uma composição contendo monômero de domínio Fc. Em qualquer uma das fórmulas aqui descritas (por exemplo, qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D- I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)), quando n é 2, E é uma composição contendo o domínio Fc.
[00319] Em certas modalidades, a composição contendo o domínio Fc é um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Um anticorpo pode incluir qualquer forma de imunoglobulina, anticorpo de cadeia pesada, anticorpo de cadeia leve, anticorpo baseado em LRR ou outro andaime de proteína com propriedades semelhantes a anticorpos, bem como qualquer outra fração de ligação imunológica conhecida na técnica, incluindo fragmentos de anticorpo (por exemplo, um Fab, Fab', Fab’2, F(ab')2, Fd, Fv, Feb, scFv, ou SMIP). As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de anticorpos são bem conhecidas na técnica. Um fragmento de anticorpo pode incluir uma porção de ligação que inclui uma porção derivada de ou tendo homologia significativa com um anticorpo, tal como a região determinante de antígeno de um anticorpo. Fragmentos de anticorpo exemplificativos incluem Fab, Fab', Fab’2, F(ab')2, Fd, Fv, Feb, scFv, e SMIP.
[00320] Em modalidades particulares, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um humano, camundongo, camelídeo (por exemplo, lhama, alpaca ou camelo), cabra, ovelha, coelho, galinha, porquinho-da-índia, hamster, cavalo ou rato, anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em modalidades específicas, o anticorpo é IgG, IgA, IgD, IgE, IgM ou intracorpo. Em certas modalidades, o fragmento de anticorpo inclui um scFv, sdAb, dAb, Fab, Fab',
Fab'2, F(ab')2, Fd, Fv, Feb, ou SMIP.
[00321] Em algumas modalidades, a composição contendo o domínio Fc (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo) confere especificidade de ligação a um ou mais alvos (por exemplo, um antígeno).
[00322] Em algumas modalidades, o um ou mais alvos (por exemplo, um antígeno) ligados pela composição contendo o domínio Fc (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo) é uma proteína viral (por exemplo, influenza), como neuraminidase ou hemaglutinina. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo reconhece um antígeno de superfície viral. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo tem como alvo a hemaglutinina. Os anticorpos direcionados à hemaglutinina incluem anticorpos monoclonais, como CR6261, CR8020, MEDI8852, MHAA4549A e VIS410. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo amplamente neutralizante ou fragmento de anticorpo direcionado à hemaglutinina da gripe (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo descrito em Wu et al., J. Mol. Biol. 429:2694–2709 (2017)). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo direciona uma proteína da matriz viral (por exemplo, proteína da matriz 2). TCN032 é uma proteína da matriz 2 que direciona o anticorpo monoclonal.
[00323] Em algumas modalidades, a composição contendo o domínio Fc (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo) inclui um ou mais anticorpos de domínio único (sdAbs). Em algumas modalidades, a composição contendo o domínio Fc é um anticorpo ou fragmento de anticorpo incluindo um sdAb com reatividade para influenza A, tal como um sdAb que se liga a hemaglutinina de influenza A (por exemplo, SD36 ou SD38, descrito em Laursen et al. Science. 362:598-602 (2018)). Em algumas modalidades, a composição contendo o domínio Fc é um anticorpo ou fragmento de anticorpo incluindo um sdAb com reatividade para influenza B, tal como um sdAb que se liga a hemaglutinina de influenza B (por exemplo, SD83 ou SD84, descrito em Laursen et al. Science. 362:598-602 (2018)).
[00324] Em algumas modalidades, a composição contendo o domínio Fc é um anticorpo de múltiplos domínios (MDAb) ou fragmento de anticorpo de múltiplos domínios incluindo 2 ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais) sdAbs. Em algumas modalidades, o MDAb ou fragmento do mesmo inclui um ou mais sdABs que se ligam à hemaglutinina da influenza A e um ou mais sdAbs que se ligam à hemaglutinina da influenza B. Em algumas modalidades, o MDAb é JNJ-7445 (também conhecido como MD3606 ), que é descrito em Laursen et al. Science. 362:598-602 (2018). Em resumo, JNJ-7445 é um MDAb que inclui dois sdAbs que se ligam à hemaglutinina da influenza A (SD36 e SD38) e dois sdAbs que se ligam à hemaglutinina da influenza B (SD83 e SD84), que estão ligados a um domínio Fc (IgG1). Os sdAbs foram produzidos por meio da imunização de lhamas com vacina contra influenza e hemaglutinina recombinante H7 e H2.
[00325] Em outro aspecto, a invenção inclui um conjugado descrito por qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I) (por exemplo, qualquer uma das fórmulas (1), (2), (3), (4), (5), (D-I), (D-II), (D-II-1), (D-II-2), (D-II-3), (D-II-4), (D-II-5), (D-II-6), (D-II-7), (D-II-8), (D-II-9), (D- II-10), (D-III), (D-III-1), (D-III-2), (D-III-3), (D-III-4), (D-III-5), (D-III-6), (D-III-7), (D- III-8), (D-III-9), (D-IV), (D-IV-1), (D-IV-2), (D-V), (D-V-1), (D-V-2), (D-V-3), (D-V- 4), (D-V-5), (D-V-6), (D-V-7), (D-V-8), (D-V-9), (D-V-10), (D-VI), (D-VI-1), (D-VI- 2), (D-VI-3), (D-VI-4), (D-VI-5), (D-VI-6), (D-VI-7), (D-VI-8), (D-VI-9), (D-VII), (D- VIII), (D-VIII-1), (D-VIII-2), (D-VIII-3), (D-VIII-4), (D-VIII-5), (D-VIII-6), (D-VIII-7), (D-VIII-8), (D-VIII-9), (D-VIII-10), (D-VIII-11), (D-IX), (D-IX-1), (D-IX-2), (D-IX-3), (D-IX-4), (D-IX-5), (D-IX-6), (D-X), (D-X-1), (D-X-2), (D-X-3), (D’-I), (M-I), (M-II), (M-II-1), (M-II-2), (M-II-3), (M-II-4), (M-II-5), (M-II-6), (M-II-7), (M-II-8), (M-II-9), (M- II-10), (M-III), (M-III-1), (M-III-2), (M-III-3), (M-III-4), (M-III-5), (M-III-6), (M-III-7),
(M-III-8), (M-III-9), (M-IV), (M-IV-1), (M-IV-2), (M-V), (M-V-1), (M-V-2), (M-V-3), (M-V-4), (M-V-5), (M-V-6), (M-V-7), (M-V-8), (M-V-9), (M-V-10), (M-VI), (M-VI-1), (M-VI-2), (M-VI-3), (M-VI-4), (M-VI-5), (M-VI-6), (M-VI-7), (M-VI-8), (M-VI-9), (M- VII), (M-VIII), (M-VIII-1), (M-VIII-2), (M-VIII-3), (M-VIII-4), (M-VIII-5), (M-VIII-6), (M-VIII-7), (M-VIII-8), (M-VIII-9), (M-VIII-10), (M-VIII-11), (M-IX), (M-IX-1), (M-IX- 2), (M-IX-3), (M-IX-4), (M-IX-5), (M-IX-6), (M-X), (M-X-1), (M-X-2), (M-X-3), ou (M’-I)), onde E é um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em modalidades preferidas, onde E é um anticorpo ou fragmento de anticorpo, n é 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo inclui qualquer anticorpo ou fragmento de anticorpo aqui descrito, como um anticorpo monoclonal que se liga a hemaglutinina viral (por exemplo, CR6261, CR8020, MEDI8852, MHAA4549A ou VIS410); um anticorpo amplamente neutralizante ou fragmento de anticorpo direcionado à hemaglutinina viral (por exemplo, anticorpos ou fragmentos de anticorpos descritos em Wu et al., J. Mol. Biol. 429:2694–2709 (2017)); um sdAb direcionado à hemaglutinina viral (por exemplo, SD36, SD38, SD83 ou SD84); ou um MDAb ou fragmento do mesmo direcionado à hemaglutinina viral (por exemplo, JNJ-7445).
[00326] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
[00327] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 2.
[00328] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[00329] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
[00330] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.
[00331] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[00332] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.
[00333] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
[00334] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
[00335] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
[00336] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
[00337] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
[00338] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
[00339] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
[00340] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
[00341] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 16.
[00342] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
[00343] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
[00344] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
[00345] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.
[00346] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
[00347] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
[00348] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23.
[00349] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
[00350] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
[00351] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
[00352] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27.
[00353] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
[00354] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29.
[00355] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 30.
[00356] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31.
[00357] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
[00358] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33.
[00359] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
[00360] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35.
[00361] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36.
[00362] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.
[00363] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.
[00364] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39.
[00365] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.
[00366] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.
[00367] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.
[00368] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43.
[00369] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 45.
[00370] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46.
[00371] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47.
[00372] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48.
[00373] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49.
[00374] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[00375] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51.
[00376] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52.
[00377] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.
[00378] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54.
[00379] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55.
[00380] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.
[00381] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57.
[00382] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.
[00383] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 59.
[00384] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 60.
[00385] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61.
[00386] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62.
[00387] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63.
[00388] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64.
[00389] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65.
[00390] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
[00391] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 67.
[00392] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 68.
[00393] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69.
[00394] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 70.
[00395] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, E (por exemplo, cada E) inclui a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71. Em algumas modalidades, E inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 71.
[00396] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, em que E inclui um monômero de domínio Fc, o monômero de domínio Fc (por exemplo, o monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68) inclui uma mutação tripla correspondente a M252Y / S254T / T256E (YTE). Como utilizado neste documento, um aminoácido "correspondente a" um resíduo de aminoácido particular (por exemplo, de uma SEQ ID NO. Particular) deve ser entendido como incluindo qualquer resíduo de aminoácido que um versado na técnica entenderia para se alinhar ao resíduo (por exemplo, da sequência particular). Por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68 pode ser mutada para incluir uma mutação YTE.
[00397] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, em que E inclui um monômero de domínio Fc, o monômero de domínio Fc (por exemplo, o monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68) inclui um mutante duplo correspondente a M428L / N434S (LS). Como utilizado neste documento, um aminoácido "correspondente a" um resíduo de aminoácido particular (por exemplo, de uma SEQ ID NO. Particular) deve ser entendido como incluindo qualquer resíduo de aminoácido que um versado na técnica entenderia para se alinhar ao resíduo (por exemplo, da sequência particular). Por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68 pode ser mutada para incluir uma mutação LS.
[00398] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, em que E inclui um monômero de domínio Fc, o monômero de domínio Fc (por exemplo, o monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68) inclui um mutante correspondente a N434H. Como utilizado neste documento, um aminoácido "correspondente a" um resíduo de aminoácido particular (por exemplo, de uma SEQ ID NO. Particular) deve ser entendido como incluindo qualquer resíduo de aminoácido que um versado na técnica entenderia para se alinhar ao resíduo (por exemplo, da sequência particular). Por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68 pode ser mutada para incluir uma mutação N434H.
[00399] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, em que E inclui um monômero de domínio Fc, o monômero de domínio Fc (por exemplo, o monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68) inclui um mutante duplo correspondente a C220S. Como utilizado neste documento, um aminoácido "correspondente a" um resíduo de aminoácido particular (por exemplo, de uma SEQ ID NO. Particular) deve ser entendido como incluindo qualquer resíduo de aminoácido que um versado na técnica entenderia para se alinhar ao resíduo
(por exemplo, da sequência particular). Por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68 pode ser mutada para incluir uma mutação C220S.
[00400] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, em que E inclui um monômero de domínio Fc, o monômero de domínio Fc (por exemplo, o monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68) é um fragmento do monômero de domínio Fc (por exemplo, um fragmento de pelo menos 25 (por exemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 , 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou mais), pelo menos 50 (por exemplo, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 ou mais), pelo menos 75 (por exemplo , 75, 76, 77 , 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou mais) aminoácidos consecutivos de comprimento de SEQ ID NOs: 1-68.
[00401] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos descritos neste documento (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas(1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)), um ou mais átomos de nitrogênio de um ou mais resíduos de lisina expostos à superfície de E ou um ou mais átomos de enxofre de uma ou mais cisteínas expostas à superfície em E são covalentemente conjugados a um ligante (por exemplo, um ligante PEG2-PEG20 ). O ligante conjugado a E pode ser funcionalizado de modo que possa reagir para formar uma ligação covalente com o L de qualquer A 1-L ou qualquer A2-L-A1 descrito aqui. Em modalidades preferidas, E é conjugado a um ligante funcionalizado com um grupo azido e o L de A 1-L ou qualquer A2-L- A1 é funcionalizado com um grupo alquino. A conjugação (por exemplo, por química de clique) do ligante-azido de E e ligante-alquino de A1-L ou A2-L-A1 forma um conjugado da invenção, por exemplo, um conjugado descrito por qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I). Em ainda outras modalidades, E é conjugado a um ligante funcionalizado com um grupo alcino e L de qualquer A1-L ou de qualquer A2-L-A1 é funcionalizado com um grupo azido. A conjugação (por exemplo, por química de clique) do ligante- alcino de E e ligante-azido de A1-L ou A2-L-A1 forma um conjugado da invenção, por exemplo, um conjugado descrito pela fórmula (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M- I)-(M-X), ou (M’-I).
[00402] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, a linha ondulada de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M'-I) pode representar uma ligação covalente entre E e o L de A1-L ou A2-L-A1.
[00403] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, a linha ondulada de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I) pode representar que uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos de E (por exemplo, um ou mais átomos de nitrogênio de um ou mais resíduos de lisina expostos à superfície de E ou um ou mais átomos de enxofre de uma ou mais cisteínas expostas à superfície em E) foram conjugados a um ligante (por exemplo, um ligante PEG 2-PEG20 ) em que o ligante foi funcionalizado com uma fração reativa, de modo que a fração reativa forme uma ligação covalente com o L de qualquer A1-L ou qualquer A2-L-A1 aqui descrito (por exemplo, por química de clique entre um ligante funcionalizado com azido e um ligante funcionalizado com alquino, como descrito acima). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-I): (A-I).
[00404] Em modalidades preferidas, em que A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-I): R1 é -NHC(=NH)NH2, R4 é -CO2H, R5 é -COCH3, e/ou X é -O-. Em modalidades preferidas, A1 e/ou A2 têm a estrutura de zanamivir descrita por: .
[00405] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-II): (A-II).
[00406] Em modalidades preferidas, em que A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-II): R1 é -NHC(=NH)NH2, R2 é H ou F, R3 é H ou F, R4 é -CO2H, R5 é -COCH3, e/ou X é -O-. Em modalidades preferidas, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por: ou .
[00407] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-III):
(A-III).
[00408] Em modalidades preferidas, em que A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-III): R1 é -NHC(=NH)NH2, R4 é -CO2H, e/ou R5 é - COCH3. Em modalidades preferidas, A1 e/ou A2 têm a estrutura de peramivir descrita por: .
[00409] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-IV): (A-IV).
[00410] Em modalidades preferidas, em que A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-IV): R1 é -NHC(=NH)NH2, R4 é -CO2H, e/ou R5 é - COCH3. Em modalidades preferidas, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por: .
[00411] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-V): (A-V).
[00412] Em modalidades preferidas, em que A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-V): R1 é -NHC(=NH)NH2, R4 é -CO2H, e/ou R5 é - COCH3. Em modalidades preferidas, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por: .
[00413] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-VI): (A-VI).
[00414] Em modalidades preferidas, em que A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-VI): R1 é -NHC(=NH)NH2, R4 é -CO2H, R5 é -COCH3, e/ou X é -O-. Em modalidades preferidas, A1 e/ou A2 têm a estrutura de zanamivir descrita por: .
[00415] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-VII): (A-VII).
[00416] Em modalidades preferidas, em que A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-VII): R1 é -NHC(=NH)NH2, R2 é H ou F, R3 é H ou F, R4 é -CO2H, R5 é -COCH3, e/ou X é -O-. Em modalidades preferidas, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por: ou .
[00417] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-VIII):
(A-VIII).
[00418] Em modalidades preferidas, em que A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-VIII): R1 é -NHC(=NH)NH2, R5 é -COCH3, e/ou X é - O-. Em modalidades preferidas, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por: .
[00419] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-IX): (A-IX).
[00420] Em modalidades preferidas, em que A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-IX): R1 é -NHC(=NH)NH2, R2 é H ou F, R3 é H ou F, R5 é -COCH3, e/ou X é -O-. Em modalidades preferidas, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por:
ou .
[00421] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-X): (A-X).
[00422] Em modalidades preferidas, em que A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-X): R1 é -NHC(=NH)NH2, R3 é H, R5 é -COCH3, e/ou X é -O-. Em modalidades preferidas, A1 e/ou A2 têm a estrutura de sulfozanamivir descrita por: .
[00423] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-XI): (A-XI).
[00424] Em modalidades preferidas, em que A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-XI): R4 é -CO2H, e/ou R5 é -COCH3. Em modalidades preferidas, o alqueno é (E), (Z) ou uma mistura racêmica de (E)/(Z). Em modalidades preferidas, A1 e/ou A2 tem a estrutura de A-315675 (Abbott) descrita por: .
[00425] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos aqui descritos, A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-XII): (A-XII).
[00426] Em modalidades preferidas, em que A1 e/ou A2 têm a estrutura descrita por (A-XII): R4 é -CO2H. Em modalidades preferidas, A1 e/ou A2 tem a estrutura de A-315675 (Abbott) descrita por: .
[00427] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 1, ou qualquer regioisômero do mesmo, e a razão droga-anticorpo (DAR) (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1 , 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5 , 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5,
6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0.
Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00428] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 2, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1 , 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5 , 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00429] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 3, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1 , 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5 , 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00430] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 4, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1 , 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3,
3,4, 3,5 , 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00431] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 5, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1 , 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5 , 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00432] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 6, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1 , 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5 , 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00433] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 7, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T)
está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1 , 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5 , 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00434] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 8, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00435] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 9, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00436] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 10, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00437] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 11, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00438] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 12, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o
DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00439] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 13, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00440] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 14, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00441] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 15, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,
7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00442] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 16, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00443] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 17, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00444] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 18, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4,
3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00445] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 19, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00446] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 20, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00447] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 21, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T)
está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00448] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 22, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00449] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 23, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00450] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 24, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00451] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 25, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00452] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 26, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o
DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00453] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 27, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00454] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 28, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00455] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 29, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,
7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00456] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 30, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00457] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 31, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00458] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 32, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4,
3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00459] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 33, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00460] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 34, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00461] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 35, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T)
está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00462] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 36, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00463] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 37, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00464] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 38, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00465] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 39, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00466] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 40, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o
DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00467] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 41, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00468] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 42, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
[00469] Em algumas modalidades, o conjugado é o conjugado 43, ou qualquer regioisômero do mesmo, e o DAR (por exemplo, T) está entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,
7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 , 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Em algumas modalidades, o DAR está entre 0,5 e 2,0, entre 2,0 e 4,0, entre 4,0 e 6,0 entre 6,0 e 8,0 ou entre 8,0 e 10,0.
Definições
[00470] Para facilitar a compreensão desta invenção, vários termos são definidos abaixo. Os termos aqui definidos têm significados como comumente entendidos por uma pessoa versada comum nas áreas relevantes para a presente invenção. Termos como "um", "uma" e "o/a" não se destinam a referir-se apenas a uma entidade singular, mas incluem a classe geral da qual um exemplo específico pode ser usado para ilustração. A terminologia aqui é usada para descrever modalidades específicas da invenção, mas seu uso não delimita a invenção, exceto conforme descrito nas reivindicações.
[00471] O termo "inibidor da neuraminidase" ou ""inibidor da neuraminidase viral", como utilizado neste documento, refere-se a compostos que diminuem a atividade da enzima neuraminidase do vírus influenza (por exemplo, do vírus influenza A, B ou C). Um inibidor da neuraminidase pode ser identificado por métodos conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo, por redução da replicação viral em um ensaio de redução da placa viral da influenza, por exemplo, em concentrações menores que 20 μM (por exemplo, menos que 10 μM, 5 μM, 2 μM, 1 μM, 500 nM ou 100 nM). Os inibidores da neuraminidase viral conhecidos dos versados na técnica incluem zanamivir, sulfozanamivir, peramivir e A-315675 (Abbott) (ver, por exemplo, Hadházi et al.
A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity.
ChemMedChem Comm. 13:785-789 (2018) e caracterização in vitro de A- 315675, um inibidor altamente potente das cepas A e B das neuraminidases do vírus influenza e replicação do vírus influenza. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46(4):1014-1021 (2002)). Os inibidores da neuraminidase viral da invenção incluem zanamivir, sulfozanamivir, peramavir, A-315675 e análogos dos mesmos, tais como os inibidores da neuraminidase viral de fórmulas (A-I)-
(A-XII):
, , , ,
, (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V) , , , , (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) , , ; (A-X) (A-XI) (A-XII)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e
R6 é selecionado de , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
, , , , , e ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; e R8 é selecionado de C3- C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril..
[00472] O termo "inibe a atividade da neuraminidase", como utilizado neste documento, refere-se a um IC50 menor ou igual a 1.000 nM, por exemplo, conforme medido de acordo com o ensaio de inibição da neuraminidase no Exemplo 2 deste documento. Especificamente, o IC50 representa a concentração do inibidor da neuraminidase do vírus influenza que é necessária para 50% de inibição in vitro. Em alguns aspectos, um IC 50 menor ou igual a 100 nM ou menor ou igual a 10 nM de acordo com o ensaio de inibição da neuraminidase é indicativo de um composto que inibe a atividade da neuraminidase.
[00473] Por “infecção viral” entende-se o crescimento patogênico de um vírus (por exemplo, o vírus da gripe) em um organismo hospedeiro (por exemplo, um sujeito humano). Uma infecção viral pode ser qualquer situação na qual a presença de uma população(ões) viral(ais) é prejudicial ao corpo do hospedeiro. Assim, um sujeito está "sofrendo" de uma infecção viral quando uma quantidade excessiva de uma população viral está presente no corpo do sujeito ou quando a presença de uma população viral está danificando as células ou outro tecido do sujeito.
[00474] Como utilizado neste documento, o termo "monômero de domínio Fc" refere-se a uma cadeia polipeptídica que inclui pelo menos um domínio de dobradiça e um segundo e terceiro domínios constantes de anticorpo (CH2 e CH3) ou fragmentos funcionais dos mesmos (por exemplo,
fragmentos que são capazes de (i) dimerização com outro monômero de domínio Fc para formar um domínio Fc e (ii) ligação a um receptor Fc. O monômero de domínio Fc pode ser qualquer isótipo de anticorpo de imunoglobulina, incluindo IgG, IgE, IgM, IgA ou IgD (por exemplo, IgG). Além disso, o monômero de domínio Fc pode ser um subtipo IgG (por exemplo, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 ou IgG4) (por exemplo, IgG1). Um monômero de domínio Fc não inclui qualquer porção de uma imunoglobulina que seja capaz de atuar como uma região de reconhecimento de antígeno, por exemplo, um domínio variável ou uma região determinante de complementaridade (CDR). Monômeros de domínio Fc nos conjugados, conforme descrito neste documento, podem conter uma ou mais alterações de uma sequência de monômero de domínio Fc de tipo selvagem (por exemplo, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 substituições, adições ou deleções de aminoácidos) que alteram a interação entre um domínio Fc e um receptor Fc. Exemplos de mudanças adequadas são conhecidos na técnica. Em certas modalidades, um monômero de domínio Fc humano (por exemplo, uma cadeia pesada de IgG, como IgG1) compreende uma região que se estende de qualquer um de Asn208, Glu216, Asp221, Lys222 ou Cys226 até o terminal carboxil da cadeia pesada em Lys447. Lys447 C-terminal da região Fc pode ou não estar presente, sem afetar a estrutura ou estabilidade da região Fc. A menos que especificado de outra forma aqui, a numeração de resíduos de aminoácidos no monômero de domínio IgG ou Fc está de acordo com o sistema de numeração EU para anticorpos, também chamado de índice Kabat EU, conforme descrito, por exemplo, em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[00475] Como utilizado neste documento, o termo "domínio Fc" refere-se a um dímero de dois monômeros de domínio Fc que é capaz de se ligar a um receptor Fc. No domínio Fc de tipo selvagem, os dois monômeros de domínio Fc dimerizam pela interação entre os dois domínios constantes de anticorpo CH3, em algumas modalidades, uma ou mais ligações dissulfeto se formam entre os domínios de dobradiça dos dois monômeros de domínio Fc de dimerização.
[00476] O termo "ligado covalentemente" refere-se a duas partes de um conjugado que estão ligadas entre si por uma ligação covalente formada entre dois átomos nas duas partes do conjugado.
[00477] Como utilizado neste documento, o termo "peptídeo de ligação a Fc" refere-se a um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de 5 a 50 (por exemplo, 5 a 40, 5 a 30, 5 a 20, 5 a 15, 5 a 10, 10 a 50, 10 a 30 ou 10 a 20) resíduos de aminoácidos que têm afinidade e funções para se ligar a um domínio Fc, tal como qualquer um dos domínios Fc aqui descritos. Um peptídeo de ligação a Fc pode ser de diferentes origens, por exemplo, sintético, humano, camundongo ou rato. Os peptídeos de ligação a Fc da invenção incluem peptídeos de ligação a Fc que foram projetados para incluir um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro ou cinco) resíduos de cisteína ou lisina expostos a solvente, que podem fornecer um sítio para conjugação a um composto da invenção (por exemplo, conjugação a um monômero ou dímero inibidor da neuraminidase, incluindo por meio de um ligante). Mais preferencialmente, o peptídeo de ligação a Fc conterá uma única cisteína ou lisina exposta ao solvente, permitindo assim a conjugação específica de sítio de um composto da invenção. Os peptídeos de ligação a Fc podem incluir apenas resíduos de aminoácidos de ocorrência natural ou podem incluir um ou mais resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural. Quando incluído, um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural (por exemplo, a cadeia lateral de um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural) pode ser usado como o ponto de ligação para um composto da invenção (por exemplo, um monômero ou dímero inibidor de neuraminidase, incluindo por meio de um ligante). Os peptídeos de ligação a Fc da invenção podem ser lineares ou cíclicos. Os peptídeos de ligação a Fc da invenção incluem quaisquer peptídeos de ligação a Fc conhecidos por um versado na técnica.
[00478] Como utilizado neste documento, o termo "proteína de albumina" refere-se a um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos correspondente a uma proteína de albumina de ocorrência natural (por exemplo, albumina de soro humano) ou uma variante da mesma, tal como uma variante engenheirada de uma proteína de albumina de ocorrência natural.
Variantes de proteínas de albumina incluem polimorfismos, fragmentos como domínios e subdomínios e proteínas de fusão (por exemplo, uma proteína de albumina tendo uma fusão C-terminal ou N-terminal, como um ligante polipeptídico). De preferência, a proteína albumina tem a sequência de aminoácidos da albumina de soro humano (HSA) ou uma variante ou fragmento da mesma, mais preferencialmente uma variante funcional ou fragmento da mesma. Proteínas de albumina da invenção incluem proteínas com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71. As proteínas de albumina da invenção incluem proteínas de albumina que foram engenheiradas para incluir um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro ou cinco) resíduos de cisteína ou lisina expostos a solvente, que podem fornecer um sítio para conjugação a um composto da invenção (por exemplo, conjugação a um monômero ou dímero inibidor da neuraminidase, incluindo por meio de um ligante). Mais preferencialmente, a proteína de albumina conterá uma única cisteína ou lisina exposta ao solvente, permitindo assim a conjugação específica de sítio de um composto da invenção. As proteínas de albumina podem incluir apenas resíduos de aminoácidos de ocorrência natural ou podem incluir um ou mais resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural. Quando incluído, um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural (por exemplo, a cadeia lateral de um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural) pode ser usado como o ponto de ligação para um composto da invenção (por exemplo, um monômero ou dímero inibidor de neuraminidase, incluindo por meio de um ligante).
[00479] Como utilizado neste documento, "peptídeo de ligação à proteína de albumina" refere-se a um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de 5 a 50 (por exemplo, 5 a 40, 5 a 30, 5 a 20, 5 a 15, 5 a 10, 10 a 50, 10 a 30 ou 10 a 20) resíduos de aminoácidos que têm afinidade e funções para se ligar a uma proteína de albumina, tal como qualquer uma das proteínas de albumina aqui descritas. De preferência, o peptídeo de ligação à proteína albumina liga-se a uma albumina sérica de ocorrência natural, mais preferencialmente albumina sérica humana. Um peptídeo de ligação à proteína de albumina pode ser de diferentes origens, por exemplo, sintético, humano, camundongo ou rato. Os peptídeos de ligação de proteína de albumina da invenção incluem peptídeos de ligação de proteína de albumina que foram projetados para incluir um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro ou cinco) resíduos de cisteína ou lisina expostos a solvente, que podem fornecer um sítio para conjugação a um composto da invenção (por exemplo, conjugação a um monômero ou dímero inibidor da neuraminidase, incluindo por meio de um ligante). Mais preferencialmente, o peptídeo de ligação à proteína de albumina conterá uma única cisteína ou lisina exposta ao solvente, permitindo assim a conjugação específica de sítio de um composto da invenção. Peptídeos de ligação de proteína de albumina podem incluir apenas resíduos de aminoácidos de ocorrência natural ou podem incluir um ou mais resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural. Quando incluído, um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural (por exemplo, a cadeia lateral de um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural) pode ser usado como o ponto de ligação para um composto da invenção (por exemplo, um monômero ou dímero inibidor de neuraminidase, incluindo por meio de um ligante). Os peptídeos de ligação à proteína de albumina da invenção podem ser lineares ou cíclicos. O peptídeo de ligação à proteína de albumina da invenção inclui quaisquer peptídeos de ligação à proteína de albumina conhecidos por um versado na técnica, exemplos dos quais são fornecidos aqui. Outros exemplos de peptídeos de ligação à proteína de albumina são fornecidos no Pedido de Patente U.S 2005/0287153, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00480] Como utilizado neste documento, um "aminoácido exposto à superfície" ou "aminoácido exposto ao solvente", tal como uma cisteína exposta à superfície ou uma lisina exposta à superfície refere-se a um aminoácido que é acessível ao solvente que envolve a proteína. Um aminoácido exposto à superfície pode ser uma ocorrência natural ou uma variante engenheirada (por exemplo, uma substituição ou inserção) da proteína. Em algumas modalidades, um aminoácido exposto à superfície é um aminoácido que, quando substituído, não altera substancialmente a estrutura tridimensional da proteína.
[00481] Os termos "ligante", "L" e "L'", conforme usados neste documento, referem-se a uma ligação covalente ou conexão entre dois ou mais componentes em um conjugado (por exemplo, entre dois inibidores de neuraminidase em um conjugado aqui descrito, entre um inibidor da neuraminidase e um domínio Fc ou proteína de albumina em um conjugado aqui descrito, e entre um dímero de dois inibidores de neuraminidase e um domínio Fc ou uma proteína de albumina em um conjugado aqui descrito). Em algumas modalidades, um conjugado aqui descrito pode conter um ligante que tem uma estrutura trivalente (por exemplo, um ligante trivalente). Um ligante trivalente tem três braços, nos quais cada braço está covalentemente ligado a um componente do conjugado (por exemplo, um primeiro braço conjugado a um primeiro inibidor de neuraminidase, um segundo braço conjugado a um segundo inibidor de neuraminidase e um terceiro braço conjugado a um domínio Fc ou uma proteína de albumina).
[00482] As moléculas que podem ser usadas como ligantes incluem pelo menos dois grupos funcionais, que podem ser iguais ou diferentes,
por exemplo, dois grupos de ácido carboxílico, dois grupos de amina, dois grupos de ácido sulfônico, um grupo de ácido carboxílico e um grupo maleimida, um ácido carboxílico e um grupo alquino, um grupo ácido carboxílico e um grupo amina, um grupo ácido carboxílico e um grupo ácido sulfônico, um grupo amina e um grupo maleimida, um grupo amina e um grupo alquino, ou um grupo amina e um grupo ácido sulfônico.
O primeiro grupo funcional pode formar uma ligação covalente com um primeiro componente no conjugado e o segundo grupo funcional pode formar uma ligação covalente com o segundo componente no conjugado.
Em algumas modalidades de um ligante trivalente, dois braços de um ligante podem conter dois ácidos dicarboxílicos, nos quais o primeiro ácido carboxílico pode formar uma ligação covalente com o primeiro inibidor de neuraminidase no conjugado e o segundo ácido carboxílico pode formar uma ligação covalente com o segundo inibidor de neuraminidase no conjugado, e o terceiro braço do ligante pode para uma ligação covalente com um domínio Fc ou proteína de albumina no conjugado.
Exemplos de ácidos dicarboxílicos são descritos mais adiante neste documento.
Em algumas modalidades, uma molécula contendo um ou mais grupos maleimida pode ser usada como um ligante, em que o grupo maleimida pode formar uma ligação carbono-enxofre com uma cisteína em um componente (por exemplo, um domínio Fc ou uma proteína de albumina) no conjugado.
Em algumas modalidades, uma molécula contendo um ou mais grupos alquino pode ser usada como um ligante, em que o grupo alquino pode formar uma ligação 1,2,3-triazol com uma azida em um componente (por exemplo, um domínio Fc ou uma proteína de albumina) no conjugado.
Em algumas modalidades, uma molécula contendo um ou mais grupos azida pode ser usada como um ligante, em que o grupo azida pode formar uma ligação 1,2,3-triazol com um alquino em um componente (por exemplo, um domínio Fc ou uma proteína de albumina) no conjugado. Em algumas modalidades, uma molécula contendo um ou mais grupos bis-sulfona pode ser usada como um ligante, em que o grupo bis-sulfona pode formar uma ligação com um grupo amina um componente (por exemplo, um domínio Fc ou uma proteína de albumina) no conjugado. Em algumas modalidades, uma molécula contendo um ou mais grupos de ácido sulfônico pode ser usada como um ligante, em que o grupo de ácido sulfônico pode formar uma ligação de sulfonamida com um componente no conjugado. Em algumas modalidades, uma molécula contendo um ou mais grupos de isocianato pode ser usada como um ligante, em que o grupo de isocianato pode formar uma ligação de ureia com um componente no conjugado. Em algumas modalidades, uma molécula contendo um ou mais grupos haloalquil pode ser usada como um ligante, em que o grupo haloalquil pode formar uma ligação covalente, por exemplo, ligações C-N e C-O, com um componente no conjugado.
[00483] Em algumas modalidades, um ligante fornece espaço, rigidez e / ou flexibilidade entre os dois ou mais componentes. Em algumas modalidades, um ligante pode ser uma ligação, por exemplo, uma ligação covalente. O termo "ligação" se refere a uma ligação química, por exemplo, uma ligação amida, uma ligação dissulfeto, uma ligação C-O, uma ligação C-N, uma ligação N-N, uma ligação C-S ou qualquer tipo de ligação criada a partir de uma reação química, por exemplo, conjugação química. Em algumas modalidades, um ligante inclui não mais que 250 átomos. Em algumas modalidades, um ligante inclui não mais que 250 átomos que não sejam de hidrogênio. Em algumas modalidades, a espinha dorsal de um ligante inclui não mais que 250 átomos. A "espinha dorsal" de um ligante se refere aos átomos no ligante que juntos formam o caminho mais curto de uma parte de um conjugado para outra parte do conjugado (por exemplo, o caminho mais curto ligando um primeiro inibidor da neuraminidase e um segundo inibidor da neuraminidase). Os átomos na estrutura do ligante estão diretamente envolvidos na ligação de uma parte de um conjugado a outra parte do conjugado (por exemplo, ligando um primeiro inibidor da neuraminidase e um segundo inibidor da neuraminidase).
Por exemplo, átomos de hidrogênio ligados a carbonos na espinha dorsal do ligante não são considerados como diretamente envolvidos na ligação de uma parte do conjugado a outra parte do conjugado.
[00484] Em algumas modalidades, um ligante pode compreender um grupo sintético derivado de, por exemplo, um polímero sintético (por exemplo, um polímero de polietileno glicol (PEG)). Em algumas modalidades, um ligante pode compreender um ou mais resíduos de aminoácidos, como resíduos de aminoácidos D ou L. Em algumas modalidades, um ligante pode ser um resíduo de uma sequência de aminoácidos (por exemplo, uma sequência de aminoácidos de 1-25 aminoácidos, 1-10 aminoácidos, 1-9 aminoácidos, 1-8 aminoácidos, 1-7 aminoácidos, 1 -6 aminoácidos, 1-5 aminoácidos, 1-4 aminoácidos, 1-3 aminoácidos, 1-2 aminoácidos ou 1 aminoácido). Em algumas modalidades, um ligante pode compreender um ou mais, por exemplo, 1-100, 1-50, 1-25, 1-10, 1-5 ou 1-3, alquileno opcionalmente substituído, heteroalquileno opcionalmente substituído (por exemplo, uma unidade PEG), alquenileno opcionalmente substituído, heteroalquenileno opcionalmente substituído, alquinileno opcionalmente substituído, heteroalquinileno opcionalmente substituído, cicloalquileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, cicloalquenileno opcionalmente substituído, heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, cicloalquinileno opcionalmente substituído, heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído, heteroarileno opcionalmente substituído (por exemplo, piridina), O, S, NRi (Ri é H, alquil opcionalmente substituído, heteroalquil opcionalmente substituído, alquenil opcionalmente substituído, heteroalquenil opcionalmente substituído, alquinil opcionalmente substituído, heteroalquinil opcionalmente substituído, cicloalquil opcionalmente substituído, heterocicloalquil opcionalmente substituído, cicloalquenil opcionalmente substituído, heterocicloalquenil opcionalmente substituído,
cicloalquinil opcionalmente substituído, heterocicloalquinil opcionalmente substituído, aril ou heteroaril opcionalmente substituído), P, carbonil, tiocarbonil,
sulfonil, fosfato, fosforil ou imino.
Por exemplo, um ligante pode compreender um ou mais C1-C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno
(por exemplo, uma unidade PEG), opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído (por exemplo, C2 alquenileno), C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído,
C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído (por exemplo, C6 arileno), C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído (por exemplo, imidazol, piridina), O, S, NRi (Ri é H, C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído,
C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído), P, carbonil, tiocarbonil, sulfonil, fosfato,
fosforil ou imino.
[00485] Os termos "alquil", "alquenil" e "alquinil", conforme usados neste documento, incluem substituintes monovalentes de cadeia linear e de cadeia ramificada, bem como combinações dos mesmos, contendo apenas C e H quando não substituídos. Quando o grupo alquil inclui pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono ou ligação tripla carbono-carbono, o grupo alquil pode ser referido como um grupo "alquenil" ou "alquinil", respectivamente. A monovalência de um grupo alquil, alquenil ou alquinil não inclui os substituintes opcionais no grupo alquil, alquenil ou alquinil. Por exemplo, se um grupo alquil, alquenil ou alquinil está ligado a um composto, a monovalência do grupo alquil, alquenil ou alquinil refere-se à sua ligação ao composto e não inclui quaisquer substituintes adicionais que podem estar presentes no grupo alquil, alquenil ou alquinil. Em algumas modalidades, o grupo alquil ou heteroalquil pode conter, por exemplo, 1-20. 1-18, 1-16, 1-14, 1-12, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 ou 1-2 átomos de carbono (por exemplo, C1-C20, C1-C18, C1-C16, C1-C14, C1-C12, C1-C10, C1- C8, C1-C6, C1-C4, ou C1-C2). Em algumas modalidades, o grupo alquenil, heteroalquenil, alquinil ou heteroalquinil pode conter, por exemplo, 2-20, 2-18, 2- 16, 2-14, 2-12, 2-10, 2-8, 2-6, ou 2-4 átomos de carbono (por exemplo, C2-C20, C2-C18, C2-C16, C2-C14, C2-C12, C2-C10, C2-C8, C2-C6, ou C2-C4). Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, metil, etil, isobutil, sec-butil, terc- butil, 2-propenil e 3-butinil.
[00486] O termo "cicloalquil", como utilizado neste documento, representa um grupo alquil cíclico não aromático monovalente saturado ou insaturado. Um cicloalquil pode ter, por exemplo, três a vinte carbonos (por exemplo, um C3-C7, C3-C8, C3-C9, C3-C10, C3-C11, C3-C12, C3-C14, C3-C16, C3-C18 ou C3-C20 cicloalquil). Exemplos de cicloalquil incluem, mas não estão limitados a, ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, ciclohexil e ciclo-heptil. Quando o grupo cicloalquil inclui pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono, o grupo cicloalquil pode ser referido como um grupo
"cicloalquenil". Um cicloalquenil pode ter, por exemplo, quatro a vinte carbonos (por exemplo, um C4-C7, C4-C8, C4-C9, C4-C10, C4-C11, C4-C12, C4-C14, C4- C16, C4-C18 ou C4-C20 cicloalquenil). Grupos cicloalquenil exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, ciclopentenil, ciclo-hexenil e ciclo-heptenil.
Quando o grupo cicloalquil inclui pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono, o grupo cicloalquil pode ser referido como um grupo "cicloalquinil". Um cicloalquinil pode ter, por exemplo, oito a vinte carbonos (por exemplo, um C8- C9, C8-C10, C8-C11, C8-C12, C8-C14, C8-C16, C8-C18 ou C8-C20 cicloalquinil). O termo "cicloalquil" também inclui um composto cíclico com uma estrutura multicíclica em ponte na qual um ou mais carbonos ligam dois membros não adjacentes de um anel monocíclico, por exemplo, biciclo[2.2.1.]heptil e adamantano. O termo "cicloalquil" também inclui estruturas de anel fundido bicíclico, tricíclico e tetracíclico, por exemplo, decalina e compostos espiro- cíclicos.
[00487] O termo "aril", como utilizado neste documento, refere-se a qualquer sistema monocíclico ou de anel fundido bicíclico ou tricíclico que tem as características de aromaticidade em termos de distribuição de elétrons ao longo do sistema de anel, por exemplo, fenil, naftil ou fenantreno. Em algumas modalidades, um sistema de anel contém 5-15 átomos membros do anel ou 5-10 átomos membros do anel. Um grupo aril pode ter, por exemplo, cinco a quinze carbonos (por exemplo, um C5-C6, C5-C7, C5-C8, C5-C9, C5- C10, C5-C11, C5-C12, C5-C13, C5- C14 ou C5-C15 aril). O termo "heteroaril" também se refere a tais sistemas de anéis monocíclicos ou bicíclicos fundidos contendo um ou mais, por exemplo, 1-4, 1-3, 1, 2, 3 ou 4, heteroátomos selecionados de O, S e N. Um grupo heteroaril pode ter, por exemplo, dois a quinze carbonos (por exemplo, um C2-C3, C2-C4, C2-C5, C2-C6, C2-C7, C2- C8, C2-C9. C2-C10, C2-C11, C2-C12, C2-C13, C2-C14, ou C2-C15 heteroaril).
A inclusão de um heteroátomo permite a inclusão de anéis de 5 membros a serem considerados aromáticos, bem como anéis de 6 membros. Assim, sistemas heteroaril típicos incluem, por exemplo, piridil, pirimidil, indolil, benzimidazolil, benzotriazolil, isoquinolil, quinolil, benzotiazolil, benzofuranil, tienil, furil, pirrolil, tiazolil, oxazolil, isoxazolil, benzoxazolil, benzoisoxazolil e imzoidazolil. Como os tautômeros são possíveis, um grupo como o ftalimido também é considerado heteroaril. Em algumas modalidades, o grupo aril ou heteroaril é um sistema de anéis aromáticos de 5 ou 6 membros, opcionalmente contendo 1-2 átomos de nitrogênio. Em algumas modalidades, o grupo aril ou heteroaril é um fenil, piridil, indolil, pirimidil, piridazinil, benzotiazolil, benzimidazolil, pirazolil, imidazolil, isoxazolil, tiazolil ou imidazopiridinil opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, o grupo aril é fenil. Em algumas modalidades, um grupo aril pode ser opcionalmente substituído por um substituinte, tal como um substituinte aril, por exemplo, bifenil.
[00488] O termo "alcaril" refere-se a um grupo aril que está conectado a um grupo alquileno, alquenileno ou alquinileno. Em geral, se um composto está ligado a um grupo alcaril, a porção alquileno, alquenileno ou alquinileno do alcaril é ligada ao composto. Em algumas modalidades, um alcaril é C6-C35 alcaril (por exemplo, C6-C16, C6-C14, C6-C12, C6-C10, C6-C9, C6- C8, C7 ou C6 alcaril), em que o número de carbonos indica o número total de carbonos tanto na porção aril quanto na porção alquileno, alquenileno ou alquinileno do alcaril. Exemplos de alcaris incluem, mas não estão limitados a, (C1-C8)alquileno (C6-C12)aril, (C2-C8)alquenileno (C6-C12)aril, ou (C2- C8)alquinileno(C6-C12)aril. Em algumas modalidades, um alcaril é benzil ou fenetil. Em um heteroalcaril, um ou mais heteroátomos selecionados de N, O e S podem estar presentes na porção alquileno, alquenileno ou alquinileno do grupo alcaril e / ou podem estar presentes na porção aril do grupo alcaril. Em um alcaril opcionalmente substituído, o substituinte pode estar presente na porção alquileno, alquenileno ou alquinileno do grupo alcaril e / ou pode estar presente na porção aril do grupo alcaril.
[00489] O termo "amino", como utilizado neste documento, representa –N(Rx)2 ou –N+(Rx)3, onde cada Rx é, independentemente, H, alquil, alquenil, alquinil, aril, alcaril, cicloalquil ou dois Rx combinam para formar um heterocicloalquil. Em algumas modalidades, o grupo amino é -NH2.
[00490] O termo "alcamino", como utilizado neste documento, refere-se a um grupo amino, aqui descrito, que está ligado a um grupo alquileno (por exemplo, C1-C5 alquileno), alquenileno (por exemplo, C2-C5 alquenileno) ou alquinileno (por exemplo, C2-C5 alquenileno). Em geral, se um composto está ligado a um grupo alcamino, a porção alquileno, alquenileno ou alquinileno do alcamino é ligada ao composto. A porção amino de um alcamino refere-se a –N(Rx)2 ou –N+(Rx)3, onde cada Rx é, independentemente, H, alquil, alquenil, alquinil, aril, alcaril, cicloalquil ou dois Rx combinam para formar um heterocicloalquil. Em algumas modalidades, a porção amino de um alcamino é - NH2. Um exemplo de um grupo alcamino é C1-C5 alcamino, por exemplo, C2 alcamino (por exemplo, CH2CH2NH2 ou CH2CH2N(CH3)2). Em um grupo heteroalcamino, um ou mais, por exemplo, 1-4, 1-3, 1, 2, 3 ou 4, heteroátomos selecionados de N, O e S podem estar presentes na porção alquileno, alquenileno ou alquinileno do grupo heteroalcamino. Em algumas modalidades, um grupo alcamino pode ser opcionalmente substituído. Em um grupo alcamino substituído, o substituinte pode estar presente na porção alquileno, alquenileno ou alquinileno do grupo alcamino e / ou pode estar presente na porção amino do grupo alcamino.
[00491] O termo "alcamida", como utilizado neste documento, refere-se a um grupo amida que está ligado a um grupo alquileno (por exemplo, C1-C5 alquileno), alquenileno (por exemplo, C2-C5 alquenileno), ou alquinileno (por exemplo, C2-C5 alquenileno) . Em geral, se um composto está ligado a um grupo alcamida, a porção alquileno, alquenileno ou alquinileno da alcamida é ligada ao composto. A porção amida de uma alcamida se refere a –C(O)-N(Rx)2, onde cada Rx é, independentemente, H, alquil, alquenil, alquinil, aril, alcaril, cicloalquil ou dois Rx combinam para formar um heterocicloalquil. Em algumas modalidades, a porção amida de uma alcamida é -C(O)NH2. Um grupo alcamida pode ser -(CH2)2-C(O)NH2 ou -CH2-C(O)NH2. Em um grupo heteroalcamida, um ou mais, por exemplo, 1-4, 1-3, 1, 2, 3 ou 4, heteroátomos selecionados de N, O e S podem estar presentes na porção alquileno, alquenileno ou alquinileno do grupo heteroalcamida. Em algumas modalidades, um grupo alcamida pode ser opcionalmente substituído. Em um grupo alcamida substituído, o substituinte pode estar presente na porção alquileno, alquenileno ou alquinileno do grupo alcamida e / ou pode estar presente na porção amida do grupo alcamida.
[00492] Os termos "alquileno", "alquenileno" e "alquinileno", como utilizados neste documento, referem-se a grupos divalentes com um tamanho especificado. Em algumas modalidades, um alquileno pode conter, por exemplo, 1-20. 1-18, 1-16, 1-14, 1-12, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 ou 1-2 átomos de carbono (por exemplo, C1-C20, C1-C18, C1-C16, C1-C14, C1-C12, C1-C10, C1- C8, C1-C6, C1-C4, ou C1-C2). Em algumas modalidades, um alquenileno ou alquinileno pode conter, por exemplo, 2-20, 2-18, 2-16, 2-14, 2-12, 2-10, 2-8, 2- 6 átomos de carbono ou 2-4 átomos de carbono (por exemplo, C2-C20, C2-C18, C2-C16, C2-C14, C2-C12, C2-C10, C2-C8, C2-C6 ou C2-C4). Alquileno, alquenileno e / ou alquinileno inclui formas de cadeia linear e de cadeia ramificada, bem como combinações das mesmas. A divalência de um grupo alquileno, alquenileno ou alquinileno não inclui os substituintes opcionais no grupo alquileno, alquenileno ou alquinileno . Por exemplo, dois inibidores da neuraminidase podem ser ligados um ao outro por meio de um ligante que inclui alquileno, alquenileno e / ou alquinileno, ou combinações dos mesmos. Cada um dos grupos alquileno, alquenileno e / ou alquinileno no ligante é considerado divalente em relação às duas ligações em qualquer extremidade do grupo alquileno, alquenileno e / ou alquinileno. Por exemplo, se um ligante inclui - (alquileno opcionalmente substituído)-(alquenileno opcionalmente substituído)- (alquileno opcionalmente substituído)-, o alquenileno é considerado divalente em relação às suas ligações aos dois alquilenos nas extremidades do ligante. Os substituintes opcionais no alquenileno não estão incluídos na divalência do alquenileno. A natureza divalente de um grupo alquileno, alquenileno ou alquinileno (por exemplo, um grupo alquileno, alquenileno ou alquinileno em um ligante) refere-se a ambas as extremidades do grupo e não inclui substituintes opcionais que podem estar presentes em um grupo alquileno, alquenileno ou alquinileno. Por serem divalentes, eles podem ligar várias (por exemplo, duas) partes de um conjugado, por exemplo, um primeiro inibidor da neuraminidase e um segundo inibidor da neuraminidase. Os grupos alquileno, alquenileno e / ou alquinileno podem ser substituídos pelos grupos tipicamente adequados como substituintes para grupos alquil, alquenil e alquinil conforme estabelecido neste documento. Por exemplo, C=O é um C1 alquileno que é substituído por um oxo (=O). Por exemplo, -HCR-C≡C- pode ser considerado como um alquinileno opcionalmente substituído e é considerado um grupo divalente, embora tenha um substituinte opcional, R. Os grupos heteroalquileno, heteroalquenileno e / ou heteroalquinileno referem-se a grupos alquileno, alquenileno e / ou alquinileno incluindo um ou mais, por exemplo, 1-4, 1-3, 1, 2, 3, ou 4, heteroátomos, por exemplo, N, O e S. Por exemplo, um polímero de polietileno glicol (PEG) ou uma unidade de PEG -(CH2)2-O- em um polímero PEG é considerado um heteroalquileno contendo um ou mais átomos de oxigênio.
[00493] O termo "cicloalquileno", como utilizado neste documento, refere-se a um grupo cíclico divalente ligando duas partes de um composto. Por exemplo, um carbono dentro do grupo cicloalquileno pode estar ligado a uma parte do composto, enquanto outro carbono dentro do grupo cicloalquileno pode estar ligado a outra parte do composto. Um grupo cicloalquileno pode incluir grupos cíclicos não aromáticos saturados ou insaturados. Um cicloalquileno pode ter, por exemplo, três a vinte carbonos na porção cíclica do cicloalquileno (por exemplo, um C3-C7, C3-C8, C3-C9, C3- C10, C3-C11, C3-C12, C3-C14, C3-C16, C3-C18, ou C3-C20 cicloalquileno).
Quando o grupo cicloalquileno inclui pelo menos uma ligação dupla carbono- carbono, o grupo cicloalquileno pode ser referido como um grupo "cicloalquenileno". Um cicloalquenileno pode ter, por exemplo, quatro a vinte carbonos na porção cíclica do cicloalquenileno (por exemplo, um C4-C7, C4-C8, C4-C9. C4-C10, C4-C11, C4-C12, C4-C14, C4-C16, C4-C18 ou C4-C20 cicloalquenileno). Quando o grupo cicloalquileno inclui pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono, o grupo cicloalquileno pode ser referido como um grupo "cicloalquinileno". Um cicloalquinileno pode ter, por exemplo, quatro a vinte carbonos na porção cíclica do cicloalquinileno (por exemplo, um C4-C7, C4-C8, C4-C9. C4-C10, C4-C11, C4-C12, C4-C14, C4-C16, C4-C18, ou C8-C20 cicloalquinileno). Um grupo cicloalquileno pode ser substituído pelos grupos tipicamente adequados como substituintes para grupos alquil, alquenil e alquinil conforme estabelecido aqui. Heterocicloalquileno refere-se a um grupo cicloalquileno incluindo um ou mais, por exemplo, 1-4, 1-3, 1, 2, 3 ou 4, heteroátomos, por exemplo, N, O e S. Exemplos de cicloalquilenos incluem, mas não estão limitados a, ciclopropileno e ciclobutileno. Um tetra-hidrofurano pode ser considerado um heterocicloalquileno.
[00494] O termo "arileno", como utilizado neste documento, refere-se a um grupo aril multivalente (por exemplo, divalente ou trivalente) que liga várias (por exemplo, duas ou três) partes de um composto. Por exemplo, um carbono dentro do grupo arileno pode estar ligado a uma parte do composto, enquanto outro carbono dentro do grupo arileno pode estar ligado a outra parte do composto. Um arileno pode ter, por exemplo, cinco a quinze carbonos na porção aril do arileno (por exemplo, um C5-C6, C5-C7, C5-C8, C5-C9. C5-C10,
C5-C11, C5-C12, C5-C13, C5-C14, ou C5-C15 arileno). Um grupo arileno pode ser substituído pelos grupos tipicamente adequados como substituintes para grupos alquil, alquenil e alquinil conforme estabelecido aqui. Heteroarileno refere-se a um grupo aromático incluindo um ou mais, por exemplo, 1-4, 1-3, 1, 2, 3 ou 4, heteroátomos, por exemplo, N, O e S. Um grupo heteroarileno pode ter, por exemplo, dois a quinze carbonos (por exemplo, um C2-C3, C2-C4, C2- C5, C2-C6, C2-C7, C2-C8, C2-C9. C2-C10, C2-C11, C2-C12, C2-C13, C2-C14, ou C2-C15 heteroarileno).
[00495] O termo "opcionalmente substituído", como utilizado neste documento, refere-se a ter 0, 1 ou mais substituintes, tais como 0-25, 0- 20, 0-10 ou 0-5 substituintes. Os substituintes incluem, mas não estão limitados a, alquil, alquenil, alquinil, aril, alcaril, acil, heteroaril, heteroalquil, heteroalquenil, heteroalquinil, heteroalcaril, halogênio, oxo, ciano, nitro, amino, alcamino, hidroxi, alcoxi, alcanoil, carbonil, carbamoil, guanidinil, ureido, amidinil, qualquer um dos grupos ou frações descritos acima, e versões hetero de qualquer um dos grupos ou frações descritos acima. Os substituintes incluem, mas não estão limitados a, F, Cl, metil, fenil, benzil,OR, NR2, SR, SOR, SO2R, OCOR, NRCOR, NRCONR2, NRCOOR, OCONR2, RCO, COOR, alkyl-OOCR, SO3R, CONR2, SO2NR2, NRSO2NR2, CN, CF3, OCF3, SiR3, e NO2, em que cada R é, independentemente, H, alquil, alquenil, aril, heteroalquil, heteroalquenil ou heteroaril, e em que dois dos substituintes opcionais no mesmo ou adjacentes átomos podem ser unidos para formar um anel aromático ou não aromático, saturado ou insaturado fundido, opcionalmente substituído, que contém 3-8 membros, ou dois dos substituintes opcionais no mesmo átomo podem ser unidos para formar um anelaromático ou não aromático opcionalmente substituído, saturado ou insaturado que contém 3–8 membros.
[00496] Um grupo ou fração opcionalmente substituído refere-se a um grupo ou fração (por exemplo, qualquer um dos grupos ou frações descritos acima) em que um dos átomos (por exemplo, um átomo de hidrogênio) é opcionalmente substituído por outro substituinte. Por exemplo, um alquil opcionalmente substituído pode ser um metil opcionalmente substituído, no qual um átomo de hidrogênio do grupo metil é substituído por, por exemplo, OH.
Como outro exemplo, um substituinte em um heteroalquil ou sua contraparte divalente, heteroalquileno, pode substituir um hidrogênio em um carbono ou um hidrogênio em um heteroátomo, tal como N. Por exemplo, o átomo de hidrogênio no grupo -R-NH-R- pode ser substituído por um substituinte alcamida, por exemplo, -R-N[(CH2C(O)N(CH3)2]-R.
[00497] Geralmente, um substituinte opcional é um substituinte não interferente. Um "substituinte não interferente" refere-se a um substituinte que deixa a capacidade dos conjugados aqui descritos (por exemplo, conjugados de qualquer uma das fórmulas(1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) para se ligar à neuraminidase viral ou para inibir a proliferação do vírus da influenza. Assim, em algumas modalidades, o substituinte pode alterar o grau de tal atividade. No entanto, desde que o conjugado retenha a capacidade de se ligar à neuraminidase viral ou de inibir a proliferação viral, o substituinte será classificado como "não interferente". Por exemplo, o substituinte não interferente deixaria a capacidade do composto de fornecer eficácia antiviral com base em um valor de IC50 de 10 μM ou menos em um ensaio de redução de placa viral, como no Exemplo 2 com base em um valor de IC50 contra neuraminidase do vírus influenza inferior de 500 nM. Assim, o substituinte pode alterar o grau de inibição com base na redução da placa ou na inibição da neuraminidase do vírus da influenza. No entanto, desde que os compostos aqui, tais como compostos de fórmulas (A-I), (A-II), (A-III), (A-IV), (A-V), (A-VI), (A-VII), (A-VIII), (A-IX), (A- X), (A-XI), e (A-XII) retenham a capacidade de inibir a atividade da neuraminidase do vírus da influenza, o substituinte será classificado como "não interferente". Uma série de ensaios para determinar a redução da placa viral ou a capacidade de qualquer composto para inibir a neuraminidase do vírus influenza estão disponíveis na técnica, e alguns são exemplificados nos Exemplos abaixo.
[00498] O termo "hetero", quando usado para descrever um grupo químico ou fração, refere-se a ter pelo menos um heteroátomo que não é um carbono ou um hidrogênio, por exemplo, N, O e S. Qualquer um dos grupos ou frações descritos acima pode ser referido como hetero se contiver pelo menos um heteroátomo. Por exemplo, um grupo heterocicloalquil, heterocicloalquenil ou heterocicloalquinil refere-se a um grupo cicloalquil, cicloalquenil ou cicloalquinil que tem um ou mais heteroátomos independentemente selecionados de, por exemplo, N, O e S. Um exemplo de um grupo heterocicloalquenil é um maleimido. Por exemplo, um grupo heteroaril se refere a um grupo aromático que tem um ou mais heteroátomos independentemente selecionados de, por exemplo, N, O e S. Um ou mais heteroátomos também podem ser incluídos em um substituinte que substituiu um átomo de hidrogênio em um grupo ou fração como aqui descrito. Por exemplo, em um grupo heteroaril opcionalmente substituído, se um dos átomos de hidrogênio no grupo heteroaril for substituído por um substituinte (por exemplo, metil), o substituinte também pode conter um ou mais heteroátomos (por exemplo, metanol).
[00499] O termo "acil", como utilizado neste documento, refere-se a um grupo com a estrutura: , em que Rz é um alquil, alquenil, alquinil, cicloalquil, cicloalquenil, cicloalquinil, aril, alcaril, alcamino, heteroalquil, heteroalquenil, heteroalquinil, heterocicloalquil opcionalmente substituído, heterocicloalquenil, heterocicloalquinil, heteroaril, heteroalcaril ou heteroalcamino.
[00500] O termo "halo" ou "halogênio", como utilizado neste documento, refere-se a qualquer átomo de halogênio, por exemplo, F, Cl, Br ou
I. Qualquer um dos grupos ou frações aqui descritos pode ser referido como uma "fração halo" se contiver pelo menos um átomo de halogênio, como haloalquil.
[00501] O termo "hidroxil", como utilizado neste documento, representa um grupo -OH.
[00502] O termo "oxo", como utilizado neste documento, refere-se a um substituinte com a estrutura = O, onde há uma ligação dupla entre um átomo e um átomo de oxigênio.
[00503] O termo "carbonil", como utilizado neste documento, refere-se a um grupo com a estrutura: .
[00504] O termo "tiocarbonil", como utilizado neste documento, refere-se a um grupo com a estrutura:
[00505] O termo "fosfato", como utilizado neste documento, representa o grupo com a estrutura: .
[00506] O termo "fosforil", como utilizado neste documento, representa o grupo com a estrutura: ou .
[00507] O termo "sulfonil", como utilizado neste documento, representa o grupo com a estrutura: .
[00508] O termo "imino", como utilizado neste documento, representa o grupo com a estrutura: , em que R é um substituinte opcional.
[00509] O termo "grupoN-protetor", como utilizado neste documento, representa aqueles grupos destinados a proteger um grupo amino contra reações indesejáveis durante os procedimentos sintéticos. Os grupos
Nprotetores comumente usados são divulgados em Greene, “Protective Groups in Organic Synthesis,” 5th Edition (John Wiley & Sons, New York, 2014), que é aqui incorporado por referência. Os grupos N-protetores incluem, por exemplo, grupos acil, ariloil e carbamil, tais como formil, acetil, propionil, pivaloil, t- butilacetil, 2-cloroacetil, 2-bromoacetil, trifluoroacetil, tricloroacetil, ftalil, o- nitrofenoxiacetil, α-clorobutiril, benzoil, carboxibenzil (CBz), 4-clorobenzoil, 4- bromobenzoil, 4-nitrobenzoil e auxiliares quirais, tais como D, L ou D protegido ou desprotegido, L-resíduos de aminoácido, tais como alanina, leucina, fenilalanina; grupos contendo sulfonil tais como benzenossulfonil e p- toluenossulfonil; grupos formadores de carbamato, tais como benziloxicarbonil, p-clorobenziloxicarbonil, p-metoxibenziloxicarbonil, p-nitrobenziloxicarbonil, 2- nitrobenziloxicarbonil, p-bromobenziloxicarbonil, 3,4-dimetoxibenziloxicarbonil, 3,5-dimetoxibenziloxicarbonil, 2,4-dimetoxibenziloxicarbonil, 4- metoxibenziloxicarbonil, 2-nitro-4,5-dimetoxibenziloxicarbonil, 3,4,5- trimetoxibenziloxicarbonil, 1-(p-bifenilil)-1-metiletoxicarbonil, α,α-dimetil-3,5- dimetoxibenziloxicarbonilo, benzidriloxi carbonil, t-butiloxicarbonil (BOC), di- isopropilmetoxicarbonil, isopropiloxicarbonil, etoxicarbonil, metoxicarbonil, aliloxicarbonil, 2,2,2-tricloroetoxicarbonil, fenoxicarbonil, 4-nitrofenoxi carbonil, fluorenil-9-metoxicarbonil (Fmoc), ciclopentiloxicarbonil, adamantiloxicarbonil, ciclo-hexiloxicarbonil e feniltiocarbonil; grupos alcaril, tais como benzil, trifenilmetil e benziloximetil; e grupos silil, tais como trimetilsilil.
[00510] O termo "aminoácido", como utilizado neste documento, significa aminoácidos de ocorrência natural e aminoácidos de ocorrência não natural.
[00511] O termo "aminoácidos de ocorrência natural", como utilizado neste documento, significa aminoácidos incluindo Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr , Trp, Tyr e Val.
[00512] O termo "aminoácido de ocorrência não natural",
como utilizado neste documento, significa um alfa aminoácido que não é produzido naturalmente ou encontrado em um mamífero.
Exemplos de aminoácidos de ocorrência não natural incluem D-aminoácidos; um aminoácido possuindo um grupo acetilaminometil ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína; um aminoácido peguilado; os aminoácidos ômega da fórmula
NH2(CH2)nCOOH onde n é aminoácidos 2-6 neutros não polares, tais como sarcosina, t-butil alanina, t-butil glicina, N-metil isoleucina e norleucina;
oximetionina; fenilglicina; citrulina; sulfóxido de metionina; ácido cisteico;
ornitina; ácido diaminobutírico; 3-aminoalanina; 3-hidroxi-D-prolina; ácido 2,4-
diaminobutírico; ácido 2-aminopentanoico; ácido 2-amino-octanoico, 2-
carboxipiperazina; ácido piperazina-2-carboxílico, ácido 2-amino-4-
fenilbutanoico; 3-(2-naftil)alanina e hidroxiprolina.
Outros aminoácidos são ácido α-aminobutírico, α-amino-α-metilbutirato, aminociclopropano-carboxilato, ácido aminoisobutírico, aminonorbornil-carboxilato, L-ciclo-hexilalanina,
ciclopentilalanina, L-N-metilleucina, L-N-metilmetionina, L-N-metilnorvalina, L-N-
metilfenilalanina, L-N-metilprolina, L-N-metilserina, L-N-metiltriptofano, D-
ornitina, L-N-metiletilglicina, L-norleucina, α-metil-aminoisobutirato, α-metilciclo-
hexilalanina, D-α-metilalanina, D-α-metilarginina, D-α-metilasparagina, D-α-
metilaspartato, D-α-metilcisteína, D-α-metilglutamina, D-α-metil-histidina, D-α-
metilisoleucina, D-α-metilleucina, D-α-metilisina, D-α-metilmetionina, D-α-
metilornitina, D-α-metilfenilalanina, D-α-metilprolina, D-α-metilserina, D-N-
metilserina, D-α-metiltreonina, D-α-metiltriptofano, D-α-metiltirosina, D-α-
metilvalina, D-N-metilalanina, D-N-metilarginina, D-N-metilasparagina, D-N-
metilaspartato, D-N-metilcisteína, D-N-metilglutamina, D-N-metilglutamato, D-N-
metil-histidina, D-N-metilisoleucina, D-N-metilleucina, D-N-metilisina, N-
metilciclo-hexilalanina, D-N-metilornitina, N-metilglicina, N- metilaminoisobutirato, N-(1-metilpropil)glicina, N-(2-metilpropil)glicina, D-N-
metiltriptofano, D-N-metiltirosina, D-N-metilvalina, ácido γ-aminobutírico, L-t-
butilglicina, L-etilglicina, L-homofenilalanina, L-α-metilarginina, L-α-
metilaspartato, L-α-metilcisteína, L-α-metilglutamina, L-α-metilhistidina, L-α-
metilisoleucina, L-α-metilleucina, L-α-metilmetionina, L-α-metilnorvalina, L-α-
metilfenilalanina, L-α-metilserina, L-α-metiltriptofano, L-α-metilvalina, N-(N-(2,2-
difeniletil)carbamilmetilglicina, 1-carboxi-1-(2,2-difenil-etilamino)ciclopropano, 4-
hidroxiprolina, ornitina, 2-aminobenzoil (antraniloil), D-ciclo-hexilalanina, 4-fenil-
fenilalanina, L-citrulina, α-ciclo-hexilglicina, ácido L-1,2,3,4-tetra-
hidroisoquinolina-3-carboxílico, ácido L-tiazolidina-4-carboxílico, L-homotirosina,
L-2-furilalanina, L-histidina (3-metil), N-(3-guanidinopropil)glicina, O-metil-L-
tirosina, O-glicano-serina, meta-tirosina, nor-tirosina, L-N,N′,N″-trimetilisina,
homolisina, norlisina, N-glicano asparagina, 7-hidroxi-1,2,3,4-tetra-hidro-4-
fluorofenilalanina, 4-metilfenilalanina, bis-(2-picolil)amina,
pentafluorofenilalanina, ácido indolina-2-carboxílico, ácido 2-aminobenzoico,
ácido 3-amino-2-naftoico, dimetilarginina assimétrica, ácido L-tetra-
hidroisoquinolina-1-carboxílico, ácido D-tetra-hidroisoquinolina-1-carboxílico,
ácido 1-amino-ciclo-hexano acético, D/L-alilglicina, ácido 4-aminobenzoico,
ácido 1-amino-ciclobutano carboxílico, ácido 2 ou 3 ou 4-aminociclo-hexano carboxílico, ácido 1-amino-1-ciclopentano carboxílico, ácido 1-aminoindano-1-
carboxílico, ácido 4-amino-pirrolidina-2-carboxílico, ácido 2-aminotetralina-2-
carboxílico, ácido azetidina-3-carboxílico, ácido 4-benzil-pirrolidina-2-carboxílico,
terc-butilglicina , b- (benzotiazolil-2-il)-alanina, b-ciclopropil alanina, ácido 5,5-
dimetil-1,3-tiazolidina-4-carboxílico, ácido (2R,4S)4-hidroxipiperidina-2-
carboxílico, ácido (2S, 4S) e (2S, 4R)-4-(2-naftilmetoxi)-pirolidina-2-carboxílico,
ácido (2S, 4S) e (2S, 4R)4-fenoxi-pirrolidina-2-carboxílico, ácido (2R, 5S) e (2S,
5R)-5-fenil-pirrolidina-2-carboxílico, ácido (2S,4S)-4-amino-1-benzoil-pirrolidina-
2-carboxílico, t-butilalanina, ácido (2S, 5R)-5-fenil-pirrolidina-2-carboxílico, ácido 1-aminometil-ciclo-hexano-acético, ácido 3,5-bis-(2-amino)etoxi-benzoico, ácido
3,5-diamino-benzoico, ácido 2-metilamino-benzoico, ácido N-metilantranílico, L-
N-metilalanina, L-N-metilarginina, L-N-metilasparagina, ácido L-N-
metilaspártico, L-N-metilcisteína, L-N-metilglutamina, ácido L-N-metilglutâmico,
L-N-metilhistidina, L-N-metilisoleucina, L-N-metilisina, L-N-metilnorleucina, L-N-
metiltreonitina, L-N-metilornitina, L-N-metiltirosina, L-N-metilvalina, L-N-metil-t-
butilglicina, L-norvalina, α-metil-γ-aminobutirato, 4,4′-bifenilalanina, α-
metilcilcopentilalanina, α-metil-α-naftilalanina, α-metilpenicilamina , N-(4-
aminobutil)glicina, N-(2-aminoetil)glicina, N-(3-aminopropil)glicina, N-amino-α-
metilbutirato, α-naftilalanina, N-benzilglicina, N-(2-carbamiletil)glicina, N-
(carbamilmetil)glicina, N-(2-carboxietil)glicina, N-(carboximetil)glicina, N-
ciclobutilglicina, N-ciclodecilglicina, N-ciclo-heptilglicina, N-ciclo-hexilglicina, N-
ciclodecilglicina, N-cilcododecilglicina, N-ciclo-octilglicina, N-ciclopropilglicina, N-
cicloundecilglicina, N-(2,2-difeniletil)glicina, N-(3,3-difenilpropil)glicina, N-(3-
guanidinopropil)glicina, N-(1-hidroxietil)glicina, N-(hidroxietil))glicina, N-
(imidazoliletil))glicina, N-(3-indolietil)glicina, N-metil-γ-aminobutirato, D-N-
metilmetionina, N-metilciclopentilalanina, D-N-metilfenilalanina, D-N-
metilprolina, D-N-metiltreonina, N-(1-metiletil)glicina, N-metil-naftilalanina, N-
metilpenicilamina, N-(p-hidroxifenil)glicina, N-(tiometil)glicina, penicilamina, L-α-
metilalanina, L-α-metilasparagina, L-α-metil-t-butilglicina, L-metiletilglicina, L-α-
metilglutamato, L-α-metil-homofenilalanina, N-(2-metiltioetil)glicina, L-α-
metilisina, L-α-metilnorleucina, L-α-metilornitina, L-α-metilprolina, L-α-
metiltreonina, L-α-metiltirosina, L-N-metil-homofenilalanina, N-(N-(3,3-
difenilpropil)carbamilmetilglicina, ácido L-piroglutâmico, ácido D-piroglutâmico,
O-metil-L-serina, O-metil-L-homoserina, 5-hidroxilisina, α-carboxiglutamato,
fenilglicina, ácido L-pipecólico (homoprolina), L-homoleucina, L-lisina (dimetil), L-
2-naftilalanina, L-dimetildopa ou L-dimetoxi-fenilalanina, L-3-piridilalanina, L-
histidina (benzoiloximetil), N-ciclo-heptilglicina, L-difenilalanina, O-metil-L- homotirosina, L-β-homolisina, O-glicano-treoína , Orto-tirosina, L-N,N′-
dimetilisina, L-homoarginina, neotriptofano, 3-benzotienilalanina, ácido isoquinolina-3-carboxílico, ácido diaminopropiônico, homocisteína, 3,4- dimetoxifenilalanina, 4-clorofenilalanina, ácido L-1,2,3,4-tetra-hidronorharman-3- carboxílico, adamantilalanina, dimetilarginina simétrica, 3-carboxitiomorfolina, ácido D-1,2,3,4-tetra-hidronorharman-3-carboxílico, ácido 3-aminobenzoico, 3- amino-1-carboximetil-piridin-2-ona, ácido 1-amino-1-ciclo-hexano carboxílico, ácido 2-aminociclopentano carboxílico, ácido 1-amino-1-ciclopropano carboxílico, ácido 2-aminoindano-2-carboxílico, ácido 4-amino-tetra- hidrotiopirano-4-carboxílico, ácido azetidina-2-carboxílico, b-(benzotiazol-2-il)- alanina, neopentilglicina, 2-carboximetil piperidina, b-ciclobutil alanina, alilglicina, ácido diaminopropiônico, homo-ciclohexil alanina, (2S,4R)- 4-hidroxiperidina-2- carboxílico, ácido octa-hidroindol-2-carboxílico, (2S,4R) e (2S,4R)-4-(2-naftil), ácido pirrolidina-2-carboxílico, ácido nipecótico, ácido (2S,4R) e (2S 4S)-4-(4- fenilbenzil)pirrolidina-2-carboxílico, ácido (3S)-1-pirrolidina-3-carboxílico, ácido (2S, 4S)-4-tritilmercapto-pirrolidina-2-carboxílico, ácido (2S,4S)-4- mercaptoprolina, t-butilglicina, N,N-bis(3-aminopropil)glicina, ácido 1-amino- ciclo-hexano-1-carboxílico, N-mercaptoetilglicina, e selenocisteína. Em algumas modalidades, os resíduos de aminoácidos podem ser carregados ou polares. Os aminoácidos carregados incluem alanina, lisina, ácido aspártico ou ácido glutâmico ou análogos de ocorrência não natural. Os aminoácidos polares incluem glutamina, asparagina, histidina, serina, treonina, tirosina, metionina ou triptofano, ou análogos de ocorrência não natural dos mesmos. É especificamente contemplado que em algumas modalidades, um grupo amino terminal no aminoácido pode ser um grupo amido ou um grupo carbamato.
[00513] Como utilizado neste documento, o termo "porcentagem (%) de identidade" se refere à porcentagem de resíduos de aminoácidos de uma sequência candidata, por exemplo, um Fc-IgG, ou fragmento do mesmo, que são idênticos aos resíduos de aminoácidos de uma sequência de referência após alinhar as sequências e introduzir folgas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade (ou seja, folgas podem ser introduzidas em uma ou ambas as sequências candidatas e de referência para alinhamento ideal e sequências não homólogas podem ser desconsideradas para fins de comparação). O alinhamento para fins de determinação de percentual de identidade pode ser obtido de várias maneiras que estão com os versados na técnica, por exemplo, usando softwares de computador disponíveis publicamente como software BLAST, ALIGN, ou Megalign (DNASTAR) Os versados na técnica podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas. Em algumas modalidades, a porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos de uma determinada sequência candidata a, com ou contra uma determinada sequência de referência (que pode, alternativamente, ser expressa como uma dada sequência candidata que tem ou inclui uma certa identidade de sequência de aminoácidos percentual para, com, ou contra uma determinada sequência de referência) é calculado da seguinte forma: 100 x (fração de A/B); onde A é o número de resíduos de aminoácidos classificados como idênticos no alinhamento da sequência candidata e da sequência de referência, e onde B é o número total de resíduos de aminoácidos na sequência de referência. Em algumas modalidades em que o comprimento da sequência candidata não é igual ao comprimento da sequência de referência, a porcentagem de identidade da sequência de aminoácidos da sequência candidata com a sequência de referência não seria igual à porcentagem de identidade da sequência de aminoácidos da sequência de referência para a sequência candidata.
[00514] Duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas são ditas "idênticas" se a sequência de nucleotídeos ou aminoácidos nas duas sequências for a mesma quando alinhada para correspondência máxima, conforme descrito acima. As comparações entre duas sequências são normalmente realizadas comparando as sequências em uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação", como utilizado neste documento, refere-se a um segmento de pelo menos cerca de 15 posições contíguas, cerca de 20 posições contíguas, cerca de 25 posições contíguas ou mais (por exemplo, cerca de 30 a cerca de 75 posições contíguas, ou cerca de 40 a cerca de 50 posições contíguas), em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências estarem alinhadas de forma otimizada.
[00515] O termo "tratando" ou "tratar", como utilizado neste documento, refere-se a um tratamento terapêutico de uma infecção viral (por exemplo, uma infecção viral como uma infecção por influenza) em um sujeito.
Em algumas modalidades, um tratamento terapêutico pode retardar a progressão da infecção viral, melhorar o resultado do sujeito e / ou eliminar a infecção. Em algumas modalidades, um tratamento terapêutico de uma infecção viral em um sujeito pode, de forma alternativa, ou melhorar um ou mais sintomas ou condições associadas à infecção viral, diminuir a extensão da infecção viral, estabilizar (ou seja, não piorar) o estado da infecção viral, prevenir a propagação da infecção viral e / ou atrasar ou retardar o progresso da infecção viral, como comparar o estado e / ou a condição da infecção viral na ausência do tratamento terapêutico.
[00516] O termo "valor médio de T", como utilizado neste documento, refere-se ao número médio de monômeros de inibidor de neuraminidase ou dímeros de inibidores de neuramindase conjugados a um domínio Fc ou uma proteína de albumina dentro de uma população de conjugados. Em algumas modalidades, dentro de uma população de conjugados, o número médio de monômeros de inibidor de neuraminidase ou dímeros de inibidores de neuramindase conjugados a um monômero de domínio Fc pode ser de 1 a 20 (por exemplo, o valor médio de T é de 1 a 2, 1 a 3, 1 a 4, 1 a 5, 5 a 10, 10 a 15 ou 15 a 20). Em algumas modalidades, o valor médio de T é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 .
[00517] O termo "sujeito", como utilizado neste documento, pode ser um ser humano, primata não humano ou outro mamífero, tal como, mas não se limitando a, cão, gato, cavalo, vaca, porco, peru, cabra, peixe, macaco, galinha, rato, camundongo e ovelha.
[00518] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", como utilizado neste documento, refere-se a uma quantidade, por exemplo, dose farmacêutica, eficaz na indução de um efeito desejado em um sujeito ou no tratamento de um sujeito com uma condição ou distúrbio aqui descrito (por exemplo, uma infecção viral, como uma infecção por influeza). Também deve ser entendido aqui que uma "quantidade terapeuticamente eficaz" pode ser interpretada como uma quantidade que dá um efeito terapêutico e / ou preventivo desejado, tomada em uma ou mais doses ou em qualquer dosagem ou via e / ou tomada sozinha ou em combinação com outros agentes terapêuticos (por exemplo, um agente antiviral aqui descrito). Por exemplo, no contexto de administração de um conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) que é usado para o tratamento de uma infecção viral, uma quantidade eficaz de um conjugado é, por exemplo, uma quantidade suficiente para prevenir, retardar ou reverter a progressão da infecção viral em comparação com a resposta obtida sem administração do conjugado.
[00519] Como utilizado neste documento, o termo "composição farmacêutica" refere-se a uma formulação medicinal ou farmacêutica que contém pelo menos um ingrediente ativo (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)), bem como um ou mais excipientes e diluentes para permitir o ingrediente ativo adequado para o método de administração. A composição farmacêutica da presente divulgação inclui componentes farmaceuticamente aceitáveis que são compatíveis com um conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M- X), ou (M’-I)).
[00520] Como utilizado neste documento, o termo "transportador farmaceuticamente aceitável" refere-se a um excipiente ou diluente em uma composição farmacêutica. Por exemplo, um transportador farmaceuticamente aceitável pode ser um veículo capaz de suspender ou dissolver o conjugado ativo (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), ou (M-I)-(M-VI)). O transportador farmaceuticamente aceitável deve ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não deve ser prejudicial ao receptor. Na presente divulgação, o transportador farmaceuticamente aceitável deve fornecer estabilidade farmacêutica adequada a um conjugado aqui descrito. A natureza da transportadora difere com o modo de administração. Por exemplo, para administração oral, é preferido um transportador sólido; para administração intravenosa, um transportador de solução aquosa (por exemplo, WFI e / ou uma solução tamponada) é geralmente usado.
[00521] O termo "sal farmaceuticamente aceitável", como utilizado neste documento, representa sais dos conjugados descritos neste documento (por exemplo, conjugados de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D- I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) que são, dentro do escopo do bom julgamento médico, adequados para uso em métodos descritos neste documento sem toxicidade indevida, irritação e / ou resposta alérgica. Sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os sais farmaceuticamente aceitáveis são descritos em: Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (Eds. P.H. Stahl and C.G. Wermuth), Wiley-VCH,
2008. Os sais podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais dos conjugados aqui descritos ou separadamente por reação do grupo de base livre com um ácido orgânico adequado.
