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KR102623965B1 - 당단백질의 글리칸 함량 수준을 조작하는 방법 - Google Patents

당단백질의 글리칸 함량 수준을 조작하는 방법 Download PDF

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KR102623965B1
KR102623965B1 KR1020177016893A KR20177016893A KR102623965B1 KR 102623965 B1 KR102623965 B1 KR 102623965B1 KR 1020177016893 A KR1020177016893 A KR 1020177016893A KR 20177016893 A KR20177016893 A KR 20177016893A KR 102623965 B1 KR102623965 B1 KR 102623965B1
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다니엘 알. 레이스케
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암젠 인크
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Abstract

본 발명은 재조합 단백질에서의 푸코실화된 글리칸 함량을 조작하는 방법을 제공한다.

Description

당단백질의 글리칸 함량 수준을 조작하는 방법{PROCESS FOR MANIPULATING THE LEVEL OF GLYCAN CONTENT OF A GLYCOPROTEIN}
보다 고등의 진핵생물에 의해 발현되는 단백질에 대해 메틸화, 황산화, 인산화, 지질 첨가 및 글리코실화를 포함하는 다양한 번역 후 변형이 수행된다. 글리코실화는 특정 아미노산에 대한 당 모이어티의 공유 부착을 수반하며, 재조합 단백질에 대한 가장 통상적이고 중요한 번역 후 변형 중 하나이다. 단백질 글리코실화는 단백질 폴딩 및 품질 관리, 분자 수송 및 분류, 및 세포 표면 수용체 상호작용을 포함하는 다수의 기능에서 어떤 역할을 한다. 다수의 분비 단백질, 막 단백질 및 소수포 또는 특정 세포내 세포소기관에 표적화된 단백질은 글리코실화되는 것으로 알려져 있다.
글리코실화는 다수 형태를 취할 수 있지만, N-연결 글리코실화가 가장 흔하다. N-연결 글리코실화는 단백질(예를 들어, Asn-X-Ser/Thr)에서 특정 인식 서열에서 발견되는 아스파라긴 잔기에 대한 올리고당의 첨가를 수반한다. N-연결 당단백질은 만노스, 갈락토스, N-아세틸글루코사민 및 뉴라민산으로 구성된 표준 분지 구조를 포함한다. 재조합으로 발현된 치료 항체의 Fc 도메인의 N-연결 글리코실화는 중대한 번역후 변형이다. 전형적인 치료 항체는 각각의 분지 상에서 N-아세틸갈락토사민(GlcNAc), 갈락토스 및 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac) 잔기에 의해 캡핑된 트라이만노실 코어를 지니는 푸코실화된 2-안테나 글리칸을 갖는 복잡한 당형(glycoform)을 가진다. 다른 당형은 비푸코실화, 갈락토실화, 시알릴화되고, 말단의 또는 2등분의 GlcNAc를 가지며, 고 만노스(5 내지 9개 잔기) 등을 가질 수 있다.
글리코실화는 재조합 단백질 약물의 치료 효능에 영향을 미칠 수 있다. Fc 글리코실화의 변형이 Fc-매개 효과기 기능에 영향을 미칠 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 일부 당형, 예컨대 갈락토실화 및 시알릴화는 면역원성, 및 기타, 예컨대 비푸코실화, 2등분 GlcNAc 잔기를 감소시키는 데 바람직하고, 고 만노스 글리칸은 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC) 활성을 향상시킨다.
글리코실화는 치료 항체의 구조 및 기능 결정에서 중요하다. 일단 항체가 치료 용도로 도입된다면, 이는 결합 능력을 결정하며, 종종 항체의 인식 및 처리를 결정한다. 갈락토실화 및 푸코실화의 경우에, 그들은 그들이 영향을 미치는 상보체 의존적 세포독성(CDC) 활성 및 ADCC 기능을 각각 결정한다.
β-갈락토실화 수준은 더 "성숙한" 당형과 관련된다. 갈락토스 첨가는 분비 전에 골지체에서 일어나는 글리코실화의 마지막 단계 중 하나이다. 말단 갈락토스는 일부 단백질의 글리코실화에서 최종 단계일 수 있는 시알릴화에 필요하다. 갈락토스는 또한 갈락토스 결합 단백질의 리간드로서 작용하고, 탄수화물 함량과 관련된 다양한 항원 반응에 기반한다. 갈락토스는 또한 용액 중의 단백질 입체구조에 영향을 미치는 것으로 나타났다. (Furukawa and Sato, (1999) Biochimica et Biophysica Acta (BBA), 1473 (1), 페이지 54-86 및 Houde et al., (2010) Molecular and Cellular Proteomics, 9(8), 페이지 1716-1728.
푸코실화는 또한 분비 전에 단백질 성숙의 부분으로서 골지체에서 일어난다. 단백질이 푸코실화된다면, 이는 전형적으로 글리코실화 경로에서 갈락토실화 전에 일어난다. 그러나, 푸코실화는 갈락토실화가 진행되는 것을 필요로 하지 않는다(Hossler et al., (2009) Glycobiology, 19(9), 페이지 936-949).
치료 당단백질의 생활성, 약동학, 면역원성, 용해도 및 생체내 클리어런스에 대한 글리코실화의 영향은 생물 약제학적 제조를 위한 중요한 매개변수인 글리코실화의 모니터링 및 제어에 의해 이루어졌다. 따라서, 치료 단백질의 글리칸 함량 수준을 제조하기 위한 방법이 유리하였다.
재조합 치료 당단백질 함량 수준을 조작 및 제어하기 위한 약제학적 산업에서의 필요가 있으며, 세포 성장, 생존도 및 생산성에 대한 상당한 영향 없이 이를 달성하기 위한 방법이 유용할 것이다. 본 발명은 세포 배양 배지에서 구리 및 망간 함량 및 pH를 조절함으로써 재조합 단백질에서의 푸코실화 글리칸 함량을 조작하는 방법을 제공한다.
본 발명은 생물반응기를 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포로 접종하는 단계, 화학적으로 규명된(chemically defined) 무혈청 세포 배양 배지에서 숙주 세포를 배양시키는 단계로서, 세포 배양 배지는 pH 7.0에서 구리 10 내지 100ppb 및 망간 50 내지 1000nM을 포함하는, 상기 배양시키는 단계, 숙주 세포에 의해 생성된 재조합 단백질을 채취하는 단계를 포함하되, 재조합 단백질 상의 비푸코실화 글리칸 수준은 더 낮은 pH에서 동일한 세포 배양 배지에서 얻어진 비푸코실화 글리칸 수준에 비해 증가된, 재조합 단백질에서의 푸코실화 글리칸 함량을 조작하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 재조합 단백질에 대한 β-갈락토실화 수준의 증가를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 구리의 농도는 100ppb이다.
일 실시형태에서, 망간의 농도는 1000nM이다.
일 실시형태에서, 푸코실화 글리칸 함량은 재조합 단백질의 효과기 기능에 영향을 미치도록 조작된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 온도 이동을 추가로 포함한다. 관련된 실시형태에서, 온도 이동은 36℃에서 31℃로의 이동이다. 다른 관련된 실시형태에서, 온도 이동은 성장기와 생성기 사이의 전이에서 일어난다. 또 다른 관련된 실시형태에서, 온도 이동은 생성기 동안에 일어난다.
일 실시형태에서, 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포는 회분 배양(batch culture), 유가 배양(fed-batch culture), 관류 배양(perfusion culture) 또는 이들의 조합으로 배양된다. 관련된 실시형태에서, 배양은 관류 배양이다. 다른 관련된 실시형태에서, 관류는 연속 관류를 포함한다. 다른 관련된 실시형태에서, 관류 속도는 일정하다. 다른 관련된 실시형태에서, 관류는 1일 당 1.0 작업 용적 이하의 속도로 수행된다. 또 다른 관련된 실시형태에서, 관류는 교번의 접선 유동에 의해 달성된다.
일 실시형태에서, 생물반응기는 용량이 적어도 500ℓ이다.
일 실시형태에서, 생물반응기는 용량이 적어도 500ℓ 내지 2000ℓ이다.
일 실시형태에서, 생물반응기는 용량이 적어도 1000ℓ 내지 2000ℓ이다.
일 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 0.5 x 106개 세포/㎖로 접종된다.
일 실시형태에서, 무-혈청의 화학적으로 규명된 세포 배양 배지는 관류 세포 배양 배지이다.
일 실시형태에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다.
일 실시형태에서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포이다.
일 실시형태에서, 재조합 단백질은 당단백질이다.
일 실시형태에서, 재조합 단백질은 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 융합 단백질 또는 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 숙주 세포에 의해 생성된 재조합 단백질은 약제학적으로 허용가능한 제형으로 정제 및 제형화된다.
일 실시형태는 본 발명의 방법에 의해 생성된 재조합 단백질이다. 관련된 실시형태에서, 이에 따른 재조합 단백질은 정제된다. 또 다른 관련된 실시형태에서, 재조합 단백질은 약제학적으로 허용가능한 제형으로 제형화된다.
도 1은 통합 생세포 밀도(106개 세포 일/㎖)를 도시한 도면
pH 6.85 50 Mn2 + 10 Cu2 +(+에 의한 회색 파선)
pH 6.85 50 Mn2 + 100 Cu2 +(+에 의한 회색 선)
pH 6.85 1000 Mn2 + 10 Cu2 +(속이 빈 원에 의한 회색 파선)
pH 6.85 50 Mn2 + 100 Cu2 +(속이 빈 원에 의한 회색 선)
pH 7.0 50 Mn2 + 10 Cu2 +(+에 의한 검정색 파선)
pH 7.0 50 Mn2 + 100 Cu2 +(+에 의한 검정색 선)
pH 7.0 1000 Mn2 + 10 Cu2 +(속이 빈 원에 의한 검정색 파선)
pH 7.0 50 Mn2 + 100 Cu2 +(속이 빈 원에 의한 검정색 선)
pH는 세포 성장에 영향을 미치는 유일한 인자인 것으로 나타났다. 망간 및 구리 농도는 세포 성장에 효과를 갖지 않는 것으로 보였다.
도 2는 생존도(%)를 도시한 도면
pH 6.85 50 Mn2 + 10 Cu2 +(+에 의한 회색 파선)
pH 6.85 50 Mn2 + 100 Cu2 +(+에 의한 회색 선)
pH 6.85 1000 Mn2 + 10 Cu2 +(속이 빈 원에 의한 회색 파선)
pH 6.85 50 Mn2 + 100 Cu2 +(속이 빈 원에 의한 회색 선)
pH 7.0 50 Mn2 + 10 Cu2 +(+에 의한 검정색 파선)
pH 7.0 50 Mn2 + 100 Cu2 +(+에 의한 검정색 선)
pH 7.0 1000 Mn2 + 10 Cu2 +(속이 빈 원에 의한 검정색 파선)
pH 7.0 50 Mn2 + 100 Cu2 +(속이 빈 원에 의한 검정색 선)
17일까지, pH 6.85에서의 배양은 pH 7.0에서의 배양 실행에 비해 더 높은 최종 생존도를 가졌다. 그러나, 최종 생존도는 pH와 상관없이 80% 초과였다. 시험 범위에서 구리 및 망간 농도는 생존도에 대해 효과가 없었다.
도 3은 패킹 세포 조절 역가(g/ℓ)를 도시한 도면
pH 6.85 50 Mn2 + 10 Cu2 +(+에 의한 회색 파선)
pH 6.85 50 Mn2 + 100 Cu2 +(+에 의한 회색 선)
pH 6.85 1000 Mn2 + 10 Cu2 +(속이 빈 원에 의한 회색 파선)
pH 6.85 50 Mn2 + 100 Cu2 +(속이 빈 원에 의한 회색 선)
pH 7.0 50 Mn2 + 10 Cu2 +(+에 의한 검정색 파선)
pH 7.0 50 Mn2 + 100 Cu2 +(+에 의한 검정색 선)
pH 7.0 1000 Mn2 + 10 Cu2 +(속이 빈 원에 의한 검정색 파선)
pH 7.0 50 Mn2 + 100 Cu2 +(속이 빈 원에 의한 검정색 선)
pH는 패킹 세포 조절 역가에 대해 통계학적 영향을 갖지 않으며, 마찬가지로, 구리 및 망간 농도는 이 세포주 및 공정에 대해 효과가 없었다.
