KR20160145004A - 메신저 rna 의 정제 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 다른 것들 중에서, (a) 불순한 제제로부터 mRNA를 침전시키는 단계; (b) 침전된 mRNA를 포함하는 상기 불순한 제제를, 막여과를 포함하는 정제 공정처리하여 상기 침전된 mRNA를 막으로 포집하는 단계; 및 (c) mRNA를 재가용화시킴으로써 막으로부터 상기 포집된 침전 mRNA를 용출시키고, 이로써 정제된 mRNA 용액을 유발하는 단계를 포함하는 메신저 RNA (mRNA)의 정제 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 막여과를 포함하는 정제 공정은 접선 유동 여과(tangential flow filtration)이다.
Description
관련 출원
본 출원은, 2014년 4월 25일 출원된, 미국 가출원 일련 번호 61/984,503 에 우선권 주장하고, 이 개시내용은 본원에서 참고로 편입된다.
메신저 RNA 요법은 다양한 질병의 치료를 위해 점차적으로 중요한 접근법이 되고 있다. 메신저 RNA 요법은 그 요법이 필요한 환자에게 메신저 RNA (mRNA)의 투여 및 환자 신체내에 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 생산을 포함한다. 따라서, 치료 용도에 적합한 매우 순수한 및 안전한 mRNA 생성물의 대규모 생산에 대한 요구가 크다.
서열 목록
본 명세서는 (2015년 4월 24일에 "Sequence listing.txt" 이름의 .txt 파일로 전자적으로 제출된) 서열 목록을 참고한다. 상기 .txt 파일은 2015년 4월 22일에 생성되었고 11,184 바이트 크기이다. 서열 목록의 전체 내용은 본원에서 참고로 편입된다.
발명의 요약
본 발명은 치료 용도에 적합한 메신저 RNA (mRNA), 특히, 시험관내 합성된 mRNA의 개선된 효과적인 정제 방법을 제공한다. 본 발명은, 부분적으로, 매우 드문 조합인, mRNA의 침전, 그 다음 막 여과가 예상외로 높은 품질 mRNA의 성공적인 대규모 생산을 유발한다는 놀라운 발견에 기반한다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명은 (a) 불순한 제제로부터 mRNA를 침전시키는 단계; (b) 침전된 mRNA를 포함하는 상기 불순한 제제를, 막여과를 포함하는 정제 공정처리하여 상기 침전된 mRNA를 막으로 포집하는 단계; 및 (c) mRNA를 재가용화시킴으로써 막으로부터 상기 포집된 침전 mRNA를 용출시키고, 이로써 정제된 mRNA 용액을 유발하는 단계를 포함하는 메신저 RNA (mRNA)의 정제 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 막 여과를 포함하는 정제 공정은 접선 유동 여과(tangential flow filtration)이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 막 여과를 포함하는 정제 공정은 직접 유동 여과(direct flow filtration)이다.
일부 구현예에서, mRNA 침전의 단계는 리튬 클로라이드, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 구아니디늄 이소티오시아네이트, 암모늄 아세테이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시약을 포함하는 용액으로 불순한 제제를 처리하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 시약은 구아니디늄 티오시아네이트이다.
일부 구현예에서, mRNA 침전에 적합한 용액은 구아니디늄 티오시아네이트를 약 1 M 이상, 약 2 M 이상, 약 3 M 이상, 약 4 M 이상, 약 5 M 이상, 약 6 M 이상, 약 7 M 이상, 약 8 M 이상, 약 9 M 이상, 또는 약 10 M 이상의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 침전에 적합한 용액은 구아니디늄 티오시아네이트를 약 4 M의 농도로 포함한다. 일부 상기 구현예에서, 적합한 용액은 나트륨 라우릴 사르코실 및/또는 나트륨 시트레이트를 추가로 포함한다. 예를 들면, 특정 구현예에서, mRNA 침전에 적합한 용액은 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, 0.5 % 나트륨 라우릴 사르코실, 및 25 mM 나트륨 시트레이트를 포함한다. 특정 구현예에서, mRNA 침전에 적합한 용액은 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, 및 0.5 % 나트륨 라우릴 사르코실을 포함한다. 특정 구현예에서, mRNA 침전에 적합한 용액은 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, 및 25 mM 나트륨 시트레이트를 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA 침전의 단계는 추가로 불순한 제제를 무수 에탄올로 처리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA 침전의 단계는 추가로 불순한 제제를 이소프로필 알코올로 처리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 막은 폴리에테르설폰 (mPES) (변형되지 않음), 폴리에테르설폰 (mPES) 중공 섬유 막, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 셀룰로오스 아세테이트, 니트로셀룰로오스, MCE (혼합된 셀룰로오스 에스테르), 초고 MW 폴리에틸렌 (UPE), 폴리플루오로테트라에틸렌 (PTFE), 나일론, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 구성된다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 추가로 용출 전에 포집된 침전 mRNA 세정을 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 단계는 구아니디늄 완충액 및 에탄올, 그 다음 약 70-80 % 에탄올 (예를 들면, 약 70 %, 75 %, 또는 80 % 에탄올)을 포함한 세정 용액을 이용한 다중 린스 사이클을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 다중 린스 사이클은 적어도 5 또는 5 초과 사이클 (예를 들면, 약 5 내지 10 사이클 또는 약 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 사이클)이다.
일부 구현예에서, 용출 단계는 포집된 침전 mRNA를 RNAse가 없는 물로 재가용화하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, RNAse가 없는 물은 약 5-10 분동안 (예를 들면, 약 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 분동안) 재순환된다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 추가로 정제된 mRNA 용액 투석 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 용액은 100 kDa 분획 분자량 (MWCO) 막을 이용하여 1 mM 나트륨 시트레이트로 투석된다.
다양한 구현예에서, 본 발명은 시험관내 mRNA 합성 반응 혼합물을 함유하는 불순한 제제로부터 시험관내 합성된 mRNA를 정제하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 불순한 제제는 시험관내 합성에서 사용되는 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약을 포함한다.
일부 구현예에서, 정제된 mRNA 용액은 시험관내 합성에서 사용되는 약 5 % 미만 (예를 들면, 약 4.5 %, 4 %, 3.5 %, 3 %, 2.5 %, 2 %, 1.5 %, 1 %, 0.5 %, 0.1 % 미만)의 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약을 함유한다. 특정 구현예에서, 정제된 mRNA 용액은 시험관내 합성에서 사용되는 약 1 % 미만 (예를 들면, 약 0.9 %, 0.8 %, 0.7 %, 0.6 %, 0.5 % 미만)의 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약을 함유한다. 특정 구현예에서, 정제된 mRNA 용액은 시험관내 합성에서 사용되는 약 0.5 % 미만 (예를 들면, 약 0.4 %, 0.3 %, 0.2 %, 또는 0.1 % 미만)의 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약을 함유한다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 용액은 시험관내 합성에서 사용되는 약 0.1 % 미만의 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약을 함유한다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 용액은 시 험관내 합성에서 사용되는 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약이 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 시험관내 합성에서 사용되는 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약은 은 염색, 겔 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC), 및/또는 모세관 전기영동을 통해 평가된다.
일부 구현예에서, 미숙하게 중절된 RNA 서열은 15 미만 염기 (예를 들면, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3 미만 염기)를 함유한다. 일부 구현예에서, 미숙하게 중절된 RNA 서열은 약 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11, 또는 8-10 염기를 함유한다.
일부 구현예에서, 시험관내 합성에서 사용되는 효소 시약은 T7 RNA 폴리머라제, DNAse I, 파이로포스파타제, 및/또는 RNAse 저해제를 포함한다.
일부 구현예에서, mRNA는 뱃치 당 1 그램, 5 그램, 10 그램, 15 그램, 20 그램, 25 그램, 30 그램, 35 그램, 40 그램, 45 그램, 50 그램, 75 그램, 100 그램, 150 그램, 200 그램, 250 그램, 300 그램, 350 그램, 400 그램, 450 그램, 500 그램, 550 그램, 600 그램, 650 그램, 700 그램, 750 그램, 800 그램, 850 그램, 900 그램, 950 그램, 1 kg, 2.5 kg, 5 kg, 7.5 kg, 10 kg, 25 kg, 50 kg, 75 kg, 또는 100 kg 이상의 규모로 정제된다. 아래의 실시예에서 보여진 바와 같이, 10 그램 이상 (25 그램 이상)의 양으로 정제된 mRNA를 포함하는 뱃치는 본 발명의 방법으로 쉽게 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA는 캡 및/또는 테일이 mRNA에 부가되기 전에 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 캡 및/또는 테일이 mRNA에 부가된 후에 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 캡이 부가된 후에 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 캡 및/또는 테일이 mRNA에 부가되기 전 및 후 둘 다에 정제된다.
일부 구현예에서, mRNA는 길이로 약 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb, 3.5 kb, 4 kb, 4.5 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 또는 20 kb 이상이다.
일부 구현예에서, mRNA는 하나 이상의 변형을 포함하여 안정성을 높인다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 변형된 뉴클레오티드 및/또는 변형된 당 포스페이트 골격을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 비변형된다.
일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 95 % 이상 (예를 들면, 약 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 이상)의 완전성을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 98 % 이상의 완전성을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 99 % 이상의 완전성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명은 (a) 불순한 제제로부터 mRNA를 침전시키는 단계; (b) 침전된 mRNA를 포함하는 불순한 제제를 접선 유동 여과처리하여 침전된 mRNA가 여과막에 의해 포집되면서 불순물이 투과를 통해 폐기되는 단계; 그리고 (c) 침전된 mRNA를 재가용화시킴으로써 포집된 침전 mRNA를 용출시켜, 정제된 mRNA 용액을 유발하는 단계를 포함하는 메신저 RNA (mRNA)의 정제 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 시험관내 mRNA를 합성하고; 그리고 본원에 기재된 방법을 이용하여 시험관내 합성된 mRNA를 정제하는 것을 포함하는 메신저 RNA (mRNA)의 제조 방법을 제공한다.
다른 것들 중에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 방법을 이용하여 정제된 메신저 RNA (mRNA)를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 인간 대상체 투여에 적합한 단일 mRNA 종의 5 그램 이상을 포함하는 정제된 mRNA의 뱃치를 제공한다. 일부 구현예에서, 뱃치는 단일 mRNA 종의 10 그램 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 뱃치는 단일 mRNA 종의 25 그램 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 뱃치는 mRNA 합성 공정으로부터 불순물이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 뱃치는 단일 mRNA 종의 시험관내 합성에서 사용되는 미숙하게 중절된 RNA 서열, DNA 주형, 및/또는 효소 시약이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 시험관내 합성에서 사용되는 약 5 % 미만의 효소 시약을 함유한다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 95 % 초과의 완전성을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 정제된 메신저 RNA를 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 시험관내 합성된 메신저 RNA를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 조성물은 시험관내 합성에서 사용되는 1 % 미만의 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약을 함유한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 시험관내 합성된 메신저 RNA (mRNA)를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 상기 mRNA는 95 % 이상의 완전성을 갖는다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은 동등물로서 사용된다. 약/대략이 있거나 없이 본 출원에 사용된 임의의 숫자는 관련 기술의 숙련가에 의해 인정된 임의의 정상 변동을 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점은 후기하는 상세한 설명에서 명백하다. 그러나, 상세한 설명은 본 발명의 구현예를 나타내면서 비제한적으로 단지 예시 방식으로 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 내에서 다양한 변화 및 변형은 상세한 설명으로부터 당해분야의 숙련가에게 명백해질 것이다.
하기 도면은 단지 설명하기 위한 것이고 제한을 위한 것은 아니다.
도 1은 적재, 세정 및 용출 단계를 포함하는 mRNA의 예시적인 대규모 정제 방법을 묘사한다. 예를 들면, 침전된 mRNA는 막에 적재될 수 있어서 0.22 um 미만의 가용성 불순물 뿐만 아니라 불용성인 것이 투과물을 통해 폐기되는 반면 침전된 mRNA가 보전물로서 포집될 수 있다. 포집 이후, 고체 침전물은 순수한 메신저 RNA 생성물을 위해 다양한 완충액로 세정되고 그 다음 재가용화 및 용출된다.
도 2는 (3개의 용출액을 갖는) 제공된 방법에 따라 초기 1 그램 시험관내 전사 (IVT) 반응으로부터 변형된 낭포성 섬유증 막통과 전도도 조절물질 (CFTR) mRNA의 예시적인 은-염색된 단백질 겔 그리고 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 3은 (6개의 용출액을 갖는) 제공된 방법에 따라 초기 1.5 그램 시험관내 전사 (IVT) 반응으로부터 변형된 CFTR mRNA의 예시적인 은-염색된 단백질 겔 그리고 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 4는 아가로스 겔 전기영동에 의해 나타낸 바와 같이 제공된 방법에 따라 정제되고 여과되는 변형된 CFTR mRNA의 시험관내 전사 (IVT) 샘플에서 예시적인 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 변형된 CFTR mRNA 대규모 후 침전동안 잔류하였다.
도 5는 (5개의 용출액을 갖는) 제공된 방법에 따라 초기 1 그램 시험관내 전사 (IVT) 반응으로부터 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA의 예시적인 은-염색된 단백질 겔 그리고 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 6은 (5개의 용출액을 갖는) 제공된 방법에 따라 초기 1 그램 시험관내 전사 (IVT) 반응으로부터 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA의 예시적인 SYPRO-염색된 단백질 겔 그리고 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 7은 아가로스 겔 전기영동에 의해 나타낸 바와 같이 제공된 방법에 따라 정제되고 여과되는 ASS1 mRNA의 시험관내 전사 (IVT) 샘플에서 예시적인 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 ASS1 mRNA 대규모 후 침전동안 잔류하였다.
도 8은 (단일 또는 이중 침전을 갖는) 제공된 방법에 따라 초기 시험관내 전사 (IVT) 반응으로부터 개똥벌레 루시퍼라아제 (FFL) mRNA의 예시적인 은-염색된 단백질 겔 그리고 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 9는 (단일 또는 이중 침전을 갖는) 제공된 방법에 따라 초기 시험관내 전사 (IVT) 반응으로부터 개똥벌레 루시퍼라아제 (FFL) mRNA의 예시적인 SYPRO-염색된 단백질 겔 그리고 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 10은 아가로스 겔 전기영동에 의해 나타낸 바와 같이 제공된 방법에 따라 정제되고 여과되는 개똥벌레 루시퍼라아제 (FFL) mRNA의 시험관내 전사 (IVT) 샘플에서 예시적인 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 FFL mRNA 대규모 후 침전 및 재-침전동안 잔류하였다.
도 11은 (3개의 용출액을 갖는) 최종 캡핑 및 테일링 반응으로부터 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA의 예시적인 은-염색된 단백질 겔 그리고 캡핑 및 테일링 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 12 는 아가로스 겔 전기영동에 의해 나타낸 바와 같이 제공된 방법에 따라 정제되고 여과되는 예시적인 최종 ASS1 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 ASS1 mRNA 대규모 후 침전 및 재-침전동안 잔류하였다.
도 13은 FFL mRNA 처리된 HEK293T 세포의 세포 용해물내에서 관측된 예시적인 발광을 보여준다. 세포를 24 시간 후-형질감염으로 수확하였다. 판매인 유도된 mRNA 대 스핀-칼럼 정제된 mRNA (상업적 키트) 대 침전-TFF 정제된 FFL mRNA 번역 능력의 비교를 나타낸다.
도 14는 hCFTR mRNA-형질감염된 HEK293T 세포의 세포 용해물내에서 관측된 예시적인 CFTR 단백질 수준을 보여준다. 세포를 24 시간 후-형질감염으로 수확하였다. TFF 정제된 mRNA 대 스핀-칼럼 (상업적 키트) hCFTR mRNA 번역 능력의 비교를 나타낸다.
도 15는 제공된 방법에 따라 정제되고 여과되는 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA의 시험관내 전사 (IVT) 샘플로부터 예시적인 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 ASS1 mRNA 대규모 (5G) 후 침전동안 잔류하였다.
도 16은 제공된 방법에 따라 정제되고 여과되는 (전- 및 후-캡핑된/테일링된) 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA의 시험관내 전사 (IVT) 샘플로부터 예시적인 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 ASS1 mRNA 대규모 (5G) 후 침전동안 잔류하였다.
도 17은 제공된 방법에 따라 최종 정제 (5G)후 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA의 예시적인 은-염색된 단백질 겔 뿐만 아니라 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 18은 ASS1 mRNA 처리된 HEK293T 세포의 세포 용해물내에서 관측된 예시적인 인간 ASS1 단백질 생산을 보여준다. 세포를 24 시간 후-형질감염으로 수확하였다. 스핀-칼럼 정제된 mRNA (상업적 키트) 대 침전-TFF 정제된 ASS1 mRNA (5G) 번역 능력의 비교를 나타낸다.
