DE69732831T2

DE69732831T2 - Kontrastmittel

Info

Publication number: DE69732831T2
Application number: DE69732831T
Authority: DE
Inventors: Julian Cockbain; Wolfgang Gunther; Kenneth Kellar; Kiyoshi Dennis FUJII; Vinay Desai; Christopher Black; Marshall Beeber; Jennifer Wellons; Kjersti Anne FAHLVIK; Anne Naevestad; George Na; Barbara Yuan; Jack Stevens; Brian Weekley; Torgrim Engell; Michel Gacek; Lee David LADD; Jasbir Singh; Richard Edward BACON; Lynn Gregory MCINTIRE
Original assignee: Amersham Health AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1996-01-10
Filing date: 1997-01-09
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2017-01-10
Also published as: AU1390497A; JP2000504300A; EA199800630A1; MX9805508A; DE69732831D1; AU716667B2; EP0877630A2; EP0877630B1; IL125150A0; CA2242647A1; WO1997025073A3; NO983060D0; ATE291439T1; HUP9901192A1; JP4280304B2; IL125150A; NZ325403A; US6423296B1; HUP9901192A3; NO983060L

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf superparamagnetische teilchenförmige Kontrastmittel, insbesondere zur Verwendung in der Magnetresonanzbildgebung, speziell der Vaskulatur, und auf ihre Herstellung.
Hintergrund der Erfindung
In diagnostischen Bildgebungsmodalitäten, wie beispielsweise Röntgenstrahlungs-, Ultraschall- und Magnetresonanz(MR)-Bildgebung ist die Verwendung von Kontrastmitteln zum Verstärken des Kontrasts zwischen verschiedenen Geweben oder Organen oder zwischen gesundem und geschädigtem Gewebe eine gut etablierte Technik. Für die verschiedenen Bildgebungsmodalitäten wird eine Kontrastverstärkung durch das Kontrastmittel auf verschiedene Arten erreicht. Daher erreichen z.B. bei der Protonen-MR-Bildgebung Kontrastmittel im allgemeinen ihren kontrastverstärkenden Effekt durch Modifizieren der charakteristischen Relaxationszeiten (T₁ und T₂) der Bildgebungskerne (im Allgemeinen Wasserprotonen), von denen sich das MR-Signal, das zum Erzeugen des Bildes verwendet wird, ableitet.
Wenn sie einem Lebewesen injiziert werden, können Materialien mit magnetischen Eigenschaften, wie Paramagnetismus, Superparamagnetismus, Ferromagnetismus und Ferrimagnetismus eine Reduktion in den T₁- und T₂- (oder T₂*-)Werten von Gewebewasserprotonen verursachen. Obwohl eine Reduktion in T₁ nicht ohne eine Reduktion in T₂ (oder T₂*) erfolgen kann, kann die Teilabnahme in T₁ von derjenigen in T₂ (oder T₂*) verschieden sein. Falls die Teilabnahme in T₁ größer ist als jene in T₂ (T₂*), steigt die Intensität des MR-Bildes an, und das Material wird als ein T₁- oder positives Kontrastmittel bezeichnet. Falls die Teilabnahme in T₁ geringer ist als jene in T₂ (oder T₂*), nimmt die Intensität des MR-Bildes ab, und das Material wird als ein T₂- (oder T₂*-) oder negatives Kontrastmittel bezeichnet.
Teilchen mit den magnetischen Eigenschaften von Superparamagnetismus, Ferrimagnetismus und Ferromagnetismus werden hier als magnetische Teilchen bezeichnet.
Der erste Vorschlag in der Literatur zur Verwendung von magnetischen Materialien als MR-Kontrastmittel war der Vorschlag von Lauterbur im Jahr 1978, dass Mangansalze in dieser Hinsicht verwendet werden könnten. Der erste Vorschlag in der Patentliteratur war der Vorschlag von Schering in EP-A-71564 (und sein Äquivalent US-A-4647447), dass Chelatkomplexe von paramagnetischen Metallionen, wie das Lanthanidenion Gd(III), verwendet werden könnten.
Die frühen kommerziellen Kontrastmittel für MR-Bildgebung wie GdDTPA, GdDTPA-BMA und GdHP-D03A, erhältlich von Schering, Nycomed und Bracco unter den Marken MAGNEVIST, OMNISCAN und PROHANCE, sind alle lösliche Chelatkomplexe von paramagnetischen Lanthanidenionen und sind bei der Verwendung positive Kontrastmittel, die die Bildintensität von den Bereichen, an die sie sich verteilen, verstärken.
Nachfolgend wurden teilchenförmigen ferromagnetische, ferrimagnetische und superparamagnetische Mittel zur Verwendung als negative MR-Kontrastmittel vorgeschlagen. Orale Formulierungen derartiger teilchenförmiger Mittel, im allgemeinen hier als magnetische Teilchen bezeichnet, wurden zur Bildgebung des Gastrointestinaltraktes kommerziell erhältlich, z.B. das Produkt ABDOSCAN erhältlich von Nycomed Imaging. Jedoch wurde eine parenterale Verabreichung derartiger teilchenförmiger Mittel auch weit verbreitet vorgeschlagen zur Bildgebung der Leber und der Milz, da diese Organe so wirken, dass sie teilchenförmiges Fremdmaterial aus dem Blut relativ schnell entfernen. Daher wird als Beispiel die Leber- und Milzbildgebung unter Verwenden derartiger Mittel von Widder in US-A-4859210 vorgeschlagen.
Kürzlich wurde vorgeschlagen, z.B. von Pilgrimm in US-A-5160725 und WO-94/21240, dass die Aufnahme von parenteral verabreichten magnetischen Teilchen aus dem Blut durch das retikuloendotheliale System blockiert sein kann, und daher die Verweilzeit im Blut verlängert sein kann, durch chemisches Binden einer Stabilisatorsubstanz an die Oberfläche des magnetischen Teilchens.
Beispiele für Materialien, die auf diese Weise als Stabilisatoren verwendet werden können, umfassen Kohlenhydrate, wie Oligo- und Polysaccharide, wie auch Poly aminosäuren, Oligo- und Polynucleotide und Polyalkylenoxide (einschließlich Poloxamere und Poloxamine) und andere Materialien, die vorgeschlagen wurden von Pilgrimm in US-A-5160725 und WO-94/21240, von Nycomed in PCT/GB94/02097, von Bracco in US-A-5464696 und von Illum in US-A-4904479.
Auf diese Art und Weise beschichtete magnetische Teilchen können dann als Blutspeichermittel (d.h. zum Abbilden der Vaskulatur) oder zur Lymphknotenbildgebung verwendet werden, oder alternativ können sie an Biotargeting-Mittel konjugiert werden und zur Bildgebung der Zielgewebe oder -organe verwendet werden.
Wenn als Blutspeichermittel verabreicht, wurde für magnetische Teilchen gefunden, dass die Teilreduktion in T₁ der Blutprotonen größer sein kann als die Teilabnahme in T₂ (oder T₂*), und daher solche Mittel als positive MR-Mittel für die Vaskulatur verwendet werden können.
Für die parenterale Verwendung sind die Größe und die Größenverteilung der zusammengesetzten Teilchen und die chemische Natur der Oberfläche des gesamten Teilchens von großer Wichtigkeit beim Bestimmen der Kontrasterzeugungswirksamkeit, der Halbwertszeit im Blut und der Bioverteilung und dem Bioabbau des Kontrastmittels. Idealerweise befindet sich die Größe des magnetischen Teilchens (d.h. die Kristallgröße des magnetischen Materials) innerhalb des Bereichs der Größe einer einzelnen Domäne (so dass die Teilchen superparamagnetisch sind und daher keine Hysterese und eine reduzierte Tendenz zum Aggregieren besitzen) und die Gesamtgrößenverteilung der Teilchen ist eng, so dass die Teilchen eine einheitliche Bioverteilung, Bioelimination und Kontrasteffekte besitzen. Bevorzugt sollten magnetische Teilchen mit einer Oberflächenbeschichtung eines Materials versehen sein, die die Teilchenbioverteilung modifiziert, z.B. durch Verlängern der Halbwertszeit im Blut oder durch Erhöhen der Stabilität, oder die als ein Targeting-Vektor wirkt, der eine bevorzugte Verteilung an eine Zielstelle, wie eine Tumorstelle verursacht.
Mittlere Kristallgrößen, d.h. des magnetischen Kernmaterials sollten allgemein im Bereich von 1 bis 50 nm, bevorzugt 1 bis 20 nm und speziell bevorzugt 2 bis 15 nm sein, und, zur Verwendung als Blutspeichermittel, sollte die mittlere Teilchengesamt größe einschließlich eines beliebigen Beschichtungsmaterials bevorzugt unter 30 nm sein. (Die Teilchengröße kann durch Elektronenmikroskopie bestimmt werden.) Das Herstellen superparamagnetischer Kristalle oder zusammengesetzter Teilchen mit derartigen Größen ist für sich selbst gesehen nicht besonders problematisch. Jedoch stellt die Herstellung von Teilchen mit der erwünschten Größe, akzeptablen Größenverteilung und ohne übermäßige Kristallaggregation ein Problem dar und auf die Lösung dieses Problemes ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung gerichtet.
Typischerweise werden magnetische Kristalle durch Flüssigphasenpräzipitation hergestellt, im allgemeinen in einer Lösung eines polymeren Beschichtungsmittels (z.B. unter Verwenden einer Copräzipitationstechnik, wie jene, die von Molday in US-A-4452773 beschrieben ist). Diese Technik führt zur Erzeugung relativ polydisperser Teilchen, die einen nachfolgenden Größenfraktionierungsschritt erfordern, z.B. durch Zentrifugation oder Chromatographie. Beispielsweise wird durch eine derartige Technik das Produkt AMI 227 von Advanced Magnetics hergestellt.
Wir haben nun gefunden, dass magnetische Teilchen mit besonders vorteilhaften Eigenschaften durch Präzipitation in einem verzweigten Polymer, das ein wässriges Medium enthält, und nachfolgendes Spalten des Polymers hergestellt werden kann, um zusammengesetzte Teilchen freizusetzen, die magnetischen Teilchen und eine gespaltene Polymerbeschichtung umfassen.
Zusammenfassung der Erfindung
Daher stellt von einem Aspekt aus gesehen die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung zusammengesetzter superparamagnetischer Eisenoxidteilchen bereit, das die nachstehend aufeinanderfolgenden Schritte umfasst:

(i) Mischen von Eisen (II)- und Eisen (III)-Salzen, einer Stärke und einer Base in einer erwärmten wässrigen Lösung;
(ii) gegebenenfalls Kühlen der genannten Lösung auf unter 15°C um eine Gelbildung zu ermöglichen;
(iii) Verringern des pH auf einen Wert im Bereich von 6,0 bis 8,5, wobei dieser Schritt gegebenenfalls vor Schritt (ii) durchgeführt wird;
(iv) Behandeln mit einem Oxidationsmittel, um die Stärke zu spalten und die genannten Teilchen freizusetzen;
(v) Waschen und Filtrieren der freigesetzten Teilchen;
(vi) gegebenenfalls Umsetzen der freigesetzten Teilchen mit einem funktionalisierten Polyalkylenoxid-Derivat, um das genannte Derivat an die genannten Teilchen zu binden; und
(vii) gegebenenfalls Sterilisieren der freigesetzten Teilchen in einem Autoklaven.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1, 2 und 3 zeigen T₁-gewichtete MR-Bilder des Kaninchens vor und nach dem Kontrast, auf eine Verabreichung eines Kontrastmediums gemäß der Erfindung folgend.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Das hydrophile verzweigte organische Polymer, das im Verfahren der Erfindung verwendet wird, ist Stärke.
Diese kann eine native Stärke oder alternativ eine bearbeitete Stärke sein, z.B. eine mit Säure behandelte, mit Enzymen behandelte oder eine solubilisierte Stärke. Natürliche Stärken, insbesondere von Pflanzen abgeleitete Stärken, wie Getreide-, Kartoffel-, Reis- oder Weizenstärke sind besonders bevorzugt.
Natürliche Stärken sind eine Kombination der im Allgemeinen linearen Amylose- und der verzweigten Amylopektinpolysaccharide. Für die Praxis der Erfindung ist, solange wie der Amylosegehalt akzeptabel ist, er bevorzugt nicht so hoch, als dass er Retrogradation verursacht, der stark irreversible Übergang vom dispergierten Zustand zum im wesentlichen unlöslichen mikrokristallinen Zustand. Aus diesem Grund wird die Verwendung der Amylopectin-reichen Kartoffelstärke bevorzugt gegenüber Mais- oder Weizenstärken.
Wo das Polymermaterial, das gemäß der Erfindung verwendet wird, ein Material ist, das durch Auflösung in einem wässrigen Medium und Wärmebehandlung darin be einflusst wird, z.B. ein Material wie Stärke, das von einem granulären Zustand zuerst quillt und sich teilweise auflöst, kann die Wärmegeschichte des Reaktionsmediums die Eigenschaften des Endproduktes beeinflussen. In derartigen Fällen kann eine Wärmegeschichte, die zu einer stärkeren Steuerung der Viskosität und der Struktur des Mediums führt, bevorzugt sein. Daher ist es für Stärke insbesondere bevorzugt, dass das Reaktionsmedium erzeugt, gekühlt und dann wieder erwärmt wird, z.B. durch Bildung einer wässrigen Dispersion bei 60 bis 95°C, Kühlen auf zwischen 5 und 80°C (z.B. 5 bis 60°C) und Wiedererwärmen auf 45 bis 85°C (z.B. 45 bis 80°C). Auf diese Weise kann eine vorteilhafte Struktur für das Präzipitationsmedium erreicht werden.
Es wird geglaubt, dass Stärke dispergierte Präzipitationsimpfstellen innerhalb des wässrigen Mediums bereitstellt, was ermöglicht, dass sich einheitliche kleine Präzipitatteilchen bilden. Die Verwendung von nicht-hydrophilen Polymeren, wie Gelatine oder Dextran oder von anorganischen Gelen wie Silicagel ist nicht effektiv.
Stärke ist bevorzugt bei einer Konzentration vorhanden, die ausreicht, um das Präzipitationsmedium dazu zu veranlassen, in Gelform bei Umgebungs- oder Peri-Umgebungstemperaturen vorzuliegen, z.B. 0 bis 60°C. Die verwendete Konzentration ist auch in geeigneter Weise derart, dass ein Gel bei Temperaturen bis zu 80°C erzeugt wird. Für Stärken sind Konzentrationen von 1 bis 200 g/l, speziell 2 bis 150 g/l, besonders 20 bis 100 g/l und insbesondere 40 bis 90 g/l bevorzugt.
Während das Präzipitationsmedium wässrig ist, kann es auch Mischungen von Wasser und Co-Lösungsmittel, wie mit Wasser mischbare Alkohole, Äther oder Ketone enthalten.
Wie oben angegeben, ist es besonders bevorzugt, dass das gemäß der Erfindung verwendete Präzipitationsmedium im kolloidalen Materiezustand vorliegt, der als ein Gel bezeichnet wird. In einem derartigen Medium bildet ein polymeres gelbildendes Material ein Netzwerk, was vom wässrigen Dispersionsmedium durchdrungen wird. Ein derartiges Gel wird allgemein viskoser sein als das wässrige Dispersionsmedium alleine, aber für die Zwecke der Erfindung muss das Gel nicht so viskos sein, dass es in einem starren oder halbstarren selbsttragenden Zustand vorliegt. In der Tat kann die Gelstruktur sogar so schwach sein, dass das Präzipitationsmedium einfach eine freie fließende Lösung zu sein scheint. Jedoch kann in jenem Fall die Gelnatur des Mediums auf einfache Weise durch seine thixotropen Eigenschaften verifiziert werden, nämlich, dass die Viskosität des Mediums durch Bewegung verringert wird.
Während das Präzipitationsmedium eine Stärke wie oben erwähnt enthalten muss, kann es andere gelbildende Polymere enthalten, die z.B. linear sein können. Beispiele geeigneter Polymere zur Verwendung in dieser Hinsicht umfassen Proteine, Polysaccharide, Proteoglycane und gelbildende oberflächenaktive Mittel, z.B. oberflächenaktive Mittel aus einem Blockcopolymer der Pluronic- und Tetronic-Reihen, wie F-127, F-108 und F-68. Diese oberflächenaktiven Mittel bilden Gele im wässrigen Medium bei den erhöhten Temperaturen und pH-Gehalten, die im Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Daher kann beispielsweise ein Präzipitationsmedium in Gelform unter Verwendung einer wässrigen Dispersion eines gelbildenden, linearen oberflächenaktiven Mittels aus einem Blockcopolymer und eines verzweigten organischen Polymers, wie Amylopectin hergestellt werden.
Die Gelmatrix des Präzipitationsmediums sollte jedoch derart sein, dass chemische (oder biochemische) Spaltung mindestens einer der Polymerkomponenten, bevorzugt mindestens der Stärke, möglich ist, um so die magnetischen Teilchen freizusetzen. Aus diesem Grund ist die Verwendung von stark vernetzten Polymeren nicht erwünscht.
Die Teilchenpräzipitation kann mit dem wässrigen Medium in starrer oder halbstarrer Gelform bewirkt werden, z.B. durch Durchdringen des Gels mit einer Base, aber am meisten bevorzugt wird die Präzipitation in einem erwärmten, bewegten (z.B. gerührten) wässrigen Medium bewirkt, das eine merklich erhöhte Viskosität relativ zu Wasser aufweisen kann oder nicht. Besonders bevorzugt wird die Präzipitation bei Temperaturen im Bereich von 40 bis 95°C bewirkt, und mit sanftem Rühren.
Durch Manipulieren der thixotropen Eigenschaften des wässrigen Präzipitationsmediums können zusammengesetzte Teilchen gemäß der Erfindung mit einem Bereich von Größen hergestellt werden.
Es wird geglaubt, dass die Bildung magnetischer Teilchen in dem Verfahren der Erfindung ein zweistufiger Prozess sein kann, bei dem sich Domänen von amorphem Material bilden und dann in magnetische Teilchen umwandeln, z.B. bei einer erhöhten Temperatur, z.B. 40 bis 95°C, bevorzugt 50 bis 93°C. Daher wurde gefunden, dass die Entwicklung der magnetischen Eigenschaften der Teilchen über eine Zeitspanne von Minuten bis Stunden, z.B. bis 3 Stunden, überwacht werden kann. Jedoch wird in der Praxis gefunden, dass die Entwicklung magnetischer Eigenschaften im wesentlichen innerhalb von 2 Stunden abgeschlossen ist und dass eine beträchtliche Magnetisierung innerhalb von 20 Minuten entwickelt wird.
Die magnetischen Teilchen, die sich im wässrigen Medium bilden, sind Eisenoxide der Formel (FeO)_nFe₂O₃, wobei sich n im Bereich von 0 bis 1 befindet, verkörpert durch Maghemit (γ-Fe₂O₃) und Magnetit (Fe₃O₄), oder sind Mischungen derartiger magnetischer Eisenoxide.
Ein weiter Bereich von Eisensalzen kann als die Quelle der Fe^III- und Fe^II-Ionen verwendet werden, z.B. FeCl₂, FeCl₃, Fe^III-Citrat, Fe^II-Gluconat, FeSO₄, Fe₂(SO₄)₃, Fe^II-Oxalat, Fe(NO₃)₃, Fe^II-Acetylacetonat, Fe^II-Ethyldiammoniumsulfat, Fe^II-Fumarat, Fe^III-Phosphat, Fe^III-Pyrophosphat, Ammonium-Fe^III-Citrat, Ammonium-Fe^II-Sulphat, Ammonium-Fe^III-Sulphat und Ammonium-Fe^II-Oxalat. Das Verhältnis der Fe^II- und Fe^III-Ionen sollte bevorzugt im Bereich von 1 : 5 bis 5 : 1 liegen.
Eine Präzipitation wird durch Einstellen des pH des wässrigen Mediums oberhalb der Präzipitationsinitiationsschwelle initiiert, im allgemeinen durch Zugabe einer Base, bevorzugt einer wässrigen Base, wie Alkalimetallhydroxid (z.B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Lithiumhydroxid) oder Ammoniumhydroxid, besonders bevorzugt konzentriertes Ammoniumhydroxid. Die zugegebene Base sollte einen pKb besitzen, der ausreichend ist, um den pH des wässrigen Mediums über die Präzipitationsinitiationsschwelle zu bringen, z.B. auf über 10.
Die Base wird bevorzugt zu einem wässrigen Medium gegeben, das Eisen(II)- und Eisen(III)-Salze und Stärke enthält. Alternativ können die Base und die Stärke kombiniert werden und die Eisen(II)- und Eisen(III)-Salze nachfolgend zugegeben werden. Diese Zugaben können in geeigneter Weise durch Mischen von wässrigen Lösungen der Komponenten bei einer erhöhten Temperatur, z.B. 40 bis 95°C, bevorzugt 50 bis 60°C, unter Rühren bewirkt werden.
Es wird geglaubt, dass sich nach der Initiation der Präzipitation Impfkristalle magnetischer Teilchen innerhalb amorpher paramagnetischer Domänen von Metallionen oder Metallhydroxiden, die durch das verzweigte Polymer begrenzt sind, bilden, und dass sich diese amorphen Domänen in die vollständig gebildeten magnetischen Teilchen umwandeln. Daher kann es möglich sein, dass sich die Teilchenbildung für eine ausgewählte Zeitspanne von Minuten bis Tagen, z.B. 1 Minute bis 24 Stunden, bevorzugt 20 Minuten bis 10 Stunden, speziell 1 bis 5 Stunden fortsetzt.
Wo die Teilchenbildung bei einer Temperatur in Richtung des oberen Endes der hier spezifizierten Bereiche bewirkt wird, z.B. bei 90°C, wird das Medium bevorzugt auf dieser erhöhten Temperatur für nur eine relative kurze Zeitspanne gehalten, z.B. bis zu 2 Stunden.
Falls die Base, präzipitierbares Eisen(II) und Eisen(III) und Stärke bei einer niedrigeren Temperatur kombiniert werden und das Medium dann auf eine höhere Temperatur erwärmt wird, damit die Bildung des magnetischen Teilchens erfolgt, sollte dann die Geschwindigkeit des Temperaturanstiegs vorsichtig geregelt werden, z.B. bei 10 bis 100°C/Stunde. Daher wird während der Teilchenbildung die Temperatur des wässrigen Mediums bevorzugt in einer geregelten Weise (z.B. mit einem Temperaturanstieg, der über die Zeit im wesentlichen linear ist) erhöht, z.B. sich von einer Mischtemperatur von 55°C auf eine Endtemperatur von 90°C über eine Zeitspanne von 2 Stunden erhöhend.