[00522] O termo "razão de droga para anticorpo" ou "DAR" refere-se ao número médio de frações de droga de molécula pequena (por exemplo, o número médio de monômeros ou dímeros de droga de molécula pequena) conjugadas a um anticorpo, domínio Fc ou proteína de albumina descrita aqui. Em algumas modalidades aqui descritas, o DAR é representado por "T" (por exemplo, nas fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’- I)). Como utilizado neste documento, cada fração de monômero (por exemplo, cada monômero de zanamivir ou peramivir) ou cada fração de dímero (por exemplo, cada dímero de zanamivir ou dímero de peramivir) conjugado com o domínio Fc, anticorpo ou proteína de albumina corresponde a um valor DAR de 1,0 (por exemplo, um valor “T” de 1,0). Por exemplo, um domínio Fc conjugado a 4 monômeros de zanamivir teria um DAR de 4,0 (por exemplo, um “T” de 4,0).
Um domínio Fc conjugado a 4 dímeros de zanamivir (por exemplo, 8 moléculas de zanamivir no total) também teria um DAR de 4,0 (por exemplo, um “T” de 4,0).
O DAR também pode ser calculado como o DAR médio para uma população de moléculas, como uma população de domínios Fc, anticorpos ou proteínas de albumina. Os valores de DAR podem afetar a eficácia, potência, farmacocinética ou toxicidade do medicamento.
[00523] O termo "cerca de", como utilizado neste documento, indica uma taxa de variação de ± 5%. Por exemplo, cerca de 10% refere-se a de 9,5% a 10,5%.
[00524] Todos os valores fornecidos em um intervalo de valores incluem os limites superior e inferior e todos os valores contidos nos limites superior e inferior.
[00525] O termo “(1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)”, como utilizado aqui, representa as fórmulas de qualquer um de (1), (2), (3), (4), (5), (D-I), (D-II), (D-II-1), (D-II-2), (D-II-3), (D-II-4), (D-II-5), (D-II-6), (D-II- 7), (D-II-8), (D-II-9), (D-II-10), (D-III), (D-III-1), (D-III-2), (D-III-3), (D-III-4), (D-III- 5), (D-III-6), (D-III-7), (D-III-8), (D-III-9), (D-IV), (D-IV-1), (D-IV-2), (D-V), (D-V-1), (D-V-2), (D-V-3), (D-V-4), (D-V-5), (D-V-6), (D-V-7), (D-V-8), (D-V-9), (D-V-10), (D-VI), (D-VI-1), (D-VI-2), (D-VI-3), (D-VI-4), (D-VI-5), (D-VI-6), (D-VI-7), (D-VI- 8), (D-VI-9), (D-VII), (D-VIII), (D-VIII-1), (D-VIII-2), (D-VIII-3), (D-VIII-4), (D-VIII- 5), (D-VIII-6), (D-VIII-7), (D-VIII-8), (D-VIII-9), (D-VIII-10), (D-VIII-11), (D-IX), (D- IX-1), (D-IX-2), (D-IX-3), (D-IX-4), (D-IX-5), (D-IX-6), (D-X), (D-X-1), (D-X-2), (D- X-3), (D’-I), (M-I), (M-II), (M-II-1), (M-II-2), (M-II-3), (M-II-4), (M-II-5), (M-II-6), (M- II-7), (M-II-8), (M-II-9), (M-II-10), (M-III), (M-III-1), (M-III-2), (M-III-3), (M-III-4), (M- III-5), (M-III-6), (M-III-7), (M-III-8), (M-III-9), (M-IV), (M-IV-1), (M-IV-2), (M-V), (M- V-1), (M-V-2), (M-V-3), (M-V-4), (M-V-5), (M-V-6), (M-V-7), (M-V-8), (M-V-9), (M- V-10), (M-VI), (M-VI-1), (M-VI-2), (M-VI-3), (M-VI-4), (M-VI-5), (M-VI-6), (M-VI-7), (M-VI-8), (M-VI-9), (M-VII), (M-VIII), (M-VIII-1), (M-VIII-2), (M-VIII-3), (M-VIII-4), (M-VIII-5), (M-VIII-6), (M-VIII-7), (M-VIII-8), (M-VIII-9), (M-VIII-10), (M-VIII-11), (M-IX), (M-IX-1), (M-IX-2), (M-IX-3), (M-IX-4), (M-IX-5), (M-IX-6), (M-X), (M-X-1), (M-X-2), (M-X-3), ou (M’-I)).
[00526] Outras características e vantagens dos conjugados aqui descritos serão evidentes a partir da seguinte Descrição Detalhada e das reivindicações.
Descrição dos Desenhos
[00527] A FIG. 1 é uma imagem que descreve métodos exemplificativos de conjugação de um monômero ou dímero inibidor de neuraminidase, por exemplo, por meio de um ligante, a um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina.
[00528] A FIG. 2 mostra SDS-PAGE de não redução e redução e uma ilustração esquemática de um domínio Fc formado a partir de monômeros de domínio Fc com a sequência de SEQ ID NO: 1.
[00529] A FIG. 3 mostra SDS-PAGE de não redução e redução e uma ilustração esquemática de um domínio Fc formado a partir de monômeros de domínio Fc com a sequência de SEQ ID NO: 3.
[00530] A FIG. 4 mostra SDS-PAGE de não redução e redução e uma ilustração esquemática de um domínio Fc formado a partir de monômeros de domínio Fc com a sequência de SEQ ID NO: 5.
[00531] A FIG. 5 mostra SDS-PAGE de não redução e redução e uma ilustração esquemática de um domínio Fc formado a partir de monômeros de domínio Fc com a sequência de SEQ ID NO: 7.
[00532] A FIG.6 mostra SDS-PAGE de não redução e redução e uma ilustração esquemática de um domínio Fc formado a partir de monômeros de domínio Fc com a sequência de SEQ ID NO: 9.
[00533] A FIG. 7 mostra SDS-PAGE de não redução e redução e uma ilustração esquemática de um domínio Fc formado a partir de monômeros de domínio Fc com a sequência de SEQ ID NO: 12.
[00534] A FIG. 8 mostra SDS-PAGE de não redução e redução e uma ilustração esquemática de um domínio Fc formado a partir de monômeros de domínio Fc com a sequência de SEQ ID NO: 14.
[00535] A FIG. 9 mostra uma SDS-PAGE de não redução do Conjugado 1.
[00536] A FIG. 10 mostra uma SDS-PAGE de não redução do Conjugado 2.
[00537] A FIG. 11 mostra uma SDS-PAGE de não redução do
Conjugado 3.
[00538] A FIG. 12 mostra uma SDS-PAGE de não redução do Conjugado 4.
[00539] A FIG. 13 mostra uma SDS-PAGE de não redução do Conjugado 5.
[00540] A FIG. 14 mostra uma SDS-PAGE de não redução do Conjugado 6.
[00541] A FIG. 15 é um gráfico que mostra os valores de IC50 de um ensaio de inibição da neuraminidase H1N1 para Int-2 e Conjugado 1.
[00542] A FIG. 16 é um gráfico que mostra os valores de IC50 de um ensaio de inibição da neuraminidase H1N1 para os Conjugados 1-6.
[00543] A FIG. 17 é um gráfico que mostra os valores de IC50 de um ensaio de inibição da neuraminidase H3N2 para os Conjugados 1-6.
[00544] As FIGS. 18A-18C são uma série de gráficos que mostram a célula por meio da capacidade de células A549 tratadas com o Conjugado 3 (FIG. 18A), Conjugado 4 (FIG. 18B) ou Conjugado 6 (FIG. 18C).
[00545] As FIGS. 19A-19E são uma série de gráficos que mostram a capacidade do Conjugado 3 de inibir o crescimento de cepas virais de influenza patogênica A/WSN/33 H1N1 (FIG. 19A), A/Wyoming/3/03 H3N2 (FIG. 19B), A/California/04/09 H1N1 pdm (FIG. 19C), A/Vietnam/1203/04 H5N1 HALo (FIG. 19D), ou B/Lee/40 Victoria (FIG. 19E) em células epiteliais humanas.
[00546] As FIGS. 20A-20E são uma série de gráficos que mostram a capacidade do Conjugado 4 de inibir o crescimento de cepas virais de influenza patogênica A/WSN/33 H1N1 (FIG. 20A), A/Wyoming/3/03 H3N2 (FIG. 20B), A/California/04/09 H1N1 pdm (FIG. 20C), A/Vietnam/1203/04 H5N1 HALo (FIG. 20D), ou B/Lee/40 Victoria (FIG. 20E) em células epiteliais humanas.
[00547] As FIGS. 21A-21E são uma série de gráficos que mostram a capacidade do Conjugado 6 de inibir o crescimento de cepas virais de influenza patogênica A/WSN/33 H1N1 (FIG. 21A), A/Wyoming/3/03 H3N2 (FIG. 21B), A/California/04/09 H1N1 pdm (FIG. 21C), A/Vietnam/1203/04 H5N1 HALo (FIG. 21D), ou B/Lee/40 Victoria (FIG. 21E) em células epiteliais humanas.
[00548] As FIGS. 22A-22E são uma série de gráficos que mostram a capacidade do Conjugado 6 para inibir o crescimento de cepas virais de influenza patogênica A/WSN/33 H1N1 (FIG. 22A), A/Wyoming/3/03 H3N2 (FIG. 22B), A/California/04/09 H1N1 pdm (FIG. 22C), B/Lee/40 Victoria (FIG.
22D), ou A/Vietnam/1203/04 (FIG. 22E) em células epiteliais humanas, em comparação com Oseltamivir.
[00549] A FIG. 23 é um gráfico que mostra a concentração relativa de soro de camundongo do Conjugado 6 em comparação com Fc (hIgG1) sozinho.
[00550] A FIG. 24 é um gráfico que mostra o efeito do Conjugado 6 no peso do camundongo em um modelo de influenza letal de camundongo. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 29.
[00551] A FIG. 25 é um gráfico que mostra o efeito do Conjugado 6 na sobrevida em um modelo letal de influenza de camundongo. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 29.
[00552] A FIG. 26 é um gráfico que mostra o efeito do Conjugado 6 no peso do camundongo em um modelo de influenza letal de camundongo. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 30.
[00553] A FIG. 27 é um gráfico que mostra o efeito do Conjugado 6 na sobrevida em um modelo letal de influenza de camundongo. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 30.
[00554] A FIG. 28 é uma imagem que descreve um método de conjugar um monômero ou dímero inibidor de neuraminidase, por exemplo, por meio de um ligante, a um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina por conjugação de oxima a um resíduo de aminoácido, por exemplo, um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície.
[00555] A FIG. 29 é uma imagem que descreve um método de conjugação de um monômero ou dímero inibidor de neuraminidase, por exemplo, por meio de um ligante, a um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina por conjugação de tioéter a um resíduo de aminoácido, por exemplo, um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície.
[00556] A FIG. 30 é uma imagem que descreve um método de conjugação de um monômero ou dímero inibidor de neuraminidase, por exemplo, por meio de um ligante, a um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina por conjugação de cisteína reformada em ponte, por exemplo, conjugação de cisteína reformada em ponte a um par de átomos de enxofre de duas cisteínas de dobradiça em um monômero de domínio Fc ou domínio Fc.
[00557] As FIGS. 31A-31F são uma série de gráficos que mostram a sobrevida de camundongos tratados com o Conjugado 6 em um modelo letal de influenza em camundongo. Os camundongos foram tratados com controle de Oseltamivir (TamifluTM), 20 mg / kg, 2x ao dia, começando 8 horas após a infecção (FIG. 31A); Conjugado 6, 50 mg / kg, 1 dose 28 dias antes da infecção (FIG. 31B); Conjugado 6, 10 mg / kg, 1 dose 28 dias antes da infecção (FIG. 31C); Conjugado 6, 5 mg / kg, 1 dose 28 dias antes da infecção (FIG. 31D); Conjugado 6, 2,5 mg / kg, 1 dose 28 dias antes da infecção (FIG. 31E); ou Conjugado 6, 1,25 mg / kg, 1 dose 28 dias antes da infecção (FIG. 31F). Este estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 33.
[00558] As FIGS. 32A-32F são uma série de gráficos que mostram que o Conjugado 6 estende a janela de tratamento em comparação ao Oseltamivir (TamifluTM), conforme determinado pela sobrevida em um modelo letal de influenza de camundongo. Os camundongos foram tratados com veículo (PBS), Fc apenas 10 mpk ou Conjugado 6, 4 horas antes da infecção (FIG. 32A); Conjugado 6 ou Oseltamivir (TamifluTM), 8 horas após a infecção (FIG. 32B); Conjugado 6 ou Oseltamivir (TamifluTM), 24 horas após a infecção (FIG. 32C); Conjugado 6 ou Oseltamivir (TamifluTM), 48 horas após a infecção (FIG. 32D); Conjugado 6 ou Oseltamivir (TamifluTM), 72 horas após a infecção (FIG. 32E); ou Conjugado 6 ou Oseltamivir (TamifluTM), 96 horas após a infecção (FIG. 32F). O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 34.
[00559] FIG. 33 é um gráfico que mostra que nenhum efeito significativo de ganho de peso corporal foi observado após a administração do Conjugado 6 em um estudo de toxicidade de localizador de faixa de dose em rato de 14 dias. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 35.
[00560] As FIGS. 34A-34D são uma série de gráficos que mostram que o Conjugado 6 estende a janela de tratamento em comparação ao Oseltamivir (TamifluTM), conforme determinado pela sobrevida em um modelo letal de influenza de camundongo. Os camundongos foram tratados com controle de Oseltamivir (TamifluTM), 20 mg / kg, 2x ao dia, começando 8 horas após a infecção (FIG. 34A); Conjugado 6, 10 mg / kg, 1 dose 4 horas antes da infecção (FIG. 34B); Conjugado 6, 2 mg / kg, 1 dose 4 horas antes da infecção (FIG. 34C); ou Conjugado 6, 0,4 mg / kg, 1 dose 4 dias antes da infecção (FIG. 34D). O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 37.
[00561] A FIG. 35 é um gráfico que mostra o efeito do Conjugado 6 no peso do camundongo em um modelo de influenza letal de camundongo. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 37.
[00562] A FIG. 36 é um gráfico que mostra um estudo farmacocinético em rato de 7 dias após a administração IV do Conjugado 6. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 38.
[00563] A FIG. 37 é um gráfico que mostra um estudo farmacocinético em rato de 14 dias após a administração IV do Conjugado 6. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 39.
[00564] A FIG. 38 é um gráfico que mostra um estudo farmacocinético de rato de 28 dias comparando a administração IV e SC do Conjugado 6. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 40.
[00565] A FIG. 39 é um gráfico que mostra um estudo farmacocinético de primatas não humanos de 28 dias após a administração IV do Conjugado 6. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 41.
[00566] A FIG. 40 é um gráfico que mostra um estudo farmacocinético de distribuição de pulmão de camundongo após a administração IV do Conjugado 6. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 42.
[00567] A FIG. 41 é um gráfico que mostra um estudo farmacocinético de camundongo de 5 dias comparando a administração IV, SC e IM do Conjugado 6. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 43.
[00568] FIG. 42 mostra uma SDS-PAGE de não redução do Conjugado 8.
[00569] A FIG. 43 mostra a estrutura do Conjugado 6.
[00570] A FIG. 44 é um gráfico que mostra um estudo de estabilidade de plasma de camundongo in vitro de 24 horas comparando o Conjugado 6 incubado a 37°C por 24 horas em comparação com um controle e um composto puro.
[00571] A FIG. 45 é um gráfico que mostra um estudo de estabilidade de plasma humano in vitro de 24 horas comparando o Conjugado 6 incubado a 37°C por 24 horas em comparação com um controle e um composto puro.
[00572] A FIG. 46 é um gráfico que mostra um estudo de estabilidade microssômico de fígado de camundongo de 24 horas comparando o Conjugado 6 incubado a 37°C por 24 h em células microssômicas de fígado de camundongo e células microssômicas de fígado de camundongo mortas pelo calor como um controle.
[00573] A FIG. 47 é um gráfico que mostra um estudo de estabilidade microssômica de fígado humano de 24 horas comparando o Conjugado 6 incubado a 37°C por 24 horas em células microssômicas de fígado humano e células microssômicas de fígado de camundongo mortas por calor como um controle.
[00574] A FIG. 48 é um gráfico que mostra a % de mudança de peso corporal em camundongos ao longo de 15 dias após o desafio viral. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 66.
[00575] A FIG. 49 é um gráfico que mostra a % de sobrevida em camundongos ao longo de 15 dias após o desafio viral. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 66.
[00576] A FIG. 50 é um gráfico que mostra a ligação do Conjugado 6 e do Conjugado 12 em comparação com hIgG1 Fc (WT) e hIgG1 Fc (N297A) ao receptor Fcγ IIIA. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 67.
[00577] A FIG. 51 é um gráfico que mostra a ligação do Conjugado 6 e do Conjugado ao receptor Fcγ IIIA. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 67.
[00578] A FIG. 52 é um gráfico que mostra um estudo tóxicocinético de primatas não humanos de 7 dias após a administração IV do Conjugado 6. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 68.
[00579] A FIG. 53 é um gráfico que mostra um estudo farmacocinético de primatas não humanos de 28 dias comparando a administração IV e SC do Conjugado 6. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 68.
[00580] FIG. 54 mostra uma SDS-PAGE de não redução do Conjugado 12.
[00581] A FIG. 55 mostra uma SDS-PAGE de não redução do Conjugado 13 com diferentes valores de razão de droga para anticorpo (DAR) (Conjugado 13a, Conjugado 13b, Conjugado 13c, Conjugado 13d, Conjugado 13e, Conjugado 13f e Conjugado 13g).
[00582] A FIG. 56 é um gráfico que mostra a % de sobrevida em camundongos imunocomprometidos ao longo de 35 dias após o desafio viral.
O grupo de tratamento com conjugado 6 de 0,3 mg / kg permaneceu com 100% de sobrevida, mas está ligeiramente deslocado no gráfico para maior clareza. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 95.
[00583] A FIG. 57 é um gráfico que mostra a % de alteração do peso corporal em camundongos imunocomprometidos ao longo de 35 dias após o desafio viral. O estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 95.
[00584] A FIG. 58 é um gráfico que mostra a administração do conjugado 6 resulta na depuração viral dependente da dose nos pulmões de um modelo de camundongo infectado com Influenza A (H1N1) e que esta depuração viral é maior do que o controle de PBS, controle apenas de Fc ou controle de Oseltamivir. Este estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo
96.
[00585] A FIG. 59 é um gráfico que mostra que a administração do conjugado 6 resulta em uma redução dependente da dose em citocinas inflamatórias nos pulmões em um modelo de camundongo infectado com Influenza A (H1N1). Este estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo
97.
[00586] A FIG. 60 é um gráfico que mostra a farmacocinética do conjugado 6 em camundongos BALB / c SCID (imunocomprometidos) e camundongos CD-1 (imunocompetentes). Este estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 98.
[00587] A FIG. 61 é uma imagem que descreve o conjugado
33.
[00588] As FIGS. 62A-62B são gráficos que mostram a alteração do peso corporal (%) em camundongos BALB / c desafiados por via intranasal com 3x the LD95 de influenza adaptado a camundongo A.PR/8/1934 (H1N1). Este estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 133.
[00589] FIG. 63A é um gráfico que mostra a carga viral no dia 4 após a infecção. Este estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 133.
[00590] A FIG. 63B é um gráfico que mostra a redução logarítmica da carga viral no dia 4 após a infecção. Este estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 133.
[00591] A FIG. 64A é um gráfico que mostra a administração do conjugado 33 resulta na redução dependente da dose da carga viral em um modelo de camundongo infectado com Influenza A (H1N1) em comparação com o controle de PBS ou controle apenas de Fc. Este estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 133.
[00592] A FIG. 64B é um gráfico que mostra a redução logarítmica da carga viral no dia 4 após a infecção. Este estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 133.
[00593] As FIGS. 65A-65E são uma série de gráficos de barras que mostram que a administração do conjugado 33 resulta na redução de vezes dependente da dose nos níveis de citocinas para TNF- (FIG. 65A), IL-6 (FIG. 65B), INF- (FIG. 65C), MCP-1 (FIG. 65D), e MIP-1 (FIG. 65E). Este estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 133.
[00594] A FIG. 66 é um cromatógrafo que mostra a estabilidade de Int-80 em comparação com Int-4 no dia 7 de incubação a 37°C e
60°C. Este estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 142.
[00595] A FIG. 67 é um gráfico que mostra a passagem em série de A / CA / 09 pdm na presença de Conjugado 6, oseltamivir, baloxavir ou controle de PBS em células A549 para avaliar o potencial de desenvolvimento de cepas virais mutantes resistentes a drogas sob pressão seletiva com inibidores virais. Este estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 147.
[00596] A FIG. 68 é um gráfico que mostra a passagem em série de A / WSN / 1933 na presença de Conjugado 6, Conjugado 33, oseltamivir, baloxavir ou controle de PBS em células MDCK para avaliar o potencial de desenvolvimento de cepas virais mutantes resistentes a drogas sob pressão seletiva com inibidores virais. Este estudo foi realizado conforme descrito no Exemplo 147.
Descrição detalhada
[00597] A divulgação apresenta conjugados, composições e métodos para o tratamento de infecções virais (por exemplo, infecções virais de influenza). Os conjugados aqui divulgados incluem monômeros ou dímeros de inibidores da neuraminidase viral (por exemplo, zanamivir, peramivir ou análogos dos mesmos) conjugados com monômeros Fc, domínios Fc, peptídeos de ligação a Fc, proteínas de albumina ou peptídeos de ligação de proteína de albumina. O inibidor da neuraminidase (por exemplo, zanamivir, peramivir ou análogos dos mesmos) nos conjugados direciona a neuraminidase na superfície da partícula viral. Os monômeros Fc ou domínios Fc nos conjugados se ligam a FcγRs (por exemplo, FcRn, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa e FcγRIIIb) em células imunes, por exemplo, neutrófilos, para ativar a fagocitose e funções efetoras, como células dependentes de anticorpos citotoxicidade mediada (ADCC), levando assim ao engolfamento e destruição de partículas virais por células imunes e intensificando ainda mais a atividade antiviral dos conjugados.
A albumina ou o peptídeo de ligação à albumina pode estender a meia-vida do conjugado, por exemplo, pela ligação da albumina ao receptor Fc neonatal de reciclagem. Essas composições são úteis em métodos para a inibição do crescimento viral e em métodos para o tratamento de infecções virais, tais como aquelas causadas por um vírus influenza A, vírus influenza B e vírus influenza C.
I. Infecções virais
[00598] Os compostos e composições farmacêuticas aqui descritos (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D- I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), or (M’-I)) pode ser usado para tratar uma infecção viral (por exemplo, uma infecção viral de influenza, como influenza A, B, C ou parainfluenza).
[00599] A infecção viral se refere ao crescimento patogênico de um vírus (por exemplo, o vírus da gripe) em um organismo hospedeiro (por exemplo, um sujeito humano). Uma infecção viral pode ser qualquer situação na qual a presença de uma população(ões) viral(ais) é prejudicial ao corpo do hospedeiro. Assim, um sujeito está sofrendo de uma infecção viral quando uma quantidade excessiva de uma população viral está presente no corpo do sujeito ou quando a presença de uma população viral está danificando as células ou outro tecido do sujeito.
[00600] A influenza, comumente conhecida como "gripe", é uma doença infecciosa causada por um vírus influenza. Os sintomas podem ser leves a graves. Os sintomas mais comuns incluem: febre alta, coriza, dor de garganta, dores musculares, dor de cabeça, tosse e sensação de cansaço.
Esses sintomas geralmente começam dois dias após a exposição ao vírus e duram menos de uma semana. A tosse, no entanto, pode durar mais de duas semanas. Em crianças, pode haver náuseas e vômitos, mas são menos comuns em adultos. As complicações da influenza podem incluir pneumonia viral, pneumonia bacteriana secundária, infecções dos seios da face e agravamento de problemas de saúde anteriores, como asma ou insuficiência cardíaca.
Complicações graves podem ocorrer em sujeitos com sistema imunológico enfraquecido, como jovens, idosos, aqueles com doenças que enfraquecem o sistema imunológico e aqueles em tratamento terapêutico resultando em um enfraquecimento do sistema imunológico.
[00601] Três tipos de vírus influenza afetam seres humanos, a saber: Tipo A, Tipo B e Tipo C. Normalmente, o vírus se espalha pelo ar através da tosse ou espirro. Acredita-se que isso ocorra principalmente em distâncias relativamente curtas. Também pode ser transmitido ao tocar em superfícies contaminadas pelo vírus e, em seguida, tocar a boca ou os olhos. Uma pessoa pode ser infecciosa para outras pessoas antes e durante o período em que apresenta os sintomas. A infecção pode ser confirmada testando a garganta, expectoração ou nariz para o vírus. Vários testes rápidos estão disponíveis; no entanto, as pessoas ainda podem ter a infecção se os resultados forem negativos. Um tipo de reação em cadeia da polimerase que detecta o RNA do vírus pode ser usado para diagnosticar a infecção por influenza.
II. Conjugados da Divulgação
[00602] São fornecidos aqui conjugados sintéticos úteis no tratamento de infecções virais (por exemplo, infecções por influenza). Os conjugados divulgados neste documento incluem um domínio Fc ou uma proteína de albumina conjugada a um ou mais monômeros inibidores de neuraminidase ou um ou mais dímeros de dois inibidores de neuraminidase (por exemplo, inibidores de neuraminidase selecionados de zanamivir, sulfozanamivir, peramivir, A-315675 ou análogos dos mesmos). Os dímeros de dois inibidores da neuraminidase incluem um inibidor da neuraminidase (por exemplo, um primeiro inibidor da neuraminidase de fórmula (A-I), (A-II), (A-III), (A-IV), (A-V), (A-VI), (A-VII), (A-VIII), (A-IX), (A-X), (A-XI), ou (A-XII)) e um segundo inibidor de neuraminidase (por exemplo, um segundo inibidor de neuraminidase de fórmula (A-I), (A-II), (A-III), (A-IV), (A-V), (A-VI), (A-VII), (A- VIII), (A-IX), (AX), (A-XI) ou (A-XII)). O primeiro e o segundo inibidores da neuraminidase estão ligados um ao outro por meio de um ligante.
[00603] Sem estar limitado pela teoria, em alguns aspectos, os conjugados aqui descritos ligam-se à superfície de uma partícula viral (por exemplo, ligam-se à enzima neuraminidase viral na superfície de uma partícula viral da influenza) através das interações entre as porções inibidoras da neuraminidase nos conjugados e proteínas na superfície da partícula viral. O inibidor da neuraminidase interrompe a neuraminidase, uma glicoproteína do envelope que cliva os ácidos siálicos, ou seja, resíduos de ácido neuramínico terminal, das estruturas de glicano na superfície das células hospedeiras infectadas, liberando a progênie de vírus e permitindo a disseminação do vírus da célula hospedeira para as células vizinhas não infectadas.
[00604] Os conjugados da invenção incluem monômeros e dímeros inibidores da neuraminidase conjugados a um domínio Fc, monômero Fc ou peptídeo de ligação a Fc. O domínio Fc nos conjugados aqui descritos liga- se aos FcγRs (por exemplo, FcRn, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa e FcγRIIIb) em células imunes. A ligação do domínio Fc nos conjugados descritos neste documento aos FcγRs em células imunes ativa a fagocitose e funções efetoras, tais como citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), levando assim ao engolfamento e destruição de partículas virais por células imunes e intensificando ainda mais a atividade antiviral dos conjugados.
[00605] Os conjugados da invenção incluem monômeros e dímeros inibidores da neuraminidase conjugados com uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina. A proteína de albumina ou peptídeo de ligação à proteína de albumina pode estender a meia-vida do conjugado, por exemplo, pela ligação da albumina ao receptor Fc neonatal de reciclagem.
[00606] Os conjugados fornecidos neste documento são descritos por qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I). Em algumas modalidades, os conjugados aqui descritos incluem um ou mais monômeros de inibidores da neuraminidase conjugados a um domínio Fc ou uma proteína de albumina. Em algumas modalidades, os conjugados aqui descritos incluem um ou mais dímeros de inibidores da neuraminidase conjugados a um domínio Fc ou uma proteína de albumina. Em algumas modalidades, quando n é 2, E (um monômero de domínio Fc) se dimeriza para formar um domínio Fc.
[00607] Os conjugados aqui descritos podem ser sintetizados usando técnicas de síntese química disponíveis na técnica. Nos casos em que um grupo funcional não está disponível para conjugação, uma molécula pode ser derivatizada usando técnicas convencionais de síntese química que são bem conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, os conjugados descritos neste documento contêm um ou mais centros quirais. Os conjugados incluem cada uma das formas estereoisoméricas isoladas, bem como misturas de estereoisômeros em vários graus de pureza quiral, incluindo misturas racêmicas.
Também abrange os vários diastereômeros, enantiômeros e tautômeros que podem ser formados.
Inibidores da neuraminidase
[00608] Um componente dos conjugados aqui descritos é uma fração inibidora da neuraminidase do vírus influenza. Um inibidor da neuraminidase do vírus influenza interrompe a neuraminidase, uma glicoproteína do envelope que cliva os ácidos siálicos, ou seja, resíduos de ácido neuramínico terminal, das estruturas de glicano na superfície das células hospedeiras infectadas, liberando a progênie de vírus e permitindo a disseminação do vírus da célula hospedeira para as células vizinhas não infectadas. Exemplos de um inibidor da neuraminidase do vírus influenza incluem zanamivir (Relenza),
sulfozanamivir, A-315675 e peramivir. Além disso, os derivados de zanamivir, sulfozanamivir, A-315675 e peramivir, tais como aqueles encontrados na literatura, têm atividade inibidora de neuraminidase e são úteis como frações inibidoras de neuraminidase dos compostos aqui (ver, por exemplo, Hadházi et al. A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity.
ChemMedChem Comm. 13:785-789 (2018) e caracterização in vitro de A- 315675, um inibidor altamente potente das cepas A e B das neuraminidases do vírus influenza e replicação do vírus influenza. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46(4):1014-1021 (2002)).
[00609] Os conjugados aqui descritos são separados em dois tipos: (1) um ou mais dímeros de inibidores da neuraminidase conjugados com um domínio Fc ou uma proteína de albumina e (2) um ou mais monômeros de inibidores de neuraminidase conjugados com um domínio Fc ou uma proteína de albumina. Os dímeros de inibidores da neuraminidase estão ligados uns aos outros por meio de um ligante, tal como os ligantes aqui descritos.
[00610] Os inibidores da neuraminidase viral da invenção incluem zanamivir, sulfozanamivir, peramavir, A-315675 e análogos dos mesmos, tais como os inibidores da neuraminidase viral de fórmulas (A-I)-(A- XII): , , , , , (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV)
(A-V) , , , , (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) , , ; (A-X) (A-XI) (A-XII)
em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -
H, -OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de e R6 é selecionado de , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , e ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; e R8 é selecionado de C3- C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril. Mais preferencialmente o inibidor da neuraminidase viral de fórmula (A-I), (A-II), (A-III), (A-IV), (A-V), (A- VI), (A-VII), (A-VIII), (A-IX), (A-X), (A-XI), ou (A-XII) é covalentemente ligado ao conjugado por meio de Y.
[00611] De preferência, o inibidor da neuraminidase viral é selecionado de zanamivir, sulfozanamivir, peramivir ou A-315675:
, , , . Zanamivir Sulfozanamivir, Peramivir A- 315675 Conjugados de dímeros de inibidores de neuraminidase ligados a um domínio Fc ou uma proteína de albumina
[00612] Os conjugados aqui descritos incluem um domínio Fc e monômero Fc, um peptídeo de ligação a Fc e proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a proteína de albumina covalentemente ligado a um ou mais dímeros de inibidores de neuraminidase. Os dímeros de dois inibidores de neuraminidase incluem um primeiro inibidor de neuraminidase (por exemplo, um primeiro inibidor de neuraminidase viral de fórmulas (A-I)-(A-XII)) e um segundo inibidor de neuraminidase (por exemplo, um segundo inibidor de neuraminidase viral de fórmulas (A-I)-(A-XII)). O primeiro e o segundo inibidores da neuraminidase estão ligados um ao outro por meio de um ligante, tal como um ligante aqui descrito. Em algumas modalidades dos dímeros de inibidores da neuraminidase, o primeiro e o segundo inibidores da neuraminidase são iguais.
Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo inibidores da neuraminidase são diferentes.
[00613] Dímeros de inibidores de neuraminidase incluem homodímeros de zanamivir ou seus análogos (por exemplo, (A-I), (A-II), (A-VI),
(A-VII), (A-VIII), ou (A-IX)). Por exemplo, os dímeros inibidores da neuraminidase da invenção incluem dímeros com a estrutura A 1-L-A2, em que cada A1 e cada A2 é selecionado de (A-I), (A-II), (A-VI), (A-VII), (A-VIII), e (A-IX).
[00614] Os dímeros de inibidores da neuraminidase incluem homodímeros de peramivir ou análogos dos mesmos (por exemplo, (A-III), (A- IV) ou (A-V)). Por exemplo, os dímeros inibidores da neuraminidase da invenção incluem dímeros com a estrutura A1-L-A2, em que cada A1 e cada A2 é selecionado de (A-III), (A-IV), e (A-V).
[00615] Dímeros de inibidores de neuraminidase incluem heterodímeros incluindo zanamivir ou análogos dos mesmos e peramivir de análogos dos mesmos (por exemplo, (A-I)-(A-IX)). Por exemplo, os dímeros inibidores da neuraminidase da invenção incluem dímeros com a estrutura A 1-L- A2, em que cada A1 é selecionado de (A-I), (A-II), (A-VI), (A-VII), (A-VIII), e (A- IX), e cada A2 é selecionado de (A-III), (A-IV), e (A-V).
[00616] Em algumas modalidades, quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), cada A1-L-A2 pode ser selecionado independentemente (por exemplo, independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A1-L-A2 descritas aqui). Em algumas modalidades, E pode ser conjugado a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais frações A1-L-A2 diferentes. Em algumas modalidades, E é conjugado a uma primeira fração A1-L-A2 , e uma segunda fração A1-L-A2. Em algumas modalidades, A1 e A2 da primeira fração A1-L-A2 são independentemente selecionados de qualquer uma das fórmulas (A-III)-(A-V): , , ; (A-III) (A-IV) (A-V)
e A1 e A2 da segunda fração A1-L-A2 moiety são independentemente selecionados de qualquer uma das fórmulas (A-I), (A-II), (A- VI), (A-VII), (A-VIII), ou (A-IX): , , , , , (A-I) (A-II) (A-VI) (A-VII) (A-VIII) . (A-IX)
[00617] Em algumas modalidades, a primeira fração A 1-L-A2 é conjugada especificamente a resíduos de lisina de E (por exemplo, os átomos de nitrogênio de resíduos de lisina expostos à superfície de E), e a segunda fração A1-L-A2 é conjugado especificamente com resíduos de cisteína de E (por exemplo, os átomos de enxofre de resíduos de cisteína expostos à superfície de
E). Em algumas modalidades, a primeira fração A1-L-A2 é conjugada especificamente a resíduos de cisteína de E (por exemplo, os átomos de enxofre de resíduos de cisteína expostos à superfície de E), e a segunda fração A1-L-A2 é conjugada especificamente a resíduos de lisina de E (por exemplo, os átomos de nitrogênio de resíduos de lisina expostos à superfície de E).
[00618] Em algumas modalidades, a divulgação fornece um conjugado, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, descrito pelas fórmulas abaixo: ; (1) ; (3) ; (D-I) ;
(D-II)
; (D-II-1)
; (D-II-2)
;
(D-II-3)
; (D-II-4)
; (D-II-5)
; (D-II-6)
; (D-II-7)
; (D-II-8)
; (D-II-9)
; (D-II-10)
; (D-III)
; (D-III-1)
; (D-III-2)
;
(D-III-3)
; (D-III-4)
; (D-III-5)
; (D-III-6)
; (D-III-7)
;
(D-III-8)
; (D-III-9)
; (D-IV)
; (D-IV-1)
; (D-IV-2)
; (D-V)
; (D-V-1)
; (D-V-2)
; (D-V-3)
; (D-V-4)
; (D-V-5)
; (D-V-6)
; (D-V-7)
; (D-V-8)
; (D-V-9)
; (D-V-10)
; (D-VI)
;
(D-VI-1)
; (D-VI-2)
; (D-VI-3)
;
(D-VI-4)
; (D-VI-5)
; (D-VI-6)
; (D-VI-7)
; (D-VI-8)
; (D-VI-9)
; (D-VII) ; (D-VIII)
; (D-VIII-1)
; (D-VIII-2)
; (D-VIII-3)
;
(D-VIII-4)
; (D-VIII-5)
; (D-VIII-6)
; (D-VIII-7)
; (D-VIII-8)
; (D-VIII-9)
;
(D-VIII-10)
; (D-VIII-11)
; (D-IX)
; (D-IX-1)
; (D-IX-2)
; (D-IX-3)
;
(D-IX-4)
; (D-IX-5)
; (D-IX-6)
; (D-X)
; (D-X-1)
; (D-X-2)
; ou (D-X-3)
; (D’-I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00619] Nos conjugados aqui descritos, a linha ondulada conectada a E indica que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) dímeros de inibidores de neuraminidase podem ser ligados a um monômero de domínio Fc, domínio Fc, peptídeo de ligação a Fc, proteína de albumina ou peptídeo de ligação à proteína de albumina. Em algumas modalidades, quando n é 1, um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) dímeros de inibidores de neuraminidase podem ser ligados a um monômero de domínio Fc, domínio Fc, peptídeo de ligação a Fc, proteína de albumina ou peptídeo de ligação à proteína de albumina. Em algumas modalidades, quando n é 2, um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19 ou 20) dímeros de inibidores da neuraminidase podem ser ligados a um domínio Fc. A linha ondulada nos conjugados aqui descritos não deve ser interpretada como uma ligação simples entre um ou mais dímeros de inibidores da neuraminidase e um átomo no domínio Fc ou proteína de albumina. Em algumas modalidades, quando T é 1, um dímero de inibidores de neuraminidase pode ser ligado a um átomo no monômero de domínio Fc, domínio Fc, peptídeo de ligação a Fc, proteína de albumina ou peptídeo de ligação à proteína de albumina. Em algumas modalidades, quando T é 2, dois dímeros de inibidores de neuraminidase podem ser ligados a um átomo no monômero de domínio Fc, domínio Fc, peptídeo de ligação a Fc, proteína de albumina ou peptídeo de ligação à proteína de albumina.
[00620] Conforme descrito adicionalmente neste documento, um ligante em um conjugado descrito neste documento (por exemplo, L ou L') pode ser uma estrutura ramificada. Conforme descrito adicionalmente neste documento, um ligante em um conjugado descrito neste documento (por exemplo, L ou L') pode ser uma estrutura multivalente, por exemplo, uma estrutura divalente ou trivalente tendo dois ou três braços, respectivamente. Em algumas modalidades, quando o ligante tem três braços, dois dos braços podem ser anexados ao primeiro e ao segundo inibidores da neuraminidase e o terceiro braço pode ser anexado ao monômero do domínio Fc, domínio Fc, peptídeo de ligação a Fc, proteína de albumina ou peptídeo de ligação à proteína de albumina.
[00621] Em conjugados com um domínio Fc covalentemente ligado a um ou mais dímeros de inibidores da neuraminidase, conforme representado pelas fórmulas acima, quando n é 2, dois monômeros de domínio Fc (cada monômero de domínio Fc é representado por E) dimerizam para formar um domínio Fc.
Conjugados de monômeros de inibidores de neuraminidase ligados a um domínio Fc ou uma proteína de albumina
[00622] Em algumas modalidades, os conjugados aqui descritos incluem um monômero de domínio Fc, domínio Fc, peptídeo de ligação a Fc, proteína de albumina ou peptídeo de ligação à proteína de albumina covalentemente ligado a um ou mais monômeros de inibidores de neuraminidase. Conjugados de um monômero de domínio Fc ou proteína de albumina e um ou mais monômeros de inibidores de neuraminidase podem ser formados ligando o domínio Fc ou proteína de albumina a cada um dos monômeros de inibidores de neuraminidase através de um ligante, tal como qualquer um dos ligantes aqui descritos.
[00623] Nos conjugados com um domínio Fc ou proteína de albumina covalentemente ligada a um ou mais monômeros de inibidores de neuraminidase aqui descritos, a linha ondulada conectada a E indica que um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20) monômeros de inibidores de neuraminidase podem ser ligados a um monômero de domínio Fc, domínio Fc, peptídeo de ligação a Fc, proteína de albumina, ou peptídeo de ligação à proteína de albumina. Em algumas modalidades, quando n é 1, um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) monômeros de inibidores de neuraminidase podem ser ligados a um monômero de domínio Fc ou uma proteína de albumina. Em algumas modalidades, quando n é 2, um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19 ou 20) monômeros de inibidores da neuraminidase podem ser ligados a um domínio Fc. A linha ondulada nos conjugados aqui descritos não deve ser interpretada como uma ligação simples entre um ou mais monômeros de inibidores de neuraminidase e um átomo no monômero de domínio Fc, domínio Fc, peptídeo de ligação a Fc, proteína de albumina ou peptídeo de ligação à proteína de albumina. Em algumas modalidades, quando T é 1, um monômero de inibidores de neuraminidase pode ser ligado a um átomo no monômero de domínio Fc, domínio Fc, peptídeo de ligação a Fc, proteína de albumina ou peptídeo de ligação à proteína de albumina. Em algumas modalidades, quando T é 2, dois monômeros de inibidores de neuraminidase podem ser ligados a um átomo no monômero de domínio Fc, domínio Fc, peptídeo de ligação a Fc, proteína de albumina ou peptídeo de ligação à proteína de albumina.
[00624] Em algumas modalidades, quando T é maior que 1 (por exemplo, T é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20), cada A1-L pode ser selecionado independentemente (por exemplo,
independentemente selecionado de qualquer uma das estruturas A 1-L descritas aqui). Em algumas modalidades, E pode ser conjugado a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
ou mais frações A1-L diferentes.
Em algumas modalidades, E é conjugado a uma primeira fração A1-L e uma segunda fração A1-L.
Em algumas modalidades, A1 da primeira fração A1-L é selecionada de qualquer uma das fórmulas (A-III)-(A-
V): , , ; (A-III) (A-IV) (A-V)
e A1 da segunda fração A1-L é selecionado de qualquer uma das modalidades (A-I), (A-II), (A-VI), (A-VII), (A-VIII), ou (A-IX):
, , , ,
, (A-I) (A-II) (A-VI) (A-VII) (A-VIII) . (A-IX)
[00625] Em algumas modalidades, a primeira fração A1-L é conjugada especificamente a resíduos de lisina de E (por exemplo, os átomos de nitrogênio de resíduos de lisina expostos à superfície de E), e a segunda fração A1-L é conjugado especificamente com resíduos de cisteína de E (por exemplo, os átomos de enxofre de resíduos de cisteína expostos à superfície de E). Em algumas modalidades, a primeira fração A 1-L é conjugada especificamente a resíduos de cisteína de E (por exemplo, os átomos de enxofre de resíduos de cisteína expostos à superfície de E), e a segunda fração A 1-L é conjugada especificamente a resíduos de lisina de E (por exemplo, os átomos de nitrogênio de resíduos de lisina expostos à superfície de E).
[00626] Conforme descrito adicionalmente neste documento, um ligante em um conjugado tendo um monômero de domínio Fc, domínio Fc, peptídeo de ligação a Fc, proteína de albumina ou peptídeo de ligação à proteína de albumina covalentemente ligado a um ou mais monômeros de inibidores de neuraminidase aqui descritos (por exemplo, L ou L') pode ser uma estrutura divalente com dois braços. Um braço em um ligante divalente pode ser ligado ao monômero do inibidor da neuraminidase e o outro braço pode ser ligado ao monômero do domínio Fc, domínio Fc, peptídeo de ligação a Fc, proteína de albumina ou peptídeo de ligação à proteína de albumina.
[00627] Em algumas modalidades, um conjugado contendo um monômero de domínio Fc, domínio Fc, peptídeo de ligação a Fc, proteína de albumina ou peptídeo de ligação à proteína de albumina covalentemente ligado a um ou mais monômeros de inibidores de neuraminidase aqui fornecidos é descrito por qualquer uma das fórmulas abaixo:
; (2)
; (4)
(5)
; (M-I) ; (M-II)
; (M-II-1)
; (M-II-2)
; (M-II-3)
; (M-II-4)
; (M-II-5)
; (M-II-6)
; (M-II-7)
; (M-II-8)
;
(M-II-9)
; (M-II-10)
; (M-III)
; (M-III-1)
; (M-III-2)
; (M-III-3)
; (M-III-4)
; (M-III-5)
;
(M-III-6)
; (M-III-7)
;
(M-III-8)
; (M-III-9)
; (M-IV)
; (M-IV-1)
; (M-IV-2)
; (M-V)
;
(M-V-1)
; (M-V-2)
; (M-V-3)
; (M-V-4)
; (M-V-5)
; (M-V-6)
;
(M-V-7)
; (M-V-8)
; (M-V-9)
; (M-V-10)
; (M-VI)
; (M-VI-1)
;
(M-VI-2)
; (M-VI-3)
; (M-VI-4)
; (M-VI-5)
; (M-VI-6)
; (M-VI-7)
; (M-VI-8)
;
(M-VI-9)
; (M-VII) ; (M-VIII)
; (M-VIII-1)
; (M-VIII-2)
; (M-VIII-3)
; (M-VIII-4)
; (M-VIII-5)
; (M-VIII-6)
; (M-VIII-7)
; (M-VIII-8)
; (M-VIII-9)
; (M-VIII-10)
; (M-VIII-11)
; (M-IX)
; (M-IX-1)
; (M-IX-2)
;
(M-IX-3)
; (M-IX-4)
; (M-IX-5)
; (M-IX-6)
; (M-X)
; (M-X-1)
; (M-X-2)
; ou (M-X-3) ; (M’-I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[00628] Em conjugados com um domínio Fc covalentemente ligado a um ou mais monômeros de inibidores da neuraminidase, conforme representado pelas fórmulas acima, quando n é 2, dois monômeros de domínio Fc (cada monômero de domínio Fc é representado por E) dimerizam para formar um domínio Fc.
Regioisômeros de conjugados incluindo zanamivir ou análogos dos mesmos
[00629] Conjugados (por exemplo, conjugados de monômero ou dímero conforme descrito em detalhes neste documento) podem ser produzidos como uma mistura ou regioisômeros. Um regioisômero particular ou mistura de regioisômeros pode ser preferido por razões tais como facilidade de síntese, termoestabilidade, estabilidade oxidativa, farmacocinética (por exemplo,
estabilidade metabólica ou biodisponibilidade), ligação efetora ou eficácia terapêutica.
[00630] Em algumas modalidades, um conjugado da invenção inclui zanamivir ou um análogo do mesmo (por exemplo, qualquer um de (A-I), (A-II), (A-VI), (A-VII), (A-VIII), (A-IX), ou (A-X)). Zanamivir ou um análogo do mesmo pode ser conjugado a um domínio Fc ou uma proteína de albumina (por exemplo, por meio de um ligante) através, por exemplo, da posição C7 (ver, por exemplo, (A-I), (A-II), ou (A-X)) ou através da posição C9 (ver, por exemplo, (A-VI) ou (A-VII)): (A-I), conjugação C7, (A-II), conjugação C7, (A-X), conjugação C7, (A-VI), conjugação C9,
(A-VII), conjugação C9.
[00631] A presente divulgação inclui uma população de conjugados monoméricos (por exemplo, uma população de conjugados de fórmula (M-I)) em que a população de conjugados inclui qualquer um dos conjugados monoméricos descritos neste documento e um ou mais de seus regioisômeros correspondentes. Por exemplo, uma população de conjugados pode incluir (1) zanamivir ou um análogo do mesmo conjugado (por exemplo, por meio de um ligante) na posição C7 a um domínio Fc ou uma proteína de albumina, e (2) zanamivir ou um análogo do mesmo conjugado (por exemplo, por meio de um ligante) na posição C9 a um domínio Fc ou uma proteína de albumina.
[00632] A população de conjugados monoméricos pode ter uma razão especificada de conjugado ligado a C7 para conjugado ligado a C9.
Por exemplo, a população de conjugados pode ter substancialmente 100% de conjugado C-7 ligado e substancialmente 0% de conjugado C-9 ligado. A população de conjugados pode ter cerca de 95% de conjugado C-7 ligado e cerca de 5% de conjugado C-9 ligado. A população de conjugados pode ter cerca de 90% de conjugado C-7 ligado e cerca de 10% de conjugado C-9 ligado. A população de conjugados pode ter cerca de 85% de conjugado C-7 ligado e cerca de 15% de conjugado C-9 ligado. A população de conjugados pode ter cerca de 80% de conjugado C-7 ligado e cerca de 20% de conjugado C-9 ligado.
A população de conjugados pode ter cerca de 75% de conjugado C-7 ligado e cerca de 25% de conjugado C-9 ligado. A população de conjugados pode ter cerca de 70% de conjugado C-7 ligado e cerca de 30% de conjugado C-9 ligado.
A população de conjugados pode ter cerca de 65% de conjugado C-7 ligado e cerca de 35% de conjugado C-9 ligado. A população de conjugados pode ter cerca de 60% de conjugado C-7 ligado e cerca de 40% de conjugado C-9 ligado.
A população de conjugados pode ter cerca de 55% de conjugado C-7 ligado e cerca de 45% de conjugado C-9 ligado. A população de conjugados pode ter cerca de 50% de conjugado C-7 ligado e cerca de 50% de conjugado C-9 ligado.
A população de conjugados pode ter cerca de 45% de conjugado C-7 ligado e cerca de 55% de conjugado C-9 ligado. A população de conjugados pode ter cerca de 40% de conjugado C-7 ligado e cerca de 60% de conjugado C-9 ligado.
A população de conjugados pode ter cerca de 35% de conjugado C-7 ligado e cerca de 65% de conjugado C-9 ligado. A população de conjugados pode ter cerca de 30% de conjugado C-7 ligado e cerca de 70% de conjugado C-9 ligado.
A população de conjugados pode ter cerca de 25% de conjugado C-7 ligado e cerca de 75% de conjugado C-9 ligado. A população de conjugados pode ter cerca de 20% de conjugado C-7 ligado e cerca de 80% de conjugado C-9 ligado.
A população de conjugados pode ter cerca de 15% de conjugado C-7 ligado e cerca de 85% de conjugado C-9 ligado. A população de conjugados pode ter cerca de 10% de conjugado C-7 ligado e cerca de 90% de conjugado C-9 ligado.
A população de conjugados pode ter substancialmente 0% de conjugado C-7 ligado e substancialmente 100% de conjugado C-9 ligado.
[00633] A população de conjugados pode ter mais que 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 60%, 65%, 60%, 55%, ou 50% de conjugado ligado a C7.
[00634] A população de conjugados pode ter menos que 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% de conjugado ligado a C9.
[00635] A presente divulgação também inclui uma população de conjugados diméricos (por exemplo, uma população de conjugados de fórmula (D-I)) em que a população de conjugados inclui qualquer um dos conjugados diméricos descritos neste documento e um ou mais de seus regioisômeros correspondentes. Por exemplo, uma população de conjugados pode incluir um (1) um dímero C7-C7 (por exemplo, ambas as frações zanamivir ou análogo do mesmo são conjugadas (por exemplo, por meio de um ligante) em suas respectivas posições C7 a um domínio Fc ou uma proteína de albumina), (2) um dímero C9-C9 (por exemplo, ambas as frações zanamivir ou análogo do mesmo são conjugadas (por exemplo, por meio de um ligante) em suas respectivas posições C9 a um domínio Fc ou uma proteína de albumina ), e / ou (3) um dímero C7-C7 (por exemplo, uma fração zanamivir ou análogo do mesmo é conjugada (por exemplo, por meio de um ligante) a um domínio Fc ou uma proteína de albumina através de sua posição C7 e a outra fração zanamivir ou análogo do mesmo é conjugada (por exemplo, por meio de um ligante) a um domínio Fc ou uma proteína de albumina através de sua posição C9).
[00636] A população de conjugados diméricos pode ter uma razão especificada de conjugado C7-C7 ligado para conjugado C7-C9 ligado para conjugado C9-C9 ligado. Por exemplo, a população de conjugados pode ter substancialmente 100% de conjugado C7-C7 ligado e substancialmente 0% de conjugado C7-C9 ou C9-C9 ligado. A população de conjugados pode ter substancialmente 100% de conjugado C9-C9 ligado e substancialmente 0% de conjugado C7-C7 ou C7-C9 ligado. A população de conjugados pode ter substancialmente 100% de conjugado C7-C9 ligado e substancialmente 0% de conjugado C7-C7 ou C9-C9 ligado.
[00637] A população de conjugados pode ter mais que 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 60%, 65%, 60%, 55%, ou 50% de conjugado ligado a C7-C7.
[00638] A população de conjugados pode ter menos que 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% de conjugado ligado a C9-C9.
[00639] A população de conjugados pode ter menos que 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% de conjugado ligado a C7-C9.
[00640] Para qualquer uma das populações de regioisômeros descritas acima, A1 e/ou A2 (por exemplo, de (M-I) ou (D-I)) podem ser selecionados a partir de zanamivir ou qualquer um dos análogos de zanamivir aqui descritos (por exemplo, qualquer um de (A-I), (A-II), (A-VI), (A-VII), (A-VIII), (A-IX), ou (A-X)). Em particular, o zanamivir ligado a C7 ou análogos dos mesmos é descrito por (A-I), (A-II) e (A-X), e o zanamivir ligado a C9 ou análogos dos mesmos é descrito por (A-VI) ou (A-VII). Métodos exemplificativos para preparar regioisômeros, por exemplo, C7, C9, C7-C7, C7-C9 e regioisômeros C9-C9 ligados, são descritos nos Exemplos 100-103, 123 e 124. Em alguns casos, pode ser preferível ter 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais, ou substancialmente 100% de conjugados de monômero C7 ligado ou conjugados de dímero C7-C7 ligado. Nestes casos, pode ser preferível preparar o intermediário com um método que forme substancialmente monômero C7 ligado ou intermediários dímeros C7-C7 ligados, tal como os métodos descritos, por exemplo, nos Exemplos 103 e 123. O método do Exemplo 103 é um exemplo de métodos usados para atingir principalmente o intermediário C7 ou C7-C7 ligado e pode ser usado para preparar qualquer intermediário aqui descrito.
[00641] Em modalidades preferidas, o conjugado é um conjugado de qualquer uma das fórmulas (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’- I), em que A1 e/ou A2 são descritos pela fórmula (A-I), (A-II), ou (A-X) e Y é , em que R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3- C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril. Em modalidades preferidas, A1 e/ou A2 são descritos pela fórmula (A-I) (por exemplo, zanamivir). Em modalidades preferidas, R7 é C1-C20 alquil (por exemplo, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3). Foi demonstrado que tais conjugados exibem estabilidade aumentada da ligação C7, resultando em menos migração de C7 para C9. Espera-se, portanto, que o produto resultante seja mais homogêneo e exiba maior eficácia. III. Monômeros de domínio Fc e domínios Fc
[00642] Um monômero de domínio Fc inclui um domínio de dobradiça, um domínio constante de anticorpo CH2 , e um domínio constante de anticorpo CH3. O monômero de domínio Fc pode ser de isótipo de anticorpo de imunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgA ou IgD. O monômero de domínio Fc também pode ser de qualquer isótipo de anticorpo de imunoglobulina (por exemplo, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 ou IgG4). O monômero de domínio Fc pode ser de qualquer alótipo de anticorpo de imunoglobulina (por exemplo, IGHG1*01 (i.e., G1m(za)), IGHG1*07 (i.e., G1m(zax)), IGHG1*04 (i.e., G1m(zav)), IGHG1*03 (G1m(f)), IGHG1*08 (i.e., G1m(fa)), IGHG2*01, IGHG2*06, IGHG2*02, IGHG3*01, IGHG3*05, IGHG3*10, IGHG3*04, IGHG3*09, IGHG3*11, IGHG3*12, IGHG3*06, IGHG3*07, IGHG3*08, IGHG3*13, IGHG3*03, IGHG3*14, IGHG3*15, IGHG3*16, IGHG3*17, IGHG3*18, IGHG3*19, IGHG2*04, IGHG4*01, IGHG4*03, ou IGHG4*02) (conforme descrito em, por exemplo, em Vidarsson et al. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector function.
Frontiers in Immunology. 5(520):1-17 (2014)). O monômero de domínio Fc também pode ser de qualquer espécie, por exemplo, humano, murino ou camundongo. Um dímero de monômeros de domínio Fc é um domínio Fc que pode se ligar a um receptor Fc, que é um receptor localizado na superfície dos leucócitos.
[00643] Em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc nos conjugados descritos neste documento podem conter uma ou mais substituições, adições e / ou deleção de aminoácidos em relação a um monômero de domínio Fc tendo uma sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68. Em algumas modalidades, um Asn em um monômero de domínio Fc nos conjugados, conforme descrito neste documento, pode ser substituído por Ala a fim de evitar a glicosilação ligada a N (ver, por exemplo, SEQ ID NOs: 12- 15, onde a substituição de Asn por Ala é marcada com*). Em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc nos conjugados descritos neste documento também pode conter adições Cys adicionais (ver, por exemplo, SEQ ID NOs: 9, 10 e 11, onde adições Cys são marcadas com *).
[00644] Em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc nos conjugados, conforme descrito neste documento, inclui uma fração adicional, por exemplo, um peptídeo de ligação à albumina, um peptídeo de purificação (por exemplo, um peptídeo hexa-histidina (HHHHHH (SEQ ID NO: 72)), ou uma sequência de sinal (por exemplo, sequência de sinal IL2 MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO: 73)) ligada ao N ou C terminal do monômero de domínio Fc. Em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc no conjugado não contém qualquer tipo de região variável de anticorpo, por exemplo, VH, VL, uma região determinante de complementaridade (CDR) ou uma região hipervariável (HVR).
[00645] Em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc nos conjugados, conforme descrito neste documento, pode ter uma sequência que é pelo menos 95% idêntica (por exemplo, 97%, 99% ou 99,5% idêntica) à sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68 mostrada abaixo.
Em algumas modalidades, um monômero de domínio Fc nos conjugados, conforme descrito neste documento, pode ter uma sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68 mostradas abaixo. SEQ ID NO: 1: Fc-IgG2a murino com sequência de sinal IL2 no N- terminal (negrito)
MYRMQLLSCIALSLALVTNSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPS VFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHR EDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAP QVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVL
DSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK SEQ ID NO: 2: Fc-IgG2a murino maduro
PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTC VVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDW MSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLT CMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNW
VERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK SEQ ID NO: 3: Fc-IgG1 humano com sequência de sinal de IL2 no N-terminal (negrito) e resíduos de aminoácidos MVRS do N-terminal adicionados (sublinhado)
MYRMQLLSCIALSLALVTNSMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 4: Fc-IgG1 humano maduro com resíduos de aminoácidos MVRS N-terminais adicionados (sublinhado)
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 5: Fc-IgG2a murino com sequência de sinal IL2 (negrito) no N-terminal e peptídeo hexa-histidina (itálico) no C-terminal
MYRMQLLSCIALSLALVTNSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPS VFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHR EDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAP QVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVL DSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKHH
HHHH SEQ ID NO: 6: Fc-IgG2a murino maduro com peptídeo hexa- histidina (itálico) no C-terminal
PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTC VVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDW MSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLT CMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNW
VERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKHHHHHH SEQ ID NO: 7: Fc-IgG1 humano com sequência de sinal IL2 (negrito) no N-terminal, resíduos de aminoácidos MVRS do N-terminal adicionados (sublinhado) e peptídeo hexa-histidina (itálico) no C-terminal
MYRMQLLSCIALSLALVTNSMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
HHHHHH SEQ ID NO: 8: Fc-IgG1 humano maduro com peptídeo hexa- histidina (itálico) no C-terminal e resíduos de aminoácidos MVRS N-terminais adicionados (sublinhado)
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 9: Fc-IgG1 humano com sequência de sinal IL2 (negrito) no N-terminal, resíduos de aminoácidos MVRS do N-terminal adicionados (sublinhado), duas cisteínas adicionais na região de dobradiça (*) e peptídeo hexa-histidina (itálico) no C-terminal MYRMQLLSCIALSLALVTNSMVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPE
LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 10: Fc-IgG1 humano maduro com resíduos de aminoácidos MVRS N-terminais adicionados (sublinhados), duas cisteínas adicionais na região de dobradiça (*) e peptídeo hexa-histidina (itálico) no C- terminal MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS
RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT
VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 11: Fc-IgG1 humano maduro com resíduos de aminoácidos MVRS N-terminais adicionados (sublinhados), duas cisteínas adicionais na região de dobradiça (*) MVRSDKTHTCPPCPPC*KC*PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS
RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT
VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 12: Fc-IgG2a murino com sequência de sinal IL2 (negrito) no N-terminal substituição de Asn por Ala (*) e peptídeo hexa-histidina (itálico) no C-terminal
MYRMQLLSCIALSLALVTNSPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPS VFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHR EDYA*STLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRA PQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPV LDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKH
HHHHH SEQ ID NO: 13: Fc-IgG2a murino maduro com substituição de Asn por Ala (*) e peptídeo hexa-histidina (itálico) no C-terminal
PRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTC VVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYA*STLRVVSALPIQHQD WMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTL TCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKN
WVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKHHHHHH SEQ ID NO: 14: Fc-IgG1 humano com sequência de sinal IL2 (negrito) no N-terminal, resíduos de aminoácidos MVRS do N-terminal adicionados (sublinhado), substituição de Asn por Ala (*) e peptídeo hexa- histidina (itálico) no C-terminal
MYRMQLLSCIALSLALVTNSMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYA*STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
HHHHHH SEQ ID NO: 15: Fc-IgG1 humano maduro com substituição de Asn por Ala (*), resíduos de aminoácidos MVRS N-terminais adicionados (sublinhados) e peptídeo hexa-histidina (itálico) no C-terminal
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA*STYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH SEQ ID NO: 16: IgG1 Fc humano com sequência de sinal de albumina de soro humano (negrito) no N-terminal e resíduos de aminoácidos ISAMVRS N-terminais adicionados (sublinhado)
MKWVTFISLLFLFSSAYSISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 17: IgG1 Fc humano com Sequência de Sinal de Albumina de Soro Humano (negrito) no N-terminal, resíduos de aminoácidos ISAMVRS N-terminais adicionados (sublinhado), ligante G4S C-terminal (itálico) e tag c-Myc C-terminal (sublinhado, itálico)
MKWVTFISLLFLFSSAYSISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGG
GGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 18: IgG1 Fc humano maduro com resíduos de aminoácidos ISAMVRS N-terminais adicionados (sublinhado), ligante G4S C- terminal (itálico) e tag c-Myc C-terminal (sublinhado, itálico)
ISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 19: IgG1 Fc humano com Sequência de Sinal de Albumina de Soro Humano (negrito), resíduos de aminoácidos ISAMVRS N- terminais adicionados (sublinhados) e modificação de lisina para serina (*) para evitar a conjugação de lisina neste sítio.
MKWVTFISLLFLFSSAYSISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPS*DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 20: IgG1 Fc humano madura com resíduos de aminoácidos ISAMVRS N-terminais adicionados (sublinhados) e modificação de lisina para serina (*) para evitar a conjugação de lisina neste sítio ISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPS*DTLMISRTP
EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 21: IgG1 Fc humano com Sequência de Sinal de Albumina de Soro Humano (negrito) no N-terminal, resíduos de aminoácidos ISAMVRS N-terminais adicionados (sublinhados), modificação de lisina para serina (*) para evitar a conjugação de lisina neste sítio, ligante G4S C-terminal (itálico) e tag C-Myc C-terminal (sublinhado, itálico)
MKWVTFISLLFLFSSAYSISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPS(*)DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
GGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 22: IgG1 Fc humano madura com resíduos de aminoácidos N-terminal ISAMVRS adicionados (sublinhado), modificação de lisina para serina (*) para evitar a conjugação de lisina neste sítio, ligante G4S C-terminal (itálico) e tag C-Myc C-terminal (sublinhado, itálico) ISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPS(*)DTLMISRT
PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 23: IgG1 Fc humano com Sequência de Sinal de Albumina de Soro Humano (negrito) no N-terminal, resíduos de aminoácidos ISAMVRS N-terminais adicionados (sublinhado), substituição de Asn por Ala (*), ligante G4S C-terminal (itálico) e tag C-myc C-terminal (sublinhado, itálico)
MKWVTFISLLFLFSSAYSISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYA(*)STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
GGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 24: IgG1 Fc humano maduro com resíduos de aminoácidos ISAMVRS N-terminais adicionados (sublinhado), substituição de Asn por Ala (*), ligante G4S C-terminal (itálico) e tag C-myc C-terminal (sublinhado, itálico)
ISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 25: IgG1 Fc humano com sequência de sinal de albumina de soro humano (negrito) no N-terminal, resíduos de aminoácidos ISAMVRS N-terminais adicionados (sublinhado), mutações H310A (*) e H435A (*) para impedir a ligação de FcRn, G4S C-terminal (itálico), e C-myc tag C- terminal (sublinhado, itálico)
MKWVTFISLLFLFSSAYSISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLA(*)QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA(*)KG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSP
GGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 26: IgG1 Fc humano madura com Sequência de Sinal de Albumina de Soro Humano (negrito) no N-terminal, resíduos de aminoácidos ISAMVRS N-terminal adicionados (sublinhados), com mutações H310A (*) e H435A (*) para impedir a ligação FcRn, G4S C-terminal (itálico) e tag C-myc C- terminal (sublinhado, itálico)
ISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLA (*)QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA(*)KGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNAYTQKSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 27: IgG1 Fc humano com Sequência de Sinal de Albumina de Soro Humano (negrito) no N-terminal, resíduos de aminoácidos
ISAMVRS N-terminais adicionados (sublinhado), ligante G4S C-terminal (itálico) e C-terminal mutado (lisina para fenilalanina, negrito) tag C-myc (sublinhado, itálico)
MKWVTFISLLFLFSSAYSISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGG
GGGSEQFLISEEDL SEQ ID NO: 28: IgG1 Fc humano maduro com resíduos de aminoácidos ISAMVRS N-terminais adicionados (sublinhado), ligante G4S C- terminal (itálico) e C-terminal mutado (lisina para fenilalanina, negrito) C-myc tag (sublinhado , itálico)
ISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQFLISEEDL SEQ ID NO: 29: IgG1 Fc humano com Sequência de Sinal de Albumina de Soro Humano (negrito) no N-terminal, resíduos de aminoácidos ISAMVRS N-terminais adicionados (sublinhado), substituição de Asn por Ala (*), ligante G4S C-terminal (itálico) e C-terminal mutado (lisina para fenilalanina, negrito) tag C-myc (sublinhado, itálico)
MKWVTFISLLFLFSSAYSISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYA(*)STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
GGGGSEQFLISEEDL SEQ ID NO: 30: IgG1 Fc humano madura com resíduos de aminoácidos MVRS N-terminais adicionados (sublinhado), substituição de Asn por Ala (*), ligante G4S C-terminal (itálico) e mutação C-terminal (lisina para fenilalanina, negrito) tag C-myc (sublinhado, itálico)
ISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA(*)STYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQFLISEEDL SEQ ID NO: 31: IgG1 Fc humano com Sequência de Sinal de Albumina de Soro Humano (negrito) no N-terminal, alótipo G1m(fa) (negrito itálico), ligante G4S C-terminal (itálico) e C-terminal mutado (lisina para fenilalanina, negrito) tag C-myc (sublinhado)
MKWVTFISLLFLFSSAYSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQF
LISEEDL SEQ ID NO: 32: IgG1 Fc humano com sequência de sinal de albumina de soro humano (negrito) no N-terminal, alótipo G1m(fa) (negrito itálico)
MKWVTFISLLFLFSSAYSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 33: IgG1 de Fc humano maduro com uma mutação tripla YTE (negrito e sublinhado) com resíduos de aminoácidos MVRS N- terminais adicionados (sublinhado)
MVRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 34: IgG1 Fc humano com sequência de sinal de albumina de soro humano (negrito) no N-terminal, contém resíduos EPKSS compreendendo a região de dobradiça completa no N-terminal de IgG1 Fc humano maduro (sublinhado), substituição de Cys por Ser (#), alótipo G1m(fa) (negrito itálico).
MKWVTFISLLFLFSSAYSEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 35: IgG1 Fc humano com sequência de sinal de IgG murina (negrito) no N-terminal, com remoção de resíduos de dobradiça EPKSSD do N-terminal do IgG1 Fc humano maduro, alótipo G1m(fa) (negrito itálico)
MGWSCIILFLVATATGVHSKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 36: IgG1 Fc humano maduro com uma mutação tripla YTE (negrito e sublinhado), com remoção de resíduos de dobradiça EPKSSD do N-terminal do IgG1 Fc humano maduro, alótipo G1m(fa) (negrito itálico)
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 37: IgG1 Fc humano maduro com uma mutação dupla LS (negrito e sublinhado), com remoção de resíduos de dobradiça EPKSSD do N-terminal do IgG1 Fc humano maduro, alótipo G1m(fa) (negrito itálico)
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 38: IgG1 Fc humano madura com Sequência de Sinal de Albumina de Soro Humano (negrito) no N-terminal, uma mutação tripla YTE (negrito e sublinhado), alótipo G1m(fa) (negrito itálico), ligante G4S C-terminal (itálico) e tag C-myc C-terminal (sublinhado)
MKWVTFISLLFLFSSAYSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEQK
LISEEDL SEQ ID NO: 39: IgG1 Fc humano maduro, em que X 1 é Met ou Trp, X2 é Ser ou Thr, X 3 é Thr ou Glu, X 4 é Asp ou Glu, e X 5 é Leu ou Met, X 6 é Met ou Leu, e X 7 é Asn ou Ser DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLX1IX2RX 3PEVTC
VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQ
DWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX 4EX5TKN
QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVX6HEALHX 7HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 40: Fc IgG1 humano maduro em que X 4 é Asp ou Glu, e X 5 é Leu ou Met
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX 4EX 5TKNQ
VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 41: Fc IgG1 humano maduro com uma mutação tripla YTE (negrito e sublinhado), e em que X 4 é Asp ou Glu, e X 5 é Leu ou Met
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX 4EX 5TKNQ
VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 42: IgG1 Fc humano maduro com uma mutação tripla YTE (negrito e sublinhado), alótipo G1m(fa) (negrito itálico)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 43: IgG1 Fc humano maduro com uma mutação tripla YTE (negrito e sublinhado), alótipo G1m (f) (negrito itálico)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 44: Fc IgG1 humano maduro com uma mutação dupla LS (negrito e sublinhado), e em que X 4 é Asp ou Glu, e X 5 é Leu ou Met
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX 4EX 5TKNQ
VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 45: IgG1 Fc humano maduro com uma mutação dupla LS (negrito e sublinhado), alótipo G1m(fa) (negrito itálico)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 46: IgG1 Fc humano maduro com uma mutação dupla LS (negrito e sublinhado), alótipo G1m (f) (negrito itálico)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 47: IgG1 Fc humano maduro com sequência de sinal Vh de MIgG de cadeia pesada de camundongo (negrito), substituição de Cys por Ser (#), e em que X 1 é Met ou Trp, X 2 é Ser ou Thr, X 3 é Thr ou Glu, X 4 é Asp ou Glu, e X 5 é Leu ou Met, X 6 é Met ou Leu, e X 7 é Asn ou Ser MGWSCIILFLVATATGVHSNVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)D KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLX1IX 2RX 3PEVTCVVVDVSHEDP
EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRX 4EX 5TKNQVSLTCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVX 6HEALHX7HYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 48: IgG1 Fc humano maduro com sequência de sinal Vh de MIgG de cadeia pesada de camundongo (negrito), substituição de Cys por Ser (#), alótipo G1m (fa) (negrito itálico) MGWSCIILFLVATATGVHSNVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)D
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF
SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 49: IgG1 Fc humano maduro com sequência de sinal Vh de MIgG de cadeia pesada de camundongo (negrito), substituição de Cys por Ser (#), alótipo G1m (f) (negrito itálico) MGWSCIILFLVATATGVHSNVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)D
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 50: IgG1 Fc humano maduro com sequência de sinal Vh de MIgG de cadeia pesada de camundongo (negrito), substituição de Cys por Ser (#), mutações M428L, N434S (negrito / sublinhado), alótipo G1m (fa) (negrito itálico) MGWSCIILFLVATATGVHSNVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)D
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF
SCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 51: IgG1 Fc humano maduro com sequência de sinal Vh de MIgG de cadeia pesada de camundongo (negrito), substituição de Cys por Ser (#), mutações M428L, N434S (negrito / sublinhado), alótipo G1m(f) (negrito itálico) MGWSCIILFLVATATGVHSNVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)D
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 52: IgG1 Fc humano maduro com sequência de sinal Vh de MIgG de cadeia pesada de camundongo (negrito), substituição de Cys por Ser (#), mutação tripla YTE (negrito e sublinhado), alótipo G1m(fa) (negrito itálico) MGWSCIILFLVATATGVHSNVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)D
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 53: IgG1 Fc humano maduro com sequência de sinal Vh de MIgG de cadeia pesada de camundongo (negrito), substituição de Cys por Ser (#), mutação tripla YTE (negrito e sublinhado), alótipo G1m(f) (negrito itálico) MGWSCIILFLVATATGVHSNVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)D
KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 54: IgG1 Fc humano maduro com sequência de sinal Vh MIgG de cadeia pesada de camundongo (negrito), resíduos de aminoácidos ISAMVRS N-terminais adicionados (itálico), mutações M428L, N434S (negrito / sublinhado), ligante G4S (itálico), e C-terminal C-myc-tag (sublinhado), alótipo G1m(f) (negrito itálico)
MGWSCIILFLVATATGVHSISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQ
KSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 55: IgG1 Fc humano maduro com sequência de sinal Vh MIgG de cadeia pesada de camundongo (negrito), resíduos de aminoácidos ISAMVRS N-terminais adicionados (itálico), mutações M428L, N434S (negrito / sublinhado), ligante G4S (itálico), C-terminal C-myc-tag (sublinhado), alótipo G1m(fa) (negrito itálico)
MGWSCIILFLVATATGVHSISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQ
KSLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 56: IgG1 Fc humano maduro com sequência de sinal Vh MIgG de cadeia pesada de camundongo (negrito), resíduos de aminoácidos ISAMVRS N-terminais adicionados (itálico), mutante triplo YTE (negrito / sublinhado), ligante G4S (itálico), e C-terminal C-myc-tag (sublinhado), alótipo G1m(f) (negrito itálico)
MGWSCIILFLVATATGVHSISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 57: IgG1 Fc humano maduro com sequência de sinal Vh MIgG de cadeia pesada de camundongo (negrito), resíduos de aminoácidos ISAMVRS N-terminais adicionados (itálico), mutação tripla YTE (negrito / sublinhado), ligante G4S (itálico), C-terminal C-myc-tag (sublinhado), alótipo G1m(fa) (negrito itálico)
MGWSCIILFLVATATGVHSISAMVRSDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGGGGGSEQKLISEEDL SEQ ID NO: 58: IgG1 humana maduro com sequência de sinal de MIgG1 de cadeia pesada de camundongo (negrito), substituição Cys por
Ser (#), G4S C-terminal (itálico) e peptídeo IgA C-terminal (sublinhado), alótipo G1m(fa) (negrito itálico) MGWSCIILFLVATATGVHSEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSPGGGGGSQRNPRLRLIRRHPTLRIPPI SEQ ID NO: 59: IgG1 humano maduro com sequência de sinal MIgG1 de cadeia pesada de camundongo (negrito), substituição de Cys por Ser (#), mutações M428L, N434S (negrito / sublinhado), G4S C-terminal (itálico) e peptídeo de IgA C-terminal (sublinhado), alótipo G1m(fa) (negrito itálico) MGWSCIILFLVATATGVHSEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLG
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYT
QKSLSLSPGGGGGSQRNPRLRLIRRHPTLRIPPI SEQ ID NO: 60: Fc IgG1 humano maduro, Z 1 é Cys ou Ser, e em que X 1 é Met ou Trp, X 2 é Ser ou Thr, X 3 é Thr ou Glu, X 4 é Asp ou Glu, e X5 é Leu ou Met, X 6 é Met ou Leu, e X 7 é Asn ou Ser NVNHKPSNTKVDKKVEPKSZ1DKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLX 1IX 2RX 3PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSRX 4EX 5TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVX6HEALHX 7HYTQK
SLSLSPGK
SEQ ID NO: 61: Fc IgG1 humano maduro, substituição de Cys por Ser (#), e em que X 1 é Met ou Trp, X 2 é Ser ou Thr, X 3 é Thr ou Glu, X 4 é Asp ou Glu, e X 5 é Leu ou Met, X 6 é Met ou Leu, e X 7 é Asn ou Ser NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLX 1IX 2RX 3PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRX 4EX5TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVX 6HEALHX 7HYTQ
KSLSLSPGK SEQ ID NO: 62: IgG1 Fc humano maduro, substituição de Cys por Ser (#), X 4 é Asp ou Glu, e X 5 é Leu ou Met NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSV
FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP
REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRX 4EX 5TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY
KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK SEQ ID NO: 63: IgG1 Fc humano maduro, substituição de Cys por Ser (#), alótipo G1m(f) (negrito itálico) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSV
FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPGK SEQ ID NO: 64: IgG1 Fc humano maduro, substituição de Cys por Ser (#), alótipo G1m(fa) (negrito itálico) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSV
FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPGK SEQ ID NO: 65: IgG1 Fc humano maduro, substituição Cys por Ser (#), mutações M428L, N434S (negrito / sublinhado), alótipo G1m(fa) (negrito itálico) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSV
FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLS
LSPGK SEQ ID NO: 66: IgG1 Fc humano maduro, substituição Cys por Ser (#), mutações N434S, M428L (negrito / sublinhado), alótipo G1m(f) (negrito itálico) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSV
FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLS
LSPGK SEQ ID NO: 67: IgG1 Fc humana maduro, substituição de Cys por Ser (#), mutação tripla YTE (negrito e sublinhado), alótipo G1m(fa) (negrito itálico) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSV
FLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPGK SEQ ID NO: 68: IgG1 Fc humano maduro, substituição de Cys por Ser (#), mutação tripla YTE (negrito e sublinhado), alótipo G1m(f) (negrito itálico) NVNHKPSNTKVDKKVEPKSS(#)DKTHTCPPCPAPELLGGPSV
FLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK.
[00646] Conforme definido neste documento, um domínio Fc inclui dois monômeros de domínio Fc que são dimerizados pela interação entre os domínios constantes de anticorpo C H3, bem como uma ou mais ligações dissulfeto que se formam entre os domínios de dobradiça dos dois monômeros de domínio Fc de dimerização. Um domínio Fc forma a estrutura mínima que se liga a um receptor Fc, por exemplo, receptores Fc-gama (isto é, receptores Fcγ (FcγR)), receptores Fc-alfa (isto é, receptores Fcα (FcαR)), receptores Fc-epsilon (isto é, receptores Fcε (FcεR)) e / ou o receptor Fc neonatal (FcRn). Em algumas modalidades, um domínio Fc da presente invenção se liga a um receptor Fcγ (por exemplo, receptor FcRn, FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32), FcγRIIb (CD32), FcγRIIIa (CD16a), FcγRIIIb (CD16b)), e/ou FcγRIV e/ou o receptor Fc neonatal (FcRn).
[00647] Em algumas modalidades, o monômero de domínio Fc ou domínio Fc da invenção é um monômero de domínio Fc aglicosilado ou domínio Fc (por exemplo, um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc que mantém o acoplamento a um receptor Fc (por exemplo, FcRn). Por exemplo, o domínio Fc é uma variante de IgG1 aglicosilada que mantém o acoplamento a um receptor Fc (por exemplo, uma IgG1 tendo uma substituição de aminoácido em N297 e / ou T299 do motivo de glicosilação).
Domínios Fc aglicosilados exemplificativos e métodos para fazer domínios Fc aglicosilados são conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito em Sazinsky S.L. et al., Aglycosylated immunoglobulin G1 variants productively engage activating Fc receptors, PNAS, 2008, 105(51):20167-20172, que é aqui incorporado em sua totalidade.
[00648] Em algumas modalidades, o domínio Fc ou monômero de domínio Fc da invenção é engenheirado para intensificar a ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn). Por exemplo, o domínio Fc pode incluir a mutação tripla correspondente a M252Y / S254T / T256E (YTE) (por exemplo, uma IgG1, tal como uma IgG1 humana ou humanizada com uma mutação YTE, por exemplo SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 56 ou SEQ ID NO: 57). O domínio Fc pode incluir o mutante duplo correspondente a M428L / N434S (LS) (por exemplo, um IgG1, tal como um IgG1 humano ou humanizado com uma mutação LS, tal como SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 ou SEQ ID NO: 59). O domínio Fc pode incluir o único mutante correspondente a N434H (por exemplo, uma IgG1, como uma IgG1 humana ou humanizada com uma mutação N434H). O domínio Fc pode incluir o único mutante correspondente a C220S (por exemplo, uma IgG1, tal como uma IgG1 humana ou humanizada com uma mutação C220S, tal como SEQ ID NOs: 34, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 58,
SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68).
O domínio Fc pode incluir uma combinação de uma ou mais das mutações descritas acima que intensificam a ligação ao FcRn. A ligação aumentada ao FcRn pode aumentar a meia-vida do conjugado contendo o domínio Fc.
Por exemplo, a incorporação de uma ou mais mutações de aminoácidos que aumentam a ligação ao FcRn (por exemplo, uma mutação YTE, uma mutação LS ou uma mutação N434H) pode aumentar a meia-vida do conjugado em 5%, 10%, 15 %, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%.
100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em relação a um conjugado com o domínio Fc correspondente sem a mutação que intensifica a ligação de FcRn. Domínios Fc exemplificativos com ligação aprimorada ao FcRN e métodos para fazer domínios Fc tendo ligação intensificada ao FcRN são conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito em Maeda, A. et al., Identification of human IgG1 variant with enhanced FcRn binding and without increased binding to rheumatoid factor autoantibody, MABS, 2017, 9(5):844- 853, que é aqui incorporado em sua totalidade. Como utilizado neste documento, um aminoácido "correspondente a" um resíduo de aminoácido particular (por exemplo, de uma SEQ ID NO. Particular) deve ser entendido como incluindo qualquer resíduo de aminoácido que um versado na técnica entenderia para se alinhar ao resíduo (por exemplo, da sequência particular).