도 4는 생세포 밀도(105개 세포 일/㎖)를 도시한 도면
pH 6.85 50 Mn 10 Cu(+에 의한 회색 파선)
pH 6.85 50 Mn 100 Cu(+에 의한 회색 선)
pH 6.85 1000 Mn 10 Cu(속이 빈 원에 의한 회색 파선)
pH 6.85 50 Mn2 + 100 Cu2 +(속이 빈 원에 의한 회색 선)
pH 7.0 50 Mn2 + 10 Cu2 +(+에 의한 검정색 파선)
pH 7.0 50 Mn2 + 100 Cu2 +(+에 의한 검정색 선)
pH 7.0 1000 Mn2 + 10 Cu2 +(속이 빈 원에 의한 검정색 파선)
pH 7.0 50 Mn2 + 100 Cu2 +(속이 빈 원에 의한 검정색 선)
pH 6.85에서의 반응기 실행은 pH 7.0에서 성장한 반응기보다 더 많이 거의 106개 세포/㎖의 세포 밀도로 성장하였다. 구리 및 망간의 농도는 이 세포주 및 처리를 위한 이 실험에서 세포 성장에 대해 통계학적으로 유의한 효과를 가졌다. pH는 세포 성장에 영향을 미치는 유일한 인자였다.
도 5는 JMP 통계 소프트웨어를 이용하여 생성한 β-갈락토실화(Adj. R2 = 0.95) 예측 프로파일러. 프로파일은 pH 및 망간 농도 조작 결과로서 β-갈락토실화의 변화 방향성 및 규모를 도시한다. 프로파일러에서 기간은 통계학적으로 유의하지 않은 해당 기간을 제거한 후에 통계학적 모델에서 남아있는 기간을 나타낸다. 망간의 첨가는 베타-갈락토실화 수준; 더 큰 망간 농도, 더 큰 백분율의 베타-갈락토실화에 대해 유의한 효과를 가졌다. pH는 또한 망간을 첨가했을 때 관찰된 정도는 아니지만, pH가 증가하고, 또한 베타-갈락토실화가 증가함에 따라 베타-갈락토실화에 대해 통계학적으로 유의한 효과를 가졌다.
도 6은 JMP 통계 소프트웨어를 이용하여 생성한 비푸코실화(Adj. R2 = 0.92) 예측 프로파일러. 프로파일은 pH 및 구리 농도 조작 결과로서 비푸코실화의 변화 방향성 및 규모를 도시한다. 프로파일러에서 기간은 통계학적으로 유의하지 않은 해당 기간을 제거한 후에 통계학적 모델에서 남아있는 기간을 나타낸다. 구리, 망간 및 pH는 모두 비푸코실화 수준에 대해 통계학적으로 유의한 영향을 가졌다. 구리 및 망간 수준의 증가뿐만 아니라 pH 증가는 모두 비푸코실화의 증가를 초래하였다.
도 7은 염기 비푸코실화(4%), 6% 비푸코실화 및 8% 비푸코실화에서 ADCC 상대적 세포독성을 도시한 도면.
도 8은 염기 β-갈락토실화(2.7%), 25% β-갈락토실화 및 50% β-갈락토실화에서 CDC 척도 용량 반응을 도시한 도면.
세포 배양 배지에서 망간 농도를 달리하는 것은 재조합 항체의 β-갈락토실화 정도에 영향을 미칠 수 있다. 망간은 갈락토실트랜스퍼라제 활성 조절에서 보조인자로서 작용한다. 갈락토실트랜스퍼라제 매개 반응은 당 기질로서 UDP-갈락토스 및 보조인자로서 망간을 사용한다. 갈락토실화 수준의 변화는 UDP-갈락토스 유용성의 변화 또는 효소 활성의 변화에 의해(예를 들어, 망간 보조인자 농도를 변경함으로써), 또는 둘 다에 의해 야기될 수 있다.
유사하게, 푸코실화는 GDP-푸코스 기질 수준을 변경함으로써, 푸코실트랜스퍼라제 활성을 방해함으로써 또는 GDP-푸코스 수송체 메커니즘을 변형시킴으로써 조정될 수 있다. 그러나, 금속 이온은 임의의 이들 메커니즘에서 직접적 역할을 하는 것으로 보고되지 않았다. 본 명세서에 기재된 바와 같은, 망간 및 구리 수준의 증가는 비푸코실화 글리칸 수준을 유의하게 증가시킴으로써 재조합 단백질 푸코실화 글리칸 함량에 영향을 미치는 것이 발견되었다. 추가로, pH는 또한 글리코실화 패턴을 결정함에 있어서 주된 역할을 한다는 것을 발견하였다.
IgG1 항체에 대한 N-연결 글리코실화 유형 및 정도는 Fc-매개 효과기 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 비푸코실화 수준은 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도를 증가시킴으로써 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 강하게 향상시키는 반면, 갈락토실화 수준은 상보체 의존적 세포독성(CDC) 활성에 영향을 미칠 수 있다. 이는 치료 단백질의 글리코실화 특성 및 수준을 이해하고 제어하는 데 중요하게 만든다. 본 명세서에 기재된 바와 같은, 비푸코실화 및 갈락토실화의 강화는 ADCC 및 CDC 효과기에 대한 실질적인 영향을 가졌다
세포 배양 배지에서 pH 및 망간(Mn2 +) 및 구리(Cu2 +) 농도를 조작함으로써 재조합 단백질에 대한 비푸코실화 글리칸 수준 제어를 개선하는 방법이 제공된다. 비푸코실화 및 β-갈락토실화 글리칸 수준은 세포 배양 성능에 영향을 미치는 일 없이 증가되었다.
본 발명은 생물반응기를 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포로 접종하는 단계, 화학적으로 규명된 무혈청 세포 배양 배지에서 숙주 세포를 배양시키는 단계로서; 세포 배양 배지는 pH 7.0에서 구리 10 내지 100ppb 및 망간 50 내지 1000nM을 포함하는, 상기 배양시키는 단계, 숙주 세포에 의해 생성된 재조합 단백질을 채취하는 단계를 포함하되, 재조합 단백질 상의 비푸코실화 글리칸 수준은 더 낮은 pH에서 동일한 세포 배양 배지에서 얻어진 비푸코실화 글리칸 수준에 비해 증가된, 재조합 단백질에서의 푸코실화 글리칸 함량을 조작하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 재조합 단백질에 대한 β-갈락토실화 수준의 증가를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 구리의 농도는 100ppb이다. 일 실시형태에서, 망간의 농도는 1000nM이다. 일 실시형태에서, 푸코실화 글리칸 함량은 재조합 단백질의 효과기 기능에 영향을 미치도록 조작된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 온도 이동을 추가로 포함한다. 관련된 실시형태에서, 온도 이동은 36℃에서 31℃로의 이동이다. 다른 관련된 실시형태에서, 온도 이동은 성장기와 생성기 사이의 전이에서 일어난다. 또 다른 관련된 실시형태에서, 온도 이동은 생성기 동안에 일어난다.
일 실시형태에서, 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포는 회분 배양, 유가 배양, 관류 배양 또는 이들의 조합으로 배양된다. 관련된 실시형태에서, 배양은 관류 배양이다. 다른 관련된 실시형태에서, 관류는 연속 관류를 포함한다. 다른 관련된 실시형태에서, 관류 속도는 일정하다. 다른 관련된 실시형태에서, 관류는 1일 당 1.0 작업 용적 이하의 속도로 수행된다. 또 다른 관련된 실시형태에서, 관류는 교번의 접선 유동에 의해 달성된다.
일 실시형태에서, 생물반응기는 용량이 적어도 500ℓ이다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 용량이 적어도 500ℓ 내지 2000ℓ이다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 용량이 적어도 1000ℓ 내지 2000ℓ이다. 일 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 0.5 x 106개 세포/㎖로 접종된다.
일 실시형태에서, 무-혈청의 화학적으로 규명된 세포 배양 배지는 관류 세포 배양 배지이다. 일 실시형태에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 일 실시형태에서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
일 실시형태에서, 재조합 단백질은 당단백질이다. 일 실시형태에서, 재조합 단백질은 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 융합 단백질 또는 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 숙주 세포에 의해 생성된 재조합 단백질은 약제학적으로 허용가능한 제형으로 정제 및 제형화된다. 일 실시형태는 본 발명의 방법에 의해 생성된 재조합 단백질이다. 관련된 실시형태에서, 이에 따른 재조합 단백질은 정제된다. 또 다른 관련된 실시형태에서, 재조합 단백질은 약제학적으로 허용가능한 제형으로 제형화된다.
세포 배양
"세포 배양" 또는 "배양물"은 다세포 유기체 또는 조직 밖의 세포 성장 및 증식을 의미한다. 포유류 세포에 적합한 배양 조건은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 동물 세포 배양: 문헌[A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford University Press, New York (1992)]. 포유류 세포는 현탁액 중에서 배양될 수 있거나 또는 한편으로 고체 기질에 부착된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포 배양 배지"(또한 "배양 배지", "세포 배양 배지", "조직 배양 배지"로 불림)는 성장하는 세포, 예를 들어, 동물 또는 포유류 세포에 대해 사용되는 임의의 영양소 용액을 지칭하며, 다음의: 에너지 공급원(보통 탄수화물, 예컨대 글루코스 형태); 하나 이상의 모든 필수 아미노산, 및 일반적으로 20가지의 염기성 아미노산 + 시스테인; 비타민 및/또는 전형적으로 저농도로 필요한 다른 유기 화합물; 지질 또는 유리 지방산; 및 미량 원소, 예를 들어, 전형적으로 매우 저농도로(보통 마이크로몰 범위로) 필요한 무기 화합물 또는 천연 유래 원소로부터의 적어도 하나 이상의 성분을 제공한다.
영양소 용액은 선택적으로 배양될 세포 및/또는 목적으로 하는 세포 배양 매개변수의 필요에 따라서 세포 성장을 최적화하기 위해 추가적인 성분, 예컨대 호르몬 및 다른 성장 인자, 예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장 인자, 혈청 등; 염, 예를 들어, 칼슘, 마그네슘 및 인산염, 및 완충제, 예를 들어, HEPES; 뉴클레오사이드 및 염기, 예를 들어, 아데노신, 티미딘, 하이포크산틴; 및 단백질 및 조직 가수분해물, 예를 들어, 가수분해된 동물 단백질(동물 부산물, 정제 젤라틴 또는 식물 물질로부터 얻을 수 있는 펩톤 또는 펩톤 혼합물); 항생제, 예를 들어, 겐타마이신; 세포 보호제 또는 계면활성제, 폴리아민, 예를 들어, 푸트레신, 스페르미딘 또는 스페르민(예를 들어, WIPO 공개 번호 WO 2008/154014) 및 피루브산염(예를 들어, 미국 특허 제8053238호 참조)으로 보충될 수 있다.
비이온성 계면활성제는 또한 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 비이온성 계면활성제의 예는 폴리비닐 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 비이온성 블록 공중합체 계면활성제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 또한 알킬 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 옥사이드)와 폴리(프로필렌 옥사이드)의 공중합체(EO-PO 블록 공중합체), 폴리(비닐피롤리돈), 알킬 폴리글루코사이드(예컨대 수크로스 모노스테아레이트, 라우릴 다이글루코사이드, 또는 솔비탄 모노라우레이트, 옥틸 글루코사이드 및 데실 말토사이드), 지방 알코올(세틸 알코올 또는 올레일 알코올) 또는 코카마이드(코카마이드 MEA, 코카마이드 DEA 및 코카마이드 TEA)가 포함된다.
