ES2678143T3 - Opsonina obtenida por ingeniería genética para la detección y el tratamiento de microorganismos patógenos - Google Patents

Abstract

Proteína de fusión de opsonina recombinante que comprende: un dominio de reconocimiento de carbohidrato de una lectina de unión a manosa (MBL) en donde el dominio de reconocimiento de carbohidrato permite la unión a manosa en la superficie de un microbio condensado a una porción Fc de una inmunoglobulina, en donde la proteína de fusión de opsonina recombinante excluye un dominio funcional de la opsonina que se une a una serina proteasa asociada a lectina de unión a manano (MASP).

Description

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DESCRIPCION

Opsonina obtenida por ingenierla genetica para la deteccion y el tratamiento de microorganismos patogenos Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a inmunologla molecular, microbios patogenos, y sistemas para detectar y/o eliminar microorganismos patogenos en fluidos, incluyendo fluidos corporales tales como sangre. Mas especlficamente, por ejemplo, la presente invencion proporciona una opsonina molecular obtenida por ingenierla genetica que se puede usar para unirse a microorganismos patogenos biologicos o identificar subclases o especies especlficas de microorganismos patogenos para su uso en dispositivos y sistemas para el tratamiento y diagnostico de pacientes con enfermedades infecciosas, enfermedades de transmision sangulnea, o sepsis.

Antecedentes

En los Estados Unidos de America, la sepsis es la segunda causa principal de muerte en los pacientes de UCI no coronaria, y la decima causa mas comun de muerte general. La sepsis es una afeccion medica grave que se caracteriza por un estado inflamatorio corporal completo (denominado slndrome de respuesta inflamatoria sistemica) y la presencia de una infeccion conocida o sospechada. Por lo general, la sepsis se produce durante bacteremia, viremia o fungemia, y puede ser el resultado de infecciones que estan causadas por microorganismos patogenos, tales como Staphylococcus aureus, que no son microorganismos patogenos de transmision sangulnea habituales. Los microorganismos patogenos de transmision sangulnea son microorganismos que causan una enfermedad cuando se transfieren desde una persona infectada a otra persona a traves de la sangre u otros fluidos corporales potencialmente infectados. Las enfermedades mas comunes incluyen hepatitis B, virus de la inmunodeficiencia humana, malaria, hepatitis C, y slfilis.

Desafortunadamente, el slndrome de respuesta inflamatoria sistemica se puede volver mortal antes de que se haya identificado el agente de la infeccion mediante un cultivo sangulneo. Esta respuesta inmunologica causa una activacion extendida de protelnas de fase aguda, que afecta al sistema de complemento y a las rutas de coagulacion, que a continuation causan danos tanto en la vasculatura como en los organos. Tambien se activan diversos sistemas contrarreguladores neuroendocrinos, agravando a menudo el problema. Incluso con un tratamiento inmediato y agresivo, esto puede progresar a slndrome de disfuncion organica multiple y finalmente la muerte. Por lo tanto, existe la necesidad de tecnicas mejoradas para el diagnostico y el tratamiento de pacientes con enfermedades infecciosas, infecciones de transmision sangulnea, sepsis, o slndrome de respuesta inflamatoria sistemica. El documento de Patente WO03/054164A2 desvela polinucleotidos de lectina de tipo C y metodos de preparation y el uso de los mismos. El documento de Patente WO04/018698A2 desvela composiciones de lectina y metodos para modular una respuesta inmune. El documento de Patente WO09/126346A2 desvela metodos para prevenir y tratar infecciones con lectina de union a manano y protelnas de fusion ficol-MBL. El documento de Patente WO09/062195A2 desvela protelnas de fusion de lectinas de union a manosa para el tratamiento de enfermedades. El documento de Patente US2008/0193965A1 desvela la deteccion y el analisis de microorganismos usando reconocimiento de carbohidrato y lectinas.

Sumario

La presente invencion proporciona una protelna de fusion de opsonina molecular obtenida por ingenierla genetica que se define mediante las reivindicaciones que se puede usar para unirse a microorganismos patogenos biologicos o identificar subclases o especies especlficas de microorganismos patogenos para su uso en dispositivos y sistemas para el tratamiento y el diagnostico de pacientes con enfermedades infecciosas, infecciones de transmision sangulnea o sepsis; o en la identification de microorganismos patogenos que se trasmiten por el agua o la comida. La presente divulgation proporciona una lectina de union a manosa (MBL), que es una protelna del suero natural abundante que es parte del sistema inmune innato. La capacidad esta protelna lectina para unirse a las moleculas superficiales de casi todas las clases de biopatogenos (virus, bacterias, hongos, protozoos) hace las formas obtenidas por ingenierla de MBL extremadamente utiles en el diagnostico y el tratamiento de enfermedades infecciosas y sepsis.

Una realization de la presente divulgacion proporciona una opsonina recombinante que comprende un dominio de reconocimiento de carbohidrato de una opsonina, un dominio de union a sustrato, y un dominio de peptido flexible que une el dominio de reconocimiento al dominio de union a superficie solida. En aspectos de la divulgacion, el dominio de reconocimiento de carbohidrato es una lectina o un fragmento de una lectina. Alternativamente, el dominio de reconocimiento de carbohidrato es una colectina o ficolina, o una parte o fragmento de estas. En un aspecto particular, el dominio de reconocimiento de carbohidrato (CRD) comprende una parte de MBL que comienza en el resto de prolina 81 en el extremo N-terminal de la parte de lectina de la opsonina obtenida por ingenierla genetica. En otro aspecto particular, el dominio de reconocimiento de carbohidrato comprende la parte de MBL que comienza en el resto de glicina 111 en el extremo N-terminal de la parte de lectina de la opsonina obtenida por ingenierla genetica.

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En un aspecto particular de la divulgacion, el dominio de union a sustrato de la opsonina recombinante comprende uno o mas restos de cistelna que permiten la reticulacion qulmica a un sustrato solido. El sustrato solido puede comprender una microperla magnetica (que puede estar revestida con protelna A), una membrana microporosa, un reactor de fibra hueca, o cualquier otra membrana u dispositivo de flujo de filtracion sangulnea. En otros aspectos, el sustrato puede ser la superficie de celulas, tales como celulas inmunes (por ejemplo, macrofagos), las superficies de celulas que revisten los tejidos u organos del sistema inmune (por ejemplo, ganglios linfaticos o bazo), o la superficie de la matriz extracelular de tejidos u organos del sistema inmune.

En otro aspecto de la divulgacion, el dominio de peptido flexible puede comprender al menos un segmento Glicina + Serina y/o al menos un segmento Prolina + Alanina + Serina. En otro aspecto de la presente invencion, el conector flexible es una porcion Fc de una inmunoglobulina, tal como Fcy. La fusion de Fc IgG1 humana al cuello y las regiones CRD de MBL mejora la expresion y la purificacion y el acoplamiento a un sustrato en una forma activa.