도 19는 아가로스 겔 전기영동에 의해 나타낸 바와 같이 제공된 방법에 따라 정제 및 여과되는 (전- 및 후-캡핑된/테일링된) 낭포성 섬유증 막통과 전도도 조절물질 (CFTR) mRNA의 시험관내 전사 (IVT) 샘플에서 예시적인 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 CFTR mRNA 대규모 (10G) 후 침전동안 잔류하였다.
도 20은 제공된 방법에 따라 최종 정제 (10G)후 낭포성 섬유증 막통과 전도도 조절물질 (CFTR) mRNA의 예시적인 은-염색된 단백질 겔 뿐만 아니라 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 21은 대규모 생산 및 정제로부터 hCFTR mRNA-형질감염된 HEK293T 세포의 세포 용해물내에서 관측된 예시적인 CFTR 단백질 수준을 보여준다. 세포를 24 시간 후-형질감염으로 수확하였다.
도 22는 25G 규모 생산에서 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA의 시험관내 전사 (IVT) 샘플에서 예시적인 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 ASS1 mRNA 대규모 (25G) 후 단리동안 잔류하였다.
정의
본 발명이 더욱 쉽게 이해되기 위해서, 어떤 용어들은 아래에서 먼저 정의된다. 하기 용어들 및 다른 용어들에 대한 추가 정의는 명세서 전반에 걸쳐 제시된다.
동물: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동물"은 동물계의 임의의 구성원을 언급한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 개발 단계에서 인간을 언급한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 개발 단계에서 비-인간 동물을 언급한다. 특정 구현예에서, 비-인간 동물은 포유동물 (예를 들면, 설치류, 마우스, 랫트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류, 및/또는 돼지)이다. 일부 구현예에서, 동물은, 비제한적으로, 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충, 및/또는 벌레를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 형질전환 동물, 유전적으로-조작된 동물, 및/또는 클론일 수 있다.
대략 또는 약: 본원에서 사용된 바와 같이, 하나 이상의 해당 값에 적용되는 바와 같이, 용어 "대략" 또는 "약,"은 언급된 참조 값에 유사한 값을 언급한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되지 않는 한 또는 (그 숫자가 가능한 값의 100 %를 초과하는 것을 제외하는) 맥락으로부터 달리 명백하게 언급된 참조 값의 어느 방향 (초과 또는 미만)에서 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % 내에, 또는 그 미만에 해당하는 값의 범위를 언급한다.
생물학적 활성: 본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "생물학적 활성"은 생물학적 시스템에서, 및 특히 유기체에서 활성을 갖는 임의의 제제의 특징을 언급한다. 예를 들면, 유기체에 투여되는 경우, 그 유기체에 생물학적 효과를 갖는 제제는 생물학적 활성이 있는 것으로 고려된다.
발현: 본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 서열의 "발현"은 mRNA의 폴리펩티드로의 번역, 다중 폴리펩티드의 온전한 단백질로의 어셈블리 및/또는 폴리펩티드 또는 완전히 어셈블리된 단백질의 번역후 변형을 언급한다. 본 출원에서, 용어들 "발현" 및 "생산," 및 문법적 동등물은 교환가능하게 사용된다.
기능적: 본원에서 사용된 바와 같이, "기능적" 생물학적 분자는 특징으로 하는 특성 및/또는 활성을 나타내는 형태의 생물학적 분자이다.
개선하다, 증가하다, 또는 감소하다: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "개선하다," "증가하다" 또는 "감소하다," 또는 문법적 동등물은 기준 측정, 예컨대 본원에 기재된 처리의 개시에 앞서 동일한 개체에서의 측정, 또는 본원에 기재된 처리의 부재시 대조군 대상체 (또는 다중 대조군 대상체)에서의 측정에 대한 값을 나타낸다. "대조군 대상체"는 치료될 대상체와 약 동일한 연령인, 치료될 대상체와 동일한 형태의 질환으로 고통받는 대상체이다.
불순물: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "불순물"은 표적 물질 또는 화합물의 화학 조성물과 상이한, 국한된 양의 액체, 기체, 또는 고체 내부의 물질을 언급한다. 불순물은 또한 오염물질로 언급된다.
시험관내: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "시험관내"는 다중-세포성 유기체 내에서 보다는, 인공 환경에서, 예를 들면, 시험관 또는 반응 용기에서, 세포 배양, 등에서 발생하는 이벤트를 언급한다.
생체내: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생체내"는 다중-세포성 유기체, 예컨대 인간 및 비-인간 동물 내에서 발생하는 이벤트를 언급한다. 세포 기반 시스템의 맥락에서, 상기 용어는 (예를 들면, 시험관내 시스템과 대조적으로) 살아 있는 세포 내에서 발생하는 이벤트를 언급하는데 사용될 수 있다.
단리된: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 (1) (자연에서 및/또는 실험적 세팅에서) 초기에 생산된 경우 관련되었던 성분의 적어도 일부로부터 분리된, 및/또는 (2) 사람의 손에 의해 생산된, 제조된, 및/또는 제작된 물질 및/또는 독립체를 언급한다. 단리된 물질 및/또는 독립체는 이들이 초기에 관련되었던 약 10 %, 약 20 %, 약 30 %, 약 40 %, 약 50 %, 약 60 %, 약 70 %, 약 80 %, 약 90 %, 약 91 %, 약 92 %, 약 93 %, 약 94 %, 약 95 %, 약 96 %, 약 97 %, 약 98 %, 약 99 %, 또는 약 99 % 초과의 다른 성분으로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 제제는 약 80 %, 약 85 %, 약 90 %, 약 91 %, 약 92 %, 약 93 %, 약 94 %, 약 95 %, 약 96 %, 약 97 %, 약 98 %, 약 99 %, 또는 약 99 % 초과 순수하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 물질은 다른 성분이 실질적으로 없다면 "순수한"이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단리된 물질 및/또는 독립체의 퍼센트 순도 계산은 부형제 (예를 들면, 완충액, 용매, 물, 등)를 포함하지 않아야 한다.
메신저 RNA ( mRNA ): 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "메신저 RNA (mRNA)"는 적어도 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 언급한다. 본원에서 사용된 바와 같이 mRNA는 모든 변형된 및 비변형된 RNA를 포함한다. mRNA는 하나 이상의 암호화 및 비-암호화 영역을 함유할 수 있다.
mRNA 완전성: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "mRNA 완전성"은 일반적으로 mRNA의 품질을 언급한다. 일부 구현예에서, mRNA 완전성은 정제 공정 (예를 들면, 접선 유동 여과) 이후 분해되지 않는 mRNA의 백분율을 언급한다. mRNA 완전성은 당해기술에서 잘 알려진 방법을 이용하여, 예를 들면, RNA 아가로스 겔 전기영동 (예를 들면, Ausubel 등, John Weley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology)에 의해 측정될 수 있다.
핵산: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산,"은 그 가장 넓은 의미로, 폴리뉴클레오티드 사슬내에 편입되거나 또는 편입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 언급한다. 일부 구현예에서, 핵산은 포스포디에스테르 연결부를 통해 폴리뉴클레오티드 사슬내에 편입되거나 또는 편입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질이다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별적인 핵산 잔기 (예를 들면, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 언급한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별적인 핵산 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 사슬을 언급한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA 뿐만 아니라 단일 및/또는 이중-가닥 DNA 및/또는 cDNA를 포함한다. 더욱이, 용어들 "핵산," "DNA," "RNA," 및/또는 유사한 용어들은 핵산 유사체, 즉, 포스포디에스테르 골격을 갖지 않는 유사체를 포함한다. 예를 들면, 당해기술에 공지되어 있고 그리고 골격에서 포스포디에스테르 결합 대신 펩티드 결합을 갖는 소위 "펩티드 핵산,"이 본 발명의 범위내로 고려된다. 용어 "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 변성 버전이고/이거나 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및/또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다. 핵산은 재조합 발현 시스템을 이용하여 생산된 및 임의로 정제된, 화학적으로 합성된 천연 공급원 등으로부터 정제될 수 있다. 적절한 경우, 예를 들면, 화학적으로 합성된 분자의 경우, 핵산은 뉴클레오시드 유사체 예컨대 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 골격 변형을 갖는 유사체 등을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 다르게 명시되지 않는 한 5' 내지 3' 방향으로 존재한다. 일부 구현예에서, 핵산은 하기이거나 하기를 포함한다: 천연 뉴클레오시드 (예를 들면, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘); 뉴클레오시드 유사체 (예를 들면, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기 (예를 들면, 메틸화된 염기); 삽입된 염기; 변형된 당류 (예를 들면, 2'-플루오로리보오스, 리보오스, 2'-데옥시리보오스, 아라비노오스, 및 헥소오스); 및/또는 변형된 포스페이트 그룹 (예를 들면, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결부). 일부 구현예에서, 본 발명은, 전달을 촉진하기 위해 또는 달성하기 위해 화학적으로 변형되지 않는 핵산 (예를 들면, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드를 포함하여, 폴리뉴클레오티드 및 잔기)을 의미하는, "비변형된 핵산,"에 특이적으로 관련한다.
환자: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "환자" 또는 "대상체"는, 예를 들면, 실험적, 진단적, 예방적, 미용적, 및/또는 치료적 목적을 위해, 제공된 조성물이 투여될 수 있는 임의의 유기체를 언급한다. 전형적인 환자는 동물 (예를 들면, 포유동물 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 비-인간 영장류, 및/또는 인간)을 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 인간이다. 인간은 출산 전 및 후 형태를 포함한다.
약제학적으로 허용가능한: 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "약제학적으로 허용가능한"은, 합리적인 유익/유해 비율에 상응하는, 과도한 독성, 자극, 알러지성 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 건전한 의료 판단의 범위 내에서 인간 및 동물의 조직과 접촉시 사용에 적합한 물질을 언급한다.
미숙하게 중절된 RNA 서열: 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "미숙하게 중절된 RNA 서열"은 mRNA 합성 반응 (예를 들면, 시험관내 합성 반응)의 불완전한 생성물을 언급한다. 다양한 이유로, RNA 폴리머라제는 DNA 주형의 전사를 항상 완성하지 않는다; 즉, RNA 합성이 미숙하게 종료한다. RNA 합성의 미숙한 종료의 가능한 원인은 DNA 주형의 품질, 주형에 존재하는 특정한 폴리머라제용 폴리머라제 종결자 서열, 분해된 완충액, 온도, 리보뉴클레오티드의 고갈, 및 mRNA 2차 구조를 포함한다. 미숙하게 중절된 RNA 서열은 원하는 전사 생성물의 의도된 길이 미만인 임의의 길이일 수 있다. 예를 들면, 미숙하게 중절된 mRNA 서열은 1000 미만 염기, 500 미만 염기, 100 미만 염기, 50 미만 염기, 40 미만 염기, 30 미만 염기, 20 미만 염기, 15 미만 염기, 10 미만 염기 또는 더 적을 수 있다.
염: 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "염"은 산과 염기 사이의 중화 반응에서 비롯되거나 비롯될 수 있는 이온성 화합물을 언급한다.
대상체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 또는 임의의 비-인간 동물 (예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 언급한다. 인간은 출생 전 및 출생 후 형태를 포함한다. 많은 구현예에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 환자일 수 있고, 이는 질환의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 제공하는 인간을 언급한다. 용어 "대상체"는 "개체" 또는 "환자"와 상호교환적으로 본원에서 사용된다. 대상체는 질환 또는 장애로 고통받을 수 있거나 또는 이에 민감하지만 질환 또는 장애의 증상을 나타낼 수 있거나 나타내지 않을 수 있다.
실질적으로: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로"는 해당 특징 또는 특성의 총 또는 거의-총 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 상태를 언급한다. 생물학 분야에서의 숙련가는 생물학적 및 화학적 현상이 드물게, 설사 하더라도, 완료하고/하거나 완성도에 이르거나 또는 절대적 결과를 달성 또는 회피한다는 것을 이해할 것이다. 용어 "실질적으로"는 따라서 많은 생물학적 및 화학적 현상에서 고유한 완성도의 잠재적인 부족을 포집하기 위해 본원에서 사용된다.
실질적으로 없는: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 없는"은 제거되는 물질(예를 들면, 미숙하게 중절된 RNA 서열)이 상대적으로 적은 양 또는 없는 양으로 존재하는 상태를 언급한다. 예를 들면, "미숙하게 중절된 RNA 서열이 실질적으로 없는"은 미숙하게 중절된 RNA 서열이 대략 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1.0 %, 0.9 %, 0.8 %, 0.7 %, 0.6 %, 0.5 %, 0.4 %, 0.3 %, 0.2 %, 0.1 % 미만 또는 더 적은 (w/w) 불순물의 수준으로 존재한다는 것을 의미한다. 대안적으로, "미숙하게 중절된 RNA 서열이 실질적으로 없는"은 미숙하게 중절된 RNA 서열이 약 100 ng, 90 ng, 80 ng, 70 ng, 60 ng, 50 ng, 40 ng, 30 ng, 20 ng, 10 ng, 1 ng, 500 pg, 100 pg, 50 pg, 10 pg 미만, 또는 더 적은 수준으로 존재한다는 것을 의미한다.
도 1은 적재, 세정 및 용출 단계를 포함하는 mRNA의 예시적인 대규모 정제 방법을 묘사한다. 예를 들면, 침전된 mRNA는 막에 적재될 수 있어서 0.22 um 미만의 가용성 불순물 뿐만 아니라 불용성인 것이 투과물을 통해 폐기되는 반면 침전된 mRNA가 보전물로서 포집될 수 있다. 포집 이후, 고체 침전물은 순수한 메신저 RNA 생성물을 위해 다양한 완충액로 세정되고 그 다음 재가용화 및 용출된다.
도 2는 (3개의 용출액을 갖는) 제공된 방법에 따라 초기 1 그램 시험관내 전사 (IVT) 반응으로부터 변형된 낭포성 섬유증 막통과 전도도 조절물질 (CFTR) mRNA의 예시적인 은-염색된 단백질 겔 그리고 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 3은 (6개의 용출액을 갖는) 제공된 방법에 따라 초기 1.5 그램 시험관내 전사 (IVT) 반응으로부터 변형된 CFTR mRNA의 예시적인 은-염색된 단백질 겔 그리고 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 4는 아가로스 겔 전기영동에 의해 나타낸 바와 같이 제공된 방법에 따라 정제되고 여과되는 변형된 CFTR mRNA의 시험관내 전사 (IVT) 샘플에서 예시적인 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 변형된 CFTR mRNA 대규모 후 침전동안 잔류하였다.
도 5는 (5개의 용출액을 갖는) 제공된 방법에 따라 초기 1 그램 시험관내 전사 (IVT) 반응으로부터 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA의 예시적인 은-염색된 단백질 겔 그리고 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 6은 (5개의 용출액을 갖는) 제공된 방법에 따라 초기 1 그램 시험관내 전사 (IVT) 반응으로부터 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA의 예시적인 SYPRO-염색된 단백질 겔 그리고 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 7은 아가로스 겔 전기영동에 의해 나타낸 바와 같이 제공된 방법에 따라 정제되고 여과되는 ASS1 mRNA의 시험관내 전사 (IVT) 샘플에서 예시적인 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 ASS1 mRNA 대규모 후 침전동안 잔류하였다.
도 8은 (단일 또는 이중 침전을 갖는) 제공된 방법에 따라 초기 시험관내 전사 (IVT) 반응으로부터 개똥벌레 루시퍼라아제 (FFL) mRNA의 예시적인 은-염색된 단백질 겔 그리고 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 9는 (단일 또는 이중 침전을 갖는) 제공된 방법에 따라 초기 시험관내 전사 (IVT) 반응으로부터 개똥벌레 루시퍼라아제 (FFL) mRNA의 예시적인 SYPRO-염색된 단백질 겔 그리고 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 10은 아가로스 겔 전기영동에 의해 나타낸 바와 같이 제공된 방법에 따라 정제되고 여과되는 개똥벌레 루시퍼라아제 (FFL) mRNA의 시험관내 전사 (IVT) 샘플에서 예시적인 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 FFL mRNA 대규모 후 침전 및 재-침전동안 잔류하였다.
도 11은 (3개의 용출액을 갖는) 최종 캡핑 및 테일링 반응으로부터 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA의 예시적인 은-염색된 단백질 겔 그리고 캡핑 및 테일링 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 12 는 아가로스 겔 전기영동에 의해 나타낸 바와 같이 제공된 방법에 따라 정제되고 여과되는 예시적인 최종 ASS1 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 ASS1 mRNA 대규모 후 침전 및 재-침전동안 잔류하였다.
도 13은 FFL mRNA 처리된 HEK293T 세포의 세포 용해물내에서 관측된 예시적인 발광을 보여준다. 세포를 24 시간 후-형질감염으로 수확하였다. 판매인 유도된 mRNA 대 스핀-칼럼 정제된 mRNA (상업적 키트) 대 침전-TFF 정제된 FFL mRNA 번역 능력의 비교를 나타낸다.
