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KR102489353B1 - 특정 집단에 대한 항원으로 t 세포를 스크리닝하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

특정 집단에 대한 항원으로 t 세포를 스크리닝하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR102489353B1
KR102489353B1 KR1020177037686A KR20177037686A KR102489353B1 KR 102489353 B1 KR102489353 B1 KR 102489353B1 KR 1020177037686 A KR1020177037686 A KR 1020177037686A KR 20177037686 A KR20177037686 A KR 20177037686A KR 102489353 B1 KR102489353 B1 KR 102489353B1
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cells
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polynucleotide
leu
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제임스 알. 히스
송밍 펭
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캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

환자 유래의 항원-특이적 T 세포를 분리하기 위한 조성물 및 방법은 펩타이드-적재된 스트렙타비딘 주조직 적합성 복합체(MHC) 사량체와 복합체화된 폴리뉴클레오타이드 바코드된 나노 입자 분류제를 포함하는 항원 복합체를 포함하며, 상기 바코딩 기술로 인해 상기 항원 복합체의 라이브러리를 높은 정확도로 스크리닝할 수 있어 항원-특이적 T 세포를 쉽게 분리하고 확인할 수 있다.

Description

특정 집단에 대한 항원으로 T 세포를 스크리닝하기 위한 조성물 및 방법
연방 후원 연구 또는 개발에 관한 선언
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 부여된 보조금 번호 CA151819 및 CA1710689 하에서의 정부 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 소정의 권리를 갖는다.
종양 세포 유래의 신생항원은 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 단백질의 펩타이드 단편이며 종양 내의 세포 표면 상의 주조직 적합성 복합체(ＭＨＣ）제 I 부류 분자(Major Histocompatibility Complex (MHC) Class I molecules)의 틈새에 존재할 수 있으며, CD8-양성 T 세포는 이 곳에 있는 신생항원을 조사할 수 있다. 신생항원의 종양-특이성과 암세포를 특이적으로 사멸시키는 신생항원-특이적 T 세포의 능력으로 인해, 종양 신생항원은 암 면역요법에 점점 더 중요해져 가고 있다. 또한 특정 신생항원을 인식하는 T 세포 수용체(TCR)는 신생항원을 생성하는 감염을 표적으로 하는 TCR-조작 세포 기반 치료법(TCR-engineered cell based therapies)의 후보 물질이다.
이전에는 종양 엑솜(exome) 분석에 의해 추정 신생항원을 확인하였고, 이후 인 실리코 분석(in silico analysis)을 사용하여 이들의 MHC 결합 강도에 따라 순위가 매겨졌다. 그러나 어떤 신생항원 후보가 실제로 T 세포 종양 침윤을 촉진시키는지를 찾아내는 데는 여러 가지 이유로 어려움이 있다. 첫째, 발현된 DNA 염기쌍 100만개 당 10개의 돌연변이 밀도를 갖는 환자 종양에서, 정해진 인간 백혈구 항원(HLA) 유전자형 MHC에 대해 500 nM 이하의 결합 상수(Kd)를 나타내는 추정 신생항원은 50개 정도일 것으로 예측된다. 또한 임의의 특정 신생항원-특이적 T 세포 집단은 매우 낮은 농도로 환자 내에 존재할 가능성이 높아, 신생항원-특이적 T 세포의 분리 및/또는 확인이 매우 어렵다. 이러한 문제와 관련된 어려움에는 신생항원과 이들의 동족 TCR의 짝-형성(pairing)이 포함된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 신생항원-T 세포 짝-형성 상호 작용은 암 면역요법의 핵심이며, 따라서 이러한 어려움을 해결하기 위한 많은 노력이 수행되어 왔다. 신생항원-특이적 T 세포 짝-형성에 대한 이전의 접근법은 힘들고 비정량적이었으며 및/또는 제한된 민감성으로 인하여 HLA 유전자형 당 하나 또는 두 개의 T 세포 집단만을 식별할 수 있었다.
본 발명의 일부 구현예에서, 항원 복합체는 나노 입자, 하나 이상의 코딩 영역을 가지며 상기 나노 입자에 컨쥬케이트된 폴리뉴클레오타이드 검출 태그 및 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그에 컨쥬게이트된 제 1 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인을 포함하는 나노 입자 분류제(sorting agent)를 포함한다. 상기 항원 복합체는 또한 변형된 스트렙타비딘 단백질, 상기 변형된 스트렙타비딘 단백질에 각각 독립적으로 컨쥬게이트된 4개의 바이오틴-변형된 MHC 단백질, 상기 바이오틴-변형된 MHC 단백질에 결합된 항원 펩타이드, 및 상기 제 1 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인과 상이하며 상기 변형된 스트렙타비딘 단백질에 컨쥬게이트된 제 2 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인을 포함하는 펩타이드-적재된 스트렙타비딘 주조직 적합성 복합체(major histocompatability complex)(ＭＨC) 사량체를 포함하며, 상기 나노 입자 분류제는 상기 제 1 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인과 상기 제 2 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인의 혼성화에 의해 상기 펩타이드-적재된 스트렙타비딘 MHC 사량체에 연결된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 항원 복합체의 라이브러리는 상기에 개시된 복수의 상기 항원 복합체를 포함하며, 상기 항원 복합체 각각은 상기 복수의 항원 복합체 내의 임의의 다른 항원 복합체와 상이한 항원 펩타이드 및 상이한 폴리뉴클레오타이드 검출 태그를 갖는다.
