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KR102530120B1 - 항진균성 파에니바실러스 균주, 푸사리시딘-유형 화합물, 및 이의 용도 - Google Patents

항진균성 파에니바실러스 균주, 푸사리시딘-유형 화합물, 및 이의 용도 Download PDF

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KR102530120B1 KR1020177006147A KR20177006147A KR102530120B1 KR 102530120 B1 KR102530120 B1 KR 102530120B1 KR 1020177006147 A KR1020177006147 A KR 1020177006147A KR 20177006147 A KR20177006147 A KR 20177006147A KR 102530120 B1 KR102530120 B1 KR 102530120B1
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Abstract

본 발명은 본래 토양으로부터 단리되고 넓은 범위의 병원균에 대항하는 길항 활성을 나타내며 항균성 대사물질을 생산할 수 있는, 파에니바실러스 (Paenibacillus) 속의 일원인 신규한 단리된 박테리아 균주에 관한 것이다. 균주 Lu16774 및 Lu17007 이 파에니바실러스 폴리믹사 종 플란타룸으로 명명되는 신규한 아종에 속하는 반면, 균주 Lu17015 는 파에니바실러스 에피파이티쿠스에 대해 제안된 신규한 종에 속하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 또한 이러한 신규한 박테리아 균주, 전체 배양 브로쓰 또는 무-세포 추출물 또는 이의 분획 또는 이의 적어도 하나의 대사물질 중 적어도 하나, 및/또는 각각의 박테리아 균주 또는 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 분획의 모든 확인되는 특징을 갖는 상기 신규한 박테리아 균주 중 적어도 하나의 돌연변이체, 및/또는 식물 병원균에 대항하는 길항 활성을 나타내는 이의 돌연변이체의 대사물질을 포함하는 미생물 살충제 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 식물 병원균을 방제 또는 억제하는 방법 또는 이러한 조성물을 적용함으로써 식물 병원균 감염을 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 균주에 의해 제조되는 대사물질인 신규한 푸사리시딘-유형 화합물에 관한 것이다.