도 14는 hCFTR mRNA-형질감염된 HEK293T 세포의 세포 용해물내에서 관측된 예시적인 CFTR 단백질 수준을 보여준다. 세포를 24 시간 후-형질감염으로 수확하였다. TFF 정제된 mRNA 대 스핀-칼럼 (상업적 키트) hCFTR mRNA 번역 능력의 비교를 나타낸다.
도 15는 제공된 방법에 따라 정제되고 여과되는 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA의 시험관내 전사 (IVT) 샘플로부터 예시적인 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 ASS1 mRNA 대규모 (5G) 후 침전동안 잔류하였다.
도 16은 제공된 방법에 따라 정제되고 여과되는 (전- 및 후-캡핑된/테일링된) 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA의 시험관내 전사 (IVT) 샘플로부터 예시적인 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 ASS1 mRNA 대규모 (5G) 후 침전동안 잔류하였다.
도 17은 제공된 방법에 따라 최종 정제 (5G)후 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA의 예시적인 은-염색된 단백질 겔 뿐만 아니라 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 18은 ASS1 mRNA 처리된 HEK293T 세포의 세포 용해물내에서 관측된 예시적인 인간 ASS1 단백질 생산을 보여준다. 세포를 24 시간 후-형질감염으로 수확하였다. 스핀-칼럼 정제된 mRNA (상업적 키트) 대 침전-TFF 정제된 ASS1 mRNA (5G) 번역 능력의 비교를 나타낸다.
도 19는 아가로스 겔 전기영동에 의해 나타낸 바와 같이 제공된 방법에 따라 정제 및 여과되는 (전- 및 후-캡핑된/테일링된) 낭포성 섬유증 막통과 전도도 조절물질 (CFTR) mRNA의 시험관내 전사 (IVT) 샘플에서 예시적인 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 CFTR mRNA 대규모 (10G) 후 침전동안 잔류하였다.
도 20은 제공된 방법에 따라 최종 정제 (10G)후 낭포성 섬유증 막통과 전도도 조절물질 (CFTR) mRNA의 예시적인 은-염색된 단백질 겔 뿐만 아니라 반응에서 존재하는 대조군 효소를 보여준다.
도 21은 대규모 생산 및 정제로부터 hCFTR mRNA-형질감염된 HEK293T 세포의 세포 용해물내에서 관측된 예시적인 CFTR 단백질 수준을 보여준다. 세포를 24 시간 후-형질감염으로 수확하였다.
도 22는 25G 규모 생산에서 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA의 시험관내 전사 (IVT) 샘플에서 예시적인 mRNA의 길이를 보여준다. 최대 완전성은 ASS1 mRNA 대규모 (25G) 후 단리동안 잔류하였다.
정의
본 발명이 더욱 쉽게 이해되기 위해서, 어떤 용어들은 아래에서 먼저 정의된다. 하기 용어들 및 다른 용어들에 대한 추가 정의는 명세서 전반에 걸쳐 제시된다.
동물: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동물"은 동물계의 임의의 구성원을 언급한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 개발 단계에서 인간을 언급한다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 개발 단계에서 비-인간 동물을 언급한다. 특정 구현예에서, 비-인간 동물은 포유동물 (예를 들면, 설치류, 마우스, 랫트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류, 및/또는 돼지)이다. 일부 구현예에서, 동물은, 비제한적으로, 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충, 및/또는 벌레를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 형질전환 동물, 유전적으로-조작된 동물, 및/또는 클론일 수 있다.
대략 또는 약: 본원에서 사용된 바와 같이, 하나 이상의 해당 값에 적용되는 바와 같이, 용어 "대략" 또는 "약,"은 언급된 참조 값에 유사한 값을 언급한다. 특정 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되지 않는 한 또는 (그 숫자가 가능한 값의 100 %를 초과하는 것을 제외하는) 맥락으로부터 달리 명백하게 언급된 참조 값의 어느 방향 (초과 또는 미만)에서 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % 내에, 또는 그 미만에 해당하는 값의 범위를 언급한다.
생물학적 활성: 본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "생물학적 활성"은 생물학적 시스템에서, 및 특히 유기체에서 활성을 갖는 임의의 제제의 특징을 언급한다. 예를 들면, 유기체에 투여되는 경우, 그 유기체에 생물학적 효과를 갖는 제제는 생물학적 활성이 있는 것으로 고려된다.
발현: 본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 서열의 "발현"은 mRNA의 폴리펩티드로의 번역, 다중 폴리펩티드의 온전한 단백질로의 어셈블리 및/또는 폴리펩티드 또는 완전히 어셈블리된 단백질의 번역후 변형을 언급한다. 본 출원에서, 용어들 "발현" 및 "생산," 및 문법적 동등물은 교환가능하게 사용된다.
기능적: 본원에서 사용된 바와 같이, "기능적" 생물학적 분자는 특징으로 하는 특성 및/또는 활성을 나타내는 형태의 생물학적 분자이다.
개선하다, 증가하다, 또는 감소하다: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "개선하다," "증가하다" 또는 "감소하다," 또는 문법적 동등물은 기준 측정, 예컨대 본원에 기재된 처리의 개시에 앞서 동일한 개체에서의 측정, 또는 본원에 기재된 처리의 부재시 대조군 대상체 (또는 다중 대조군 대상체)에서의 측정에 대한 값을 나타낸다. "대조군 대상체"는 치료될 대상체와 약 동일한 연령인, 치료될 대상체와 동일한 형태의 질환으로 고통받는 대상체이다.
불순물: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "불순물"은 표적 물질 또는 화합물의 화학 조성물과 상이한, 국한된 양의 액체, 기체, 또는 고체 내부의 물질을 언급한다. 불순물은 또한 오염물질로 언급된다.
시험관내: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "시험관내"는 다중-세포성 유기체 내에서 보다는, 인공 환경에서, 예를 들면, 시험관 또는 반응 용기에서, 세포 배양, 등에서 발생하는 이벤트를 언급한다.
생체내: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생체내"는 다중-세포성 유기체, 예컨대 인간 및 비-인간 동물 내에서 발생하는 이벤트를 언급한다. 세포 기반 시스템의 맥락에서, 상기 용어는 (예를 들면, 시험관내 시스템과 대조적으로) 살아 있는 세포 내에서 발생하는 이벤트를 언급하는데 사용될 수 있다.
단리된: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 (1) (자연에서 및/또는 실험적 세팅에서) 초기에 생산된 경우 관련되었던 성분의 적어도 일부로부터 분리된, 및/또는 (2) 사람의 손에 의해 생산된, 제조된, 및/또는 제작된 물질 및/또는 독립체를 언급한다. 단리된 물질 및/또는 독립체는 이들이 초기에 관련되었던 약 10 %, 약 20 %, 약 30 %, 약 40 %, 약 50 %, 약 60 %, 약 70 %, 약 80 %, 약 90 %, 약 91 %, 약 92 %, 약 93 %, 약 94 %, 약 95 %, 약 96 %, 약 97 %, 약 98 %, 약 99 %, 또는 약 99 % 초과의 다른 성분으로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 제제는 약 80 %, 약 85 %, 약 90 %, 약 91 %, 약 92 %, 약 93 %, 약 94 %, 약 95 %, 약 96 %, 약 97 %, 약 98 %, 약 99 %, 또는 약 99 % 초과 순수하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 물질은 다른 성분이 실질적으로 없다면 "순수한"이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단리된 물질 및/또는 독립체의 퍼센트 순도 계산은 부형제 (예를 들면, 완충액, 용매, 물, 등)를 포함하지 않아야 한다.
메신저 RNA ( mRNA ): 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "메신저 RNA (mRNA)"는 적어도 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 언급한다. 본원에서 사용된 바와 같이 mRNA는 모든 변형된 및 비변형된 RNA를 포함한다. mRNA는 하나 이상의 암호화 및 비-암호화 영역을 함유할 수 있다.
mRNA 완전성: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "mRNA 완전성"은 일반적으로 mRNA의 품질을 언급한다. 일부 구현예에서, mRNA 완전성은 정제 공정 (예를 들면, 접선 유동 여과) 이후 분해되지 않는 mRNA의 백분율을 언급한다. mRNA 완전성은 당해기술에서 잘 알려진 방법을 이용하여, 예를 들면, RNA 아가로스 겔 전기영동 (예를 들면, Ausubel 등, John Weley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology)에 의해 측정될 수 있다.
핵산: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산,"은 그 가장 넓은 의미로, 폴리뉴클레오티드 사슬내에 편입되거나 또는 편입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 언급한다. 일부 구현예에서, 핵산은 포스포디에스테르 연결부를 통해 폴리뉴클레오티드 사슬내에 편입되거나 또는 편입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질이다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별적인 핵산 잔기 (예를 들면, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 언급한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 개별적인 핵산 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 사슬을 언급한다. 일부 구현예에서, "핵산"은 RNA 뿐만 아니라 단일 및/또는 이중-가닥 DNA 및/또는 cDNA를 포함한다. 더욱이, 용어들 "핵산," "DNA," "RNA," 및/또는 유사한 용어들은 핵산 유사체, 즉, 포스포디에스테르 골격을 갖지 않는 유사체를 포함한다. 예를 들면, 당해기술에 공지되어 있고 그리고 골격에서 포스포디에스테르 결합 대신 펩티드 결합을 갖는 소위 "펩티드 핵산,"이 본 발명의 범위내로 고려된다. 용어 "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 변성 버전이고/이거나 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및/또는 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다. 핵산은 재조합 발현 시스템을 이용하여 생산된 및 임의로 정제된, 화학적으로 합성된 천연 공급원 등으로부터 정제될 수 있다. 적절한 경우, 예를 들면, 화학적으로 합성된 분자의 경우, 핵산은 뉴클레오시드 유사체 예컨대 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 골격 변형을 갖는 유사체 등을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 다르게 명시되지 않는 한 5' 내지 3' 방향으로 존재한다. 일부 구현예에서, 핵산은 하기이거나 하기를 포함한다: 천연 뉴클레오시드 (예를 들면, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘); 뉴클레오시드 유사체 (예를 들면, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기 (예를 들면, 메틸화된 염기); 삽입된 염기; 변형된 당류 (예를 들면, 2'-플루오로리보오스, 리보오스, 2'-데옥시리보오스, 아라비노오스, 및 헥소오스); 및/또는 변형된 포스페이트 그룹 (예를 들면, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결부). 일부 구현예에서, 본 발명은, 전달을 촉진하기 위해 또는 달성하기 위해 화학적으로 변형되지 않는 핵산 (예를 들면, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드를 포함하여, 폴리뉴클레오티드 및 잔기)을 의미하는, "비변형된 핵산,"에 특이적으로 관련한다.
환자: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "환자" 또는 "대상체"는, 예를 들면, 실험적, 진단적, 예방적, 미용적, 및/또는 치료적 목적을 위해, 제공된 조성물이 투여될 수 있는 임의의 유기체를 언급한다. 전형적인 환자는 동물 (예를 들면, 포유동물 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 비-인간 영장류, 및/또는 인간)을 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 인간이다. 인간은 출산 전 및 후 형태를 포함한다.
약제학적으로 허용가능한: 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "약제학적으로 허용가능한"은, 합리적인 유익/유해 비율에 상응하는, 과도한 독성, 자극, 알러지성 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 건전한 의료 판단의 범위 내에서 인간 및 동물의 조직과 접촉시 사용에 적합한 물질을 언급한다.
미숙하게 중절된 RNA 서열: 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "미숙하게 중절된 RNA 서열"은 mRNA 합성 반응 (예를 들면, 시험관내 합성 반응)의 불완전한 생성물을 언급한다. 다양한 이유로, RNA 폴리머라제는 DNA 주형의 전사를 항상 완성하지 않는다; 즉, RNA 합성이 미숙하게 종료한다. RNA 합성의 미숙한 종료의 가능한 원인은 DNA 주형의 품질, 주형에 존재하는 특정한 폴리머라제용 폴리머라제 종결자 서열, 분해된 완충액, 온도, 리보뉴클레오티드의 고갈, 및 mRNA 2차 구조를 포함한다. 미숙하게 중절된 RNA 서열은 원하는 전사 생성물의 의도된 길이 미만인 임의의 길이일 수 있다. 예를 들면, 미숙하게 중절된 mRNA 서열은 1000 미만 염기, 500 미만 염기, 100 미만 염기, 50 미만 염기, 40 미만 염기, 30 미만 염기, 20 미만 염기, 15 미만 염기, 10 미만 염기 또는 더 적을 수 있다.
염: 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "염"은 산과 염기 사이의 중화 반응에서 비롯되거나 비롯될 수 있는 이온성 화합물을 언급한다.
대상체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 또는 임의의 비-인간 동물 (예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 언급한다. 인간은 출생 전 및 출생 후 형태를 포함한다. 많은 구현예에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 환자일 수 있고, 이는 질환의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 제공하는 인간을 언급한다. 용어 "대상체"는 "개체" 또는 "환자"와 상호교환적으로 본원에서 사용된다. 대상체는 질환 또는 장애로 고통받을 수 있거나 또는 이에 민감하지만 질환 또는 장애의 증상을 나타낼 수 있거나 나타내지 않을 수 있다.
실질적으로: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로"는 해당 특징 또는 특성의 총 또는 거의-총 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 상태를 언급한다. 생물학 분야에서의 숙련가는 생물학적 및 화학적 현상이 드물게, 설사 하더라도, 완료하고/하거나 완성도에 이르거나 또는 절대적 결과를 달성 또는 회피한다는 것을 이해할 것이다. 용어 "실질적으로"는 따라서 많은 생물학적 및 화학적 현상에서 고유한 완성도의 잠재적인 부족을 포집하기 위해 본원에서 사용된다.
실질적으로 없는: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 없는"은 제거되는 물질(예를 들면, 미숙하게 중절된 RNA 서열)이 상대적으로 적은 양 또는 없는 양으로 존재하는 상태를 언급한다. 예를 들면, "미숙하게 중절된 RNA 서열이 실질적으로 없는"은 미숙하게 중절된 RNA 서열이 대략 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1.0 %, 0.9 %, 0.8 %, 0.7 %, 0.6 %, 0.5 %, 0.4 %, 0.3 %, 0.2 %, 0.1 % 미만 또는 더 적은 (w/w) 불순물의 수준으로 존재한다는 것을 의미한다. 대안적으로, "미숙하게 중절된 RNA 서열이 실질적으로 없는"은 미숙하게 중절된 RNA 서열이 약 100 ng, 90 ng, 80 ng, 70 ng, 60 ng, 50 ng, 40 ng, 30 ng, 20 ng, 10 ng, 1 ng, 500 pg, 100 pg, 50 pg, 10 pg 미만, 또는 더 적은 수준으로 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명은, 다른 것들 중에서, mRNA 침전 그 다음 막 여과 (예를 들면, 접선 유동 여과)를 포함하는 공정에 기반하여 불순한 제제 (예를 들면, 시험관내 합성 반응 혼합물)로부터 mRNA의 개선된 정제 방법을 제공한다.
본 발명의 다양한 측면은 하기 섹션에 상세히 기재된다. 섹션의 사용은 본 발명을 제한하는 의미는 아니다. 각각의 섹션은 본 발명의 임의의 측면에 적용할 수 있다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 다르게 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다.
mRNA의
합성
본 발명은 임의의 mRNA를 정제하는데 사용될 수 있다. mRNA는 전형적으로 정보를 DNA로부터 리보솜으로 전달하는 RNA의 유형으로서 생각된다. mRNA의 존재는 전형적으로 매우 짧고 처리 및 번역, 그 다음 분해를 포함한다. 전형적으로, 진핵 유기체에서, mRNA 처리는 N-터미널 (5') 말단에 "캡", 및 C-터미널 (3') 말단에 "테일"의 부가를 포함한다. 전형적인 캡은 제 1 전사된 뉴클레오티드에 5'-5'-삼인산 결합을 통해 연결되는 구아노신인 7-메틸구아노신 캡이다. 캡의 존재는 대부분의 진핵 세포에서 발견되는 뉴클레아제에 내성을 제공하는데 중요하다. 테일은 전형적으로 폴리아데닐화 이벤트이고 이로써 폴리아데닐릴 모이어티가 mRNA 분자의 3' 말단에 부가된다. 이러한 "테일"의 존재는 mRNA를 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호하는 작용을 한다. 메신저 RNA는 리보솜에 의해 단백질을 이루는 일련의 아미노산으로 번역된다.