Por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68 pode ser mutada para incluir uma mutação YTE, uma mutação LS e / ou uma mutação N434H por mutação dos "resíduos correspondentes" da sequência de aminoácidos.
[00649] Como utilizado neste documento, um átomo de enxofre "correspondente a" um resíduo de cisteína particular de uma SEQ ID NO particular. deve ser entendido como incluindo o átomo de enxofre de qualquer resíduo de cisteína que um versado na técnica entenderia para se alinhar à cisteína particular da sequência particular. O alinhamento da sequência de proteína de IgG1 humana (UniProtKB: P01857; SEQ ID NO: 94), IgG2 humana (UniProtKB: P01859; SEQ ID NO: 95), IgG3 humana (UniProtKB: P01860; SEQ ID NO: 96) e IgG4 humana (UniProtKB: P01861; SEQ ID NO: 97) é fornecido abaixo (alinhado com Clustal Omega Multiple Pairwise Alignment). O alinhamento indica resíduos de cisteína (por exemplo, átomos de enxofre de resíduos de cisteína) que “correspondem” uns aos outros (em caixas e indicados pelo símbolo •). Um versado na técnica seria prontamente capaz de realizar tal alinhamento com qualquer variante de IgG da invenção para determinar o átomo de enxofre de uma cisteína que corresponde a qualquer átomo de enxofre de uma cisteína particular de uma SEQ ID NO particular. aqui descrita (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68). Por exemplo, um versado na técnica seria prontamente capaz de determinar que Cys10 de SEQ ID NO: 10 (a primeira cisteína do motivo CPPC conservado da região de dobradiça do domínio Fc) corresponde a, por exemplo, Cys109 de IgG1, Cys106 de IgG2, Cys156 de IgG3, Cys29 de SEQ ID NO: 1, Cys9 de SEQ ID NO: 2, Cys30 de SEQ ID NO: 3 ou Cys10 de SEQ ID NO: 10.
[00650] Em algumas modalidades, o domínio Fc ou monômero de domínio Fc da invenção tem a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 39-68 pode incluir ainda aminoácidos adicionais no N-terminal (Xaa)x e / ou aminoácidos adicionais no C-terminal (Xaa) z, em que Xaa é qualquer aminoácido e x e z são um número inteiro maior ou igual a zero, geralmente menor que 100, preferencialmente menor que 10 e mais preferencialmente 0, 1, 2, 3, 4 ou 5. Em algumas modalidades, os aminoácidos adicionais são pelo menos 70% (por exemplo, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idênticos a um ou mais aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 94. Por exemplo, os aminoácidos adicionais podem ser um único aminoácido auxiliar no C-terminal correspondente a Lys330 de IgG1 (SEQ ID NO: 94).
[00651] Como utilizado neste documento, um átomo de nitrogênio "correspondente a" um resíduo de lisina particular de uma SEQ ID NO particular. deve ser entendido como incluindo o átomo de nitrogênio de qualquer resíduo de lisina que um versado na técnica entenderia para se alinhar à lisina particular da sequência particular. O alinhamento da sequência de proteína de IgG1 humana (UniProtKB: P01857; SEQ ID NO: 94), IgG2 humana (UniProtKB: P01859; SEQ ID NO: 95), IgG3 humana (UniProtKB: P01860; SEQ ID NO: 96) e IgG4 humana (UniProtKB: P01861; SEQ ID NO: 97) é fornecido abaixo (alinhado com Clustal Omega Multiple Pairwise Alignment). O alinhamento indica resíduos de lisina (por exemplo, átomos de nitrogênio de resíduos de lisina) que “correspondem” uns aos outros (em caixas e indicados pelo símbolo *). Um versado na técnica seria prontamente capaz de realizar tal alinhamento com qualquer variante de IgG da invenção para determinar o átomo de nitrogênio de uma lisina que corresponde a qualquer átomo de nitrogênio de uma lisina particular de uma SEQ ID NO particular. aqui descrita (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68). Por exemplo, um versado na técnica seria prontamente capaz de determinar que Lys35 de SEQ ID NO: 10 corresponde a, por exemplo, Lys129 de IgG1, Lys126 de IgG2, Lys176 de IgG3, Lys51 de SEQ ID NO: 1, Lys31 da SEQ ID NO: 2, Lys50 da SEQ ID NO: 3 ou Lys30 da SEQ ID NO:
10.
Alinhamento de sequência de proteína de IgG1 (SEQ ID NO: 94), IgG2 (SEQ ID NO: 95), IgG3 (SEQ ID NO: 96) e IgG4 (SEQ ID NO: 97)
Ativação de células imunes
[00652] Os receptores Fc-gama (FcγRs) ligam-se à porção Fc da imunoglobulina G (IgG) e desempenham papéis importantes na ativação e regulação imunológica. Por exemplo, os domínios IgG Fc em complexos imunes (ICs) envolvem FcγRs com alta avidez, desencadeando cascatas de sinalização que regulam a ativação de células imunes. A família FcγR humana contém vários receptores de ativação (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa e FcγRIIIb) e um receptor inibitório (FcγRIIb). A sinalização de FcγR é mediada por domínios intracelulares que contêm motivos de ativação de tirosina imune (ITAMs) para ativação de FcγRs e motivos inibitórios de tirosina imune (ITIM) para o receptor inibitório FcγRIIb. Em algumas modalidades, a ligação de FcγR por domínios Fc resulta na fosforilação de ITAM por quinases da família Src; isso ativa as quinases da família Syk e induz redes de sinalização a jusante, que incluem as vias PI3K e Ras.
[00653] Nos conjugados aqui descritos, a porção dos conjugados incluindo monômeros ou dímeros de inibidores da neuraminidase se liga a e inibe a neuraminidase viral levando à inibição da replicação viral, enquanto a a porção do domínio Fc dos conjugados se liga a FcγRs (por exemplo, FcRn, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa e FcγRIIIb) em células imunes e ativam a fagocitose e funções efetoras, tais como citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), levando assim ao engolfamento e destruição de partículas virais por células imunes e intensificando ainda mais a atividade antiviral dos conjugados. Exemplos de células imunes que podem ser ativadas pelos conjugados aqui descritos incluem, mas não estão limitados a, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos, células dendríticas foliculares, células assassinas naturais e mastócitos.
IV. Proteínas de albumina e peptídeos de ligação a proteínas de albumina Proteínas de albumina
[00654] Uma proteína de albumina da invenção pode ser uma albumina de ocorrência natural ou uma variante da mesma, tal como uma variante engenheirada de uma proteína de albumina de ocorrência natural. As variantes incluem polimorfismos, fragmentos como domínios e subdomínios e proteínas de fusão. Uma proteína de albumina pode incluir a sequência de uma proteína de albumina obtida de qualquer fonte. De preferência, a fonte é um mamífero, tal como humano ou bovino. Mais preferencialmente, a proteína de albumina é albumina de soro humano (HSA), ou uma variante da mesma.
Albuminas de soro humano incluem qualquer proteína de albumina possuindo uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural em humanos e variantes das mesmas. Uma sequência de codificação de proteína de albumina pode ser obtida por métodos conhecidos pelos versados na técnica para isolamento e sequenciamento de cDNA correspondente a genes humanos. Uma proteína de albumina da invenção pode incluir a sequência de aminoácidos de albumina de soro humano (HSA), fornecida em SEQ ID NO: 69 ou SEQ ID NO: 70, ou a sequência de aminoácidos de albumina de soro de camundongo (MSA), fornecida em SEQ ID NO: 71, ou uma variante ou fragmento da mesma, de preferência uma variante funcional ou fragmento da mesma. Um fragmento ou variante pode ou não ser funcional, ou pode reter a função da albumina em algum grau. Por exemplo, um fragmento ou variante pode reter a capacidade de se ligar a um receptor de albumina, como HSA ou MSA, em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% , 90%, 100% ou 105% da capacidade da albumina parental (por exemplo, a albumina parental da qual o fragmento ou variante é derivado). A capacidade de ligação relativa pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica, como por ressonância de plasmon de superfície.
[00655] A proteína de albumina pode ser uma variante polimórfica de ocorrência natural de uma proteína de albumina, tal como albumina de soro humano. Geralmente, as variantes ou fragmentos de albumina de soro humano terão pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% ou 70% e, de preferência, 80%, 90%, 95 %, 100% ou 105% ou mais de albumina de soro humano ou atividade de ligação de albumina de soro de camundongo.
[00656] A proteína de albumina pode incluir a sequência de aminoácidos da albumina de soro bovino. Proteínas de albumina de soro bovino incluem qualquer albumina com uma sequência de aminoácidos de ocorrência natural em vacas, por exemplo, como descrito pelo número de acessão Swissprot P02769, e variantes das mesmas como aqui definidas. Proteínas de albumina de soro bovino também incluem fragmentos de albumina de soro bovino de comprimento total ou variantes das mesmas, como aqui definido.
[00657] A proteína de albumina pode compreender a sequência de uma albumina derivada de uma albumina de soro de cão (por exemplo, número de acessão Swissprot P49822-1), porco (por exemplo, número de acessão Swissprot P08835-1), cabra (por exemplo, produto Sigma no. A2514 ou A4164), gato (por exemplo, número de acessão Swissprot P49064-1), frango (por exemplo, número de acessão Swissprot P19121-1), ovalbumina (por exemplo, ovalbumina de frango) (por exemplo, número de acessão Swissprot P01012-1), ovalbumina de peru (por exemplo, número de acessão Swissprot O73860-1), burro (por exemplo, número de acessão Swissprot Q5XLE4-1), porquinho da índia (por exemplo, número de acessão Swissprot Q6WDN9-1), hamster (por exemplo, como descrito em DeMarco et al. International Journal for Parasitology 37 (11):1201-1208 (2007)), cavalo (por exemplo, número de acessão Swissprot P35747-1), macaco rhesus (por exemplo, número de acessão Swissprot Q28522-1), camundongo (por exemplo, número de acessão Swissprot P07724 -1), pombo (por exemplo, conforme definido por Khan et al.
Int. J. Biol. Macromol. 30(3-4),171-8 (2002)), coelho (por exemplo, número de acessão Swissprot P49065-1), rato (por exemplo, número de acessão Swissprot P02770-1) ou ovelha (por exemplo, número de acessão Swissprot P14639-1), e inclui variantes e fragmentos dos mesmos, conforme definido neste documento.
[00658] Muitas formas mutantes de albumina de ocorrência natural são conhecidas dos versados na técnica. Formas mutantes de albumina de ocorrência natural são descritas em, por exemplo, Peters, et al. All About Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical Applications, Academic Press, Inc.,
San Diego, Calif., p.170-181 (1996).
[00659] As proteínas de albumina da invenção incluem variantes de proteínas de albumina de ocorrência natural. Uma albumina variante se refere a uma proteína de albumina tendo pelo menos uma mutação de aminoácido, tal como uma mutação de aminoácido gerada por uma inserção, deleção ou substituição, conservadora ou não conservadora, desde que tais alterações resultem em uma proteína de albumina para a qual pelo menos uma propriedade básica não foi significativamente alterada (por exemplo, não foi alterada em mais que 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ou 40%).
Propriedades exemplificativas que podem definir a atividade de uma proteína de albumina incluem atividade de ligação (por exemplo, incluindo especificidade de ligação ou afinidade para bilirrubina, ou um ácido graxo, como um ácido graxo de cadeia longa), osmolaridade ou comportamento em uma certa faixa de pH.
[00660] Normalmente, uma variante de proteína de albumina terá pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60% e de preferência pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácidos com uma proteína de albumina de ocorrência natural, tal como a proteína de albumina de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71.
[00661] Os métodos para a produção e purificação de albuminas humanas recombinantes estão bem estabelecidos (Sleep et al.
Biotechnology, 8(1):42-6 (1990)), e incluem a produção de albumina humana recombinante para aplicações farmacêuticas (Bosse et al. J Clin Pharmacol 45(1):57-67 (2005)). The three-dimensional structure of HSA has been elucidated by X-ray crystallography (Carter et al. Science. 244(4909): 1195- 8(1998)); Sugio et al. Protein Eng. 12(6):439-46 (1999)). A cadeia de polipeptídeo HSA tem 35 resíduos de cisteína, que formam 17 ligações dissulfeto, e uma cisteína desemparelhada (por exemplo, livre) na posição 34 da proteína madura. Cys-34 de HSA foi usado para a conjugação de moléculas com albumina (Leger et al. Bioorg Med Chem Lett 14(17):4395-8 (2004); Thibaudeau et al. Bioconjug Chem 16(4):1000-8 (2005)), e fornece um sítio para conjugação específica de sítio.
SEQ ID NO: 69 (albumina de soro humano (HSA), variante 1)
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVN EVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEP ERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYF YAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS LQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECA DDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAAD FVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCC AAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKK VPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEK TPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKE RQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGK
KLVAASQAALGL SEQ ID NO: 70 (albumina de soro humano (HSA), variante 2)
RGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFED HVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCD KSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASL QKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECC HGDLLECADDRADLAKYICENQDSISS KLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCK NYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECY AKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKK VPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVL NQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVN RRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTA LVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAF
VEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL SEQ ID NO: 71 (albumina de soro de camundongo (MSA))
RGVFRREAHKSEIAHRYNDLGEQHFKGLVLIAFSQYLQKCSYDE HAKLVQEVTDFAKTCVADESAANCDK SLHTLFGDKLCAIPNLRENYGELADCCTKQEPERNECFLQHKDD NPSLPPFERPEAEAMCTSFKENPTTF MGHYLHEVARRHPYFYAPELLYYAEQYNEILTQCCAEADKESCL TPKLDGVKEKALVSSVRQRMKCSSM QKFGERAFKAWAVARLSQTFPNADFAEITKLATDLTKVNKECCH GDLLECADDRAELAKYMCENQATISSKLQTCCDKPLLKKAHCLSEVEHDTMP ADLPAIAADFVEDQEVCKNYAEAKDVFLGTFLYEYSRRHPDYSV SLLLRLAKKYEATLEKCCAEANPPACYGTVLAEFQPLVEEPKNLV KTNCDLYEKLGEYGFQNAILVRYTQK APQVSTPTLVEAARNLGRVGTKCCTLPEDQRLPCVEDYLSAILN RVCLLHEKTPVSEHVTKCCSGSLVER RPCFSALTVDETYVPKEFKAETFTFHSDICTLPEKEKQIKKQTAL AELVKHKPKATAEQLKTVMDDFAQFL
DTCCKAADKDTCFSTEGPNLVTRCKDALA Conjugação de proteínas de albumina
[00662] Uma proteína de albumina da invenção pode ser conjugada a (por exemplo, por meio de uma ligação covalente) a qualquer composto da invenção (por exemplo, por meio da porção ligante de um monômero ou dímero inibidor de neuraminidase). A proteína albumina pode ser conjugada com qualquer composto da invenção por qualquer método bem conhecido dos versados na técnica para a produção de conjugados de molécula pequena-proteína. Isso pode incluir a conjugação covalente a um aminoácido exposto ao solvente, como uma cisteína ou lisina exposta ao solvente. Por exemplo, albumina de soro humano pode ser conjugada a um composto da invenção por ligação covalente ao átomo de enxofre correspondente a Cys34 de SEQ ID NO: 69 ou Cys40 de SEQ ID NO: 70.
[00663] Uma proteína albumina da invenção pode ser conjugada a qualquer composto da invenção por meio de um aminoácido localizado dentro de 10 resíduos de aminoácidos da extremidade C-terminal ou N-terminal da proteína de albumina. Uma proteína de albumina pode incluir uma fusão polipeptídica C-terminal ou N-terminal de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 ou mais aminoácidos. A fusão de polipeptídeo C-terminal ou N-terminal pode incluir um ou mais resíduos de cisteína ou lisina expostos a solvente, que podem ser usados para a conjugação covalente de um composto da invenção (por exemplo, conjugação a um monômero ou dímero inibidor de neuraminidase, incluindo por forma de um ligante).
[00664] As proteínas de albumina da invenção incluem quaisquer proteínas de albumina que foram engenheiradas para incluir um ou mais resíduos de cisteína ou lisina expostos a solvente, que podem fornecer um sítio para conjugação a um composto da invenção (por exemplo, conjugação a um monômero ou dímero inibidor da neuraminidase, incluindo por meio de um ligante). Mais preferencialmente, a proteína de albumina conterá uma única cisteína ou lisina exposta ao solvente, permitindo assim a conjugação específica de sítio de um composto da invenção.
[00665] Métodos exemplificativos para a produção de variantes engenheiradas de proteínas de albumina que incluem um ou mais resíduos de cisteína competentes para a conjugação são fornecidos no Pedido de Patente U.S. 2017/0081389, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade. Resumidamente, as variantes de proteína de albumina preferidas são aquelas que compreendem um único resíduo de cisteína, exposto ao solvente, desemparelhado (por exemplo, livre), permitindo assim a conjugação específica de sítio de um ligante ao resíduo de cisteína.
[00666] As proteínas de albumina que foram engenheiradas para permitir a conjugação química a um resíduo de cisteína não pareado exposto a solvente incluem as seguintes variantes de proteína de albumina: (a) uma proteína de albumina tendo uma substituição de um resíduo de aminoácido não cisteína por uma cisteína em um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um de L585, D1, A2, D562, A364, A504, E505, T79, E86, D129, D549 , A581, D121, E82, S270, Q397 e A578 de SEQ ID NO: 69; (b) uma proteína de albumina tendo uma inserção de uma cisteína em uma posição adjacente ao lado N ou C-terminal de um resíduo de aminoácido correspondente a qualquer um de L585, D1, A2, D562, A364, A504, E505, T79, E86 , D129, D549, A581, D121, E82, S270, Q397 e A578 de SEQ ID NO: 69; (c) uma proteína de albumina engenheirada para ter uma cisteína desemparelhada tendo um grupo tiol livre em um resíduo correspondente a qualquer um de C369, C361, C91, C177, C567, C316, C75, C169, C124 ou C558 de SEQ ID NO: 69 , e que pode ou não ser gerado por deleção ou substituição de um resíduo correspondente a C360, C316, C75, C168, C558, C361, C91, C124, C169 ou C567 de SEQ ID NO: 69; e / ou (d) adição de uma cisteína ao N ou C-terminal de uma proteína albumina.
[00667] Em algumas modalidades da invenção, o resultado líquido dos eventos de substituição, exclusão, adição ou inserção de (a), (b), (c) e / ou (d) é que o número de resíduos de cisteína competentes de conjugação da sequência polipeptídica é aumentada em relação à sequência da albumina parental. Em algumas modalidades da invenção, o resultado líquido dos eventos de substituição, exclusão, adição ou inserção de (a), (b), (c) e / ou (d) é que o número de resíduos de cisteína competente de conjugação da sequência polipeptídica é uma, permitindo assim a conjugação específica de sítio.
[00668] As variantes de proteína de albumina preferidas também incluem proteínas de albumina com um único resíduo de lisina exposto ao solvente, permitindo assim a conjugação específica de sítio de um ligante com o resíduo de lisina. Tais variantes podem ser geradas por engenharia de uma proteína de albumina, incluindo qualquer um dos métodos descritos anteriormente (por exemplo, inserção, deleção, substituição ou fusão C-terminal ou N-terminal).
Peptídeos de ligação à proteína de albumina
[00669] A conjugação de um composto biologicamente ativo a um peptídeo de ligação à proteína albumina pode alterar a farmacodinâmica do composto biologicamente ativo, incluindo a alteração da absorção, penetração e difusão pelo tecido. Em uma modalidade preferida, a conjugação de um peptídeo de ligação à proteína de albumina a um composto da invenção (por exemplo, um monômero ou dímero inibidor de neuraminidase, por meio de um ligante) aumenta a eficácia ou diminui a toxicidade do composto, em comparação com o composto sozinho.
[00670] Os peptídeos de ligação de proteína de albumina da invenção incluem qualquer polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de 5 a 50 (por exemplo, 5 a 40, 5 a 30, 5 a 20, 5 a 15, 5 a 10, 10 a 50, 10 a 30 , ou 10 a 20) resíduos de aminoácidos que têm afinidade e funções para se ligar a uma proteína de albumina, tal como qualquer uma das proteínas de albumina aqui descritas. De preferência, o peptídeo de ligação à proteína albumina liga-se a uma albumina sérica de ocorrência natural, mais preferencialmente albumina sérica humana. Um peptídeo de ligação à proteína de albumina pode ser de diferentes origens, por exemplo, sintético, humano, camundongo ou rato. Os peptídeos de ligação de proteína de albumina da invenção incluem peptídeos de ligação de proteína de albumina que foram projetados para incluir um ou mais (por exemplo, dois, três, quatro ou cinco) resíduos de cisteína ou lisina expostos a solvente, que podem fornecer um sítio para conjugação a um composto da invenção (por exemplo, conjugação a um monômero ou dímero inibidor da neuraminidase, incluindo por meio de um ligante). Mais preferencialmente, o peptídeo de ligação à proteína de albumina conterá uma única cisteína ou lisina exposta ao solvente, permitindo assim a conjugação específica de sítio de um composto da invenção. Peptídeos de ligação de proteína de albumina podem incluir apenas resíduos de aminoácidos de ocorrência natural ou podem incluir um ou mais resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural. Quando incluído, um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural (por exemplo, a cadeia lateral de um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural) pode ser usado como o ponto de ligação para um composto da invenção (por exemplo, um monômero ou dímero inibidor de neuraminidase, incluindo por meio de um ligante). Os peptídeos de ligação à proteína de albumina da invenção podem ser lineares ou cíclicos. Os peptídeos de ligação à proteína de albumina da invenção inclui quaisquer peptídeos de ligação à proteína de albumina conhecidos por um versado na técnica, exemplos dos quais são fornecidos aqui.
[00671] O peptídeo de ligação à proteína de albumina e conjugados incluindo um peptídeo de ligação de proteína de albumina, preferencialmente ligam uma proteína de albumina (por exemplo, albumina de soro humano) com uma afinidade caracterizada por uma constante de dissociação, Kd, que é inferior a cerca de 100 μM, de preferência inferior a cerca de 100 nM, e mais preferencialmente não se ligam substancialmente a outras proteínas plasmáticas. Os exemplos específicos de tais compostos são peptídeos lineares ou cíclicos, de preferência entre cerca de 10 e 20 resíduos de aminoácidos de comprimento, opcionalmente modificados no N-terminal ou C- terminal ou em ambos.
[00672] Os peptídeos de ligação de proteína de albumina incluem peptídeos lineares e cíclicos compreendendo as seguintes fórmulas gerais, em que Xaa é qualquer aminoácido: SEQ ID NO: 74 Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Phe-Cys-Xaa- Asp-Trp-Pro-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Cys SEQ ID NO: 75 Val-Cys-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Ile-Cys-Phe SEQ ID NO: 76 Cys-Tyr-Xaa-Pro-Gly-Xaa-Cys SEQ ID NO: 77 Asp-Xaa-Cys-Leu-Pro-Xaa-Trp-Gly-Cys-Leu-Trp SEQ ID NO: 78 Trp-Cys-Asp-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Ala-Xaa-Asp-Leu-Cys SEQ ID NO: 79 Asp-Leu-Val-Xaa-Leu-Gly-Leu-Glu-Cys-Trp.
[00673] Os peptídeos de ligação de proteína de albumina da invenção incluem ainda qualquer uma das seguintes sequências de peptídeos, que podem ser lineares ou cíclicas: SEQ ID NO: 80 DLCLRDWGCLW SEQ ID NO: 81 DICLPRWGCLW SEQ ID NO: 82 MEDICLPRWGCLWGD SEQ ID NO: 83 QRLMEDICLPRWGCLWEDDE SEQ ID NO: 84 QGLIGDICLPRWGCLWGRSV SEQ ID NO: 85 QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK
SEQ ID NO: 86 EDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO: 87 RLMEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO: 88 MEDICLPRWGCLWEDD SEQ ID NO: 89 MEDICLPRWGCLWED SEQ ID NO: 90 RLMEDICLARWGCLWEDD SEQ ID NO: 91 EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG SEQ ID NO: 92 RAPESFVCYWETICFERSEQ SEQ ID NO: 93 EMCYFPGICWM.
[00674] Os peptídeos de ligação de proteína de albumina de SEQ ID NOs: 74-93 podem incluir ainda aminoácidos adicionais no N-terminal (Xaa)x e / ou aminoácidos adicionais no terminal C(Xaa)z, em que Xaa é qualquer aminoácido e x e z são um número inteiro maior ou igual a zero, geralmente menor que 100, de preferência menor que 10 e mais preferencialmente 0, 1, 2, 3, 4 ou 5.
[00675] Outros exemplos de peptídeos de ligação à proteína de albumina são fornecidos no Pedido de Patente U.S 2005/0287153, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
Conjugação de peptídeos de ligação à proteína de albumina
[00676] Um peptídeo de ligação à proteína de albumina da invenção pode ser conjugado a (por exemplo, por meio de uma ligação covalente) a qualquer composto da invenção (por exemplo, por meio da porção ligante de um monômero ou dímero inibidor de neuraminidase). O peptídeo de ligação à proteína albumina pode ser conjugado a qualquer composto da invenção por qualquer método conhecido pelos versados na técnica para a produção de conjugados de peptídeo-molécula pequena. Isso pode incluir a conjugação covalente ao grupo da cadeia lateral de um resíduo de aminoácido, como uma cisteína, uma lisina ou um aminoácido não natural. Alternativamente, a conjugação covalente pode ocorrer no C-terminal (por exemplo, para o C-
terminal de ácido carboxílico, ou para o grupo da cadeia lateral do resíduo C- terminal) ou no N-terminal (por exemplo, ao grupo N-terminal amino ou ao grupo da cadeia lateral do aminoácido N-terminal).
V. Ligantes
[00677] Um ligante se refere a uma ligação ou conexão entre dois ou mais componentes em um conjugado aqui descrito (por exemplo, entre dois inibidores de neuraminidase em um conjugado aqui descrito, entre um inibidor de neuraminidase e um domínio Fc ou uma proteína de albumina em um conjugado aqui descrito, e entre um dímero de dois inibidores da neuraminidase e um domínio Fc ou uma proteína de albumina em um conjugado aqui descrito).
Ligantes em conjugados com um domínio Fc ou uma proteína de albumina covalentemente ligada a dímeros de inibidores de neuraminidase
[00678] Em um conjugado contendo um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a proteína de albumina covalentemente ligado a um ou mais dímeros de inibidores de neuraminidase como aqui descrito, um ligante no conjugado (por exemplo, L ou L') pode ser uma estrutura ramificada. Conforme descrito adicionalmente neste documento, um ligante em um conjugado descrito neste documento (por exemplo, L ou L') pode ser uma estrutura multivalente, por exemplo, uma estrutura divalente ou trivalente tendo dois ou três braços, respectivamente. Em algumas modalidades, quando o ligante tem três braços, dois dos braços podem ser anexados ao primeiro e ao segundo inibidores da neuraminidase e o terceiro braço pode ser anexado ao monômero do domínio Fc, domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina. Em algumas modalidades, quando o ligante tem dois braços, um braço pode ser anexado a um domínio Fc ou uma proteína de albumina e o outro braço pode ser anexado a um dos dois inibidores de neuraminidase. Em outras modalidades,
um ligante com dois braços pode ser usado para anexar os dois inibidores de neuraminidase em um conjugado contendo um domínio Fc ou proteína de albumina covalentemente ligada a um ou mais dímeros de inibidores de neuraminidase.
[00679] Em algumas modalidades, um ligante em um conjugado com um domínio Fc ou uma proteína de albumina covalentemente ligada a um ou mais dímeros de inibidores de neuraminidase é descrito pela fórmula (D-L-I): (L-I) em que LA é descrito pela fórmula GA1-(ZA1)g1-(YA1)h1-(ZA2)i1-(YA2)j1- (ZA3)k1-(YA3)l1-(ZA4)m1-(YA4)n1-(ZA5)o1-GA2; LB é descrito pela fórmula GB1-(ZB1)g2- (YB1)h2-(ZB2)i2-(YB2)j2-(ZB3)k2-(YB3)l2-(ZB4)m2-(YB4)n2-(ZB5)o2-GB2; LC é descrito pela fórmula GC1-(ZC1)g3-(YC1)h3-(ZC2)i3-(YC2)j3-(ZC3)k3-(YC3)l3-(ZC4)m3-(YC4)n3-(ZC5)o3- GC2; GA1é uma ligação anexada a Q na fórmula (D-L-I); GA2 é uma ligação anexada ao primeiro inibidor da neuraminidase (por exemplo, A 1); GB1 é uma ligação anexada a Q na fórmula (D-L-I); GB2 é uma ligação anexada ao segundo inibidor da neuraminidase (por exemplo, A2); GC1 é uma ligação anexada a Q na fórmula (D-L-I); GC2 é uma ligação anexada a um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de proteína de albumina, ou um grupo funcional capaz de reagir com um grupo funcional conjugado com um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina (por exemplo, maleimida e cisteína, amina e ácido carboxílico ativado, tiol e maleimida, ácido sulfônico ativado e amina, isocianato e amina, azida e alquino, e alqueno e tetrazina); cada de ZA1, ZA2, ZA3, ZA4, ZA5, ZB1, ZB2, ZB3, ZB4, ZB5, ZC1, ZC2, ZC3, ZC4, e ZC5 é,
independentemente, C1-C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído; cada um de
YeA1, YA2, YA3, YA4, YB1, YB2, YB3, YB4, YC1, YC2, YC3, e YC4 é, independentemente,
O, S, NRi, P, carbonil, tiocarbonil, sulfonil, fosfato, fosforil ou imino; Ri é H C1-
C20 alquil opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído, C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-
C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído; cada um de g1, h1,
i1, j1, k1, l1, m1, n1, o1, g2, h2, i2, j2, k2, l2, m2, n2, o2, g3, h3, i3, j3, k3, l3, m3,
n3, e o3 é, independentemente, 0 ou 1; Q é um átomo de nitrogênio, C1-C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído,
C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído.
[00680] Em algumas modalidades, LC pode ter dois pontos de ligação ao domínio Fc (por exemplo, dois GC2).
[00681] Em algumas modalidades, L inclui um ligante de polietileno glicol (PEG). Um ligante PEG inclui um ligante tendo a estrutura de unidade de repetição (-CH2CH2O-)n, onde n é um número inteiro de 2 a 100. Um ligante de polietileno glicol pode unir covalentemente a um inibidor de neuraminidase e E (por exemplo, em um conjugado de qualquer uma das fórmulas (M-I) - (M-X)). Um ligante de polietileno glicol pode unir covalentemente a um primeiro inibidor de neuraminidase e a um segundo inibidor de neuraminidase (por exemplo, em um conjugado de qualquer uma das fórmulas (D-I)-(D-X)). Um ligante de polietileno glicol pode unir covalentemente um dímero inibidor de neuraminidase e E (por exemplo, em um conjugado de qualquer uma das fórmulas (D-I)-(D-X)). Um ligante de polietileno glicol pode selecionar qualquer um de PEG2 to PEG100 (por exemplo, PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG5-PEG10, PEG10-PEG20, PEG20-PEG30, PEG30-PEG40, PEG50-PEG60, PEG60-PEG70, PEG70-PEG80, PEG80-PEG90, PEG90-PEG100). Em algumas modalidades, Lc inclui um ligante PEG, onde LC está covalentemente ligado a cada um de Q e E.
[00682] Ligantes de fórmula (D-L-I) que podem ser usados em conjugados aqui descritos incluem, mas não estão limitados a ,
, ,
, ,
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; ; ; ; ; ; ; ou , em que z1 e z2 são cada um, independentemente, e inteiros de 1 a 20; e R9 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril.
[00683] Ligantes da fórmula (D-L-I) também podem incluir qualquer um de ,
,
,
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, , ,
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, , , ,
, , ,
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, ;
, ;
, ; , ; , , ou . Ligantes em conjugados com um domínio Fc ou uma proteína de albumina covalentemente ligada a monômeros de inibidores de neuraminidase
[00684] Em um conjugado contendo um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a proteína de albumina covalentemente ligado a um ou mais monômeros de inibidores de neuraminidase como aqui descrito, um ligante no conjugado (por exemplo, L ou L') pode ser uma estrutura divalente com dois braços. Um braço em um ligante divalente pode ser ligado ao monômero do inibidor da neuraminidase e o outro braço pode ser ligado ao monômero do domínio Fc, e domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina. Em algumas modalidades, um ou mais monômeros de inibidores de neuraminidase nos conjugados aqui descritos podem ser, cada um, independentemente, conectados a um átomo no monômero de domínio Fc e domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina.
[00685] Em algumas modalidades, um ligante é descrito pela fórmula (M-L-I): J1-(Q1)g-(T1)h-(Q2)i-(T2)j-(Q3)k-(T3)l-(Q4)m-(T4)n-(Q5)o-J2 em que J1 é uma ligação anexada a um inibidor da neuraminidase; J2 é uma ligação anexada a um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina, ou um grupo funcional capaz de reagir com um grupo funcional conjugado com um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina (por exemplo, maleimida e cisteína, amina e ácido carboxílico ativado, tiol e maleimida, ácido sulfônico ativado e amina, isocianato e amina, azida e alquino, e alqueno e tetrazina); cada um de Q1, Q2, Q3, Q4, e Q5 é, independentemente, C1-C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído; cada um de T 1, T2, T3, T4 é, independentemente, O, S, NRi, P, carbonil, tiocarbonil, sulfonil, fosfato, fosforil ou imino; Ri H, C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído, C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído,
C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4- C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído; e cada um de g, h, i, j, k, l, m, n e o é, independentemente, 0 ou 1.
[00686] Em algumas modalidades, J2 pode ter dois pontos de ligação ao monômero de domínio Fc e domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina (por exemplo, dois J2).
[00687] Ligantes de fórmula (M-L-I) que podem ser usados em conjugados aqui descritos incluem, mas não estão limitados a, , , , , ou , em que d é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, d é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20).
[00688] Ligantes de fórmula (M-L-I) que podem ser usados em conjugados aqui descritos incluem, mas não estão limitados a, , , , , , ,
, , , , , , , , , e , em que cada um de d e e é, independentemente, um inteiro de 1 a 26. Grupos de ligação
[00689] Em algumas modalidades, um ligante fornece espaço, rigidez e / ou flexibilidade entre os inibidores de neuraminidase e o monômero de domínio Fc e domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina nos conjugados descritos aqui ou entre dois inibidores da neuraminidase nos conjugados aqui descritos. Em algumas modalidades, um ligante pode ser uma ligação, por exemplo, uma ligação covalente, por exemplo, uma ligação amida,
uma ligação dissulfeto, uma ligação C-O, uma ligação C-N, uma ligação N-N,
uma ligação C-S ou qualquer tipo de ligação criada a partir de uma reação química, por exemplo, conjugação química.
Em algumas modalidades, um ligante (L ou L' como mostrado em qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-
X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) inclui não mais que 250 átomos (por exemplo, 1-
2, 1-4, 1-6, 1-8, 1-10, 1-12, 1-14, 1-16, 1- 18, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45,
1-50, 1-55, 1-60, 1-65, 1-70, 1-75, 1-80, 1-85, 1-90, 1-95, 1-100, 1-110, 1-120, 1-
130, 1-140, 1-150, 1-160, 1-170, 1- 180, 1-190, 1-200, 1-210, 1-220, 1-230, 1-
240 ou 1-250 átomo(s); 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180 , 170, 160, 150,
140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 28,
26, 24 , 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 átomo(s)). Em algumas modalidades, um ligante (L ou L) inclui não mais que 250 átomos que não sejam de hidrogênio (por exemplo, 1-2, 1-4, 1-6, 1-8, 1-10, 1-12, 1-14 , 1-16, 1-18, 1-
20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45, 1-50, 1-55, 1-60, 1-65, 1 -70, 1-75, 1-80, 1-85,
1-90, 1-95, 1-100, 1-110, 1-120, 1-130, 1-140, 1-150, 1-160 , 1-170, 1-180, 1-
190, 1-200, 1-210, 1-220, 1-230, 1-240 ou 1-250 átomo(s) não hidrogênio; 250,
240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95,
90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14,
12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 átomo(s) não hidrogênio). Em algumas modalidades, a espinha dorsal de um ligante (L ou L) inclui não mais que 250 átomos (por exemplo, 1-2, 1-4, 1-6, 1-8, 1-10, 1-12, 1-14 , 1-16, 1-18, 1-20, 1-25,
1-30, 1-35, 1-40, 1-45, 1-50, 1-55, 1-60, 1-65, 1 -70, 1-75, 1-80, 1-85, 1-90, 1-95,
1-100, 1-110, 1-120, 1-130, 1-140, 1-150, 1-160 , 1-170, 1-180, 1-190, 1-200, 1-
210, 1-220, 1-230, 1-240 ou 1-250 átomo(s); 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190,
180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55,
50, 45, 40, 35, 30, 28, 26, 24, 22, 20, 18, 16, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 átomo(s)). A "espinha dorsal" de um ligante se refere aos átomos no ligante que,
juntos, formam o caminho mais curto de uma parte do conjugado para outra parte do conjugado. Os átomos na espinha dorsal do ligante estão diretamente envolvidos na ligação de uma parte do conjugado a outra parte do conjugado.
Por exemplo, átomos de hidrogênio ligados a carbonos na espinha dorsal do ligante não são considerados como diretamente envolvidos na ligação de uma parte do conjugado a outra parte do conjugado.
[00690] As moléculas que podem ser usadas para fazer ligantes (L ou L') incluem pelo menos dois grupos funcionais, por exemplo, dois grupos de ácido carboxílico. Em algumas modalidades de um ligante trivalente, dois braços de um ligante podem conter dois ácidos dicarboxílicos, nos quais o primeiro ácido carboxílico pode formar uma ligação covalente com o primeiro inibidor de neuraminidase no conjugado e o segundo ácido carboxílico pode formar uma ligação covalente com o segundo inibidor de neuraminidase no conjugado, e o terceiro braço do ligante pode formar uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação C-O) com um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina no conjugado. Em algumas modalidades de um ligante divalente, o ligante divalente pode conter dois ácidos carboxílicos, nos quais o primeiro ácido carboxílico pode formar uma ligação covalente com um componente (por exemplo, um inibidor de neuraminidase) no conjugado e o segundo ácido carboxílico pode formar uma ligação covalente (por exemplo, uma ligação C-S ou uma ligação C-N) com outro componente (por exemplo, um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina) no conjugado.
[00691] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido dicarboxílico podem ser usadas como ligantes (por exemplo, um ligante de ácido dicarboxílico). Por exemplo, em um conjugado contendo um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina covalentemente ligado a um ou mais dímeros de inibidores de neuraminidase, o primeiro ácido carboxílico em uma molécula de ácido dicarboxílico pode formar uma ligação covalente com um grupo hidroxil ou amina do primeiro inibidor de neuraminidase e o segundo ácido carboxílico pode formar uma ligação covalente com um grupo hidroxil ou amina do segundo inibidor de neuraminidase.
[00692] Exemplos de moléculas de ácidos dicarboxílicos que podem ser usados para formar ligantes incluem, mas não estão limitados a, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
, , , , , , , , , , , , , , , e em que n é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20).
[00693] Outros exemplos de moléculas de ácidos dicarboxílicos que podem ser usados para formar ligantes incluem, mas não estão limitados a, , , , , , , , , ,
, , , ,
, , ,
, , , ,
, , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , , ,
,e .
[00694] Em algumas modalidades, as moléculas de ácido dicarboxílico, como as aqui descritas, podem ser funcionalizadas para conter um ou mais grupos funcionais adicionais. Os ácidos dicarboxílicos podem ser adicionalmente funcionalizados, por exemplo, para fornecer um ponto de ligação a um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de proteína de albumina (por exemplo, por meio de um ligante, como um ligante PEG).
[00695] Em algumas modalidades, quando o inibidor de neuraminidase está ligado ao monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina, o grupo de ligação pode compreender uma fração compreendendo uma fração de ácido carboxílico e uma fração amino que está espaçada de 1 a 25 átomos. Exemplos de tais grupos de ligação incluem, mas não estão limitados a,
em que n é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20).
[00696] Em algumas modalidades, um grupo de ligação pode incluir uma fração incluindo uma fração de ácido carboxílico e uma fração amino, como as aqui descritas, pode ser funcionalizado adicionalmente para conter um ou mais grupos funcionais adicionais. Tais grupos de ligação podem ser adicionalmente funcionalizados, por exemplo, para fornecer um ponto de ligação a um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de proteína de albumina (por exemplo, por meio de um ligante, como um ligante PEG).
[00697] Em algumas modalidades, quando o inibidor de neuraminidase está ligado ao monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina, o grupo de ligação pode compreender uma fração compreendendo duas ou frações amino (por exemplo, uma fração diamino) que estão espaçadas de 1 a 25 átomos. Exemplos de tais grupos de ligação incluem, mas não estão limitados a,
em que n é um número inteiro de 1 a 20 (por exemplo, n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20).
[00698] Em algumas modalidades, um grupo de ligação pode incluir uma fração amino, como as aqui descritas, pode ser funcionalizado adicionalmente para conter um ou mais grupos funcionais adicionais. Tais grupos de ligação diamino podem ser adicionalmente funcionalizados, por exemplo, para fornecer um ponto de ligação a um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de proteína de albumina (por exemplo, por meio de um ligante, como um ligante PEG).
[00699] Em algumas modalidades, uma molécula contendo um grupo azida pode ser usada para formar um ligante, no qual o grupo azida pode sofrer cicloadição com um alquino para formar uma ligação 1,2,3-triazol.
Em algumas modalidades, uma molécula contendo um grupo alquino pode ser usada para formar um ligante, no qual o grupo alquino pode sofrer cicloadição com uma azida para formar uma ligação 1,2,3-triazol. Em algumas modalidades, uma molécula contendo um grupo maleimida pode ser usada para formar um ligante, em que o grupo maleimida pode reagir com uma cisteína para formar uma ligação C-S. Em algumas modalidades, uma molécula contendo um ou mais grupos de ácido sulfônico pode ser usada para formar um ligante, no qual o grupo de ácido sulfônico pode formar uma ligação de sulfonamida com o nitrogênio de ligação em um inibidor de neuraminidase. Em algumas modalidades, uma molécula contendo um ou mais grupos de isocianato pode ser usada para formar um ligante, em que o grupo de isocianato pode formar uma ligação de ureia com o nitrogênio de ligação em um inibidor de neuraminidase. Em algumas modalidades, uma molécula contendo um ou mais grupos haloalquil pode ser usada para formar um ligante, em que o grupo haloalquil pode formar uma ligação covalente, por exemplo, ligações C-N e C-O, com um inibidor de neuraminidase.
[00700] Em algumas modalidades, um ligante (L ou L’) pode compreender um grupo sintético derivado de, por exemplo, um polímero sintético (por exemplo, um polímero de polietileno glicol (PEG)). Em algumas modalidades, um ligante pode compreender um ou mais resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, um ligante pode ser uma sequência de aminoácidos (por exemplo, uma sequência de aminoácidos de 1-25 aminoácidos, 1-10 aminoácidos, 1-9 aminoácidos, 1-8 aminoácidos, 1-7 aminoácidos, 1 -6 aminoácidos, 1-5 aminoácidos, 1-4 aminoácidos, 1-3 aminoácidos, 1-2 aminoácidos ou 1 aminoácido). Em algumas modalidades, um ligante (L ou L’) pode incluir um ou mais C1-C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno (por exemplo, uma unidade PEG) opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído (por exemplo, C2 alquenileno), C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído C3- C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído (por exemplo, C6 arileno), C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído (por exemplo, imidazol, piridina), O, S, NRi (Ri é H, C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2- C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído, C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3- C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído), P, carbonil, tiocarbonil, sulfonil, fosfato, fosforil ou imino.
Químicas de conjugação
[00701] Monômero ou dímeros do inibidor de neuraminidase (por exemplo, em um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D- X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) pode ser conjugado a um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina, por exemplo, por meio de um ligante, por qualquer química de conjugação padrão conhecida para aqueles versados na técnica. As seguintes químicas de conjugação são especificamente contempladas, por exemplo, para a conjugação de um ligante PEG (por exemplo, um ligante PEG funcionalizado) a um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina.
[00702] A conjugação covalente de dois ou mais componentes em um conjugado usando um ligante pode ser realizada usando técnicas e métodos de síntese química orgânica bem conhecidos. Grupos funcionais complementares em dois componentes podem reagir entre si para formar uma ligação covalente. Exemplos de grupos funcionais reativos complementares incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, maleimida e cisteína, amina e ácido carboxílico ativado, tiol e maleimida, ácido sulfônico ativado e amina, isocianato e amina, azida e alquino, e alqueno e tetrazina. A conjugação específica de sítio a um polipeptídeo (por exemplo, um monômero de domínio Fc, um domínio Fc, um peptídeo de ligação a Fc, uma proteína de albumina ou um peptídeo de ligação à proteína de albumina) pode ser realizada usando técnicas conhecidas na técnica. Técnicas exemplificativas para a conjugação específica de sítio de uma pequena molécula com um domínio Fc são fornecidas em Agarwall. P., et al. Bioconjugate Chem. 26:176-192 (2015).
[00703] Outros exemplos de grupos funcionais capazes de reagir com grupos amino incluem, por exemplo, agentes alquilantes e acilantes.
Os agentes alquilantes representativos incluem: (i) um grupo α-haloacetil, por exemplo, XCH2CO- (onde X = Br, Cl ou I); (ii) um grupo N-maleimida, que pode reagir com grupos amino através de uma reação do tipo Michael ou através de acilação por adição ao grupo carbonil do anel; (iii) um haleto de aril, por exemplo, um grupo nitro-haloaromático; (iv) um haleto de alquil; (v) um aldeído ou cetona capaz de formar base de Schiff com grupos amino; (vi) um epóxido, por exemplo,
uma epicloridrina e um bisoxirano, que pode reagir com grupos amino, sulfidril ou hidroxil fenólicos; (vii) uma s-triazina contendo cloro, que é reativa para nucleófilos, tais como grupos amino, sufidril e hidroxil; (viii) uma aziridina, que é reativa para nucleófilos, tais como grupos amino, pela abertura do anel; (ix) um éster dietílico de ácido esquárico; e (x) um éter α-haloalquílico.
[00704] Exemplos de grupos acilantes aminorreativos incluem, por exemplo, (i) um isocianato e um isotiocianato; (ii) um cloreto de sulfonil; (iii) um haleto de ácido; (iv) um éster ativo, por exemplo, um éster nitrofenílico ou éster N-hidroxisuccinimidílico, ou derivados dos mesmos (por exemplo, éster azido-PEG2-PEG40-NHS); (v) um anidrido de ácido, por exemplo, um misto, simétrico, ou N-carboxianidrido; (vi) uma acilazida; e (vii) um imidoéster. Aldeídos e cetonas podem reagir com aminas para formar bases de Schiff, que podem ser estabilizadas por aminação redutiva.
[00705] Será apreciado que certos grupos funcionais podem ser convertidos em outros grupos funcionais antes da reação, por exemplo, para conferir reatividade ou seletividade adicional. Exemplos de métodos úteis para este propósito incluem a conversão de aminas em carboxis usando reagentes, tais como anidridos dicarboxílicos; conversão de aminas em tióis usando reagentes, tais como N-acetil-homocisteína tiolactona, anidrido S- acetilmercaptosuccínico, 2-iminotiolano ou derivados de succinimidil contendo tiol; conversão de tióis em carboxis usando reagentes, tais como α-haloacetatos; conversão de tióis em aminas usando reagentes como etilenimina ou 2- bromoetilamina; conversão de carboxis em aminas usando reagentes, tais como carbodi-imidas seguidas por diaminas; e conversão de álcoois em tióis usando reagentes, tais como cloreto de tosil seguida por transesterificação com tioacetato e hidrólise para tiol com acetato de sódio.
[00706] Em algumas modalidades, um ligante da invenção (por exemplo, L ou L', como LC de D-L-I), é conjugado (por exemplo, por qualquer um dos métodos aqui descritos) com E (por exemplo, um domínio Fc ou proteína de albumina). Em modalidades preferidas da invenção, o ligante é conjugado por meio de: (a) uma ligação de tioureia (isto é, -NH(C=S)NH-) a uma lisina de E; (b) uma ligação carbamato (isto é, -NH(C=O)-O) a uma lisina de E; (c) uma ligação amina por aminação redutiva (isto é, -NHCH2) entre uma lisina e E; (d) uma amida (isto é, -NH-(C=O)CH2) a uma lisina de E; (e) um conjugado cisteína- maleimida entre uma maleimida do ligante para uma cisteína de E; (f) uma ligação amina por aminação redutiva (isto é, -NHCH2) entre o ligante e um carboidrato de E (por exemplo, um grupo glicosil de um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc); (g) um conjugado de cisteína com nova ponte, em que o ligante é conjugado com duas cisteínas de E; (h) uma ligação oxima entre o ligante e um carboidrato de E (por exemplo, um grupo glicosil de um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc); (i) uma ligação oxima entre o ligante e um resíduo de aminoácido de E; (j) uma ligação azido entre o ligante e E; (k) acilação direta de um ligante a E; ou (l) uma ligação tioéter entre o ligante e E.
[00707] Em algumas modalidades, um ligante é conjugado a E, em que a ligação inclui a estrutura -NH (C = NH) X-, em que X é O, HN ou uma ligação. Em algumas modalidades, um ligante é conjugado a E, em que a ligação entre o restante do ligante e E inclui a estrutura -NH (C = O) NH-.
[00708] Em algumas modalidades, um ligante (por exemplo, um éster ativo, por exemplo, um nitrofeniléster ou N-hidroxisuccinimidil éster, ou derivados dos mesmos (por exemplo, um ligante PEG funcionalizado (por exemplo, éster azido-PEG2-PEG40-NHS), é conjugado com E , com um T de (por exemplo, DAR) de entre 0,5 e 10,0, por exemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1 , 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5 , 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,0, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 ,
8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 ou 10,0. Nestes casos, a E-(PEG2-PEG40)-azide pode reagir com um Int tendo um ligante alcino terminal (por exemplo, L ou L', como LC de D-L-I) por meio de conjugação de clique. Durante a conjugação de clique, a reação catalisada por cobre de uma azida (por exemplo, a Fc-(PEG2-PEG40)-azida) com o alquino (por exemplo, o Int tendo um ligante alquino terminal (por exemplo, L ou L’, como L C de D-L-I) formando um anel de heteroátomo de 5 membros. Em algumas modalidades, o ligante conjugado a E é um alquino terminal e é conjugado a um Int tendo uma azida terminal. Preparações exemplificativas de preparações de E-(PEG2- PEG40)-azida são descritas nos Exemplos 7, 8, 61, 84, 88, e 124. Figuras exemplificativas de conjugados preparados por meio de conjugação de clique são representadas nas FIGS. 43 e 61. Um versado na técnica entenderia prontamente o produto final de uma conjugação química de clique.
[00709] Estratégias de ligação exemplificativas (por exemplo, métodos para ligar um monômero ou um dímero de um inibidor da neuraminidase a E, tal como, por meio de um ligante) são adicionalmente representadas nas FIGS. 1, 28, 29, 30, 43 e 61.
VI. Terapias de Combinação Agentes antivirais
[00710] Em algumas modalidades, um ou mais agentes antivirais podem ser administrados em combinação (por exemplo, administrados substancialmente simultaneamente (por exemplo, na mesma composição farmacêutica ou em composições farmacêuticas separadas) ou administrados separadamente em momentos diferentes) com um conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’- I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)).
[00711] Em algumas modalidades, o agente antiviral é um agente antiviral para o tratamento do vírus influenza. Por exemplo, o agente antiviral pode ser um bloqueador do canal iônico M2, um inibidor da neuraminidase (por exemplo, um inibidor da neuraminidase de ação prolongada), um inibidor da polimerase, um inibidor da hemaglutinina, um inibidor da proteína de fusão, um inibidor COX-2 ou um agonista PPAR. O agente antiviral pode direcionar o vírus ou o sujeito hospedeiro. O agente antiviral para o tratamento do vírus da influenza usado em combinação com um conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) pode ser selecionado de oseltamivir, zanamivir, peramivir, laninamivir, CS-8958, amantadina, rimantadina, cianovirina-N, um inibidor de endonuclease dependente de cap (por exemplo, baloxavir marboxil), um inibidor de polimerase (por exemplo, T-705), um inibidor de PB2 (por exemplo, JNJ-63623872), uma sialidase conjugada (por exemplo, DAS181), um tiazolídeo (por exemplo, nitazoxanida), um inibidor de COX, um agonista PPAR, um anticorpo direcionado a hemaglutinina (por exemplo, um anticorpo monoclonal como CR6261, CR8020, MEDI8852, MHAA4549A, ou VIS410), ou um siRNA direcionado a um hospedeiro ou gene viral, ou pró-drogas dos mesmos, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
Vacinas antivirais
[00712] Em algumas modalidades, qualquer um dos conjugados aqui descritos (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) é administrado em combinação com uma vacina antiviral (por exemplo, uma composição que provoca uma resposta imune em um sujeito dirigida contra um vírus). A vacina antiviral pode ser administrada substancialmente simultaneamente (por exemplo, na mesma composição farmacêutica ou em composições farmacêuticas separadas) como os conjugados, ou pode ser administrada antes ou após os conjugados (por exemplo, dentro de um período de 1 dia, 2 dias, 5, dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses, 6 meses ou 12 meses ou mais).
[00713] Em algumas modalidades, a vacina viral compreende um imunógeno que induz uma resposta imune no sujeito contra o vírus influenza A, B, C ou o vírus parainfluenza. Em algumas modalidades, o imunógeno é um vírus inativado (por exemplo, a vacina é uma vacina trivalente de influenza que contém material purificado e inativado do vírus da gripe A, B, C ou vírus da parainfluenza ou qualquer combinação dos mesmos). Em algumas modalidades, a vacina é administrada como uma injeção intramuscular. Em algumas modalidades, a vacina é uma vacina de vírus vivo que contém vírus vivos que foram atenuados (enfraquecidos). Em algumas modalidades, a vacina é administrada como um spray nasal.
VII. Métodos
[00714] Os métodos descritos neste documento incluem, por exemplo, métodos de proteção contra ou tratamento de uma infecção viral (por exemplo, uma infecção viral de influenza) em um sujeito e métodos de prevenção, estabilização ou inibição do crescimento de partículas virais. Um método de tratamento de uma infecção viral (por exemplo, uma infecção viral de influenza) em um sujeito inclui administrar ao sujeito um conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) ou uma composição farmacêutica dos mesmos. Em algumas modalidades, a infecção viral é causada pelo vírus influenza (por exemplo, vírus influenza A, B, C ou vírus parainfluenza). Em algumas modalidades, a infecção viral é causada por uma cepa de vírus resistente. Um método de prevenção, estabilização ou inibição do crescimento de partículas virais ou prevenção da replicação e propagação do vírus inclui o contato do vírus ou um local suscetível ao crescimento viral com um conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’- I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) ou uma composição farmacêutica dos mesmos.
[00715] Além disso, os métodos descritos neste documento também incluem métodos de proteção contra ou tratamento de infecção viral em um sujeito pela administração ao sujeito de um conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’- I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)). Em algumas modalidades, o método inclui ainda administrar ao sujeito um agente antiviral ou uma vacina antiviral.
[00716] Os métodos descritos neste documento também incluem métodos de proteção ou tratamento de uma infecção viral em um sujeito pela administração ao referido sujeito (1) de um conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’- I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) e (2) um agente antiviral ou uma vacina antiviral. Os métodos descritos neste documento também incluem métodos de prevenção, estabilização ou inibição do crescimento de partículas virais ou prevenção da replicação ou disseminação de um vírus, por contato do vírus ou um local suscetível ao crescimento viral com (1) um conjugado descrito neste documento (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) e (2) um agente antiviral ou uma vacina antiviral.
[00717] Em algumas modalidades, o conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) é administrado primeiro, seguido pela administração do agente antiviral ou da vacina antiviral sozinha. Em algumas modalidades, o agente antiviral ou vacina antiviral é administrado primeiro, seguido pela administração do conjugado aqui descrito sozinho. Em algumas modalidades, o conjugado aqui descrito e o agente antiviral ou vacina antiviral são administrados substancialmente simultaneamente (por exemplo, na mesma composição farmacêutica ou em composições farmacêuticas separadas). Em algumas modalidades, o conjugado aqui descrito ou o agente antiviral ou vacina antiviral é administrado primeiro, seguido pela administração do conjugado aqui descrito e o agente antiviral ou vacina antiviral substancialmente simultaneamente (por exemplo, na mesma composição farmacêutica ou em composições farmacêuticas separadas). Em algumas modalidades, o conjugado aqui descrito e o agente antiviral ou vacina antiviral são administrados primeiro substancialmente simultaneamente (por exemplo, na mesma composição farmacêutica ou em composições farmacêuticas separadas), seguido pela administração do conjugado aqui descrito ou o agente antiviral ou vacina antiviral sozinho. Em algumas modalidades, quando um conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’- I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) e um agente antiviral ou vacina antiviral são administrados juntos (por exemplo, substancialmente simultaneamente nas mesmas ou em composições farmacêuticas separadas, ou separadamente no mesmo regime de tratamento), a inibição da replicação viral de cada um do conjugado e o agente antiviral ou vacina antiviral pode ser maior (por exemplo, ocorrer em uma concentração mais baixa) do que a inibição da replicação viral de cada um dos conjugados e do agente antiviral ou vacina antiviral quando cada um é usado sozinho em um regime de tratamento.
VIII. Composições e Preparações farmacêuticas
[00718] Um conjugado aqui descrito pode ser formulado em uma composição farmacêutica para uso nos métodos aqui descritos. Em algumas modalidades, um conjugado aqui descrito pode ser formulado apenas em uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, um conjugado aqui descrito pode ser formulado em combinação com um agente antiviral ou vacina antiviral em uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui um conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado descrito por qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M- I)-(M-X), ou (M’-I)) e transportadores e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[00719] Os transportadores e excipientes aceitáveis nas composições farmacêuticas não são tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações utilizadas. Os transportadores e excipientes aceitáveis podem incluir tampões como fosfato, citrato, HEPES e TAE, antioxidantes como ácido ascórbico e metionina, conservantes como cloreto de hexametônio, cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, resorcinol e cloreto de benzalcônio, proteínas como albumina sérica humana, gelatina, dextrano e imunoglobulinas, polímeros hidrofílicos, como polivinilpirrolidona, resíduos de aminoácidos, como glicina, glutamina, histidina e lisina, e carboidratos, como glicose, manose, sacarose e sorbitol.
[00720] Exemplos de outros excipientes incluem, mas não estão limitados a, antiaderentes, aglutinantes, revestimentos, auxiliares de compressão, desintegrantes, corantes, emolientes, emulsificantes, enchimentos (diluentes), formadores de filme ou revestimentos, sabores, fragrâncias, deslizantes (intensificadores de fluxo), lubrificantes, sorventes, agentes de suspensão ou dispersão ou adoçantes. Excipientes exemplificativos incluem, mas não estão limitados a: hidroxitolueno butilado (BHT), carbonato de cálcio, fosfato de cálcio (dibásico), estearato de cálcio, croscarmelose, polivinilpirrolidona reticulada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etilcelulose, gelatina,hidroxipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose, lactose, estearato de magnésio, maltitol, manitol, metionina, metilcelulose, metil parabeno, celulose microcristalina, polietileno glicol, povidona, amido pré-gelatinizado, propil parabeno, palmitato de retinil, goma laca, dióxido de silício, carboximetil celulose de sódio, citrato de sódio, glicolato de amido de sódio, sorbitol, amido (milho), ácido esteárico, ácido esteárico, sacarose, talco, dióxido de titânio, vitamina A, vitamina E, vitamina C e xilitol.
[00721] Os conjugados aqui podem ter grupos ionizáveis de modo a serem capazes de preparação como sais farmaceuticamente aceitáveis.
Estes sais podem ser sais de adição de ácido envolvendo ácidos inorgânicos ou orgânicos ou os sais podem, no caso de formas acídicas dos conjugados aqui descritos, ser preparados a partir de bases inorgânicas ou orgânicas.
Frequentemente, os conjugados são preparados ou usados como sais farmaceuticamente aceitáveis preparados como produtos de adição de ácidos ou bases farmaceuticamente aceitáveis. Ácidos e bases farmaceuticamente aceitáveis adequados são bem conhecidos na técnica, tais como ácidos clorídrico, sulfúrico, bromídrico, acético, lático, cítrico ou tartárico para formar sais de adição de ácido e hidróxido de potássio, hidróxido de sódio, hidróxido de amônio, cafeína, várias aminas e semelhantes para formar sais básicos. Os métodos para a preparação dos sais apropriados estão bem estabelecidos na técnica.
[00722] Sais de adição de ácido representativos incluem, entre outros, acetato, sais de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benzenossulfonato, benzoato, bissulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, fumarato, gluco-heptonato, glicerofosfato, hemissulfato, heptanato, hexanoato, bromidrato, cloridrato, iodidrato, 2-hidroxi- etanossulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartarato, tiocianato, toluenossulfonato, undecanoato e sais de valerato. Sais de metais alcalinos ou alcalino-terrosos representativos incluem, mas não estão limitados a, sódio, lítio, potássio, cálcio e magnésio, bem como amônio não tóxico, amônio quaternário e cátions de amina, incluindo, mas não se limitando a amônio, tetrametilamônio, tetraetilamônio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina e etilamina.
[00723] Dependendo da via de administração e da dosagem,
um conjugado aqui ou uma composição farmacêutica do mesmo usado nos métodos aqui descritos será formulado em composições farmacêuticas adequadas para permitir a fácil distribuição. Um conjugado (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) ou uma composição farmacêutica do mesmo pode ser formulada para ser administrada por via intramuscular, intravenosa (por exemplo, como uma solução estéril e em um sistema de solvente adequado para uso intravenoso), intradérmica, intra-arterial, intraperitoneal, intralesional, intracranial, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarretal, tópica, intratumoral, peritoneal, subcutânea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral (por exemplo, um comprimido, cápsula, cápsula gelatinosa ou xarope), topicamente (por exemplo, como um creme, gel, loção ou pomada), local, por inalação, por injeção ou por infusão (por exemplo, infusão contínua, perfusão localizada, banhando células alvo diretamente, cateter, lavagem, em cremes ou composições lipídicas). Dependendo da via de administração, um conjugado aqui ou uma composição farmacêutica do mesmo pode estar na forma de, por exemplo, comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, granulados, suspensões, emulsões, soluções, géis, incluindo hidrogéis, pastas, pomadas, cremes, emplastros, pomadas, dispositivos de distribuição osmótica, supositórios, enemas, injetáveis, implantes, sprays, preparações adequadas para distribuição iontoforética ou aerossóis. As composições podem ser formuladas de acordo com a prática farmacêutica convencional.
[00724] Um conjugado aqui descrito pode ser formulado de uma variedade de maneiras que são conhecidas na técnica. Para uso como tratamento de sujeitos humanos e animais, um conjugado aqui descrito pode ser formulado como composições farmacêuticas ou veterinárias. Dependendo do sujeito (por exemplo, um humano) a ser tratado, do modo de administração e do tipo de tratamento desejado, por exemplo, profilaxia ou terapia, um conjugado aqui descrito é formulado de maneiras consoantes com esses parâmetros. Um resumo dessas técnicas pode ser encontrado em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Lippincott Williams & Wilkins (2012); and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, 4th Edition, J. Swarbrick and J. C.
Boylan, Marcel Dekker, New York (2013), cada um dos quais é aqui incorporado por referência.
[00725] As formulações podem ser preparadas de uma maneira adequada para administração sistêmica ou administração tópica ou local. As formulações sistêmicas incluem aquelas projetadas para injeção (por exemplo, injeção intramuscular, intravenosa ou subcutânea) ou podem ser preparadas para administração transdérmica, transmucosa ou oral. A formulação geralmente incluirá um diluente, bem como, em alguns casos, adjuvantes, tampões e conservantes. Os conjugados podem ser administrados também em composições lipossômicas ou como microemulsões. A administração sistêmica também pode incluir métodos relativamente não invasivos, como o uso de supositórios, adesivos transdérmicos, distribuição transmucosa e administração intranasal. A administração oral também é adequada para conjugados aqui. As formas adequadas incluem xaropes, cápsulas e comprimidos, como é entendido na técnica.
[00726] As composições farmacêuticas podem ser administradas parenteralmente na forma de uma formulação injetável. As composições farmacêuticas para injeção podem ser formuladas usando uma solução estéril ou qualquer líquido farmaceuticamente aceitável como veículo.
As formulações podem ser preparadas como formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção ou como emulsões. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, água estéril, solução salina fisiológica e meio de cultura de células (por exemplo, meio de
Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), meio de Eagle modificado por α (α- MEM), meio F-12). Essas composições injetáveis também podem conter quantidades de substâncias auxiliares não tóxicas, como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH, como acetato de sódio e monolaurato de sorbitano. Os métodos de formulação são conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2nd Edition, M. Gibson, Taylor & Francis Group, CRC Press (2009).
[00727] As composições farmacêuticas podem ser preparadas na forma de uma formulação oral. As formulações para uso oral incluem comprimidos contendo o(s) ingrediente(s) ativo(s) em uma mistura com excipientes farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos. Estes excipientes podem ser, por exemplo, diluentes ou enchimentos inertes (por exemplo, sacarose, sorbitol, açúcar, manitol, celulose microcristalina, amidos incluindo amido de batata, carbonato de cálcio, cloreto de sódio, lactose, fosfato de cálcio, sulfato de cálcio ou fosfato de sódio); agentes de granulação e desintegração (por exemplo, derivados de celulose incluindo celulose microcristalina, amidos incluindo amido de batata, croscarmelose de sódio, alginatos ou ácido algínico); agentes de ligação (por exemplo, sacarose, glicose, sorbitol, acácia, ácido algínico, alginato de sódio, gelatina, amido, amido pré-gelatinizado, celulose microcristalina, silicato de alumínio e magnésio, carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropil metilcelulose, etilcelulose, polivinilpirrolidona ou polietileno glicol); e agentes lubrificantes, deslizantes e anti-adesivos (por exemplo, estearato de magnésio, estearato de zinco, ácido esteárico, sílicas, óleos vegetais hidrogenados ou talco). As formulações para uso oral também podem ser fornecidas como comprimidos mastigáveis ou como cápsulas de gelatina dura em que o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte (por exemplo, amido de batata, lactose, celulose microcristalina, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulino, ou como cápsulas de gelatina mole em que o ingrediente ativo é misturado com água ou um meio de óleo, por exemplo, óleo de amendoim, parafina líquida ou azeite. Pós, granulados e peletes podem ser preparados usando os ingredientes mencionados acima em comprimidos e cápsulas de uma maneira convencional usando, por exemplo, um misturador, um aparelho de leito fluido ou um equipamento de secagem por pulverização.
[00728] Outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis para formulações orais incluem, mas não estão limitados a, corantes, agentes aromatizantes, plastificantes, umectantes e agentes tamponantes. As formulações para uso oral também podem ser fornecidas como comprimidos mastigáveis ou como cápsulas de gelatina dura em que o ingrediente ativo é misturado com um diluente sólido inerte (por exemplo, amido de batata, lactose, celulose microcristalina, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulino, ou como cápsulas de gelatina mole em que o ingrediente ativo é misturado com água ou um meio de óleo, por exemplo, óleo de amendoim, parafina líquida ou azeite. Pós, granulados e peletes podem ser preparados usando os ingredientes mencionados acima em comprimidos e cápsulas de uma maneira convencional usando, por exemplo, um misturador, um aparelho de leito fluido ou um equipamento de secagem por pulverização.
[00729] Dissolução ou liberação controlada de difusão de um conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) ou uma composição farmacêutica do mesmo pode ser alcançada por revestimento apropriado de um comprimido, cápsula, pelete ou formulação de granulado do conjugado, ou incorporando o conjugado em uma matriz apropriada. Um revestimento de liberação controlada pode incluir uma ou mais das substâncias de revestimento mencionadas acima e / ou, por exemplo, goma laca, cera de abelha, glicowax, cera de rícino, cera de carnaúba, álcool estearílico, monoestearato de gliceril, diestearato de gliceril, palmitostearato de glicerol, etilcelulose, resinas acrílicas,
ácido dl-polilático, butirato de acetato de celulose, cloreto de polivinil, acetato de polivinil, pirrolidona de vinil, polietileno, polimetacrilato, metacrilato de metil, 2- hidroximetacrilato, hidrogéis de metacrilato, 1,3 butileno glicol, metacrilato de etileno glicol e / ou polietileno glicóis. Em uma formulação de matriz de liberação controlada, o material de matriz também pode incluir, por exemplo, metilcelulose hidratada, cera de carnaúba e álcool estearílico, carbopol 934, silicone, triestearato de gliceril, acrilato de metil-metacrilato de metil, cloreto de polivinil, polietileno e / ou fluorocarbono halogenado.
[00730] A composição farmacêutica pode ser formada em uma forma de dosagem unitária conforme necessário. A quantidade de componente ativo, por exemplo, um conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)), incluídos nas composições farmacêuticas são tais que uma dose adequada dentro da faixa designada é fornecida (por exemplo, uma dose dentro da faixa de 0,01-100 mg / kg de peso corporal).
IX. Vias de administração e Dosagens
[00731] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, os conjugados aqui podem ser administrados por qualquer via apropriada para tratar ou proteger contra uma infecção viral (por exemplo, uma infecção por influenza), ou para prevenir, estabilizar ou inibir a proliferação ou propagação de um vírus (por exemplo, um vírus da influenza). Os conjugados aqui descritos podem ser administrados a humanos, animais domésticos, gado ou outros animais com um diluente, transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a administração compreende a administração de qualquer um dos conjugados aqui descritos (por exemplo, conjugados de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) ou composições por via intramuscular, intravenosa (por exemplo, como uma solução estéril e em um sistema de solvente adequado para uso intravenoso), intradérmica, intra-arterial, intraperitoneal, intralesional, intracranial, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarretal, tópica, intratumoral, peritoneal, subcutânea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral (por exemplo, um comprimido, cápsula, cápsula gelatinosa ou xarope), topicamente (por exemplo, como um creme, gel, loção ou pomada), local, por inalação, por injeção ou por infusão (por exemplo, infusão contínua, perfusão localizada, banhando células alvo diretamente, cateter, lavagem, em cremes ou composições lipídicas). Em algumas modalidades, se um agente antiviral também for administrado além de um conjugado aqui descrito, o agente antiviral ou uma composição farmacêutica do mesmo também pode ser administrado em qualquer uma das vias de administração aqui descritas.
[00732] A dosagem de um conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas(1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) ou suas composições farmacêuticas dependem de fatores, incluindo a via de administração, a doença a ser tratada (por exemplo, a extensão e / ou condição da infecção viral) e as características físicas, por exemplo, idade, peso, geral saúde, do sujeito. Normalmente, a quantidade do conjugado ou da composição farmacêutica do mesmo contida em uma dose única pode ser uma quantidade que efetivamente previne, retarda ou trata a infecção viral sem induzir toxicidade significativa. Uma composição farmacêutica pode incluir uma dosagem de um conjugado aqui descrito variando de 0,01 a 500 mg / kg (por exemplo, 0,01, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ou 500 mg / kg) e, em uma modalidade mais específica, cerca de 0,1 a cerca de 30 mg / kg e, em uma modalidade mais específica, cerca de 1 a cerca de 30 mg / kg. Em algumas modalidades, quando um conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) e um agente antiviral ou vacina antiviral são administrados em combinação (por exemplo, substancialmente simultaneamente nas mesmas ou em composições farmacêuticas separadas, ou separadamente no mesmo regime de tratamento), a dosagem necessária do conjugado aqui descrito pode ser menor do que a dosagem necessária do conjugado se o conjugado foi usado sozinho em um regime de tratamento.
[00733] Um conjugado aqui descrito (por exemplo, um conjugado de qualquer uma das fórmulas (1)-(5), (D-I)-(D-X), (D’-I), (M-I)-(M-X), ou (M’-I)) ou uma composição farmacêutica do mesmo pode ser administrada a um sujeito em necessidade do mesmo, por exemplo, uma ou mais vezes (por exemplo, 1-10 vezes ou mais; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9 ou 10 vezes) diariamente, semanalmente, mensalmente, semestralmente, anualmente ou conforme necessário do ponto de vista médico. As dosagens podem ser fornecidas em regimes de dosagem única ou múltipla. O intervalo entre as administrações pode diminuir à medida que a condição médica melhora ou aumentar à medida que a saúde do paciente diminui. A dosagem e frequência de administração podem ser adaptadas pelo médico de acordo com fatores convencionais, tais como a extensão da infecção e diferentes parâmetros do sujeito.
EXEMPLOS
[00734] Os exemplos a seguir são apresentados de modo a fornecer aos versados na técnica uma descrição de como as composições e métodos descritos neste documento podem ser usados, feitos e avaliados e se destinam a ser puramente exemplificativos da invenção e não são destinados a limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção.
Exemplo 1: Preparação de Construtos Fc
[00735] As traduções reversas dos aminoácidos que compreendem os construtos de proteína (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 12 e 14) foram sintetizadas por síntese em fase sólida. Os modelos de oligonucleotídeos foram clonados em pcDNA3.1 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) nos sítios de clonagem BamHI e XhoI (New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA) e incluíram sequências de sinal derivadas da Interleucina-2 humana ou humana albumina. Os plasmídeos pcDNA3.1 foram transformados em células Top10 de E. coli (LifeTech). O DNA foi amplificado, extraído e purificado usando o kit PURELINK® HiPure Plasmid Filter Maxiprep (LifeTech). O DNA de plasmídeo é distribuído, usando o ExpiFectamine™ 293 Transfection Kit (LifeTech), em células HEK-293 de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram centrifugadas, filtradas e os sobrenadantes foram purificados usando resina MabSelect Sure (GE Healthcare, Chicago, IL, EUA). As moléculas purificadas foram analisadas usando géis Bis Tris SDS PAGE 4-12% carregando 1-2 µg de cada molécula no gel e coloração usando coloração instantânea com Blue. Cada gel incluía uma escada de peso molecular com os padrões de peso molecular indicados (FIGS. 2-8). As faixas reduzidas e não reduzidas são indicadas por “R” e “NR”. As FIGS. 2-8 mostram SDS-PAGE não redutor e redutor de um domínio Fc formado a partir de monômeros de domínio Fc com as sequências de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 12 e 14, respectivamente.
Exemplo 2. Síntese de Zanamivir Intermediário
Etapa a.
[00736] Metil 5-acetamido-7,8,9-O-triacetil-2,6-anidro-4- azido-3,4,5-trideoxi-D-glicero-D-galacto-non-2-enonato (4,56 g, 10,0 mmol) foi dissolvido em THF anidro (15 mL) e a solução foi resfriada a aproximadamente 13 ℃. Trifenilfosfina (2,89 g, 11 mmol) foi adicionada em porções ao longo de 20 minutos. A mistura resultante foi agitada a aproximadamente 13 ℃ à temperatura ambiente durante 2 horas, em seguida, uma solução de LiOH (24 mg, 1 mmol) em água (1,5 mL) foi adicionada gota a gota. Após agitação durante 28 horas, a mistura de reação foi adicionada com N,N'-bis-boc-1-guanilpirazol (3,26 g, 10,5 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (244,4 mg, 2 mmol). A reação foi agitada durante 1,5 dias. Foi então diluída com uma mistura 1:1 de acetato de etil:hexanos (100 mL) e extraída com água (30 mL). A camada aquosa foi extraída de volta com etil acetato (30 mL). As camadas orgânicas combinadas foram concentradas por evaporação rotativa. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de fase reversa C18 (150 g, 25 a 70% de acetonitrila e água). As frações coletadas foram concentradas por evaporação rotativa à temperatura ambiente. Resultou uma solução aquosa turva e a maior parte do produto se depositou no frasco como um gel. A solução foi então extraída com acetato de etil (150 mL). A camada orgânica foi usada para redissolver o material de gel. Foi então seca sobre Na2SO4, concentrada por evaporação rotativa e adicionalmente seca sob alto vácuo para fornecer o composto do título como uma espuma branca. Rendimento 6,24 g, 92,8%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 673,2.
Etapa b.
[00737] Uma solução do produto da etapa a (6,24 g, 9,28 mmol) em MeOH anidro (20 mL) foi resfriada em um banho de água gelada e uma solução 0,5 M de metóxido de sódio em MeOH (26 mL, 13 mmol) foi lentamente adicionada. A reação foi agitada durante 1 hora, depois o seu pH foi cuidadosamente ajustado para 7 a 7,5 por adição gota a gota de uma solução 4 N de HCl em dioxano (3 mL). O solvente foi removido por evaporação rotativa a uma temperatura não superior à temperatura ambiente. O resíduo foi diluído com uma mistura 2:1 de acetato de etil e hexanos (150 mL), e a solução resultante foi extraída com água (20 mL). A camada aquosa foi extraída de volta com etil acetato (30 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SO4, concentradas por evaporação rotativa e posteriormente secas sob alto vácuo. O produto foi transportado para a etapa subsequente sem purificação adicional. Rendimento 5,03 g, 99,2%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 547,2.
Etapa c.
[00738] O produto da etapa b (713 mg, 1,3 mmol) em DCM anidro (6 mL) foi resfriado em um banho de água gelada e 4-dimetilaminopiridina (159,8 mg, 1,3 mmol) e DIPEA (520 mg, 4 mmol) foram adicionados. A mistura foi então adicionada gota a gota com uma solução de cloroformato de 4-nitrofenil (356,6 mg, 2,2 mmol) em DCM anidro (2 mL). O banho de água gelada foi então removido e a mistura de reação foi agitada durante 3 horas e monitorada por
LCMS (cloroformato de 4-nitrofenil adicional pode ser adicionado se necessário).
Depois que a reação foi concluída, foi extinta com água (10 mL), e a camada orgânica foi extraída e concentrada por evaporação rotativa. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de fase reversa C18 (100 g, 20 a 70% de acetonitrila e água). A acetonitrila nas frações coletadas foi removida por evaporação rotativa à temperatura ambiente. A camada aquosa foi então extraída com uma mistura 1:1 de acetato de etil e hexano (120 mL). A camada aquosa foi extraída de volta com etil acetato (30 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SO4, concentradas por evaporação rotativa e posteriormente secas sob alto vácuo para fornecer o composto do título como um sólido branco. Rendimento de 520 mg, 70%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 573,2.
Exemplo 3. Síntese do Ligante-1 Etapa a.
[00739] A uma mistura de éster γ-metílico de Z-D-glutâmico (2,0 g, 6,77 mmol) e éster metílico de glicina HCl (1,282 g, 10,2 mmol) em DMF anidro (7 mL) foi adicionado DIPEA (2,02 g, 15,57 mmol) seguido por HATU (2,66 g, 7,0 mmol) em porções ao longo de 25 minutos. Após a dissolução de HATU,
foi adicionada uma quantidade adicional de DIPEA (1,15 g, 8,8 mmol). A mistura de reação foi agitada durante 1,5 horas, depois extraída com HCl aquoso a 5% (100 mL) e EtOAc (100 mL x 2). A camada orgânica foi concentrada por evaporação rotativa. O resíduo foi re-extraído com água (100 mL) e EtOAc / hexanos (2:1, 150 mL). A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4, concentrada por evaporação rotativa e posteriormente seca sob alto vácuo até um sólido branco. O produto em bruto foi transportado para a etapa subsequente sem purificação adicional. Rendimento 2,3 g, 93%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 367.
Etapa b.
[00740] O produto da etapa a (2,3 g, 6,29 mmol) foi dissolvido em uma mistura 1:1 de MeOH e THF (10 mL). Depois que a solução foi resfriada em um banho de água gelada, uma solução de mono-hidrato de LiOH (630 mg, 15 mmol) em água (9 mL) foi adicionada em porções ao longo de 1,5 horas. Após agitação durante 2 horas adicionais, a mistura de reação foi neutralizada com HCl 4 N em dioxano (3,7 mL). O solvente orgânico foi parcialmente removido por evaporação rotativa à temperatura ambiente. O material restante foi purificado diretamente por RPLC (150 g, 0 a 39% de acetonitrila e água). Rendimento de 2,03 g, 88,7% em duas etapas. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 339,2.
Etapa c.
[00741] A uma mistura do produto da etapa b (1,41 g, 4,17 mmol) e N-Boc-1,6-diamino-hexano (1,99 g, 9,2 mmol) em DMF anidro (6 mL) e DIPEA (1,3 g, 10 mmol), uma solução de HATU (3,5 g, 9,2 mmol) em DMF (10 mL) foi adicionada por meio de uma bomba de seringa a uma taxa de 11 mL / h.
Após a adição completa do HATU, a reação foi agitada por mais 30 minutos e diretamente purificada por RPLC (150 g, 10 a 50% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 1,3 g, 42,4%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 735, [M - Boc + H] + = 635,4.
Etapa d.
[00742] O produto da etapa c (1,3 g, 1,77 mmol) foi dissolvido em MeOH (20 mL) e Pd / C foi adicionado à solução. A mistura foi agitada sob hidrogênio durante 4 horas. O Pd / C foi removido por filtração e o filtrado foi concentrado por evaporação rotativa e posteriormente seco sob alto vácuo.
Rendimento 1,03 g, 96,9%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 601.
Etapa e.
[00743] Um frasco de reação seco por chama foi lavado com nitrogênio e carregado com ácido 4-azidobutírico (77 mg, 0,6 mmol), N- hidroxissuccinimida (92 mg, 0,8 mmol) e DMF anidro (0,5 mL). A mistura foi agitada para dissolver os sólidos e, em seguida, foi adicionado DCC (125,5 mg, 0,608 mmol). Após agitação durante uma hora, o produto da etapa d (300 mg, 0,5 mmol) foi adicionado à mistura de reação. A reação foi agitada por 6 horas e diretamente purificada usando RPLC (150 g, 10 a 70% de acetonitrila e água, usando 01.% TFA como modificador). As frações coletadas foram liofilizadas a um sólido branco (LCMS: [M + H]+ = 712, [M - Boc + H]+ = 612). O material foi redissolvido em DCM (~ 2 mL) e TFA (~ 1 mL) e agitado durante 15 minutos. Foi então concentrado por evaporação rotativa, e o resíduo foi purificado por RPLC
(50 g, 0 a 40% de acetonitrila e água). Rendimento 255 mg, 68. 9%. Íons encontrados por LCMS: [M + H]+ = 512, [(M + 2H) / 2]+ = 256.
Exemplo 4. Síntese de Int-1 Etapa a.