본 발명의 일부 구현예에서, 신생항원-특이적 T 세포를 검출하기 위한 키트는, 하나 이상의 코딩 영역을 포함하고 나노 입자에 컨쥬게이트된 폴리뉴클레오타이드 검출 태그를 포함하며, 상기 키트는 또한 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 상기 하나 이상의 코딩 영역과 혼성화할 수 있는 디코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 또한 상기 디코딩 폴리뉴클레오타이드와 혼성화할 수 있는 변위 폴리뉴클레오타이드(displacement polynucleotide)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 도 4의 폴리뉴클레오타이드 검출 태그 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 도 8A의 디코딩 폴리뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 도 8B의 변위 폴리뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 또한 변형된 스트렙타비딘 단백질, 상기 변형된 스트렙타비딘 단백질에 각각 독립적으로 컨쥬게이트된 4개의 바이오틴-변형된 MHC 단백질 및 상기 바이오틴-변형된 MHC 단백질에 결합된 항원 펩타이드를 포함하는 펩타이드-적재된 스트렙타비딘 주조직 적합성 복합체(ＭＨC) 사량체를 하나 이상 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 대상 내의 종양에 대한 신생항원-특이적 T 세포를 분리하는 방법은 주조직 적합성 복합체(MHC) 결합 알고리즘을 사용하여 상기 종양에 대한 후보 T 세포 에피토프를 확인하는 단계, 상기 후보 T 세포 에피토프에 상응하는 항원 펩타이드를 합성하는 단계, 상기 항원 펩타이드를 사용하여 항원 복합체의 라이브러리를 제조하는 단계, 상기 항원 복합체의 라이브러리를 상기 대상 유래의 TIL 또는 PBMC와 함께 배양하는 단계 및 짝을 이룬 T 세포를 짝을 이루지 않은 T 세포로부터 분리하는 단계를 포함하며, 상기 짝을 이룬 T 세포는 상기 항원 복합체의 라이브러리 내의 상기 항원 복합체 중 어느 하나의 항원 펩타이드와 짝을 이룬 T 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 전술한 대상 내의 종양에 대한 신생항원-특이적 T 세포를 분리하는 방법은 또한 상기 짝을 이룬 T 세포를 미세유체 장치(microfluidic device)에 첨가하여 상기 짝을 이룬 T 세포를 짝을 이룬 개별 T 세포로 분리하는 단계 및 각각의 짝을 이룬 개별 T 세포의 상기 항원 복합체의 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 상기 하나 이상의 코딩 영역의 서열을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 짝을 이룬 개별 T 세포의 상기 항원 복합체의 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 상기 하나 이상의 코딩 영역의 서열을 검출하는 상기 단계는 각각의 짝을 이룬 개별 T 세포의 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그를 2개 이상의 표지된(labeled) 디코딩 폴리뉴클레오타이드와 함께 배양하는 단계 및 혼성화된 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출하여 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 상기 하나 이상의 코딩 영역의 서열을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 대상 내의 종양에 대한 신생항원-특이적 T 세포를 분리하는 상기 방법은 전술한 바와 같으며, 여기서 상기 항원 복합체의 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그 중 상기 하나 이상의 코딩 영역은 2개 이상의 코딩 영역을 포함하며, 각각의 짝을 이룬 개별 T 세포의 상기 항원 복합체의 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 상기 2개 이상의 코딩 영역의 서열을 검출하는 단계는 각각의 짝을 이룬 개별 T 세포의 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그를 2개 이상의 제 1 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드와 함께 배양하는 단계, 하나 이상의 제 1 혼성화된 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출하여 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 상기 2개 이상의 코딩 영역 중 제 1 코딩 영역의 서열을 결정하는 단계, 상기 하나 이상의 제 1 혼성화된 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 변위 폴리뉴클레오타이드와 배양하여 상기 제 1 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드를 상기 제 1 혼성화된 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드로부터 제거하여 부분적으로 디코딩된 폴리뉴클레오타이드 검출 태그를 생산하는 단계, 상기 부분적으로 디코딩된 폴리뉴클레오타이드 검출 태그를 하나 이상의 제 2 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드와 배양하는 단계 및 제 2 혼성화된 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출하여 각각의 짝을 이룬 개별 T 세포의 상기 항원 복합체의 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 상기 2개 이상의 코딩 영역 중 제 2 코딩 영역의 서열을 결정하는 단계를 포함한다.