Una realizacion de la invencion proporciona un metodo de recogida de un microorganismo de union a opsonina de un fluido que comprende poner en contacto el fluido con una protelna de fusion de opsonina recombinante que se define mediante las reivindicaciones, conjugada a una superficie solida; en el que la opsonina recombinante consiste en un dominio de reconocimiento de carbohidrato de una opsonina, un dominio de union a sustrato solido, y un dominio de peptido flexible que une el dominio de reconocimiento al dominio de union a superficie solida; permitir que el microorganismo de union a opsonina se una a dicho conjugado opsonina recombinante-superficie solida; y separar dicho fluido de dicho conjugado opsonina recombinante unida a microorganismo-superficie solida. El fluido puede ser un fluido biologico, tal como sangre, obtenido de un sujeto. El fluido se puede devolver a continuacion al sujeto.

Otra realizacion de la divulgacion proporciona un metodo de tratamiento de una infeccion sangulnea en un sujeto que comprende administrar una opsonina recombinante a la sangre del sujeto, en el que la opsonina recombinante consiste en un dominio reconocimiento de carbohidrato de una opsonina, un dominio de union a sustrato, y un dominio de peptido flexible que une el dominio de reconocimiento al dominio de union a sustrato, en el que el dominio de reconocimiento de carbohidrato se une a un microorganismo de union a opsonina, y en el que el dominio de union a sustrato se une a una celula, tejido u organo del sistema inmune; permitir que la opsonina recombinante se una al microorganismo de union a opsonina; y permitir que la opsonina recombinante unida al microorganismo se una a una celula, tejido u organo del sistema inmune en el que se elimina el microorganismo. El sujeto puede ser un animal o un ser humano.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra un diagrama de lectina de union a manosa (MBL) obtenida por ingenierla genetica en conjuntos de trlmeros (pollmeros) en una realizacion de la presente invencion.

Las Figuras 2A y 2B son diagramas de una realizacion de la presente invencion en la que una protelna artificial (Figura 2A) que comprende un extremo N-terminal no impedido estericamente (opcionalmente con una cistelna en o cerca del extremo N-terminal), seguido por un segmento largo y flexible de peptido, y a continuacion un dominio de lectina MBL en el extremo C-terminal, esta reticulada a un sustrato solido en el dispositivo a modo de ejemplo en la Figura 2B.

La Figura 3 muestra un diagrama de una realizacion de la invencion, Fc-MBL.81, tanto en una vineta como en forma de modelo basado en los modelos de cristalografla de rayos X de Fc y del cuello y los dominios de reconocimiento de carbohidrato (CRD) de MBL.

La Figura 4 es un esquema de un vector que codifica Fc en un aspecto de la invencion.

La Figura 5 muestra la union dependiente de calcio de Dynabead-MBL a C. albicans en la que el calcio mantiene la union y el AEDT a desestabiliza la union.

La Figura 6 muestra la union de MBL-perlas magneticas a diferentes patogenos. Los patogenos se unieron mediante MPL-perlas magneticas revestidas (control: perlas sin MBL), se lavaron, y se eluyeron sobre placas de cultivo.

La Figura 7 muestra datos de union de MBL-perlas magneticas a microorganismos y ensayo de cultivo durante una noche. Los patogenos se unieron mediante MBL-perlas magneticas revestidas (control: perlas sin MBL), se lavaron, y se eluyeron sobre placas de cultivo y se incubaron durante una noche.

La Figura 8 demuestra altos niveles de expresion de FcMBL de transfeccion transitoria. La Figura 8A es una transferencia de Western de un gel reducido cargado con sobrenadante sin purificar de 293 celulas transfectado con pFUSEFc MBL.81 (y pFUSE Fc) y con sonda de anti-hFc. La Figura 8B muestra Protelna A-FcMBL.81 purificada.

La Figura 9 muestra resultados de un ensayo de agotamiento en el que la construccion FcMBL.81 fue tan activa como MBL de longitud completa en union a C. albicans.

Descripcion detallada

Se ha de entender que la presente invencion no se limita a la metodologla particular, protocolos, y reactivos, etc., que se describen en el presente documento y como tales pueden variar. La terminologla que se usa en el presente documento es con el fin de describir unicamente realizaciones particulares, y no se pretende que limite el ambito de

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la presente invention, que se define unicamente mediante las reivindicaciones.

Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, las formas en singular incluyen la referencia en plural y viceversa a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. A diferencia de los ejemplos operativos, o cuando se indique de otro modo, todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reaction que se usan en el presente documento se deberla entender que estan modificados en todos los casos con el termino "aproximadamente".

Todos los documentos de patente y otras publicaciones identificadas se incorporan expresamente en el presente documento por referencia con el fin de describir y desvelar, por ejemplo, las metodologlas que se describen en tales publicaciones que se pudieran usar junto con la presente invencion. Estas publicaciones se proporcionan unicamente para su divulgation antes de la fecha de presentation de la presente solicitud. No se deberla interpretar nada a este respecto como la admision de que los inventores estan facultados para antedatar tal divulgacion en virtud de invencion anterior o por cualquier otra razon. Todas las declaraciones en lo que se refiere a la fecha o la representation en lo que se refiere a los contenidos de estos documentos se basan en la information disponible para los solicitantes y no constituye ninguna admision en lo que se refiere a la correction de las fechas o los contenidos de estos documentos.

A menos que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientlficos que se usan en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende de forma habitual el experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invencion. Aunque se puede usar cualquier metodo, dispositivo, y material conocido en la practica o en el ensayo de la invencion, en el presente documento se describen los metodos, dispositivos, y materiales a este respecto.

En el sentido mas amplio, las opsoninas son protelnas que se unen a la superficie de una partlcula. En la naturaleza, las opsoninas actuan como mejoradores de union para el proceso de fagocitosis, por ejemplo, mediante el revestimiento de las moleculas con carga negativa sobre una membrana de un patogeno diana. La presente invencion proporciona una opsonina molecular obtenida por ingenierla genetica, tal como lectina de union a manosa (MBL), que se puede usar para unir patogenos biologicos o identificar subclases o especies especlficas de patogenos para su uso en dispositivos y sistemas para el tratamiento y el diagnostico de pacientes con enfermedades infecciosas, infecciones de transmision sangulnea o sepsis. El tratamiento se puede llevar a cabo in vivo o ex vivo.

MBL es una opsonina de lectina de suero que se une a manosa, carbohidratos que contienen N-acetilglucosamina (NAG), y otros carbohidratos diversos que estan presentes en la superficie de numerosos patogenos microbianos. MBL (tambien denominada protelna de union a manosa o manano, MBP) es una protelna polimerica ensamblada a partir de tres o mas monomeros de 32 kDa. Cada monomero tiene una region N-terminal rica en cistelna, una region gly-X-Y de tipo colageno, una region de cuello y un dominio de reconocimiento de carbohidrato. El ensamblaje de los pollmeros de mayor peso molecular (MW) comienza con la formation de trlmeros del monomero de 32 kDa; estos trlmeros se autoensamblan a continuation en pollmeros de mayor MW de tres a seis conjuntos de trlmeros. Vease la Figura 1.

MBL es un componente clave en la opsonization de patogenos microbianos y en la activation del complemento (a traves de la ruta de la lectina) y la coagulation. La opsonizacion es la union de protelnas a celulas diana y la fijacion como diana de estas celulas para la captation y destruction por parte de celulas fagoclticas, tales como macrofagos y neutrofilos. Esta opsonizacion parece estar mediada por el dominio N-terminal rico en cistelna pequeno de MBL as! como C3b depositado en la superficie de las celulas diana mediante la activacion de la ruta del complemento de la lectina mediada por MBL.

