DE10325752A1

DE10325752A1 - Lektin-Konjugate

Info

Publication number: DE10325752A1
Application number: DE10325752A
Authority: DE
Inventors: Bernhard K. Keppler; Wolfgang Buchberger; Paul L. Debbage
Original assignee: Faustus Forschungs Cie Translational Cancer Research GmbH
Current assignee: Faustus Forschungs Cie Translational Cancer Research GmbH
Priority date: 2003-06-06
Filing date: 2003-06-06
Publication date: 2004-12-30
Also published as: JP2006527182A; WO2004108747A2; US20060251580A1; EP1635879A2; WO2004108747A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Konjugat, das mindestens eine zielsuchende Einheit, die spezifisch an Rezeptoren auf der Oberfläche von Endothelzellen bindet, und mindestens eine daran über einen Linker gekoppelte Effektoreinheit umfasst, wobei die Effektoreinheit mindestens eine Signaleinheit sowie gegebenenfalls mindestens einen therapeutischen Wirkstoff aufweist und die zielsuchende Einheit ein Lektin oder eine Fragment oder Derivat davon umfasst, wobei das Lektin kein L-Selektin ist, und die Signaleinheit ein Lanthanidenion umfasst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Konjugate, die mindestens eine zielsuchende Einheit, die spezifisch an Rezeptoren auf der Oberfläche von Endothelzellen bindet, und mindestens eine daran über einen Linker gekoppelte Effektoreinheit umfassen. Die Erfindung betrifft weiterhin Zusammensetzungen, die die Konjugate enthalten, sowie deren Verwendung und die Herstellung der Konjugate.
Alle Zellen besitzen spezielle Oberflächenmoleküle, die z. B. Zell-Zell-Interaktionen und dergleichen ermöglichen. Dies gilt entsprechend auch für die Zellen des vaskulären Endotheliums. Ein Großteil dieser Oberflächenmoleküle besteht aus Proteoglykanen und Glykoproteinen, deren Proteingerüst mehr oder weniger stark glykosyliert vorliegt. Die jeweilige Expression von Oligosacchariden variiert von Spezies zu Spezies, aber auch von Organ zu Organ. Darüber hinaus verändert sich diese sogenannte Glykokalix auch im Rahmen der Entwicklung oder der Veränderung des Endotheliums durch pathophysiologische Prozesse in einer charakteristischen Weise. Somit werden sogar die Funktionszustände des darunter liegenden Gewebes durch die Oberfläche der Endothelzellen signalisiert.
Zu den (patho)physiologischen Vorgängen, die eine Veränderung der Glykokalix zur Folge haben, gehören z. B. Entzündungsreaktionen, Einwirkung von Hormonen, die Reaktion auf eindringende Organismen wie z. B. Viren, und besonders Veränderungen in der Glykokalix durch proliferierende Zellen, wie sie z. B. während der Angiogenese auftreten. Zu den Vorgängen, die eine Proliferation des Endotheliums zur Folge haben, gehören die Neubildung von Gewebe im Rahmen der Wundheilung sowie die unkontrollierte Proliferation von Zellen beim Tumorwachstum und bei der metastatischen Verbreitung von Tumorzellen.
Diese vom Normalzustand abweichenden Markierungen auf den Zelloberflächen des vaskulären Endotheliums lassen sich somit zur Erkennung, d. h. zur Diagnose pathophysiologischer Zustände des darunter liegenden Gewebes verwenden, darüber hinaus jedoch auch zum zielgerichteten Transport von therapeutischen Wirkstoffen, wenn diese an ein geeignetes Trägermolekül gebunden sind. Besonders die große Variabilität an möglichen Strukturen, die sich bei der Verknüpfung einer gegebenen Zahl an Zuckermolekülen ergibt und die die Variabilität von aus Aminosäuren aufgebauten Strukturen um Größenordnungen übertrifft, erlaubt die Darstellung der verschiedenen Stadien der Entwicklung einer Zelle und auch der jeweils aktiven Funktionen.

Es sind immer wieder Versuche unternommen worden, bestimmte Marker auf dem vaskulären Endothelium, die krankhafte Veränderungen anzeigen, für den zielgerichteten Wirkstofftransport oder zum Transport von Partikeln, die für diagnostische Zwecke eingesetzt werden können, zu verwenden. Als zielsuchende Teilchen sind häufig z. B. monoklonale Antikörper eingesetzt worden. Erschwert wird der allgemeingültige Einsatz dieser Technologie durch die geringe Spezifität der verwendeten Strukturen oder auch durch das Hervorrufen einer Immunantwort. Gerade im Rahmen von diagnostischen Verfahren ist die immunogene Wirkung und die durch die Immunantwort des Körpers hervorgerufene Zerstörung der markierten Zellen ein ernstzunehmendes Problem bei der Verwendung von Antikörpern. Auch Zielstrukturen auf den Zellen des Krankheitsherdes selbst sind schon öfter als Target für ein zielsuchendes Teilchen beschrieben worden, wobei hier als Nachteil besonders die schwierige Erreichbarkeit der erkrankten Stelle bei systemischer Applikation zu nennen ist.

Die natürlichen Liganden für die Glykoproteine und Proteoglykane der Glykokalix sind die Lektine. Lektine sind Proteine oder Glykoproteine, die eine starke Affinität zu den Zuckerstrukturen der Glykokalix besitzen. Die Strukturen der Lektine variieren in einem breiten Rahmen, jedoch ist das gemeinsame Merkmal, dass es sich immer um Proteine handelt. Ein weiteres gemeinsames Merkmal von Lektinen ist, dass sie mit hoher Affinität spezifisch und reversibel nur an Kohlenhydrate binden. Dabei ist die Affinität der Bindung zu Oligosacchariden um ein Vielfaches höher als die Affinität der Bindung zu Monosacchariden. Somit ermöglicht die unterschiedliche räumliche und auch funktionell zeitliche Ausbildung von Oligosacchariden und der endothelialen Zelloberfläche ein räumlich spezifisches Anbinden der Lektine. Neben dieser sehr günstigen Eigenschaft in Hinblick auf die Selektivität ist auch die Verfügbarkeit dieser Proteinstrukturen aus verschiedenen Quellen sehr günstig.

WO 01/17566 offenbart ein Kontrastmittel zur Darstellung von Lymphknotenveränderungen, von entzündlichen Prozessen oder pathologischen Veränderungen, die mit der spezifischen Expression von endothelialen und/oder leukozytären Liganden verbunden sind. Bei diesem Kontrastmittel ist ein Rezeptor für spezifisch exprimierte endotheliale Liganden, konkret L-Selektin oder ein L-Selektin-Derivat, in definierter Ausrichtung an eine Signaleinheit gekoppelt.

WO 85/01442 beschreibt verschiedene Konjugate von Lektinen, ausgewählt aus Erdnuß-Lektin, Lektinextrakt der Orangenschale, Maclura pomifera-Lektin, Dolichos biflorus-Agglutinin und Sojabohnen-Agglutinin, mit entweder einem therapeutischen Agens oder einer radiaktiven Markierung, die zur Krebs-Therapie oder zum Nachweis von Tumorzellen eingesetzt werden sollen.