Description

항진균성 파에니바실러스 균주, 푸사리시딘-유형 화합물, 및 이의 용도 {ANTIFUNGAL PAENIBACILLUS STRAINS, FUSARICIDIN-TYPE COMPOUNDS, AND THEIR USE}
본 발명은 본래 토양으로부터 단리되고 넓은 범위의 병원균에 대항하는 길항 활성을 나타내며 항균성 대사물질을 생산할 수 있는, 파에니바실러스 (Paenibacillus) 속의 일원인 신규한 단리된 박테리아 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 신규한 박테리아 균주, 전체 배양 브로쓰 또는 무-세포 추출물 또는 이의 분획 또는 이의 적어도 하나의 대사물질 중 적어도 하나, 및/또는 각각의 박테리아 균주 또는 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 분획의 모든 확인되는 특징을 갖는 상기 신규한 박테리아 균주 중 적어도 하나의 돌연변이체, 및/또는 식물 병원균에 대항하는 길항 활성을 나타내는 이의 돌연변이체의 대사물질을 포함하는 미생물 살충제 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 식물 병원균을 방제 또는 억제하는 방법 또는 이러한 조성물을 적용함으로써 식물 병원균 감염을 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 균주에 의해 제조되는 대사물질인 신규한 푸사리시딘-유형 화합물에 관한 것이다.
식물 또는 작물에 영향을 미치는 식물병원성 진균을 제어하는 기술 분야에서, 예를 들어, 처리하고자 하는 식물 또는 작물에 유해하지 않은 박테리아, 예컨대 포자-형성 박테리아, 또는 진균으로부터 선택되는 생물농약을 포함하는 활성 화합물 조성물을 적용하는 것이 잘 알려져 있고, 생물학적 방제제는 식물 병원균의 고전적인 유기 화학적 길항제와 추가로 조합될 수 있다.
생물농약은 미생물 (박테리아, 진균, 바이러스, 선충, 등) 또는 천연 생성물 (생물학적 공급원으로부터의 화합물 또는 추출물) 기반의 살충제의 형태로서 정의되어 있다 (U.S. Environmental Protection Agency: http://www.epa.gov/농약/bio농약/).
생물농약은 전형적으로 박테리아 및 기타 미생물, 진균, 바이러스, 선충, 단백질 등을 포함하는 자연 발생적 유기체 및/또는 이들의 대사물질을 성장 및 농축시킴으로써 제작된다. 이들은 종종 통합 해충 관리 (IPM) 프로그램의 중요한 구성성분인 것으로 고려되고, 합성 화학 식물 보호 제품 (PPP) 에 대한 대체물로서 많은 실질적은 관심을 받았다.
생물농약은 미생물 및 생화학 농약의 두 가지 주요 계열로 나뉜다:
(1) 미생물 농약은 박테리아, 진균 또는 바이러스로 이루어진다 (종종 박테리아 및 진균이 생성하는 대사물질을 포함한다). 곤충병원성 선충류는 또한 비록 이들이 다세포일 지라도, 미생물 농약으로서 분류된다.
(2) 생화학 농약은 해충을 방제하거나 또는 하기 정의된 바와같은, 그러나 포유동물에게 비교적 무독성인 다른 작물 보호 용도를 제공하는 자연 발생된 성분이다.
식물병원성 진균의 방제를 위해, 포자-형성 박테리아 예컨대 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 를 포함하는 여러 가지 미생물 농약은 이전에 기재되어 있다, 예를 들어, WO 1998/050422; WO 2000/029426; WO 1998/50422 및 WO 2000/58442 를 참고한다.
WO 2009/0126473 은 수성/유기 용매에 함유되고 곤충 방제제, 농약, 살진균제 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있는, 박테리아 또는 진균 포자를 포함하는 농업적으로 허용가능한 수성 조성물을 기재한다. 바실러스 속의 박테리아의 포자가 바람직한 종이다.
WO 2006/017361 은 식물 병원균을 방제하고 이러한 조성물의 유효한 수명을 연장하는 적어도 하나의 유리한 박테리아, 적어도 하나의 유리한 진균, 적어도 하나의 영양소 및 적어도 하나의 화합물을 포함하기 위한 조성물을 기재한다. 유리한 박테리아의 그룹은 예를 들어, 파에니바실러스 폴리믹사 (Paenibacillus polymyxa) 및 파에니바실러스 두룸 (Paenibacillus durum) 의 박테리아를 포함한다.
EP-A-1 168 922 는 식물 성장에 영향을 주는 및/또는 적어도 2 개의 식물-성장 촉진 리조박테리아 (Rhizobacteria) 균주 및 키틴성 화합물을 포함하는 질환 저항성을 부여하는 조성물로서, 상기 균주가 바실러스 (Bacillus), 파에니바실러스 (Paenibacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 비르기바실러스 (Virgibacillus), 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 및 아뉴리니로바실러스 (Aneurinibacillus) 속으로부터 선택되는 조성물에 관한 것이다. 그러나 특정한 파에니바실러스 균주가 청구된 조성물의 지지에서 예증되지 않는다.
WO 1999/059412 는 여러 개의 식물병원성 진균에 대항하여 활성인 파에니바실러스 폴리믹사 균주 PKB1 (ATCC 접근 번호 202127 을 가짐) 을 기재한다.
WO 2006/016558 은 진균으로의 감염으로부터 식물을 보호하기 위한 파에니바실러스 sp. 균주 BS-0048, BS-0074, BS-0277 및 P. 폴리믹사 균주 BS-0105 뿐 아니라 푸사리시딘 A 및 푸사리시딘 B 를 기재한다. 추가의 항진균성 파에니바실러스 균주 BRF-1 은 대두 근권 (rhizosphere) 으로부터 단리되었다 (African J. Microbiol. Res. 4(24), 2692-2698, 2010).
WO 2011/069227 은 병원균 박테리아, 대부분 식품-유래 인간 병원균 박테리아에 대항하여 높은 억제 효과를 갖는 P. 폴리믹사 균주 JB05-01-1 (ATCC 접근 번호 PTA-10436 을 가짐) 을 기재한다.
Budi et al. (Appl Environ Microbiol, 1999, 65, 5148-5150) 은 파이토프토라 파라시티카 (Phytophthora parasitica) 와 같은 토양 유래 진균 병원균에 대한 길항 활성을 갖는 소르굼 비콜로르 (Sorghum bicolor) 의 균근균권으로부터 단리된 파에니바실러스 sp. 균주 B2 를 갖는다.
Cote d'Ivoire 의 토양으로부터 Delaporte, B. (Lab Cytol Veg, Paris, France) 에 의해 단리되고 Agricultural Research Service, USDA, U.S.A. 의 개방 수집물에 NRRL 접근 번호 BD-62 (Int. J. Syst Bacteriol. 46(4), 988-1003, 1996, 본원에 이하 또한 균주 BD-62 로서 언급됨) 로 기탁된 파에니바실러스 페오리아에 (Paenibacillus peoriae) 균주 11.D.3 은 여러 식물병원성 박테리아 및 진균에 대항하는 항진균성 활성을 나타냈다 (J. Appl. Microbiol. 95, 1143-1151, 2003). NRRL 은 BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE (주소: National Center for Agricultural Utilization Research, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA) 에서 미생물 균주를 기탁하려는 목적을 위한 국제 기탁 기관인 Angricultural Research Service Culture Collection 에 대한 약어이다.
수 많은 박테리아, 진균 및 효모 병원균에 대항하는 수 많은 파에니바실러스 균주, 즉, P. 페오리아에 균주의 항균성 활성이 그밖에도 보고되었다 (Lett. Appl. Microbiol. 43, 541-547, 2006).
Raza et al. (Brazilian Arch. Biol. Techol. 53, 1145-1154, 2010; Eur. J. Plant Pathol.125: 471-483, 2009) 은 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum) 에 대항하여 효과적인 푸사리시딘-유형 화합물-생성 파에니바실러스 폴리믹사 균주 SQR-21 을 기재한다.
푸사리시딘은 시클릭 리포뎁시펩티드의 계열에 속하는 파에니바실러스 종으로부터 단리되는 항생제의 그룹이다. 계열 전반에서 보존되어 있는 이들의 공통적인 구조적 특징은 다음과 같다: 6 개의 아미노산 잔기 (이 중 3 개는 L-Thr, D-allo-Thr 및 D-Ala 임) 뿐 아니라, 아미드 결합에 의해 N-말단 L-Thr 잔기에 부착된 15-구아니디노-3-히드록시펜타-데칸산 테일로 이루어지는 마크로시클릭 고리 (ChemMedChem 7, 871-882, 2012; J. Microbiol. Meth. 85, 175-182, 2011, 본원의 표 1). 상기 화합물은 N-말단 L-Thr 히드록실 기와 C-말단 D-Ala 카르보닐 기 사이의 락톤 가교에 의해 고리화된다. 뎁시펩티드 사이클 내의 아미노산 잔기의 위치는 통상 그 자체가 또한 GHPD 사슬을 갖는 상기 언급된 L-Thr 로 시작하고 C-말단 D-Ala 로 종결되어 넘버링된다. 파에니바실러스로부터 단리된 푸사리시딘의 비-제한적인 예는 LI-F03, LI- F04, LI-F05, LI-F07 및 LI-F08 (J. Antibiotics 40(11), 1506-1514, 1987; Heterocycles 53(7), 1533-1549, 2000; Peptides 32, 1917-1923, 2011) 및 푸사리시딘 A (또한 LI-F04a 로 불림), B (또한 LI-F04b 로 불림), C (또한 LI-F03a 로 불림) 및 D (또한 LI-F03b 로 불림) (J. Antibiotics 49(2), 129-135, 1996; J. Antibiotics 50(3), 220-228, 1997) 로 지정된다. 푸사리시딘의 아미노산 사슬은 리보솜에서 생성되지 않으나, 비-리보솜 펩티드 신테타아제에 의해 생성된다. 공지된 푸사리시딘의 구조식은 표 1 에 제시된다 (Bio-technol Lett. 34, 1327-1334, 2012; 그곳의 표 1). LI-F03a, LI F03b 에서 LI-F08a 및 LI F08b 까지 지정된 화합물은 본원에서 또한 푸사리시딘 계열 내의 이들의 구조로 인해 푸사리시딘 LI F03a, LI-F03b 에서 LI-F08a 및 LI-F08b 까지로서 언급된다 (표 1 참고).
표 1: 푸사리시딘 계열의 구조.
Figure 112017021872046-pct00001
Figure 112017021872046-pct00002
식 중, 화살표는 GHPD 의 카르보닐 모이어티와 L-Thr (L-트레오닌) 의 아미노 기 사이의 또는 하나의 아미노산의 카르보닐 기와 이웃하는 아미노산의 아미노 기 사이의 단일 (아미드) 결합을 정의하며, 화살표의 끝은 상기 아미노산 L-Thr 또는 상기 이웃하는 아미노산의 아미노 기에 대한 부착을 나타내고;
단일 선 (화살표 머리 없음) 은 D-Ala (D-알라닌) 의 카르보닐 기와 L-Thr 의 히드록실 기 사이의 단일 (에스테르) 결합을 정의하고; GHPD 는 15-구아니디노-3-히드록시펜타데칸산이다.
단리된 푸사리시딘 항생제 중에서, 푸사리시딘 A 는 다양한 임상적으로 관련된 진균 및 그람-양성 박테리아 예컨대 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 에 대항하는 가장 유망한 항생제 활성을 보여준다 (MIC 값 범위: 0.78-3.12 μg/ml) (ChemMedChem 7, 871-882, 2012). 자연 발생적 GHPD 대신에 12-구아니디노-도데칸산 (12-GDA) 또는 12-아미노-도데칸산 (12-ADA) 을 함유하는 푸사리시딘 유사체의 합성이 성립되었으나, GHPD 의 12-ADA 에 의한 대체는 항균성 활성의 완전한 상실을 초래하는 반면, GHPD 의 12-GDA 에 의한 대체는 항균성 활성을 보유하였다 (Tetrahedron Lett. 47, 8587-8590, 2006; ChemMedChem 7, 871-882, 2012).
푸사리시딘 A, B, C 및 D 는 또한 식물 병원균성 진균 예컨대 푸사리움 옥시스포룸, 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 및 페니실룸 토미이 (Penicillum thomii) 를 억제하는 것으로 보고되어 있다 (J. Antibiotics 49(2), 129-135, 1996; J. Antibiotics 50(3), 220-228, 1997). 푸사리시딘 예컨대 Li-F05, LI-F07 및 LI-F08 은 다양한 식물 병원균성 진균 예컨대 푸사리움 모닐리포름 (Fusarium moniliforme), F. 옥시스포룸, F. 로세움, 지베렐라 푸쿠로이 (Giberella fujkuroi), 헬민토스포룸 세사뭄 (Helminthosporium sesamum) 및 페니실리움 익스판숨 (Penicillium expansum) 에 대항하는 특정한 항진균성 활성을 갖는 것으로 발견되었다 (J. Antibiotics 40(11), 1506-1514, 1987). 푸사리시딘은 또한 스타필로코쿠스 아우레우스를 포함하는 그람-양성 박테리아에 대한 항박테리아 활성을 갖는다 (J. Antibiotics 49, 129-135, 1996; J. Antibiotics 50, 220-228, 1997). 부가적으로, 푸사리시딘은 카놀라의 검은 뿌리 썩음병을 야기하는 렙토스파에리아 마쿨란스 (Leptosphaeria maculans) 에 대항하는 항진균 활성을 갖는다 (Can. J. Microbiol. 48, 159-169, 2002). 게다가, 특정 파에니바실러스 균주에 의해 생성되는 푸사리시딘 A 및 B 및 이의 2 개의 관련된 화합물 (식 중, D-allo-Thr 은 이의 히드록실 기를 통해 에스테르 가교를 사용하여 부가적인 알라닌에 결합됨) 은, 배양된 파슬리 세포에서 저항성 반응을 유도하고 푸사리움 옥시스포룸의 성장을 억제하는 것으로 발견되었다 (WO 2006/016558; EP 1 788 074 A1).
WO 2007/086645 는 푸사리시딘 A, B, C, D, LI-F03, LI-F04, LI-F05, LI-F07 및 LI-F08 의 합성에 관여하는 효소인 파에니바실러스 폴리믹사 균주 E681 로부터 단리된 푸사리시딘 신테타아제 효소 및 이의 엔코딩 유전자를 기재한다.
여러 개의 파에니바실러스 폴리믹사 균주의 게놈이 지금까지 공개되었다: 특히 균주 M-1 (NCBI 접근 번호 NC_017542; J. Bacteriol. 193 (29), 5862-63, 2011; BMC Microbiol. 13, 137, 2013), 균주 CR1 (GenBank 접근 번호 CP006941; Genome Announcements 2 (1), 1, 2014) 및 균주 SC2 (GenBank 접근 번호 CP002213 및 CP002214; NCBI 접근 번호 NC_014622; J. Bacteriol. 193 (1), 311-312, 2011), 추가의 균주에 대해서는 본원의 도 12 의 설명부분을 참고한다. P. 폴리믹사 균주 M-1 은 China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC) 에 접근 번호 CGMCC 7581 로 기탁되었다.
Montefusco et al. 은 문헌 Int. J. Systematic Bacteriol. (43, 388-390, 1993) 에 바실러스 속의 신규한 박테리아 종을 기재하고, 다른 바실러스 균주, 예를 들어 바실러스 바디우스 (Bacillus badius), B. 코아굴란스, B. 폴리믹사 및 기타와 구별될 수 있는 명칭 바실러스 페오리아에 (Bacillus peoriae) 를 제안했다. 상기 신규한 바실러스 균주는 포자를 생성하고, 그람-양성이고 옥시다아제를 생성하지 않으면서, 카탈라아제를 생성하는 것으로 보고된다. 추가의 생화학 특징이 그곳에 요약된다. 토양 또는 썩은 식물 물질로부터 단리될 수 있는 균주는 BD-57 로 지정되었고, Agricultural Research Service, USDA, U.S.A. 에 NRRL B-14750 로서 또한 DSMZ (하기 참고) 에 균주 DSM 8320 으로서 기탁되었다. 추가의 생물화학적 및 유전자 분석에 기반하여, 상기 균주는 이후 파에니바실러스 페오리아에로서 재명명되었다 (참고, Int. J. Systematic Bacteriol. 46, 988-1003, 1996). PCR-DGGE 방법을 사용하는 옥수수 근권에서 파에니바실러스 종의 다양함의 좀더 최근의 평가가 문헌 J. Microbiol. Methods 54, 213-231, 2003 에 기재되었다.
작물 질환에 대항하여 사용하기 위한 생물농약은 그 자체가 다양한 작물에 대해 이미 성립되었다. 예를 들어, 생물농약은 이미 노균병을 방제하는데 중요한 역할을 한다. 이들의 이점에는 하기가 포함된다: 0-Day Pre-Harvest Interval 및 중간 내지 심각한 질환 압력 하에 사용하는 능력.
생물농약에 대한 주요한 성장 영역은 종자 처리 및 토양 개질 영역이다. 생물농약 종자 처리는 예를 들어, 종자 썩음, 모잘록병, 뿌리 썩음 및 모 마름병을 야기하는 토양 유래 진균 병원균을 방제하는데 사용된다. 이들은 또한 내부 종자 유래 진균 병원균 뿐 아니라 종자의 표면 상에 있는 진균 병원균을 방제하는데 사용될 수 있다. 많은 생물농약 제품은 또한 처리된 작물을 다양한 생물적 및 비생물적 스트레스에 대해 좀더 저항성이 될 수 있게 하는 식물 숙주 방어 및 다른 생리학적 과정을 촉진하는 능력을 나타낸다.
그러나, 특정 조건 하에서의 생물농약은 또한 단점, 예컨대 높은 특이성 (해충/병원균의 정확한 확인 및 복합 제품의 사용을 필요로 함), 느린 작용 속도 (따라서 해충 발발이 작물을 즉각적으로 위협하는 경우에는 부적합함), 다양한 생물적 및 비생물적 인자의 영향으로 인한 가변적인 효과 (생물농약이 통상 살아있는 유기체이므로, 표적 곤충 해충/병원균 내에서 복합적으로 함으로써 해충/병원균 방제를 유발함), 및 내성 발병을 가질 수 있다.
따라서 모든 계열의 식물병원성 진균에 대항하여 넓은 활성 스펙트럼을 특징으로 하는 식물병원성 미생물, 특히 진균에 대적하는 추가의 박테리아 균주 및 추가의 항균성 대사물질에 대한 필요성이 있다.
상기 문제는 놀랍게도, 식물병원균 진균에 대항하는, 또한 식물 잎 병원균으로 확장되는, 예를 들어 알테나리아 (Alternaria) 종, 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 파이토프토라 인페스탄스 (Phytophthora infestans), 및 스클레로티니아 스클레로티오룸 (Sclerotinia sclerotiorum) 으로부터 선택되는 진균에 대항하는 독특한 프로파일의 길항 활성을 특징으로 하는 파에니바실러스 속의 박테리아의 신규한 균주를 제공함으로써 해결되었다. 상기 박테리아 균주는 International Depositary Authority: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7 B, 38124 Braunschweig, Germany (이하 DSMZ) 에 기탁되었다.
게다가, 이들 박테리아 균주의 전체 배양 브로쓰, 배양 배지 및 무-세포 추출물은 적어도 알테나리아 종, 보트리티스 시네레아 및 파이토프토라 인페스탄스에 대항하는 억제 활성을 나타내었다. 유기 추출물의 생물활성 가이드 분획화는 2 가지 신규한 푸사리시딘-유형 화합물 (화합물 1A 및 1B) 의 단리를 초래하고, 이의 구조는 1D- 및 2D-NMR 분광학 뿐 아니라 질량 분석에 의해 설명된다.
따라서, 본 발명은 하기 균주 중 하나의 확인되는 특징 중 하나 이상을 갖는 파에니바실러스 계열의 일원인 단리된 미생물에 관한 것이다:
1) 접근 번호 DSM 26969 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 sp. 균주 Lu16774,
2) 접근 번호 DSM 26970 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 sp. 균주 Lu17007, 및
3) 접근 번호 DSM 26971 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 sp. 균주 Lu17015.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 파에니바실러스 sp. 균주는 용어 파에니바실러스 균주와 동일하다.
본원에 사용되는 바와 같은, "단리물" 은 단일 미생물 콜로니를 배양함으로써 수득되는 단리물과 같은 이의 천연 기원으로부터 분리되는 순수한 미생물 배양물을 말한다. 단리물은 미생물의 이종의, 야생 집단으로부터 유래되는 순수한 배양물이다.
본원에 사용되는 바와 같은, "균주" 는 동일한 종의 균주 또는 다른 단리물의 것과 구별되는, 동일한 계통에 속하는 표현형, 생리학적, 대사성 및/또는 유전자형 특성을 나타내는 단리물 또는 단리물의 그룹을 말한다.
추가의 구현예는 바람직하게는 적어도 하나의 식물 병원균에 대항하여 길항 활성을 나타내는 상기 정의된 바와 같은 미생물 중 적어도 하나의 전체 배양 브로쓰, 상청액 또는 무-세포 추출물 또는 분획 또는 적어도 하나의 대사물질에 관한 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은, "전체 배양 브로쓰" 는 각각의 미생물에 의해 제조되는 배양 배지 및 임의로 대사물질에 현탁된 식물 세포 및/또는 포자를 함유하는 미생물의 액체 배양물을 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은, "배양 배지" 는 상기 배지, 바람직하게는 액체 브로쓰에서 미생물을 배양함으로써 수득가능한 배지를 말하며, 배지에서 성장된 세포가 제거되고 남은 것, 예를 들어, 액체 브로쓰에서 성장된 세포가 원심분리, 여과, 침강, 또는 당업계에 잘 공지된 다른 수단에 의해 제거되고 남은 상청액; 각각의 미생물에 의해 제조되고 배양 배지 내로 분비되는 예를 들어, 대사물질을 포함하는, 배지를 말한다. "배양 배지" 는 종종 또한 약 2 내지 30℃ 의 온도에서 (더욱 바람직하게는 4 내지 20℃ 의 온도에서) 약 10 내지 60 분 (더욱 바람직하게는 약 15 내지 30 분) 동안 약 5,000 내지 20,000 x g 에서 (더욱 바람직하게는 약 15,000 x g 에서) 예를 들어, 원심분리에 의해 수득될 수 있는 "상청액" 을 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은, "무-세포 추출물" 은 업계에 공지된 세포 파쇄 방법, 예컨대 용매-기반 (예를 들어, 종종 적합한 염과 조합으로의 유기 용매 예컨대, 알코올), 온도-기반, 전단력 적용, 포음파분쇄기로의 세포 파쇄에 의해 수득가능한 각각의 미생물에 의해 제조되는 세포성 대사물질을 포함하는 미생물의 식물 세포, 포자 및/또는 전체 배양 브로쓰의 추출물을 말한다. 원하는 추출물은 건조, 증발, 원심분리 등과 같은 통상의 농축 기술에 의해 농축될 수 있다. 유기 용매 및/또는 수계 배지를 사용하는 특정한 세정 단계는 또한 바람직하게는 사용 전에 미정제 추출물에 적용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은, 용어 "대사물질" 은 본원에서 식물 활성 정도의 본원에 기재되는 임의의 유리한 효과, 예컨대 살충 활성 또는 식물 성장의 개선, 식물의 물 사용 효율, 식물 건강, 식물 외양, 또는 토양 내 유리한 미생물의 집단을 갖는 미생물 (예컨대 진균 및 박테리아, 특히 본 발명의 균주) 에 의해 생성되는, 임의의 구성성분, 화합물, 성분 또는 부산물 (소분자 이차 대사물질, 폴리케티드, 지방산 신타아제 생성물, 비-리보솜 펩티드, 리보솜 펩티드, 단백질 및 효소를 포함하나 이에 제한되지 않음) 을 말한다.
본원에 사용되는 바와 같은, "단리물" 은 천연 기원으로부터 분리되는 순수한 미생물 배양물, 예컨대 단일 미생물 콜로니를 배양함으로써 수득되는 단리물을 말한다. 단리물은 미생물의 이종의, 야생 집단으로부터 유래되는 순수한 배양물이다.
본원에 사용되는 바와 같은, "균주" 는 동일한 종의 균주 또는 다른 단리물의 것과 구별되는, 동일한 계통에 속하는 표현형 및/또는 유전자형 특성을 나타내는 단리물 또는 단리물의 그룹을 말한다.
추가의 구현예는 하기 화학식 I 의 신규 화합물 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염:
Figure 112017021872046-pct00003
(식 중,
R 은 15-구아니디노-3-히드록시펜타데칸산 (GHPD) 및 12-구아니디노도데칸산 (12-GDA) 으로부터 선택되고;
X1 은 트레오닌이고;
X2 는 이소류신이고;
X3 은 티로신이고;
X4 는 트레오닌이고;
X5 는 글루타민 및 아스파라긴으로부터 선택되고;
X6 은 알라닌이고;
식 중, 화살표는 R 의 카르보닐 모이어티와 아미노산 X1 의 아미노 기 사이의 또는 하나의 아미노산의 카르보닐 기와 이웃하는 아미노산의 아미노 기 사이의 단일 (아미드) 결합을 정의하며, 화살표의 끝은 상기 아미노산 X1 또는 상기 이웃하는 아미노산의 아미노 기에 대한 부착을 나타내고;
단일 선 (화살표 머리 없음) 은 X6 의 카르보닐 기와 X1 의 히드록실 기 사이의 단일 (에스테르) 결합을 정의함);
및 본 발명의 균주를 배양하고 상기 화학식 I 의 화합물을 전체 배양 브로쓰로부터 단리하는 것을 포함하는, 본 발명의 화학식 I 의 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
추가의 구현예에 따르면, 본 발명은 추가로 R 은 GHPD 이고, X5 는 화합물 1A 의 경우에는 아스파라긴이고 X5 는 화합물 1B 의 경우에는 글루타민인, 화학식 I 의 것인 화합물 1A 및 1B 에 관한 것이다:
Figure 112017021872046-pct00004
본 발명은 추가로 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 또는 화학식 I 의 화합물 및 이들의 염을 포함하는 조성물 뿐 아니라, 식물 병원균을 방제 또는 억제하기 위한 또는 식물 병원균 감염을 예방하기 위한 또는 유해 미생물에 의한 침입 파괴에 대항하기 위한 물질의 보호를 위한 이들의 용도, 및 병원균, 병원균 공격에 대항하여 보고하고자 하는 이들의 서식지 또는 물질 또는 식물, 또는 토양 또는 번식 물질을 유효량의 본 발명의 조성물, 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 또는 화학식 I 의 화합물 및 이들의 염으로 처리하는 것을 포함하는 상응하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 구현예는 본 발명의 하기 상세한 설명, 청구항 및 도면에 기재된다.
본 발명은 하기 미생물 균주에 관한 것이다:
1) 접근 번호 DSM 26969 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 sp. 균주 Lu16774,
2) 접근 번호 DSM 26970 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 sp. 균주 Lu17007, 및
3) 접근 번호 DSM 26971 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 sp. 균주 Lu17015.
균주 Lu16774, Lu 17007 및 Lu17015 는 독일을 비롯한 다양한 유럽 지역으로부터의 토양 샘플로부터 단리되고, Budapest Treaty with the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) 에, 상기 언급된 접근 번호로, BASF SE (Germany) 사에 의해, 2013 년 2 월 20 일에 기탁되었다.
파에니바실러스 속 (이전의 rRNA 그룹 3 바실리) 은 하기에 의해 표현형적으로 그리고 생리학적으로 (Antonie van Leeuwenhoek 64, 253-260 (1993)) 특징화된다:
- 그람-양성 구조의 막대형 세포,
- 그람 염색으로 약한 반응, 종종 심지어 음성으로 염색,
- 포자낭 (모 세포) 을 뚜렷하게 팽창되는 타원체 내생포자로 분화,
- 니트레이트가 존재하는지와 상관없이 공기의 부재하에서 강한 성장을 갖는 조건적 혐기성 성장,
- 다양한 당의 발효,
- 글루코오스를 포함하는 다양한 당으로부터의 산 및 기체 형성,
- 아도니톨 및 소르비톨로부터의 산 생성 없음,
- 우레아제-음성 (P. 발리두스 제외),
- 아르기닌 디히드롤라아제 음성,
- 시트레이트 이용 안함,
- 10% 염화나트륨의 존재 하에 성장 없음,
- DNA, 단백질, 전분을 분해하는 수 많은 세포외 가수분해 효소의 분비; 및/또는
- 40% 내지 54% 의 DNA 의 G+C 함량.
파에니바실러스 속 (이전의 rRNA 그룹 3 바실리) 은 또한 16S rDNA 분석에 의해 (Antonie van Leeuwenhoek 64, 253-260 (1993)) 특징화된다:
- 16S rDNA (5' 에서 3') 의 가변 영역 V5 내에 특이적 22-염기 서열을 가짐: TCGATACCCTTGGTGCCGAAGT (Antonie van Leeuwenhoek 64, 253-260 (1993), 그곳의 표 3 참고); 및/또는
- 단리된 또는 PCR-증폭된 염색체 DNA 와 BG3 프로브 (5'-TCGATACCCTTGGTGCCGAAGT-3') 와의 혼성화에 의함 (참고 Antonie van Leeuwenhoek 64, 253-260 (1993)).
본 발명의 기탁된 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 는 하기 형태학적 및 생리학적 관찰에 대해 파에니바실러스 속에 속하는 것으로 결정되었다 (본원의 실시예 2.3 참고):
- 막대형 세포
- 타원체 포자
- 팽창된 포자낭
- 혐기성 성장
- 산 형성과 함께 글루코오스, 아라비노오스, 자일로스, 만니트, 프룩토오스, 라피노오스, 트레할로오스 및 글리세롤을 비롯한 다양한 당의 발효
- 글루코오스로부터의 기체 발생
- 아르기닌 디히드롤라아제 음성
- 시트레이트 이용 없음
- 5% 이상의 염화나트륨의 존재 하에 성장 없음
- 전분, 젤라틴, 카세인 및 에스쿨린을 분해하는 세포외 가수분해 효소의 생성.
게다가, 본 발명의 기탁된 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 는 또한 16S rDNA 에서 파에니바실러스-특이적 22-염기 서열을 가짐으로써 (5' 에서 3') 16S rDNA 분석에 의해 파에니바실러스 속에 속하는 것으로 측정되었다:
5'-TCGATACCCTTGGTGCCGAAGT-3'
(참고 본원의 서열 목록의 SEQ ID NO:1 (뉴클레오티드 840-861), SEQ ID NO:2 (840-861), SEQ ID NO:3 (844-865) 및 SEQ ID NO:4 (840-861)).
추가로, 24 개의 상이한 파에니바실러스 균주와 비교하여 완전한 16S rDNA 의 서열분석은 기탁된 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의, 파에니바실러스 브라실리엔시스, P. 크립벤시스, P. 자밀라에, P. 페오리아에, 및 P. 폴리믹사의 유형 균주, 더욱 바람직하게는 P. 페오리아에, 특히 파에니바실러스 페오리아에 균주 BD-62 (본원의 도 1 및 2 참고) 와의 클러스터링을 산출하였다. P. 폴리믹사 및 P. 페오리아에가 99.6 내지 99.7% 의 16S rDNA 서열 일치성 값을 갖는 것으로 알려져 있다 (J. Gen. Appl. Microbiol. 48, 281-285 (2002)).
2 개의 뉴클레오티드 서열 사이의 "% 일치성" 또는 "% 유사성" 은 정렬된 서열의 완전한 길이에 대한 잔기의 % 일치성을 의미하며, 2 개의 최적으로 위치 정렬된 서열을 2 개의 서열 사이의 위치 정렬의 길이에 의해 정의된 비교 윈도우에 대해 비교함으로써 측정된다, 예컨대, 예를 들어, 프로그램 AE2 (Alignment Editor 2) 의 도움으로 수동 정렬 후 (다소 유사한 서열에 대해) 계산된 일치성. 2 개의 서열 사이의 위치 정렬은 오로지 정렬을 수행하는데 사용되는 알고리즘 (예를 들어, AE2, BLAST, rRNA 분자의 2 차 구조 등) 에 따른 범주에 따라 충분히 유사한 것으로 간주된 각각의 서열의 분절을 포함한다. % 일치성은, 일치하는 핵산이 두 서열에서 발생되는 위치의 수를 측정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총 수로 나누고, 결과에 100 을 곱함으로써, 계산된다.
2 개의 핵산 서열 (예를 들어, 표 1 의 뉴클레오티드 서열 중 하나 및 이의 상동체) 의 % 서열 일치성을 측정하기 위해, 서열을 최적 비교 목적 (예를 들어, 갭은 다른 핵산과의 최적 정렬을 위해 하나의 핵산의 서열에 도입될 수 있음) 에 대해 정렬한다. 상응하는 위치에서의 염기를 이후 비교한다. 하나의 서열 내의 위치가 다른 서열 내의 상응하는 위치로서 염기에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 일치한다. 서열 일치성의 측정 목적을 위해 DNA 서열을 RNA 서열과 비교할 때, 티미딘 뉴클레오티드는 우라실 뉴클레오티드에 등가인 것으로 이해된다.
정렬을 위해, 서열 데이터를 프로그램 AE2 (http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/unix/ae2.readme) 에 입력하고, 산출되는 rRNA 분자의 2 차 구조에 따라 수동으로 정렬시키고, Firmicutes 에 속하는 유기체의 대표적인 16S rRNA 유전자 서열과 비교한다 (Nucl. Acids Res. 27, 171-173, 1999). 복합 서열의 경우 % 일치성 값을 수득하기 위해, 모든 서열을 서로 정렬시켰다 (복합 서열 정렬). 추가로, 복합 정렬과 비교하여 정렬된 서열의 더 긴 신장부를 따라 2 개의 서열 사이의 % 일치성 값을 수득하기 위해, AE2 (쌍방식 서열 정렬) 를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 수동 쌍방식 서열 정렬을 수행하였다.
게다가, 표준화된, 자동화된 리보타이핑 (ribotyping) 은 0.24 내지 0.5 의 P. 페오리아에 BD-62 에 대한 모든 3 개의 신규한 균주의 유사성을 산출하는 제한 효소 EcoRI 를 사용하는 P. peoriae BD-62 과 비교한 파에니바실러스 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 로의 Qualicon RiboPrintersystem 을 사용하여 수행한다 (실시예 2.2 및 도 12).
요약하면, 균주는 하기 분류학적 그룹에 대해 지정되었다.
파에니바실러스 균주 Lu16774 및 Lu17007 은 둘다 파에니바실러스 폴리믹사 종에 속한다.
따라서, 본 발명은 하기 미생물 균주에 관한 것이다:
1) 접근 번호 DSM 26969 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 폴리믹사 균주 Lu16774,
2) 접근 번호 DSM 26970 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 폴리믹사 균주 Lu17007, 및
3) 접근 번호 DSM 26971 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 폴리믹사 균주 Lu17015.
본원에 제시된 계통발생적 분석 결과 (도 12 내지 22) 및 Professor Borriss, Germany 의 미공개 결과에 따르면, 이종 종 파에니바실러스 폴리믹사가 2 개의 아종으로의 새로운 분류학적 분류를 필요로 한다는 것을 제안한다:
1) 파에니바실러스 폴리믹사 ssP. 폴리믹사 및 2) 파에니바실러스 폴리믹사 ssp. 플란타룸; 및 3) 신규한 종 파에니바실러스 nov. spec. 에피파이티쿠스.
최대 가망 계통도 각각에서 P. 폴리믹사 균주 SQR-21, CF05, CICC 10580, NRRL B-30509 및 A18 형태와 함께 유형 균주 P. 폴리믹사 DSM 36 을 5 개의 보존된 하우스 키핑 유전자 (dnaN, gyrB, recA, recN 및 rpoA) 분리 클러스터 (도 17-21) 에 대해 분석하였다.
매우 유사한 결과는 박테리아 종 사이에서 계통발생적 관계의 측정에 종종 사용되는 평균 아미노산 일치성 (AAI) 의 측정에 의해 수득되었다. 상기 방법은 아미노산 수준에 대한 코어 게놈의 평균 일치성의 계산에 근거한다 (Proc. Natl. Acad. USA 102, 2567-2572, 2005). 도 22 에서 산출되는 AAI-매트릭스에 따르면, P. 폴리믹사 DSM 36 은 P. 폴리믹사 SQR-21 균주와 함께 본원에 제시된 2 개의 다른 서브 클러스터 (sub cluster) 와 상이한 서브 클러스터를 형성한다.
균주 Lu16674 및 Lu17007 은 균주 P. 폴리믹사 M-1, 1-43, SC2 및 Sb3-1 과 함께 5 개의 보존된 하우스 키핑 유전자 (dnaN, gyrB, recA, recN 및 rpoA) 에 대해 분석된 최대 가망 계통도 각각에서 두번째 서브 클러스터를 형성한다 (도 17-21). 코어 게놈의 분석에 근거한 도 22 에서의 AAI-매트릭스에 따르면, 상기 두번째 버스 클러스터는 Lu16674 및 Lu17007 은 P. 폴리믹사 M-1 및 SC2 균주와 함께 이의 대표적인 균주에 의해 확인된다.
2 개의 서브 클러스터 사이의 차이는 신규한 종을 정당화하는 것이 중요하지 않으나, 두 클러스터의 대표물 사이의 AAI 일치성 수준은 2 개의 분리된 아종으로의 분류를 정당화하는 약 97.5 % 이다.
따라서, 첫번째 서브 클러스터를 유형 P. 폴리믹사 균주 DSM 36T 파에니바실러스 폴리믹사 ssP. 폴리믹사에 따라 지명하기를 제안한다. 균주 DSM 36 이외에, P. 폴리믹사 균주 SQR-21, CF05, CICC 10580, NRRL B-30509 및 A18 은 아종 파에니바실러스 폴리믹사 ssP. 폴리믹사에 속할 것이다.
추가로, 두번째 서브 클러스터를 신규한 아종 파에니바실러스 폴리믹사 ssp. 플란타룸으로서 지명하기를 제안한다. 균주 Lu16674 및 Lu17007 외에, P. 폴리믹사 균주 M-1, 1-43, SC2 및 Sb3-1 은 파에니바실러스 폴리믹사 ssp. 플란타룸에 속할 것이다.
균주 Lu17015 는 코어 게놈의 유전자와 유형 균주 파에니바실러스 폴리믹사 DSM36 = ATCC 842 사이에 오직 94.9 % 일치성 (AAI) 만을 갖는다 (도 22). 그러므로, 균주 Lu17015 는 임의의 다른 공지된 파에니바실러스 종이 아닌 파에니바실러스 폴리믹사 종으로 지정될 수 없었다. 균주 E681 (94.7 %) 및 CR2 (94.9 %) 에 대해서 유사한 값이 발견된다. 서로간에, 상기 3 개의 균주는 적어도 98.1 % 일치성 (AAI) 을 갖는다. Konstantinides and Tiedje (Proc Natl. Acad. Sci. USA. 102, 2567-2572, 2005) 의 종 정의에 따르면, 균주 Lu17015 및 또한 균주 E681 및 CR2 가 신규한 종으로 지정될 수 있다. 따라서, 신규한 종 파에니바실러스 spec. nov. 에피파이티쿠스가 여기에서 제안된다. 따라서, 파에니바실러스 균주 Lu17015 는 파에니바실러스 에피파이티쿠스에 속한다. 상기 균주는 유형 균주일 것으로 제안된다. 마찬가지로, 5 개의 하우스 키핑 유전자의 서열 비교에 기반한 계통도 (도 17-21) 는 모든 다른 P. 폴리믹사 균주와 먼 상기 클러스터를 보여준다. Lu17015 외에, P. 폴리믹사 균주 E681, CR2 TD94, DSM 365 및 WLY78 이 파에니바실러스 spec. nov. 에피파이티쿠스에 속할 것이라고 제안된다.
따라서, 본 발명은 하기 미생물 균주에 관한 것이다:
4) 접근 번호 DSM 26969 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 폴리믹사 ssp. 플란타룸 균주 Lu16774,
5) 접근 번호 DSM 26970 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 폴리믹사 ssp. 플란타룸 균주 Lu17007, 및
6) 접근 번호 DSM 26971 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 에피파이티쿠스 균주 Lu17015.
균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 외에, 본 발명은 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의 확인 특징 중 적어도 하나를 보유하기만 한다면, 임의의 파에니바실러스 균주 (균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 중 임의의 것의 본래 기탁물로부터 물리적으로 유래된 또는 독립적으로 단리된 것이든) 에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 파에니바실러스 균주는 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 중 임의의 것의 임의의 자손 (상기 균주의 돌연변이체 포함) 을 포함한다.
용어 "돌연변이체" 는 직접 돌연변이체 선별에 의해 수득된 미생물을 말하는 것 뿐 아니라, 추가로 돌연변이화되거나 또는 다르게는 조작된 (예를 들어, 플라스마의 도입을 통해) 미생물을 포함한다. 따라서, 구현예는 돌연변이체, 변이체, 및 또는 각각의 미생물의 유도체 (자연 발생적이고 인공적으로 유도된 돌연변이 둘다) 를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이체는 미생물을, 통상의 방법을 사용하여 공지된 돌연변이유발, 예컨대 X-선, UV 방사선 또는 N-메틸-니트로소구아니딘에 적용함으로써 유도될 수 있다. 상기 처리에 후속하여 원하는 특징을 보여주는 돌연변이체 균주에 대한 스크리닝을 수행할 수 있다.
돌연변이체 균주는 직접 돌연변이체 선별, 화학적 돌연변이유발 또는 유전자 조작 (예를 들어, 플라스마의 도입을 통해) 과 같은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 이러한 돌연변이체는 공지된 돌연변이유발요인, 예컨대 X-선, UV 방사선 또는 N-메틸-니트로소구아니딘을 적용함으로써 수득가능하다. 상기 처리에 후속하여 원하는 특징을 보여주는 돌연변이체 균주에 대한 스크리닝을 수행할 수 있다.
본 발명의 파에니바실러스 균주는 특히, 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의 16S rDNA 서열 중 임의의 하나에 대해, 즉, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3 인 서열 목록에 언급되는 상기 뉴클레오티드 서열 중 임의의 하나에 대해, 적어도 99.6 %, 바람직하게는 적어도 99.8 %, 더 더욱 바람직하게는 적어도 99.9 %, 및 특히 100.0 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 DNA 서열을 포함하는 것이다.
추가의 구현예에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 특히, 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의 16S rDNA 서열 중 임의의 하나에 대해, 즉, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3 인 서열 목록에 언급되는 상기 뉴클레오티드 서열 중 임의의 하나에 대해, 100% 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 DNA 서열을 포함하는 것이다.
추가의 구현예에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 완전한 16S rDNA 서열이 정렬된 서열 윈도우 내의 최적 정렬 후 서열 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:2 중 적어도 하나에 대해 적어도 99.6% 일치성 또는 SEQ ID NO:3 에 대해 적어도 99.8% 일치성; 바람직하게는 서열 SEQ ID NO:1, SEQ ID:2 및 SEQ ID NO:3 중 적어도 하나에 대해 적어도 99.8 % 일치성; 더욱 바람직하게는 서열 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3 중 적어도 하나에 대해 적어도 99.9 % 일치성; 더 더욱 바람직하게는 서열 SEQ ID NO:1, SEQ ID:2 및 SEQ ID NO:3 중 적어도 하나에 대해 99.9 % 초과의 일치성; 특히 서열 SEQ ID NO:1, SEQ ID:2 및 SEQ ID NO:3 중 적어도 하나에 대해 100 % 일치성을 갖는 것이다.
추가의 구현예에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
a) 접근 번호 DSM 26969 로 DSMZ 에 기탁된 균주 Lu16774;
b) 접근 번호 DSM 26970 로 DSMZ 에 기탁된 균주 Lu17007;
c) 접근 번호 DSM 26971 로 DSMZ 에 기탁된 균주 Lu17015; 및
d) 하기를 나타내는 DNA 서열을 포함하는 균주:
d1) DNA 서열 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:9 에 대해 적어도 99.6 % 뉴클레오티드 서열 일치성; 또는
d2) DNA 서열 SEQ ID NO:14 에 대해 적어도 99.8 % 뉴클레오티드 서열 일치성; 또는
d3) DNA 서열 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:10 에 대해 적어도 99.9 % 뉴클레오티드 서열 일치성; 또는
d4) DNA 서열 SEQ ID NO:15 에 대해 적어도 99.2 % 뉴클레오티드 서열 일치성; 또는
d5) DNA 서열 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:11 에 대해 적어도 99.2 % 뉴클레오티드 서열 일치성; 또는
d6) DNA 서열 SEQ ID NO:16 에 대해 적어도 99.8 % 뉴클레오티드 서열 일치성; 또는
d7) DNA 서열 SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:12 에 대해 적어도 99.8 % 뉴클레오티드 서열 일치성; 또는
d8) DNA 서열 SEQ ID NO:17 에 대해 적어도 99.3 % 뉴클레오티드 서열 일치성; 또는
d9) DNA 서열 SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:13 에 대해 100.0 % 뉴클레오티드 서열 일치성; 또는
d10) DNA 서열 SEQ ID NO:18 에 대해 적어도 99.8 % 뉴클레오티드 서열 일치성.
본 발명의 파에니바실러스 균주는 특히, DNA 서열 SEQ ID NO:4 또는 SEQ ID NO:9 에 대해 적어도 99.6 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 dnaN DNA 서열을 포함하는 또는 DNA 서열 SEQ ID NO:14 에 대해 적어도 99.8 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 DNA 서열을 포함하는 것이다.
추가의 구현예에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 완전한 dnaN DNA 서열이 정렬된 서열 윈도우 내의 최적 정렬 후 DNA 서열 SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:9 중 적어도 하나에 대해 적어도 99.6 % 일치성 또는 SEQ ID NO:14 에 대해 적어도 99.8 % 일치성; 바람직하게는 SEQ ID NO:14 에 대해 적어도 99.9 % 일치성; 특히 SEQ ID NO:14 에 대해 100 % 일치성을 갖는 것이다.
본 발명의 파에니바실러스 균주는 특히 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의 dnaN DNA 서열 중 임의의 하나에 대해, 즉, 이들 DNA 서열 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:14 중 임의의 하나에 대해 적어도 99.8 %, 특히 100.0 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 DNA 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 파에니바실러스 균주는 특히, DNA 서열 SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:10 에 대해 적어도 99.9 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 gyrB DNA 서열을 포함하는 또는 DNA 서열 SEQ ID NO:15 에 대해 적어도 99.2 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 DNA 서열을 포함하는 것이다.
추가의 구현예에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 완전한 gyrB DNA 서열이 정렬된 서열 윈도우 내의 최적 정렬 후 DNA 서열 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:10 중 적어도 하나에 대해 적어도 99.9 % 일치성 또는 SEQ ID NO:15 에 대해 적어도 99.9 % 일치성; 바람직하게는 SEQ ID NO:15 에 대해 적어도 99.9 % 일치성; 특히 SEQ ID NO:15 에 대해 100 % 일치성을 갖는 것이다.
본 발명의 파에니바실러스 균주는 특히, 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의 gyrB DNA 서열 중 임의의 것에 대해, 즉, 이들 DNA 서열 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:15 중 임의의 것에 대해 100.0 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 DNA 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 파에니바실러스 균주는 특히, DNA 서열 SEQ ID NO:6 또는 SEQ ID NO:11 에 대해 적어도 99.2 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 recF DNA 서열을 포함하거나 DNA 서열 SEQ ID NO:16 에 대해 적어도 99.8 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 DNA 서열을 포함하는 것이다.
추가의 구현예에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 완전한 recF DNA 서열이 정렬된 서열 윈도우 내의 최적 정렬 후 DNA 서열 SEQ ID NO:6 및 SEQ ID NO:11 중 적어도 하나에 대해 SEQ ID NO:16 에 대해 적어도 99.2 % 일치성 또는 적어도 99.8 % 일치성; 바람직하게는 SEQ ID NO:16 에 대해 적어도 99.9 % 일치성; 특히 SEQ ID NO:16 에 대해 100 % 일치성을 갖는 것이다.
본 발명의 파에니바실러스 균주는 특히, 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의 recF DNA 서열 중 임의의 하나에 대해, 즉, 이들 DNA 서열 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:11 및 SEQ ID NO:16 중 임의의 하나에 대해 적어도 99.8 %, 특히 100.0 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 DNA 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 파에니바실러스 균주는 특히, DNA 서열 SEQ ID NO:7 또는 SEQ ID NO:12 에 대해 적어도 99.8 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 recN DNA 서열을 포함하거나 또는 DNA 서열 SEQ ID NO:17 에 대해 적어도 99.3 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 DNA 서열을 포함하는 것이다.
추가의 구현예에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 완전한 recN DNA 서열이 정렬된 서열 윈도우 내의 최적 정렬 후 DNA 서열 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:12 중 적어도 하나에 대해 적어도 99.8 % 일치성 또는 SEQ ID NO:17 에 대해 적어도 99.3 % 일치성; 바람직하게는 SEQ ID NO:17 에 대해 적어도 99.6 % 일치성; 특히 SEQ ID NO:17 에 대해 100 % 일치성을 갖는 것이다.
본 발명의 파에니바실러스 균주는 특히, 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의 recN DNA 서열 중 임의의 하나에 대해, 즉, 이들 DNA 서열 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:12 및 SEQ ID NO:17 중 임의의 하나에 대해 적어도 99.8 %, 특히 100.0 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 DNA 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 파에니바실러스 균주는 특히, DNA 서열 SEQ ID NO:8 또는 SEQ ID NO:13 에 대해 100.0 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 rpoA DNA 서열을 포함하는 또는 DNA 서열 SEQ ID NO:18 에 대해 적어도 99.8 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 DNA 서열을 포함하는 것이다.
추가의 구현예에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 완전한 rpoA DNA 서열이 정렬된 서열 윈도우 내의 최적 정렬 후 DNA 서열 SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:13 중 적어도 하나에 대해 100.0 % 일치성 또는 SEQ ID NO:18 에 대해 적어도 99.8 % 일치성; 바람직하게는 SEQ ID NO:17 에 대해 적어도 99.9 % 일치성; 특히 to SEQ ID NO:18 에 대해 100 % 일치성을 갖는 것이다.
본 발명의 파에니바실러스 균주는 특히, 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의 rpoA DNA 서열 중 임의의 하나에 대해, 즉, 이들 DNA 서열 SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:18 중 임의의 하나에 대해 100.0 % 뉴클레오티드 서열 일치성을 나타내는 DNA 서열을 포함하는 것이다.
추가의 구현예는 하기 균주 중 하나의 확인 특성 중 적어도 하나를 갖는, 계열 파에니바실러스의 일원인 단리된 미생물에 관한 것이다:
1) 접근 번호 DSM 26969 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu16774,
2) 접근 번호 DSM 26970 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu17007, 또는
3) 접근 번호 DSM 26971 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu17015.
추가의 구현예는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 파에니바실러스 균주에 관한 것이다:
1) 접근 번호 DSM 26969 로 DSMZ 에 기탁된 균주 Lu16774,
2) 접근 번호 DSM 26970 로 DSMZ 에 기탁된 균주 Lu17007, 및
3) 접근 번호 DSM 26971 로 DSMZ 에 기탁된 균주 Lu17015,
4) 상기 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 중 하나의 확인 특성 중 적어도 하나를 갖는 균주.
본 발명의 또다른 구현예는 하기 균주로부터 선택되고:
1) 접근 번호 DSM 26969 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu16774,
2) 접근 번호 DSM 26970 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu17007, 및
3) 접근 번호 DSM 26971 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu17015;
적어도 하나의 식물 병원균에 대항하는 길항 활성을 보여주고, 적어도 하나의 푸사리시딘-유형 화합물을 생성할 수 있는 단리된 미생물; 또는 상기 능력을 보유하는, 즉 적어도 하나의 식물 병원균에 대항하는 상기 길항 활성을 보유하고, 적어도 하나의 푸사리시딘-유형 화합물을 생성하는 상기 능력을 보유하는 이의 돌연변이체 균주에 관한 것이다.
추가의 구현예는 하기로부터 선택되는 미생물:
1) 접근 번호 DSM 26969 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu16774,
2) 접근 번호 DSM 26970 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu17007, 및
3) 접근 번호 DSM 26971 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu17015;
또는 상기 균주 중 하나의 확인 특성 모두를 갖는 이의 돌연변이체 균주에 관한 것이다.
기탁된 파에니바실러스 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의 확인 특성은 각각의 균주의 대사물질인, 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 로부터 선택되는, 적어도 하나의 화학식 I 의 화합물을 생성할 수 있다는, 특히 화합물 1A 및 1B; 및 이의 농업적으로 허용가능한 염을 생성할 수 있다는 것이다.
따라서, 본 발명의 하나의 양상에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 적어도 하나의 화학식 I 의 화합물을 생성, 더욱 바람직하게는 화합물 1A 또는 1B 를 생성, 특히 화합물 1A 및 1B; 및 이의 농업적으로 허용가능한 염을 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 양상에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 탄소 공급원 및 하나의 질소 공급원을 포함하는 성장 배지에서, 적어도 하나의 화학식 I 의 화합물을 생성, 더욱 바람직하게는 화합물 1A 또는 1B 를 생성, 특히 화합물 1A 및 1B; 및 이의 농업적으로 허용가능한 염을 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 양상에 따르면, 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 탄소 공급원 및 하나의 질소 공급원을 포함하는 성장 배지에서 본 발명의 파에니바실러스 균주는 적어도 하나의 화학식 I 의 화합물을 생성, 더욱 바람직하게는 화합물 1A 또는 1B 를 생성, 특히 화합물 1A 및 1B; 및 이의 농업적으로 허용가능한 염을 생성한다.
본 발명의 또다른 구현예는 하기로부터 선택되고:
1) 접근 번호 DSM 26969 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu16774,
2) 접근 번호 DSM 26970 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu17007, 및
3) 접근 번호 DSM 26971 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu17015;
적어도 하나의 식물 병원균에 대항하는 길항 활성을 보여주고, 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 로부터 선택되는, 적어도 하나의 화학식 I 의 푸사리시딘-유형 화합물, 특히 화합물 1A 및 1B 를 생성할 수 있는 단리된 미생물; 또는 상기 능력을 보유하는, 즉 적어도 하나의 식물 병원균에 대항하는 상기 길항 활성을 보유하고, 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 로부터 선택되는, 적어도 하나의 화학식 I 의 푸사리시딘-유형 화합물, 특히 화합물 1A 및 1B 를 생성하는 상기 능력을 보유하는 이의 돌연변이체 균주에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 구현예는 하기로부터 선택되고:
1) 접근 번호 DSM 26969 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu16774,
2) 접근 번호 DSM 26970 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu17007, 및
3) 접근 번호 DSM 26971 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu17015;
적어도 하나의 식물 병원균에 대항하는 길항 활성을 보여주고, 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 탄소 공급원 및 하나의 질소 공급원을 포함하는 성장 배지에서 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 로부터 선택되는, 적어도 하나의 화학식 I 의 푸사리시딘-유형 화합물, 특히 화합물 1A 및 1B 를 생성할 수 있는 단리된 미생물; 또는 상기 능력을 보유하는, 즉 적어도 하나의 식물 병원균에 대항하는 상기 길항 활성을 보유하고, 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 로부터 선택되는, 적어도 하나의 화학식 I 의 푸사리시딘-유형 화합물, 특히 화합물 1A 및 1B 를 생성하는 상기 능력을 보유하는 이의 돌연변이체 균주에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 구현예는 하기로부터 선택되고:
1) 접근 번호 DSM 26969 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu16774,
2) 접근 번호 DSM 26970 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu17007, 및
3) 접근 번호 DSM 26971 로 DSMZ 에 기탁된 파에니바실러스 균주 Lu17015;
적어도 하나의 식물 병원균에 대항하는 길항 활성을 보여주고, 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 로부터 선택되는, 적어도 하나의 화학식 I 의 푸사리시딘-유형 화합물, 특히 화합물 1A 및 1B 를 생성할 수 있는 단리된 미생물; 또는 상기 능력을 보유하는, 즉 적어도 하나의 식물 병원균에 대항하는 상기 길항 활성을 보유하고, 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 로부터 선택되는, 적어도 하나의 화학식 I 의 푸사리시딘-유형 화합물, 특히 화합물 1A 및 1B 를 생성하는 상기 능력을 보유하는 이의 돌연변이체 균주에 관한 것이다.
기탁된 파에니바실러스 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 또는 이의 돌연변이체 균주의 추가의 확인 특성은 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 로부터 선택되는, 적어도 하나의 화학식 I 의 화합물, 특히 화합물 1A 및 1B 를 생성하는 이들의 능력 외에도, 이들이 푸사리시딘 A, 푸사리시딘 B, 푸사리시딘 C, 푸사리시딘 D, LI-F06a, LI-F06b 및 LI-F08b 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 생성할 수 있다는 것이다.
따라서, 본 발명의 추가의 양상에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 본원에 기재된 바와 같이, 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 로부터 선택되는, 적어도 하나의 화학식 I 의 푸사리시딘을 생성, 특히 화합물 1A 및 1B 를 생성할 수 있고, 푸사리시딘 A, 푸사리시딘 B, 푸사리시딘 C, 푸사리시딘 D, LI-F06a, LI-F06b 및 LI-F08b 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 생성할 수 있다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 본원에 기재된 바와 같이, 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 로부터 선택되는, 적어도 하나의 화학식 I 의 푸사리시딘을 생성, 특히 화합물 1A 및 1B 를 생성할 수 있고, 푸사리시딘 A, 푸사리시딘 B, 푸사리시딘 C, 푸사리시딘 D, LI-F06a, LI-F06b 및 LI-F08b 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 3 개의 화합물을 생성할 수 있다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 본원에 기재된 바와 같이, 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 로부터 선택되는, 적어도 하나의 화학식 I 의 푸사리시딘을 생성, 특히 화합물 1A 및 1B 를 생성할 수 있고, 푸사리시딘 A, 푸사리시딘 B, 푸사리시딘 C, 푸사리시딘 D, LI-F06a, LI-F06b 및 LI-F08b 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 5 개의 화합물을 생성할 수 있다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 본원에 기재된 바와 같이, 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 로부터 선택되는, 적어도 하나의 화학식 I 의 푸사리시딘을 생성, 특히 화합물 1A 및 1B 를 생성할 수 있고, 푸사리시딘 A, 푸사리시딘 B, 푸사리시딘 C, 푸사리시딘 D 및 LI-F08b 를 생성할 수 있다.
기탁된 파에니바실러스 균주의 추가의 확인 특성은 이들의 항진균성 활성이다. 특히, 이들 균주는 알테나리아 종, 보트리티스 시네레아, 파이토프토라 인페스탄스, 및 스클레로티니아 스클레로티오룸을 포함하는 식물 병원균으로의 감염에 대항하여 효과적인 것으로 밝혀졌고; 알테나리아 종은 바람직하게는 A. 솔라니 및 A. 알테르나타, 특히 A. 솔라니로부터 선택된다.
따라서, 본 발명의 추가의 양상에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는, 특히 알테나리아 종, 보트리티스 시네레아, 파이토프토라 인페스탄스, 및 스클레로티니아 스클레로티오룸으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 식물 병원균에 대항하는 항진균성 활성을 갖고, 알테나리아 종은 바람직하게는 A. 솔라니 및 A. 알테르나타, 특히 A. 솔라니로부터 선택된다. 더욱 특히, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 상기 병원균 의 적어도 2 개에 대항하는 또는 4 개 모두에 대항하는 항진균성 활성을 갖는다.
본 발명의 추가의 양상에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 식물 병원균 알테나리아 솔라니, 보트리티스 시네레아, 파이토프토라 인페스탄스, 및 스클레로티니아 스클레로티오룸에 대항하는 항진균성 활성을 갖는다.
식물 병원균에 대항하는 파에니바실러스 균주의 길항 활성은 원하는 식물병원성 진균 예컨대 알테나리아 종, 보트리티스 시네레아, 파이토프토라 인페스탄스, 및 스클레로티니아 스클레로티오룸을 사용하는 시험관 내 대립 어세이에서 제시될 수 있고, 알테나리아 종은 바람직하게는 A. 솔라니 및 A. 알테르나타, 특히 A. 솔라니로부터 선택된다:
상기 식물병원성 진균에 대한 성장 배지로서, 리터 당: 10g 맥아 추출물 (Sigma Aldrich, 70167); 4 g Bacto 효모 추출물 (Becton Dickinson, 212750); 4 g 글루코오스 일수화물 (Sigma Aldrich, 16301); 20 g Agar (Becton Dickinson, 214510), pH 약 7, Aq. bidest 를 포함하는 ISP2 배지가 사용된다. PHYTIN 에 대한 성장 배지로서, 리터 당: 200 ml 의 야채 쥬스, 3 g 탄산칼슘 (Merck Millipore, 1020660250); 30 g Agar (Becton Dickinson, 214510), pH 6.8, Aq. bidest 를 포함하는 V8 배지가 사용된다.
파에니바실러스 균주를 아가 플레이트의 하나의 면 상에 지점-접종한다. 하나의 활성적으로 성장하는 식물 병원균을 함유하는 아가 블록 (대략 0.3 cm²) 을 플레이트 중심에 넣는다. 7-14 일 동안 약 25℃ 에서 접종 후, 특히 억제 구역에 대해, 식물 병원균의 성장을 평가한다. 하기 길항 효과가 평가될 수 있다: 항생작용은 무-진균 구역 (억제 구역) 의 직경 평가에 의해 점수를 매긴다. 대조군 플레이트에 비해 박테리아 균주가 있는 플레이트 상에서 진균 병원균의 성장 직경을 비교함으로써 경쟁의 점수를 매긴다. 박테리아가 진균 병원균보다 및 또한 기생균류가 병원균보다 과성장하는 경우 균기생이 기록될 수 있다. 이것을 현미경으로 시각화할 수 있다.
기탁된 파에니바실러스 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의 또다른 확인 특징은 이들이; 특히 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 탄소 공급원 및 하나의 질소 공급원을 포함하는 성장 배지에서, 바람직하게는 키티나아제, 셀룰라아제 및 아밀라아제 (실시예 6 참고), 더 더욱 바람직하게는 적어도 키티나아제 및 셀룰로오스로부터 선택되는 적어도 하나의 용해 효소를 생성 및 분비할 수 있다는 것이다.
따라서, 본 발명의 추가의 양상에 따르면, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 특히 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 탄소 공급원 및 하나의 질소 공급원을 포함하는 성장 배지에서, 바람직하게는 키티나아제, 셀룰라아제 및 아밀라아제, 더 더욱 바람직하게는 적어도 키티나아제 및 셀룰로오스로부터 선택되는 적어도 하나의 용해 효소를 생성 및 분비할 수 있다.
더욱 특히, 본 발명은 기탁된 균주의 확인 특성 중 하나 이상을 갖는 기탁된 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 및 임의의 파에니바실러스 균주에 관한 것으로, 확인 특성은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
(a) 알테나리아 종, 보트리티스 시네레아, 파이토프토라 인페스탄스, 및 스클레로티니아 스클레로티오룸으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 식물 병원균에 대항하는 항진균성 활성, 알테나리아 종은 본원에 기재된 바와 같이 바람직하게는 A. 솔라니 및 A. 알테르나타, 특히 A. 솔라니로부터 선택됨;
(b) 본원에 기재된 바와 같이 적어도 하나의 화학식 I 의 푸사리시딘-유형 화합물, 특히 화합물 1A 및/또는 1B 를 생성하는 능력;
(c) 본원에 기재된 바와 같이 푸사리시딘 A, B, C, D, LI-F06a, LI-F06b 및 LI-F08b 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 생성하는 능력; 및
(d) 본원에 기재된 바와 같이 키티나아제, 셀룰로오스 및 아밀라아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용해 효소를 생성 및 분비하는 능력.
더욱 바람직하게는, 상기 파에니바실러스 균주는 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 탄소 공급원 및 하나의 질소 공급원을 포함하는 성장 배지에서 (b), (c) 및 (d) 로서 언급되는 능력을 갖는다.
특히, 본 발명의 파에니바실러스 균주는 기탁된 균주의 확인 특징 중 2 개 이상을 갖고, 적어도 특징 (a) 및 (b) 를 갖는 균주가 특히 바람직하다. 예를 들어, 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 균주 (a) 는 알테나리아 종, 보트리티스 시네레아, 파이토프토라 인페스탄스, 및 스클레로티니아 스클레로티오룸으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 식물 병원균에 대항하는 항진균성 활성을 갖고, 알테나리아 종은 바람직하게는 A. 솔라니 및 A. 알테르나타, 특히 A. 솔라니로부터 선택되고, (b) 는 적어도 하나의 화학식 I 의 화합물, 및 특히 화합물 1B 를 생성할 수 있다. 추가의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 균주 (a) 는 알테나리아 종, 보트리티스 시네레아, 파이토프토라 인페스탄스, 및 스클레로티니아 스클레로티오룸으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 식물 병원균 중 3 개에 대항하는 또는 모두에 대항하는 항진균성 활성을 갖고, 알테나리아 종은 바람직하게는 A. 솔라니 및 A. 알테르나타, 특히 A. 솔라니로부터 선택되며, (b) 는 적어도 하나의 화학식 I 의 화합물을 생성, 더욱 바람직하게는 화합물 1A 또는 1B 를 생성, 특히 화합물 1A 및 1B 를 생성할 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명의 균주는 단리된 또는 실질적으로 정제된 형태로 제공된다.
용어 "단리된" 또는 "실질적으로 정제된" 은 본 발명의 균주가 자연 환경에서 제거되고, 단리된 또는 분리되고, 이들이 자연적으로 연관된 다른 성분이 적어도 60% 없는, 바람직하게는 적어도 75% 없는, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 없는, 더 더욱 바람직하게는 적어도 95% 없는, 가장 바람직하게는 적어도 99% 없는 것을 나타내는 것을 의미한다. 단일 미생물 콜로니를 배양함으로써 수득된 단리물은 본 발명의 단리된 균주의 예이다.
본 발명의 균주는 활성 또는 휴면과 같은 임의의 생리학적 상태로 제공될 수 있다. 휴면 균주는 예를 들어 동결, 건조 또는 동결건조 (lyophilized) 되거나 또는 부분적으로 건조된 (desiccated) (부분적으로 건조된 유기체를 제조하기 위한 절차는 WO 2008/002371 에 제시됨) 또는 포자 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명의 균주는 포자 형태로 제공된다.
본 발명의 추가의 구현예에 따르면, 본 발명의 균주는 본 발명의 균주를 포함하는 전체 배양 브로쓰로서 제공된다.
배양물은 바람직하게는 단리된 또는 실질적으로 정제된 배양물이다.
"단리된 배양물" 또는 "실질적으로 정제된 배양물" 은 균주가 성장하는 및/또는 균주가 정상적으로 수득될 수 있는 자연 서식지에서 정상적으로 발견되는 상당한 양의 다른 물질을 포함하지 않는 본 발명의 균주의 배양물을 말한다. 따라서, 이러한 "단리된 배양물" 또는 "실질적으로 정제된 배양물" 은 균주가 성장하는 및/또는 균주가 정상적으로 수득될 수 있는 자연 서식지에서 정상적으로 발견되는 다른 물질이 적어도 60% 없는, 바람직하게는 적어도 75% 없는, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 없는, 더 더욱 바람직하게는 적어도 95% 없는, 가장 바람직하게는 적어도 99% 없는 것이다. 이러한 "단리된 배양물" 또는 "실질적으로 정제된 배양물" 은 본 발명의 균주의 복제를 간섭하기에 충분한 양의 임의의 다른 미생물을 정상적으로 포함하지 않는다. 본 발명의 단리된 배양물은 그러나 본 발명의 균주 및 추가의 생물살충제, 바람직하게는 미생물 살충제의 혼합된 배양물을 제조하기 위해 조합될 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 항병원균 생물농약의 발효 제조를 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 사용되는 균주는 배치 공정에서 또는 공급 배치에서 또는 반복된 공급 배치 공정에서 연속적으로 또는 불연속적으로 배양될 수 있다. 공지된 배양 방법에 대한 리뷰는 Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) 문헌 또는 Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) 문헌에서 찾을 수 있다.
미생물의 배양에 사용하고자 하는 배지는 특정 균주의 필요성을 적합한 방식으로 만족해야만 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지의 설명은 American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) 의 지침서 "Manual of Methods for General Bacteriology" 에 제공된다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 상기 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소 공급원, 질소 공급원, 무기 염, 비타민 및/또는 미량 원소를 포함한다. 바람직한 탄소 공급원은 당, 예컨대 단당류, 이당류 또는 다당류이다. 매우 양호한 탄소 공급원은 예를 들어, 글루코오스, 프룩토오스, 만노오스, 갈락토오스, 리보오스, 소르보오스, 리불로오스, 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스, 전분 또는 셀룰로오스이다. 복합 화합물, 예컨대 당밀을 통해, 또는 당 정제로부터의 기타 부산물을 통해 배지에 당이 또한 첨가될 수 있다. 또한 다양한 탄소 공급원의 혼합물을 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 기타 가능한 탄소 공급원은 오일 및 지방, 예컨대 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛유, 지방산, 예컨대 팔미트산, 스테아르산 또는 리놀레산, 알코올, 예컨대 글리세롤, 메탄올 또는 에탄올 및 유기산, 예컨대 아세트산 또는 락트산이다. 질소 공급원은 통상 유기 또는 무기 질소 화합물 또는 상기 화합물을 함유하는 재료이다. 질소 공급원의 예는 암모니아 기체 또는 암모늄 염, 예컨대 암모늄 술페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카보네이트 또는 암모늄 니트레이트, 니트레이트, 우레아, 아미노산 또는 복합 질소 공급원, 예컨대 옥수수 침지액, 대두분, 대두 단백질, 효모 추출물, 고기 추출물 및 기타를 포함한다. 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 배지에 존재할 수 있는 무기 염기 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브덴, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 클로라이드, 포스페이트 또는 술페이트 염을 포함한다. 무기 황-함유 화합물, 예를 들어 술페이트, 술파이트, 디티오나이트, 테트라티오네이트, 티오술페이트, 술파이드, 또한 유기 황 화합물, 예컨대 메르캅탄 및 티올이, 황이 공급원으로서 사용될 수 있다. 인산, 칼륨 디히드로겐포스페이트 및 디칼륨 히드로겐포스페이트 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 인의 공급원으로서 사용될 수 있다. 용액 중에 금속 이온을 유지하기 위해, 킬레이트제가 배지에 첨가될 수 있다. 특히 적합한 킬레이트제는 디히드록시페놀, 예컨대 카테콜 또는 프로토카테쿠에이트, 또는 유기 산, 예컨대 시트르산을 포함한다. 본 발명에 따라 사용되는 발효 배지는 또한 기타 성장 인자, 예컨대 비타민 또는 성장 촉진제를 포함할 수 있으며, 이것은 예를 들어, 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 포함한다. 성장 인자 및 염은 종종 배지의 복합 성분, 예컨대 효모 추출물, 당밀, 옥수수 침지액 등으로부터 유래한다. 부가적으로, 적합한 전구체가 배지에 첨가될 수 있다. 배지 내의 화합물의 정확한 조성은 특정 실험에 따라 크게 좌우되고 각각의 특정 경우에 대해 개별적으로 결정되야만 한다. 배지 최적화에 대한 정보는 문헌 "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Publ. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0 19 963577 3) 에서 찾을 수 있다. 성장 배지는 또한 Standard 1 (Merck) 또는 BHI (Brain heart infusion, DIFCO) 등과 같은 상업 공급처로부터 수득될 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 바람직한 성장 배지는 L-아라비노오스, N-아세틸-D-글루코사민, D-갈락토오스, L-아스파르트산, D-트레할로오스, D-만노오스, 글리세롤, D-글루콘산, D-자일로스, D-만니톨, D-리보오스, D-프룩토오스, α-D-글루코오스, 말토오스, D-멜리비오스, 티미딘, α-메틸-D-갈락토시드, α-D-락토오스, 락툴로오스, 수크로오스, 우리딘, α-히드록시 글루타르산-γ-락톤, β-메틸-D-글루코시드, 아도니톨, 말토트리오스, 2-데옥시아데노신, 아데노신, 시트르산, 점액산, D-셀로비오스, 이노신, L-세린, L-알라닐-글리신, D-갈락투론산, α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, 덱스트린, 이눌린, 펙틴, 아미그달린, 겐티오비오스, 락티톨, D-멜레지토스, α-메틸-D-글루코시드, β-메틸-D-갈락토시드, β-메틸-D-자일로시드, 팔라티노스, D-라피노오스, 스타키오스, 투라노오스, γ-아미노 부티르산, D-글루오사민, D-락트산, L-라이신, 3-히드록시 2-부타논으로부터 선택되는 하나 이상의 탄소 공급원; 및 암모니아, 니트레이트, 니트레이트, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-글루타민, 글리신, 아미노산 다임: Ala-Asp, AlaGln, Ala-Glu, Ala-His, Gly-Gln, Gly-Glu, Gly-Met, 및 Met-Ala 로부터 선택되는 하나 이상의 질소 공급원; 특히 니트레이트를 포함한다. 상기 배지는 무기 염 및 비타민 및/또는 미량 원소로 보충될 수 있다. 균주는 상기 성장 배지 중에서 화합물 1A 및 1B 를 생성할 수 있다.
배지의 모든 성분은 가열 (2.0 bar 및 121 ℃에서 20 분) 또는 멸균 여과에 의해 멸균된다. 구성성분은 함께 멸균되거나 필요할 경우 별도로 멸균될 수 있다. 배지의 모든 구성성분은 성장 시작시에 존재할 수 있거나 임의로 연속적으로 또는 배치 공급에 의해 첨가될 수 있다.
배양물의 온도는 보통 15 ℃ 내지 36 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 33 ℃이며, 일정하게 유지하거나 실험 중에 변화시킬 수 있다. 배지의 pH 값은 5 내지 8.5 의 범위, 바람직하게는 약 7.0 이어야한다. 성장을 위한 pH 값은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아 수와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 첨가함으로써 성장 중에 제어될 수 있다. 소포제, 예를 들어, 지방산 폴리글리콜 에스테르가 발포 억제 용으로 사용될 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해, 선택적 작용을 갖는 적합한 물질, 예를 들어, 항생제를 배지에 첨가할 수 있다. 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물, 예를 들어, 주위 공기는 호기성 조건을 유지하기 위해 배양물에 공급된다. 배양물의 온도는 일반적으로 20℃ 내지 45℃ 이다. 원하는 생성물의 최대가 형성될 때까지 배양을 계속한다. 이는 일반적으로 10 시간에서 160 시간 이내에 달성된다.
특히, 본 발명의 균주는 Luria-Bertani Broth (LB), 트립티카아제 - 대두 브로쓰 (TSB), 효모 추출물/맥아 추출물/글루코오스 브로쓰 (YMG, ISP2) 와 같은 다양한 표준 미생물 배지에서, 15 ~ 36 ℃ 에서 18 ~ 360 시간 동안 액체 배지 또는 페트리 디쉬 상의 아가-응고 배지에서 배양될 수 있다. 통기가 필요할 수 있다. 박테리아 세포 (식물 세포 및 포자) 는 세척 및 농축될 수 있다 (예를 들어, 약 15 내지 30 ℃ 의 온도에서 7,000 x g 에서 약 15 분 동안 원심분리시킴으로써).
본 발명은 또한 본 발명의 균주를 배지에서 배양하고 배양 브로쓰로부터 배지를 분리함으로써 (따라서, 배지에서 성장된 세포가 전체 배양 브로쓰로부터 제거 될 때 남아있는) 수득가능한 배양 배지, 예를 들어, 전체 배양 브로쓰의 상청액, 즉 브로쓰 및 다른 잔해에서 성장한 세포가 원심 분리, 여과, 침강 또는 당 업계에 널리 공지된 다른 수단에 의해 제거될 때 잔류하는 액체 브로쓰에 관한 것이다. 상청액은 예를 들어, 약 5,000 내지 20,000 x g 에서 (더욱 바람직하게는 약 15,000 x g 에서) 약 2 내지 30 ℃ (더욱 바람직하게는 4 내지 20 ℃의 온도에서) 의 온도에서 약 10 내지 60 분 (더욱 바람직하게는 약 15 내지 30 분) xg) 동안의 원심분리에 의해 수득될 수 있다.
이러한 배양 배지는 배양된 균주에 의해 생산되는 농약 대사물질을 함유한다.
본 발명은 또한 본 발명의 균주의 무-세포 추출물에 관한 것이다. 무-세포 추출물을 제조하기 위해, 본 발명의 균주를 상기 기재한 바와 같이 배양할 수 있다. 세포를 고주파 초음파, 고압, 예를 들어 French 압력 셀에서, 오스몰 분해에 의해, 세제, 용해 효소 또는 유기 용매의 작용에 의해, 균질화기를 사용하여 또는 나열된 몇 가지 방법의 조합에 의해 파괴될 수 있다. 추출은 바람직하게는 유기 용매 또는 용매 혼합물, 더욱 바람직하게는 알코올 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, n- 프로판올, 2-프로판올 등), 더 더욱 바람직하게는 2-프로판올 (예를 들어, 배양물 부피에 대해 1:1 비율로) 로 수행될 수 있다. 상 분리는 NaCl 과 같은 염을 첨가함으로써 향상될 수 있다. 유기 상을 수집할 수 있고 용매 또는 용매 혼합물은 통상적인 증류 및/또는 건조에 이어 메탄올 중 재현탁 및 여과에 의해 제거될 수 있다.
이러한 추출물은 배양된 균주에 의해 생산되는 농약 대사물질을 함유한다.
본 발명의 균주에 특이적인 살충성 대사물질은 특히 본 발명의 균주가 전술 한 바와 같이 배양될 때 통상적인 방법에 따라 상기 배지 또는 추출물로부터 회수 될 수 있다.
본 발명의 방법론은 개별적인 농약 대사물질을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
"회수하는" 이라는 용어는 배양 배지 또는 무-세포 추출물로부터 화합물을 추출, 수확, 단리 또는 정제하는 것을 포함한다. 화합물을 회수하는 것은 통상적 인 수지 (예를 들어, 음이온 또는 양이온 교환 수지, 비-이온성 흡착 수지 등) 로의 처리, 통상의 흡착제 (예를 들어, 활성탄, 규산, 실리카겔, 셀룰로오스, 알루미나 등) 로의 처리, pH 의 변경, 용매 추출 (예를 들어, 알코올, 에틸 아세테이트, 헥산 등과 같은 통상의 용매로), 증류, 투석, 여과, 농축, 결정화, 재결정화, pH 조정, 동결건조 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 당업계에 공지된 임의의 통상적인 단리 또는 정제 방법론에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 미생물을 먼저 제거함으로써, 대사물질을 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 잔류 브로쓰는 이후 양이온 교환 수지를 통해 또는 그 위를 통과시켜, 원하지 않는 양이온을 제거한 다음, 음이온 교환 수지를 통해 또는 그 위를 통과시켜, 원하지 않는 무기 음이온 및 유기 산을 제거한다.
신규 파에니바실러스 균주의 전체 배양 브로쓰에서 여러 대사물질이 발견되었다. 9 가지 대사물질이 상세히 연구되고 확인되었다 (실시예 7, 도 1 참조). 이들 중 두 개는 새로운 것으로 밝혀졌다 (화합물 1A 및 화합물 1B). 화합물 1A 및 1B 는 본 발명의 3 가지 모든 파에니바실러스 균주에 의해 생성되는 것으로 밝혀졌지만 (표 17 참조), 파에니바실러스 페오리아에 균주 NRRL BD-62 의 전체 배양 브로쓰에서는 이들 중 어느 것도 발견되지 않았다.
따라서 본 발명은 또한 화학식 I 의 화합물 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염에 관한 것이다:
Figure 112017021872046-pct00005
(식 중,
R 은 15-구아니디노-3-히드록시펜타데칸산 (GHPD) 및 12-구아니디노도데칸산 (12-GDA) 으로부터 선택되고;
X1 은 트레오닌이고;
X2 는 이소류신이고;
X3 은 티로신이고;
X4 는 트레오닌이고;
X5 는 글루타민 및 아스파라긴으로부터 선택되고;
X6 은 알라닌이고;
식 중, 화살표는 R 의 카르보닐 모이어티와 아미노산 X1 의 아미노 기 사이의 또는 하나의 아미노산의 카르보닐 기와 이웃하는 아미노산의 아미노 기 사이의 단일 (아미드) 결합을 정의하며, 화살표의 끝은 상기 이웃하는 아미노산의 아미노 기에 대한 부착을 나타내고;
단일 선 (화살표 머리 없음) 은 X6 의 카르보닐 기와 X1 의 히드록실 기 사이의 단일 (에스테르) 결합을 정의함).
추가의 구현예에 따르면, 화학식 I 에서 X1 은 바람직하게는 L-트레오닌이다.
추가의 구현예에 따르면, 화학식 I 에서 X2 는 바람직하게는 D-이소류신 또는 D-allo-이소류신이다.
추가의 구현예에 따르면, 화학식 I 에서 X3 은 바람직하게는 L-티로신이다.
추가의 구현예에 따르면, 화학식 I 에서 X4 는 바람직하게는 D-allo-트레오닌이다.
추가의 구현예에 따르면, 화학식 I 에서 X5 는 바람직하게는 D-글루타민 또는 D-아스파라긴이다.
추가의 구현예에 따르면, 화학식 I 에서 R 은 바람직하게는 GHPD 이다.
화학식 I 의 화합물에 대한 화학식 I 의 신장부는 또한 하기와 같이 명시될 수 있다:
Figure 112017021872046-pct00006
,
(식 중,
X 는 -NH-(C=O)-CH2-CH(OH)-(CH2)12-NH-C(=NH)NH2 및 -NH-(C=O)-(CH2)11-NH-C(=NH)NH2 로부터 선택되고;
R1 은 1-히드록시에틸이고;
R2 는 1-메틸프로필 (sec-부틸) 이고;
R3 은 4-히드록시벤질이고;
R4 는 1-히드록시에틸이고;
R5 는 카르바모일에틸 및 카르바모일메틸로부터 선택되고;
R6 은 메틸임).
마찬가지로, 화학식 I 의 상기 대안적인 신장부에 기반한 바람직한 구현예는 하기와 같다:
상기 화학식 I 에서 R1 은 바람직하게는 (1S,2R)-1-히드록시에틸이다.
상기 화학식 I 에서 R2 는 바람직하게는 (1R,2R)-1-메틸프로필 또는 (1R,2S)-1-메틸프로필이다.
상기 화학식 I 에서 R3 은 바람직하게는 (S)-4-히드록시-벤질이다.
상기 화학식 I 에서 R4 는 바람직하게는 (1S,2R)-1-히드록시에틸이다.
상기 화학식 I 에서 R5 는 바람직하게는 (R)-카르바모일에틸 및 (R)-카르바모일메틸이다.
상기 화학식 I 에서 X 는 바람직하게는 -NH-(C=O)-CH2-CH(OH)-(CH2)12-NH-C(=NH)NH2 이다.
추가의 구현예에 따르면, 본 발명은 추가로 R 은 GHPD 이고, X4 는 화합물 1A 의 경우에는 아스파라긴이고 X4 는 화합물 1B 의 경우에는 글루타민인, 화학식 I 의 것인 화합물 1A 및 1B 에 관한 것이다:
Figure 112017021872046-pct00007
.
본 발명의 균주로부터의 살충성 대사물질은 본 발명의 균주의 배양물, 즉, 전체 배양 브로쓰로부터 추출 및 단리에 의해 수득될 수 있는, 바람직하게는 R 은 GHPD 인 화학식 I 의 화합물로부터 선택, 특히 화합물 1A 및 1B 로부터 선택된다.
또한, R 이 GHTD 인 화학식 I 의 푸사리시딘-유형 화합물은 당업계에 공지 된 방법과 유사하게 합성될 수 있다 (Biopolymers 80(4), 541, 2005; J. Peptide Sci. 12S, 219, 2006; Tetrahedron Lett. 47(48), 8587-90, 2006; Biopolymers 88(4), 568, 2007; ChemMedChem 7, 871-882, 2012).
본 발명은 또한 화학식 I 의 상기 푸사리시딘-유형 화합물의 농업적으로 허용가능한 염, 특히 산 부가 염에 관한 것이다. 상기 염은 당업계에 공지된 통상적 인 방법, 예를 들어, 본 발명의 화합물을 적합한 산과 반응시켜 산 부가 염을 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 유용한 산 부가 염의 음이온은 주로 클로라이드, 브로마이드, 플루오라이드, 요오다이드, 히드로겐술페이트, 메틸술페이트, 술페이트, 디히드로겐포스페이트, 히드로겐포스페이트, 니트레이트, 비카보네이트, 카보네이트, 헥사플루오로실리케이트, 헥사플루오로포스페이트, 벤조에이트 및 또한 C1-알칸산의 음이온, 바람직하게는 포르메이트, 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트이다.
따라서, 본 발명은 또한, 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는 적어도 하나의 화학식 I 의 화합물 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염을 포함하는 미생물의 전체 배양 브로쓰에 관한 것으로, 특히 상기 전체 배양 브로쓰는 화합물 1A 및 1B 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염을 포함한다.