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도 1은 T 세포(청색으로 표시됨) 상의 T 세포 수용체(TCR)와 항원 제시 세포(APC)(적색으로 표시됨) 상의 주조직 적합성 복합체(MHC)에 의해 제시되는 항원 간의 상호 작용을 도시하는 개략도이다. 이는 Coulie et al., 2014, Nat Rev Cancer 14: 135-146에 기재되어 있으며, 이 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
도 2A 내지 도 2B는 TCR(자주색)과 상호 작용하는 MHC 분자(녹색) 내의 펩타이드 항원(황색) 간의 특이적 결합 상호 작용과, 천연 에피토프 잔기(native epitope residues)에 대한 돌연변이된 에피토프 잔기의 예측 IC50 결합값을 나타낸다. 이는 Fritsch et al., 2014, Cancer Immunol Res., 2:522-529에 기재되어 있으며, 이 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
도 3A는 본 발명의 구현예에 따라, 4개의 바이오틴-MHC 분자에 의해 결합된 DNA-표지된(흑색) 시스테인-변형된 스트렙타비딘(갈색)을 사용하여 상이한 후보 항원 펩타이드를 적재하기 위한 조건부 항원 MHC 분자(conditional antigen MHC molecule)(녹색 및 자주색)를 구축하여 DNA-표지된 항원-MHC 복합체의 라이브러리를 형성하는 개략도이다.
도 3B는 본 발명의 구현예에 따라, DNA 바코드된(DNA barcoded) 나노 입자(NP)와 DNA-표지된 항원-MHC 복합체를 조립 및 연결하여 바코드된 NP-항원-MHC 복합체의 라이브러리를 형성하는 것을 도시하는 개략도로서, 여기서 상기 DNA 바코드(즉, 폴리뉴클레오타이드 검출 태그)는 상기 나노 입자에 부착되며 상기 바코드의 3' 말단에서 상기 DNA-표지된 항원-MHC 복합체의 혼성화 DNA(흑색)와 복합체화하여 바코드된 NP-항원-MHC 복합체 라이브러리를 형성하는 3개의 별개의 코딩 영역(적색, 녹색 또는 황색)을 포함한다.
도 3C는 본 발명의 구현예에 따른 3-위치 코딩 영역 바코드(적색, 녹색 또는 황색)의 예를 도시하는 개략도이다.
도 4는 본 발명의 구현예에 따른, 항원-특이적 T 세포를 확인하기 위한 바코드된 NP-항원-MHC 복합체의 라이브러리를 제조하기 위한 3-위치 DNA 바코드(폴리뉴클레오타이드 검출 태그)(적색, 녹색 또는 황색) 서열의 예를 기재한 표이다.
도 5A는 본 발명의 구현예에 따른, 바코드된-NP-항원-MHC 복합체 라이브러리 내의 27개의 후보 항원, 상응하는 바코드 서열, 및 디코딩 서열(적색, 황색 또는 녹색)에 대한 형광 염료 색상을 나열한 항원 바코드 키(barcode key)이다.
도 5B는 본 발명의 구현예에 따른, 각 항원에 상응하는 판독을 디코딩 서열에 상응하는 형광 염료(적색, 황색 또는 녹색)와 함께 확인된 상응하는 코딩 영역 서열(D1, D2, D3, D5, D6, D7, D9, D10 또는 D11)로 나타낸 항원 바코드 키이다.
도 6은 본 발명의 구현예에 따른, T 세포 상의 동족 T 세포 수용체(TCR)와 짝을 이룬 바코드된 자성(magnetic) NP-항원-MHC 복합체 및 자석을 사용한 상기 자성 NP의 분리를 나타내는 개략도이다.
도 7은 본 발명의 구현예에 따른 DNA 순차적 바코드 판독(DNA sequential barcode reads)의 개략도(A) 및 50 ㎛의 눈금자를 포함한 형광 이미지(B 내지 G)를 도시하며, 여기서 NP-DNA는 리드(read) 1 DNA(Read 1 DNA)와 혼성화되어 이미지 B에 도시된 바와 같이 적색 형광을 제공하며; 변위 1 DNA(Displace 1 DNA)와 리드 2 DNA가 도입되어 이미지 C에 도시된 바와 같이 리드 1 DNA를 제거하고 이미지 D에 도시된 바와 같이 녹색 형광을 생성하며; 유사한 공정이 뒤이어 수행되어 이미지 E에 도시된 바와 같이 리드 2 DNA를 제거하고 이미지 F에 도시된 바와 같이 제 3 황색 형광 신호를 생성한다.
도 8A는 본 발명의 구현예에 따른, 도 4 및 도 5B의 각 코딩 영역을 디코딩하기 위한 부착 염료(적색, 황색, 청색)의 색상으로 나타낸 서열을 갖는 형광 염료 표지된 DNA(폴리뉴클레오타이드 디코딩 서열)(M1, M2, M3, M5, M6, M7, M9, M10 및 M11)의 목록이다.