Demgegenüber besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung neuartiger Lektin-Konjugate, welche auf besonders wirksame und den Körper wenig belastende Weise die Diagnose von pathophysiologischen Veränderungen der Glykokalix ermöglichen und darüber hinaus gegebenenfalls auch einfach und effektiv an therapeutische Wirkstoffe gekoppelt werden können. Die letztere Ausführungsform erlaubt nicht nur einen zielgerichteten Wirkstofftransport, sondern auch eine Verfolgung der Wirkstoffakkumulation im Körper des Patienten.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Konjugate gemäß Anspruch 1 der vorliegenden Anmeldung, welche mindestens eine zielsuchende Einheit, die spezifisch an Rezeptoren auf der Oberfläche von Endothelzellen bindet, und mindestens eine daran über einen Linker gekoppelte Effektoreinheit, die mindestens eine Signaleinheit sowie gegebenenfalls mindestens einen therapeutischen Wirkstoff umfasst, umfassen und dadurch gekennzeichnet sind, dass die zielsuchende Einheit ein Lektin oder ein Fragment oder Derivat davon umfasst, wobei das Lektin kein L-Selektin ist, und die Signaleinheit ein Lanthanidenion umfasst.

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Konjugate bereitgestellt, welche mindestens eine zielsuchende Einheit, die spezifisch an Rezeptoren auf der Oberfläche von Endothelzellen bindet, und mindestens eine daran über einen Linker gekoppelte Effektoreinheit, die mindestens einen therapeutischen Wirkstoff umfasst, umfassen und dadurch gekennzeichnet sind, dass die zielsuchende Einheit ein Lektin oder ein Fragment oder Derivat davon umfasst, wobei das Lektin kein Erdnuß-Lektin, Lektinextrakt der Orangenschale, Maclura pomifera-Lektin, Dolichos biflorus-Agglutinin oder Sojabohnen-Agglutinin ist.

Die vorliegende Erfindung umfasst ferner Verfahren zur Herstellung dieser Konjugate sowie die Verwendung derselben in diagnostischen und/oder therapeutischen Verfahren.

Durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Konjugats, gebildet aus einer zielsuchenden Einheit und einer auf die jeweilige Aufgabe abgestimmten Effektoreinheit, können unter Ausnutzung der spezifischen Wechselwirkung zwischen der durch pathophysiologische Veränderungen modifizierten Glykokalix sowie den als zielsuchende Einheit eingesetzten Lektinen diese pathophysiologischen Veränderungen erkannt und nachweisbar gemacht werden und gegebenenfalls kann auch ein Wirkstoff zielgerichtet zum Ort der Erkrankung transportiert und die Wirkstoffakkumulation im Körper des Patienten verfolgt werden.

Die zur erkennende charakteristische Glykokalix kann außer durch die spezifischen Kohlenhydratstrukturen oder spezifischen Lektine, die von den pathologisch veränderten Endothelzellen exprimiert werden, auch durch auf der Gefäßwand abgelagerte Teilchen, wie z. B. Plaque, Arteriosklerose oder ein Biofilm, geprägt werden. Auch die Tatsache, dass die eigentliche Oberfläche des Blutgefäßes durch Ablagerungen auf dieser verdeckt ist und die Glykokalix somit nicht mehr registriert werden kann, ist als Zeichen für eine Veränderung des Blutgefäßes heranzuziehen und kann auf pathophysiologische Veränderungen hinweisen. Weiterhin lassen sich mit den erfindungsgemäßen Konjugaten unter Umständen auch charakteristische Glykane des unter dem Blutgefäß liegenden Gewebes abbilden, wenn dieses durch pathologische Prozesse mit partiellem Verlust des vaskulären Gewebes freigelegt worden ist.

Vorzugsweise sind die als Target dienenden Kohlenhydratstrukturen der Glykokalix der vaskulären Gefäßwand charakteristisch für Entzündungskrankheiten oder für darunter liegendes Tumorgewebe.

Als endotheliale Marker für Entzündungskrankheiten eignen sich zum Beispiel VCAMGPI, Klasse I MHC Antigen, ICAM-1, VCAM-1, ELAM-1, E-Selektin, P-Selektin oder VLA-4.

Als Marker für unter dem vaskulären Endothel liegendes Tumorgewebe und für eine durch Tumorwachstum verursachte Angiogenese und die damit verbundenen Veränderungen des vaskulären Endothels eignen sich die Zelloberflächenmoleküle 4Ff2, EndoGlyx-1, die Galektine und insbesondere Endosialin.

Als zielsuchende Einheit für das erfindungsgemäße Konjugat dienen Lektine, Fragmente oder Derivate davon, die spezifisch an die charakteristischen Kohlenhydratstrukturen der Glykokalix von durch pathophysiologische Vorgänge veränderten Endothelzellen binden.

Bevorzugt wird für das Konjugat ein monovalentes Lektin verwendet, so dass es bei der Applikation nicht zur Agglutination der Blutzellen, z. B. der Erythrozyten, kommt.

Auch sollen durch das eingesetzte Lektin die normalen Körperfunktionen nicht beeinflusst oder gar gestört werden.

Die in dem Konjugat eingesetzten Lektine, Fragmente oder Derivate davon sind pflanzlichen, tierischen, bakteriellen, viralen oder menschlichen Ursprungs.

Konkrete Beispiele geeigneter Lektine für die vorliegende Erfindung sind:

Lektine von Viren:
Lektin des Rotavirus
Lektin des Vacciniavirus

Bakterielle Lektine:
Adhäsine, insbesondere das Adhäsin von Bordetella Pertussis
Familie 13 der Kohlenhydrat-bindenden Moleküle
Comitinlektin aus dem Bakterienrasen Dictyostelium
Neuroaminidase von Vibrio Cholera

Lektine von Einzellern:
Lektin von Entamoeba

Lektine aus Pflanzen:
LEA, DSA, GSA-1B₄, PHA, HPA, SBA, UEA-1, CSA-1, WGA, Kartoffellektin (STA), Barley-Lektin, LAA-1, MAA, GNA, DBA, Jacalin, SCAman, ConA, ECA, PSA, RCA, LOLI, Modeccin, Abrin, ML-1, LFA, Alliumlektin

Tierische Lektine:
BSCLT aus Botryllus Schlosseri
BgSEL aus Miomphalaria Glabrata
Ficolin/Opsonin P35-Lektin aus dem Igel
Echicetin aus der Schlange
BjcuL aus der Schlange
RVV-X aus der Schlange
Galektin aus dem Nematoden Caenorhabditis Elegans
BmLBP aus dem Seidenwurm
CCF-1 der Wirbellosen
Ly-49 der Maus
Limulin
Limulus-Faktor C

Lektine des Menschen:

1) C-Typ-Lektine Familie der Collectine: Clq, MBL, HSP-A, HSP-D, Collectin 43, α-Ficolin, β-Ficolin, Conglutinin, P35 Familie der Siglecs: Siglec1 (Sialoadhäsin), Siglec 2 (CD22), Siglec 3, Siglec 4, Siglec 5, Siglec 6, Siglec 7, Siglec 8, Siglec 9, Siglec 10 Familie der Lecticane: Aggrecan, Versican, Neurocan, Brevican Cytokine: IL-3, TFN-α, Thrombomodulin, CD11b/CD18, CD66b, Elastin/Lamininbindendes Protein, CD44, EN4, CD36, Hevein, Pseudohevein Adhäsionsmoleküle: Galactosylrezeptor, PECAM-1 (CD31), EpCAM, ICAM-1 (CD54), ELAM-1 (CD62E), VCAM-1 (CD106), CD72, Vitronectin, LEC-CAM, insbesondere LEC-CAM-1 C-Typ Lektine, die mit Zellen des Immunsystems assoziiert sind: NK-Zell-Domänen wie Ly-49, CD23, oder CD69, Monozyten- und Makrophagen-Lektin, CD72, T&B-Lymphoblastoid-Mucin-artiges Lektin, P47, LSLCL Gen-Produkt weitere Lektine: Hepatischer Asialoglycoprotein-Rezeptor, Tetranectin, P58/ERGIC-53, LOX-1, Koagulationsfaktoren IX/X-bindendes Protein, Polycystin-1-C-Typ-Lektin, Mucin-artige Proteine mit C-Typ-Lektindomänen, Myelinassoziiertes Glycoprotein, Endosialin (TEM1), Endoglyx, Lipopolysaccharidebindendes Protein
2) S-Typ-Lektine S-Lac-Lektine Galektine: Galektin-1, Galektin-3, Galektin-9 Besonders bevorzugt sind die pflanzlichen Lektine, hier besonders LEA, GSA-1B₄, UEA-1, ConA und LFA, und die körpereigenen Lektine des Menschen, hier besonders LOX-1, Thrombomodulin, Endosialin, Endoglyx und Galektin-1.

