KR101993290B1 - 세포사멸방지용 배지 조성물 및 이를 이용한 배양방법 - Google Patents
세포사멸방지용 배지 조성물 및 이를 이용한 배양방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명에 따른 포유동물세포로부터 수득한 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 배지 조성물은, 포유동물세포의 세포 활성의 저하를 억제하며, 세포사멸을 방지 및 억제시켜 포유동물세포의 세포 생존율을 증가시킴으로써 배양된 포유동물세포를 질적으로 향상시킬 수 있다.
또한, 포유동물세포 자신으로부터 나온 물질인 엑소좀을 이용하고 있으므로, 독성이나 부작용과 같은 문제점이 없으며, 세포의 생물학적 산물을 생산하는 기작이나 세포의 활성에도 전혀 영향을 미치지 않으므로 매우 안전할 뿐만 아니라 상기 엑소좀은 해당 포유동물세포의 배양을 통해 쉽게 얻을 수 있기 때문에 매우 경제적이다.
또한, 포유동물세포 자신으로부터 나온 물질인 엑소좀을 이용하고 있으므로, 독성이나 부작용과 같은 문제점이 없으며, 세포의 생물학적 산물을 생산하는 기작이나 세포의 활성에도 전혀 영향을 미치지 않으므로 매우 안전할 뿐만 아니라 상기 엑소좀은 해당 포유동물세포의 배양을 통해 쉽게 얻을 수 있기 때문에 매우 경제적이다.
Description
본 발명은 세포사멸방지용 배지 조성물 및 이를 이용한 배양방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 포유동물세포의 배양기간 중에 발생하는 포유동물세포의 세포사멸을 억제하기 위한 배양방법에 관한 것이다.
차이니즈 햄스터 난소세포(이하, 'CHO((Chinese Hamster Ovary) 세포'라고도 한다)는 단일클론항체를 포함한 치료용 바이오 의약품 생산에 사용되는 세포주로, 이는 주로 유가식 배양(Fed-batch culture)으로 배양된다. 유가식 배양을 통해 CHO 세포를 배양할 경우, 고농도로 장시간 배양할 수 있어 상기 CHO 세포로부터 생물학적 산물을 더 많은 양 얻을 수 있기 때문이다.
이 경우 CHO 세포로부터 생물학적 산물을 대량으로 얻기 위해서, 높은 세포 밀도 및 높은 생산율을 보유한 화학 조성배지(chemically defined media, CDM)이 선호되는데, 이는 경제적 이유와 더불어 동물 유래 복합 물질인 혈청 등의 사용에 따른 정제 공정에서의 문제점과 전염성 스펀지형 뇌병증 및 다른 오염원들과 관련된 안전성의 문제를 고려한 것이다.
그러나, 상기 CHO 세포는 어떠한 화학 조성배지에서건 유가식 배양을 통해 배양되는 동안에, 배양기 내에서 다양한 스트레스 신호를 받게 되고, 이로 인해 아폽토시스(apoptosis)와 같은 다양한 세포사멸기작이 유도되어 생존력이 현저히 저하되는 문제가 발생하게 된다.
상술한 배양 중 발생하는 CHO 세포의 세포사멸은 바이오 의약품과 같은 생물학적 산물을 생산하는 살아 있는 세포의 농도를 낮출 뿐 아니라, 세포의 활성이 떨어지면서 생산되는 바이오 의약품의 품질까지 저하되는 문제를 야기하게 된다.
따라서 바이오 의약품을 고농도로 생산하기 위해서는, 세포 배양 공정에서 발생하는 CHO 세포의 세포사멸 문제를 해결하기 위한 대책 개발이 시급한 실정이다.
상기 CHO 세포의 세포사멸을 억제하기 위한 방법으로는 외부로부터 여러 가지 물질들이나 세포에 특정 유전자를 결손 또는 삽입시켜 조절하는 방법들이 공지된 바 있으나, 이는 첨가물질과 유전자들의 인체 안전성과 고비용, 효율성 문제로 인하여 실제 공정에 적용되는데 한계가 있다. 이에 저비용으로 간편하게 CHO 세포를 장기간 배양할 수 있는 방법에 대한 연구가 계속하여 진행되고 있으나, CHO 세포의 세포사멸을 제어할 수 있는 배양방법에 대해서는 아직까지 전무한 상태이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 CHO 세포를 포함하는 포유동물세포의 세포사멸을 방지하기 위한 배양배지에 있어서, 세포독성을 나타내지 않으면서도 세포의 생존력을 최대화할 수 있는 배지 조성물 및 이를 이용한 배양방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 포유동물세포 배양액으로부터 추출한 엑소좀 및 기본배지를 포함하는, 포유동물세포의 세포사멸방지용 배지 조성물을 제공한다.
상기 포유동물세포는 원숭이 신장세포7(COS7;monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO;Chinese Hamster Ovary) 세포, W138 세포, 어린 햄스터 신장(BHK;baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 포유동물세포의 배양액은 엑소좀이 제거된 소태아혈청 5 내지 15%를 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 포유동물세포의 배양액은 50 내지 100 시간동안 배양한 것일 수 있다.
상기 엑소좀의 배지 조성물 내에 농도는 1 × 108 내지 1 × 1012 입자수(particle)/㎠일 수 있다.
상기 기본배지는 M199/F12 배지, MEM-alpha 배지, 저농도 글루코오스 함유 DMEM 배지, MCDB 131 배지, IMDM 배지, K-SFM 배지, DMEM/F12 배지, 및 EGM-2 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 배지를 기본배지로 할 수 있다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 아래 단계를 포함하는 포유동물세포의 배양방법을 제공한다.