추가의 구현예에 따르면, 본 발명은 또한, 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는 적어도 하나의 화학식 I 의 화합물 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염을 포함하는 파에니바실러 속의 미생물의 전체 배양 브로쓰에 관한 것으로, 특히 상기 전체 배양 브로쓰는 화합물 1A 및 1B 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염을 포함한다.
추가의 구현예에 따르면, 본 발명은 또한, 바람직하게는 selected from 화합물 1A 및 1B 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는 적어도 하나의 화학식 I 의 화합물 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염을 포함하는 상기 확인되고 정의된 바와 같은 본 발명의 적어도 하나의 파에니바실러스 균주의 전체 배양 브로쓰에 관한 것으로, 특히 상기 전체 배양 브로쓰는 화합물 1A 및 1B 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염을 포함한다.
상기 푸사리시딘-유형 화합물은 이것을 생산할 수 있는 각각의 미생물의 배양 배지 내로 분비된다.
따라서, 본 발명은 또한, 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는 적어도 하나의 화학식 I 의 화합물 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염을 포함하는 미생물의 배양 배지 및/또는 무-세포 추출물에 관한 것으로, 특히 상기 배양 배지 및/또는 무-세포 추출물은 화합물 1A 및 1B 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염을 포함한다.
추가의 구현예에 따르면, 본 발명은 또한, 바람직하게는 1A 및 1B 의 화합물 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는 적어도 하나의 화학식 I 의 화합물 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염을 포함하는 파에니바실러스 속의 미생물의 배양 배지 및/또는 무-세포 추출물에 관한 것으로, 특히 상기 배양 배지 및/또는 무-세포 추출물은 화합물 1A 및 1B 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염을 포함한다.
추가의 구현예에 따르면, 본 발명은 또한, 바람직하게는 화합물 1A 및 1B 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는 적어도 하나의 화학식 I 의 화합물 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염을 포함하는 상기 확인되고 정의된 바와 같은 본 발명의 적어도 하나의 파에니바실러스 균주의 배양 배지 및/또는 무-세포 추출물에 관한 것으로, 특히 상기 배양 배지 및/또는 무-세포 추출물은 화합물 1A 및 1B 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염을 포함한다.
본 발명은 추가로 하기 정의되는 바와 같은 보조제 및 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 및 화학식 I 의 화합물 각각을 적어도 하나 이상 포함하는 농약 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용되는 바와 같은, 본 발명의 생성물 (미생물 균주, 작용제 또는 제형) 을 참고로 하는 "조성물" 은 성분의 조합을 말하며, 여기서 "제형화" 는 성분들의 조합의 경우 제형을 형성하기 위해 첨가되어지는 처방전과 같은, 제형을 사용하는 과정이다. 이러한 조성물은 또한 본원에서 제형으로 지칭된다.
본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물 및 조성물은 각각 항진균제 또는 살진균제로서 적합하다. 이들은 플라스모-디오포로마이세테스 (Plasmo-diophoromycetes), 페로노스포로마이세테스 (Peronosporomycetes) (동의어, 오오마이세테스 (Oomycetes)), 키트리디오마이세테스 (Chytridiomycetes), 자이고마이세테스 (Zygomycetes), 아스코마이세테스 (Ascomycetes), 마시디오마이세테스 (Basidiomycetes) 및 듀테로마이세테스 (Deuteromycetes) (동의어, 펑지 임페르펙티 (Fungi imperfecti)) 의 부류에서 특히 유래한 토양-매개 진균을 포함하여 광범위한 식물병원성 진균에 대항하여 탁월한 효과에 의해 구별된다. 일부는 전신적으로 효과적이며 이들은 잎사귀 살진균제, 씨앗 드레싱을 위한 살진균제 및 토양 살진균제로서 작물 보호에 사용될 수 있다. 더욱이 이들은 특히 나무 또는 식물의 뿌리에서 발생하는 유해 진균을 방제하는데 적합하다.
본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물 및 조성물은 하기와 같은 다양한 경작 식물, 예컨대 곡물, 예를 들어, 밀, 호밀, 보리, 라이밀, 귀리 또는 쌀; 비트, 예를 들어, 사탕무 또는 사료 사탕무; 과일, 예컨대, 이과 (pome), 핵과 또는 장과, 예를 들어, 사과, 배, 자두, 복숭아, 아몬드, 체리, 딸기, 라즈베리, 블랙베리 또는 구스베리; 콩과 식물, 예컨대 렌틸콩, 완두콩, 알팔파 또는 대두; 유지 식물, 예컨대, 평지, 겨자, 올리브, 해바라기, 코코넛, 코코아 콩, 피마자 오일 식물, 기름 야자, 땅콩 또는 대두; 조롱박, 예컨대 호박, 오이 또는 멜론; 섬유 식물, 예컨대 목화, 아마, 대마 또는 황마; 감귤류 과일, 예컨대 오렌지, 레몬, 자몽 또는 귤; 채소, 예컨대 시금치, 상추, 아스파라거스, 양배추, 당근, 양파, 토마토, 감자, 조롱박 또는 파프리카; 녹나무과 식물, 예컨대 아보카도, 시나몬 또는 장뇌; 에너지 및 원료 식물, 예컨대 옥수수, 대두, 유채, 사탕 수수 또는 기름 야자; 옥수수; 담배; 견과류; 커피; 차; 바나나; 덩굴 (생식용 포도와 포도 주스 포도 덩굴); 홉; 잔디 (turf); 달콤한 잎 (또한 스테비아 (Stevia) 로 불림); 천연 고무 식물 또는 관상식물 및 산림 식물, 예컨대 꽃, 관목, 활엽수 또는 상록수, 예를 들어, 침엽수; 등 및 종자 식물 번식 물질, 예컨대 종자, 및 이러한 식물의 작물에 대한 재료의 다수의 식물병원성 진균의 방제에 특히 중요하다.
바람직하게는, 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물 배양 배지, 화학식 I 의 화합물; 및 조성물은 각각 경작 농작물, 예컨대 감자 사탕무, 담배, 밀, 호밀, 보리, 귀리, 쌀, 옥수수, 목화, 대두, 평지, 콩과식물, 해바라기, 커피 또는 사탕 수수; 과일; 덩굴; 관상식물; 또는 채소, 예컨대 오이, 토마토, 콩 또는 호박에 대해 다양한 진균을 방제하는데 사용된다.
용어 "식물 번식 물질" 이란, 식물의 모든 유전적 부분, 예를 들어, 종자 및 영양적 식물 물질 (vegetative plant material), 예를 들어, 식물의 증식에 사용될 수 있는 절단물 및 괴경류 (예를 들어, 감자) 를 의미하는 것으로 이해된다. 이것은, 발아 후 또는 토양으로부터의 출아 후 이식되는 묘목 및 유식물을 비롯해, 종자, 뿌리, 과실, 괴경, 구근, 근경, 순, 싹 및 식물의 다른 부분을 포함한다. 이들 어린 식물은 또한 담금 또는 주입에 의한 전체적 또는 부분적 처리에 의해 이식 이전에 보호될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물 배양 배지, 화합물 I 의 화합물 및 조성물로의 식물 번식 물질의 처리는 각각 곡물, 예컨대 밀, 호밀, 보리 및 귀리; 쌀, 옥수수, 목화 및 대두에 대해 다양한 진균을 방제하는데 사용된다.
용어 "경작 식물" 은 육종, 돌연변이유발 또는 유전 공학에 의해 변형된 식물을 포함하나, 시판중이거나 개발 중인 농작 생명공학 생성물에 제한되지 않는 것으로 이해된다 (참조, http://cera-gmc.org/, 그곳의 GM 농작물 데이터베이스 참조). 유전적으로 개질된 식물은, 유전적 물질이 자연적인 환경 하에서 교차 육종, 돌연변이 또는 자연적 재조합에 의해 쉽게 수득될 수 없는 재조합 DNA 기법의 사용에 의해 개질되는 식물이다. 전형적으로, 하나 이상의 유전자가 식물의 특정한 특성을 개선하기 위해 유전적으로 개질된 식물의 유전적 물질 내로 통합되었다. 이러한 유전적 개질은 또한 예를 들어, 프레닐화, 아세틸화 또는 파르네실화 일부분 또는 PEG 일부분과 같은 당화 또는 중합체 부가에 의한, 단백질(들), 올리고펩티드 또는 폴리펩티드의 표적화된 번역-후 개질을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
육종, 돌연변이생성 또는 유전 조작에 의해 개질된 식물은 예를 들어, 육종 또는 유전 조작의 통상의 방법의 결과로서 특정 계열의 제조체, 예컨대 옥신 제초제, 예컨대 디캄바 또는 2,4-D; 표백제 제초제, 예컨대 히드록실페닐피루베이트 디옥시게나아제 (HPPD) 억제제 또는 파이토엔 불포화화효소 (PDS) 억제제; 아세토락테이트 신타아제 (ALS) 억제제, 예컨대 설포닐 우레아 또는 이미다졸리논; 에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타아제 (EPSPS) 억제제, 예컨대 글리포세이트; 글루타민 합성효소 (GS) 억제제, 예컨대 글루포시네이트; 프로토포르피리노겐-IX 옥시다아제 억제제; 지질 생합성 억제제, 예컨대 아세틸 CoA 카르복실라아제 (ACCase) 억제제; 또는 옥시닐 (즉, 브로목시닐 또는 이옥시닐) 제초제의 적용에 대해 내성을 가지게 된다. 게다가, 식물은 복합 유전적 개질을 통해 다중 계열의 제초제에 대한 내성, 예컨대 글리포세이트 및 글루포시네이트 둘다 또는 글리포세이트 및 또다른 계열의 제조체, 예컨대 ALS 억제제, HPPD 억제제, 옥신 제초제, 또는 ACCase 억제제 모두에 대한 내성을 가지게 된다. 상기 제초제 내성 기술은 예를 들어, Pest Managem. Sci. 61, 2005, 246; 61, 2005, 258; 61, 2005, 277; 61, 2005, 269; 61, 2005, 286; 64, 2008, 326; 64, 2008, 332; Weed Sci. 57, 2009, 108; Austral. J. Agricult. Res. 58, 2007, 708; Science 316, 2007, 1185; 및 그곳에 인용된 참조에 기재되어 있다. 여러 경작 식물은 통상적 육종 방법 (돌연변이유발) 에 의해 제초제에 대한 내성이 부여되는데, 예를 들어, 이미다졸리논, 예를 들어, 이마자목스에 내성인 Clearfield® summer rape (Canola, BASF SE, Germany) 또는 설포닐 우레아, 예를 들어 트리베누론에 내성인 ExpressSun® 해바라기 (DuPont, USA) 가 있다. 유전 공학 방법은 경작 식물, 예를 들어, 대두, 목화, 옥수수, 비트 및 평지에 제초제, 예를 들어, 글리포세이트 및 글루포시네이트에 대한 내성을 부여하는데 사용되고, 이 중 일부는 RoundupReady® (글리포세이트-내성, Monsanto, U.S.A.), Cultivance® (이미다졸리돈 내성, BASF SE, Germany) 및 LibertyLink® (글루포시네이트-내성, Bayer CropScience, Germany) 의 상품명으로 시판된다.
게다가, 식물은 또한 하나 이상의 살곤충 단백질, 특히 박테리아 속 바실러스, 특히 바실러스 투린기엔시스 (Bacillus thuringiensis) 로부터 공지된 것, 예컨대 δ-엔도톡신, 예를 들어 CryIA(b), CryIA(c), CryIF, CryIF(a2), CryIIA(b), CryIIIA, CryIIIB(b1) 또는 Cry9c; 식물 생장 관련 살곤충 단백질 (VIP: vegetative insecticidal proteins), 예를 들어 VIP1, VIP2, VIP3 또는 VIP3A; 선충에 서식하는 박테리아, 예를 들어 포토라브두스 종 (Photorhabdus spp.) 또는 제노라브두스 종 (Xenorhabdus spp.) 의 살곤충 단백질; 동물에 의해 생성된 독소, 예컨대 전갈 독소, 거미 독소, 말벌 독소, 또는 기타 곤충-특이적 신경독소; 곰팡이에 의해 생성된 독소, 예컨대 스트렙토마이세테스 독소, 식물 렉틴, 예컨대 완두콩 또는 보리 렉틴; 응집소; 프로테나아제 억제제, 예컨대 트립신 억제제, 세린 프로테아제 억제제, 파타틴, 시스타틴 또는 파파인 억제제; 리보솜-불활성화 단백질 (RIP), 예컨대 리신, 옥수수-RIP, 아브린, 루핀, 사포린 또는 브리오딘; 스테로이드 대사 효소, 예컨대 3-히드록시스테로이드 옥시다아제, 엑디스테로이드-IDP-글리코실-트랜스퍼라아제, 콜레스테롤 옥시다아제, 엑디손 억제제 또는 HMG-CoA-환원 효소; 이온 채널 차단제, 예컨대 나트륨 또는 칼슘 채널의 차단제; 유충 호르몬 에스테라아제; 이뇨 호르몬 수용체 (헬리코키닌 수용체); 스틸벤 신타아제, 비벤질 신타아제, 키티나아제 또는 글루카나아제를 합성할 수 있는 재조합 DNA 기법의 사용에 의한 식물을 포괄한다. 본 발명의 맥락에서 이러한 살곤충 단백질 또는 독소는 표현적으로 또한 예비-독소, 혼성 단백질, 절단된 또는 다르게 개질된 단백질로 이해된다. 혼성 단백질은 단백질 도메인의 신규 조합을 특징으로 한다 (예를 들어 WO 02/015701 참조). 상기 독소 또는 상기 독소를 합성할 수 있는 유전적-개질된 식물의 추가 예는 예를 들어 EP-A 374 753, WO 93/007278, WO 95/34656, EP-A 427 529, EP-A 451 878, WO 03/018810 및 WO 03/052073 에 개시되어 있다. 상기 유전적으로 개질된 식물의 제조 방법은 일반적으로 당업자에 공지되어 있고 예를 들어 상기 언급된 문헌에 기재되어 있다. 이러한 유전적 개질된 식물에 함유된 살곤충 단백질은 절지동물의 모든 분류학적 군으로부터의 해로운 해충, 특히 초시류 (딱정벌레목), 파리 (쌍시류) 및 나방 (나비목) 및 선충 (선충류) 으로부터의 보호를 이러한 단백질을 생성하는 식물에 부여한다. 하나 이상의 살충 단백질을 합성할 수 있는 유전적으로 개질된 식물은 예를 들어, 상기 언급된 공개문헌에 기재되어 있고, 이의 일부는 시판되는데, 예컨대 YieldGard® (Cry1Ab 독소를 생성하는 옥수수 품종), YieldGard® Plus (Cry1Ab 및 Cry3Bb1 독소를 생성하는 옥수수 품종), Starlink® (Cry9c 독소를 생성하는 옥수수 품종), Herculex® RW (Cry34Ab1, Cry35Ab1 및 효소 포스피노트리신-N-아세틸트랜스페라아제 [PAT] 를 생성하는 옥수수 품종); NuCOTN® 33B (Cry1Ac 독소를 생성하는 목화 품종), Bollgard® I (Cry1Ac 독소를 생성하는 목화 품종), Bollgard® II (Cry1Ac 및 Cry2Ab2 독소를 생성하는 목화 품종); VIPCOT® (VIP-독소를 생성하는 목화 품종); NewLeaf® (Cry3A 독소를 생성하는 감자 품종); Bt-Xtra®, NatureGard®, KnockOut®, BiteGard®, Protecta®, Bt11 (예를 들어, Agrisure® CB) 및 Bt176 (Syngenta Seeds SAS, France 사제), (Cry1Ab 독소 및 PAT 효소를 생성하는 옥수수 품종), MIR604 (Syngenta Seeds SAS, France 사제) (Cry3A 독소의 변형된 버전을 생성하는 옥수수 품종, 참조, WO 03/018810), MON 863 (Monsanto Europe S.A., Belgium 사제) (Cry3Bb1 독소를 생성하는 옥수수 품종), IPC 531 from Monsanto Europe S.A., Belgium 사제) (Cry1Ac 독소의 변형된 버전을 생성하는 옥수수 품종) 및 1507 (Pioneer Overseas Corporation, Belgium 사제) (Cry1F 독소 및 PAT 효소를 생성하는 옥수수 품종) 이 있다.
게다가, 식물은 또한 박테리아, 바이러스 또는 진균 병원균에 대해 상기 식물의 저항성 또는 내성을 증가시키기 위한 하나 이상의 단백질을 합성할 수 있는 재조합 DNA 기법의 사용에 의한 것이 포괄된다. 이러한 단백질의 예는 소위 "병인-관련 단백질" (PR 단백질, 참조, 예를 들어, EP A 392 225), 식물 질환 내성 유전자 (예를 들어, 멕시코 야생 감자 솔라눔 불보카스타눔 (Solanum bulbocastanum) 유래의 파이토프토라 (Phytophthora) 감염에 대항하여 작용하는 저항성 유전자를 발현하는 감자 품종) 또는 T4-리소자임 (예를 들어, 에르위니아 아밀보라 (Erwinia amylvora) 와 같은 박테리아에 대항하여 증가된 저항성을 갖는 상기 단백질을 합성할 수 있는 감자 품종) 이다. 이러한 유전적으로 개질된 식물을 제조하는 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 상기 언급된 공개문헌에 기재되어 있다.
게다가, 식물은 또한 생산성 (예를 들어, 바이오매스 생성, 과립 수율, 전분 함량, 오일 함량 또는 단백질 함량), 가뭄, 염분 또는 기타 성장-제한 환경 인자에 대한 내성 또는 상기 식물의 해충 및 진균, 박테리아 또는 바이러스 병원균에 대한 내성을 증가시키기 위한 하나 이상의 단백질을 합성할 수 있는 재조합 DNA 기법의 사용에 의한 것이 포괄된다.
게다가, 식물은 또한 재조합 DNA 기법의 사용에 의해 구체적으로는 인간 또는 동물 영양분을 개선하기 위해 개질된 양의 성분 함량 또는 신규 성분 함량을 함유하는 것, 예를 들어, 건강-증진 장쇄 오메가-3 지방산 또는 불포화 오메가-9 지방산을 생성하는 기름 작물 (예를 들어, Nexera® 평지, DOW Agro Sciences, Canada) 이 포괄된다.
게다가, 식물은 또한 구체적으로는 원료 생산을 개선하기 위해 재조합 DNA 기법의 사용에 의해 개질된 양의 성분 함량 또는 신규 성분 함량을 함유하는 것, 예를 들어, 증가된 양의 아밀로펙틴을 생성하는 감자 (예를 들어, Amflora® 감자, BASF SE, Germany) 가 포괄된다.
본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물은 각각 하기 식물 질환을 방제하는데 특히 적합하다:
알부고 (Albugo) 종 (흰 녹병) [관상식물, 채소 (예를 들어, 에이. 칸디다 (A. candida)) 및 해바라기 (예를 들어, 에이. 트라고포고니스 (A. tragopogonis))]; 알테르나리아 (Alternaria) 종 (알테르나리아 점무늬병) [채소, 평지 (에이. 브라시콜라 (A. brassicola) 또는 브라시카에 (brassicae)), 사탕무 (에이. 테누이스 (A. tenuis)), 과실류, 벼, 대두, 감자 (예를 들어, 에이. 솔라니 (A. solani) 또는 에이. 알테르나타 (A. alternata)), 토마토 (예를 들어, 에이. 솔라니 또는 에이. 알테르나타) 및 밀]; 아파노미세스 (Aphanomyces) 종 [사탕무 및 채소]; 아스코키타 (Ascochyta) 종 [곡류 및 채소], 예를 들어, 에이. 트리티시 (A. tritici) (탄저병) [밀] 및 에이. 호르데이 (A. hordei) [보리]; 비폴라리스 (Bipolaris) 및 드레크슬레라 (Drechslera) 종 (완전세대: 코클리오볼루스 (Cochliobolus) 종), 예를 들어 남부 잎마름병 (디. 마이디스 (D. maydis)) 또는 북부 잎마름병 (비. 제이콜라 (B. zeicola)) [옥수수], 예를 들어, 점무늬병 (비. 소로키니아나 (B. sorokiniana)) [곡류] 및 예를 들어 비. 오리자에 (B. oryzae) [벼 및 잔디]; 블루메리아 (Blumeria) (이전 명칭: 에리시페 (Erysiphe)) 그라미니스 (graminis) (흰가루병) [곡류 (예를 들어, 밀 또는 보리)]; 보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea) (완전세대: 보트리오티니아 푹켈리아나 (Botryotinia fuckeliana): 잿빛곰팡이병) [과실류 및 장과류 (예를 들어, 딸기), 채소 (특히, 상추, 당근, 셀러리 및 양배추), 평지, 꽃, 덩굴, 산림 식물 및 밀]; 브레미아 락투카에 (Bremia lactucae) (노균병) [상추]; 세라토시스티스 (Ceratocystis) (이명: 오피오스토마 (Ophiostoma)) 종 (썩음병 또는 시들음병) [활엽수 및 상록수], 예를 들어, 씨. 울미 (C. ulmi) (네덜란드 느릅나무병) [느릅나무]; 세르코스포라 (Cercospora) 종 (세르코스포라 점무늬병) [옥수수 (예를 들어, 회색 점무늬병: 씨. 제아에-마이디스 (C. zeae-maydis)), 벼, 사탕무 (예를 들어, 씨. 베티콜라 (C. beticola)), 사탕수수, 채소, 커피, 대두 (예를 들어, 씨. 소지나 (C. sojina) 또는 씨. 키쿠키이 (C. kikuchii)) 및 벼]; 클라도스포리움 (Cladosporium) 종 [토마토 (예를 들어, 씨. 풀붐 (C. fulvum): 잎곰팡이병) 및 곡류], 예를 들어, 씨. 헤르바룸 (C. herbarum) (검은이삭병) [밀]; 클라비셉스 푸르푸레아 (Claviceps purpurea) (맥각병) [곡류]; 코클리오볼루스 (불완전세대: 비폴라리스의 헬민토스포리움 (Helminthosporium)) 종 (점무늬병) [옥수수 (씨. 카르보눔 (C. carbonum)), 곡류 (예를 들어, 씨. 사티부스 (C. sativus), 불완전세대: 비. 소로키니아나) 및 벼 (예를 들어, 씨. 미야베아누스 (C. miyabeanus), 불완전세대: 에이치. 오리자에 (H. oryzae))]; 콜레토트리쿰 (Colletotrichum) (완전세대: 글로메렐라(Glomerella)) 종 (탄저병) [목화 (예를 들어, 씨. 고시피이 (C. gossypii)), 옥수수 (예를 들어, 씨. 그라미니콜라 (C. graminicola): 탄저병 줄기썩음병), 장과류, 감자 (예를들어, 씨. 콕코데스 (C. coccodes): 흑점병), 콩 (예를 들어, 씨. 린데무티아눔 (C. lindemuthianum)) 및 대두 (예를 들어, 씨. 트룬카툼 (C. truncatum) 또는 씨. 글로에오스포리오이데스 (C. gloeosporioides))]; 코르티시움 (Corticium) 종, 예를 들어, 씨. 사사키이 (C. sasakii) (잎집무늬마름병) [벼]; 코리네스포라 카시이콜라 (Corynespora cassiicola) (점무늬병) [대두 및 관상식물]; 시클로코니움 (Cycloconium) 종, 예를 들어, 씨. 올레아기눔 (C. oleaginum) [올리브 나무]; 실린드로카르폰 (Cylindrocarpon) 종 (예를 들어, 과수 동고병 또는 어린 덩굴 쇠약, 완전세대: 넥트리아 (Nectria) 또는 네오넥트리아 (Neonectria) 종) [과수, 덩굴류 (예를 들어, 씨. 리리오덴드리 (C. liriodendri), 완전세대: 네오넥트리아 리리오덴드리 (Neonectria liriodendri): 검은뿌리 병) 및 관상식물]; 데마토포라 (Dematophora) (완전세대: 로셀리니아 (Rosellinia)) 네카트릭스 (necatrix) (뿌리 썩음병 및 줄기썩음병) [대두]; 디아포르테 (Diaporthe) 종, 예를 들어, 디. 파세올로룸 (D. phaseolorum) (모잘록병) [대두]; 드레크슬레라 (이명: 헬민토스포리움, 완전세대: 피레노포라 (Pyrenophora)) 종 [옥수수, 곡류, 예컨대 보리 (예를 들어, 디. 테레스 (D. teres), 그물무늬병) 및 밀 (예를 들어, 디. 트리티시-레펜티스 (D. tritici-repentis): 황갈색점무늬병), 벼 및 잔디]; 에스카 (Esca) (가지마름병, 졸중) [덩굴류] (포르미티포리아 (Formitiporia) (이명: 펠리누스 (Phellinus)) 푼크타타(punctata), 에프. 메디테라네아 (F. mediterranea), 파에오모니엘라 클라미도스포라 (Phaeomoniella chlamydospora) (이전 명칭: 파에오아크레모니움 클라미도스포룸 (Phaeoacremonium chlamydosporum)), 파에오아크레모니움 알레오필룸 (Phaeoacremonium aleophilum) 및/또는 보트리오스파에리아 오브투사 (Botryosphaeria obtusa) 에 의해 유발됨); 엘시노에 (Elsinoe) 종 [인과류 (이. 피리 (E. pyri)), 장과류 (이. 베네타 (E. veneta): 탄저병) 및 덩굴류 (이. 암펠리나 (E. ampelina): 탄저병)]; 엔틸로마 오리자에 (Entyloma oryzae) (잎깜부기병) [벼]; 에피코크쿰 (Epicoccum) 종 (검은곰팡이병) [밀]; 에리시페 (Erysiphe) 종 (흰가루병) [사탕무 (이. 베타에 (E. betae)), 채소 (예를 들어, 이. 피시 (E. pisi)), 예컨대 조롱박 (예를 들어, 이. 시코라세아룸 (E. cichoracearum)), 양배추, 평지 (예를 들어, 이. 크루시페라룸 (E. cruciferarum))]; 유티파 라타 (Eutypa lata) (유티파 동고병 또는 가지마름병, 불완전세대: 시토스포리나 라타 (Cytosporina lata), 이명: 리베르텔라 블레파리스 (Libertella blepharis)) [과수, 덩굴류 및 관상용 나무]; 엑세로힐룸 (Exserohilum) (이명: 헬민토스포리움) 종 [옥수수 (예를 들어, 이. 투르시쿰 (E. turcicum))]; 푸사리움 (Fusarium) (완전세대: 지베렐라 (Gibberella)) 종 (시들음병, 뿌리썩음병 또는 줄기썩음병) [다양한 식물], 예컨대 에프. 그라미네아룸 (F. graminearum) 또는 에프. 쿨모룸 (F. culmorum) (뿌리썩음병, 반점병 또는 이삭마름병) [곡류 (예를 들어, 밀 또는 보리)], 에프. 옥시스포룸 (F. oxysporum) [토마토], 에프. 솔라니 (F. solani) (f. sp. glycines 지금은 에프. 비르굴리포름 (F. virguliforme)) 및 에프. 투쿠마니아에 (F. tucumaniae) 및 에프. 브라실리엔스 (F. brasiliense), 각각 급사증을 야기함 [대두] 및 에프. 베르티실리오이데스 (F. verticillioides) [옥수수]; 가에우만노미세스 그라미니스 (Gaeumannomyces graminis) (입고병) [곡류 (예를 들어, 밀 또는 보리) 및 옥수수]; 지베렐라 (Gibberella) 종 [곡류 (예를 들어, 지. 제아에 (G. zeae)) 및 벼 (예를 들어, 지. 푸지쿠로이 (G. fujikuroi): 키다리병)]; 글로메렐라 신굴라타(Glomerella cingulata) [덩굴류, 인과류 및 기타 식물] 및 지. 고시피이 (G. gossypii) [목화]; 그레인스테이닝 콤플렉스 [벼]; 구이그나르디아 비드웰리이 (Guignardia bidwellii) (검은썩음병) [덩굴류]; 짐노스포란기움 (Gymnosporangium) 종 [장미과 식물 및 주니퍼], 예를 들어, 지. 사비나에 (G. sabinae) (녹병) [배]; 헬민토스포리움 종 (이명: 드레크슬레라, 완전세대: 코클리오볼루스) [옥수수, 곡류 및 벼]; 헤밀레이아 (Hemileia) 종, 예를 들어, 에이치. 바스타트릭스 (H. vastatrix) (커피잎녹병) [커피]; 이사리오프시스 클라비스포라 (Isariopsis clavispora) (이명: 클라도스포리움 비티스 (Cladosporium vitis)) [덩굴류]; 마크로포미나 파세올리나 (Macrophomina phaseolina) (이명: 파세올리 (phaseoli)) (뿌리썩음병 및 줄기썩음병) [대두 및 목화]; 미크로도키움 (Microdochium) (이명: 푸사리움) 니발레 (nivale) (분홍설부병) [곡류 (예를 들어, 밀 또는 보리)];
미크로스파에라 디푸사 (Microsphaera diffusa) (흰가루병) [대두]; 모닐리니아 (Monilinia) 종, 예를 들어, 엠. 락사 (M. laxa), 엠. 프룩티콜라 (M. fructicola) 및 엠. 프룩티게나 (M. fructigena) (꽃 및 잔가지마름병, 갈색썩음병) [핵과류 및 다른 장미과 식물]; 미코스파에렐라 (Mycosphaerella) 종 [곡류, 바나나, 장과류 및 땅콩], 예컨대 예를 들어 엠. 그라미니콜라 (M. graminicola) (불완전세대: 세프토리아 트리티씨 (Septoria tritici), 세프토리아 무늬병) [밀] 또는 엠. 피지엔시스 (M. fijiensis) (검은시가토카병) [바나나]; 페로노스포라 (Peronospora) 종 (노균병) [양배추 (예를 들어, 피. 브라시카에 (P. brassicae)), 평지 (예를 들어, 피. 파라시티카 (P. parasitica)), 양파 (예를 들어, 피. 데스트룩토르 (P. destructor)), 담배 (예를 들어, 피. 타바시나 (P. tabacina)) 및 대두 (예를 들어, 피. 만슈리카 (P. manshurica))]; 파코프소라 파키리지 (Phakopsora pachyrhizi) 및 피. 메이보미아에 (P. meibomiae) (대두녹병) [대두]; 피알로포라 (Phialophora) 종 [예를 들어, 덩굴류 (예를 들어, 피. 트라케이필라 (P. tracheiphila) 및 피. 테트라스포라 (P. tetraspora)) 및 대두 (예를 들어, 피. 그레가타 (P. gregata): 줄기썩음병)]; 포마 린감 (Phoma lingam) (뿌리썩음병 및 줄기썩음병) [평지 및 양배추] 및 피. 베타에 (P. betae) (뿌리썩음병, 점무늬병 및 모잘록병) [사탕무]; 포모프시스 (Phomopsis) 종 [해바라기, 덩굴류 (예를 들어, 피. 비티콜라 (P. viticola): 만할병) 및 대두 (예를 들어, 줄기썩음병: 피. 파세올리 (P. phaseoli), 완전세대: 디아포르테 파세올로룸 (Diaporthe phaseolorum))]; 피소데르마 마이디스 (Physoderma maydis) (갈색점무늬병) [옥수수]; 파이토프토라 (Phytophthora) 종 (시들음병, 뿌리썩음병, 잎썩음병, 과실썩음병 및 줄기썩음병) [다양한 식물, 예컨대 파프리카 및 조롱박 (예를 들어, 피. 카프시시 (P. capsici)), 대두 (예를 들어, 피. 메가스페르마 (P. megasperma), 이명: 피. 소자에 (P. sojae)), 감자 및 토마토 (예를 들어, 피. 인페스탄스 (P. infestans): 역병) 및 활엽수 (예를 들어, 피. 라모룸 (P. ramorum): 오크 급사병)]; 플라스모디오포라 브라시카에 (Plasmodiophora brassicae) (뿌리혹병) [양배추, 평지, 무 및 기타 식물]; 플라스모파라 (Plasmopara) 종, 예를 들어, 피. 비티콜라 (P. viticola) (포도 덩굴 노균병) [덩굴류] 및 피. 할스테디이 (P. halstedii) [해바라기]; 포도스파에라 (Podosphaera) 종 (흰가루병) [장미과 식물, 홉, 인과류 및 장과류], 예를 들어, 피. 류코트리카 (P. leucotricha) [사과]; 폴리믹사 (Polymyxa) 종 [예를 들어, 곡류, 예컨대 보리 및 밀 (피. 그라미니스 (P. graminis)) 및 사탕무 (피. 베타에 (P. betae))] 및 이로 인해 전달되는 바이러스성 질병; 슈도세르코스포렐라 헤르포트리코이데스 (Pseudocercosporella herpotrichoides) (눈무늬병, 완전세대: 타페시아 얄룬다에 (Tapesia yallundae)) [곡류, 예를 들어, 밀 또는 보리]; 슈도페로노스포라 (Pseudoperonospora) (노균병) [다양한 식물], 예를 들어, 피. 쿠벤시스 (P. cubensis) [조롱박] 또는 피. 휴밀리 (P. humili) [홉]; 슈도페지쿨라 트라케이필라 (Pseudopezicula tracheiphila) (레드 파이어 질병 또는 '로트브레너 (rotbrenner)', 불완전세대: 피알로포라 (Phialophora)) [덩굴류]; 푹시니아 (Puccinia) 종 (녹병) [다양한 식물], 예를 들어, 피. 트리티시나 (P. triticina) (갈녹병 또는 잎녹병), 피. 스트리이포르미스 (P. striiformis) (줄녹병 또는 황녹병), 피. 호르데이 (P. hordei) (좀녹병), 피. 그라미니스 (P. graminis) (줄기녹병 또는 검은녹병) 또는 피. 레콘디타 (P. recondita) (갈녹병 또는 잎녹병) [곡류, 예컨대 예를 들어, 밀, 보리 또는 호밀], 피. 쿠에니이 (P. kuehnii) (오렌지녹병) [사탕수수] 및 피. 아스파라기 (P. asparagi) [아스파라거스]; 피레노포라 (Pyrenophora) (불완전세대: 드레크슬레라) 트리티시-레펜티스 (tritici-repentis) (황갈색점무늬병) [밀] 또는 피. 테레스 (P. teres) (그물무늬병) [보리]; 피리쿨라리아 (Pyricularia) 종, 예를 들어, 피. 오리자에 (P. oryzae) (완전세대: 마그나포르테 그리세아 (Magnaporthe grisea), 벼 도열병) [벼] 및 피. 그리세아 (P. grisea) [잔디 및 곡류]; 피티움 (Pythium) 종 (모잘록병) [잔디, 벼, 옥수수, 밀, 목화, 평지, 해바라기, 대두, 사탕무, 채소 및 다양한 기타 식물 (예를 들어, 피. 울티뭄 (P. ultimum) 또는 피. 아파니데르마툼 (P. aphanidermatum))]; 라물라리아 (Ramularia) 종, 예를 들어, 알. 콜로-시그니 (R. collo-cygni) (라물라리아 점무늬병, 생리학적 점무늬병) [보리] 및 알. 베티콜라 (R. beticola) [사탕무]; 리족토니아 (Rhizoctonia) 종 [목화, 벼, 감자, 잔디, 옥수수, 평지, 감자, 사탕무, 채소 및 다양한 기타 식물], 예를 들어, 알. 솔라니 (R. solani) (뿌리썩음병 및 줄기썩음병) [대두], 알. 솔라니 (잎집무늬마름병) [벼] 또는 알. 세레알리스 (R. cerealis) (리족토니아 봄마름병) [밀 또는 보리]; 리조푸스 스톨로니페르 (Rhizopus stolonifer) (검은곰팡이병, 무름병) [딸기, 당근, 양배추, 덩굴류 및 토마토]; 린코스포리움 세칼리스 (Rhynchosporium secalis) (갈색잎마름병) [보리, 호밀 및 트리티케일]; 사로클라디움 오리자에 (Sarocladium oryzae) 및 에스. 아테누아툼 (S. attenuatum) (잎집썩음병) [벼]; 스클레로티니아 (Sclerotinia) 종 (줄기썩음병 또는 흰곰팡이병) [채소 및 재배지 작물, 예컨대 평지, 해바라기 (예를 들어, 에스. 스클레로티오룸 (S. sclerotiorum)) 및 대두 (예를 들어, 에스. 롤프시이 (S. rolfsii) 또는 에스. 스클레로티오룸 (S. sclerotiorum))]; 세프토리아 (Septoria) 종 [다양한 식물], 예를 들어, 에스. 글리시네스 (S. glycines) (갈색점무늬병) [대두], 에스. 트리티시 (S. tritici) (세프토리아 무늬병) [밀] 및 에스.(S.) (이명: 스타고노스포라 (Stagonospora)) 노도룸 (nodorum) (스타고노스포라 무늬병) [곡류]; 운시눌라 (Uncinula) (이명: 에리시페) 네카토르 (necator) (흰가루병, 불완전세대: 오이디움 툭케리 (Oidium tuckeri)) [덩굴류]; 세토스파에리아 (Setospaeria) 종 (잎마름병) [옥수수 (예를 들어, 에스. 투르시쿰 (S. turcicum), 이명: 헬민토스포리움 투르시쿰 (Helminthosporium turcicum)) 및 잔디]; 스파셀로테카 (Sphacelotheca) 종 (깜부기병) [옥수수 (예를 들어, 에스. 레일리아나 (S. reiliana): 이삭깜부기병), 수수 및 사탕수수]; 스파에로테카 풀리기네아 (Sphaerotheca fuliginea) (흰가루병) [조롱박]; 스폰고스포라 수브테라네아 (Spongospora subterranea) (가루더뎅이병) [감자] 및 이로 인해 전달되는 바이러스성 질병; 스타고노스포라 (Stagonospora) 종 [곡류], 예를 들어, 에스. 노도룸 (S. nodorum) (스타고노스포라 무늬병, 완전세대: 렙토스파에리아 (Leptosphaeria) [이명: 파에오스파에리아 (Phaeosphaeria)] 노도룸) [밀]; 신키트리움 엔도비오티쿰 (Synchytrium endobioticum) [감자] (감자 사마귀병); 타프리나 (Taphrina) 종, 예를 들어, 티. 데포르만스 (T. deformans) (잎말림병) [복숭아] 및 티. 프루니 (T. pruni) (자두 주머니병)) [자두]; 티엘라비오프시스 (Thielaviopsis) 종 (검은뿌리썩음병) [담배, 인과류, 채소, 대두 및 목화], 예를 들어, 티. 바시콜라 (T. basicola) (이명: 칼라라 엘레간스 (Chalara elegans)); 틸레티아 (Tilletia) 종 (깜부기병 또는 비린깜부기병) [곡류], 예컨대 예를 들어, 티. 트리티시 (T. tritici) (이명: 티. 카리에스 (T. caries), 밀깜부기병) 및 티. 콘트로베르사 (T. controversa) (난쟁이깜부기병) [밀]; 티풀라 인카르나타 (Typhula incarnata) (회색설부병) [보리 또는 밀]; 우로시스티스 (Urocystis) 종, 예를 들어, 유. 오쿨타 (U. occulta) (줄기깜부기병) [호밀]; 우로미세스 (Uromyces) 종 (녹병) [채소, 예컨대 콩 (예를 들어, 유. 아펜디쿨라투스 (U. appendiculatus), 이명: 유. 파세올리 (U. phaseoli)) 및 사탕무 (예를 들어, 유. 베타에 (U. betae))]; 우스틸라고 (Ustilago) 종 (겉깜부기병) [곡류 (예를 들어, 유. 누다 (U. nuda) 및 유. 아바에나에 (U. avaenae)), 옥수수 (예를 들어, 유. 마이디스 (U. maydis): 옥수수깜부기병) 및 사탕수수]; 벤투리아 (Venturia) 종 (흑성병) [사과 (예를 들어, 브이. 이나에쿠알리스 (V. inaequalis)) 및 배]; 및 베르티실리움 (Verticillium) 종 (시들음병) [다양한 식물, 예컨대 과실류 및 관상식물, 덩굴류, 장과류, 채소 및 재배지 작물], 예를 들어, 브이. 달리아에 (V. dahliae) [딸기, 평지, 감자 및 토마토].
본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화합물 I 의 화합물 및 조성물은 각각 또한 저장된 생성물 또는 수확물의 보호 및 물질의 보호 시 유해한 진균의 방제에 적합하다.
용어 "물질의 보호" 는 유해한 미생물, 예컨대 진균 및 박테리아에 의한 감염 및 파괴에 대항하는, 기술적 및 무생물 물질, 예컨대 접착제, 풀 (glues), 목재, 종이 및 합판, 직물, 가죽, 페인트 분산액, 플라스틱, 콜링 (colling) 윤활제, 섬유 또는 옷감의 보호를 나타내는 것으로 이해된다. 목재 및 기타 물질의 보호에 대해서는, 특별히 주목하는 것은 하기 유해한 진균: 아스코마이세테스 (Ascomycetes), 예컨대 오피오스토마 종 (Ophiostoma spp.), 세라토시스티스 종 (Ceratocystis spp.), 오우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans), 스클레로포마 종 (Sclerophoma spp.), 카에토뮴 종 (Chaetomium spp.), 휴미콜라 종 (Humicola spp.), 페트리엘라 종 (Petriella spp.), 트리쿠루스 종 (Trichurus spp.); 바시디오마이세테스 (Basidiomycetes), 예컨대 코니오포라 종 (Coniophora spp.), 코리올루스 종 (Coriolus spp.), 글로에오필룸 종 (Gloeophyllum spp.), 렌티누스 종 (Lentinus spp.), 플레우로투스 종 (Pleurotus spp.), 포리아 종 (Poria spp.), 세르풀라 종 (Serpula spp.) 및 티로마이세스 종 (Tyromyces spp.), 듀테로마이세테스 (Deuteromycetes), 예컨대 아스페르길루스 종 (Aspergillus spp.), 클라도스포룸 종 (Cladosporium spp.), 페니실리움 종 (Penicillium spp.), 트리코르마 종 (Trichorma spp.), 알테르나리아 종 (Alternaria spp.), 파에실로마이세스 종 (Paecilomyces spp.) 및 자이고마이세테스 (Zygomycetes), 예컨대 무코르 종 (Mucor spp.), 및 저장된 생성물 및 수확물의 보호에 있어서는 하기 효모 진균이 주목된다: 칸디다 종 (Candida spp.) 및 사카로마이세스 세레비자에 (Saccharomyces cerevisae).
본 발명에 따른 처리 방법은 저장된 제품 또는 수확물을 진균 및 미생물의 공격으로부터 보호하는 분야에서도 사용될 수있다. 본 발명에 따르면, "저장된 제품"이라는 용어는 식물 또는 동물 기원의 천연 물질 및 자연적 생애 주기에서 취해졌으며 장기간 보호가 요구되는 가공된 형태를 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 줄기, 잎, 괴경, 종자, 과실 또는 곡물과 같은 식물 또는 그 일부와 같은 작물 기원의 저장 제품은 신선하게 수확된 상태 또는 사전 건조, 축축한, 제분된, 분쇄된, 압착된 또는 볶은, 가공된 형태로 보호될 수 있으며. 이러한 방법은 또한 수확 후 처리라고도 알려져 있다. 또한 저장된 제품의 정의에 해당하는 것은 목재로서, 이것은 건설 목재, 전기 철탑 및 장벽과 같은 원목 목재 형태 또는 목재 또는 가구로 만든 완제품 형태의 목재 여부와 상관없다. 동물 기원의 저장 제품은 대피 (hides), 가죽, 모피, 모발 등이다. 본 발명에 따른 배합물은 부패, 변색 또는 곰팡이와 같은 불리한 영향을 방지할 수 있다. 바람직하게는 "저장된 제품" 은 식물 유래의 천연 물질 및 이들의 가공된 형태, 더욱 바람직하게는 과일 및 가공된 형태, 예를 들면, 이과, 핵과, 장과 및 감귤 및 이들의 가공된 형태를 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화합물 I 의 화합물, 및 조성물은 각각 식물의 건강을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 식물, 이의 번식 물질 및/또는 식물이 자라고 있는 또는 자라고자 하는 자리를 유효량의 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화합물 I 의 화합물, 및 조성물 각각으로 처리함으로써, 식물 건강을 개선하기 위한 방법에 관한 것이다.
용어 "식물 건강" 은 수율 (예를 들어, 증가된 바이오매스 및/또는 가치있는 성분의 증가된 함량), 식물 활력 (예를 들어, 개선된 식물 성장 및/또는 푸르른 잎 ("녹색 효과")), 품질 (예를 들어, 특정 성분의 개선된 함량 또는 조성) 및 무생명적 및/또는 생명적 스트레스에 대한 내성 등과 같은 단독으로 또는 조합으로의 여러 지표에 의해 측정된 식물 및/또는 이의 생성물의 상태를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 식물의 건강 조건에 대한 상기 확인된 지표는 상호의존적일 수 있거나 서로 발생할 수 있다.
더 건강한 식물은 더 좋은 수확량 및/또는 식물 또는 작물의 더 좋은 품질, 특히 수확된 식물 부분의 품질이 우수하기 때문에 바람직하다. 더 건강한 식물은 또한 생물학적 및/또는 비생물학적 스트레스에 더 잘 저항한다. 생물학적 스트레스에 대한 높은 내성은 당업자에게 적용되는 농약의 양을 감소시키고 그 결과 각각의 농약에 대한 내성의 발달을 늦추도록한다.
본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각의 상기 언급된 효과, 즉 식물의 건강 증진은 또한 식물이 생물학적 스트레스 하에 있지 않은 경우, 특히 식물이 해충 압력 하에 있지 않은 경우에도 존재한다는 것이 강조되어야 한다.
예를 들어, 종자 처리 및 토양 적용의 경우, 곰팡이 또는 살충 공격에 시달리는 식물은 발아 및 출현을 감소시켜 식물 또는 작물의 수립 및 활발한 발전의 열악성을 가져오고, 따라서 해당 해충에 대한 치유 또는 예방 치료를 받았고 생물학적 스트레스 요인으로 인한 손상없이 자랄 수 있는 식물 번식 물질와 비교하여 수확량이 줄어든다는 것이 명백하다. 그러나, 본 발명에 따른 방법은 생물학적 스트레스가 없는 경우에도 식물 건강을 증진시킨다. 이는 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물의 각각의 긍정적인 효과가 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물의 살충 활성에 의해 단지 설명될 수 없으나, 추가의 활성 프로파일에 기초한다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물의 각각의 적용은 해충 압력이 없는 경우에도 수행될 수있다.
동일하게 바람직한 실시 양태에서, 본 발명은 상기 식물 번식 물질로부터 성장된 식물의 건강을 개선시키는 방법에 관한 것으로, 상기 식물 번식 물질은 유효량의 적어도 하나의 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물 또는 조성물로 처리된다.
비생물학적 및/또는 생물학적 스트레스에 대한 식물의 수확량, 식물 활력, 품질 및 내성으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아래에 열거되는 각각의 식물 건강 지표는 본 발명의 바람직한 구현예로서 이해되어야 한다 (그 자체나 또는 바람직하게는 서로 조합된 것).
본 발명에 따르면, 식물의 "수율 증가" 는 동일한 조건 하에서, 그러나 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물을 각각 적용하지 않고, 생성된 식물의 동일 생성물의 수율에 비해 각 식물의 생성물의 수율이 측정 가능한 양만큼 증가한다.
종자 처리 예를 들어, 접종제 및/또는 엽면 적용 형태의 경우, 증가된 수율은 식물의 다음과 같은 개선된 특성에 의해 특징지어질 수 있다 : 증가된 식물 무게; 및/또는 증가된 식물 높이; 및/또는 전체 신선한 체중 (FW) 과 같은 증가된 바이오매스; 및/또는 식물 당 증가된 꽃의 수; 및/또는 보다 높은 곡물 및/또는 과일 수확량; 및/또는 더 많은 곁눈 또는 옆 사발 (가지); 및/또는 큰 잎; 및/또는 증가된 싹의 성장; 및/또는 증가된 단백질 함량; 및/또는 증가된 오일 함량; 및/또는 증가된 전분 함량; 및/또는 증가된 안료 함량; 및/또는 증가된 엽록소 함량 (엽록소 함량은 식물의 광합성 속도와 양의 상관 관계를 갖고 따라서 식물의 수확량이 높을수록 엽록소 함량이 높다) 및/또는 식물의 품질 향상.
"곡물" 및 "과실" 은 수확 후 추가로 사용되는, 식물에 의해 생성되는 경제적 가치가 있는 임의의 식물 생성물, 예를 들어, 적합한 의미에서 과일, 채소, 견과류, 곡류, 종자, 목재 (예를 들어, 조경 식물의 경우), 꽃 (예를 들어, 원예 식물의 경우, 장식식물) 등으로서 이해된다.
본 발명에 따르면, 수율은 4 % 이상 증가된다. 일반적으로, 수율 증가는 예를 들어 5 내지 10 %, 보다 바람직하게는 10 내지 20 %, 또는 심지어 20 내지 30 % 일 수 있다.
본 발명에 따르면, 해충 압력이 없는 상태에서 측정된 경우의 수율은 2 % 이상 증가한다. 일반적으로, 수율 증가는 예를 들어 4 % 내지 5 % 또는 그 이상까지 더 높을 수도 있다.
식물의 상태에 대한 또 다른 지표는 식물의 활력이다. 식물의 활력은 일반적인 시각적 외관과 같은 몇 가지 측면에서 명백해진다.
잎 적용의 경우, 개선된 식물 활력은 다음과 같은 식물의 개선된 특성에 의해 특징지어질 수 있다: 식물의 활력 개선; 및/또는 개선된 식물 성장; 및/또는 개선된 식물 발달; 및/또는 개선된 시각적 외관; 및/또는 개선된 식물 지지 (적은 식물 마디/쓰러짐 및/또는 더 큰 잎; 및/또는 더 큰 크기; 및/또는 증가된 식물 높이; 및/또는 및/또는 증가된 곁눈 수; 및/또는 증가된 곁순 수; 및/또는 식물 당 꽃 수 증가; 및/또는 싹 성장 증가 및/또는 광합성 활동의 증가 (예를 들어, 증가된 기공 전도도 및/또는 증가된 CO2 동화율에 기초함)); 및/또는 초기 개화; 및/또는 초기 과실; 및/또는 초기 곡물 성숙; 및/또는 덜 비생산적인 곁눈; 및/또는 덜 죽은 기저잎; 및/또는 적은 주입 필요성 (예컨대, 비료 또는 물); 및/또는 푸른 잎; 및/또는 단축된 식생 기간 동안 완전한 성숙; 및/또는 더 쉬운 수확; 및/또는 빠르고 균일한 숙성; 및/또는 보다 긴 저장 기간; 및/또는 더 긴 원추; 및/또는 노화 지연; 및/또는 더 강하고 및/또는 더 생산적인 곁눈; 및/또는 성분의 보다 양호한 추출성; 및/또는 종자의 품질 향상 (종자 생산을 위한 다음 계절에 종자를 뿌리기 위해); 및/또는 에틸렌의 감소된 생산 및/또는 식물에 의한 그것의 수용의 억제를 포함한다.
식물의 상태에 대한 또다른 지표는 식물 및/또는 그 생성물의 "품질" 이다. 본 발명에 따르면, 향상된 품질은 특정 성분의 함량 또는 조성물과 같은 특정 식물 특성이 동일한 조건 하에서, 그러나 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각 없이, 생산된 식물의 동일한 인자에 비해 측정가능하거나 현저한 양만큼 증가 또는 개선된다. 강화된 품질은 식물 또는 이의 생성물의 개선된 특성에 따라 특성화될 수 있다: 증가된 영양소 함량; 및/또는 증가된 단백질 함량; 및/또는 증가된 오일 함량; 및/또는 증가된 전분 함량; 및/또는 지방산의 증가된 함량; 및/또는 증가된 대사물질 함량; 및/또는 증가된 카로티노이드 함량; 및/또는 증가된 당 함량; 및/또는 필수 아미노산의 증가된 양; 및/또는 개선된 영양소 조성; 및/또는 개선된 단백질 조성; 및/또는 지방산의 개선된 조성; 및/또는 개선된 대사물질 조성; 및/또는 개선된 카로티노이드 조성; 및/또는 개선된 당 조성; 및/또는 개선된 아미노산 조성; 및/또는 개선된 또는 최적의 과실 색; 및/또는 개선된 잎 색상; 및/또는 더 높은 저장 용량; 및/또는 수확된 생성물의 가공성.
식물의 상태에 대한 또 다른 지표는 생물학적 및/또는 비생물학적 스트레스 요인에 대한 식물의 저항성 또는 내성이다. 생물학적 및 비생물학적 스트레스는 특히 장기간에 걸쳐 식물에 해로운 영향을 줄 수 있다.
생물학적 스트레스는 생물체에 의해 유발되는 반면, 비생물학적 스트레스는 예를 들어, 극한 환경에서 유발된다. 본 발명에 따르면, "생물학적 및/또는 비생물학적 스트레스 인자에 대한 강화된 저항성 또는 내성" 은 (1) 생물학적 및/또는 비생물학적 스트레스에 의해 야기된 특정한 부정적인 인자가 동일한 조건에 노출된, 그러나 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각으로 처리되지 않은, 식물과 비교하여 측정가능한 또는 현저한 양으로 감소한다는 것, 및 (2) 부정적 효과가 스트레스 인자에 대해, 예를 들어, 미생물이나 해충을 직접적으로 파괴하는 살진균성 또는 살곤충적 작용에 의한 것이 아니라 오히려 상기 스트레스 요인들에 대한 식물 자신의 방어 반응의 자극에 의해, 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각의 직접적인 작용에 의해 감소되지 않는다는 것을 의미한다.
병원균 및 해충과 같은 생물학적 스트레스에 의해 야기되는 부정적인 요인은 널리 알려져 있으며, 경쟁하는 식물 (예를 들어, 잡초), 미생물 (예컨대 식물병원성 진균 및/또는 박테리아) 및/또는 바이러스와 같은 살아있는 유기체에 의해 야기된다.
비생물학적 스트레스에 의해 야기되는 음성 요인 또한 잘 알려져 있으며, 식물 생력을 감소시키는 것으로 종종 관찰할 수 있다 (위 참조). 예를 들어:
낮은 수확량 및/또는 덜 활력, 두 가지 효과에 대한 예는 탄 나뭇잎, 적은 꽃, 조기 성숙, 후기 농작물 성숙, 다른 사람들 사이의 영양 가치 감소.
비생물학적 스트레스는 열 또는 추위와 같은 온도의 극단 (열 스트레스/추위 스트레스); 및/또는 온도의 강한 변화; 및/또는 특정 계절에 비정상적인 기온; 및/또는 가뭄 (가뭄 스트레스); 및/또는 극한의 젖음; 및/또는 높은 염분 (염 스트레스); 및/또는 방사선 (예를 들어, 감소하는 오존 층으로 인한 증가된 UV 복사); 및/또는 증가된 오존 수준 (오존 스트레스); 및/또는 유기 오염 (예를 들어, 식물 독성 농약의 양에 의한 경우); 및/또는 무기 오염 (예를 들어, 중금속 오염 물질에 의한).
생물학적 및/또는 비생물학적 스트레스 요인의 결과로 스트레스를 받는 식물의 품질과 양이 감소한다. 품질 (상기 정의된 바와 같음) 과 관련하여, 생식 발달은 과일이나 씨앗에 중요한 작물에 대한 결과로 인해 보통 심각하게 영향을 받는다. 단백질의 합성, 축적 및 저장은 대부분 온도에 의해 영향을 받고; 성장은 거의 모든 유형의 스트레스에 의해 저하되고; 다당류 합성은 구조 및 저장 모두 감소되거나 변화되고; 이러한 효과는 바이오매스 (수율) 의 감소와 제품의 영양가 변화를 초래한다.
상기 지적한 바와 같이, 식물의 건강 상태에 대한 상기 확인된 지표는 상호 의존적일 수 있으며 서로간에 발생할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 및/또는 비생물학적 스트레스에 대한 증가된 내성은 더 나은 식물 활력, 예를 들어, 더 양호하고 더 큰 작물에 이르기까지, 그리고 따라서 증가된 수확량에 이를 수 있다. 역으로, 더 발달된 뿌리 시스템은 생물학적 및/또는 비생물학적 스트레스에 대한 증가 된 내성을 초래할 수 있다. 그러나 이러한 상호의존성 및 상호작용은 모두 알려져 있지도 않고, 완전히 이해되지도 않았으므로 다양한 지표가 별도로 설명된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각은 식물 또는 그 생성물의 증가된 수율을 달성한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각은 식물 또는 그 생성물의 증가된 활력을 달성한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각은 식물 또는 그 생성물의 품질을 향상시킨다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각은 생물학적 스트레스에 대항하는 식물 또는 그 생성물의 증가된 내성 및/또는 저항성을 달성한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각은 비생물학적 스트레스에 대항하는 식물 또는 그 생성물의 증가된 내성 및/또는 저항성을 달성한다.
본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각은 그대로 또는 조성물의 형태로 진균 또는 식물, 식물 번식 물질, 예컨대 씨앗, 토양, 표면, 진균 공격으로부터 보호하고자 하는 재료 또는 공간을 살진균 유효량의 활성 물질로 처리함으로써 사용된다. 적용은 진균에 의한 식물, 식물 번식 물질, 예컨대 씨앗, 토양, 표면, 재료 또는 공간의 감염 전후모두에 수행될 수 있다.
용어 "유효량" 이란, 경작 식물 상의 유해한 진균의 방제 또는 물질의 보호에 충분하고 처리된 식물에 대해 실질적인 손상을 야기하지 않는 양을 의미한다. 이러한 양은 광범위하게 달라질 수 있으며, 다양한 인자, 예컨대, 방제하고자 하는 진균 종, 처리된 경작 식물 또는 물질, 기후 조건 및 사용된 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 및 화학식 I 의 화합물 또는 이의 염 각각에 좌우될 수 있다.
식물 번식 물질은 식재 또는 이식시 또는 그 전에 예방적으로 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물로 각각 처리될 수 있다.
본 발명의 균주는 식물에 대한 접종제로서 제형화될 수 있다. 용어 "접종 제" 는 본 발명의 단리된 균주 및 임의로 생물학적으로 허용가능한 배지를 포함할 수 있는 담체를 포함하는 조성물을 의미한다
이러한 접종제 및 다른 적합한 조성물은 통상적인 수단에 의해 활성 성분 외에도 적어도 하나의 보조제 (비활성 성분) 를 포함하는 조성물로 제조될 수 있다 (예를 들어, H.D. Burges: Formulation of Microbial Biopesticides, Springer, 1998 참고).
건조 제형을 제조하기 위해, 박테리아 세포, 바람직하게는 포자를 적합한 건조 담체 (예를 들어, 점토) 에 현탁시킬 수 있다. 액체 제형을 제조하기 위해, 세포, 바람직하게는 포자를 원하는 포자 밀도에 적합한 액체 담체 (예를 들어, 수성)에 재현탁시킬 수 있다. ml 당 포자의 포자 밀도 수는 약 20 내지 약 30 ℃ 의 온도에서 수일 동안 항온 배양한 후 아가 배지, 예를 들어 감자 덱스트로스 아가 배지 상의 콜로니 형성 단위 (colony-forming units, CFU) 의 수를 확인함으로써 결정할 수 있다.
하나의 구현예에 따르면, 키트의 일부 또는 2 성분 또는 3 성분 혼합물의 부분과 같은 본 발명에 따른 조성물의 개별 성분은 분무 탱크 또는 적용을 위해 사용되는 임의의 다른 종류의 용기에서 사용자 자신에 의해 혼합될 수 있고 (예를 들어, 종자 처리기 드럼, 종지 펠렛팅 기계, 배낭 분무기), 적합한 경우 추가 보조 장치를 추가할 수 있다. 본 발명의 파에니바실러스 균주와 같은 살아있는 미생물이 이러한 키트의 일부를 형성할 때, 키트의 다른 부분 (예를 들어, 화학 살충제) 및 추가 보조제의 선택 및 양이 사용자에 의해 혼합된 조성물에서 미생물 농약의 생존력에 영향을 미치면 안될 것이다. 특히 살균제 및 용매의 경우, 각각의 미생물 살충제와의 적합성을 고려해야 한다.
균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 및/또는 본 발명의 화합물 I 의 화합물은 통상적인 유형의 농약 조성물, 예를 들어, 용액, 유화액, 현탁액, 분진, 분말, 페이스트, 과립, 압착물, 캡슐 및 이들의 혼합물로 전환될 수 있다. 조성물 유형에 대한 예는 현탁액 (예를 들어, SC, OD, FS), 유화성 농축물 (예를 들어, EC), 유화액 (예를 들어, EW, EO, ES, ME), 캡슐 (예를 들어, CS, ZC), 페이스트, 사탕형 알약 (pastille), 습윤성 분말 또는 분진 (예를 들어, WP, SP, WS, DP, DS), 압착물 (예를 들어, BR, TB, DT), 과립 (예를 들어, WG, SG, GR, FG, GG, MG), 살충 물품 (예를 들어, LN) 뿐만 아니라, 식물 번식 물질, 예를 들어, 종자의 처리를 위한 겔 제형 (예를 들어, GF) 이다. 이들 조성물 및 추가의 조성물 유형은 문헌 ["Catalogue of pesticide formulation types and international coding system", Technical Monograph No. 2, 6th Ed. May 2008, CropLife International] 에 정의되어 있다.
상기 조성물은, 예컨대, 문헌 [Mollet and Grubemann, Formulation technology, Wiley VCH, Weinheim, 2001; 또는 Knowles, New developments in crop protection product formulation, Agrow Reports DS243, T&F Informa, London, 2005] 에 의해 기재된 바와 같은 공지의 방식으로 제조된다.
적합한 보조제는 용매, 액체 담체, 고체 담체 또는 충전제, 계면활성제, 분산제, 유화제, 습윤제, 아쥬반트, 가용화제, 침투 촉진제, 보호성 콜로이드, 접착제, 증점제, 보습제, 기피제, 유인제, 공급 촉진제, 상용화제, 살세균제, 동결 방지제, 소포제, 착색제, 점착제 및 결합제이다.
적합한 용매 및 액체 담체는 물 및 유기 용매, 예컨대, 중간 비점 내지 고 비점의 광유 분획, 예를 들어, 등유, 디젤유; 식물성 또는 동물성 기원의 오일; 지방족, 시클릭 및 방향족 탄화수소, 예를 들어, 톨루엔, 파라핀, 테트라히드로나프탈렌, 알킬화 나프탈렌; 알코올, 예를 들어, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 벤질알코올, 시클로헥산올; 글리콜; DMSO; 케톤, 예를 들어, 시클로헥산온; 에스테르, 예를 들어, 락테이트, 카르보네이트, 지방산 에스테르, 감마-부티로락톤; 지방산; 포스포네이트; 아민; 아미드, 예를 들어, N-메틸피롤리돈, 지방산 디메틸아미드; 및 이들의 혼합물이다.
적합한 고체 담체 또는 충전제는 미네랄 토류 (mineral earth), 예를 들어, 실리케이트, 실리카 겔, 탈크, 카올린, 석회석, 석회, 백악, 점토, 돌로마이트, 규조토, 벤토나이트, 황산칼슘, 황산마그네슘, 산화마그네슘; 다당류, 예를 들어, 셀룰로오스, 전분; 비료, 예를 들어, 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아; 식물성 기원의 생성물, 예를 들어, 곡물 가루 (cereal meal), 나무 껍질 가루, 목재 가루, 견과 껍질 가루 및 이들의 혼합물이다.
적합한 계면활성제는 표면-활성 화합물, 예컨대, 음이온성, 양이온성, 비이온성 및 양쪽성 계면활성제, 블록 중합체, 고분자전해질 및 이들의 혼합물이다. 상기 계면활성제는 유화제, 분산제, 가용화제, 습윤제, 침투 촉진제, 보호성 콜로이드 또는 아쥬반트로서 사용될 수 있다. 계면활성제의 예는 문헌 [McCutcheon's, Vol.1: Emulsifiers & Detergents, McCutcheon's Directories, Glen Rock, USA, 2008 (International Ed. or North American Ed.)] 에 열거되어 있다.
적합한 음이온성 계면활성제는 설포네이트, 설페이트, 포스페이트, 카르복실레이트 및 이들의 혼합물의 알칼리, 알칼리 토금속 또는 암모늄 염이다. 설포네이트의 예는 알킬아릴설포네이트, 디페닐설포네이트, 알파-올레핀 설포네이트, 리그닌 설포네이트, 지방산 및 오일의 설포네이트, 에톡시화 알킬페놀의 설포네이트, 알콕시화 아릴페놀의 설포네이트, 축합 나프탈렌의 설포네이트, 도데실벤젠 및 트리데실벤젠의 설포네이트, 나프탈렌 및 알킬나프탈렌의 설포네이트, 설포석시네이트 또는 설포석시나메이트이다. 설페이트의 예는 지방산 및 오일의 설페이트, 에톡시화 알킬페놀의 설페이트, 알코올의 설페이트, 에톡시화 알코올의 설페이트 또는 지방산 에스테르의 설페이트이다. 포스페이트의 예는 포스페이트 에스테르이다. 카르복실레이트의 예는 알킬 카르복실레이트 및 카르복실화 알코올 또는 알킬페놀 에톡실레이트이다.
적합한 비이온성 계면활성제는 알콕실레이트, N-치환된 지방산 아미드, 아민 산화물, 에스테르, 당계 계면활성제, 중합체성 계면활성제 및 이들의 혼합물이다. 알콕실레이트의 예는 알코올, 알킬페놀, 아민, 아미드, 아릴페놀, 지방산 또는 지방산 에스테르 (이는 1 당량 내지 50 당량으로 알콕시화됨) 와 같은 화합물이다. 에틸렌 옥시드 및/또는 프로필렌 옥시드, 바람직하게는 에틸렌 옥시드가 알콕시화를 위해 사용될 수 있다. N-치환된 지방산 아미드의 예는 지방산 글루카미드 또는 지방산 알칸올아미드이다. 에스테르의 예는 지방산 에스테르, 글리세롤 에스테르 또는 모노글리세라이드이다. 당계 계면활성제의 예는 소르비탄, 에톡시화 소르비탄, 수크로오스 및 글루코오스 에스테르 또는 알킬폴리글루코사이드이다. 중합체성 계면활성제의 예는 비닐피롤리돈, 비닐알코올 또는 비닐아세테이트의 단독중합체 또는 공중합체이다.
적합한 양이온성 계면활성제는 4차 계면활성제, 예를 들어, 1 또는 2 개의 소수성 기를 가지는 4차 암모늄 화합물, 또는 장쇄 1차 아민의 염이다. 적합한 양쪽성 계면활성제는 알킬베타인 및 이미다졸린이다. 적합한 블록 중합체는 폴리에틸렌 옥시드 및 폴리프로필렌 옥시드의 블록을 포함하는 A-B 또는 A-B-A 유형, 또는 알칸올, 폴리에틸렌 옥시드 및 폴리프로필렌 옥시드를 포함하는 A-B-C 유형의 블록 중합체이다. 적합한 고분자전해질은 다가 산 또는 다가 염기이다. 다가 산의 예는 폴리아크릴산의 알칼리 염 또는 다가 산 빗살형 중합체 (polyacid comb polymer) 이다. 다가 염기의 예는 폴리비닐아민 또는 폴리에틸렌아민이다.
적합한 아쥬반트는, 무시할 수 있거나 심지어 그 자체로 어떠한 살충 활성도 가지지 않으며, 표적에 대한 무-세포 추출물, 배양 배지 또는 대사물질의 생물학적 성능을 향상시키는 화합물이다. 그 예는 계면활성제, 광유 또는 식물성 오일 및 기타 보조제이다. 추가의 예는 문헌 [Knowles, Adjuvants and additives, Agrow Reports DS256, T&F Informa UK, 2006, chapter 5] 에 열거되어 있다.
적합한 증점제는 다당류 (예를 들어, 잔탄 검, 카르복시메틸셀룰로오스), 유기질 점토 (유기적으로 개질되거나 비개질됨), 폴리카르복실레이트 및 실리케이트이다.
적합한 살균제는 브로노폴 및 이소티아졸리논 유도체, 예컨대 알킬이소-티아 졸리논 및 벤즈이소티아졸리논이다. 적절한 부동제는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 우레아 및 글리세린이다. 적합한 소포제는 실리콘, 장쇄 알코올 및 지방산의 염이다. 적합한 착색제 (예를 들어, 적색, 청색 또는 녹색) 는 수용성이 낮은 안료 및 수용성 염료이다. 무기 착색제 (예를 들어, 산화철, 산화 티탄, 철 헥사시아노 페레이트) 및 유기 착색제 (예를 들어, 알리자린, 아조 및 프탈로시아닌 착색제) 가 그 예이다. 적합한 점착제 또는 결합제는 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 알코올, 폴리아크릴레이트, 생물학적 또는 합성 왁스 및 셀룰오스 에테르이다.
세포 또는 포자의 형태로 본 발명의 파에니바실러스 균주와 같은 살아있는 미생물이 조성물의 일부를 형성할 때, 상기 조성물은 활성 성분 이외의 통상적 인 수단에 의한 하나 이상의 보조제 (비활성 성분) 를 포함하는 조성물로서 제조될 수 있다 (예를 들어, H.D. Burges: Formulation of Microbial Biopesticides, Springer, 1998). 상기 조성물의 적절한 통상적인 유형은 현탁액, 분진, 분말, 페이스트, 과립, 가압제, 캡슐 및 이들의 혼합물이다. 조성물 유형에 대한 예는 현탁액 (예를 들어, SC, OD, FS), 캡슐 (예를 들어, CS, ZC), 페이스트, 사탕형 알약, 젖은 분말 또는 분진 (예를 들어, WP, SP, WS, DP, DS), 가압제 (예를 들어, BR, TB , DT), 과립 (예를 들어, WG, SG, GR, FG, GG, MG), 살충 물품 (예를 들어, LN) 뿐 아니라, 종자와 같은 식물 번식 물질 처리용 겔 제형 (예 : GF) 이다. 여기서, 각각의 제형 유형 또는 보조제의 선택은 조성물의 저장 동안 및 최종적으로 토양, 식물 또는 식물 번식 물질에 적용될 때 미생물의 생존력에 영향을 주지 않아야 한다는 것을 고려해야한다. 적합한 제형은 예를 들어, WO 2008/002371, US 6,955,912, US 5,422,107 에 언급되어 있다.
적합한 보조제의 예는 본원에서 앞서 언급한 보조제로서, 그러한 보조제의 선택 및 양이 조성물 중 미생물 농약의 생존력에 영향을 주어서는 안된다는 것에 주의해야 한다. 특히 살균제 및 용매의 경우, 각각의 미생물 살충제의 각각의 미생물과의 상용성을 고려해야 한다. 또한, 미생물 농약을 함유하는 조성물은 안정화제 또는 영양제 및 UV 보호제를 추가로 함유할 수 있다. 적합한 안정제 또는 영양소는 예를 들어, 알파-토코페롤, 트레할로오스, 글루타메이트, 칼륨 소르베이트, 글루코오스, 수크로오스, 락토오스 및 말토덱스트린과 같은 다양한 당이다 (H.D. Burges: Formulation of Microbial Biopesticides, Springer, 1998). 적합한 UV 보호제는 예를 들어, 산화 타티늄, 산화 아연 및 산화 철 안료와 같은 무기 화합물 또는 벤조페논, 벤조트리아졸 및 페닐트리아진과 같은 유기 화합물이다. 상기 조성물은 본 명세서에서 화합물 I 을 포함하는 조성물에 대해 언급된 보조제에 부가적으로 0.1-80 % 의 안정화제 또는 영양제 및 0.1-10 % 의 UV 보호제를 포함할 수 있다.
농약 조성물은 일반적으로 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 90 중량%, 특히 0.5 내지 75 중량% 의 활성 물질을 포함한다. 활성 물질은 90% 내지 100%, 바람직하게는 95% 내지 100% 의 순도 (NMR 스펙트럼에 따름) 로 사용된다.
조성물 유형 및 이의 제조에 대한 예는 하기와 같다:
i) 수용성 농축물 (SL, LS)
본 발명의 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 또는 대사물질 10-60 중량% 및 습윤제 (예를 들어, 알코올 알콕실레이트) 5-15 중량% 를 물 및/또는 수용성 용매 (예를 들어, 알코올) 중에 100 중량% 까지 용해시킨다. 활성 물질은 물에 의한 희석 중에 용해시킨다.
ii) 분산성 농축물 (DC)
본 발명의 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 또는 대사물질 5-25 중량% 및 분산제 (예를 들어, 폴리비닐피롤리돈) 1-10 중량% 를 유기 용매 (예를 들어, 시클로헥산온) 중에 100 중량% 까지 용해시킨다. 물에 의한 희석은 분산액을 제공한다.
iii) 유화성 농축물 (EC)
본 발명의 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 또는 대사물질 15-70 중량% 및 유화제 (예를 들어, 칼슘 도데실벤젠설포네이트 및 피마자유 에톡실레이트) 5-10 중량% 를 수불용성 유기 용매 (예를 들어, 방향족 탄화수소) 중에 100 중량% 까지 용해시킨다. 물에 의한 희석은 유화액을 제공한다.
iv) 유화액 (EW, EO, ES)
본 발명의 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 또는 대사물질 5-40 중량% 및 유화제 (예를 들어, 칼슘 도데실벤젠설포네이트 및 피마자유 에톡실레이트) 1-10 중량% 를 20-40 중량% 수불용성 유기 용매 (예를 들어, 방향족 탄화수소) 중에 용해시킨다. 이러한 조성물을 유화 기계에 의해 물 100 중량% 까지 도입하고 균질한 유화액으로 만든다. 물에 의한 희석은 유화액을 제공한다.
v) 현탁액 (SC, OD, FS)
교반되는 볼 밀에서, 본 발명의 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 또는 대사물질 20-60 중량% 를 분산제 및 습윤제 (예를 들어, 나트륨 리그노설포네이트 및 알코올 에톡실레이트) 2-10 중량%, 증점제 (예를 들어, 잔탄 검) 0.1-2 중량% 및 물 100 중량% 이하의 첨가와 함께 분쇄하여, 미세 활성 물질 현탁액을 수득한다. 물에 의한 희석은 활성 물질의 안정한 현탁액을 제공한다. FS 유형 조성물의 경우, 결합제 (예를 들어, 폴리비닐알코올) 40 중량% 이하를 첨가한다.
vi) 수분산성 과립 및 수용성 과립 (WG, SG)
본 발명의 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 또는 대사물질 50-80 중량% 를 분산제 및 습윤제 (예를 들어, 나트륨 리그노설포네이트 및 알코올 에톡실레이트) 100 중량% 이하의 첨가와 함께 미세하게 분쇄하고, 기술적 적용 (예를 들어, 압출, 분무 타워, 유동층) 에 의해 수분산성 또는 수용성 과립으로서 제조한다. 물에 의한 희석은 활성 물질의 안정한 분산액 또는 용액을 제공한다.
vii) 수분산성 분말 및 수용성 분말 (WP, SP, WS)
본 발명의 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 또는 대사물질 50-80 중량% 를 분산제 (예를 들어, 나트륨 리그노설포네이트) 1-5 중량%, 습윤제 (예를 들어, 알코올 에톡실레이트) 1-3 중량% 및 고체 담체, 예를 들어, 실리카 겔 100 중량% 이하의 첨가와 함께 회전자-정류자 밀에서 분쇄한다. 물에 의한 희석은 활성 물질의 안정한 분산액 또는 용액을 제공한다.
viii) 겔 (GW, GF)
교반되는 볼 밀에서, 본 발명의 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 또는 대사물질 5-25 중량% 를 분산제 (예를 들어, 나트륨 리그노설포네이트) 3-10 중량%, 증점제 (예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스) 1-5 중량% 및 물 100 중량% 이하의 첨가와 함께 분쇄하여, 활성 물질의 미세 현탁액을 제공한다. 물에 의한 희석은 활성 물질의 안정한 현탁액을 제공한다.
ix) 마이크로유화액 (ME)
본 발명의 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 또는 대사물질 5-20 중량% 를 유기 용매 블렌드 (예를 들어, 지방산 디메틸아미드 및 시클로헥산온) 5-30 중량%, 계면활성제 블렌드 (예를 들어, 알코올 에톡실레이트 및 아릴페놀 에톡실레이트) 10-25 중량% 및 물 100% 이하에 첨가한다. 이러한 혼합물을 1 시간 동안 교반하여 열역학적으로 안정한 마이크로유화액을 자발적으로 생성한다.
x) 마이크로캡슐 (CS)
본 발명의 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 또는 대사물질 5-50 중량%, 수불용성 유기 용매 (예를 들어, 방향족 탄화수소) 0-40 중량%, 아크릴 단량체 (예를 들어, 메틸메타크릴레이트, 메타크릴산 및 디아크릴레이트 또는 트리아크릴레이트) 2-15 중량% 를 포함하는 오일 상을 보호성 콜로이드 (예를 들어, 폴리비닐 알코올) 의 수용액 중에 분산시킨다. 라디칼 개시제에 의해 개시되는 라디칼 중합은 폴리(메트)아크릴레이트 마이크로캡슐의 형성을 초래한다.
대안적으로는, 본 발명의 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 또는 대사물질 5-50 중량%, 수불용성 유기 용매 (예를 들어, 방향족 탄화수소) 0-40 중량% 및 이소시아네이트 단량체 (예를 들어, 디페닐메텐-4,4'-디이소시아네이트) 를 포함하는 오일 상을 보호성 콜로이드 (예를 들어, 폴리비닐 알코올) 의 수용액 중에 분산시킨다. 폴리아민 (예를 들어, 헥사메틸렌디아민) 의 첨가는 폴리우레아 마이크로캡슐의 형성을 초래한다. 단량체는 1-10 중량% 에 이른다. 중량% 는 전체 CS 조성물에 대한 것이다.
xi) 분진성 분말 (DP, DS)
본 발명의 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 또는 대사물질 1-10 중량% 를 미세하게 분쇄하고 고체 담체 (예를 들어, 미분된 카올린) 100 중량% 이하와 친밀하게 혼합한다.
xii) 과립 (GR, FG)
본 발명의 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 또는 대사물질 0.5-30 중량% 를 미세하게 분쇄하고 고체 담체 (예를 들어, 실리케이트) 100 중량% 이하와 연결시킨다. 과립화는 압출, 분무-건조 또는 유동층에 의해 달성된다.
xiii) 초저 부피 액체 (UL)
본 발명의 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지 또는 대사물질 1-50 중량% 를 유기 용매 (예를 들어, 방향족 탄화수소) 에 100 중량% 이하 중에 용해시킨다.
조성물 유형 i) 내지 xiii) 는 임의로 추가의 보조제, 예컨대, 살세균제 0.1-1 중량%, 동결 방지제 5-15 중량%, 소포제 0.1-1 중량% 및 착색제 0.1-1 중량% 를 포함할 수 있다.
종자 처리 (LS), 현탁유화액 (suspoemulsion) (SE), 유동성 농축물 (FS), 건조 처리용 분말 (DS), 슬러리 처리용 수분산성 분말 (WS), 수용성 분말 (SS), 유화액 (ES), 유화성 농축물 (EC) 및 겔 (GF) 에 대한 용액은 일반적으로 식물 번식 물질, 특히 종자의 처리를 위해 사용된다.
종자 처리 제형 유형 또는 프리-믹스 조성물에 대한 토양 적용의 바람직한 예는 WS, LS, ES, FS, WG 또는 CS-유형의 것이다.
전형적으로, 종자 처리 적용을 위한 프리-믹스 제형은 0.5 내지 99.9 %, 특히 1 내지 95 % 의 원하는 성분, 및 99.5 내지 0.1 %, 특히 99 내지 5 % 의 고체 또는 액체 보조제 (예를 들어, 물과 같은 용매를 포함) 를 포함하며, 여기서 보조제는 프리-믹스 제형을 기준으로 0 내지 50 %, 특히 0.5 내지 40 % 의 양의 계면 활성제일 수 있다. 시판 제품은 바람직하게는 농축물 (예를 들어, 프리-믹스 조성물 (제형)) 로 제형화될 것이나, 최종 사용자는 통상적으로 희석 제형 (예를 들어, 탱크 믹스 조성물) 을 사용할 것이다.
본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물 및 조성물 각각을 식물 번식 물질, 특히 종자에 적용 또는 처리하기 위한 종자 처리 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 번식 물질의 드레싱, 코팅, 필름코팅, 펠렛화 및 적용 방법이 포함된다. 이러한 방법은 또한 본 발명에 따른 조합 물에도 적용 가능하다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물 및 조성물 각각을 발아에 부정적으로 영향을 주지 않는 방법에 의해 식물 번식 물질상에 적용하거나 처리한다. 따라서, 종자와 같은 식물 번식 물질을 적용 (또는 처리) 하기 위한 적합한 방법의 예는 종자 드레싱, 종자 코팅 또는 종자 펠렛화 등이 있다.
식물 번식 물질은 종자, 종자 조각 (즉, 줄기) 또는 종자 구근인 것이 바람직하다.
본 발명의 방법은 임의의 생리학적 상태로 종자에 적용될 수 있다고 믿어지지만, 종자가 처리 과정 중에 손상을 입지 않도록 충분히 내구성 있는 상태로 존재하는 것이 바람직하다. 전형적으로, 종자는 들판에서 수확된; 식물에서 제거된;그리고 임의의 코브 (cob), 줄기, 바깥 껍질 (husk) 및 주변 펄프 (pulp) 또는 다른 비-종자 식물 재료로부터 분리된 종자일 것이다. 종자는 처리가 종자에 생물학적 손상을 일으키지 않을 정도의 범위로 생물학적으로 안정한 것이 바람직하다. 처리는 종자 수확과 종자 파종 사이 또는 파종 과정 (종자 직접 적용) 사이의 어느 때라도 종자에 적용될 수 있다고 믿어진다. 종자는 또한 처리 전후에 준비될 수 있다.
본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각 내의 성분의 균일한 분포 및 종자에 대한 이들의 부착은 번식 물질 처리 동안 바람직하다. 처리는 식물 번식 물질, 예컨대 종자 상에 조합, 예를 들어, 활성 성분(들) 의 혼합물을 함유하는 제형의 박막 (드레싱) 으로 변화할 수 있으며, 여기서 본래 크기 및/또는 형상은 중간 단계 (예컨대 코팅) 에서부터 더 두꺼운 필름 (예컨대, 담체, 예를 들어 점토; 다른 활성 성분과 같은 상이한 제형; 및 착색제) 으로 식별가능하며, 이때 종자의 본래 크기 및/또는 형상은 더이상 식별할 수 없다.
본 발명의 양상은 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각을 목적하는 방식으로 식물 번식 물질 상에 적용하는 것을 포함하며, 전체 식물 번식 물질 또는 이의 오로지 일부 (오직 단일 면 상에 또는 단일 면의 일부 상에) 상에 성분을 조합으로 배치하는 것을 포함한다. 당업자는 EP954213B1 및 WO06/112700 에 제공된 설명으로부터 이러한 적용 방법을 이해할 것이다.
본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각은 또한 "알약" 또는 "펠렛" 또는 적합한 기질의 형태로, 식물 번식 물질 옆에, 처리된 알약 또는 기질을 배치, 또는 파종하여 사용될 수 있다. 이러한 기술은 당 업계에, 특히 EP1124414, WO07/67042 및 WO 07/67044 에 공지되어 있다. 본원에 기재된 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각을 식물 번식 물질에 적용하는 것은 또한 살충제-처리된 종자 옆에 하나 이상의 살충제-함유 입자를 둠으로써 본 발명의 조합으로 처리된 식물 번식 물질을 보호하는 것을 포함하고, 이때 살충제의 양은, 살충제-처리된 종자 및 살충제-함유 입자가 함께 유효 용량의 살충제를 함유하고, 살충제-처리된 종자 내에 함유되는 살충제 용량이 살충제의 최대 비-식물독성 용량 이하인 정도이다. 이러한 기술은 당해 기술 분야, 특히 WO2005/120226 에 공지되어 있다.
본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각을 종자 상에 적용하는 것은 또한 종자 상의 제어된 방출 코팅을 포함하며, 조합물의 성분은 시간이 지남에 따라 성분을 방출하는 물질에 통합되어 있다. 제어된 방출 종자 처리 기술의 예는 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, 중합체 필름, 왁스 또는 기타 종자 코팅을 포함하며, 상기 성분은 제어된 방출 물질 내로 혼입되거나 또는 물질 층들 사이에 적용될 수 있거나 둘다 적용될 수 있다.
종자는 임의의 원하는 순서로 또는 동시에 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물, 및 조성물 각각을 적용함으로써 처리될 수 있다.
종자 처리는 미파종된 종자에 일어나며, 용어 "미파종된 종자" 는 종자 수확과, 발아 및 식물 성장을 목적으로 땅에 종자의 파종 사이의 모든 기간에 종자를 포함하는 것으로 의미한다.
미파종된 종자에 대한 처리는 활성 성분이 토양에 적용되는 관행을 포함하는 것을 의미하지는 않지만 식재 과정 중에 종자를 목표로 할 것인 임의의 적용 관행을 포함할 것이다.
바람직하게는, 처리는 종자를 파종하기 전에 일어나서 미파종된 종자가 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물 및 조성물 각각으로 전처리되도록 한다. 특히, 종자 코팅 또는 종자 펠렛화 (seed pelleting) 가 바람직하다. 처리 결과로서, 성분은 종자에 부착되므로, 해충 방제가 가능하다.
처리된 종자는 임의의 다른 활성 성분 처리된 종자와 동일한 방식으로 저장, 취급, 파종 및 경작될 수 있다.
특히, 본 발명은 해충으로부터 식물 번식 물질을 보호하기 위한 방법 및/또는 상기 식물 번식 물질로부터 성장된 식물의 건강을 개선시키는 방법에 관한 것으로, 상기 식물 번식 물질이 파종된 토양을 유효량의 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물 및 조성물 각각으로 처리한다.
특히, 본 발명은 해충으로부터 식물 번식 물질을 보호하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 식물 번식 물질이 파종된 토양을 유효량의 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물 및 조성물 각각으로 처리한다.
특히, 본 발명은 유해 진균으로부터 식물 번식 물질을 보호하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 식물 번식 물질이 파종된 토양을 유효량의 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물 및 조성물 각각으로 처리한다.
특히, 본 발명은 동물 해충 (곤충, 진드기 또는 선충류) 으로부터 식물 번식 물질을 보호하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 식물 번식 물질이 파종된 토양을 유효량의 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물 및 조성물 각각으로 처리한다.
사용자는 일반적으로 예비주입 장치 (predosage device), 배낭형 분무기 (knapsack sprayer), 분무 탱크 (spray tank), 분무 비행기 (spray plane) 또는 관개 시스템 (irrigation system) 으로부터 본 발명에 따른 조성물을 적용한다. 일반적으로, 물, 완충액 및/또는 추가의 보조제를 사용하여 농약 조성물을 목적하는 적용 농도로 만들고, 이에 따라 본 발명에 따른 즉시 사용가능한 분무액 또는 농약 조성물을 수득한다. 일반적으로, 농업적으로 유용한 면적의 헥타르 당 20 리터 내지 2000 리터, 바람직하게는 50 리터 내지 400 리터의 즉시 사용가능한 분무액을 적용한다.
식물 번식 물질, 특히 종자의 처리에 관해서는, 본원에 개시된 조성물은 2 내지 10 배 희석한 후, 활성 성분 농도가 0.01 내지 60 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 40 중량% 인 사용할 수 있는 제제를 산출한다. 적용은 파종 전 또는 파종 중에 수행할 수 있다. 식물 번식 물질, 특히 종자 상에 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물 및 조성물 각각을 적용하는 방법은 드레싱, 코팅, 펠릿 처리, 분진 처리, 침지 및 고랑내 적용 (in-furrow application) 방법을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 균주, 전체 배양 브로쓰, 무-세포 추출물, 배양 배지, 화학식 I 의 화합물 및 조성물 각각은 각각 발아가 유도되지 않도록 하는 방법, 예를 들어, 종자 드레싱, 펠릿 처리, 코팅 및 분진 처리에 의해 식물 번식 물질에 적용된다.
본 발명의 균주가 작물 보호에 사용되는 경우, 균주는 옆면 처리로서 또는 토양에 적용되며, 적용 비율은 통상, 약 1 x 106 내지 5 x 1015 (또는 이상) CFU/ha, 바람직하게는 약 1 x 107 내지 약 1 x 1013 CFU/ha, 더 더욱 바람직하게는 1 x 109 내지 5 x 1012 CFU/ha 의 범위이다.
본 발명의 균주가 종자 처리에 사용되는 경우, 식물 번식 물질에 대한 적용 비율은 통상, 약 1 x 101 내지 1 x 1012 (또는 이상) CFU/종자, 바람직하게는 약 1 x 103 내지 약 1 x 1010 CFU/종자, 더 더욱 바람직하게는 약 1 x 103 내지 약 1 x 106 CFU/종자의 범위이다. 대안적으로는, 식물 번식 물질에 대한 적용 비율은 바람직하게는 종자 100 kg 당 약 1 x 107 내지 1 x 1016 (또는 이상) CFU, 바람직하게는 종자 100 kg 당 1 x 109 내지 약 1 x 1015 CFU, 더 더욱 바람직하게는 종자 100 kg 당 1 x 1011 내지 약 1 x 1015 CFU 의 범위이다.
무-세포 추출물, 배양 배지 및/또는 화학식 I 의 화합물이 사용되는 경우, 고체 물질 (건조 물질) 은 예를 들어, 액체 제형의 경우 추출 매질 또는 현탁 매질의 건조 또는 증발 후 수득되는, 활성 성분으로서 고려된다. 식물 보호에 사용될 때, 적용되는 활성 물질의 양은 목적하는 효과의 유형에 따라, 0.001 내지 2 kg/ha, 바람직하게는 0.005 내지 2 kg/ha, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 0.9 kg/ha, 특히 0.1 내지 0.75 kg/ha 이다. 예를 들어, 종자의 분진 처리, 코팅 또는 적심 (drenching) 에 의한 종자와 같은 식물 번식 물질의 처리에서, 식물 번식 물질 (바람직하게는 종자) 100 kg 당 0.1 내지 1000 g, 바람직하게는 1 내지 1000 g, 더욱 바람직하게는 1 내지 100 g, 가장 바람직하게는 5 내지 100 g 의 활성 물질의 양이 일반적으로 요구된다. 물질 또는 저장 생산물의 보호에서 사용될 때, 적용되는 활성 물질의 양은 적용 면적의 종류 및 목적하는 효과에 좌우된다. 물질의 보호에 통상 적용되는 양은 처리되는 물질의 입방 미터 당 0.001 g 내지 2 kg, 바람직하게는 0.005 g 내지 1 kg 의 활성 물질이다.
하나의 구현예에 따르면, 키트의 일부 또는 2 성분 또는 3 성분 혼합물의 부분과 같은 본 발명에 따른 조성물의 개별 성분은 분무 탱크 또는 적용을 위해 사용되는 임의의 다른 종류의 용기에서 사용자 자신에 의해 혼합될 수 있고 (예를 들어, 종자 처리기 드럼, 종지 펠렛팅 기계, 배낭 분무기), 적합한 경우 추가 보조 장치를 추가할 수 있다.
본 발명의 균주와 같은 살아있는 미생물이 이러한 키트의 일부를 형성할 때, 성분 (예를 들어, 화학 살충제) 및 추가 보조제의 선택 및 양이 사용자에 의해 혼합된 조성물에서 미생물의 생존력에 영향을 미치면 안될 것이다. 특히 살균제 및 용매의 경우, 각각의 미생물과의 적합성을 고려해야 한다.
각종 유형의 오일, 습윤제, 아쥬반트, 비료 또는 미량 영양소 및 기타 살충제 (예를 들어, 제초제, 살충제, 살진균제, 성장 조절제, 완화제, 생물농약) 는 프리믹스로서 또는 경우에 따라 사용 직전에 비로소 (탱크 혼합), 본 발명의 균주, 무-세포 추출물, 배양 배지, 대사물질, 화학식 I 의 화합물 및 조성물 각각에 첨가될 수 있다. 이들 제제는 본 발명에 따른 조성물과 1:100 내지 100:1, 바람직하게는 1:10 내지 10:1 의 중량비로 혼합될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 추가의 생물살충제를 포함한다. 더 더욱 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 보조제 및 적어도 하나의 화학식 I 의 화합물 이외에, 미생물 살충제를 포함한다.
살충제는 일반적으로 화학 또는 생물학적 제제 (예를 들어, 바이러스, 박테리아, 항균제 또는 소독제) 이고, 그 효과를 통해 해충을 제지, 무력화, 살해 또는 다르게는 저지한다. 표적 해충은 재산을 파괴하거나 폐렴을 일으키거나 질병을 전파시키거나 질병에 대한 매개체가 되는 곤충, 식물 병원균, 잡초, 연체동물, 새, 포유동물, 물고기, 선충류 (roundworms), 및 미생물을 포함할 수 있다. 농약이라는 용어는 또한 식물의 예상되는 성장, 개화 또는 번식 속도를 변경시키는 식물 성장 조절제; 일반적으로 수확을 용이하게 하기 위해 식물에서 잎이나 기타 경엽을 떨어 뜨리는 고엽제; 불필요한 식물 상부와 같은 살아있는 조직의 건조를 촉진시키는 건조제; 특정 해충을 방어하기 위한 식물 생리물질을 활성화시키는 식물 활성화제; 농작물에 대한 농약의 원치 않는 제초 작용을 감소시키는 완화제; 및 식물 성장 인자, 바이오매스, 수확량 또는 작물의 수확 가능한 제품의 다른 품질 파라미터를 증가시키는 식물 생리학에 영향을 미치는 식물 성장 촉진제를 포함한다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명될 것이다. 하기 실시예는 예증의 목적을 위한 것으로, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 본 발명의 신규한 박테리아 균주의 단리
독일을 비롯한 다양한 유럽 국가의 토양 샘플을 수집하였다. 이들 토양에 통상적으로 공지된 미생물 단리 절차를 적용함으로써, 본 발명자는 본원에 기재된 바와 같이 순수 단리물을 제공하기 위한 통상적인 단리 기술에 추가로 적용되는 다양한 박테리아를 수득하였다.
표준 미생물 농축 기술 (C. A. Reddy, T. J. Beveridge, J. A. Breznak, G. A. Marzluf, T. M. Schmidt, and L. R. Snyder (eds.). Methods for General and Molecular Microbiology, Am. Soc. Microbiol., Washington, District of Columbia) 에 이어, 각 유형의 박테리아를 단리하였다.
하기 균주를 단리하고, 부다페스트 조약 (Budapest Treaty) 에 따라, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) 에, 2013 년 2 월 20 일에 기탁하였다:
a) 수탁 번호 DSM 26969 로 DSMZ 에 기탁된 Lu16774
b) 수탁 번호 DSM 26970 로 DSMZ 에 기탁된 Lu17007
c) 수탁 번호 DSM 26971 로 DSMZ 에 기탁된 Lu17015.
실시예 2 - 신규한 박테리아 균주의 특징분석
실시예 2.1: 16S-rDNA 서열분석
파에니바실러스 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 DSMZ, Braunschweig, Germany 에서, PCR-증폭된 16S rDNA 의 직접 서열분석에 의해 측정하였다.
게놈 DNA 추출을 제조사의 지침에 따라 MasterPureTM Gram Positive DNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies 사제) 를 사용하여 수행하였다. 16S rDNA 의 PCR-매개된 증폭 및 PCR 생성물의 정제를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Int. J. Syst. Bacteriol. 46, 1088-1092, 1996). 정제된 PCR 생성물을 제조자의 프로토콜에 명시된 바와 같이 BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems 사제) 를 사용하여 서열분석하였다. 서열 반응물을 3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems 사제) 를 사용하여 전기영동하였다. 서열 모호성은 단일 게놈 내에 상이한 서열을 가진 16S rRNA 를 엔코딩하는 여러 개의 시스트론의 존재로 인한 것일 수 있다 (J. Bacteriol. 178(19), 5636-5643, 1996).
균주로부터 산출되는 서열 데이터를 정렬 편집기 AE2 (http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/unix/ae2.readme) 에 입력하고, 산출되는 rRNA 분자의 2 차 구조에 따라 수동으로 정렬하고, Firmicutes 에 속하는 유기체의 대표적인 16S rRNA 유전자 서열과 비교하였다 (Nucl. Acids Res. 27, 171-173, 1999). 비교를 위해, EMBL 및 RDP 데이터 베이스로부터 16S rRNA 서열을 수득하였다.
본 발명의 균주의 16S rDNA 서열은 표 2 에 표시된 바와 같은 서열 목록에 언급된다.
표 2: 파에니바실러스 균주의 16S rDNA 의 서열 목록 참고.
Figure 112017021872046-pct00008
16S rDNA 유전자 일치성 값 (%) 를 비교된 서열의 정렬 내에 서열의 쌍방식 비교에 의해 계산하였다.
쌍방식 서열 정렬에 기반한 오로지 2 개의 서열의 수행된 비교는 본원에서 2 원 값으로서 표시된다. 다른 값은 비교 내 모든 서열의 복합 서열 정렬에 기반한다. 다중서열 비교로부터의 더 높은 일치성 값은 비교된 서열의 서열 데이터가 더 짧은 정렬을 산출하는 상이한 길이의 것이었다는 문제를 산출한다.
3 개의 신규한 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 사이의 완전한 rDNA 서열의 쌍방식 비교로부터의 % 일치성은 99.5 내지 99.9% 였다 (표 3, 2 원 값).
표 3: 3 개의 신규한 파에니바실러스 균주의 완전한 16S rRNA 서열의 일치성 (%) (괄호 내 2 원 값).
Figure 112017021872046-pct00009