Eine weitere funktionelle Komponente der erfindungsgemäßen Konjugate ist eine mittels geeigneter Methoden an das Lektin gekoppelte Signaleinheit, die unter physiologischen Bedingungen stabil am Lektin verbleibt. Diese Signaleinheit umfasst ein Lanthanidenion, vorzugsweise ein Gadoliniumion oder Europiumion. Das Lanthanidenion ist dabei vorzugsweise an einen geeigneten Chelator gebunden. Einige nicht beschränkende Beispiele geeigneter chelatbildender Moleküle oder Chelatoren sind EDTA, DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure), DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N,N,N-tetraessigsäure), DFO (Deferoxamin). Besonders bevorzugt sind DTPA oder DFO.

Zum Erreichen einer höheren Metallionenbeladung des Konjugats können als Signaleinheit auch durch geeignete Methoden oligomerisierte oder polymerisierte Chelator-Einheiten verwendet werden. Als bifunktionale verbrückende Reagenzien können beispielsweise geeignete Diole, wie z. B. Ethylenglykol, 1,3-Propylenglykol oder N,N-Bis-(2-hydroxyethylglycin), oder Diamine, wie z. B. Ethylendiamin, 1,3-Propylendiamin oder 1,6-Hexamethylendiamin, verwendet werden, so dass die Chelator-Monomere über Ester- oder Amidfunktionen aneinander gekoppelt werden. Die Zahl der durch die oben beschriebenen bifunktionalen Einheiten verknüpften Monomere beträgt n = 2 bis 20, bevorzugt n = 2 bis 15, besonders bevorzugt n = 2 bis 12 und ganz besonders bevorzugt n = 3 bis 10.

Die monomeren oder oligomeren Chelator-Einheiten der Signaleinheit können kovalent an das Lektin, Fragment oder Derivat davon gekoppelt werden und fungieren so gleichzeitig als kovalente Linker.

Die Kopplung der Signaleinheit an das Lektin, das Fragment oder das Derivat davon erfolgt durch Verwendung einer geeigneten funktionellen Gruppe des Lektins ohne dessen biologische Funktion zu beeinträchtigen. Erforderlichenfalls kann diese funktionelle Gruppe durch Modifizierung des nativen Lektins eingeführt worden sein. Vorzugsweise erfolgt die Kopplung der Signaleinheit über eine freie Stickstoff-Funktion des Lysins im Lektin. Als Linker zur Ankopplung einer Signaleinheit an das Lektin können grundsätzliche alle bekannten Linkermoleküle eingesetzt werden, die einen sicheren Transport der Signaleinheit zum Zielort ermöglichen und den sicheren Verbleib der Signaleinheit am Zielort erlauben. Ein geeigneter Linker zur Ankopplung der Signaleinheit ist nicht-toxisch und beeinträchtigt weder das biologische Verhalten und die Spezifität des Lektins, des Fragments oder des Derivats davon noch die Aktivität der Signaleinheit in erheblichem Maße. Geeignete Linker können in Abhängkeit von der Art der zur Kopplung vorgesehenen Substanz und der Art der reaktiven funktionellen Gruppe auf dem Lektin ausgewählt werden. Ein Reihe von Linkern zur Kopplung diagnostischer und therapeutischer Substanzen an verschiedene funktionelle Gruppen auf Proteinen sind im Stand der Technik bereits bekannt und können erforderlichenfalls für die speziellen erfindungsgemäßen Konjugate angepasst und eingesetzt werden.

Zur Synthese des Lektin-Linker-Konjugats wird erforderlichenfalls die spezifische Bindungsstelle des Lektins durch einen geeigneten, temporär bindenden und nach erfolgter Ankopplung wieder zu entfernenden Liganden geschützt. Hierbei kann es sich beispielsweise um spezifisch bindende Oligo- oder Polysaccharide handeln, die nach erfolgter Kopplung zum Beispiel durch Affinitätschromatographie wieder entfernt werden können. Bei dieser Schutzgruppe kann es sich beispielsweise um Chitobiose handeln.

In einem speziellen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden spezifisch exprimierte Lektine auf der Oberfläche von Endothelzellen der vaskulären Gefäßwand nachgewiesen. Hierzu werden erfindungsgemäß divalente Zucker eingesetzt, die einerseits eine selektive Bindungsaffinität gegenüber den Lektinen auf der Endothelzelle und andererseits eine zweite Affinität gegenüber dem Lektin, Fragment oder Derivat davon der zielsuchenden Einheit der erfindungsgemäßen Lektinkonjugate besitzen. Dabei kann der divalente Zucker entweder vor der Applikation an die spezifische Bindungsstelle des konjugierten Lektins gebunden werden oder aber separat appliziert werden, so dass der Zucker zuerst an das spezifisch exprimierte Lektin auf der Endothelzelle bindet und dann erst von dem konjugierten Lektin erkannt und gebunden wird.

Zur Erzielung eines therapeutischen Effekts wird die zielsuchende Einheit, d. h. das Lektin, das Fragment oder das Derivat davon, bzw. das Konjugat aus zielsuchender Einheit und Signaleinheit mit einem therapeutischen Wirkstoff in einer derartigen Weise versehen, dass an dem durch das Target charakterisierten Zielort der Wirkstoff problemlos wieder freigesetzt werden kann.

Der therapeutische Wirkstoff ist vorzugsweise eine cytotoxische Substanz. Diese kann z. B. ein Metallkomplex wie cis-Platin oder geeignete Derivate davon sein. Auch andere cytostatisch wirksame Substanzen, wie Alkylantien, Antibiotika, Antimetabolite, Hormone oder Mitose-Hemmstoffe sind als Wirkstoffe einsetzbar. Auch Wachstumsfaktoren, Toxine, rekombinante Proteine oder Vektoren für Gen-Transfektionen sind verwendbar. Bei der Verwendung von Radionukliden wird das radioaktive Teilchen durch einen geeigneten Chelator, wie beispielsweise DTPA oder DFO, an das Lektin gekoppelt. Auch hier können höhere Metallionenkonzentrationen pro Mol Lektin durch Verwendung höher oligomerisierter oder polymerisierter Chelator-Einheiten erzielt werden. Im Falle von nicht-metallischen Radionukliden kann das radioaktive Element in geeignete Gruppen eingebaut werden und so an das Protein gekoppelt werden.

Als Radionuklide können ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³⁰I, ¹³¹I, ¹³³I, ¹³⁵I, ⁴⁷Sc, ⁷²Se, ⁹⁰Y, ⁸⁸Y, ⁹⁷Ru, ¹⁰⁰Pd, ^101mRh, ¹¹⁹Sb, ¹²⁸Ba, ¹⁹⁷Hg, ²¹¹At, ²¹²Pd, ¹⁰⁹Pd, ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁶⁷Cu, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br, ^99mTc, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O und ¹⁸F verwendet werden. Besonders bevorzugt sind ¹²⁵I, ¹¹¹In, ^99mTc und ¹⁸F.