Nach der Zeitspanne der Teilchenbildung wird das Reaktionsmedium auf einen pH von 6,0 bis 8,5 gebracht. Dies kann z.B. durch Kühlen des Mediums ausgeführt werden, um ein abgesetztes Gel herzustellen, das gewaschen werden kann, bis es neut ral ist, durch Neutralisieren des Mediums mit Säure (annehmbare Säuren umfassen z.B. Salzsäure, Schwefel- und Salpetersäure) oder festem Kohlendioxid oder durch Anlegen eines Vakuums, um die Base zu entfernen, falls sie einen höheren Dampfdruck besitzt (z.B. falls sie Ammoniumhydroxid ist). Das neutralisierte Medium kann sofort weiterverarbeitet werden.
Für diesen Neutralisationsschritt ist Waschen besonders wirksam, wo dem Medium ermöglicht wurde, ein abgesetztes Gel zu bilden, und dient zum Entfernen von überschüssigen Metallsalzen und Base. Waschen kann auf geeignete Weise mit entionisiertem Wasser bewirkt werden, bevorzugt vorgekühlt auf 3 bis 15°C, und bevorzugt fortgesetzt, bis der pH annähernd neutral ist.
Während man das gewaschene Gel einfach beschallen kann, um die Gelmatrix aufzulösen, ohne die Stärke zu spalten, während immer noch mit Polymer beschichtete magnetische Teilchen freigesetzt werden, wurde gefunden, dass das teilchenförmige Produkt besonders günstige Eigenschaften besitzt, falls die Stärke gespalten wird, um die beschichteten Teilchen freizusetzen, z.B. durch Auflösen der Molekularstruktur des Polymers. Ein chemisches Auflösen wird unter Verwenden von Oxidantien bewirkt. Oxidantien, die in Spuren selbst biotolerabel sind, oder deren Reduktionsprodukte auf ähnliche Weise biotolerabel sind, wie Halogenoxyanionen (z.B. Alkalimetallhypochlorite (wie Natriumhypochlorit und Calciumhypochlorit), Perjodate (wie Natriumperiodat), Permanganate (wie KMnO₄), Peroxide (wie H₂O₂), und enzymatische Oxidantien sind bevorzugt. Jegliches überschüssiges Oxidanz, das verwendet wird, wird bevorzugt nachfolgend inaktiviert, z.B. durch die Zugabe von Harnstoff, wenn Hypochlorid als das Oxidanz verwendet wird. Wenn eine Stärkespaltung unter Verwenden eines Oxidanz bewirkt wird, besitzen die dadurch freigesetzten magnetischen Teilchen eine negative Oberflächenladung und eine Teilchenagglomeration wird weiter verringert.
Die für die Stärkespaltung verwendeten Oxidantien sollten bevorzugt nicht Mittel sein, die die magnetischen Teilchen angreifen oder verursachen, dass jene Teilchen ihre magnetischen Eigenschaften verlieren. Demgemäß ist die Verwendung von sauren Mitteln im allgemeinen unerwünscht.
Das Ausmaß, bis zu dem eine Stärkespaltung erfolgt, kann wie erwünscht variiert werden, um eine kleinere oder größere Menge des Restes der Stärke als eine Beschichtung auf den Teilchen zu belassen. Es sollte auch angemerkt werden, dass eine Beschichtung im allgemeinen erwünscht ist, und dass als ein Ergebnis die Teilchengesamtgröße der zusammengesetzten Teilchen größer ist als jene der Kerne der magnetischen Teilchen. Gemäß der gewählten Spaltungstechnik kann der als eine Beschichtung auf den Teilchen verbliebene Rest polymer, oligomer oder sogar monomer sein.
Nach der Stärkespaltung wird das Produkt frei von Kontaminanten unter Verwenden von Membranfiltrationstechniken, z.B. Ultrafiltration oder Diafiltration, gewaschen.
Die resultierende Teilchengesamtgröße liegt allgemein im Bereich von 1 bis 300 nm, bevorzugt 4 bis 30 nm und besonders bevorzugt 8 bis 20 nm. In dieser Hinsicht kann angemerkt werden, dass die Oxidanzspaltung der Stärke dazu neigt, kleinere Teilchengesamtgrößen zu ergeben, als die enzymatische Spaltprozedur, und dass beide kleinere Größen ergeben als eine einfache Beschallung einer Gelmatrix.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die zusammengesetzten Teilchen in einer Eintopfreaktion hergestellt werden, was die Gesamtreaktionszeit verringert, ein Aufarbeiten und die Handhabung von Zwischenprodukten vermeidet und Wärmestress für die magnetischen Kernteilchen verringert. In dieser Ausführungsform werden Eisen(III)- und Eisen(II)-Salze (bzw. Chloride) in einer Stärke-Wasser-Lösung aufgelöst und Eisenoxidteilchen werden durch die Zugabe einer Base (z.B. wässrigem Ammoniak) präzipitiert. Man lässt die Reaktion 1 bis 3 Stunden bei 70 bis 90°C laufen, wonach die Menge der überschüssigen Base verringert wird (z.B. durch Anlegen eines Vakuums und/oder Stickstoffspülen über der warmen Reaktionsmischung, wenn Ammoniak verwendet wurde). Der pH wird dann auf unter 8,2 oder auf den Punkt reduziert, bei dem die Reaktionsmischung ihre Pufferkapazität verliert. Dann wird das Oxidationsmittel (z.B. Natriumhypochlorit) zugegeben, während die Mischung noch warm ist (z.B. 70 bis 90°C) und man lässt die Oxidation bei 70 bis 90°C laufen, bis eine annehmbare Größe des zusammengesetzten Teilchens erreicht wird. Für eine Größe des zusammengesetzten Teilchens im Bereich von 10 bis 20 nm wird die Reaktionszeit ungefähr 30 bis 120 Minuten sein. Bei 0,47 Tesla und 40°C sollte das Moment der magnetischen Sättigung erwünschterweise über 50 EMU/g FeOx, r₁ größer als 15 mM^–1·s^–1 und r₂/r₁ weniger als 2,3 sein. Die Reaktionsmischung wird dann mit Harnstoff gequencht und gefiltert, z.B. durch 0,2 μm-Filter. Die Stärkereste können durch Diafiltration entfernt werden, z.B. unter Verwenden einer UF-Membran mit einer molekularen Begrenzung von 20 bis 200 kD.
Die magnetischen „Kern"-Teilchen besitzen bevorzugt eine Teilchengrößencharakteristik von Einzeldomänenteilchen, z.B. eine Teilchengröße von 1 bis 50 nm, speziell 1 bis 20 nm, insbesondere 2 bis 15 nm und am meisten bevorzugt 4 bis 12 nm. In der Tat sind in den durch das Verfahren der Erfindung hergestellten zusammengesetzten Teilchen die Kernkristalle im allgemeinen im wesentlichen von einer Größe, häufig im Bereich von 4 bis 12 nm.
Das Verfahren der Erfindung kann verwendet werden, um zusammengesetzte superparamagnetische Eisenoxidteilchen (d.h. mit gespaltener Stärke beschichtete superparamagnetische Eisenoxidteilchen) mit einer ausreichend engen Größenverteilung, um eine nachfolgende Größenfraktionierung unnötig zu machen, herzustellen, z.B. mit mindestens 90% mit Teilchengrößen innerhalb 10 nm, bevorzugt innerhalb 5 nm und speziell bevorzugt innerhalb 2 nm der Durchschnittsintensität-Teilchengröße, wie gemessen durch Photonenkorrelationspektroskopie. Jedoch werden die Teilchen im allgemeinen durch einen Filter mit einem relativ großen Durchmesser gefiltert, z.B. einen 0,1 bis 0,2 μm-Filter, um gelegentlich auftretende große Polymerfragmente oder eine beliebige biologische oder teilchenförmige Kontamination zu entfernen. (Die Teilchengröße kann durch Elektronenmikroskopie bestimmt werden.)
Von einem anderen Aspekt aus gesehen, stellt die Erfindung zusammengesetzte Teilchen, bevorzugt geladene Teilchen bereit, mit einer mittleren Teilchengesamtgröße von 4 bis 30 nm und umfassend superparamagnetische Eisenoxidkernteilchen mit einem Beschichtungsmaterial aus gespaltener Stärke und weiter aufweisend eine Beschichtung eines funktionalisierten Polyalkylenoxidderivats. Bevorzugt wird die Mehrheit der zusammengesetzten Teilchen einen einzelnen superparamagnetischen Kernkristall enthalten.
Von einem weiteren Aspekt aus gesehen stellt die Erfindung eine Kontrastmediumzusammensetzung bereit, umfassend eine kontrastwirksame Menge der zusammengesetzten Teilchen gemäß der Erfindung. Das funktionalisierte Polyalkylenoxid ist bevorzugt ein Methoxy-PEG-Phosphat.
Für bestimmte Anwendungen kann es erwünscht sein, im wesentlichen die gesamte Beschichtung der gespaltenen Stärke von den magnetischen Teilchen zu entfernen und sie vielleicht mit einem unterschiedlichen oberflächenmodifizierenden Mittel zu ersetzen. In diesem Fall kann ein Oxidationsmittel (bevorzugt ein nichtionisches Oxidationsmittel, wie Wasserstoffperoxid) oder ein Enzym, das zum Verdauen des gespaltenen Polymers fähig ist (z.B. eine Amylase), verwendet werden. Die Verwendung von ionischen Oxidationsmitteln ist weniger bevorzugt, da sie die elektrostatische Stabilisierung verringern und die Aggregation der magnetischen Teilchen fördern können, wenn die sterisch stabilisierende Beschichtung des gespaltenen Polymers entfernt wird. Bevor die gespaltene Stärke entfernt wird, ist es erwünscht, ein stabilisierendes Mittel zuzugeben, z.B. ein elektrostatisches stabilisierendes Mittel, wie Natriumdiphosphat oder Natriumtriphosphat, das an die magnetischen Teilchen bindet und der Suspension eine elektrostatische Stabilisierung vermittelt. Der pH sollte erwünschterweise neutral oder leicht alkalisch gehalten werden (z.B. durch Zugabe von Natriumhydroxid), da ein saurer pH eine Flokkulation durch Protonieren eines stabilisierenden Mittels aus Phosphat verursachen kann. Es wurde gefunden, dass die Inkubation von magnetischen Teilchen, die mit von Stärke abgeleitetem gespaltenen Polymer beschichtet sind (hergestellt durch die Verfahren der unten angegebenen Beispiele), mit Natriumdiphosphat und Wasserstoffperoxid bei 50 bis 60°C für 3 bis 4 Stunden ausreichend ist, um im wesentlichen die gesamte restliche Beschichtung des von Stärke abgeleiteten, gespaltenen Polymers zu entfernen. Die resultierenden Teilchen hatten eine mittlere Teilchengröße von ungefähr 9 nm und waren in Suspension bei Umgebungstemperatur und unter Dampfsterilisationsbedingungen stabil.
Nach der Stärkespaltung und Waschen und Filtern der freigesetzten Teilchen, werden die Teilchen bevorzugt mit einer Beschichtung aus einem zweiten Material versehen, z.B., um die Biotolerabilität durch Reduzieren von komplementären Aktivie rungseffekten zu verbessern, die Blutspeicherrestzeit zu verlängern, eine Gewebe-Targeting-Fähigkeit bereitzustellen, die Lagerstabilität zu verbessern oder die Autoklavierbarkeit zu verbessern.
Besonders bevorzugt ist das zweite Beschichtungsmaterial ein Polyalkylenoxid- (z.B. ein Poloxamer-, ein Poloxamin-, ein Polyethylenglycol-, etc.)material, das eine funktionelle Gruppe trägt, z.B. eine Oxysäure-(z.B. Schwefel-, Kohlen- oder Phosphoroxysäure)funktion, die es ermöglicht, dass das Beschichtungsmaterial chemisch an die zusammengesetzten Teilchen und insbesondere an die magnetischen Kernteilchen bindet oder daran adsorbiert. In dieser Hinsicht kann eine besondere Erwähnung erfolgen von Methoxy-PEG-Phosphat (MPP) und anderen Polyalkylenoxid-Materialien, die von Pilgrimm in US-A-5160725 und WO-94/21240 beschrieben sind.