1) 포유동물세포를 기본배지에서 배양하는 단계;
2) 상기 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;
3) 상기 분리된 엑소좀을 기본배지에 혼합하여 세포사멸방지용 배지 조성물을 제조하는 단계; 및
4) 상기 배지 조성물에 포유동물세포를 접종하여 배양하는 단계.
상기 1) 단계의 포유동물세포와 상기 4) 단계의 포유동물세포는 서로 동일하며, 상기 포유동물세포는 원숭이 신장세포7(COS7;monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO;Chinese Hamster Ovary) 세포, W138 세포, 어린 햄스터 신장(BHK;baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 1) 단계에서 기본배지와 상기 3) 단계에서의 기본배지는 서로 동일한 것을 사용하며, 상기 기본배지는 M199/F12 배지, MEM-alpha 배지, 저농도 글루코오스 함유 DMEM 배지, MCDB 131 배지, IMDM 배지, K-SFM 배지, DMEM/F12 배지, 및 EGM-2 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 배지일 수 있다.
상기 1) 단계는 엑소좀이 제거된 소태아 혈청 5 내지 15%를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 1) 단계의 배양 시간은 50 내지 100 시간일 수 있다.
상기 3) 단계에서 제조된 배지 조성물 내에 상기 엑소좀은 1 × 108 내지 1 × 1012 입자수(particle)/㎠ 농도로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 포유동물세포로부터 수득한 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 배지 조성물은, 포유동물세포의 세포 활성의 저하를 억제하며, 세포사멸을 방지 및 억제시켜 포유동물세포의 세포 생존율을 증가시킴으로써 배양된 포유동물세포를 질적으로 향상시킬 수 있다.
또한, 포유동물세포 자신으로부터 나온 물질인 엑소좀을 이용하고 있으므로, 독성이나 부작용과 같은 문제점이 없으며, 세포의 생물학적 산물을 생산하는 기작이나 세포의 활성에도 전혀 영향을 미치지 않으므로 매우 안전할 뿐만 아니라 상기 엑소좀은 해당 포유동물세포의 배양을 통해 쉽게 얻을 수 있기 때문에 매우 경제적이다.
도 1은 제조예 3의 엑소좀 용액에 존재하는 엑소좀의 크기 분포와 농도를 나타낸 결과 그래프이다.
도 2는 실시예 4로 배양한 CHO 세포에 있어서, CHO 세포 내에 엑소좀이 흡수되었는지를 공초점 현미경으로 관찰한 사진이다. 이때, 녹색은 배지 조성물에 첨가한 CHO 유래 엑소좀을 나타내며, 파란색은 CHO 세포의 핵을 나타낸다.
도 3은 실시예 3의 배지 조성물로 배양한 CHO 세포(실험군; w/ exo)와 일반 IMDM 배지로 배양한 CHO 세포(대조군; w/o exo)에 STS를 처리한 후, 이들 각각의 세포 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 CHO 세포 유래 엑소좀이 첨가되지 않은 IMDM 배지로 배양한 CHO 세포(대조군; w/o exo)에 STS를 처리한 후, 이의 세포 생존율을 유세포 분석기를 이용하여 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 실시예 3의 배지 조성물로 배양한 CHO 세포(실험군; w/ exo)에 STS를 처리한 후, 이의 세포 생존율을 유세포 분석기를 이용하여 측정한 결과 그래프이다.
도 6은 실험군(w/ exo)과 대조군(w/o exo)에 존재하는 미토콘드리아의 상대적인 막 전위 변화량(%;relative mitochondrial membrane potential(%))을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 실시예 4로 배양한 CHO 세포에 있어서, CHO 세포 내에 엑소좀이 흡수되었는지를 공초점 현미경으로 관찰한 사진이다. 이때, 녹색은 배지 조성물에 첨가한 CHO 유래 엑소좀을 나타내며, 파란색은 CHO 세포의 핵을 나타낸다.
도 3은 실시예 3의 배지 조성물로 배양한 CHO 세포(실험군; w/ exo)와 일반 IMDM 배지로 배양한 CHO 세포(대조군; w/o exo)에 STS를 처리한 후, 이들 각각의 세포 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 CHO 세포 유래 엑소좀이 첨가되지 않은 IMDM 배지로 배양한 CHO 세포(대조군; w/o exo)에 STS를 처리한 후, 이의 세포 생존율을 유세포 분석기를 이용하여 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 실시예 3의 배지 조성물로 배양한 CHO 세포(실험군; w/ exo)에 STS를 처리한 후, 이의 세포 생존율을 유세포 분석기를 이용하여 측정한 결과 그래프이다.
도 6은 실험군(w/ exo)과 대조군(w/o exo)에 존재하는 미토콘드리아의 상대적인 막 전위 변화량(%;relative mitochondrial membrane potential(%))을 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
포유동물세포를 배양함에 있어서, 배경기술에서 지적한 바와 같이, 다양한 난제들이 존재하기 때문에, 이를 극복할 수 있는 보다 안전하면서 효율적인 방법의 개발이 필요하다. 본 발명은 이러한 문제를 해결하고자, 포유동물세포(특히 CHO 세포)에서 자연스럽게 생산되는 미세 소포체인 엑소좀(exosome)을, 해당 포유동물세포(CHO 세포) 배양에 이용함으로써, 세포의 세포사멸(apoptosis)를 억제하는 배지 조성물 및 배양방법을 개발하기에 이르렀다.
포유동물세포로부터 생산된 엑소좀을 해당 포유동물세포의 배양에 이용하는 것은, 외래물질을 사용하거나, 포유동물세포를 재조합하거나 유전자를 도입하거나 하는 것이 아닌, 포유동물세포 자신으로부터 나온 물질을 이용하는 것이기 때문에, 독성이나 부작용과 같은 문제점이 없으며, 세포의 생물학적 산물을 생산하는 기작이나 세포의 활성에도 전혀 영향을 미치지 않으므로 매우 안전하다. 또한 상기 엑소좀은 해당 포유동물세포의 배양을 통해 쉽게 얻을 수 있기 때문에 매우 경제적이다.