관련된 분류군이 있는 3 개의 신규한 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의 완전한 16S rRNA 서열의 비교 (도 9 참고) 는 파에니바실러스 페오리아에 (유형-균주 DSM 8320) 에 대한 높은 % 일치성 99.8% 를 밝혀냈다. P. 페오리아에의 신규한 균주와의 쌍방식-서열 정렬에 대한 2 원 값은 하기와 같았다: 각각 Lu16774: 99.5%, Lu17007: 99.5%; 및 Lu17015: 99.7% 일치성.
신규한 파에니바실러스 균주 Lu16774, Lu17015 및 Lu17007 이 속하는 종의 최종 평가는 16S rRNA 서열 데이터에 기반하여 가능하지 않았다.
완전한 rDNA 의 서열분석은 파에니바실러스 페오리아에 NRRL BD 62 이 P. 페오리아에 (유형 균주 DSM 8320) 에 대해 100.0% 일치성임을 산출하여, 상기 균주 BD-62 에 대한 종 지정 P. 페오리아에로 확인하였다 (도 9 참고).
모든 3 개의 신규한 파에니바실러스 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의 P. 페오리아에에 대한 가까운 관계는, 99.8% 의 일치성 값을 산출한 P. 페오리아에 균주 BD-62 의 16S rRNA 서열과의 비교에 의해 확인하였다 (도 9 참고).
계통발생적 계통도의 구축을 위해 ARB 패키지의 작업 (Nucl. Ac-ids Res. 35, 7188-7196, 2007) 을 사용하였다: 진화 거리 값에 근거하여 계통발생적 트리를, Jukes and Cantor 의 교정을 사용하여 (Mol. Biol. Evol. 4, 406-425, 1987), 이웃-연결 방법에 의해 구축하였다 (Jukes, T. H. & Cantor C. R. (1969). Evolution of protein molecules. In Mammalian protein metabolism, pp. 21-132. Edited by H. N. Munro. New York: Academic press). 트리의 뿌리는 코넬라 테르모토레란스 (Cohnella thermotolerans) 의 16S rRNA 유전자 서열을 분석하는 것을 포함하여 결정하였다. 계통도 아래의 척도 막대는 100 개 뉴클레오티드 당 1 개 클레오티드 치환을 나타낸다. 결과를 도 10 에 제공한다.
상기 서열의 계통발생적 계통도 (도 10) 는 3 개의 신규한 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 가 서로에 대해 가장 가까우며, 이들 각각에 대해 알려진 가장 가까운 친척은 파에니바실러스 페오리아에 균주 NRRL BD 62 였다는 것을 보여준다.
실시예 2.2: RiboPrint-분석
표준화된, 자동화된 리보타이핑을 Qualicon RiboPrintersystem 을 사용하여 수행한다. RiboPrinter 시스템은 가닥-단독, 자동화된 기구 내에 리보타이핑을 위한 분자 프로세싱 단계를 조합한다. 상기 절차는 세포 용해, 제한 효소 EcoRI 로의 염색체 DNA 의 소화, 전기영동에 의한 절편의 분리, DNA 절편의 나일론 멤브레인으로의 이동, E. coli 의 rrnB 오페론으로부터 생성된 프로브에 대한 혼성화, rrn 오페론 서열을 함유하는 절편에 대한 프로브의 화학발광 검출, 이미지 검출 및 RiboPrint 패턴의 컴퓨터 분석을 포함한다 (Food Technology 50(1), 77-81, 1996; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5229-5233, 1995; Int. Journ. Syst. Bact. 44(3), 454-460, 1994).
리보타이핑은 제한 효소 EcoRI 을 사용하는 P. 페오리아에 균주 BD-62 와 비교한 신규한 파에니바실러스 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 로, DSMZ, Germany 에 의해 실행되었다. 산출 패턴은 RiboPrinter 시스템의 Software, integrated DuPont Identification Library 뿐 아니라 BioNumerics Software (Applied Maths, Belgium) 를 사용하여 비교하였다.
모든 3 개의 신규한 균주의 BD-62 에 대한 유사성은 0.24 내지 0.5 였다 (도 11). 3 개의 신규한 균주 그룹을 2 개의 그룹으로, 첫번째는 Lu17015 를 포함하는 반면, 두번째 그룹은 균주 Lu16774 및 Lu17007 을 포함한다. 신규한 균주 중 어느 것도 DuPont Identification Library 내의 임의의 균주에 대해 0.84 보다 큰 유사성을 갖지 않으며, 따라서 자동적으로 확인되지 않았다.
균주 BD-62 는 DuPont 식별 라이브러리의 번호 DUP-13142 에 기반하여 파에니바실러스 페오리아에로서 확인되었다 (파에니바실러스 페오리아에 DSM 8320 에 기반한 번호).
실시예 2.3: 형태학적 및 생리학적 특징분석
균주를 하기 문헌에 기재된 방법과 유사하게 DSMZ 에서 특징분석하였다 - Gordon, R.E., Haynes, W.C. & Pang. C.H.-N. (1973): The Genus Bacillus, Agriculture Handbook no. 427. Washington DC: US Department of Agriculture. 결과를 표 4 에 제시한다.
표 4: 본 발명의 파에니바실러스 균주의 특징분석 데이터 및 공지된 파에니바실러스 페오리아에 균주 NRRL BD-62 에 대한 비교.
Figure 112017021872046-pct00010
Figure 112017021872046-pct00011