도 8B는 본 발명의 구현예에 따른, 도 9A에 나열된 각각의 디코딩 서열을 변위시키는 변위 DNA(폴리뉴클레오타이드 변위 서열)(M1 comp, M2 comp, M3 comp, M5 comp, M6 comp, M7 comp, M9 comp, M10 comp 및 M11 comp)의 목록이다.
도 9는 본 발명의 구현예에 따른, 환자(환자 #1) 유래의 확장된 종양 침윤 림프세포(TIL) 표본으로부터 수집된 바코드되고 침전된 신생항원-특이적 T 세포의 단일 세포 분석을 나타내며, 여기서 최좌측의 이미지는 10개의 세포 트랩(cell traps)이 장착된 미세유체 챔버의 광학 현미경 사진이며, 상기 트랩 중 9개는 단일-바코드된 T 세포를 포함하며, 형광 이미지(왼쪽에서 오른쪽)는 코딩 영역 1(제 1)의 판독, 코딩 영역 2(제 2)의 판독 및 코딩 영역 3의 판독을 나타내며, 해당 이미지 아래에는 R=적색, Y=황색, 및 G=녹색으로 판독 결과를 나타내었다.
도 10A는 본 발명의 구현예에 따른, 쥬르카트(Jurkat) 및 GBM U876 세포(청색 세포)의 혼합물로부터 Mart-1 특이적 T 세포 수용체(녹색 세포)로 형질 도입된 쥬르카트 세포를 포획하기 위한 바코드된 NP-Mart-1 MHC 사량체의 개략도이다.
도 10B는 본 발명의 구현예에 따른, 혼합된 쥬르카트 세포(녹색 염색) 및 GBM U87 세포(청색 염색)의 형광 이미지를 도시한다.
도 10C는 본 발명의 구현예에 따른, 도 10B의 쥬르카트(녹색 세포) 및 GBM U876(청색 세포) 세포 혼합물로부터 상기 바코드된 NP-Mart-1 MHC 사량체를 분리한 후의 세포 상청액의 이미지를 나타낸다.
도 10D는 본 발명의 구현예에 따른, 도 10B의 쥬르카트(녹색 세포) 및 GBM U876(청색 세포) 세포 혼합물로부터의 상기 바코드된 NP-Mart-1 MHC 사량체의 자성 풀다운(magnetic pulldown)과 관련된 세포의 이미지를 나타낸다.
도 11은 환자 #1의 흉벽, 흉막 및 폐의 흑색종 종양의 컴퓨터 축 단층 영상화(CAT) 스캔을 도시한다.
도 12는 본 발명의 구현예에 따른, 도 5에 열거된 27개의 추정 항원의 바코드된 NP-항원-MHC 복합체 라이브러리를 사용한 2개의 독립적인 세포 포획(주황색의 확장 #1 및 청색의 확장 #2)을 사용하여 환자 #1에 대한 신생항원-특이적 CD8+ T 세포의 포획 백분율을 나타낸 그래프로서, 이는 동일한 방법을 사용하여 포획된 CD4+ 양성 T 세포의 개수로부터 추정된 약 0.5%의 비선택적 포획(non-selective capture)을 포함한다.
도 13은 환자 #1의 종양 유래의 확장된 TIL로부터 검출된 신생항원 모집단을 나타낸 그래프로서, 표시된 3런(run)의 각 런(런 #1 = 녹색, 런 #2 = 적색 및 런 #3 = 청색)에서, 약 10,000개의 CD8+ TIL이 상기 부착된 NP-바코드의 형광-기반 판독을 위한 미세유체 칩의 세포 포획 챔버 내에서 분석되고 분리되었으며; 런 #1 및 런 #2에는 도 5의 27개의 신생항원을 포함하는 동일한 27-요소(27-element) NP 바코드된 항원-MHC 라이브러리를 사용하였고, 런 #3에는 순위 28 내지 50의 신생항원에 특이적인 CD8+ T 세포를 포획하도록 고안된 NP-바코드된 항원-MHC 라이브러리를 사용하였다.
도 14A는 본 발명의 구현예에 따라, 환자 #1에서의 병변 크기의 타임라인(timeline)을 도시하며, 여기서 0일은 항-PD1 치료의 시작에 상응하며, 기준선 종양 생검(적색 별표로 표시됨)은 28일째에 게놈 및 전사체 분석을 위해 수집되었다. 도 11에 도시된 CT 스캔 측정 날짜에 상응하는 흑색 점들과 도 14B의 컬러 데이터 막대(colored data bars)에 상응하는 컬러 화살표(주황색, 자주색/분홍색, 청색, 녹색 및 흑색)가 도시되어 있다.