[00744] A uma solução do intermediário Zanamivir (Exemplo 2) (532,5 mg, 0,93 mmol) em THF anidro (2 mL) foi adicionado DMAP (490 mg, 4 mmol), seguido por bis (pentafluorofenil)carbonato (385 mg, 0,911 mmol). Após agitação durante a noite, uma solução de Ligante-1 (Exemplo 3) (245,6 mg, 0,332 mmol) em DMF anidro (1 mL) e DIPEA (91 mg, 0,3 mmol) foi adicionada à mistura de reação. A reação foi continuada por 2 horas, depois purificada por RPLC (100 g, 5 a 67% de acetonitrila e água). Rendimento de 135 mg, 23,8%.
Íon encontrado por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 845,9.
Etapa b.
[00745] O produto da etapa a (135 mg, 0,079 mmol) foi dissolvido em TFA (0,5 mL) e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 20 minutos. Foi então purificado diretamente por RPLC (50 g, 5 a 32% de acetonitrila e água). Rendimento de 88 mg, 85,1%. Íon encontrado por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 654,8.
Etapa c.
[00746] Uma solução do produto da etapa b (88 mg, 0,0673 mmol) em MeOH (1,5 mL) foi resfriada em um banho de água gelada e LiOH (5 mg, 0,2 mmol) em água (0,5 mL) foi adicionado. Após a mistura ser agitada durante 5 horas, foi acidificada com solução de HCl 4N em dioxano (0,1 mL) e purificada por HPLC (5 a 20% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 76,4 mg, 78%. Íon encontrado por LCM: [(M + 2H) /
2]+ = 614,8.
Exemplo 5. Síntese do Ligante-2 Etapa a.
[00747] A uma solução de propargil-PEG4-ácido (364,4 mg, 1,4 mmol) em DMF anidr (2 mL) foi adicionado HATU (558,9 mg, 1,47 mmol).
Após agitação para dissolver todo o reagente de acoplamento, DIPEA (390 mg, 3 mmol) foi adicionado e agitado durante 10 minutos. Foi adicionada uma solução do produto Ligante-1 etapa-d (Exemplo 3, etapa d) (701,1 mg, 1,167 mmol) em DMF anidro (1 mL). A mistura resultante foi agitada durante 30 minutos e diretamente purificada por RPLC (100 g, 5 a 60% de acetonitrila e água).
Rendimento 830 mg, 84,4%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 843.
Etapa b.
[00748] O produto da etapa a foi dissolvido em THF (5 mL) e tratado com solução de HCl 4N em dioxano (2,5 mL). Após agitação à temperatura ambiente durante a noite, a mistura de reação foi concentrada por evaporação rotativa. O resíduo foi redissolvido em acetonitrila / água (1:1, 16 mL) e a solução foi liofilizada. O produto em bruto foi transportado para a etapa subsequente sem purificação adicional. Rendimento 761,8 mg, 100%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 643,8.
Exemplo 6. Síntese de Int-2 Etapa a.
[00749] Um frasco de reação seco à chama foi lavado com nitrogênio e carregado com intermediário Zanamivir (Exemplo 2) (533,6 mg, 0,812 mmol), DMAP (99,8 mg, 0,81 mmol) e DCM anidro (1 mL). Após agitação para dissolver o material de partida, a solução foi resfriada em um banho de água gelada e cloroformato de 4-nitrofenil (242 mg, 1,2 mmol) foi adicionado. A mistura resultante foi agitada durante 5 horas, depois adicionada a uma solução do Ligante-2 (Exemplo 5) (228,4 mg, 0,319 mmol) em DMF anidro (1 mL) e DIPEA (130 mg, 1 mmol). A reação foi agitada durante a noite e purificada por RPLC (150 g, 20 a 65% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador).
As frações coletadas foram liofilizadas. Rendimento 178,3 mg, 30,4%. Íon encontrado por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 920,5, [(M + 3H) / 3]+ = 614,2.
Etapa b.
[00750] O produto da etapa a (178,3 mg, 0,0969 mmol) foi dissolvido em TFA (0,5 mL). A solução foi agitada durante 20 minutos, depois diretamente purificada por HPLC (0 a 25% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 91,8 mg, 56,8%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 720,4, [(M + 3H) / 3]+ = 480,6.
Etapa c.
[00751] O produto da etapa b (91,8 mg, 0,055 mmol) foi dissolvido em MeOH (1 mL) e a solução foi resfriada em um banho de água gelada. Mono-hidrato de LiOH (21 mg, 0,5 mmol) em água (1 mL) foi adicionado em porções ao longo de 1 hora. Após agitação por mais 2 horas, a mistura de reação foi acidificada com uma solução de HCl 4N em dioxano (0,3 mL) e purificada por HPLC (0 a 20% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 36,2 mg, 59,4%.%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 680,3, [(M + 3H) / 3]+ = 454,0.
Exemplo 7. Síntese de h-IgG1 Fc-PEG4-azida
[00752] Éster PEG4-azidoNHS (98%, 180 μmol, 9,5 equivalentes, 71,4 mg em 0,5 mL de DMF e diluído para 3,60 mL com solução tampão PBS 1x de pH 7,4) foi adicionado a uma solução de h-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 4) (1103 mg em 70,0 mL de PBS de pH 7,4, MW ~ 58.000 Da, 19,0 μmol) e a mistura foi agitada suavemente durante 12 horas à temperatura ambiente. A solução foi concentrada usando um concentrador centrífugo (30.000 MWCO) para um volume de ~ 1,5 mL. A mistura bruta foi diluída 1:10 em PBS pH 7,4 e concentrada novamente. Este procedimento de lavagem foi repetido por um total de três vezes. O reagente de molécula pequena foi removido com este procedimento de lavagem. A Fc-PEG4-azida concentrada foi diluída para 70,0 mL com tampão PBS 1x pH 7,4 e pronta para a conjugação de Clique. O material purificado foi quantificado usando um espectrofotômero visível Nanodrop™ UV (usando um coeficiente de extinção calculado com base na sequência de aminoácidos de h-IgG1). O rendimento é quantitativo após a purificação. DAR = 4,3 determinado por MALDI. O valor DAR pode ser ajustado alterando os equivalentes do éster NHS PEG4-azido em uma relação quase linear. Por exemplo, quando 7,0 equivalentes de éster NHS de PEG4-azida são usados, o valor DAR será 3,0.
Exemplo 8. Síntese de albumina de soro de camundongo recombinante (MSA) -PEG4-azida
[00753] Éster de PEG4-azidoNHS (98%, 81,7 mol, 4,5 equivalentes, 32,4 mg em 0,3 mL de DMF e diluído para 1,63 mL com solução tampão PBS 1x de pH 7,4) foi adicionado a uma solução de albumina de soro de camundongo recombinante (SEQ ID NO: 71) (1200 mg em 75,0 mL de PBS de pH 7,4, MW ~ 66.000 Da, 18,2 mol) e a mistura foi agitada suavemente durante
12 horas à temperatura ambiente. A solução foi concentrada usando um concentrador centrífugo (30.000 MWCO) para um volume de ~ 1,5 mL. A mistura bruta foi diluída 1:10 em PBS pH 7,4 e concentrada novamente. Este procedimento de lavagem foi repetido por um total de três vezes. O reagente de molécula pequena foi removido com este procedimento de lavagem. A MSA- PEG4-azida concentrada foi diluída para 75,0 mL com tampão PBS 1x pH 7,4 e pronta para a conjugação de Clique. O material purificado foi quantificado usando um espectrofotômero visível Nanodrop™ UV (usando um coeficiente de extinção calculado com base na sequência de aminoácidos de h-IgG1). O rendimento é quantitativo após a purificação. DAR = 3,5 determinado por MALDI. O valor DAR pode ser ajustado alterando os equivalentes de PEG4-azido NHS éster semelhante a h-IgG1 Fc (Exemplo 7).
Exemplo 9. Síntese do Conjugado 1
[00754] Uma solução de PBS de h-IgG1 Fc-PEG4-azida (Exemplo 7) (50 mg, 2,815 mL, 0,8591 µmol) foi adicionada a um tubo de centrífuga de 15 mL contendo Int-2 (Exemplo 6) (35,2 mg, 0,02217 mmol). Após a mistura ser agitada suavemente para dissolver todo Int-2, 344 µl de uma solução de sódio de ácido L-ascórbico (59,4 mg, 0,3 mmol), sulfato de cobre (II) (10 mg, 0,05 mmol) e THPTA (23 mg , 0,05 mmol) em tampão PBS 7,4 (1 mL) foi adicionada. A mistura resultante foi agitada suavemente durante a noite. Foi purificada por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão de tamanho, conforme descrito no Exemplo 8. A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 63797 Da (DAR = 3,4). Rendimento 27,39 mg, rendimento de 55%. A FIG. 9 mostra uma SDS-PAGE de não redução do Conjugado 1.
Exemplo 10. Purificação de Conjugados
[00755] A mistura bruta foi diluída 1:10 em PBS pH 7,4 e purificada usando resina MabSelect Sure (GE Healthcare, Chicago, IL, EUA),
seguida por cromatografia de exclusão por tamanho. (HiLoad 26/600 Superdex200 pg, GE Healthcare, Chicago, IL, USA). As frações contendo o conjugado purificado foram reunidas e concentradas a aproximadamente 20 mg / mL usando um concentrador centrífugo (30.000 MWCO). O material purificado foi quantificado usando um espectrofotômero visível Nanodrop™ UV (usando um coeficiente de extinção calculado com base na sequência de aminoácidos de hIgG1 Fc(myc). Moléculas purificadas foram analisadas usando géis Bis Tris SDS PAGE 4-12% carregando 1 μg de cada molécula no gel e coloração usando Instant Blue (Expedeon, San Diego, CA, USA). Cada gel incluía uma escada de peso molecular com os padrões de peso molecular indicados. Os rendimentos foram calculados e a pureza determinada por Agilent Analytical HPLC. O pico do produto e o MW foram encontrados por Maldi MS e um DAR final calculado.
Exemplo 11. Síntese de Int-3
Etapa a.
[00756] A uma solução de propargil-PEG4-ácido (260 mg, 1 mmol) e HATU (380,2 mg, 1 mmol) em DMF anidro (1 mL) foi adicionado DIPEA (130 mg). Após agitação durante 5 minutos, NH-bis (PEG3-Boc) (500 mg, 0,881 mmol) foi adicionado e a agitação continuou à temperatura ambiente durante a noite. Foi então purificada diretamente por RPLC 9100 g, 5 a 50% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 683 mg, 95,8%.
Íons encontrados por LCMS: [M + H]+ = 810,4, [M - Boc + H]+ = 710,4, [(M - 2Boc + 2H) / 2]+ = 305,8.
Etapa b.
[00757] O produto da etapa a foi dissolvido em TFA (1 mL). A solução foi agitada durante 2 horas e então diretamente purificada através de RPLC (100 g, 0 a 30% de acetonitrila e água). Rendimento 589 mg, 98,7%. Íon encontrado por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 305,8.
Etapa c.
[00758] Um frasco de reação seco à chama foi lavado com nitrogênio e carregado com intermediário Zanamivir (Exemplo 2) (572 mg, 1 mmol) e DCM anidro (1 mL). Após agitação para dissolver o material de partida, a solução foi resfriada em um banho de água gelada e cloroformato de 4-
nitrofenil (302,4 mg, 1,5 mmol) foi adicionado seguido por DMAP (22,4 mg, 0,2 mmol). A mistura resultante foi agitada durante 5 horas e, em seguida, foi adicionada água temperada (0,2 mL). Após agitação durante 10 minutos, o produto da etapa b (256,7 mg, 0,355 mmol) em DMF anidro (1 mL) e DIPEA (163,8 mg, 1,26 mmol) foi adicionado. A agitação continuou durante 2 horas e, em seguida, a reação foi purificada diretamente por RPLC (150 g, 20 a 65% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). As frações coletadas foram liofilizadas. Rendimento de 422,8 mg do produto desejado que estava contaminado com algumas impurezas, rendimento <69%. O material foi transportado para a etapa subsequente sem purificação adicional. Íon encontrado por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 903,9, [(M + 3H) / 3]+ = 603,2.
Etapa d.
[00759] O produto da etapa c (422,8 mg, <0,245 mmol) foi dissolvido em TFA (1 mL). A solução foi agitada durante 20 minutos, depois diretamente purificada por HPLC (5 a 25% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 169,7 mg, 29,2% em duas etapas. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 704,0, [(M + 3H) / 3]+ = 469,6.
Etapa e.
[00760] O produto da etapa d (169,7 mg, 0,0923 mmol) foi dissolvido em MeOH (1,5 mL) e a solução foi resfriada em um banho de água gelada. Mono-hidrato de LiOH (21 mg, 0,5 mmol) em água (1 mL) foi adicionado em porções ao longo de 1 hora. Após agitação durante a noite, a mistura de reação foi acidificada com a forma de hidrogênio Dowex 50W x 8 e purificada através de RPLC (0 a 30% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 107,9 mg, 66,9%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 663,8, [(M + 3H) / 3]+ = 442,9.
Exemplo 12. Síntese do Conjugado 2
[00761] O conjugado do título foi preparado analogamente ao Conjugado 1 (Exemplo 9) usando Int-3 (Exemplo 11). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 63561 Da (DAR = 3,3).
Rendimento 43,4 mg, rendimento de 43%. A FIG. 10 mostra uma SDS-PAGE de não redução do Conjugado 2.
Exemplo 13. Síntese de Int-4
Etapa a.
[00762] Um frasco de reação seco à chama foi lavado com nitrogênio e carregado com Intermediário Zanamivir (Exemplo 2) (343,2 mg, 0,6 mmol) e DCM anidro (1,5 mL). A solução foi resfriada em um banho de água gelada e adicionada com DIPEA (234 mg, 1,8 mmol) seguido por cloroformato de 4-nitrofenil (121 mg, 0,6 mmol) e DMAP (67,4 mg, 0,6 mmol). A mistura resultante foi agitada durante 15 minutos, depois adicionada com uma quantidade adicional de cloroformato de 4-nitrofenil (121 mg, 0,6 mmol). Após agitação durante 2 horas, foi adicionada água (0,2 mL) para extinguir o cloroformato que não reagiu. Depois de agitada durante 10 minutos, a mistura de reação foi adicionada com uma solução de propargil-PEG4-amina (185 mg, 0,8 mmol) em DMF anidro (0,5 mL). A reação foi continuada por 1 hora e então diretamente purificada através de RPLC (100 g, 5 a 60% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). As frações coletadas foram liofilizadas.
Rendimento 355 mg, 71,3%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 830,2.
Etapa b.
[00763] O produto da etapa a (355 mg, 0,428 mmol) foi dissolvido em TFA (1 mL). A solução foi agitada durante a noite, depois diretamente purificada por RPLC (5 a 25% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento de 260,2 mg, 70,9% em duas etapas.
Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 630,2.
Etapa c.
[00764] O produto da etapa b (260,2 mg, 0,303 mmol) foi dissolvido em MeOH (1,5 mL). Depois que a solução foi resfriada em um banho de água gelada, uma solução de mono-hidrato de LiOH (42 mg, 1 mmol) em água (1 mL) foi adicionada em porções ao longo de 1 hora. A reação foi agitada durante a noite, depois acidificada com a forma de hidrogênio Dowex 50W x 8 e purificada por RPLC (0 a 50% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 78,1 mg, 99%. Íons encontrados por LCMS: [M + H] + = 590,2.
Exemplo 14. Síntese do Conjugado 3
[00765] O conjugado do título foi preparado analogamente ao Conjugado 1 (Exemplo 9) usando Int-4 (Exemplo 13). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 61182 Da (DAR = 3,4).
Rendimento 50,89 mg, rendimento de 51%. A FIG. 11 mostra uma SDS-PAGE de não redução do Conjugado 3.
Exemplo 15. Síntese de Int-5 Etapa a.
[00766] Um frasco de reação seco à chama foi lavado com nitrogênio e carregado com (1S,2S,3R,4R)-metil 3-((S)-1-acetamido-2-etilbutil)- 4-(terc-butoxicarbonilamino)-2- hidroxiciclopentanocarboxilato (320,4 mg, 0,8 mmol) e DCM anidro (2 mL). A solução foi resfriada em um banho de água gelada e DIPEA (312 mg, 2,4 mmol) foi adicionado seguido por cloroformato de 4- nitrofenil (161,3 mg, 0,8 mmol) e DMAP (98 mg, 0,8 mmol). A mistura resultante foi agitada durante 15 minutos, depois foi adicionada uma quantidade adicional de cloroformato de 4-nitrofenil (161,3 mg, 0,8 mmol). A reação foi agitada durante 2 horas, em seguida, água (0,2 mL) foi adicionada para extinguir o cloroformato que não reagiu. Após agitação durante 10 minutos, foi adicionada uma solução de propargil-PEG4-amina (259 mg, 1,12 mmol) em DMF anidro (0,5 mL). A reação foi agitada durante 1 hora e depois purificada diretamente por RPLC (100 g, 5 a 60% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). As frações coletadas foram liofilizadas. Rendimento 391,2 mg, 74,4%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 658,3, [M - Boc + H]+ = 558,3.
Etapa b.
[00767] O produto da etapa a (391,2 mg, 0,595 mmol) foi dissolvido em TFA (0,8 mL) e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 20 minutos. Foi então purificado diretamente por RPLC (100 g, 5 a 60% de acetonitrila e água). Rendimento 323,2 mg, 81%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 558,3.
Etapa c.
[00768] A uma solução do produto da etapa b (323,2 mg, 0,482 mmol) em THF (2 mL) foi adicionado N,N'-Bis-Boc-1-guanilpirazol (224,4 mg, 0,723 mmol) e PIPEA (260 mg, 2 mmol). A mistura de reação foi agitada durante 1 dia e depois extraída com água (3 mL) e EtOAc / hexanos (1:1, 8 mL).
A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada por evaporação rotativa. O resíduo foi redissolvido em TFA (~ 1 mL) e a solução foi agitada durante a noite. Foi então purificada diretamente por RPLC (100 g, 0 a 30% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). As frações coletadas foram liofilizadas. Rendimento 254,2 mg, 83,2%. Íons encontrados por LCMS: [M + H]+ = 600,3, [M - Boc + H]+ = 300,6.
Etapa d.
[00769] O produto da etapa c (254,2 mg, 0,356 mmol) foi dissolvido em THF (1,5 mL) e a solução foi resfriada em um banho de água gelada. Di-hidrato de CaCl2 (419 mg, 2,85 mmol) foi adicionado, então 1,8 mL de KOH (112 mg,2 mmol) em água (2 mL) foram adicionados em porções ao longo de 1 hora. Depois de agitada por mais 3 horas, a mistura de reação foi acidificada pela forma de hidrogênio Dowex 50W x 8 e purificada por RPLC (0 a 30% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador).
Rendimento 102 mg, 49,8%. Íons encontrados por LCMS: [M + H]+ = 586,4, [(M + 2H) / 2]+ = 293,8.
Exemplo 16. Síntese do Conjugado 4
[00770] O conjugado do título foi preparado analogamente ao Conjugado 1 (Exemplo 9) usando Int-5 (Exemplo 15). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 63002 Da (DAR = 3,4).
Rendimento 49,315 mg, rendimento de 49%. A FIG. 12 mostra uma SDS-PAGE de não redução do Conjugado 4.
Exemplo 17. Síntese de Int-6
Etapa a.
[00771] Um frasco de reação seco à chama foi lavado com nitrogênio e carregado com (1S,2S,3R,4R)-metil 3-((S)-1-acetamido-2-etilbutil)- 4-(terc-butoxicarbonilamino)-2- hidroxiciclopentanocarboxilato (280,4 mg, 0,7 mmol) e DCM anidro (1 mL). Após agitação para dissolver o material de partida, DMAP (85,7 mg, 0,7 mmol) foi adicionado à solução, seguido por bis(pentafluorofenil)carbonato (295,6 mg, 0,75 mmol). A mistura resultante foi agitada durante 1 hora, depois adicionada a uma solução de Ligante-2 (Exemplo 5) (157,5 mg, 0,22 mmol) em DMF anidro (1 mL) e DIPEA (130 mg, 1 mmol). A reação foi agitada durante a noite e purificada por RPLC (50 g, 5 a 90% de acetonitrila e água). As frações coletadas foram liofilizadas. Rendimento 134,1 mg, 40,7%. Íon encontrado por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 748,6.
Etapa b.
[00772] O produto da etapa a (134,1 mg, 0,0896 mmol) foi dissolvido em TFA (0,5 mL). A solução foi agitada durante 20 minutos, depois diretamente purificada por RPLC (50 g, 5 a 60% de acetonitrila e água).
Rendimento 108,4 mg, 93,4%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 648,3, [(M + 3H) / 3]+ = 432,8.
Etapa c.
[00773] A uma solução do produto da etapa b (108,4 mg, 0,0837 mmol) em THF anidro (1 mL) foi adicionado N,N'-bis-boc-1-guanilpirazol (81,3 mg, 0,285 mmol) e DIEPA (65 mg, 0,5 mmol). A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 2,5 dias, em seguida, purificada diretamente por RPLC (100 g, 40 a 75% de acetonitrila e água). Rendimento 73,6 mg, 49,4%. Íon encontrado por LCMS: [(M + 3H) / 3]+ = 594,2.
Etapa d.
[00774] O produto da etapa c (73,6 mg, 0,041 mmol) foi dissolvido em TFA (0,5 mL). A solução foi agitada durante 20 minutos, depois diretamente purificada por RPLC (50 g, 5 a 60% de acetonitrila e água).
Rendimento de 62,1 mg, 94,1%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 690,4, [(M + 3H) / 3]+ = 460,8.
Etapa e.
[00775] O produto da etapa d (62,1 mg, 0,0386 mmol) em THF (3 mL) foi resfriado em um banho de água gelada e uma solução a 45% p / p de KOH (0,2 mL) foi adicionada em porções ao longo de 1 hora. A reação foi agitada por mais 2 horas, depois acidificada com solução de HCl 4N em dioxano (0,8 mL) e extraída com hexanos (10 mL) e água (1,5 mL). A camada aquosa foi purificada por HPLC (0 a 20% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 36,2 mg, 59,4%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 676,5, [(M + 3H) / 3]+ = 451,4.
Exemplo 18. Síntese do Conjugado 5
[00776] O conjugado do título foi preparado analogamente ao Conjugado 1 (Exemplo 9) usando Int-6 (Exemplo 17). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 63561 Da (DAR = 3,3).
Rendimento 43,4 mg, rendimento de 43%. A FIG. 13 mostra uma SDS-PAGE de não redução do Conjugado 5.
Exemplo 19. Síntese de Int-7
Etapa a.
[00777] A uma solução de propargil-PEG4-ácido (609 mg, 2,34 mmol) e NH-bis (PEG1-azida) (500 mg, 2,055 mmol) em DMF anidro (2 mL) foi adicionado HATU (889,7 mg, 2,34 mmol) em porções durante 5 minutos. Após agitação para dissolver todo o reagente de acoplamento, DIPEA (390 mg, 3 mmol) foi adicionado e a agitação continuou durante 1 hora. Foi então purificado diretamente por RPLC (100 g, 5 a 40% de acetonitrila e água). Rendimento 918 mg, 92%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 486,2.
Etapa b.
[00778] O produto da etapa a (918 mg, 1,89 mmol) foi dissolvido em THF e a solução foi resfriada a ~ 13 ℃. Trifenilfosfina (1,141 g, 4,35 mmol) foi adicionada em porções ao longo de 10 minutos. A mistura resultante foi agitada a ~ 13 ℃ à temperatura ambiente por 2 horas. Uma solução de mono-hidrato de LiOH (42 mg, 1 mmol) em água (2 mL) e MeOH (1 mL) foi adicionada. Após a agitação ser continuada por 20 horas, a reação foi purificada por RPLC (100 g, 0 a 30% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 825 mg, 65,9%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 434,4.
Etapa c.
[00779] Um frasco de reação seco à chama foi lavado com nitrogênio e carregado com intermediário Zanamivir (Exemplo 2) (865 mg, 1,51 mmol) e DCM anidro (5 mL). Após agitação para dissolver o material de partida, a solução foi resfriada em um banho de água gelada e cloroformato de 4- nitrofenil (365,3 mg, 1,81 mmol) foi adicionado seguido por DMAP (152,2 mg, 0,755 mmol). O banho de água gelada foi removido e a mistura foi agitada durante 3 horas. Uma quantidade adicional de cloroformato de 4-nitrofenil (304,4 mg, 1,51 mmol) foi adicionada, e a agitação foi continuada por 1 hora. A reação foi então extinta com água (1 mL). Depois de vigorosamente agitada durante 1 hora, a mistura de reação foi extraída com água (20 mL x 2) e DCM (20 mL). A camada orgânica foi agitada durante a noite, seca sobre Na2SO4, e concentrada por evaporação rotativa. O material foi transportado para a etapa subsequente sem purificação adicional. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 738,2.
Etapa d.
[00780] Uma solução de uma mistura do produto da etapa b (429,7 mg, 0,65 mmol) e DIPEA (260 mg, 2 mmol) em THF anidro (1 mL) foi adicionada gota a gota ao produto da etapa c. A mistura resultante foi agitada durante 2 horas, então diretamente purificada por RPLC (100 g, 10 a 65% de acetonitrila e água). A acetonitrila nas frações coletadas foi removida por evaporação rotativa à temperatura ambiente. A camada aquosa heterogênea foi extraída com EtOAc (200 mL), depois extraída de volta com EtOAc (50 mL). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SO4 e concentradas por evaporação rotativa até a secura. Rendimento 442 mg, 41,7%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 815,8, [(M - Boc + 2H) / 2]+ = 765,8, [(M - 2Boc + 2H) / 2]+ = 716.
Etapa e.
[00781] O produto da etapa d (441 mg, 0,271 mmol) foi dissolvido em TFA (1 mL). A solução foi agitada durante 20 minutos, depois diretamente purificada por HPLC (5 a 20% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 308 mg, 77,9%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 615,8, [(M + 3H) / 3]+ = 411.
Etapa f.
[00782] O produto da etapa e (308 mg, 0,211 mmol) foi dissolvido em MeOH (1 mL) e água (0,5 mL), e a solução foi resfriada em um banho de água gelada. Uma solução de mono-hidrato de LiOH (42 mg, 1 mmol) em água (1 mL) foi adicionada em porções ao longo de 1 hora. A reação foi agitada durante a noite, acidificada por solução de HCl 4 N em dioxano (0,25 mL) e purificada por RPLC (0 a 20% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 198 mg, 64%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 575,8, [(M + 3H) / 3]+ = 384,2.
Exemplo 20. Síntese do Conjugado 6
[00783] O conjugado do título é preparado analogamente ao Conjugado 1 (Exemplo 9) usando Int-7 (Exemplo 19). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 62854. Da (DAR = 3,1).
Rendimento 175,4 mg, rendimento de 50%. A FIG. 14 mostra uma SDS-PAGE de não redução do Conjugado 6.
Exemplo 21. Síntese de Int-8 DMP, bromoace acetona tato Etapa a.
[00784] Metil 5-acetoamido-7,8,9-O-triacetil-2,6-anidro-4- azido-3,4,5-tridesoxi-D-glicero-D-galacto-non-2-enonato (1,8 g, 4,0 mmol) foi dissolvido em 40 mL de metanol e, em seguida, tratada com 400 mg de 5% Pd / C e 1,1 g de anidrido Boc (5,0 mmol), em seguida, a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente sob uma atmosfera de hidrogênio durante 1 hora. O paládio-carvão foi removido por filtração. O filtrado foi concentrado e usado na etapa seguinte sem purificação.
Etapa b.
[00785] O produto da etapa anterior foi dissolvido em 20 mL de metanol seco e depois tratado com 2 mL de metóxido de sódio em metanol (0,5 M) gota a gota com resfriamento em um banho de água gelada. Após 2 horas, o progresso da reação foi determinado por LCMS. A reação foi extinta com HCl 1N para pH 5-6. A solução resultante foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 5% a 100% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador. Íon(s) encontrado (s) por LCMS: (M + H)+ = 405 Etapa c.
[00786] Metil 5-acetamido-2,6-anidro-4-[(terc- butoxicarbonil)amino]-3,4,5-trideoxi-D-eritro-non-2-enonato (0,4 g, 1 mmol) foi dissolvido em 10 mL de acetona, 4 mL de 2,2-dimetoxipropano e 20 mg de hidrato de ácido p-toluenossulfônico (0,1 mmol). A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, então extinta com 1 mL de NaHCO 3 saturado. A mistura foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 5% a 100% de acetonitrila e água sem modificador. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: (M + H)+ = 445.
Etapa d.
[00787] Hidreto de sódio (40 mg, 60% em óleo, 1,0 mmol) foi adicionado a metil 5-acetamido-2,6-anidro-4-[(terc-butoxicarbonil)amino]-3,4,5- trideoxi-8,9-O-(1-metiletilideno)-D-eritro-non-2-enonato (0,25 g, 0,50 mmol) em 5 mL de THF seco com resfriamento de um banho de água gelada. A solução resultante foi agitada durante 0,5 hora, em seguida foi adicionado bromoacetato de benzil (0,23 g, 1,0 mmol). A solução resultante foi agitada durante 2 horas e extinta com 5 mL de cloreto de amônio a 10% em água. Em seguida, a solução foi diluída com 50 mL de acetato de etil. A camada orgânica foi separada e seca com sulfato de sódio. A solução orgânica seca foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 5% a 100% de acetonitrila e água sem modificador. Íon(s) encontrado (s) por LCMS: (M + H)+ = 593.
Exemplo 22. Síntese de Int-9 então, Bromoa cetato Boc2O THF (seco) Etapa a.
[00788] Metil 5-acetoamido-7,8,9-O-triacetil-2,6-anidro-4- azido-3,4,5-tridesoxi-D-glicero-D-galacto-non-2-enonato (10g, 22mmol) foi dissolvido em 100 ml de metanol e depois aquecido a 60°C com um banho de óleo, o SnCl2 (5,7 g, 20 mmol) foi adicionado à solução em 3 porções (cuidado, o gás evolui). A mistura de reação foi agitada durante 10 min, momento em que a reação foi concluída por HPLC. A solução de reação foi lentamente adicionada a uma solução de 50 ml de NaHCO 3 Sat. e 50g de celite com agitação vigorosa.
A pasta resultante foi filtrada. O filtrado foi tratado com Boc 2O (6,6 g, 30 mmol, 1,5 equiv). Após 2 horas à temperatura ambiente, a solução foi concentrada para remover a maior parte do metanol, dissolvida em 200 ml de DCM e extraída duas vezes com 100 ml de DCM. Os extratos combinados foram secos com sulfato de sódio, filtrados e usados na próxima etapa sem purificação adicional.
Rendimento bruto 12g, 100%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M+H =531.
Etapa b.
[00789] O material da etapa anterior foi dissolvido em 60 ml de metanol seco, depois tratado com 10 ml de metóxido de sódio em metanol (0,5 M) enquanto se resfriava com um banho de água gelada. O progresso da reação foi monitorado por LCMS que estava completo após 2h. A reação foi extinta com HCl 1N para um pH de 5-6. A solução resultante foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 0% a 30% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador. Rendimento dos produtos 7,2 g, 80%. Íon(s) encontrado (s) por LCMS: M+H =405.
Etapa c.
[00790] Uma solução do produto da etapa anterior (3,5 g, 8,5 mmol), CDI (2,8 g, 2 equiv), trimetilamina (4,2 ml, 30 mmol) e DMAP (240 mg, 2 mmol) foram aquecidos em acetonitrila (50 mL) durante a noite, em seguida, concentrado e purificado por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 0% a 30% de acetonitrila e água sem modificador. Rendimento do produto desejado 2,3 g,
60%. Íon(s) encontrado (s) por LCMS: M+H =431.
Etapa d.
[00791] Hidreto de sódio (400 mg, 60% em óleo, 10 mmol) foi adicionado ao produto da etapa anterior (1,45 g, 3,3 mmol) em 50 ml de THF seco (reação sensível à umidade) sob o banho de água gelada. A solução resultante foi agitada durante 0,5 hora, em seguida, bromo-acetato de tercbutil (2 g, 10 mmol) foi adicionado à solução acima, a solução resultante foi aquecida até 60°C durante a noite e extinta com ácido acético. A solução resultante foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 0% a 50% de acetonitrila e água com TFA como modificador. Rendimento de 1g, 57%. Íon(s) encontrado (s) por LCMS: M+H =593.
Etapa e.
[00792] O produto da etapa anterior (1,2 g, 2,2 mmol) foi agitado com 10 mL de TFA à temperatura ambiente durante a noite, e o progresso da desproteção foi monitorado por LCMS. A solução resultante foi concentrada e usada na etapa seguinte sem purificação. O resíduo foi redissolvido em 20 ml de THF, então N,N'-bis-boc-1-guanilpirazol (1 g, 3,3 mmol), 4-dimetilaminopiridina (120 mg, 1 mmol) e trietilamina (0,7 ml, 5 mmol) foram adicionados à solução, e a solução resultante foi aquecida a 60C durante 2 horas. A solução resultante foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 0% a 50% de acetonitrila e água sem modificador.
Rendimento de 700 mg, 84%. Íon(s) encontrado (s) por LCMS: M+H =631.
Etapa f.
[00793] A uma solução de ligante-3 (preparada conforme descrito no Exemplo 19) (73 mgg, 0,14 mmol) e o produto da etapa anterior (200 mg, 0,32 mmol, 2,2 equi) em DMF (30 mL) foi adicionado EDC (100 mg, 0,5 mmol), HOAt (65 mg, 3 mmol) e DIEA (0,14 mL, 1 mmol) à temperatura ambiente.
A solução foi agitada durante a noite. A solução resultante foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 0% a 50% de acetonitrila e água sem modificador. Rendimento de 120 mg, 52%. Íon(s) encontrado(s) por
LCMS: M / 2 + H = 830.
Etapa g.
[00794] Hidróxido de lítio (24mg, 1mmol) em 2ml H2O foi adicionado à solução do produto da etapa anterior (120mg, 0,07mmol) em 2ml THF e 1ml MeOH, LCMS monitorou o progresso da reação. Após a conclusão, a solução foi adicionada AMBERLITE® IRN-77, resina de troca iônica para ajustar a pH1, então a solução resultante foi filtrada e o filtrado foi concentrado e usado na próxima etapa sem purificação. O composto resultante foi tratado com 2 mL de TFA à temperatura ambiente, a solução foi agitada durante a noite a 40 C, em seguida, concentrada e purificada por HPLC eluído com 0% a 20% de acetonitrila e água, usando TFA como modificador. Rendimento de 60 mg, rendimento de 74%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: [M/2] +1 = 589,8.
Exemplo 23. Ensaio de inibição da neuraminidase
[00795] Um ensaio de inibição da neuraminidase usando substrato de ácido 2'-(4-metilumbeliferil)-alfa-D-N-aceilneuramínico (MUNANA) foi realizado conforme descrito abaixo. Resumidamente, 50 μL de neuraminidase do vírus influenza recombinante purificado (0,1 ng / μL, Tris 50 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) foram misturados com 50 μL de inibidor e incubados por 30 min à temperatura ambiente. Foram utilizadas pelo menos 5 concentrações de cada inibidor em uma faixa apropriada para cada repetição. Após a incubação, 50 μL de 400 µM de MUNANA em 50 mM de Tris, 5 mM de CaCl2, 200 mM de NaCl, (pH 7,5) foram adicionados à solução para iniciar a reação usando uma pipeta de 12 pontas (Eppendorf). Um controle positivo e um controle negativo foram incluídos em cada pista de 12 poços. Depois de iniciar a reação para cada pista na placa, a mistura de reação foi imediatamente carregada em um SpectraMax M5 (Dispositivos moleculares), onde a fluorescência foi quantificada ao longo de 25 min em um comprimento de onda de excitação de 365 nm e um comprimento de onda de emissão de 445 nm. Pontos de tempo únicos foram escolhidos em que o controle positivo produziu um sinal de fluorescência de aproximadamente 1.000. Todos os ensaios foram feitos em triplicado e os valores de IC50 para cada inibidor foram calculados com ajuste sigmoidal do log[inibidor] vs. porcentagem de inibição usando GraphPad Prism.
A FIG. 15 mostra o gráfico dos dados cinéticos como RFU / min ao longo de um intervalo linear para o Conjugado 1 e Int-2, mostrando a maior eficácia do Conjugado 1 como um inibidor da neuraminidase. A FIG. 16 e FIG. 17 mostram os resultados do ensaio para os Conjugados 1-6 contra rH1N1 Neuraminidase e rH3N2 Neuraminidase, respectivamente (Tabela 2).
Tabela 2: Valores de IC50 para conjugados contra H1N1 e H3N2 Neuraminidase Número do Conjugado H1N1 IC50 (nM) H3N2 IC50 (nM) Conjugado 1 3,9 32,5 Conjugado 2 3,7 17,6 Conjugado 3 3,6 38 Conjugado 4 1,9 17,2 Conjugado 5 1,1 14,3 Conjugado 6 4,1 29,8 Exemplo 24: Ensaio de citotoxicidade
[00796] Os conjugados 1, 2, 3 e 6 foram testados quanto à citotoxicidade. Dez diluições em série de duas vezes de cada conjugado começando com 10 µM foram preparadas em triplicado para inoculação com células MDCK em placas de cultura de 96 poços. A capacidade celular foi determinada quatro dias após o tratamento usando o kit CellTiter-GLO. 50% da concentração de citotoxicidade (CC50) foi calculada usando o modelo de resposta à dose XLfit (Tabela 3). Para todos os compostos testados, a citotoxicidade não foi observada até 10 µM, com exceção do conjugado 3. No caso do Conjugado 3, O EC50 no ensaio de efeito citopático (CPE) (ver Exemplo23 ) é 725 vezes inferior ao CC50 neste ensaio.
Tabela 3: Teste de citotoxicidade Número do Conjugado CC50 (µM) Conjugado 1 >10 Conjugado 2 >10 Conjugado 3 7,98 Conjugado 6 >10 PBS >10 Zanamavir >10 Exemplo 25. Ensaio de efeito citopático Ensaio de microneutralização baseado em CPE #1
[00797] Para medir a capacidade dos conjugados de neuraminidase de proteger as células de mamíferos da infecção e destruição pelo vírus da gripe, foram realizados ensaios de microneutralização com base no efeito citopático (CPE). Resumidamente, vinte diluições em série de duas vezes de cada conjugado começando a 0,25 µM foram preparadas em duplicata para inoculação de uma hora com células MDCK semeadas em placas de 96 poços. O vírus INFV CA/09 foi adicionado às células em uma multiplicidade de infecção (MOI) 0,001 para incubação de uma hora. No dia quatro após a incubação, as células foram coradas com cristal violeta e a densidade óptica foi lida para cálculo de 50 por cento da concentração efetiva (EC50) de cada TA usando o modelo de resposta à dose XLfit. Zanamivir foi usado como comparador e controle positivo. Fc humano foi incluído como um controle negativo. Os conjugados 1, 2, 3 e 6 demonstraram desempenho superior ao controle do zanamivir, demonstrando EC50s 42 a 227 vezes menores do que o zanamivir (Tabela 4).
Tabela 4: Ensaio de microneutralização baseado em CPE #1 Número do Conjugado EC50 (nM) 1 2,0574 2 4,1487 3 11,007 6 5,2167 PBS N/C Fc Humano N/C Zanamavir† 468,7 N / C: Não calculável † Concentração inicial de 10000 nM Ensaio de microneutralização baseado em CPE #2
[00798] Um ensaio de microneutralização adicional baseado em CPE foi executado para avaliar ainda mais a atividade in vitro do Conjugado 6 e Conjugado 7. Resumidamente, os artigos de teste foram preparados em uma concentração inicial de 160 nM, e um total de dez diluições de 2 vezes foram feitas. As diluições do artigo de teste foram então pré-misturadas com o vírus Influenza A (INFV CA / 09) em uma multiplicidade de infecção de 0,001 em relação à monocamada. Após uma hora, o artigo de teste + mistura viral foi adicionado a células Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cultivadas até 70-80% de confluência sob condições padrão em uma placa de 96 poços. O controle de zanamivir foi tratado da mesma forma, exceto que a concentração inicial foi de 9600 nM, uma vez que era esperado que fosse menos potente do que os Conjugados sendo testados. Após quatro dias de incubação, a monocamada foi corada com cristal violeta e a densidade óptica (reflexo da saúde da monocamada) foi determinada para calcular a concentração efetiva de 50% (EC50) usando o modelo de resposta à dose XLfit (idbs; https://www.idbs.com).
[00799] Conforme mostrado na Tabela 5, o zanamivir a uma concentração de 496 nM reduziu os efeitos citopáticos mediados pelo vírus pela metade. Em contraste, o Conjugado 6 foi aproximadamente 100x mais ativo com um EC50 de apenas 4,64 nM. O Conjugado 7 melhorou ainda mais a atividade em aproximadamente 15 vezes, reduzindo a EC50 para o nível sub-nM.
Tabela 5: Ensaio de microneutralização baseado em CPE #2 Número do Conjugado EC50 (nM) 6 4,64 7 0,31 Zanamivir 496 Exemplo 26. Célula por meio de ensaio de capacidade
[00800] As células A549 foram semeadas em placas de 96 poços um dia antes do tratamento com o composto. As células foram tratadas com Conjugado 3 (FIG. 18A), Conjugado 4 (FIG. 18B) ou Conjugado 6 (FIG. 18C) em concentrações de 1 µM - 10 nM por 24 horas. A capacidade celular foi então medida usando Cell Titer Glow (Promega). Os resultados representam a média e SD de três repetições biológicas. Não foram observados efeitos nas células por meio da capacidade de qualquer um dos conjugados em quaisquer concentrações em qualquer uma das concentrações usadas no ensaio de crescimento viral (Exemplo 27).
Exemplo 27. Ensaio de crescimento viral
[00801] Para medir a capacidade dos conjugados de neuraminidase de inibir o crescimento de cepas virais de influenza patogênicas de interesse em células epiteliais humanas, foram realizados ensaios de redução da placa viral. Resumidamente, as células A549 foram semeadas em placas de 24 poços um dia antes do tratamento com o composto. As células foram tratadas com compostos em concentrações de 1 µM - 10 nM por 2 horas e infectadas com as cepas virais indicadas em MOI 0,01 para incubação de uma hora. O vírus foi removido, as células foram lavadas e os compostos foram reaplicados em concentrações de 1 µM - 10 nM. Os sobrenadantes foram coletados em pontos de tempo indicados e titulados usando o método de ensaio de placa em células MDCK. Os resultados representam a média e SD de três repetições biológicas.
Oseltamivir foi usado como comparador e controle positivo. Conjugado 3 (FIGS.
19A-19E), Conjugado 4 (FIGS. 20A-E) ou Conjugado 6 (FIGS. 21A-21E e FIGS.
22A-22E), todos demonstraram desempenho superior ao controle de oseltamivir, mostrando redução da placa superior (geralmente) ou semelhante ao oseltamivir em concentrações 100 vezes menores. Os efeitos dos compostos (para avaliar os artigos de teste quanto à citotoxicidade potencial) nas células A549 foram avaliados para cada artigo de teste usando uma célula por meio de ensaio de capacidade (Exemplo 26). Resumidamente, as células A549 foram semeadas em placas de 96 poços um dia antes do tratamento com o composto. As células foram tratadas com compostos em concentrações de 1 µM - 10 nM durante 24 horas. A capacidade celular foi então medida usando Cell Titer Glow (Promega).
Os resultados representam a média e SD de três repetições biológicas.
Exemplo 28. Meia-vida sérica de camundongo
[00802] Os estudos farmacocinéticos (PK) usaram camundongos fêmea CD-1 (Charles River Laboratories) entre 20 e 22 gramas.
Os camundongos foram injetados IV por meio da veia da cauda, com 50 mg / kg de artigo de teste (volume de dose de 10 ml / kg). Os animais foram alojados em condições de alojamento padrão aprovadas pelo IACUC. Em momentos apropriados, os animais foram sangrados de forma não terminal (retro-orbital, bochecha ou pela veia da cauda) com sangue coletado em tubos de EDTA para prevenir a coagulação. O sangue coletado foi centrifugado (2.000 xg, por 10 minutos) e o plasma retirado para análise das concentrações do artigo de teste ao longo do tempo.
[00803] As concentrações plasmáticas para o Conjugado 6 ou hIgG1 Fc em cada ponto de tempo foram medidas por ELISA em sanduíche da seguinte forma: As moléculas do Conjugado 6 foram capturadas em placas revestidas com Neuraminidase ou placas revestidas com anticorpo anti-hIgG1 e, em seguida, detectadas usando um anticorpo anti-IgG-Fc humano conjugado com HRP. hIgG1 foi capturado usando anticorpo anti-hIgG1 Fc. A concentração de proteína foi calculada no GraphPad Prism usando a regressão não linear 4PL das curvas padrão do Conjugado 6 (ou hIgG1 Fc). Uma descrição mais detalhada do método é fornecida abaixo.
[00804] As placas Qiagen Ni-NTA HisSorb (Cat No. 35061, Qiagen) foram revestidas com Neuraminidase de A / California / 04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Bio) ou anticorpo anti-IgG1 Fc em tampão de revestimento 1X KPL ( 5150-0041, SeraCare). Nos casos em que o anticorpo anti-IgG1 Fc foi usado para capturar o artigo de teste, os anticorpos anti-IgG1 Fc de captura e detecção foram selecionados que se ligam a diferentes epítopos. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. Diluições em série das amostras de plasma foram semeadas e incubadas à temperatura ambiente por 2 horas (diluente da amostra: 0,5% de leite em pó desnatado + 3% de soro de cabra em PBS 0,05% de Tween20; concentração final de plasma de camundongo naïve de 1:900). As curvas padrão do Conjugado 6 ou hIgG1 Fc variando de 500 - 0,230 ng / mL, em duplicado, foram executadas em cada placa.
[00805] Após a incubação de 2 horas, as placas foram lavadas 5x em 300uL de PBS com 0,05% de Tween20. O conjugado 6 ligado à neuraminidase nas placas (ou anticorpo anti-hIgG1 Fc) foi então testado com um F(ab')2 anti-IgG Fc humano conjugado com HRP (Jackson 709-036-098) diluído 1:2.000 em diluente de amostra por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 8x em 300uL de PBS com 0,05% de Tween20 e desenvolvidas com substrato TMB por 7 minutos. A reação foi interrompida com 1N H2SO4. A absorbância foi lida a 450 nm. Um protocolo semelhante foi usado para hIgG1 Fc, onde apenas o anticorpo anti-hIgG1 Fc foi usado para a captura.
As quantidades de Conjugado 6 medidas em diferentes pontos de tempo usando neuraminidase ou captura de anticorpo anti-hIgG1 Fc foram semelhantes no erro experimental, sugerindo que o conjugado intacto é estável in vivo.
[00806] Conjugado total 6 (ou hIgG1 Fc) em amostras de teste foi interpolado usando Graphpad Prism Versão 6 após análise de regressão não linear (Sigmoidal, análise 4PL) das curvas padrão do Conjugado 6 (ou hIgG1 Fc). Os parâmetros PK foram calculados usando o software WinNonlin. As curvas que comparam o Conjugado 6 e hIgG1 Fc são mostradas na FIG. 23 e um resumo dos principais parâmetros de PK é fornecido na Tabela 6.
Inesperadamente, as exposições de plasma e meia-vida terminal são significativamente melhores para o Conjugado 6 do que para o hIgG1 Fc de tipo selvagem. As AUCs ao longo de 8 dias são 3x maiores para o Conjugado 6 do que para hIgG1 Fc, e a meia-vida terminal para o Conjugado 6 é de 214 horas, contra 52 horas para IgG1 Fc humano.
Tabela 6: PK de camundongo do Conjugado 6 em comparação com hIgG1 Fc Meia-vida (horas) AUClast (h*mg/mL) Conjugado 6 214 33100 hIgG1 51,8 10600 Exemplo 29. Eficácia do Conjugado 6 em um modelo letal de influenza de camundongo: Estudo #1
[00807] O Conjugado 6 foi avaliado contra uma infecção letal por influenza INFV A H1N1 em camundongos fêmeas BALB / c. O experimento compreendeu 7 grupos de 5 camundongos. No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com 1xLD90 H1N1 A / Texas / 36/91. Os grupos 1-6 receberam tratamento IV, 4 horas antes do desafio (Tabela 7). IgG1 humano (Fc sozinho) foi incluído como um controle negativo adicional. O Grupo 7 recebeu fosfato de Oseltamivir por via oral, começando 8 horas após a infecção, duas vezes ao dia, durante 5 dias. Todos os camundongos foram monitorados quanto à perda de peso (FIG. 24, Tabela 8) e sobrevida (FIG. 25, Tabela 9) durante 15 dias após o desafio.
[00808] Os camundongos tratados com o Conjugado 6 mostraram 100% de sobrevida com doses únicas em todas as concentrações testadas, em comparação com 20% e 0% de sobrevida nos grupos de controle de veículo e controle de hIgG1, respectivamente. Os resultados foram estatisticamente significativos quando comparados ao grupo veículo (p = 0,0135), apesar do pequeno tamanho do grupo (n = 5). Quando comparado com o grupo do fosfato de Oseltamivir, o Conjugado 6 demonstrou eficácia semelhante com uma dose cumulativa 500x inferior (em mg / kg). Os camundongos em todas as doses de Conjugado 6 mantiveram seu peso durante todo o curso do experimento, superior ao do grupo de controle do Oseltamivir.
Tabela 7: Desenho do estudo Grupo Desafio Composto Dose Tratamento n=5 Dia 0 (mg/kg) Rota / Dosagem 1 Veículo (PBS) N/A 2 Fc sozinho 50 3 Conjugado 6 50 4 Vírus da influenza A, Conjugado 6 10 IV, q.d. 4 horas pré-desafio cepa H1N1 A / Texas / 36/91 por meio da Conjugado 6 2 5 via IN.
6 Conjugado 6 0,4 Oseltamivir (TamifluTM) 20 PO, b.i.d. 8 horas depois 7 desafio por 5 dias Tabela 8: Peso Médio Diário Dias após Peso médio diário (O número de camundongos é adicionado apenas para os a infecção Grupos 1 e 2) Fc sozinho Conjugado 6 Fosfato de Veículo oseltamivir (PBS) 50mg/kg 50mg/kg 10mg/kg 2mg/kg 0,4mg/kg 20mg/kg 0 17,9 (5) 17,9 (5) 18,7 19,3 18,5 18,8 18,8 1 18,0 (5) 18,0 (5) 18,8 19,36 18,6 18,8 18,9 2 18,5 (5) 18,8 (5) 19,2 19,6 19,4 18,8 19,2 3 17,7 (5) 17,7 (5) 18,9 19,5 19,1 18,9 19,1 4 17,2 (5) 17,0 (5) 19,5 19,9 19,3 18,9 18,9 5 16,3 (5) 15,8 (5) 19,2 19,8 19,5 18,7 18,8 6 15,6 (4) 15,0 (5) 19,1 19,9 19,5 18,7 18,4 7 15,5 (2) 14,0 (2) 18,8 19,6 19,2 18,9 17,3 8 17,2 (1) 19,1 20,0 19,7 19,2 17,1 9 20,1 (1) 18,7 19,3 19,1 18,8 17,8
10 20,0 (1) 19,1 20,1 19,5 19,3 18,9 11 20,4 (1) 19,0 19,8 19,2 19,2 18,7 12 20,6 (1) 19,6 20,3 19,8 19,3 19,2 13 20,3 (1) 19,2 20,4 19,7 19,7 19,3 14 20,7 (1) 19,5 20,6 19,9 19,8 19,6 Tabela 9: Sobrevida de camundongos Sobrevida % de Composto Dosagem Significado para o veículo (p) Média sobrevida Veículo (PBS) N/A 7 20 N/A Fc sozinho 50mg/kg 7 0 0,8335 Conjugado 6 50mg/kg 15 100 0,0135 Conjugado 6 10mg/kg 15 100 0,0135 Conjugado 6 2mg/kg 15 100 0,0135 Conjugado 6 0,4mg/kg 15 100 0,0135 Fosfato de 20mg / kg 15 100 0,0135 oseltamivir B.I.D Exemplo 30. Eficácia do Conjugado 6 em um modelo letal de influenza de camundongo: Estudo #2
[00809] O Conjugado 6 foi avaliado contra uma infecção letal por influenza INFV A H3N2 em camundongos fêmeas BALB / c. O experimento compreendeu 11 grupos de 5 camundongos. No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com 1xLD90 H3N2 A / Hong Kong / 1/68. Os grupos 1-10 receberam tratamento IV, 4 horas antes do desafio (Tabela 10). IgG1 humano (Fc sozinho) foi incluído como um controle negativo adicional. O Grupo 11 recebeu fosfato de Oseltamivir por via oral, começando 8 horas após a infecção, duas vezes ao dia, durante 5 dias. Todos os camundongos foram monitorados quanto à perda de peso (FIG. 26) e sobrevida (FIG. 27, Tabela 11) durante 15 dias após o desafio.
[00810] Os camundongos tratados com o Conjugado 6 mostraram 100% de sobrevida com doses únicas em até 0,4 mg / kg e 80% de sobrevida com uma dose única de 0,2 mg / kg em comparação com 0% de sobrevida nos grupos de controle de veículo e controle de hIgG1,
respectivamente. 80% dos camundongos sobreviveram no grupo de controle do oseltamivir. Os resultados foram estatisticamente significativos quando comparados ao grupo veículo (p = 0,0128), apesar do pequeno tamanho do grupo (n = 5). Quando comparado com o grupo do fosfato de Oseltamivir, o Conjugado 6 demonstrou eficácia semelhante com uma dose cumulativa 1000x inferior (em mg / kg). Os camundongos em todas as doses de Conjugado 6 mantidas até 0,4 mg / kg e seu peso em 5%, superior ao grupo de controle do Oseltamivir.
Tabela 10: Desenho do estudo Grupo Desafio Artigo de Dose Tratamento Leitura / Ponto final n=5 Dia 0 teste (mg/kg) Rota / Dosagem Veículo N/A 1 (PBS) 2 Fc sozinho 50 3 50 4 2 IV, q.d. 4 horas pré- Monitoramento diário de 5 H3N2 A / 0,4 desafio peso e pontuação de Hong Kong / 0,2 6 saúde por 15 dias após o 1/68 por Conjugado 6 0,1 desafio 7 meio da rota % de sobrevida
IN 8 0,05 9 0,025 10 0,0125 20 PO, b.i.d. 8 horas Oseltamivir 11 após o desafio por 5 (TamifluTM) dias Tabela 11: Sobrevida de camundongos Sobrevida % de Significância para o veículo Composto Dosagem Média (dias) sobrevida (valor p) Veículo (PBS) N/A 9 0 N/A Controle Fc 50 mg/kg 8 0 0,2498 50 mg/kg 15 100 0,002 2 mg/kg 15 100 0,002 0,4 mg / kg 15 100 0,002 0,2 mg/kg Conjugado 6 15 80 0,0128 máx. 0,1 mg/kg 9 20 0,8264 0,05 mg/kg 9 20 0,5769 0,025 mg / kg 8 20 > 0,9999
0,0125 mg / 11 0 0,4703 kg Fosfato de oseltamivir 20 mg/kg 15 80 0,0052 (B.I.D. por 5 dias) Exemplo 31. Síntese de Int-10
THF (seco) bromoac etato Etapa a.
[00813] Metil I 5-acetamido-7,8,9-O-triacetil-2,6-anidro-4- azido-3,4,5-tridesoxi-D-glicero-D-galacto-non-2-enonato (SM-1, 10g, 22mmol) foi dissolvido em 100 ml de metanol e depois aquecido a 60°C com um banho de óleo, o SnCl2 (5,7 g, 20 mmol) foi adicionado à solução em 3 porções (cuidado, o gás evolui). A mistura de reação foi agitada durante 10 min, momento em que a reação foi concluída por HPLC. A solução de reação foi lentamente adicionada a uma solução de 50 ml de NaHCO3 Sat. e 50g de celite com agitação vigorosa.
A pasta resultante foi filtrada. O filtrado foi tratado com Boc 2O (6,6 g, 30 mmol, 1,5 equiv). Após 2 horas à temperatura ambiente, a solução foi concentrada para remover a maior parte do metanol, dissolvida em 200 ml de DCM e extraída duas vezes com 100 ml de DCM. Os extratos combinados foram secos com sulfato de sódio, filtrados e usados na próxima etapa sem purificação adicional.
Rendimento bruto 12g, 100%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M+H =531.
Etapa b.
[00814] O material da etapa anterior foi dissolvido em 60 ml de metanol seco, depois tratado com 10 ml de metóxido de sódio em metanol (0,5 M) enquanto se resfriava com um banho de água gelada. O progresso da reação foi monitorado por LCMS que estava completo após 2h. A reação foi extinta com HCl 1N para um pH de 5-6. A solução resultante foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 0% a 30% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador. Rendimento dos produtos 7,2 g, 80%. Íon(s) encontrado (s) por LCMS: M+H =405.
Etapa c.
[00815] Uma solução do intermediário da etapa anterior (3,5 g, 8,5 mmol), CDI (2,8 g, 2 equiv), trimetilamina (4,2 ml, 30 mmol) e DMAP (240 mg, 2 mmol) foram aquecidos a 60 °C em DMF (50 mL) durante a noite, em seguida, concentrado e purificado por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 0% a 30% de acetonitrila e resultando sem modificador. Rendimento do produto desejado 2,3 g, 60%. Íon(s) encontrado (s) por LCMS: M+H =431.
Etapa d.
[00816] Hidreto de sódio (400 mg, 60% em óleo, 10 mmol) foi adicionado Int-4 (1,45 g, 3,3 mmol) em 50 ml de THF seco (reação sensível à umidade) sob o banho de água gelada. A solução resultante foi agitada durante 0,5 hora, em seguida, foi adicionado bromoacetato de terc-butil (2 g, 10 mmol) à solução anterior. A solução resultante foi aquecida a 60 C durante a noite e extinta com ácido acético, concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 0% a 50% de acetonitrila e água com TFA como modificador.
Rendimento de 1g, 57%. Íon(s) encontrado (s) por LCMS: M+H =593.A reação é bastante limpa por HPLC, mas com baixo rendimento isolado) Etapa f.
[00817] O intermediário da etapa anterior (1,2 g, 2,2 mmol) foi agitado com 10 mL de TFA à temperatura ambiente durante a noite. O progresso da desproteção foi monitorado por LCMS. A solução resultante foi concentrada e usada na próxima etapa sem purificação.
[00818] O resíduo da reação anterior foi dissolvido em 20 ml de THF, então N,N'-bis-boc-1-guanilpirazol (1 g, 3,3 mmol), 4- dimetilaminopiridina (120 mg, 1 mmol) e trietil amina (0,7 mL, 5 mmol) foram adicionados à solução, e a solução resultante foi aquecida a 60 °C durante 2 horas. A solução resultante foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 0% a 50% de acetonitrila e água sem modificador. Rendimento de 700 mg, 84%. Íon(s) encontrado (s) por LCMS: M+H =631.
Etapa g.
[00819] A uma solução de ligante-3 (preparada conforme descrito no Exemplo 19) (73 mgg, 0,14 mmol) e o intermediário da etapa anterior (200 mg, 0,32 mmol, 2,2 equi) em DMF (30 mL) foi adicionado EDC (100 mg, 0,5 mmol), HOAt (65 mg, 3 mmol) e DIEA (0,14 mL, 1 mmol) à temperatura ambiente.
A solução foi agitada durante a noite. A solução resultante foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 0% a 50% de acetonitrila e água sem modificador. Rendimento de 120 mg, 52%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 830.
Etapa (h)
[00820] Hidróxido de lítio (24 mg, 1 mmol) em 2 mL de água foi adicionado a uma solução do intermediário da etapa anterior (120 mg, 0,07 mmol) em 2 mL de THF e 1 ml de MeOH. Após a reação estar completa por LCMS, a solução foi extinta com AMBERLITE® IRN-77, resina de troca iônica para ajustar a pH = 1, então a solução foi filtrada e o filtrado foi concentrado e na próxima etapa sem purificação adicional.
[00821] O intermediário da etapa anterior foi tratado em 2 mL de TFA à temperatura ambiente durante a noite a 40°C. A reação em bruto foi concentrada e purificada por HPLC com 0% a 20% de acetonitrila e água, usando TFA como modificador. Rendimento de 60 mg, rendimento de 74%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: [M/2] +1 = 589,8.
Exemplo 32. Síntese do Conjugado 7
[00822] Uma solução de Fc-PEG4-azida (cada monômero de domínio Fc tendo a sequência de SEQ ID NO: 38) em solução tampão PBSx1 (100 mg, 1,28 μmol, 6,1 mL, MW = 57260 Da, DAR = 3,6) foi adicionada a Int-10 (preparado conforme descrito no Exemplo 31) (sal de TFA, 44 mg, 0,031 mmol) e soluções de PBS pH 7,4 recém-preparadas de CuSO4 (0,7 mL de 50,0 mM, 20 eq), tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)-amina (THPTA , 0,7mL de 50,0 mM, 20 eq) e ascorbato de sódio (1,05 mL de 50,0 mM, 30eq). A solução homogênea resultante foi agitada em mesa oscilante por 12h. As soluções brutas foram diluídas com PBS pH 7,4 para uma concentração final de 1mg / mL, e ultrafiltradas (10.000 MWCO) para um volume de 1mL, duas vezes. As misturas brutas foram então diluídas 1:10 em PBS pH 7,4 e purificadas usando resina MabSelect Sure (GE Healthcare, Chicago, IL, EUA), seguida por cromatografia de exclusão por tamanho. O material purificado foi quantificado usando um espectrofotômero visível de UV Nanodrop™ (usando um coeficiente de extinção calculado com base na sequência de aminoácidos do Fc usado na conjugação e concentrado para aproximadamente 10 mg / mL usando um concentrador centrífugo (10.000 MWCO). As moléculas purificadas foram analisadas usando géis Bis Tris SDS PAGE 4-12% carregando 1-2 µg de cada molécula no gel e coloração usando coloração instantânea com Blue. Cada gel incluía uma escada de peso molecular com os padrões de peso molecular indicados. Os rendimentos são normalmente de 40-60%. A análise MALDI MS mostrou uma faixa de massas
(60000-90000) com uma média de massa de 63633. DAR médio = 4,5.
Exemplo 33. Eficácia do Conjugado 6 em um modelo letal de influenza de camundongo: Estudo #3
[00823] O Conjugado 6 foi avaliado contra uma infecção letal por influenza INFV A H1N1 em camundongos fêmeas BALB / c. O experimento compreendeu 7 grupos de 5 camundongos. No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com 1xLD90 H1N1 A / Texas / 36/91. Os grupos 1-6 receberam tratamento IV, 28 dias antes do desafio (Tabela 12). Veículo (PBS) foi incluído como um controle negativo adicional. O Grupo 7 recebeu fosfato de Oseltamivir por via oral, começando 8 horas após a infecção, duas vezes ao dia, durante 5 dias. Todos os camundongos foram monitorados quanto à sobrevida (FIGS. 31A- 31F) durante 15 dias após o desafio.
[00824] Os camundongos tratados com o Conjugado 6 mostraram 100% de sobrevida com doses únicas em todas as concentrações até 2,5 mg / kg e 80% de sobrevida com 1,25 mg / kg, em comparação com 0% de sobrevida no grupo de controle de veículo. Todos os camundongos do grupo de controle de fosfato de Oseltamivir sobreviveram. Quando comparado ao grupo de fosfato de Oseltamivir, o Conjugado 6 demonstrou eficácia semelhante ao Oseltamivir em uma dose cumulativa 20x menor (em mg / kg), apesar do fato de que todos os grupos do Conjugado 6 foram administrados uma vez, 28 dias antes da infecção.
Tabela 12: Desenho do estudo Desafio Composto Dose Tratamento Grupo Dia 0 (mg/kg) Rota / Dosagem n=5 1 Veículo (PBS) N/A 2 Vírus da influenza A, Conjugado 6 50 cepa H1N1 A / Texas IV, q.d. 28 dias pré-desafio 3 / 36/91 por meio da Conjugado 6 10 via IN. 4 Conjugado 6 5
Conjugado 6 2,5 5 Conjugado 6 1,25 6 Oseltamivir (TamifluTM) 20 PO, b.i.d. 8 horas depois desafio por 5 dias 7 Exemplo 34. Eficácia do Conjugado 6 em um modelo letal de influenza de camundongo: Estudo #4
[00825] O Conjugado 6 foi avaliado contra uma infecção letal por influenza INFV A H1N1 em camundongos fêmeas BALB / c. O experimento compreendeu 13 grupos de 5 camundongos. No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com 1xLD90 H1N1 A / Texas / 36/91. Todos os grupos do Conjugado 6 (8-13) receberam doses únicas de 10 mg / kg IV em momentos diferentes, pré e pós-infecção, conforme descrito na Tabela 13. Veículo (PBS) e Fc apenas foram incluídos como controles negativos. Os grupos 3-7 receberam fosfato de Oseltamivir (20 mg / kg) por via oral, começando em diferentes pontos de tempo pós-infecção duas vezes ao dia por 5 dias, conforme descrito na Tabela 13. Todos os camundongos foram monitorados quanto à sobrevida (FIGS. 32A-32F) durante 15 dias após o desafio.
[00826] Os camundongos tratados com o Conjugado 6 mostraram 100% de sobrevida com doses únicas de 10 mg / kg quando tratados até 24 horas após a infecção e 60 e 80% de sobrevida em 48 e 72 horas após a infecção, respectivamente. No grupo de fosfato de Oseltamivir, a sobrevida caiu drasticamente para 0% e 20%, respectivamente, nos grupos onde o tratamento foi iniciado 48 e 72 horas após a infecção. Estes resultados sugerem que o Conjugado 6 possui potencialmente uma janela de tratamento superior em relação ao Oseltamivir para o tratamento de infecções por influenza A.
Tabela 13: Desenho do estudo Cronologia Grupo Cepa Rota / Dose Artigo de teste da dose (N = 5) influenza A Programação (mg/kg) (horas) 1 Veículo (PBS) IV, único --- T-4 2 Fc apenas IV, único 10 T-4 3 Oseltamivir PO, bid x 5 dias 20 T+8 4 Oseltamivir PO, bid x 5 dias 20 T+24 5 Oseltamivir PO, bid x 5 dias 20 T+48 6 Oseltamivir PO, bid x 5 dias 20 T+72 A/Texas/36/91 7 (H1N1) Oseltamivir PO, bid x 5 dias 20 T+96 por meio de IN 8 Conjugado 6 IV, único 10 T-4 9 Conjugado 6 IV, único 10 T+8 10 Conjugado 6 IV, único 10 T+24 11 Conjugado 6 IV, único 10 T+48 12 Conjugado 6 IV, único 10 T+72 Conjugado 6 13 IV, único 10 T+96 Exemplo 35. Estudo de toxicidade do Conjugado 6
[00827] A segurança do Conjugado 6 foi avaliada em um estudo de toxicidade de localizador de faixa de dose em rato de 14 dias. Os ratos foram administrados com 5 mpk, 20 mpk ou 50 mpk do Conjugado 6 por administração intravenosa nos dias 0 e 7 do estudo. Em comparação com os controles de veículo, não foram observados efeitos significativos no ganho de peso corporal (FIG. 33), pesos de órgãos e consumo de alimentos em qualquer dose testada. As exposições plasmáticas (medidas pela AUC) aumentaram proporcionalmente com a dose. Esses resultados de segurança pré-clínica são consistentes com um alto índice terapêutico. Um resumo das observações é fornecido na Tabela 14.
Tabela 14. Resumo do estudo de toxicidade localizador de intervalo de dose em ratos de 14 dias Parâmetro Achados na dose mais alta (50mpk), comparado ao veículo Observações clínicas Sem achados Hematologia Sem alteração de veículo Química Clínica Sem alteração de veículo Coagulação Sem alteração de veículo Urinálise Sem alteração de veículo Histopatologia Sem observações Exemplo 36. Eficácia do Conjugado 6 contra uma dose modelo letal de influenza em camundongo por três vias diferentes: Estudo #5
[00828] O Conjugado 6 foi avaliado contra uma infecção letal por influenza IAV H1N1 em camundongos fêmeas BALB / c (Charles River Laboratories, 6-8 semanas). O vírus desafio (A / Texas / 36/91) é um isolado adaptado a camundongos capaz de causar infecções letais em camundongos.
O experimento compreendeu 15 grupos de 5 camundongos. No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com vírus a 1x o LD90 por inoculação intranasal em um volume de 50 µl, após serem levemente anestesiados com isoflurano. Os grupos 1-14 receberam um único tratamento, 4 horas antes do desafio (Tabela 15). A fim de determinar a potência do Conjugado 6 por diferentes vias de dosagem correspondentes às concentrações do Conjugado (10, 2, 0,4 e 0,1 mg / kg) foram dosados IV, IM ou SC. Além do grupo de veículo (PBS) apenas, IgG1 humano (Fc sozinho) foi incluído como um controle negativo adicional (grupo 2).
O Grupo 15 recebeu fosfato de Oseltamivir por via oral, começando 8 horas após a infecção, duas vezes ao dia, durante 5 dias. Todos os camundongos foram monitorados quanto à sobrevida (Tabela 15) durante 14 dias.
[00829] Os camundongos tratados com o Conjugado 6 mostraram 100% de sobrevida no dia 14 contra o desafio por influenza (H1N1) com doses únicas de 10, 2 ou 0,4 mg / kg, independentemente da via de dosagem. Apenas na concentração mais baixa do artigo de teste foram observadas diferenças de camundongo único entre a dosagem IV, IM e SC (Tabela 16; 60, 80 e 100% de sobrevida, respectivamente). Estes resultados sugerem fortemente que as concentrações pulmonares protetoras do Conjugado 6 podem ser obtidas por vias de doses múltiplas.
Tabela 15: Desenho do estudo Grupo Desafio Dose Tratamento Composto Rota da dose n=5 Dia 0 (mg/kg) Rota / Dosagem 1 Veículo (PBS) N/A 2 Fc sozinho 50 IV 3 Conjugado 6 10 4 Conjugado 6 2
IV 5 Conjugado 6 0,4 6 Conjugado 6 0,1 7 Conjugado 6 10 Dose única, 4 horas 8 Vírus da influenza Conjugado 6 2 antes do desafio viral A (H1N1) A / IM Texas / 36/91 9 por meio de IN Conjugado 6 0,4 10 Conjugado 6 0,1 11 Conjugado 6 10 12 Conjugado 6 2
SC 13 Conjugado 6 0,4 14 Conjugado 6 0,1 Oseltamivir b.i.d. 8 horas depois 15 20 PO (TamifluTM) desafio por 5 dias
Tabela 16: Sobrevida de camundongos % Sobrevida Artigo de teste mg/kg Rota da dose (Dia 14) Veículo (PBS) na IV 0 hIgG1 (apenas Fc) 10 IV 0 10 100 2 100 Conjugado 6 IV 0,4 100 0,1 60 10 100 2 100 Conjugado 6 0,4 IM 100 0,1 80 10 100 2 100 Conjugado 6 0,4 SC 100 0,1 100 oseltamivir 20 PO 100 Exemplo 37. Eficácia do Conjugado 6 contra um isolado resistente ao oseltamivir em um modelo letal de influenza de camundongo: Estudo # 6
[00830] O Conjugado 6 foi avaliado contra uma infecção letal por influenza IAV H1N1 em camundongos fêmeas BALB / c (Charles River Laboratories, 6-8 semanas). O vírus de desafio (A / Perth / 261/2009) é um isolado adaptado a camundongo que carrega a mutação H275Y resultando em resistência ao inibidor da neuraminidase oseltamivir.
[00831] O experimento compreendeu 10 grupos de 5 camundongos. No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com A / Perth / 261/2009 (H1N1) a 1x o LD90 por inoculação intranasal em um volume de 50 µl, em camundongos levemente anestesiados com isoflurano. Os grupos 1-9 receberam um único tratamento por IV, 4 horas antes do desafio (Tabela 17).
Além do grupo de veículo (PBS) apenas, IgG1 humano (Fc sozinho) foi incluído como um controle negativo adicional. O Grupo 10 recebeu fosfato de Oseltamivir por via oral, começando 8 horas após a infecção, duas vezes ao dia, durante 5 dias. Todos os camundongos foram monitorados quanto à sobrevida (FIGS. 34A- 34D, Tabela 18) e perda de peso (FIG. 35, Tabela 19) durante 15 dias após o desafio.
[00832] Os camundongos tratados com o Conjugado 6 mostraram 100% de sobrevida contra o desafio por influenza (A / Perth / 261/2009) com doses únicas de 50, 10 e 2 mg / kg. Além disso, apesar do pequeno tamanho do grupo (n = 5), esses resultados foram estatisticamente significativos em relação ao controle do veículo (Tabela 18).
[00833] Nas concentrações do Conjugado 6 de 0,4, 0,2 ou 0,1 mg / kg, a sobrevida foi de 60%, enquanto nenhum camundongo sobreviveu até o final do estudo se doseado com veículo (PBS) ou hIgG1 (apenas Fc). O grupo do oseltamivir teve apenas um único animal sobrevivente (20% de eficácia), apesar do tratamento com uma dose que demonstrou ser protetora contra isolados sensíveis ao oseltamivir anteriormente (20 mg / kg, bid x 5 dias). Esses resultados confirmam que o vírus de desafio é resistente ao oseltamivir e sensível ao Conjugado 6.
[00834] A potência do Conjugado 6 contra mutantes contendo a mutação H275Y foi ainda suportada por dados de peso corporal (FIG. 35, Tabela 19). Os grupos que receberam uma dose única de Conjugado 6 em concentrações de 2 mg / kg ou mais demonstraram 5% ou menos de perda de peso transitória.
Tabela 17: Desenho do estudo
Grupo Desafio Dose Tratamento Composto n=5 Dia 0 (mg/kg) Rota / Dosagem
1 Veículo (PBS) N/A
2 Fc sozinho 50
3 Conjugado 6 50
4 Conjugado 6 10
5 Conjugado 6 2 IV, q.d. 4 horas pré-desafio Vírus da influenza A (H1N1) A / Perth / 261/2009 pela via IN. 6 Conjugado 6 0,4
7 Conjugado 6 0,2
8 Conjugado 6 0,1
9 Conjugado 6 0,05
PO, b.i.d. 8 horas depois 10 Oseltamivir (TamifluTM) 20 desafio por 5 dias
Tabela 18: Sobrevida de camundongos Sobrevida % de Composto Dosagem Significado para o veículo (p) mediana sobrevida Veículo (PBS) N/A 7 0 N/A Fc sozinho 50mg/kg 6 0 ns
Conjugado 6 50mg/kg Não def 100 0,0027
Conjugado 6 10mg/kg Não def 100 0,0027 Conjugado 6 2mg/kg Não def 100 0,0027
Sobrevida % de Composto Dosagem Significado para o veículo (p) mediana sobrevida Conjugado 6 0,4mg/kg Não def 60 0,1167 Conjugado 6 0,2mg/kg Não def 60 0,0185 Conjugado 6 0,1mg/kg Não def 60 0,1047 Conjugado 6 0,05mg/kg 7 0 0,9241 Fosfato de 20mg / kg oseltamivir B.I.D 7 20 0,3470 Tabela 19: Peso Médio Diário Peso médio diário (# de camundongos mostrado entre parênteses se for menor que 5) Dias Fc Fosfato de após a Veículo sozinho Conjugado 6 oseltamivir infecção (PBS) 50mg/kg 50mg/kg 10mg/kg 2mg/kg 0,4mg/kg 0,2mg/kg 0,1mg/kg 0,05mg/kg 20mg/kg 0 100 (5) 100 (5) 100 100 100 100 100 100 100 100 1 103 (5) 104 (5) 101 101 102 102 103 105 102 105 2 102 (5) 105 (5) 103 101 103 100 102 102 101 102 3 93 (5) 97 (5) 101 101 98 92 98 95 94 95 4 88 (5) 90 (5) 95 98 99 91 98 92 90 93 5 85 (5) 85 (5) 94 98 98 91 98 92 89 92 6 83 (4) 88 (3) 100 100 99 88 95 85 84 (4) 86 7 79 (3) 90 (2) 103 99 95 90 (3) 94 83 (4) 77 (1) 86 (3) 8 75 (2) 81 (1) 102 99 97 93 (3) 94 (4) 87 (3) 78 (1) 85 (2) 9 106 104 104 101 (3) 101 (4) 95 (3) 86 (2) 10 105 102 103 100 (3) 99 (4) 97 (3) 95 (1) 11 106 102 104 102 (3) 104 (4) 102 (3) 97 (1) 12 108 104 105 102 (3) 105 (3) 107 (3) 104 (1) 13 107 103 105 102 (3) 105 (3) 107 (3) 104 (1) 14 107 103 105 102 (3) 106 (3) 108 (3) 104 (1) 15 100 100 100 100 (3) 100 (3) 100 (3) 100 (1) Exemplo 38. Estudo de PK de rato de 7 dias após administração IV do artigo de teste
[00835] Os estudos de farmacocinética (PK) em ratos foram realizados por Seventh Wave Laboratories (Maryland Heights, MO) usando ratos Sprague Dawley machos com 46-49 dias de idade. Os ratos foram injetados IV por meio da veia da cauda com 75 mg / kg de artigo de teste (volume de dose de 5 ml / kg). Os animais foram alojados em condições de alojamento padrão aprovadas pelo IACUC.Em momentos apropriados, os animais foram sangrados de forma não terminal (retro-orbital, bochecha ou pela veia da cauda) com sangue coletado em tubos K2EDTA para prevenir a coagulação. O sangue coletado foi centrifugado (2.000 xg, por 10 minutos) e o plasma retirado para análise das concentrações do artigo de teste ao longo do tempo.
[00836] As concentrações plasmáticas para o Conjugado 6 ou hIgG1 Fc em cada ponto de tempo foram medidas por ELISA em sanduíche da seguinte forma: As moléculas do Conjugado 6 foram capturadas em placas revestidas com Neuraminidase ou placas revestidas com anticorpo anti-hIgG1 e, em seguida, detectadas usando um anticorpo anti-IgG-Fc humano conjugado com HRP. hIgG1 foi capturado usando anticorpo anti-hIgG1 Fc. A concentração de proteína foi calculada no GraphPad Prism usando a regressão não linear 4PL das curvas padrão do Conjugado 6 (ou hIgG1 Fc). Uma descrição mais detalhada do método é fornecida abaixo.
[00837] Placas de 96 poços Nunc Maxisorp (Cat No. 12-565- 136, ThermoFisher) foram revestidas com neuraminidase de A / California / 04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological) ou anticorpo anti-IgG1 Fc em 1X tampão de revestimento KPL (5150-0041, SeraCare). Nos casos em que o anticorpo anti-IgG1 Fc foi usado para capturar o artigo de teste, os anticorpos anti-IgG1 Fc de captura e detecção foram selecionados que se ligam a diferentes epítopos. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora em um agitador de placa orbital (500 rpm). Diluições em série das amostras de plasma foram semeadas e incubadas à temperatura ambiente por 2 horas (diluente da amostra: 1% de BSA em PBS 0,05% de Tween 20 + concentração final de plasma de rato naïve de 1:900). As curvas padrão do Conjugado 6 ou hIgG1 Fc variando de 500 - 0,230 ng / mL, em duplicado, foram executadas em cada placa.
[00838] Após a incubação de 2 horas, as placas foram lavadas 5x em 300 µL de PBS com Tween 20 a 0,05%. O Conjugado 6 ligado à neuraminidase nas placas (ou anticorpo anti-hIgG1 Fc) foi então testado com um F(ab')2 anti-IgG Fc humano conjugado com HRP (709-036-098, Jackson) diluído 1:1.000 em diluente de amostra por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 8x em 300 µL de PBS com 0,05% de Tween 20 e desenvolvidas com substrato TMB por 7-8 minutos. A reação foi interrompida com 1N H2SO4. A absorbância foi lida a 450 nm. Um protocolo semelhante foi usado para hIgG1 Fc, onde apenas o anticorpo anti-hIgG1 Fc foi usado para a captura. As quantidades de Conjugado 6 medidas em diferentes pontos de tempo usando neuraminidase ou captura de anticorpo anti-hIgG1 Fc foram semelhantes no erro experimental, sugerindo que o conjugado intacto é estável in vivo.
[00839] Conjugado total 6 (ou hIgG1 Fc) em amostras de teste foi interpolado usando Graphpad Prism Versão 6 após análise de regressão não linear (Sigmoidal, análise 4PL) das curvas padrão do Conjugado 6 (ou hIgG1 Fc). As curvas que comparam o Conjugado 6 e hIgG1 Fc são mostradas na FIG.
36. As quantidades de Conjugado 6 medidas em diferentes pontos de tempo usando neuraminidase ou captura de anticorpo anti-hIgG1 Fc foram semelhantes no erro experimental, sugerindo que o conjugado intacto é estável in vivo.
Exemplo 39. Estudo de PK de rato de 14 dias após administração IV do artigo de teste
[00840] Os estudos de PK em ratos foram realizados por Seventh Wave Laboratories (Maryland Heights, MO) usando ratos Sprague Dawley machos com 46-49 dias de idade. Os ratos foram injetados IV por meio da veia da cauda com 5, 20 ou 50 mg / kg de artigo de teste (volume de dose de 5 ml / kg) nos dias 1 e 8. Os animais foram alojados em condições de alojamento padrão aprovadas pelo IACUC.Em momentos apropriados, os animais foram sangrados de forma não terminal (retro-orbital, bochecha ou pela veia da cauda)
com sangue coletado em tubos K2EDTA para prevenir a coagulação.O sangue coletado foi centrifugado (2.000 xg, por 10 minutos) e o plasma retirado para análise das concentrações do artigo de teste ao longo do tempo.
[00841] As concentrações plasmáticas para o Conjugado 6 ou em cada ponto de tempo foram medidas por ELISA em sanduíche da seguinte forma: As moléculas do Conjugado 6 foram capturadas em placas revestidas com Neuraminidase e, em seguida, detectadas usando um anticorpo anti-IgG-Fc humano conjugado com HRP. hIgG1 foi capturado usando anticorpo anti-hIgG1 Fc. A concentração de proteína foi calculada no GraphPad Prism usando a regressão não linear 4PL das curvas padrão do Conjugado 6. Uma descrição mais detalhada do método é fornecida abaixo.