본 발명의 일 측면은 포유동물세포 배양액으로부터 추출한 엑소좀 및 기본배지를 포함하는, 세포를 배양하는 과정에서 포유동물세포의 세포사멸방지용 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "배양"이란 세포를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 과정을 의미한다.
또한, 본 발명에서의 세포 배양은 산업적 생물공학에서 확립된 다양한 방법에 의해 사용될 수 있고, 본 발명의 배지 조성물을 사용하여 불연속 및 연속 세포 배양방법, 일예로 관류 및 화학조절 배양장치를 이용할 수 있으며, 반복 유가식 및 반복 회분식이 포함되는 불연속 방법이 가장 바람직한 예일 수 있다.
상기 회분식 세포 배양은 유가식 배양 또는 단순 회분식 배양을 포함하고, 이때, 용어 "유가식 세포 배양"은 세포 및 세포배양 배지가 초기에 배양 용기에 공급되고, 배양 종결 전에 주기적으로 세포 및/또는 생성물을 수확하면서 또는 수확하지 않으면서 배양 공정 동안 추가적인 배양 영양소가 연속적으로 또는 불연속적인 증분으로 배양물에 공급되는 세포 배양을 지칭한다. 용어 "단순 회분식 배양"은 배양 공정을 시작할 때 세포 및 세포 배양 배지가 포함되는 세포 배양을 위한 모든 성분이 배양 용기에 공급되는 절차에 관련된다.
상기 배지 조성물은 체외 배양용 배지 조성물로 사용되는 것이 바람직하며, "체외 배양"이란 체내에서 세포가 성장하는 상태와 구분되는 방법으로 실험실의 인큐베이터(incubator;배양기)에서 체내 환경과 유사한 조건으로 배양하는 일련의 실험실 과정을 의미하는 것으로, 본 발명의 배지 조성물은 이러한 체외배양에 최적화된 배지 조성물이다.
본 발명의 배지 조성물을 적용할 수 있는 포유동물세포는 체외에서 배양할 수 있는 포유동물세포라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 포유동물세포 그 자체이거나, 외래 유전자가 삽입된 형질감염 혹은 형질전환된 형태일 수 있다. 예컨대 상기 포유동물세포의 형질감염 혹은 형질전환된 형태란 재조합 단백질 또는 항체 또는 항체 단편을 발현시키기 위해 다양한 재조합 벡터를 삽입한 포유동물세포를 의미한다.
상기 포유동물세포는 원숭이 신장세포7(COS7;monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO;Chinese Hamster Ovary) 세포, W138 세포, 어린 햄스터 신장(BHK;baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 특히 바람직하게는 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO;Chinese Hamster Ovary)을 대상으로 하는 것이 바람직하다.
상기 포유동물세포의 배양액은 포유동물세포의 엑소좀만을 높은 수율로 추출하기 위하여, 소태아혈청을 포함하지 않는 무혈청의 기본 배지로 배양하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 상기 기본 배지에는 엑소좀이 제거된 소태아혈청 5 내지 15%을 더 포함할 수 있다. 포유동물세포의 생장을 높이기 위해 소태아혈청을 주입하게 될 경우, 엑소좀을 제거하는 것이 바람직하며, 엑소좀이 제거되지 않은 소태아 혈청을 사용할 경우에는 이종의 엑소좀의 유입으로 인하여, 생물학적 산물의 생산율이 저하되거나 품질이 떨어질 수 있다.
또한 상기 배양은 50 내지 100 시간동안 배양하는 것이 바람직하다. 50 시간 미만으로 배양하는 경우 배양이 충분하지 않은 문제가 있으며, 100 시간을 초과하여 배양하는 경우 배양 조성물 내의 세포 농도가 과도하게 증가하여 세포사멸 혹은 세포자살이 발생하게 되어, 목적하는 엑소좀을 충분히 얻을 수 없게 된다.
본 발명에 따른 배지 조성물은 상기 엑소좀이 배지 조성물 내에 1 × 104 내지 1 × 1012 입자수(particle)/㎠ 농도로 포함되어 있는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1 × 108 내지 1 × 1011 입자수(particle)/㎠ 농도로 포함될 수 있다. 상기 엑소좀의 농도가 1 × 108 (particle)/㎠ 미만의 양으로 포함되는 경우에는 포유동물세포 내로 흡수되는 엑소좀의 양이 불충분한 문제가 있을 수 있으며, 1 × 1012 입자수(particle)/㎠를 초과하여 포함하는 경우에는 필요 이상의 엑소좀을 사용하는 문제가 있을 수 있다.
본 발명의 배지 조성물은 상기 포유동물세포의 배양액으로부터 추출한 엑소좀을 통상적인 포유동물세포를 배양에 이용되는 기본 배지에 첨가시켜 이용할 수 있다. 본 발명에서 기본 배지는 포유동물의 종에 따라 차이가 있으나, 무기염류, 탄소원, 아미노산 및 보조인자 등을 기본적으로 포함하는 포유동물세포 배양용 배지로서, 당업자들에게 잘 알려진 일반적인 배지를 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 M199/F12 배지, MEM-alpha 배지, 저농도 글루코오스 함유 DMEM 배지, MCDB 131 배지, IMDM 배지, K-SFM 배지, DMEM/F12 배지, 및 EGM-2 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 일 수 있다.