도 14B는 본 발명의 구현예에 따라, 환자 #1에서 187일째(상단 그래프)(자주색/핑크색 막대)에 수집된 TIL로부터 검출된 신생항원-특이적 T 세포 집단 및 치료 과정 동안의 PBMC의 그래프(도 14A에 도시된 병변 크기와 상응하는 것은 화살표의 색상과 동일한 주황색, 녹색 및 청색 막대로 표시) 및 기준선 RNA-염기서열 분석으로부터의 돌연변이 단백질에 대한 돌연변이-함유 mRNA 판독 계수(하단 그래프)를 나타내며, 여기서 상기 PBMC 분석 그래프의 수평 파선은 T 세포 집단의 확인이 통계적으로 유의해지는 신호 임계치를 나타내고; 수직 회색 파선은 상이한 시점 및 환자 물질에 걸쳐 검출된 T 세포 집단을 나타내는 반면, 수직 주황색 파선은 41일째에 검출된 전사체 및 상응하는 T 세포 집단에 상응하며; 상기 TIL 분석에서는 MART-1 종양 항원이 라이브러리 요소 #50으로 포함된 반면, PBMC의 경우 조건부 항원(MHC-J)을 포함하는 라이브러리 요소가 이러한 요소로 포함되었다.
도 15A는 본 발명의 구현예에 따른, 건강한 공여자 PBMC(주황색) 및 동일한 임상 시험 내의 비관련(unrelated) 흑색종 환자 유래의 PBMC(청색)로부터 CD8+ T 세포를 포획하기 위해 환자 #1을 위해 고안된 NP-바코드된 항원-MHC 라이브러리를 사용하여 분리된 T 세포의 평균 개수를 나타내는 대조군 실험의 그래프이다.
도 15B는 본 발명의 구현예에 따른, x-축 상의 수치 표지가 추정 신생항원 의 순위에 상응하는 그래프로서, 도 15A의 두 대조군 간에 상관 관계가 없음을 나타내며, 주황색 막대는 건강한 PMBC를 나타내고 청색 막대는 다른 환자(환자 #1이 아님)의 흑색종 PMBC를 나타낸다.
도 16은 환자 #2에 대해 추정된 상위 28개의 신생항원과 MART-1 종양 항원에 기초한 NP-바코드 NACS 라이브러리를 사용한 신생항원-특이적 CD8+ T 세포 집단에 대한 환자 #2 TIL의 그래프 분석(녹색 막대가 있는 상부 그래프)을 나타내며, 여기서 3000 TIL 당 5개 초과의 세포가 검출된 T 세포 집단만이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었으며, 하부 그래프(회색 막대)는 상기 신생항원이 유래된 돌연변이된 단백질에 대해 측정된 mRNA 사본을 나타낸다.
도 17은 환자 #1 TIL의 다중 흐름 분석(multiplex flow analysis)으로부터의 데이터를 나타내며, 여기서 T 세포는 형광-스트렙타비딘 컨쥬게이트된 신생항원 다량체로 염색되며, 범례에 표시된 2색 바코드를 가지며, 상기 흐름 데이터로부터, 신생항원 #12는 10개 초과의 세포에서 두 가지 색으로만 나타난다는 점과 이러한 다중 방법(multiplx method) 사용시, 흐름 데이터가 개별 세포를 분석할 수 없는 점으로 인해, #7, Mart-1, #19 및 #27과 같은 다른 신생항원(파선 상자)은 모호하다는 점이 분명히 확인되었다.
도 18은 본 발명의 구현예에 따른, 항-PD-1 치료를 시작한 후 439일째에 수집된 혈액 채취를 사용하여 스크리닝된 환자 #1 특이적 바코드된 NP-항원-MHC 라이브러리를 사용하여 환자 #1의 PBMC에서 분석된 T 세포의 개수를 나타내는 그래프이며, 평균의 두 표준 편차(라이브러리 요소 당 2.2±1.4 세포)를 초과하여 분리된 T 세포 집단은 나타나지 않았다.
도 19A는 본 발명의 구현예에 따른, 2 mm 간격으로 배치되도록 설계된 단일 세포 트랩(최상위 채널에 흑색 화살표로 표시됨)을 갖는 단일 세포 트랩 장치를 개략적으로 도시한 것으로서, 2 mm를 나타내는 눈금자로 다른 트랩된 세포를 방해하지 않으면서 1 mm 세포 펀처(puncher)를 사용하여 특정한 트랩된 세포를 분리하였다.
도 19B는 본 발명의 구현예에 따른, 50 ㎛를 나타내는 눈금자를 갖는 단일 세포 트랩의 현미경 이미지이다.
도 20A는 본 발명의 구현예에 따른, 환자 #1의 포획된 바코드된 T 세포 및 신생항원 #12에 대한 특이성을 확인하기 위한 3개의 순차적인 형광 판독 단계(각각 황색, 적색 및 녹색)의 광학 현미경 사진(왼쪽에서 오른쪽)을 나타내고, 여기에는 20 ㎛를 나타내는 눈금자가 포함되어 있으며; 포획된 단일 T 세포를 순차적으로 펀치 아웃하여(punch out) RT-PCR을 수행하여 TCRα 및 TCRβ 유전자 서열(DNA 사다리: 100bp)을 수득하고, 수득된 TCR 유전자를 조립하여 레트로바이러스 벡터(개략적으로 도시됨)에 도입하여 쥬르카트 T 세포 (녹색으로 개략적으로 도시됨) 내로 주입하여 유세포 분석(flow cytometry)을 수행하는 것을 도시한다.