[00842] Placas de 96 poços Nunc Maxisorp (Cat No. 12-565- 136, ThermoFisher) foram revestidas com neuraminidase de A / California / 04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological) em 1X tampão de revestimento KPL (5150-0041, SeraCare). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora em um agitador de placa orbital (500 rpm). Diluições em série das amostras de plasma foram semeadas e incubadas à temperatura ambiente por 2 horas (diluente da amostra: 1% de BSA em PBS 0,05% de Tween 20 + concentração final de plasma de rato naïve de 1:900). As curvas padrão do Conjugado 6 variando de 500 - 0,230 ng / mL, em duplicado, foram executadas em cada placa.
[00843] Após a incubação de 2 horas, as placas foram lavadas 5x em 300 µL de PBS com Tween 20 a 0,05%. O Conjugado 6 ligado à neuraminidase nas placas foi então testado com um F(ab')2 anti-IgG Fc humano conjugado com HRP (709-036-098, Jackson) diluído 1:1.000 em diluente de amostra por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 8x em 300 µL de PBS com 0,05% de Tween 20 e desenvolvidas com substrato TMB por 7-8 minutos. A reação foi interrompida com 1N H2SO4. A absorbância foi lida a 450 nm.
[00844] Conjugado total 6 (ou hIgG1 Fc) em amostras de teste foi interpolado usando Graphpad Prism Versão 6 após análise de regressão não linear (Sigmoidal, análise 4PL) das curvas padrão do Conjugado 6. As curvas comparando o Conjugado 6 mostrado na FIG. 37 demonstram proporcionalidade de dose linear.
Exemplo 40. Estudo PK de rato de 28 dias comparando a administração IV e SC do artigo de teste
[00845] Os estudos de PK em ratos foram realizados por Seventh Wave Laboratories (Maryland Heights, MO) usando ratos Sprague Dawley machos com 46-49 dias de idade. Os ratos foram injetados IV ou SC com 5 mg / kg de artigo de teste (volume de dose de 5 ml / kg). Os animais foram alojados em condições de alojamento padrão aprovadas pelo IACUC.Em momentos apropriados, os animais foram sangrados de forma não terminal (retro-orbital, bochecha ou pela veia da cauda) com sangue coletado em tubos K2EDTA para prevenir a coagulação.O sangue coletado foi centrifugado (2.000 xg, por 10 minutos) e o plasma retirado para análise das concentrações do artigo de teste ao longo do tempo.
[00846] As concentrações plasmáticas para o Conjugado 6 ou hIgG1 Fc ou em cada ponto de tempo foram medidas por ELISA em sanduíche da seguinte forma: As moléculas do Conjugado 6 foram capturadas em placas revestidas com Neuraminidase e, em seguida, detectadas usando um anticorpo anti-IgG-Fc humano conjugado com HRP. A concentração de proteína foi calculada no GraphPad Prism usando a regressão não linear 4PL das curvas padrão do Conjugado 6. Uma descrição mais detalhada do método é fornecida abaixo.
[00847] Placas de 96 poços Nunc Maxisorp (Cat No. 12-565- 136, ThermoFisher) foram revestidas com neuraminidase de A / California /
04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological) em 1X tampão de revestimento KPL (5150-0041, SeraCare). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora em um agitador de placa orbital (500 rpm). Diluições em série das amostras de plasma foram semeadas e incubadas à temperatura ambiente por 2 horas (diluente da amostra: 1% de BSA em PBS 0,05% de Tween 20 + concentração final de plasma de rato naïve de 1:900). As curvas padrão do Conjugado 6 variando de 500 - 0,230 ng / mL, em duplicado, foram executadas em cada placa.
[00848] Após a incubação de 2 horas, as placas foram lavadas 5x em 300 µL de PBS com Tween 20 a 0,05%. O Conjugado 6 ligado à neuraminidase nas placas foi então testado com um F(ab')2 anti-IgG Fc humano conjugado com HRP (709-036-098, Jackson) diluído 1:1.000 em diluente de amostra por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 8x em 300 µL de PBS com 0,05% de Tween 20 e desenvolvidas com substrato TMB por 7-8 minutos. A reação foi interrompida com 1N H2SO4. A absorbância foi lida a 450 nm.
[00849] Conjugado total 6 (ou hIgG1 Fc) em amostras de teste foi interpolado usando Graphpad Prism Versão 6 após análise de regressão não linear (Sigmoidal, análise 4PL) das curvas padrão do Conjugado 6. As curvas comparando o Conjugado 6 na FIG. 38 mostram que os níveis de plasma SC e IV convergiram em 24 h e foram semelhantes dentro do erro experimental de 336 h.
Exemplo 41. Estudo de PK de primata não humano de 28 dias após administração IV do artigo de teste
[00850] Os estudos de PK de primatas não humanos (NHP) foram realizados por BTS Research (San Diego, CA) usando macacos Cynomolgus machos e fêmeas de 4,5-8 anos de idade com pesos corporais variando de 2,5-6,5 kg. Os NHPs foram injetados IV por meio da veia safena ou cefálica com 5 ou 20 mg / kg de artigo de teste (volume de dose de 5 ml / kg).
Os animais foram alojados em condições de alojamento padrão aprovadas pelo IACUC.Em momentos apropriados, os animais foram sangrados de forma não terminal (por meio das veias femoral ou cefálica) com sangue coletado em tubos K2EDTA para evitar a coagulação.O sangue coletado foi centrifugado (2.000 xg, por 10 minutos) e o plasma retirado para análise das concentrações do artigo de teste ao longo do tempo.
[00851] As concentrações plasmáticas para o Conjugado 6 ou em cada ponto de tempo foram medidas por ELISA em sanduíche da seguinte forma: As moléculas do Conjugado 6 foram capturadas em placas revestidas com Neuraminidase e, em seguida, detectadas usando um anticorpo anti-IgG-Fc humano conjugado com HRP. A concentração de proteína foi calculada no GraphPad Prism usando a regressão não linear 4PL das curvas padrão do Conjugado 6. Uma descrição mais detalhada do método é fornecida abaixo.
[00852] Placas de 96 poços Nunc Maxisorp (Cat No. 12-565- 136, ThermoFisher) foram revestidas com neuraminidase de A / California / 04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological) em 1X tampão de revestimento KPL (5150-0041, SeraCare). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora em um agitador de placa orbital (500 rpm). Diluições em série das amostras de plasma foram semeadas e incubadas à temperatura ambiente por 2 horas (diluente da amostra: 1% de BSA em PBS 0,05% de Tween 20 + concentração final de plasma de macaco cynomolgus de 1:2.500). As curvas padrão do Conjugado 6 variando de 500 - 0,230 ng / mL, em duplicado, foram executadas em cada placa.
[00853] Após a incubação de 2 horas, as placas foram lavadas 5x em 300 µL de PBS com Tween 20 a 0,05%. O Conjugado 6 ligado à neuraminidase nas placas foi então testado com um F(ab')2 anti-IgG Fc humano conjugado com HRP (709-036-098, Jackson) diluído 1:1.000 em diluente de amostra por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 8x em 300 µL de PBS com 0,05% de Tween 20 e desenvolvidas com substrato TMB por 7-8 minutos. A reação foi interrompida com 1N H2SO4. A absorbância foi lida a 450 nm.
[00854] Conjugado total 6 em amostras de teste foi interpolado usando Graphpad Prism Versão 6 após análise de regressão não linear (Sigmoidal, análise 4PL) das curvas padrão do Conjugado 6 (ou hIgG1 Fc).
Os parâmetros PK foram calculados usando o software WinNonlin. As curvas que comparam o Conjugado 6 são mostradas na FIG. 39 e um resumo dos principais parâmetros de PK é fornecido na Tabela 20. A resposta à dose é linear entre 5 e 20 mg / kg IV, resultando em uma meia-vida de aproximadamente 9 dias em ambas as doses (comparável a camundongo / rato).
Tabela 20: PK de macaco Cynomolgus do Conjugado 6 Conjugado 6 Meia-vida (horas) AUClast (h*mg/mL) 5 mg/kg IV 230 6240 20 mg/kg IV 197 25400 Exemplo 42. Estudo de PK de distribuição pulmonar de camundongo após administração IV do artigo de teste
[00855] Os estudos de PK em camundongos foram realizados usando camundongos CD-1 machos com 6 semanas de idade. Os camundongos foram injetados IV por meio da veia da cauda com 10 mg / kg de artigo de teste (volume de dose de 5 ml / kg). Os animais foram alojados em condições de alojamento padrão aprovadas pelo IACUC.Nos pontos de tempo indicados, os animais foram sacrificados para colheita de sangue (por meio de punção cardíaca) em tubos K2EDTA e pulmões. O sangue foi centrifugado (2.000 xg, por 10 minutos) para obtenção do plasma. Os pulmões foram pesados e homogeneizados em tubos de 1,5 ml com um pilão descartável estéril (Z359947, Sigma) em 100 uL de tampão de homogeneização composto por 11,64 mL de reagente de extração de proteína de tecido (78510, Thermo Scientific), 0,24 ml de coquetel inibidor de protease (78410, Thermo Scientific) e 0,12 ml de EDTA.
Após 1-2 min de homogeneização, o volume foi ajustado para 1 mL com tampão de homogeneização e as amostras incubadas em gelo por 20 min com mistura periódica por vórtice suave. Os homogenatos foram centrifugados a 8.000 xg durante 10 min e o sobrenadante retido para análise das concentrações do artigo de teste ao longo do tempo.
[00856] As concentrações plasmáticas e pulmonares para o Conjugado 6 ou em cada ponto de tempo foram medidas por ELISA em sanduíche da seguinte forma: As moléculas do Conjugado 6 foram capturadas em placas revestidas com Neuraminidase e detectadas usando um anticorpo anti-IgG-Fc humano conjugado com HRP. A concentração de proteína foi calculada no GraphPad Prism usando a regressão não linear 4PL das curvas padrão do Conjugado 6. Uma descrição mais detalhada do método é fornecida abaixo.
[00857] Placas de 96 poços Nunc Maxisorp (Cat No. 12- 565-136, ThermoFisher) foram revestidas com neuraminidase de A / California / 04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological) em 1X tampão de revestimento KPL (5150-0041, SeraCare). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora em um agitador de placa orbital (500 rpm). Diluições em série das amostras de plasma foram semeadas e incubadas à temperatura ambiente por 2 horas (diluente da amostra: 1% de BSA em PBS 0,05% de Tween 20 + concentração final de plasma de camundongo naïve de 1:100). As curvas padrão do Conjugado 6 variando de 500 - 0,230 ng / mL, em duplicado, foram executadas em cada placa.
[00858] Após a incubação de 2 horas, as placas foram lavadas 5x em 300 µL de PBS com Tween 20 a 0,05%. O Conjugado 6 ligado à neuraminidase nas placas foi então testado com um F(ab')2 anti-IgG Fc humano conjugado com HRP (709-036-098, Jackson) diluído 1:1.000 em diluente de amostra por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 8x em 300 µL de PBS com 0,05% de Tween 20 e desenvolvidas com substrato TMB por 7-8 minutos. A reação foi interrompida com 1N H2SO4. A absorbância foi lida a 450 nm.
[00859] Conjugado total 6 em amostras de teste foi interpolado usando Graphpad Prism Versão 6 após análise de regressão não linear (Sigmoidal, análise 4PL) das curvas padrão do Conjugado 6. As curvas que comparam as concentrações de plasma e pulmão do Conjugado 6 são mostradas na FIG. 40 Inesperadamente, a C max do pulmão foi atingida em t = 1 h (19,5 μg / g de tecido pulmonar, ~ 310 nM). Houve aproximadamente 10% de exposição pulmonar do Conjugado 6, em relação ao plasma Exemplo 43. Estudo de PK em camundongo de 5 dias comparando a administração IV, SC e IM do artigo de teste
[00860] Os estudos de PK em camundongos foram realizados usando camundongos CD-1 machos com 6 semanas de idade.
Os camundongos foram injetados IV por meio da veia da cauda com 5 mg / kg de artigo de teste (volume de dose de 5 ml / kg). Os animais foram alojados em condições de alojamento padrão aprovadas pelo IACUC.Em momentos apropriados, os animais foram sangrados de forma não terminal (retro-orbital, bochecha ou pela veia da cauda) com sangue coletado em tubos K 2EDTA para prevenir a coagulação.O sangue coletado foi centrifugado (2.000 xg, por 10 minutos) e o plasma retirado para análise das concentrações do artigo de teste ao longo do tempo.
[00861] As concentrações plasmáticas para o Conjugado 6 ou em cada ponto de tempo foram medidas por ELISA em sanduíche da seguinte forma: As moléculas do Conjugado 6 foram capturadas em placas revestidas com Neuraminidase e, em seguida, detectadas usando um anticorpo anti-IgG-Fc humano conjugado com HRP. A concentração de proteína foi calculada no GraphPad Prism usando a regressão não linear 4PL das curvas padrão do Conjugado 6 (ou hIgG1 Fc). Uma descrição mais detalhada do método é fornecida abaixo.
[00862] Placas de 96 poços Nunc Maxisorp (Cat No. 12- 565-136, ThermoFisher) foram revestidas com neuraminidase de A / California / 04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological) em 1X tampão de revestimento KPL (5150-0041, SeraCare). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora em um agitador de placa orbital (500 rpm). Diluições em série das amostras de plasma foram semeadas e incubadas à temperatura ambiente por 2 horas (diluente da amostra: 1% de BSA em PBS 0,05% de Tween 20 + concentração final de plasma de camundongo naïve de 1:100). As curvas padrão do Conjugado 6 variando de 500 - 0,230 ng / mL, em duplicado, foram executadas em cada placa.
[00863] Após a incubação de 2 horas, as placas foram lavadas 5x em 300 µL de PBS com Tween 20 a 0,05%. O Conjugado 6 ligado à neuraminidase nas placas foi então testado com um F(ab')2 anti-IgG Fc humano conjugado com HRP (709-036-098, Jackson) diluído 1:1.000 em diluente de amostra por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 8x em 300 µL de PBS com 0,05% de Tween 20 e desenvolvidas com substrato TMB por 7-8 minutos. A reação foi interrompida com 1N H2SO4. A absorbância foi lida a 450 nm.
[00864] Conjugado total 6 em amostras de teste foi interpolado usando Graphpad Prism Versão 6 após análise de regressão não linear (Sigmoidal, análise 4PL) das curvas padrão do Conjugado 6. As curvas que comparam o Conjugado 6 são mostradas na FIG. 41. Os níveis de exposição para IV, IM e SC foram semelhantes com AUCs de 2082, 1944 e 2500, respectivamente.
Exemplo 44. A eficácia do camundongo e a farmacocinética de múltiplas espécies suportam a dosagem profilática infrequente em seres humanos
[00865] A escala alométrica da dosagem de eficácia em camundongos com base em estudos de PK em camundongos, ratos e primatas foi usada para prever a dosagem e os parâmetros de PK em sujeitos humanos. A escala alométrica foi baseada na área sob a curva (AUC) a uma dose eficaz de 2,5 mg / kg em um estudo de prevenção em camundongo de 28 dias (ver Exemplo 33).
[00866] Para escala alométrica apenas de macaco cynomolgus, a depuração humana (CL) foi calculada com base nos dados de PK de macaco cynomolgus (Exemplo 41) usando apenas uma equação alométrica simples: CL (humano) = CL (macaco) • [BW (humano) / BW (monkey)] w, onde BW = peso corporal e w é o expoente de escala fixado em 0,85. Os resultados da escala apenas de macacos cynomolgus são fornecidos na Tabela 21.
[00867] Para a escala alométrica camundongo-rato- cynomolgus, a depuração humana (CL) de espécies animais foi representada contra o peso corporal do animal (BW) em uma escala log -log de acordo com a seguinte equação alométrica: CL = a•BWx, onde a é coeficiente e x é o expoente da equação alométrica. O coeficiente a e o expoente x foram calculados a partir da interceptação e inclinação da linha de regressão linear, respectivamente. Os resultados da escala camundongo - rato-cyno são fornecidos na Tabela 22.
[00868] Os valores de depuração humana calculados pelos respectivos algoritmos acima foram então usados para calcular a dose humana correspondente necessária para atingir o alvo de Eficácia AUC de 3700 ug-h / mL (a partir da dose de 2,5 mg / kg de camundongo, Exemplo
33) usando a seguinte equação: Dose = CL•AUC.
Tabela 21: Escala alométrica apenas de macaco Cynomolgus (β = 0,85) Área de eficácia sob a curva (AUC) 3700 μg-h/mL Depuração Humana (CL) 0,43 mL / min Dose Humana 95,46 mg, 1,4 mg / kg Tabela 22. Escala alométrica camundongo-rato-cyno (β = 0,97) Área de eficácia sob a curva (AUC) 3700 μg-h/mL Depuração Humana (CL) 0,59 mL / min Dose Humana 130,98 mg, 1,9 mg / kg Exemplo 45. Síntese de Int-11 então, TFA Etapa a.
[00869] Uma solução de terc-butil (4-bromobutil)carbamato (11,2 g, 60 mmol) e terc-butil (4-aminobutil)carbamato (10g, 40mmol) dissolvido em DMF (150mL) foi tratada com carbonato de potássio (16,4g, 120 mmol), depois agitada a 80°C durante 6 horas. A mistura de reação foi particionada entre DCM (500 mL) e salmoura (100 mL). A camada orgânica foi separada e lavada com salmoura e depois seca com sulfato de sódio. A solução foi filtrada, concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 10% a 100% de acetonitrila e água com 0,1% de TFA como modificador. Rendimento do produto 11,0g, 77%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M+H = 360,4 Etapa b.
[00870] O produto da etapa anterior (0,4g, 1,11mmol) e Fmoc-OSu (0,45mg, 1,3mmol) foram dissolvidos em DCM (10mL), em seguida, tratados com N-metilmorfolina (0,22 ml, 2mmol) e agitados durante 1 hora à temperatura ambiente. A reação foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 10% a 100% de acetonitrila e água sem TFA 0,1% como modificador. Rendimento dos produtos 450 mg, 69%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 582,4.
Etapa c.
[00871] O produto da etapa anterior (0,4 g, 0,7 mmol) foi tratado com TFA (5 mL) à temperatura ambiente por 0,5 hora, depois concentrado até a secura e usado na etapa seguinte sem purificação adicional.
O rendimento foi quantitativo para esta etapa. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M
/ 2 + H = 382,3.
Etapa d.
[00872] Fmoc diamina (24 mg, 0,063 mmol) da etapa anterior foi adicionada a uma solução de ácido carboxílico (80 mg, 0,126 mmol, descrito na síntese Int-10, etapa f) em DMF (5 mL), então tratada com HATU (50 mg, 0,13 mmol), seguido de N-metilmorfolina (0,06 mL, 0,50 mmol). Após agitação por 1h, a solução resultante foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 10% a 100% de acetonitrila e água com TFA como um modificador.
Rendimento dos produtos 80 mg, 79%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 803,9.
Etapa e.
[00873] O produto da etapa anterior (80 mg, 0,050 mmol) foi tratado com DBU a 1% (1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno) em DMF (2 mL) e agitado à temperatura ambiente. Quando a reação foi completada por LCMS (15 min), ela foi concentrada, então tratada com TFA (2 mL) e agitada por 30 min à temperatura ambiente. A solução da reação foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 10% a 100% de acetonitrila e água, usando
0,1% de TFA como modificador. O rendimento do produto foi de 52 mg como sal de TFA. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 492,7.
Etapa f.
[00874] O produto da etapa anterior foi dissolvido em água (2 mL), depois tratado com uma solução de hidróxido de lítio (12 mg, 0,50 mmol, em 1 mL de água). A reação resultante foi monitorizada por LCMS. Após agitação durante 10 min, a reação foi extinta com 0,1 ml de ácido acético. A solução resultante foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 0% a 30% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador.
Rendimento do produto: 30 mg como sal de TFA, 66%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 452,7. M/3+H=302,1.
Exemplo 46. Síntese de Int-12
Etapa a.
[00875] A uma solução de terc-butil (4-bromobutil)carbamato (4,8g, 19 mmol) e propargil-PEG4 amina (2g, 8,6mmol) em DMF (50 mL) foi adicionado carbonato de potássio (3,6g, 26 mmol). A solução foi agitada a 80 OC durante 6 horas, em seguida, repartida entre DCM (200 ml) e salmoura (50 ml). A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura, seca com sulfato de sódio, filtrada e concentrada, depois purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 10% a 100% de acetonitrila e água com 0,1% TFA como modificador.
Rendimento do produto 3,5 g, 70%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 574,4.
Etapa b.
[00876] O produto da etapa anterior (3,5 g, 8,6 mmol) foi tratado com TFA (20 ml) à temperatura ambiente por 0,5 hora, em seguida, concentrado até a secura, dissolvido em água, congelado, liofilizado e usado na etapa seguinte sem purificação adicional. O rendimento foi quantitativo para esta etapa. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 374,3.
Etapa c.
[00877] O sal de diamina TFA da etapa anterior (37 mg, 0,1 mmol) foi adicionado a uma solução do ácido carboxílico (130 mg, 0,2 mmol, descrito na síntese Int-10, etapa f) em 10 mL de DMF, depois tratada com HATU (80 mg, 0,2 mmol) e N-metilmorfolina (0,25 mL, 2 mmol). A solução resultante foi agitada por 1h, em seguida concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 10% a 100% de acetonitrila e água sem TFA 0,1% como modificador.
Rendimento do produto 120 mg, 75%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 799,9.
Etapa d.
[00878] O produto da etapa anterior (120 mg, 0,075 mmol) foi tratado com 2 mL de ácido trifluoroacético e agitado durante 30 min à temperatura ambiente. A solução resultante foi concentrada, dissolvida em água
(2 mL), depois tratada com uma solução de hidróxido de lítio (12 mg, 0,5 mmol) dissolvido em água (1 mL). A solução resultante foi agitada 10 min, então tornada ligeiramente acídica com 0,1 ml de ácido acético, concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 0% a 30% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador. Rendimento dos produtos 48 mg como sal de TFA, 57%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 559,757. M/3+H=373,5.
Exemplo 47. Síntese do Conjugado 8
[00879] Uma solução de h-IgG1 Fc-PEG4-azida em solução tampão PBSx1 (100 mg, 1,71 μmol, 7,011 mL, MW = 58200 Da, DAR = 3,7) foram adicionadas molécula pequena derivatizada de alquino (sal Int-12 TFA, 45 mg, 0,031 mmol) e soluções de PBS com pH 7,4 recém-preparadas de CuSO4 (0,7 mL de 50,0 mM, 20 eq), tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)-amina (THPTA, 0,7mL de 50,0 mM, 20 eq) e ascorbato de sódio (1,05 mL de 50,0 mM, 30eq). A solução homogênea resultante foi agitada em mesa oscilante por 12h. As soluções brutas foram diluídas com PBS pH 7,4 para uma concentração final de 1mg / mL, e ultrafiltradas (10.000 MWCO) para um volume de 1mL, duas vezes.
As misturas brutas foram então diluídas 1:10 em PBS pH 7,4 e purificadas usando resina MabSelect Sure (GE Healthcare, Chicago, IL, EUA), seguida por cromatografia de exclusão por tamanho. O material purificado foi quantificado usando um espectrofotômero visível de UV Nanodrop™ (usando um coeficiente de extinção calculado com base na sequência de aminoácidos do Fc usado na conjugação e concentrado para aproximadamente 10 mg / mL usando um concentrador centrífugo (10.000 MWCO). As moléculas purificadas foram analisadas usando géis Bis Tris SDS PAGE 4-12% carregando 1-2 µg de cada molécula no gel e coloração usando coloração instantânea com Blue. Cada gel incluía uma escada de peso molecular com os padrões de peso molecular indicados. (FIG. 42). Os rendimentos são normalmente de 40-60%. A análise
MALDI MS mostrou uma faixa de massas (60000-90000) com uma média de massa de 62358. DAR médio = 3.
Exemplo 48. Comparação da potência in vitro e in vivo de inibidores selecionados com seus conjugados de Fc em ensaios de CPE e em um modelo letal de influenza de camundongo
[00880] Para demonstrar que a conjugação de inibidores de neuraminidase aqui descritos com Fc intensifica suas atividades em ensaios de replicação viral e em modelos de eficácia in vivo , comparamos as atividades de inibidores não conjugados selecionados com seus conjugados de Fc em ensaios de Efeito Citopático (CPE) e em um modelo letal de infecção por influenza de camundongo. Para o ensaio de microneutralização de CPE, dez diluições em série de duas vezes de cada artigo de teste (TA), começando em 160 nM ou 400 nM (9600 nM para controles de zanamivir e oseltamivir), foram preparadas em duplicata para inoculação de uma hora com INFV A (A/CA/09 H1N1) em uma multiplicidade de infecção (MOI) 0,001 e INFV B em um MOI de 0,01 para incubação de uma hora. A mistura de TA-vírus foi então adicionada a células MDCK semeadas em placas de 96 poços e incubadas durante uma hora. No dia 3 após a infecção para INFV A e 5 para INFV B (B/Brisbane), as células foram fixadas e coradas com violeta de cristal e a densidade óptica foi lida para cálculo de 50 por cento da concentração eficaz (EC50) de cada TA usando o modelo de resposta à dose XLfit . A citotoxicidade intrínseca de cada TA também foi avaliada usando dez diluições em série de duas vezes de cada TA começando em 160 nM ou 400 nM foram preparadas em duplicata para inoculação com células MDCK em placas de cultura de 96 poços. A capacidade celular foi determinada 3 e 5 dias após o tratamento usando o kit CellTiter-Glo. 50% da concentração de citotoxicidade (CC50) foi calculada usando o modelo de resposta à dose XLfit. Nenhuma citotoxicidade foi observada para qualquer um dos TAs para as concentrações mais altas testadas. Um sumário do ensaio de microneutralização baseado em CPE é mostrado na Tabela 23.
Tabela 23. Ensaio de microneutralização baseado em CPE EC50 vs INFV A (nM) EC50 vs INFV B (nM) Oseltamivir 390,0 1065,0 Zanamivir 264,8 382,6 Int-7 665,7 106,6 (Fração de segmentação correspondente ao Conjugado 6) Int-12 15,4 0,6 (Fração de direcionamento correspondente ao Conjugado 8) Conjugado 6 4,0 52,1 Conjugado 8 0,6 0,3
[00881] Os dados resumidos na Tabela 23 demonstram que as formas Fc-conjugadas dos dímeros de neuraminidase possuem atividade superior no ensaio de microneutralização de CPE em relação à sua contraparte não conjugada. Intensificações de 166 vezes e 2 vezes, contra INFV A e INFV B, respectivamente, foram observadas ao comparar o Conjugado 6 com Int-7.
Intensificações de 26 vezes e 2 vezes, contra INFV A e INFV B, respectivamente, foram observadas ao comparar o Conjugado 8 com Int-12.
[00882] O Conjugado 6 foi comparado a um dímero do inibidor de neuraminidase mais potente do estudo resumido na Tabela 23 (Int- 11, apenas dímero correspondendo a Int-12 sem o ligante trimérico permitindo a conjugação com um Fc) em um modelo de infecção letal por influenza IAV H1N1 usando camundongos BALB / c fêmeas (Charles River Laboratories, 6-8 semanas). O vírus de desafio (A / Puerto Rico / 08/1934, também conhecido como PR8) é um isolado adaptado a camundongo com um LD90 de aproximadamente 30 unidades formadoras de placa (pfu) por camundongo.
[00883] O experimento compreendeu 8 grupos de 5 camundongos. No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com PR8 a 10x o LD90 por inoculação intranasal em um volume de 50 µl, em camundongos anestesiados com uma mistura de cetamina / xilazina (150 e 10 mg / kg, respectivamente). Os grupos receberam um único tratamento de veículo, hIgG1 Fc apenas, conjugado 6 ou Int-11 por IV, 2 horas após o desafio (Tabela 24; grupos 1-6). O Grupo 7 recebeu Int-11 (15 mg / kg) duas vezes ao dia (bid) por 5 dias, também IV. O Grupo 8 recebeu oseltamivir (15 mg / kg) por via oral (PO), bid, por 5 dias. Todos os camundongos foram monitorados quanto à sobrevida (Tabela 25) e perda de peso (dados não mostrados) durante 10 dias após o desafio viral.
[00884] Como esperado, os camundongos tratados com veículo ou hIgG1 Fc sucumbiram à infecção apenas no dia 7 (Tabela 25). Os camundongos tratados com 10 doses (150 mg / camundongo no total) de oseltamivir demonstraram um atraso estatisticamente significativo na morte, mas apenas um único animal sobreviveu até o dia 10. Todos os camundongos que receberam uma dose única de conjugado 6 a 0,3 ou 3 mg / kg sobreviveram até o final do estudo e mostraram um ganho de peso líquido ao longo do experimento. É importante ressaltar que todos os camundongos que receberam o Int-11 a 0,3 ou 3 mg / kg morreram ao longo do estudo, com apenas um atraso mínimo (2 dias ou menos) na morte em relação ao veículo e apenas controles de hIgG1 Fc. Como o hIgG1 Fc não tem atividade antiviral inerente (grupo 2), isso sugere que a atividade muito melhorada do conjugado 6 é o resultado da avidez melhorada resultante da exibição multivalente em um Fc, como sugerido pelos resultados resumidos na Tabela 23, também como farmacocinética melhorada e contribuição do envolvimento imunológico mediado por Fc. A diferença na atividade entre o dímero inibidor sozinho e o conjugado 6 foi estatisticamente significativa em ambas as concentrações de dose (compare os grupos 3 e 6 e os grupos 4 e 5; Tabela 25). Em uma base de massa, uma dose cumulativa 500x maior de Int-11 foi necessária para observar eficácia equivalente ao conjugado 6.
Tabela 24: Desenho do estudo
Grupo Desafio Dose Tratamento Composto n=5 Dia 0 (mg/kg) Rota / Dosagem
1 Veículo (PBS) N/A
2 hIgG1 Fc apenas 3
3 Conjugado 6 3 IV, dose única começando 2 horas após a infecção 4 Conjugado 6 0,3 Vírus da influenza A (H1N1) A / Puerto Rico / 08/1934 pela 5 via IN.
Int-11 0,3
6 Int-11 3
IV, bid por 5 dias começando 7 Int-11 15 2 horas após a infecção
PO, bid por 5 dias 8 Oseltamivir (TamifluTM) 20 começando 2 horas após a infecção
Tabela 25: Sobrevida de camundongos Grupo Artigo de Dose Cronograma % de Significância Significância para teste (mg/kg) de Dosagem sobrevida para Veículo Int-11 0,3 mg / kg * ou 3 mg / kg ^
1 Veículo IV, único 0 (PBS) 2 hIgG1 Fc 3 IV, único 0 NS apenas 3 Conjugado 6 3 IV, único 100 0,0027 0,0035^ 4 Conjugado 6 0,3 IV, único 100 0,0027 0,0027* 5 Int-11 0,3 IV, único 0 0,0027 6 Int-11 3 IV, único 0 0,0027 7 Int-11 15 IV, bid x 5 dias 100 0,0027 8 Oseltamivir 15 PO, bid x 5 20 0,0027 dias Exemplo 49. Síntese de Int-13 (ácido (5R)-((1R)-Acetilamino-(2S)-metoxi- (2S)-metilpentil)-(4S)-E/Z-[3-(propargil-PEG4)-propenil]-pirrolidina-(2R)- carboxílico) etapa etapa etapa Etapa c etapa etapa f 2-Me-buteno Etapa a. Éster terc-butílico do ácido (2R)-((1R)-Acetilamino-(2S)-metoxi- (2S)metilpentil)-(5R)-carboxi-(3S)-Z-propenilpirrolidina-1-carboxílico.
[00885] A uma mistura de agitação de ácido (5R)-((1R)- acetilamino-(2S)-metoxi-(2S)-metilpentil)-(4S)-Z-propenilpirrolidina-(2R)-carboxílico, sal HCl (preparado de acordo com referência JACS, 2002, 124, 4716-4721; 1,0 mmol) em acetonitrila (10 mL) é adicionado hidróxido de trimetilamônio (1,5 mmol). Após agitação durante 3 h à temperatura ambiente, adiciona-se dicarbonato de di-terc-butil (4 eqmol). Após a conclusão da reação, todos os voláteis são evaporados por técnicas de vácuo. O resíduo é diluído com água (10 ml). Acetato de etil (10 ml) é adicionado, e solução aquosa de ácido sulfúrico 1 M é adicionada até que a camada de água atinja pH ~ 3. A camada de água é lavada com duas alíquotas adicionais de acetato de etil (10 mL). Os orgânicos combinados são secos sobre sulfato de sódio,
filtrados e concentrados. O resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Etapa b. Éster terc-butílico do ácido (2R)-((1R)-Acetilamino-(2S)-metoxi- (2S)metilpentil)-(5R)-carboximetil-(3S)-Z-propenilpirrolidina-1-carboxílico.
[00886] A uma mistura de agitação a 0°C de ácido (2R)-((1R)- acetilamino-(2S)-metoxi-(2S)-metilpentil)-(5R)-carboxi-(3S)-Z-propenilpirrolidina-1- carboxílico éster terc-butílico (1,0 mmol) em diclorometano (5,0 mL) e metanol (1,0 mL) é adicionado lentamente (trimetilsilil)diazometano (1,1 mmol). A mistura é agitada até à conclusão, enquanto a temperatura é suavemente deixada atingir a temperatura ambiente. Todos os voláteis são evaporados por técnicas de vácuo. Se necessário, o resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Etapa c. Éster terc-butílico do ácido (2R)-((1R)-Acetilamino-(2S)-metoxi- (2S)metilpentil)-(5R)-carboximetil-(3S)-formilpirrolidina-1-carboxílico.
[00887] Uma mistura à temperatura ambiente de ácido (2R)- ((1R)-acetilamino-(2S)-metoxi-(2S)-metilpentil)-(5R)-carboximetil-(3S)-Z- propenilpirrolidina-1-carboxílico éster (1 mmol) em diclorometano (15 mL) é resfriada a -78°C. Ozônio é borbulhado através da solução até que uma cor azul clara de ozônio dissolvido persista. O nitrogênio é borbulhado através da solução até que a cor azul desapareça, então sulfeto de dimetil (4,0 mmol) é adicionado, o frasco é transferido para um freezer (-20°C) e deixado assentar por 1 hora. A solução é concentrada e o resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Etapa d. ácido (2R)-((1R)-Acetilamino-(2S)-metoxi-(2S)-metilpentil)-(5R)- carboximetil-(3S)-E/Z-[3-(propargil-PEG4)-propenil]pirrolidina-1-carboxílico.
[00888] A uma mistura com agitação a 0°C de brometo de propargil-PEG4-fosfônio (1,0 mmol) em DMF (5,0 mL) é adicionado hidreto de sódio (1,1 mmol), e após 10 minutos a temperatura é elevada até a temperatura ambiente.
A agitação é continuada por 1 h, então ácido (2R)-((1R)-Acetilamino-(2S)-metoxi- (2S)-metilpentil)-(5R)-carboximetil-(3S)-formilpirrolidina-1-carboxílico terc-éster butílico (1,0 mmol) é adicionado em DMF (1,0 mL). Após a conclusão, a reação é extinta por solução saturada de cloreto de amônio. A solução aquosa é extraída várias vezes com acetato de etil e as fases orgânicas combinadas são lavadas com salmoura, secas e evaporadas. O resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Etapa e. ácido (2R)-((1R)-Acetilamino-(2S)-metoxi-(2S)- metilpentil)-(5R)-carboxi-(3S) E/Z-[3-(propargil-PEG4)-propenil]pirrolidina-1- carboxílico.
[00889] A uma mistura em agitação a 0°C de ácido (2R)-((1R)- Acetilamino-(2S)-metoxi-(2S)-metilpentil)-(5R)-carboximetil-(3S)-E/Z-[3-(propargil- PEG4)-propenil]pirrolidina-1-carboxílico éster terc-butílico (1,0 mmol) em tetra- hidrofurano (12,0 mL) e água (3,0 mL) é adicionado hidróxido de lítio (1,1 mmol). A agitação é continuada e a temperatura é elevada à temperatura ambiente após 15 minutos. Após a conclusão, a solução é levada a pH acídico por meio da adição em excesso da resina AMBERLITE® IRN-77. A mistura é filtrada e o filtrado é concentrado por técnicas de vácuo, dando origem ao composto do título. Se necessário, o resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Etapa f. ácido (5R)-((1R)-Acetilamino-(2S)-metoxi-(2S)-metilpentil)- (4S)-E/Z-[3-(propargil-PEG4)-propenil]-pirrolidina-(2R)-carboxílico.
[00890] A uma mistura de agitação a 0°C de ácido (2R)-((1R)- Acetilamino-(2S)-metoxi-(2S)-metilpentil)-(5R)-carboxi-(3S) E/Z-[3-(propargil-PEG4)- propenil]pirrolidina-1-carboxílico éster terc-butílico (1,0 mmol) e 2-metil-2-buteno (0,5 mL) em diclorometano (8,0 mL), adiciona-se ácido trifluoroacético (4,0 mL). Após 10 minutos, a temperatura é elevada para a ambiente. Após a conclusão , todos os voláteis são evaporados por técnicas de vácuo. O resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Exemplo 50. Síntese do Conjugado 9
[00891] Uma solução de hIgG1 Fc-PEG4-azida em solução tampão PBS x 1 pH 7,4 (100 mg, 1,71 umol, 7,011 mL, MW = 58.200 Da, DAR = 3,7) é adicionada a uma solução tampão PBS x 1 pH 7,4 (2,45 mL ) de Int-13 ((5R)-((1R)- Acetilamino-(2S)-metoxi- (2S)-metilpentil)-(4S)-E/Z-[3-(propargil-PEG4)-propenil]- pirrolidina-(2R)-carboxílico) (0,031 mmol), sulfato cúprico (0,62 mmol), tris(3- hidroxipropiltriazolilmetil)amina (0,62 mmol) e ascorbato de sódio (0,93 mmol). A solução homogênea resultante é agitada suavemente com uma mesa oscilante por 12h. A solução bruta é diluída com PBS pH 7,4 para uma concentração final de 1mg / mL, e ultrafiltradas (10.000 MWCO) para um volume de 1mL, por duas vezes. A mistura bruta é então diluída 1:10 em PBS pH 7,4 e purificada usando resina MabSelect Sure (GE Healthcare, Chicago, IL, EUA), seguida por cromatografia de exclusão por tamanho. O material purificado é quantificado usando um espectrofotômero visível de UV Nanodrop™ (usando um coeficiente de extinção calculado com base na sequência de aminoácidos do Fc usado na conjugação e concentrado para aproximadamente 10 mg / mL usando um concentrador centrífugo (10.000 MWCO). As moléculas purificadas são analisadas usando géis Bis Tris SDS PAGE 4-12% carregando 1-2 µg de cada molécula no gel e coloração usando coloração instantânea com Blue. Cada gel inclui uma escada de peso molecular com os padrões de peso molecular indicados. A análise MALDI MS é usada para determinar o DAR médio.
Exemplo 51. Síntese de propargil-PEG4-fosfônio.
Tolueno, refluxo
[00892] Uma mistura de propargil-PEG4-brometo (1,0 mmol) e trifenilfosfina (1,2 mmol) em tolueno (10 mL) são refluxados. Após a conclusão,
a mistura é resfriada para ambiente. Os sólidos são filtrados e usados na próxima etapa sem qualquer purificação adicional.
Exemplo 52. Síntese de Int-14 ácido ((5R)-[(1R)-(propargil-PEG4- carboxiamida)-(2S)-metoxi-(2S)-metilpentil]-(4S)-Z-propenilpirrolidina-(2R)- carboxílico, sal HCI) etapa etapa 0ºC até RT
2. Propargil-PEG-ácido, DIPEA, HATU DMF, 0ºC até RT então Boc2O, Et3N MeCN Etapa c etapa etapa até -50ºC então pTsOH MeOH Etapa a. N-{(2,S)-metoxi-((1R)-[1-(4-metoxibenzil)-5-oxo-(3S)-Z- propenilpirrolidin-(2R)-il]-(2S)-metilpentil}-(propargil-PEG4)- carboxiamida.
[00893] A 0°C, uma mistura em agitação de ácido{(2S)- Methoxy-(1R)-[1-(4-methoxybenzyl)-5-oxo-(3S)-Z-propenylpyrrolidin-(2R)- yl]-(2S)-methylpentyl}-carbâmico éster terc-butílico (é preparada de acordo com a referência JACS, 2002, 124, 4716-4721; 1,0 mmol) em diclorometano seco (5 mL) é adicionado ácido trifluoroacético (10 mmol) , e a temperatura é elevada para a ambiente. Após conclusão, o solvente é removido sob pressão reduzida. O resíduo resultante é dissolvido em diclorometano (20 mL) e extraído com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio. A camada orgânica é separada, seca (sulfato de sódio), filtrada e evaporada.
A amina bruta é dissolvida em DMF (5 mL) e tratada a 0°C sob agitação com ácido propargil-PEG4 (1,1 mmol), di-isopropiletilamina (3,0 mmol) e HATU (1,1 mmol). Após a conclusão da reação, todos os voláteis são evaporados por técnicas de vácuo. O resíduo é retomado em acetato de etil (15 mL) e lavado com solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (10 mL), em seguida solução aquosa de ácido sulfúrico 1 M (10 mL). Os orgâ nicos combinados são secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados. O resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Etapa b. ácido (2R)-((1R)-(propargil-PEG4-carboxiamida)- (2S)-metoxi-(2S)-metilpentil)-(5R)-oxo-(3S)-Z-propenilpirrolidina-1- carboxílico éster terc-butílico.
[00894] A uma solução agitada de N-{(2,S)-metoxi-(1R)-[1- (4-metoxibenzil)-5-oxo-(3S)-Z-propenilpirrolidin-(2R)-il]-(2S)-metilpentil}- (propargil-PEG4)-carboxiamida (1,0 mmol) em uma mistura de acetonitrila e água (10:1,5 mL) é adicionado nitrato de amônio cérico (2,0 mmol) em pequenas porções a 45°C durante 1 h, e a agitação é continuada até a conclusão. A reação foi extinta com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (5 mL). A camada aquosa é extraída com EtOAc (3 x 10 mL), as camadas orgânicas combinadas são secas (sulfato de sódio) e evaporadas para dar um produto bruto que é usado na próxima etapa sem purificação adicional. O material é dissolvido em acetonitrila (5 mL), di -terc- butilcarbonato é adicionado (1,5 mmol) seguido por trietilamina (2,0 mmol) e DMAP (catalítico). Após a conclusão, a reação é extinta com uma solução saturada de cloreto de amônio (5 mL). A camada aquosa é extraída com EtOAc (3 x 10 mL) e as camadas orgânicas combinadas são secas (sulfato de sódio). Todos os voláteis são removidos por técnicas de vácuo. Se necessário, o resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Etapa c. ácido (2R)-((1R)-(propargil-PEG4-carboxiamida)- (2S)-metoxi-(2S)-metilpentil)-(5R/S)-metoxi-(3S)-Z-propenilpirrolidina- 1-carboxílico éster terc-butílico.
[00895] A uma solução de agitação de -78°C de ácido (2R)- ((1R)-(propargil-PEG4-carboxiamida)-(2S)-metoxi-(2S)-metilpentil)-(5R)-oxo- (3S)-Z-propenilpirrolidina-1-carboxílico éster terc-butílico (1,0 mmol) em THF (8 mL) é adicionado SUPER-HYDRIDE® (1 M em THF, 2,2 mmol). Após 30 min, a mistura de reação é extinta com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (4 mL) e peróxido de hidrogênio a 30% (5 gotas). A mistura é aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 30 min e a camada aquosa é extraída com EtOAc (3 x 10 mL). As camadas orgânicas combinadas são secas (sulfato de sódio) e o solvente é evaporado para dar o hemiaminal, que é usado sem purificação adicional. A uma solução do produto acima em metanol (16 mL) é adicionado hidrato de ácido p-toluenossulfônico (0,1 mmol) à temperatura ambiente. A mistura de reação é agitada durante a noite e é extinta com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (10 mL). O metanol é removido sob pressão reduzida, água (10 mL) é adicionada ao resíduo resultante e extraída com EtOAc (3 x 10 mL). Os orgânicos são separados e secos com salmoura e sulfato de sódio, filtrados e concentrados. Se necessário, o resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Etapa d. ácido (2R)-((1R)-(propargil-PEG4-carboxiamida)-(2S)- metoxi-(2S)-metilpentil)-(5R)-ciano-(3S)-Z-propenilpirrolidina-1-carboxílico éster terc-butílico.
[00896] A uma solução de agitação de -78°C de (2R)-((1R)- (propargil-PEG4-carboxiamida)-(2S)-metoxi-(2S)-metilpentil)-(5R/S)-metoxi- (3S)-Z-propenilpirrolidina-1-carboxílico éster terc-butílico (1,0 mmol) em diclorometano (20 mL) é adicionado cianeto de trimetilsilil (2,0 mmol) seguido de eterato dietílico de trifluoreto de boro (1,2 mmol). A mistura de reação é agitada de -78°C a -50°C durante um período de 3 h. Uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (40 mL) é adicionada e a camada aquosa é extraída com EtOAc (3 x 15 mL). As camadas orgânicas combinadas são secas (sulfato de sódio), filtradas e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo resultante consistindo em uma mistura de derivados ciano epiméricos é purificado por técnicas cromatográficas para fornecer o produto desejado.
Etapa e. ácido ((5R)-[(1R)-(propargil-PEG4-carboxiamida)-(2S)- metoxi-(2S)-metilpentil]-(4S)-Z-propenilpirrolidina-(2R)-carboxílico, sal HCI.
[00897] A uma solução de ácido (2R)-((1R)-(propargil-PEG4- carboxiamida)-(2S)-metoxi- (2S)-metilpentil)-(5R)-ciano-(3S)-Z- propenilpirrolidina-1-carboxílico éster terc-butílico (1,0 mmol) em AcOH (10 mL), 12N HCl (10 mL) é adicionado à temperatura ambiente. A solução é agitada à temperatura ambiente até a conclusão, o solvente é evaporado sob pressão reduzida. Se necessário, o resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Exemplo 53. Síntese do Conjugado 10
[00898] Uma solução de hIgG1 Fc-PEG4-azida em solução tampão PBS x 1 pH 7,4 (100 mg, 1,71 umol, 7,011 mL, MW = 58.200 Da, DAR = 3,7) é adicionada a uma solução tampão PBS x 1 pH 7,4 (2,45 mL ) de Int-14 ácido ((5R)-[(1R)-(propargil-PEG4-carboxiamida)-(2S)-metoxi-(2S)-metilpentil]- (4S)-Z-propenilpirrolidina-(2R)-carboxílico, sal de HCI) (0,031 mmol), sulfato cúprico (0,62 mmol), tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina (0,62 mmol) e ascorbato de sódio (0,93 mmol). A solução homogênea resultante é agitada suavemente com uma mesa oscilante por 12h. A solução bruta é diluída com PBS pH 7,4 para uma concentração final de 1mg / mL, e ultrafiltradas (10.000 MWCO) para um volume de 1mL, por duas vezes. A mistura bruta é então diluída 1:10 em PBS pH 7,4 e purificada usando resina MabSelect Sure (GE Healthcare, Chicago, IL, EUA), seguida por cromatografia de exclusão por tamanho. O material purificado é quantificado usando um espectrofotômero visível de UV Nanodrop™ (usando um coeficiente de extinção calculado com base na sequência de aminoácidos do Fc usado na conjugação e concentrado para aproximadamente 10 mg / mL usando um concentrador centrífugo (10.000 MWCO). As moléculas purificadas são analisadas usando géis Bis Tris SDS PAGE 4-12% carregando 1-2 µg de cada molécula no gel e coloração usando coloração instantânea com Blue. Cada gel inclui uma escada de peso molecular com os padrões de peso molecular indicados. A análise MALDI MS é usada para determinar o DAR médio.
Exemplo 54. Síntese de Int-15, sal HCI
Etapa a. N-{(2,S)-metoxi-((1R)-[1-(4-metoxibenzil)-5-oxo-(3S)-Z- propenilpirrolidin-(2R)-il]-(2S)-metilpentil}-(3-butinil)-carboxiamida.
[00899] A 0°C, uma mistura em agitação de ácido{(2S)- Methoxy-(1R)-[1-(4-methoxybenzyl)-5-oxo-(3S)-Z-propenylpyrrolidin-(2R)- yl]-(2S)-methylpentyl}-carbâmico éster terc-butílico (é preparada de acordo com a referência JACS, 2002, 124, 4716-4721; 1,0 mmol) em diclorometano seco (5 mL) é adicionado ácido trifluoroacético (10 mmol) , e a temperatura é elevada para a ambiente. Após conclusão, o solvente é removido sob pressão reduzida. O resíduo resultante é dissolvido em diclorometano (20 mL) e extraído com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio.
A camada orgânica é separada, seca (sulfato de sódio), filtrada e evaporada.
A amina bruta é dissolvida em DMF (5 mL) e tratada a 0°C sob agitação com ácido 4-pentinoico (1,1 mmol), di-isopropiletilamina (3,0 mmol) e HATU (1,1 mmol). Após a conclusão da reação, todos os voláteis são evaporados por técnicas de vácuo. O resíduo é retomado em acetato de etil (15 mL) e lavado com solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (10 mL), em seguida solução aquosa de ácido sulfúrico 1 M (10 mL). Os orgânicos combinados são secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados. O resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Etapa b. ácido (2R)-((1R)-(4-pentinoil)-(2S)-metoxi-(2S)- metilpentil)-(5R)-oxo-(3S)-Z-propenilpirrolidina-1-carboxílico éster terc- butílico.
[00900] A uma solução agitada de N-{(2,S)-metoxi-((1R)- [1-(4-metoxibenzil)-5-oxo-(3S)-Z-propenilpirrolidin-(2R)-il]-(2S)-metilpentil}- (3-butinil)-carboxiamida (1,0 mmol) em uma mistura de acetonitrila e água (10:1,5 mL) é adicionado nitrato de amônio cérico (2,0 mmol) em pequenas porções a 45°C durante 1 h, e a agitação é continuada até a conclusão. A reação foi extinta com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (5 mL). A camada aquosa é extraída com EtOAc (3 x 10 mL), as camadas orgânicas combinadas são secas (sulfato de sódio) e evaporadas para dar um produto bruto que é usado na próxima etapa sem purificação adicional.
O material é dissolvido em acetonitrila (5 mL), di-terc-butilcarbonato é adicionado (1,5 mmol) seguido por trietilamina (2,0 mmol) e DMAP (catalítico). Após a conclusão, a reação é extinta com uma solução saturada de cloreto de amônio (5 mL). A camada aquosa é extraída com EtOAc (3 x 10 mL) e as camadas orgânicas combinadas são secas (sulfato de sódio).
Todos os voláteis são removidos por técnicas de vácuo. Se necessário, o resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Etapa c. ácido (2R)-((1R)-(4-pentinoil)-(2S)-metoxi-(2S)- metilpentil)-(5R/S)-metoxi-(3S)-Z-propenilpirrolidina-1-carboxílico éster terc-butílico.
[00901] A uma solução de agitação de -78°C de ácido (2R)-((1R)-(2R-((1R)-(4-pentinoil)-(2S)-metoxi-(2S)-metilpentil)-(5R)-oxo- (3S)-Z-propenilpirrolidina-1-carboxílico éster terc-butílico (1,0 mmol) em THF (8 mL) é adicionado SUPER-HYDRIDE® (1 M em THF, 2,2 mmol). Após 30 min, a mistura de reação é extinta com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (4 mL) e peróxido de hidrogênio a 30% (5 gotas). A mistura é aquecida até a temperatura ambiente e agitada por mais 30 min e a camada aquosa é extraída com EtOAc (3 x 10 mL). As camadas orgânicas combinadas são secas (sulfato de sódio) e o solvente é evaporado para dar o hemiaminal, que é usado sem purificação adicional. A uma solução do produto acima em metanol (16 mL) é adicionado hidrato de ácido p - toluenossulfônico (0,1 mmol) à temperatura ambiente. A mistura de reação é agitada durante a noite e é extinta com uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (10 mL). O metanol é removido sob pressão reduzida, água (10 mL) é adicionada ao resíduo resultante e extraída com EtOAc (3 x 10 mL). Os orgânicos são separados e secos com salmoura e sulfato de sódio, filtrados e concentrados. Se necessário, o resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Etapa d. ácido (2R)-((1R)-(4-pentinoil)-(2S)-metoxi-(2S)- metilpentil)-(5R)-ciano-(3S)-Z-propenilpirrolidina-1-carboxílico éster terc-butílico.
[00902] A uma solução de agitação de -78°C de (2R)- ((1R)-(4-pentinoil)-(2S)-metoxi-(2S)-metilpentil)-(5R/S)-metoxi-(3S)-Z- propenilpirrolidina-1-carboxílico éster terc-butílico (1,0 mmol) em diclorometano (20 mL) é adicionado cianeto de trimetilsilil (2,0 mmol) seguido de eterato dietílico de trifluoreto de boro (1,2 mmol). A mistura de reação é agitada de -78°C a -50°C durante um período de 3 h. Uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (40 mL) é adicionada e a camada aquosa é extraída com EtOAc (3 x 15 mL). As camadas orgânicas combinadas são secas (sulfato de sódio), filtradas e concentradas sob pressão reduzida. O resíduo resultante consistindo em uma mistura de derivados ciano epiméricos é purificado por técnicas cromatográficas para fornecer o produto desejado.
Etapa e.
[00903] A uma mistura agitada de N-{(2.S)-metoxi-((1R)- [1-(4-metoxibenzil)-5-oxo-(3S)-Z-propenilpirrolidin-(2R)-il]-(2S)-metilpentil}- (3-butinil)-carboxiamida (1,0 mmol), amida bis-[N'-(2-azidoetil)]- iminodiacética (0,5 mmol), 1H-1,2,3-Triazol-4-metanamina, 1-(fenilmetil)- N,N-bis[1-(fenilmetil)-1H-1,2,3-triazol-4-il]metil]-(0,1 mmol) e ascorbato de sódio (1,0 mmol) em etanol (5 mL) e água (5 mL), adiciona-se sulfato de cobre (0,1 mmol). Após a conclusão, a reação é tratada com SiliaMetS
TAAcONa (0,3 mmol) durante 30 minutos. A reação é filtrada e todos os voláteis são evaporados por técnicas de vácuo. O resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Etapa f.
[00904] A 0°C, uma solução com agitação do intermediário da etapa e. (1,0 mmol), ácido propargil-PEG4 (1,05 mmol) e DIPEA (3,0 mmol) em DMF (10 mL) é adicionada HATU (2,0 mmol). Todos os voláteis são evaporados por técnicas de vácuo e o resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para fornecer o produto desejado.
Etapa g. Int-15, sal de HCl
[00905] A uma solução do intermediário da etapa f. (1,0 mmol) em AcOH (10 mL), 12N HCl (10 mL) é adicionado à temperatura ambiente.
A solução é agitada à temperatura ambiente até a conclusão, o solvente é evaporado sob pressão reduzida. Se necessário, o resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Exemplo 55. Síntese do Conjugado 11
[00906] Uma solução de hIgG1 Fc-PEG4-azida em solução tampão PBS x 1 pH 7,4 (100 mg, 1,71 umol, 7,011 mL, MW = 58.200 Da, DAR = 3,7) é adicionada a uma solução tampão PBS x 1 pH 7,4 (2,45 mL ) de sal Int-15 HCI (0,031 mmol), sulfato cúprico (0,62 mmol), tris(3- hidroxipropiltriazolilmetil)amina (0,62 mmol) e ascorbato de sódio (0,93 mmol). A solução homogênea resultante é agitada suavemente com uma mesa oscilante por 12h. A solução bruta é diluída com PBS pH 7,4 para uma concentração final de 1mg / mL, e ultrafiltradas (10.000 MWCO) para um volume de 1mL, por duas vezes. A mistura bruta é então diluída 1:10 em PBS pH 7,4 e purificada usando resina MabSelect Sure (GE Healthcare, Chicago, IL, EUA), seguida por cromatografia de exclusão por tamanho. O material purificado é quantificado usando um espectrofotômero visível de UV Nanodrop™ (usando um coeficiente de extinção calculado com base na sequência de aminoácidos do Fc usado na conjugação e concentrado para aproximadamente 10 mg / mL usando um concentrador centrífugo (10.000 MWCO). As moléculas purificadas são analisadas usando géis Bis Tris SDS PAGE 4-12% carregando 1-2 µg de cada molécula no gel e coloração usando coloração instantânea com Blue. Cada gel inclui uma escada de peso molecular com os padrões de peso molecular indicados. A análise MALDI MS é usada para determinar o DAR médio.
Exemplo 56. Síntese de amida bis-[N'-(2-azidoetil)]-iminodiacética. etapa a etapa b 0ºC até RT Etapa a. Amida bis-[N'-(2-azidoetil)]-N-Boc-iminodiacética.
[00907] A 0°C de uma solução de agitação de ácido N-Boc- iminodiacético (1,0 mmol), cloridrato de 2-azidoetan-1-amina (2,0 mmol) e DIPEA (6,0 mmol) em DMF (10 mL) é adicionado HATU (2,0 mmol). Todos os voláteis são evaporados por técnicas de vácuo e o resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para fornecer o produto desejado.
Etapa b. Amida bis-[N'-(2-azidoetil)]-iminodiacética.
[00908] A uma mistura de agitação a 0°C de amida Bis-[N'-(2- azidoetil)]-N-Boc-iminodiacética (1,0 mmol) e 2-metil-2-buteno (0,5 mL) em diclorometano (8,0 mL), adiciona-se ácido trifluoroacético (4,0 mL). Após 10 minutos, a temperatura é elevada para a ambiente. Após a conclusão , todos os voláteis são evaporados por técnicas de vácuo. O resíduo é purificado por técnicas cromatográficas para proporcionar o produto desejado.
Exemplo 57. Síntese de Int-16
[00909] Um monômero de sulfozanamivir conjugado a um ligante PEG4-alquino que pode ser adicionalmente conjugado a um domínio Fc ou uma proteína de albumina é produzido de acordo com o seguinte esquema de síntese. O material de partida sulfozanamivir é produzido de acordo com Hadházi et al. A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity.
ChemMedChem Comm. 13:785-789 (2018).
Propargil-Peg4-amina 3) 4-nitrofenil cloroformato 4) 4-nitrofenil cloroformato 4 4-nitrofenil cloroformato -pirazol-1-carboxamidina, 3) Diastereômeros separados por cromatografia 4) NaOMe, MeOH 5) TFA Exemplo 58. Síntese de Int-17
[00910] Um dímero de sulfozanamivir conjugado a um ligante PEG4-alquino que pode ser adicionalmente conjugado a um domínio Fc ou uma proteína de albumina é produzido de acordo com o seguinte esquema de síntese.
O material de partida sulfozanamivir é produzido de acordo com Hadházi et al. A sulfozanamivir analogue has potent anti-influenza virus activity. ChemMedChem Comm. 13:785-789 (2018).
-pirazol-1-carboxamidina, 3) Diastereômeros separados por cromatografia 4) NaOMe, MeOH
1) 4-nitrofenil cloroformato 2) 4-nitrofenil cloroformato 4 4-nitrofenil cloroformato Exemplo 59. Síntese do Conjugado 12
[00911] Uma solução de Fc aglicosilado com azido funcionalizado (70 mg, 4,7 mL, 1,3709 µmol) foi adicionada a um tubo de centrífuga de 15 mL contendo uma pequena molécula derivada de alquino (29,8 mg, 0,0216 mmol, Int-7). Após agitação suave para dissolver todos os sólidos, a mistura foi adicionada com 206 µl de uma solução de mistura de ácido L- ascórbico de sódio (59,4 mg, 0,3 mmol), sulfato de cobre (II) (15,9 mg, 0,1 mmol) e THPTA (43,5 mg, 0,1 mmol) em tampão PBS 7,4 (1 ml). A mistura resultante foi agitada suavemente durante a noite. Foi purificada por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão de tamanho, conforme descrito no Exemplo 8. A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 56.177 Da (DAR = 3,6). Rendimento de 10,1 mg, rendimento de 14%. Uma SDS-PAGE de não redução do Conjugado 12 é fornecida na FIG. 54.
Exemplo 60. Síntese de Int-18 Etapa b Etapa a Etapa c Etapa d Etapa e Etapa a. Síntese de terc-butil (17-{4-[(tert-butoxycarbonyl)amino]butyl}-16- oxo-4,7,10,13-tetraoxa-17-azahenicos-1-in-21-il)carbamato
[00912] A a solução de di-terc-butil [azanediyldi(butano-4,1- di-il)]biscarbamato (1,5g, 4,17mmol do Exemplo 45, etapa a) e propargil-PEG4- ácido (1,08g, 4,17 mmol) em DCM (40 mL) foi adicionado EDC (1,0 g, 5 mmol), HOBt (650 mg, 5 mmol) e DIEA (1,4 mL, 10 mmol) à temperatura ambiente, depois agitada durante a noite à temperatura ambiente. A solução resultante foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 10% a 100%
de acetonitrila e água sem modificador. Rendimento de 1,9g, 76%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M+H = 602,4.
Etapa b. Síntese de N,N-bis(4-aminobutil)-4,7,10,13-tetraoxa- hexadec-15-in-1-amida
[00913] Terc-butyl (17-{4-[(tert-butoxycarbonyl)amino]butyl}- 16-oxo-4,7,10,13-tetraoxa-17-aza-henicos-1-in-21-il)carbamato (1,90, 3,1 mmol) foi tratado com 20 ml de TFA à temperatura ambiente durante 0,5 hora, em seguida, concentrada à secura e usada na próxima etapa sem purificação adicional. O rendimento é quantitativo para esta etapa. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 402,3.
Etapa c. Síntese de Int-18 totalmente protegido
[00914] N,N-bis(4-aminobutil)-4,7,10,13-tetraoxa-hexadec- 15-in-1-amida (0,150 g, 0,32 mmol) foi adicionado a uma solução do ácido de zanamivir ligado a éter (0,400 g, 0,63 mmol, descrito no Exemplo 31, etapa f) em DCM (10 mL), depois tratado com EDC (0,200 g, 1,0 mmol), HOBt (0,135 g, 1,00 mmol) e DIEA (0,14 mL, 1,00 mmol) em temperatura ambiente durante a noite.
A solução resultante foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 10% a 100% de acetonitrila e água sem TFA 0,1% como modificador.
Rendimento dos produtos 310 mg, 60,3%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 813,9.
Etapa d. Síntese Int-18
[00915] O produto da etapa anterior (300 mg, 0,18 mmol) foi tratado com ácido trifluoroacético (2 mL) e agitado durante 30 min à temperatura ambiente. A solução resultante foi concentrada, redissolvida em água (2 mL), depois tratada com uma solução de hidróxido de lítio (24 mg, 1 mmol) dissolvido em água (1 mL). A reação foi agitada 10 min, em seguida, extinta com 0,1 ml de ácido acético, concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 0% a 50% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador. Rendimento dos produtos 140 mg, 52%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 573,8, M / 3 + H = 382,9.
Exemplo 61. Síntese de PEG4-azido Fc para o Conjugado 13a c-Preparação de solução de éster de PEG4-azido NHS 0,05 M em DMF / PBS
[00916] O éster NHS de PEG4-azido (80,5 mg) foi dissolvido em DMF (0,50 mL) a 0°C e diluído para 4,063 mL pela adição de 3,50 mL de tampão PBS 1x a 0°C. Esta solução foi usada para preparar outro PEG4-azido Fc com uma variedade de valores da razão droga-anticorpo (DAR) ajustando os equivalentes desta solução de PEG4-azido éster NHS PBS x1.
Preparação de PEG4-azido Fc
[00917] 0,05 M de solução tampão de éster de PEG4- azidoNHS PBS x1 (0,0984 mL, 4,92 μmol, 2,5 equivalentes) foi adicionado a uma solução de h-IgG1 Fc (105 mg em 5,031 mL de PBS de pH 7,4, MW ~ 53.360 Da, 1,968 μmol) e a mistura foi agitada suavemente durante 12 horas à temperatura ambiente. A solução foi concentrada usando um concentrador centrífugo (30.000 MWCO) para um volume de ~ 1,5 mL. A mistura bruta foi diluída 1:10 em PBS pH 7,4 e concentrada novamente. Este procedimento de lavagem foi repetido por um total de três vezes. O reagente azido que não reagiu foi removido com este procedimento. A Fc-PEG4-azida concentrada foi diluída para 5,03 mL com tampão PBS 1x pH 7,4 e pronta para a conjugação de clique.
O material purificado foi quantificado usando um espectrofotômero visível Nanodrop™ UV (usando um coeficiente de extinção calculado com base na sequência de aminoácidos de h-IgG1). O rendimento foi quantitativo após troca / purificação do tampão.
Exemplo 62. Síntese do Conjugado 13a
[00918] Preparação da solução de reagente de clique: 0,0050M de CuSO4 em solução tampão PBS: 20,0 mg de CuSO4 foi dissolvido em 25,0 mL de PBS x1, do que levou 22,0 mL da solução de CuSO 4 acima e adicionou-se 189,4 mg de BTTAA e 1090 mg de ascorbato de Na para dar uma solução límpida (0,0050 M de CuSO4, 0,020 M de BTTAA e 0,25 M de ascorbato de sódio).
[00919] Uma solução de Fc funcionalizada com azido (100 mg, 4,79 mL, 1,87 µmol, CTP-161-4A-Linker-1-Azida) foi adicionada a um tubo de centrífuga de 15 mL contendo molécula pequena derivatizada de alquino, Int- 18 (11,2 mg, 0,00750 mmol, preparado no Exemplo 60). Após agitar suavemente para dissolver todos os sólidos, a solução foi tratada com 3,00 mL da solução de reagente de clique acima. A solução homogênea incolor resultante foi agitada suavemente durante a noite. Foi purificado por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (ver protocolo geral de purificação de conjugado no Exemplo 10). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 55.913 Da (DAR = 1,7). Rendimento de 54,0 mg, rendimento de 54%.
Exemplo 63. Síntese do Conjugado 13b, Conjugado 13c, Conjugado 13d, Conjugado 13e, Conjugado 13f e Conjugado 13g
[00920] O PEG4-azido Fcs para o Conjugado 13b, Conjugado 13c, Conjugado 13d, Conjugado 13e, Conjugado 13f e Conjugado 13g foram preparados analogamente ao PEG4-azido Fc do Conjugado 13a (Exemplo 61) ajustando o número de equivalentes de PEG4- azido NHS éster conforme descrito na tabela abaixo. O Conjugado 13b, o Conjugado 13c, o Conjugado 13d, o Conjugado 13e, o Conjugado 13f e o Conjugado 13g foram preparados analogamente ao Conjugado 13a no Exemplo 62, onde o número de equivalentes da fração de direcionamento (Int-18) foi ajustado com base no valor DAR desejado (Tabela 26), e o volume da solução de reagente de clique usado era o mesmo volume que o empregado no procedimento do Exemplo 62. Os valores DAR, pesos moleculares e rendimentos estão listados na tabela abaixo. Os conjugados do produto foram purificados por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão de tamanho, conforme descrito no Exemplo 8. Uma SDS-PAGE de não redução dos Conjugados 13a-13g é fornecida na FIG. 55.
Tabela 26: Rendimentos dos Conjugados 13a-13g Nome da Equivalente DAR MALDI Fração de Equivalente Tipo de Rendiment Amostra s de PEG4- (média massa direcionamen s de TM proteín o (%) azido NHS ) Da to (TM) a éster (média ) Conjugad 4 hIgG1 2,5 1,7 55913 Int-18 54% o 13a Fc Conjugad 6 hIgG1 4,5 2,7 57278 Int-18 50% o 13b Fc Conjugad 8 hIgG1 6,5 3,8 58908 Int-18 60% o 13c Fc Conjugad 10 hIgG1 8,5 4,7 60149 Int-18 54% o 13d Fc Conjugad 12 hIgG1 11 5,8 61726 Int-18 55% o 13e Fc Conjugad 16 hIgG1 18 8,2 65146 Int-18 53% o 13f Fc Conjugad 20 hIgG1 25 10,3 68153 Int-18 45% o 13g Fc Exemplo 64. estabilidade in vitro do Conjugado 6
[00921] Para demonstrar a estabilidade in vitro do Conjugado 6 usando plasma fresco tratado com K 2EDTA fresco de humano e de camundongo e microssomas de fígado. A estabilidade in vitro de plasma humano e de camundongo foi determinada comparando o envelope da Razão de Droga para Anticorpo (DAR) após uma incubação de 24 horas em plasma a 37°C por detecção por espectrometria de massa MALDI-TOF. A estabilidade microssômica do fígado usando microssomas de camundongo e humanos também foi realizada após incubação por 24 horas a 37°C com detecção por espectrometria de massa MALDI-TOF. Isto foi para identificar potenciais sítios metabolicamente lábeis na proteína Fc, ligante ou fração alvo.
64.1 Preparação de amostra de estabilidade de plasma
[00922] Primeiro, 60 µL de Conjugado 6 a 3 mg / ml foram misturados com 120 µL de plasma. Cada tipo de plasma foi dividido em 2 tubos. Uma alíquota foi imediatamente congelada de cada tipo de plasma. O alíquota restante foi colocada em banho-maria (37°C) por 24 horas. As esferas MAGNE® Protien A (Promega) foram equilibradas agitando suavemente as esferas em suspensão. Em duplicata para ambos os tipos de plasma, 50 µL de saliva de esferas foram adicionados a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e colocados no suporte magnético por 10 segundos. Após 10 segundos, o tampão de armazenamento foi removido e descartado. 500 µL de tampão de ligação / lavagem (0,1% BSA em 1X PBS pH 7,4) foram adicionados ao tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo as esferas. As esferas foram misturadas (vórtice) e colocadas em um suporte magnético por 10 segundos. Após 10 segundos, o tampão de ligação/lavagem foi removido e descartado. 50 µL de tampão (1x PBS, pH 7,4) foram adicionados ao tubo de microcentrífuga contendo as esferas. 50 µL da mistura de plasma foram adicionados às esferas e suavemente agitados em vórtice para misturar. Usando um agitador tubular, a amostra foi misturada à temperatura ambiente por 60 minutos, garantindo que as esferas permanecessem em suspensão. Após a mistura, o tubo foi colocado em um suporte magnético por 10 segundos e o sobrenadante foi removido.
Adicionou-se 500 µL de tampão (1x PBS, pH 7,4) e agitou-se suavemente em vórtice para misturar. Após a mistura, o tubo foi colocado em um suporte magnético por 10 segundos, seguido da remoção e descarte do tampão de lavagem. A etapa de lavagem foi repetida para um total de 2 lavados. Após 2 lavagens com 500 µL de tampão (1x PBS, pH 7,4), foram realizadas 3 lavagens com 500 µL, 200 µL e 100 µL, respectivamente, de água. O volume apropriado de água foi adicionado ao tubo e suavemente agitado em vórtice para misturar bem e, em seguida, colocado em um suporte magnético por
10 segundos antes da remoção e descarte da água. Após a terceira lavagem com água, 30 µL de tampão de eluição (90:10:0,4 Água: Acetonitrila:TFA) foram adicionados às esferas. Usando um agitador tubular, o tampão de eluição e a amostra foram misturados por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a mistura, o tubo foi colocado em bancada magnética por 10 segundos, o tampão de eluição, contendo a amostra, foi retirado e guardado.
2 µL da amostra foram misturados com 2 µL de matriz MALDI (20 mg / mL de ácido sinápico em 70:30:0,1 água:acetonitrila:TFA) e colocados em uma placa alvo MALDI usando uma técnica de camada dupla. A amostra foi então analisada por espectrometria de massa MALDI-TOF.
64.2 Preparação de Amostras Microssômicas de Fígado
[00923] Preparou-se um tampão 10x com Tris-HCl 500 mM a pH 7,5 e hexa-hidrato de cloreto de magnésio 50 mM. ACV-006 foi diluído para 50 µM em 1x PBS, pH 7,4. Os microssomas do fígado foram descongelados e agitados em vórtice. Uma alíquota de cada espécie de microssomas de fígado (humano e camundongo) foi morta pelo calor a 70°C por 15 minutos para uso como controle. As misturas de reação foram preparadas para ambas as espécies de acordo com a Tabela 27. Os tubos foram incubados em banho-maria (37°C) por 24 horas. As amostras foram extraídas para análise usando esferas MAGNE® Protein A (Promega) seguindo o protocolo de 59.1.
Tabela 27: concentração final de microssomas de 0,5 mg / mL com 5 µM de Conjugado 6 Mortos por Calor Vivos Total 400 μL 400 μL Água 286 μL 286 μL 10x Tampão 40 μL 40 μL Microssomas (20 mg / mL) 10 μL 10 μL Composto (50 µM) 40 μL 40 μL Solução regeneradora NADPH A 20 μL 20 μL
Solução regeneradora NADPH B 4 μL 4 μL
64.3 Amostra e Análise de Dados
[00924] As amostras foram adquiridas usando Bruker Compass Flex Control versão 3.4 para obter espectro de massa MALDI-TOF de varredura completa (Tabela 28). BSA foi usado como um calibrador interno para a faixa de massa de aquisição. Os dados foram posteriormente analisados com o software Bruker Compass Flex Analysis versão 3.4. Além disso, o padrão DAR do controle é comparado ao padrão DAR da amostra de teste.
Tabela 28: Parâmetros do Espectrômetro de Massa (MS) Espectrômetro de massa Bruker Microflex LT Detecção Faixa de massa 17-141 kDa Taxa de amostragem e configurações do digitalizador 0,5 Ganho do detector 2,05x Ajuste de compensação de linha de base 0% Compensação analógica 0,5mV Frequência do laser 60 Hz Espectrômetro Fonte de íons 1 (IS1) 20,03 kV Fonte de íons 2 (IS2) 18,12 kV (90,5% IS1) Lentes 7,17 kV (35,8% IS1) Extração de íons pulsada 1010 ns Transportador de amostra Random Walk Amostra Parcial Laser shots 100 / seção Total de disparos a laser 500 Disparos em Raster 20 Limite do diâmetro disparo Raster 2000 um Configuração Compensação de atenuador global de laser 0% Compensação de atenuador de laser 20% Faixa do atenuador de laser 30% Sensibilidade do digitalizador (Escala completa) 100 mV
Linear de compensação analógica do digitalizador 0,5 mV Linear de compensação digital do digitalizador 0 cnt Voltagem de ganho do detector - Base linear 2500 V Voltagem de ganho do detector - Reforço linear 0V Calibração Albumina de soro bovino [M+2H], [M+H], [2M+H] 64,4 Resultados
[00925] O composto de teste, Conjugado 6 (FIG. 43), foi testado quanto à estabilidade in vitro em plasma tratado com K 2EDTA fresco humano e de camundongo e em microssomas de fígado.
[00926] O Conjugado 6 foi adicionado a plasma K 2EDTA fresco humano e de camundongo a uma concentração final de 1 mg / mL. O plasma foi dividido em 2 alíquotas, sendo uma congelada imediatamente e a outra incubada em banho-maria a 37°C por 24 horas. No final da incubação, as amostras foram extraídas da matriz do plasma por esferas magnéticas de Proteína A MAGNE®. Após as incubações de plasma, as amostras foram analisadas por espectrometria de massa MALDI-TOF para alterações no DAR. O Conjugado 6 nas incubações de plasma de camundongo (FIG. 44) ou humano (FIG. 45) não gerou quaisquer alterações no DAR.
[00927] A estabilidade microssômica do fígado do Conjugado 6 foi testada em uma concentração final de 5 μM em uma solução tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 que continha microssomas de fígado ativos ou mortos por calor em uma concentração final de 0,5 mg / mL e MgCl 2 em uma concentração final de 5 mM. Todas as amostras foram incubadas a uma temperatura constante de 37°C e a solução regeneradora de fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADPH) foi utilizada para fornecer disponibilidade contínua de cofator durante a incubação. As incubações foram realizadas por 24 horas. No final da incubação, as amostras foram extraídas da matriz microssômica por esferas magnéticas de Proteína A.
Após as incubações microssômicas de fígado, as amostras foram analisadas por espectrometria de massa MALDI-TOF para alterações no DAR. O Conjugado 6 em incubações microssômicas de fígado de camundongo (FIG.
46) ou humano (FIG. 47) não gerou quaisquer alterações no DAR.
[00928] A estabilidade do plasma in vitro após incubação a 37°C por 24 horas, sugere uma falta de degradação do Conjugado 6 Fc, ligante ou fração de direcionamento em camundongo ou humano. Da mesma forma, uma falta de degradação foi observada após a incubação em microssomas de fígado de camundongo e humano, sugerindo a ausência de metabólitos. Os resultados desses estudos de estabilidade in vitro confirmam que este é um composto estável com degradantes que podem ter passivos biológicos.
Exemplo 65. Eficácia do Conjugado 13 em diferentes razões droga-anticorpo (DARs) contra influenza A (H1N1) em um modelo de camundongo letal.
[00929] O Conjugado 13 foi avaliado contra uma infecção letal por influenza IAV H1N1 em camundongos fêmeas BALB / c (Charles River Laboratories, 6-8 semanas). O vírus de desafio (A / Puerto Rico / 8/1934) é um isolado adaptado a camundongos capaz de causar infecções letais em camundongos. O experimento compreendeu 13 grupos de 5 camundongos. No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com vírus a 3x o LD95 por inoculação intranasal em um volume de 30 µl, após serem anestesiados com uma mistura de cetamina / xilazina (150 e 10 mg / kg respectivamente).
[00930] Os grupos 1-13 receberam um único tratamento IV, 2 horas após o desafio viral do artigo de teste ou veículo (PBS). O estudo avaliou 4 construtos DAR diferentes do Conjugado 13 correspondentes ao
Conjugado 13a, Conjugado 13c, Conjugado 13d e Conjugado 13g (DARs de 1,7, 3,8, 5,8 e 10,3, respectivamente). A síntese do Conjugado 13a, Conjugado 13c, Conjugado 13d e Conjugado 13g é descrita no Exemplo 61- Exemplo 63. Cada construto foi avaliada em 0,03, 0,1 e 0,3 mg / kg. O desenho geral do estudo para cada conjugado está resumido na Tabela 29.
Tabela 29: Desenho geral do estudo de varredura DAR Dose Volume de dose Grupo Conjugado DAR Rota / Dosagem (mg/kg) (ml/kg) 1 Conjugado 13a 1,7 IV, T+2 horas 0,3 5 2 Conjugado 13a 1,7 IV, T+2 horas 0,1 5 3 Conjugado 13a 1,7 IV, T+2 horas 0,03 5 4 Conjugado 13c 3,8 IV, T+2 horas 0,3 5 5 Conjugado 13c 3,8 IV, T+2 horas 0,1 5 6 Conjugado 13c 3,8 IV, T+2 horas 0,03 5 7 Conjugado 13d 5,8 IV, T+2 horas 0,3 5 8 Conjugado 13d 5,8 IV, T+2 horas 0,1 5 9 Conjugado 13d 5,8 IV, T+2 horas 0,03 5 10 Conjugado 13g 10,3 IV, T+2 horas 0,3 5 11 Conjugado 13g 10,3 IV, T+2 horas 0,1 5 12 Conjugado 13g 10,3 IV, T+2 horas 0,03 5 13 Veículo (PBS) Na IV, T+2 horas na 5
[00931] Todos os construtos foram totalmente protetores a 0,3 mg / kg, em contraste, nenhum construto foi ativo a 0,03 mg / kg (0% de sobrevida para todos os grupos), indicando que a dose baixa estava abaixo do limiar de dose eficaz. No entanto, os grupos que receberam 0,1 mg / kg de conjugados podem ser discriminados (Tabela 30). Neste nível de dose, os conjugados com DARs de 1,7, 3,8 e 5,8 foram significativamente mais protetores do que os camundongos tratados apenas com veículo (p = 0,0027). O construto de alto DAR (10.3), no entanto, não foi significativamente mais protetor do que camundongos tratados apenas com veículo (p = 0,091). O mecanismo subjacente pelo qual o construto de alto DAR perde atividade é atualmente desconhecido, mas pode ser causado por vários fatores, incluindo interferência com a reciclagem de anticorpos, resultando em meia-vida mais curta.
Tabela 30: Estudo de faixa DAR (grupos de dose de 0,1 mg / kg) Conjugado DAR % de sobrevida Significância* Conjugado 13a 1,7 60 p = 0,0027 Conjugado 13c 3,8 40 p = 0,0027 Conjugado 13d 5,8 80 p = 0,0027 Conjugado 13g 10,3 0 p = 0,091** * = Significância em relação ao veículo (PBS) apenas camundongos tratados pelo teste Log- rank (Mantel-Cox). ** = Não significativo Exemplo 66. Eficáciain vivo do Conjugado 6 e Conjugado 12
[00932] O Conjugado 6 e o Conjugado 12, análogo com mutação Fc em N297A, foram avaliados contra uma infecção letal pela influenza IAV H1N1 em camundongos fêmeas BALB / c (Charles River Laboratories, 6-8 semanas). O vírus de desafio (A / Puerto Rico / 8/34) é um isolado adaptado a camundongos. O experimento compreendeu 5 camundongos por grupo. Os camundongos foram anestesiados com cetamina / xilazina (150/10 mg / kg) e foram desafiados com vírus influenza a 3-5x do LD95 por inoculação intranasal em um volume de 30 µL. Uma única dose de tratamento foi administrada por via IV, 2 h após a infecção. PBS foi dado como controle negativo. Todos os camundongos foram monitorados quanto à % de perda de peso corporal (FIG. 48) e para a sobrevida (FIG. 49) por 15 dias após o desafio.
Exemplo 67. Ligação ao receptor Fcγ IIIA in vitro do Conjugado 6 e Conjugado 12
[00933] A ligação do Conjugado 6 e do Conjugado 12, análogo com mutação Fc em N297A, foi avaliada contra FcyRIIIA por ELISA. A placa foi revestida com 1 µg / mL de FcγRIIIA humano recombinante durante a noite. No dia seguinte, a placa foi bloqueada com solução de BSA a 1% por 1 h.
Os conjugados foram adicionados à placa em resposta à dose variando de 0,01 - 1000 nM e incubados por 2 h. A ligação foi detectada por incubação com anti- Fc humano conjugado com peroxidase por 1 h e subsequente incubação com reagente substrato TMB por 10-15 min.
[00934] A ligação foi determinada lendo a absorbância a 450 nm (FIG. 50 e FIG. 51).
Exemplo 68. Análise de amostra de plasma do Conjugado 6 in vivo
[00935] O Conjugado 6 em amostras de plasma foi quantificado por um ELISA de detecção de captura de neuraminidase.