Die günstigen Effekte von MPP können auch unter Verwenden von hydrophilen Polymeren realisiert werden, die am terminalen Ende mit anderen Siderophilen als die Phosphat-Gruppen von MPP funktionalisiert sind. Eine derartige Gruppe ist Salicylat. PEG kann mit dieser durch Konjugation an 4-Amino-salicylsäure oder 5-Amino-salicylsäure funktionalisiert werden, von denen beide im wesentlichen unschädlich sind, mit einer langen Geschichte der biologischen Verwendung.
Eine weitere Option zum Binden des zweiten Beschichtungsmaterials an die Oxidoberfläche besteht darin, Oligomere oder Polymere von Eisenbindungsgruppen zu verwenden, z.B. Phosphate, wie Diphosphat, Triphosphat und höhere Polymere, eher als das Monophosphat von MPP. Derartige Oligo- und Polyphosphate binden sehr stark an Eisenoxidteilchen, wahrscheinlich aufgrund des Vorhandenseins von multiplen Bindungsstellen, und die Konjugationsreaktion ist einfach und leicht auszuführen. Daher kann man z.B. anstelle des hier erwähnten Methoxy-PEG-Phosphats, z.B. in den unten angegebenen Beispielen, Methoxy-PEG-Diphosphat oder Methoxy-PEG-Triphosphat verwenden. Oligo- und Polyphosphate, Sulfate und Sulfonate können auch verwendet werden, um andere Vektor- oder Reportergruppen (wie im folgenden weiter diskutiert wird) an die magnetischen Teilchen zu konjugieren.
Als eine Alternative zum Verwenden der verschiedenen Phosphatbindungsgruppen, die oben diskutiert wurden, zum Binden des zweiten Beschichtungsmaterials oder anderer Vektor- und Reportergruppen an die Oxidfläche, kann man statt dessen Phosphonatbindungsgruppen verwenden, z.B. kann man Methoxy-PEG-Phosphonat verwenden. Dies stellt zahlreiche potentielle Vorteile bereit, insbesondere eine vergrößerte hydrolytische Stabilität aufgrund des Ersetzens der P-O-C-Verbindung von MPP durch eine P-C-Bindung, möglicherweise eine stärkere Bindung an die Oxidoberfläche und eine vergrößerte chemische Stabilität, was eine größere Freiheit zum Herstellen von heterobifunktionellen PEG-Phosphonaten ermöglicht, die als Linker beim Herstellen von magnetischen Kristall-Linker-Vektor/Reporter-Konjugaten nützlich sind.
Daher könnten z.B. heterobifunktionelle Linker, wie
auf einfache Weise verwendet werden, um die magnetischen Teilchen an Proteine, Proteinfragmente, Oligopeptide und andere peptidische Vektoren zu koppeln. Daher können die Linker der Formeln A bis E an derartige peptidische Verbindungen mit reaktiven Thiol- oder Amingruppen gekoppelt werden, und dann an die magnetischen Teilchen über die Phosphonatgruppen gekoppelt werden.
Weitere geeignete Bindungsgruppen zum Binden des PEG oder anderen Vektor-/Reporter-Gruppen an die magnetischen Teilchen umfassen andere Gruppen mit hoher Bindungsaffinität für Eisenionen, z.B. Hydroxamat, Catechol, Ascorbat und Deferrioxamin-Gruppen.
Es wurde gefunden, dass das Molekulargewicht des zweiten Beschichtungsmaterials nicht besonders kritisch ist und in geeigneter Weise im Bereich von 0,1 bis 1000 kD liegen kann, aber Materialien mit Molekulargewichten von 0,3 bis 20 kD, speziell 0,5 bis 10 kD, am meisten speziell 1 bis 5 kD sind bevorzugt, z.B. Polyalkylenoxidmaterialien mit mindestens 60 Alkylenoxid-Wiederholungseinheiten.
Das Gewichtsverhältnis des zweiten Beschichtungsmaterials zu den anorganischen Kernteilchen liegt bevorzugt im Bereich von 0,02 bis 25 g/g, speziell 0,4 bis 10 g/g und besonders 0,5 bis 8 g/g.
Ein besonderer Vorteil, der für die doppelt beschichteten zusammengesetzten Teilchen, die gemäß des Verfahrens der Erfindung hergestellt wurden, gefunden wurde, ist, dass sie durch Autoklavierung sterilisiert werden können (z.B. bei 121°C für 15 Minuten), ohne eine inakzeptable Verschlechterung in Teilchengröße oder Teilchenverteilung. Dies ist von besonderer Wichtigkeit, da es bedeutet, dass frühere Prozessschritte nicht unter aseptischen Bedingungen ausgeführt werden müssen, und so die Produktions-Ökonomie stark verbessert.
Außer der Bereitstellung einer Beschichtung aus dem zweiten Beschichtungsmaterial, können andere Modifikationen nach der Herstellung an den zusammengesetzten Teilchen, die gemäß der Erfindung hergestellt wurden, ausgeführt werden. Daher können insbesondere die Teilchen mit einem funktionellen Mittel behandelt werden, um die restliche Kohlenhydratbeschichtung zu konjugieren oder zu koppeln und Biotargeting-Einheiten (wie Antikörper, Antikörperfragmente, Peptide oder Biomoleküle, wie Insulin) oder Reportergruppen (z.B. Gruppen, die in diagnostischen Bildgebungsmodalitäten, wie Röntgenstrahlungs-, MR-, Ultraschall, Lichtbildgebung, etc. detektierbar sind) können an eines der Beschichtungsmaterialien unter Verwenden herkömmlicher chemischer Techniken konjugiert werden. Weitere geeignete Targeting-Vektoren- oder immunoreaktive Gruppen sind z.B. in WO-93/21957 beschrieben.
Typischerweise können die Konjugate zwischen den magnetischen Teilchen und derartigen Biotargeting-(Vektor)- und Reporter-Gruppen durch die Formel MP-X-L-V repräsentiert werden, worin MP das magnetische Teilchen ist (wobei gegebenenfalls seine Beschichtung aus gespaltener Stärke wie oben beschrieben entfernt ist); X für eine Gruppe (Anker) steht, die zum Binden an die Oberfläche des Teilchens fähig ist (z.B. ein Phosphat, Oligo- oder Polyphosphat, Phosphonat, Hydroxamat oder ein anderes Siderophil, wie oben diskutiert); L eine Bindung oder bevorzugter eine Linker-Gruppe ist (bevorzugt eine organische Kette eines Molekulargewichts von 1000 bis 10⁶ D, z.B. eine PEG-Gruppe des Mol.-Gew. 2 bis 50 kD), die mindestens eine X-Gruppe an mindestens eine V-Gruppe bindet; und V eine Vektor- oder Reporter-Gruppe, d.h. eine Gruppe ist, die die Biodistribution des magnetischen Teilchens modifiziert (z.B. um eine bevorzugte Struktur an Organen, Geweben oder Krankheitsstellen zu erzeugen), oder die durch eine diagnostische Bildgebungstechnik detektierbar ist (z.B. ein chelatiertes Schwermetallion, Schwermetallatom-Cluster, paramagnetisches Metallion oder Metallradionuclid, oder eine Gas-Microblase oder einen Microblasengenerator, ein nicht-metallisches Radionuclid, ein nicht-metallisches nicht-0-Kernspinatom (z.B. ein F-Atom) außer Wasserstoff, ein nicht-metallisches schweres Atom (z.B. I), ein Chromophor, ein Fluorophor, ein Arzneimittel etc.).
Ein weiter Bereich von Vektoren und Reportern kann an magnetische Teilchen auf diese Weise konjugiert werden. Beispiele von Targeting-Vektoren umfassen: PEG (das eine erweiterte Blutspeicherresistenz verursacht); t-PA, Streptokinase und Urokinase, entweder als ganze Proteine oder als ausgewählte Fragmente, die Bindungsdomänen enthalten; Peptide, die RGD und analoge Blutplättchenrezeptor-Bindungsmotife enthalten und atherosklerotische Plaque-Bindungspeptide (z.B. das Apolipoprotein-B-Fragment SP-4). t-PA ist von Genentech erhältlich. RGD-Peptide sind in einem Bereich von Patentveröffentlichungen beschrieben z.B. US-A-4589881, US-A-4661111, US-A-4614517 und US-A-5041380. Ein Beispiel eines RGD-Peptids, das verwendet werden könnte, ist Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Ala-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Lys-Lys-CONH₂, das über den Lys-Lys-CONH₂-Terminus konjugierbar ist. Dies kann durch Standard-Oligopeptidsynthesetechniken erzeugt werden, z.B. Festphasenpeptidsynthese. SP-4 in der Form (Tyr)-Arg-Ala-Leu-Val-Asp-Thr-Leu-Lys-Phe-Val-Thr-Gln-Ala-Glu-Gly-Ala-Lys-CONH₂ (wo (Tyr) zugegeben wird, um ein Radiomarkieren mit Jod zu ermöglichen) kann mit Konjugation über den Lys-CONH₂-Terminus verwendet werden. Wieder kann dies durch Standardtechniken hergestellt werden.
Wo V ein chelatiertes Metall ist, wird der Linker eine geeignete Chelatierungseinheit enthalten, z.B. einen DTPA-, EDTA-, TMT-, DO3A-, etc. Rest. Derartige Gruppen sind im Gebiet der diagnostischen Bildgebungskontrastmittel gut bekannt und können entweder über eine gebundene Rückgrad-Funktionalität (z.B. CH₂⌀SCN) oder über eine der metallkoordinierenden Gruppen, (z.B. CH₂COOH) konjugiert sein.
Das Metallion wird selbst gemäß der Bildgebungsmodalität gewählt, z.B. ⁹⁰Y chelatiert durch TMT für Scintigraphie oder TMT-chelatiertes Europium für Fluoreszenzbildgebung.
Für Röntgenstrahlungsbildgebung ist es günstig, ein jodiertes Organophosphat (oder -phosphonat oder -oligo- oder -polyphosphat) zu verwenden, da derartige Verbindungen sowohl die magnetischen Teilchen stabilisieren als auch als Röntgenstrahlungskontrastmittel wirken werden (durch Vergrößerung der Radioopazität der Teilchen). Beispiele geeigneter jodierter Organophosphate würden umfassen
worin R¹ und R² optional, aber bevorzugt hydroxylierte C_1-6-Alkylgruppen sind, und R³ eine Linker-Gruppe ist, z.B. eine Kette aus 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bereitstellt.
Es ist besonders bevorzugt, dass die X-L-V-Verbindung multiple Ankerstellen für die Bindung an das magnetische Teilchen bereitstellen sollten. Daher besitzen bevorzugte X-L-V-Verbindungen die Formeln:
oder V[L](X)_p worin L₁ und L₂ Komponenten des Linkers L sind, und p für 2 oder mehr steht, z.B. 2, 3, 4 oder 5. Daher könnten z.B. auf PEG basierende Strukturen mit 1 bis 4 Ankergruppen wie folgt sein: V-(PEG)-OC-CH₂-N(CH₂X)CH₂(CH₂N(CH₂X)CH₂)_rCO(PEG)-V [X(CH₂)_s]-CH₂-V-(PEG)-V V-PEG-CONH(CH₂)₅N(OH)CO(CH₂)₂CONH(CH₂)₅N(OH)CO(CH₂)₂CONH(CH₂)₂N(OH)COCH₃ worin r für 1, 2 oder 3 steht,
s für 1 bis 6 steht,
Y für CONH oder NHCO steht,
(PEG) für eine Polyethylenglycol-Kette steht,
X für CONHOH, -CONH-Bishydroxyphenyl oder
-CO-O-Bishydroxyphenyl steht (wobei die zwei Hydroxylgruppen sich an benachbarten Kohlenstoffen befinden.
Wo ein Reporter oder ein Vektor in dieser Art und Weise konjugiert ist, wird die Anzahl pro Teilchen und die Anzahl pro Dosis klar derart ausgewählt, dass ein ausreichender Vektor vorhanden ist, um auf die Teilchen effizient abzuzielen und/oder dass ausreichend Reporter vorhanden ist, dass die Teilchen durch die gewählte Modalität detektiert werden können.
Daher umfasst das Verfahren der Erfindung die nachstehenden aufeinanderfolgenden Schritte:

(i) mische eine Stärke, Eisen(II)- und Eisen(III)-Salze und eine Base in einer erwärmten wässrigen Lösung;
(ii) gegebenenfalls kühle die genannte Lösung auf unter 15°C, um eine Gelbildung zu ermöglichen;
(iii) verringere den pH auf einen Wert im Bereich von 6,0 bis 8,5, wobei dieser Schritt gegebenenfalls vor Schritt (ii) durchgeführt wird;
(iv) behandele mit einem Oxidationsmittel, z.B. einem Halogenoxyanion-Oxidationsmittel, um die Stärke zu spalten und die genannten Teilchen freizusetzen;
(v) wasche und filtriere die freigesetzten Teilchen;
(vi) gegebenenfalls setze die freigesetzten Teilchen mit einem funktionalisierten Polyalkylenoxid-Derivat um, um das genannte Derivat an die genannten Teilchen zu binden; und
(vii) gegebenenfalls sterilisiere die freigesetzten Teilchen in einem Autoklaven.

Schritt (iii) kann z.B. durch Entfernen von überschüssigem Wasser und Base (z.B. Ammoniumhydroxid) unter reduziertem Druck vor dem Schritt (ii) oder durch Zugabe von Säure (z.B. HCl) ausgeführt werden, um überschüssige Base vor dem Schritt (iv) auszugleichen.
Es wurde gefunden, dass zusammengesetzte Teilchen, die Eisenoxidkernteilchen aufweisen, die mit einer Beschichtung aus gespaltener Stärke und mit einem die Lebensdauer im Blut verlängernden hydrophilen Polymer, das an die Oberfläche des anorganischen Teilchens gebunden ist, versehen sind, eine beträchtlich verbesserte Lebensdauer im Blut im Vergleich zu vergleichbaren Teilchen besitzen, die nur eine der beiden Beschichtungen besitzen. Es wird geglaubt, dass sich dies ergibt als eine Folge der gespaltenen Stärke, die zum Abschirmen der Teilchenoberflächen-Bindungsstelle des die Lebensdauer im Blut verlängernden Polymers dient und so die in vivo-Spaltung des die Lebensdauer im Blut verlängernden Polymers von dem anorganischen Teilchen verzögert. Derartige Teilchen bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung.
Von diesem Aspekt ausgesehen, stellt die Erfindung ein injizierbares zusammengesetztes teilchenförmiges Mittel bereit, das ein superparamagnetisches Eisenoxid-Kernkristallteilchen umfasst, das auf seiner Oberfläche ein funktionalisiertes Polyalkylenoxid als ein hydrophiles, die Lebensdauer im Blut verlängerndes Polymer (bevorzugt Methoxy-PEG-Phosphat, 30 kD, speziell 1 bis 10 kD) chemisch oder physikalisch (aber bevorzugt chemisch) gebunden hat und das mit oxidierter Stärke versehen ist.
Derartige Teilchen können als Blutspeichermittel verwendet werden oder alternativ an einen Biotargeting-Vektor wie oben beschrieben, konjugiert sein. Außerdem können die Teilchen in indirekter Lymphographie verwendet werden, z.B. nach (iv) oder einer subkutanen Injektion folgend.
Die Relaxivität der den superparamagnetischen Kristall enthaltenden Teilchen der Erfindung wird mit der Größe und der Zusammensetzung des Kerns und des beschichteten Teilchens variieren (wie auch mit Temperatur und dem angelegten Magnetfeld). Die T₁-Relaxivität (r₁) kann so niedrig wie 5 und so hoch wie 200 sein, während die T₂-Relaxivität (r₂) zwischen 5 und 500 bei 0,5 T variieren kann (Relaxivität gegeben als (mMFe)^–1(sec)^–1). Das r₂/r₁-Verhältnis kann von 1 bis über 100 variieren, z.B. von 1 bis 10, insbesondere 1,2 bis 3 bei 0,47 T und 40°C. Kleine Einkristallteilchen werden r₂/r₁-Verhältnisse im unteren Bereich besitzen, während größere Teilchen und multikristalline Teilchen höhere Verhältnisse zeigen werden. Falls die Teilchen ein superparamagnetisches Verhalten zeigen, wird die Magnetisierung der Teilchen im Bereich von 0 T bis ungefähr 1 T von der Kristallgröße abhängen, wobei die größeren Kristalle eine beträchtlich größere Magnetisierung besitzen. Bei 1 T beträgt die Magnetisierung ungefähr 20 bis 100, bevorzugt 30 bis 90 emu/g Eisenoxid.
Wo die superparamagnetischen Teilchen durch Basen-Präzipitation von Fe^II und Fe^III hergestellt werden, wird das r₂/r₁-Verhältnis bei 0,47 T und 40°C im allgemeinen geringer als 3 sein. Als eine Folge sind in der T1-gewichteten Bildgebung die gemäß der Erfindung hergestellten Teilchen als positive Kontrastmittel wirksam. Ferner zeigen die Magnetisierungskurven für Suspensionen derartiger Teilchen, dass sogar bei Feldstärken so hoch wie 4 T die Teilchen nicht voll magnetisiert sind. Die unvollständige Magnetisierung der Teilchen bei den Feldstärken, die herkömmlicherweise in einer MR-Bildgebungsvorrichtung verwendet wird, bedeutet, dass die Größe beliebiger Suszeptibilitätseffekte, die in den MR-Bildern vorhanden sein können, verringert ist. Außerdem nimmt die Relaxivität der Teilchen der Erfindung nicht so schnell mit steigender Feldstärke ab, wie bei herkömmlichen Eisenoxidteilchen.
In der herkömmlichen MR-Bildgebung gab es viele Jahre lang einen Trend in Richtung der Verwendung von Maschinen mit hohem Feld und primären magnetischen Feldstärken von 1 bis 1,5 T.
Jedoch nimmt die Verwendung von Maschinen mit niedrigerem Feld zu und es gibt eine sich entwickelnde Nachfrage nach positiven MR-Kontrastmitteln, die bei den niedrigen Feldstärken einiger kommerzieller Bildgeber nützlich sind, z.B. bei 0,1 bis 0,3 T. Dieser Nachfrage wird nachgekommen durch die Teilchen der Erfindung, die mindestens 3 mal wirksamer bei diesen Feldstärken sind als die herkömmlichen Metallchelate, die auf positiven MR-Kontrastmitteln basieren, wie Magnevist.
Von einem weiteren Aspekt aus gesehen, stellt die Erfindung diagnostische Zusammensetzungen bereit, umfassend die Teilchen oder hergestellt gemäß der Erfindung zusammen mit mindestens einem physiologisch annehmbaren Träger oder Zusatzstoff, z.B. Wasser für Injektionen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können in einer beliebigen herkömmlichen pharmazeutischen Form vorliegen, z.B. Suspension, Emulsion, Pulver, etc., und können wässrige Träger (wie Wasser für Injektionen) und/oder Ingredientien enthalten, um die Osmolalität, den pH, die Viskosität und die Stabilität einzustellen. Idealerweise liegt die Zusammensetzung in Suspensionsform vor, wobei die Suspension isotonisch mit und von gleichem pH-Wert wie Blut ist. Zum Beispiel kann eine isotonische Suspension durch die Zugabe von Salzen, wie Natriumchlorid, Zucker von niedrigem Molekulargewicht, wie Glucose (Dextrose), Lactose, Maltose oder Mannitol oder einer löslichen Fraktion des Beschichtungsmittels oder einer Mischung von diesen hergestellt werden. Der gleiche pH-Wert kann durch die Zugabe von Säuren erreicht werden, wie Salzsäure, oder Basen, wie Natriumhydroxid, falls nur eine geringfügige Einstellung des pH erforderlich ist. Puffer, wie Citrat, Acetat, Borat, Tartrat, Gluconat, Zwitterionen und Tris können auch verwendet werden. Die chemische Stabilität der Teilchensuspension kann durch die Zugabe von Antioxidantien, wie Ascorbinsäure oder Natriumpyrosulfit modifiziert werden. Zusatzstoffe können auch zugegeben werden, um die physikalische Stabilität des Präparats zu verbessern. Am häufigsten verwendete Zusatzstoffe für parenterale Suspensionen sind oberflächenaktive Mittel, wie Polysorbate, Lecithin oder Sorbitanester, Viskositätsmodifizierer, wie Glycerol, Propylenglycol und Polyethylenglycole (Macrogole) oder den Trübungspunkt modifizierende Mittel, bevorzugt nicht-ionische Mittel. (Den Trübungspunkt modifizierende Mittel ändern die Temperatur, bei der nicht-ionische Zusammensetzungen von oberflächenaktiven Mitteln eine Phasentrennung durchlaufen, die zur Flokkulation führen kann.)
Die Zusammensetzungen der Erfindung werden vorteilhafterweise das Eisenoxid bei einer diagnostisch wirksamen Metallkonzentration enthalten, im allgemeinen 0,1 bis 250 mg Fe/ml, bevorzugt 0,5 bis 100 mg Fe/ml, und besonders bevorzugt 1 bis 75 mg Fe/ml.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können zum Abbilden der Vaskulatur, insbesondere unter Verwenden von T₁-gewichteter MR-Bildgebung verwendet werden. Die Bilderzeugung kann bewirkt werden, bevor jegliche beträchtliche Teilchenaufnahme durch die Leber oder Milz erfolgt. Bei Teilchen, die mit einer die Lebensdauer im Blut verlängernden Polymerbeschichtung versehen sind, z.B. aus Methoxy-PEG-Phosphat, kann die Bilderzeugung günstigerweise innerhalb 24 Stunden stattfinden, bevorzugt innerhalb 4 Stunden und mehr bevorzugt innerhalb einer Stunde der intravaskulären Verabreichung. In alternativen Ausführungsformen des Verfahrens können nach einer lokalisierten Injektion T₂-gewichtete Bilder des lymphatischen Systems erzeugt werden oder nach der Injektion in die Vaskulatur können T₂-gewichtete Studien der Leber oder Milz oder T₂-gewichtete Diffusionsstudien bewirkt werden.
Die verwendete Dosierung wird eine Kontrast-wirksame Dosierung für die verwendete Bildgebungsmodalität sein. Im allgemeinen wird dies innerhalb des Bereiches von 0,05 bis 30 mg Fe/kg Körpergewicht liegen, bevorzugt 0,1 bis 15 mg Fe/kg und speziell bevorzugt 0,25 bis 8 mg Fe/kg.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung der neuen zusammengesetzten Teilchen zur Herstellung einer diagnostischen Kontrastmittelzusammensetzung zur Anwendung in einem Verfahren der Diagnose bereit, die die Verabreichung der Zusammensetzung an einen menschlichen oder nicht-menschlichen, tierischen Körper umfasst.
Neben der Verwendung als Kontrastmittel, können die zusammengesetzten Teilchen der Erfindung auch bei lokalisierten Wärmebehandlungen oder Hyperthermie-Anwendungen verwendet werden – unter Verwenden ihrer magnetischen Eigenschaften kann Energie an die Teilchen in vivo übertragen werden (z.B. durch Aussetzen einem Magnetfeld wechselnder Richtung oder Feldstärke) und der Energieverlust von dem Teilchen an das umgebende Gewebe kann für einen therapeutischen Effekt verwendet werden, z.B. um einen zytotoxischen Effekt zu erreichen. Dies ist von besonderer Wichtigkeit, wo die Teilchen an einem Targeting-Vektor konjugiert sind, z.B. über ein bifunktionellen Linker, wie ein bifunktionelles Polyalkylenoxid.
Auf ähnliche Weise können die Teilchen in der Eisen-Therapie verwendet werden.
Verschiedene Eisenoxid-Präparate hergestellt gemäß des Stands der Technik sind dafür bekannt, dass sie beträchtliche nachteilige Effekte ergeben, wenn sie intravaskulär verabreicht werden. Die am häufigsten berichteten Beobachtungen sind die Unterdrückung des systemischen Blutdrucks und die akute Verarmung an Blutplätt chen. Es scheint, dass diese Nebenwirkungen physiologische und hämathologische Antworten auf eine Teilchen-induzierte Aktivierung des Komplement-Systems sein können. Während herkömmliche Eisenoxidteilchen, wie Magnetic Starch Microspheres (MSM) die Komplement-Kaskade stark aktivieren können, besitzen die Teilchen der vorliegenden Erfindung keinen oder nur geringen Einfluss auf die Anzahl der zirkulierenden Blutplättchen, während herkömmliche Präparate eine akute merkliche und transiente Thrombozytopenie verursachen.
Es wurde überraschenderweise gezeigt, dass die Teilchen der vorliegenden Erfindung keinen Effekt auf das Komplementsystem oder auf Komplement-bezogene Parameter, wie den Blutdruck und die Blutplättchenzahl, besitzen. Das ausgewählte Beschichtungsmaterial ergibt eine Teilchenoberfläche, die nicht die Komplementaktivierung auf eine ähnliche Weise wie die herkömmlichen Teilchen triggern wird.
Die Teilchen sind für weitere Oberflächenmodifikation oder Beschichtung sehr geeignet, aufgrund ihrer großen Oberfläche und der dünnen Stärkebedeckungsschicht, die es erlaubt, dass terminate funktionalisierte hydrophile Polymere, wie MPP, die Oberfläche des magnetischen Kernteilchens durchdringen und daran binden oder auf dieser adsorbieren.
Die FeOx-Teilchen haben eine geringere Magnetisierung als herkömmliche Eisenoxidmittel und die Magnetiserung ist innerhalb des Bereiches des Bildgebungsfeldes nicht vollständig gesättigt. Dieses Merkmal wird das Auftreten von Suszeptibilitäts-Artefakten bei hohen magnetischen Feldstärken verringern.
Es wurde gefunden, dass die Teilchen eine beträchtlich längere Halbwertszeit im Blut (um einen Faktor von 2 oder mehr) in Mäusen besitzen als herkömmliche MSM-Teilchen, die durch Copräzipitation von Stärke und FeOx hergestellt wurden.
Die Blutkinetik der Teilchen wird weiter durch Zugeben des zweiten Beschichtungsmaterials modifiziert. So wurde für MPP-beschichtete Teilchen, d.h. doppelt beschichtete Teilchen, gezeigt, dass sie beträchtlich längere Halbwertszeiten im Blut (um einen Faktor 2 oder mehr) in Mäusen besitzen als Teilchen ohne MPP- Beschichtung oder mit Methoxy-PEG (MeO-PEG) als ein zugegebener Zusatzstoff (MeO-PEG wirkt als ein Zusatzstoff und wechselwirkt nicht mit der FeOx-Oberfläche). Es wurde gezeigt, dass die beschichteten MPP-Teilchen eine beträchtlich längere Halbwertszeit im Blut (um einen Faktor 2 oder mehr) in Mäusen besitzen, als FeOx-Teilchen in Nanogröße, die mit MPP beschichtet aber ohne die primäre Beschichtung des gespaltenen Polymers sind.
Es wurde gefunden, dass die doppelt beschichteten Teilchen gemäß der Erfindung keine hämathologischen Effekte in Ratten besitzen, wohingegen herkömmliche Polysaccharid-FeOx-Präparate Anlass zu einer beträchtlichen Thrombozytopenie geben.
Außerdem wurde gefunden, dass die doppelt beschichteten Teilchen gemäß der Erfindung keinen Effekt auf menschliches Komplement besitzen, wohingegen herkömmliche Stärke-FeOx(MSM)-Teilchen ein wirksamer Komplement-Aktivator sind.
Die Einkristallkernteilchen der Erfindung sind besonders vorteilhaft, da sie eine verringerte Tendenz zum Aggregieren besitzen und so die Menge von Stabilisatoren (wie Dextran), die in den Zusammensetzungen der Erfindung benötigt werden, verringern und dadurch die Möglichkeit von Toxizitätsproblemen verringern.
Um Lager- und Transportprobleme zu minimieren, kann das teilchenförmige Kontrastmittel, das gemäß der Erfindung hergestellt wird, günstigerweise als ein Trockenpulver hergestellt werden, z.B. durch Sprühtrocknen oder Gefriertrocknen, bevorzugt unter aseptischen Bedingungen. Das getrocknete Mittel bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung.
Die vorliegenden Erfindung wird nun in weiterem Detail mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben:
Beispiel 1
Die Gelherstellungsschritte sind: Herstellung der Stärkelösung und Erwärmen auf 55°C, Zugabe von Eisenfluorid zur Stärkelösung, Zugabe von Ammoniumhydroxid zur Eisen/Stärke-Lösung, Erwärmen der Reaktionsmischung auf 87–90°C und Produktkühlung/Gel-Neutralisation.
A. Herstellung der Stärkelösung