도 20B는 본 발명의 구현예에 따른, 형질 도입되지 않은 쥬르카트 세포(좌측), LNGFR 발현 리포터(reporter)로 형질 도입된 쥬르카트 세포(중앙) 및 NGFR 및 신생항원 12에 특이적인 TCR로 형질 도입된 쥬르카트 세포(우측)에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸다.
T-세포 매개 면역은 도 1에 도시된 바와 같이, 주조직 적합성 복합체(MHC) 내의 외래 항원의 에피토프를 표면 상에 전시하는 세포에서의 세포 사멸을 유도할 수 있는 항원-특이적 세포독성 T 세포의 활성화를 특징으로 한다. 외래 항원이 적재된 MHC 복합체를 전시하는 이들 세포에는 바이러스-감염된 세포, 세포내 박테리아를 갖는 세포 및 종양 항원을 전시하는 암세포가 포함된다. T-세포 매개 면역 과정, 예를 들어, 환자-특이적 암 면역요법을 이용하기 위해 초기 단계 중 하나에는 환자의 종양-특이적 항원(즉, 신생항원)의 확인이 포함된다. 환자의 추정 신생항원(종양 또는 병원균)을 확인하기 위해, 종양, 바이러스 또는 세균의 염기서열 분석 데이터를 분석하여 추정상 발현된 신생항원에 상응하는 체세포 돌연변이를 확인하는 인 실리코 예측 알고리즘(in silico predictive algorithm) 프로그램이 사용된다. 또한, 인간 백혈구 항원(HLA) 타이핑(typing)은 환자의 종양 또는 혈액 표본으로부터 측정되며, 이러한 HLA 정보는 상기 언급된 Fritsch et al., 2014에 의해 입증되고 도 2 A 및 도 2B에 도시된 바와 같은 MHC 결합에 대한 예측 알고리즘에서 확인된 추정 신생항원 펩타이드 서열과 함께 이용된다. 이러한 인 실리코 분석은 동종 항원-특이적 T 세포의 스크리닝을 위해 쉽게 합성될 수 있는, 환자의 신생항원 펩타이드 후보 목록의 순위를 결정한다. 본 명세서에서 사용된 "항원-특이적 T 세포(antigen-specific T cells)"는 항원 특이성을 부여하는 T 세포 수용체(TCR)에 의해 서로 구별되는 세포를 의미한다.
신생항원-특이적 T 세포를 스크리닝하기 위한 현재 공지된 방법은 시간 소모적이고/거나 감도가 낮으며, 대부분의 방법은 HLA 유전자형 당 단지 몇 개의 T 세포만을 확인한다. 본 발명의 구현예는 재조합 항원-적재된 MHC 조성물, 및 환자-특이적 항원, 예를 들어 신생항원을 표적으로 하는 환자-특이적 T 세포 집단을 높은 정확도로 신속하고 비파괴적으로 분리 및 확인하기 위한 용이한 디코딩 방법을 포함한다. 본 발명의 구현예는 고유한 재조합 항원-MHC 복합체에 연결된 고유한 폴리뉴클레오타이드 바코드(NP)를 갖는 나노 입자(NP)를 포함한다. 상기 바코드된 나노 입자-항원-MHC 복합체를 이용하여, 상기 항원-MHC 복합체와 짝을 이루는 T 세포가 상기 나노 입자의 선택적 분리에 의해 항원-MHC-T 세포 복합체로 분리된다. 상기 분리된 항원-MHC-T 세포 복합체를 세포 트래핑 플랫폼(cell trapping platform)으로 전달하여 개별 항원-MHC 복합체-T 세포로 분리할 수도 있다. 본 발명의 구현예에 따르면, 각각의 분리된 NP에 대한 고유한 바코드는 계내 증폭(in situ amplification) 또는 형광 표지된 바코드 센스 가닥 "판독기"(fluorescently labeled barcode sense strand "readers")를 사용하여 확인된다. 이러한 나노 입자 분리 및 바코드 식별 방법은 상기 개별 항원-MHC-T 세포 복합체를 확인하지만 파괴하지는 않는다. 따라서, 상기 분리된 T 세포는 확인 후, 추가 특성 규명(예를 들어, 종양 바이오 마커 분석) 또는 추가 증식을 위한 귀중한 공급원으로서 이용 가능하다. 상기 T 세포의 추가 성장은 환자-특이적 항원을 표적으로 하는 농축된 환자-유래 T 세포 집단을 생성한다. 환자-특이적 항원을 표적으로 하는 환자-유래 T 세포의 이러한 집단은 종양 또는 병원체를 표적으로 하는 면역 요법의 수단으로서 환자에 대한 양육세포 이입(adoptive cell transfer)에 사용될 수 있다.