En la activacion del complemento a traves de la ruta de la lectina, el microbio y protelnas especializadas, es decir, MASP-1 (serina proteasa asociada a lectina de union a manano) (Matsushita & Fujita, 176 J. Exp. Med. 1497 (1992)), y MASP-2 (Thiel et al., 386 Nat. 506 (1997)), interactuan con la MBL unida y activan el complemento en ausencia de anticuerpos. Los complejos de MBL de mayor peso molecular (de 5 a 6 repeticiones del trlmero de MBL funcional) son potentes activadores del complemento a traves de esta ruta de la lectina, en la que MASP 2 parece activar el complemento, y MASP 1 activa la coagulacion. Los complejos menores (de tres a cuatro repeticiones de la unidad de trlmero de MBL) son los activadores mas potentes de la coagulacion. Krarup et al., 2 PLoS One e623 (2007).

En ciertas poblaciones humanas, existe una alta frecuencia alelica de mutaciones en MBL en la helice de colageno, en los codones 52, 54, y 57. Garred et al., 7 Genes Immun. 85 (2006). Estas mutaciones evitan la formacion de las formas de MBL de mayor peso molecular y suprimen la activacion del complemento. En estos casos, MBL aun funciona como una opsonina y estimula la coagulacion, pero sin la activacion del complemento. Tambien existen algunas evidencias de una ventaja heterocigotica con respecto a la sepsis, en la que los heterocigotos tienen la mejor supervivencia, los homocigotos "de tipo salvaje" la segunda mejor, y los homocigotos "mutantes" tienen la peor supervivencia. Vease Sprang et al., 49 Clin. Infect Dis. 1380 (2009). Ademas, los neonatos homocigotos mutantes son particularmente susceptibles a la infection antes de que el sistema inmune adquirido comience a

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funcionar.

Ha habido mucho debate con respecto a la utilidad de MBL como protelna terapeutica recombinante para el tratamiento de enfermedades infecciosas. Se ha usado MBL intacta en ensayos cllnicos en fase 1 y fase 2, tanto como protelna recombinante como cuando se purifica a partir de donaciones de sangre humana. De hecho, se ha usado MBL obtenida a partir de plasma como agente terapeutico en ensayos en fase 1 y fase II de pacientes pediatricos deficientes en MBL con neutropenia inducida por quimioterapia. Frakking et al., 45 Eur. J. Cancer 50 (2009). Los esfuerzos comerciales por desarrollar MBL han fracasado debido a las dificultades tanto en la produccion de la protelna recombinante como en la eficacia de estabilizacion. Como se usa en el presente documento, tratamiento o tratar a un sujeto se puede referir a los cuidados medicos que se proporcionan para controlar, mejorar, o aliviar una enfermedad, afeccion, o los slntomas de las mismas.

La presente invencion proporciona opsoninas obtenidas por ingenierla genetica, por ejemplo, MBL o pollmeros MBL obtenidos por ingenierla genetica, para su uso en dispositivos y sistemas para la deteccion y eliminacion de microorganismos patogenos. La Figura 5 muestra la union dependiente de calcio de microperlas magneticas conjugadas con MBL a la levadura C. albicans. Las Figuras 6 y 7 comparan la union de MBL-perla magnetica entre varios patogenos diferentes, incluyendo la bacteria grampositiva S. aureus; las bacterias gramnegativas Klebsiella y E. coli; y la levadura C. albicans. Los trabajos recientes han demostrado la viabilidad del uso de tecnicas micromagneticas y microfluidas combinadas para eliminar microorganismos patogenos vivos de fluidos circulantes, tales como fluidos biologicos, tales como sangre. Xia et al., 8 Biomed. Dev. Biomed. Microdev. 299 (2006); Yung et al., Lab on a Chip DOI: 10.1039/b816986a (2009). En estos microdispositivos (microperlas magneticas que estan revestidas con moleculas que se unen de forma especlfica a marcadores superficiales en las celulas de microorganismos patogenos), se permite que se unan a estas celulas en sangre humana completa, y a continuacion se extraen exentas de la sangre que fluye a traves de canales microfluidos usando un gradiente de campo magnetico aplicado. Veanse los documentos de Patente WO/2008/130618; WO/2007/044642.

Entre otros usos, estos dispositivos son una gran promesa para limpiar con rapidez la sangre de pacientes septicos de microorganismos patogenos que producen toxinas, y por lo tanto aumentan en gran medida la respuesta a las terapias antibioticas convencionales. La capacidad de unirse, detectar y aislar con rapidez (en minutos) microorganismos patogenos vivos que circulan en la sangre, o presentes en otros fluidos biologicos, usando un microdispositivo potencialmente barato y facil de usar tambien sortea las limitaciones principales de los ensayos de deteccion y de prueba de sensibilidad de microorganismos patogenos actuales que requieren multiples dlas de cultivo microbiano en los hospitales o los laboratorios comerciales.

Los fluidos biologicos que se pueden usar en la presente invencion incluyen, por ejemplo, sangre, llquido cefalorraquldeo, fluido articular, orina, semen, saliva, lagrimas, y fluidos que se recogen por insercion de una aguja. Ademas, se pueden recoger fluidos de muestras de alimentos o agua para ensayos de contaminacion generales y rapidos de acuerdo con la presente invencion: tal fluido se puede recoger y analizar para contaminacion microbiana natural o para posible contaminacion por "bioterrorismo".

Ademas, la eficacia actual de estos metodos aprovecha el conocimiento de la tecnica anterior de microorganismos patogenos especlficos que se desea eliminar de la sangre, debido a que se situa un ligando especlfico para ese patogeno (por ejemplo, un anticuerpo especlfico) sobre las microperlas magneticas antes de usar el dispositivo de limpieza de la sangre. De ese modo, la presente invencion refuerza los enfoques actuales mediante la provision de moleculas de union genericas obtenidas por ingenierla genetica que funcionan como opsoninas biologicas y se unen a muchos o la totalidad de tipos especlficos de patogenos microbianos segun requiera la aplicacion. A este respecto, la presente invencion tiene aplicaciones terapeuticas.

Otra necesidad que se aborda en el presente documento es el desarrollo de opsoninas especlficas de clase de microorganismo patogeno especializadas que se unan, por ejemplo, a la totalidad de los tipos de hongos o a la totalidad de las bacterias gramnegativas o a la totalidad o a bacterias grampositivas especlficas o a la totalidad de los virus o a la totalidad de los protozoos, dado que este conocimiento podrla aconsejar con rapidez a los medicos en su seleccion de terapias antimicrobianas antes de que se identifique la caracterizacion completa del tipo de especie de sensibilidad antibiotica con los metodos convencionales que a menudo requieren muchos dlas para completarse.

Ademas, con el uso de la ingenierla genetica, y las estrategias de evolucion y seleccion dirigidas, se pueden obtener por ingenierla genetica versiones modificadas de opsoninas naturales, tales como MBL, que se unan a microorganismos patogenos de forma especlfica a la especie. Finalmente, se puede conseguir una union que sea especlfica para una sensibilidad de microorganismo patogeno a diferentes antibioticos o sustancias terapeuticas antimicrobianas usando estrategias de seleccion apropiadas. Por lo tanto, la presente invencion proporciona el desarrollo de opsoninas obtenidas por ingenierla genetica que proporcionan estas propiedades de alto valor.