1. Suspendiere 50 g lösliche Kartoffelstärke (CAS No. 9005-84-9) in 850 g kochendem entionisiertem Wasser und mische.
2. Bringe zum Kochen und unmittelbar beim Kochen stelle die Stärkelösung in ein 55°C-Wasserbad.

B. Zugabe von Eisen und Ammoniumhydroxid zu Stärke

1. Löse 9,0 g FeCl₃·6H₂O und 3,3 g FeCl₂·4H₂O (2 : 1 Molarverhältnis FeIII zu Fell) in einem Gesamtvolumen von 50 ml entionisiertem Wasser auf.
2. Nachdem die Stärkelösung auf beständige 55°C gekühlt wurde, gieße die Eisenlösung in die Stärkelösung, mische gründlich und gebe 50 ml 30% (conc.) NH₄OH zu.
3. Erwärme die resultierende Lösung derart, dass die Temperatur auf 89°C über zwei Stunden ansteigt und halte bei 89°C für weitere 50 Minuten.
4. Nach dem Heizen für 170 Minuten auf dem Wasserbad, a) kühle über nacht bei 4°C zur Gelbildung, oder b) kühle auf Umgebungstemperatur und neutralisiere mit Säure (siehe unten).

C. Gelwaschprozedur (bei der das Gel nicht mit Säure neutralisiert wird)
Wasche das abgesetzte Gel durch Pumpen von kaltem entionisiertem Wasser durch die erhärtete Gelsuspension, bis der pH geringer als 8,5 ist.
D. Alternativer Neutralisationsprozess
Kühle die Mischung auf unter 40°C, neutralisiere mit Säure.
E. Oxidative Gelspaltung mit Natriumhypochlorit
Eine Dosis-Titration der Menge von Natriumchlorit (hypo) pro Gramm Gel kann mit einer neuen Charge ausgeführt werden, um die Herstellung zu optimieren. Die Herstellung des magnetischen Teilchens wird durch Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS) auf Größe und Dispersität und durch Bestimmung der Wasserprotonenrelaxationsgeschwindigkeiten bewertet.

a. Zum Beispiel 1,8 ml 5%-iges Hypochlorit pro 12,5 mg Fe/5 g Gel. Stelle das Volumen des Hypochlorits auf die Konzentration des verfügbaren Chlors und mg Fe in 5 g ein.
b. Wiege das Gel aus, gebe Hypochlorit hinzu und erwärme im Wasserbad bei 70°C 45 Minuten lang.
c. Gebe 8 M Harnstoff (0,8 ml/5 g Gel) nach dem Erwärmen hinzu. Der Harnstoff inaktiviert überschüssiges Hypochlorit.
d. Diafiltriere unter Verwenden einer Membran (MW-Grenze < kD), bis das gesamte freie Fe und CHO entfernt ist.

F. Analyse
Die Proben werden dann einer Analyse unterzogen. Das auf diese Weise hergestellte Material besitzt die in Tabelle 1 dargelegten Eigenschaften: Tabelle 1

⁺⁺⁺ 1 g FeOx ist annähernd 70 Gew.-% Fe
* Nuclear Magnetic Relaxation Dispersion
** Lattice Fringe Imaging
*** hergestellt in einem größeren Maßstab
⁺⁺ weniger als 5% Sedimente gebildet bei Zentrifugation bei 12000 × g für 5 Minuten

%-Fläche: = % Gesamtfläche unter HPLC-Spur

Mit NMRD wird die Longitudinale Relaxationsgeschwindigkeit (1/T₁) als eine Funktion der magnetischen Feldstärke im Bereich von 2,35 Gauss bis 1,2 Tesla gemessen. Siehe z.B. Koenig et al. „NMR Spectroscopy of Cells and Organisms", Bd. II, S. 75, R. K. Gupta (Herausgeber), CRC Press, 1987 und Koenig et al. „Progress in NMR Spectroscopy", 22: 487–567 (1990).
Beispiel 2
Magnetische Teilchen wurden gemäß Beispiel 1 hergestellt, mit Ausnahme, dass Kartoffelstärke durch Maisstärke ersetzt wurde.
Es sollte angemerkt werden, dass die Verwendung von Materialien, die andere sind als lösliche Kartoffelstärke, eine Modifikation der Mengen der Materialien, die für die Gelbildung und den Gelabbau verwendet werden, erfordern kann.
Beispiel 3
Magnetische Teilchen wurden gemäß Beispiel 1 hergestellt, mit Ausnahme, dass Kartoffelstärke durch Reisstärke ersetzt wurde.
Beispiel 6
Methoxy-PEG-Phosphat (MPP) (Mol.-Gew. 5 kD) wurde zu einer wässrigen Suspension von Teilchen gegeben, die gemäß Beispiel 1 bei dem erwünschten Verhältnis von MPP zu Eisenoxid (FeOx) hergestellt wurde (typischerweise 1 bis 2 g MPP/g Fe), 15 Stunden lang bei 37°C mit konstanter Rotation inkubiert und dann bei 4°C gelagert, bis es verwendet wurde.
Falls erwünscht, können die Teilchen bei 121°C 15 Minuten lang im Autoklaven sterilisiert werden.
Alternativ können die MPP-beschichteten Teilchen bei 75°C 12 Stunden lang inkubiert werden oder können direkt bei 121°C 10 bis 20 Minuten lang autoklaviert werden.
Beispiel 7
MPP-beschichtete Teilchen wurden analog zu Beispiel 6 hergestellt unter Verwenden verschiedener Molekulargewichte von MPP (1,1, 2,1, 5,0 und 10,0 kD) und verschiedener Beschichtungsverhältnisse (0,02, 0,2, 0,4, 0,5, 0,8, 1,0, 1,2, 1,5, 1,6, 2, 2,5, 3, 4 und 8 g MPP/g FeOx).
Beispiel 8
Ergebnisse von Tests mit Tieren und Tests mit menschlichem Plasma in Bezug auf Teilchen der Beispiele 1, 6 und 7
Die Halbwertszeit (T_1/2) im Mäuseblut wurde für Teilchen gemäß der Erfindung bestimmt, die einen Bereich von MPP-Beschichtungsdichten besitzen. In Mäusen wurde über die Schwanzvene 100 μl Proben mit 1 mg Fe/ml der Präparate der Beispiele 1, 6 und 7 injiziert. Bei zeitlich festgelegten Intervallen wurden die Tiere eingeschläfert, Blutproben von zwei Mäusen gesammelt und vereinigt und 1/T₁ wurde gemessen. Von den 1/T₁-Werten wurden die Halbwertszeiten (T_1/2) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargelegt, die zum Vergleich die Ergebnisse für unbeschichtete Teilchen und herkömmliche MSM-Teilchen umfassen: Tabelle 2

*: Mol.Gew. 5 kD
#: bedeuten ± ein geschätzter Standardfehler in der Linearität der T_1/2-Kurvenanpassung

MSM:: herkömmliche copräzipitierte magnetische Stärketeilchen

Von Tabelle 2 ist klar, dass MPP-Beschichten die Halbwertszeit im Blut beträchtlich verlängert, aber dass sogar unbeschichtete Teilchen gemäß der Erfindung viel größere Halbwertszeiten im Blut als die herkömmlichen Teilchen besitzen.
Wo ein nicht-assoziierendes zweites Beschichtungsmittel anstelle von MPP verwendet wurde, wurde gefunden, dass es keinen beträchtlichen Anstieg in der Halbwertszeit im Blut von Mäusen gab. Dies wurde durch einen Vergleich von detektierten Halbwertszeiten von Mäuseblut für unbeschichtete und MPP-beschichtete Teilchen und für Teilchen, behandelt mit Methoxy-PEG (Mol.Gew. 5 kD) und mit einem Stärkederivat Hetastarch gezeigt. Anders als MPP, bindet Methoxy-PEG nicht chemisch an oder assoziiert sich nicht mit den Teilchen und ist so einfach als ein Zusatzstoff vorhanden. Die Ergebnisse des Vergleichs sind in Tabelle 3 dargelegt:
Tabelle 3
MPP-beschichtete und nicht mit MPP beschichtete Teilchen wurden in Ratten auf hämatologische Effekte getestet.
Männliche Ratten wurden mit Dosierungs- und Probeentnahme-Dauerkatheter, die in die rechte Jugularvene eingesetzt wurden, präpariert. Annähernd 24 Stunden vor und annähernd 3, 10 und 60 Minuten und/oder 24 Stunden nach der Dosierung wurden Blutproben gesammelt. Gemessene Hämatologieparameter umfassten: Zählung der weißen Blutzellen und der Blutplättchen.
Anders als mit Dextran-Magnetit oder MSM-Teilchen wurde kein Anzeichen transienter Trombozytopenie mit den MPP-beschichteten und nicht mit MPP beschichteten Teilchen der Erfindung beobachtet.
Die MPP-beschichteten und nicht mit MPP beschichteten Teilchen und MSM wurden mit menschlichem Plasma getestet, um das Ausmaß der Aktivierung des terminalen Komplementkomplexes zu bestimmen. Anders als mit MSM verursachten die MPP-beschichteten und nicht mit MPP beschichteten Teilchen keine Aktivierung.
Beispiel 9
Mit MPP beschichtete Teilchen, hergestellt nach Beispiel 6, wurden in das Kaninchen bei einer Dosierung von 1 mg Fe/kg und 15 Minuten später bei einer Dosierung von 2 mg Fe/kg verabreicht. Prä- und Post-Kontrast-T1-gewichtete MR-Bilder wurden bei 1,5 T, 3D TOF, TR/TE 25/5,6, Flip-Winkel 60° aufgenommen und erscheinen als 1, 2 und 3 der beigefügten Zeichnungen. Die Verstärkung der Vaskulatur ist klar in beiden Post-Kontrast-Bildern und, trotz der Kombination hoher Dosierung und hohen Feldes, zeigt das Bild der 3 einen hohen Gefäß-Zu-Gewebe-Kontrast ohne Suszeptibilitätsartefakte.
Beispiel 11
Formulierte Produkte der Beispiele 1 und 7
Tabelle 5 präsentiert Details der Eigenschaften von gemäß Beispiel 1 hergestellten Teilchen (Zusammensetzung A) und (1,2 g MPP (2 kD)/g FeOx) (Zusammensetzung B) und formuliert mit Zusatzstoffen (Tris (50 mM), Mannitol (2,5%) und Natriumhydroxid auf pH 6–8) für die Verabreichung.
Tabelle 5
Anmerkungen:

NMRD

= Nuclear Magnetic Relaxation Dispersion

%-Fläche

= % Gesamtfläche unter der HPLC-Spur

Beispiel 12
(Beste Art der Herstellung von Teilchen vor der MPP-Beschichtung)
(A) In einem 22 l-Dreihalskolben, ausgerüstet mit einem mechanischen Überkopfrührer und einem Kühler, wurden 12,8 l entionisiertes Wasser auf 95°C erwärmt, wonach eine Aufschlämmung von 800 g löslicher Kartoffelstärke (Sigma, Nr. S-2630) in 1,6 l entionisiertem Wasser mit einer Rührgeschwindigkeit von 80 bis 100 Upm zugegeben wurde. Die resultierende leicht wolkige Lösung wurde 10 Minuten lang bei Umgebungstemperatur gerührt und dann auf 55°C über eine Zeitspanne von 30 Minuten gekühlt. Eine Lösung von 144 g Eisen(III)-chloridhexahydrat und 52,8 g Eisen(II)-chloridtetrahydrat in 1,2 l entionisiertem Wasser wurde zugegeben und dann wurde 3 Minuten später 800 ml 28%-iges Ammoniumhydroxid in einer Portion zugegeben. Die Rührgeschwindigkeit wurde auf 60 Upm herabgesetzt, und die schwarze Reaktionsmischung wurde bei Umgebungstemperatur 15 Minuten lang gerührt, bevor sie allmählich auf 92°C über eine Zeitspanne von 60 Minuten erwärmt wurde. Die Temperatur wurde bei 92 bis 94°C 3 Stunden lang gehalten und das Fortschreiten der Reaktion wurde durch Messungen der magnetischen Suszeptibilität während und nach der Reaktion gemessen. Das überschüssige Ammoniumhydroxid wurde durch Vakuumdestillation entfernt. Die Konzentration wurde auf 20°C gekühlt und im Kühlschrank aufbewahrt, um ein Gel zu bilden.
Im Ganzen wurden vier Ansätze der Gels hergestellt, wobei beim größten Ansatz 800 g Kartoffelstärke verwendet wurden. Tabelle 6 Herstellung des Gels