DSMZ 에서 수행된 세포 지방산의 분석은 모든 균주가 파에니바실러스 종에 대한 전형적인 프로파일을 나타냈다는 것을 산출하였다.
이용가능한 유전학적, 생리학적 및 생물화학적 데이터를 사용하여, 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 가 파에니바실러스 속에 속한다는 것을 제시한다. 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 뿐 아니라 BD-62 가 글루코오스로부터 기체를 생성하므로, 이 중 어느 것도 파에니바실러스 자밀라에에 속하지 않는다.
파에니바실러스 페오리아에와 파에니바실러스 폴리믹사 사이의 표현형 차이는 주로 특정 기질로부터의 산 제조의 특징을 사용하여 가능하다 (Int. J. Syst. Bacteriol. 43(2), 388-390, 1993; In. J. Syst. Bacteriol. 46(6), 988-1003, 1996). 신규한 균주 중 어느 것도 표 4 에 요약된 이의 특징이 상기 2 가지 종 중 임의의 것에 완전히 부합되지는 않았지만, 이용가능한 유전학적, 생리학적 및 생물화학적 데이터의 합에서 종 파에니바실러스 페오리아에 및 P. 폴리믹사을 또는 파에니바실러스 페오리아에 및 P. 폴리믹사에 매우 가깝게 연관된 또다른 종을 가장 높게 가리킬 것 같다.
지금까지 기재된 다수의 파에니바실러스 종으로 인해, 표 4 로부터의 생리학적 및 형태학적 범주에 기반하여 시험된 3 개의 단리물의 올바른 분류학적 종을 측정하는 것이 불가능하다 (Rainer Borriss, Humboldt University Berlin, unpublished results).
그럼에도 불구하고, 상기 속 내에 종을 완전히 측정하는 것은 가능하지 않다. 가장 가깝게 관련된 종 및 균주는 16S rDNA 분석에 기반하여 파에니바실러스 페오리아에 BD-62 인 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 도 11 참고).
실시예 2.4: DnaN, GyrB, RecF, RecN 및 RpoA 를 코딩하는 유전자에 기반한 계통발생적 분석
DnaN, GyrB, RecF, RecN 및 RpoA 를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 완전한 게놈 서열로부터 또는 공개 데이터베이스로부터 추출하였다 (표 28 에 요약된 서열 목록).
일치성 표 (도 12 내지 16) 를 모든 서열을 모든 다른 서열과 정렬시키는 모든 접근법에 대해 모두 발생시켰다. 서열 정렬을 프로그램 바늘로 수행하였다 (EMBOSS package 6.6.0; Trends in Genetics 16 (6), 276?277). 사용되는 표준 파라미터 (갭 창출 10.0; 갭 확장 0.5). 일치성 점수를 임의의 갭을 고려하지 않고 정렬에 기반하여 계산한다.
계통발생적 트리 (도 17 내지 21) 에 대해, 복합 서열 정렬을 Clustal Omega 로 수행하였다 (version 1.2.0; Molecular Systems Biology 7: 539, doi:10.1038/msb.2011.75). 계통발생적 트리를 소프트웨어 Dnaml (Phylip 3.696 package 로 실행됨; Felsenstein 1981, http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html) 로 최대 가망도 방법에 의해 계산한다. 계통도는 2 의 전이 - 전환 비를 적용하면서 F84 거리 모델을 사용하여 성립되었다. 트리는 도구 Dendroscope (http://dendroscope.org/) 로 작성한다.
표 28: 파에니바실러스 균주의 dnaN, gyrB, recF, recN 및 rpoA DNA 서열의 서열 목록 참고.
Figure 112017021872046-pct00012
실시예 2.5: 코어 게놈 비교 및 AAI 매트릭스
게놈 비교는 Gießen 대학의 소프트웨어 패키지 EDGAR 을 사용하여 수행하였다 (BMC Bioinformatics 10, 154, 2009; (https://edgar.computational.bio.uni-giessen.de/cgi-bin/edgar.cgi). 코어 게놈, 완전한 게놈 서열에 기반한 계통발생적 계통도 및 AAI 매트릭스 값의 측정은 소프트웨어 패키지 EDGAR 을 사용하여 수행하였다. 결과를 도 22 에 제시한다.
실시예 3: 생체 내 시험을 위한 균주의 성장 (발효력)
온실 및 들판 시험을 위해, 파에니바실러스 균주를 먼저 ISP2 플레이트 (바로 사용 아가, BD [USA], 카탈로그 번호 277010) 상에서 성장시켰다. 이후, 액체 ISP2 배지를 함유하는 배플 (baffled) 진탕 플라스크에 아가 플레이트로부터의 콜로니를 접종하고, 5-7 일 동안 150 rpm 및 25℃ 에서 인큐베이션하였다. 시험에 따라, 전체 배양 브로쓰, 또는 원심분리되고 H2O-세척된 세포 펠렛, 또는 상청액을 식물에 적용하였다. 10L 발효기까지의 규모 상승이 가능하였다.
파에니바실러스 균주를 ISP2 액체 배지 (10g/L 맥아 추출물, 4 g/L Bacto 효모 추출물, 4 g/L 글루코오스 일수화물) 에서 6 일 동안 22℃ 및 150 rpm 에서 성장시켰다. 박테리아 성장을 나타내는 OD600nm 을 상이한 시점에 측정하였다.
표 5: 액체 ISP2 배지 중의 파에니바실러스 균주의 박테리아 성장.
Figure 112017021872046-pct00013