MBL es una excelente seleccion para su uso como opsonina generica para los fines que se describen en el presente documento; sin embargo, por lo general, la molecula intacta no se usa en presencia de la sangre completa debido a que tiene multiples dominios funcionales que estimulan la coagulacion sangulnea que pueden interferir con la

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funcion diagnostica y terapeutica del microdispositivo. Esta caracterlstica de MBL se puede separar de su funcion de union a microorganismo patogeno como se proporciona en el presente documento. De forma mas especlfica, MBL contiene cuatro partes, de extremo N-terminal a C-terminal: un dominio N-terminal pequeno de funcion basicamente desconocida que puede estar implicado en la union a macrofagos y/o la union a MASP; un segmento de colageno que tambien puede estar implicado en la union a MASP y la oligomerizacion de orden superior; un segmento de "cuello" alfa-helicoidal que es suficiente para la trimerizacion; y el dominio de lectina de CRD en el extremo C- terminal que media la union directa al microorganismo patogeno. El dominio de lectina es util para la aplicacion manual, y los demas dominios pueden estar presentes o ser eliminados dependiendo de las necesidades del usuario, y se puede determinar mediante ensayo de rutina. Ademas, la actividad de lectina es dependiente de calcio, de modo que los microbios unidos se podrlan liberar mediante un agente quelante con fines diagnosticos.

Una realization de una configuration obtenida por ingenierla genetica de MBL, util como opsonina generica para aplicaciones diagnosticas y terapeuticas, comprende el dominio de lectina de MBL. Por ejemplo, la Glicina 111 (como se define en el Colaboratorio de Investigation para la Bioinformatica Estructural, Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB), archivo estructural 1HUP del Banco de Datos de Protelnas, Protein Data Bank) es un punto N-terminal conveniente en el que comenzar la parte de lectina de la opsonina obtenida por ingenierla genetica. Debido a que la union de MBL a un azucar monomerico dado es debil, la MBL se puede unir a la matriz solida de una forma flexible de un modo tal que las protelnas sobre la superficie se puedan mover y ajustar a la forma del microbio. Por ejemplo, se puede situar un peptido flexible, tal como uno o mas segmentos de Glicina + Serina o uno o mas segmentos de Prolina + Alanina + Serina, u otro u otros conectores peptldicos conocidos en la tecnica, en el extremo N-terminal de MBL, como en la Figura 2A, debido a que estos segmentos tienden a no formar estructuras dobladas.

Otra realizacion de una configuracion obtenida por ingenierla genetica de MBL, util como opsonina generica para aplicaciones diagnosticas y terapeuticas, comprende el cuello y los dominios de lectina de MBL. La Prolina 81 (como se define en el archivo estructural 1HUP del Colaboratorio de Investigacion para la Bioinformatica Estructural, Banco de Datos de Protelnas, (RCSB PDB)) es un punto N-terminal conveniente en el que empezar la secuencia de la lectina para esta construction de opsonina obtenida por ingenierla genetica. Esta parte de MBL se condensa corriente abajo (C-terminal) a la portion Fc de IgG humana (Fcy). La portion Fc puede incluir la interfase CH2-CH3 del dominio Fc de IgG, que contiene los sitios de union para un cierto numero de receptores de Fc que incluyen la protelna A estafilococica. En uso, la porcion Fc se dimeriza y refuerza la afinidad de avidez de la union mediante lectinas MBL a azucares monomericos. Ademas, cuando se usa como reactivo de diagnostico, se puede retirar la glucosilacion unida a N de la opsonina recombinante. Por ejemplo, en Fc MBL.81 la glucosilacion se puede retirar mediante el cambio del aminoacido en el resto 297 de asparagina a acido aspartico (N297D) en el sistema de Kabat de numeration de aminoacidos en anticuerpos, este corresponde al aminoacido 82 en esta construccion de Fc particular. Fc glucosilado mantiene la orientation correcta para la citotoxicidad mediada por celulas (ADCC) y la citotoxicidad mediada por complemento (CDC) dependientes de anticuerpos mediados por Fc.

La opsonina Fc MBL obtenida por ingenierla genetica se podrla usar en la activation de la captation mediada por receptores de Fc de Mycobacterium tuberculosis opsonizado con Fc MBL, evitando la captacion mediada por receptores de manosa de M. tuberculosis. Las publicaciones recientes (Kang et al., 202 J. Exp. Med. 987 (2005)), sugieren que el lipoarabinomanano (ManLaM) de la superficie de las celulas de M. tuberculosis se acopla al receptor de manosa de los macrofagos (MMR) durante el proceso de fagocitosis. Esto dirige al M. tuberculosis a su nicho fagosomico inicial e inhibe la fusion fagosoma-lisosoma (P-L), potenciando de ese modo la supervivencia en los macrofagos humanos. De forma interesante, la inhibition de la fusion P-L no se produjo con la entrada a traves de receptores Fcy. En una realizacion, la captacion mediante endocitosis del receptor de Fc dirige la bacteria (por ejemplo M. tuberculosis, a diferentes veslculas intracelulares.

La configuracion de la opsonina obtenida por ingenierla genetica de la presente invention tambien contribuye a la union de la protelna de fusion a un sustrato, tal como una superficie solida de una microperla magnetica o una membrana microporosa, mediante el uso de un reticulador qulmico que es especlfico para el grupo amino en el extremo N-terminal, o a un resto de cistelna libre que se ha obtenido por ingenierla genetica para que este cerca del extremo N-terminal de la protelna, como en la Figura 2B (la lisina es una alternativa a la cistelna, seguido opcionalmente de la retirada del resto de los restos de lisina de la protelna).

En algunas realizaciones, el sustrato al que se une la opsonina es una celula viva o la matriz extracelular de un tejido u organo. Por ejemplo, el sustrato puede ser la superficie de una celula, tejido u organo asociado a la respuesta inmune. Por ejemplo, la celula puede ser un fagocito (macrofago, neutrofilo, y celula dendrltica), mastocito, eosinofilo, basofilo, y/o linfocito citolltico natural. La celula puede ser una celula de los tejidos u organos del sistema inmune, tales como bazo, ganglios linfaticos, vasos linfaticos, amlgdalas, timo, medula osea, placas de Peyer, tejidos conectivos, membranas mucosas, el sistema reticuloendotelial, etc. La superficie a la que se une la opsonina tambien puede ser la matriz extracelular de uno o mas de estos tejidos u organos.

En algunas realizaciones, el sustrato solido puede comprender perlas magneticas u otros materiales con estructura, que a continuation extraen los microbios de los fluidos, incluyendo fluidos biologicos tales como sangre, y concentran y recogen los microbios, incluyendo los microbios vivos. Este enfoque es ventajoso debido a que las

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perlas se pueden examinar a continuacion para la presencia del microbio, o se pueden usar para transferir los microbios recogidos a un cultivo de microorganismos patogenos convencional y ensayos de prueba de sensibilidad. En otras palabras, la opsonina obtenida por ingenierla genetica se puede usar en diagnostico como medio de recogida de microorganismos patogenos potenciales para identificacion; no solo en el diagnostico de enfermedades, sino tambien en la identificacion de microorganismos patogenos, materiales formados por partlculas u otros contaminantes que se transmiten por el agua o los alimentos. Alternativamente, el sustrato solido puede comprender un reactor de fibra hueca o cualquier otra membrana o dispositivo de flujo de filtracion de sangre (por ejemplo, un tubo de dialisis sencillo) u otras resinas, fibras, o laminas que se unan selectivamente a y secuestren los microorganismos patogenos biologicos.