본 발명의 배지 조성물은 포유동물세포의 배양과정에서 발생하는 스트레스 요인들에 의해 유발되는 세포사멸(apoptosis) 억제활성을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 배지 조성물은 동일한 종의 포유동물세포의 배양액에서 추출한 엑소좀을 포함할 경우, 포유동물세포가 배양되는 과정에서 세포사멸 억제활성을 가지게 한다. 결국 배양과정에서 발생하는 통상적인 스트레스 요인들로 인해 세포사멸이 유발되어, 세포 생장이 어렵게 되므로, 포유동물세포의 세포사멸을 억제시킴으로써 발달을 증대시키고 세포 내 활성을 확보하면 좀 더 용이하게 생물학적 산물을 생산할 수 있게 된다.
본 발명의 다른 측면은 배지 조성물에서 포유동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 포유동물세포의 배양방법에 관한 것이다. 구체적으로 아래 단계를 포함한다.
1) 포유동물세포 기본배지에서 배양하는 단계;
2) 상기 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;
3) 상기 분리된 엑소좀을 기본배지에 혼합하여 포유동물세포의 세포사멸방지용 배지 조성물을 제조하는 단계; 및
4) 상기 배지 조성물에 포유동물세포를 접종하여 배양하는 단계.
본 발명의 배양방법은 포유동물세포의 배양액으로부터 추출된 엑소좀을 포함하는 배지 조성물에서 포유동물세포를 배양시켜 세포 생존율을 증대시킴으로써, 생물학적 산물이 상기 포유동물세포로부터 용이하게 생산되도록 할 수 있다. 본 발명의 배양방법은 포유동물세포를 생체 외(ex vivo) 및 시험관 내(in vitro)(또는 체외라고도 한다)에서 배양할 수 있는 방법으로, 상기 포유동물세포는 체외에서 배양할 수 있는 포유동물세포라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO;Chinese Hamster Ovary)이거나, 재조합 단백질을 발현하는 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO;Chinese Hamster Ovary)를 대상으로 하는 것이 바람직하다.
또한 이러한 배양방법은 특히 생체 외에서 포유동물세포를 대량배양함으로써, 상기 포유동물세포로부터 생물학적 산물을 대량 생산할 수 있다는 이점을 갖는다.
본 발명의 배양방법에서 사용되는 상기 배지는 상술한 바와 같이 공지의 기본 배지에 상기 1), 2), 3) 단계를 통해 얻은 엑소좀을 포함시킨 배지이다. 상기 엑소좀은 배지 조성물 내에 1 × 104 내지 1 × 1012 입자수(particle)/㎠ 농도로 포함되어 있는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 1 × 108 내지 1 × 1011 입자수(particle)/㎠ 농도로 포함될 수 있다.
또한, 상기 배양방법에서 동종의 포유동물세포로부터 엑소좀을 얻기 위해서는 우선 1) 포유동물세포를 기본배지(바람직하게는, 엑소좀이 제거된 소태아 혈청 5 내지 15%를 포함하는 기본배지)로 배양하며, 배양하는 시간은 포유동물세포로부터 엑소좀이 충분히 생성될 정도이면 특별히 이에 제한되지 않는다. 포유동물세포가 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO;Chinese Hamster Ovary)이거나, 재조합 단백질을 발현하는 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO;Chinese Hamster Ovary)인 경우에는 10% FBS(엑소좀을 제거함)을 포함한 기본배지에서 약 50 내지 100 시간 배양하는 것이 바람직하다.
또한 상기 배양이 50 시간 미만으로 배양하는 경우 배양이 충분하지 않은 문제가 있으며, 100 시간을 초과하여 배양하는 경우 배양 조성물 내의 세포 농도가 과도하게 증가하여 세포배양에 유리하지 않을 수 있다.
다음 2) 상기 1) 단계의 배양액으로부터 엑소좀을 분리하여, 엑소좀을 회수하였다. 이때, 엑소좀의 분리는 상기 배양액의 여과, 침전 또는 그 조합을 통해 수행될 수 있고, 초고속원심분리 혹은 엑소좀 분리 시약을 이용할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 분리한 엑소좀의 정량은 통상적인 단백질 정량법을 이용할 수 있다. 또한 엑소좀 분비 수준은 전자 현미경을 통한 관찰 또는 엑소좀 바이오마커 단백질을 이용한 ELISA 분석에 의해서도 확인될 수 있다.
상기 엑소좀 바이오마커 단백질은 Tetraspanins(CD63, CD81), Clathrin, Flotillin-1, ICAM-1, 다른 엑소좀 바이오마커 단백질, 또는 그의 조합일 수 있다.
3) 상기 분리된 엑소좀을 기본배지에 혼합하여 포유동물세포의 세포사멸방지용 배지 조성물을 제조하고, 이후 4) 상기 배양조성물에 포유동물세포를 접종하여 배양한다. 상기 3) 단계에서 제조된 배지 조성물 내에 상기 엑소좀은 1 × 108 내지 1 × 1012 입자수(particle)/㎠ 농도로 포함되는 것이 바람직하다.
상기 1) 단계의 포유동물세포과 상기 4) 단계의 포유동물세포는 서로 동일한 것으로, 서로 다른 종일 경우, 이종의 엑소좀의 유입으로 인하여, 생물학적 산물의 생산율이 저하되거나 품질이 떨어지게 되는 문제가 발생함을 확인하였다.
본 발명에서 기본 배지는 포유동물의 종에 따라 차이가 있으나, 무기염류, 탄소원, 아미노산 및 보조인자 등을 기본적으로 포함하는 포유동물세포 배양용 배지로서, 당업자들에게 잘 알려진 일반적인 배지를 모두 포함할 수 있다. 특히 바람직하게 상기 기본 배지는 M199/F12 배지, MEM-alpha 배지, 저농도 글루코오스 함유 DMEM 배지, MCDB 131 배지, IMDM 배지, K-SFM 배지, DMEM/F12 배지, 및 EGM-2 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 배지일 수 있고, 이를 그대로 사용할 수 있다. 포유동물세포가 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO;Chinese Hamster Ovary)이거나, 재조합 단백질을 발현하는 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO;Chinese Hamster Ovary)의 경우 소태아 혈청(FBS)를 10% 첨가한 것을 사용하는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 사용될 수 있는 용매는 증류수 혹은 인산완충액(pH 6.0-7.0)이다.