또한 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 블록 공중합체로서도 지칭되는 에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드에 기반한 블록 공중합체가 포함된다. 이들 분자는 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥사이드))의 중앙 소수성 사슬에 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 2개의 친수성 사슬이 측접하는 비이온성 삼블록 공중합체이다. 각각의 폴리옥시에틸렌 사슬의 70개 폴리옥시프로필렌 단위 및 30단위를 갖는 것에 특별한 관심이 있다. 바람직한 실시형태에서, 블록 공중합체는 폴록사머 188(평균 분자량이 8.4kd인 CAS #90003-11-6, 뉴욕주 워싱턴에 소재한 바스프 케미칼사(BASF Chemical))인데, 이는 다양한 상표명, 예컨대 플루로닉(Pluronic)(등록상표) F68, 콜리포(Kolliphor)(등록상표) P-188, 루트롤(Lutrol)(등록상표) F68, 및 루트롤(등록상표) 188 하에 판매된다. 이러한 비이온성 계면활성제는 5g/ℓ 이상까지의 농도로 첨가될 수 있고, ATF 관류 조건 하에서 더 긴 배양 지속시간 동안 세포 생존도를 유지하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 구리 10 내지 100ppb 및 망간 50 내지 1000nM을 함유하는 세포 배양 배지를 제공한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 100ppb 망간을 함유한다. 다른 실시형태에서, 세포 배양 배지는 1000nM 망간을 함유한다. 다른 실시형태에서, 세포 배양 배지는 100ppb 망간 및 1000nM 망간을 함유한다. 본 발명에 유용한 구리 및 망간염은, 황산제2구리 5수화물 및 황산망간 1수화물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
구리 및 망간을 포함하는 세포 배양 배지 성분은 분말 배지 제형으로 완전히 분쇄되거나; 필요하다면 세포 배양 배지에 첨가된 액체 보충물과 함께 부분적으로 분쇄되거나; 또는 세포 배양 배지 성분은 세포 배양물에 완전히 액체 형태로 첨가될 수 있다.
세포 배양 배지는 임의의 세포 배양 공정, 예컨대 이하로 제한되는 것은 아니지만, 세포의 회분, 확장 회분, 유가 및/또는 관류 또는 연속적 배양과 함께 전형적으로 사용되고/되거나 함께 사용을 위해 알려진 것을 포함한다.
"기본"(또는 회분) 세포 배양 배지는 세포 배양을 개시하기 위해 전형적으로 사용되고, 세포 배양을 지원하는데 충분히 완전한 세포 배양 배지를 지칭한다.
"성장" 세포 배양 배지는 지수적 성장 기간인 "성장기" 동안 세포 배양에서 전형적으로 사용되고, 이 단계 동안 세포 배양을 지원하는 데 충분히 완전한 세포 배양 배지를 지칭한다. 성장 세포 배양 배지는 또한 숙주 세포주에 혼입된 저항성 또는 생존 내지 선택 마커를 부여하는 선택 제제를 함유할 수 있다. 이러한 선택 제제는 제네티신(G4118), 네오마이신, 하이그로마이신 B, 퓨로마이신, 제오신, 메티오닌 설폭시민, 메토트렉세이트, 무-글루타민 세포 배양 배지, 글리신, 하이포크산틴 및 티미딘이 없는 세포 배양 배지, 또는 티미딘 단독을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
"생성" 세포 배양 배지는 지수적 성장이 끝나고 단백질 생성이 우세해질 때 전이 및 생성기 동안 세포 배양에서 전형적으로 사용되고, 이들 단계 동안 목적으로 하는 세포 밀도, 생존도 및/또는 생성물 역가를 유지하는 데 충분히 완전한 세포 배양 배지를 지칭한다.
"관류" 세포 배양 배지는 관류 또는 연속적 배양 방법에 의해 유지되는 세포 배양에서 전형적으로 사용되고, 이 공정 동안 세포 배양을 지원하는 데 충분히 완전한 세포 배양 배지를 지칭한다. 관류 세포 배양 배지 제형은 소모 배지를 제거하기 위해 사용되는 방법을 수용하기 위해 기본 세포 배양 배지 제형보다 강화되거나 또는 더 농축될 수 있다. 관류 세포 배양 배지는 성장기와 생성기 둘 다 동안에 사용될 수 있다.
세포 배양은 성분, 예컨대 영양소 및 아미노산을 함유하는 농축 공급물 배지로 보충될 수 있는데, 이는 배양의 생성기 과정 동안 소모된다. 농축 세포 배양 배지는 세포 배양을 유지하는 데 필수적인 일부 또는 모든 영양소를 함유할 수 있고; 특히, 농축 배지는 세포 배양의 생성기 과정 동안 소모될 것으로 동정된 또는 알려진 영양소를 함유할 수 있다. 농축 배지는 거의 임의의 세포 배양 배지 제형에 기반할 수 있다. 이러한 농축 공급 배지는 그들의 정상량의, 예를 들어, 약 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 25X, 30X, 40X, 50X, 75X, 100x, 200X, 400X, 600X, 800X 또는 심지어 1000X에서 세포 배양 배지의 일부 또는 모든 성분을 함유할 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포 배양 배지는 무-혈청이고/이거나 동물 유래 생성물 또는 성분이 없을 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 규명될 수 있으며, 여기서 모든 화학 성분은 알려져 있다.
실행자에 의해 인식될 바와 같이, 동물 또는 포유류 세포는 배양 중인 특정 세포에 적합한 배지에서 배양되며, 이는 과도한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 배지가 이용될 수 있으며, 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), RPMI 1640 및 최소 필수 배지-알파(MEM-알파), 둘베코 변형 이글배지(DMEM), DME/F12, 알파 MEM, 얼(Earle)의 BSS를 지니는 기본 배지 이글, 글루타민이 있는 DMEM 고글루코스, 글루타민이 없는 DMEM 고글루코스, 글루타민이 없는 DMEM 저글루코스, 글루타민이 있는 DMEM:F12 1:1, GMEM(글래스고(Glasgow)의 MEM), 글루타민이 있는 GMEM, 그레이스(Grace)의 완전 곤충 배지, FBS가 없는 그레이스의 곤충 배지, 글루타민이 있는 함(Ham)의 F-10, 글루타민이 있는 함의 F-12, HEPES 및 글루타민이 있는 IMDM, HEPES가 있고 글루타민이 없는 IMDM, IP41 곤충 배지, 글루타민 또는 페놀 레드가 없는 15(레보비츠(Leibovitz))(2X), 글루타민이 없는 15(레보비츠), 맥코이(McCoy) 5A 변형 배지, 배지199, 글루타민 또는 페놀 레드가 없는 MEM 이글(2X), 글루타민이 있는 MEM 이글-얼 BSS, 글루타민이 없는 MEM 이글-얼 BSS, 글루타민이 없는 MEM 이글-행크스 BSS, 글루타민이 있는 NCTC-109, 글루타민이 있는 릭터(Richter) CM 배지, HEPES가 있는 RPMI 1640, 글루타민 및/또는 페니실린-스트렙토마이신, 글루타민이 있는 RPMI 1640, 글루타민이 없는 RPMI 1640, 슈나이더(Schneider) 곤충 배지 또는 특정 세포 유형에 대해 제형화된 당업자에게 공지된 임의의 다른 배지를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 앞서 언급한 예시적인 배지에 필요하거나 또는 원한다면, 그리고 일상적인 기술을 이용하여 당업자에 의해 공지되고 실행될 수 있다면, 적절한 농도 또는 양으로 선택적 성분을 포함하는 보충적 구성성분 또는 성분이 첨가될 수 있다.
세포 배양은 또한 제형화가 어렵거나 또는 세포 배양물에서 빠르게 고갈될 수 있는 특정 영양소의 독립적 농축 공급물로 보충될 수 있다. 이러한 영양소는 아미노산, 예컨대 타이로신, 시스테인 및/또는 시스틴일 수 있다(예를 들어, WIPO 공개 번호 2012/145682). 예를 들어, 타이로신의 농축 용액은 타이로신을 함유하는 세포 배양 배지에서 성장된 세포 배양에 독립적으로 공급될 수 있다. 타이로신 및 시스틴 농축 용액은 타이로신, 시스틴 및/또는 시스테인이 없는 세포 배양 배지에서 성장 중인 세포 배양물에 독립적으로 공급될 수 있다. 독립적 공급은 생성기 전에 또는 생성기의 시작 시 시작할 수 있다. 독립적 공급은 농축 공급 배지로서 동일 또는 상이한 날에 세포 배양 배지에 대해 유가 배양에 의해 달성될 수 있다. 독립적 공급은 또한 관류 배지와 동일 또는 상이한 날에 관류될 수 있다.
포유류 세포 배양물, 예컨대 피드백 제어를 사용하지 않는 것에 연속적 공급을 위한 방법이 사용될 수 있다(WIPO 공개 번호 WO 2013/040444).
배지 처리
생물반응기 및/또는 세포 배양에 대한 첨가 전에 배지를 멸균 또는 소독하기 위한 방법 또는 장치를 이용하여 세포 배양 배지가 처리될 수 있다. 세포 배양 배지는 고온단시간(high temperature short time: HTST)을 이용하여 처리될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,420,183호 참조). 세포 배양 배지는 여과와 조합하여 UV를 이용하여 처리될 수 있다(예를 들어, WIPO 공개 WO 2008/157247; WO 2012/115874; WO 2013/063298 및 WO 2013/138159 참조). 세포 배양 배지에 나노여과가 실시될 수 있다(예를 들어, 문헌[Liu et al., (2000) Biotechnol. Prog. 16:425-434] 참조). 세포 배양 배지는 바이러스를 비활성화시키는 화학물질, 예컨대 용매, 세정제, 소랄렌 또는 베타-프로피오락톤으로 처리될 수 있다.
세포
본 발명에서 사용되는 세포주(또한 "숙주 세포"로서 지칭됨)는 상업적 또는 과학적 관심 대상의 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 유전자 조작된다. 세포주는 전형적으로 비제한 시간 동안 배양물에서 유지될 수 있는 1차 배양물로부터 생긴 계통으로부터 유래된다. 예를 들어, 형질전환, 형질감염, 감염 또는 주사, 발현 벡터(작제물), 예컨대 플라스미드 등을 통해, 배양 공정에서 발현 및 생성을 위한 단백질을 암호화하는 암호 서열, 또는 이의 일부를 보유하는 세포가 도입될 수 있다. 이러한 발현 벡터는 삽입된 암호 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소를 함유한다. 당업자에게 잘 알려져 있고 당업자에 의해 실행되는 방법은 생성된 단백질 및 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 함유하는 발현 벡터뿐만 아니라 적절한 전사 및 번역 제어 요소를 구성하는 데 사용될 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기법은 문헌[J. Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4th edition Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. 또는 임의의 이전의 판; F. M. Ausubel et al., 2013, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 또는 임의의 이전의 판; Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990]에 기재되어 있으며, 이들 모두는 임의의 목적을 위해 본 명세서에 포함된다.
동물 세포, 포유류 세포, 배양 세포, 동물 또는 포유류 숙주 세포, 숙주 세포, 재조합 세포, 재조합 숙주 세포 등은 본 발명의 공정에 따라 배양될 수 있는 세포에 대한 모든 용어이다. 이러한 세포는 전형적으로 포유류로부터 얻은 또는 유래된 세포주이고, 적절한 영양소 및/또는 다른 인자, 예컨대 본 명세서에 기재된 것을 함유하는 배지에서 단층 배양물 또는 현탁 배양물 중에 위치될 때 성장 및 생존할 수 있다. 단백질을 발현 및 분비할 수 있거나, 또는 다량의 특정 단백질, 더 구체적으로는 관심 대상의 당 단백질을 배양 배지로 발현 및 분비하도록 분자적으로 공학 처리될 수 있는 세포가 전형적으로 선택된다. 숙주 세포에 의해 생성된 단백질은 숙주 세포에 대해 내인성이거나 또는 상동성일 수 있다는 것이 이해될 것이다. 대안적으로, 단백질은 숙주 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 숙주 세포에 의해 생성 및 분비된 인간 단백질에 대해 이종성, 즉, 외래이다. 추가적으로, 포유류 단백질, 즉, 본래 포유류 유기체로부터 얻어지거나 또는 유래된 것은 본 발명의 방법에 의해 달성되고, 세포에 의해 배양 배지로 분비될 수 있다.