실시예 4 - 항진균성 활성을 위한 시험관 내 대립 어세이
식물 병원균에 대항하는 파에니바실러스 균주의 길항 활성을 시험관 내 대립 어세이에서 제시하였다. 사용된 식물병원성 진균은 스클레로티니아 스클레로티오룸 (Sclerotina sclerotiorum) (SCLSCL), 보트리티스 시네레아 (BOTRCI), 알테나리아 sp. (ALTESP) 및 파이토프토라 인페스탄스 (PHYTIN) 이다.
BOTRCI, ALTESP, SCLSCL 에 대한 성장 배지로서, 리터 당: 10 g 맥아 추출물 (Sigma Aldrich, 70167); 4 g Bacto 효모 추출물 (Becton Dickinson, 212750); 4 g 글루코오스 일수화물 (Sigma Aldrich, 16301); 20 g Agar (Becton Dickinson, 214510), pH 약 7, Aq. bidest 를 포함하는 ISP2 배지가 사용된다. PHYTIN 에 대한 성장 배지로서, 리터 당: 200 ml 의 야채 쥬스, 3 g 탄산칼슘 (Merck Millipore, 1020660250); 30 g Agar (Becton Dickinson, 214510), pH 6.8, Aq. bidest 를 포함하는 V8 배지가 사용된다.
파에니바실러스 균주를 아가 플레이트의 하나의 면 상에 지점-접종한다. 하나의 활성적으로 성장하는 식물 병원균을 함유하는 아가 블록 (대략 0.3 cm²) 을 플레이트 중심에 넣는다. 7-14 일 동안 약 25℃ 에서 접종 후, 특히 억제 구역에 대해, 식물 병원균의 성장을 평가한다.
이후, 아가 플레이트를 ℃ 에서 약 7-14 일 동안 인큐베이션 후 평가한다. 항생작용은 무-진균 구역 (억제 구역) 의 직경 평가에 의해 점수를 매긴다. 대조군 플레이트에 비해 박테리아 균주가 있는 플레이트 상에서 진균 병원균의 성장 직경을 비교함으로써 경쟁의 점수를 매긴다. 박테리아가 진균 병원균보다 및 또한 기생균류가 병원균보다 과성장하는 경우 균기생이 기록될 수 있다. 이것을 현미경으로 시각화할 수 있다.
신규한 파에니바실러스 균주는 모든 시험된 식물 병원균에 대항하는 항진균성 활성을 나타냈다.
표 6: 시험관 내 대립 어세이 결과.
Figure 112017021872046-pct00014

실시예 5 - 식물 병원균성 진균에 대항하는 활성에 대한 온실 시험
사용예 5.1: 보호성 적용으로의 파이토프토라 인페스탄스에 의해 야기되는 토마토 상의 잎마름병에 대항하는 활성
시판되는 어린 토마토 모종 ("Goldene Konigin") 을 기재된 온실 시험을 위해 사용하였다. 처리 당 2 개의 복제본 (각 1 개의 식물로의 화분) 을 사용하였다. 식물을 시판되는 성분 (Universal, Floragard) 상에 대략 22 ℃ 의 온실에서 성장시켰다. 습도를 특수 장치를 사용하여 통제하였다 (~90% 습도). 식물에 분무 캐비넷을 사용하여 각각의 파에니바실러스 균주의 6 일 배양물 (설정에 따라 다름) 의 미정제/전체 배양 브로쓰를 유출 분무하였다. 균주에 대한 배양 조건은 실시예 3 에 기재한다. 적용 1 일 후 처리된 식물을 파이토프토라 인페스탄스 (PHYTIN) 의 포자낭 현탁액으로 접종하였다. 접종 후, 시험 식물을 즉시 습윤 챔버로 옮겼다. 접종 후 5 내지 7 일에 잎 상의 진균 공격 범위를 시각적으로 평가하였다. 미처리된 대조군에서의 진균 공격은 80-100% 였고 비교를 위해 100% 로 설정하였다.
표 7:
Figure 112017021872046-pct00015

사용예 5.2: 보호성 적용으로의 보트리티스 시네레아에 의해 야기되는 고추 상의 회색 곰팡이에 대항하는 활성
시판되는 어린 고추 모종 ("Neusiedler Ideal") 을 기재된 온실 시험을 위해 사용하였다. 처리 당 2 개의 복제본 (각 1 개의 식물로의 화분) 을 사용하였다. 식물을 시판되는 성분 (Universal, Floragard) 상에 대략 22 ℃ 의 온실에서 성장시켰다. 습도를 특수 장치를 사용하여 통제하였다 (~90% 습도). 식물에 분무 캐비넷을 사용하여 각각의 파에니바실러스 균주의 6 일 배양물 (설정에 따라 다름) 의 미정제 배양 브로쓰를 유출 분무하였다. 균주에 대한 배양 조건은 실시예 3 에 기재한다. 적용 1 일 후 처리된 식물을 보트리티스 시네레아 (BOTRCI) 의 포자 현탁액으로 접종하였다. 접종 후, 시험 식물을 즉시 습윤 챔버로 옮겼다. 접종 후 5 내지 7 일에 잎 상의 진균 공격 범위를 시각적으로 평가하였다. 미처리된 대조군에서의 진균 공격은 80-100% 였고 비교를 위해 100% 로 설정하였다.
표 8:
Figure 112017021872046-pct00016

사용예 5.3: 보호성 적용으로의 알테나리아 솔라니에 의해 야기되는 토마토 상의 반점병에 대항하는 활성
시판되는 어린 토마토 모종 ("Goldene Konigin") 을 기재된 온실 시험을 위해 사용하였다. 처리 당 2 개의 복제본 (각 1 개의 식물로의 화분) 을 사용하였다. 식물을 시판되는 성분 (Universal, Floragard) 상에 대략 22 ℃ 의 온실에서 성장시켰다. 습도를 특수 장치를 사용하여 통제하였다 (~90% 습도). 식물에 분무 캐비넷을 사용하여 각각의 파에니바실러스 균주의 6 일 배양물 (설정에 따라 다름) 의 미정제/전체 배양 브로쓰를 유출 분무하였다. 균주에 대한 배양 조건은 실시예 3 에 기재한다. 적용 1 일 후 처리된 식물을 알테나리아 솔라니 (ALTESO) 의 포자 현탁액으로 접종하였다. 접종 후, 시험 식물을 즉시 습윤 챔버로 옮겼다. 접종 후 5 내지 7 일에 잎 상의 진균 공격 범위를 시각적으로 평가하였다. 미처리된 대조군에서의 진균 공격은 80-100% 였고 비교를 위해 100% 로 설정하였다.
표 9:
Figure 112017021872046-pct00017

사용예 5.4: 보호성 적용으로의 파코프소라 파키리지 (Phakopsora pachyrhizi) 에 의해 야기되는 대두 상의 대두 녹병에 대항하는 활성
시판되는 어린 대두 모종 ("Mentor") 을 기재된 온실 시험을 위해 사용하였다. 처리 당 2 개의 복제본 (각 1 개의 식물로의 화분) 을 사용하였다. 식물을 시판되는 성분 (Universal, Floragard) 상에 대략 22 ℃ 의 온실에서 성장시켰다. 습도를 특수 장치를 사용하여 통제하였다 (~90% 습도). 식물에 분무 캐비넷을 사용하여 각각의 파에니바실러스 종의 2 내지 6 일 배양물 (설정에 따라 다름) 의 미정제 배양 브로쓰를 유출 분무하였다. 적용 1 일 후 처리된 식물을 파코프소라 파키리지 (PHAKPA) 의 포자 현탁액으로 접종하였다. 접종 후, 시험 식물을 즉시 습윤 챔버로 옮겼다. 접종 후 5 내지 7 일에 잎 상의 진균 공격 범위를 시각적으로 평가하였다.
사용예 5.5: 보호성 적용으로의 푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum) 에 의해 야기되는 밀 상의 푸사리움 적매병에 대항하는 활성
시판되는 어린 밀 모종을 기재된 온실 시험을 위해 사용하였다. 처리 당 2 개의 복제본 (각 1 개의 식물로의 화분) 을 사용하였다. 식물을 시판되는 성분 (Universal, Floragard) 상에 대략 22 ℃ 의 온실에서 성장시켰다. 습도를 특수 장치를 사용하여 통제하였다 (~90% 습도). 식물에 분무 캐비넷을 사용하여 각각의 파에니바실러스 종의 2 내지 6 일 배양물 (설정에 따라 다름) 의 미정제 배양 브로쓰를 유출 분무하였다. 배양 조건은 실시예 3 에 기재한다. 적용 1 일 후 처리된 식물을 푸사리움 그라미네아룸 (GIBBZE) 의 포자 현탁액으로 접종하였다. 접종 후, 시험 식물을 즉시 습윤 챔버로 옮겼다. 접종 후 5 내지 7 일에 잎 상의 진균 공격 범위를 시각적으로 평가하였다.
사용예 5.6: 보호성 적용으로의 셉토리아 트리티시 (Septoria tritici) 에 의해 야기되는 밀 상의 반점 잎 마름병에 대항하는 활성
시판되는 어린 밀 모종을 기재된 온실 시험을 위해 사용하였다. 처리 당 2 개의 복제본 (각 1 개의 식물로의 화분) 을 사용하였다. 식물을 시판되는 성분 (Universal, Floragard) 상에 대략 22 ℃ 의 온실에서 성장시켰다. 습도를 특수 장치를 사용하여 통제하였다 (~90% 습도). 식물에 분무 캐비넷을 사용하여 각각의 파에니바실러스 종의 2 내지 6 일 배양물 (설정에 따라 다름) 의 미정제 배양 브로쓰를 유출 분무하였다. 배양 조건은 실시예 3 에 기재한다. 적용 1 일 후 처리된 식물을 셉토리아 트리티시 (SEPTTR) 의 포자 현탁액으로 접종하였다. 접종 후, 시험 식물을 즉시 습윤 챔버로 옮겼다. 접종 후 21 내지 28 일에 잎 상의 진균 공격 범위를 시각적으로 평가하였다.
사용예 5.7: 보호성 적용으로의 다양한 병원균에 대항하는 파에니바실러스 세포 및 상청액의 활성
파에니바실러스 균주 Lu17007 의 6 일 배양물로부터의 전체 배양 브로쓰를 사용예 3 에 따라 수득하고, 사용예 5.1 내지 5.3 의 실험 설정에서와 같이 사용하였다. 대안적으로, 이러한 전체 배양 브로쓰를 0.2 μm 공극 크기의 필터를 통해 여과하여, 배양 배지 및 미정제 세포 분획을 수득하였다. 미정제 세포 분획은 포스페이트-완충 식염수의 본래 부피로 3 회 추가로 세척하여 세척된 세포를 수득할 수 있을 것이다.
온실 시험을 각각의 병원균 파이토프토라 인페스탄스, 보트리티스 시네레아 및 알테나리아 솔라니에 대해 상기 사용예 5.1, 5.2 및 5.3 에 기재된 바와 같이 수행하였다. 접종 후 5 내지 7 일에 잎 상의 진균 공격 범위를 시각적으로 평가하였다. 미처리된 대조군에서의 진균 공격은 80-100% 였고 비교를 위해 100% 로 설정하였다.
표 10:
Figure 112017021872046-pct00018