Vorzugsweise wird der Wirkstoff an das Lektin, das Fragment oder das Derivat davon gebunden. Die Kopplung des Wirkstoffs erfolgt über kovalente Linker unter Verwendung einer geeigneten funktionellen Gruppe des Lektins ohne dessen biologische Funktion zu beeinträchtigen. Erforderlichenfalls kann diese funktionelle Gruppe durch Modifizierung des nativen Lektins, z. B. durch chemische oder gentechnische Methoden, eingeführt worden sein. Vorzugsweise erfolgt die Kopplung des Wirkstoffs über eine freie Stickstoff-Funktion des Lysins im Lektin.

Als Linker zur Ankopplung eines Wirkstoffes an das Lektin können grundsätzliche alle bekannten Linkermoleküle eingesetzt werden, die einen sicheren Transport des Wirkstoffs zum Zielort ermöglichen und eine Freisetzung des Wirkstoffs am Zielort ermöglichen. Ein geeigneter Linker zur Ankopplung der Signaleinheit bzw. des Wirkstoffs ist nicht-toxisch und beeinträchtigt weder das biologische Verhalten und die Spezifität des Lektins, des Fragments oder des Derivats davon noch die Aktivität des Wirkstoffes in erheblichem Maße. Bevorzugte Linker zur Kopplung von Metallionen wurden bereits oben angeführt.

Andere geeignete Linker können in Abhängigkeit von der Art der zur Kopplung vorgesehenen Substanz und der Art der reaktiven funktionellen Gruppe auf dem Lektin ausgewählt werden. Ein Reihe von Linkern zur Kopplung diagnostischer und therapeutischer Substanzen an verschiedene funktionelle Gruppen auf Proteinen sind im Stand der Technik bereits bekannt und können erforderlichenfalls für die speziellen erfindungsgemäßen Konjugate angepasst und eingesetzt werden.

Erforderlichenfalls wird dabei die spezifische Bindungsstelle des Lektins durch einen geeigneten, temporär bindenden und nach erfolgter Ankopplung wieder zu entfernenden Liganden geschützt. Hierbei kann es sich beispielsweise um spezifisch bindende Oligo- oder Polysaccharide handeln, die nach erfolgter Kopplung zum Beispiel durch Affinitätschromatographie wieder entfernt werden können. Bei dieser Schutzgruppe kann es sich beispielsweise um Chitobiose handeln.

Bei den erfindungsgemäßen Lektin-Wirkstoff-Konjugaten ist das Lektin, Fragment oder Derivat der zielsuchenden Einheit vorzugsweise so gestaltet, dass die pathologisch veränderte Endothelzelle das Lektin zuerst an ihre Glykokalix binden kann, dann das Lektin in die Zelle aufgenommen und wieder in den subendothelialen Bereich abgegeben werden kann, wonach eine selektive und zielgerichtete Aufnahme in den Krankheitsherd möglich wird.

Ein therapeutischer Effekt kann auch durch eine selektive Markierung der Endothelzelle mit anschließender Transzytose erzielt werden, so dass auf der subendothelialen Seite der vaskulären Gefäßwand eine hohe Wirkstoffakkumulation bzw. eine hohe Wirkstoffkonzentration erreicht wird. Die hohe Akkumulation erleichtert dann den passiven Wirkstofftransport in Richtung krankes Gewebe durch Diffusion.

Bevorzugt handelt es sich bei den zu behandelnden pathophysiologischen Zuständen im Gewebe um Entzündungs- oder Tumorerkrankungen.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind mindestens eine Signaleinheit und mindestens ein Wirkstoff an dasselbe Lektin gekoppelt. Durch die gemeinsame Kopplung einer Signaleinheit und eines Wirkstoffs an ein und dasselbe Lektin wird eine diagnostische Verfolgung der Wirkstoffakkumulation im Körper eines Patienten möglich.

In einem speziellen Aspekt der Erfindung können die Konjugate auch lediglich aus einer Kombination von zielsuchender Einheit, d. h. Lektin, Fragment oder Derivat davon, und therapeutischem Wirkstoff bestehen. Für diese Ausführungsform sind Kombinationen aller oben genannten Lektine, Fragmente und Derivate mit allen oben genannten Wirkstoffen möglich. Besonders bevorzugt sind hierfür die körpereigenen Lektine des Menschen und hier ganz besonders LOX-1, die Leukozyten- und Makrophagen-Rezeptoren, das Elastin/Laminin-bindende Protein, CD11b/CD18, MBL, Thrombomodulin, Vitronectin und EpCAM.

Das molare Verhältnis zwischen Lektin, Fragment oder Derivat davon und der jeweiligen an das Lektin gekoppelten Signaleinheit bzw. des jeweiligen gekoppelten Wirkstoffes kann zur optimalen Erfüllung der speziellen Aufgabe des jeweiligen Lektinkonjugats in einem empirisch bestimmbaren Rahmen variiert werden. Derartige Optimierungsversuche liegen ohne weiteres im Rahmen der Fähigkeiten eines Durchschnittsfachmanns auf diesem Gebiet.

Lektin, Signaleinheit und gegebenenfalls Wirkstoff können in getrennten Syntheseverfahren aufgebaut und nach Wunsch kombiniert werden. Durch diesen modularen Aufbau ist eine Variation der Eigenschaften der erfindungsgemäßen Konjugate, z. B. ein Wechsel der Lektinspezifität, bequem möglich.

In einer speziellen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Lektinkonjugate auf der Oberfläche eines polymeren Trägers immobilisiert oder im Inneren eines polymeren Trägers eingeschlossen sein. Spezielle Beispiele solcher polymeren Träger sind Nano- oder Mikropartikel auf Polystyrol- oder Chitosanbasis, BSA/PLA (Polymilchsäure)-Mikropartikel oder Latexpartikel, z. B. aus Polystyrol. Die Größe des Polymerträgers ist dabei so gewählt, dass der normale Blutfluss in den Blutgefäßen durch die Anwesenheit des Lektin-Konjugats nicht gestört wird.

Auf diese Weise können hohe Konzentrationen der gewünschten Efffektoreinheit am Zielort erreicht werden.

Die mit einer Signaleinheit gekoppelten erfindungsgemäßen Konjugate sind in verschiedenen bildgebenden diagnostischen Verfahren, vorzugsweise in der MRI („Nuclear resonance imaging") zum Nachweis spezifischer Targets, z. B. charakteristischer Kohlenhydratstrukturen oder spezifisch exprimierter Lektine, auf vaskulären Endothelzellen oder gegebenenfalls dem darunter liegenden Gewebe einsetzbar. in einem weiteren Aspekt kann die Endothel-Markierung für das MRI auch durch ein weniger selektiv wirkendes Lektin erfolgen, so dass das gesamte vaskuläre Endothelium vollständig durch das Lektin-Signaleinheit-Konjugat markiert wird und somit durch Bestimmung des Blutgefäßvolumens in einem gegebenen Volumenelement eine vollständige Abbildung der Blutgefäße möglich wird.

Figurenbeschreibung:

1 Konzentrations-Wirkungs-Kurve der Verbindung 1 (LEA-DTPA-Gd) im Vergleich zu Omniscan [Aqua[5,8-bis(carboxymethyl)-11-[_2,-(methylamino)-2-oxo-ethyl]-3-oxo-2,5,8,11-tetraazatridecan-13-oato-(3-)-N₅, N₈, N₁₁, O₃, O₅, O₈, O₁₁, O₁₃]gadoliniumhydrat und Magnevist [1-Desoxy-1-(methylamino)-D-glucitol-dihydrogen-N,N-bis[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl]-glycinato-(5-)-]gadolinat(2--)(2:1)]; die relative Signaländerung ist bezogen auf den Signalwert von PBS.