본 발명의 방법은 다양한 세포의 배양에서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 배양 세포는 진핵 세포, 예컨대 식물 및/또는 동물 세포이다. 상기 세포는 포유류 세포, 어류 세포, 곤충 세포, 양서류 세포 또는 조류 세포일 수 있다. 배양물에서 성장에 적합한 매우 다양한 포유류 세포주는 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection)(버지니아주 매너서스에 소재) 및 다른 기탁소뿐만 아니라 상업적 판매회사로부터 입수 가능하다. 본 발명의 공정에서 사용될 수 있는 세포는 MK2.7 세포, PER-C6 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 예컨대 CHO-K1(ATCC CCL-61), DG44(문헌[Chasin et al., 1986, Som . Cell Molec . Genet., 12:555-556; Kolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36:10901-10909]; 및 WO 01/92337 A2), 디하이드로폴레이트 환원효소 음성 CHO 세포(CHO/-DHFR, Urlaub and Chasin, 1980, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 77:4216), 및 dp12.CHO 세포(미국 특허 제5,721,121호); 원숭이 신장 세포(CV1, ATCC CCL-70); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포(COS 세포, COS-7, ATCC CRL-1651); HEK 293 세포, 및 Sp2/0 세포, 5L8 하이브리도마 세포, 다우디(Daudi) 세포, EL4 세포, 헬라(HeLa) 세포, HL-60 세포, K562 세포, 주카트(Jurkat) 세포, THP-1 세포, Sp2/0 세포, 1차 상피 세포(예를 들어, 케라틴 세포, 자궁경부 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포 및 망막 상피 세포) 및 확립된 세포주 및 그들의 균주(예를 들어, 인간 배아 신장 세포(예를 들어, 293 세포, 또는 현탁 배양물에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol ., 36:59); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL-10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, 1980, Biol . Reprod ., 23:243-251); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL-2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL-34); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL-75); 인간 간세포암 세포(HEP-G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562, ATCC CCL-51); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL-1442); TRI 세포(Mather, 1982, Annals NY Acad . Sci ., 383:44-68); MCR 5 세포; FS4 세포; PER-C6 망막 세포, MDBK(NBL-1) 세포, 911 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, BeWo 세포, 창(Chang) 세포, 디트로이트 562 세포, 헬라(HeLa) 229 세포, 헬라 S3 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LS 180 세포, LS 174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI 2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK2 세포, 클론 M-3 세포, 1-10 세포, RAG 세포, TCMK-1 세포, Y-1 세포, LLC-PK1 세포, PK(15) 세포, GH1 세포, GH3 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MH1C1 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포, 및 TH-I, B1 세포, 또는 이들의 유도체), 임의의 조직 또는 기관으로부터의 섬유아세포(심장, 간, 신장, 결장, 장, 식도, 위, 신경 조직(뇌, 척수를 포함하지만, 이들로 제한되지 않음), 폐, 혈관 조직(동맥, 정맥, 모세혈관), 림프조직(림프샘, 아데노이드, 편도, 골수 및 혈액), 비장 및 섬유아세포 및 섬유아세포-유사 세포주(예를 들어, TRG-2 세포, IMR-33 세포, Don 세포, GHK-21 세포, 시트룰린혈증 세포, 뎀프세이(Dempsey) 세포, 디트로이트(Detroit) 551 세포, 디트로이트 510 세포, 디트로이트 525 세포, 디트로이트 529 세포, 디트로이트 532 세포, 디트로이트 539 세포, 디트로이트 548 세포, 디트로이트 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, MiCl1 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, 아프리카 그린 원숭이 신장 세포(베로(VERO)-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C3H/IOTI/2 세포, HSDM1C3 세포, KLN205 세포, 맥코이(McCoy) 세포, 마우스 L 세포, 균주 2071(마우스 L) 세포, L-M 균주(마우스 L) 세포, L-MTK(마우스 L) 세포, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포, 스위스/3T3 세포, 인디안 문탁(Indian muntac) 세포, SIRC 세포, CII 세포, 및 젠센(Jensen) 세포 또는 이들의 유도체) 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 세포 유형을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
세포는 접착제, 단일층 또는 현탁 배양물, 형질감염, 및 단백질, 예를 들어, 항체의 발현에 적합할 수 있다. 세포는 회분배양, 유가배양 및 관류배양 또는 연속적 배양 방법에 의해 사용될 수 있다.
세포 배양 유형
이해의 목적을 위해, 또한 제한 없이, 단백질 생성을 위한 세포 배양 및 배양 실행은 3가지 일반적인 유형, 즉, 회분 또는 장기간 회분 배양, 유가 배양, 관류 배양 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다. 회분 배양에서, 세포는 처음에 배지에서 배양되고, 이 배지는 제거, 대체 또는 보충되지 않으며, 즉, 세포는 배양 실행 동안 또는 배양 시작 전에 신선한 배지로 "공급"되지 않는다. 목적으로 하는 생성물은 배양 실행의 마지막에 채취된다.
유가 배양을 위해, 배양 실행 시간은 실행 동안 새로운 배지를 이용하여 1회 이상(또는 연속적으로) 배양 배지를 보충함으로써 증가되고, 즉, 세포는 배양 기간 동안 새로운 배지("공급 배지")로 "공급"된다. 유가 배양은 다양한 공급 요법 및 횟수, 예를 들어, 매일, 격일로, 2일마다 등, 1일당 1회 초과 또는 1일당 1회 미만 등을 포함할 수 있다. 추가로, 유가 배양은 공급 배지에 의해 연속적으로 공급될 수 있다. 이어서, 목적으로 하는 생성물이 배양/생성 실행의 마지막에 채취될 수 있다.
때때로 연속 배양으로서 지칭되는 관류 배양은 세포 배양이 새로운 관류 배지를 수용하며, 소모 배지가 실행 동안 생물반응기로부터 제거되는 것이다. 새로운 배지의 세포 배양물 내로의 관류 및 소모 배지의 제거는 연속적, 단계적 또는 이들 중 임의의 또는 모두의 조합일 수 있다. 관류 속도는 1 미만의 작업 용적/일 내지 다수의 작업 용적/일의 범위일 수 있다.
용어 "관류 유속"은 주어진 시간에 일부분 또는 다수 용적의 작업 용적으로서 전형적으로 표현되는 생물반응기로부터 통과된(첨가 및 제거된) 배지의 양이다. 관류 유속은 세포 배양 실행의 지속기간에 걸쳐 다를 수 있다. "작업 용적"은 세포 배양을 위해 사용되는 생물반응기 용적의 양을 지칭한다. 일 실시형태에서, 관류 유속은 1 이하의 작업용적/일이다. 관류 공급 배지는 관류 유속을 최소화하기 위해 관류 영양소 농도를 최대화하도록 제형화될 수 있다.
바람직하게, 세포는 배양물에서 보유되고, 제거된 소모 배지는 실질적으로 세포가 없거나 배양물보다 세포가 상당히 더 적다. 세포 배양에 의해 발현되는 재조합 단백질은 또한 이후의 채취 동안 배양물에서 보유될 수 있거나 또는 소모 배지에 의해 제거될 수 있다.
관류는 원심분리, 침강 또는 여과를 포함하는 다수의 수단에 의해 달성될 수 있다, 예를 들어 문헌[Voisard et al., (2003), Biotechnology and Bioengineering 82:751-65] 참조. 일 실시형태에서, 여과 방법이 사용된다. 필터는 막 필터, 세라믹 필터 및 금속 필터를 포함하고, 나권형 또는 관형을 포함하는 임의의 형상이거나 또는 시트 형태일 수 있다. 하나 이상의 필터는 직렬로 또는 병렬로 함께 또는 독립적으로 생물반응기와 유체 연통하도록 연결될 수 있다.
중공 섬유 필터는 세포 및/또는 재조합 단백질 체류를 위한 포유류 세포 관류 배양에서 사용될 수 있다. 세포 배양 배지, 세포(전체 및 용해), 가용성 발현 재조합 단백질, 숙주 세포 단백질, 폐생성물 등을 포함하는 세포 배양물을 기공 크기 또는 분자량 컷오프(MWCO)에 따라서 필터에 도입할 때, 중공 섬유 물질은 내강측(내면) 상에 특정 세포 배양 성분을 보유하고, 중공 섬유 물질의 기공 크기 또는 분자량 컷오프에 기반하여 특정 성분이 필터를 통과(침투)하게 할 수 있다. 보유(체류)된 물질은 생물반응기로 복귀된다. 새로운 관류 세포 배양 배지가 생물반응기에 첨가되며, 침투물은 목적으로 하는 또는 일정한 생물반응기 용적을 유지하기 위해 사전 결정된 간격으로 또는 연속적으로 필터로부터 회수된다. 침투물은 폐기되거나, 보유 탱크, 백(bag) 또는 토트(tote)에 저장되거나, 또는 다른 단위 작업, 예컨대 여과, 응집, 원심분리 및/또는 다른 하류 정제 방법 등에 직접적으로 전달될 수 있다. 마이크로여과를 위한 중공 섬유는 전형적으로 기공 크기가 0.1㎛ 내지 5 내지 10㎛ 또는 분자량 컷오프 500kDa 이상의 범위이며, 단백질이 침투물 내로 통과하도록 사용될 수 있다. 한외여과 중공 섬유는 전형적으로 기공 크기가 0.01㎛ 내지 0.1㎛ 또는 분자량 컷오프 300kDa 이하의 범위이며, 체류물 중에서 목적으로 하는 단백질을 보유하기 위해 그리고 생물반응기에 그것을 복귀시키기 위해 사용될 수 있다. 이는, 예를 들어, 채취를 위한 재조합 단백질 생성물을 농축시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 필터는 잼플러(Xampler) UFP-750-E-4MA, 잼플러 UFP-30-E-4MA(펜실베니아주 피츠버그에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare)) 및 미디크로스(Midikros) TC 모듈 T02-E030-10, T02-050-10, T02-E750-05, T02-M10U-06(캘리포니아주 도밍게스에 소재한 스펙트럼 래버러토리즈 인코포레이티드(Spectrum Laboratories, Inc))와 같이 상업적으로 입수 가능하다.
세포 배양물은 펌핑 시스템에 의해 생물반응기 밖으로 그리고 필터 내로 회수될 수 있는데, 이는 세포 배양물을 중공 섬유의 내강측을 통해 통과시킨다. 세포 펌핑 시스템의 예는 연동 펌프, 이중 격막 펌프, 저전단 펌프(레비트로닉스(Levitronix)(등록상표) 펌프, 스위스 취리히에 소재) 및 교번 접선 유동 시스템(ATF(상표명), 뉴욕주 파인 브룩에 소재한 리파인 테크놀로지(Refine Technology), 예를 들어, 미국 특허 제6,544,424호; 문헌[Furey (2002) Gen. Eng. News. 22 (7), 62-63] 참조)을 포함한다. 침투물은 연동 펌프의 사용에 의해 필터로부터 회수될 수 있다. 바람직한 실시형태에서 관류는 교번 접선 유동 시스템의 사용에 의해 달성된다.
세포 배양 공정
세포 배양은 동물 또는 포유류 세포 배양을 위해 통상적으로 사용되는 배양 용기 및/또는 배양 장치를 이용하여 재조합 단백질의 소규모 내지 대규모 생산을 위한 조건 하에서 수행될 수 있다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 조직 배양 접시, T-플라스크 및 스피너 플라스크는 전형적으로 실험실 규모로 사용된다. 배양을 위해, 대규모 장비, 예컨대 이하로 제한되는 것은 아니지만, 발효기형 탱크 배양 장치, 에어 리프트형 배양 장치, 유동층 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 롤러 보틀 배양, 교반 탱크 생물반응기 시스템, 충전층형 배양 장치 및 단일 사용 일회용 백 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 적합한 장치가 사용될 수 있다. 마이크로운반체는 롤러 보틀 또는 교반 탱크 생물반응기 시스템과 함께 사용될 수 있다. 시스템은 회분, 유가 또는 관류/연속 방식으로 작동될 수 있다. 추가로, 배양 장치 또는 시스템은 필터, 중력, 원심력 등을 이용하는 추가적인 장치, 예컨대 세포 분리기를 구비할 수 있다.
재조합 단백질의 생성은 다중상 배양 공정으로 행해질 수 있다. 다중상 공정에서, 세포는 2 이상의 별도의 상으로 배양된다. 예를 들어, 세포는 세포 증식 및 생존도를 최대화하는 환경 조건 하에 하나 이상의 성장기에서 처음 배양될 수 있고, 이어서 단백질 생성을 최대화하는 조건 하에서 생성기로 전이될 수 있다. 포유류 세포에 의한 재조합 단백질의 생성을 위한 상업적 공정에서, 최종 생성 배양에 앞서는 상이한 배양 용기(N-x 내지 N-1)에 일어나는 통상적으로 다수의, 예를 들어, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 성장기가 있다. 성장 및 생성기는 하나 이상의 전이기에 선행하거나 또는 하나 이상의 전이기에 의해 분리될 수 있다. 생성기는 대규모로 수행될 수 있다.