본 발명의 구현예에 따른 조성물은 바코드된 나노 입자(NP) 분류제와 복합체화되어 바코드된 NP-항원-MHC 복합체를 형성하는 재조합 항원-MHC를 포함한다. 상기 바코드된 NP-항원-MHC 복합체는 도 3A 및 도 3B에 개략적으로 도시된 바와 같이 모듈형이다. 상기 바코드된 NP-항원-MHC 복합체는 항원-MHC 복합체 및 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인(도 3B에서 흑색으로 도시됨)에 의해 함께 연결된 바코드된 NP 복합체로 이루어진다. 상기 바코드된 NP-항원-MHC 복합체의 모듈형 형태로 인해, 상기 바코드된 코딩 영역은, 함께 분석되고 이후 분리되고 확인될 수 있는 상이한 복합체의 수를 증가시키고 특이성을 부가하도록 용이하게 변형될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 검출 태그를 형성하는 바코드된 코딩 영역을 사용하여, 각 항원은 위치 당 n개의 가능한 서열을 허용하는 고유한 n-위치 바코드 폴리뉴클레오타이드 서열과 관련지어지게 된다. 3-위치 바코드의 일례는 도 3B 및 도 3C에서 상이한 색상(황색, 적색 또는 녹색)으로 도시된다. 이러한 3-위치 바코드는 33 또는 27-플렉스(27-plex) 항원 라이브러리를 생성하며, 상기 27개의 상이한 항원 각각은 상기 복합체의 분리시 쉽게 측정될 수 있는 특정 바코드를 갖는다. 하나의 T 세포 현탁액으로 27개의 상이한 항원을 스크리닝하는 능력은 보다 많은 시간을 소비하는 현재의 방법에 비해 중요한 이점이다. 상기 바코드된 NP-항원-MHC 복합체의 각 모듈 구성 요소는 아래에서 보다 상세히 설명된다.
인 실리코 분석은 신생항원을 확인하는데 사용될 수 있다. 추정 신생항원을 확인하기 위한 인 실리코 분석에는 환자의 종양, 바이러스 또는 박테리아의 게놈(DNA) 또는 엑솜(RNA) 서열이 필요하다. 환자에서 발견되는 대부분의 바이러스와 박테리아가 한 명의 환자에게 고유한 것이 아니기 때문에 이들 병원체의 게놈 서열을 알 수 있고 이용 가능한 서열 데이터를 사용할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 알려지지 않은(새로운) 바이러스 및 박테리아와 이전에 확인된 바이러스 및 박테리아 모두가 DNA 또는 RNA 염기서열 분석을 위해 환자로부터(예를 들어, 혈액 표본로부터) 분리될 수 있다.
종양 암은 환자-특이적 돌연변이를 포함하기 때문에, 환자의 종양 생검 또는 혈액 표본으로부터의 종양 세포의 DNA 또는 RNA 염기서열 분석이 초기 단계로서 수행된다. 본 발명의 구현예에 따라 종양 신생항원의 예를 사용하는 경우, 환자에게 특이적인 종양 신생항원을 확인하는 단계는 환자의 종양 생검 또는 혈액 표본으로부터의 종양 세포의 HLA-타이핑 뿐만 아니라 DNA 및/또는 RNA 염기서열 분석도 포함한다. 체세포 돌연변이 확인(즉, 체세포 돌연변이 호출(somatic mutation calling))을 위해, DNA 또는 RNA 염기서열 분석은 환자의 일치하는 정상 종양 또는 혈액 표본(a matched normal patient tumor or blood sample)에서도 또한 수행된다. 집단 종양-정상 염기서열 분석 데이터(collective tumor-normal sequencing data)는 하나 이상의(예를 들어, 2개 또는 3개) 알고리즘 프로그램(예를 들어, MuTect v1.1.7, Varscan2 Somatic (V2.3.6), 및/또는 the GATK-HaplotypeCaller (HC, v3.3))에 입력되어 신생항원을 추정상 발현하는 (신생항원에 대응하는) 체세포 돌연변이를 확인한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 낮은 돌연변이 부담(mutation burden)을 갖는 종양을 갖는 환자의 경우, 인 실리코로 확인된 체세포 돌연변이 모두를 이용하여 T 세포 스크리닝을 위한 후보 종양 신생항원 세트를 형성할 수 있다. 대안적으로, 확인된 모든 체세포 돌연변이를 분석할 수 있지만, 돌연변이 부담이 큰 종양 환자에서는 많은 체세포 돌연변이가 확인될 수 있으므로 상기 확인된 모든 돌연변이를 스크리닝하는 것이 효율적이지 않을 수 있고 반드시 효과적이지 않을 수도 있다. 따라서, 본 발명의 일부 구현예에서, 인 실리코에 의해 확인된 체세포 돌연변이는 3개 이상의 알고리즘 프로그램과 이후 2개 이상의 알고리즘 프로그램에 의해 관찰하여 가장 높은 순위의 체세포 돌연변이로 순위가 매겨진다. 관리할 수 있는 개수의 후보 신생항원 펩타이드를 스크리닝하기 위해, 환자의 HLA 유형은 HLA 타이핑용 소프트웨어(예를 들어, ATHLATES)를 사용하여 종양 엑솜 서열 데이터로부터 측정된다. 환자-특이적 HLA 유형에 대한 소프트웨어(예를 들어, NetMHC3.4 server)를 사용하여 환자의 생검된 종양 또는 혈액 표본의 추정 신생항원 서열을 확인한다.