Resumidamente, as moléculas foram capturadas em placas revestidas com neuraminidase e, em seguida, detectadas usando um anticorpo anti-IgG-Fc humano conjugado com HRP. A concentração de proteína foi calculada no GraphPad Prism usando a regressão não linear 4PL das curvas padrão do Conjugado 6. Uma descrição mais detalhada do método é fornecida abaixo.
[00936] Placas de 96 poços Nunc Maxisorp (Cat No. 12-565- 136, ThermoFisher) foram revestidas com 0,1U/poço de neuraminidase de A / California / 04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological) em 1X tampão de revestimento KPL (5150-0041, SeraCare). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora em um agitador de placa orbital (500 rpm). Diluições em série das amostras de plasma foram semeadas e incubadas à temperatura ambiente por 2 horas (diluente da amostra: 0,5% de BSA em PBS
0,025% de Tween 20 + concentração final de plasma de macaco cynomolgus de 1:2.500). As curvas padrão do Conjugado 6 variando de 0,230 a 500 ng/mL, em duplicado, foram executadas em cada placa. Após a incubação de 2 horas, as placas foram lavadas 5x em 300 µL de PBS com Tween 20 a 0,05%. O Conjugado 6 ligado à neuraminidase nas placas foi então testado com um F(Fab')2 anti-IgG Fc humano conjugado com HRP (709-036-098, Jackson) diluído 1:1.000 em diluente de amostra por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 8x em 300 µL de PBS com 0,05% de Tween 20 e desenvolvidas com substrato TMB por 7-8 minutos. A reação foi interrompida com 1N H2SO4. A absorbância foi lida a 450 nm. Conjugado 6 em amostras de plasma foi interpolado usando GraphPad Prism Versão 6 após análise de regressão não linear (Sigmoidal, análise 4PL) das curvas padrão.
[00937] As concentrações plasmáticas médias resultantes foram então usadas para calcular os parâmetros farmacocinéticos por análise não compartimental usando Phoenix WinNonlin 7.0.
Toxicocinética (TK), Grupos 2 (IV, 5 mg / kg) e 3 (IV, 20 mg / kg)
[00938] As concentrações foram comparáveis entre animais machos e fêmeas dentro do mesmo grupo de dose no dia 1 (Tabela 31) e no dia 8 (Tabela 32) após a administração. As exposições plasmáticas médias pareceram aumentar aproximadamente proporcionalmente à dose em ambos os dias. Após a administração da 2ª dose, foi observada uma ligeira acumulação de cerca de 30% nos diferentes grupos de dose. Um gráfico das concentrações plasmáticas médias dos dias 1 e 8 nos diferentes grupos de dose é mostrado na FIG. 52.
Tabela 31: Toxicocinética Dia 1 Dose Conc (µg / mL) no Tempo (h) Tmax Cmax AUC0-t (mg/kg) Rota Gênero 0,083 1 2 4 8 24 72 120 168 (h) (μg / (µg•h/mL) mL) 5 IV F 112 78,8 85,8 71,0 75,1 52,5 38,6 18,5 22,3 0,083 112 6190 IV M 101 84,6 107 75,3 72,5 38,1 29,8 35,3 15,8 2 107 5970 Média 107 81,7 96,5 73,2 73,8 45,3 34,2 26,9 19,0 1,04 110 6080
20 IV F 449 510 353 331 303 134 105 63,6 46,6 1 510 18800 IV M 448 422 485 373 329 160 96,0 76,2 53,4 2 485 20500 Média 449 466 419 352 316 147 100 69,9 50,0 1,50 497 19600 Tabela 32: Toxicocinética, Dia 8 Dose Conc (µg / mL) no Tempo (h) Tmax Cmax AUC0-t (mg/kg) Rota Gênero 0,083 1 2 4 8 24 72 120 168 (h) (μg / (µg•h/mL) mL) 5 IV F 111 111 99,3 82,3 100 52,2 46,7 35,0 33,9 1 111 7970 IV M 113 114 113 78,4 74,4 54,7 35,2 47,1 28,2 1 114 7700 Média 112 112 106 80,4 87,3 53,5 41,0 41,1 31,0 1 112 7830 20 IV F 398 359 319 315 298 190 126 99,3 85,5 0,083 398 23900 IV M 391 443 354 435 263 219 143 142 83,8 1 443 27800 Média 394 401 337 375 280 205 134 120 84,7 0,542 420 25800 Farmacocinética (PK), Grupos 4 (IV, 10 mg / kg) e 5 (SC, 10 mg / kg)
[00939] Após a administração IV, as concentrações plasmáticas dos animais machos e fêmeas eram comparáveis. Foi observada uma depuração muito baixa, resultando em uma meia-vida terminal longa após a administração IV (Tabela 33A e Tabela 33B).
Tabela 33A: Concentrações plasmáticas para animais machos e fêmeas Dose Conc (µg / mL) no Tempo (h) (mg/kg) Rota Gênero 0,083 1 2 4 8 24 72 120 168 336 504 672 5 IV F 166 174 220 153 144 58,6 40,6 21,2 20,7 14,7 n/a 2,7 5 IV M 191 135 258 161 154 71 43,7 47,6 32 22,9 n/a 5,3 Tabela 33B: Parâmetros PK para animais machos e fêmeas Tmax C0 Cmax AUClast AUCINF_obs Meia- Cl_obs Vss_obs Vz_obs (h) (µg/mL) (µg/mL) (h*µg/mL) (h*µg/mL) vida (mL/min/kg) (mL/kg) (mL/kg) (h) 1 166 220 13700 14400 170 0,00579 68,9 85,1 1 204 258 19400 20800 183 0,004 56,6 63,2
[00940] Após a administração SC, o tempo para atingir as concentrações máximas foi atingido 72 horas após a dosagem, mas as concentrações foram mensuráveis ao longo de 672 horas após a dose (Tabela 34A e Tabela 34B). A biodisponibilidade após a dosagem SC foi alta em aproximadamente 139%. Uma comparação da concentração de plasma ao longo do tempo entre a administração de 10 mg / kg IV e SC é mostrada na FIG. 53.
Tabela 34A: Concentrações plasmáticas para animais machos e fêmeas Rota Dose Gênero Conc (µg / mL) no Tempo (h) (mg/kg) 0,083 0,5 1 4 8 24 72 120 168 336 504 672 SC 10 F n/a 1,9 5,3 23,1 39,5 54 58,6 66,9 54 28,4 18,9 6,4 SC 10 M n/a 0,3 2,1 19,9 28,1 46,8 64,9 54,7 57,2 26,8 25,5 8,6 Tabela 34B: Parâmetros PK para animais machos e fêmeas Tmax Cmax AUC0-t F (h) (µg/mL) (µg×h/mL) (%) 120 66,9 22600 137% 72 64,9 23300 141% Exemplo 69. Eficácia do Conjugado 6 contra influenza A / Puerto Rico / 8/1934 (H1N1) em um modelo letal de camundongo
[00941] O Conjugado 6 foi avaliado contra uma infecção letal por influenza IAV H1N1 em camundongos fêmeas BALB / c (Charles River Laboratories, 6-8 semanas). O vírus de desafio (A / Puerto Rico / 8/1934) é um isolado adaptado a camundongos capaz de causar infecções letais em camundongos. O experimento compreendeu 7 grupos de 5 camundongos. No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com vírus a 3x o LD95 por inoculação intranasal em um volume de 30 µl, após serem anestesiados com uma mistura de cetamina / xilazina (150 e 10 mg / kg respectivamente). A mortalidade e os pesos corporais foram registrados diariamente e qualquer animal com uma perda de 20% do peso corporal foi classificado como uma morte.
[00942] Os grupos de teste receberam um único tratamento IV, 2 horas após o desafio viral do conjugado 6, controle de hIgG1 Fc ou veículo (PBS). Os animais que receberam oseltamivir foram administrados por via oral,
duas vezes ao dia, durante 5 dias, começando 2 horas após o desafio viral. O projeto do estudo está resumido na Tabela 35.
Tabela 35: Desenho do estudo para o estudo Influenza A / PR / 8/34 (h1N1) Volume de Dose # de Grupo Artigo de teste Rota / Dosagem dose (mg/kg) camundongos (ml / kg) 1 Veículo IV, T+2 horas. na 5 5 2 hIgG1 Fc IV, T+2 horas. 10 5 5 3 Oseltamivir PO, bid x5, T+2 horas. 20 5 5 4 Oseltamivir PO, bid x5, T+2 horas. 5 5 5 5 Conjugado 6 IV, T+2 horas. 10 5 5 6 Conjugado 6 IV, T+2 horas. 2 5 5 7 Conjugado 6 IV, T+2 horas. 0,4 5 5
[00943] Como esperado, os camundongos que receberam o veículo ou o hIgG1 Fc sucumbiram à infecção apenas no dia 6. Da mesma forma, os camundongos tratados com oseltamivir na dose baixa (5 mg / kg; bid por 5 dias) atingiram a mortalidade no dia 8 (Tabela 36). No entanto, os ratos que receberam 20 mg / kg de oseltamivir com o mesmo esquema de dosagem estavam totalmente protegidos (p = 0,0027). Em contraste com o observado com o oseltamivir, os camundongos tratados com o conjugado 6 foram totalmente protegidos em todos os níveis de dose (10, 2 e 0,4 mg / kg) de uma única dose IV (p = 0,0027).
Tabela 36: Estudo de sobrevida para Influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (Dia 14) Artigo de teste Dose % de sobrevida Significância* hIgG1 Fc 10 0 p=0,85** Oseltamivir 20 100 p = 0,0027 Oseltamivir 5 0 p = 0,091** Conjugado 6 10 100 p = 0,0027 Conjugado 6 2 100 p = 0,0027
Conjugado 6 0,4 100 p = 0,0027 * = Significância em relação ao veículo (PBS) apenas camundongos tratados pelo teste Log- rank (Mantel-Cox). ** = Não significativo
[00944] A potência do conjugado 6 foi ainda suportada por medições diárias do peso corporal. Como esperado, os camundongos tratados com veículo ou hIgG1 Fc demonstraram uma queda constante no peso corporal até exceder 20%, momento em que foram avaliados como morte (Tabela 37). O grupo tratado com oseltamivir 5 mg / kg também apresentou uma perda consistente de peso até atingir a mortalidade no dia 8. Os camundongos tratados com oseltamivir na dose elevada (20 mg / kg) mostraram uma perda de peso corporal estável, mas reduzida, que atingiu 14% no dia 8, antes da recuperação.
[00945] Em contraste com os camundongos controle e tratados com oseltamivir, os grupos que receberam o conjugado 6 mantiveram pesos corporais saudáveis ao longo do estudo, mesmo na concentração de dose mais baixa (0,4 mg / kg) (Tabela 37). A maior perda transitória de peso entre os camundongos tratados com conjugado 6 foi de apenas 2% no dia 14 no grupo de dose de 2 mg / kg. Por ambas as medidas de sobrevida e peso corporal, o conjugado 6 demonstrou proteção robusta contra Influenza A / Puerto Rico / 8/1934 com uma dose IV única de 0,4 mg / kg.
Tabela 37: Dados de peso corporal do camundongo (% BW em relação ao dia 0). Média de 5 camundongos; * dados não incluídos uma vez que o primeiro animal atinge a mortalidade dentro de um grupo hIgG1 Fc Oseltamivir Conjugado 6 Dia após Veículo (mg / kg) (mg / kg) (mg / kg) o desafio (PBS) 10 20 5 10 2 0,4 0 100 100 100 100 100 100 100 1 99 99 102 99 103 102 101 2 102 102 103 96 104 102 103
Exemplo 70. Síntese do Conjugado 14
[00946] O conjugado do título foi preparado analogamente ao Conjugado 13a (Exemplo 61) usando PEG-azido-Fc (SEQ ID NO: 35) e Int-7 (Exemplo 19). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 56.502. Da (DAR = 2,1). Rendimento 43,4 mg, 43,4%.
Exemplo 71. Síntese do Conjugado 15
[00947] Este conjugado foi preparado analogamente ao Exemplo 62 (Conjugado 13a) por PEG4-azido-Fc (SEQ ID NO: 35, Exemplo 61) e Int-12 (Exemplo 46). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 56.528. Da (DAR = 2,2). Rendimento 40,0 mg, 40,0%.
Exemplo 72. Síntese do Conjugado 16
[00948] Este conjugado foi preparado analogamente ao Exemplo 62 (Conjugado 13a) por PEG4-azido-Fc (SEQ ID NO: 35, Exemplo 61) e Int-10 (Exemplo 31). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 56.507. Da (DAR = 2,1). Rendimento 41,7 mg, 42%.
Exemplo 73. Síntese de Int-19 Etapa a.
[00949] A uma solução de terc-butil [2-(2- bromoetoxi)etil]carbamato (1,8g, 6,6 mmol) e propargil-PEG4 amina (0,7g, 3,0mmol) em 30ml DMF foi adicionado carbonato de potássio (1,2 g, 9 mmol). A reação foi agitada a 80 OC durante 6 horas e, em seguida, repartida entre DCM (200 mL) e salmoura (50 mL). A camada orgânica foi separada e lavada com salmoura e seca com sulfato de sódio anidro. Após a filtração, o filtrado resultante foi concentrado e purificado por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 10% a 100% de acetonitrila e água com 0,1% de TFA como modificador. Rendimento dos produtos 1,0 g, 65%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 606,4.
Etapa b.
[00950] O produto da etapa anterior (1,0 g, 1,6 mmol) foi tratado com TFA (10 mL) à temperatura ambiente por 0,5 hora, em seguida, concentrado até a secura e usado na próxima etapa sem purificação adicional.
O rendimento foi quantitativo para esta etapa. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 406,3.
Etapa c.
[00951] O produto da etapa anterior (120 mg, 0,17 mmol) foi tratado com uma solução de ácido éter zanamivir (230 mg, 0,38 mmol, Exemplo 31) em 10 mL de DMF. A esta solução foi adicionado EDC (100 mg, 0,5 mmol), HOBt (65 mg, 0,5 mmol) e DIEA (0,14 mL, 1 mmol).A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, depois purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 10% a 100% de acetonitrila e água sem TFA como modificador. Rendimento dos produtos 180 mg, 60,2%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 816,9.
Etapa d.
[00952] O produto da etapa anterior (180 mg, 0,11 mmol) foi tratado com ácido trifluoroacético (2 mL) por 30 min em temperatura ambiente.
A solução resultante foi concentrada e dissolvida em água (2 mL), depois tratada com uma solução de hidróxido de lítio (24 mg, 1 mmol) dissolvido em H2O (1 mL). A reação resultante foi agitada 10 min e depois extinta com 0,1 ml de ácido acético. A solução foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 0% a 50% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador.
Rendimento do produto 140 mg, 52%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M / 2 + H = 575,8, M / 3 + H = 384,2.
Exemplo 74. Síntese do Conjugado 17
[00953] Este conjugado foi preparado analogamente ao Exemplo 62 (Conjugado 13a) por PEG4-azido-Fc (SEQ ID NO: 35, Exemplo 61) e Int-19 (Exemplo 73). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 56.672. Da (DAR = 2,2). Rendimento 36,7 mg, 36,7%.
Exemplo 75. Síntese de Int-20 Etapa a.
[00954] A uma solução de dietil iminodiacetato (3,1 g, 16,06 mmol) em DMF anidro (36 mL) foi adicionado brometo de benzil (2,38 mL, 19,64 mmol) e carbonato de potássio (6,44 g, 46,46 mmol). A mistura resultante foi aquecida a 70 oC durante 16 horas. Após resfriamento até a temperatura ambiente, a mistura de reação foi diluída com água e extraída com éter butilmetílico terciário (3 x 100 mL). As camadas orgânicas foram lavadas com salmoura, secas sobre Na2SO4 e filtradas e concentradas. O resíduo foi purificado por cromatografia de fase normal em sílica gel (Isco, 0 a 10% de acetato de etil e hexano). Rendimento 3,13 g, 69,8%. Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 280,2.
Etapa b.
[00955] Uma solução de éster di-etílico da etapa a (3,2 g, 11,2 mmol) em THF anidro (5 mL) foi adicionada lentamente a um frasco de fundo redondo contendo LiALH4 (425 mg, 14,2 mmol) em THF (2 mL) sob gás nitrogênio a 0 oC. A seringa foi enxaguada com THF (2 x 5 mL). A mistura resultante foi lentamente aquecida à temperatura ambiente durante a noite.
Metanol (2 mL) foi adicionado lentamente para extinguir a reação seguido pela adição de NaOH aquoso (1 mL). A mistura resultante foi agitada durante 1 hora e depois filtrada sob vácuo. O filtrado foi concentrado e usado na etapa seguinte sem purificação. Rendimento 2,4 g, 109%. Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 196,2.
Etapa c.
[00956] O produto da etapa anterior (1,02 g, 5,24 mmol) em THF anidro (4 mL) foi adicionado lentamente a um frasco contendo NaH (60% de pureza, 2,09 g, 52,4 mmol) e THF (5 mL) a 0 oC sob gás nitrogênio. A mistura resultante foi agitada durante 1 hora seguida pela adição gota a gota de 3-(Boc- amino) propilbrometo (3,8 g, 15,7 mmol) em THF (20 mL). A mistura de reação foi lentamente aquecida à temperatura ambiente e agitada por 3 dias. A reação foi resfriada até 0 oC, em seguida, extinta com água (6 mL) e agitada durante 1 hora. Foi extraído com acetato de etil (2 x 100 mL). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução aquosa de HCl 1 N e salmoura. Foi seca sobre Na2SO4, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia de fase normal (Isco, 0 a 5% de metanol e diclorometano). Rendimento 984 mg, 37%. Íon encontrado por LCMS [M + H] + = 510,0.
Etapa d.
[00957] Hidróxido de paládio (543 mg, 0,77 mmol) foi adicionado a um frasco contendo o produto da etapa c (985,3 mg, 1,93 mmol) em metanol anidro (19,5 mL), sob uma atmosfera de H2 . A mistura resultante foi então agitada em temperatura ambiente por 16 horas. Foi então filtrada através de uma almofada de celite e lavada com metanol e concentrada. O resíduo foi transportado para a próxima etapa sem purificação. Rendimento 828,6 mg, 102%. Íon encontrado por LCMS [M + H] + = 420,0.
Etapa e.
[00958] O produto da etapa d (829 mg, 1,97 mmol) em H2O:THF (1:1, 16 mL) foi resfriado a 0 oC. A esta solução foi adicionado Na2CO3 (314 mg, 2,96 mmol) seguido pela adição de éster Fmoc N-hidroxissuccinimida (826 mg, 2,37 mmol). A mistura resultante foi aquecida à temperatura ambiente e agitada até completa por LCMS, em seguida extraída com acetato de etil. A camada orgânica foi lavada com salmoura e seca sobre Na 2SO4, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia de fase normal (Isco, 0 a 60% de acetato de etil e hexano). Rendimento 784 mg, 62%. Íon encontrado por LCMS [M+H-Boc]+ = 542,0.
Etapa f.
[00959] O produto da etapa e (1,01 g, 1,57 mmol) foi agitado em TFA (5 mL) e CH 2Cl2 (9 mL) à temperatura ambiente durante 1 hora, em seguida, concentrado sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por RPLP (Isco, 5 a 100% de metanol e água sem modificador).
Rendimento 903 mg, 86%. Íon encontrado por LCMS [M + H] + = 442,2.
Etapa g.
[00960] A uma mistura de ácido éter zanamivir (340 mg, 0,49 mmol), produto da etapa f (111 mg, 0,25 mmol, Exemplo 31) e HATU (206 mg, 0,53 mmol) em DMF anidro (3 mL) foi adicionado DIEA (162 mg, 1,23 mmol). A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora, depois purificada diretamente por RPLC (Isco, 30 a 100% de metanol e água sem modificador). Rendimento 249 mg, 61%. Íon encontrado por LCMS [(M + 2H) / 2] + = 833,8.
Etapa (h)
[00961] A uma solução do produto da etapa g (249 mg, 0,15 mmol) em DMF anidro (0,5 mL) foi adicionado SilaMetS Thiol (1,2 g, 1,47 mmol) e 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (12 mg, 0,07 mmol). A mistura resultante foi agitada durante 1,5 horas, em seguida, filtrada diretamente em um via ofl contendo HATU (69 mg, 0,18 mmol), ácido propargil PEG-4 (43 mg, 0,16 mmol) e DIEA (43 mg, 0,33 mmol). A mistura de reação foi agitada durante 1 hora, em seguida purificada diretamente por RPLC (Isco, 30 a 100% de metanol e água sem modificador). Rendimento 298 mg, 118%. Íon encontrado por LCMS [(M + 2H-Boc) / 2] + = 843,9.
Etapa i Sal TFA
[00962] O produto da etapa h (298 mg, 0,18 mmol) foi dissolvido em TFA (3 mL) e CH 2Cl2 (3 mL), e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. Foi então concentrado sob pressão reduzida e purificado por HPLC (ACCQ Isco, 0 a 25% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como um modificador). Rendimento 112 mg, 44%. Íons encontrados por LCMS [(M + 2H) / 2] + = 643,8 e [(M + 3H) / 3] + = 429,6.
Etapa j.
Sal TFA
[00963] A uma solução do produto da etapa i (112 mg, 0,072 mmol) em MeOH (4 mL) e água (2 mL) foi adicionado LiOH (10,6 mg, 0,43 mmol). A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora, depois acidificada com TFA e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por HPLC (ACCQ Isco, 0 a 25% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 37 mg, 36%. Íons encontrados por LCMS [(M + 2H) / 2] + = 603,8, [(M + 3H) / 3] + = 402,9.
Exemplo 76. Síntese do Conjugado 18
[00964] Uma solução de Fc aglicosilado com azido funcionalizado (100 mg, 5,4 mL, 1,87 µmol, SEQ ID NO: 35) foi adicionada a um tubo de centrífuga de 15 mL contendo molécula pequena derivatizada com alquino (16,1 mg, 0,011 mmol, Int-20). Após agitação suave para dissolver todos os sólidos, a mistura foi adicionada a 3 mL de solução pré - misturada de ácido L-ascórbico de sódio (149 mg, 0,75 mmol, 0,25 M), sulfato de cobre (II) (2,4 mg, 0,015 mmol, 0,005 M) e BTTAA (25,8 mg, 0,6 mmol, 0,02 M) em tampão PBS 7,4. A solução resultante foi agitada suavemente durante a noite. Foi purificado por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (ver protocolo geral de purificação de conjugado no Exemplo 10). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 56826 Da (DAR 2.2). Rendimento 36,64 mg, 37%.
Exemplo 77. Síntese de Int-21 Etapa a.
[00965] A uma solução de 2-(2-Boc-aminoetoxi)etanol (6,15 g, 30 mmol) em DCM anidro (60 ml) foi adicionado DIPEA (7,8 g, 60 mmol) e DMAP (366,6 mg, 3 mmol). Cloreto de P-toluenossulfonil (6,86 g, 36 mmol) foi então adicionado em porções ao longo de 30 minutos. Após a mistura resultante ter sido agitada durante 3 dias, foi concentrada por evaporação rotativa e purificada por RPLC (20% a 70% de acetonitrila / água sem modificador).
Rendimento 3,71 g, 34,4%. Íon encontrado por LCMS: [M -Boc + H]+ = 260.
Etapa b.
[00966] A uma solução do produto da etapa a (2,1 g, 5,83 mmol) em THF anidro (10 ml) foi adicionado carbonato de sódio (1,24 g, 11,7 mmol) e mono-N-Boc-1,4-diaminobutano (1,32 g, 7 mmol). A mistura resultante foi aquecida a 60 ℃ durante 1 dia. O sal foi então removido por filtração e o filtrado foi concentrado por evaporação rotativa. O resíduo foi purificado através de RPLC (100 g, 5 a 50% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 1,94 g, 88,6%. Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 376,0.
Etapa c.
[00967] A uma solução de ácido propargil PEG-4 (781 mg, 3 mmol) e HATU (1,14 g, 3 mmol) em DMF anidro (3 ml) foi adicionado DIPEA (390 mg, 3 mmol), seguido pela adição da solução do produto da etapa b (940 mg, 2,5 mmol) e DIPEA (390 mg, 3 mmol) em DMF anidro (3 mL). A mistura de reação foi agitada por 30 minutos, então diretamente purificada através de RPLC (100 g, 5 a 80% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador).
Rendimento de 960,2 mg, 65,3%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 618,3, [M - Boc + H]+ = 518,3.
Etapa d.
[00968] O produto da etapa c (960,2 mg, 1,63 mmol) foi dissolvido em THF anidro (6 mL). Adicionou-se solução de HCl 4 N em dioxano (4 ml) e agitou-se a mistura de reação durante a noite. Em seguida, foi concentrada por evaporação rotativa. O resíduo foi extraído com água (3 ml x 3) e acetato de etil (10 ml). As camadas aquosas combinadas foram liofilizadas.
Rendimento de 760 mg, 95,1%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 418,0.
Etapa e.
[00969] A uma mistura de ácido éter zanamivir (315 mg, 0,5 mmol) e HATU (190 mg, 0,5 mmol) em DMF anidro (1 mL) foi adicionada em porções uma solução do produto da etapa d diamina (148 mg, 0,3 mmol) e DIPEA (165 mg, 1,5 mmol) em DMF anidro (1 ml) ao longo de 20 minutos. Após a adição, a reação foi agitada por mais 30 minutos e diretamente purificada por RPLC (50 g, 30 a 90% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador).
Rendimento 233 mg, 56,7%. Íon encontrado por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 821,3.
Etapa f.
[00970] O produto da etapa e (233 mg, 0,142 mmol) foi dissolvido em TFA (1,5 mL) e a solução foi aquecida a 30 ℃ por 30 minutos. Foi então concentrado e diretamente purificado por RPLC (0% a 30% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento de 120 mg, 57,4%.
Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 621,4, [(M + 3H) / 3]+ = 414,7.
Etapa g.
[00971] A uma solução do produto da etapa f (120 mg, 0,0816 mmol) em MeOH (2 mL) foi adicionada solução de mono-hidrato de LiOH (63 mg, 1,5 mmol) em água (2 mL). A mistura resultante foi agitada durante 1,5 horas e depois concentrada por evaporação rotativa. O resíduo foi acidificado por solução de HCl 4N em dioxano (0,5 ml) e foi purificado por HPLC (0 a 15% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 98,2 mg, 86,6%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2] + = 581,8, [(M + 3H) / 3]+
= 388,2.
Exemplo 78. Síntese do Conjugado 19
[00972] Este conjugado foi preparado analogamente ao Exemplo 62 (Conjugado 13a) por PEG4-azido-Fc (SEQ ID NO: 35, Exemplo 61) e Int-21 (Exemplo 78). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 56.548. Da (DAR = 2,1). Rendimento 39,7 mg, 39,7%.
Exemplo 79. Síntese de Int-22 Etapa a.
[00973] A uma mistura de ácido éter zanamivir (1,8 g, 2,8 mmol Exemplo 31) e propargil-PEG4-amina (0,82 g, 3,5 mmol. 1,2 eq.) em diclorometano (50 mL), foi adicionado EDC (1,0 g, 5 mmol), HOBt (0,65 g, 5 mmol) e DIEA (1,4 mL, 10 mmol). A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 10% a 100% de acetonitrila e água sem TFA 0,1% como modificador. Rendimento dos produtos 1,35g, 50,2%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M+H = 830,4.
Etapa b.
[00974] O produto da etapa anterior (1,35 g, 1,6 mmol) foi tratado com ácido trifluoroacético (20 mL) por 30 min à temperatura ambiente. A solução resultante foi concentrada, dissolvida em água (10 mL) e MeOH (10 mL), depois tratada com uma solução de hidróxido de lítio (120 mg, 5 mmol) em água (10 mL). A reação foi agitada 10 min e depois extinta com 0,5 ml de ácido acético.
A reação foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 0% a 50% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador. Rendimento dos produtos 510 mg, 52,8%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M + H = 604,3.
Exemplo 80. Síntese do Conjugado 20
[00975] Este conjugado foi preparado analogamente ao Exemplo 62 (Conjugado 13a) por PEG4-azido-Fc (SEQ ID NO: 35, Exemplo 61) e Int-22 (Exemplo 79). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 55.508. Da (DAR = 2,3). Rendimento 37,0 mg, 37,0%.
Exemplo 81. Síntese de Int-23 Etapa a.
[00976] A uma solução de N-Boc-1,4-diaminobutano (941,5 mg, 5 mmol) em THF anidro (10 ml) foi adicionado carbonato de sódio (1,06 g, 10 mmol) e 3-(Boc-amino)propilbrometo (1,43 g, 6 mmol). A mistura resultante foi aquecida a 50 ℃ durante 1 dia. O sal foi então filtrado e concentrado por evaporação rotativa. O resíduo foi purificado por RPLC (100 g, 5 a 50% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento de 1,35 g, 58,8%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 346,0.
Etapa b.
[00977] A uma solução de ácido propargil PEG-4 (781 mg, 3 mmol) e HATU (1,14 g, 3 mmol) em DMF anidro (3 ml) foi adicionado DIPEA (390 mg, 3 mmol), seguido pela adição da solução do produto da etapa a (863,8 mg, 2,5 mmol) e DIPEA (390 mg, 3 mmol) em DMF anidra (3 mL). A mistura de reação foi agitada por 30 minutos, então diretamente purificada por RPLC (100 g, 5 a 80% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador).
Rendimento 1,19 g, 81%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 588,3.
Etapa c.
[00978] O produto da etapa b (1,19 g, 2,02 mmol) foi dissolvido em THF anidro (6 mL). Adicionou-se solução de HCl 4 N em dioxano (4,5 ml) e agitou-se a mistura de reação por 1 dia. Em seguida, foi concentrada por evaporação rotativa. O resíduo foi extraído com água (3 ml x 3) e acetato de etil (15 ml). As camadas aquosas combinadas foram liofilizadas. Rendimento de 940 mg, rendimento quantitativo. Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 388,3.
Etapa d.
[00979] A uma mistura de ácido éter zanamivir (315 mg, 0,5 mmol, Exemplo 31) e HATU (209,1 mg, 0,55 mmol) em DMF anidro (1 mL) foi adicionado DIPEA (65 mg, 0,5 mmol). Após 5 minutos, uma solução do produto da etapa c (170 mg, 0,439 mmol) e DIPEA (130 mg, 1 mmol) em DMF anidro (1 mL) foi adicionada em porções ao longo de 20 minutos. A reação foi agitada por mais 30 minutos, então diretamente purificada por RPLC (50 g, 30 a 90% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 208 mg, 51,6%. Íon encontrado por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 806,7.
Etapa e.
[00980] O produto da etapa d (208 mg, 0,129 mmol) foi dissolvido em TFA (1,5 mL) e a solução foi aquecida a 30 ℃ por 30 minutos. Foi então purificada diretamente por RPLC (100 g, 0 a 30% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento de 134 mg, 72%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 606,8, [(M + 3H) / 3]+ = 405,0.
Etapa f.
[00981] A uma solução do produto da etapa e (134 mg, 0,093 mmol) em MeOH (2 mL) foi adicionada uma solução de mono-hidrato de LiOH
(63 mg, 1,5 mmol) em água (2 mL). A mistura resultante foi agitada durante 1,5 horas e depois concentrada por evaporação rotativa. O resíduo foi acidificado por solução de HCl 4N em dioxano (0,5 ml) e foi purificado por HPLC (0 a 15% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 78,4 mg, 62%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2] + = 566,4, [(M + 3H) / 3]+ = 378,4.
Exemplo 82. Síntese do Conjugado 21
[00982] Este conjugado foi preparado analogamente ao Exemplo 62 (Conjugado 13a) por PEG4-azido-Fc (SEQ ID NO: 35, Exemplo 61) e Int-23 (Exemplo 81). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 56.503. Da (DAR = 2,2). Rendimento 34,4 mg, 34%.
Exemplo 83. Atividade dos Conjugados 13 a 21 contra Influenza A H7N9 de alta via e dois isolados de Influenza B em um ensaio de efeitos citopáticos (CPE)
[00983] Um total de 9 conjugados (Tabela 38) foram executados em concentrações de 100, 10, 1 e 0,1 nM e comparados com a ribavirina em um ensaio de CPE. O ensaio de CPE seguiu a metodologia padrão, mas resumidamente, utilizou monocamadas confluentes de 80-100% de células MDCK em uma placa de 96 poços. A estes, os artigos de teste foram adicionados em triplicado e incubados a 37ºC (+5% de CO2) até que os efeitos do CPE fossem visualmente aparentes. Uma vez que o CPE foi observado, as camadas de células foram coradas com vermelho neutro a 0,011% por aproximadamente 2 horas. Em seguida, uma mistura 50:50 de tampão citrato Sorensen / etanol foi adicionada e incubada por 30 min, em seguida o A 540 foi lido em um espectrofotômetro e os valores EC50/CC50 calculados por análise de regressão.
[00984] Todos os conjugados tiveram atividade significativa contra o isolado Influenza B / Florida / 4/2006, com valores de EC50 variando de 3,05 a 33,5 nm (Tabela 39). Em média, os conjugados demonstraram uma vantagem de potência de 275 vezes sobre a ribavirina (EC 50 de 3.250 nM). A atividade dos conjugados contra Influenza B / Brisbane / 60/2008 foi muito semelhante à observada contra B / Florida com exceção do conjugado 14, que teve um EC50 superior a 100 nM
[00985] É importante ressaltar que todos os conjugados foram altamente ativos contra o isolado Influenza A / Anhui / 1/2013 (H7N9) de alta via. A EC50 média para todos os conjugados foi de 21,2 nM contra este isolado (variando de 12 a 28,5 nM), em comparação com 14.000 nM para a ribavirina. Por último, nenhum efeito citotóxico direto dos conjugados em monocamadas de MDCK foi detectado nas concentrações testadas.
Tabela 38: Conjugados e propriedades Conjugado Int Domínio Fc DAR Ligante Observações 13 18 SEQ ID NO: 35 2,2 15 átomos éter, dímero 14 7 SEQ ID NO: 35 2,1 15 átomos carbamato, dímero 15 12 SEQ ID NO: 35 2,2 15 átomos éter, dímero 16 9 SEQ ID NO: 35 2,1 17 átomos éter, dímero 17 19 SEQ ID NO: 35 2,2 17 átomos éter, dímero 18 20 SEQ ID NO: 35 2,2 19 átomos éter, dímero 19 21 SEQ ID NO: 35 2,1 16 átomos éter, dímero 20 22 SEQ ID NO: 35 2,3 na éter, monômero 21 23 SEQ ID NO: 35 2,2 14 átomos éter, dímero Tabela 39: Atividade de conjugados em um ensaio de CPE contra subtipos de influenza EC50 (nM)* Conjugado A/Anhui/1/2013 (H7N9) B/Brisbane/60/2008 B/Florida/4/2006 (zoonotic aby way ofn) (Linhagem Victoria) (Linhagem Yamagata) Ribavirina 14000 3300 3250 13 24 21 33,5
14 12 >100 18,5 15 21,5 5,95 4,6 16 28,5 14,5 11 17 28** 11 13 18 31 4,35 3,05 19 14,5 6,8 4,55 20 20,5 12,5 14,5 21 17,5 4,05 3,05 *Média de 2 valores (VIS + NR) **EC50 de 28 por VIS,> 100 por NR Exemplo 84. Síntese do Conjugado 22 Etapa a. Síntese de PEG4-azido IVIG
[00986] Preparação de solução de éster PEG4-azidoNHS 0,05 M em DMF / PBS: 6,05 mg de éster NHS PEG4-azido foi dissolvido em 0,050 mL de DMF a 0°C e diluído para 0,305 mL pela adição de 0,250 mL de tampão PBS 1x a 0°C . Esta solução foi usada para preparar outro PEG4-azido IVIG com uma variedade de valores DAR ajustando os equivalentes desta solução de PBS éster NHS de PEG4-azido.
[00987] Preparação de PEG4-azido IVIG: 0,05 M de solução tampão PEG4-azidoNHS éster PBS (0,301 mL, 15,0 μmol, 5,5 equivalentes) foi adicionado a uma solução de IVIG (Intravenous Immune Globulin, Baxter)) (407 mg em 9,25 mL de pH 7,4 PBS, MW ~ 148863 Da, 1,968 μmol) e a mistura foi agitada suavemente durante 12 horas à temperatura ambiente. A solução foi concentrada usando um concentrador centrífugo (100.000 MWCO) para um volume de ~ 1,5 mL. A mistura bruta foi diluída 1:10 em PBS pH 7,4 e concentrada novamente. Este procedimento de lavagem foi repetido por um total de três vezes. O reagente de molécula pequena foi removido com este procedimento de lavagem. a IVIG-PEG4-azida concentrado foi diluída para 9,25 mL com tampão PBS 1x de pH 7,4 e pronta para a conjugação de Clique. O material purificado foi quantificado usando um espectrofotômero visível NANODROP™ UV (usando um coeficiente de extinção calculado com base na sequência de aminoácidos de IVIG). O rendimento é quantitativo após a purificação.
Etapa b. Síntese de conjugados
[00989] Preparou de a solução de reagente de Clique: 0,0050M de CuSO4em solução tampão PBS: 10,0 mg de CuSO4 foi dissolvido em 12,53 mL PBS x1, do que levou 6,00 mL 0,0050M da solução de CuSO4 e adicionou-se 57,7 mg de BTTAA (número CAS 1334179-85-9) e 297,6 mg de ascorbato de Na para dar a solução reagente de clique (0,0050 M de CuSO4, 0,020 M de BTTAA e 0,25 M de ascorbato de sódio).
[00990] Uma solução de IVIG funcionalizada com azido (140 mg, 3,17 mL, 0,936 µmol, IVIG-Linker-1-Azida) foi adicionada a um tubo de centrífuga de 15 mL contendo molécula pequena derivada de alquino (8,4 mg, 0,00618 mmol, 6,6 eq, descrito em Exemplo 60). Após agitar suavemente para dissolver todos os sólidos, 1,50 mL da solução de reagente de clique acima de (ácido L-ascórbico de sódio, 0,25 M, 74,2 mg, 0,374 mmol, sulfato de cobre (II) 0,0050M, 1,2 mg, 0,0075 mmol e BTTAA 0,020M , 12,9 mg, 0,0300 mmol). A mistura resultante foi agitada suavemente durante a noite. Foi purificado por cromatografia de afinidade em uma coluna de Proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (ver protocolo de purificação de conjugado no Exemplo 10). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 151873 Da (DAR = 2,7). Rendimento 51,0 mg, rendimento de 36%.
Exemplo 85. Síntese do Conjugado 23
[00991] O Conjugado 23 foi preparado analogamente ao Conjugado 22, substituindo a molécula pequena funcionalizada com alquino apropriada (Int-23 descrita no Exemplo 81) na etapa de conjugação com clique.
Exemplo 86. Síntese do Conjugado 24
[00992] O Conjugado 24 foi preparado analogamente ao Conjugado 22, substituindo a molécula pequena funcionalizada com alquino apropriada (descrita no Exemplo 19) na etapa de conjugação com clique.
Exemplo 87. Eficácia dos conjugados 13, 14 e 21 contra Influenza B em um modelo letal de camundongo
[00993] Os conjugados foram avaliados contra uma infecção letal por Influenza B em camundongos BALB / c fêmeas (Charles River Laboratories, 6-8 semanas). O vírus de desafio (B / Malaysia / 2506/04) é um isolado adaptado a camundongos capaz de causar infecções letais em camundongos. O experimento compreendeu 11 grupos de 5 camundongos. No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com vírus a 3x o LD95 por inoculação intranasal em um volume de 30 µl (aprox. 1E4 por camundongo), após serem anestesiados com uma mistura de cetamina / xilazina (150 e 10 mg / kg respectivamente).
[00994] Todos os grupos receberam um único tratamento IV, 2 horas após o desafio viral do artigo de teste, veículo (PBS) ou controle apenas de Fc (hIgG1 Fc). O estudo avaliou Int-18, Int-7 e Int-23 conjugados com monômeros Fc idênticos (conjugados 13, 14 e 21, respectivamente), testados em 3,0, 1,0 e 0,3 mg / kg. Os camundongos foram monitorados por 2 semanas e os animais que ultrapassaram a perda de peso corporal de 20%, ou foram encontrados moribundos, foram avaliados como mortalidade.
[00995] Todos os camundongos tratados com veículo ou o controle apenas Fc, atingiram a mortalidade no dia 7. Em contraste, os camundongos que receberam os conjugados 13, 14 e 21 foram totalmente protegidos após receber uma única dose IV de 0,3 mg / kg (Tabela 40). Como esperado, os grupos que receberam os conjugados a 1,0 ou 3,0 mg / kg também foram totalmente protegidos. A potência de todos os conjugados contra a Influenza B foi ainda suportada pelas medições corporais diárias (Tabela 41), que mostram uma queda transitória inferior a 5% em todo o estudo para qualquer grupo tratado com conjugado. A atividade dos conjugados 13, 14 e 21 é comparável em dose à atividade do conjugado 6 contra os subtipos de Influenza A H1N1 e H3N2. Uma vez que os conjugados, 6 e 14 têm frações de direcionamento idênticas (correspondendo a Int-7), um único conjugado pode ser ativo contra os tipos de influenza sazonal dominantes (Influenza A (H1N1), Influenza A (H3N2) e Influenza B).
Tabela 40. Dados de mortalidade no final do estudo (dia 14). Média de 5 camundongos; Valores p calculados pelo teste Log-rank (Mantel-Cox) Significância para o veículo Composto Dosagem (mg/kg) % de sobrevida (valor p) Veículo (PBS) na 0 na Fc sozinho 3,0 0 p= 1 0,3 100 (0,0027) Conjugado 13 1,0 100 (0,0027) 3,0 100 (0,0027) 0,3 100 p = 0,0027 Conjugado 14 1,0 100 p = 0,0027 3,0 100 p = 0,0027 0,3 100 (0,0027) 1,0 100 (0,0027) Conjugado 21 3,0 100 (0,0027)
Tabela 41: Dados de peso corporal do camundongo (% BW em relação ao dia 0). Média de 5 camundongos; * dados não incluídos uma vez que o primeiro animal atinge a mortalidade dentro de um grupo Dia Fc Conjugado 14 Veículo sozinho (mg/kg) após o (PBS) desafio 3,0 0,3 1,0 3,0 0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 1 98,1 98,1 99,3 99,1 96,5 2 99,6 96,7 98,6 98,6 98,3 3 96,4 94,9 96,8 97,0 98,7 4 89,8 87,8 98,4 97,5 97,8 5 83,6 80,8 97,4 97,8 98,0 6 79,0 76,1 96,9 98,3 99,7 7 * * 99,2 100,5 100,6 8 * * 100,3 101,9 101,1 9 * * 102,5 100,4 100,6 10 * * 100,6 102,0 101,2 11 * * 100,9 100,9 100,9 12 * * 101,8 101,7 101,8 13 * * 101,4 101,7 101,4 14 * * 102,2 102,6 102,2 Exemplo 88. Síntese de PEG4-azido Fc para o Conjugado 25, Conjugado 26, Conjugado 27 e Conjugado 28
[00996] Preparação de solução de éster PEG4-azidoNHS 0,05 M em DMF / PBS x1: 27,40 mg de éster NHS PEG4-azido foi dissolvido em 0,155 mL de DMF a 0°C e diluído pela adição de 1,200 mL de tampão PBS 1x a 0°C . Esta solução foi usada para preparar outro PEG4-azido Fc com uma variedade de valores DAR ajustando os equivalentes desta solução de PBS x1 éster NHS de PEG4-azido.
[00997] Preparação de PEG4-azido Fc (SEQ ID NO: 48): 0,05 M PEG4-azidoNHS éster PBS x1 solução tampão (0,0984 mL, 4,92 μmol, 2,5 equivalentes) foi adicionado a uma solução de h-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 48 ) (234 mg em 13,605 mL de PBS de pH 7,4, MW ~ 57,976 Da, 4,036 μmol) e a mistura foi agitada suavemente durante 2 horas à temperatura ambiente. A solução foi concentrada usando um concentrador centrífugo (30.000 MWCO) para um volume de ~ 2 mL. A mistura bruta foi diluída 1:7 em PBS pH 7,4 e concentrada novamente. Este procedimento de lavagem foi repetido por um total de três vezes. O reagente de molécula pequena foi removido com este procedimento de lavagem. O Fc concentrado (SEQ ID NO: 48)-PEG4-azida foi diluído para 13,60 mL com tampão PBS 1x pH 7,4 e pronto para a conjugação de Clique. O material purificado foi quantificado usando um espectrofotômero visível Nanodrop™ UV (usando um coeficiente de extinção calculado com base na sequência de aminoácidos de h-IgG1).
[00998] A preparação de PEG4-azido Fc (SEQ ID NO: 50) foi análogo ao PEG4-azido Fc acima (SEQ ID NO: 48).
Exemplo 89. Síntese do Conjugado 25
[00999] Preparação da solução de reagente de Clique: 0,0050M de CuSO4 em PBS x1 solução tampão: 10,0 mg de CuSO4 foi dissolvido em 12,53 mL de PBS x1, em seguida, levou 10,00 mL desta solução de CuSO 4 solution e adicionou-se 86,1 mg de BTTAA e 495,3 mg de ascorbato de Na para dar a solução reagente de Clique (0,0050 M de CuSO4, 0,020 M de BTTAA e 0,25 M de ascorbato de sódio). Esta solução reagente de Clique será usada para o Conjugado 25 e o Conjugado 26.
[001000] Uma solução de Fc funcionalizado com azido (78,0 mg, 4,535 mL, 1,35 µmol, SEQ ID NO: 48-PEG4-Azida) foi adicionada a um tubo de centrífuga de 15 mL contendo molécula pequena derivatizada de alquino (13,2 mg, 8,88 μmol, Int-23). Após agitação suave para dissolver todos os sólidos, a mistura foi adicionada com 2,153 mL da solução de reagente de clique acima de (ácido L-ascórbico de sódio, 0,25 M, 106,6 mg, 0,538 mmol, sulfato de cobre (II) 0,0050 M, 1,72 mg, 0,0107 mmol e BTTAA 0,020M, 18,5 mg, 0,0431 mmol). A mistura resultante foi agitada suavemente durante 6 horas à temperatura ambiente. Foi purificado por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (ver protocolo de purificação de conjugado no Exemplo 10). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 60973 Da (DAR = 2,1).
Rendimento 50,3 mg, rendimento de 64%.
Exemplo 90. Síntese do Conjugado 26
[001001] A preparação do Conjugado 26 foi análoga ao Conjugado 25 usando o mesmo lote de PEG4-azido Fc (SEQ ID NO: 48) e uma pequena molécula derivatizada com alquino (Int-7). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 61068 Da (DAR = 2,2).
Rendimento 49,5 mg, rendimento de 63%.
Exemplo 91. Síntese do Conjugado 27
[001003] Preparação da solução de reagente de Clique: 0,0050M de CuSO4 em PBS x1 solução tampão: 10,0 mg de CuSO4 foi dissolvido em 12,53 mL de PBS x1, em seguida, levou 12,00 mL desta solução de CuSO 4 e adicionou-se 103,3 mg de BTTAA e 594,3 mg de ascorbato de Na para dar a solução reagente de Clique (0,0050 M de CuSO4, 0,020 M de BTTAA e 0,25 M de ascorbato de sódio). Esta solução reagente de Clique será usada para o Conjugado 28.
[001004] Uma solução de Fc funcionalizado com azido (80,0 mg, 4,535 mL, 1,38 µmol, SEQ ID NO: 50-PEG4-Azida) foi adicionada a um tubo de centrífuga de 15 mL contendo molécula pequena derivatizada de alquino (13,5 mg, 9,10 μmol, Int-23). Após agitação suave para dissolver todos os sólidos, a mistura foi adicionada com 2,21 mL da solução de reagente de clique acima de (ácido L-ascórbico de sódio, 0,25 M, 109,3 mg, 0,552 mmol, sulfato de cobre (II) 0,0050 M, 1,76 mg, 0,0110 mmol e BTTAA 0,020M, 19,0 mg, 0,0441 mmol). A mistura resultante foi agitada suavemente durante 6 horas à temperatura ambiente. Foi purificado por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (ver protocolo de purificação de conjugado no Exemplo 10). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 61447 Da (DAR = 2,5).
Rendimento 37,1 mg, rendimento de 46%.
Exemplo 92. Síntese do Conjugado 28
[001005] A preparação do Conjugado 28 foi análoga ao Conjugado 27 usando o mesmo lote de PEG4-azido Fc (SEQ ID NO: 50) e uma pequena molécula derivatizada com alquino (Int-7). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 61388 Da (DAR = 2,4).
Rendimento 44,6 mg, rendimento de 56%.
Exemplo 93. Atividade do Conjugado 6 e do Conjugado 21 contra Influenza A de alta via (H5N1, H7N9) em um ensaio de efeitos citopáticos (CPE)
[001006] Um ensaio in vitro para determinar a potência dos conjugados da invenção foi conduzido contra BSL-3 (alta via) influenza A, e geralmente seguiu procedimentos padrão. Resumidamente, diferentes concentrações de conjugados foram misturados com vírus (aproximadamente 250 TCID50) e incubados a 35 ºC por uma hora. Após a incubação, a mistura foi adicionada a uma monocamada confluente de 80-90% de células MDCK. Após uma incubação de 90 minutos, as células foram lavadas e os conjugados reaplicados. A monocamada foi subsequentemente sobreposta com carboximetilcelulose para minimizar a propagação viral e deixada a incubar por dois dias. Após dois dias de cultura, as células foram lavadas com PBS e fixadas com formalina a 10%. Após a fixação, a monocamada MDCK foi permeabilizada com Triton X-100 e imunomarcada com um mAb de camundongo contra a nucleoproteína da influenza. As monocamadas foram lidas e a área manchada por poço foi calculada para determinar os valores de EC50/100.
[001007] Os resultados do estudo estão resumidos na Tabela 42 e demonstram a potência do Conjugado 6 e do Conjugado 21 contra cepas altamente patogênicas com potencial pandêmico. É importante ressaltar que ambos os conjugados geraram valores de EC100 em, ou abaixo, 15 nM contra quatro H5N1 e um isolado H7N9. Em contraste, o oseltamivir tinha um EC 100 de aproximadamente 15 nM apenas contra um isolado (A / Vietnam / 1194/2004) e valores variando de 125 a > 1000 nM contra as outras cepas de alta via. Estes resultados sugerem que o potencial do Conjugado 6 e do Conjugado 21 para tratar pandemias causadas por influenza altamente virulenta é superior ao do oseltamivir.
Tabela 42: Atividade in vitro do Conjugado 6 e Conjugado 12 contra isolados de influenza de alta via Influenza de alta via EC100 (nM) (CPE em células MDCK) H5N1 Veículo Conjugado 6 Conjugado 21 Oseltamivir A / Indonésia / 5/2005 N/A ~15 <15 ~200 - 500 (clado 2.1) A/Vietnã/1194/2004 N/A ~15 <15 ~15 (clado 1) A/turquia/Turquia/1/2005 N/A <15 <15 ~125 - 250 (clade 2.2) A/Hong Kong/156/1997 N/A ~15 <15 >1000 (clado 0) H7N9 A/Anhui/01/2013 N/A <15 <15 ~500 - 1000 H1N1 (controle positivo) A / Holanda / 602/2009 N/A <15 <15 ~1000
Exemplo 94. Atividade do Conjugado 6 e do Conjugado 21 contra o Influenza A (H1N1) em diferentes multiplicidades de infecção (MOI) em um ensaio de efeitos citopáticos (CPE)
[001008] As células MDCK foram semeadas a 4x104 células / poço em meio MEM em placa de 96 poços (tratado com TC) e incubadas a 37°C, 5% de CO2 por 18-24 h. Os artigos de teste (Zanamivir, Oseltamivir, Baloxavir, Conjugado 6 e Conjugado 21) na faixa de dosagem entre 1,93 - 10000 nM foram incubados com influenza A / WSN / 1933 em uma multiplicidade de infecção (MOI) de vírus:célula entre 0,001 - 1 por 1 h à temperatura ambiente (RT). Após 1 h, o vírus pré-incubado e o artigo de teste foram adicionados a 90-100% de monocamada confluente de células MDCK e incubados por 1 h à RT.
[001009] Após 1 h, o meio MEM suplementado com L- glutamina e penicilina / estreptomicina foi adicionado aos poços. As células infectadas foram incubadas a 37C, 5% de CO2 por 72 h. O CPE foi determinado após fixação e coloração das células com violeta de cristal. EC50 foi calculado com análise de regressão não linear usando o software Graphpad Prism 6. Os resultados do ensaio de CPE fornecidos na Tabela 43 indicam que o Conjugado 6 e o Conjugado 21 superam o padrão de agentes de tratamento in vitro, particularmente em MOIs elevados.
Tabela 43: Atividade in vitro do Conjugado 6 e Conjugado 12 contra influenza A (H1N1) em diferentes multiplicidades de infecção EC50 (nM) H1N1 A/WSN/1933 (CPE em células MDCK) MOI 0,001 MOI 0,01 MOI 0,1 MOI 1 Zanamivir 137 938 >10000 >10000 Oseltamivir 525 1896 >10000 >10000 Baloxavir 5 4 79 >100 Conjugado 6 9 15 >100 >100 Conjugado 12 0,6 2 7 10
Exemplo 95. Eficácia do Conjugado 6 contra Influenza A (H1N1) em um modelo de camundongo com imunodeficiência combinada severa letal
[001010] Os conjugados foram avaliados contra uma infecção letal por Influenza A em camundongos BALB / c com imunodeficiência combinada severa (SCID) (Stock # 001803; Jackson Laboratories, 6-8 semanas de idade). O vírus de desafio (A / Puerto Rico /08/1934) é um isolado adaptado a camundongos capaz de causar infecções letais em camundongos. O experimento compreendeu 5 grupos de 5 camundongos cada. No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com vírus a 3x o LD95 por inoculação intranasal em um volume de 30 µl (aprox. 1E3 por camundongo), após serem anestesiados com uma mistura de cetamina e xilazina (150 e 10 mg / kg respectivamente).
[001011] Todos os grupos receberam um único tratamento IV do conjugado 6, 2 horas após o desafio viral do artigo de teste, veículo (PBS) ou controle apenas de Fc (hIgG1 Fc). O estudo avaliou 3 concentrações de dose diferentes do conjugado 6 (0,3, 1,0 ou 3,0 mg / kg). Os camundongos foram monitorados por 5 semanas e os animais que ultrapassaram a perda de peso corporal de 20%, ou que foram encontrados moribundos, foram avaliados como mortalidade. Pesos corporais também foram registrados para monitorar a saúde geral dos animais.
[001012] Todos os camundongos tratados com veículo ou o controle apenas Fc, atingiram a mortalidade na semana 2. Em contraste, os camundongos que receberam o conjugado 6 foram totalmente protegidos após receberem doses IV únicas de 1 ou 3 mg / kg durante o estudo (FIG. 56, Tabela 44). Quando a dose do conjugado 6 foi reduzida para 0,3 mg / kg, a sobrevida caiu para 20% no final do estudo. A dose de 0,3 mg / kg ficou totalmente protegida durante 3 semanas. A potência do conjugado 6 neste modelo de imunodeficiência grave foi ainda suportada pelos dados de peso corporal (FIG.
57, Tabela 45). Os grupos que receberam o conjugado 6 nas concentrações de dose de 1 ou 3 mg / kg demonstraram não mais do que uma perda transitória de peso corporal de menos que 3% ao longo de todo o curso do estudo. Além disso, no final do estudo, ambos os grupos de dosagem mostraram um ganho líquido de peso (7,5 e 2,2%, respectivamente). O grupo dosado com a concentração mais baixa de conjugado 6 (0,3 mg / kg) teve menos que 4% de perda transitória de peso corporal nas primeiras 3 semanas do estudo antes de mostrar sinais de infecção na semana 4, o que acabou resultando em morte para quatro de cinco animais.
[001013] Coletivamente, esses dados demonstram a potência do conjugado 6 ao proteger camundongos desafiados de forma letal com doses IV únicas de conjugado tão baixas quanto 1 mg / kg. Além disso, essa proteção foi de longa duração, estendendo-se ao longo das 5 semanas de duração do estudo. Isso foi realizado em um modelo extremo de imunodeficiência em camundongos sem células imunes T&B, que são essenciais para limpar infecções por influenza. Esses dados apoiam o uso do conjugado 6 para tratar populações de pacientes imunocompetentes e deficientes.
Tabela 44: Mortalidade dos grupos de dose do estudo por semana % Sobrevida (Dia pós-desafio viral) Artigo de teste 7 14 21 28 35 Veículo 80 0 0 0 0 Fc apenas 80 0 0 0 0 Conjugado 6 (3 mg / kg) 100 100 100 100 100 Conjugado 6 (1 mg / kg) 100 100 100 100 100 Conjugado 6 (0,3 mg / kg) 100 100 100 80 20 Tabela 45: Peso corporal médio do grupo para animais de estudo durante 35 dias ou até a primeira morte dentro de um grupo Dia Veículo Fc apenas Conjugado 6 dose 3 mg/kg 1 mg/kg 0,3 mg / kg 0 100 100 100 100 100
Dia Veículo Fc apenas Conjugado 6 dose 1 99,5 99,8 99,6 99,4 98,6 2 98,8 99,2 99,9 99,1 98,9 3 97,7 96,8 101 100,6 97,9 4 94,4 95,4 99,4 98,4 98,5 5 93,7 90,7 100,6 97,9 99,3 6 88,7 83,9 101,2 98,7 98,1 7 81,1 77,6 101,8 98 96,9 8 101,3 99,7 98,9 9 102,6 100,7 98,8 10 101,6 99,8 99,4 11 101,6 99,7 100,3 12 101,8 100,2 100,7 13 102,3 101 100,7 14 103,9 100,5 99,9 15 104,3 101,8 102,3 16 104,3 102 101,3 17 104,3 100,6 102 18 105,4 103,9 100,5 21 105,7 105,9 96,8 22 105,5 103,4 93,9 23 105,6 106,9 91 24 108,4 102,9 25 106,4 102,7 26 108,4 103,9 27 108,6 103,5 28 109,1 104,7 29 108,96 104,5 30 109 105,8 31 108,2 104,9 35 107,5 102,2 Exemplo 96. Conjugado 6 depuração viral dependente da dose nos pulmões
[001014] Os estudos de eficácia foram conduzidos em camundongos BALB / c fêmeas de 6-8 semanas (Charles River) desafiados por via intranasal com 3x102 PFU/camundongo(3x do LD95) de influenza A / Puerto Rico / 8/1934 adaptado a camundongo (H1N1). O conjugado 6 ou controle Fc de IgG1 humana foi administrado como uma dose intravenosa única (IV) 2 h após o desafio a 0,1 - 3 mg / kg. Oseltamivir foi administrado por via oral, duas vezes ao dia durante 4 dias, começando 2 h após a infecção a 5 ou 15 mg / kg. Os pesos corporais (BW) foram registrados por 4 dias. Aos 4 dias após a infecção, os camundongos foram sacrificados por CO2 ambos os lobos do pulmão foram colhidos. Os pulmões foram homogeneizados com esferas de sílica de 1 mm em 1 mL de PBS usando um MagNA Lyser (Roche). A homogeneização foi realizada a 6.000 rpm por 60 s e resfriada em gelo por 5 min entre as execuções. Após a homogeneização pulmonar, os tubos foram centrifugados por 10 min a 600 x g e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo.
[001015] Para determinar a carga viral nos pulmões (medida como unidades formadoras de placas (PFUs)), os sobrenadantes do homogenato de pulmão foram diluídos em tampão de infecção variando de 10-1 a 10-6. 100 µL de diluições de vírus foram adicionados à monocamada confluente de células MDCK em placas de 24 poços e incubados por 1 h à temperatura ambiente com agitação a cada 15 min. Após a remoção do vírus, o meio líquido de cobertura contendo Avicel foi adicionado às células MDCK. As células foram incubadas a 37ºC, 5% de CO2 por 40 h. Após a incubação, o meio foi removido e as células foram coradas com violeta cristal para enumerar as placas. PFUs foram calculados em relação ao peso do pulmão (PFU / g pulmão).
[001016] Os resultados deste estudo demonstram que doses baixas de conjugado 6 reduzem rapidamente as ordens de magnitude da carga viral melhor do que oseltamivir (TAMIFLU®) (FIG. 58, Tabela 46). Esta observação tem significado clínico, uma vez que infecções graves de influenza são causadas pelo vírus que se move de uma infecção inicial do trato respiratório superior para os pulmões.
Tabela 46: Carga viral no dia 4 pós-infecção Artigo de teste [mg / kg] Redução de Log Redução de Log (PFU/mL) (PFU/g) PBS [0] 0,00 0,00 hIgG1 Fc [3] -0,04 0,26 Oseltamivir [5] 0,24 0,43 Oseltamivir [15] 0,52 0,75 Conjugado 6 [0,1] 0,60 0,79 Conjugado 6 [0,3] 1,33 1,55 Conjugado 6 [1] 2,25 2,34 Conjugado 6 [3] 3,20 3,40 Exemplo 97. Redução dependente da dose do conjugado 6 em citocinas inflamatórias nos pulmões
[001017] Os estudos de eficácia foram conduzidos em camundongos BALB / c fêmeas de 6-8 semanas (Charles River) desafiados por via intranasal com 3x102 PFU/camundongo(3x do LD95) de influenza A / Puerto Rico / 8/1934 adaptado a camundongo (H1N1). O conjugado 6 ou controle Fc de IgG1 humana foi administrado como uma dose intravenosa única (IV) 2 h após o desafio a 0,1 - 3 mg / kg. Oseltamivir foi administrado por via oral, duas vezes ao dia durante 4 dias, começando 2 h após a infecção a 5 ou 15 mg / kg. Os pesos corporais (BW) foram registrados por 4 dias. Aos 4 dias após a infecção, os camundongos foram sacrificados por CO2 ambos os lobos do pulmão foram colhidos. Os pulmões foram homogeneizados com esferas de sílica de 1 mm em 1 mL de PBS usando um MagNA Lyser (Roche). A homogeneização foi realizada a 6.000 rpm por 60 s e resfriada em gelo por 5 min entre as execuções. Após a homogeneização pulmonar, os tubos foram centrifugados por 10 min a 600 x g e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo.
[001018] Para a análise de citocinas, os sobrenadantes do homogenato de pulmão foram diluídos em série 2 vezes em placa de 96 poços. Os níveis de citocinas para INF-, TNF-, IL-6, MIP-1 e MCP-1 foram determinados por ELISA de acordo com as instruções do fabricante (R&D
Systems).
[001019] A morbidade e mortalidade da influenza grave são, em última análise, causadas pelo influxo induzido por vírus de citocinas pró- inflamatórias nos pulmões. Uma preocupação potencial do uso de um conjugado Fc para tratar a gripe é se o fragmento Fc exacerba a inflamação induzida por citocinas. Os resultados do modelo de infecção letal por H1N1 mostram exatamente o oposto: uma diminuição dependente da dose do conjugado 6 em citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, TNFα e IL-6) em tecidos pulmonares infectados (FIG. 59, Tabela 47).
Tabela 47: Resposta de citocinas no dia 4 pós-infecção Mudança em vezes em comparação com o controle unificado Artigo de teste [mg / kg] INFy TNFa IL-6 MCP-1 MIP-1a PBS [0] 0,4 2,2 4,6 16,3 16,4 hIgG1 Fc [3] 0,5 2,2 6,2 20,2 16,8 Oseltamivir [5] 0,2 1,7 4,0 11,7 7,5 Oseltamivir [15] 0,2 1,8 3,5 10,5 6,1 Conjugado 6 [0,1] 0,3 1,5 3,0 10,8 7,9 Conjugado 6 [0,3] 0,2 1,2 1,9 6,7 7,4 Conjugado 6 [1] 0,2 1,1 1,9 6,1 3,6 Conjugado 6 [3] 0,8 1,1 1,4 2,8 2,6 Não infectado 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Exemplo 98. Análise de amostra de plasma do Conjugado 6 in vivo. Comparação de PK em camundongos com deficiência imunológica combinada severa de CD-1 e BALB / c.
[001020] O Conjugado 6 em amostras de plasma foi quantificado por um ELISA de detecção de captura de neuraminidase.
Resumidamente, as moléculas foram capturadas em placas revestidas com neuraminidase e, em seguida, detectadas usando um anticorpo anti-IgG-Fc humano conjugado com HRP. A concentração de proteína foi calculada no GraphPad Prism usando a regressão não linear 4PL das curvas padrão do
Conjugado 6. Uma descrição mais detalhada do método é fornecida abaixo.
[001021] Placas de 96 poços Nunc Maxisorp (Cat No. 12-565- 136, ThermoFisher) foram revestidas com 0,1U/poço de neuraminidase de A / California / 04/2009 (H1N1) (11058-VNAHC, Sino Biological) em 1X tampão de revestimento KPL (5150-0041, SeraCare). As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora em um agitador de placa orbital (500 rpm).
Diluições em série das amostras de plasma foram semeadas e incubadas à temperatura ambiente por 2 horas (diluente da amostra: 0,5% de BSA em PBS 0,025% de Tween 20 + concentração final de plasma de camundongo de 1:2.500). As curvas padrão do Conjugado 6 variando de 0,230 a 500 ng/mL, em duplicado, foram executadas em cada placa. Após a incubação de 2 horas, as placas foram lavadas 5x em 300 µL de PBS com Tween 20 a 0,05%. Conjugado ligado à neuraminidase nas placas foi, então, testado com um anti-F(Fab')2 de IgG Fc humano conjugado com HRP (709-036-098, Jackson) diluído 1:1.000 em diluente de amostra por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 8x em 300 µL de PBS com 0,05% de Tween 20 e desenvolvidas com substrato TMB por 7-8 minutos. A reação foi interrompida com 1N H2SO4. A absorbância foi lida a 450 nm. Conjugado 6 em amostras de plasma foi interpolado usando GraphPad Prism Versão 6 após análise de regressão não linear (Sigmoidal, análise 4PL) das curvas padrão.
Perfis PK, CD-1 vs camundongo BALB / c SCID
[001022] O conjugado 6 administrado por via intravenosa a camundongos SCID e CD-1 (imunocompetentes) a 5 mg / kg demonstrou perfis de PK semelhantes (FIG. 60). As concentrações eram comparáveis nos pontos de tempo amostrados. Os perfis de PK de duas fases compreendem fases de distribuição de 24 horas seguidas por uma fase de eliminação rasa. Os níveis plasmáticos do conjugado 6 permaneceram altos (~ 10 µg / ml) em relação aos níveis Cmax ao longo do curso de uma semana do estudo.
Exemplo 99. Síntese do ligante central de propargil diamina benzilamina Propargil-PEG4-ácido Etapa a.
[001023] Uma solução de 2-(2-Boc-Aminoetoxi)etanol (16,0 g, 78,0 mmol) e CBr4 (31,0 g, 93,5 mmol) em DCM (100 mL) a 0 ℃ foi tratado com PPh3 (24,5 g, 93,5 mmol) lentamente mais de 15 minutos (exotérmico). Durante o curso da adição, a temperatura interna foi mantida abaixo de 30 ℃. Após adição de PPh3 a reação foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. A reação em bruto foi concentrada até um óleo e depois purificada por cromatografia de fase normal, eluindo com 10% de acetato de etil / hexanos para 80% de acetato de etil / hexanos. As frações contendo gotículas de óleo no interior dos tubos de coleta foram combinadas e concentradas em um óleo incolor. Rendimento 18,1 g, 86%.
Etapa b.
[001024] Uma solução do produto da etapa a (10 g, 37,3 mmol), benzilamina (1,60 g, 14,9 mmol) e K2CO3 (6,19, 44,8 mmol) em DMF (20 mL) foram aquecidos em um banho de óleo a 75 ℃ durante 8h. A mistura foi filtrada, concentrada e purificada por RPLC (5% ACN / água a 100% ACN).
Rendimento 6,8 g, 95%.
Etapa c.
[001025] A uma solução do produto da etapa b (5,35 g, 8,98 mmol) em CHCl3/EtOH (1:20, 100 mL) foi adicionado 20% Pd(OH)2/C (1,26 g, 1/80 mmol). A reação foi agitada durante a noite sob balão de hidrogênio à temperatura ambiente. A mistura de reação foi filtrada através de uma almofada de Celite. Os solventes foram removidos e transportados para a etapa subsequente sem purificação.
Etapa d.
[001026] O produto da etapa c foi redissolvido em 20 mL de DMF / diclorometano (1:5). A esta solução de amina livre, ácido propargil PEG4 (2,36 g, 8,98 mmol), EDCI (2,57 g, 13,5 mmol), HOAt (1,83 g, 13,5 mmol) e base de Hunig (3,13 mL, 18,0 mmol) foram adicionados. A mistura de reação foi agitada durante quatro horas, depois concentrada e purificada por RPLC (10% ACN / água a 60% ACN / água. Rendimento de 4,00 g, 70% em duas etapas. Íons encontrados por LCMS: [M - Boc + H]+ = 534,2, [M + H]+ = 634,2.
Etapa e.
[001027] O produto da etapa d (4,00 g, 6,31 mmol) foi tratado com HCl 4N em dioxano (30 mL) durante 2 horas. HCl extra e dioxano foram removidos por evaporação rotativa, e o restante foi adicionalmente seco sob alto vácuo para dar Int-10 como sal 2HCl. Rendimento 3,15 g, 99%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 434,2.
Exemplo 100. Síntese de Int-7a (isômero C7-C7) 1) cat Lindlar/H2 2) Bis-boc guanilpirazol 3) NaOMe, MeOH 60% durante 2 etapas Ligante central propragi-diamino Etapa a.
[001028] Metil 5-acetamido-7,8,9-O-triacetil-2,6-anidro-4- azido-3,4,5-trideoxi-D-glicero-D-galacto-non-2-enonato (30 g, 65,7 mmol) foi dissolvido em metanol (100 mL) e combinado com catalisador de Lindlar (15 g).
A mistura resultante foi lavada com hidrogênio e agitada por 5 horas, liberando hidrogênio através do espaço superior com hidrogênio a cada 30 minutos. Após a reação completa, conforme determinado por HPLC, o catalisador é filtrado através de celite. O filtrado foi usado na próxima etapa.
[001029] A amina bruta da etapa anterior (18,9 g, 43,8 mmol) foi tratada com N,N'-bis-boc-1-guanilpirazol (14,3 g, 46,0 mmol) e DIEA (9,9 ml, 57,0 mmol) em metanol (100 mL). A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente até que todo o material de partida fosse consumido conforme determinado por LCMS (~ 30 min). A solução foi concentrada até uma espuma e armazenada sob alto vácuo durante a noite, em seguida, usada sem purificação adicional na etapa seguinte.
[001030] O tri-acetato bruto da etapa anterior (43,8 mmol) foi dissolvido em 100 ml de metanol seco, depois tratado com metóxido de sódio em metanol (1,9 ml, solução a 25% em metanol, 8,76 mmol) à temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por LCMS que estava completo após 10 minutos. A reação foi extinta com HCl 1N para um pH de ~7. A solução resultante foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 10% a 100% de acetonitrila e água. Nenhum modificador de TFA foi usado para esta purificação. Rendimento do produto 15,6 g, 65%.
Etapa b.
[001031] Uma mistura do produto da etapa a (5,47 g, 10 mmol) e DMAP (1,222 g, 10 mmol) foi dissolvida em THF anidro (30 mL). Após o resfriamento em um banho de água gelada, a solução foi tratada lentamente com 1,1'-carbonildi-imidazol (2,6 g, 16 mmol), em seguida, agitada por 30 minutos a 0 ºC, seguido de aquecimento a 60℃ por 2 horas. Foi então resfriada à temperatura ambiente e extraída com água (50 ml) e EtOAc / hexano (1:1, 100 ml). A camada orgânica foi lavada com água (50 ml x 3), seca sobre Na 2SO4 e concentrada por evaporação rotativa. O produto de espuma branca foi posteriormente seco sob alto vácuo e transportado para a etapa subsequente sem purificação adicional. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 573,2.
Etapa c.
[001032] Um frasco de reação contendo o produto da etapa b foi lavado a vácuo com nitrogênio e dissolvido em DCM anidro (50 mL), em seguida, resfriado em um banho de água gelada. À solução resfriada foi adicionado DMAP (4,89 g, 40 mmol), seguido de 4-nitrofenilcloroformato (6,05 g, 30 mmol) em porções ao longo de 20 minutos. A solução foi agitada a 0 ℃, em seguida, aquecida à temperatura ambiente durante 1 hora. LCMS mostra material de partida 1 h, então DMAP adicional (1,22 g, 10 mmol) e 4- nitrofenilcloroformato (1 g, 5 mmol) foram adicionados. A reação foi continuada por 4 horas, depois purificada com duas colunas de sílica gel (220 g, pré-úmida com 20% de EtOAc e hexano) e eluída com 20% a 80% de EtOAc e hexano.
Rendimento de 4,42 g, 59,9% para duas etapas. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 738,2.
Etapa d.
[001033] A uma solução do produto da etapa c (3,2 g. 4,34 mmol) em DCM anidro (3 mL) foi adicionada em porções ao longo de 30 minutos uma mistura de ligante central de propargil diamina (1,26 g, 2,5 mmol, descrito no Exemplo 99) e DIPEA (1,68 g, 13 mmol) em DMF anidro (5 mL). A reação foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas. Foi então concentrado e purificado por RPLC (30% a 90% de acetonitrila e água, sem modificador de TFA). Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 815,8, [(M - Boc + 2H) / 2]+ = 765,8, [(M - 2Boc + 2H) / 2]+ = 716. Rendimento 3,33 g, 94,2%.
Etapa e.
[001034] O produto da etapa d (3,33 g, 2,04 mmol) foi dissolvido em DCM (5 ml) e TFA (5 ml), em seguida, agitado a 35 ℃ durante ~ 6 horas. A reação foi monitorizada por LCMS. Quando completa, a solução foi concentrada e purificada por RPLC (5 a 30% de acetonitrila e água, sem TFA).
Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 615,8, [(M + 3H) / 3]+ = 411.
Rendimento 2,29 g, 91,3%.
Etapa f.
[001035] O produto da etapa e (61,5 mg, 0,05 mmol) foi dissolvido em MeOH / água (1:1, 0,6 mL). Depois que a solução foi resfriada a - 6 ℃ (banho de sal / gelo), LiOH 1,0 M (0,3 ml, 0,3 mmol) foi adicionado gota a gota e a reação foi agitada durante 30 minutos. Foi então extinta para pH ~ 7,0 com HCl 4N em solução de dioxano (75 µl) e diretamente purificada por HPLC prep (Isco ACCQ prep, Luna 5 µm C18 (2) 100 Å LC coluna 100 mm x 30 mm; Gradiente: 0% acetonitrila / água por 2 min, então 0% a 15% de acetonitrila / água ao longo de 12 min, então isocrático a 15% de acetonitrila por 10 min, usando 0,1% de TFA). Rendimento de 45 mg, 65,3%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 575,8, [(M + 3H) / 3]+ = 384,2. Tempo de retenção analítico: 6,013 min. Condições: coluna de HPLC Phenomemex Gemini, 3 µm WX-C18 110 Å, 100 mm x 3 mm, eluída durante 25 minutos com 5-95% de acetonitrila e gradiente de água, usando 0,1% de TFA.
Exemplo 101. Síntese de Int-7b (isômero C7-C9)
[001036] O heterodímero C7-C9 (Int-7b) foi preparado de forma análoga a Int-7a (isômero C7-C7, Exemplo 100), com a exceção de que a reação é conduzida a 0 ºC e é monitorada por HPLC (tempo de retenção: 6,112 min. Condições: ver Exemplo 100, síntese de Int-7a e interrompida quando o isômero C7-C9 predomina (~ 3h). Este isômero é isolado usando as mesmas condições que foram usadas para isolar Int-7a. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 575,8, [(M + 3H) / 3]+ = 384,2.
Exemplo 102. Síntese de Int-7c (isômero C9-C9)
[001037] Int-7c (isômero C9-C9) foi preparado de forma análoga a Int-7a (isômero C7-C7, Exemplo 100), com a exceção de que a reação conduzida a 0 ºC e é monitorada por HPLC (tempo de retenção: 6,232 min.
Condições: ver Exemplo 100, síntese de Int-7a e interrompida quando o isômero C9-C9 predomina (~ 6h). Este isômero é isolado usando as mesmas condições que foram usadas para isolar Int-7a. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 575,8, [(M + 3H) / 3]+ = 384,2.
Exemplo 103. Síntese de Int-7 (via acetonida) cat Reagente dimetóxi-propano Lindar guanil TFA, entao H2O Etapa a.
[001038] Metil 5-acetamido-7,8,9-O-triacetil-2,6-anidro-4- azido-3,4,5-trideoxi-D-glicero-D-galacto-non-2-enonato (10,0 g, 22 mmol) foi dissolvido em 60 ml de metanol seco, depois tratado com 20 ml de metóxido de sódio em metanol (0,5 M em metanol, 10 mmol) enquanto resfriava num banho de água gelada. O progresso da reação foi monitorado por LCMS que estava completo após 2 horas. O pH da solução de reação foi então ajustado para um valor de 5 a 6 usando resina de troca iônica Amberlite IRN-77. A mistura foi filtrada para remover a resina e evaporada até a secura sob vácuo. O óleo resultante foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M + H = 331,1.
Etapa b.
[001039] A uma solução dos produtos da etapa anterior em 70 ml de acetona foram adicionados 30 ml de 2,2-dimetoxipropano e ácido p- toluenossulfônico 1 hidratado (400 mg, 2,0 mmol), a solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. No final deste tempo, foi adicionado bicarbonato de sódio (170 mg, 2,0 mmol) e a mistura foi concentrada até a secura. O resíduo resultante foi usado na próxima etapa sem purificação.
Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M + H = 371,2.
Etapa c.
[001040] A uma solução do material da etapa anterior em 60 ml de metanol foram adicionados 5,0 g de um catalisador de Lindlar. A mistura resultante foi borbulhada com hidrogênio a cada 30 minutos e agitada durante 5 horas. Após a reação completa, conforme determinado por HPLC, o catalisador foi filtrado através de celite. O filtrado foi concentrado e usado na etapa seguinte sem purificação.
[001041] O produto bruto da etapa anterior em 60 ml de THF foi tratado com N,N'-bis-boc-1-guanilpirazol (9,3 g, 30,0 mmol) e DIEA (9,9 ml, 57,0 mmol). A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente até que todo o material de partida fosse consumido conforme determinado por LCMS (4h). A solução foi concentrada e purificada por cromatografia flash eluída com 20% a 80% de acetato de etil / diclorometano. Rendimento de 8,8 g, 59,0% para quatro etapas. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M + H = 587,3.
Etapa d.
[001042] Um frasco de reação contendo o produto da etapa anterior (6,5 g, 11 mmol) foi lavado a vácuo com nitrogênio e dissolvido em diclorometano anidro (100 mL). Depois que a solução foi resfriada em um banho de água gelada, DMAP (4,89 g, 40 mmol) foi adicionado e agitado para dissolver, em seguida, 4-nitrofenilcloroformato (5,58 g, 28 mmol) foi adicionado em porções, enquanto se agitava a 0 ℃ até a temperatura ambiente durante 1 hora.
LCMS mostra material de partida 1 h, então DMAP adicional (1,22 g, 10 mmol) e 4-nitrofenilcloroformato (1,0 g, 5 mmol) foram adicionados. A reação foi continuada por mais 4 horas, em seguida, concentrada e purificada por cromatografia flash eluindo com 20% a 80% de acetato de etil / diclorometano.
Rendimento 5,1 g, 59,9%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 752,2 Etapa e.
[001043] A uma solução do carbonato de nitrofenil da etapa anterior (1,8 g. 2,3 mmol) em diclorometano anidro (20 ml) foi adicionada uma mistura de ligante central (0,51 g, 1,0 mmol, adicionado em porções ao longo de 30 minutos) e DIPEA (1,4 ml, 10 mmol) em DMF anidro (20 ml). A reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, em seguida, concentrada e purificada por cromatografia flash eluindo com 0% a 10% de metanol / diclorometano. Rendimento 1,35 g, 80%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 830,4, [(M - Boc + 2H) / 2]+ = 780,4, [(M - 2Boc + 2H) / 2]+ = 730,4.
Etapa f.
[001044] O produto da etapa anterior (200 mg, 0,2 mmol) foi dissolvido em 2 ml de MeOH e 2 ml de THF, então tratado com uma solução de hidróxido de lítio (24 mg, 1 mmol) dissolvido em 2 ml de água. A reação foi agitada durante 10 min à temperatura ambiente altura em que HPLC mostrou que a reação estava completa. O pH da solução de reação foi ajustado para o valor de 5 a 6 usando a resina de troca iônica Amberlite IRN-77, que foi filtrada para remover a resina. O produto bruto foi evaporado à secura sob vácuo e usado na próxima etapa com purificação. Íon (s) encontrado (s) por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 815,4, [(M - Boc + 2H) / 2]+ = 765,4, [(M - 2Boc + 2H) / 2]+ = 715,4 .
Etapa g.
[001045] O produto da etapa g (400 mg, 0,25 mmol) foi dissolvido em 5 ml de diclorometano e 5 ml de TFA, e a solução de reação resultante foi agitada à temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por LCMS. Após a conclusão da reação (6h), a solução foi evaporada até a secura e então dissolvida em 4 mL de água e 4 mL de acetonitrila. A solução resultante foi agitada durante mais 2 horas à temperatura ambiente à qual LCMS mostra a desproteção completa dos grupos de proteção de acetonida. Esta mistura foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco COMBIFLASH® eluído com 5% a 40% de acetonitrila / água com 0,1% de TFA como modificador.
Rendimento 270 mg, 68,0%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 575,8, [(M + 3H) / 3]+ = 384,2.
Exemplo 104. Resultados de NMR para Int-7a, Int-7b e Int-7c NMR de Int-7a 1H NMR (500 MHz, Metanol-d4) δ 5,91-5,89 (m, 2H), 5,00-4,96 (m, 2H), 4,58-4,53 (m, 2H), 4,42-4,37 (m, 2H), 4,20-4,17 (m, 6H), 4,02-3,97 (m, 2H), 3,78 - 3,49 (m, 28H), 3,29-3,18 (m, 4H), 2,86 (t, J = 2,6 Hz, 1H), 2,85-2,72 (m, 2H), 1,96 (s, 3H), 1,95 (s, 3H). 13C NMR (125 MHz, MeOD) δ 171,73, 170,80, 170,29, 161,95, 156,06, 155,08, 154,99, 144,07, 143,93, 116,41, 114,10, 106,03, 105,86, 77,71, 74,46, 73,22, 68,62, 68,54, 68,50, 68,38, 68,12 , 68,00, 67,94, 67,67, 67,64, 67,53, 67,20, 66,96, 65,44, 61,53, 56,17, 49,74, 49,64, 47,37, 45,17, 39,16, 39,06, 31,73, 19,96, 19,92.