용어 세포 배양의 "성장기"는 세포가 일반적으로 빠르게 분화하는 기하급수적인 세포 성장 기간(즉, 대수기)을 지칭한다. 세포는 약 1일, 또는 약 2일, 또는 약 3일, 또는 약 4일, 또는 4일 초과의 기간 동안 성장기에서 유지된다. 세포가 성장기에 유지되는 지속 시간은, 예를 들어 세포 유형 및/또는 세포 성장 속도 및/또는 배양 조건에 기반하여 다를 것이다.
용어 "전이기"는 성장기와 생성기 사이의 시간 기간을 지칭한다. 일반적으로, 전이기는 배양 조건이 성장기로부터 생성기까지의 이동을 지원하도록 제어될 수 있는 동안의 시간이다. 제어될 수 있는 다양한 세포 배양 매개변수는 온도, pH, 삼투압몰농도, 비타민, 아미노산, 당, 펩톤, 암모늄 염 등 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 세포 배양의 "생성기"는 세포 성장이 안정기에 있는 시간 기간을 지칭한다. 대수 세포 성장은 전형적으로 이 단계 전에 또는 동안에 끝나고, 단백질 생성이 우세해진다. 유가 배양 및 관류 세포 배양 공정은 이 단계에서 목적으로 하는 세포 밀도, 생존도 및 생성물 역가를 달성 및 유지하기 위해 세포 배양 배지를 보충하거나 또는 새로운 배지를 제공한다. 생성기는 대규모로 수행될 수 있다. 대규모 세포 배양은 적어도 약 100, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 8000, 10,000, 15,000, 20,000리터의 용적에서 유지될 수 있다. 본 발명의 실시형태에서, 생성기는 500ℓ, 1000ℓ 및/또는 2000ℓ 생물반응기에서 수행된다.
전형적으로 최종 생성 배양에 선행하는 세포 배양은 2개의 선행 단계, 파종 및 접종 트레인을 통과한다. 파종 트레인 단계(N-X)는 세포는 수가 빠르게 확장되는 소규모로 일어난다. 접종 트레인 단계(N-1)에서, 세포는 생성 생물반응기를 위한 접종물, 에컨대 적어도 0.5 x 106개 세포/㎖의 접종물을 생성하기 위해 추가로 확장된다. 파종 및 N-1 트레인은 임의의 배양 방법, 전형적으로 회분 세포 배양에 의해 생성될 수 있다. 0.5 x 105개 세포/㎖ 이상의 N-1 세포 밀도가 생성 생물반응기의 파종에 전형적이다. 더 높은 N-1 세포 밀도는 생성 생물반응기에서 목적으로 하는 세포 밀도에 도달하는데 필요한 시간을 감소 또는 심지어 제거할 수 있다. 더 높은 N-1 세포 밀도를 달성하기 위한 바람직한 방법은 교번 접선 유동 여과를 이용하는 관류 배양이다. 교번 접선 유동 여과를 이용하는 관류 공정에 의해 성장된 N-1 세포 배양은 임의의 목적으로 하는 밀도, 예컨대 90 x 106개 초과 세포/㎖의 밀도로 세포를 제공할 수 있다. N-1 세포 배양은 단일 볼루스 접종 배양물을 생성하기 위해 사용될 수 있거나 또는 다중 생성 생물반응기를 접종하기 위해 유지되는 롤링 파종 저장 배양물로서 사용될 수 있다. 접종 밀도는 생성된 재조합 단백질 수준에 대해 긍정적 영향을 가질 수 있다. 접종 밀도가 증가함에 따라 생성물 수준은 증가하는 경향이 있다. 역가의 개선은 더 높은 접종 밀도에 구속될 뿐만 아니라, 생성에 놓이는 세포의 대사 및 세포 주기 상태에 의해 영향 받을 가능성이 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 세포 배양은 생물반응기를 적어도 0.5 x 106개 세포/㎖로 접종함으로써 확립된다.
용어 "세포 밀도"는 주어진 용적의 배양 배지에서 세포 수를 지칭한다. "생세포 밀도"는 표준 생존도 분석(예컨대 트립판 블루 염료 배제 방법)에 의해 결정한 바와 같은 주어진 용적의 배양 배지에서의 생세포 수를 지칭한다. "충전 세포 용적"(PCV%)으로도 지칭되는 용어 "충전 세포 용적"(PCV)은 백분율로서 표현되는 세포에 의해 점유되는 용적 대 세포 배양의 총 용적의 비이다(문헌[Stettler, et al., (2006) Biotechnol Bioeng. Dec 20:95(6):1228-33] 참조). 충전 세포 용적은 세포 밀도 및 세포 직경의 함수이며; 충전 세포 용적의 증가는 세포 밀도 또는 세포 직경 중 하나 또는 둘 다의 증가로부터 생길 수 있었다. 충전 세포 용적은 세포 배양물 내 고체 수준의 측정이다.
세포 배양 제어
본 발명의 방법에 적합한 세포 배양 조건은 pH, 용존 산소(O2) 및 이산화탄소(CO2), 교반 및 습도, 및 온도를 주의하여, 세포의 회분, 유가 또는 관류(연속) 배양을 위해 전형적으로 사용되고, 알려진 것 또는 해당 방법의 임의의 조합이다. 재조합 단백질 생성 동안, 세포가 목적으로 하는 시간 동안 또는 목적으로 하는 밀도로 성장되는 제어 시스템을 갖는 것이 바람직하며, 이어서, 세포의 생리적 상태는, 세포가 에너지 및 기질을 사용하여 세포 밀도 증가에 바람직한 재조합 단백질을 생성하는 성장-제한 또는 저지된, 고생산성 상태로 전환된다. 상업적 규모 세포 배양 및 생물학적 치료제의 제조를 위해, 세포 성장을 제한 또는 저지하는 능력 또는 생성기 동안 성장-제한 또는 저지된 상태에서 세포를 유지할 수 있는 능력이 매우 바람직하다. 이러한 방법은, 예를 들어, 온도 이동, 단백질 생성의 화학적 유도자의 사용, 영양소 제한 또는 기아 및 세포 주기 저해제를 단독으로 또는 조합하여 포함한다.
성장을 제한 또는 저지하는 하나의 이러한 메커니즘은 세포 배양 동안 온도를 이동시키는 것이다. 온도 이동은 세포 배양 동안 임의의 시간에 일어날 수 있다. 성장기는 생성기보다 고온에서 일어날 수 있다. 세포 배양은 약 35℃ 내지 약 38℃의 제1 온도 설정점에서 실행될 수 있고, 이어서, 온도는 약 29℃ 내지 약 37℃, 선택적으로 약 30℃ 내지 약 36℃ 또는 약 30℃ 내지 약 34℃의 제2 온도 설정점으로 이동될 수 있다. 일 실시형태에서, 온도 이동은 성장기와 생성기 사이의 전이 동안 일어날 수 있다. 다른 실시형태에서, 온도 이동은 생성기 동안 일어날 수 있다.
온도 설정점의 전환은 수동으로 행해질 수 있거나 또는 생물반응기 제어 시스템을 사용하게 함으로써 자동으로 행해질 수 있다. 온도 설정점은 사전결정된 시간에 또는 하나 이상의 배지 성분의 하나 이상의 세포 배양 매개변수, 예컨대 세포 밀도, 역가 또는 농도에 반응하여 전환될 수 있다. 하나의 이러한 방법은 목적으로 하는 세포 밀도에 도달될 때 온도 설정점 변화를 촉발하기 위해 생물반응기 제어 시스템 내로 도입되는 온라인 바이오매스 모니터링 도구를 이용한다. 예를 들어, 용량 기반 바이오매스 프로브는 온라인 세포 밀도 추정을 위해 사용될 수 있고, 온라인 측정으로부터의 데이터는 생물반응기 온도의 이동을 촉발하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 용량 기반 프로브는 포갈(Fogale) 용량 센서(DN12-200)(프랑스 님에 소재)를 포함한다.
단백질 생성의 화학적 유도자, 예컨대 카페인, 뷰티레이트 및/또는 헥삼에틸렌 비스아세트아마이드(HMBA)는 온도 이동과 독립적으로, 또는 동시에 첨가될 수 있다. 유도자가 온도 이동 후에 첨가된다면, 그들은 온도 이동 후 1시간 내지 5일, 선택적으로 온도 이동 후 1 내지 2일에 첨가될 수 있다. 이어서, 세포 배양은 며칠 또는 심지어 몇 주 동안 유지될 수 있는 반면, 세포는 목적으로 하는 단백질(들)을 생성할 수 있다.
세포를 목적으로 하는 생리 상태로 유지하기 위한 다른 방법은 낮은 L-아스파라긴 조건에 대한 세포 배양의 노출에 의해 세포 성장 저지를 유도하는 것이다(예를 들어, WIPO 공개 번호 WO2013/006479 참조). 세포 배양물 중의 L-아스파라긴 농도의 제한 및 L-아스파라긴의 낮은 농도 유지를 포함하는 세포 성장 저지가 배양 배지를 통해 달성 및 유지될 수 있다. 세포를 성장 저지 상태에서 유지하기 위해 L-아스파라긴 농도를 5mM 이하에서 유지하는 것이 사용될 수 있다.
세포 주기 진행 및 관련된 전사 과정, DNA 수선, 분화, 노화 및 이와 관련된 세포자멸사를 조절하는 것으로 알려지거나 또는 의심되는 화합물인 세포 주기 저해제는 또한 세포 성장-저지를 유도하는 데 유용하다. 사이클린-의존적 키나제(cyclin-dependent kinase: CDK)와 같은 주기 기작과 상호작용하는 세포 주기 저해제는 다른 경로, 예컨대 AKT, mTOR 및 세포 주기에 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 미치는 다른 경로로부터의 단백질과 상호작용하는 해당 분자로서 유용하다.
채취 및 정제
발현된 재조합 단백질은 그들이 회수 및/또는 수집될 수 있는 배양 배지에 분비될 수 있다. 이어서, 재조합 단백질에 채취, 정제, 내독소 및/또는 바이러스 비활성화/여과, 및/또는 한외여과/정용 여과를 포함하는 하나 이상의 처리 단계가 실시될 수 있다.
발현된 재조합 단백질은 채취 침투물에서 포획될 수 있다. 단백질은 당업계에 공지되어 있고/있거나 상업적 판매업자로부터 입수 가능한 공정 및 상업적으로 입수 가능한 제품을 이용하여 채취 침투물로부터 정제 또는 부분적으로 정제될 수 있다. 이러한 방법은 다른 이용 가능한 방법 중에서도 응집; 원심분리; 침투; 여과 방법, 예컨대 심층 여과; 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 혼합 방식 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 수산화인회석 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피 방법을 포함한다.
이어서, 정제 단백질은 "제형화"될 수 있는데, 이는 최종 사용자에 대해 완충제 교환, 멸균, 벌크 패키징 및/또는 패키징될 수 있다. 약제학적 조성물에 적합한 제형은 당업계에 공지되어 있고, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA]에 기재된 것을 포함한다.
공정 분석 기법
공정 분석 기법 및 방법은 재조합 단백질 및 생성 공정의 특징을 정량적으로 및/또는 정성적으로 모니터링하기 위해 세포 배양 및 정제 공정 동안 취해진 샘플을 모니터링하고 평가하기 위해 이용 가능하다. 이 실시간 또는 인라인 정보는 시기적절하게 결정하고 필요하다면 공정을 변형하기 위해 생성물 및 생성 매개변수, 예컨대 역가, 세포 밀도; 생성물 품질 속성, 예컨대 번역후 변형; 생성물 또는 공정 가변성, 예컨대 불순물 등을 모니터 및/또는 제어하기 위해 사용될 수 있다.
상류 세포 배양 공정 또는 하류 정제 공정의 각각의 단계는 사전 설정한 표적 및 범위로 특정 생성물 품질 속성(PQA)의 양에 관한 정보를 제공하기 위해 그리고 이 PQA를 제어하기 위해 모니터링될 수 있다.