또한, 본 발명자들은 상술한 과정을 통해 준비한 엑소좀을 기본 배지에 첨가한 후, 동종의 포유동물세포를 접종하여, 배양하고, 이의 배양액을 회수하여 세포 생존율을 체크하였다.
본 발명자들은 동종의 포유동물세포 배양액으로부터 추출한 엑소좀이 상기 포유동물세포의 배양시 발생하는 세포사멸에 미치는 영향을 조사한 결과, 일반 배지를 사용하여 CHO 세포를 배양하는 경우보다, CHO 유래 엑소좀을 포함하는 배지 조성물로 CHO 세포를 배양한 경우(실험군)이 현저히 세포사멸이 억제되어, 세포 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
또한 본 발명에 따른 배양방법으로 포유동물세포를 배양할 경우, 세포로부터 생산되는 생물학적 산물의 질적 측면도 개선하는 효과를 가짐을, 세포 내부에 존재하는 미토콘드리아의 막 전위 변화량을 통해 확인하였다. 또한 본 발명에 따라 포유동물세포의 배양액으로부터 추출한 엑소좀을 배지 조성물로 처리함으로써 세포 활성의 저하를 억제하고 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 배지 조성물 및 이를 이용한 배양방법은 포유동물세포 특히 CHO 세포 유래 엑소좀을 이용하여 바이오 의약품 등을 생산하는 CHO 세포 공정에서 발생하는 세포사멸을 억제하는 것을 확인하였고, 이를 통해 CHO 세포로부터 생산되는 생물학적 산물(바이오 의약품, 재조합 단백질 등)의 생산성 및 질적 측면이 증대되는 것을 알 수 있었다. 본 발명에서는 상기 엑소좀을 CHO 세포 자신으로부터 유래된 것을 사용하기 때문에, CHO 세포 배양에서 외래 물질 사용에 의한 안전성 문제 혹은 부작용 문제가 전혀없는 안정한 배지 조성물 및 배양방법을 제공할 수 있다. 또한 세포 배양 중에 엑소좀은 자연스럽게 대량 생산되기 엑소좀 확보 역시 용이하기 때문에 경제적, 비용적 측면에 강점을 갖는다. 따라서 본 발명은 바이오 의약품 생산 공정의 효율성과 생산성을 높이는데 널리 사용될 수 있으며, 치료용 단백질과 항체 생산 세포 배양 외에도 다양한 포유동물세포 배양 공정에도 널리 적용될 수 있다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
제조예 1. 엑소좀 분리용 CHO 세포 배양액 제조
CHO 세포를 엑소좀이 제거된 10% 소태아 혈청(이하, 'FBS(fetal bovine serum)'이라고도 한다)을 포함한 IMDM 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium로, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 72 시간 동안 배양하였고, 배양이 완료된 후 배양액을 수거하여 엑소좀 분리에 사용하였다.
상기 엑소좀이 제거된 10% 소태아 혈청은, FBS를 초고속 원심분리기가 가능한 폴리알로머(polyallomer)튜브에 담은 후, 이를 초고속 원심분리기(Beckman coulter 사, OptimaTM, TLA-100.3)를 이용하여 4℃ 120,000 g에서 10시간 동안 원심분리한 다음, 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액은 0.2 ㎛ 시린지 필터(Syringe filter)를 이용하여 여과하였다. 여과된 엑소좀이 제거된 FBS는 4℃에 보관하며, 필요할 때마다, 꺼내어 사용하였다. 별도의 언급이 없는 한 배지에 10%(v/v) 첨가하였다.
제조예 2. CHO 세포배양액으로부터 엑소좀 분리-엑소좀 분리시약
제조예 1로부터 제조된 CHO 세포배양액으로부터 엑소좀을 분리하기 위하여, 상용화된 엑소좀 분리 시약을 이용하여 분리한다.
엑소좀을 세포배양액으로부터 분리하기 위한 시약으로 ExoQuick-TCTM(System Biosciences)을 사용하였다.
제조예 1로부터 제조된 CHO 세포배양액을 수거하고, 세포와 세포 불순물(debris)을 제거하기 위해, 3,000 g에서 15분간 원심분리를 하여, 상층액을 분리하고, 분리한 상층액을 ExoQuick-TCTM와 5대 1의 비율로 섞는다. 이것을 4℃에서 O/N 인큐베이션 시켰다. 다음날 4℃ 1,500 g에서 30 분간 원심분리를 하였다. 상층액을 제거한 후 가능한 남은 유체를 완전하게 제거하기 위해 4℃, 1,500 g에서 5 분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고, 펠렛(Pellet)에 100 ㎕의 0.2 ㎛ 시린지 필터를 이용하여 여과한 PBS를 첨가하여 재현탁하여, 분리된 엑소좀 용액을 제조하였다.
상기 분리된 엑소좀 용액은 배양액으로부터 1 × 108 내지 1 × 1010 입자수(particle)/㎖ 농도로 얻을 수 있다. 상기 분리된 엑소좀 용액은 4℃ 혹은 -20℃에서 보관하여, 필요할 때 꺼내어 사용하였다.