Las perlas magneticas pueden ser de cualquier forma que incluye, pero no se limita a, esferica, varilla, ellptica, cillndrica, disco, y similares. En algunas realizaciones, se usan perlas magneticas que tienen una verdadera forma cillndrica y una qulmica superficial definida para minimizar la aglutinacion qulmica y la union no especlfica. Como se usa en el presente documento, la expresion "perlas magneticas" se refiere a una partlcula a nano o microescala que es atralda o repelida por un gradiente de campo magnetico o tiene una susceptibilidad magnetica que no es cero. La perla magnetica puede ser paramagnetica o superparamagnetica. En algunas realizaciones, las perlas magneticas son superparamagneticas. Las perlas magneticas tambien se denominan partlculas magneticas en el presente documento. En algunas realizaciones, se usan perlas magneticas que tienen una corteza de pollmero para proteger el microorganismo de la exposicion al hierro. Por ejemplo, se pueden usar perlas magneticas revestidas con pollmero para proteger a los microorganismos patogenos de la exposicion al hierro.

Las perlas magneticas pueden variar en tamano de 1 nm a 1 mm. Por ejemplo, las perlas magneticas tienen un tamano de aproximadamente 250 nm a aproximadamente 250 pm. En algunas realizaciones, la perla magnetica tiene un tamano de 0,1 pm a 100 pm. En algunas realizaciones, la perla magnetica tiene un tamano de 0,1 pm a 50 pm. En algunas realizaciones, la perla magnetica tiene un tamano de 0,1 pm a 10 pm. En algunas realizaciones, la perla magnetica es una nanopartlcula magnetica o una micropartlcula magnetica. Las nanopartlculas magneticas son una clase de nanopartlculas que se pueden manipular usando un campo magnetico o un gradiente de campo magnetico. Tales partlculas consisten habitualmente en elementos magneticos tales como hierro, nlquel y cobalto y sus compuestos qulmicos. Las nanopartlculas magneticas se conocen bien y se han descrito metodos para su preparacion en la tecnica. Veanse, por ejemplo, los documentos de Patente de Estados Unidos n.° 6.878.445; n.° 5.543.158; n.° 5.578.325; n.° 6.676.729; n.° 6.045.925; y n.° 7.462.446; y los documentos de Publication de Patente de Estados Unidos n.° 2005/0025971; n.° 2005/0200438; n.° 2005/0201941; n.° 2005/0271745; n.° 2006/0228551; n.° 2006/0233712; n.° 2007/01666232; y n.° 2007/0264199.

Las perlas magneticas se pueden encontrar facil y ampliamente en el mercado, con o sin grupos funcionales capaces de unirse a moleculas de afinidad. Estan disponibles en el mercado perlas magneticas adecuadas tal como en Dynal Inc. (Lake Success, NY); PerSeptive Diagnostics, Inc. (Cambridge, MA); Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA); Cortex Biochem Inc. (San Leandro, CA); y Bangs Laboratories (Fishers, IN). En realizaciones particulares, las partlculas magneticas son las perlas magneticas MyOne™ Dynabeads® (Dynal Inc.).

El sustrato solido se puede fabricar a partir de o revestir con un material biocompatible. Como se usa en el presente documento, la expresion "material biocompatible" se refiere a cualquier material que no deteriore de forma perceptible y no induzca ninguna respuesta inmune significativa ni reaction perjudicial a los tejidos, por ejemplo, reaction toxica o irritation significativa, a lo largo del tiempo cuando se implanta en o se situa adyacente al tejido biologico de un sujeto, ni induzca a aglutinacion sangulnea o coagulation cuando entra en contacto con la sangre. Los materiales biocompatibles adecuados incluyen, por ejemplo, derivados o copollmeros de poliimidas, poli(etilenglicol), alcohol polivinllico, polietilenimina, y polivinilamina, poliacrilatos, poliamidas, poliesteres, policarbonatos, y poliestirenos.

En algunas realizaciones, el sustrato solido se fabrica o se reviste con un material seleccionado entre el grupo que consiste en polidimetilsiloxano, poliimida, tereftalato de polietileno, poli(metacrilato de metilo), poliuretano, poli(cloruro de vinilo), poliestireno polisulfona, policarbonato, polimetilpenteno, polipropileno, un fluoruro de polivinilideno, polisilicona, politetrafluoroetileno, polisulfona, acrilonitrilo butadieno estireno, poliacrilonitrilo, polibutadieno, poli(tereftalato de butileno), poli(eter sulfona), poli(eter eter cetonas), poli(etilenglicol), resina de estireno-acrilonitrilo, poli(tereftalato de trimetileno), polivinil butiral, poli(difluoruro de vinilideno), poli(vinilpirrolidona), y cualquier combination de los mismos.

En un aspecto de la invention, las opsoninas recombinantes que se describen en el presente documento se pueden conjugar con el sustrato solido mediante metodos bien conocidos en la tecnica para conjugar peptidos con otras moleculas. Por ejemplo, Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES (2a Ed., Academic Press (2008)) y Niemeyr, Bioconjugation Protocols: Strategies & Methods, en Methods in Molecular Biology (Humana Press, 2004), proporcionan cierto numero de metodos y tecnicas para conjugar peptidos a otras moleculas, de Graaf, et al., 20 Biocojugate Chem. 1281 (2009), proporciona una revision de introduction especlfica de sitio de aminoacidos no naturales en peptidos para conjugation.

Alternativamente, la superficie del sustrato solido se puede funcionalizar para incluir moleculas de union que se unan

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selectivamente a la opsonina recombinante. Estas moleculas de union tambien se denominan en el presente documento moleculas de afinidad. La molecula de union se puede unir de forma covalente o no covalente sobre la superficie del sustrato solido. Como se usa en el presente documento, la expresion "molecula de union" o "molecula de afinidad" se refiere a cualquier molecula que sea capaz de unirse de forma especlfica a una opsonina recombinante que se describe en el presente documento. Algunos ejemplos representativos de moleculas de afinidad incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, antlgenos, lectinas, protelnas, peptidos, acidos nucleicos (ADN, ARN, APN y acidos nucleicos que son mezclas de los mismos o que incluyen derivados o analogos de nucleotidos); moleculas receptoras, tales como el receptor de insulina; ligandos para receptores (por ejemplo, insulina para el receptor de insulina); y moleculas biologicas, qulmicas u otras moleculas que tienen afinidad por otra molecula, tal como biotina y avidina. Las moleculas de union no necesitan comprender una molecula de origen natural completa sino que pueden consistir solo en una parte, fragmento o subunidad de una molecula de origen natural o no natural, como por ejemplo el fragmento Fab de un anticuerpo. La molecula de union puede comprender ademas un marcador que se pueda detectar.