샘플은 간헐적으로, 목적으로 하는 빈도로 또는 연속적으로 취할 수 있다. 샘플은 실시간으로 또는 거의 실시간으로 분석될 수 있거나 또는 이후의 분석을 위해 저장될 수 있다. 이 정보는 상류 및 하류 공정 동안의 변화를 제어하기 위해 사용될 수 있다.
생성물 품질 속성의 검출은 질량 분석법, UV 및/또는 질량 분석법 검출과 함께 액체 크로마토그래피 및 모세관 전기이동 등을 이용하여 행해질 수 있다.
이들 공정은 구체화된 생성물 품질 속성 수준에 의해 결정하여 수동 또는 자동 공정 조절, 예컨대 공급물, 온도, 공정 지속시간에 따라 연속적 모니터링에 적합하게 될 수 있다.
아미노산 가공 및 글리코실화와 같은 번역후 변형의 존재를 검출하기 위한 무손상 질량 분석은 크기 배제 방식으로 작동되고, ESI-MS와 결합된 폴리하이드록시에틸 아스파트아마이드 칼럼을 이용하여 이루어질 수 있다(Brady et al., (2008) J Am Soc Mass Spectro, 19: 502-509).
레이저 광 산란 검출기 및 UV 흡광도를 이용하여 각각의 분획에 대한 정규화된 LS/UV 비를 모니터링하는 것에 의한 이온 교환 크로마토그래피로부터의 용리액의 실시간 모니터링, 미국 특허 공개 제2013-0303732호 참조.
다중 속성 방법은 다양한 데이터베이스 및 검색 플랫폼, 예컨대 시퀘스트(Sequest)(캘리포니아주 라호야에 소재한 더 스크립츠 리서치 인스티튜트(The Scripps Research Institute)), 엑스!탠덤(X!Tandem)(더 글로벌 프로테옴 머신 오가니제이션(The Global Proteome Machine Organization)) 또는 마스코트(Mascot)(매사추세츠주 보스톤에 소재한 매트릭스사이언스(Matrix Science))를 이용하여 탠덤 MS 데이터를 검색 및 특성규명하는데 단일 액체-크로마토그래피/질량 분석(LC/MS)을 사용하게 한다. 낮은 pH에서 이황화물 아이소폼을 유지하고 숙신이미드 변이체를 보호하기 위해 샘플을 높은 pH에서 에서 변성시킬 수 있다. 이어서, 샘플을 환원시키고 나서, 알킬화한 다음, 트립신으로 분해하였다. 이어서, 샘플을 MS(예컨대 Q Exactive(상표명) 혼성 사중극자-오비트랩 질량 분석계(Orbitrap Mass Spectrometer), 매사추세츠주 월섬에 소재한 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fischer Scientific))에 주입하고 나서, 핀포인트(Pinpoint) 소프트웨어(써모 피셔 사이언티픽)를 이용하여 분석을 수행한다. 동정, 정량화 및 모니터링될 수 있는 속성은 이성질화, 탈아민화, 이황화물 환원, 숙주 세포 단백질 오염, 돌연변이, 오편입(misincorporation), 하이드록시라이신, 티오에터, 비-당 분해된 중쇄, C-말단 아마이드화, 잔여 단백질 A는 글리칸을 특성규명하고, 분자 정체를 제공한다. 모니터링한 각각의 속성에 대한 질량 정확도는 예측 질량의 5ppm 미만으로 설정될 수 있다. 펩타이드/속성의 동정은 MS2 단편화 및 직교 특성규명 방법(예를 들어 글리코실화에 대해 HILIC-MS)에 의해 확인된다. 실험적 동위원소 분포는 이론적 동위원소 분포에 비교할 때 0.95보다 더 양호한 내적 스코어를 가져야 한다. 체류 시간 창은 각각의 속성에 대해 설정하며, 각각의 속성에 대한 모든 검출 가능한 전하 상태는 정량화를 위해 고려된다. 속성의 변화를 검출하는 기준이 정해진다. 예를 들어, 탈아미노화는 탈아민 값(탈아미노화 펩타이드를 탈아미노 펩타이드와 비변형 모 펩타이드의 합으로 나누고 100을 곱한 것)을 결정함으로써 모니터링될 수 있다. 글리코실화는 각각의 특정 글리칸을 모든 검출 가능한 글리칸에 비교함으로써 모니터링될 수 있다.
단백질
본 명세서에서 사용되는 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 전체적으로 상호 호환적으로 사용되며, 펩타이드 결합에 의해 서로 결합되는 2 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 또한 당단백질을 초래하는 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카복실화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 변형을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "당단백질"은 만노스 잔기를 포함하는 적어도 하나의 올리고당 측쇄를 갖는 펩타이드 및 단백질을 지칭한다. 당단백질은 숙주 세포에 대해 상동성일 수 있거나, 또는 이용되는 숙주 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 숙주 세포에 의해 생성되는 인간 당단백질에 대해 이종성, 즉, 외래일 수 있다. 이러한 당단백질은 일반적으로 "재조합 당단백질"로서 지칭된다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포에 의해 발현되는 당단백질은 배지 내로 직접 분비된다.
단백질계 약물을 포함하는 단백질에 과학적 또는 상업적 관심이 있을 수 있다. 단백질은 특히 항체 및 융합 단백질을 포함한다. 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 세포 배양 방법을 이용하여 재조합 동물 세포주에 의해 생성될 수 있고, "재조합 펩타이드", "재조합 폴리펩타이드", "재조합 단백질", "재조합 당단백질"로서 지칭될 수 있다. 발현 단백질(들)은 세포내로 생성될 수 있거나 또는 그것이 회복 및/또는 수집될 수 있는 배양 배지 내로 분비될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 유리하게 생성될 수 있는 포유류 단백질의 비제한적 예는 다음의 단백질 중 모두 또는 하나와 동일한 또는 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함한다: 종양 괴사 인자(TNF), flt3 리간드(WO 94/28391), 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 칼시토닌, IL-2, 앤지오포이에틴-2 (Maisonpierre et al. (1997), Science 277(5322): 55-60), NF-카피 B의 수용체 활성체에 대한 리간드(RANKL, WO　01/36637), 종양 괴사 인자(TNF)-관련 세포자멸사-유도 리간드(TRAIL, WO 97/01633), 흉선 기질-유래 림포포이에틴, 과립구 집락 자극 인자, 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF, 호주 특허 제588819호), 비만세포 성장 인자, 줄기 세포 성장 인자(미국 특허 제6,204,363호), 상피 성장 인자, 케라틴세포 성장 인자, 대핵세포 성장 및 발생 인자, RANTES, 인간 피브리노겐-유사 2 단백질(FGL2; NCBI 수탁 번호 NM_00682; Ruegg and Pytela (1995), Gene 160:257-62) 성장 호르몬, 인슐린, 인슐리노트로핀, 인슐린-유사 성장 인자, 부갑상선 호르몬, α-인터페론, γ-인터페론, 및 공통 인터페론을 포함하는 인터페론(미국 특허 제4,695,623호 및 제4,897471호), 신경 성장 인자, 뇌-유래 신경성장인자, 시냅토태그민-유사 단백질(SLP 1-5), 뉴로트로핀-3, 글루카곤, 인터류킨, 집락 자극 인자, 림포톡신-β, 백혈병 저해 인자, 및 온코스타틴-M. 본 발명에 따라 생성될 수 있는 단백질의 설명은, 예를 들어, 문헌[Human Cytokines : Handbook for Basic and Clinical Research, all volumes (Aggarwal and Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay and Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993); 및 The Cytokine Handbook, Vols . 1 and 2 (Thompson and Lotze eds., Academic Press, San Diego, CA, 2003)]에서 찾을 수 있다.
추가적으로, 본 발명의 방법은 임의의 상기 언급한 단백질에 대한 수용체의 아미노산 서열의 모두 또는 부분을 포함하는 단백질, 이러한 수용체에 대한 길항제 또는 임의의 상기 언급한 단백질 및/또는 이러한 수용체 또는 길항제와 실질적으로 유사한 단백질을 생성하는 데 유용할 것이다. 이들 수용체와 길항제는 둘 다 종양 괴사 인자 수용체(p55 및 p75로서 지칭되는 TNFR, 미국 특허 제5,395,760호 및 미국 특허 제5,610,279호), 인터류킨-1(IL-1) 수용체(I 및 II형; 유럽 특허 제0460846호, 미국 특허 제4,968,607호, 및 미국 특허 제5,767,064호), IL-1 수용체 길항제(미국 특허 제6,337,072), IL-1 길항제 또는 저해제(미국 특허 제5,981,713호, 제6,096,728호 및 제5,075,222호) IL-2 수용체, IL-4 수용체(유럽 특허 제0 367 566호 및 미국 특허 제5,856,296호), IL-15 수용체, IL-17 수용체, IL-18 수용체, Fc 수용체, 과립구-대식세포 집락 자극 인자 수용체, 과립구 집락 자극 인자 수용체, 온코스타틴-M 및 백혈병 저해 인자에 대한 수용체, NF-카파 B의 수용체 활성체(RANK, WO 01/36637 및 미국 특허 제6,271,349), 오스테오프로테게린(미국 특허 제6,015,938호), TRAIL에 대한 수용체(TRAIL 수용체 1, 2, 3 및 4를 포함), 및 Fas 또는 세포자멸사-유도 수용체(AIR)와 같은 사멸 도메인을 포함하는 수용체의 형태를 포함한다.
본 발명을 이용하여 생성될 수 있는 다른 단백질은 분화 항원의 아미노산 서열의 모두 또는 부분을 포함하는 단백질(CD 단백질로서 지칭됨) 또는 이들의 리간드 또는 이들 중 하나와 실질적으로 유사한 단백질을 포함한다. 이러한 항원은 문헌[Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., eds., Kobe, Japan, 1996)]에 개시되어 있다. 유사한 CD 단백질이 후속 작업에 개시되어 있다. 이러한 항원의 예는 CD22, CD27, CD30, CD39, CD40 및 이에 대한 리간드(CD27 리간드, CD30 리간드 등)를 포함한다. 몇몇 CD 항원은 41BB 및 OX40을 또한 포함하는 TNF 수용체 패밀리의 구성원이다. 리간드는 종종 41BB 리간드 및 OX40 리간드와 같은 TNF 패밀리의 구성원이다.
효소적으로 활성인 단백질 또는 그들의 리간드가 또한 본 발명을 이용하여 생성될 수 있다. 예는 다음의 단백질 중 하나의 모두 또는 부분을 포함하는 단백질 또는 이들 중 하나와 실질적으로 유사한 리간드 또는 단백질을 포함한다: TNF-알파 전환 효소를 포함하는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 도메인 패밀리 구성원, 다양한 키나제, 글루코세레브로시다제, 수퍼옥사이드 디스무타제, 조직 플라스미노겐 활성체, 인자 VIII, 인자 IX, 아포지질단백질 E, 아포리포단백질 A 내지 I, 글로빈, IL-2 길항제, 알파-1 안티트립신, 임의의 상기 언급한 효소에 대한 리간드 및 수많은 다른 효소 및 그들의 리간드.