2 MRI-Aufnahmen unter Verwendung des Latex-LEA-Konjugats 3.4 als Kontrastmittel und der Spin-Echo-Technik in der humanen Vena saphena magna: Vene (Kontrolle), ohne Kontrastmittel, Vene ist im negativen Kontrast zu erkennen; Vene (1 Woche), mit Kontrastmittel, Vene ist in der Draufsicht am rechten Rand des Röhrchens zu sehen; Vene (frisch), mit Kontrastmittel, Draufsicht auf den Venenquerschnitt; PBS als Negativkontrolle; Magnevist als Positivkontrolle

3 MRI-Aufnahmen von Lebergefäßen der Maus unter Verwendung des Latex-LEA-Konjugats 3.4 als Kontrastmittel

3A Lebergefäße der Maus im negativen Kontrast, kein Kontrastmittel

3B Substanz 3.4 als Kontrastmittel, Lebergefäße der Maus sind weiß, Kontrastmittel befindet sich in den Gefäßen (Konzentration 5,75 mg/ml)

3C Kontrastmittel in der Maus mit 1 ml PBS herausgespült, Gefäße sind immer noch etwas weißlich gefärbt

3D Kontrastmittel mit 4 ml PBS herausgespült, Lebergefäße sind immer noch weiß und enthalten Kontrastmittel

In den folgenden nicht-beschränkenden Beispielen werden einige bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung näher beschrieben.