NMR de Int-7b
1H NMR (500 MHz, Metanol-d4) δ 5,91-5,87 (m, 2H), 5,04-4,95 (m, 1H), 4,58-4,48 (m, 2H), 4,45-4,37 (m, 3H), 4,20-4,10 (m, 5H), 4,08 - 3,98 (m, 2H), 3,79-3,44 (m, 29H), 3,29 - 3,18 (m, 4H), 2,88-2,70 (m, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,96 - 1,94 (m, 3H). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 8,28 (d, J = 8,4 Hz, 2H, -NH), 7,98 (d, J = 11,5 Hz, 2H, -NH), 7,78 (d, J = 8,7 Hz , 2H, -NH), 7,60 (t, J = 8,5 Hz, 2H, -NH), 7,20 (bs, 2H, -NH), 7,06 (bs, 2H, -NH), 5,69 (bs, 1H), 5,67 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,83 (dd, J = 9,2, 2,2 Hz, 1H), 4,45 (dt, J = 9, 2,5 Hz, 1H), 4,37 (d, J = 2,2 Hz, 1H) , 4,33-4,24 (m, 2H), 4,13 (d, J = 2,5 Hz, 2H), 4,05-4,32 (m, 41H), 3,23 (m, 1H), 3,15-3,09 (m, 2H), 3,06-3,02 (m, 2H), 2,59 (t, J = 6,7 Hz, 2H), 1,91 (s, 3H), 1,78 (s, 3H). 13C NMR (125 MHz, MeOD) δ:173,19, 172,98, 172,25, 171,75, 164,26, 163,82, 157,88, 157,55, 156,51, 146,09, 107,21, 106,93, 106,59, 79,22, 76,19, 75,92, 74,72, 74,68, 70,12, 70,08, 70,03, 69,99, 69,92, 69,88, 69,66, 69,48, 69,12, 69,01, 68,94, 68,73, 68,69, 68,50, 68,19, 67,08, 66,93, 66,79, 63,04, 57,68, 51,24, 51,15, 50,13, 48,87, 48,72, 46,72, 46,58, 46,23, 40,64, 40,41, 33,21, 21,49, 21,45, 21,40.
NMR de Int-7c 1H NMR (500MHz, Metanol-d4) δ: 5,88 (d, J = 2,6 Hz, 2H), 4,50 (dt, J = 8,5, 2,7 Hz, 2H), 4,43 (ddd, J = 9,7, 3,9, 1,5 Hz, 2H), 4,39 (dd, J = 11,5, 2,4 Hz, 2H), 4,25 - 4,16 (m, 2H), 4,19 (d, J = 2,4 Hz, 2H), 4,13 (dt, J = 11,5, 5,9 Hz, 2H ), 4,05 (m, 2H), 3,77 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,72 - 3,55 (m, 22H), 3,51 (m, 4H),
3,35 - 3,23 (m, 4H), 2,86 (t, J = 2,4 Hz, 1H), 2,74 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 2,02 (s, 6H). 13C NMR (125 MHz, MeOD) δ:173,03, 163,76, 157,89, 157,54, 145,60, 107,21, 79,28, 76,29, 74,70, 70,11, 70,07, 70,03, 69,92, 69,70, 69,47, 68,96, 68,89, 68,72, 68,54, 68,19, 67,05, 66,75, 57,69, 50,09, 48,69, 48,08, 46,10, 40,44, 40,38, 33,23, 21,42.
Exemplo 105. Síntese de Int-60 2-azidoetilamina cloridrato
2. Dipropargilamina, CuSO4, TBTA Ascorbato de sódio, EtOH, H2O 94% Propargil-PEG4-ácido Etapa a.
[001046] A uma solução de agitação a 0°C de ácido éter- zanamivir previamente preparado (1,00 g, 1,586 mmol, Exemplo 31), cloridrato de 2-azidoetilamina (213 mg, 1,744 mmol) e DIPEA (1,105 mL, 6,343 mmol) em DMF (8,0 mL), foi adicionado HATU (615 mg, 1,618 mmol). A temperatura foi elevada até a temperatura ambiente e a agitação continuou até à conclusão.
Todos os voláteis foram removidos por técnicas de vácuo. O resíduo foi retomado em acetato de etil, lavado com uma solução aquosa 1 M de ácido sulfúrico (1 x 50 mL), em seguida, uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (3 x 20 mL) e salmoura (1 x 50 mL). As camadas orgânicas resultantes foram secas com sulfato de magnésio, filtradas e todos os voláteis foram removidos por técnicas de vácuo. Desta forma, 816 mg da azida intermediária desejada foram obtidos em alta pureza e usados na próxima etapa sem qualquer purificação adicional. (Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 699,2). A uma solução de agitação do material em bruto descrito (816 mg, 1,168 mmol), dipropargilamina (54 mg, 0,584 mmol), tris((1-benzil-4-triazolil)metil)amina (31 mg, 0,058 mmol) e sódio ascorbato (58 mg, 0,292 mmol) em etanol (10 mL) e água (5 mL), foi adicionado sulfato cúprico (10 mg, 0,061 mmol). Após a conclusão, o eliminador de cobre SiliaMetS TAAcONa (300 mg, carregando 0,45 mmol / g) foi adicionado e a agitação foi continuada por 1 h. A mistura foi filtrada com a ajuda de diclorometano. O filtrado foi lavado com uma solução saturada de bicarbonato de sódio. A camada aquosa foi adicionalmente lavada com diclorometano (3 vezes). Os orgânicos combinados foram secos com sulfato de magnésio, filtrados e concentrados. O resíduo foi purificado por coluna de sílica usando uma cromatografia líquida Isco COMBIFLASH® eluída com 0% a 100% de hexanos e acetato de etil, seguido por 0% a 30% de diclorometano e.
Rendimento 817 mg, rendimento de 94%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 745,8, [(M + 3H) / 3]+ = 497,5.
Etapa b.
[001047] A uma solução de agitação a 0°C do produto da etapa a (817 mg, 0,548 mmol), ácido propargil-PEG4 (185 mg, 0,712 mmol) e DIPEA (286 uL, 1,644 mmol) em DMF (7,0 mL), foi adicionado HATU (212 mg, 0,544 mmol). A temperatura foi elevada até a temperatura ambiente e a agitação continuou até à conclusão. Todos os voláteis foram removidos por técnicas de vácuo. O resíduo foi purificado por HPLC (0 a 90% de metanol e água).
Rendimento de 520 mg, 56%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 866,8, [(M + 3H) / 3]+ = 578,4.
Etapa c.
[001048] Uma solução de agitação do composto da etapa b (520 mg, 0,300 mmol) em 2-metil-2-buteno (0,25 mL), diclorometano (4,0 mL) e TFA (2,0 mL) foi agitada até a evolução de gás cessar. Todos os voláteis foram removidos por técnicas de vácuo. O resíduo foi purificado por HPLC (0 a 30% de metanol e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento de 221 mg, 47%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 666,8, [(M + 3H) / 3]+ = 444,8.
Etapa d.
[001049] A uma solução em agitação a 0°C do produto da etapa c (221 mg, 0,142 mmol) em água (3,0 mL) foi adicionado hidróxido de lítio (20 mg, 0,850 mmol). A reação foi extinta com ácido acético (120 uL), e todos os voláteis foram removidos por técnicas de vácuo. O resíduo foi purificado por HPLC (0 a 20% de metanol e água, usando 0,1% de TFA como modificador).
Rendimento de 130 mg, 62%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2] + = 626,8, [(M + 3H) / 3]+ = 418,2.
Exemplo 106. Síntese do Conjugado 29
[001050] Uma solução de Fc aglicosilado azido funcionalizado (SEQ ID NO: 35) em solução tampão PBS x 1 pH 7,4 (100 mg, 10 mL, 1,874 µmol) é adicionada a um tubo de centrífuga contendo uma solução tampão PBS x 1 pH 7,4 (10,50 mL ) de molécula pequena derivatizada de alquino (17 mg, 0,0112 mmol; Exemplo 105, Int-60), sulfato cúprico (4 mg, 0,0225 mmol), tris(3- hidroxipropiltriazolilmetil)amina (39 mg, 0,0900 mmol) e ascorbato de sódio (7,4 mg, 0,375 mmol). A mistura resultante foi agitada suavemente durante a noite.
Foi purificado por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (ver Exemplo 10). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 56938 Da (DAR = 2,3). Rendimento 49,9 mg, rendimento de 49%.
Exemplo 107. Síntese de Int-65 Etapa a.
[001051] A uma solução de agitação a 0°C de ácido éter- zanamivir previamente preparado (2,00 g, 3,172 mmol, Exemplo 31) e 4- metilmorfolina (0,628 mL, 5,709 mmol) em tetra-hidrofurano (30 mL) foi adicionado cloroformato de isobutil (0,617 mL, 4,7574 mmol). Após 10 minutos, a temperatura foi aumentada para a ambiente e a agitação continuou durante 20 minutos. A temperatura foi diminuída de volta para 0°C, e boro-hidreto de sódio (360 mg, 9,515 mmol) foi adicionado em uma porção, seguido pela adição gota a gota de (10 mL) ao longo de 5 minutos. Após a conclusão, a reação foi extinta com ácido acético (2,860 mL, 50 mmol), e após 5 minutos a temperatura foi elevada à temperatura ambiente, enquanto a agitação foi continuada até a evolução de gás cessar. Todos os voláteis foram evaporados e o resíduo foi suspenso em diclorometano e filtrado. O filtrado foi concentrado e o resíduo foi purificado por coluna de sílica usando uma cromatografia líquida Isco COMBIFLASH® eluída com 20% a 100% de hexanos e acetato de etil, usando 3% de metanol como um modificador. Rendimento 1,302 g, rendimento de 66%.
Íons encontrados por LCMS: [(M + H)] + = 617,2.
Etapa b.
[001052] A uma solução em agitação a 0°C do produto da etapa a (1,25 g, 2,027 mmol) e DIPEA (1,095 mL, 6,284 mmol) em diclorometano (15 mL), foi adicionado cloreto de metanossulfonil (0,314 mmol, 4,054 mmol).
Após a conclusão, a reação foi tratada com água (15 mL). As camadas foram separadas e a camada de diclorometano foi seca com salmoura, em seguida sulfato de magnésio e filtrada. A solução foi concentrada e o resíduo foi dissolvido em DMF (10 mL), e azida de sódio (264 mg, 4,054 mmol) foi adicionada, enquanto a temperatura foi elevada para 50°C. A conclusão foi observada após 18 h, e todos os voláteis foram evaporados por técnicas de vácuo. O resíduo foi purificado por coluna de sílica usando uma cromatografia líquida Isco COMBIFLASH® eluída com 20% a 100% de hexanos e acetato de etil, usando 3% de metanol como um modificador. Rendimento 767 mg, rendimento de 59%. Íons encontrados por LCMS: [(M + H)] + = 642,2.
Etapa c.
[001053] A uma solução em agitação do produto da etapa b (496 mg, 0,773 mmol), dipropargilamina (36 mg, 0,386 mmol), tris((1-benzil-4-
triazolil)metil)amina (41 mg, 0,077 mmol) e ascorbato de sódio (115 mg, 0,580 mmol) em etanol (16 mL) e água (8 mL), foi adicionado sulfato cúprico (13 mg, 0,081 mmol). Após a conclusão, o eliminador de cobre SiliaMetS TAAcONa (600 mg, carregando 0,45 mmol / g) foi adicionado e a agitação foi continuada por 1 h. A mistura foi filtrada com a ajuda de diclorometano. O filtrado foi lavado com uma solução saturada de bicarbonato de sódio. A camada aquosa foi adicionalmente lavada com diclorometano (3 vezes). Os orgânicos combinados foram secos com sulfato de magnésio, filtrados e todos os voláteis foram evaporados por técnicas de vácuo. A uma solução de agitação a 0°C do resíduo, propargil-PEG4-ácido (151 mg, 0,580 mmol)) e DIPEA (337 uL, 1,933 mmol) em DMF (10,0 mL), foi adicionado HATU (220 mg, 0,580 mmol) ) A temperatura foi elevada até a temperatura ambiente e a agitação continuou até à conclusão.
Todos os voláteis foram removidos por técnicas de vácuo. O resíduo foi purificado por HPLC (0 a 90% de metanol e água). Rendimento 457 mg, 73%.
Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2] + = 809,8, [(M + 2H - Boc) / 2] + = 759,8.
Etapa d.
[001054] Uma solução de agitação do composto da etapa c (451 mg, 0,279 mmol) em 2-metil-2-buteno (0,25 mL), diclorometano (4,0 mL) e TFA (2,0 mL) foi agitada até a evolução de gás cessar. Todos os voláteis foram removidos por técnicas de vácuo. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2] + = 609,8, [(M + 3H) / 3] + = 407,0 .. A uma solução com agitação a 0°C do resíduo em tetra-hidrofurano (6 mL) e água (6 mL), foi adicionado hidróxido de lítio (240 mg, 10,03 mmol). Após a conclusão, a reação foi extinta com ácido acético (0,638 mL, 11,14 mmol), e todos os voláteis foram removidos por técnicas de vácuo. O resíduo foi purificado por HPLC (0 a 90% de metanol e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 209 mg, 67%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2] + = 569,8, [(M + 2H - Boc) / 2] + = 380,3.
Exemplo 108. Síntese do Conjugado 30
[001055] Uma solução de Fc aglicosilado com azido funcionalizado (Exemplo 7, SEQ ID NO: 35) em solução tampão PBS x 1 de pH 7,4 (50 mg, 5 mL, 1,874 µmol) é adicionada a um tubo de centrífuga contendo uma solução tampão PBS x 1 de pH 7,4 (9,50 mL) de molécula pequena derivatizada de alquino (8,7 mg, 0,0064 mmol, Int-65), sulfato cúprico (2 mg, 0,013 mmol), tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina (22 mg, 0,0508 mmol) e ascorbato de sódio (25 mg, 0,127 mmol). A mistura resultante foi agitada suavemente durante a noite. Foi purificado por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (ver Exemplo 10). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 61548 Da (DAR = 2,4). Rendimento 32,33 mg, rendimento de 67%.
Exemplo 109: Síntese do intermediário p-nitrofenil carbonato zanamivir dimetóxi-propano Cat Lindar
Etapa a.
[001056] O intermediário triacetoxi-azido Zanamivir (10,0 g, 22 mmol) foi dissolvido em 60 ml de metanol seco, depois tratado com 20 ml de metóxido de sódio em metanol (0,5 M em metanol, 10 mmol) enquanto se resfriava em um banho de água gelada. O progresso da reação foi monitorado por LCMS que estava completo após 2 horas. O pH da solução de reação foi então ajustado para um valor de 5 a 6 usando resina de troca iônica Amberlite IRN-77. A mistura foi filtrada para remover a resina e evaporada até a secura sob vácuo. O óleo resultante foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M + H = 331,1.
Etapa b.
[001057] A uma solução dos produtos da etapa anterior em 70 ml de acetona foram adicionados 30 ml de 2,2-dimetoxipropano e ácido p- toluenossulfônico 1 hidratado (400 mg, 2,0 mmol), a solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. No final deste tempo, foi adicionado bicarbonato de sódio (170 mg, 2,0 mmol) e a mistura foi concentrada até a secura. O resíduo resultante foi usado na próxima etapa sem purificação.
Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M + H = 371,2.
Etapas c e d
[001058] A uma solução do material da etapa anterior em 60 ml de metanol foram adicionados 5,0 g de um catalisador de Lindlar. A mistura resultante foi borbulhada com hidrogênio a cada 30 minutos e agitada durante 5 horas. Após a reação completa, conforme determinado por HPLC, o catalisador foi filtrado através de celite. O filtrado foi concentrado e usado na etapa seguinte sem purificação.
[001059] O produto bruto da etapa anterior em 60 ml de THF foi tratado com N,N'-bis-boc-1-guanilpirazol (9,3 g, 30,0 mmol) e DIEA (9,9 ml, 57,0 mmol). A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente até que todo o material de partida fosse consumido conforme determinado por LCMS (4h). A solução foi concentrada e purificada por cromatografia flash eluída com 20% a 80% de acetato de etil / diclorometano. Rendimento de 8,8 g, 59,0% para quatro etapas. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M + H = 587,3.
Etapa e.
[001060] Um frasco de reação contendo o produto da etapa anterior (6,5 g, 11 mmol) foi lavado a vácuo com nitrogênio e dissolvido em diclorometano anidro (100 mL). Depois que a solução foi resfriada em um banho de água gelada, DMAP (4,89 g, 40 mmol) foi adicionado e agitado para dissolver, em seguida, 4-nitrofenilcloroformato (5,58 g, 28 mmol) foi adicionado em porções, enquanto se agitava a 0 ℃ até a temperatura ambiente durante 1 hora.
LCMS mostra material de partida 1 h, então DMAP adicional (1,22 g, 10 mmol) e 4-nitrofenilcloroformato (1,0 g, 5 mmol) foram adicionados. A reação foi continuada por mais 4 horas, em seguida, concentrada e purificada por cromatografia flash eluindo com 20% a 80% de acetato de etil / diclorometano.
Rendimento 5,1 g, 59,9%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 752,2.
Exemplo 110. Síntese de Int-71 Etapa a.
[001061] A uma solução de 2-(2-Boc-aminoetoxi)etanol (6,15 g, 30 mmol) em DCM anidro (60 ml) foi adicionado DIPEA (7,8 g, 60 mmol) e DMAP (366,6 mg, 3 mmol). Cloreto de P-toluenossulfonil (6,86 g, 36 mmol) foi então adicionado em porções ao longo de 30 minutos. Após a mistura resultante ter sido agitada durante 3 dias, foi concentrada por evaporação rotativa e purificada por RPLC (20% a 70% de acetonitrila / água). Rendimento 3,71 g, 34,4%. Íon encontrado por LCMS: [M -Boc + H]+ = 260.
Etapa b.
[001062] A uma solução do produto da etapa a (2,1 g, 5,83 mmol) em THF anidro (10 ml) foi adicionado carbonato de sódio (1,24 g, 11,7 mmol) e N-Boc-1,4-diaminobutano (1,32 g, 7 mmol). A mistura resultante foi aquecida a 60℃ durante 1 dia. O sal foi então removido por filtração e o filtrado foi concentrado por evaporação rotativa. O resíduo foi purificado por RPLC (100 g, 5 a 50% de acetonitrila e água). Rendimento 1,94 g, 88,6%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 376,0.
Etapa c.
[001063] A uma solução de ácido propargil PEG-4 (781 mg, 3 mmol) e HATU (1,14 g, 3 mmol) em DMF anidro (3 ml) foi adicionado DIPEA (390 mg, 3 mmol), seguido pela adição da solução do produto da etapa b (940 mg, 2,5 mmol) e DIPEA (390 mg, 3 mmol) em DMF anidro (3 mL). A mistura de reação foi agitada por 30 minutos, então diretamente purificada por RPLC (5% a 80% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento de 960,2 mg, 65,3%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 618,3, [M - Boc + H]+ = 518,3.
Etapa d.
[001064] O produto da etapa c (960,2 mg, 1,63 mmol) foi dissolvido em THF anidro (6 mL). Adicionou-se solução de HCl 4 N em dioxano (4 ml) e agitou-se a mistura de reação durante a noite. Em seguida, foi concentrada por evaporação rotativa. O resíduo foi extraído com água (3 x 3 ml) e acetato de etil (10 ml). As camadas aquosas combinadas foram liofilizadas.
Rendimento de 760 mg, 95,1%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 418,0.
Etapa e.
[001065] A uma mistura do produto da etapa d (556,2 mg, 1,13 mmol) e DIPEA (741 mg, 5,7 mmol) em DMF anidro (3 ml) foi adicionado em porções carbonato de p-nitrofenil de zanamivir (1,67 g, 2,26 mmol, descrito no Exemplo 109) ao longo de 20 minutos. A reação foi agitada durante 1 hora, depois diretamente purificada por RPLC (30% a 90% de acetonitrila / água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento de 1,35 g, 74%. Íon encontrado por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 807,9.
Etapa f.
[001066] O produto da etapa e (1,35 g, 0,836 mmol) foi dissolvido em TFA (5 mL). A reação foi aquecida a 30 ℃ durante 1 hora, foi diretamente purificada por RPLC (0% a 35% de acetonitrila / água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 1,00 g, 82,9%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 607,8.
Etapa g.
[001067] O produto da etapa f (1,00 g, 0,693 mmol) foi dissolvido em MeOH (12 mL), em seguida, resfriado em um banho de água gelada. Foi então tratada com uma solução de mono-hidrato de LiOH (286 mg, 6,6 mmol) em água (9 ml). A mistura resultante foi agitada durante a noite e depois acidificada com solução de HCl 4 N em dioxano (2 mL). Depois que os solventes orgânicos foram removidos por evaporação rotativa, o resíduo foi purificado por HPLC preparativa (Isco ACCQ prep, Luna 5 µm C18 (2) 100 Å LC coluna 100 mm x 30 mm; Gradiente: 0% acetonitrila / água por 2 min, depois 0% até 15% de acetonitrila / água ao longo de 12 min, então isocrático a 15% de acetonitrila por 10 min, usando 0,1% de TFA). Rendimento 275,9 mg, 29,2%.
Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 567,8, [(M + 3H) / 3]+ = 378,9.
Exemplo 111. Síntese do Conjugado 31
[001068] Um tubo de centrífuga estéril de 15 ml foi carregado com ascorbato de sódio (68,1 mg, 0,344 mmol), THPTA (14,9 mg, 0,0344 mmol), pequena molécula derivatizada de alquino (17,5 mg, 0,00953 mmol, descrito no Exemplo 110) e tampão PBS 7,4 (1 ml). Depois de agitado por vórtice para dissolver tudo, Peg 4 azido Fc (50 mg, 0,0008588 mmol, descrito no Exemplo 7 SEQ ID No. 18) foi adicionado seguido por uma solução de CuSO4 (2,05 mg, 0,0129 mmol) em PBS (0,5 ml). A mistura foi girada suavemente durante 20 horas, em seguida, purificada por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína-A, seguida por cromatografia de exclusão de tamanho. A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 63586 Da (DAR = 3,8). Rendimento 32,8 mg, rendimento de 66%.
Exemplo 112. Síntese de Int-72 Etapa a.
[001069] A uma solução de N-Boc-1,4-diaminobutano (1,56 g, 8,28 mmol) em DMF anidro (7 ml) foi adicionado carbonato de sódio (742 mg, 7 mmol) e 5-(Boc-amino)-1-pentilbrometo (1,73 g, 6,5 mmol). A mistura resultante foi aquecida a 50 ℃ por 24 horas. O sal foi então removido por filtração e o filtrado foi concentrado por evaporação rotativa. O resíduo foi purificado por RPLC (5% a 50% de acetonitrila/água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 2 g, 63,2%.
Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 374,4.
Etapa b.
[001070] A uma solução de ácido propargil PEG-4 (1,3 g, 5 mmol) e HATU (2,1 g, 5,5 mmol) em DMF anidro (6 mL) foi adicionado DIPEA (1,3 g, 10 mmol). Após 5 minutos, a mistura de reação foi adicionada ao produto da etapa a (2 g, 4,1 mmol) e agitada durante 1 hora. Foi então purificada diretamente por RPLC (5% a 80% de acetonitrila/água, usando 0,1% de TFA como modificador).
Rendimento 2,34 g, 95%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 616,4, [M - Boc + H]+ = 516,4.
Etapa c.
[001071] O produto da etapa b (2,34 g, 3,8 mmol) foi dissolvido em THF anidro (12 mL). Adicionou-se solução de HCl 4 N em dioxano (10 ml) e agitou-se a mistura de reação durante a noite. Em seguida, foi concentrada por evaporação rotativa. O resíduo foi redissolvido em acetonitrila / água (1:1, ~16 ml) e a solução foi liofilizada. O produto em bruto foi transportado para a etapa subsequente sem purificação adicional. Rendimento 1,91 g, rendimento quantitativo. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 416,4.
Etapa d.
[001072] A uma solução de carbonato de p-nitropenil de zanamivir (2,25 g, 3,05 mmol, descrito no Exemplo 109) em DCM anidro (3 mL) foi adicionada em porções uma mistura do produto da etapa c (610 mg, 1,249 mmol) e DIPEA (1,05 g, 8,1 mmol) em DMF anidra (4 ml) ao longo de 20 minutos. Após agitação durante 1 hora, a mistura de reação foi concentrada e purificada por RPLC (30% a 80% de acetonitrila / água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 1,73 g, 85,9%. Íon encontrado por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 806,8, [(M - Boc + 2H) / 2]+ = 756,8.
Etapa e.
[001073] O produto da etapa d (1,73 g, 1,073 mmol) foi dissolvido em TFA (5 mL). Depois que a solução foi aquecida a 30℃ por 3 horas, foi diretamente purificada por RPLC (0% a 35% de acetonitrila / água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 1,176 g, 76,1%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 606,8, [(M + 3H) / 3]+ = 405.
Etapa f.
[001074] O produto da etapa e (1,176 g, 0,817 mmol) foi dissolvido em MeOH (12 mL) e a solução foi resfriada em um banho de água gelada. Foi tratado gota a gota com uma solução de mono-hidrato de LiOH (344,4 mg, 8,2 mmol) em água (9 ml). A mistura resultante foi agitada durante a noite e depois acidificada com solução de HCl 4 N em dioxano (2 mL). Depois que os solventes orgânicos foram removidos por evaporação rotativa, o resíduo foi purificado por HPLC preparativa (Isco ACCQ prep, Luna 5 µm C18 (2) 100 Å LC coluna 100 mm x 30 mm; Gradiente: 0% acetonitrila / água por 2 min, depois 0% até 15% de acetonitrila / água ao longo de 12 min, então isocrático a 15% de acetonitrila por 10 min, usando 0,1% de TFA). Rendimento 108 mg, 9,7%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 566,8, [(M + 3H) / 3]+ = 378,2.
Exemplo 113. Síntese do Conjugado 32
[001075] Um tubo de centrífuga estéril de 15 ml foi carregado com ascorbato de sódio (68,1 mg, 0,344 mmol), THPTA (14,9 mg, 0,0344 mmol), produto do Exemplo 112, Int-72 (17,5 mg, 0,00953 mmol) e PBS 7,4 (1 ml). Depois de agitação por vórtice para dissolver tudo, azido Fc (50 mg, 0,0008588 mmol, descrito no Exemplo 7 com SEQ ID NO: 4) foi adicionado seguido por uma solução de CuSO4 (2,05 mg, 0,0129 mmol) em PBS (0,5 ml). A mistura foi girada durante 20 horas. Foi purificado por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho. A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 63588. Da (DAR = 3,8). Rendimento de 30,9 mg, rendimento de 62%.
Exemplo 114. Síntese de Int-73
Etapa a.
[001076] A uma solução do carbonato de p-nitrofenil de zanamivir (698,4 mg, 0,95 mmol, descrito no Exemplo 109) em DCM anidro (2 ml) foi adicionado em porções ao longo de 10 minutos uma mistura de ligante central de propargil diamina (209 mg, 0,426 mmol, descrito no Exemplo 110) e DIPEA (330,8 mg, 2,56 mmol) em DMF anidra (2 mL). A reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. Foi então concentrado e purificado por RPLC (30% a 85% de acetonitrila/água, sem modificador de TFA). Rendimento 531 mg, 69,2%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 807,8, [(M - Boc + 2H) / 2]+ = 757,8.
Etapa b.
[001077] O produto da etapa b (531 mg, 0,329 mmol) foi dissolvido em DCM (1,5 mL) e TFA (1,5 mL) e, em seguida, agitado a 35 ℃ durante 3 horas. Foi concentrado e purificado por RPLC (5% a 30% de acetonitrila/água, sem modificador de TFA). Rendimento 387 mg, 97,1%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 607,6, [(M + 3H) / 3]+ = 405,4.
Etapa c.
[001078] O produto da etapa b (121,4 mg, 0,1 mmol) foi dissolvido em solução de NaCl 1,0 M (3 ml) e acetonitrila (1 ml). Depois que a solução foi resfriada a -8 ℃ (banho de sal / gelo), NaOH 1,0 M (0,4 ml, 0,4 mmol) foi adicionado gota a gota e a reação foi agitada a -14 ℃ a -8 ℃ por 6 horas. Foi então neutralizada com 4N HCl em solução de dioxano (100 µl) e diretamente purificada por HPLC preparativa (Isco ACCQ prep, Luna 5 µm C18 (2) 100 Å LC coluna 100 mm x 30 mm; Gradiente: 0% acetonitrila / água por 2 min, então 0% a 17,8% de acetonitrila / água ao longo de 12 min, então isocrático a 17,8% de acetonitrila por 10 min, usando 0,1% de TFA). Rendimento 85,5 mg, 62,8%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 567,8, [(M + 3H) / 3]+ = 378,9.
Exemplo 115. Síntese de Int-74
Etapa a.
[001079] A uma solução de N-Boc-2-(2-amino-etoxi)etilamina (1,2 g, 5 mmol) em DMF anidro (5 ml) foi adicionado carbonato de sódio (691 mg, 5 mmol) e N-Boc-6- bromo-hexilamina (1,4 g, 5 mmol). A mistura resultante foi aquecida a 70 ℃ por 24 horas. O sal foi então removido por filtração e o filtrado foi concentrado por evaporação rotativa. O resíduo foi purificado por RPLC (5% a 50% de acetonitrila/água, usando 0,1% de TFA como modificador).
Rendimento 444 mg, 22%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 404,3.
Etapa b.
[001080] A uma solução de ácido propargil PEG-4 (342,6 mg, 1,32 mmol) e HATU (601,5 mg, 1,58 mmol) em DMF anidro (2 ml) foi adicionado DIPEA (258 mg, 2 mmol). Após 5 minutos, a mistura de reação foi adicionada ao produto da etapa a (444,3 mg, 0,858 mmol) e agitada durante 1 hora. Foi então purificada diretamente por RPLC (5% a 80% de acetonitrila/água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento de 297,1 mg, 53,6%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 646,2, [M - Boc + H]+ = 546,2.
Etapa c.
[001081] O produto da etapa b (297,1 mg, 0,46 mmol) foi dissolvido em THF anidro (2 mL). Adicionou-se solução de HCl 4 N em dioxano (4 ml) e agitou-se a mistura de reação durante a noite. Foi então concentrado por evaporação rotativa e purificado por HPLC preparativa (5% a 50% de acetonitrila / água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento de 239,6 mg, 77,3%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 446,2.
Etapa d.
[001082] A uma solução do carbonato de p-nitrofenil de zanamivir (523,8 mg, 0,71 mmol, descrito no Exemplo 2) em DCM anidro (2 ml) foi adicionada em porções ao longo de 10 minutos uma mistura do produto da etapa c (239,6 mg, 0,356 mmol) e DIPEA (245,5 mg, 1,9 mmol) em DMF anidra (2 mL). A reação foi agitada à temperatura ambiente por 1 hora. Foi então concentrado e purificado por RPLC (30% a 85% de acetonitrila/água, sem modificador de TFA). Rendimento 553 mg, 96,5%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 821,8, [(M - Boc + 2H) / 2]+ = 771,8.
Etapa e.
[001083] O produto da etapa d (553 mg, 0,343 mmol) foi dissolvido em DCM (1,5 mL) e TFA (1,5 mL) e, em seguida, agitado a 35 ℃ durante 3 horas. Foi concentrado e purificado por RPLC (5% a 30% de acetonitrila/água, sem modificador de TFA). Rendimento de 424,6 mg, 99,6%.
Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 621,6, [(M + 3H) / 3]+ = 415,0.
Etapa f.
[001084] O produto da etapa e (424,6 mg, 0342 mmol) foi dissolvido em solução de NaCl 1,0 M (4 ml) e acetonitrila (4 ml). Depois que a solução foi resfriada a -11 ℃ (banho de sal / gelo), NaOH 1,0 M (1,53 ml, 1,53 mmol) foi adicionado gota a gota e a reação foi agitada a -14℃ to -8℃ por 6 horas. Foi então extinta com 4N HCl em solução de dioxano (375 µl) e diretamente purificada por HPLC preparativa (Isco ACCQ prep, Luna 5 µm C18 (2) 100 Å LC coluna 100 mm x 30 mm; Gradiente: 0% acetonitrila / água por 2 min, então 0% a 20,9% de acetonitrila / água ao longo de 13,6 min, então isocrático a 20,9% de acetonitrila por 10 min, usando 0,1% de TFA). Rendimento 439 mg, 92,3%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 581,8, [(M + 3H) / 3]+ = 388,2.
Exemplo 116. Síntese de Int-75
Etapa a.
[001085] Uma mistura de terc-butil (4-oxobutil) carbamato (850 mg, 4,54 mg) e terc-butil N-{2-[2-(2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl} carbamato (1,99 g, 8 mmol) foi dissolvida em DCM (30 ml) e seca sobre Na2SO4. Após filtração e concentração, o resíduo foi redissolvido em DCM anidro (20 ml). Foi adicionado ácido acético (641 mg, 11 mmol), seguido por triacetoxiboro-hidreto de sódio (3,4 g, 16 mmol) em porções ao longo de 1 hora. A mistura de reação foi agitada durante a noite, então extinta com AcOH (3 mL) e MeOH (10 mL). A mistura foi filtrada e o filtrado foi concentrado por evaporação rotativa e purificado por RPLC (5% a 45% de acetonitrila e água). Rendimento 618 mg, 32,5%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 420,4.
Etapa b.
[001086] Este composto foi preparado analogamente ao produto da etapa b do Exemplo 115. Íons encontrados por LCMS: [M + H] + = 662,4, [M - Boc + H] + = 562,4.
Etapa c.
[001087] Este composto foi preparado analogamente ao produto da etapa c do Exemplo 115. Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 462,4.
Etapa d.
[001088] Este composto foi preparado analogamente ao produto da etapa d do Exemplo 115. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 829,8, [(M - Boc + 2H) / 2]+ = 779,8.
Etapa e.
[001089] Este composto foi preparado analogamente ao produto da etapa e do Exemplo 115. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 629,8, [(M + 3H) / 3]+ = 420,2.
Etapa f.
[001090] Este composto foi preparado analogamente ao produto da etapa f do Exemplo 115. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2] + = 598,8, [(M + 3H) / 3]+ = 393,6.
Exemplo 117. Síntese de Int-76
Etapa a.
[001091] A uma solução do tosilato de N-Boc-peg-1 (1,54 g, 4,28 mmol, descrito no Exemplo 110) em THF anidro (8 mL) foi adicionado terc- butil N-2{2-[2-(2-aminoethoxy) ethoxy] ethyl} carbamato (1,59 g, 6,42 mmol) e carbonato de sódio (453,7 mg, 4,28 mmol). A mistura resultante foi aquecida a 50 ℃ por 24 horas. O sólido foi filtrado e lavado com acetonitrila. O filtrado foi concentrado e purificado por RPLC (100 g, 5 a 90% de acetonitrila e água).
Rendimento 1,15 g, 61,7%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 436,4.
Etapa b.
[001092] Este composto foi preparado analogamente ao produto da etapa b do Exemplo 115. Íons encontrados por LCMS: [M + H]+ = 678,2, [M - Boc + H]+ = 578,2.
Etapa c.
[001093] Este composto foi preparado analogamente ao produto da etapa c do Exemplo 115. Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 478,2.
Etapa d.
[001094] Este composto foi preparado analogamente ao produto da etapa d do Exemplo 115. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 837,6, [(M - Boc + 2H) / 2]+ = 767,8.
Etapa e.
[001095] Este composto foi preparado analogamente ao produto da etapa e do Exemplo 115. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2] + = 637,5, [(M + 3H) / 3]+ = 425,6.
Etapa f.
[001096] Este composto foi preparado analogamente ao produto da etapa f do Exemplo 115. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 597,8, [(M + 3H) / 3]+ = 399,0.
Exemplo 118 Síntese de Int-67
Etapa a.
[001097] O material de partida ácido de éter zanamivir previamente preparado (0,90 g, 1,43 mmol, descrito no Exemplo 22) e N-metil morfolina (0,23 mL, 2,14 mmol) foram dissolvidos em THF (35 mL) e resfriados a 0°C (banho de água gelada) sob uma atmosfera de nitrogênio. Cloroformato de isobutil (0,24 mL, 1,85 mmol, em 2 mL de DCM) foi adicionado gota a gota, por meio de uma seringa ao longo de um período de 5 minutos. A mistura foi agitada a 0°C por 30 minutos, em seguida, 15 min à temperatura ambiente e, em seguida, resfriada a 0°C, onde boro-hidreto de sódio (540 mg, 14,3 mmol, dissolvido em 5 mL de metanol) foi adicionado, gota a gota durante 5 minutos. A reação foi agitada durante 15 minutos, ponto em que todo o material de partida tinha sido consumido (por LC / MS). Algumas gotas (~ 1 mL) de ácido acético glacial foram adicionadas para acidificar a mistura (pH ~ 5). A mistura foi diluída com acetato de etil e água e extraída em acetato de etil (3x). Lavou-se a camada orgânica com salmoura e secou-se os extratos orgânicos sobre sulfato de sódio e concentrou-se no evaporador rotativo. O material em bruto foi purificado por cromatografia em gel de sílica, seco em celite primeiro e, em seguida, eluído com 0% -10% de metanol em DCM ao longo de 30 min. Rendimento 0,66 g, 75%. Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 617,2.
Etapa b.
[001098] A uma mistura agitada de produto da etapa anterior
(0,66 g, 1,10 mmol), em 20 mL de DCM, foi adicionada trietilamina (0,30 mL, 1,3 mmol). A mistura foi resfriada a 0°C (banho de água gelada) sob uma atmosfera de nitrogênio e depois tratada com cloreto de mesil (0,15 g, 1,3 mmol), gota a gota durante 5 minutos por meio de seringa. O banho de gelo foi removido e a reação foi agitada durante 45 minutos. A reação foi extinta com bicarbonato de sódio aquoso saturado e, em seguida, extraída para DCM (3x). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos sobre sulfato de sódio e concentrados no evaporador rotativo. Rendimento 0,74 g, 99%. Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 695,2. O intermediário foi levado para a próxima etapa sem purificação.
Etapa c.
[001099] O mesilato da etapa anterior (0,74 g, 1,1 mmol) foi agitado em DMF (5 mL) a 80°C com 3 eq de azida de sódio (0,21 g, 3,3 mmol) durante 5 horas. A mistura foi diluída com água, extraída em DCM (3x). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos sobre sulfato de sódio e concentrados. Rendimento 0,67 g, 95%. Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 642,4. A azida foi levada para a próxima etapa sem purificação.
Etapa d.
[001100] A azida da etapa anterior (0,67 g, 1,04 mmol) foi agitada em metanol (20 mL) na presença de catalisador de Lindlar (300 mg) sob
1 atmosfera de gás hidrogênio durante 12 horas. A mistura foi filtrada através de celite e concentrada para proporcionar o composto do título como um óleo transparente. A amina foi levada para a próxima etapa sem purificação.
Rendimento 0,37 g, 54%, 3 etapas. Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 616,2.
Etapa e.
[001101] EDC (150 mg, 0,78 mmol) foi adicionado a uma solução em agitação de amina da etapa anterior (370 mg, 0,60 mmol), ácido propargil-peg4-carboxílico (188 mg, 0,72 mmol) e trietilamina (0,100 mL, 0,72 mmoL), dissolvido em DMF (4mL). A reação foi agitada durante 2 horas à temperatura ambiente, em seguida purificada diretamente RPLC (10% -95% de acetonitrila / água, sem modificador, gradiente de 30 minutos). As frações puras foram reunidas e liofilizadas e levadas diretamente para a próxima etapa.
Rendimento 490 mg, 80%. Íon encontrado por LC / MS: [M + H]+ = 858,2 Etapa f.
[001102] O produto da etapa anterior (490 mg, 0,57 mmol) foi agitado em TFA (4 mL) durante 45 minutos, em seguida, concentrado e azeotropado com metanol (3x) no evaporador rotativo. Íon encontrado por LC / MS: [M + H]+ = 658,2. O resíduo foi agitado em 1/1 metanol / água contendo LiOH (43 mg, 1,8 mmol) durante 30 minutos. A reação foi neutralizada com algumas gotas de ácido acético glacial e o volume foi reduzido pela metade no evaporador rotativo. O produto em bruto foi purificado por HPLC semi-
preparativa (0% -75% de acetonitrila / água, 0,1% de TFA, gradiente de 30 minutos). As frações puras foram reunidas e liofilizadas para proporcionar o composto do título. Rendimento de 105 mg, 29%, 3 etapas. Íon encontrado por LC / MS: [M + H]+ = 618,2.
Exemplo 119. Síntese de Int-68 Etapa a.
[001103] Cloroformato de p-nitrofenil (0,23 g, 1,14 mmol) foi adicionado a uma mistura de agitação do álcool primário (0,47 g, 0,76 mmol descrito no Exemplo 118) e trietilamina (0,21 mL, 1,52 mmol) dissolvido em DCM (15 mL, anidro). A reação foi agitada durante 1 hora, em seguida, trimetilamina adicional (0,21 mL) e cloroformato de p-nitrofenil (230 mg) foram adicionados, e a agitação foi continuada por mais uma hora, momento em que a mistura foi diluída com água e extraída em DCM (3x). Os extratos orgânicos combinados foram lavadas com salmoura e secos sobre sulfato de sódio. O solvente foi removido por evaporação rotativa. O resíduo bruto foi dissolvido em DCM (3 mL), carregado em celite e purificado por cromatografia em gel de sílica (0% a 70% de acetato de etil / hexanos, gradiente de 30 minutos). As frações puras foram reunidas e concentradas para proporcionar o composto do título como um sólido branco. Rendimento de 525 mg, 88%. Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 782,2.
Etapa b.
[001104] Trietilamina (0,14 mL, 0,97 mmol) foi adicionada a uma solução em agitação de propargil-peg4-amina (181 mg, 0,78 mmol) em 1 mL de acetonitrila. A mistura de trietilamina / propargil-peg4-amina foi adicionada ao produto da etapa anterior (510 mg, 0,65 mmol, em 2 mL de acetonitrila) e agitada durante 1 hora, ponto em que todos os materiais de partida foram consumidos. O solvente foi removido em um evaporador rotativo. O resíduo bruto foi purificado por RPLC (20-95% de acetonitrila / água, gradiente de 30 min, sem modificador). Rendimento 475 mg, 83%. Íon encontrado por LC / MS: [M + H]+ = 874,2.
Etapa c.
[001105] O produto da etapa anterior (475 mg, 0,54 mmol), foi agitado em TFA (5 mL) durante 2 horas e, em seguida, concentrado e azeotropado com metanol (3x) em um evaporador rotativo. Íon encontrado por LC / MS: [M + H]+ = 674,2. O resíduo foi agitado em uma mistura 1:1 de metanol / água contendo LiOH (49 mg, 1,6 mmol) durante 30 minutos. A reação foi neutralizada com ácido acético glacial e depois concentrada por evaporação rotativa. O produto foi purificado por HPLC semi-preparativa (0% -75% de acetonitrila / água, 0,1% de TFA, gradiente de 30 minutos). As frações puras foram reunidas e liofilizadas. Rendimento 204 mg, 59%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 634,2.
Exemplo 120 Síntese de Int-77 Etapa a.
[001106] HATU (0,44 g, 1,16 mmol, em 1,5 mL de DMF) foi adicionado gota a gota a uma solução em agitação de propargil-peg4-amina (0,24 g, 1,05 mmol), bis-Boc-D-ornitina (0,35 g, 1,05 mmol), e trietilamina (0,59 mL, 4,21 mmol) em DMF (2 mL). A reação foi agitada durante 1 hora à temperatura ambiente, depois purificada diretamente por RPLC (5% -90% de acetonitrila / água, 0,1% de TFA, gradiente de 35 minutos). As frações puras foram reunidas e liofilizadas para proporcionar o produto como um óleo transparente viscoso. Íon encontrado por LC / MS: [M + H]+ = 546,2
[001107] O intermediário protegido com Boc foi agitado em HCL 4N em dioxano (10 mL) durante 45 minutos à temperatura ambiente. O solvente foi removido por evaporação rotativa, então o resíduo resultante foi dissolvido em água DI (20 mL), congelado e liofilizado para fornecer o produto como um óleo transparente. Rendimento 310 mg, 70%, 2 etapas. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 346,2.
Etapa b.
[001108] O produto da etapa anterior (96 mg, 0,28 mmol) e trietilamina (0,15 mL, 1,11 mmol) em acetonitrila (2 mL) foram adicionados a uma solução de agitação de carbonato de p-nitrofenil de zanamivir (435 mg, 0,56 mmol, descrito no Exemplo 118, em 6 mL de acetonitrila), e agitado durante 12 horas à temperatura ambiente, depois 2 horas a 80°C. O solvente foi removido e o resíduo bruto foi purificado por RPLC (10-95% de acetonitrila / água, sem modificador, gradiente de 35 minutos). As frações puras foram reunidas e concentradas em um evaporador rotativo. Íon encontrado por LC / MS: [(M + 2H) / 2]+ = 815,8
[001109] Este intermediário foi agitado em TFA (5 mL) durante 45 minutos, em seguida, concentrado e seco sob alto vácuo. Íon encontrado por LC / MS [(M + 2H) / 2]+ = 615,8.
[001110] Este sal de TFA foi agitado em (1/1) MeOH / água DI (5 mL) contendo LiOH (27 mg, 1,11 mmol) durante 30 minutos a 0°C. A mistura foi acidificada (~ pH ~ 5) com ácido acético glacial. O metanol foi removido por evaporação rotativa e o resíduo resultante foi purificado por HPLC semi- preparativa (5% -70% de acetonitrila / água, 0,1% de TFA, gradiente de 35 minutos). As frações puras foram reunidas e liofilizadas. Rendimento 35 mg, 11%, 3 etapas. Íon encontrado por LC / MS: [(M + 2H) / 2]+ = 575,8.
Exemplo 121. Síntese de Int-78
Etapa a.
[001111] Propargil-Peg4-ácido (640 mg, 2,46 mmol),sal diol- HCl (350 mg, 2,46 mmol), EDC (471 mg, 2,46 mmol), HOBt (377 mg, 2,46 mmol) e trietilamina (249 mg, 2,46 mmol) foram agitados em DMF (3 mL) à temperatura ambiente durante 4 horas. A mistura foi purificada diretamente por RPLC (0% - 80% de acetonitrila / água, sem modificador, gradiente de 35 minutos). As frações puras foram reunidas e concentradas para proporcionar o produto como um óleo transparente. Rendimento 580 mg, 68%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 348,4.
Etapa b.
[001112] Cloroformato de p-nitro-fenil (1,23 g, 1,25 mmol) foi adicionado a uma solução em agitação do produto da etapa anterior (530 mg, 6,10 mmol) e trietilamina (925 mg, 9,15 mmol) em DCM (25 mL), depois resfriado a 0°C sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi agitada durante 15 minutos a 0°C e depois à temperatura ambiente durante 2 horas. A reação foi diluída com água DI e extraída para DCM (3 x 20 mL). Os extratos orgânicos combinados foram lavadas com salmoura e secos sobre sulfato de sódio. O resíduo bruto foi purificado por cromatografia em gel de sílica (10% -100% acetato de etil / hexanos, gradiente de 25 minutos) para fornecer o produto como um sólido branco. Rendimento, 250 mg, 24%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 678,2.
Etapa c.
[001113] Zanamivir funcionalizado com amina (505 mg, 0,82 mmol, descrito no Exemplo 118) e trietilamina (0,15 mL, 1,11 mmol) em acetonitrila (2 mL) foram adicionados a uma solução de agitação do produto da etapa anterior (220 mg, 0,37 mmol) em acetonitrila (10 mL) e agitados durante 4 horas à temperatura ambiente. A reação foi concentrada no evaporador rotativo. O resíduo resultante foi purificado por RPLC (15% -95% de acetonitrila / água, sem modificador, gradiente de 35 minutos). As frações puras foram reunidas e concentradas em um evaporador rotativo. Íon encontrado por LC / MS: [(M + 2H) / 2]+ = 815,2.
[001114] Este intermediário foi agitado em TFA (5 mL) durante 45 minutos, em seguida, concentrado e seco sob alto vácuo. Íon encontrado por LC / MS: [(M + 2H) / 2]+ = 615,2.
[001115] Este sal de TFA resultante foi agitado em (1/1) MeOH / água DI (5 mL) contendo LiOH (71 mg, 2,98 mmol) durante 30 minutos a 0°C. A mistura foi acidificada (~ pH ~ 5) com ácido acético glacial. O metanol foi removido por evaporação rotativa e purificado por HPLC semi-preparativa (5% -
70% de acetonitrila / água, 0,1% de TFA, gradiente de 35 minutos). As frações puras foram reunidas e liofilizadas. Rendimento 125 mg, 29% para 3 etapas. Íon encontrado por LC / MS: [(M + 2H) / 2]+ = 575,8.
Exemplo 122. Síntese de Int-4a Etapa a.
[001116] Propargil-Peg 4-amina (165 mg, 0,71 mmol) foi adicionada a uma solução em agitação de carbonato de p-nitrofenil de zanamivir (350 mg, 0,47 mmol, descrito no Exemplo 109) em acetonitrila (20 mL). A reação foi agitada durante 1 hora à temperatura ambiente, em seguida o solvente foi removido por evaporador rotativo. O resíduo foi purificado por RPLC (10% -95% de acetonitrila / água, sem modificador, gradiente de 30 minutos). As frações puras foram reunidas e liofilizadas para proporcionar o intermediário protegido com boc como um sólido branco. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 830,2.
[001117] Este intermediário foi agitado em TFA (5 mL) à temperatura ambiente durante 30 minutos. O solvente foi removido por evaporador rotativo e o resíduo foi purificado por RPLC (10% -95% de acetonitrila / água, 0,1% de TFA, gradiente de 30 minutos). As frações puras foram reunidas e liofilizadas para proporcionar o produto como um sólido branco.
Rendimento 155 mg, 52%, 2 etapas. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 630,2.
Etapa b.
[001118] O produto da etapa anterior (140 mg, 0,22 mmol) foi agitado em uma mistura 1:3 de metanol:água (8 mL) contendo LiOH (21 mg, 0,89 mmol) a 0°C durante 20 minutos. A mistura foi acidificada com algumas gotas de ácido acético glacial e concentrada no evaporador rotativo. O material bruto foi purificado por HPLC semi-preparativa (5% -95% de acetonitrila / água, 0,1% de TFA, gradiente de 30 minutos). As frações puras foram reunidas e liofilizadas para proporcionar o produto como um sólido branco. Rendimento 60 mg, 45%.
Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 590,2. 1H NMR (500 MHz, Metanol-d4) δ 5,86 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 4,99 (dd, J = 9,0, 2,7 Hz, 1H), 4,55 (dd, J = 9,7, 2,7 Hz, 1H) , 4,38 (dd, J = 8,6, 2,6 Hz, 1H), 4,24 - 4,14 (m, 1H), 4,19 (d, J = 2,6 Hz, 2H), 4,02-3,98 (m, 1H), 3,74 - 3,59 (m , 13H), 3,54 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 3,52-3,48 (m, 1H), 3,29-3,22 (m, 2H), 2,84 (t, J = 2,4 Hz, 1H), 1,96 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, MeOD) δ 172,33, 163,68, 157,54, 156,58, 106,80, 79,23, 75,91, 74,56, 70,18, 70,13, 69,96, 69,87, 69,59, 69,51, 69,14, 68,74, 62,98, 57,67, 51,11, 40,54, 21,37.
Exemplo 123. Síntese de Int-4b
[001119] O intermediário funcionalizado Peg (100 mg, 0,13 mmol, descrito no Exemplo 122) foi agitado em uma mistura 1:3 de metanol:água
(5 mL) contendo LiOH (12 mg, 0,52 mmol) à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura foi acidificada com ácido acético glacial e concentrada em evaporador rotativo. O material bruto foi purificado por RPLC (5-95% de acetonitrila em água DI, 0,1% de TFA, gradiente de 30 minutos).As frações puras foram reunidas e liofilizadas para proporcionar o produto como um sólido branco.
Rendimento 21 mg, 31%. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 590,2. 1H NMR (Metanol-d4) δ: 5,86 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 4,48 (dd, J = 8,6, 2,7 Hz, 1H), 4,42 (dd, J = 9,6, 1,4 Hz, 1H), 4,38 (d, J = 12 Hz, 1H), 4,22 - 4,19 (m, 1H), 4,19 (d, J = 2,4 Hz, 2H), 4,16-4,12 (dd, J = 11,5, 6 Hz, 1H), 4,09 - 4,02 (m, 1H), 3,75 - 3,58 (m, 13H), 3,55 (t, J = 5,5 Hz, 2H), 3,33-3,29 (m, 2H), 2,84 (t, J = 2,4 Hz, 1H), 2,02 (s, 3H). 13C NMR (126 MHz, MeOD) δ 172,94, 163,82, 157,90, 157,53, 106,80, 79,23, 76,18, 74,55, 70,19, 70,13, 69,96, 69,90, 69,61, 68,96, 68,74, 68,17, 66,69, 57,67, 50,11, 40,43, 21,33 .
Exemplo 124. Procedimento geral para síntese de azido Fc
[001120] Preparação de solução de éster PEG4-azidoNHS (0,050 M) em DMF / PBS: 16,75 mg de éster NHS PEG4-azido foi dissolvido em 0,100 mL de DMF a 0°C e diluído para 0,837 mL pela adição de tampão PBS 1x a 0°C . Esta solução foi usada para preparar outro PEG4-azido Fc com uma variedade de valores DAR ajustando os equivalentes desta solução de PBS éster NHS de PEG4-azido.
[001121] Pré-tratamento de h-lgG1 Fc, SEQ ID NO: 48 (107,2 mg em 8,800 mL de PBS de pH 7,4, MW ~ 57891 Da, 1,852 μmol): A solução de Fc foi transferida para quatro concentradores centrífugos (30.000 MWCO, 15 mL) e diluída para 15 mL com tampão PBS x1 e concentrada para um volume de ~ 1,5 mL. O resíduo foi diluído 1:10 em PBS pH 7,4 e concentrado novamente. Este procedimento de lavagem foi repetido por um total de quatro vezes seguido por diluição para 8,80 mL.
[001122] Preparação de PEG4-azido Fc: 0,050M PEG4- azidoNHS éster PBS solução tampão (0,593 mL, 29,6 μmol, 16 equivalentes) foi adicionado à solução acima de h-IgG1 Fc (SEQ ID NO: 48) e a mistura foi agitada e girada por 2 horas à temperatura ambiente. A solução foi concentrada usando quatro concentradores centrífugos (30.000 MWCO, 15 mL) para um volume de ~ 1,5 mL. A mistura bruta foi diluída 1:10 em PBS pH 7,4 e concentrada novamente. Este procedimento de lavagem foi repetido por um total de três vezes. A Fc-PEG4-azida concentrada foi diluída para 8,80 mL com tampão PBS pH 7,4 e pronta para a conjugação de Clique. O material purificado foi quantificado usando um espectrofotômero visível NANODROP™ UV (usando um coeficiente de extinção calculado com base na sequência de aminoácidos de h-IgG1). O rendimento foi quantitativo após a purificação.
Exemplo 125. Síntese do Conjugado 34
[001123] Uma solução de Fc funcionalizada com azido (40 mg, 2,5 mL, 0,69 µmol, descrita na preparação geral de Fc de azido, Exemplo 124, SEQ ID No. 18) foi adicionada a um tubo de centrífuga de 15 mL contendo molécula pequena derivatizada de alquino (6,0 mg , 8,23 µmol, Int-67, Exemplo 118). Após agitação suave para dissolver todos os sólidos, a mistura foi adicionada a uma solução de sal de sódio de ácido L-ascórbico (54 mg, 0,27 mmol), sulfato de cobre (II) (0,88 mg, 5,5 µmol) e BTTA (9,4 mg, 22 µmol) em tampão PBS 7,4 (1,09 mL). A mistura resultante foi suavemente girada durante a noite. Foi então purificada por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (Ver protocolo geral de purificação de conjugado). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 64.678 Da (DAR = 7,2). Rendimento de 24 mg, rendimento de 54%. Exemplo 126. Síntese do Conjugado 35
[001124] Uma solução de Fc funcionalizada com azido (40 mg,
2,5 mL, 0,69 µmol, descrita na preparação geral de Fc de azido, Exemplo 124, SEQ ID No. 18) foi adicionada a um tubo de centrífuga de 15 mL contendo molécula pequena derivatizada de alquino (6,1 mg , 8,23 µmol, Int-68, Exemplo 119). Após agitação suave para dissolver todos os sólidos, a mistura foi adicionada à solução de sal de sódio de ácido L-ascórbico (54 mg, 0,27 mmol), sulfato de cobre (II) (0,88 mg, 5,5 µmol) e BTTA (9,4 mg, 22 µmol) em tampão PBS 7,4 (1,09 mL). A solução resultante foi suavemente girada durante a noite.
Foi então purificada por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (Ver protocolo geral de purificação de conjugado). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 64.830 Da (DAR = 7,3). Rendimento 23 mg, rendimento de 52%.
Exemplo 127. Síntese do Conjugado 36
[001125] Uma solução de Fc funcionalizada com azido (50 mg, 2,5 mL, 0,86 µmol, descrita na preparação geral de Fc de azido, Exemplo 124, SEQ ID No. 18) foi adicionada a um tubo de centrífuga de 15 mL contendo molécula pequena derivatizada de alquino (7,1 mg, 5,2 µmol, Int-77, Exemplo 120). Após agitação suave para dissolver todos os sólidos, a mistura foi adicionada a uma solução de sal de sódio de ácido L-ascórbico (68 mg, 0,34 mmol), sulfato de cobre (II) (1,1 mg, 6,9 µmol) e BTTA (12 mg, 27 µmol) em tampão PBS 7,4 (1,37 mL). A mistura resultante foi suavemente girada durante a noite. Foi então purificada por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (Ver protocolo geral de purificação de conjugado). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 63.300 Da (DAR = 3,6). Rendimento 37 mg, rendimento de 73%. Exemplo 128. Síntese do Conjugado 37
[001126] Uma solução de Fc funcionalizado com azido (70 mg,
2,5 mL, 1,2 µmol, descrito na preparação geral de Fc azido, Exemplo 124, SEQ ID No. 18) foi adicionada a um tubo de centrífuga de 15 mL contendo molécula pequena derivatizada com alquino (13,3 mg , 9,6 µmol, Int 78, Exemplo 121).
Após agitação suave para dissolver todos os sólidos, a mistura foi adicionada a uma solução de sal de sódio de ácido L-ascórbico (96 mg, 0,48 mmol), sulfato de cobre (II) (1,6 mg, 10 µmol) e BTTA (17 mg, 38 µmol) em tampão PBS 7,4 (1,92 mL). A mistura resultante foi agitada suavemente durante a noite. Foi então purificada por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (Ver protocolo geral de purificação de conjugado). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 63.574 Da (DAR = 3,6). Rendimento 42 mg, rendimento de 61%.
Exemplo 129. Síntese do Conjugado 33
[001127] Preparação da solução de reagente de Clique: 0,0050M de CuSO4 em solução tampão PBS: 10,0 mg de CuSO4 foi dissolvido em 12,53 mL de PBS, em seguida, tomou 5,00 mL desta solução de CuSO4 e adicionou-se 43,1 mg de BTTAA (CAS # 1334179-85-9) e 247,5 mg de ascorbato de sódio para dar a solução reagente de Clique (0,0050 M de CuSO4, 0,020 M de BTTAA e 0,25 M de ascorbato de sódio).
[001128] A uma solução de Fc funcionalizado com azido (104,9 mg, 8,60 mL, 18,1 µmol; Exemplo 124, SEQ ID NO: 64) em um tubo de centrífuga de 15 mL foi adicionado a molécula pequena derivatizada de alquino (29,7 mg, 19,9 μmol, descrito no Exemplo 100 , 2,5 equivalentes para cada azido no Fc). Após agitação suave para dissolver todos os sólidos, a mistura foi tratada com a solução de reagente de Clique (4,34 mL) de (ácido L-ascórbico de sódio, 0,25 M, 1086 μmol, sulfato de cobre (II) 0,0050 M, 21,7 μmol e BTTAA 0,020M, 86,9 μmol). A mistura resultante foi girada suavemente durante 6 horas à temperatura ambiente. Foi purificada por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (ver protocolo geral de purificação de conjugado). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 64550 Da (DAR = 4,6). Rendimento 90,7 mg com pureza de 98%.
Exemplo 130. Eficácia do Conjugado 33 contra Influenza B / Brisbane / 60/2008 em um modelo letal de camundongo
[001129] Os artigos de teste foram avaliados contra uma infecção letal por Influenza B em camundongos BALB / c fêmeas (Jackson Laboratories, 6-8 semanas de idade). O vírus de desafio (B/Brisbane/60/2008) é um isolado adaptado a camundongos capaz de causar infecções letais em camundongos. O experimento compreendeu 10 grupos de 5 camundongos cada.
No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com vírus a 3x o LD95 por inoculação intranasal em um volume de 50 µl (aproximadamente 1E5 vírus por camundongo), após serem anestesiados com isoflurano.
[001130] Todos os grupos receberam um único tratamento IV de conjugado 33 (Exemplo 129), veículo (PBS) ou controle apenas de Fc (hIgG1 Fc) duas horas após o desafio viral. Um grupo adicional foi tratado por via oral com oseltamivir (20 mg / kg, bid, por 5 dias) começando 8 horas após o desafio viral.
[001131] O estudo avaliou 7 concentrações de dose diferentes de conjugado 33 (10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 e 0,01 mg / kg). Os camundongos foram monitorados por 2 semanas e os animais que ultrapassaram a perda de peso corporal de 20%, ou foram encontrados moribundos, foram avaliados como mortalidade. Pesos corporais também foram registrados para monitorar a saúde geral dos animais.
[001132] Todos os camundongos tratados com veículo ou o controle apenas Fc, atingiram a mortalidade no Dia 8 como esperado. Em contraste, todos os camundongos que receberam o conjugado 33 foram totalmente protegidos após receberem doses IV únicas de 10 a 0,3 mg / kg durante o estudo (Tabela 48). Em contraste, o grupo tratado com oseltamivir resultou apenas em 40% de sobrevida, embora a dose cumulativa que esses camundongos receberam foi de 200 mg / kg ao longo do experimento. A potência do conjugado 33 foi ainda suportada por medições diárias de peso corporal (Tabela 49; dados mostrados apenas até a primeira morte dentro de um grupo).
Os camundongos tratados com o conjugado 33 a 0,3 mg / kg demonstraram apenas uma perda transitória de peso corporal atingindo um máximo de 7%, em um único dia. Coletivamente, este estudo demonstra a potência do conjugado 33 medida por dois parâmetros indicativos de infecção por Influenza B (sobrevida e peso corporal) contra uma cepa de influenza da linhagem Yamagata.
Tabela 48: % de sobrevida Dia pós-infecção PBS Fc Conjugado 33 Oseltamivir (10 a 0,3 mg / kg) (0,03mg / kg) (0,01mg / kg) 0,1mg/kg 10mg/kg 0 100 100 100 100 100 100 100 1 100 100 100 100 100 100 100 2 100 100 100 100 100 100 100 3 100 100 100 100 100 100 100 4 60 100 100 100 100 100 100 5 40 40 100 100 60 80 40 6 0 0 100 60 60 40 0 7 0 0 100 60 60 0 0 8 0 0 100 60 60 0 0 9 0 0 100 60 60 0 0 10 0 0 100 60 60 0 0 11 0 0 100 60 60 0 0 12 0 0 100 60 60 0 0 13 0 0 100 60 60 0 0 14 0 0 100 60 60 0 0
Tabela 49: Pesos corporais (g) Dia pós-infecção PBS Fc Conjugado 33 Oseltamivir (0,03mg / kg) (0,01mg / kg) (0,3mg / kg) (3mg / kg) 0,1mg/kg (1mg/kg) 10mg/kg 10mg/kg 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 1 99 101 103 98 98 98 98 99 98 98 2 95 97 100 99 97 101 97 97 97 97 3 87 90 101 98 96 97 93 95 92 89 4 82 84 104 99 99 97 93 93 88 85 5 78 79 102 99 99 97 92 84 79 6 98 96 98 93 79 7 102 98 100 96 8 101 98 98 97 9 104 101 102 101 10 103 100 101 101 11 104 102 101 101 12 104 101 102 102 13 103 102 102 102 14 103 102 102 101 Exemplo 131. Caracterização de Regioisômeros
[001133] Monômero e dímero intermediários podem ser produzidos como um regioisômero particular ou uma mistura de regioisômeros.
Os Exemplos 100-102 mostraram como preparar regioisômeros Int-7 (C7-C7, Exemplo 100; C7-C9, Exemplo 101; C9-C9, Exemplo 102; C7-C7 otimizado, Exemplo 103). Os métodos aqui descritos podem ser usados para separar misturas de regioisômeros de qualquer intermediário aqui descrito. A Tabela 50 fornece a caracterização da porcentagem relativa (%) das quantidades de monômeros ligados a C7 e C9 e dímeros ligados a C7-C7, C7-C9 e C9-C9 nas sínteses previamente descritas do intermediário de pré-conjugação.
Tabela 50: Análise de regiosômero
Monômero (M) ou Int Exemplo %C7 % C7-C9 %C9 Dímero (D) Exemplo 6 Int-2 D 95 5 Int-3 Exemplo 11 D 70 30 Int-4 Exemplo 13 M 58 42 Int-4a Exemplo 122 M 97 Int-7 Exemplo 19 D 3 2 95 Int-7a Exemplo 100 D 100 Int-7b Exemplo 101 D 5 95 Int-7c Exemplo 102 D 100 Int-25 N/A D 5 95 Int-26 N/A D 25 50 25 Int-27 N/A D 29 35 36 Int-28 N/A D 5 28 67 Int-31 N/A D 90 Int-34 N/A D 12 6 82 Int-37 N/A M 95 Int-71 Exemplo 110 D 3 97 Exemplo 112 Int-72 D 100 Exemplo 132. Eficácia do Conjugado 33 dosado por via subcutânea contra influenza A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) em um modelo de camundongo letal
[001134] O Conjugado 33 foi avaliado contra uma infecção letal por influenza IAV H1N1 em camundongos fêmeas BALB / c (Charles River Laboratories, 6-8 semanas). O vírus de desafio (A / Puerto Rico / 8/1934) é um isolado adaptado a camundongos capaz de causar infecções letais em camundongos. O experimento compreendeu 6 grupos de 5 camundongos. No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com vírus a 3x o LD95 por inoculação intranasal em um volume de 30 µl, após serem anestesiados com uma mistura de cetamina / xilazina (150 e 10 mg / kg respectivamente). A mortalidade e os pesos corporais foram registrados diariamente e qualquer animal com uma perda de 20% do peso corporal foi classificado como uma morte.
[001135] Os grupos de teste receberam um único tratamento subcutâneo (SC) de conjugado 33, controle de hIgG1 Fc ou veículo (PBS) 2 horas após o desafio viral. O projeto do estudo está resumido na Tabela 51.
Tabela 51: Desenho do estudo para o estudo Influenza A / PR / 8/34 (H1N1) Volume de Dose # de Grupo Artigo de teste Rota / Dosagem dose (mg/kg) camundongos (ml / kg) 1 Veículo SC, T + 2 horas. na 10 5 2 hIgG1 Fc SC, T + 2 horas. 1 10 5 3 Conjugado 33 SC, T + 2 horas. 1 10 5 4 Conjugado 33 SC, T + 2 horas. 0,3 10 5 5 Conjugado 33 SC, T + 2 horas. 0,1 10 5 6 Conjugado 33 SC, T + 2 horas. 0,03 10 5
[001136] Como esperado, os camundongos que receberam o veículo ou o controle hIgG1 Fc sucumbiram à infecção nos dias 6-7 (Tabela 52).
No entanto, os camundongos tratados com o conjugado 33 foram totalmente protegidos com níveis de dose de 1, 0,3 e 0,1 mg / kg. A mortalidade com o conjugado 33 foi observada apenas na concentração de dose mais baixa de 0,03 mg / kg.
Tabela 52: Porcentagem de sobrevida por dia de estudo (n = 5) Dia pós- Veículo hIgG1 Fc Conjugado 33 infecção (1,0 mg/kg) (1,0 mg/kg) (0,3 mg/kg) (0,1 mg/kg) (0,03 mg / kg) 0 100 100 100 100 100 100 1 100 100 100 100 100 100 2 100 100 100 100 100 100 3 100 100 100 100 100 100 4 100 100 100 100 100 100 5 100 100 100 100 100 100 6 40 60 100 100 100 100 7 0 0 100 100 100 60
[001137] A potência do conjugado 33 foi ainda suportada por medições diárias do peso corporal. Como esperado, os camundongos tratados com veículo ou hIgG1 Fc demonstraram uma queda constante no peso corporal até exceder 20%, momento em que foram avaliados como um mortalidade (Tabela 53).
[001138] Em contraste com os camundongos de controle, os grupos que receberam o conjugado 33 a 1, 0,3 e 0,1 mg / kg mantiveram pesos corporais saudáveis ao longo do estudo e nunca demonstraram mais do que uma queda transitória do peso corporal de menos que 8% (grupo de dose de 0,1 mk / kg , Dia 8; Tabela 53). Por ambas as medidas de sobrevida e peso corporal, o conjugado 33 demonstrou proteção robusta contra um desafio letal de Influenza A / Puerto Rico / 8/1934 com uma dose SC única de 0,1 mg / kg.
Tabela 53: Dados de peso corporal (gm) Dia pós- Veículo hIgG1 Fc Conjugado 33 infecção (1,0 mg/kg) (1,0 mg/kg) (0,3 mg/kg) (0,1 mg/kg) (0,03 mg / kg) 0 100 100 100 100 100 100 1 98,1 97,6 98 98,6 98,7 98,5 2 100,9 99 100,3 101,3 101,6 99,9 3 94,1 92,6 98,4 100,5 96,5 93,9 4 86 85,7 102,6 99,2 93,5 88,6 5 79,8 79,1 98,2 97,7 94,9 86,5 6 75,3 75,2 102,2 102,3 99,4 84,6 7 103,5 102,9 95,2 78,4
8 101,8 103,2 92,4 9 101,2 102,9 95,4 10 101,3 102,5 98,8 11 102,8 102,6 98,7 12 102,4 100,7 98,6 13 102,2 101,1 98,3 14 100,2 102 99,6 Exemplo 133. Eficácia do Conjugado 33 contra A / PR / 8/1934 (H1N1), carga de PFU do pulmão e níveis de citocinas
[001139] Os estudos de eficácia para o conjugado 33 foram conduzidos em camundongos BALB / c fêmeas de 6-8 semanas (Charles River) desafiados por via intranasal com 3E2 PFU / camundongo (3x o LD95) de influenza A / PR / 8/1934 adaptado a camundongo (H1N1). O conjugado 33 ou controles Fc de IgG1 humana foram administrados como uma dose única por via subcutânea (SC) 2 h após o desafio a 0,1 - 3 mg / kg. Oseltamivir foi administrado por via oral, duas vezes ao dia durante 4 dias, começando 2 h após a infecção a 5 ou 50 mg / kg. O baloxavir foi ressuspenso em 0,5% de metilcelulose e administrado por via oral, duas vezes ao dia durante 4 dias, começando 2 h após a infecção a 30 mg / kg (Tabela 54). Os pesos corporais (BW) foram registrados durante 4 dias (Fig. FIGS. 62A-62B. Aos 4 dias após a infecção, os camundongos foram sacrificados por CO2 ambos os lobos do pulmão foram colhidos. Os pulmões foram homogeneizados com esferas de sílica de 1 mm em 1 mL de PBS usando um MagNA Lyser (Roche). A homogeneização foi realizada a 6.000 rpm por 60 s e resfriada em gelo por 5 min entre as execuções. Após a homogeneização pulmonar, os tubos foram centrifugados por 10 min a 600 x g e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo.
Tabela 54: Desenho do Estudo Artigo de Teste (DAR) Rota / Dosagem Dose [mg/kg] PBS IV, T+2h N/A hIgG1 Fc IV, T+2h 3 Oseltamivir PO, BID x 4 5
Oseltamivir PO, BID x 4 50 Baloxavir SC, BID x 4 30 Conjugado 33 (4,7) SC, T + 2h 0,1 Conjugado 33 (4,7) SC, T + 2h 0,3 Conjugado 33 (4,7) SC, T + 2h 1 Conjugado 33 (4,7) SC, T + 2h 3 não infectado N/A N/A
[001140] Para a determinação de PFU, os sobrenadantes do homogenato de pulmão foram diluídos em tampão de infecção variando de 10-1 to 10-6. 100 µL de diluições de vírus foram adicionados à monocamada confluente de células MDCK em placas de 24 poços e incubados por 1 h em temperatura ambiente com agitação a cada 15 min. Após a remoção do vírus, o meio líquido de cobertura contendo Avicel foi adicionado às células MDCK. As células foram incubadas a 37C, 5% de CO2 por 40 h. Após a incubação, o meio foi removido e as células foram coradas com violeta de cristal para enumerar as placas e as unidades formadoras de placas (PFU) foram calculadas em relação ao peso do pulmão (PFU / g de pulmão).
[001141] Para a análise de citocinas, os sobrenadantes do homogenato de pulmão foram diluídos em série 2 vezes em placa de 96 poços.
Os níveis de citocinas para INF-, TNF-, IL-6, MIP-1 e MCP-1 foram determinados por ELISA de acordo com as instruções do fabricante (R&D Systems). Após um desafio letal com influenza em um modelo de camundongo, a carga pulmonar de PFU (FIGS. 63A-63B) e os níveis de citocinas pulmonares foram determinados no dia 4 pós-infecção (Tabela 55 e Tabela 56, respectivamente). O conjugado 33 demonstrou uma redução logarítmica dependente da dose na carga viral, resultando em 0,7 a 0,1 mg / kg, 1,88 a 0,3 mg / kg, 3 a 1 mg / kg e 3,8 a 3 mg / kg. Oseltamivir a 5 mg / kg e 50 mg / kg teve efeitos modestos sobre a carga viral, resultando em uma redução de 0,86 e 2 log, respectivamente. O Baloxavir reduziu a carga viral abaixo do limite de detecção, 1e2 PFU / mL, reduzindo assim a carga viral em > 5,99 logs em comparação com o controle de PBS.
[001142] Nenhuma diferença biológica relevante foi observada entre os controles negativos, PBS e hIgG1 Fc como esperado.
[001143] O conjugado 33 reduz a carga viral na dependência da dose no dia 4 pós-infecção desafiada com influenza A em um modelo de camundongo (Tabela 55, FIGS. 64A-64B). Da mesma forma, o conjugado 33 demonstrou uma redução de vezes dependente da dose nos níveis de citocinas para TNF-, IL-6, INF-, MCP-1, e MIP-1 (FIGS. 65A-65E, respectivamente) em comparação com o controle não infectado no dia 4 pós-infecção desafiada com influenza A em um modelo de camundongo (Tabela 56).
Tabela 55: Carga PFU Artigo de teste [mg / kg] PFU/g Redução de Log PBS [0]PBS 3.26E+07 0,0 hIgG1 Fc [3] 1.74E+07 0,364 Oseltamivir [5] 4.78E+06 0,86 Oseltamivir [50] 3.81E+05 2 Baloxavir [30] <1,00E+02* > 5,99* AVC-076-5B [0,1] 6,85E+06 0,715 AVC-076-5B [0,3] 5,31E+05 1,88 AVC-076-5B [1] 3.69E+04 2,99 AVC-076-5B [3] 5.84E+03 3,77 * Baloxavir reduziu a carga viral abaixo do limite de detecção.
Tabela 56: Níveis de citocinas pulmonares Artigo de teste [mg / INF- TNF- IL-6 MCP-1 MIP-1 kg] PBS [0] 1,6 1,4 4,2 38,6 18,1 hIgG1 Fc [3] 1,7 1,2 3,3 36,3 15,9 Oseltamivir [5] 1,0 0,8 1,8 24,0 6,3 Oseltamivir [50] 0,8 0,8 1,4 16,2 4,0 Baloxavir [30] 1,2 1,0 1,0 1,0 0,8 conjugado 33 [0,1] 1,1 0,7 0,8 19,1 5,6 conjugado 33 [0,3] 1,1 0,9 0,8 9,6 3,9 conjugado 33 [1] 0,9 0,7 1,1 5,7 1,7 conjugado 33 [3] 0,8 0,7 1,1 1,8 1,0 Não infectado 1 1 1 1 1
[001144] A concentração mais alta testada do conjugado 33 a
3 mg / kg não demonstrou perda de peso ao longo do curso da infecção semelhante aos camundongos controle não infectados (Tabela 57).
Tabela 57: Dados de peso corporal (% de redução) Artigo de teste [mg / Dia 0 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 kg] PBS [0] 0 -3,5 -2,86 -10,96 -17,32 hIgG1 Fc [3] 0 -2,6 -1,3 -9,58 -15,6 Oseltamivir [5] 0 -2,86 -2,42 -8,16 -13,88 Oseltamivir [50] 0 -3,78 -2,12 -3,22 -5,74 Baloxavir [30] 0 -2,38 -2,82 -2,6 -0,18 conjugado 33 [0,1] 0 -3,24 -2,32 -10,12 -11,46 conjugado 33 [0,3] 0 -2,16 1,34 -3,4 -4,36 conjugado 33 [1] 0 -1,5 -0,9 -1,98 -0,9 conjugado 33 [3] 0 -1,7 -1,6 -1,9 0,52 Não infectado 0 1,02 -0,14 -0,16 2,8 Exemplo 134. Eficácia do conjugado 33 contra Influenza A (H1N1) em um modelo de camundongo com imunodeficiência (SCID) combinada severa letal.
[001145] Os artigos de teste foram avaliados contra uma infecção letal por Influenza A em camundongos BALB / c scid fêmeas (Jackson Laboratories, 6-8 semanas de idade). O vírus de desafio (A / Puerto Rico / 8/1934) é um isolado adaptado a camundongos capaz de causar infecções letais em camundongos. O experimento compreendeu 11 grupos de 5 camundongos cada. No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com vírus a 3x o LD95 por inoculação intranasal em um volume de 30 µl (aprox. 1E3 vírus por camundongo), após serem anestesiados com uma mistura de cetamina/xilazina (150 e 10 mg / kg respectivamente).
[001146] Os grupos receberam um único tratamento SC de veículo (PBS), controle de hIgG1 Fc ou conjugado 33 (3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 mg / kg) duas horas após o desafio viral. Um braço separado do estudo consistiu em 3 grupos de ratos tratados com baloxavir marboxil (DC Chemicals, Shanghai, China) por via oral, duas vezes ao dia, durante 1 dia; também começando 2 horas após o desafio viral. Os camundongos foram monitorados por 2 semanas e os animais que ultrapassaram a perda de peso corporal de 20%, ou foram encontrados moribundos, foram avaliados como mortalidade.
[001147] No final do estudo (Dia 14), os camundongos que receberam o conjugado 33 estavam totalmente protegidos em todas as concentrações de dose entre 3 e 0,1 mg / kg (Tabela 58). O conjugado 33 só falhou em proteger contra o desafio viral letal na concentração testada mais baixa de 0,03 mg / kg. Como esperado, os grupos que receberam veículo ou hIgG1 Fc não foram protegidos. Os camundongos tratados com baloxavir também foram protegidos, mas nas doses cumulativas significativamente maiores de 60 e 20 mg / kg, em uma dose total de 6 mg / kg, apenas 40% dos camundongos sobreviveram até o Dia 14.
Tabela 58: % de sobrevida no Dia 14. hIgG1 Veículo Baloxavir Conjugado 33 Fc 3,0 (30 (10 3,0 3,0 (1,0 (0,3 (0,1 (0,03 mg (PBS) mg/kg mg/kg) mg/kg) mg/kg mg/kg mg/kg) mg/kg) mg/kg) / kg) 0 0 100 100 40 100 100 100 100 0
[001148] A potência do conjugado 33 neste modelo de imunodeficiência grave também foi evidente com base nos pesos corporais (Tabela 59). A concentração mais baixa de conjugado fornecendo proteção total com base em uma leitura de mortalidade foi de 0,1 mg / kg. Neste nível de dose, a maior perda média de peso para o grupo foi transitória e resultou em menos de 5% de redução (ocorrendo no Dia 2). Além disso, a diferença no peso corporal para os grupos nos níveis de dose de 1 e 3 mg / kg mostrou menos de 2% de diferença no Dia 14 em comparação com os camundongos não infectados.
[001149] Coletivamente, esses dados demonstram a potência do conjugado 33 protegendo camundongos desafiados letalmente com doses SC únicas de conjugado tão baixas quanto 0,1 mg / kg. Isso foi realizado em um modelo de imunodeficiência grave com camundongos sem células imunes T&B, que são essenciais para limpar infecções por influenza. Estes dados suportam o uso do conjugado 33 para tratar populações de pacientes com deficiência imunológica.
Tabela 59: % do peso corporal médio por dia. (mg / kg). Dados mostrados apenas até a primeira mortalidade dentro de um grupo. Dia pós- hIgG1 Não Veículo Baloxavir Conjugado 33 infecção Fc infectado (0,03 (3 (30 (10 (3 (3 (1 (0,3 (0,1 (PBS) mg / mg/kg) mg/kg) mg/kg) mg/kg) mg/kg) mg/kg) mg/kg) mg/kg) kg) 0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 1 100,0 99,0 98,9 91,5 97,3 99,0 99,6 98,8 97,6 99,7 99,5 2 99,0 100,8 99,1 97,3 100,1 100,1 99,9 100,7 95,8 98,6 99,8 3 94,0 93,0 97,0 96,4 97,4 100,0 98,9 97,6 97,0 96,7 98,8 4 93,0 89,7 99,1 95,9 99,0 101,0 99,8 99,2 97,8 94,4 99,9 5 87,0 84,4 99,1 97,5 96,6 99,0 98,6 96,3 97,4 93,0 100,9 6 82,0 80,1 97,9 97,9 97,0 100,6 99,7 99,9 98,7 91,6 100,2 7 78,0 98,6 97,0 97,2 101,9 99,6 99,6 98,1 87,0 101,0 8 98,6 96,4 95,4 100,9 98,2 99,2 98,3 82,2 100,4 9 99,6 95,1 93,1 100,6 98,4 100,0 97,0 100,7 10 96,0 95,9 90,5 98,8 98,8 98,5 95,8 100,2 11 97,3 97,3 99,0 99,3 98,3 96,0 99,7 12 98,7 95,8 99,1 99,4 98,1 96,3 100,4 13 98,6 96,8 98,4 99,0 97,9 97,3 99,7 14 97,9 95,9 99,3 99,3 98,1 97,8 100,5 Exemplo 135. Eficácia do conjugado 33 dosado por via subcutânea contra influenza A / California / 07/2009 (H1N1) pdm em um modelo de camundongo letal.