실시예 6 - 효소 시험
사용예 6.1: 키티나아제
키티나아제 시험 고체 배지:
2 g/l NaNO3, 1g/l K2HPO4, 0.5 g/l MgSO4, 0.5 g/l KCl, 0.2 g/l 펩톤, 15 g/l 아가, 10 g/l 게 껍데기로부터의 키틴 (Sigma-Aldrich C7170).
시험 고체 배지를 오토클레이브하고, 9 cm 페트리 디쉬 내에 채웠다. 파에니바실러스 균주를 플레이트의 중심에 접종하고, 2 일 동안 27℃ 에서 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 1:3 희석된 Lugol 용액 (Carl Roth N052.2) 으로 5 내지 10 분 동안 염색하였다. Lugol 용액을 붓고, 플레이트의 사진을 찍고 평가하였다. 상이한 균주의 성장은 5-10 mm 를 넘지 않았다. 비-염색된 구역 (키티나아제 활성과 연관됨) 은 0 mm (활성 없음; 표 11 의 "-") 에서 수 cm (표 11 의 "+") 로 가변되었다.
사용예 6.2: 셀룰라아제
셀룰라아제 시험 고체 배지:
2 g/l NaNO3, 1g/l K2HPO4, 0.5 g/l MgSO4, 0.5 g/l KCl, 0.2 g/l 펩톤, 15 g/l 아가, 카르복시메틸 셀룰로오스, 나트륨 염 (Sigma-Aldrich 419273).
배지를 오토클레이브하고, 9 cm 페트리 디쉬 내에 부었다. 파에니바실러스 균주를 플레이트의 중심에 접종하고, 2 일 동안 27℃ 에서 인큐베이션하였다. 접종 후, 플레이트를 1:3 희석된 Lugol 용액 (Carl Roth N052.2) 으로 5 내지 10 분 동안 염색하였다. Lugol 용액을 붓고, 플레이트의 사진을 찍었다.
사용예 6.3: 아밀라아제
아밀라아제 시험 고체 배지:
2 g/l NaNO3, 1g/l K2HPO4, 0.5 g/l MgSO4, 0.5 g/l KCl, 0.2 g/l 펩톤, 15 g/l 아가, 10 g/l 가용 전분 (Merck 1.01252).
배지를 오토클레이브하고, 9 cm 페트리 디쉬 내에 부었다. 파에니바실러스 균주를 플레이트의 중심에 접종하고, 2 일 동안 27℃ 에서 인큐베이션하였다. 접종 후, 플레이트를 1:3 희석된 Lugol 용액 (Carl Roth N052.2) 으로 5 내지 10 분 동안 염색하였다. Lugol 용액을 붓고, 플레이트의 사진을 찍었다.
표 11: 파에니바실러스 균주의 키티나아제, 셀룰로오스 및 아밀라아제 활성.
Figure 112017021872046-pct00019

실시예 7 - 파에니바실러스 균주로부터 수득되는 푸사리시딘-유형 대사물질
실시예 7.1: 박테리아 단리물의 대규모 배양 및 푸사리시딘-유형 대사물질의 추출
a) 배양
파에니바실러스 균주를 GYM 배지 (10 g/l 글루코오스, 4 g/l 효모 추출물, 10 g/l 맥아 추출물; pH 5.5, 오토클레이브 전 조정됨) 및 20 g/l 아가를 함유하는 아가 플레이트 상에서 배양하였다. 배양을 10 내지 20 일 동안 실온에서 수행하였다. 유지를 위해 동일한 배지로의 아가 슬란트 (slant) 를 사용하고 4℃ 에 저장하였다.
소규모 액체 배양물 (500 ml 플라스크 내 250 ml GYM 배지) 에 잘 성장된 아가 배양물의 4-5 개 조각을 접종하고, 120 rpm 및 실온 (20-23℃) 에서 궤도 진탕기에서 배양하였다.
대규모 발효를 250 ml 잘 성장된 액체 배양물로 접종된 15 l GYM 배지 (포말 형성 때문에 발효기의 총 용량이 사용되지 않았다) 가 있는 20 l 발효기에서 수행하였고, 발효를 5 내지 8 일 동안 진탕 (120 rpm) 및 통기 (3 l/분) 와 함께 실온 (20-23℃) 에서 실시하였다.
b) 추출
1 동일한 부피의 이소프로판올을 전체 배양 브로쓰 (액체 배양물로부터의 바이오매스의 분리가 수행되지 않았음) 에 첨가하였다. 2 내지 16 시간 동안의 진탕 및 접종 후, 유기 및 수성 상의 상 분리가 가시화될 때까지 통상의 식염 (염화나트륨 - 100 내지 200 g/l) 을 혼합물에 첨가하였다.
이소프로판올 상을 진공에서 농축하였다. 잔류 추출물 (여전히 다량의 염을 함유함) 을 메탄올에 용해하고, 염 잔류물의 더 나은 침전을 위해 원심분리하고, 유기상을 다시 농축하였다. 염 침전이 더이상 존재하지 않을 때까지 이 단계를 반복하였다.
c) 정제
i) 실리카 겔 크로마토그래피
30 그램의 추출물을 메탄올에 용해시키고, 50 g 실리카 겔 (Merck, K60, 70-230 메쉬) 에 결합시키고, 40℃ 에서 건조시키고, 1 kg 의 실리카 겔 상에 층화시켰다 (컬럼 10 cm 직경, 30 cm 높이 대략).
용리를 하기와 같은 4 단계로 수행하였다:
단계 1- 4 l 에틸 아세테이트
단계 2- 4 l 에틸 아세테이트:메탄올 (3:1, v/v)
단계 3- 7 l 에틸 아세테이트:메탄올 (1:1, v/v)
단계 4- 4 l 메탄올
활성 화합물을 함유하는 세번째 분획 (중간체 1) 을 진공에서 건조시키고, 0.1% 포름산 (FA) (농도: 100 mg/ml) 중의 40 % 메탄올 (MeOH) 에 용해시켰다. 다른 분획을 폐기하였다.
ii) Chromabond HR-X 분획화
20 ml 의 중간체 1 을 미리 평형화된 (0.1 % FA 중의 40 % MeOH 함유) Chromabond HR-X 카트리지 (Macherey-Nagel, 1000 mg, ref 730941) 상에 로딩하였다. 카트리지를 0.1 % FA 중의 100 ml 40% MeOH 로 세척하고, 0.1 % FA 중의 60 ml 70% MeOH 로 용리하였다. 상기 중간체 1-1 을 이후 진공에서 건조시켰다.
iii) Sunfire C18 컬럼 상의 분취용 HPLC
중간체 1-1 을 DMSO (농도: 200 mg/ml) 에 용해하고, 300 μl 의 중간체 1-1 을 하기와 같이 Sunfire C18 컬럼 (19 x 250 mm, 5 μm, Waters) 상에 크로마토그래피하였다:
10 ml/분으로 16 분, 등용매 70% 0.2 FA; 30% 아세토니트릴 (ACN),
14 ml/분으로 1 분, 65% 0.2% FA 로의 구배; 35% ACN,
14 ml/분으로 5 분, 등용매 65% 0.2% FA; 35% ACN.
5 개의 분획을 검출할 수 있다. 모든 5 개의 산출 분획을 진공 하에서 건조시키고 DMSO (농도: 125 mg/ml) 에 용해하였다. 동일한 컬럼 및 매 분획에 대해 조정된 (실행 당 12.5 mg) 등용매 조건 (흐름: 10.5 ml/분) 을 사용하여 추가의 정제를 수행하였다:
분획 1: 69% 0.2 FA; 31% ACN; 2 개의 피크 검출됨 (1-1 및 1-2)
분획 2: 69% 0.2 FA; 31% ACN; 2 개의 피크 검출됨 (2-1 및 2-2)
분획 3: 69% 0.2 FA; 31% ACN; 3 개의 피크 검출됨 (3-1, 3-2 및 3-3)
분획 4/5: 67% 0.2 FA; 33% ACN; 1 개의 피크 검출됨 (4/5)
분획 6: 65% 0.2 FA; 35% ACN; 2 개의 피크 검출됨 (6-1 및 6-2)
하기 샘플의 순도 및 양은 NMR 분석 및 구조 해석에 대해 충분하였다: 피크 1-2, 2-1, 3-2, 4/5 및 6-1.
실시예 7.2: 신규한 화합물 1A 및 1B 의 구조 해석
분획 2 의 피크 2-1 로부터, 화합물 1A 및 1B 의 혼합물 (비 약 3:7) 을 갈색 오일 ([α]D25 = +20.9 (c = 0.6, DMSO-d6)) 로서 수득하였다.
주요 성분인, 화합물 1B 의 분자식 C47H78N10O12 는 m/z 975.5863 [M+H]+; ESI-MS: 975.6 (100%, [M+H]+), 488.4 (51%, [M+2H]2+) 에서 피크를 산출하는 HR-ESI-MS 스펙트럼으로부터 유츄되었다.
게다가, 혼합물이 또한 부차 성분으로서, 더 가벼운 상동체 1A 를 함유하였고, 두 화합물 사이의 질량 차이는 14 amu 였다. 상기 관찰은 m/z 961.6 에서 ESI-MS 스펙트럼에서 관찰된 두번째 피크에 의해 지지되었다.
NMR 스펙트럼 (표 12) 은 δ 6.83 내지 8.58 의 교환가능한 양성자의 신호 외에, δ 166.0-174.5 의 범위의 카르보닐의 공명 및 펩티드에 대한 표시인 δ 47.8 내지 δ 60.4 의 메틴 신호를 포함하였다.
화합물 1B 의 1D- 및 2D-NMR 데이터의 광범위한 분석은 티로신 (Tyr), 글루타민 (Gln), 알라닌 (Ala), 2 개의 트레오닌 (Thr1 및 Thr2) 및 이소류신 (Ile) 을 포함하는 6 개의 아미노산의 존재를 밝혔다. 이들의 서열은 아미드 형성을 가로질러 2 개 또는 3 개의 결합 관련성을 사용하여 밝혀졌다. 따라서, COSY, NOESY (도 2) 및 HMBC (도 3) 스펙트럼은 δ 3.84 에서 Thr2 의 메틴 양성자 및 Tyr 의 δ 166.7 에서의 카르보닐의 신호에 대한 δ 8.58 에서 Thr2 의 질소-양성자로부터의 관련성을 묘사한 반면, 동일한 관련성이 δ 8.52 에서 Tyr 의 질소-양성자와 δ 2.60 에서 Tyr 의 메틸렌 양성자 및 Ile 의 δ 170.4 에서의 카르보닐의 신호 사이에서 명시되었다. 게다가, δ 4.16 에서 Ile 의 메틴 수소는 δ 170.4 에서 Ile 의 카르보닐 신호와 강한 관련성 및 δ 168.6 에서 Thr1 의 것과 약한 접촉을 가졌고; Thr1 의 δ 5.30 에서 β-메틴 양성자의 신호는 Ala 의 δ 170.4 에서 카르보닐 신호와 관련성이 있었다. 상기 언급된 관련성에 부가적으로, 다른 것은 동일한 아미노산의 δ 4.20 에서 메틴 양성자에 대해 Ala 의 δ 7.27 에서 N-양성자로부터 나타내지는 반면, 상기 마지막 양성자는 이의 아미노의 카르보닐 및 Gln 의 하나와 동일한 상호작용을 가졌다. 게다가, 교차 피크는 Gln 의 δ 8.20 에서의 교환가능한 양성자로부터 Gln 의 δ 3.87 에서의 메틴 수소 및 δ 170.6 에서의 Thr2 의 카르보닐까지 밝혀졌고; 이들 상기 언급된 데이터는 화합물 1B 에 대한 시클로뎁시펩티드 구조를 암시하였다.
상기 시클로뎁시펩티드 1B 는 Thr1 에 부착된 말단 구아디닌 β-히드록시 지방산을 함유하는데, 핵심 관련성이 δ 4.39 에서 이의 α-메틴 양성자의 신호와 δ 171.9 에서 카르보닐의 공명 사이에서 관찰되고; δ 171.9 에서의 카르보닐로부터 δ 2.35 에서 α-메틸렌 양성자 및 δ 3.77 에서 β-메틴 양성자까지의 HMBC 접촉뿐 아니라, δ 3.03 에서 메틸렌 양성자 및 δ 157.2 에서 구아니딘 탄소 사이에서도 추가로 관찰되었다. 측쇄는 m/z 256.2 에서 모체 [M+H]+ 이온의 APCI-MS-MS 스펙트럼에서 관찰된 분획 이온에 근거하여 β-히드록시와 구아니딘 기 사이에 12 개의 메틸렌 기를 함유하는 것으로 추론되었다. 마찬가지로, 상기 스펙트럼은 아미노산의 연결 서열을 확인하고 도 1 에 제시된 바와 같은 화합물 1B 의 구조 해석을 도출하는 정보 (도 4b) 를 제공하였다.
1D- 및 2D-스펙트럼에서의 2.80, 2.52/36.3 에서 CH2 기의 신호는 가정적으로 화합물 1A 중의 아스파라긴 (Asn) 의 β-CH2 기에 상응하였다. 상기 결론은 m/z 961.6 에서 모체 피크의 MS/MS 로부터 수득된 (도 4a) 분획과 연관하여 보고된 데이터 (Heterocycles 53, 1533-1549, 2000) 에 의해 지지되었다. 마찬가지로, 상기 분석은 두 화합물에서 아미노산의 연결 서열을 확인하고 도 1 에 제시된 바와 같은 화합물 1A 및 1B 의 구조 해석을 도출하는 정보 (도 4a, 4b) 를 제공하였다.
실시예 7.3: 푸사리시딘 C 및 D 로서의 화합물 2A 및 2B 의 구조적 확인
분획 1 의 피크 1-2 로부터, 화합물 2A 및 2B 의 혼합물 (비 약 1:1) 을 갈색 오일로서 수득하였다. 더 무거운 성분인, 화합물 2B 의 분자식은, 저해상도 질량 분석에 기반하여 C46H76N10O12 인 것으로 측정되었다. NMR 데이터 (표 13) 의 분석은 화합물 2B 를 푸사리시딘 D 로서 확인하는 것을 허용하였다. 혼합물의 더 가벼운 성분인, 화합물 2A 가 마찬가지로, 푸사리시딘 C 로서 확인디었고, 여기서 푸사리시딘 C 의 Gln 잔기가 Asn 로 대체된다.
화합물 2B 및 2A, 각각에 대해 m/z 961.6 및 947.6 의 모체 이온의 질량 분광 단편화 패턴 (도. 5a, 5b) 은 화합물 1B 로서 확인되는 치환된 지방산 측쇄의 길이를 확인하였다. 푸사리시딘 C 및 D 는 이전에 Kajimura et al. 에 의해 보고되었다 (J. Antibiot. 50, 220-228, 1997).
실시예 7.4: 화합물 3 의 LI-F08b 로서의 구조적 확인
분획 6 의 피크 6-1 로부터, 화합물 3 을 갈색 오일로서 단리하였고, 이의 낮은 해상도가 m/z 925.6 [M+H]+ 에서 피크를 나타내었고 이것을, NMR 데이터 (표 14) 와 조합하여, 분자식 C44H80N10O11 을 산출하였다. 화합물 3 은 방향족 신호의 존재를 제외하고는, 화합물 1B 및 화합물 2B (푸사리시딘 D) 와 NMR 스펙트럼에서 유사한 특징을 나타냈다 (표 14). 따라서, 펩티드의 특징적인 공명이 관찰되었다, 즉 δ 6.89 내지 8.49 사이의 질소에 부착된 양성자의 10 개의 신호, δ 168.1 내지 174.3 사이의 범위의 카르보닐의 8 개의 공명, 및 N 메틴의 6 개의 신호가 δ 48.0 내지 59.5 사이에 포함되었다. HMQC, COSY 및 TOCSY 스펙트럼의 상세한 분석은 Gln, Thr 의 2 개의 단위, Ile 및 Ala 의 2 개의 단위를 포함하는 6 개의 아미노산의 존재를 밝혀냈다. 게다가, 상기 스펙트럼은 화합물 1A, 1B 및 푸사리시딘 C (2A) 및 D (2B) 에서와 같이 말단 구아니딘으로의 동일한 β-히드록실 지방산에 기여가능한 화학적 편이를 보여주었다. 상기 측쇄의 위치는 Thr1 의 δ 4.44 에서의 N 메틴의 양성자 신호와 지방산의 δ 172.1 에서의 카르보닐 신호 사이의 HMBC 스펙트럼에 대해 발견되는 긴 범위 상호관계에 기반하여 측정되었다. 아미노산의 서열은 NOESY 상호작용 및 단편화 패턴으로부터 유추되었다 (도 6).
NMR 데이터 (표 14) 및 질량 분석의 조합은 대사물질 화합물 3 을 LI-F08b (본원에서 또한 푸사리시딘 LI-F08b 로 불림, Kuroda et al. 에 의해 처음 보고됨 (Heterocycles 53, 1533-1549, 2000)) 로서 확인을 도출하였다.
실시예 7.5: LI-F06a 및 LI-F06b 로서 화합물 4A 및 4B 및 푸사리시딘 A 및 B 로서 화합물 5A 및 5B 각각의 구조적 확인
분획 4/5 의 피크 4/5 로부터, 2 개의 추가의 대사물질, 화합물 4A 및 4B 의 혼합물 (비 약 1:3) 을 ESI-MS 스펙트럼에서 m/z 897.5 (4A) 및 911.6 (4B) 에서의 2 개의 피크를 제공하는 것으로 관찰하여, 2 개의 추가의 상동 시클로뎁시펩티드를 암시하였다. 펩티드에 대한 공명 표시가 이들의 NMR 스펙트럼 (표 15) 뿐 아니라 구아니딘 기에서 끝나는 β-히드록실 지방산의 것에서 관찰되었다. 화합물 4A 및 4B 에 대해 발견된 2 개의 모체 이온의 단편화 패턴 (도 7a, 7b) 은 아미노산의 서열을 측정하고 LI-F06a (4A) 및 LI-F06b (4B) 각각의 혼합물의 구성성분을 확인하는 것을 가능하게 하였다.
분획 3 의 피크 3-2 로부터 수득된, 화학식 5A 및 5B 의 혼합물 (비 약 1:3) 을 동일한 방식으로 분석하였다. 혼합물의 ESI 질량 스펙트럼은 m/z 883.6 (5A) 및 897.5 (5B) 에서 2 개의 피크 및 상기 모체 이온의 단편화 패턴 (도 8a, 8b) 을 보여주었고, NMR 데이터 (표 16) 와 함께 상기 성분을 푸사리시딘 A (5A) 및 푸사리시딘 B (5B) 로서 확인하는 것을 가능하게 하였다. 4A, 4B, 5A 및 5B 에 대해 밝혀진 데이터는 이전에 보고된 것들과 부합하였다 (J. Antibiot. 50, 220?228, 1997; Heterocycles 53, 1533-1549, 2000).
표 12. 화합물 1A 및 1B 의 1H (DMSO-d6, 600 MHz) 및 13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz) 데이터.
Figure 112017021872046-pct00020
Figure 112017021872046-pct00021

표 13. 화합물 2A ?? 2B 의 1H (DMSO-d6, 600 MHz) 및 13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz) 데이터.
Figure 112017021872046-pct00022
Figure 112017021872046-pct00023

표 14. LI-F08b 인 화합물 3 의 1H (DMSO-d6, 600 MHz) 및 13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz) 데이터.
Figure 112017021872046-pct00024
Figure 112017021872046-pct00025
Figure 112017021872046-pct00026
표 15. 화합물 4A 및 4B 의 1H (DMSO-d6, 600 MHz) 및 13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz) 데이터.
Figure 112017021872046-pct00027
Figure 112017021872046-pct00028

표 16. 화합물 5A 및 5B 의 1H (DMSO-d6, 600 MHz) 및 13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz) 데이터.
Figure 112017021872046-pct00029
Figure 112017021872046-pct00030
구성 아미노산의 배열을 확인하기 위한 가수분해 실험은 실시하지 않았다.
실시예 8 - 파에니바실러스 균주에 의해 제조되는 대사물질
실시예 8.1: 파에니바실러스 균주에 의한 대사물질의 제조
일반적으로 푸사리시딘 및 특히 공지된 푸사리시딘 A, B, C, D, LI-F06a, LI-F06b 및 LI-F08b 뿐 아니라 신규한 푸사리시딘-유형 화합물 1A 및 1B 의 존재를 상기 실시예 7.1 에 기재된 절차 단계에 따라 파에니바실러스 균주로부터 측정하였다.
표 17: 파에니바실러스 균주의 푸사리시딘-유형 대사물질 제조.
Figure 112017021872046-pct00031

모든 신규한 파에니바실러스 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의 전체 배양 브로쓰는 실시예 7 에서 확인된 적어도 하나의 푸사리시딘-유형 대사물질을 함유하였다 (표 17). 상기 푸사리시딘-유형 대사물질 중 어느 것도 P. 페오리아에 균주 BD-62 의 전체 배양 브로쓰에서 검출되지 않았다.
신규한 파에니바실러스 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의 전체 배양 브로쓰 모두는 신규한 푸사리시딘-유형 화합물 1A 및 1B 를 함유하였다. 추가로, 신규한 파에니바실러스 균주 Lu16774, Lu17007 및 Lu17015 의 전체 배양 브로쓰 모두는 푸사리시딘 A, B, C 및 D 뿐 아니라 LI-F08b 를 함유하였다. 부가적으로, 신규한 파에니바실러스 균주 Lu17007 및 Lu17015 의 전체 배양 브로쓰는 푸사리시딘 LI-F06a 및 LI-F06b 를 함유하였다.
화합물 1A 및 1B 는 가깝게 관련된 P. 페오리아에 균주 BD-62 의 전체 배양 브로쓰에서 검출되지 않았다. 푸사리시딘 A, B, C 및 D, LI-F06a, LI-F06b 및 LI-F08b 는 또한 P. 페오리아에 균주 BD-62 의 전체 배양 브로쓰 내에 없었다.
실시예 9: 다양한 진균 병원균에 대항하는 파에니바실러스 균주에 의한 대사물질의 활성
화합물 1A 및 1B, 푸사리시딘 A, B 및 D 가 수득되었고, 하기 실험에서 사용되었다.
진균 성장 어세이를 병원균 보트리티스 시네레아 (BOTRCI, YBA 중 [10 g Bacto 펩톤 (Becton Dickinson 211677), 10 g 효모 추출물 (Becton Dickinson 212750),20 g 나트륨 아세테이트, ad 1000 mL aqua bidest] 또는 알테나리아 솔라니 (ALTESO, YBG 중 [10g Bacto peptone (Becton Dickinson 211677), 10 g 효모 추출물 (Becton Dickinson 212750),20 g 글리세린 99%, ad 1000 mL aqua bidest]) 의 포자 현탁액으로 96 웰 플레이트에서 수행하였다. 푸사리시딘 및 화합물 1A 및 1B 를 DMSO 에 용해하고 희석하였다. 60 μM 에서 0.3 μM 까지의 범위의 상이한 농도를 마이크로티터 플레이트 내에 파이펫팅하였다. 104 포자/ml 의 수성 현탁액을 첨가하였다. 플레이트를 약 18℃ 에서 인큐베이션하였다. 포자 접종 후 3 및 7 일에 마이크로플레이트 판독기에서 600 nm 에서 광학 밀도를 측정함으로써 진균 성장을 측정하고 미처리된 대조군 (DMSO) 과 비교하였다. IC50 (진균 성장의 50% 억제에 필요한 각각의 대사물질의 농도 [μM]) 을 이하 측정하였다.
특히, 화합물 1A 및 1B 는 0.4-0.6 μM 의 IC50 값으로 최고 항진균성 효능을 보였다 (표 18).
표 18. 파에니바실러스 대사물질 IC50 값의 항진균성 성장 억제
Figure 112017021872046-pct00032

부가적으로, 온실 시험을 각각의 병원균 보트리티스 시네레아 (BOTRCI), 알테나리아 솔라니 (ALTESO), 파이토프토라 인페스탄스 (PHYTIN), 파코프소라 파키리지 (PHAKPA) 및 푸사리움 그라미네아룸 (GIBBZE) 에 대해 상기 사용예 5.1 내지 5.5 에 기재된 바와 같이 화합물 1A 및 1B 로 수행하였다. 접종 후 5 내지 7 일에 잎 상의 진균 공격 범위를 시각적으로 평가하였다.
특히, 화합물 1A 및 1B 는 작물 상에 중요한 진균 질병을 방제하는데 7.2 ppm 정도의 낮은 용량 수준에서도 이미 유효하였고, 푸사리시딘 A, B 및 D 보다 높은 항진균성 효과를 보였다 (표 19 내지 21).
표 19. 식물에서 측정된 대사물질의 항진균성 효율.
Figure 112017021872046-pct00033

표 20. 보호성 적용으로의 파이토프토라 인페스탄스에 의해 야기되는 토마토 상의 잎마름병에 대항하는 대사물질의 효율.
Figure 112017021872046-pct00034

표 21. 보호성 적용으로의 푸사리움 그라미네아룸에 의해 야기되는 밀 상의 이삭 마름병에 대항하는 대사물질의 효율.
Figure 112017021872046-pct00035

표 22. 보호성 적용으로의 셉토리아 트리티시에 의해 야기되는 밀 상의 이삭 마름병에 대항하는 대사물질의 효율.
Figure 112017021872046-pct00036

실시예 10: 온실 실험에서 다양한 병원균에 대항하는 파에니바실러스 폴리믹사 nov. ssp. 플란타룸 M-1 와 본 발명에 따른 파에니바실러스 폴리믹사 nov. ssp. 플란타룸 균주 Lu16674 및 Lu17007 의 활성 비교
파에니바실러스 균주 Lu17007, Lu16674 및 M1 의 6 일 배양물로부터의 전체 배양 브로쓰를 사용예 3 에 따라 수득하였고, 사용예 5.1 내지 5.5 의 실험 설정에서와 같이 사용하였다. 온실 시험을 각각의 병원균에 대해 상기 사용예 5.1 내지 5.5 에 기재된 바와 같이 수행하였다. 접종 후 5 내지 7 일에 잎 상의 진균 공격 범위를 시각적으로 평가하였다.
특히, 파에니바실러스 균주 Lu16774 및 Lu17007 은 심지어 높은 희석 인자에서도 작물 상에 중요한 진균 질병을 방제하는데 유효하였고, 가깝게 관련된 균주 M-1 보다 높은 항진균성 효과를 보였다 (표 22 내지 27).
표 22.
Figure 112017021872046-pct00037