La molecula de union se puede conjugar a la superficie del sustrato solido usando cualquiera de diversos metodos conocidos por los expertos en la materia. La molecula de union se puede acoplar o conjugar a la superficie del sustrato solido de forma covalente o no covalente. La inmovilizacion covalente se puede conseguir, por ejemplo, a traves de acoplamiento de silano. Vease, por ejemplo, Weetall, 15 Adv. Mol. Cell Bio. 161 (2008); Weetall, 44 Meths. Enzymol. 134 (1976). La union covalente entre la molecula de union y la superficie tambien puede estar mediada por un conector. La union no covalente entre la molecula de afinidad y la superficie se puede basar en interacciones ionicas, interacciones de van der Waals, interacciones dipolo-dipolo, enlaces de hidrogeno, interacciones electrostaticas, y/o interacciones por reconocimiento de forma.

Como se usa en el presente documento, el termino "conector" significa un resto molecular que conecta dos partes de una composicion. Los conectores peptldicos pueden afectar al plegamiento de una protelna de fusion dada, y tambien pueden reaccionar con/unirse a otras protelnas, y estas propiedades se pueden analizar de forma sistematica mediante tecnicas conocidas. Algunos conectores a modo de ejemplo, ademas de los que se describen en el presente documento, incluyen una cadena de restos de histidina, por ejemplo, His6; secuencias compuestas por Ala y Pro, que varlan el numero de pares Ala-Pro para modular la flexibilidad del conector; y secuencias compuestas por restos de aminoacidos cargados, por ejemplo, por mezcla de Glu y Lys. La flexibilidad se puede controlar mediante los tipos y los numeros de restos en el colector. Vease, por ejemplo, Perham, 30 Biochem. 8501 (1991); Wriggers et al., 80 Biopolymers 736 (2005). Los conectores qulmicos pueden comprender un enlace directo o un atomo tal como oxlgeno o azufre, una unidad tal como NH, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH, o una cadena de atomos, tal como alquilo C1-C6 sustituido o sin sustituir, alquenilo C2-C6 sustituido o sin sustituir, alquinilo C2-C6 sustituido o sin sustituir, arilo C6-C12 sustituido o sin sustituir, heteroarilo C5-C12 sustituido o sin sustituir, heterociclilo C5-C12 sustituido o sin sustituir, cicloalquilo C3-C12 sustituido o sin sustituir, donde uno o mas metilenos pueden estar interrumpidos o terminados con O, S, S(O), SO2, NH, o C(O).

Las moleculas de union basadas en acidos nucleicos incluyen aptameros. Como se usa en el presente documento, el termino "aptamero" significa una secuencia de nucleotidos de cadena sencilla, de cadena parcialmente sencilla, de cadena parcialmente doble o de cadena doble capaz de reconocer de forma especlfica una molecula o grupo de moleculas seleccionados que no son oligonucleotidos mediante un mecanismo distinto al emparejamiento de bases de Watson-Crick o formation de tripletes. Los aptameros pueden incluir, sin limitation, segmentos de secuencia definida y secuencias que comprenden nucleotidos, ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos, analogos de nucleotidos, nucleotidos modificados y nucleotidos que comprenden modificaciones, puntos de ramification y restos que no son nucleotidos, grupos o puentes en la cadena principal. Los metodos para seleccionar aptameros que se unen a una molecula se conocen ampliamente en la tecnica y son facilmente accesibles para el experto habitual en la materia.

La opsonina recombinante se puede conjugar con la superficie del sustrato solido mediante un par de union por afinidad. La expresion "par de union por afinidad" o "par de union" se refiere a una primera y una segunda moleculas que se unen de forma especlfica entre si. Un miembro del par de union se conjuga con la superficie solida mientras que el segundo miembro se conjuga con la opsonina recombinante. Como se usa en el presente documento, la expresion "union especlfica" se refiere a la union del primer miembro del par de union con el segundo miembro del par de union con una afinidad y especificidad mayores que para otras moleculas.

Algunos pares de union a modo de ejemplo incluyen cualquier compuesto haptenico o antigenico en combination con un anticuerpo correspondiente o una parte de union o fragmento del mismo (por ejemplo, digoxigenina y antidigoxigenina; inmunoglobulina de raton e inmunoglobulina antiraton de cabra) y pares de union no inmunologicos (por ejemplo, biotina-avidina, biotina-estreptoavidina), hormonas (por ejemplo, tiroxina y cortisol-protelna de union a hormonas), receptor-agonista del receptor, receptor-antagonista del receptor (por ejemplo, receptor de acetilcolina- acetilcolina o un analogo de la misma), IgG-protelna A, lectina-carbohidrato, enzima-cofactor de enzima, enzima- inhibidor de enzima, y pares de oligonucleotidos complementarios capaces de formar dupletes de acido nucleico), y similares. El par de union tambien puede incluir una primera molecula que este cargada negativamente y una segunda molecula que este cargada positivamente.

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Un ejemplo del uso de la conjugacion de un par de union es el metodo de sandwich con biotina. Vease, por ejemplo, Davis et al., 103 PNAS 8155 (2006). Las dos moleculas que se conjugan conjuntamente estan biotinadas y a continuacion se conjugan conjuntamente usando estreptoavidina tetravalente como conector. Se puede acoplar un peptido a una secuencia de 15 aminoacidos de un peptido aceptor para la biotinacion (denominado AP; Chen et al., 2 Nat. Methods 99 (2005)). La secuencia peptldica aceptora permite la biotinacion especlfica de sitio mediante la enzima biotina ligasa de E. coli (BirA; Id.). Una opsonina recombinante se puede biotinar de forma similar para su conjugacion con un sustrato solido. Tambien estan disponibles numerosos kits comerciales para la biotinacion de protelnas. Otro ejemplo para la conjugacion a una superficie solida serla el uso de bioconjugacion mediada por PLP. Vease, por ejemplo, Witus et al., 132 JACS 16812 (2010). En este ejemplo, una secuencia de AKT en el extremo N- terminal de Fc permite la conjugacion a la superficie solida y la orientacion del dominio de union a lectina en la orientacion optima senalando hacia afuera de la superficie solida.

Se ha de observar que la afinidad de un dominio de lectina individual por un azucar es baja, y la union esta dirigida normalmente por la avidez y la multivalencia. En el caso de los presentes dispositivos, los dominios de multimerizacion se suprimen de la protelna, y la multivalencia de la protelna se produce de forma eficaz mediante la union a un sustrato solido (por ejemplo, una perla) a alta densidad, densidad que se puede variar para proporcionar la funcionalidad optima.

Ademas, en lo que respecta a la MBL, sus caracterlsticas de union se pueden manipular mediante evolucion dirigida para especificidad de union alterada. Se puede modificar MBL de un modo tal que se una a mas de un conjunto limitado de azucares u otras caracterlsticas moleculares, con el resultado de que la MBL modificada se unira a mas conjuntos limitados de microbios para proporcionar la capacidad para la identification de una clase de microorganismos patogenos (por ejemplo, uno de virus, bacterias, hongos, o protozoos), tipaje de subclase (por ejemplo, bacterias gramnegativas o grampositivas) o determination de especies especlficas. Estan disponibles numerosas estrategias en la tecnica.