본 발명에 따른 mRNA는 임의의 다양한 공지된 방법에 따라 합성될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 mRNA는 시험관내 전사 (IVT)를 통해 합성될 수 있다. 간단히, IVT는 전형적으로 프로모터, 리보뉴클레오티드 삼인산의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충액 시스템, 및 적절한 RNA 폴리머라제 (예를 들면, T3, T7 또는 SP6 RNA 폴리머라제), DNAse I, 파이로포스파타제, 및/또는 RNAse 저해제를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 주형으로 수행된다. 정확한 상태는 특정 적용에 따라 다양할 것이다. 이들 시약의 존재는 몇 개의 구현예에 따른 최종 생성물에서 바람직하지 않고 따라서 불순물로서 언급될 수 있고 하나 이상의 상기 불순물을 함유하는 제제는 불순한 제제로서 언급될 수 있다.
다양한 구현예에 있어서, 본 발명은 다양한 길이의 시험관내 합성된 mRNA를 정제하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 길이로 약 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb, 3.5 kb, 4 kb, 4.5 kb, 5 kb 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 또는 20 kb 이상의 시험관내 합성된 mRNA를 정제하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 길이로 약 1-20 kb, 약 1-15 kb, 약 1-10 kb, 약 5-20 kb, 약 5-15 kb, 약 5-12 kb, 약 5-10 kb, 약 8-20 kb, 또는 약 8-15 kb 범위의 시험관내 합성된 mRNA를 정제하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 전형적인 mRNA는 길이로 약 1 kb 내지 약 5 kb일 수 있다. 더욱 전형적으로, mRNA는 약 1 kb 내지 약 3 kb의 길이를 가질 것이다. 그러나, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물에서 mRNA는 훨씬 더 길다 (약 20 kb 초과). 일부 구현예에서, 본 발명은 전형적으로 안정성을 높이는 하나 이상의 변형을 함유하는 mRNA를 정제하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 변형된 뉴클레오티드, 변형된 당 포스페이트 골격, 5' 및/또는 3' 미번역된 영역으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 비변형되는 시험관내 합성된 mRNA를 정제하는데 사용될 수 있다.
전형적으로, mRNA는 변형되어 안정성을 높인다. mRNA의 변형은, 예를 들면, RNA의 뉴클레오티드의 변형을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 변형된 mRNA는 따라서, 예를 들면, 골격 변형, 당 변형 또는 염기 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 암호화 mRNA (예를 들면, 중쇄 및 경쇄 암호화 mRNA)는, 비제한적으로, 퓨린 (아데닌 (A), 구아닌 (G)) 또는 피리미딘 (티민 (T), 시토신 (C), 우라실 (U)), 및 변형된 뉴클레오티드 유사체 또는 퓨린 및 피리미딘의 유도체로서, 예컨대 예를 들면 1-메틸-아데닌, 2-메틸-아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐-아데닌, N6-메틸-아데닌, N6-이소펜테닐-아데닌, 2-티오-시토신, 3-메틸-시토신, 4-아세틸-시토신, 5-메틸-시토신, 2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-구아닌, 2-메틸-구아닌, 2,2-디메틸-구아닌, 7-메틸-구아닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 슈도우라실 (5-우라실), 디하이드로-우라실, 2-티오-우라실, 4-티오-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-우라실, 5-(카복시하이드록시메틸)-우라실, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-우라실, 5-메틸-2-티오-우라실, 5-메틸-우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 5-메틸아미노메틸-우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오-우라실, 5'-메톡시카보닐메틸-우라실, 5-메톡시-우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 1-메틸-슈도우라실, 쿠에오신, .베타.-D-만노실-쿠에오신, 와이부톡소신, 및 포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트, 펩티드 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트, 7-데아자구아노신, 5-메틸시토신 및 이노신을 포함하는 천연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체 (변형된 뉴클레오티드)로부터 합성될 수 있다. 상기 유사체의 제조는 예를 들면 미국 특허 번호 4,373,071, 미국 특허 번호 4,401,796, 미국 특허 번호 4,415,732, 미국 특허 번호 4,458,066, 미국 특허 번호 4,500,707, 미국 특허 번호 4,668,777, 미국 특허 번호 4,973,679, 미국 특허 번호 5,047,524, 미국 특허 번호 5,132,418, 미국 특허 번호 5,153,319, 미국 특허 번호 5,262,530 및 5,700,642로부터 당해분야의 숙련가에게 공지되고, 그 개시내용은 참고로 그 전체 범위에서 본원에 포함된다.
전형적으로, mRNA 합성은 N-터미널 (5') 말단에 "캡", 및 C-터미널 (3') 말단에 "테일"의 부가를 포함한다. 캡의 존재는 대부분의 진핵 세포에서 발견되는 뉴클레아제에 내성을 제공하는데 중요하다. "테일"의 존재는 mRNA를 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호하는 작용을 한다.
따라서, 일부 구현예에서, mRNA는 5' 캡 구조를 포함한다. 5' 캡은 전형적으로 하기와 같이 부가된다: 먼저, RNA 터미널 포스파타제가 5' 뉴클레오티드로부터 터미널 포스페이트기의 하나를 제거하여, 2개의 터미널 포스페이트를 이탈시키고; 그 다음 구아노신 삼인산 (GTP)을 구아닐릴 전달효소를 통해 터미널 포스페이트에 부가하여, 5'5'5 삼인산 연결부를 생성하고; 그 다음 구아닌의 7-질소를 메틸전달효소로 메틸화한다. 캡 구조의 예는, 비제한적으로, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')pp p(5')A 및 G(5')ppp(5')G를 포함한다.
시험관내 전사 반응으로부터 제공된 mRNA가 일부 구현예에서 바람직할 수 있는 반면, 박테리아, 진균, 식물, 및/또는 동물로부터 생산된 야생형 mRNA를 포함하는 본 발명의 범위 내로서 mRNA의 다른 공급원이 고려된다.
일부 구현예에서, mRNA는 5' 및/또는 3' 미번역된 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 미번역된 영역은 mRNA의 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소, 예를 들면, 철 반응 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 미번역된 영역은 길이로 약 50 내지 500 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 구현예에서, 3' 미번역된 영역은 하나 이상의 폴리아데닐화 신호, 세포내 위치의 mRNA의 안정성에 영향을 미치는 단백질에 대한 결합 부위, 또는 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 미번역된 영역은 길이로 50 내지 500 뉴클레오티드 또는 더 길 수 있다.
본 발명은 다양한 단백질을 암호화하는 mRNA를 정제하는데 사용될 수 있다. 개똥벌레 루시퍼라아제, 아르기니노석시네이트 합성효소, 인자 IX, 및 CFTR를 암호화하는 mRNA의 정제의 비-제한적인 예는 실시예 섹션에서 상세히 기재된다.
전형적으로, 본 발명은 단일 mRNA 종을 정제하는데 사용된다, 즉 정제되는 mRNA 제제는 단일 유전자 혹은 단일 합성 또는 발현 작제물로부터 유도된 mRNA를 함유한다. 그에 반해서, 세포로부터 정제된 총 mRNA는 다중 mRNA 종을 함유한다.
본 발명에 따른 정제 공정은 합성 동안 또는 이후 수행될 수 있다. 예를 들면, mRNA는 캡 및/또는 테일이 mRNA에 부가되기 전에 본원에 기재된 바와 같이 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 캡 및/또는 테일이 mRNA에 부가된 후에 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 캡이 부가된 후에 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 캡 및/또는 테일이 mRNA에 부가되기 전 및 후 모두에 정제된다. 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 정제 단계는, 임의로 다른 정제 공정, 예컨대 투석과 함께, mRNA 합성의 각각의 단계후에 수행될 수 있다. 예를 들면, mRNA는 투석처리하여 (예를 들면, 테일과 또는 테일 없이) 초기 합성 이후 쇼트머를 제거할 수 있고 그리고 그 다음 본원에 기재된 바와 같이 침전 및 정제 처리하고, 그 다음 캡 및/또는 테일의 부가 이후, 침전 및 정제에 의해 다시 정제될 수 있다.
mRNA의
침전
본 발명에 따르면, mRNA는, 당해기술에 공지된 다양한 침전 방법을 이용하여, 불순한 제제, 예컨대 시험관내 합성 반응 혼합물로부터 침전될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "침전" (또는 이의 임의의 문법적 동등물)은 용액내 고체의 형성을 언급한다. mRNA와 관련하여 사용될 때, 용어 "침전"은 액체내 mRNA의 불용성 또는 고체 형태의 형성을 언급한다.
mRNA 침전에 적합한 임의의 및 모든 방법은 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, mRNA 침전은 변성 상태를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변성 상태"는 mRNA의 원상태 확인의 파괴를 유발할 수 있는 임의의 화학적 또는 물리적 상태를 언급한다. 분자의 원상태 형태가 보통 최고 수용성이기 때문에, 분자의 2차 및 3차 구조 파괴가 용해도 변화를 유발할 수 있고 용액으로부터 mRNA의 침전을 야기할 수 있다.
예를 들면, 불순한 제제로부터 mRNA 침전의 적합한 방법은 불순한 제제를 변성 시약으로 처리하고 이로써 mRNA가 침전하는 것을 포함한다. 본 발명에 적합한 예시적인 변성 시약은, 비제한적으로, 리튬 클로라이드, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 구아니디늄 이소티오시아네이트, 암모늄 아세테이트 및 이들의 조합을 포함한다. 적합한 시약은 고체 형태로 또는 용액으로 제공될 수 있다.
비제한적인 예로서, 구아니디늄 티오시아네이트는 mRNA를 침전하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 구아니디늄 티오시아네이트는 용액에서 약 1 M 이상, 약 2 M 이상, 약 3 M 이상, 약 4 M 이상, 약 5 M 이상, 약 6 M 이상, 약 7 M 이상, 약 8 M 이상, 약 9 M 이상, 또는 약 10 M 이상의 농도로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 침전에 적합한 용액은 구아니디늄 티오시아네이트를 약 4 M의 농도로 함유한다.
변성 시약에 더하여, mRNA 침전에 적합한 용액은 추가의 염, 계면활성제 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 적합한 용액은 나트륨 라우릴 사르코실 및/또는 나트륨 시트레이트를 추가로 포함할 수 있다. 비-제한적 예로서, mRNA 침전에 적합한 용액은 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, 0.5 % 나트륨 라우릴 사르코실, 및 25 mM 나트륨 시트레이트; 또는 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, 및 0.5 % 나트륨 라우릴 사르코실; 또는 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, 및 25 mM 나트륨 시트레이트를 함유할 수 있다.
전형적으로, mRNA의 실질적인 양의 침전을 허용하는 원하는 온도에서 일정 기간 동안 본원에 기재된 하나 이상의 변성 시약으로 불순한 제제를 인큐베이션하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 불순한 제제 및 변성제의 혼합물은 실온 또는 주위 온도에서 일정 기간 동안 인큐베이션될 수 있다. 전형적으로, 적합한 인큐베이션 시간은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 또는 60 분 이상의 기간이다. 일부 구현예에서, 적합한 인큐베이션 시간은 약 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5 분 이하의 기간이다. 일부 구현예에서, 혼합물은 약 5 분동안 실온에서 인큐베이션된다. 전형적으로, "실온" 또는 "주위 온도"는 약 20-25 ℃ 범위를 갖는 온도, 예를 들면, 약 20 ℃, 21 ℃, 22 ℃, 23 ℃, 24 ℃, 또는 25 ℃를 언급한다. 일부 구현예에서, 불순한 제제 및 변성제의 혼합물은 또한 실온 초과 (예를 들면, 약 30-37 ℃ 또는 특히, 약 30 ℃, 31 ℃, 32 ℃, 33 ℃, 34 ℃, 35 ℃, 36 ℃, 또는 37 ℃) 또는 실온 미만 (예를 들면, 약 15-20 ℃ 또는 특히, 약 15 ℃, 16 ℃, 17 ℃, 18 ℃, 19 ℃, 또는 20 ℃)에서 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 기간은 인큐베이션 온도에 기반하여 조정될 수 있다. 전형적으로, 높은 인큐베이션 온도는 짧은 인큐베이션 시간을 필요로 한다.
대안적으로 또는 추가로, 용매는 mRNA 침전을 촉진하는데 사용될 수 있다. 적합한 예시적인 용매는, 비제한적으로, 이소프로필 알코올, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 에탄올, 메탄올, 데나토늄, 및 이들의 조합을 포함한다. 예를 들면, 용매 (예를 들면, 무수 에탄올)는 본원에 기재된 바와 같이 불순한 제제에 변성 시약과 함께 또는 변성 시약의 부가 및 인큐베이션 이후 부가되어, 추가로 mRNA 침전을 높이고/높이거나 촉진시킬 수 있다. 전형적으로, 적합한 용매 (예를 들면, 무수 에탄올)의 부가 이후, 혼합물은 또 다른 기간동안 실온에서 인큐베이션될 수 있다. 전형적으로, 인큐베이션 시간의 적합한 기간은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 또는 60 분 이상이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적합한 기간은 약 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5 분 이하의 기간이다. 전형적으로, 혼합물은 또 다른 약 5 분동안 실온에서 인큐베이션된다. 실온 초과 또는 미만의 온도는 인큐베이션 시간의 적절한 조정으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 인큐베이션은 침전을 위해 4 ℃ 또는 -20 ℃에서 발생할 수 있다.
전형적으로, 본원에서 기재된 방법은 불순한 제제로부터 실질적인 양의 mRNA의 침전을 유발한다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 방법은 불순한 제제로부터 적어도 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 %의 총 mRNA의 침전을 유발한다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 방법은 불순한 제제로부터 실질적으로 100 %의 총 mRNA의 침전을 유발한다.
막 여과
본 발명에 따르면, 침전된 mRNA를 함유하는 불순한 제제는 막 여과를 포함하는 정제 공정 처리되어 침전된 mRNA는 막에 의해 포집되거나 보유될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 불순한 제제는 막 여과 처리된 다음 전처리 없이 침전되어 불용물을 제거한다.
다양한 유형의 막 여과는 침전된 mRNA를 포집 또는 보유하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 막 여과는 하나 이상의 개재된 투과성 막을 이용하여 유체로부터 고체를 분리하는 것을 포함한다. 막 여과는 또한 기체성 샘플로부터 입자를 여과하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 말하면, 막 여과의 2개의 주요한 형태, 용액-확산으로 인해 단독으로 진행하는 수동적 여과, 및 막을 가로질러 액체 또는 기체를 강제하기 위해 양성 압력 또는 음성 압력 (즉 진공)을 이용하는 능동적 여과가 있다.
mRNA 정제용 막 여과를 포함하는 예시적인 공정은 도 1에 나타난다. 전형적으로, 상기 공정은 적재, 세정 및 용출 단계를 포함한다.
적재
전형적으로, 적재 단계는 공급물 (예를 들면, 침전된 mRNA를 함유하는 불순한 제제)을 막에 적재하고 양성 또는 음성 압력에 의해 돌파하여, 막에 포집된 또는 보유된 보전물을 이탈시키는 것을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보전물"은 막에 의해 보유되는 임의의 비-투과성 용질 및/또는 불용물을 언급한다. 본 발명에 따르면, 침전된 mRNA는 보전물로서 막에 의해 포집된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "막"은 물질의 임의의 다공성 층 또는 시트를 언급한다. 본 출원에서, 용어 "막"은 필터와 교환적으로 사용된다.
일부 구현예에서, 적합한 막은 침전된 mRNA 포집 또는 보유에 적절한 기공 크기를 가지면서, (기공 크기 미만의 크기를 갖는 가용성 불순물 및/또는 불용물을 포함하는) 불순물을 투과시 통과시킨다. 일부 구현예에서, 적합한 막은 약 0.10 ㎛, 0.20 ㎛, 0.22 ㎛, 0.24 ㎛, 0.26 ㎛, 0.28 ㎛, 0.30 ㎛, 0.40 ㎛, 0.5 ㎛, 또는 1.0 ㎛ 이상의 평균 기공 크기를 갖는다. 특정 구현예에서, 적합한 막은 약 0.22 ㎛의 평균 기공 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA 보유에 적절한 기공 크기는, 또한 분획 분자량 (MWCO)으로 언급되는, 침전된 mRNA의 명목 분자량 제한 (NMWL)에 의해 측정될 수 있다. 전형적으로, 침전된 mRNA의 NMWL 또는 MWCO 미만의 기공 크기를 갖는 막이 사용된다. 일부 구현예에서, 침전된 mRNA의 NMWL 또는 MWCO 아래 2 내지 6 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 또는 6) 배의 기공 크기를 갖는 막이 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 막은 약 100 킬로달톤 (kDa), 300 kDa, 500 kDa, 1,000 kDa, 1,500 kDa, 2,000 kDa, 2,500 kDa, 3,000 kDa, 3,500 kDa, 4,000 kDa, 4,500 kDa, 5,000 kDa, 5,500 kDa, 6,000 kDa, 6,500 kDa, 7,000 kDa, 7,500 kDa, 8,000 kDa, 8,500 kDa, 9,000 kDa, 9,500 kDa, 또는 10,000 kDa 이상의 기공 크기를 가질 수 있다.