표 23.
Figure 112017021872046-pct00038

표 24.
Figure 112017021872046-pct00039

표 25.
Figure 112017021872046-pct00040

표 26.
Figure 112017021872046-pct00041

표 27.
Figure 112017021872046-pct00042

본원에 언급된 문헌은 참고로서 인용된다.
[도면의 간략한 설명]:
도 1. 화합물 1A, 1B, 2A, 2B, 3, 4A, 4B, 5A 및 5B.
도 2. 화합물 1B 의 핵심 NOESY 및 COSY 상관관계.
도 3. 화합물 1B 의 HMBC 상관관계.
도 4. a) 화합물 1A 및 b) 화합물 1B 의 단편화 패턴.
도 5. a) 화합물 2A (푸사리시딘 C) 및 b) 화합물 2B (푸사리시딘 D) 의 단편화 패턴.
도 6. 화합물 3 (LI-F08b) 의 단편화 패턴.
도 7. a) 화합물 4A (LI-F06a) 및 b) 화합물 4B (LI-F06b) 의 단편화 패턴.
도 8. a) 화합물 5A (푸사리시딘 A) 및 b) 화합물 5B (푸사리시딘 B) 의 단편화 패턴.
도 9 는 복합 서열 정렬 후 관련 분류군에 대한 본 발명의 파에니바실러스 균주의 완전한 16S rDNA 서열에 대한 % 일치성을 보여준다.
해설: * 균주 번호: 1 = 파에니바실러스 균주 Lu16774; 2 = 파에니바실러스 균주 Lu17015; 3 = 파에니바실러스 균주 Lu17007; 4 = 파에니바실러스 페오리아에 NRRL BD-62; 5 = 파에니바실러스 아나에리카누스 MH21; 6 = 파에니바실러스 브라실리엔시스 PB172; 7 = 파에니바실러스 캄피나센시스 324; 8 = 파에니바실러스 치벤시스 JCM 9905; 9 = 파에니바실러스 글루카노라이티쿠스 DSM 5162; 10 = 파에니바실러스 휴나넨시스 FeL05; 11 = 파에니바실러스 자밀라에 CECT 5266; 12 = 파에니바실러스 크리벤시스 AM49; 13 = 파에니바실러스 락티스 MB 1871; 14 = 파에니바실러스 라우투스 JCM 9073; 15 = 파에니바실러스 마세란스 IAM 12467; 16 = 파에니바실러스 마실리엔시스 2301065; 17 = 파에니바실러스 파불리 HSCC 492; 18 = 파에니바실러스 페오리아에 DSM 8320 (BD-57); 19 = 파에니바실러스 피니 S22; 20 = 파에니바실러스 폴리믹사 IAM 13419; 21 = 파에니바실러스 푸리스파티이 ES_MS17; 22 = 파에니바실러스 세디미니스 GT-H3; 23 = 파에니바실러스 테라에 AM141; 24 = 파에니바실러스 테리게나 A35; 25 = 파에니바실러스 티모넨시스 2301032; 26 = 파에니바실러스 투리센시스 MOL722; 27 = 파에니바실러스 울리기니스 N3/975; 28 = 코넬라 테르모톨레란스 CCUG 47242. 균주 6 내지 28 은 각각의 종에 대한 유형 균주이다.
신규한 균주와 파에니바실러스 페오리아에 (NRRL BD-62 및 DSM 8320) 와의 유사성이 굵은 글씨로 표시되었다.
도 10 은 다른 분류군과 본 발명의 파에니바실러스 균주의 16S-rDNA 서열의 % 일치성으로부터 계산되는 계통발생적 계통도를 보여준다 (도 9). 트리의 뿌리는 코넬라 테르모톨레란스의 16S rRNA 유전자 서열을 분석하는 것을 포함하여 결정하였다. 계통도 아래의 척도 막대는 100 개 뉴클레오티드 당 1 개 클레오티드 치환을 나타낸다.
도 11 은 RiboPrinter Microbial Characterization System 및 그로부터 산출되는 계통발생적 계통도를 사용하여 가깝게 관련된 P. 페오리아에 균주 BD-62 의 샘플과 비교하여 본 발명의 파에니바실러스 균주의 샘플로부터 수득되는 RiboPrint 패턴을 보여준다.
도 12 는 복합 서열 정렬 후 관련 파에니바실러스 균주에 대한 본 발명의 파에니바실러스 균주의 dnaN 유전자의 DNA 서열의 % 일치성을 보여준다.
해설: * 균주 번호: 1 = 파에니바실러스 균주 Lu16774; 2 = 파에니바실러스 균주 Lu17007; 3 = 파에니바실러스 균주 Lu17015; 4 = P. 페오리아에 DSM 8320T = KCTC 3763T (GenBank 접근 번호 AGFX00000000; J. Bacteriol. 194, 1237-1238, 2012); 5 = P. 폴리믹사 1-43 (GenBank 접근 번호 ASRZ01000000; deposition no. GCMCC 4965; CN 102352332 B); 6 = P. 폴리믹사 A18 (Gen-Bank acc. no JWJJ00000000.1; NCBI Project ID 225496); 7 = P. 폴리믹사 ATCC 842T = DSM 36T = KCTC 3858T (GenBank 접근 번호 AFOX001000000; J. Bacteriol. 193(18), 5026?5027, 2011); 8 = P. 폴리믹사 CF05 (GenBank 접근 번호 CP009909; Genome Announc 3(2):e00198-15. Doi:10.1128/genomeA.00198-15); 9 = P. 폴리믹사 CICC 10580 (GenBank 접근 번호 JNCB00000000; Genome Announc. 2(4):e00854-14. doi:10.1128/genomeA.00854-14); 10 = P. 폴리믹사 DSM 365 (GenBank 접근 번호 JMIQ00000000; J. Biotechnol. 195, 72-73, 2015); 11 = P. 폴리믹사 E681 (GenBank 접근 번호 CP000154; GenomeNet Ref Seq NC_014483.2; J. Bacteriol. 192(22), 6103?6104, 2010); 12 = P. 폴리믹사 M-1 (GenBank 접근 번호 HE577054.1; GenomeNet Ref Seq NC_017542.1); 13 = P. 폴리믹사 NRRL B-30509 (GenBank 접근 번호 JTHO00000000; Genome Announc. 2015 Mar-Apr; 3(2): e00372-15); 14 = P. 폴리믹사 SC2 (GenBank 접근 번호 CP002213; J. Bacteriol. 193 (1), 311-312, 2011); 15 = P. 폴리믹사 SQR-21 (GenBank 접근 번호 CP006872; GenomeNet Ref Seq NZ_CP006872.1; Genome Announc. 2014 Mar-Apr; 2(2): e00281-14); 16 = P. 폴리믹사 Sb3-1 (GenBank 접근 번호 CP010268; Genome Announc. 2015 Mar-Apr; 3(2): e00052-15); 17 = P. 폴리믹사 TD94 (GenBank 접근 번호 ASSA00000000); 17 = P. 폴리믹사 WLY78 (GenBank 접근 번호 ALJV00000000); P. terrae HPL-003 (GenBank 접근 번호 CP003107; NCBI Ref Seq NC_016641.1); P. 폴리믹사 CR1 (GenBank 접근 번호 CP006941; Genome Announc. 2014 Jan-Feb; 2(1): e01218-13).
도 13 은 복합 서열 정렬 후 관련된 파에니바실러스 균주에 대한 본 발명의 파에니바실러스 균주의 완전한 gyrB 유전자의 DNA 서열의 % 일치성을 보여준다. 균주 번호는 도 12 에 대한 해설에 기재된다.
도 14 는 복합 서열 정렬 후 관련된 파에니바실러스 균주에 대한 본 발명의 파에니바실러스 균주의 완전한 recF 유전자의 DNA 서열의 % 일치성을 보여준다. 균주 번호는 도 12 에 대한 해설에 기재된다.
도 15 는 복합 서열 정렬 후 관련된 파에니바실러스 균주에 대한 본 발명의 파에니바실러스 균주의 완전한 recN 유전자의 DNA 서열의 % 일치성을 보여준다. 균주 번호는 도 12 에 대한 해설에 기재된다.
도 16 은 복합 서열 정렬 후 관련된 파에니바실러스 균주에 대한 본 발명의 파에니바실러스 균주의 완전한 rpoA 유전자의 DNA 서열의 % 일치성을 보여준다. 균주 번호는 도 12 에 대한 해설에 기재된다.
도 17 은 P. 폴리믹사 복합체의 균주의 완전한 dnaN 유전자 서열에 근거하는 최대 가망 계통도를 보여준다. 제시된 0.1 의 척도는 1 % 뉴클레오티드 교환에 상응한다.
도 18 은 P. 폴리믹사 복합체의 균주의 완전한 gyrB 유전자 서열에 근거하는 최대 가망 계통도를 보여준다. 제시된 0.1 의 척도는 1 % 뉴클레오티드 교환에 상응한다.
도 19 는 P. 폴리믹사 복합체의 균주의 완전한 recF 유전자 서열에 근거하는 최대 가망 계통도를 보여준다. 제시된 0.1 의 척도는 1 % 뉴클레오티드 교환에 상응한다.
도 20 은 P. 폴리믹사 복합체의 균주의 완전한 recN 유전자 서열에 근거하는 최대 가망 계통도를 보여준다. 제시된 0.1 의 척도는 1 % 뉴클레오티드 교환에 상응한다.
도 21 은 P. 폴리믹사 복합체의 균주의 완전한 rpoA 유전자 서열에 근거하는 최대 가망 계통도를 보여준다. 제시된 0.1 의 척도는 1 % 뉴클레오티드 교환에 상응한다.
도 22 는 실시예 2.5 에 따라 수행된 P. 폴리믹사 복합체의 대표적 게놈의 아미노산 지수 (AAI) 매트릭스를 보여준다. 균주 번호는 도 12 에 대한 해설에 기재된다.
SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> Paenibacillus strains <130> 0000077456 <160> 3 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 1539 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> source <222> 1..1539 <223> /organism="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum" /note="Strain Lu16774 complete 16S rDNA" /mol_type="other DNA" <220> <221> unsure <222> 37,58,60,65,82,87,89,204,263,645,1020,1264,1457 <400> 1 tttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcntaa tacatgcaag tcgagcgngn 60 ttatntagaa gcttgcttct anaattncna gcggcggacg ggtgagtaac acgtaggcaa 120 cctgcccaca agacagggat aactaccgga aacggtagct aatacccgat acatcctttt 180 cctgcatggg agaaggagga aagncggagc aatctgtcac ttgtggatgg gcctgcggcg 240 cattagctag ttggtggggt aanggcctac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300 ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttccg caatgggcga aagcctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420 cggatcgtaa agctctgttg ccagggaaga acgtcttgta gagtaactgc tacaagagtg 480 acggtacctg agaagaaagc cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540 gggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggctc tttaagtctg 600 gtgtttaatc ccgaggctca acttcgggtc gcactggaaa ctggngagct tgagtgcaga 660 agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag 720 tggcgaaggc gactctctgg gctgtaactg acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa 780 caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga atgctaggtg ttaggggttt 840 cgataccctt ggtgccgaag ttaacacatt aagcattccg cctggggagt acggtcgcaa 900 gactgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagca gtggagtatg tggtttaatt 960 cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatccct ctgaccggtc tagagatagn 1020 cctttccttc gggacagagg agacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1080 atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatgct tagttgccag caggtcaagc 1140 tgggcactct aagcagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200 atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtactacaat ggccggtaca acgggaagcg 1260 aagncgcgag gtggagccaa tcctagaaaa gccggtctca gttcggattg taggctgcaa 1320 ctcgcctaca tgaagtcgga attgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg 1380 ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttacaacac ccgaagtcgg 1440 tgaggtaacc gcaaggngcc agccgccgaa ggtggggtag atgattgggg tgaagtcgta 1500 acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctc 1539 <210> 2 <211> 1545 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> source <222> 1..1545 <223> /organism="Paenibacillus polymyxa ssp. plantarum" /note="Strain Lu17007 complete 16S rDNA" /mol_type="other DNA" <220> <221> unsure <222> 58,60,65,82,87,645,1020 <400> 2 tttgatcctg gctcaggacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcgngn 60 ttatntagaa gcttgcttct anataancta gcggcggacg ggtgagtaac acgtaggcaa 120 cctgcccaca agacagggat aactaccgga aacggtagct aatacccgat acatcctttt 180 cctgcatggg agaaggagga aagacggagc aatctgtcac ttgtggatgg gcctgcggcg 240 cattagctag ttggtggggt aawggcctac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 300 ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 360 gaatcttccg caatgggcga aagcctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt 420 cggatcgtaa agctctgttg ccagggaaga acgtcttgta gagtaactgc tacaagagtg 480 acggtacctg agaagaaagc cccggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 540 gggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggctc tttaagtctg 600 gtgtttaatc ccgaggctca acttcgggtc gcactggaaa ctggngagct tgagtgcaga 660 agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag 720 tggcgaaggc gactctctgg gctgtaactg acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa 780 caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga atgctaggtg ttaggggttt 840 cgataccctt ggtgccgaag ttaacacatt aagcattccg cctggggagt acggtcgcaa 900 gactgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagca gtggagtatg tggtttaatt 960 cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatccct ctgaccggtc tagagatagn 1020 cctttccttc gggacagagg agacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1080 atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatgct tagttgccag caggtcaagc 1140 tgggcactct aagcagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc 1200 atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtactacaat ggccggtaca acgggaagcg 1260 aagccgcgag gtggagccaa tcctagaaaa gccggtctca gttcggattg taggctgcaa 1320 ctcgcctaca tgaagtcgga attgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg 1380 ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttacaacac ccgaagtcgg 1440 tgaggtaacc gcaaggagcc agccgccgaa ggtggggtag atgattgggg tgaagtcgta 1500 acaaggtagc cgtatcggaa ggtgcggctg gatcacctcc tttct 1545 <210> 3 <211> 1547 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> source <222> 1..1547 <223> /organism="Paenibacillus epiphyticus" /note="Strain Lu17015 complete 16S rDNA" /mol_type="other DNA" <220> <221> unsure <222> 68,87,1024 <400> 3 tgagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60 ggggttgntt agaagcttgc ttctaancaa cctagcggcg gacgggtgag taacacgtag 120 gcaacctgcc cacaagacag ggataactac cggaaacggt agctaatacc cgatacatcc 180 ttttcctgca tgggagaagg aggaaagacg gagcaatctg tcacttgtgg atgggcctgc 240 ggcgcattag ctagttggtg gggtaaaggc ctaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg 300 agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 360 tagggaatct tccgcaatgg gcgaaagcct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg 420 ttttcggatc gtaaagctct gttgccaggg aagaacgtct tgtagagtaa ctgctacaag 480 agtgacggta cctgagaaga aagccccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 540 tagggggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg gctctttaag 600 tctggtgttt aatcccgagg ctcaacttcg ggtcgcactg gaaactgggg agcttgagtg 660 cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagatatg tggaggaaca 720 ccagtggcga aggcgactct ctgggctgta actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag 780 caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttaggg 840 gtttcgatac ccttggtgcc gaagttaaca cattaagcat tccgcctggg gagtacggtc 900 gcaagactga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcagtggag tatgtggttt 960 aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat ccctctgacc ggtctagaga 1020 tagncctttc cttcgggaca gaggagacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080 tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tgcttagttg ccagcaggtc 1140 aagctgggca ctctaagcag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1200 aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtacta caatggccgg tacaacggga 1260 agcgaaatcg 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atccacacaa ggcaaaaaag caaagatcaa cgggctagag 300 cagcgaaagc tgagcgattt tatcggttcg ttaaacgtgg tcatgtttgc gcccgaggat 360 ctggaaattg tcaaaggaac accgggggtt cgccgccggt ttcttgacat ggaaattgga 420 caagttgcgc caggatattt gtatcatttg cagcaatatc agaaagtgct ggttcagcgg 480 aataacctgc tcaagcaagc ttgggggaaa gatatggcgt ccgtgcagct gatgctggag 540 gtatggaatg agcaacttgt tgagcatggt gttaaaattg taaaaaagcg gaaacaattt 600 ataacaaagc tacaaaagtg ggcccaagcc attcatgaag ggattgcagg tgggacagaa 660 gagttaaaat tagcctatgt tccctctttc ggtgagccag aggaagaaga tgaagctgtc 720 ttattggagc gatttatgat aaagttatcc caaatgaggg aacaggaaat ccgccgtggc 780 atgactttgg cgggacccca tcgtgatgat ttggcctttg ccattaacgg cagagaagtg 840 catacgtatg gctctcaggg gcagcagcgg acgacggccc tgtctttgaa gctggccgaa 900 atagaattaa ttcatgagga aattggggag tatcctatcc tgctgctgga tgatgtattg 960 tccgagctgg acccctatcg tcagactcag ctgatcgaga ctttccaaag caaggtacag 1020 acctttatca cggcaaccgg gattgagacg ttgaacgcag aacgacttaa gggtgcccat 1080 atttatcacg tccacgacgg gcatgtggaa cactaa 1116 <210> 12 <211> 1719 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> source <222> 1..1719 <223> /organism="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum" /note="Strain Lu17007 recN" /mol_type="DNA" <400> 12 atgctggtca ctttgtctat acggaatttg gcagtcgtag aagctgtcga tgttcatttt 60 tataaaggat ttcatgtatt gagcggagaa actggtgctg gtaaatccat tattatcgac 120 gcacttgggc tgattgcggg cggcagggga tctgctgatc tagtgcgtta cggatgtgat 180 aaagccgaaa tggaagcctt gtttgaattg ccggtcaaac atcccgtttg gaatacgttg 240 gaggaacaag ggattaaggc taatccagaa gagcatttgc tgattcgtcg agaacttaca 300 gttcagggga aaagctcatc tcgaattaac ggtcagatgg ttaatttaac gatgctgcgt 360 gaggtaggtg agcaactcgt taatatccac gggcagcatg agcatcaaag cttgctgcgt 420 gcggatcgcc atcttgcgct gctggatacg ttcggtgact cggtcattgg tccagtcaaa 480 gcgctttacc gggagcgcta caatgctttt gtcaaagcgg aaaaagaagt aagagaattg 540 caaagctcca gtcaaaaggc ttatcagcta ttggacatgt atcgcttcca attggaagag 600 atcgctgcgg cggagttaaa attgggtgaa gatgaattat tggcagagga acgggtcaag 660 ctatcccata gtgagaaaat gatggatgga gtatcaggag catacgagct gttaagtggc 720 agaggtggtc tggatacggt caataacgtg ttgtccagat taaatgatgt tcagagctac 780 gacagtaaaa gccttcagcc cattgcggag cagattcaat ctgctttcta tcagttggag 840 gatgcagcgt ttcaattacg ctcttatcgt gaggatattg aatttaatcc gggcaagctg 900 catgaggtgg agcaacgttt gaatcaaatt accgggttac agcgaaaata tggtgatagt 960 atagagcaga ttttggaata ctatagccgt attgagcagg aaaccgatct gttggaaaat 1020 aaagatgagc ggctggagca gctcattgca aagcgggatg agttgctttc gaatttgctg 1080 gagattgctg aagagcttac agaggcacgt gaaatttgtg ctgaagagct tgcagagcaa 1140 gtagagcagg aattaaaaga tcttcaaatg gaaagaacgt cactcaaggt gcgtattgat 1200 ccaattgaag atccacgtgg atatgaatat aaaggtctaa aggtacgacc taccaagcaa 1260 gggatagata atgcggaatt tctgatttcg cccaatccag gtgagccact tcgcccactc 1320 ggtaaaatcg cttccggtgg tgagttatca cgtatcatgt tggcgatgaa aagtattttt 1380 gcgcgtcatg atcaaattcc ggtgctcatt tttgacgagg tggataccgg ggtaagtggt 1440 cgtgcagctc agtccatagc cgagaagctt tatcgtttgt cttccgtttg tcaggtgttt 1500 tccattactc atttgccgca ggtggcatgt atggcagatc atcagtacct gattgagaaa 1560 aatgttcatg acggacggac catgactcaa attgagggac taacggagga aggtcgtgtt 1620 aaggaattgg cacggatgct gggtggggta gaaattaccg aaaaaacatt gcatcacgca 1680 caggaaatgc tgaatttggc ggaaggaaag aaagcctga 1719 <210> 13 <211> 945 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> source <222> 1..945 <223> /organism="Paenibacillus polymyxa spp. plantarum" /note="Strain Lu17007 rpoA" /mol_type="DNA" <400> 13 gtgatagaaa tcgaaaagcc gaaaattgag acggttgacg tcaatgatga tggcacctat 60 ggaaaattcg tagtagaacc gctggaacgc ggatacggta cgacgcttgg gaactcgctt 120 cgccgtattc tgttatcctc gttaccgggg gcagcagtca catcggttca gatcgatggg 180 gttctgcacg agtttgcaac ggttcccggt gtgaaggaag acgtaacgga gatcattctg 240 aacttgaaag ctttatcgct taaaatccac tcagatgaag agaaagtact tgaaatcgat 300 gcggaaggcg aaggagttgt aacggcaggt gatatccgtg cggatagtga tgtggaaatt 360 cttaatccgg atcttcacat tgcaacgctc ggaccgggtt cgagacttca catgcgtatt 420 tttgccaatc gcggtcgcgg ttacgttaag caggatcgga ataaacgtga tgaccagccg 480 atcggcgtca ttcccgtcga ctccatctac actccgattg cacgcgtgaa ctacggcgta 540 gaaaatacgc gtgtcggcca ggttacgaat tatgacaagc tgacacttga ggtttggact 600 gacggaacta ttcgtcctga agaagctgtg agccttggag ccaaaatttt gaccgagcat 660 gtgatgctat tcgtgggtct cacggatgaa gcaaaagatg cagaaattat ggtcgaaaaa 720 gaagaagaca aaaaagaaaa agttcttgaa atgacgatcg aagagctgga tctctccgtc 780 cgttcctata actgccttaa gcgcgctggt atcaatacgg tacaagaact cacgactaaa 840 tctgaagaag atatgatgaa ggtccgtaac ttgggtcgca aatctttgga agaagtacaa 900 gagaagctcg aggaacttgg tttaggactt cgtacggaag aatag 945 <210> 14 <211> 1143 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> source <222> 1..1143 <223> /organism="Paenibacillus epiphyticus" /note="Strain Lu17015 dnaN" /mol_type="DNA" <400> 14 atgaagatca gcattctgaa aaacgttttg aacgaggcta tacaacatgt atccaaagcg 60 atatcaagtc ggactacgat tccaattctg agtggtatta agctggatgt gaatcaccag 120 ggagtaacgc tgaccgccag cgatacagac atctccattc aatcctttat tccgatggag 180 gatggtgacc aaactgttgt tcaggtcgaa caacccggca gtgttgtgct gcctgccaaa 240 ttctttgtcg aaattatcaa aaagttgccg tcgcaggaga tccatatgga ggtaaaagac 300 caatttcaaa cctttatctc gtctggcgca actgaaattc agattgttgg cttggaccct 360 gaagaattcc cggtgcttcc caacattgaa gaaaatcaag tcatctctgt accaggagat 420 ttacttaaaa atatgattaa acagacggta ttctccatct ccacccacga aacgacaccg 480 attttaactg gcgtgttgtg gaatctggct gagggtgaat tgaagtttgt ggcaacggac 540 cgccaccgcc ttgccacccg tagcgctcat ttggagacgt ctgaaggctt gcgttttagc 600 aatgttgtca ttgcgggcaa aacgctgaat gagctgagca gaattattcc agatcaaaat 660 atgcttgtgg atatcgtagt agcggacaat caggtattat tcaaagtaga tcgggtgcta 720 ttttattccc gcatcttgga cggcacctat cctgatactt ctagaattat tccgacctcc 780 tacaaaacag aactgattgt ggatacaaaa agtttaagtg agtcaattga ccgtgcttat 840 ttgctgtccc gtgaggaaaa aacgaatatt gtaaaaatgc agtcgctgga aaatggcggt 900 ttggagattt cctctagttc ctctgagctt ggcaaagtgc gtgaggaagt aactgtgtcc 960 aaatttgagg gagagccgct caaaatttcg ttcaactcta aatacatgct cgacgtgctg 1020 aaggtgattg acagcgagca gctgacgatt gcttttaccg gcattatgag ccccattatt 1080 ttaaaaccgg ctgattccag caatgcgctg tatatcatcc tgccatatcg cacaaccaac 1140 tga 1143 <210> 15 <211> 1980 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> source <222> 1..1980 <223> /organism="Paenibacillus epiphyticus" /note="Strain Lu17015 gyrB" /mol_type="DNA" <400> 15 atggtcgaca aaatcgactt gtctgcggga gtgtccggca cacaaagcgg agcttcggaa 60 tatggcgcgg acgacattca agtgctcgaa gggcttgtgg cagttcgcaa acggccgggc 120 atgtacatcg ggagcaccag ttcttcgggg ctgcatcatt tggtatggga aattgtagac 180 aacgcggtgg atgaacatct cgccaagttt tgctctcgca ttgatattac aatgcataag 240 gacggttccg ttacagtatc agacaacggg cgcggtattc ctacgggaat gcacaaaacg 300 ggaattccta cgcctcaggt tgtattcacc attttgcacg ccggaggtaa gtttggcggt 360 tcgggatata aaaaatccgg gggtctgcac ggtgtaggtg cgtctgtaac gaacgctctt 420 tcggaatggc ttgaagtaga aatttaccgg gacggcaaga ttcaccgtca gcggtttgaa 480 tattggcagg acaagaaggg cgtggagcat gtcggggaac cgaccacagg ccttgaagtg 540 ctgggcaata ctaacaagac gggctcgaaa attacattta aaccggatat tcgtgttttt 600 caggcaggca ttcattttaa ctacgatacg ttggctgagc gccttcagga aattgctttt 660 ctaaattcgg gccttcgtat tcaacttaaa gacgaacgca gcggaaagtc agatgagtat 720 ttttatgagg gtggcgcaag tcagtttgtt gcttttctga atgagggcaa ggatgtgctg 780 catgacgtta ttcactttaa tgccgagaaa gaagacattg aagtagagat tgccatccag 840 tacaatgctg gttatacaga gacgattgct tcgttcgtta actccattcc gacacgtgga 900 ggaggtacgc atgaaacggg attcaaaacc gcttacactc gtgtcatgaa cgactatgcc 960 cggaaaacgg tgatgttgaa agaaaaggat aaaaacttgg agggcaacga tctacgtgag 1020 ggcatgatgg ctgtaatcag tgtcaagatg gctgaggttg aatttgtcgg ccagacaaag 1080 gatcagctgg gaagcgcttc ggcacggagt acagtggatg ccatcgtatc tgagcagatg 1140 cagcgttttt tggaagaaaa tccgcagata gcacaaactt tgatcaagaa ggcagttcaa 1200 gcatccagag cacgtgaagc tgcacgtaaa gctcgggatg aaatgcgttc cggtaaaaag 1260 cgcagtgaaa gttccaattt gaatggtaaa ctatcgcctg cgcagtccaa ggattttaca 1320 cgtaatgagt tgtttattgt ggaaggcgat tcggctggag gatcagccaa gcagggacgg 1380 gattccaaaa ttcaggccat attgccgcta aagggcaagc cgatgaatcc ggaaaaatcc 1440 aaactggcgg atattatgaa gaatgatgag taccgtgcta ttacagcagc tattggtgcg 1500 ggagtaggaa cagagttttc gctggaagac agcaattatt ccaaaatcat cattatgacc 1560 gatgcagata cagatggtgc gcacattcaa gtgctgttgt tgacgttctt ttatcggtac 1620 atgaaagagc ttattgatgc aggacgcata tttattgctc aaccgccatt gtataaaata 1680 actcgaaagt cgggtaagct cgaaacggtg cgttatgctt ggactgacga gcagcttgat 1740 aattatttaa aagaatttgg acgaaatttt gagcttcagc gctataaagg acttggggaa 1800 atgaaccctg atcagttatg ggaaacaacg atgaatcccg attcacgcac cttgctacgc 1860 gttcagatag aggatgcagc caaggctgaa cgcagggtgt ccactttgat gggtgataag 1920 gtggatccgc gcaagcgctg gatcgtggaa aacgtagatt ttacggaata cgtagagtag 1980 <210> 16 <211> 1116 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> source <222> 1..1116 <223> /organism="Paenibacillus epiphyticus" /note="Strain Lu17015 recF" /mol_type="DNA" <400> 16 gtgtttgtga acaacattgt tttgcagcag taccggaact atgaacagct ggagctgaat 60 gaatttgggc ccgttaattt gctgatcgga caaaatgcgc agggcaaaac gaatctggta 120 gaggcaattt ttgtactggc tttaaccaaa agtcatcgaa cgtcccgcga caaggagtta 180 atctctttcg gggctacttc cactcaccta gctgcggatg tggataaaaa atacgggaaa 240 atcagactgg atctcgcgtt atccacacaa ggcaaaaaag caaagatcaa cggactggag 300 cagcgcaaac tgagcgattt tatcggttcg ttaaatgtgg tcatgtttgc acctgaggat 360 ctggaaattg tgaaaggaac accgggggtt cgccgccggt ttcttgacat ggaaatcgga 420 caggttgcgc caggatatct gtatcatttg cagcaatatc agaaagtatt ggttcagcga 480 aacaacctgc tcaagcaagc ttggggtaag gatatggcgt cagtgcagct gatgctggag 540 gtatggaatg agcaacttgt tgagcatggt gttaaaattg ttaaaaagcg gaaacaattt 600 ataacaaagc tacaaaagtg ggctcaggcc attcatgaag ggatcgcagg tgggacagaa 660 gagttaaaat taacctatgt tccctccttc agtgagccag aggaagaaga tgaagctgtc 720 ttattggagc gatttatgat aaagttatcc caaatgaggg aacaggaaat ccgccgtggc 780 atgactttgg cgggacccca tcgtgacgat ttggcctttg ccattaacgg cagagaagtg 840 catacgtatg gctctcaggg gcagcagcgg acgacggccc tgtccttgaa gttggccgaa 900 atagagttaa ttcatgagga aattggtgaa tatcctgtct tgctgctgga tgatgttttg 960 tccgagctgg acccctatcg tcagacccag ctgatcgaga ctttccaaag caaggtacag 1020 acctttatca cggcaaccgg ggttgagact ttgaacgcag aacgactcaa ggatgccaat 1080 atttatcacg tccacgacgg gcatgtggaa cactaa 1116 <210> 17 <211> 1719 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> source <222> 1..1719 <223> /organism="Paenibacillus epiphyticus" /note="Strain Lu17015 recN" /mol_type="DNA" <400> 17 atgctggtca ctttgtctat acggaatttg gcggtcgtag aggccgtcga tgttcatttt 60 tataaagggt ttcatgtctt gagcggggaa acaggtgctg gtaaatccat tattatcgat 120 gcgcttggcc tgattgcagg cggtaggggc tctgctgatc tagtgcgtta cggttgtgat 180 aaagcagaga tggaagcctt gtttgagctg ccggtaaaac atccagtttg gaaaacactt 240 gaggaacaag ggattaaggc caatgcggag gagcatttgc tgattcgtcg cgaacttacg 300 gttcagggga aaagctcttc tcgaattaac ggtcagatgg ttaatttaac gatgctgcgt 360 gaggtaggtg agcagctcgt caatatccac gggcaacatg agcatcaaag cctgctacgt 420 gcagatcgcc atctggcgct gctggatacg ttcggtgatt cggtgatcgg tccagtcaaa 480 acgctttacc gtgagcgtta caatgctttt gtcaaagcgg aaaaagaagt aagagaactg 540 caaagctcca gtcaaaaggc ttatcagctt ttggatatgt accgatttca attagaagag 600 atcgctgcgg cggagttgaa attgggagaa gatgaattat tggcagagga acgggtcaag 660 ctatcccata gtgagaaaat gatggatggg atatcaggag catacgaact gctaagcggc 720 agaggtgggc tggatacgat caataacgta ttgtctagat tgaacgatgt ccaaagctat 780 gacagcaaaa gccttcagcc cattgcggag cagattcagt ctgcttttta ccagttagag 840 gacgcagcat tccaattacg ttcttatcgt gaggatattg aatttaatcc aggcaagctg 900 catgaagtgg agcaacgttt gaatcaaatt accggattac agcgaaaata tggtgatagt 960 atagagcaga ttttggaata ctatagccgt attgagcagg aaaccgatct gctggaaaat 1020 aaagatgagc ggctggagca gctcattgca aaacgggatg agttgctttc cgatttgctg 1080 gagatttcag aagagcttac agaagcacgt gaaatttgtg ctgaagagct tgcagagcaa 1140 gtggagcagg agttaaaaga cctgcagatg gaaagaacgt cactcaaggt gcgcattgat 1200 ccaattgaag atccacgcgg atatgagtat aaaggtctga aggtaaggcc taccaagcaa 1260 ggaattgata atgcggaatt tcttatttca cccaatccag gtgagccact acgtccactt 1320 ggtaagatcg cttcaggcgg tgagctatca cgtatcatgt tggcgatgaa aagtattttt 1380 gcgcgtcatg atcaaattcc agtactcatt tttgacgagg tggataccgg ggtgagtggt 1440 cgtgcagctc aatccattgc cgagaagcta tatcgtttat cttccgtttg tcaggtgttt 1500 tccattactc atttgccaca ggtggcatgt atggcagatc atcagtacct tattgagaaa 1560 aatgttcatg atggacggac catgactcaa attgagggac ttacggagga cgggcgtgtc 1620 aaggaattgg cacggatgct gggcggcgtg gaaattaccg aaaaaacatt gcatcacgca 1680 caggaaatgc tgaatttggc ggaaggaaag aaagcctga 1719 <210> 18 <211> 945 <212> DNA <213> Paenibacillus sp. <220> <221> source <222> 1..945 <223> /organism="Paenibacillus epiphyticus" /note="Strain Lu17015 rpoA" /mol_type="DNA" <400> 18 gtgatagaaa tcgaaaagcc gaaaattgag acggttgacg tcaatgatga tggcacctat 60 ggaaaattcg tagtagaacc gctggaacgc ggatacggta cgacgttggg aaactcgctt 120 cgccgtattc tgttatcctc gttaccgggg gcagcagtca catcggttca gatcgatggg 180 gttctgcacg agtttgcaac ggttcccggt gtgaaggaag acgtaacgga gatcattctg 240 aacttgaaag ctttatcgct taaaatccac tcggatgaag agaaagtact cgaaatcgat 300 gcggaaggcg aaggagttgt aacggcagga gatatccgtg cggatagtga tgtggaaatt 360 cttaatccgg atcttcacat tgctacgctc ggaccgggtt cgagacttca catgcgtatt 420 tttgccaatc gcggtcgcgg ttacgttaag caggatcgga acaaacgtga tgaccagccg 480 atcggcgtca ttcccgtcga ctccatctac actccgattg cacgcgtgaa ctacggcgta 540 gaaaatacgc gtgtcggcca ggttacgaat tacgacaagc tgacacttga ggtttggact 600 gacggaagta ttcgtcccga ggaagcagtg agccttggag ccaaaatttt gaccgagcat 660 gtgatgttgt tcgtgggtct cacggacgag gcaaaagatg ctgaaattat ggttgaaaaa 720 gaagaagaca agaaagaaaa agttcttgaa atgacgatcg aagagctgga tctctccgtc 780 cgttcctata actgccttaa gcgcgctggt atcaatacgg tacaagaact cacgactaaa 840 tctgaagaag atatgatgaa ggtccgtaac ttgggtcgca aatctttgga agaagtacaa 900 gagaagctcg aggaacttgg tttaggactt cgtacggaag aatag 945

Claims (20)

  1. 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 파에니바실러스 (Paenibacillus) 균주:
    a) 접근 번호 DSM 26969 로 DSMZ 에 기탁된 균주 Lu16774;
    b) 접근 번호 DSM 26970 로 DSMZ 에 기탁된 균주 Lu17007; 및
    c) 접근 번호 DSM 26971 로 DSMZ 에 기탁된 균주 Lu17015.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 정의된 바와 같은 파에니바실러스 균주의 정제된 배양물.
  4. 제 1 항에 정의된 바와 같은 파에니바실러스 균주의 전체 배양 브로쓰 또는 무-세포 추출물.
  5. 하기 화학식 I 의 화합물 또는 이의 농업적으로 허용가능한 염:
    Figure 112022070922503-pct00045

    (식 중,
    R 은 15-구아니디노-3-히드록시펜타데칸산 및 12-구아니디노도데칸산으로부터 선택되고;
    X1 은 트레오닌이고;
    X2 는 이소류신이고;
    X3 은 티로신이고;
    X4 는 트레오닌이고;
    X5 는 글루타민 및 아스파라긴으로부터 선택되고;
    X6 은 알라닌이고;
    식 중, 화살표는 R 의 카르보닐 모이어티와 아미노산 X1 의 아미노 기 사이의 또는 하나의 아미노산의 카르보닐 기와 이웃하는 아미노산의 아미노 기 사이의 단일 아미드 결합을 정의하며,
    화살표의 끝은 상기 아미노산 X1 또는 상기 이웃하는 아미노산의 아미노 기에 대한 부착을 나타내고;
    화살표 머리 없는 단일 선은 X6 의 카르보닐 기와 X1 의 히드록실 기 사이의 단일 에스테르 결합을 정의함).
  6. 제 5 항에 있어서, 화합물 1A 및 1B:
    Figure 112022070922503-pct00046
    ;
    또는 이의 농업적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는 화합물.
  7. 제 1 항에 정의된 바와 같은 파에니바실러스 균주를 배양하고, 전체 배양 브로쓰로부터 제 5 항 또는 제 6 항에 정의된 바와 같은 화합물 또는 이의 염을 회수하는 것을 포함하는, 제 5 항 또는 제 6 항에 정의된 바와 같은 화합물 또는 이의 염의 제조 방법.
  8. 하기를 포함하는 조성물:
    a) 제 1 항에 정의된 바와 같은 파에니바실러스 균주; 또는
    b) 제 1 항에 정의된 바와 같은 파에니바실러스 균주의 정제된 배양물; 또는
    c) 제 1 항에 정의된 바와 같은 파에니바실러스 균주의 전체 배양 브로쓰 또는 무-세포 추출물; 또는
    d) 제 5 항 또는 제 6 항에 정의된 바와 같은 화학식 I 의 화합물 또는 이의 염;
    및 보조제.
  9. 제 8 항에 있어서, 살충제를 추가로 포함하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 살충제가 추가의 생물살충제인 조성물.
  11. 제 8 항에 정의된 바와 같은 조성물을 포함하는 코팅을 갖는 종자.
  12. 제 8 항에 있어서, 식물 병원균을 방제 또는 억제하기 위해 또는 식물 병원균 감염을 예방하기 위해 또는 유해 미생물에 의한 침입 및 파괴에 대항하는 물질의 보호를 위해 사용되는 조성물로서,
    상기 식물 병원균 및/또는 유해 미생물이 스클레로티니아 스클레로티오룸, 보트리티스 시네레아, 알테나리아 솔라니, 파이토프토라 인페스탄스, 파코프소라 파키리지, 푸사리움 그라미네아룸 및 셉토리아 트리티시로 이루어진 군으로 선택되는 조성물.
  13. 식물 병원균, 이들의 서식지 또는 식물 병원균 공격에 대항하여 보호하고자 하는 식물, 또는 토양 또는 종자를 제 8 항에 정의된 바와 같은 조성물의 유효량으로 처리하는, 식물 병원균을 방제, 억제 또는 식물 병원균 감염을 예방하는 방법으로서,
    상기 식물 병원균이 스클레로티니아 스클레로티오룸, 보트리티스 시네레아, 알테나리아 솔라니, 파이토프토라 인페스탄스, 파코프소라 파키리지, 푸사리움 그라미네아룸 및 셉토리아 트리티시로 이루어진 군으로 선택되는, 식물 병원균을 방제, 억제 또는 식물 병원균 감염을 예방하는 방법.
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