Por ejemplo, una estrategia de evolucion dirigida sencilla examina de forma visual la estructura atomica de la MBL que forma un complejo con un azucar, y a continuacion muta los aminoacidos apropiados para que hagan contacto de una forma especlfica para el azucar, de un modo tal que se pierdan los contactos distintivos o se creen tipos particulares de impedimentos histericos. La estructura tridimensional de la MBL de rata se ha resuelto en un complejo con un oligosacarido de alto contenido de manosa y con N-acetilglucosamina, una fucosa metilada, etc. His189Val e Ile207Val son ejemplos de sustituciones cuyas modificaciones alteran la especificidad.

En otra estrategia de evolucion dirigida, la protelna se somete a mutagenesis aleatoria y las protelnas resultantes se analizan de forma sistematica para las cualidades deseadas. Esta es una tecnologla particularmente util para la maduracion por afinidad de anticuerpos que se presentan en fagos, donde las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo estan mutadas mediante mutagenesis por saturation y las variantes con exito de los seis CDR se barajan conjuntamente para formar los anticuerpos de mayor afinidad.

El paradigma de evolucion dirigida se puede aplicar a MBL con el fin de seleccionar variantes de MBL con union especlfica a levaduras, bacterias grampositivas, gramnegativas, coagulasa negativas, bacterias aerobias, etc. Sin embargo, para este trabajo, el patron y la naturaleza de los azucares diana o las caracterlsticas superficiales relacionadas con estos organismos dianas pueden tener que diferir entre las clases o especies.

Se conoce que MBL se une fuertemente a manosa y N-acetilglucosamina azucares en hongos, y bacterias grampositivas y gramnegativas. Por ejemplo, se une fuertemente a Candida spp., Aspergillus fumigatus, Staphylococcus aureus, y el grupo A de estreptococos p hemollticos. MBL tiene una afinidad intermedia por Escherichia coli, Klebsiella spp., y Haemophilus influenzae de tipo b. MBL se une debilmente al grupo B de estreptococos p hemollticos, Streptococcus pneumoniae, y Staphylococcus epidermidis. Neth et al., 68 Infect. & Immun. 688 (2000). Se piensa que el polisacarido capsular del serogrupo B de Neisseria meningitides, H .influenzae de tipo b y Cryptococcus neoformans disminuye la union de MBL, como tambien la endotoxina bacteriana. Id.; Van Emmerik et al., 97 Clin. Exp. Immunol. 411 (1994); Schelenz et al., 63 Infect. Immun. 3360 (1995).

Otros han informado que MBL facilita la opsonofagocitosis de levaduras pero no de bacterias, a pesar de la union de MBL: la ruta de MBL (lectina) del complemento fue crltica para la opsonofagocitosis de levaduras, pero la ruta del complemento clasica fue crltica para la opsonofagocitosis de bacterias. Brouwer et al., 180 J. Immunol. 4124 (2008). Sin embargo, no se informo que MBL se uniera a las especies de bacterias sometidas a ensayo, unicamente que la union de MBL no estimulo una activation significativa del complemento ni opsonofagocitosis.

Los derivados de MBL con una especificidad particular se pueden aislar mediante el siguiente enfoque, que es una estrategia de presentation en fagos convencional: en primer lugar, expresar un conjunto de variantes de MBL de un vector fagemido; a continuacion unir esta biblioteca a una diana de interes (por ejemplo, E. coli) y llevar a cabo una o dos rondas de selection; y a continuacion llevar a cabo una ronda de selection negativa frente a una diana relacionada (por ejemplo, Candida), tomando los fagemidos que fracasan en la union. A continuacion, estos ciclos de seleccion positiva y negativa se repiten hasta que se genere una poblacion de fagos que se una generalmente a la diana y no se una a la no diana. Este metodo se puede aplicar a cualquier par de cepas microbianas frente a las que

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se desea una union diferencial, tales como bacterias que son resistentes y sensibles a un antibiotico dado. Esta estrategia de enriquecimiento positivo/negativo tambien se puede usar con una biblioteca de anticuerpo- presentacion en fagos, que es una forma incluso mas convencional de aislar tales aglutinantes especlficos.

MBL pertenece a la clase de colectinas de la superfamilia de lectinas de tipo C (dependientes de calcio), otros miembros de la cual, tales como la protelna tensioactiva A, la protelna tensioactiva T, CL-L1 y CL-P1, pueden ser utiles en la presente invencion. Otras opsoninas posibles incluyen ficolinas (Thiel et al., 1997), que tambien activan la ruta del complemento de la lectina y se unen a protelnas MASP. Estas protelnas estan relacionadas con MBL pero tienen una especificidad diferente y mas limitada. En el contexto del dispositivo diagnostico que se describe en el presente documento, una opcion es usar simplemente el dominio de lectina de una ficolina que se corresponde con el dominio de lectina de la MBL que se ha descrito anteriormente. Otro enfoque es el uso del "barajado" de segmentos o aminoacidos individuales entre MBL y una o mas ficolinas para crear moleculas hlbridas que puedan tener especificidades hlbridas. El enfoque de evolucion y seleccion dirigidas que se ha descrito anteriormente tambien se podrla usar potencialmente para generar fragmentos de anticuerpos humanos o peptidos que proporcionen la especificidad de clase, subclase y especie que se ha descrito anteriormente.

Ejemplos

Ejemplo 1. Construccion y expresion de FcMBL.81

Se construyo una realizacion de una configuracion obtenida por ingenierla genetica de MBL, util como opsonina generica para aplicaciones diagnosticas y terapeuticas, usando los dominios de "cuello" y "lectina" de MBL. La Prolina 81 (como se define en el archivo estructural 1HUP del Colaboratorio de Investigacion para la Bioinformatica Estructural, Banco de Datos de Protelnas, (RCSB PDB)) se selecciono como el punto N-terminal en el que comienza la secuencia de la lectina. Esta parte de la molecula de lectina se condenso corriente abajo (C-terminal) a la porcion Fc de gama 1 humana (Fcy). En la Figura 3 se muestra un diagrama de la construccion de la opsonina obtenida por ingenierla genetica. En la Figura 4 se muestra un esquema de la porcion Fc de un clon. Los aminoacidos para esta construccion incluyen los siguientes restos:

Secuencia proteica de Fc

001 epkssdktht cppcpapell ggpsvflfpp kpkdtlmisr tpevtcvwd vshedpevkf

061 nwyvdgvevh naktkpreeq ynstyrvvsv ltvlhqdwln gkeykckvsn kalpapiekt

121 iskakgqpre pqvytlppsr deltknqvsl tclvkgfyps diavewesng qpennykttp

181 pvldsdgsff lyskltvdks rwqqgnvfsc svmhealhnh ytqkslslsp 9a(SEQID NO' 1)

Secuencia proteica de MBL.81 (esta incluye la region de cuello enrollada en espiral y los dominios de reconocimiento de carbohidrato (CRD) de MBL humana):

81 pdgdsslaas erkalqtema rikkwltfsl gkqvgnkffl tngeimtfek vkalcvkfqa

141 svatprnaae ngaiqnlike eaflgitdek tegqfvdltg nrltytnwne gepnnagsde

201 dcvlllkngq wndvpcstsh lavcefpi (esta secuencia corresponde con los restos 1-148 de SEQ ID NO: 2)

Secuencia de Fc-MBL.81:

0 01 epkssdktht cppcpapell ggpsvflfpp kpkdtlmisr tpevtcvwd vshedpevkf

061 nwyvdgvevh naktkpreeq ynstyrvvsv ltvlhqdwln gkeykckvsn kalpapiekt

121 iskakgqpre pqvytlppsr deltknqvsl tclvkgfyps diavewesng qpennykttp

181 pvldsdgsff lyskltvdks rwqqgnvfsc svmhealhnh ytqkslslsp gapdgdssla

241 aserkalqte marikkwltf slgkqvgnkf fltngeimtf ekvkalcvkf qasvatprna

301 aengaiqnli keeaflgitd ektegqfvdl tgnrltytnw negepnnags dedcvlllkn

361 gqwndvpcst shlavcefpi (SEQ ID NO: 3)

De ese modo, la construccion de FcMBL.81 consiste en una lectina que tiene los restos de aminoacido 81 (prolina) a 228 (isoleucina) de MBL, condensada con una porcion Fcy. En uso, la porcion Fc se dimeriza y anade avidez a la debil afinidad de la union de las lectinas MBL a los azucares monomericos. Cuando se disena Fc MBL.81 para su uso como reactivo diagnostico, la glucosilacion unida en N se puede retirar cambiando el aminoacido en 297 de asparagina a acido aspartico (N297D), o el aminoacido 82 en la construccion de Fc. Fc glucosilado se mantiene en la orientacion correcta para ADCC y CDC mediada por Fc. Ademas, se puede clonar un resto de cistelna en la opsonina obtenida por ingenierla genetica para permitir la union a un sustrato solido a traves de conjugacion qulmica. La construccion y la expresion de una opsonina obtenida por ingenierla genetica, tal como FcMBL, se puede conseguir mediante diversas tecnicas conocidas en la tecnica; vease, por ejemplo, el documento de Patente de Estados Unidos n.° 5.541.087.

La expresion de la construccion en celulas transfectadas transitoriamente se demuestra en las Figuras 8A y 8B. La FcMBL.81 expreso aproximadamente 35 mg/l.

Ejemplo 2. Comparacion de la construccion Fc MBL.81 con MBL de longitud completa en union a levadura.

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Se inocularon aproximadamente 5,5 millones celulas de la levadura Candida albicans con numeros variables de perlas de MBL revestidas con MBL de tipo salvaje, de longitud completa (hexameros de trlmeros) o Fc MBL.81. Como se representa graficamente en la Figura 9, 18 millones de perlas con MBL de tipo salvaje, de longitud completa o Fc MBL.81 se unieron a las 5,5 millones de celulas fungicas. Este ejemplo muestra que las perlas de Fc 10 MBL.81 son tan activas como las perlas de MBL de tipo salvaje, de longitud completa en la union a C. albicans.

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   REIVINDICACIONES

   1. Protelna de fusion de opsonina recombinante que comprende:

   un dominio de reconocimiento de carbohidrato de una lectina de union a manosa (MBL) en donde el dominio de reconocimiento de carbohidrato permite la union a manosa en la superficie de un microbio condensado a una porcion Fc de una inmunoglobulina, en donde la protelna de fusion de opsonina recombinante excluye un dominio funcional de la opsonina que se une a una serina proteasa asociada a lectina de union a manano (MASP).
2. 2. La protelna de fusion de opsonina recombinante de la reivindicacion 1, en la que la MBL es MBL humana.
3. 3. La protelna de fusion de opsonina recombinante de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, que comprende ademas al menos un resto de cistelna que permite la reticulacion qulmica a un sustrato solido.
4. 4. La protelna de fusion de opsonina recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que:

   (i) la porcion Fc de la inmunoglobulina comprende una bisagra o una interfase CH2-CH3 de un dominio Fc de IgG;

   (ii) la protelna de fusion comprende ademas un segmento de Glicina + Serina o un segmento de Prolina + Alanina + Serina situado entre el dominio de reconocimiento de carbohidrato y la porcion Fc de una inmunoglobulina; o

   (iii) la porcion Fc de la inmunoglobulina comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1, en la que esta modificado opcionalmente el resto de aminoacido 82 de asparagina (N) a acido aspartico (D).
5. 5. La protelna de fusion de opsonina recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que esta unida a un sustrato solido.
6. 6. La protelna de fusion de opsonina recombinante de la reivindicacion 5, en la que el sustrato solido es una microperla magnetica, una microperla paramagnetica, una membrana microporosa, una fibra hueca o cualquier otra membrana de filtracion o dispositivo de flujo de fluidos.
7. 7. La protelna de fusion de opsonina recombinante de la reivindicacion 5, en la que el sustrato solido es una celula viva o la matriz extracelular de un tejido o un organo biologico, opcionalmente en la que dicha celula viva es un fagocito.
8. 8. La protelna de fusion de opsonina recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el dominio de reconocimiento de carbohidrato comprende:

   (i) los restos de aminoacido 81 (prolina) a 228 (isoleucina) de MBL (que se exponen como los restos 1-148 de SEQ ID NO: 2);

   (ii) los restos de aminoacido 81 (prolina) a 228 (isoleucina) de MBL (que se exponen como los restos 1-148 de SEQ ID NO: 2), condensados a la porcion Fc de IgG humana (Fcy) que se exponen en SEQ ID NO: 3; o

   (iii) un extremo N-terminal que comienza en la glicina 111 de la MBL humana.
9. 9. La protelna de fusion de opsonina recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el extremo N-terminal consiste esencialmente en una secuencia de aminoacidos de alanina-lisina-treonina (AKT).
10. 10. Metodo para recoger un microorganismo de union a opsonina de un fluido, que comprende poner en contacto el fluido con una protelna de fusion de opsonina recombinante conjugada a una superficie solida; en el que la protelna de fusion de opsonina recombinante comprende un dominio de reconocimiento de carbohidrato de una lectina de union a manosa (MBL) en donde el dominio de reconocimiento de carbohidrato permite la union a manosa que esta presente en la superficie de un microbio, condensado a una porcion Fc de una inmunoglobulina, en donde la protelna de fusion excluye un dominio funcional de la opsonina que se une a una serina proteasa asociada a lectina de union a manano (MASP).
11. 11. El metodo de la reivindicacion 10:

    (i) que comprende ademas la etapa de identificar el microorganismo;

    (ii) en el que el fluido es un fluido biologico, en el que el fluido se selecciona opcionalmente entre el grupo que consiste en sangre, llquido cefalorraquldeo, fluido articular, orina, semen, saliva, lagrimas y fluidos recogidos mediante procedimientos con aguja, de biopsia o de aspiracion;

    (iii) en el que el fluido se obtiene a partir de una muestra de agua o de alimento; y/o

    (iv) que comprende ademas separar dicho fluido de una opsonina recombinante unida a microorganismo, opcionalmente en el que la separacion se consigue por aplicacion de una fuerza magnetica al fluido despues de que el microorganismo de union a opsonina se haya unido al conjugado opsonina recombinante-superficie solida

    cuando la superficie solida es una partlcuia magnetica.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 11 (ii), en el que el fluido biologico es sangre.

    5 13. El uso de la protelna de fusion de opsonina recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en:

    (i) la identificacion de un microorganismo patogeno; o

    (ii) la identificacion de contaminacion en agua o alimentos.

    10 14. Una protelna de fusion de opsonina recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en un

    metodo de tratamiento de una enfermedad infecciosa o sepsis, opcionalmente en donde el tratamiento se combina ademas con un tratamiento o una terapia adicionales.