본 발명에 적합한 막은 임의의 물질로 구성될 수 있다. 예시적인 막 물질은, 비제한적으로, 폴리에테르설폰 (mPES) (변형되지 않음), 폴리에테르설폰 (mPES) 중공 섬유 막, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 셀룰로오스 아세테이트, 니트로셀룰로오스, MCE (혼합된 셀룰로오스 에스테르), 초고 MW 폴리에틸렌 (UPE), 폴리플루오로테트라에틸렌 (PTFE), 나일론, 폴리설폰, 폴리에테르 설폰, 폴리아크릴로니트릴, 폴리프로필렌, 폴리비닐 클로라이드, 및 이들의 조합을 포함한다.
본 발명에 적합한 막은 다양한 표면적을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 막은 mRNA의 대규모 생산을 촉진하기 위해 충분히 큰 표면적을 갖는다. 예를 들면, 적합한 막은 약 2,000 cm2, 2,500 cm2, 3,000 cm2, 3,500 cm2, 4,000 cm2, 4,500 cm2, 5,000 cm2, 7,500 cm2, 10,000 cm2, 5 m2, 10 m2, 12 m2, 15m2, 20m2, 24 m2, 25 m2, 30m2, 또는 50 m2 이상의 표면적을 가질 수 있다.
막 여과는 침전된 mRNA를 포집하기 위해 다양한 구성방식으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 막 여과는 접선 유동 여과 (TFF)의 일부로서 수행된다.
또한 교차-유동 여과로 언급되는 접선 유동 여과 (TFF)는 여과되는 물질이 관통하기 보다는 필터를 가로질러 접선으로 통과되는 유형의 여과이다. TFF에서, 원하지 않는 투과물은 필터를 통해 통과하는 반면, 원하는 보전물 (예를 들면, 침전된 mRNA)은 필터를 따라 통과하고 필터 또는 막 다운스트림으로 포집되거나 또는 보유된다.
접선 유동 여과의 주요한 이점은 전통적 "막다른" 여과 동안 응집할 수 있고 그리고 필터 (때때로 "필터 케이크" 로 언급됨)를 차단할 수 있는 비-투과성 보전물이 대신 필터의 표면을 따라 담지되는 것이다. 이러한 이점은 접선 유동 여과를 침전된 mRNA의 대규모 정제에 특히 적합하도록 한다. 일부 구현예에서, 약 1 그램, 10 그램, 50 그램, 100 그램, 200 그램, 300 그램, 400 그램, 500 그램, 600 그램, 700 그램, 800 그램, 900 그램, 1 kg, 5 kg, 10 kg, 50 kg, 또는 100 kg 이상의 mRNA의 적재가 뱃치마다 적용될 수 있다.
전형적인 TFF 공정에서 중요한 적어도 3개의 공정 변수: 막통과 압력, 공급 속도, 및 투과물의 유속. 막통과 압력은 유체가 필터를 뚫어나가는 힘이고, 그와 함께 투과성 분자를 이동시킨다. 일부 구현예에서, 막통과 압력은 제곱 인치당 (psi) 포괄적으로 1 내지 30 파운드이다.
공급 속도 (또한 교차유동 속도로 공지됨)는 공급물 채널을 통한 및 필터를 가로지른 용액 흐름의 속도이다. 공급 속도는, 달리 필터를 막을 수 있거나 오염시킬 수 있고 그에 의해 여과액 흐름을 제한시키는 분자를 일소하는 힘을 측정한다. 일부 구현예에서, 공급 속도는 1 내지 500 L/분이다. 일부 구현예에서, 공급 속도는 50 내지 800 mL/분이다. 일부 구현예에서, 공급 속도는 50 내지 750 mL/분이다. 일부 구현예에서, 공급 속도는 50 내지 300 mL/분이다. 일부 구현예에서, 공급 속도는 50 내지 200 mL/분이다. 일부 구현예에서, 공급 속도는 75 내지 200 mL/분이다. 일부 구현예에서, 공급 속도는 100 내지 200 mL/분이다. 일부 구현예에서, 공급 속도는 125 내지 175 mL/분이다. 일부 구현예에서, 공급 속도는 130 mL/분이다. 일부 구현예에서, 공급 속도는 60 mL/분 내지 220 mL/분이다. 일부 구현예에서, 공급 속도는 60 mL/분 이상이다. 일부 구현예에서, 공급 속도는 100 mL/분 이상이다. 일부 구현예에서, 공급 속도는 150 mL/분 이상이다. 일부 구현예에서, 공급 속도는 200 mL/분 이상이다. 일부 구현예에서, 공급 속도는 220 mL/분 이상이다.
투과물의 유속은 투과물이 시스템으로부터 제거되는 속도이다. 일정한 공급 속도를 위해, 투과물 유속 증가는 필터를 가로지른 압력을 증가시킬 수 있어서, 증대된 여과 속도를 유발하면서 또한 잠재적으로 필터 막힘 또는 오염의 위험을 증가시킨다. TFF를 위해 사용된 원리, 이론, 및 디바이스는 마이클(Michaels) 등, "접선 유동 여과" in Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications (W. P. Olson, ed., Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, Ill. 1995)에 기재된다. 또한 하기를 참조한다: TFF에 대한 개선을 나타내는, 고성능 접선 유동 여과 (HP-TFF)의 설명을 위해 미국 특허 번호 5,256,294 및 5,490,937. 일부 구현예에서, 유속은 1 내지 100 L/분이다. 일부 구현예에서, 유속은 10 내지 100 mL/분이다. 일부 구현예에서, 유속은 10 내지 90 mL/분이다. 일부 구현예에서, 유속은 10 내지 80 mL/분이다. 일부 구현예에서, 유속은 10 내지 70 mL/분이다. 일부 구현예에서, 유속은 10 내지 60 mL/분이다. 일부 구현예에서, 유속은 10 내지 50 mL/분이다. 일부 구현예에서, 유속은 10 내지 40 mL/분이다. 일부 구현예에서, 유속은 20 내지 40 mL/분이다. 일부 구현예에서, 유속은 30 mL/분이다.
본원에 기재된 다양한 공정 변수의 임의의 조합이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 접선 유동 여과는 대략 100-200 mL/분 (예를 들면, 대략 100-180 mL/분, 100-160 mL/분, 100-140 mL/분, 110-190 mL/분, 110-170 mL/분, 또는 110-150 mL/분)의 공급 속도 및/또는 대략 10-50 mL/분 (예를 들면, 대략 10-40 mL/분, 10-30 mL/분, 20-50 mL/분, 또는 20-40 mL/분)의 유속으로 수행된다. 일부 구현예에서, 접선 유동 여과는 대략 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200 mL/분의 공급 속도 및/또는 대략 10, 20, 30, 40, 또는 50 mL/분의 유속으로 수행된다. 다른 구현예에서, 접선 유동 여과는 대략 500, 750 mL/분, 1, 2, 3, 4, 또는 5 L/분의 공급 속도 및/또는 대략 100, 200, 250, 500, 750 mL/분 또는 1 L/분의 유속으로 수행된다.
세정
전형적으로, 포집된 불용성 mRNA는 막에 보유된 불순물을 제거하기 위해 용출 전에 세정될 수 있다. 일부 구현예에서, 세정 단계는 하나 이상의 세정 용액을 이용하는 다중 린스 사이클을 포함한다. 예를 들면, 세정 단계는 구아니디늄 완충액 및 에탄올, 그 다음 70-80 % 에탄올 (예를 들면, 약 70 %, 75 %, 또는 80 % 에탄올)을 이용하는 다중 린스 사이클에 의해 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 다중 린스 사이클은 2 초과, 3 초과, 4 초과, 5 초과, 6 초과, 7 초과, 8 초과, 9 초과, 또는 10 초과 사이클이다.
용출
전형적으로, 포집된 또는 보유된 mRNA는 침전된 mRNA를 용액속에서 재가용화시킴으로써 용출될 수 있다. 예를 들면, 포집된 mRNA는 RNAse가 없는 물로 용출될 수 있다. 특정 구현예에서, 포집된 mRNA 용출은 RNAse가 없는 물 재순환을 포함한다. 예를 들면, RNAse가 없는 물은 약 5-30 분 (예를 들면, 약 5-25 분, 약 5-20 분, 또는 약 5-15 분)동안 순환될 수 있다. 특정 구현예에서, RNAse가 없는 물은 약 5-10 분동안 (예를 들면, 약 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 분동안) 재-순환된다.
일부 구현예에서, 재가용화된 mRNA는 원하는 제형속에서 원하는 농도로 투석될 수 있다. 다양한 제형이 투석에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 용액은 1 mM 나트륨 시트레이트로 투석된다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 용액은 나트륨 아세테이트, 암모늄 카보네이트, 암모늄 바이카보네이트, 피리디늄 아세테이트, 피리디늄 포르메이트, 암모늄 아세테이트, 우레아, 칼륨 클로라이드 등으로 투석된다. 해당 mRNA의 크기에 따라, 적절한 분획 분자량 (MWCO)을 갖는 투석 막이 사용될 수 있다. 예를 들면, 적합한 투석 막은 약 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa, 100 kDa, 150 kDa, 200 kDa, 250 kDa, 300 kDa, 350 kDa, 400 kDa, 450 kDa, 또는 500 kDa의 MWCO를 가질 수 있다.
정제된
mRNA의
특성규명
본 발명에 의해 제공된 특정한 이점은 큰 또는 상업적 규모로 mRNA, 특히, 시험관내 합성된 mRNA를 정제하는 능력이다. 예를 들면, 시험관내 합성된 mRNA는 뱃치 당 약 1 그램, 10 그램, 50 그램, 100 그램, 200 그램, 300 그램, 400 그램, 500 그램, 600 그램, 700 그램, 800 그램, 900 그램, 1 kg, 5 kg, 10 kg, 50 kg, 또는 100 kg 이상의 규모로 정제될 수 있다. 하나의 특별한 구현예에서, 시험관내 합성된 mRNA는 뱃치당 10 그램의 규모로 정제될 수 있다. 또 다른 특별한 구현예에서, 시험관내 합성된 mRNA는 뱃치당 100 그램의 규모로 정제될 수 있다. 거기에 또 다른 특정한 구현예에서, 시험관내 합성된 mRNA는 뱃치당 1 kg의 규모로 정제될 수 있다.
다양한 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는, 비제한적으로, 미숙하게 중절된 RNA 서열, DNA 주형, 및/또는 시험관내 합성에서 사용된 효소 시약을 포함하여 mRNA 합성 공정으로부터 불순물이 실질적으로 없다.
특히, 본 발명은 고도의 미숙하게 중절된 RNA 서열 (또한 "쇼트머(shortmer)"로 공지됨)을 제거하거나 또는 없앤다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 약 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 초과 또는 실질적으로 모든 미숙하게 중절된 RNA 서열을 제거한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 미숙하게 중절된 RNA 서열이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 약 5 % 미만 (예를 들면, 약 4 %, 3 %, 2 %, 또는 1 % 미만)의 미숙하게 중절된 RNA 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 약 1 % 미만 (예를 들면, 약 0.9 %, 0.8 %, 0.7 %, 0.6 %, 0.5 %, 0.4 %, 0.3 %, 0.2 %, 또는 0.1 % 미만)의 미숙하게 중절된 RNA 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는, 예를 들면, 에이티듐(eithidium) 브로마이드 및/또는 쿠마씨 염색에 의해 측정된 바와 같이 검출불가능한 미숙하게 중절된 RNA 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 미숙하게 중절된 RNA 서열은 15 미만 염기 (예를 들면, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3 미만 염기)를 포함한다. 일부 구현예에서, 미숙하게 중절된 RNA 서열은 약 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11, 또는 8-10 염기를 함유한다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은, 비제한적으로, T7 RNA 폴리머라제, DNAse I, 파이로포스파타제, 및/또는 RNAse 저해제를 포함하여 시험관내 합성에서 사용된 고도의 효소 시약을 제거하거나 또는 없앤다. 일부 구현예에서, 본 발명은 T7 RNA 폴리머라제를 제거하는데 특히 효과적이다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 포괄적으로 약 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 초과 또는 시 험관내 합성에서 사용된 실질적으로 모든 효소 시약을 제거한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 포괄적으로 시험관내 합성에서 사용된 효소 시약이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 포괄적으로 시 험관내 합성에서 사용된 약 5 % 미만 (예를 들면, 약 4 %, 3 %, 2 %, 또는 1 % 미만)의 효소 시약을 함유한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 포괄적으로 시험관내 합성에서 사용된 약 1 % 미만 (예를 들면, 약 0.9 %, 0.8 %, 0.7 %, 0.6 %, 0.5 %, 0.4 %, 0.3 %, 0.2 %, 또는 0.1 % 미만)의 효소 시약을 함유한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 포괄적으로, 예를 들면, 에티듐 브로마이드 및/또는 쿠마씨 염색에 의해 측정된 바와 같이 시험관내 합성에서 사용된 검출불가능한 효소 시약을 함유한다.
정제된 mRNA에서 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약의 수준은 당해분야에서 공지된 다양한 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 시험관내 합성에서 사용된 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약은 은 염색, 겔 전기영동, 고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 초고-성능 액체 크로마토그래피 (UPLC), 및/또는 모세관 전기영동을 통해 측정될 수 있다.
다양한 구현예에서, 본원에 기재된 방법을 이용하여 정제된 mRNA는 고도의 완전성을 유지한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "mRNA 완전성"은 일반적으로 정제 이후 mRNA의 품질을 언급한다. 일부 구현예에서, mRNA 완전성은 접선 유동 여과 이후 분해되지 않는 mRNA의 백분율을 언급한다. mRNA 완전성은 당해기술에서 잘 알려진 방법을 이용하여, 예를 들면, RNA 아가로스 겔 전기영동 (예를 들면, Ausubel 등, John Weley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology)에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 약 95 % 초과 (예를 들면, 약 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 초과 또는 더 많은)의 완전성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 98 % 초과의 완전성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 99 % 초과의 완전성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 대략 100 %의 완전성을 갖는다.
치료적 적용을 위한
mRNA의
대규모 뱃치 생산
본 발명은 치료적 적용에 필요한 고도의 순도 및 완전성을 갖는 정제된 mRNA의 대규모 생산을 위한 시급한 요구를 설명한다. 현존하는 방법은 전형적으로 규모 면에서 작고 충분히 비용-효과적으로 인간 대상체 투여에 적합한 mRNA를 상업적 생산하기에 필요한 정도까지 규모화될 수 없다. 그에 반해서, 본 발명의 방법은 실시예에서 증명된 바와 같이 완전히 확장가능하고 약제학적-등급 mRNA의 비용-효과적인 대규모 생산을 허용한다.
본 발명에 따라 생산되는 정제된 mRNA의 각각의 뱃치는 인간 대상체 투여에 적합한 5 그램 이상의 단일 mRNA 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 뱃치는 10 그램 이상의 단일 mRNA 종을 포함한다. 특정 구현예에서, 단일 뱃치는 25 그램 이상의 단일 mRNA 종을 포함한다.
본 발명의 방법은 mRNA 합성 공정으로부터 불순물이 실질적으로 없는 정제된 mRNA 뱃치를 생산한다. 특히, 뱃치는 단일 mRNA 종의 시험관내 합성에서 사용된 미숙하게 중절된 RNA 서열, DNA 주형, 및/또는 효소 시약이 실질적으로 없다. 예를 들면, 본 발명에 따라 생산되는 정제된 mRNA의 뱃치는 시험관내 합성에서 사용된 약 5 % 미만의 효소 시약을 함유한다. 각각의 뱃치에서 정제된 mRNA는 전형적으로 약 95 % 초과의 완전성을 갖는다.
본 발명의 방법에 따라 생산된 mRNA 뱃치는 치료제를 제조하기 위해 하나 이상의 다운스트림 처리 단계(들)을 필요로 하는데 사용될 수 있다. 전형적으로, 각각의 mRNA 뱃치는, 예를 들면 환자에게 투여될 수 있는 지질 나노입자, 리포좀, 폴리머-기반 폴리플렉스 등에 mRNA를 캡슐화시킴으로써 제형화될 것이다. 전형적인 투여 경로는, 비배타적으로, 정제된 mRNA의 정맥내 또는 폐 전달을 포함한다.
실시예
실시예
1. 메신저 RNA (
mRNA
)의 발생 및 정제
메신저 RNA 합성
개똥벌레 루시퍼라아제 (FFL), 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1), 및 인간 낭포성 섬유증 막통과 전도도 조절물질 (CFTR) 메신저 RNA를 시험관내 전사에 의해 유전자를 암호화하는 플라스미드 DNA 주형으로부터 합성하였고, 그 다음 겔 전기영동에 의해 측정된 바와 같이 5' 캡 구조 (캡 1) (Fechter, P.; Brownlee, G.G. "Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249) 및 대략 200 뉴클레오티드 길이의 3' 폴리(A) 테일을 부가하였다. 각각의 mRNA 생성물에 존재하는 5' 및 3' 미번역된 영역을 개별적이고 언급된 바와 같이 정의되는 (하기 참조) X 및 Y로 나타낸다. 표적 메신저 RNA 작제물의 합성은 5' 및 3' 미번역된 영역에 의해 플랭킹된 암호화 서열로 이루어진 초기 가닥이 합성되는 2-단계 공정을 포함하였다. 상기 미캡핑된 및 미테일링된 작제물을 추가로 캡핑 단계, 그 다음 폴리-A 부가 테일링 단계를 통해 정제하고 가공하였다. 테일링 반응의 마지막에서 제 2 정제 단계를 초기 정제 공정과 유사한 방식으로 수행하였다.