제조예 3. 제조예 2의 엑소좀 용액에서 엑소좀 염색
모든 빛을 차단한 뒤 PKH67과 Diluent C를 1:50의 비율로 섞어 만든 20 ㎕와 희석한 제조예 2의 엑소좀 용액(1.8 × 1010 입자수(particle)을 포함하도록 희석함)을 EP tube에 넣고 RT에서 5 분간 반응시켰다. 초고속 원심분리기 사용이 가능한 폴리알로머(polyallomer) 튜브에 반응액과 PBS 용액(0.2 ㎛ 시린지 필터로 여과)이 총 3 ㎖이 되도록 넣고, 초고속 원심분리기(Beckman coulter 사, OptimaTM, TLA-100.3)를 이용하여 4℃ 100,000 g 조건으로 2 시간 동안 원심분리 하였다. 상층액을 제거하고, 펠렛에 PBS(0.2 ㎛ 시린지 필터를 이용하여 여과) 1 ㎖을 넣어 비특이적 결합을 한 PKH67을 씻어 준 후 펠렛에 PBS(0.2 ㎛ 시린지 필터를 이용하여 여과) 100 ㎕를 넣어, 1 × 1010 입자수(particle)/㎠가 되도록 현탁하여 염색된 엑소좀 용액을 제조하였다.
실시예 1 및 실시예 2. 엑소좀 용액을 혼합한 배지 조성물의 제조
제조예 2 또는 제조예 3으로부터 얻은 엑소좀(1 × 108 내지 1 × 1010 입자수(particle)/㎖)을, 웰의 면적에 따른 1 x 1010 입자수(particle)/㎠가 되도록 현탁한 현탁액 100 ㎕를 IMDM 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, Gibco, BRL)에 혼합하여, 배지 조성물을 제조하였다.
실험의 편의를 위하여, 제조예 2의 엑소좀으로 제조한 배지 조성물은 실시예 1, 제조예 3의 염색된 엑조좀으로 제조한 배지 조성물은 실시예 2로 명명하였다.
실시예 3 및 4. 엑소좀을 포함한 배지 조성물에서 CHO 세포의 배양
CHO 세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀을 첨가한 배지 조성물로, CHO 세포를 배양할 때, CHO 세포의 아폽토시스가 억제됨을 확인하기 위하여 실시예 1의 배지 조성물에 CHO 세포를 접종하여 배양하고, 이 과정에 배지 조성물에 첨가한 엑소좀이 CHO 세포 내로 전달되는지, 세포 생존력이 증가했는지 유무를 측정하고자 하였다.
이를 위해, 실시예 1 또는 2의 배지 조성물을 200 ㎕씩 96 웰 플레이트에 담고, 각 웰에 CHO 세포(2 × 104 cell/㎠)를 접종하여 배양하였다.
실험의 편의를 위하여, 실시예 1의 배지 조성물에 CHO세포를 접종하여 배양한 배양액은 실시예 3, 실시예 2의 배지 조성물에 CHO 세포를 접종하여 배양한 배양액은 실시예 4로 명명하였다.
실험예 1. CHO 세포 배양액으로부터 분리한 엑소좀 용액의 NanoParticle Tracking Analysis (NTA)을 이용한 정량
제조예 2로부터 얻은 분리된 엑소좀 1 ㎕(PBS로 희석하기 전)과 0.2 ㎛ 시린지 필터를 이용하여 여과한 PBS 999 ㎕을 첨가하여 희석한 후, NTA를 이용하여, 희석된 엑소좀 용액에 존재하는 엑소좀의 크기 분포와 농도를 정량하였다.
도 1은 제조예 2의 엑소좀 용액에 존재하는 엑소좀의 크기 분포와 농도를 나타낸 결과 그래프이다.
도 1에 나타난 바와 같이, 희석한 제조예 2의 엑소좀 용액 100 ㎕에 8 × 1010 입자수(particle)의 엑소좀이 존재하였으며, 상기 CHO 세포의 엑소좀의 평균 크기는 79.2 ㎚였다.
실험예 2. 엑소좀의 CHO 세포 내 전달여부
실시예 4로부터 얻은, CHO 유래 엑소좀을 첨가한 배지 조성물로 배양한 CHO 세포의 배지를 회수하고, CHO 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 그 후 Hoechst 33342와 Opti-MEM을 1:5000의 비율로 섞어 세포에 넣어 준 후, 37℃에서 10 분간 배양하였다. 세포 외에 성분들을 모두 제거한 다음 PBS로 3회 세척하고, 상기 세포를 Confocal microscope(공초점 현미경)으로 측정하였다. 상술한 과정을 통해 CHO 유래 엑소좀이 CHO 배양과정 동안 CHO 세포 내로 흡수되었는지를 확인할 수 있었다.
도 2는 실시예 4로 배양한 CHO 세포에 있어서, CHO 세포 내에 엑소좀이 흡수되었는지를 공초점 현미경으로 관찰한 사진이다. 이때, 녹색은 배지 조성물에 첨가한 CHO 유래 엑소좀을 나타내며, 파란색은 CHO 세포의 핵을 나타낸다.
도 2에 나타난 바와 같이 confocal microscopy를 이용하여 확인할 결과, 배양과정에서 CHO 유래 엑소좀을 배지 조성물에 첨가할 경우, CHO 유래 엑소좀이 CHO 세포 내로 전달되어 세포 내에 흡수되어 있음을 확인하였다. 이를 통해 CHO 유래 엑소좀을 CHO 세포배양용 배지 조성물에 첨가할 경우, 세포 내로 용이하게 투과되어 흡수됨을 알 수 있다.