BEISPIEL 1
Synthese von LEA-DTPA-Gd (Substanz 1)
a) Herstellung von Nitriloessigsäuregadolinat, Trinatriumsalz (Gd(NTA)₂Na₃:
Gd₂O₃ + 6 HCl → 2 GdCl₃ + 3 H₂O GdCl₃ + 2 Na₃NTA → Gd(NTA)₂NA₃ + 3 NaCl
2,10 g Gd₂O₃ (5,8 mmol) werden in 0,046 g HCl (37 %, 1,27 mmol) suspendiert und zum Sieden erhitzt. Zum vollständigen Auflösen wird tropfenweise weitere HCl (37 %) zugegeben bis die siedende Lösung klar wird. Die GdCl₃-Lösung wird auf 60 ml verdünnt, und danach werden bei 40° C 6,38 g Na₃NTA (23.2 mmol) zugegeben. Die Lösung wird auf 100 ml aufgefüllt, und der pH-Wert wird durch Zugabe von 3 M NaOH auf pH = 6 eingestellt.
b) Konjugation von DTPABA (Diethylentriaminopentaessigsäure-bisanhydrid)
10 mg LEA (1,41 × 10^–4 mmol) werden in 0,22 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4) in einem Eppendorff-Röhrchen gelöst. 11,2 mg DTPABA (0,031 mmol, 220facher Überschuss) werden in 0,028 ml DMSO suspendiert und dann in 4 Portionen zur Proteinlösung gegeben. Zwischen den einzelnen Zugaben wird der pH-Wert durch den Zusatz von 3 M NaOH auf pH 8,5 eingestellt. Nach der letzten Zugabe wird die Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen und alle 10 Minuten geschüttelt.
c) Komplexierung von Gd(III)
Zur Entfernung von ungebundenem DTPABA wird die Reaktionslösung mittels FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) durch Gelfiltration mit Citratpuffer (0,1 M; pH 6,5) aufgetrennt. Die Proteinfraktion mit dem kovalent gebundenen DTPA wird isoliert. Die erhaltenen 3 ml Proteinlösung werden mit 0,030 ml Gd(NTA)₂-Lösung (Herstellung wie unter a)) versetzt und 24 h bei 4°C gerührt. Anschließend wird die Lösung lyophilisiert, in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst und wieder mittels FPLC gereinigt, um ungebundenes Gd(NTA)₂ und freie H₃NTA abzutrennen.
Produkteigenschaften:
MG_Lektin 71.000 g/mol; das Konjugat wird mittels AAS und Proteinbestimmung charakterisiert.
BEISPIEL 2
LEA-DTPA-Gd, eingekapselt in Chitosan-Nanopartikel
Natrium-bis(ethylhexyl)sulfosuccinat (0,03–0,1 M) wird in 40 ml n-Hexan gelöst. Zu dieser Lösung werden unter ständigem Rühren bei Raumtemperatur 100 μl 0,1 Chitosan-Essigsäure-Lösung, 200 μl LEA-DTPA-Gd-Lösung (unterschiedliche Konzentrationen), 10 μL Ammoniaklösung und 10 μl 0,01–1,0 %iger Glutaraldehyd-Lösung zugegeben. Die Reaktionslösung wird homogen und klar. Auf diese Weise bilden sich die Chitosan-Nanopartikel mit eingekapseltem LEA-DTPA-Gd-Konjugat. Beim nächsten Syntheseschritt wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und der trockene Rückstand in 5 ml Tris-Cl-Puffer (pH = 7,4) im Ultraschallbad resuspendiert. Danach wird tropfenweise 1 ml 30 %iger CaCl₂-Lösung zugegeben. Der Aktivator präzipitiert in Form von Calcium-Diethylhexylsulfosuccinat [Ca(DEHSS)₂]. Das Präzipitat wird 30 Minuten bei 4°C und 5000 UpM zentrifugiert. Das Pellet wird verworfen und der Überstand, der die Nanopartikel enthält, wird isoliert und zweimal bei 60000 UpM jeweils für 2 h zentrifugiert. Das isolierte Pellet (mit den Nanopartikeln) wird in 5 ml Tris-Cl-Puffer (pH = 7,4) suspendiert und bei 4 °C aufbewahrt.
Das so hergestellte Kontrastmittel wird mittels AAS, FACS, SEM charakterisiert.
BEISPIEL 3
Synthese von LATEX-LEA-DTPA-Gd unter verschiedenen Bedingungen
I) Herstellung der Substanzen 3.1, 3.2, 3.3 unter Verwendung von vorgefertigtem LEA-DTPA-Gd-Konjugat:
2 mg Polystyrol-COOH (400 nm), 2 mg EDC [ = 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid] und 0,73 mg LEA-DTPA-Gd-Konjugat (siehe Beispiel 1) (LEA-DTPA-Gd:EDC = 1:1000) werden in 0,4 ml tridestilliertem Wasser (bzw. in Phosphatpuffer für Substanz 3.3; LEA-DTPA-Gd:EDC = 1:100) gelöst. Das Reaktionsgemisch wird 18 h bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird die Lösung abzentrifugiert und der Überstand, der das Polystyrol-LEA-DTPA-Gd-Konjugat enthält, mittels FPLC gereinigt. Im Falle der Substanzen 3.1 sowie 3.3 wird vor der FPLC-Reinigung nicht zentrifugiert.
II) Herstellung des Konjugats unter vorheriger Umsetzung des Polymers mit LEA (Substanz 3.4):
Der Aktivator und die ionischen Verunreinigungen in der Latex-Suspension werden durch Zentrifugieren (3 × 10 Min. bei 4000 UpM in PBS) getrennt. 36,0 mg Latex-Partikel werden in 4 ml PBS resuspendiert. Nach Zugabe von 35,0 mg EDC [1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid] wird das Reaktionsgemisch 3.5 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Entfernen des Aktivators durch Waschen (einmal 3 Min. bei 4000 UpM zentrifugieren) werden 10 mg LEA zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird dann einmal bei 4000 UpM zentrifugiert, um freies Lektin abzutrennen. Abschließend wird das Polymer in 1 ml PBS resuspendiert und bei 4°C aufbewahrt. Als nächster Arbeitsschritt wird die Konjugation mit DTPABA durchgeführt. Diese erfolgt analog den Schritten b) bzw. c) im Beispiel 1. Die Beladung mit Gadolinium (III) nach Beispiel 1c) erfolgt mit 2 × 0,030 ml Gd(NTA)₂-Lösung.
BEISPIEL 4
Synthese von PLA-LEA-Gadolinium-Konjugaten
a) Synthese von BSA/PLA-Mikropartikeln (Durchmesser ca. 2 μm)
260 mg Poly-(D,L-Milchsäure) werden in 5 ml Dichlormethan gelöst und in 80 ml BSA-Lösung (25% Gew./Vol.) bei 24000 UpM, 3 Min. mittels Ultra Turrax T25 emulgiert. Die resultierende Emulsion wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Es bilden sich feste Mikropartikel, die durch Zentrifugieren (3300 × g, 15 Min.) gesammelt und sechsmal mit tridestilliertem Wasser gewaschen werden. Die Suspensionen werden dann bei 4°C aufbewahrt. Die Mikropartikelkonzentration wird durch Abwiegen von 1,5 ml Suspension nach dem Lyophilisieren bestimmt.
b) Herstellung der Konjugate:
Synthese von BSA/PLA-LEA-Gd (Substanz 4.1)
Prinzip: Das Lektin wird kovalent an BSA/PLA-Mikropartikel gebunden. Die Mikropartikel werden zuerst mit Glutaraldehyd (25 %ige wässerige Lösung) aktiviert und danach wird als zweiter Schritt die Inkubation mit LEA durchgeführt.
50 mg BSA/PLA-Mikropartikel werden durch Zentrifugieren (3300 × g, 10 Min.) in PBS (10 mM, pH = 7,4) gewaschen. Das Pellet wird beim Vortexen in 1 ml PBS resuspendiert. Danach wird 1 ml 25 %iger wässerige Glutaraldehyd-Lösung zugegeben und das Gemisch wird zur Aktivierung der Aminogruppen 6 h geschüttelt. Zur Abtrennung von nicht reagiertem Glutaraldehyd wird die BSA/PLA-Suspension abzentrifugiert und noch viermal mit PBS (10 mM, pH 7,4) gewaschen. Anschließend wird 0,25 mg LEA in PBS zu 1 ml BSA/PLA-Suspension zugegeben. Die Reaktionslösung wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Das LEA-Mikropartikel-Konjugat wird dann zentrifugiert, erneut in 1 ml PBS suspendiert und bei 4°C gelagert.
Die Menge an gebundenem Lektin wird mit der Differenzmethode (Lektin im Ansatz/Lektin im Überstand nach der Konjugation) ermittelt. Die Proteinbestimmung erfolgt nach der Amidoschwarzmethode.
Konjugation mit DTPA:
Zu 0,5 ml der Mikropartikelsuspension werden 3,5 mg DTPABA (0,009 mmol, 220facher Überschuss) in 0,007 ml DMSO zugegeben. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 3 M NaOH auf 8,5 eingestellt. Die Suspension wird 1 h lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und alle 10 Minuten geschüttelt.
Komplexierung von Gd(III):
Das Reaktionsgemisch wird 3 Minuten lang bei 4000 UpM abzentrifugiert. Das Pellet wird verworfen und der Überstand, enthaltend die Mikropartikel, wird mittels FPLC gegen Citratpuffer (0,1 M; pH = 6,5) aufgetrennt. Die BSA/PLA-LEA-Fraktion mit dem kovalent gebundenen DTPA wird isoliert. Die erhaltenen 3 ml Lösung werden mit 3 × 0,030 ml Gd(NTA)₂-Lösung versetzt und 24 h bei 4°C gerührt. Anschließend wird die Lösung lyophilisiert, in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst und wieder mittels FPLC gereinigt, um ungebundenes Gd(NTA)₂ und freie H₃NTA abzutrennen.
Synthese von BSA-Gd/PLA-LEA-Gd (Substanz 4.2):
Zuerst wird das für diese Verbindung benötigte BSA-DTPABA-Gd-Konjugat folgendermaßen hergestellt.
20 mg BSA (0,3 × 10^–3 mmol) werden in 0,44 ml HEPES-Puffer (0,1 M; pH = 8.8) in einem Eppendorff-Röhrchen gelöst. 23,6 mg DTPABA (0,066 mmol, 220facher Überschuss) werden in 0,059 ml DMSO suspendiert und dann in drei Portionen zur Proteinlösung gegeben. Zwischen den Zugaben wird der pH-Wert durch Zugabe von 3 M NaOH auf pH = 8.5 eingestellt. Nach der letzten Zugabe wird noch weitere 2 h bei Raumtemperatur nachgerührt.
Zur Entfemung von ungebundenem DTPABA wird die Reaktionslösung mittels FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) durch Gelfiltration mit Citratpuffer (0,1 M; pH = 6.5) aufgetrennt. Die Proteinfraktion mit dem kovalent gebundenen DTPA wird isoliert. Die erhaltenen 3 ml Proteinlösung werden mit 0,056 ml Gd(NTA)₂-Lösung (0,016 mmol) versetzt und 24 h bei 4°C gerührt. Anschließend wird die Lösung lyophilisiert, in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst und wieder mittels FPLC gereinigt, um ungebundenes Gd(NTA)₂ und freie H₃NTA abzutrennen.