예시적 코돈-최적화된 낭포성 섬유증
막통과
조절물질 (
CFTR
)
mRNA
작제물
디자인:
X 1 - 서열 식별 번호: 1 - Y 1
예시적 코돈-최적화된 개똥벌레
루시퍼라아제
(
FFL
)
mRNA
작제물
디자인:
X 1 - 서열 식별 번호: 2 - Y 1
예시적 코돈-최적화된 인간
아르기니노석시네이트
합성효소 (
ASS1
)
mRNA
작제물
디자인:
X 1 - 서열 식변 번호: 3 - Y 2
5' 및 3'
UTR
서열
X
1
=
Y
1
=
Y
2
=
mRNA의
합성
각각의 하기 실시예에서, mRNA의 합성을 완벽한 RNAse가 없는 상태하에서 수행하였다. 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 모든 튜브, 바이알, 피펫 팁, 피펫, 완충액 등은 무 뉴클레아제가 되기 위해 필요하였다.
하기 실시예에서, 다르게 기재되지 않는 한, mRNA를 선형화된 DNA 주형으로부터 시험관내 전사를 통해 합성하였다. 원하는 mRNA 전구체 (IVT) 작제물을 생산하기 위해, ~8 mg의 선형화된 DNA, rNTP (7.25 mM), DTT (10 mM), T7 RNA 폴리머라제, RNAse 저해제, 파이로포스파타제 및 반응 완충액 (10x, 800 mM Hepes (pH 8.0), 20 mM 스페르미딘, 250 mM MgCl2, pH 7.7)의 혼합물을 RNase가 없는 물로 최종 용적 180 mL 가 되도록 제조하였다. 반응 혼합물을 20 분 - 60 분 사이의 시간 범위동안 37 ℃에서 인큐베이션한다. 완료 시, 혼합물을 추가 15 분동안 DNase I로 처리하고 그에 맞춰 켄칭한다.
5' 캡 및 3'
테일의
부가
상기 언급된 IVT 단계 (및 또한 가능하게는 초기 TFF 여과)로부터 정제된 mRNA 생성물을 65 ℃에서 10 분동안 변성하였다. 별도로, GTP (1.0 mM), S-아데노실 메티오닌, RNAse 저해제, 2'-O-메틸전달효소 및 구아닐릴 전달효소의 분획을 반응 완충액 (10x, 500 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 60 mM KCl, 12.5 mM MgCl2)와 함께 혼합하여 최종 농도 1.6 L가 되게 한다. 변성 시, mRNA를 얼음에서 냉각시켰고 그 다음 반응 혼합물에 부가하였다. 조합된 용액을 37 ℃에서 25-90 분의 시간 범위동안 인큐베이션하였다. 완료 시, ATP (2.0 mM), 폴리A 폴리머라제 및 테일링 반응 완충액 (10x, 500 mM 트리스-HCl (pH 8.0), 2.5 M NaCl, 100 mM MgCl2)의 분취량을 부가하고 총 반응 혼합물을 37 ℃에서 20-45 분의 시간 범위동안 추가로 인큐베이션하였다. 완료 시, 최종 반응 혼합물을 켄칭하였고 그에 맞춰 정제하였다.
mRNA의
정제
mRNA의
침전
메신저 RNA는 다양한 방법을 이용하여 침전될 수 있다. 예를 들면, 리튬 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 구아니디늄 이소티오시아네이트, 암모늄 아세테이트 및 다른 염의 사용은 반응 혼합물로부터 mRNA의 효율적인 침전을 제공한다.
접선 유동 여과
하기 실시예에서, 다르게 기재되지 않는 한, 접선 유동 여과 (TFF) 시스템은 투과물에 대해 ~130 mL/분의 공급 속도와 30 mL/분 유속으로 막을 가로지른 유체의 접선 순환을 갖춘 연동 펌프 (스펙트럼 시스템) 및 여과 막으로 이루어졌다. 사용된 TFF 막은 MidiKros 500 kDa mPES 115cm2 (스펙트럼 랩스)이었다. 사용 전에, 필터 카트리지를 뉴클레아제가 없는 물로 세정하고 그리고 추가로 0.2 N NaOH로 세척하였다. 마지막으로 투과물 및 보전물의 pH가 pH ~6에 도달할 때까지 시스템을 뉴클레아제가 없는 물로 세척하였다. TFF를 통한 mRNA의 단리는 도 1에 묘사된 바와 같이 달성될 수 있다.
개똥벌레
루시퍼라아제
mRNA의
정제
mRNA 정제의 대표적인 예에서, 개똥벌레 루시퍼라아제 (FFL) mRNA의 1 그램 뱃치를 시험관내 방법을 통해 전사하여 무 캡 및 무 폴리A 테일의 상기 언급된 중간체 작제물을 생산하였다. 상기 반응은 ~180 mL의 총 용적을 유지하였고 DNAse I (~9.0 KU)의 부가에 의해 완료 시 켄칭하였다. 수득한 용액을 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, 0.5 % 나트륨 라우릴 사르코실, 및 25 mM 나트륨 시트레이트 (1500 mL)의 균질 용액으로 처리하여, 총 용적을 1.68 L로 하였다. 생성 혼합물을 주위 온도에서 ~ 5 분동안 유지하고 그 다음 추가로 1.1 L의 무수 에탄올로 처리하였다. mRNA가 서서히 침전하였고 서스펜션을 주위 온도에서 ~ 5 분동안 유지하였다. 완료 시, 전체 불균질 서스펜션을 접선 유동 여과 (TFF)를 이용하여 여과 막을 통해 펌핑하였다.
이 실시예에서, 변형된 폴리에테르설폰 (mPES) 중공 섬유 막을 2600 cm2의 표면적으로 이용하였다. 수득한 불균질 혼합물 (후-침전)을 750 mL/분의 유속에서 대략 8 분동안 나누어서 필터 시스템을 통해 펌핑하였다. 완료 시, 수득한 포집된 침전물을 구아니디늄 완충액/에탄올 조합된 완충액 용액 그 다음 80 % 에탄올 (500 mL, 750 mL/분)로 린스하고 여러 번 (>5x) 반복하였다. 일단 완전히 세정되면, 막을 가로질러 분배된 고체 mRNA를 RNAse가 없는 물 (250 mL)로 처리하고 5-10 분에 걸쳐 재-순환시켜 용해를 확인하였다. mRNA가 더이상 회수되지 않을 때까지 상기 공정을 반복하였다. 완료 시, 수득한 mRNA 용액을 추가로 100 KDa MWCO 막을 이용하여 1 mM 나트륨 시트레이트 (pH 6.4)로 투석하여 임의의 잔류 에탄올을 제거하고 적절한 보관 용액에서 최종 mRNA 생성물을 수득하였다. 260 nm (λmax)에서 흡수를 통해 최종 농도를 측정하였다. UV 흡수 (260/280 비) 뿐만 아니라 단백질 겔 (은 염색, SYPRO 염색, 쿠마씨, 등)을 통해 메신저 RNA 순도를 측정하였다. 겔 전기영동 뿐만 아니라 단백질 생산의 시험관내/생체내 분석을 통해 메신저 RNA 완전성을 측정하였다.
ASS1
mRNA의
정제
mRNA 정제의 제 2 대표적인 예에서, ASS1 mRNA의 1 그램 뱃치를 시험관내 방법을 통해 전사하여 무 캡 및 무 폴리A 테일의 상기 언급된 중간체 작제물을 생산하였다. 상기 반응은 ~180 mL의 총 용적을 유지하였고 DNAse I (~9.0 KU)의 부가에 의해 완료 시 켄칭하였다. 수득한 용액을 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, 0.5 % 나트륨 라우릴 사르코실, 및 25 mM 나트륨 시트레이트 (1500 mL)의 균질 용액으로 처리하여, 총 용적을 1.68 L로 하였다. 생성 혼합물을 주위 온도에서 ~ 5 분동안 유지하고 그 다음 추가로 1.1 L의 무수 에탄올로 처리하였다. 메신저 RNA가 서서히 침전하였고 서스펜션을 주위 온도에서 ~ 5 분동안 유지하였다. 완료 시, 전체 불균질 서스펜션을 접선 유동 여과 (TFF)를 이용하여 여과 막을 통해 펌핑하였고 상기에서 기재된 바와 같이 단리시켰다.
CFTR
mRNA의
정제
mRNA 정제의 제 3 대표적인 예에서, 변형된 CFTR mRNA의 1.5 그램 뱃치를 시험관내 방법을 통해 전사하여 무 캡 및 무 폴리A 테일의 상기 언급된 중간체 작제물을 생산하였다. 상기 반응은 ~270 mL의 총 용적을 유지하였고 DNAse I (~13.5 KU)의 부가에 의해 완료 시 켄칭하였다. 수득한 용액을 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, 0.5 % 나트륨 라우릴 사르코실, 및 25 mM 나트륨 시트레이트 (1500 mL)의 균질 용액으로 처리하여, 총 용적을 1.77 L로 하였다. 생성 혼합물을 주위 온도에서 ~ 5 분동안 유지하고 그 다음 추가로 1.1 L의 무수 에탄올로 처리하였다. mRNA가 서서히 침전하였고 서스펜션을 주위 온도에서 ~ 5 분동안 유지하였다. 완료 시, 전체 불균질 서스펜션을 접선 유동 여과 (TFF)를 이용하여 여과 막을 통해 펌핑하였고 상기에서 기재된 바와 같이 단리시켰다.
실시예
2. 정제된
mRNA의
분석
정제된
mRNA에서
효소의 존재에 대한 시험
SYPRO
염색 겔
정제 이전 및 이후 존재하는 임의의 잔류 시약 효소의 존재를 측정하기 위해 표준 SYPRO-염색된 단백질 겔을 수행하였다. 겔을 200V에서 35 분동안 작동하였다.
은 염색 겔
제조자의 계획서를 이용한 SilverQuest? (Life Technologies, Catalog # LC6070)를 사용하여 모든 mRNA 뱃치 및 분획의 은 염색을 수행하였다. 간단히, 샘플을 (RNAse 처리 또는 처리 없이) 적재하고 적재된 효소 대조군 레인과 비교로 모니터링하였다. 겔을 200V에서 35 분동안 작동하였다. 노출 시간을 8 분동안 할당하였다.
아가로스
겔 전기영동 검정을 통한
mRNA
완전성의 평가
다르게 기재되지 않는 한, mRNA 크기 및 완전성을 겔 전기영동을 통해 평가하였다. 자가-붓기 1.0 % 아가로스 겔 또는 인비트로겐 E-겔 프리케스트 1.2 % 아가로스 겔을 사용하였다. 메신저 RNA를 웰당 1.0-1.5 ㎍ 양으로 적재하였다. 완료 시, mRNA 밴드를 에티듐 브로마이드를 이용하여 시각화하였다.
시험관내
mRNA
완전성 검정
다르게 기재되지 않는 한, 개똥벌레 루시퍼라아제 (FFL), 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA, 및 CFTR mRNA의 시험관내 형질감염을 HEK293T 세포를 이용하여 수행하였다. 1 마이크로그램의 각각의 mRNA 작제물의 형질감염을 개별 웰에서 리포펙타민을 이용하여 수행하였다. 세포를 선택 시점 (예를 들면 4 시간, 8 시간, 등)에서 수확하였고 각 단백질 생산을 분석하였다. FFL mRNA에 대해, 생물발광 검정을 통해 세포 용해물을 루시퍼라아제 생산을 위해 분석하였다. ASS1 mRNA에 대해, ELISA 검정을 통해 세포 용해물을 ASS1 생산을 위해 분석하였다. CFTR mRNA에 대해, 웨스턴 블랏 절차를 통해 세포 용해물을 CFTR 생산을 위해 분석하였다.
루시퍼라아제
검정
프로메가 루시퍼라아제 검정 시스템 (Item # E1500)을 이용하여 생물발광 검정을 수행하였다. 루시퍼라아제 검정 기질에 10 mL의 루시퍼라아제 검정 완충액 부가 및 소용돌이를 통한 혼합에 의해 루시퍼라아제 검정 시약을 제조하였다. 20 μL의 균질물 샘플을 96-웰 플레이트에 적재하고, 그 다음 각 샘플에 20 μL의 플레이트 대조군을 적재하였다. 별도로, (상기 기재된 바와 같이 제조된) 120 μL의 루시퍼라아제 검정 시약을 96-웰 편평한 바닥 플레이트의 각 웰에 적재하였다. 분자 장치 플렉스 스테이션을 이용하여 적절한 챔버속에 각각의 플레이트를 삽입하였고 발광을 상대 광 단위 (RLU)로 측정하였다.
ASS1
ELISA 검정
포집 항체로서 마우스 항-ASS1 2D1-2E12 IgG와 2차 (검출) 항체로서 토끼 항-ASS1 #3285 IgG를 사용하여 표준 ELISA 절차를 수행하였다 (시에라 인간 유전적 요법). 서양고추냉이 페록시다아제 (HRP)-콘주게이트된 염소 항-토끼 IgG를 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 용액의 활성화에 사용하였다. 20 분후 2 N H2SO4를 사용하여 반응을 켄칭하였다. 분자 장치 스펙트라맥스 기기의 흡수 (450 nm)를 통해 검출을 모니터링하였다. 미처리 마우스 혈청 및 기관 및 인간 ASS1 단백질을 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다.
CFTR
웨스턴
블랏
분석
면역침강 방법 (다이나비즈(Dynabeads) G)을 이용하여 수득된 단백질 샘플에서 웨스턴 블랏을 수행하였다. 일반적으로, 세포 또는 조직 균질물을 항-인간 CFTR 항체 (R&D 시스템, MAB25031)에 예비-결합된 다이나비즈 G로 가공하고 처리하였다. 인간 CFTR 단백질의 검출을 Ab570을 이용하여 달성하였다.
실시예
3. 정제 결과
본 실시예는 침전 그 다음 접선 유동 여과와 효소 시약 뿐만 아니라 쇼트머의 제거를 이용하여 개똥벌레 루시퍼라아제 (FFL) mRNA, 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA 및 낭포성 섬유증 막통과 전도도 조절물질 (CFTR) mRNA가 성공적으로 정제되는 것을 증명한다. 많은 전형적인 무질서유발 상태를 상기 열거된 바와 같이 mRNA를 침전하는데 성공적으로 사용하였다.
상기 성공을 증명하기 위해, 대규모 생산 (~1 그램)의 변형된 CFTR mRNA IVT 반응 혼합물을 4 M 구아니디늄 완충액 용액 (상기 기재됨) 처리하였다. 그 다음 수득한 혼합물을 무수 에탄올로 처리하고 5 분동안 실온에서 인큐베이션하였다. 상기 기재된 바와 같이 TFF를 통해 침전된 mRNA의 단리를 달성하였다. 도 2는 상기 언급된 상태를 사용하여 TFF 이후 단리된 수득한 mRNA를 보여주는 은 염색된 단백질 겔을 나타낸다. 완료 시 존재하는 검출가능한 효소 (T7 폴리머라제, DNAse I, 파이로포스파타제, RNAse 저해제)는 없다. 레인 1-3은 용출 1 (E1), 용출 2 (E2) 및 용출 3 (E3) 이후 변형된 CFTR을 함유하였다. 레인 4-7은 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 함유하였다. 도 3은 잔류 효소가 없음을 보여주는 대규모 (1.5 그램 뱃치) 침전 및 여과 공정에서 비롯된 순수한 mRNA를 보여주는 은 염색된 단백질 겔을 나타낸다. 레인 1-6은 용출 1-6 이후 mRNA를 함유하였다. 레인 7-10은 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소 (T7 폴리머라제, DNAse I, RNAse 저해제, 및 파이로포스파타제)를 함유하였다. 도 4는 변형된 CFTR mRNA가 상기 정제 이후 완전히 온전하다는 것을 증명한다. 이는 침전 및 여과를 통해 정제 이후 변형된 CFTR mRNA의 아가로스 (1.0 %) 겔 전기영동의 결과를 보여준다. 레인 1은 리보룰러(RiboRuler) HR 사다리를 함유하였다. 레인 2-7은 침전 이후 여과를 통해 정제된 변형된 CFTR mRNA를 함유하였다.