* XRF = Röntgenstrahlungsfluoreszenzspektroskopie

(B) Das Gel wurde mit kaltem Wasser gewaschen, um Ammoniumchlorid, das bei der Eisenoxidbildung erhalten wurde, plus restliches Ammoniumhydroxid zu entfernen. Diese Verbindungen würden andernfalls mit Natriumhypochlorit reagieren, das zum Verdauen der Stärke in Schritt (C) verwendet wurde, wodurch eine viel größere Menge an Hypochlorit für den Hypochloritschritt erforderlich wäre.
Das Gelwaschen wurde mit wiederholter Wasserzugabe/-entfernungen in einem gerührten Reaktor ausgeführt, der nahe 5°C gehalten wurde, um die Gelauflösung zu minimieren. Das Gel wurde in ungefähr 2 Volumina kaltem entionisiertem Wasser gerührt (kurz und langsam) und man ließ es dann absetzen (ungefähr 1 Stunde lang). Eine dunkle überstehende Schicht, die von einer sehr dunklen Gelschicht getrennt war, wurde durch Saugen entfernt (visuelle Beobachtung der Schichten). Die Zugabe einer gleichen Menge Wasser, kurzes langsames Rühren, Absetzenlassen und Trennen wurden wiederholt, bis eine Leitfähigkeit von 0,5 mmho erhalten wurde. Insgesamt ungefähr 8 Volumina Wasser waren nötig, um die Gels zu waschen, unter Wiedergewinnung von Eisen von ungefähr 80%.
Tabelle 7 Gewaschenes Gel
(C) Dieser Schritt beinhaltet eine Umwandlung des gewaschenen Gels zu einer Teilchendispersion durch Oxidation der Stärkematrix. Dies wurde durch Behandlung des Gels mit Natriumhypochlorit ausgeführt. Die Menge des für die Oxidation verwendeten Hypochlorits wurde durch Ausführung von Oxidationsexperimenten in kleinem Maßstab (50 bis 100 g Gel) und Messen der Relaxivität (r1, r2 und r2/r1) und Teilchengrößen bestimmt.
Das gewaschene Gel wurde auf 45°C erwärmt und mit 12%-iger Natriumhypochloritlösung behandelt. Die Temperatur der Reaktionsmischung fiel um einige Grad (wegen der Zugabe von im Kühlschrank aufbewahrten Hypochlorit). Man ließ die Temperatur der Reaktionsmischung auf ungefähr 45°C ansteigen. Die Reaktion wurde auf 55°C 30 Minuten lang erwärmt, wobei an diesem Punkt eine exotherme Reaktion beobachtet wurde und die Temperatur um ungefähr 15°C über eine Zeitspanne von 15 Minuten anstieg. Nachdem der exotherme Effekt abnahm, wurde die Temperatur der Reaktion auf 70°C eingestellt und 45 Minuten lang gehalten. Die Explosionsabschätzung dieses Schritts unter Verwenden eine RCI-Kalorimeters bestätigte einen unauffälligen (15°C), aber kontrollierbaren exothermen Effekt für diese Reaktion.
Man ließ die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur kühlen und man filtrierte sie durch eine nominal 0,2 Micron-Filterkartusche von Millipore. Die stärkste Oxidation wurde auf 15 kg Gel (34 g Fe) ausgeführt und die Wiedergewinnung war quantitativ.
Tabelle 8 Teilchendispersion
(C) Dieser Schritt beinhaltet die Entfernung von Reststärke, freiem Eisen und anderen Reaktanten nach der Hypochloritoxidation. Regenerierte, vorskalierte TM TFF 100K-Zellulosemembrankartuschenfilter von Millipore wurden verwendet, um die erwünschten Resultate zu erreichen. Die Reinheit der Teilchen wurde durch GPC überwacht. Die Reinheit des Endproduktes nach der Ultrafiltration befand sich im Bereich von 97 bis 99% (GPC).
Tabelle 9 Endprodukt
Die analytischen Enddaten für alle vier Ansätze sind in Tabelle 10 unten zusammengefasst.
(E) Nachfolgendes PEG-Beschichten
Die durch die oben angegebenen Schritte (A) bis (D) erzeugten Teilchen können, falls gewünscht, mit PEG beschichtet werden, bevorzugt mit Methoxy-PEG-Phosphat (MPP) eines Molekulargewichts von 2000 D bei einem Beschichtungsverhältnis von 1,2 g MPP pro Gramm FeOx.
Die Teilchen, mit oder ohne einer derartigen PEG-Beschichtung, können für die Verabreichung mit 50 mM Tris-Puffer und 2,5%-igem Mannitol mit einem auf 6 bis 8 eingestellten pH mit Natriumhydroxid formuliert werden.
Tabelle 10 Analytische Ergebnisse
Beispiel 13
Herstellung von Diethyl-2-(3,5-bis-acetylamino-2,4,6-triiodbenzoyloxy)ethylphosphonat
Zu einer gerührten Lösung von Natriumdiatrizoat (7,1 g, 11,2 mmol) in trockenem Dimethylformamid (50 ml) bei Raumtemperatur unter einem Schirm aus Argon wurde eine Lösung von Diethyl-2-bromethylphosphonat (3,02 g, 12,3 mmol, 1,1 eq.) in Dimethylformamid (10 ml) gegeben.
Nach dem Rühren für 12 Stunden wurde das Lösungsmittel unter Vakuum verdampft, um einen weißen Festkörper zu ergeben, der mit 300 ml gesättigtem wässrigen NaHCO₃ gewaschen wurde, und dann mit einer 2 : 1-Mischung Chloroform-Ethanol (3 × 200 ml) extrahiert. Der organische Extrakt wurde getrocknet (MgSO₄), gefiltert und unter Vakuum verdampft, um 3,61 g (41%) des Produktes als einen weißen Feststoff zu ergeben. Eine Umkristallisation aus Acetonitril ergab ein analytisch reines Material; Smp 249–251°C; MH⁺ (779). Das ¹H-NMR-Spektrum (300 MHz) war mit dem erwünschten Material konsistent.
Kalkuliert für C₁₇H₂₂I₃PN₂O₇: C 26.24; H 2.85; I 48.93; N 3.60; Gefunden: C 26.26; H 2.70; I 49.05; N 3.50.
Beispiel 14
Herstellung von 2-(3,5-Bis-acetylamino-2,4,6-triiodbenzoyloxy)ethylphosphonsäure
Zu einer gerührten Lösung von Diethyl-2-(3,5-bis-acetylamino-2,4,6-triiodbenzoyloxy)ethylphosphonat (3,1 g, 3,98 mmol) in trockenem Dichlormethan (40 ml) bei Raumtemperatur unter einer Atmosphäre aus Stickstoff wurde 1,5 ml (10,56 mmol, 2,65 eq.) Trimethylsilyliodid gegeben. Nach dem Rühren für 12 bis 14 Stunden wurde ein viskoser Schlamm beobachtet, worauf zusätzliche 40 ml Dichlormethan zugegeben wurden und das Rühren 6 Stunden lang fortgesetzt wurde. Wasser (4 ml) wurde dann zugegeben und die Reaktion wurde 10 Minuten lang gerührt. Methanol (40 ml) wurde dann zugegeben und die resultierende rote Lösung wurde unter Vakuum konzentriert, um 3,42 g des erwünschten Rohproduktes als einen gelben Fest körper zu ergeben. Das Rohprodukt wurde in 20 ml einer Lösung aus 10% Methanol, 90% Wasser aufgelöst und die Lösung wurde durch eine C₁₈-Ionenaustauschersäule geleitet, wobei sie mit 50 ml der Methanol-Wasser-Lösung eluiert wurde. Das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, um 0,48 g (14%) der erwünschten Phosphonsäure als weißen Festkörper zu ergeben, Smp. > 220°C (dec. ~250°C); MH⁺ (723). Das ¹H-NMR-Spektrum (300 MHz) war mit dem erwünschten Material konsistent.
Berechnet für C₁₃H₁₄I₃PN₂O₇: C 21.63; H 1.95; I 52.73; N 3.88; P 4.29; gefunden: C 21.29; H 1.95; I 52.44; N 3.71; P 4.31.
Die Verbindung des Beispiels 14 kann zum Bedecken magnetischer Teilchen, die gemäß der vorstehenden Beispiele erzeugt wurden, verwendet werden.
Beispiel 15
Synthese von Methoxy-PEG(2K)-Phosphonat
Schritt 1: Methoxy-PEG(2K)-OH (21,60 g) wurde in 108 ml Toluol unter azeotroper Entfernung von Wasser mehrere Stunden lang unter Rückfluss gekocht. Die gekühlte Lösung wurde tropfenweise mit einer Mischung aus Thionylchlorid (7,88 ml) und DMF (0,313 ml) behandelt, und dann 4 Stunden lang unter Rückfluss erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde unter reduziertem Druck konzentriert und der leicht gelbe restliche Feststoff in 108 ml Wasser aufgenommen und zweimal mit Äther gewaschen. Die wässrige Lösung wurde zweimal mit Chloroform extrahiert und die kombinierten Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und auf 19,90 g Methoxy-PEG(2K)-Cl konzentriert.
Schritt 2: Eine Mischung von Methoxy-PEG(2K)-Cl (18,51 g) und Triethylphosphit (185 ml) wurde 4 Tage lang unter Rückfluss gekocht. Ein Präzipitat bildete sich beim Kühlen bis Raumtemperatur; das Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet zu 18,16 g Methoxy-PEG(2K)-P(O)(OEt)₂. ¹H NMR (CDCl₃; 300 MHz): 4,10 ppm (m, -P(O)(OCH ₂CH₃)₂); 3,65 ppm (s,(-CH ₂CH ₂O-)_n); 3,38 ppm (s, -OCH ₃); 2,13 ppm (Duplett von Tripletts, -CH₂CH ₂P(O)(OCH₂CH₃)₂); 1,33 ppm (t, -P(O)(OCH₂CH ₃)₂).
Schritt 3: Eine Lösung von Methoxy-PEG(2K)-P(O)(OEt)₂ (5,02 g) in 100 ml Methylenchlorid wurde tropfenweise mit 28 ml einer Lösung behandelt, die aus 24,15 g Bromtrimethylsilan und 157 ml Methylenchlorid hergestellt wurde. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden lang gerührt, dann zu einem weißen Feststoff konzentriert. Der weiße Feststoff wurde mit 50 ml Methanol 2 Stunden lang behandelt, dann auf 4,57 g Produkt als ein weißer Feststoff konzentriert. ¹H NMR (CDCl₃; 300 MHz): 8,20 ppm (br s, -P(O)(OH)₂); 3,65 ppm (s, (-(CH ₂CH ₂O-)_n); 3,38 ppm (s, -OCH ₃); 2,17 ppm (Duplett von Tripletts, -CH₂CH ₂P(O)(OH)₂).
Beispiel 16
Herstellung des Konjugats von Methoxy-PEG(2K)-Phosphonat/Superparamagnetisches Eisenoxid
Eine Mischung von Methoxy-PEG(2K)-Phosphonat (0,448 g); 3,42 ml einer 93,7 mg-Fe/ml-Suspension eines Eisenoxidproduktes nach Beispiel 12 und Wasser auf insgesamt 20 ml wurde bei 37°C 20 Stunden lang inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde in einer gerührten 50 ml Amicon-Zelle angeordnet, die mit einer YM-30-Membran ausgerüstet war, und gegen Wasser diafiltriert, dann durch einen 0,2 μm-Nylonfilter gefiltert. Man fand, dass die Probe 13,3 ml Fe/ml, durch ICP-Analyse; 0,34 mg/ml nicht gebundenes Methoxy-PEG(2K)-Phosphonat und 1,42 mg/ml gebundenes Methoxy-PEG(2K)-Phosphonat enthielt.
Beispiel 17
Herstellung eines Konjugats von Methoxy-PEG(5K)-Thiol/Superparamagnetisches Eisenoxid
Eine Mischung von Methoxy-PEG(5K)-Thiol (0,438 g); 1,67 ml einer 93,7 mg-Fe/ml-Suspension eines Eisenoxidproduktes nach Anspruch 12 und Wasser (10 ml) wurde bei 37°C 22 Stunden lang inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde in einer gerührten 50 ml-Amicon-Zelle angeordnet, die mit einer YM-30-Membran ausgerüstet war, und gegen Wasser diafiltriert, dann durch einen 0,2 μm-Nylonfilter gefiltert. Man fand, dass die Probe enthielt 13,47 mg Fe/ml durch ICP-Analyse; 0,23 mg/ml nicht gebundenes Methoxy-PEG(5K)-Thiol und 5,46 mg/ml gebundenes Methoxy-PEG(5K)-Thiol enthielt.
Beispiel 18
Herstellung von Eisenoxidteilchensuspensionen mit und ohne MPP-Beschichtung
Ohne MPP:
Start durch Zugabe von ~70% des Ansatzvolumens von Wasser für die Injektion in einen Glas- oder mit Glas ausgekleideten Herstellungsbehälter. Unter konstantem Mischen gebe Mannitol hinzu und löse es auf. Die Endkonzentration von Mannitol kann von 1 bis 5% Gew./Vol. reichen, wobei 3,5% Gew./Vol. typisch sind. Unter konstantem Mischen gebe Tromethamin hinzu und löse es auf. Die Endkonzentration von Tromethamin kann von 10 bis 100 mM reichen, wobei 50 mM typisch sind. Unter konstantem Mischen gebe lose Eisenoxidsuspension (hergestellt gemäß Beispiel 12) hinzu. Die Endkonzentration von Eisenoxid kann von 0,1 bis 10% Gew./Vol. Eisen reichen, wobei 3% typisch sind. Überprüfe den pH der losen Suspension. Falls nötig, stelle den pH auf 8,1–8,3 (Ziel: 8,2) mit entweder 0,1 N NaOH oder 0,1 N Salzsäure ein. Während das Mischen fortgesetzt wird, stelle die lose Suspension auf 100% des Endvolumens mit Wasser für die Injektion ein. Die hergestellte Suspension kann mit Abhitzedampf bei 121°C für 10 bis 50 F_o sterilisiert werden, wobei 15 F_o typisch sind.
Die Endsuspension kann einen pH besitzen, der von 5 bis 8 reicht, wobei 7 bis 7,5 der typische Bereich ist.
Mit MPP:
Starten durch Zugabe von ~25% des gesamten Ansatzvolumens von Wasser für die Injektion zu einem geeignet tarierten Herstellungsbehälter. Unter kontinuierlichem Mischen gebe Methoxypoly(ethylenglycol)(2000)-phosphat zu und löse es auf. Das MPP/Fe-Endverhältnis kann von 0,1 bis 5 reichen, wobei 1,5 typisch sind. Unter kontinuierlichem Mischen gebe Tromethamin hinzu und löse es auf. Die Endkonzentration von Tromethamin kann von 10 bis 100 mM reichen, wobei 50 mM typisch sind. Unter Mischen gebe Mannitol hinzu und löse es auf. Die Endkonzentration von Mannitol kann von 1 bis 5% Gew./Vol. reichen, wobei 2,5% typisch sind. Wiege eine passende Menge Eisenoxidsuspension (hergestellt nach Beispiel 12) in einem geeigneten Behälter aus. Unter Mischen, gebe die Lösung, die MPP, Mannitol und Tromethamin enthält, langsam zu der Eisenoxidsuspension zu. Die Endkonzentration von Eisenoxid kann von 0,1 bis 10% Gew./Vol. Eisen reichen, wobei 3% typisch sind. Überprüfe den pH der Suspension. Stelle den pH auf 8,4–9,0 mit 0,4 N Natriumhydroxid ein. Während das Mischen fortgesetzt wird, stelle die Suspension auf 100% des Endvolumens mit Wasser für die Injektion ein. Die wie beschrieben hergestellte Suspension kann durch Abhitzedampf bei 121° für 10 bis 50 F_o sterilisiert werden, wobei 15 F_o typisch sind. Die MPP-Bindung an Eisenoxid wird während der Dampfsterilisation vervollständigt. Alternativ kann die Suspension bei 60 bis 95°C 2 bis 4 Stunden lang inkubiert werden, um die MPP-Bindung an das Eisenoxid zu vervollständigen. Die Endsuspension kann einen pH besitzen, der von 5 bis 8 reicht, wobei 7 bis 7,5 der typische Bereich ist.
Beispiel 19
Herstellung von unbedeckten Eisenoxid-Nanokristallen
(a) Entfernung von aus Stärke abgeleiteter Polymerbeschichtung von Eisenoxid ohne Zugabe eines Stabilisators.
Ein Test wurde ausgeführt, um zu bestimmen, ob, ausgehend von Eisenoxidsuspensionen hergestellt nach Beispiel 12, stabile Suspensionen von Eisenoxid-Nanokristallen ohne eine Polymerbeschichtung hergestellt werden können, ohne einen Ersatzstabilisator. 0,5 ml 30%-iges Wasserstoffperoxid wurde zu 0,5 ml aliquoten Teilen Eisenoxidsuspension gegeben. Die Probe wurde bei 55°C unter konstantem Rühren inkubiert und eine pH-Elektrode wurde verwendet, um ihren pH zu überwachen. Als die Oxidationsreaktion voranschritt, lief der Proben-pH nach unten. Der Proben-pH wurde innerhalb des Bereichs von 6,5 bis 7,5 durch Zugabe von 1 N NaOH gehalten. Innerhalb von 3 Stunden der Inkubation flockte die Probe aus, was anzeigte, dass die Eisenoxidteilchensuspension, sobald ihre Polymerbeschichtung abgelöst ist, instabil ist und große Aggregate bildete.
(b) Versuch mit Monophosphat
Um die Wirksamkeit von Monophosphat als einen Oberflächenmodifizierer für die Stabilisation von unbedeckten Eisenoxid-Nanokristallen (Nionen) zu testen, wurde eine Studie ausgeführt, bei der 0,5 ml aliquote Eisenoxidsuspension mit verschiedenen Konzentrationen von Trinatriumphosphat gemischt wurden. 0,5 ml Wasserstoffperoxid wurde dann zu jeder Probe gegeben. Die Proben wurden bei 55°C inkubiert, um die von Stärke abgeleitete Polymerbeschichtung (SDPC) zu oxidieren.
Alle Proben flockten nach 5 Stunden der Inkubation bei 55°C aus, was anzeigte, dass Monophosphat kein zufriedenstellender Oberflächenmodifizierer und Stabilisator für unbedeckte Ferronen ist.
(c) Diphosphat als Oberflächenmodifizierer und Stabilisator
Die Wirksamkeit von Diphosphat (auch bekannt als Pyrophosphat) als ein Oberflächenmodifizierer von Eisenoxidteilchen wurde unter Verwenden von Tetranatriumpyrophosphat (wasserfrei) und einem Verfahren studiert, das jenem ähnlich ist, das mit dem Monophosphat verwendet wurde. Die Proben wurden bei 55°C inkubiert, um die von Stärke abgeleitete Polymerbeschichtung (SDPC) zu oxidieren. Nach der Inkubation bei 55°C für 5 Stunden blieben die Proben 2 bis 7 suspendiert. Ihre mittleren Teilchengrößen wurden gemessen und in der Tabelle unten gezeigt.