50 mg BSA-DTPA-Gd/PLA-Mikropartikel werden durch Zentrifugieren (3300 × g, 10 Min.) in PBS (10 mM, pH = 7,4) gewaschen. Das Pellet wird beim Vortexen in 1 ml PBS resuspendiert. Danach wird 1 ml 25 %iger wässeriger Glutaraldehyd-Lösung zugegeben und das Gemisch wird zur Aktivierung der Aminogruppen 6 h geschüttelt. Zur Abtrennung von nicht reagiertem Glutaraldehyd wird die BSA-DTPA-Gd/PLA-Suspension abzentrifugiert und noch viermal mit PBS (10 mM, pH 7,4) gewaschen. Anschließend werden 0.25 mg LEA zu 1 ml BSA-DTPA-Gd/PLA-Suspension zugegeben. Die Reaktionslösung wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Das LEA-BSA-DTPA-Gd-Mikropartikel-Konjugat wird dann zentrifugiert, erneut in 0,5 ml PBS suspendiert und bei 4°C gelagert.
Konjugation mit DTPA:
Zu der Mikropartikelsuspension (0,5 ml) werden 3,5 mg DTPABA (0,009 mmol, 220facher Überschuss) in 0,007 ml DMSO zugegeben. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 3 M NaOH auf 8,5 eingestellt. Die Suspension wird 1 h lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und alle 10 Minuten geschüttelt.
Komplexierung von Gd(III):
Das Reaktionsgemisch wird 3 Minuten lang bei 4000 UpM abzentrifugiert. Das Pellet wird verworfen und der Überstand, enthaltend die Mikropartikel, wird mittels FPLC gegen Citratpuffer (0,1 M; pH = 6,5) aufgetrennt. Die BSA/PLA-LEA-Fraktion mit dem kovalent gebundenen DTPA wird isoliert. Die erhaltenen 3 ml Lösung werden mit 3 × 0,030 ml Gd(NTA)₂-Lösung versetzt und 24 h bei 4°C gerührt. Anschließend wird die Lösung lyophilisiert, in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst und wieder mittels FPLC gereinigt , um ungebundenes Gd(NTA)₂ und freie H₃NTA abzutrennen.
Die Menge an gebundenem Lektin wird mit der Differenzmethode (Lektin im Ansatz/Lektin im Überstand nach der Konjugation) ermittelt. Die Proteinbestimmung erfolgt nach der Amidoschwarzmethode.
BEISPIEL 5
Immobilisierung von Lektinkonjugaten auf der Oberfläche eines polymeren Trägers
Als Träger werden Polykondensate der chelatisierenden Verbindung DTPABA mit jeweils [N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin)], Ethylendiamin, Hexamethylendiamin und Ethylenglykol hergestellt. Die Kettenlänge der Polykondensate variiert zwischen n = 5–9 Einheiten.
I. Polykondensation:
0,7146 g DTPABA (2 mmol) werden in 10 ml DMSO (abs.) in einem 100-ml-Rundkolben mit Öffnung für Inertgas gelöst. 0,3264 g Bicin bzw. bifunktionales Reagenz (2 mmol) werden zugegeben und das Gemisch wird 72 h lang unter N₂ gerührt. Das Polykondensat wird in der 10fachen Menge Aceton präzipitiert, filtriert und mit Aceton gewaschen. Das Produkt wird in Wasser gelöst und nochmals mit Aceton (10fache Menge) präzipitiert, filtriert und gewaschen. Dann wird es bei 40 ° C unter Vakuum bis zum konstanten Gewicht getrocknet.
II. Konjugation der Polykondensate mit LEA (Lycopersicon esculentum agglutinin):
10 mg LEA (1,41 × 10^–4 mmol) werden in 0,50 ml Phosphatpuffer (0,1 M; pH 7,4) in einem Eppendorff-Röhrchen gelöst und anschließend werden 10 mg Polykondensat zugegeben. Der pH-Wert wird durch Zusatz von 3 M NaOH auf 8,5 eingestellt. Danach wird die Lösung 1 h bei Raumtemperatur stehen gelassen und alle 10 Minuten geschüttelt.
III. Komplexierung der Polykondensate mit Gadolinium:
Zur Entfernung ungebundener Substanzen werden die Reaktionslösungen mittels FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) durch Gel-Filtration mit Citratpuffer (0,1 M; pH = 6,5) aufgetrennt. Die Proteinfraktion mit dem kovalent gebundenen Polykondensat wird isoliert. Die erhaltenen 3 ml Proteinlösungen werden mit jeweils 120 μl Gd(NTA)₂ Lösung (0,016 mmol) versetzt und bei 4°C 24 h lang gerührt. Anschließend werden die Lösungen lyophilisiert, in destilliertem Wasser gelöst und mittels FPLC gereinigt, um ungebundenes Gd(NTA)₂ und freie H₃NTA abzutrennen.
Alle Verbindungen werden mittels ¹H-, ¹³C-NMR, Massenspektrometrie, AAS oder Proteinbestimmungen charakterisiert.
BEISPIEL 6
Anwendung in der MRI-Diagnostik
a) Messungen der Relaxation
Die Verdünnungsreihen der verschiedenen Substanzen wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH = 7,4) hergestellt; die Konzentrationen lagen zwischen 10^–6 M und 1,0 M. PBS wurde als Standard verwendet. Die gelöste Testsubstanz wurde als 30- bis 100-nM-Aliquot in ein Eppendorff-Kunststoffröhrchen gefüllt und in der Detektorspule für die MRI-Messungen positioniert. Die molare Konzentration wurde im Falle der Makromoleküle auf Basis des Trägers, für den die analytischen Daten bekannt sind, und unter Berücksichtigung des molaren Verhältnisses zwischen Träger und Gadolinium berechnet. Für die kleinen Moleküle, wie z. B. Gd-DTPA oder kleinere Polymere, wurde die molare Konzentration auf der Basis des absoluten Molekulargewichts der entsprechenden Substanz bestimmt. Im Falle der Nanopartikel wurde die Konzentration der Nanopartikel-Suspension und die absolute Menge an Gadolinium, bezogen auf die Oberfläche des Nanopartikels, als Basis für die Berechnung der Konzentration in der Lösung verwendet.
Relaxationen wurden berechnet, indem die Signalverstärkung, die in PBS gemessen worden ist, mit den Werten, die in den graduell verdünnten Konzentrationsreihen der Gd-DTPA-Verbindungen erzielt worden sind, verglichen wurden.
Resultate:
Substanz 1 (LEA-DTPA-Gd): MRI-Daten: SE (Spin-Echo) = 950 % bei 1 × 10^–3 M, kein SE bei 1 × 10^–5 M.
Aus der Konzentrations-Wirkungs-Kurve (1) ist ersichtlich, dass die erfindungsgemäße Verbindung 1 eine Signalerhöhung bei geringeren Konzentrationen als Omniscan und Magnevist bewirkt.
MRI-Bilder: bei 1 × 10^–4 M schwache Abbildung der Lebervenen der Maus (Spin-Echo- und Flash-3D-Technik).
Substanz 2: MRI-Daten: SE = 110 % bei 1 × 10^–4 M, kein SE bei 1 × 10^–5 M. MRI-Bilder der Lebervene der Maus in Spin-Echo-Technik.
Substanz 3.4: MRI-Bilder, siehe 2 und 3.
b) Venendarstellungen
Die humanen Venen wurden bei der operativen Behandlung von varikösen Venen entfernt. Sie wurden sofort in 2,5 %igem Glutaraldehyd, gepuffert mit PBS, eingelegt. Nach der Fixierung in dieser Lösung für 18 bis 24 Stunden bei 4°C wurden die Venen in PBS überführt und bis zu 6 Wochen bei +4°C gelagert. Bei der Operation wird die Vene umgestülpt, was zu Folge hat, dass das Endothel im Gegensatz zur natürlichen Ausrichtung unter physiologischen Bedingen nach außen gerichtet ist.
Kurz vor der Untersuchung im MRI wurden die Venen in 2 cm große Fragmente geschnitten, in 0,15 M Ammoniumchlorid-Lösung für zwei Stunden bis zu einer Woche bei 4°C eingelegt, danach für mindestens eine Stunde in PBS mit 0,1 % HSA, 0,1 mM Calciumionen und 0,1 mM Magnesiumionen (PBS Inc.) gelagert. Danach wurden die Venen eine Stunde in PBS-Inc., das 10 mg/ml Latex-400-LEA-Gd (Substanz 3.4) enthielt, eingelegt. Als Kontrolle diente eine Vene, die in PBS-Inc. ohne Zusatz von Additiven eingelegt worden war.
MRI-Untersuchungen wurden durchgeführt während die Venensegmente in PBS Inc. oder in PBS Inc. mit Substanz 3.4 eingelegt waren. Danach wurden die Venen in 5 ml PBS Inc. als Spülung gelegt, es wurde zwei Minuten geschüttelt, danach wurde die Vene ein weiteres Mal mit PBS Inc. gespült und erneut im MRI untersucht.
MRI-Experimente wurden unter Verwendung der Spin-Echo-Frequenz und anschließend unter Verwendung der FLASH-3D-Sequenz durchgeführt.
Die Daten wurden in Form digitaler Bilder so aufgezeichnet, das quantitative Daten aus den Bildern extrahiert werden können.
In 2 sind die Ergebnisse der MRI-Messung unter Verwendung des Latex-LEA-Konjugats 3.4 in der humanen Vena saphena magna zu erkennen. Diese zeigen deutlich die Anlagerung des erfindungsgemäßen Konjugats an das Endothel der Vena saphena magna.
c) Perfusion der Maus
Jede Maus wurde mit Ketamin und Rompun narkotisiert, dann wurden kleine Venflons in eine der Carotis-Arterien und in eine der Jugularvenen eingeführt. Die Maus wurde dann in ein Falconröhrchen, das an einem Ende geöffnet war, um den Eintritt von Luft zu gewährleisten, eingebracht und das Falconröhrchen wurde innerhalb der Detektorspule des MRI-Geräts positioniert. MRI-Messungen wurden von verschiedenen Organen der Maus (Gehirn, Darm, Leber, Niere und Lunge) vor der Perfusion mit der Testsubstanz durchgeführt. Die Perfusion von 0,2 ml der Testsubstanz innerhalb von 60 Sekunden wurde direkt mittels MRI verfolgt. Nach der MRI-Messung wurde die Maus durch Perfusion mit L15 in verschiedenen Volumina zwischen 1,0 und 2,5 ml in die Jugularvene durchgespült. Die Maus wurde sofort wieder im Detektor platziert und die MRI-Messungen wurden erneut durchgeführt.
Als Beispiel zur Anwendung des Latex-Konjugats 3.4 sind in 3A bis 3D 4 MRI-Aufnahmen von der Leber der Maus dargestellt. Aus diesen Aufnahmen ist deutlich die Kontrastierung der Blutgefäße in der Leber durch Einsatz einer erfindungsgemäßen Verbindung zu erkennen. Ferner zeigt sich, dass trotz vollständigen Spülens des Blutgefäßsystems der Maus das Kontrastmittel in den Blutgefäßen verbleibt (3C und 3D).