상기 공정은 상이한 다중 mRNA 작제물에 널리 적용가능하다. 예를 들면, 제 2 mRNA 작제물을 상기 방법을 이용하여 합성 및 정제하였다. 이러한 상황에서, 상기 기재된 방법을 이용하여 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA를 생산 및 침전하였다. 고체 침전물을 TFF 시스템에 적재하고 기재된 공정에 따라 단리하였다. 도 5는 존재하는 잔류 효소 (T7 폴리머라제, DNAse I, RNAse 저해제, 파이로포스파타제)가 없음을 보여주는 수득한 단리된 ASS1 mRNA의 은-염색 분석을 나타낸다. 레인 1-5는 용출 1-5 이후 mRNA를 함유하였다. 레인 6-9는 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 함유하였다. 레인 10이 대조군으로서 RNase A를 함유하는 것은 적재에 앞서 mRNA 샘플을 RNAse A로 전처리하기 때문이었다. 도 5에서 증명된 바와 같이, 은 염색 개발에 광범위한 노출 이후 효소가 존재하지 않았다. 도 6에 나타난 바와 같이 잔류 효소에 대한 SYPRO 염색을 이용하여 이것을 추가로 확인하였다. 상기 방법을 이용하여, 또한 상기 공정을 사용하여 단리된 바와 같이 ASS1 mRNA의 순도를 증명할 수 있다. 레인 1-5는 용출 1-5 이후 mRNA를 함유하였다. 레인 6-9는 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 함유하였다. 상기 이외에, RNA 겔 전기영동은 상기 공정 이후 완전히 온전한 전장 ASS1 mRNA로 ASS1 mRNA 완전성을 유지하였음을 보여주었다 (도 7). 도 7에서, 레인 1은 리보룰러 HR 사다리를 함유하였고 레인 2-6은 용출 1-5 이후 ASS1 mRNA를 함유하였다.
상기 정제 기술이 상이한 다중 mRNA 작제물에 적용가능함을 증명하기 위해, 상기 방법을 이용하여 FFL mRNA를 합성 및 정제하였다. 4 M 구아니디늄 완충액 시스템을 이용하여 mRNA를 침전하였고 여과하였다. 도 8은 존재하는 잔류 효소가 없음을 보여주는 수득한 단리된 FFL mRNA의 은-염색 분석을 나타낸다. 레인 1-4는 단일 침전 (XL1) 또는 이중 침전 (XL2)을 통해 정제된 FFL mRNA를 함유하였고, 레인 2-4는 제 2 침전 회수로부터 상이한 용출을 함유하였다. 레인 6-9는 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 함유하였다. 도 8에서 증명된 바와 같이, 은 염색 개발에 광범위한 노출 이후 효소가 존재하지 않았다. 게다가, 단일 침전이 원치않는 잔류 효소 모두 제거시 충분한 것으로 보이는 것을 알 수 있다. 도 9에 나타난 바와 같이 잔류 효소에 대한 SYPRO 염색을 이용하여 이것을 추가로 확인하였다. 상기 방법을 이용하여, 또한 상기 공정을 사용하여 단리된 FFL mRNA의 순도를 증명할 수 있다. 도 9에서, 레인 1-4는 단일 침전 (XL1) 또는 이중 침전 (XL2)을 통해 정제된 FFL mRNA를 함유하였고, 레인 2-4는 제 2 침전 회수로부터 상이한 용출을 함유하였다. 레인 6-9는 IVT 반응에서 존재하는 대조군 효소를 함유하였다. 상기 이외에, RNA 겔 전기영동은 상기 공정 이후 완전히 온전한 전장 FFL mRNA로 FFL mRNA 완전성을 유지하였음을 보여주었다 (도 10). 게다가, mRNA는 다중 재-침전 이후 차이가 없음을 보여준다. 도 10에서, 레인 1은 리보룰러 HR 사다리를 함유하였고 레인 2-5는 단일 침전 (XL1) 또는 이중 침전 (XL2)을 통해 정제된 FFL mRNA를 함유하였다.
상기 단리된 mRNA를 추가로 처리하여 캡핑된 및 테일링된 최종 생성물 제공시, TFF 방법을 사용하여 추가로 최종 표적 mRNA를 정제하였다. 도 11은 접선 유동 여과를 이용하는 침전, 그 다음 포집 및 용출이 성공적으로 순수한 최종 mRNA 생성물을 유발하였다는 것을 증명한다. 도 11에서, 레인 1-3은 단일 침전 (E1-3 = 용출 1-3)을 통해 정제된 캡/테일 반응으로부터 ASS1 mRNA를 함유하였다. 레인 4-6은 모든 반응 단계에서 존재하는 주요 대조군 효소를 함유하였다. 레인 7이 RNase I 대조군을 함유하는 것은 mRNA 샘플을 적재에 앞서 RNAse I로 전처리하였기 때문이다. 상기 이외에, RNA 겔 전기영동은 상기 공정 이후 완전히 온전한 전장 FFL mRNA로 FFL mRNA 완전성을 유지하였음을 보여주었다 (도 12). 도 12에서, 레인 1-3은 캡핑된 및 테일링된 ASS1 mRNA를 함유하였다.
상기 특성규명이 순도 및 mRNA 크기/완전성에 대해 정보를 제공하는 반면, mRNA 품질의 실제 평가는 추가로 원하는 단백질을 생산하는 그 능력에 있다. 따라서, 각각의 단리된 FFL mRNA 작제물 (TFF 대 스핀-칼럼)을 비교하였다. 아래 열거된 각각의 3개 작제물을 HEK293T 세포에 형질감염시키고 루시페린에 노출시 FFL 발광의 형태로 FFL 단백질 활성을 통해 상응하는 FFL 단백질 생산을 평가하였다 (상기 참조(vida supra)). 세포를 24 시간 후-형질감염으로 수확하였다.
FFL 작제물:
1. 외부 판매인으로부터 구매된 FFL mRNA
2. 상업적 키트를 통해 정제된 FFL mRNA
3. 침전-TFF 방법을 통해 정제된 FFL mRNA
각각으로부터 생산된 FFL 단백질의 발광 출력의 비교를 도 13에 나타낸다. TFF-정제된 FFL mRNA의 완전성을 기재된 상태하에서 침전 및 접선 유동 여과 공정 전반에 걸쳐 유지하였다.
게다가, 상기 언급된 공정을 이용하여 단리된 hCFTR mRNA의 형질감염으로부터 인간 CFTR 단백질의 성공적인 검출을 달성하였다. 도 14는 상업적 키트 또는 상기 언급된 TFF-기반 침전 방법을 통하여 정제된 hCFTR mRNA의 형질감염 이후 인간 CFTR 단백질의 성공적인 생산을 보여준다. 전장, 적절하게 거래된 CFTR 단백질을 나타내는, CFTR 단백질에 대한 상기 "C-밴드"의 가시화는 상기 상태를 통해 단리된 mRNA의 최대 완전성 및 활성을 지지한다. 상기 공정은 추가로 쉽게 확장가능하다. 예를 들면, 상기 방법을 이용하여 개별 mRNA 작제물을 5 그램 규모로 합성 및 정제하였다. 이러한 상황에서, 상기 기재된 방법을 이용하여 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA를 생산 및 침전하였다. 고체 침전물을 TFF 시스템에 적재하고 기재된 공정에 따라 단리하였다.
2개의 별개의 방법을 이용하여 제조된 mRNA 약물 물질의 완전성을 증명하였다. 도 15는 제공된 방법에 따라 정제된 및 여과된 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA의 시험관내 전사 (IVT) 샘플로부터 예시적인 mRNA의 길이를 보여준다. 아가로스 겔-온-어-칩(gel-on-a-chip) 전기영동을 통해 mRNA 길이를 증명하였다. 모든 IVT 전구체 뿐만 아니라 최종 캡핑된 및 테일링된 작제물에 대해 겔 전기영동을 이용하여 온전한 및 전장 mRNA를 확인하였다 (도 16). 최대 완전성은 ASS1 mRNA 대규모 (5G) 후 침전동안 잔류하였다.
이전에 증명된 바와 같이, 도 17은 접선 유동 여과를 이용하는 침전, 그 다음 포집 및 용출이 성공적으로 순수한 최종 mRNA 생성물을 유발하였다는 것을 보여준다. 레인 1은 단일 침전을 통해 정제된 캡/테일 반응으로부터 ASS1 mRNA를 함유하였다. 레인 2-8은 모든 반응 단계에서 존재하는 주요 대조군 효소를 함유하였다. 레인 9가 RNase I 대조군을 함유하는 것은 mRNA 샘플을 적재에 앞서 RNAse I로 전처리하였기 때문이다. 상기 은 염색 방법은 잔류 효소가 존재하지 않음을 증명한다.
상기 특성규명이 순도 및 mRNA 크기/완전성에 대해 정보를 제공하는 반면, mRNA 품질의 실제 평가는 추가로 원하는 단백질을 생산하는 그 능력에 있다. 따라서, 단리된 ASS1 mRNA 작제물 (TFF 대 스핀-칼럼)을 비교하였다 (도 18). 아래 열거된 각각의 작제물을 HEK293T 세포에 형질감염시키고 ELISA 방법을 통해 상응하는 ASS1 단백질 생산을 평가하였다. 세포를 ~18 시간 후-형질감염으로 수확하였다.
상기 방법을 이용하여 10 그램 규모에서 CFTR mRNA의 합성 및 정제로 확장성의 추가 증명을 달성하였다. 이러한 상황에서, 상기 기재된 방법을 이용하여 낭포성 섬유증 막통과 전도도 조절물질 (CFTR) mRNA를 생산 및 침전하였다. 고체 침전물을 TFF 시스템에 적재하고 기재된 공정에 따라 단리하였다. 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 제조된 mRNA 약물 물질의 완전성을 증명하였다. 모든 IVT 전구체 뿐만 아니라 최종 캡핑된 및 테일링된 작제물에 대해 온전한 및 전장 mRNA를 확인하였다 (도 19). 최대 완전성은 CFTR mRNA 대규모 (10G) 후 침전동안 잔류하였다.
또한, 10 그램 규모로 제조된 생성물의 순도를 도 20에 보여준 바와 같이 은 염색을 통해 증명하였다. 레인 1은 단일 침전을 통해 정제된 캡/테일 반응으로부터 CFTR mRNA를 함유한다. 레인 2-8은 모든 반응 단계에서 존재하는 주요 대조군 효소를 함유하였다. 레인 9가 RNase I 대조군을 함유하는 것은 mRNA 샘플을 적재에 앞서 RNAse I로 전처리하였기 때문이다. 상기 은 염색 방법은 잔류 효소가 존재하지 않음을 증명한다.
상기 기재된 바와 같이, 상기 특성규명이 순도 및 mRNA 크기/완전성에 대해 정보를 제공하지만, mRNA 품질의 실제 평가는 추가로 원하는 단백질을 생산하는 그 능력에 있다. 따라서, 다양한 양의 CFTR mRNA를 HEK293T 세포에 형질감염시키고 웨스턴 블랏 방법을 통해 상응하는 CFTR 단백질 생산을 평가하였다 (도 21). 세포를 ~18 시간 후-형질감염으로 수확하였다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법을 이용하여 25 그램 규모에서 ASS1 mRNA의 합성 및 정제로 확장성의 추가 증명을 달성하였다. 이러한 상황에서, 상기 기재된 방법을 이용하여 아르기니노석시네이트 합성효소 (ASS1) mRNA를 생산 및 침전하였다. 고체 침전물을 TFF 시스템에 적재하고 기재된 공정에 따라 단리하였다. 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 제조된 mRNA 약물 물질의 완전성을 증명하였다. ASS1 mRNA 대규모 (25G) 후 침전에 대해 온전한 및 전장 mRNA를 확인하였다 (도 22).
동등물
및 범위
당해분야의 숙련가는 단지 일상적인 실험과정을 이용하여 본원에 기재된 발명의 특정 구현예에 대한 많은 동등물을 인식할 것이거나, 또는 확인할 수 있다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명으로 제한될 의도는 아니고, 하기 청구범위에 제시된 바와 같다.
SEQUENCE LISTING
<110> Shire Human Genetic Therapies, Inc.