용어 "항체"는 달리 구체화되지 않는 한, 인간, 인간화된, 키메라, 다중 특이성, 단클론성, 다클론성 및 올리고머 또는 이들의 항원 결합 단편을 포함하는 특정 결합을 위한 무손상 항체와 경쟁하는 임의의 아이소타입 또는 하위부류의 글리코실화된 면역글로불로빈과 비글리코실화된 면역글로불린 둘 다에 또는 이들의 항원 결합 영역에 대한 언급을 포함한다. 또한 항원 결합 단편 또는 영역, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 다이어바디, Fd, dAb, 맥시바디, 단일쇄 항체 분자, 상보성 결정 영역(CDR) 단편, scFv, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디 및 표적 폴리펩타이드에 대한 특정 항원 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린의 적어도 일부를 함유하는 폴리펩타이드를 갖는 단백질이 포함된다. 용어 "항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 것, 예컨대 항체를 발현시키기 위해 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
항체의 예는 상기 언급한 단백질 및/또는 다음의 항원을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 하나 또는 단백질들의 조합을 인식하는 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD32, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, IL-12 p35 서브유닛, IL-13, IL-21, IL-23, IL-23 p19 서브유닛, IL-12/IL-23 공유 p40 서브유닛, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-13 수용체, IL-17 수용체, IL-18 수용체 서브유닛, FGL2, PDGF-β 및 이들의 유사체(미국 특허 제5,272,064호 및 제5,149,792호), B7RP-1, B7RP-2, VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-β1, c-fms, EGF 수용체(미국 특허 제6,235,883호), CGRP 수용체, VEGF 수용체, 간세포 성장 인자, 전구단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9형(PCSK9), FGF21, 오스테오프로테그린 리간드, 인터페론 감마, EGFRvIII, B 림프구 자극제 (BlyS, 또한 BAFF, THANK, TALL-1 및 zTNF4로서 알려짐; 문헌[Do and Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13(1): 19-25), ST2, C5 상보체, IgE, 종양 항원 CA125, 종양 항원 MUC1, PEM 항원, LCG(폐암과 관련하여 발현된 유전자 산물임), HER-2, HER-3, 종양 관련 당단백질 TAG-72, SK-1 항원, 결장 및/또는 췌장암을 지니는 환자의 혈청에서 상승된 수준으로 존재하는 종양-관련 에피토프, 유방, 결장, 편평상피 세포, 전립선, 췌장, 폐 및/또는 신장암 세포에 대해 및/또는 흑색종, 신경교종 또는 신경아세포종 세포에 대해 발현된 암관련 에피토프 또는 단백질, 종양의 괴사성핵, 인테그린 알파 4 베타 7, 인테그린 VLA-4, B2 인테그린, TSLP, IFNγ, TRAIL 수용체 1, 2, 3 및 4, RANK, RANK 리간드, TNF-α, 부착 분자 VAP-1, 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 세포내 부착 분자-3(ICAM-3), 앤지오포이에틴 1(Ang1), 앤지오포이에틴 2(Ang2), 류코인테그린 어드헤신(adhesin), 혈소판 당단백질 gp IIb/IIIa, 심장 마이오신 중쇄, 부갑상선 호르몬, rNAPc2(인자 VIIa-조직 인자의 저해제), MHC I, 암배아 항원(CEA), 알파-태아단백(AFP), 종양 괴사 인자(TNF), CTLA-4(세포독성 T 림프구-관련 항원), 세포예정사 1(PD-1), 세포예정사 리간드 1(PDL-1), 세포예정사 리간드 2(PDL-2), 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3), T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3(TIM3), Fc-γ-1 수용체, HLA-DR 10 베타, HLA-DR 항원, 스클레로스틴, L-셀렉틴, 호흡기 세포 융합 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), B형 감연 바이러스(HBV), 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphlycoccus aureus). 본 발명의 방법을 이용하여 생성될 수 있는 공지된 항체의 특정 예는 아달리무맙, 알리로쿠맙, 베바시주맙, 인플릭시맙, 압식시맙, 알렘투주맙, 바피네주맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 브리아키누맙, 브로달루맙, 카나키누맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 코나투무맙, 데노수맙, 두필리루맙, 에쿨리주맙, 겜투주맙 구셀쿠맙, 오조가미신, 골리무맙, 이브리투모맙, 익세키주맙, 이플리무맙, 티욱세탄, 라베투주맙, 레브리키주맙, 마파투무맙, 마브리리무맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 모타비주맙, 무로모납-CD3, 니볼루맙, 나탈리주맙, 니모투주맙, 오파투무맙, 오마릴주맙, 오레고보맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨투모맙, 페르투주맙, 펨브롤리주맙, 라니비주맙, 리툭시맙, 로모소주맙, 로벨리주맙, 릴로투무맙, 틸드라키주맙, 토실리주맙, 토시투모맙, 트랄로키누맙, 트라스투주맙, 트레멜리무맙, 유스테키누맙, 베돌리조맙, 잘루투무맙 및 자놀리무맙을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 예를 들어 임의의 상기 언급된 단백질을 포함하는 재조합 융합 단백질을 포함하는 재조합 융합 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 언급한 단백질 중 하나를 포함하는 재조합 융합 단백질 + 다량체화 도메인, 예컨대 류신 지퍼, 또 꼬인 나선, 면역글로불린의 Fc 부분, 또는 실질적으로 유사한 단백질이 본 발명의 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, WO94/10308; 문헌[Lovejoy et al. (1993), Science 259:1288-1293; Harbury et al. (1993), Science 262:1401-05; Harbury et al. (1994), Nature 371:80-83; Hakansson et al.(1999), Structure 7:255-64] 참조. 구체적으로는 이러한 재조합 융합 단백질 중에 수용체의 일부가 에타너셉트(p75 TNFR:Fc) 및 벨라타셉트(CTLA4:Fc)와 같은 항체의 Fc 부분에 융합되는 단백질이 포함된다. 키메라 단백질 및 폴리펩타이드뿐만 아니라 임의의 앞서 언급한 단백질 및 폴리펩타이드의 단편 또는 일부, 또는 돌연변이체, 변이체 또는 유사체가 또한 본 발명의 방법에 의해 생성될 수 있는 적합한 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드에 포함된다. 이는 트레바나닙, 앤지오포이에틴(Ang) 1 및 2 중화 펩티바디를 포함한다. 또한 선택적으로 작용을 발휘하고, 종양 세포에 대해 작용하는 인간 면역계로 향하는 이중 특이성 T 세포 관여항체(bi-specific T-cell engager: BiTE)가 포함된다. 구체적으로는 이러한 BiTE 중에 표적 CD19, 예컨대 블리나투모맙이 포함된다. 다른 분자는 아플리베르셉트를 포함한다.
본 출원에서 사용되는 용어는 당업계에서 표준이지만, 특정 용어의 정의는 청구범위의 의미의 분명함 및 명확함을 보장하기 위해 본 명세서에 제공된다. 단위, 접두사 및 기호는 그들의 SI 허용 형태로 표시될 수 있다. 본 명세서에 인용되는 수치적 범위는 범위를 정하는 숫자를 포함하며, 정해진 범위 내의 각각의 정수를 뒷받침한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 기법은 일반적으로 당업계에 잘 공지된 통상적인 방법에 따라 그리고 달리 표시되지 않는 한, 본 명세서 전체적으로 인용 및 논의되는 다양한 일반적이고 더 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 및 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)] 참조. 특허, 특허 출원, 논문, 책 및 협약을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 본 출원에 인용되는 모든 문헌 또는 문헌의 일부는 본 명세서에서 명확하게 참고로 포함된다. 본 발명의 실시형태에 기재된 것은 본 발명의 다른 실시형태와 조합될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 개개 양상의 단일 예시로서 의도되는 본 명세서에 기재된 특정 실시형태, 및 본 발명의 범주 내의 기능적으로 동등한 방법 및 성분에 의해 범주가 제한되지 않는다. 사실, 본 명세서에 나타내고 기재된 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형은 앞서 언급한 설명 및 수반하는 도면으로부터 당업자에게 명확하게 될 것이다. 이러한 변형은 첨구되는 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
실시예
세포 배양
제0일에, 1500㎖ 작업 용적의 무혈청, 화학적으로 규명된 기본 배지에서 재조합 항-TNFα 항체를 발현하는 CHO 세포를 9.0 x 106개 생세포/㎖로 3ℓ 생물반응기(캘리포니아주 포스터 시티에 소재한 애플리콘사(Applikon))에 접종하였다. 배양을 36℃, 30mmHg에서의 DO, 400RPM에서의 교반에서 유지하였다. 회분 방식으로 세포 배양을 개시하고 나서, 30kDa NFWC GE RTP 중공 섬유 카트리지(펜실베니아주 피츠버그에 소재한 GE 헬스케어)를 구비한 ATF-2(상표명) 교번 접선 유동 여과 시스템(뉴저지주 하노버에 소재한 리파인 테크놀로지즈)을 이용하여 제3일에 관류를 수행하였다. 배지는 황산망간 1수화물 및 황산구리 5수화물을 포함하는 무혈청, 화학적으로 규명된 관류 배지 및 표 1에 기재하는 바와 같은 pH였다. 실험을 2회 중복하여 수행하였다.
pH Mn 2 + (nM) Cu 2 + ( ppb )
6.85 50 10
6.85 50 100
6.85 1000 10
6.85 1000 100
7.0 50 10
7.0 50 100
7.0 1000 10
7.0 1000 100
세포 배양 실행에 걸쳐 관류 속도는 0.3으로부터 1.0 작업 용적/일로 점진적으로 증가되었다. 당일에, 온도는 31℃로 이동되었고, 제17일에 배양물을 채취하였다. 글루코스를 4 내지 8g/ℓ에서 유지하였다.
배양물을 평가하기 위해 샘플을 매일 취하였다. Rapid Lab 1260 기체 분석기(펜실베니아주 말번에 소재한 지멘스(Siemens))을 이용하여 CO2(pCO2) 및 O2(pO2)의 pH 및 분압을 측정하였고; 노바플렉스(NovaFLEX)(매사추세츠주 월섬에 소재한 노바 바이오메디칼(Nova Biomedica))을 이용하여 글루코스 및 락토스의 농도를 측정하였다. 모델 2020 삼투압계(매사추세츠주 노르우드에 소재한 어드밴스트 인스트루먼츠(Advanced Instruments))에 의해 삼투압몰농도를 결정하였다. 아플리콘(Applikon) ADI1010 제어기를 이용하여 온도, pH, 용존산소 및 교반을 제어하였다.
제7일, 제10일, 제13일, 제15일 및 제17일에, 생성물 품질 분석을 위해 배양물의 50 mL 샘플을 생물반응기로부터 제거하였다. 실온에서 3000rpm에서 30분 동안 샘플을 원심분리시키고 나서(인디아나주 인디아나폴리스에 소재한 베크만 쿨터(Beckman Coulter)), 0.2㎛ 관 상부 필터(펜실베니아주 피츠버그에 소재한 코닝(Corning), 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))를 통해 상청액을 여과시켰다. 이어서, 해동될 때까지 무세포 상청액을 -20℃에서 냉동시키고, 생성물 품질 분석 전에 단백질 A를 정제하였다. 제17일 생성의 완료 시, 생물반응기로부터 남아있는 배양물을 제거하였다. 3000rpm에서 30분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 세포를 상청액으로부터 분리시키고, 0.2㎛ 폴리에터설폰(PES) 카트리지 필터를 이용하여 조건화 배양 배지를 날겐(Nalgene) 보틀(펜실베니아주 피츠버그에 소재한 피셔 사이언티픽)에 멸균 여과시키고, 이어서, 단백질에 의해 정제하고 나서, 상기 기재한 바와 같이 중화 용리액을 시험하였다.
생세포 밀도 및 세포 생존도를 바이-셀(Vi-Cell)(캘리포니아주 브레아에 소재한 베크만 쿨터)에 의해 저지하였다. 통합 생세포 밀도(IVCD)를 생성의 전체 길이에 걸쳐 누적 생세포로서 계산하였다. 포로스(POROS)(등록상표) 단백질 A(뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재한 라이프 테크놀로지즈)를 이용하여 역가를 측정하였다. 상청액 중에서 역가를 결정하고, 이어서, 주어진 용적의 세포 배양 유체 중에 실제로 존재하는 것을 대표하도록 세포에 의해 점유된 용적에 대해 조절하였다. 충전 세포 용적은 총 용적의 백분율로서 표현하기 때문에, PCV 조절 역가는 항상 상청액 중의 역가보다 더 낮았다.
상이한 N-글리칸 종을 친수성-상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC)에 의해 분석하고 나서, 합한 글리칸의 총 피크 면적의 백분율로서 제시한다. 항체-함유 샘플을 수집하고 나서, 단백질 A로 정제하였다. 정제한 샘플을 PNGase-F로 처리하고 나서, N-연결 글리칸을 방출하기 위해 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 효소적으로 방출된 글리칸을 80℃에서 75분 동안 2-아미노벤조산(2-AA)으로 표시하였다. 이어서, 과량의 2-AA 표지를 글리코클린 에스(Glycoclean S) 카트리지를 이용하여 제거하였다. 샘플을 밤새 증발시키고 나서, 얻어진 건조 펠렛을 UPLC(매사추세츠주 밀포드에 소재한 워터스 코포레이션(Waters Corporation))를 이용하여 후속적 HILIC 분석을 위한 물로 재구성하였다. 글리칸을 주입하고 나서, 높은 유기 조건에서 칼럼에 결합시키고, 수성 폼산염 완충제의 성분을 증가시켜 용리시켰다. 글리콘 용리를 모니터링하기 위해 형광 검출을 사용하고 나서, 주요 및 부수적 글리칸 종의 상대적 백분율을 계산하였다. β-gal 수준은 A1G1F, A2G1F, A2G2F 및 유사한 비푸코실화 형태를 포함한다. 비푸코실화 형태는 A1G0, A2G0, A1G1, A2G1 및 A2G2를 포함한다. 만노스 5 및 만노스 7을 또한 결정하였다.