실험예 3. CHO 유래 엑소좀을 포함하는 배지 조성물의 CHO 세포사멸(아폽토시스) 억제 효과-1
우선 24-well cell culture plate에 10% FBS IMDM을 사용하여 CHO 세포를 2 × 104 cell/㎠으로 세포 분주하였다. 24시간 이후에 대조군 세포와 실험군 세포의 배지를 제거 후 PBS로 세척해주었다. 실험군 세포에는 1 × 1010 입자수(particle)/㎠ 농도의 엑소좀 용액을 혼합하여 제조된 실시예 1의 배지 조성물을 첨가하여 배양하였으며, 대조군 세포에는 엑소좀 첨가 없이 엑소좀이 제거된 FBS가 첨가된 IMDM 배양 배지를 이용하여 배양하였다.
약 6 시간이 지난 후 0.5 μM의 STS(Staurosporine)를 실험군과 대조군 세포 모두에 처리하여 세포사멸(apoptosis)을 유발하였다. STS는 대표적인 아폽토시스 유발 화합물이다. STS를 18 시간 처리한 후 trypan blue exclusion assay를 통해 세포의 생존율을 분석하였다.
도 3은 실시예 1의 배지 조성물로 배양한 CHO 세포(실험군; w/ exo)와 CHO 세포 유래 엑소좀이 첨가되지 않은 엑소좀이 제거된 FBS가 첨가된 IMDM 배지로 배양한 CHO 세포(대조군; w/o exo)에 STS를 처리한 후, 이들 각각의 세포 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3에 나타난 바와 같이 엑소좀이 첨가된 실시예 1의 배지 조성물로 배양한 CHO 세포(실험군)은 STS 처리 후에도 세포 생존율이 80% 이상을 유지하고 있는데 반해, CHO 세포 유래 엑소좀이 첨가되지 않은 엑소좀이 제거된 FBS가 첨가된 IMDM 배지로 배양한 CHO 세포(대조군)는 40% 이하로 세포 생존율이 급감한 것을 확인할 수 있다.
이를 통해 CHO 세포 유래 엑소좀을 CHO 세포 배양액에 첨가하여, CHO 세포를 배양할 경우, 배양과정에서 발생하는 다양한 스트레스로 인해 유발되는 세포의 세포사멸(apoptosis)가 억제되므로, 일반 배지를 사용하였을 때보다(대조군) 세포 생존율이 2 배 이상 높게 유지되는 것을 알 수 있다.
실험예 4. CHO 유래 엑소좀을 포함하는 배지 조성물의 CHO 세포사멸(아폽토시스) 억제 효과-2
우선 24-well cell culture plate에 10% FBS IMDM을 사용하여 CHO 세포를 2 × 104 cell/㎠으로 세포 분주하였다. 24시간 이후에 대조군 세포와 실험군 세포의 배지를 제거 후 PBS로 세척해주었다. 실험군 세포에는 1 × 1010 입자수(particle)/㎠ 농도로 엑소좀을 넣은 실시예 1의 배지 조성물을 첨가하여 배양하였으며, 대조군 세포에는 CHO 세포 유래 엑소좀이 첨가되지 않은, 엑소좀이 제거된 FBS가 첨가된 IMDM 배지를 이용하여 배양하였다.
약 6시간이 지난 후 1 μM의 STS(Staurosporine)를 실험군과 대조군 세포 모두에 처리하여 세포사멸(apoptosis)을 유발하였다. STS는 대표적인 아폽토시스 유발 화합물이다. STS를 18 시간 처리한 후, 세포에 propidium iodide(PI)를 염색한 후, 세포의 생존율을 flow cytometer(유세포 분석기)를 이용하여 분석하였다. Propidium iodide는 죽은 세포에만 염색이 되는 형광 물질이다.
유세포 분석 과정은 구체적으로, STS처리한 실험군과 대조군의 CHO 세포를 배양기로부터 탈착하기 위해, 트립신을 사용한 다음 여러번의 세척 과정을 거친 후 50 ㎍/㎖ 농도로 PI(propidium iodide)가 혼합되어 있는 PBS 용액 500 ㎕를 첨가하고, 상온에서 15 분 동안 인큐베이션하였다. 이후 세포를 round bottom tube에 옮긴 후 유세포 분석기(Flow cytometry)로 엑소좀의 세포사멸 억제 효과를 확인하였다.
도 4는 CHO 세포 유래 엑소좀이 첨가되지 않은 엑소좀이 제거된 FBS가 첨가된 IMDM 배지로 배양한 CHO 세포(대조군)에 STS를 처리한 후, 이의 세포 생존율을 유세포 분석기를 이용하여 측정한 결과 그래프이고, 도 5는 실시예 1의 배지 조성물로 배양한 CHO 세포(실험군)에 STS를 처리한 후, 이의 세포 생존율을 유세포 분석기를 이용하여 측정한 결과 그래프이다.
도 4에 나타난 바와 같이, CHO 세포 유래 엑소좀이 첨가되지 않은 엑소좀이 제거된 FBS가 첨가된 IMDM 배지로 배양된 CHO 세포(대조군)의 경우 87.0%의 세포가 아폽토시스에 의해 사멸되었음을 확인하였다. 이에 반해, 도 5를 살펴보면 CHO 세포 유래 엑소좀이 첨가된 배지 조성물로 배양된 CHO 세포(실험군)의 경우, 동일 시간에 아폽토시스에 의해 사멸된 세포가 38.9% 임을 확인하였다.
상술한 결과를 통해, 본 발명에 따른 CHO 세포 배양액으로부터 추출한 엑소좀을 포함하는 배지 조성물은, CHO 세포 배양과정에서 발생하는 CHO 세포의 세포사멸을 효과적으로 방지 및 억제할 수 있음을 확인하였다. 즉 본 발명에 따른 배지 조성물로 CHO 세포를 배양할 경우 세포 생존율을 2 배 이상 높게 유지하도록 하는 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
실험예 5. CHO 세포 유래 엑소좀의 미토콘드리아 막 전위(Mitochondrial Membrane Potential) 감소 억제 작용 분석
미토콘드리아는 세포에서 공장과 같은 역할을 해주는 세포 내 기관으로서, 세포의 활성과 증식, 단백질 생산 등에서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 미토콘드리아는, 세포가 apoptosis로 인해 사멸할 경우, 막 전위가 감소하게 되며, 결국 세포사멸에 따라 미토콘드리아 역시 활성을 잃어버리게 되는 것이다.