Claims

Konjugat, umfassend mindestens eine zielsuchende Einheit, die spezifisch an Rezeptoren auf der Oberfläche von Endothelzellen bindet, und mindestens eine daran über einen Linker gekoppelte Effektoreinheit, die mindestens eine Signaleinheit sowie gegebenenfalls mindestens einen therapeutischen Wirkstoff umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit ein Lektin oder ein Fragment oder Derivat davon umfasst, wobei das Lektin kein L-Selektin ist, und die Signaleinheit ein Lanthanidenion umfasst.
Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit an charakteristische Kohlenhydratstrukturen der Glykokalix von durch pathophysiologische Vorgänge veränderten Endothelzellen bindet.
Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit an spezifische Lektine auf der Oberfläche von Endothelzellen bindet.
Konjugat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass an das Lektin, Fragment oder Derivat davon ein divalenter Zucker gebunden ist, welcher eine selektive Bindungsaffinität für spezifische Lektine auf der Oberfläche von Endothelzellen besitzt.
Konjugat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit an endotheliale Marker für Entzündungskrankheiten bindet.
Konjugat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit an VCAMPGPI, Klasse I MHC Antigen, ICAM-1, VCAM-1, ELAM-1, E-Selektin, P-Selektin oder VLA-4 bindet.
Konjugat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit an für Tumorzellen charakteristische endotheliale Marker bindet.
Konjugat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit an die Zelloberflächenmoleküle 4Ff2, EndoGlyx-1 oder Endosialin bindet.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1–8, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit monovalent ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1–9, dadurch gekennzeichnet, dass das Lektin LEA, ein fukose-spezifisches Lektin wie UEA-1, ein mannosebindendes Lektin wie MBL oder ConA, ein galactosid-bindendes Lektin wie GSA-1B₄, ein sialinsäure-bindendes Lektin wie LFA ist, oder dass das Lektin ein körpereigenes Lektin des Menschen wie LOX-1, Thrombomodulin, Endosialin, Endoglyx oder Galektin-1 ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1–10, dadurch gekennzeichnet, dass das Lanthanidenion ein Gadolinium- oder Europiumion ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1–11, dadurch gekennzeichnet, dass die Effektoreinheit einen therapeutischen Wirkstoff umfasst, der aus cytotoxischen und cytostatischen Substanzen ausgewählt ist.
Konjugat nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der therapeutische Wirkstoff aus Radionukliden, Metallkomplexen, Alkylantien, Antibiotika, Antimetaboliten, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Mitose-Hemmern, Toxinen, rekombinanten Proteinen oder Vektoren für Gen-Transfektionen ausgewählt ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1–13, dadurch gekennzeichnet, dass die Effektoreinheit ein chelatbildendes Molekül umfasst.
Konjugat nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das chelatbildende Molekül Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylen triaminpentaessigsäure (DTPA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N,N,N-tetraessigsäure (DOTA), Deferoxamin (DFO) oder ist.
Konjugat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Effektoreinheit mehrere chelatbildende Moleküle umfasst, die über ein bifunktionales Brückenmolekül aneinander gekoppelt sind.
Konjugat nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das bifunktionale Brückenmolekül aus Diolen, z. B. Ethylenglykol, 1,3-Propylenglykol oder N,N,-Bis-(2-hydroxyethylglycin), oder Diaminen, z. B. Ethylendiamin, 1,3-Propylendiamin oder 1,6-Hexamethylendiamin, ausgewählt ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1–17, dadurch gekennzeichnet, dass das Konjugat auf der Oberfläche eines polymeren Trägers immobilisiert ist oder im Inneren eines polymeren Trägers eingeschlossen ist.
Konjugat nach Anspruch 18 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem polymeren Träger um Nano- oder Mikropartikel auf Polystyrol- oder Chitosanbasis, um BSA/PLA-Mikropartikel oder um Latexpartikel handelt.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1–19, dadurch gekennzeichnet, dass das Konjugat ein LEA-DTPABA-Gd-Konjugat oder LEA-DTPA-Gd-Konjugat ist.
Zusammensetzung, enthaltend ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1–20 sowie gegebenenfalls zusätzliche therapeutische Wirkstoffe, signalerzeugende Komponenten, physiologisch annehmbare Träger und Hilfsstoffe.
Verwendung des Konjugats nach einem der Ansprüche 1–20 oder der Zusammensetzung nach Anspruch 21 in einem bildgebenden Verfahren.
Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass das bildgebende Verfahren MRI ist.
Verwendung des Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 20 oder der Zusammensetzung nach Anspruch 21 in einem therapeutischen Verfahren.
Verwendung des Konjugats nach einem der Ansprüche 1–20 oder der Zusammensetzung nach Anspruch 21 in einem therapeutischen Verfahren, bei dem gleichzeitig die Wirkstoffakkumulation im Körper des Patienten verfolgt wird.
Herstellung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1–20, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine wässerige Lösung des Komplexsalzes eines Lanthanidenelements hergestellt wird, b) das gewünschte Lektin, Fragment oder Derivat mit einem chelatbildenden Molekül konjugiert und ungebundenes chelatbildendes Molekül entfernt wird, und c) das konjugierte Lektin mit der Lanthanidensalz-Lösung umgesetzt wird, um das Lanthanidenion über das chelatbildende Molekül an das Konjugat zu binden, d) gegebenenfalls ein therapeutischer Wirkstoff an das Lektin oder an das Konjugat nach Schritt c) gebunden wird.
Herstellung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Komplexsalz des Lanthanidenelements Nitriloessigsäuregadolinat-Trinatriumsalz (Gd(NTA)₂Na₃) ist, das Lektin LEA ist und das chelatbildende Molekül aus der Gruppe bestehend aus EDTA, DTPA, DTPABA und DFO ausgewählt ist.
Konjugat, umfassend mindestens eine zielsuchende Einheit, die spezifisch an Rezeptoren auf der Oberfläche von Endothelzellen bindet, und mindestens eine daran über einen Linker gekoppelte Effektoreinheit, die mindestens einen therapeutischen Wirkstoff umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die zielsuchende Einheit ein Lektin oder ein Fragment oder Derivat davon umfasst, wobei das Lektin kein Erdnuß-Lektin, Lektinextrakt der Orangenschale, Maclura pomifera-Lektin, Dolichos biflorus-Agglutinin oder Sojabohnen-Agglutinin ist.