[001150] O Conjugado 33 foi avaliado contra uma infecção letal por influenza IAV H1N1 em camundongos fêmeas BALB / c (Charles River Laboratories, 6-8 semanas). O vírus desafio (A / California / 07/2009 (H1N1) pdm) é um isolado pandêmico capaz de causar infecções letais em camundongos. O experimento compreendeu 6 grupos de 5 camundongos. No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com vírus a 3x o LD95 por inoculação intranasal em um volume de 30 µl, após serem anestesiados com uma mistura de cetamina / xilazina (150 e 10 mg / kg respectivamente). A mortalidade e os pesos corporais foram registrados diariamente e qualquer animal com uma perda de 20% do peso corporal foi classificado como uma morte.
[001151] Os grupos de teste receberam um único tratamento subcutâneo (SC) de conjugado 33, controle de hIgG1 Fc ou veículo (PBS) 2 horas após o desafio viral. O desenho do estudo e os níveis de dose estão resumidos na Tabela 60.
Tabela 60: Desenho do estudo para o estudo pdm do Influenza A / Califórnia / 07/2009 (H1N1) Volume de Dose # de Grupo Artigo de teste Rota / Dosagem dose (mg/kg) camundongos (ml / kg) 1 Veículo SC, T + 2 horas. na 10 5 2 hIgG1 Fc SC, T + 2 horas. 1 10 5 3 conjugado 33 SC, T + 2 horas. 1 10 5 4 conjugado 33 SC, T + 2 horas. 0,3 10 5 5 conjugado 33 SC, T + 2 horas. 0,1 10 5 6 conjugado 33 SC, T + 2 horas. 0,03 10 5
[001152] Como esperado, os camundongos que receberam o veículo ou o controle hIgG1 Fc sucumbiram à infecção nos Dias 6-7 (Tabela 61).
No entanto, os camundongos tratados com o conjugado 33 foram totalmente protegidos com 1 mg / kg, e quase isso com 0,3 (80% de sobrevida). A mortalidade significativa com o conjugado 33 foi observada apenas nas concentrações de dose mais baixas de 0,1 e 0,03 mg / kg.
Tabela 61: Sobrevida percentual por dia. (mg / kg) Dia Veículo hIgG1 Fc conjugado 33 (1,0 mg / (1,0 mg / kg) (0,3 mg / kg) (0,1 mg/kg) (0,03 mg/kg) kg) 0 100 100 100 100 100 100 1 100 100 100 100 100 100 2 100 100 100 100 100 100 3 100 100 100 100 100 100 4 100 100 100 100 100 100 5 40 20 100 100 60 80 6 0 20 100 80 20 20 7 0 0 100 80 0 0 8 0 0 100 80 0 0 9 0 0 100 80 0 0 10 0 0 100 80 0 0 11 0 0 100 80 0 0 12 0 0 100 80 0 0 13 0 0 100 80 0 0 14 0 0 100 80 0 0
[001153] A potência do conjugado 33 foi ainda suportada por medições diárias do peso corporal. Como esperado, os camundongos tratados com veículo ou hIgG1 Fc demonstraram uma queda constante no peso corporal até exceder 20%, momento em que foram avaliados como um mortalidade (Tabela 62).
[001154] Em contraste com os camundongos de controle, os camundongos que receberam o conjugado 33 a 1 mg / kg apenas demonstraram uma queda transitória no peso corporal de aproximadamente 10%, com pico no Dia 3 (Tabela 62). Por ambas as medições de sobrevida e peso corporal, o conjugado 33 demonstrou proteção robusta contra um desafio letal de Influenza A / California / 07/2009 (H1N1) pdm com uma dose única de 1 mg / kg administrada SC. A atividade contra a cepa pandêmica clinicamente relevante usada neste estudo apoia a utilidade do conjugado 33 no tratamento de infecções graves de influenza.
Tabela 62: % do peso corporal médio por dia. (mg / kg). Dados mostrados apenas até a primeira mortalidade dentro de um grupo.
Dia pós- Veículo hIgG1 Fc Conjugado 33 infecção (0,03 mg / (1,0 mg/kg) (1,0 mg/kg) (0,3 mg/kg) (0,1 mg/kg) kg) 0 100 100 100 100 100 100 1 99,5 97,9 96,8 96,7 98 98,7 2 97,1 97,2 99,5 99,2 98 98,4 3 86,5 86,0 89,7 89,6 87,6 88,8 4 80,3 80,3 91,6 88,5 81,3 81,9 5 76,2 76,6 92,9 91,0 76,8 77,9 6 94,7 90,5 7 94,2 8 95,4 9 98,0 10 96,8 11 98,8 12 97,7 13 100,1 14 100,5 Exemplo 136. Eficácia do Conjugado 33 por via intravenosa (IV) dosado contra influenza A / Puerto Rico / 8/1934 (H1N1) em um modelo letal de camundongo letal de tratamento retardado.
[001155] O Conjugado 33 foi avaliado contra uma infecção letal por influenza A (H1N1) em camundongos fêmeas BALB / c (Charles River Laboratories, 6-8 semanas). O vírus de desafio (A / Puerto Rico / 8/1934) é um isolado adaptado a camundongos capaz de causar infecções letais em camundongos. No dia 0, todos os camundongos foram desafiados com vírus a 3x o LD95 por inoculação intranasal em um volume de 30 µl, após serem anestesiados com uma mistura de cetamina / xilazina (150 e 10 mg / kg respectivamente). A mortalidade e os pesos corporais foram registrados diariamente e qualquer animal com uma perda de 20% do peso corporal foi classificado como uma morte.
[001156] O desenho do estudo é detalhado na Tabela 63 e consiste em vários braços. O braço de controle compreende veículos (PBS) e grupos apenas de hIgG1 Fc, doseados 24 horas após o desafio viral (um grupo não infectado também fazia parte deste braço). O segundo braço consistia em oseltamivir dosado em 4x sua dose humanizada, com início do tratamento retardada por 24, 48 ou 72 horas. Os 3 braços finais consistiam no conjugado 33 administrado como doses IV únicas de 10, 3 ou 1 mg / kg; cada um sendo dosado no mesmo cronograma que o braço de oseltamivir acima.
[001157] Como esperado, o veículo e o Fc de hIgG1 não foram protetores quando administrados 24 horas após o desafio viral e resultaram em mortalidade completa no Dia 7. Em nossas mãos, o oseltamivir, mesmo em 4x a dose humanizada (200 mg / kg de dose cumulativa) foi apenas parcialmente eficaz quando a dosagem foi retardada 24 horas (Tabela 64; 40% de sobrevida).
No entanto, o conjugado 33 foi totalmente protetor em todas as concentrações (10, 3 e 1 mg / kg) no mesmo esquema de dosagem de 24 horas.
[001158] Quando a dosagem foi retardada 48 horas após o desafio viral, o oseltamivir não foi mais eficaz (0% de sobrevida), enquanto o conjugado 33 foi 80% protetor em doses de 10 e 3 mg / kg. Quando a dosagem foi retardada até 72 horas, apenas a dose de 10 mg / kg do conjugado 33 demonstrou proteção parcial (40%). A eficácia do conjugado 33 também foi evidente com base nas medições diárias do peso corporal (Tabela 65). Isso foi especialmente significativo nos grupos T + 24 horas, onde menos de 3% de redução foi observada para qualquer grupo do conjugado 33, que foi transitório e ocorreu no Dia 1. Neste estudo, o conjugado 33 é mais eficaz do que o oseltamivir, um tratamento aprovado para influenza.
Tabela 63: Desenho do estudo Primeira Volume N Artigo de Rota / Dose Grupo Cepa influenza A dose de dose (balb teste Programação (mg/kg) (horas) (ml/kg) / c) 1 A/PR/8/34 (H1N1) PBS IV, único T+24 --- 5 5 3E2 2 PFU/camundongo hIgG1 Fc IV, único T+24 10 5 5
3 Oseltamivir PO, bid x 5 dias T+24 20 10 5
4 T+48
5 T+72
6 AVC-076 IV, único T+24 10 5 5
7 T+48
8 T+72
9 AVC-076 IV, único T+24 3 5 5
10 T+48
11 T+72
12 AVC-076 IV, único T+24 1 5 5
13 T+48
14 T+72
15 Controle de BW não infectado
Tabela 64: % de sobrevida por dia.
Artigo de teste / Dose / Tempo de início do tratamento
Tabela 65: Dados de peso corporal (gm). mpk = mg / kg. Dados mostrados apenas até a primeira morte dentro de um grupo. Artigo de teste / Dose / Tempo de início do tratamento Exemplo 137. Síntese do conjugado 38 (Int-73), conjugado 39 (Int-74), conjugado 40 (Int-75) e conjugado 41 (Int-76)
[001159] Um tubo de centrífuga estéril de 15 ml é carregado com ascorbato de sódio (68,3 mg, 0,345 mmol), BTTAA (11,9 mg, 0,0276 mmol), produto dos Exemplos 114 (Int-73), 115 (Int-74), 116 (Int- 75), ou 117 (Int-76) (0,00953 mmol) e PBS 7,4 (1 ml). Os reagentes foram agitados com vórtice até ficarem homogêneos, em seguida, misturados com azido Fc (50 mg, 0,0008624mmol, descrito no Exemplo 124, SEQ ID NO: 64) seguido por uma solução de CuSO4 (1,1 mg, 0,0069 mmol) em água (0,5 ml). A mistura é girada durante 12 horas, em seguida, purificada por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão de tamanho. Os conjugados são caracterizados por análise de Maldi TOF (DAR tipicamente = 4,5). Os rendimentos são normalmente 50%.
Exemplo 138. Síntese de Int-79 Sal TFA Sal TFA Etapa a.
[001160] Zanamavir-éter-ácido (0,90 g, 1,43 mmol, Exemplo 31) e N-metil morfolina (0,23 mL, 2,14 mmol) foram dissolvidos em THF (35 mL)
e resfriados a 0°C (banho de água gelada) sob uma atmosfera de nitrogênio.
Cloroformato de isobutil (0,24 mL, 1,85 mmol, em 2 mL de DCM) foi adicionado gota a gota, por meio de uma seringa ao longo de um período de 5 minutos. A mistura foi agitada a 0°C por 30 minutos, em seguida, 15 min à temperatura ambiente e, em seguida, resfriada a 0°C. Boro-hidreto de sódio (540 mg, 14,3 mmol, dissolvido em 5 mL de metanol) foi adicionado, gota a gota durante 5 minutos. A reação foi agitada durante 15 minutos, ponto em que todo o material de partida tinha sido consumido (por LC / MS). Algumas gotas (~ 1 mL) de ácido acético glacial foram adicionadas para acidificar a mistura (pH ~ 5). Diluir com acetato de etil e água e extrair em acetato de etil (3x). Lavou-se a camada orgânica com salmoura e secou-se os extratos orgânicos sobre sulfato de sódio e concentrou-se no evaporador rotativo. O material em bruto foi purificado por cromatografia em gel de sílica (carregado em celite primeiro) (0-10% de metanol em DCM, 30 min). Rendimento 0,66 g, 75%. Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 617,2.
Etapa b.
[001161] A uma mistura em agitação de álcool (0,66, 1,1 mol, em 20 mL CH2Cl2), foi adicionada trietilamina (0,30 mL, 1,3 mmol). A mistura foi resfriada a 0°C (banho de água gelada) sob 1 atmosfera de nitrogênio e cloreto de mesil (150 mg, 1,3 mmol) foi adicionado, gota a gota, durante 5 minutos por meio de seringa. O banho de gelo foi removido e a reação foi agitada durante 45 minutos. A mistura foi diluída com bicarbonato de sódio aquoso saturado,
extraída para DCM (3x). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos sobre sulfato de sódio e concentrados no evaporador rotativo.
Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 695,2.O intermediário foi levado para a próxima etapa sem purificação.
[001162] O mesilato de zanamvir foi agitado em DMF a 80°C com 3 eq de azida de sódio durante 5 horas. A mistura foi diluída com água, extraída em DCM (3x). Os extratos orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos sobre sulfato de sódio e concentrados. Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 695,2. A azida foi levada para a próxima etapa sem purificação.
[001163] A azida de zanamavir (670 mg, 1,04 mmol) foi agitada em metanol (20 mL) na presença de catalisador de Lindlar (300 mg) sob 1 atmosfera de gás hidrogênio durante 12 horas. A mistura foi filtrada através de celite e concentrada para proporcionar o composto do título como um óleo transparente. A amina foi levada para a próxima etapa sem purificação.
Rendimento 0,37 g, 54%, 3 etapas. Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 616,2.
Etapa c.
[001164] Metil 3-(benzilamino)propanoato (1 g, 5,2 mmol), metil 4-bromobutanoato (1,2 g, 6,2 mmol) e di-isopropiletilamina (1,34 mL, 7,8 mmol) foram agitados em DMF (5 mL) a 65°C por 4 horas. A maior parte do solvente foi removida por evaporador rotativo e o material em bruto foi purificado por cromatografia em gel de sílica (Isco, 0 a 9% de metanol em DCM, gradiente de 30 minutos) para se obter o intermediário protegido com benzil como um óleo transparente. O intermediário protegido com benzil foi agitado em metanol (20 mL) sob 1 atmosfera de hidrogênio gasoso na presença de hidróxido de paládio a 20% em carbono (300 mg) durante 12 horas. A mistura foi filtrada através de celite e concentrada para proporcionar o composto do título como um óleo transparente. Rendimento 0,72 g, 69%. Íon encontrado por LCMS: [M + H] + = 204,2.
Etapa d.
[001165] O produto da etapa c (0,70 g, 2,16 mmol), ácido propargil PEG-4 (0,63 mg, 2,38 mmol) HATU (1,26 g, 3,24 mmol) em DMF (2 mL) foi agitado à temperatura ambiente seguido pela adição de DIEA ( 1,15 mL, 6,49 mmol). A mistura de reação foi agitada durante 2 horas e depois purificada por cromatografia líquida de fase reversa (Isco, 5 a 50% de acetonitrila e água com 0,1% de TFA como modificador). Rendimento de 840 mg, 87%. Íon encontrado por LCMS: [M+H]+ = 446,2.
Etapa e.
[001166] Uma solução do produto da etapa d (840 mg, 1,85 mmol) e LiOH (113,1 mg, 4,72 mmol) em H2O:MeOH (1:2, 9 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. Em seguida, a reação foi acidificada com TFA. A solução resultante foi concentrada e depois purificada por cromatografia líquida de fase reversa (Isco, 0% a 20% de acetonitrila e água). Rendimento de
454,5 mg, 59%. Íon encontrado por LCMS: [M+H]+ = 418,2.
Etapa f.
[001167] A uma solução do produto da etapa b (334,7 mg, 0,52 mmol), produto da etapa e (102 mg, 0,24 mmol) e HATU (273,25 mg, 0,704 mmol) em DMF anidro (3 mL) à temperatura ambiente foi adicionado DIEA ( 217 mg, 16,4 mmol). A mistura resultante foi agitada durante 1 hora, em seguida, foi purificada por RPLC (20% a 100% de metanol e água sem modificador).
Rendimento de 206,5 mg, 55%. Íon encontrado por LCMS [(M + 2H) / 2] + = 806,8.
Etapa g.
Sal TFA
[001168] O produto da etapa f (206,5 mg, 0,128 mmol) e TFA (3 mL) em CH2Cl2 (5 mL) foram agitados à temperatura ambiente durante a noite, depois concentrados sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por HPLC semi-preparativa (0% a 30% de acetonitrila e água com 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 144,5 mg, 69%. Íon encontrado por LCMS [(M + 2H) / 2] + = 606,8.
Etapa (h) Sal TFA
[001169] A uma solução do produto da etapa g (144,5 mg, 0,119 mmol) em MeOH (9 mL) e água (3 mL) foi adicionado LiOH (18 mg, 0,75 mmol). A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora, depois acidificada com TFA e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por HPLC semipreparativa (0% a 25% de acetonitrila e água, usando 0,1% de TFA como modificador). Rendimento 45 mg, 28%. Íons encontrados por LCMS [(M + 2H) / 2] + = 566,8.
Exemplo 139. Síntese do conjugado 42
[001170] Uma solução de Fc funcionalizado com azido (50 mg, 5,4 mL, 0,859 µmol, Exemplo 124, SEQ ID NO: 18) foi adicionada a um tubo de centrífuga de 10 mL contendo molécula pequena derivatizada com alquino (7,87 mg, 0,057 mmol, Exemplo 138). Após agitação suave para dissolver todos os sólidos, a mistura foi adicionada a 3 mL de solução pré-misturada de ácido L- ascórbico de sódio (0,68 mg, 0,34 mmol, 0,25 M), sulfato de cobre (II) (1,1 mg, 0,0069 mmol, 0,005 M) e BTTAA (11,8 mg, 0,027 mmol, 0,02 M) em tampão PBS 7,4. A solução resultante foi suavemente girada durante a noite. Foi purificada por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (Ver protocolo geral de purificação de conjugado). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 63623 Da (DAR 3,8). Rendimento 36,01 mg, 72%.
Exemplo 140. Síntese de Int-80 Etapa a.
[001171] A uma solução do carbonato de p-nitrofenil de Zanamivir (0,3 g. 0,4 mmol, Exemplo 103) em diclorometano anidro (5 ml) foi adicionado um propargil-PEG4-metilamina (0,11 g, 0,44 mmol) e DIPEA (0,14 ml, 1,0 mmol) em DMF anidro (5 ml). A reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, em seguida, concentrada e purificada por cromatografia flash eluindo com 0% a 10% de metanol / diclorometano. Rendimento 0,28 g, 81%. Íons encontrados por LCMS: (M + H)+ = 858,4, (M - Boc) + H+ = 758,4.
Etapa b.
[001172] O produto da etapa anterior (280 mg, 0,2 mmol) foi dissolvido em 2 ml de MeOH e 2 ml de THF, então tratado com uma solução de hidróxido de lítio (24 mg, 1 mmol) dissolvido em 2 ml de água. A reação foi agitada durante 10 min à temperatura ambiente altura em que HPLC mostrou que a reação estava completa. O pH da reação foi ajustado para o valor de 5 a 6 usando a resina de troca iônica Amberlite IRN-77, que foi filtrada para remover a resina. O filtrado bruto foi evaporado à secura sob vácuo e usado na próxima etapa com purificação, e o rendimento foi quantitativo. Íon (s) encontrado (s) por LCMS: (M+ H) + = 844,4, (M - Boc + H)+ = 744,4.
Etapa c.
[001173] O produto da etapa b foi dissolvido em 2 ml de diclorometano e 2 ml de TFA e agitado à temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por LCMS. Após a conclusão da reação (6h), a solução foi evaporada até a secura e então dissolvida em 2 ml de água e 2 ml de acetonitrila. A solução resultante foi agitada durante mais 2 horas à temperatura ambiente, momento no qual, o LCMS mostra a desproteção completa dos grupos de proteção de acetonida. Esta mistura foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco CombiFlash eluído com 5% a 40% de acetonitrila / água com 0,1% de TFA como modificador. Rendimento 180 mg, 78,0%. Íon (s) encontrado (s) por LCMS: (M + H)+ = 604,2.
Exemplo 141. Dados de estabilidade para Int-80 em comparação com Int-4
[001174] Int-80 (Exemplo 140) e Int-4 (Exemplo 13) foram solubilizados para 10 mg / mL em água desionizada e, em seguida, diluídos 1:10 em 1X PBS para uma concentração final de 1 mg / mL. As amostras foram incubadas a 37 ºC ou 60 ºC por 1 semana. Uma alíquota de 25 uL foi diluída em 75 uL de água para análise por HPLC. Usando um Waters Acquity H-Class UPLC com uma coluna Phenomenex Biozen PS-C18 (150x2,1 mm, 1,6um) um gradiente de 0,1% de ácido fórmico em água a 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila foi executado da seguinte forma: 5% B para 0 -1 min, 5-20% B de 1- 20 min. A detecção foi a 240 nm usando um detector de arranjo de diodos. Int- 80 teve menos de 1% de degradação ao longo de uma semana a 60ºC, enquanto Int-4 mostrou 15% de degradação ao longo do mesmo período (Fig. 66) Exemplo 142 Síntese do conjugado 43
[001175] Preparação da solução de reagente de Clique: 0,0050M de CuSO4 em PBS x1 solução tampão: 10,0 mg de CuSO4 foi dissolvido em 12,53 mL de PBS x1, em seguida, levou 10,00 mL desta solução de CuSO4 solution e adicionou-se 86,1 mg de BTTAA e 495,3 mg de ascorbato de Na para dar a solução reagente de Clique (0,0050 M de CuSO4, 0,020 M de BTTAA e 0,25 M de ascorbato de sódio).
[001176] Uma solução de Fc funcionalizado com azido (78,0 mg, 4,535 mL, 1,35 µmol, Exemplo 124, SEQ ID NO: 64) foi adicionada a um tubo de centrífuga de 15 mL contendo molécula pequena derivatizada de alquino
(13,2 mg, 8,88 umol, Int-80, Exemplo 140). Após agitação suave para dissolver todos os sólidos, a mistura foi adicionada com 2,153 mL da solução de reagente de clique acima de (ácido L-ascórbico de sódio, 0,25 M, 106,6 mg, 0,538 mmol, sulfato de cobre (II) 0,0050 M, 1,72 mg, 0,0107 mmol e BTTAA 0,020M, 18,5 mg, 0,0431 mmol). A mistura resultante foi girada suavemente durante 6 horas à temperatura ambiente. Foi purificada por cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho (Ver protocolo de purificação de conjugado). A análise de Maldi TOF do produto final purificado deu uma massa média de 64.012 Da (DAR = 7,0). Rendimento 50,3 mg, rendimento de 62%.
Exemplo 143. Síntese de Int-81 brometo de alila brometo de Ácido PEG4 2) TFA, então, H2O Etapa a.
[001177] A uma solução bem agitada de N-Boc-N-Me-glycinol (3,5 g, 20 mmol) em DMSO (20 mL) resfriada com um banho de água gelada foi adicionado brometo de alil (3,6 g, 30,0 mmol), seguido por pó de KOH finamente moído (3,5 g, 30,0 mmol) ao longo de 15 minutos. A solução resultante foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. A mistura resultante foi particionada entre 5% de HOAc aq. (50 mL) e acetato de etil (200 ml). A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura, seca com sulfato de sódio, filtrada e concentrada, depois purificada por cromatografia flash eluindo com 10% a 80% de acetato de etil / hexano. Rendimento do produto 4,1 g, 95%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M + H = 216,3.
Etapa b.
[001178] Ozônio foi borbulhado através de uma solução do composto da etapa a (8,0 g, 37 mmol) em MeOH (50 mL) e DCM (50 mL) a - 78°C até o aparecimento de uma cor azul clara. O ozônio que não reagiu foi removido borbulhando com oxigênio por 10 minutos antes da adição de NaBH4 (1,6 g, 40 mmol) em uma pequena porção ao longo de 10 minutos. Depois de todo o NaBH4 ter sido adicionado, a mistura foi gradualmente aquecida à temperatura ambiente. A solução resultante foi repartida entre acetato de etil (100 ml) e salmoura (50 ml). A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura, seca com sulfato de sódio, filtrada, concentrada até um óleo e depois purificada por cromatografia flash eluindo com 10% a 80% de acetato de etil / diclorometano. Rendimento do produto 5,0 g, 62%. Íon(s) encontrado(s) por LCMS: M + H = 220,2.
Etapa c.
[001179] A uma solução do produto (4,4 g, 20 mmol) da etapa anterior e CBr4 (10,0 g, 30,0 mmol) em DCM (50 mL) a 0℃ foi adicionado PPh3 (8.0 g, 30 mmol) lentamente ao longo de 15 minutos (exotérmico). Durante o curso da adição, a temperatura interna foi mantida abaixo de 30 ℃. Após adição de PPh3 , a reação foi agitada durante a noite à temperatura ambiente. A reação em bruto foi concentrada até um óleo e depois purificada por cromatografia de fase normal, eluindo com 10% de acetato de etil / hexanos para 80% de acetato de etil / hexanos. As frações contendo gotículas de óleo no interior dos tubos de coleta foram combinadas e concentradas em um óleo incolor. 4,0 g, 70,5%. Íon (s) encontrado (s) por LCMS: M + H = 282,1.
Etapa d.
[001180] Uma solução do produto da etapa c (4 g, 14 mmol), benzilamina (0,60 g, 5,7 mmol) K2CO3 (2,35 g, 17 mmol) em DMF (20 mL) foram aquecidos em um banho de óleo a 75 ℃ durante 8h . A mistura foi filtrada, concentrada e purificada por RPLC (5% ACN / água a 100% ACN). Rendimento de 2,1 g, 72,7%.
Etapa e.
[001181] A uma solução do produto da etapa d (1,3 g, 2,0 mmol) dissolvido em CHCl3/EtOH (1:20, 20 mL) foi adicionado 20% de Pd(OH)2/C (0,50 g). A reação foi agitada durante a noite sob balão de hidrogênio à temperatura ambiente. A mistura de reação foi filtrada através de uma almofada de Celite, depois concentrada por meio de um evaporador rotativo e transportada para a etapa subsequente sem purificação adicional.
Etapa f.
[001182] O produto da etapa e foi dissolvido em 10 mL de DMF, depois tratado com ácido propargil PEG4 (0,52 g, 2,0 mmol), EDCI (0,6 g,
3,0 mmol), HOAt (0,45 g, 3 mol) e base de Hunig (0,7 mL) , 5,0 mmol) à temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada durante quatro horas, depois concentrada e purificada por RPLC (10% ACN / água a 60% ACN / água).
Rendimento de 0,43 g, 65% para duas etapas. Íons encontrados por LCMS: [M - Boc + H]+ = 562,4, [M + H]+ = 662,4.
Etapa g.
[001183] O produto da etapa d (70 mg, 0,1 mmol) foi tratado com TFA (2 mL) durante 2 horas à temperatura ambiente. O TFA foi removido por evaporação rotativa e o óleo remanescente foi ainda seco sob alto vácuo durante 12h para dar o produto desejado como sal bis-TFA. O rendimento foi quantitativo. Íon encontrado por LCMS: [M + H]+ = 462,4.
Etapa (h)
[001184] A uma solução do carbonato de nitrofenil descrito no Exemplo 109 (0,72 g. 0,95 mmol) em DMF anidro (5 mL) foi adicionada uma mistura da etapa g diamina (0,3 g, 0,43 mmol, adicionada em porções ao longo de 30 minutos) e DIPEA (0,28 mL, 2 mmol) em DMF anidro (20 ml). A reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite, em seguida, concentrada e purificada por cromatografia flash eluindo com 0% a 10% de metanol / diclorometano. Rendimento de 0,63 g, 86%. Íons encontrados por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 844,4, [(M - Boc + 2H) / 2]+ = 794,4, [(M - 2Boc + 2H) / 2]+ = 744,4.
Etapa i
[001185] O produto da etapa anterior (600 mg, 0,35 mmol) foi dissolvido em 5 ml de MeOH e 5 ml de THF, depois tratado com uma solução de hidróxido de lítio (48 mg, 2 mmol) dissolvido em 2 ml de água. A reação foi agitada durante 10 min à temperatura ambiente altura em que HPLC mostrou que a reação estava completa. O pH da soluçãoda reação foi ajustado para um valor de 5 a 6 usando a resina de troca iônica Amberlite IRN-77, que foi filtrada para remover a resina. O produto bruto foi evaporado à secura por evaporação rotativa e usado na próxima etapa com purificação. Íon (s) encontrado (s) por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 829,9, [(M - Boc + 2H) / 2]+ = 779,4, [(M - 2Boc + 2H) / 2]+ = 729,4 .
Etapa j.
[001186] O produto da etapa-i foi dissolvido em 5 ml de diclorometano e 5 ml de TFA e agitado à temperatura ambiente. O progresso da reação foi monitorado por LCMS. Após a conclusão da reação (6h), a solução foi evaporada até a secura e então dissolvida em 4 mL de água e 4 mL de metanol.
A solução resultante foi agitada durante mais 2 horas à temperatura ambiente à qual LCMS mostra a desproteção completa dos grupos de proteção de acetonida. Esta mistura foi concentrada e purificada por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC) usando um cromatógrafo líquido Isco CombiFlash eluído com 5% a 40% de acetonitrila / água com 0,1% de TFA como modificador.
Rendimento de 380 mg, 71,0%. Íon (s) encontrado (s) por LCMS: [(M + 2H) / 2]+ = 589,8, [(M + 3H) / 3]+ = 392,5.
Exemplo 144. Síntese de Int-82
[001187] O composto do título foi preparado analogamente ao Exemplo 143, Int-81, onde o N-Boc-N-Me-glicinol foi substituído por N-Boc-N- etil-glicinol na etapa a. Íon (s) encontrado (s) por LCMS: [M / 2] +1 = 603,8, [M / 3] +1 = 402,9.
Exemplo 145. Síntese de Int-83
Etapa a.
[001188] O CBZ-protegido-amino-peg1-brometo (7,6 g, 25,2 mmol), benzilamina (1,1 g, 10,1 mmol) e carbonato de potássio (2,8g, 2,8 mmol) foram agitados em DMF (10 mL) a 60°C durante 12 horas. A solução foi concentrada no evaporador rotativo e purificada por cromatografia em gel de sílica (0-10% de metanol em DCM, gradiente de 30 minutos) para fornecer o produto como um óleo viscoso límpido. Rendimento de 3,2 gramas, 57%. Íon encontrado por LC / MS [M + H] + = 550,2.
Etapa b.
[001189] O produto da etapa a (1,9 g, 3,5 mmol) foi dissolvido em THF (20 mL) e resfriado a 0°C por meio de um banho de gelo / água sob uma atmosfera de nitrogênio. LAH (6,9 ml, 13,8 mmol, 2 M em THF) foi adicionado gota a gota por meio de uma seringa ao longo de um período de 10 minutos. A mistura foi agitada em refluxo durante 2 horas e depois resfriada a 0°C por meio de um banho de gelo / água. Foi adicionado 1 mL de água, gota a gota seguido pela adição gota a gota de 1 mL de solução aquosa (15% em peso) de NaOH. 3 mL de água foram adicionados e a mistura foi agitada durante 15 minutos, altura em que foram adicionados 2 g de sulfato de magnésio. A mistura foi agitada durante 10 minutos e depois filtrada através de celite, lavada com 2 porções adicionais de 10 ml de THF e os filtrados combinados foram concentrados no evaporador rotativo. O resíduo foi retomado em acetonitrila (20 mL), trietilamina (1,4 g, 13,8 mmol) e anidrido boc (3,0 g, 13,8 mmol) foram adicionados. A mistura foi agitada durante 45 minutos, concentrada e purificada por HPLC de fase reversa (5-95% de acetonitrila / água di, 0,1% de modificador de TFA, gradiente de 30 minutos). Rendimento 1,4 g, 79%. Íon formado por LC / MS [M + H] + = 510,2.
Etapa c.
[001190] O produto da etapa b. (1 g, 1,9 mmol) deste exemplo foi agitado em metanol (25 mL) na presença de hidróxido de paládio (200 mg) sob uma atmosfera de hidrogênio durante 2 horas. A mistura foi filtrada através de celite e concentrada para dar o produto como um óleo transparente que foi usado sem purificação adicional. Rendimento 0,73 g, 89%. Íon encontrado por LC / MS [M + H] + = 420,4.
Etapa d.
[001191] O produto da etapa c (0,73 g, 1,7 mmol), propargil- peg4-tosilato (0,91g, 2,4 mmol) e di-isopropiletilamina (0,76 g, 5,9 mmol) foi agitado em DMF (5mL) a 85°C por 4 horas. A mistura foi concentrada no evaporador rotativo, depois purificada por HPLC de fase reversa (5-95% de acetonitrila / água DI, 0,1% de modificador de TFA, gradiente de 30 minutos) para se obter o produto como um óleo viscoso límpido. Rendimento de 0,89 g, 82%. Íon obtido por LC / MS [M + H] + = 634,4.
Etapa e.
[001192] O produto da etapa d. (0,89 g, 1,4 mml) em HCl 4 N (em dioxano) durante 45 minutos à temperatura ambiente. A mistura foi concentrada no evaporador rotativo e azeotropada (3x) com benzeno. O resíduo resultante foi retomado em água DI (15 mL) congelada e liofilizada para proporcionar o produto como um óleo límpido, sal bis-HCl. Rendimento 0,65 g, 91%. Íon encontrado por LC / MS [M + H} + = 434,4.
Etapa f.
[001193] As quatro etapas restantes na síntese deste composto foram análogas as usadas na síntese do Exemplo 143, Int-81. Íon (s) encontrado (s) por LCMS: (M + 2H) / 2 = 575,8
Exemplo 146. Síntese Alternativa de Int-83
[001194] O produto descrito no Exemplo 145, Int-83, pode ser preparado alternativamente usando o esquema de reação acima por um versado na técnica usando métodos descritos nesta patente.
Exemplo 147. Experimentos de passagem em série para seleção de vírus influenza resistentes
[001195] Para avaliar o potencial de desenvolvimento de cepas virais mutantes resistentes a drogas sob pressão seletiva com inibidores virais, estudos de passagem em série foram conduzidos com os Conjugados 6 e 33, versus oseltamivir e comparadores de baloxavir. Estudos de passagem em série foram conduzidos usando células A549 ou MDCK. As passagens foram conduzidas como segue: 150.000 células A549 ou MDCK foram semeadas por poço (12 poços) em 500 µl de DMEM 10% FBS, 1% PS, 1% NaPyr e 1% HEPES e incubadas por aproximadamente 24 horas. Uma vez que as células atingiram aproximadamente 80% de confluência, foram lavadas uma vez com PBS e incubadas por 2 horas na presença de compostos ou PBS sozinho em condições normais de cultura. As concentrações do artigo de teste foram otimizadas conforme necessário para a inibição máxima do vírus, mantendo a produção de vírus suficiente para as passagens subsequentes. As concentrações de artigos de teste usados nas experiências de passagem em série são mostradas nas FIGs. 67 e 68. As células foram então infectadas a um MOI de 0,01 ou 0,05 (células MDCK e A549, respectivamente; 150ul diluído em tampão de infecção) por 1 hora à temperatura ambiente em um tampão contendo PBS, albumina bovina 35% e Ca2+/Mg2+, seguido pela remoção de inoculo e lavagem das células uma vez com DMEM 1% PS, 1% NaPyr e 1% HEPES (sem FBS). As células foram então incubadas durante 24 horas na presença de artigos de teste diluídos em DMEM 1% PS, 1% NaPyr, 1% HEPES e 1 µg / ml de tripsina tratada com TPCK. Após a incubação, os sobrenadantes virais foram coletados e as células e os resíduos foram removidos por centrifugação (5 min, 4°C, 1.400xg).
Os sobrenadantes foram então usados para: i Quantificar o título viral por ensaio de placa ii Conduzir um ensaio de hemaglutinação para determinar se o vírus escapou da inibição do composto iii Reiniciar células A549 ou MDCK semeadas recentemente na presença de compostos.
[001196] O processo foi repetido por 10 passagens, ou até que resistência fosse observada para os controles de oseltamivir e baloxavir. Uma vez que títulos aumentados na presença de drogas são detectados por duas passagens consecutivas, os vírus podem ser purificados por placa. Após a purificação da placa, todos os 8 segmentos do genoma podem ser sequenciados e comparados ao vírus de controle tratado com PBS para detectar mutações de escape.
Resumos de duas experiências de passagem em série diferentes são mostrados nas FIGS. 67 e 68. No experimento resumido na FIG. 67, o Conjugado
6 foi comparado com oseltamivir e baloxavir usando células A549 infectadas com
A / California / 04/09 / H1N1 pdm.
O conjugado 6, baloxavir e oseltamivir foram usados a 0,5 nM, 0,5 nM e 200 nM, respectivamente.
Nenhum aumento no título viral foi observado para o Conjugado 6 ao longo de 11 passagens (sugerindo não surgimento de mutantes resistentes), enquanto os títulos de baloxavir e oseltamivir aumentaram para níveis semelhantes aos observados no controle de
PBS após as passagens 5 e 11, respectivamente.
No experimento resumido na
FIG. 68, os Conjugados 6 e 33 foram comparados com oseltamivir e baloxavir usando células MDCK infectadas com A / WSN / 1933 H1N1. Conjugado 6,
Conjugado 33, baloxavir e oseltamivir foram usados a 4 nM, 2 nM, 4 nM e 50 nM,
respectivamente.
Nenhum aumento no título viral foi observado para os
Conjugados 6 ou 33 ao longo de 10 passagens (sugerindo não surgimento de mutantes resistentes), enquanto os títulos de baloxavir e oseltamivir aumentaram para níveis semelhantes aos observados no controle de PBS após as passagens
5 e 10, respectivamente.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. CONJUGADO descrito pela fórmula (1): (1) caracterizado por cada A1 e cada A2 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
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    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2- C15 heteroaril;
    cada E compreende um monômero de domínio Fc; L em cada A1-L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em cada E e a cada um de A 1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20, e as duas linhas onduladas conectadas aos dois Es indicam que cada A1-L-A2 está covalentemente ligado a um par de átomos de enxofre de duas cisteínas de dobradiça nos dois Es, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    2. CONJUGADO descrito pela fórmula (1): (1) caracterizado por cada A1 e cada A2 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, - O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
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    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    cada E compreende um monômero de domínio Fc;
    L em cada A1-L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em cada E e a cada um de A 1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20, e as duas linhas onduladas conectadas aos dois Es indicam que cada A1-L-A2 está covalentemente ligado a um par de átomos de enxofre de duas cisteínas de dobradiça nos dois Es, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    3. CONJUGADO descrito pela fórmula (1): (1) caracterizado por cada A1 e cada A2 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, - O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, - NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, - NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
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    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    cada E compreende um monômero de domínio Fc;
    L em cada A1-L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em cada E e a cada um de A 1 e A2;
    T é um número inteiro de 1 a 20, e as duas linhas onduladas conectadas aos dois Es indicam que cada A1-L-A2 está covalentemente ligado a um par de átomos de enxofre de duas cisteínas de dobradiça nos dois Es, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    4. CONJUGADO descrito pela fórmula (2): (2) caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
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    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril; cada E compreende um monômero de domínio Fc; L em cada L-A é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre em uma cisteína de dobradiça em E e em A; T é um número inteiro de 1 a 20, e as duas linhas onduladas conectadas aos dois átomos de enxofre indicam que cada L-A está covalentemente ligado a um par de átomos de enxofre de duas cisteínas de dobradiça nos dois Es, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    5. CONJUGADO descrito pela fórmula (2): (2) caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
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    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    cada E compreende um monômero de domínio Fc; L em cada L-A é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre em uma cisteína de dobradiça em E e em A; T é um número inteiro de 1 a 20, e as duas linhas onduladas conectadas aos dois átomos de enxofre indicam que cada L-A está covalentemente ligado a um par de átomos de enxofre de duas cisteínas de dobradiça nos dois Es, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    6. CONJUGADO descrito pela fórmula (2): (2) caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, - O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
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    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    cada E compreende um monômero de domínio Fc;
    L em cada L-A é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre em uma cisteína de dobradiça em E e em A; T é um número inteiro de 1 a 20, e as duas linhas onduladas conectadas aos dois átomos de enxofre indicam que cada L-A está covalentemente ligado a um par de átomos de enxofre de duas cisteínas de dobradiça nos dois Es, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    7. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por cada E compreender um monômero de domínio Fc tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68.
    8. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por cada monômero de domínio Fc compreender a sequência de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11.
    9. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por pelo menos um do par de átomos de enxofre ser o átomo de enxofre de Cys10, Cys13, Cys16 ou Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11.
    10. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo par de átomos de enxofre serem os átomos de enxofre de Cys10 e Cys13, Cys10 e Cys16, Cys 10 e Cys18, Cys13 e Cys 16, Cys13 e Cys 18, ou Cys 16 e Cys 18 no dois Es.
    11. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo T ser 1, 2, 3, 4 ou 5.
    12. POPULAÇÃO DE CONJUGADOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo valor médio de T ser de 1 a 5.
    13. CONJUGADO descrito pela fórmula (3): (3) caracterizado por cada A1 e cada A2 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, - NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
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    , , , ,
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    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc;
    L em cada A1-L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em E e a cada um de A1 e A2;
    T é um número inteiro de 1 a 20, e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A 1-L-A2 está covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em
    E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    14. CONJUGADO descrito pela fórmula (3): (3) caracterizado por cada A1 e cada A2 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, - O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, - NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, - NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-; R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc;
    L em cada A1-L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em E e a cada um de A1 e A2;
    T é um número inteiro de 1 a 20, e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A 1-L-A2 está covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em
    E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    15. CONJUGADO descrito pela fórmula (3):
    (3)
    caracterizado por cada A1 e cada A2 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc;
    L em cada A1-L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em E e a cada um de A1 e A2;
    T é um número inteiro de 1 a 20, e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A1-L-A2 está covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em
    E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    16. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado por E compreender um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc, independentemente, tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-
    68.
    17. CONJUGADO descrito pela fórmula (4): (4) caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ;
    R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2- C15 heteroaril; E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc; L em cada L-A é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em E e em A; T é um número inteiro de 1 a 20; e a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A está covalentemente ligado ao átomo de enxofre da cisteína de dobradiça em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    18. CONJUGADO descrito pela fórmula (4): (4) caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2- C15 heteroaril;
    E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc; L em cada L-A é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em E e em A; T é um número inteiro de 1 a 20; e a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A está covalentemente ligado ao átomo de enxofre da cisteína de dobradiça em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    19. CONJUGADO descrito pela fórmula (4): (4) caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc;
    L em cada L-A é um ligante covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína de dobradiça em E e em A;
    T é um número inteiro de 1 a 20; e a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A está covalentemente ligado ao átomo de enxofre da cisteína de dobradiça em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    20. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizado por cada E compreender um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc, independentemente, tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-
    68.
    21. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 20, caracterizado por E compreender a sequência de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11.
    22. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo átomo de enxofre estar em Cys10, Cys13, Cys16 ou Cys18 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11.
    23. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 20, caracterizado pelo T ser 1, 2, 3, 4 ou 5.
    24. POPULAÇÃO DE CONJUGADOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15 ou 17 a 19, caracterizada pelo valor médio de T ser de 1 a 5.
    25. POPULAÇÃO DE CONJUGADOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15 ou 17 a 19, caracterizada pelo valor médio de T ser de 1 a 2.
    26. CONJUGADO descrito pela fórmula (3): (3)
    caracterizado por cada A1 e cada A2 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, - O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc;
    L em cada A1- L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a cada um de A1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20, e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A 1-L-A2 está covalentemente ligado ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    27. CONJUGADO descrito pela fórmula (3): (3) caracterizado por cada A1 e cada A2 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, - O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, - NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, - NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc;
    L em cada A1- L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a cada um de A 1 e A2;
    T é um número inteiro de 1 a 20, e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A1-L-A2 está covalentemente ligado ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    28. CONJUGADO descrito pela fórmula (3): (3) caracterizado por cada A1 e cada A2 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, - O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, - NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, - NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-; R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc;
    L em cada A1- L-A2 é um ligante covalentemente ligado a um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a cada um de A 1 e A2;
    T é um número inteiro de 1 a 20, e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A 1-L-A2 está covalentemente ligado ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    29. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, caracterizado por cada E compreender um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc tendo, independentemente, tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-
    68.
    30. CONJUGADO descrito pela fórmula (4): (4) caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2- C15 heteroaril; E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc; L em cada L-A é um ligante covalentemente ligado a um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e em A; T é um número inteiro de 1 a 20, a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A está covalentemente ligado ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    31. CONJUGADO descrito pela fórmula (4): (4) caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2- C15 heteroaril; E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc; L em cada L-A é um ligante covalentemente ligado a um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e em A; T é um número inteiro de 1 a 20, a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A está covalentemente ligado ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    32. CONJUGADO descrito pela fórmula (4): (4) caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2- C15 heteroaril;
    E compreende um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc; L em cada L-A é um ligante covalentemente ligado a um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e em A; T é um número inteiro de 1 a 20, a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A está covalentemente ligado ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    33. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 32, caracterizado por cada E compreender um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc, cada monômero de domínio Fc, independentemente, tendo a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-
    68.
    34. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 33, caracterizado por E compreender a sequência de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11.
    35. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por cada átomo de nitrogênio ser independentemente selecionado de Lys35, Lys63, Lys77, Lys79, Lys106, Lys123, Lys129, Lys181, Lys203, Lys228 e Lys236 de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 .
    36. POPULAÇÃO DE CONJUGADOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28 ou 30 a 32, caracterizada pelo valor médio de T ser de 1 a 5.
    37. POPULAÇÃO DE CONJUGADOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28 ou 30 a 32, caracterizada pelo valor médio de T ser de 1 a 2.
    38. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizado pelo conjugado formar um homodímero que compreende um domínio Fc.
    39. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado por E homodimerizar com outro E para formar um domínio Fc.
    40. CONJUGADO descrito pela fórmula (3): (3) caracterizado por cada A1 e cada A2 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ;
    R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2- C15 heteroaril; E compreende uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação de proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc; L em cada A1-L-A2 é um ligante independentemente covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície ou um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a cada um de A1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20, e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A1-L-A2 é independentemente covalentemente ligado ao átomo de enxofre de uma cisteína exposta ao solvente ou ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta ao solvente em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    41. CONJUGADO descrito pela fórmula (3): (3) caracterizado por cada A1 e cada A2 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; E compreende uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação de proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc; L em cada A1-L-A2 é um ligante independentemente covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície ou um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a cada um de A1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20, e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A1-L-A2 é independentemente covalentemente ligado ao átomo de enxofre de uma cisteína exposta ao solvente ou ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta ao solvente em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    42. CONJUGADO descrito pela fórmula (3): (3) caracterizado por cada A1 e cada A2 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril; E compreende uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação de proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc; L em cada A1-L-A2 é um ligante independentemente covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície ou um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e a cada um de A1 e A2; T é um número inteiro de 1 a 20, e a linha ondulada conectada ao E indica que cada A1-L-A2 é independentemente covalentemente ligado ao átomo de enxofre de uma cisteína exposta ao solvente ou ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta ao solvente em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    43. CONJUGADO descrito pela fórmula (4): (4) caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    E compreende uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação de proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc;
    L em cada L-A é um ligante independentemente covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície ou um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e A;
    T é um número inteiro de 1 a 20; e a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A é independentemente covalentemente ligado ao átomo de enxofre de uma cisteína exposta ao solvente ou ao átomo de nitrogênio da lisina exposta ao solvente em
    E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    44. CONJUGADO descrito pela fórmula (4):
    (4)
    caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    E compreende uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação de proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc;
    L em cada L-A é um ligante independentemente covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície ou um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em E e A;
    T é um número inteiro de 1 a 20; e a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A é independentemente covalentemente ligado ao átomo de enxofre de uma cisteína exposta ao solvente ou ao átomo de nitrogênio da lisina exposta ao solvente em
    E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    45. CONJUGADO descrito pela fórmula (4):
    (4)
    caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-
    C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    E compreende uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação de proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc;
    L em cada L-A é um ligante independentemente covalentemente ligado a um átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície ou um átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície em
    E e A;
    T é um número inteiro de 1 a 20; e a linha ondulada conectada a E indica que cada L-A é independentemente covalentemente ligado ao átomo de enxofre de uma cisteína exposta ao solvente ou ao átomo de nitrogênio da lisina exposta ao solvente em E, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    46. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40-45, caracterizado por E compreender a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71.
    47. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo T ser 1 e L-A estar covalentemente ligado ao átomo de enxofre correspondente a Cys34 da SEQ ID NO: 69.
    48. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 47, caracterizado pelo T ser 1, 2, 3, 4 ou 5.
    49. POPULAÇÃO DE CONJUGADOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 45, caracterizada pelo valor médio de T ser de 1 a 5.
    50. POPULAÇÃO DE CONJUGADOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 45, caracterizada pelo valor médio de T ser de 1 a 2.
    51. CONJUGADO, caracterizado por compreender: (i) uma primeira fração, A 1; (ii) uma segunda fração, A 2; (iii) um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc; e (iv) um ligante covalentemente ligado a A 1 e A 2, e ao monômero do domínio Fc ou ao domínio Fc; definido pelo fato de que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , e ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2- C15 heteroaril, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    52. CONJUGADO, caracterizado por compreender: (i) uma primeira fração, A1; (ii) uma segunda fração, A2; (iii) um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc; e (iv) um ligante covalentemente ligado a A1 e A2, e ao monômero do domínio Fc ou ao domínio Fc;
    definido pelo fato de que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , , , , , , , , , , , , , , , e ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    53. CONJUGADO, caracterizado por compreender: (i) uma primeira fração, A1; (ii) uma segunda fração, A2; (iii) um monômero de domínio Fc ou um domínio Fc; e (iv) um ligante covalentemente ligado a A1 e A2, e ao monômero do domínio Fc ou ao domínio Fc; definido pelo fato de que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-C15 heteroaril, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    54. CONJUGADO, caracterizado por compreender: (i) uma primeira fração, A1; (ii) uma segunda fração, A2; (iii) uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc; e (iv) um ligante covalentemente ligado a A1 e A2, e à proteína de albuina, o peptídeo de ligação à proteína albumina ou o peptídeo de ligação a Fc; definido pelo fato de que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2- C15 heteroaril, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    55. CONJUGADO, caracterizado por compreender: (i) uma primeira fração, A1; (ii) uma segunda fração, A2; (iii) uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc; e (iv) um ligante covalentemente ligado a A1 e A2, e à proteína de albuina, o peptídeo de ligação à proteína albumina ou o peptídeo de ligação a Fc; definido pelo fato de que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, - O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, - NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, - NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-; R6 é selecionado de , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , e ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2- C15 heteroaril, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    56. CONJUGADO, caracterizado por compreender:
    (i) uma primeira fração, A1;
    (ii) uma segunda fração, A2;
    (iii) uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina ou um peptídeo de ligação a Fc; e
    (iv) um ligante covalentemente ligado a A1 e A2, e à proteína de albuina, o peptídeo de ligação à proteína albumina ou o peptídeo de ligação a
    Fc;
    definido pelo fato de que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, - NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , e ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2- C15 heteroaril, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    57. CONJUGADO descrito pela fórmula (D-I): (D-I) caracterizado por cada A1 e cada A2 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, - NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    cada E compreende um monômero de domínio Fc, uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina, ou um peptídeo de ligação a Fc;
    n é 1 ou 2; T é um número inteiro de 1 a 20; e
    L é um ligante covalentemente ligado a cada um de E, A1, e A2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    58. CONJUGADO descrito pela fórmula (D-I): (D-I) caracterizado por cada A1 e cada A2 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, - O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, - NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, - NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-; R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    cada E compreende um monômero de domínio Fc, uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina, ou um peptídeo de ligação a Fc;
    n é 1 ou 2;
    T é um número inteiro de 1 a 20; e
    L é um ligante covalentemente ligado a cada um de E, A1, e A2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    59. CONJUGADO descrito pela fórmula (D-I):
    (D-I)
    caracterizado por cada A1 e cada A2 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX):
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    cada E compreende um monômero de domínio Fc, uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina, ou um peptídeo de ligação a Fc;
    n é 1 ou 2;
    T é um número inteiro de 1 a 20; e
    L é um ligante covalentemente ligado a cada um de E, A 1, e A2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    60. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 59, caracterizado pelo T ser um número inteiro de 2 a 20, em que E é conjugado a uma ou mais primeiras frações A 1-L-A2 , em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-III)-(A-V): e em que E é conjugado com uma ou mais segundas frações A1-L- A2, em que cada A1 e cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I), (A-II), (A-VI), (A-VII), (A-VIII), e (A-IX):
    61. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por cada uma das primeiras frações A1-L-A2 ser conjugada especificamente a um átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina de superfície exposta de E e cada uma das segundas frações A 1-L-A2 ser conjugada especificamente a um átomo de enxofre de uma superfície exposta aos resíduos de cisteína de E.
    62. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por cada uma das primeiras frações A1-L-A2 ser conjugada especificamente a um átomo de enxofre de resíduos de cisteína E expostos à superfície e cada uma das segundas frações A 1-L-A2 ser conjugada especificamente a um átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina de superfície exposta de E.
    63. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 62, caracterizado pelo número das primeiras frações A1-L-A2 conjugadas a E ser um número inteiro de 1 a 10.
    64. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 60 a 63, caracterizado pelo número das segundas frações A1-L- A2 conjugadas a E ser um número inteiro de 1 a 10.
    65. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 57 ou 58, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-II): (D-II) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    66. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-II-1):
    (D-II-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    67. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-II-2): (D-II-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    68. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-II-3):
    (D-II-3) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    69. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado por L' ser um átomo de nitrogênio.
    70. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo conjugado ter a estrutura selecionada de: , , ou
    .
    71. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-II-4): (D-II-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    72. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-II-5):
    (D-II-5) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    73. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado por L' ser um átomo de nitrogênio.
    74. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo conjugado ter a estrutura selecionada de: , , ou .
    75. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo conjugado ter a estrutura de: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    76. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-II-6): (D-II-6) em que R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    77. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-II-7):
    (D-II-7) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    78. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-II-8): (D-II-8) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    79. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo conjugado ter a estrutura de: ,
    ou .
    80. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-II-9): (D-II-9) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    81. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-II-10):
    (D-II-10) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    82. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo conjugado ter a estrutura de: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    83. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 57 ou 59, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-III):
    (D-III) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    84. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-III-1): (D-III-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    85. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-III-2):
    (D-III-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    86. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-III-3): (D-III-3) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    87. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-III-4): (D-III-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    88. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-III-5): (D-III-5) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1-
    20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    89. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-III-6): (D-III-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    90. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-III-7): (D-III-7) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    91. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-III-8): (D-III-8) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    92. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-III-9): (D-III-9)
    em que L' é o restante de L, e 3 y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    93. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 57 ou 59, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-IV): (D-IV) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    94. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-IV-1):
    (D-IV-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    95. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-IV-2): (D-IV-2) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    96. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 57 ou 58, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-V): (D-V)
    ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    97. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-V-1): (D-V-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    98. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-V-2): (D-V-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    99. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-V-3):
    (D-V-3) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    100. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo L' ser um átomo de nitrogênio.
    101. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 99, caracterizado pelo y1 e y2 serem, cada um, 1, y1 e y2 serem, cada um, 2, ou y1 e y2 serem, cada um, 3.
    102. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-V-4):
    (D-III-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    103. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-V-5): (D-V-5) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    104. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo L' ser um átomo de nitrogênio.
    105. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 103, caracterizado pelo y1 e y2 serem, cada um, 1, y1 e y2 serem, cada um, 2, ou y1 e y2 serem, cada um, 3.
    106. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-V-6):
    (D-V-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    107. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-V-7): (D-V-7) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    108. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-V-8): (D-V-8) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    109. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelo L' ser um átomo de nitrogênio.
    110. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelo y1 e y2 serem, cada um, 1, y1 e y2 serem, cada um, 2, ou y1 e y2 serem, cada um, 3.
    111. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-V-9): (D-V-9) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    112. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-V-10): (D-V-10)
    em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    113. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 112, caracterizado pelo L' ser um átomo de nitrogênio.
    114. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 113, caracterizado pelo y1 e y2 serem, cada um, 1, y1 e y2 serem, cada um, 2, ou y1 e y2 serem, cada um, 3.
    115. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 57 ou 59, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VI): (D-VI) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    116. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VI-1):
    (D-VI-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    117. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VI-2): (D-VI-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    118. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VI-3): (D-VI-3) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    119. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VI-4): (D-VI-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    120. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VI-5):
    (D-VI-5) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    121. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VI-6): (D-VI-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    122. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 121, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VI-7): (D-VI-7)
    em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    123. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VI-8): (D-VI-8) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    124. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 123, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VI-9):
    (D-VI-9) em que L' é o restante de L, e 3 y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    125. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 57 ou 59, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VII): (D-VII) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    126. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 96 a 125, caracterizado pelo R1 ser -OH.
    127. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 96 a 125, caracterizado pelo R1 ser -NH2.
    128. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 96 a 125, caracterizado pelo R1 ser -NHC(=NH)NH2.
    129. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 57 ou 58, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VIII):
    (D-VIII) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    130. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 129, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VIII-1): (D-VIII-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    131. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 130, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VIII-2):
    (D-VIII-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    132. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 131, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VIII-3): (D-VIII-3) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    113. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pelo L' ser um átomo de nitrogênio.
    134. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pelo conjugado ter a estrutura selecionada de: ,
    , ou .
    135. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 130, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VIII-4): (D-VIII-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    136. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VIII-5): (D-VIII-5) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    137. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo L' ser um átomo de nitrogênio.
    138. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo conjugado ter a estrutura selecionada de: ,
    , ou .
    139. Conjugado, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que o conjugado é descrito pela estrutura de .
    140. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 130,
    caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VIII-6): (D-VIII-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    141. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 140, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VIII-7): (D-VIII-7) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    142. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 130, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VIII-8): (D-VIII-8) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    143. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 142, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VIII-9): (D-VIII-9) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1-
    20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    144. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 130, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VIII-10): (D-VIII-10) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    145. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-VIII-11): (D-VIII-11) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    146. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 57 ou 58, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-IX): (D-IX) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    147. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 146, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-IX-1): (D-IX-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    148. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 147, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-IX-2):
    (D-IX-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    149. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 147, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-IX-3): (D-IX-3) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    150. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 147, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-IX-4):
    (D-IX-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    151. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 147, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-IX-5): (D-IX-5) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    152. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 147, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-IX-6): (D-IX-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    153. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 57 ou 58,
    caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-X): (D-X) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    154. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 153, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-X-1): (D-X-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    155. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 154, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-X-2): (D-X-2)
    ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    156. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 154, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (D-X-3): (D-X-3) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    157. CONJUGADO descrito pela fórmula (D'-I): (D’-I) caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-III)-(A-V): , , ; (A-III) (A-IV) (A-V) cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I), (A-II), (A-VI), (A-VII), (A-VIII) e (A-IX):
    , , , ,
    , (A-I) (A-II) (A-VI) (A-VII)
    (A-VIII)
    ; (A-IX)
    R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de:
    e
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2- C15 heteroaril; cada E compreende um monômero de domínio Fc, uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação de proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc; n é 1 ou 2; T1 e T2 são, cada um, independentemente um número inteiro de 1 a 10; L1 é um ligante covalentemente conjugado a E e a cada A 1; L2 é um ligante covalentemente conjugado a E e cada A2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    158. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 157, caracterizado pelo A1-L-A1 ser conjugado especificamente a um átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina de superfície exposta de E, e, cada um de, A2- L-A2 ser conjugado especificamente a um átomo de enxofre de um resíduo de cisteína de superfície exposta de E.
    159. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 157, caracterizado por cada fração A1-L-A1 ser conjugada especificamente com um átomo de enxofre de um resíduo de cisteína de superfície exposta de E e cada fração A2-L-A2 ser conjugada especificamente a um átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina de superfície exposta de E.
    160. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 159, caracterizado pelo L ou L' compreender um ou mais C1- C20 alquileno C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2- C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído, C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído, O, S, NRi, P, carbonil, tiocarbonil, sulfonil, fosfato, fosforil ou imino, em que Ri é H, C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído, C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4- C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído.
    160. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 160, caracterizado pela espinha dorsal de L ou L' consistir em um ou mais C1-C20 alquileno C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2- C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído, C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído, O, S, NRi, P, carbonil, tiocarbonil, sulfonil, fosfato, fosforil ou imino, em que Ri é H, , C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído, C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4- C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído.
    162. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 160 ou 161, caracterizado por L ou L' ser oxo substituído.
    163. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 162, caracterizado pela espinha dorsal de L ou L' compreender não mais que 250 átomos.
    164. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 163, caracterizado por L ou L' ser capaz de formar uma ligação amida, carbamato, sulfonil ou ureia.
    165. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 159, caracterizado por L ou L' ser uma ligação.
    166. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 159, caracterizado por L ou L' ser um átomo.
    167. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 166, caracterizado por L ser descrito pela fórmula (D-L-I):
    (D-L-I)
    em que LA é descrito pela fórmula GA1-(ZA1)g1-(YA1)h1-(ZA2)i1-(YA2)j1-
    (ZA3)k1-(YA3)l1-(ZA4)m1-(YA4)n1-(ZA5)o1-GA2;
    LB é descrito pela fórmula GB1-(ZB1)g2-(YB1)h2-(ZB2)i2-(YB2)j2-(ZB3)k2-
    (YB3)l2-(ZB4)m2-(YB4)n2-(ZB5)o2-GB2;
    LC é descrito pela fórmula GC1-(ZC1)g3-(YC1)h3-(ZC2)i3-(YC2)j3-(ZC3)k3-
    (YC3)l3-(ZC4)m3-(YC4)n3-(ZC5)o3-GC2;
    GA1 é uma ligação ligada a Q;
    GA2 é uma ligação ligada a A1;
    GB1 é uma ligação ligada a Q;
    GB2 é uma ligação ligada a A2;
    GC1 é uma ligação ligada a Q;
    GC2 é uma ligação ligada a E ou um grupo funcional capaz de reagir com um grupo funcional conjugado a E (por exemplo, maleimida e cisteína,
    amina e ácido carboxílico ativado, tiol e maleimida, ácido sulfônico ativado e amina, isocianato e amina, azida e alquino e alqueno e tetrazina);
    cada um de ZA1, ZA2, ZA3, ZA4, ZA5, ZB1, ZB2, ZB3, ZB4, ZB5, ZC1, ZC2, ZC3, ZC4, e ZC5 é, independentemente, C1-C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2-
    C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído;
    cada um de YA1, YA2, YA3, YA4, YB1, YB2, YB3, YB4, YC1, YC2, YC3, e
    YC4 é, independentemente, O, S, NRi, P, carbonil, tiocarbonil, sulfonil, fosfato,
    fosforil ou imino;
    Ri é H, , C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído, C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído,
    C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4-
    C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído;cada um de g1, h1, i1, j1, k1, l1, m1, n1, o1, g2, h2,
    i2, j2, k2, l2, m2, n2, o2, g3, h3, i3, j3, k3, l3, m3, n3 e o3 é, independentemente,
    0 ou 1; e
    Q é um átomo de nitrogênio, C1-C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2-
    C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído.
    168. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 167, caracterizado por L ser selecionado de: , , , , , , , , , , , ,
    , ,
    , ,
    , ,
    , ,
    , ,
    , ,
    , ,
    , ,
    , ,
    , ,
    , ,
    , ,
    , ,
    , ,
    , ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    ,
    , ,
    ,
    ;
    ;
    ; ; ; ; ; ; ou , em que z1 e z2 são cada um, independentemente, e inteiros de 1 a 20; e R9 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril.
    169. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 168, caracterizado por Y ser: (-NH(C=O)O-) e L ser: .
    170. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 168, caracterizado por Y ser: (-NH(C=O)O-) e L ser:
    .
    171. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 168, caracterizado por Y ser: (-NH(C=O)O-) e L ser: .
    172. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 168, caracterizado por Y ser: (-O-) e L ser: .
    173. CONJUGADO descrito pela fórmula (M-I): (M-I) caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-XII): , , , ,
    , (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV)
    (A-V)
    , , , , (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX)
    , , ; (A-X) (A-XI) (A-XII)
    em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, - O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    cada E compreende um monômero de domínio Fc, uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina, ou um peptídeo de ligação a Fc;
    n é 1 ou 2; T é um número inteiro de 1 a 20; e L é um ligante covalentemente ligado a cada um de E e A1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    174. CONJUGADO descrito pela fórmula (M-I): (M-I) caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I)-(A-V): , , , , ; (A-I) (A-II) (A-III) (A-IV) (A-V) em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    cada E compreende um monômero de domínio Fc, uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina, ou um peptídeo de ligação a Fc; n é 1 ou 2; T é um número inteiro de 1 a 20; e L é um ligante covalentemente ligado a cada um de E e A1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    175. CONJUGADO descrito pela fórmula (M-I): (M-I) caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-VI)-(A-IX): , , , ; (A-VI) (A-VII) (A-VIII) (A-IX) em que R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e - NHC(=NH)NHR6; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, - OH, -F, -Cl, e -Br; R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H; R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3; X é selecionado de -O- e -S-; Y é selecionado de -O-, -S-, -NR7-, -O(C=O)NR7-, -O(C=S)NR7-, -
    O(C=O)O-, -O(C=O)-, -NH(C=O)O-, -NH(C=O)-, -NH(C=NH)-, -NH(C=O)NR7-, -
    NH(C=NH)NR7-, -NH(C=S)NR7-, -NH(C=S)-, -OCH2(C=O)NR7-, -NH(SO2)-, -
    NH(SO2)NR7-, -OR8-, -NHR8-, e -SR8-;
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril;
    R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2-
    C15 heteroaril;
    cada E compreende um monômero de domínio Fc, uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação a proteína de albumina, ou um peptídeo de ligação a Fc; n é 1 ou 2; T é um número inteiro de 1 a 20; e L é um ligante covalentemente ligado a cada um de E e A 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    176. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 173 a 175, caracterizado pelo T ser um número inteiro de 2 a 20, em que E é conjugado a uma ou mais primeiras frações A 1-L em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-III)-(A-V): , , ; (A-III) (A-IV) (A-V) e em que E é conjugado com uma ou mais segundas frações A1-L- A2, em que cada A1 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I), (A-II), (A-VI), (A-VII), (A-VIII), e (A-IX): , , , ,
    , (A-I) (A-II) (A-VI) (A-VII) (A-VIII) . (A-IX)
    177. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 176, caracterizado por cada uma das primeiras frações A1-L ser conjugada especificamente a um átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina de superfície exposta de E e cada uma das segundas frações A1-L ser conjugada especificamente a um átomo de enxofre de uma superfície exposta aos resíduos de cisteína de E.
    178. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 176, caracterizado por cada uma das primeiras frações A1-L ser conjugada especificamente a um átomo de enxofre de resíduos de cisteína E expostos à superfície e cada uma das segundas frações A1-L ser conjugada especificamente a um átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina de superfície exposta de E.
    179. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 176 a 178, caracterizado pelo número das primeiras frações A1-L conjugadas a E ser um número inteiro de 1 a 10.
    180. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 176 a 179, caracterizado pelo número das segundas frações A1- L conjugadas a E ser um número inteiro de 1 a 10.
    181. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 173 ou 174, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-II): (M-II) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    182. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 181, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-II-1): (M-II-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    183. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 182,
    caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-II-2): (M-II-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    184. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 183, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-II-3): (M-II-3) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    185. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 182, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-II-4): (M-II-4)
    ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    186. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 185, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-II-5): (M-II-5) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    187. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 186, caracterizado pelo conjugado ter a estrutura de: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    188. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 181, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-II-6):
    , (M-II-6) em que R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    189. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 188, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-II-7): , (M-II-7) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    190. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 188, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-II-8):
    (M-II-8) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    191. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 190, caracterizado pelo conjugado ter a estrutura de: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    192. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 188, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-II-9):
    (M-II-9) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    193. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 192, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-II-10): (M-II-10) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    194. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 193,
    caracterizado pelo conjugado ter a estrutura de: ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    195. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 174 ou 175, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-III): (M-III) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    196. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 195,
    caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-III-1): (M-III-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    197. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 196, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-III-2): (M-III-2)
    ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    198. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 197, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-III-3): (M-III-3) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    199. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 196, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-III-4):
    (M-III-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    200. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 199, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-III-5): (M-III-5) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    201. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 196, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-III-6): (M-III-6)
    ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    202. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 201, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-III-7): (M-III-7) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    203. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 196, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-III-8): (M-III-8)
    ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    204. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 203, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-III-9): (M-III-9) em que L' é o restante de L, e 3 y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    205. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 173 ou 174, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-IV): (M-IV)
    ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    206. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 205, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-IV-1): (M-IV-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    207. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 206, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-IV-2): (M-IV-2) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20,
    ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    208. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 173 ou 174, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-V): (M-V) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    209. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 208, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-V-1): (M-V-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    210. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 209, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-V-2):
    (M-V-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    211. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 210, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-V-3): (M-V-3) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    212. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 209, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-V-4): (M-V-4)
    ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    213. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 212, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-V-5): (M-V-5) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    214. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 208, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-V-6): (M-V-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    215. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 214, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-V-7):
    (M-V-7) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    216. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 215, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-V-8): (M-V-8) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    217. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 214, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-V-9):
    (M-V-9) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    218. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 217, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-V-10): (M-V-10) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    219. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 173 ou 174, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VI): (M-VI) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    220. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 219,
    caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VI-1): (M-VI-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    221. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 220, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VI-2): (M-VI-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    222. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 221, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VI-3):
    (M-VI-3) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    223. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 220, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VI-4): (M-VI-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    224. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 223,
    caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VI-5): (M-VI-5) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    225. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 220, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VI-6): (M-VI-6)
    ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    226. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 225, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VI-7): (M-VI-7) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    227. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 220, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VI-8):
    (M-VI-8) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    228. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 227, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VI-9): (M-VI-9) em que L' é o restante de L, e 3 y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    229. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 173 ou 174, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VII):
    (M-VII) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    230. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 173 a 229, caracterizado pelo R1 ser OH.
    231. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 173 a 229, caracterizado pelo R1 ser NH2.
    232. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 173 a 229, caracterizado pelo R1 ser -NHC(=NH)NH2.
    233. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 173 ou 174, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VIII): (M-VIII) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    234. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 233, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VIII-1):
    (M-VIII-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    235. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 234, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VIII-2): (M-VIII-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    236. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 235, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VIII-3): (M-VIII-3) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    237. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 234, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VIII-4):
    (M-VIII-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    238. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 237, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VIII-5): (M-VIII-5) em que L' é o restante de L, e y1 é um número inteiro de 1-20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    239. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 238, caracterizado pelo conjugado ter a estrutura de:
    ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    240. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 234, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VIII-6): (M-VIII-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    241. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 240, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VIII-7):
    (M-VIII-7) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    242. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 234, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VIII-8): (M-VIII-8) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    243. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 242, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VIII-9): (M-VIII-9) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    244. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 234, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VIII-10): (M-VIII-10) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    245. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 244, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-VIII-11):
    (M-VIII-11) em que L' é o restante de L, e y1 e y2 são cada um, independentemente, um número inteiro de 1- 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    246. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 173 ou 174, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-IX): (M-IX) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    247. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 246, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-IX-1): (M-IX-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    248. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 247, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-IX-2): (M-IX-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    249. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 247, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-IX-3): (M-IX-3) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    250. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 247, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-IX-4):
    (M-IX-4) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    251. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 247, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-IX-5): (M-IX-5) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    252. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 247, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-IX-6):
    (M-IX-6) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    253. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 173 ou 174, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-X): (M-X) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    254. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 253, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-X-1):
    (M-X-1) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    255. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 254, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-X-2): (M-X-2) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    256. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 254, caracterizado pelo conjugado ser descrito pela fórmula (M-X-3):
    (M-X-3) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    257. CONJUGADO descrito pela fórmula (M'-I): (M’-I) caracterizado por cada A1 ser independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-III)-(A-V): , , ; (A-III) (A-IV) (A-V) cada A2 é independentemente selecionado de qualquer uma das fórmulas (A-I), (A-II), (A-VI), (A-VII), (A-VIII) e (A-IX):
    , , , ,
    , (A-I) (A-II) (A-VI) (A-VII)
    (A-VIII)
    ; (A-IX)
    R1 é selecionado de -OH, -NH2, -NHC(=NH)NH2, e -
    NHC(=NH)NHR6;
    R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados de -H, -
    OH, -F, -Cl, e -Br;
    R4 é selecionado de -CO2H, -P(=O)(OH)2, -SO3H;
    R5 é selecionado de -COCH3, -COCF3, -SO2CH3;
    X é selecionado de -O- e -S-;
    Y é selecionado de:
    R6 é selecionado de , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , , ,
    , , , ,
    , , , ,
    , , , , , e
    ; R7 é selecionado de H, C1-C20 alquil, C3-C20 cicloalquil, C3-C20 heterocicloalquil; C5-C15 aril, e C2-C15 heteroaril; R8 é selecionado de C3-C20 heterocicloalquil, C5-C15 aril e C2- C15 heteroaril; cada E compreende um monômero de domínio Fc, uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação de proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc; n é 1 ou 2; T1 e T2 são, cada um, independentemente um número inteiro de 1 a 10; L1 é um ligante covalentemente conjugado a E e A1; L2 é um ligante covalentemente conjugado a E e A2, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    258. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 257, caracterizado pelo A1-L ser conjugado especificamente a um átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina de superfície exposto de E, e, cada um de, A2-L ser conjugado especificamente a um átomo de enxofre de um resíduo de cisteína de superfície exposta de E.
    259. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 257, caracterizado por cada fração A1-L ser conjugada especificamente com um átomo de enxofre de um resíduo de cisteína de superfície exposta de E e cada fração A2-L ser conjugada especificamente a um átomo de nitrogênio de um resíduo de lisina exposto na superfície de E.
    260. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 173 a 259, caracterizado por L ou L' compreender um ou mais C1- C20 alquileno C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2- C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído, C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído, O, S, NRi, P, carbonil, tiocarbonil, sulfonil, fosfato, fosforil ou imino, em que Ri é H, C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído, C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4- C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído.
    261. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 260, caracterizado pela espinha dorsal de L ou L' consistir em um ou mais C1-C20 alquileno C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2- C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído, C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído, C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído, O, S, NRi, P, carbonil, tiocarbonil, sulfonil, fosfato, fosforil ou imino, em que Ri é H, , C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído, C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4- C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído.
    262. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 260 ou 261, caracterizado pelo L ou L' ser oxo substituído.
    263. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 173 a 262, caracterizado pela espinha dorsal de L ou L' compreender não mais que 250 átomos.
    264. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 173 a 263, caracterizado por L ou L' ser capaz de formar uma ligação amida, carbamato, sulfonil ou ureia.
    265. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 173 a 259, caracterizado por L ou L' ser uma ligação.
    266. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 173 a 259, caracterizado por L ou L' ser um átomo.
    267. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 173 a 266, caracterizado por cada L ser descrito pela fórmula (M-
    L-I):
    J1-(Q1)g-(T1)h-(Q2)i-(T2)j-(Q3)k-(T3)l-(Q4)m-(T4)n-(Q5)o-J2 em que J1 é uma ligação ligada A1;
    J2 é uma ligação ligada a E ou um grupo funcional capaz de reagir com um grupo funcional conjugado a E (por exemplo, maleimida e cisteína,
    amina e ácido carboxílico ativado, tiol e maleimida, ácido sulfônico ativado e amina, isocianato e amina, azida e alquino e alqueno e tetrazina);
    cada um de Q1, Q2, Q3, Q4, e Q5 é, independentemente, C1-C20 alquileno opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenileno opcionalmente substituído, C2-C20 alquinileno opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinileno opcionalmente substituído, C3-C20 cicloalquileno opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquileno opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenileno opcionalmente substituído,
    C4-C20 heterocicloalquenileno opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinileno opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinileno opcionalmente substituído, C5-C15 arileno opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroarileno opcionalmente substituído;
    cada um de T1, T2, T3, T4 é, independentemente, O, S, NRi, P,
    carbonil, tiocarbonil, sulfonil, fosfato, fosforil ou imino; e
    Ri é H, C1-C20 alquil opcionalmente substituído, C1-C20 heteroalquil opcionalmente substituído, C2-C20 alquenil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquenil opcionalmente substituído, C2-C20 alquinil opcionalmente substituído, C2-C20 heteroalquinil opcionalmente substituído,
    C3-C20 cicloalquil opcionalmente substituído, C3-C20 heterocicloalquil opcionalmente substituído, C4-C20 cicloalquenil opcionalmente substituído, C4-
    C20 heterocicloalquenil opcionalmente substituído, C8-C20 cicloalquinil opcionalmente substituído, C8-C20 heterocicloalquinil opcionalmente substituído, C5-C15 aril opcionalmente substituído ou C2-C15 heteroaril opcionalmente substituído; e cada um de g, h, i, j, k, l, m, n e o é, independentemente, 0 ou 1.
    268. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 267, caracterizado pelo R1 ser -NHC(=NH)NH2.
    269. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 268, caracterizado pelo R2 ser -F.
    270. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 269, caracterizado pelo R3 ser -F.
    271. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 270, caracterizado pelo R4 ser –CO2H.
    272. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 271, caracterizado pelo R5 ser –COCH3.
    273. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 272, caracterizado pelo L estar covalentemente ligado ao átomo de nitrogênio de uma lisina exposta à superfície de E.
    274. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 272, caracterizado pelo L estar covalentemente ligado ao átomo de enxofre de uma cisteína exposta à superfície de E.
    275. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 274, caracterizado por cada E ser um monômero de domínio Fc.
    276. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 275, caracterizado por n ser 2, e cada E dimerizar para formar um domínio Fc.
    277. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 59, caracterizado por n ser 2, cada E ser um monômero de domínio Fc, cada E se dimerizar para formar um domínio Fc e o conjugado ser descrito pela fórmula (D-I-1): (D-I-1) em que J é um domínio Fc; e T é um número inteiro de 1 a 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    278. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 173 a 175, caracterizado por n ser 2, cada E ser um monômero de domínio Fc, cada E se dimerizar para formar um domínio Fc e o conjugado ser descrito pela fórmula (M-I-1): (M-I-1) em que J é um domínio Fc; e T é um número inteiro de 1 a 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    279. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 275 a 278, caracterizado por cada E ter a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-68.
    280. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 275 a 279, caracterizado pelo T ser 1, 2, 3, 4 ou 5.
    281. POPULAÇÃO DE CONJUGADOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 275 a 280, caracterizada pelo valor médio de T ser de 1 a 5.
    282. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 274, caracterizado por cada E ser uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação de proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de
    Fc.
    283. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 252, caracterizado por n ser 1.
    284. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 a 59, caracterizado por n ser 1, E ser uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação de proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc e o conjugado ser descrito pela fórmula (D-I-2) : (D-I-2) em que E é uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação de proteína de albumina ou peptídeo de ligação de Fc; T é um número inteiro de 1 a 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    285. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 173 a 175, caracterizado por n ser 1, E ser uma proteína de albumina, um peptídeo de ligação de proteína de albumina ou um peptídeo de ligação de Fc e o conjugado ser descrito pela fórmula (M-I-2) : (M-I-2) em que E é uma proteína de albumina, peptídeo de ligação de proteína de albumina ou peptídeo de ligação de Fc; e T é um número inteiro de 1 a 20, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
    286. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282 a 285, caracterizado pelo E ser uma proteína albumina com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NOs: 69-71.
    287. CONJUGADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282 a 285, caracterizado pelo T ser 1, 2, 3, 4 ou 5.
    288. POPULAÇÃO DE CONJUGADOS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 282 a 287, caracterizada pelo valor médio de T ser de 1 a 5.
    289. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um conjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1-288, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
    290. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE UM SUJEITO COM UMA INFECÇÃO VIRAL ou que se presume que tenha uma infecção viral, o método caracterizado por compreender administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um conjugado ou composição, como definida(o) em qualquer uma das reivindicações 1 a 289.
    291. MÉTODO PARA O TRATAMENTO PROFILÁTICO de uma infecção viral em um sujeito em necessidade do mesmo, o método, caracterizado por compreender administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um conjugado ou composição como definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 289.
    292. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 290 ou 291, caracterizado pela infecção viral ser causada pelo vírus influenza ou vírus parainfluenza.
    293. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 290 a 292, caracterizado pela infecção viral ser o vírus influenza A, B ou C ou o vírus parainfluenza.
    294. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 290 a 293, caracterizado pelo sujeito ser imunocomprometido.
    295. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 290 a 294, caracterizado pelo sujeito ter sido diagnosticado com deficiência imunológica humoral, deficiência de células T, neutropenia, asplenia ou deficiência de complemento.
    296. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 290 a 295, caracterizado pelo sujeito estar sendo tratado ou estar prestes a ser tratado com uma terapia imunossupressora.
    297. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 290 a 296, caracterizado pelo referido sujeito ter sido diagnosticado com uma doença que causa imunossupressão.
    298. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 297, caracterizado pela doença ser câncer ou síndrome de imunodeficiência adquirida.
    299. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 298, caracterizado pelo câncer ser leucemia, linfoma ou mieloma múltiplo.
    300. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 290 a 299, caracterizado pelo sujeito ter sido submetido ou estar prestes a se submeter a um transplante de células-tronco hematopoiéticas.
    301. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 290 a 300, caracterizado pelo sujeito ter sido submetido ou estar prestes a sofrer um transplante de órgão.
    302. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 290 a 301, caracterizado pelo conjugado da composição ser administrado por via intramuscular, intravenosa, intradérmica, intra-arterial, intraperitoneal, intralesional, intracraniana, intra-articular, intraprostática, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarretal, tópica, intratumoral, peritoneal, subcutânea, subconjuntiva, intravesicular, mucosa, intrapericardial, intraumbilical, intraocular, oral, local, por inalação, por injeção ou por infusão.
    303. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 290 a 302, caracterizado pelo sujeito ser tratado com um segundo agente terapêutico.
    304. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 303, caracterizado pelo segundo agente terapêutico ser um agente antiviral.
    305. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 304, caracterizado pelo agente antiviral ser selecionado de oseltamivir, zanamivir, peramivir, laninamivir, amantadina ou rimantadina.
    306. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 303, caracterizado pelo segundo agente terapêutico ser uma vacina antiviral.
    307. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 306, caracterizado pela vacina antiviral desencadear uma resposta imune no sujeito contra o vírus influenza A, B ou C ou o vírus parainfluenza.
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