상술한 기작을 통해 본 발명의 CHO 유래 엑소좀을 포함하는 세포사멸방지용 배지 조성물이, CHO 세포의 세포사멸(apoptosis)을 억제 및 방지하는 효과를 달성하고 있음을 규명하고자 하였다.
실험방법은 다음과 같다. 우선 24-well cell culture plate에 10% FBS IMDM을 사용하여 CHO 세포를 2 × 104 cell/㎠로 분주하였다. 이후 대조군 세포에는 CHO 세포 유래 엑소좀이 첨가되지 않은 엑소좀이 제거된 FBS가 첨가된 IMDM 배지를 첨가하였으며, 실험군 세포에는 1 × 1010 입자수(particle)/㎠의 엑소좀을 넣어 주었다. 엑소좀 첨가하고 6 시간 후에 0.5 μM의 STS(Staurosporine)를 실험군과 대조군 세포에 각각 12 시간 동안 처리하였다. 미토콘드리아 막 전위를 측정하기 위해, 세포 배양액을 제거 한 후 Mito-ID® MP Dye Loading Solution(Mito-IDㄾ Membrane Potential Cytotoxicity Kit, Enzo, USA) 250 ㎕를 첨가한 후 37℃에서 30 분간 배양하였다. 배양기로부터 세포를 탈착한 후, 384 well로 옮긴 후 형광값을 측정하여 아래 식 1을 통해 미토콘드리아의 상대적인 막 전위 변화량(%;relative mitochondrial membrane potential(%))을 계산 하였다(Excitation 490 nm, Emission 580 nm).
[식 1]
도 6은 실험군(w/ exo)과 대조군(w/o exo)에 존재하는 미토콘드리아의 상대적인 막 전위 변화량(%;relative mitochondrial membrane potential(%))을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6에 나타난 바와 같이, 일반적으로 세포에 STS 처리하면, 세포의 세포사멸(apoptosis)가 유도되어 미토콘드리아 막 전위가 급격하게 감소하게 되는데, 엑소좀이 첨가되지 않은 일반 IMDM 배지로 배양한 CHO 세포(대조군;w/o exo)의 경우, STS 처리 후 12 시간 뒤 막 전위가 19.8%로 현저히 감소된 것을 확인하였다.
반면, 엑소좀을 포함한 본 발명의 배지 조성물로 배양한 CHO 세포(실험군;2/ exo)에서는 미토콘드리아 막 전위가 30.5% 유지되고 있었으며, 이는 대조군에 비해 1.5 배 이상 높은 것을 확인할 수 있다. 이는 CHO 세포 활성이 일반 배지를 이용하여 배양할 때에 비해 1.5 배 이상 높게 유지됨을 나타내는 것으로, 바이오 의약품 등의 재조합 단백질을 생산함에 있어서 효율성 및 생산성이 현저히 높음을 나타내는 수치로써 유의미한 범위에서의 매우 현저한 효과의 상승을 나타낸다 볼 수 있다.
Claims (12)
- CHO 세포 배양액으로부터 추출한 엑소좀 및 기본배지를 포함하고,
상기 CHO 세포 배양액은 CHO 세포를 배양한 후의 배양물인 것을 특징으로 하는, CHO 세포 배양과정에서 CHO 세포의 사멸방지용 배지 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 CHO 세포 배양액은 50 내지 100 시간동안 배양한 것을 특징으로 하는 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 엑소좀의 배지 조성물 내에 농도는 1 × 104 내지 1 × 1012 입자수(particle)/㎠인 것을 특징으로 하는 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 기본배지는 M199/F12 배지, MEM-alpha 배지, 저농도 글루코오스 함유 DMEM 배지, MCDB 131 배지, IMDM 배지, K-SFM 배지, DMEM/F12 배지, 및 EGM-2 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 배지를 기본배지로 한 것을 특징으로 하는 배지 조성물. - 1) 포유동물세포를 기본배지에서 배양하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계;
3) 상기 분리된 엑소좀을 기본배지에 혼합하여 포유동물세포의 세포사멸방지용 배지 조성물을 제조하는 단계; 및
4) 상기 배지 조성물에 포유동물세포를 접종하여 배양하는 단계;를 포함하고,
상기 1) 단계의 포유동물세포와 상기 4) 단계의 포유동물세포는 서로 동일하며, 상기 포유동물세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO;Chinese Hamster Ovary) 세포인 것을 특징으로 하는 포유동물세포의 배양방법. - 삭제
- 삭제
- 제7항에 있어서,
상기 1) 단계의 배양 시간은 50 내지 100 시간인 것을 특징으로 하는 배양방법. - 제7항에 있어서,
상기 1) 단계에서 기본배지와 상기 3) 단계에서의 기본배지는 서로 동일한 것을 사용하며, 상기 기본배지는 M199/F12 배지, MEM-alpha 배지, 저농도 글루코오스 함유 DMEM 배지, MCDB 131 배지, IMDM 배지, K-SFM 배지, DMEM/F12 배지, 및 EGM-2 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 배지인 것을 특징으로 하는 배양방법. - 제7항에 있어서,
상기 3) 단계에서 제조된 배지 조성물 내에 상기 엑소좀은 1 × 104 내지 1 × 1012 입자수(particle)/㎠ 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 배양방법.
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