각각의 주요 인자(구리, 망간 및 pH) 및 이원 상호작용의 효과를 정하기 위해 이 실험을 설계하였다. 실험은 주요 효과 및 이원 상호작용을 정하기 위한 3인자, 2수준(23) 완전요인 배치법이었고, 중심점을 포함하지 않았다. 연구는 신호 대 노이즈 비 1.25를 이용하여 대략 0.8의 검정력 값을 전달하도록 의도된다. JMP 통계학적 소프트웨어 및 예측 프로파일(노스캐롤라이나주 캐리에 소재한 SAS 인스티튜트 인코포레이티드(SAS Institute, Inc.))을 이용하여 프로파일을 생성하였다.
결과
관류 배지에서 구리 및 망간 농도는 세포 배양 성능 또는 생산성에 영향을 미치지 않았다. pH는 세포 성장 또는 생산성에 영향을 미치지 않았지만, pH 6.85는 대략 10%만큼 최종 생존도를 감소시켰다(p<0.001), 도 1 내지 4.
고만노스 글리칸
pH는 고만노스 수준에 대해 상당한 효과를 갖는 유일한 인자이다. pH가 증가됨에 따라, 고만노스 수준은 증가되었다, 표 2 참조.
β-갈락토실화
망간의 첨가는 β-갈락토실화를 향상시켰다. 망간 농도가 클수록, β-갈락토실화 백분율은 더 컸다. pH는 β-갈락토실화에 대해서도 통계적으로 유의한 효과를 가졌다. pH가 증가할수록 β-갈락토실화는 증가되었지만, 망간을 첨가하였을 때의 증가에 비해 더 적은 정도였다, 도 5 참조. β-갈락토실화에 대한 구리의 효과는 유의하지 않았다.
비푸코실화
구리, 망간 및 pH는 모두 비푸코실화 수준에 대해 통계적으로 유의한 영향을 가졌다. 구리 및 망간의 농도가 클수록, 그리고 pH가 높을 수록, 비푸코실화 수준은 더 높았다, 도 6 참조.
모든 중요한 글리칸은 pH에 의해 유의하게 영향 받지 않았다. β-갈락토실화는 망간 농도를 증가시킴으로써 유의하게 영향을 받았다. 망간 수준을 그의 가장 높은 수준으로 증가시키는 것은 기준선 이상으로 대략 14%만큼 β-갈락토실화의 증가를 초래하였고, 통계학적 모델링에 의해 결정하여, 동일한 pH에서 가장 낮은 수준의 구리 및 망간을 시험하였다. 비푸코실화는 구리와 망간 농도 둘 다를 증가시킴으로써 상당히 영향을 받았다. 구리 및 망간 수준의 증가는 기본선 값 이상으로 대략 1.3%만큼 비푸코실화 수준을 향상시켰다. 고농도의 구리 및 망간의 첨가는 세포 배양 성능에 영향을 미치지 않았지만, 그들은 생성물 품질에 대해 영향이 없었다. 표 2 및 3 참조.
제17일 채취로부터의 결과
Mn +2 (nM) Cu +2 ( ppb ) pH 비푸코실화
(%)		 고만노스
(%)		 β- 갈락토실화
(%)
50 10 6.85 4.24 2.69 16.14
50 10 7.00 5.19 3.55 18.71
50 100 6.85 4.83 2.54 16.09
50 100 7.00 5.93 3.32 21.90
1000 10 6.85 4.94 2.63 30.79
1000 10 7.00 6.26 3.21 35.14
1000 100 6.85 5.46 2.53 29.31
1000 100 7.00 6.59 3.36 32.93
모델의 부분인 용어의 모델 적합화(R2) 및 통계학적 유의도(p 값)의 요약
매개변수 조절된 R2 더 높은 pH 더 높은 Mn2 + 더 높은 Cu2 +
P 값 P 값 P 값
β-갈락토실화 0.95 0.0028 <0.0001 --
비푸코실화 0.92 <0.0001 <0.0001 0.0028
고만노스 0.93 <0.0001 -- --
"더 높은"이라는 표기는 pH 또는 다른 인자가 더 높고, 이어서 상이한 유형의 글리코실화가 상승되는 상황을 지칭한다.
글리코실화는 재조합 단백질 약물의 치료 효능에 영향을 미칠 수 있다. Fc 글리코실화의 변형이 Fc-매개 효과기 기능에 영향을 미칠 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 비푸코실화 및 고만노스 글리칸은 항체-의존적 세포의 세포독성(ADCC) 활성을 향상시킬 수 있다. ADCC 분석을 위해, 유가 배양 공정을 이용하여 비푸코실화 및 푸코실화 재조합 항-TNFα 항체 물질을 별개로 생성하였다. 첨가한 푸코실트랜스퍼라제 저해제의 도움으로 비푸코실화 항체를 제조하였다. 얻어진 재조합 항체는 약 85% 비푸코실화되었다. 이어서, 비푸코실화 항체 물질을 완전히 푸코실화된 항체 물질과 혼합하여 최종 항체 혼합물 중에서 특정 수준의 비푸코실화를 생성하였다. 이어서, ADCC 반응의 민감성을 결정하기 위해 항체 물질을 사용하여 다양한 비푸코실화 수준에서 ADCC 활성 수준을 측정하였다.
표적 세포로서 막관통 TNFα의 TNFα 전환 효소(TACE)-저항 형태를 안정하게 발현시킨 CHO M7 세포를 이용하여 세포 기반 분석에서의 항체 혼합물의 ADCC 활성을 평가하였다. 인간 CD16(FcγRIIIa-158V)에 의해 안정하게 형질감염된 NK92-M1 세포를 효과기 세포로서 사용하였다. 간략하게, NK92-M1/CD16 효과기 세포와의 공동인큐베이션 전에 항체의 농도(0.143 ng/㎖ 내지 40 ng/㎖)를 증가시킴에 따라 표적 세포를 옵소닌화(opsonize)하였다. ADCC-매개 표적 세포 용해 시, 세포내 효소 아데닐산 키나제를 세포 배양 배지 내로 방출시켰다. 톡시라이트(ToxiLight)(상표명) 생물분석 키트(뉴저지주 알렌달에 소재한 론자(Lonza)를 이용하여 방출된 아데닐산 키나제의 양을 측정하였다. 소프트맥스(SoftMax)(등록상표) 프로(캘리포니아주 선베일에 소재한 몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices))를 수행하여 4-모수 데이터 분석을 수행하고, 용량 반응 데이터에 대해 한정 모델 곡선을 적합화하였다. 시험 샘플 반응과 기준 표준에 대해 얻은 반응을 비교함으로써 시험 샘플 활성을 결정하였고, 상대적 세포독성%로서 보고하였다.
상보체 의존적 세포독성(CDC) 활성에서 사용하기 위해, 재조합 항-TNFα 항체의 분획이 풍부한 β-갈락토실화된 물질을 크로마토그래피로 얻었다. 풍부한 항체를 사용하여 특정 수준의 β-갈락토실화를 지니는 용액을 제조하였다. 이어서, 다양한 수준의 β-갈락토실화에서 CDC 활성 수준을 측정하여 CDC 반응의 민감성을 확립하였다.
항체에 의해 유발되는 CDC 활성 정도를 기능성 세포 기반 분석에서 평가하였다. CHO M7 세포를 20μM 칼세인-AM(미주리주 세인트 루이스에 소재한 시그마(Sigma))과 함께 사전 인큐베이션시켰다. 칼세인-AM은 세포 내로 유입되었고, 형광이 되도록 비특이적 에스터라제에 의해 절단하고 나서, 무손상 세포막 내에 트래핑하였다. 칼세인-부하 표적 세포를 상이한 용량 농도의 항체(1.563 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖)와 함께 인큐베이션시킨 다음, 두번째 인큐베이션을 위해 상보체를 첨가하였다(2.5% 최종 농도).
상보체 인큐베이션 후에, 상청액을 제거하고 나서, 마이크로플레이트 판독기(엔비전(EnVision), 매사추세츠주 월섬에 소재한 퍼킨 엘머)를 이용하여 형광을 측정하였다. 형광 강도는 세포 용해의 양에 직접적으로 비례하였다. 소프트맥스(SoftMax)(등록상표) 프로(캘리포니아주 선베일에 소재한 몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices))를 사용하여 4-모수 데이터 분석을 수행하고, 용량 반응 데이터에 대해 한정 모델 곡선을 적합화하였다. 시험 샘플 반응과 기준 표준에 대해 얻은 반응을 비교함으로써 시험 샘플 활성을 결정하였고, 상대적 세포독성%로서 보고하였다.
비푸코실화 수준을 2%만큼 적게 증가시키는 것은 ADCC 활성에 실행적인 영향을 가졌다(도 7). 반응은 훨씬 덜 민감하였지만 β-갈락토실화 수준을 증가시킴으로써 CDC 활성은 또한 명확하게 영향을 받았다(도 8).
ADCC 및 CDC 효과기 기능은 치료 단백질의 임상 활성을 위한 중요한 인자일 수 있으며, 특정 글리칸에 대한 목적으로 하는 표적 값의 달성은 목적으로 하는 임상적 종점에 도달하는 데 중요할 수 있다. 비푸코실화의 작은 변화는 당단백질의 ADCC 활성에 대해 큰 영향을 가질 수 있다. 구리 및 망간을 변경시킴으로써, 이들 효과기 기능을 초래하고 생성물 품질을 총괄하는 글리칸 수준을 제어할 수 있다.

Claims (28)

  1. 재조합 단백질에서의 푸코실화 글리칸 함량을 조작하는 방법으로서,
    재조합 단백질을 발현하는 포유류 숙주 세포를 생물반응기에 접종하는 단계;
    상기 포유류 숙주 세포를 화학적으로 규명된(chemically defined) 무혈청 세포 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 세포 배양 배지는 pH 7.0에서 10 내지 100ppb 구리 및 50 내지 1000nM 망간을 포함하는, 단계; 및
    상기 포유류 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 단백질을 채취하는 단계를 포함하고,
    상기 재조합 단백질에서의 비푸코실화 글리칸 수준이, 더 낮은 pH의 동일 세포 배양 배지에서 수득한 비푸코실화 글리칸 수준에 비해서 증가하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질에서의 β-갈락토실화 수준 증가를 더 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 구리 농도가 100ppb인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 망간 농도가 1000nM인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 푸코실화 글리칸 함량이 재조합 단백질의 효과기 기능에 영향을 미치도록 조작되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 감소하는 온도 이동을 더 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 온도 이동이 36℃에서 31℃로의 이동인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 온도 이동이 성장기와 생산기 사이의 전이에서 일어나는 것인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 온도 이동이 생산기 동안 일어나는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 재조합 단백질을 발현하는 포유류 숙주 세포가 회분 배양(batch culture), 유가 배양(fed-batch culture), 또는 관류 배양(perfusion culture)으로 배양되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 배양이 관류 배양인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 관류가 연속 관류를 포함하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 관류 속도가 일정한 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 관류가 1일 당 1.0 작업 용적 이하의 속도로 수행되는 것인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 관류가 교번 접선 유동(alternating tangential flow)에 의해 달성되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 생물반응기의 용량이 적어도 500ℓ인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 생물반응기의 용량이 적어도 500ℓ 내지 2000ℓ인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 생물반응기의 용량이 적어도 1000ℓ 내지 2000ℓ인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 생물반응기에 적어도 0.5 x 106 세포/㎖가 접종되는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 화학적으로 규명된 무혈청 세포 배양 배지가 관류 세포 배양 배지인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 포유류 숙주 세포가 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 재조합 단백질이 당단백질인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 재조합 단백질이 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 융합 단백질 또는 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 포유류 숙주 세포에 의해 생산된 재조합 단백질이 정제되고, 약제학적으로 허용가능한 제형으로 제형화되는 것인 방법.
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