* Proben flockten aus.

Die kleinen Teilchengrößen reflektieren die Entfernung des von Stärke abgeleiteten Polymerbeschichtungsmaterials. Diese Daten zeigen an, dass Pyrophosphat in dem Konzentrationsbereich von ungefähr 2 bis 60 mM ein zufriedenstellender Oberflächenmodifizierer und Stabilisator für unbedeckte Eisenoxidkristalle ist.
(d) Triphosphat als Oberflächenmodifizierer und Stabilisator
Eine Studie wurde ausgeführt, um Triphosphat als einen Stabilisator zu testen. Pentanatriumtriphosphathexahydrat von Sigma wurde verwendet. Zu 3,75 ml Eisenoxidsuspension wurden 5,25 mM Natriumtriphosphat, 3,75 ml Wasser und 7,5 ml 30%-iges Wasserstoffperoxid gegeben. Die Mischung wurde bei 60°C 3 Stunden lang inkubiert. Die Suspension zeigte keinerlei Zeichen von Ausflockung und die Teilchengröße wurde auf 9 nm gemessen. Wieder reflektiert die kleinere mittlere Teilchengröße die Entfernung des bedeckenden, von Stärke abgeleiteten Materials. Diese Daten zeigen an, dass Triphosphat ein zufriedenstellender Oberflächenmodifizierer und Stabilisator für unbedeckte Eisenoxidkristallle ist.
(e) Tetraphosphat als Oberflächenmodifizierer und Stabilisator
Eine ähnliche Studie wurde ausgeführt, um Tetraphosphat zu testen. Das Hexammoniumtetrapolyphosphatsalz von Sigma wurde verwendet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.

* Proben flockten aus.

Wieder reflektieren die kleinen Teilchengrößen der Proben 2 bis 4 nach der Inkubation die Entfernung des von Stärke abgeleiteten Bedeckungsmaterials. Diese Daten zeigen an, dass Tetraphosphat auch ein zufriedenstellender Oberflächenmodifizierer und Stabilisator für unbedeckte Eisenoxidkristalle ist.
Characterisierung von unbedeckten Eisenoxid-Nanokristallen
Suspensionen von unbedeckten Eisenoxid-Nanokristallen (Nions) wurden unter Verwenden von Natriumpyrophosphat hergestellt. Nach Vervollständigung der Oxidation wurde die Suspension gegen Wasser diafiltriert, um fragmentierte Stärke und restliches Wasserstoffperoxid zu entfernen. Die resultierende Suspension wurde durch mehrere analytische Techniken, wie unten zusammengefasst, charakterisiert.

(a) GPC: Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) zeigt an, dass die unbedeckten Eisenoxid-Nanoteilchen (NION) einen scharfen Peak zeigen, ohne eine Schweifbildung von von Stärke abgeleiteten Polymeren.
(b) Gesamtmenge an organisch gebundenem Kohlenstoff: Die Analyse zweier getrennter Nion-Präparate zeigte nur ein Grundlinien-Niveau der Gesamtmenge an organisch gebundenen Kohlenstoff, was eine im wesentlichen vollständige Entfernung der Polymerbeschichtung anzeigt.
(c) Kapillarelektrophorese: Die Analyse von Nionen zeigte eine elektrophoretische Mobilität von –3,4 × 10^–4cm²v^–1s^–1, was leicht negativer ist als jene des Produktes des Beispiels 12 (–0,3 × 10^–4cm²v^–1s^–1). Dies ist mit den negativen elektrostatischen Ladungen konsistent, die zu den Teilchen durch die Polyphosphate hinzugefügt wurden.
(d) Relaxivität und magnetische Sättigung: Die magnetische Relaxivität wurde bestimmt. Die r₁ und r₂ betrugen 22,5 bzw. 34,4 mM^–1s^–1, was einen Wert von 1,53 für r₂/r₁ ergibt. Diese Werte sind im allgemeinen jenen des Produktes des Beispiels 12 ziemlich ähnlich.
(e) Stabilität unter Dampfsterilisation: Nion-Suspensionen wurden bei 121°C 20 Minuten lang dampfsterilisiert und zeigten keine detektierbare Änderung in der Teilchengröße.

Claims

Verfahren zur Herstellung zusammengesetzter superparamagnetischer Eisenoxidteilchen, das die nachstehenden aufeinanderfolgenden Schritte umfaßt: (i) Mischen von Eisen(II)- und Eisen(III)-Salzen einer Stärke und einer Base in einer erwärmten wäßrigen Lösung; (ii) gegebenenfalls Kühlen der genannten Lösung auf unter 15°C, um eine Gelbildung zu ermöglichen; (iii) Verringern des pH auf einen Wert im Bereich von 6,0 bis 8,5, wobei dieser Schritt gegebenenfalls vor Schritt (ii) durchgeführt wird; (iv) Behandeln mit einem Oxidationsmittel, um die Stärke zu spalten und die genannten Teilchen freizusetzen; (v) Waschen und Filtrieren der freigesetzten Teilchen; (vi) gegebenenfalls Umsetzen der freigesetzten Teilchen mit einem funktionalisierten Polyalkylenoxid-Derivat, um das genannte Derivat an die genannten Teilchen zu binden; und (vii) gegebenenfalls Sterilisieren der freigesetzten Teilchen in einem Autoklaven.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin Schritt (vi) obligatorisch ist.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 2, worin die Spaltung in Schritt (iv) in zwei Schritten durchgeführt wird, wobei der zweite Spaltungsschritt so ausgeführt wird, daß im wesentlichen die gesamte genannte Stärke von den magnetischen Teilchen entfernt wird, und der genannte zweite Spaltungsschritt in Gegenwart oder im Anschluß an die Zugabe eines Stabilisators, der an die magnetischen Teilchen bindet, ausgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin der genannte Stabilisator Natriumdiphosphat oder Natriumtriphosphat ist.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, worin die Verfahrensschritte (i) bis (iv) im gleichen Reaktionsgefäß ausgeführt werden.
Zusammengesetzte Teilchen, die eine mittlere Gesamtteilchengröße von 4 bis 30 nm aufweisen und superparamagnetische Eisenoxid-Kernkristalle mit einem Beschichtungsmaterial aus gespaltener Stärke umfassen und weiterhin eine Beschichtung aus einem funktionalisierten Polyalkylenoxid-Derivat umfassen.
Teilchen gemäß Anspruch 6, wobei das genannte funktionalisierte Polyalkylenoxid-Derivat Methoxy-PEG-phosphat ist.
Teilchen gemäß den Ansprüchen 6 bis 7, die eine Reporter-Gruppe aufweisen, die an die Oberfläche der Kernteilchen gebunden ist und in einem diagnostischen Bildgebungsverfahren detektierbar ist.
Teilchen gemäß Anspruch 8, wobei die Reporter-Gruppe ein jodiertes Organophosphat ist.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 bis 5 zur Herstellung zusammengesetzter Teilchen gemäß den Ansprüchen 6 bis 7.
Kontrastmittelzusammensetzung, die eine zur Kontrasterzeugung ausreichende Menge der zusammengesetzten Teilchen gemäß den Ansprüchen 6 bis 9 umfaßt.
Kontrastmittelzusammensetzung gemäß Anspruch 11, die weiterhin mindestens einen physiologisch annehmbaren Träger oder Zusatzstoff umfaßt.
Teilchen gemäß den Ansprüchen 6 bis 9 zur Verwendung als Diagnosemittel.
Teilchen gemäß den Ansprüchen 6 bis 9 zur Verwendung als therapeutisches Mittel.
Verwendung zusammengesetzter Teilchen gemäß den Ansprüchen 6 bis 9 zur Herstellung einer diagnostischen Kontrastmittelzusammensetzung zur Anwendung in einem Verfahren der Diagnose des Gefäßsystems, des Lymphsystems, der Leber oder der Milz eines menschlichen oder nicht-menschlichen tierischen Körpers.
Verwendung zusammengesetzter Teilchen gemäß den Ansprüchen 6 bis 9 zur Herstellung eines Mittels, das in lokalen Wärmebehandlungen oder Hypothermie-Anwendungen eines menschlichen oder nicht-menschlichen tierischen Körpers eingesetzt wird.
Verwendung zusammengesetzter Teilchen gemäß den Ansprüchen 6 bis 9 zur Herstellung eines Mittels, das in der Eisentherapie eingesetzt wird.