<120> METHODS FOR PURIFICATION OF MESSENGER RNA
<130> 2006685-0881
<150> 61/984,503
<151> 2014-04-25
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4443
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 1
augcagcggu ccccgcucga aaaggccagu gucgugucca aacucuucuu cucauggacu 60
cggccuaucc uuagaaaggg guaucggcag aggcuugagu ugucugacau cuaccagauc 120
cccucgguag auucggcgga uaaccucucg gagaagcucg aacgggaaug ggaccgcgaa 180
cucgcgucua agaaaaaccc gaagcucauc aacgcacuga gaaggugcuu cuucuggcgg 240
uucauguucu acgguaucuu cuuguaucuc ggggagguca caaaagcagu ccaaccccug 300
uuguuggguc gcauuaucgc cucguacgac cccgauaaca aagaagaacg gagcaucgcg 360
aucuaccucg ggaucggacu guguuugcuu uucaucguca gaacacuuuu guugcaucca 420
gcaaucuucg gccuccauca caucgguaug cagaugcgaa ucgcuauguu uagcuugauc 480
uacaaaaaga cacugaaacu cucgucgcgg guguuggaua agauuuccau cggucaguug 540
gugucccugc uuaguaauaa ccucaacaaa uucgaugagg gacuggcgcu ggcacauuuc 600
guguggauug ccccguugca agucgcccuu uugaugggcc uuauuuggga gcuguugcag 660
gcaucugccu uuuguggccu gggauuucug auuguguugg cauuguuuca ggcugggcuu 720
gggcggauga ugaugaagua ucgcgaccag agagcgggua aaaucucgga aagacucguc 780
aucacuucgg aaaugaucga aaacauccag ucggucaaag ccuauugcug ggaagaagcu 840
auggagaaga ugauugaaaa ccuccgccaa acugagcuga aacugacccg caaggcggcg 900
uauguccggu auuucaauuc gucagcguuc uucuuuuccg gguucuucgu ugucuuucuc 960
ucgguuuugc cuuaugccuu gauuaagggg auuauccucc gcaagauuuu caccacgauu 1020
ucguucugca uuguauugcg cauggcagug acacggcaau uuccgugggc cgugcagaca 1080
ugguaugacu cgcuuggagc gaucaacaaa auccaagacu ucuugcaaaa gcaagaguac 1140
aagacccugg aguacaaucu uacuacuacg gagguaguaa uggagaaugu gacggcuuuu 1200
ugggaagagg guuuuggaga acuguuugag aaagcaaagc agaauaacaa caaccgcaag 1260
accucaaaug gggacgauuc ccuguuuuuc ucgaacuucu cccugcucgg aacacccgug 1320
uugaaggaca ucaauuucaa gauugagagg ggacagcuuc ucgcgguagc gggaagcacu 1380
ggugcgggaa aaacuagccu cuugauggug auuauggggg agcuugagcc cagcgagggg 1440
aagauuaaac acuccgggcg uaucucauuc uguagccagu uuucauggau caugcccgga 1500
accauuaaag agaacaucau uuucggagua uccuaugaug aguaccgaua cagaucgguc 1560
auuaaggcgu gccaguugga agaggacauu ucuaaguucg ccgagaagga uaacaucguc 1620
uugggagaag gggguauuac auugucggga gggcagcgag cgcggaucag ccucgcgaga 1680
gcgguauaca aagaugcaga uuuguaucug cuugauucac cguuuggaua ccucgacgua 1740
uugacagaaa aagaaaucuu cgagucgugc guguguaaac uuauggcuaa uaagacgaga 1800
auccugguga caucaaaaau ggaacaccuu aagaaggcgg acaagauccu gauccuccac 1860
gaaggaucgu ccuacuuuua cggcacuuuc ucagaguugc aaaacuugca gccggacuuc 1920
ucaagcaaac ucauggggug ugacucauuc gaccaguuca gcgcggaacg gcggaacucg 1980
aucuugacgg aaacgcugca ccgauucucg cuugagggug augccccggu aucguggacc 2040
gagacaaaga agcagucguu uaagcagaca ggagaauuug gugagaaaag aaagaacagu 2100
aucuugaauc cuauuaacuc aauucgcaag uucucaaucg uccagaaaac uccacugcag 2160
augaauggaa uugaagagga uucggacgaa ccccuggagc gcaggcuuag ccucgugccg 2220
gauucagagc aaggggaggc cauucuuccc cggauuucgg ugauuucaac cggaccuaca 2280
cuucaggcga ggcgaaggca auccgugcuc aaccucauga cgcauucggu aaaccagggg 2340
caaaacauuc accgcaaaac gacggccuca acgagaaaag ugucacuugc accccaggcg 2400
aauuugacug aacucgacau cuacagccgu aggcuuucgc aagaaaccgg acuugagauc 2460
agcgaagaaa ucaaugaaga agauuugaaa gaguguuucu uugaugacau ggaaucaauc 2520
ccagcgguga caacguggaa cacauacuug cguuacauca cggugcacaa guccuugauu 2580
uucguccuca ucuggugucu cgugaucuuu cucgcugagg ucgcagcguc acuugugguc 2640
cucuggcugc uugguaauac gcccuugcaa gacaaaggca auucuacaca cucaagaaac 2700
aauuccuaug ccgugauuau cacuucuaca agcucguauu acguguuuua caucuacgua 2760
ggaguggccg acacucugcu cgcgaugggu uucuuccgag gacucccacu cguucacacg 2820
cuuaucacug ucuccaagau ucuccaccau aagaugcuuc auagcguacu gcaggcuccc 2880
auguccaccu ugaauacgcu caaggcggga gguauuuuga aucgcuucuc aaaagauauu 2940
gcaauuuugg augaccuucu gccccugacg aucuucgacu ucauccaguu guugcugauc 3000
gugauugggg cuauugcagu agucgcuguc cuccagccuu acauuuuugu cgcgaccguu 3060
ccggugaucg uggcguuuau caugcugcgg gccuauuucu ugcagacguc acagcagcuu 3120
aagcaacugg agucugaagg gaggucgccu aucuuuacgc aucuugugac caguuugaag 3180
ggauugugga cguugcgcgc cuuuggcagg cagcccuacu uugaaacacu guuccacaaa 3240
gcgcugaauc uccauacggc aaauugguuu uuguauuuga guacccuccg augguuucag 3300
augcgcauug agaugauuuu ugugaucuuc uuuaucgcgg ugacuuuuau cuccaucuug 3360
accacgggag agggcgaggg acgggucggu auuauccuga cacucgccau gaacauuaug 3420
agcacuuugc agugggcagu gaacagcucg auugaugugg auagccugau gagguccguu 3480
ucgagggucu uuaaguucau cgacaugccg acggagggaa agcccacaaa aaguacgaaa 3540
cccuauaaga augggcaauu gaguaaggua augaucaucg agaacaguca cgugaagaag 3600
gaugacaucu ggccuagcgg gggucagaug accgugaagg accugacggc aaaauacacc 3660
gagggaggga acgcaauccu ugaaaacauc ucguucagca uuagccccgg ucagcgugug 3720
ggguugcucg ggaggaccgg gucaggaaaa ucgacguugc ugucggccuu cuugagacuu 3780
cugaauacag agggugagau ccagaucgac ggcguuucgu gggauagcau caccuugcag 3840
caguggcgga aagcguuugg aguaaucccc caaaaggucu uuaucuuuag cggaaccuuc 3900
cgaaagaauc ucgauccuua ugaacagugg ucagaucaag agauuuggaa agucgcggac 3960
gagguuggcc uucggagugu aaucgagcag uuuccgggaa aacucgacuu uguccuugua 4020
gaugggggau gcguccuguc gcaugggcac aagcagcuca ugugccuggc gcgauccguc 4080
cucucuaaag cgaaaauucu ucucuuggau gaaccuucgg cccaucugga cccgguaacg 4140
uaucagauca ucagaaggac acuuaagcag gcguuugccg acugcacggu gauucucugu 4200
gagcaucgua ucgaggccau gcucgaaugc cagcaauuuc uugucaucga agagaauaag 4260
guccgccagu acgacuccau ccagaagcug cuuaaugaga gaucauuguu ccggcaggcg 4320
auuucaccau ccgauagggu gaaacuuuuu ccacacagaa auucgucgaa gugcaagucc 4380
aaaccgcaga ucgcggccuu gaaagaagag acugaagaag aaguucaaga cacgcgucuu 4440
uaa 4443
<210> 2
<211> 1653
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 2
auggaagaug ccaaaaacau uaagaagggc ccagcgccau ucuacccacu cgaagacggg 60
accgccggcg agcagcugca caaagccaug aagcgcuacg cccuggugcc cggcaccauc 120
gccuuuaccg acgcacauau cgagguggac auuaccuacg ccgaguacuu cgagaugagc 180
guucggcugg cagaagcuau gaagcgcuau gggcugaaua caaaccaucg gaucguggug 240
ugcagcgaga auagcuugca guucuucaug cccguguugg gugcccuguu caucggugug 300
gcuguggccc cagcuaacga caucuacaac gagcgcgagc ugcugaacag caugggcauc 360
agccagccca ccgucguauu cgugagcaag aaagggcugc aaaagauccu caacgugcaa 420
aagaagcuac cgaucauaca aaagaucauc aucauggaua gcaagaccga cuaccagggc 480
uuccaaagca uguacaccuu cgugacuucc cauuugccac ccggcuucaa cgaguacgac 540
uucgugcccg agagcuucga ccgggacaaa accaucgccc ugaucaugaa caguaguggc 600
aguaccggau ugcccaaggg cguagcccua ccgcaccgca ccgcuugugu ccgauucagu 660
caugcccgcg accccaucuu cggcaaccag aucauccccg acaccgcuau ccucagcgug 720
gugccauuuc accacggcuu cggcauguuc accacgcugg gcuacuugau cugcggcuuu 780
cgggucgugc ucauguaccg cuucgaggag gagcuauucu ugcgcagcuu gcaagacuau 840
aagauucaau cugcccugcu ggugcccaca cuauuuagcu ucuucgcuaa gagcacucuc 900
aucgacaagu acgaccuaag caacuugcac gagaucgcca gcggcggggc gccgcucagc 960
aaggagguag gugaggccgu ggccaaacgc uuccaccuac caggcauccg ccagggcuac 1020
ggccugacag aaacaaccag cgccauucug aucacccccg aaggggacga caagccuggc 1080
gcaguaggca agguggugcc cuucuucgag gcuaaggugg uggacuugga caccgguaag 1140
acacugggug ugaaccagcg cggcgagcug ugcguccgug gccccaugau caugagcggc 1200
uacguuaaca accccgaggc uacaaacgcu cucaucgaca aggacggcug gcugcacagc 1260
ggcgacaucg ccuacuggga cgaggacgag cacuucuuca ucguggaccg gcugaagagc 1320
cugaucaaau acaagggcua ccagguagcc ccagccgaac uggagagcau ccugcugcaa 1380
caccccaaca ucuucgacgc cggggucgcc ggccugcccg acgacgaugc cggcgagcug 1440
cccgccgcag ucgucgugcu ggaacacggu aaaaccauga ccgagaagga gaucguggac 1500
uauguggcca gccagguuac aaccgccaag aagcugcgcg gugguguugu guucguggac 1560
gaggugccua aaggacugac cggcaaguug gacgcccgca agauccgcga gauucucauu 1620
aaggccaaga agggcggcaa gaucgccgug uaa 1653
<210> 3
<211> 1239
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 3
augagcagca agggcagcgu ggugcuggcc uacagcggcg gccuggacac cagcugcauc 60
cugguguggc ugaaggagca gggcuacgac gugaucgccu accuggccaa caucggccag 120
aaggaggacu ucgaggaggc ccgcaagaag gcccugaagc ugggcgccaa gaagguguuc 180
aucgaggacg ugagccgcga guucguggag gaguucaucu ggcccgccau ccagagcagc 240
gcccuguacg aggaccgcua ccugcugggc accagccugg cccgccccug caucgcccgc 300
aagcaggugg agaucgccca gcgcgagggc gccaaguacg ugagccacgg cgccaccggc 360
aagggcaacg accaggugcg cuucgagcug agcugcuaca gccuggcccc ccagaucaag 420
gugaucgccc ccuggcgcau gcccgaguuc uacaaccgcu ucaagggccg caacgaccug 480
auggaguacg ccaagcagca cggcaucccc auccccguga cccccaagaa ccccuggagc 540
auggacgaga accugaugca caucagcuac gaggccggca uccuggagaa ccccaagaac 600
caggcccccc ccggccugua caccaagacc caggaccccg ccaaggcccc caacaccccc 660
gacauccugg agaucgaguu caagaagggc gugcccguga aggugaccaa cgugaaggac 720
ggcaccaccc accagaccag ccuggagcug uucauguacc ugaacgaggu ggccggcaag 780
cacggcgugg gccgcaucga caucguggag aaccgcuuca ucggcaugaa gagccgcggc 840
aucuacgaga cccccgccgg caccauccug uaccacgccc accuggacau cgaggccuuc 900
accauggacc gcgaggugcg caagaucaag cagggccugg gccugaaguu cgccgagcug 960
guguacaccg gcuucuggca cagccccgag ugcgaguucg ugcgccacug caucgccaag 1020
agccaggagc gcguggaggg caaggugcag gugagcgugc ugaagggcca gguguacauc 1080
cugggccgcg agagcccccu gagccuguac aacgaggagc uggugagcau gaacgugcag 1140
ggcgacuacg agcccaccga cgccaccggc uucaucaaca ucaacagccu gcgccugaag 1200
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<210> 4
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic polynucleotide
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agugcccacc agccuugucc uaauaaaauu aaguugcauc aagcu 105
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<400> 6
ggguggcauc ccugugaccc cuccccagug ccucuccugg cccuggaagu ugccacucca 60
gugcccacca gccuuguccu aauaaaauua aguugcauca aagcu 105
Claims (52)
- 메신저 RNA (mRNA)의 정제 방법으로서,
(a) 불순한 제제로부터 mRNA를 침전시키는 단계; 및
(b) 침전된 mRNA를 포함하는 상기 불순한 제제를, 막여과를 포함하는 정제 공정처리하여 상기 침전된 mRNA를 막으로 포집하는 단계; 및
(c) mRNA를 재가용화시킴으로써 상기 막으로부터 상기 포집된 침전 mRNA를 용출시키고, 이로써 정제된 mRNA 용액을 유발하는 단계를 포함하는, 방법. - 제 1 항에 있어서, 막여과를 포함하는 상기 정제 공정이 접선 유동 여과인, 방법.
- 제 1 항에 있어서, 막여과를 포함하는 상기 정제 공정이 직접 유동 여과인, 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 침전의 상기 단계가 리튬 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 구아니디늄 이소티오시아네이트, 암모늄 아세테이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시약을 포함하는 용액으로 상기 불순한 제제를 처리하는 것을 포함하는, 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 시약이 구아니디늄 티오시아네이트인, 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 용액이 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, 0.5 % 나트륨 라우릴 사르코실, 및 25 mM 나트륨 시트레이트를 포함하는, 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 용액이 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, 및 0.5 % 나트륨 라우릴 사르코실을 포함하는, 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 용액이 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, 및 25 mM 나트륨 시트레이트를 포함하는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 침전의 상기 단계가 추가로 상기 불순한 제제를 무수 에탄올로 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막이 폴리에테르설폰 (mPES) (변형되지 않음), 폴리에테르설폰 (mPES) 중공 섬유 막, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 셀룰로오스 아세테이트, 니트로셀룰로오스, MCE (혼합된 셀룰로오스 에스테르), 초고 MW 폴리에틸렌 (UPE), 폴리플루오로테트라에틸렌 (PTFE), 나일론, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 추가로 용출 전에 상기 포집된 침전 mRNA를 세정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 세정 단계가 구아니디늄 완충액 및 에탄올을 포함한 세정액, 이후 약 70% 내지 80% 에탄올을 이용하는 다중 린스 사이클(rinse cycle)을 포함하는, 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 다중 린스 사이클이 5 사이클 초과인, 방법.
- 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용출 단계가 상기 포집된 침전 mRNA를 RNAse가 없는(RNAse-free) 물로 재가용화시키는 것을 포함하는, 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 RNAse가 없는 물이 5분 내지 10분동안 재순환되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 추가로 상기 정제된 mRNA 용액을 투석하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제 16 항에 있어서, 상기 정제된 mRNA 용액이 100 kDa 분획 분자량 (molecular weight cut-off; MWCO) 막을 이용하여 1 mM 나트륨 시트레이트로 투석되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA가 시험관내 합성되고 상기 불순한 제제가 시험관내 mRNA 합성 반응 혼합물을 포함하는, 방법.
- 제 18 항에 있어서, 상기 불순한 제제가 시험관내 합성에서 사용되는 미숙하게 중절된(prematurely aborted) RNA 서열 및/또는 효소 시약을 포함하는, 방법.
- 제 19 항에 있어서, 상기 정제된 mRNA 용액이 시험관내 합성에서 사용되는 1 % 미만의 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약을 함유하는, 방법.
- 제 19 항에 있어서, 상기 정제된 mRNA 용액이 시험관내 합성에서 사용되는 0.5 % 미만의 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약을 함유하는, 방법.
- 제 19 항에 있어서, 상기 정제된 mRNA 용액이 시험관내 합성에서 사용되는 0.1 % 미만의 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약을 함유하는, 방법.
- 제 19 항에 있어서, 상기 정제된 mRNA 용액이 시험관내 합성에서 사용되는 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약이 실질적으로 없는, 방법.
- 제 23 항에 있어서, 시험관내 합성에서 사용되는 상기 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약이 은 염색, 겔 전기영동, HPLC, UPLC, 및/또는 모세관 전기영동을 통해 측정되는, 방법.
- 제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미숙하게 중절된 RNA 서열이 15 미만의 염기를 포함하는, 방법.
- 제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미숙하게 중절된 RNA 서열이 약 8 내지 12의 염기를 포함하는, 방법.
- 제 19 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 합성에서 사용되는 상기 효소 시약이 T7 RNA 폴리머라제, DNAse I, 파이로포스파타제, 및/또는 RNAse 저해제를 포함하는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA가 뱃치(batch) 당 1 그램, 10 그램, 100 그램, 1 kg, 10 kg, 또는 100 kg 이상의 규모로 정제되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA가, 캡 및 테일이 상기 mRNA에 부가되기 전에, 정제되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA가, 캡 및 테일이 상기 mRNA에 부가된 후에, 정제되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA가, 캡이 부가된 후에, 정제되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA가, 캡 및/또는 테일이 상기 mRNA에 부가되기 전 및 후 둘 다에, 정제되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA가 길이로 약 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb, 3.5 kb, 4 kb, 4.5 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 또는 20 kb 이상인, 방법.
- 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA가 하나 이상의 변형을 포함하여 안정성을 높이는, 방법.
- 제 34 항에 있어서, 상기 하나 이상의 변형이 변형된 뉴클레오티드 및/또는 변형된 당 포스페이트 골격을 포함하는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA가 비변형되는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제된 mRNA가 95 % 이상의 완전성(integrity)을 갖는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제된 mRNA가 98 % 이상의 완전성을 갖는, 방법.
- 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제된 mRNA가 99 % 이상의 완전성을 갖는, 방법.
- 메신저 RNA (mRNA)의 정제 방법으로서,
(a) 불순한 제제로부터 mRNA를 침전시키는 단계; 및
(b) 침전된 mRNA를 포함하는 상기 불순한 제제를 접선 유동 여과처리하여 상기 침전된 mRNA가 여과막에 의해 포집되도록 하고, 한편 불순물은 투과를 통해 폐기되는 단계; 및
(c) 상기 침전된 mRNA를 재가용화시킴으로써 상기 포집된 침전 mRNA를 용출시켜, 이로써 정제된 mRNA 용액을 유발하는 단계를 포함하는, 방법. - 메신저 RNA (mRNA)의 제조 방법으로서,
mRNA를 시험관내 합성하는 단계; 및
제 1 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 상기 시험관내 합성된 mRNA를 정제하는 단계를 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 41 항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 정제된, 메신저 RNA (mRNA).
- 인간 대상체 투여에 적합한 단일 mRNA 종의 5 그램 이상을 포함하는, 정제된 mRNA의 뱃치(batch).
- 제 43 항에 있어서, 단일 mRNA 종의 10 그램 이상을 포함하는, 뱃치.
- 제 43 항에 있어서, 단일 mRNA 종의 25 그램 이상을 포함하는, 뱃치.
- 제 42 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 합성 공정으로부터 불순물이 실질적으로 없는, 뱃치.
- 제 46 항에 있어서, 상기 뱃치가 상기 단일 mRNA 종의 시험관내 합성에서 사용되는 미숙하게 중절된 RNA 서열, DNA 주형, 및/또는 효소 시약이 실질적으로 없는, 뱃치.
- 제 43 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제된 mRNA가 시험관내 합성에서 사용되는 약 5 % 미만의 효소 시약을 함유하는, 뱃치.
- 제 43 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제된 mRNA가 약 95 % 초과의 완전성을 갖는, 뱃치.
- 제 1 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 정제되는 메신저 RNA를 포함하는, 조성물.
- 시험관내 합성된 메신저 RNA를 포함하는 조성물로서,
상기 조성물이 시험관내 합성에서 사용되는 1 % 미만의 미숙하게 중절된 RNA 서열 및/또는 효소 시약을 함유하는, 방법. - 시험관내 합성된 메신저 RNA (mRNA)를 포함하는 조성물로서,
상기 mRNA가 95 % 이상의 완전성을 갖는, 조성물.
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