본 발명의 구현예는 동족 T 세포와 짝을 이룰 수 있는 재조합 항원-MHC 복합체를 포함한다. 본 명세서에서, "항원-복합체", "항원-MHC", "항원-MHC 복합체", "재조합 항원-MHC 복합체", "펩타이드 MHC"및 "p/MHC"는 상호 교환적으로 사용되며, 재조합 주조직 적합성 복합체와 이의 항원 결합 그루브(antigen binding groove) 내의 펩타이드를 의미한다. 본 명세서에서, "항원"은 환자-특이적 신생항원을 포함하는 임의의 항원을 포함한다.
본 발명의 구현예에 따른 재조합 항원-MHC 복합체는 재조합 MHC 분자를 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 MHC 복합체는 CD8-양성 (CD8+) T "킬러(killer)" 세포와 짝을 이루는 ＭＨＣ 제 I 부류(MHC Class I) 복합체일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 MHC 복합체는 CD4+ "헬퍼(helper)" T 세포와 짝을 이루는 MHC 제 II 부류(MHC II) 복합체일 수 있다. MHC 제 I 부류 복합체에 의해 제시되는 항원은 세포질 단백질인 반면, MHC 제 II 부류 복합체에 의해 제시되는 항원은 세포외 단백질로부터 유도된다. 종양 세포는 돌연변이를 발현하는 내인성으로(endogenously) 유도된 세포이기 때문에 종양 항원은 일반적으로 MHC 제 I 부류 분자에 의해 제시되어 CD8+ T 세포와 짝을 이룬다. 유사하게, 바이러스 단백질은 환자의 세포로부터 내인성으로 발현되며, 또한 MHC 제 I 부류 분자에 의해 CD8+ T 세포에 제시된다. 그러나 박테리아 세포는 자체 세포 기계(cellular machinery)를 사용하여 단백질을 발현하며, 이는 환자의 감염시 외인성으로 발현되는 것으로 간주되며 환자의 MHC 제 II 부류 분자에 의해 CD4+ T 헬퍼 세포에게 제시된다. MHC 제 III 부류 분자는 보체 성분(complement components)(예를 들어, C2, C4, 인자 B) 및 사이토카인(예를 들어, TNF-α) 및 열충격 단백질(heat shock proteins)(hsps)을 인코딩하는 성분과 같은 다른 면역 성분을 포함한다.
본 발명의 구현예에 따르면, 상기 재조합 항원 MHC 복합체의 MHC I 또는 MHC II 분자는 환자의 HLA 유형에 상응하도록 합성된다. MHC I 및 MHC II 분자 모두에서 다형성(polymorphisms)이 발견된다. MHC 제 I 부류 분자는 2개의 폴리펩타이드 사슬, 즉 α 및 β2-마이크로글로불린(b2m)으로 이루어진 이종이량체(heterodimer)이다. 상기 α 사슬은 α1, α2 및 α3을 포함한 3개의 도메인을 갖는다. 상기 α 사슬과 b2m 사슬은 b2m과 상기 α 사슬의 α3 도메인의 상호 작용을 통해 비공유 결합된다. 상기 α 사슬은 다형성이며(polymorphic) 상기 HLA 유전자 복합체에 의해 인코딩되는 반면, 상기 b2m 아형(subunit)은 다형성이 아니며 상기 b2m 유전자에 의해 인코딩된다. 상기 α 및 b2m 사슬의 조립은 상기 α1 및 α2 도메인 표면 상의 항원 결합 그루브에 적재된 9 내지 11 아미노산 펩타이드 항원의 존재에 의해 안정화된다. 본 발명의 구현예에 따르면, 환자-특이적 MHC 제 I 부류 항원은 환자의 HLA 유형에 상응하는 재조합 MHC 제 I 부류 복합체 상에 제시된다. 예를 들어, MHC I α 사슬은 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C 유전자에 의해 인코딩된다. HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자 각각은 대립 유전자-특이적(allele-specific) 아형을 발현하며, 이 중 일부를 실시예 19의 표 7에 기재하였다.
MHC 제 II 부류 분자는 2개의 폴리펩타이드 사슬, 즉 α및 β로 이루어진 이종이량체이다. 상기 α와 β 사슬는 각각 α1과 α2 및 β1과 β2의 두 도메인을 가지고 있다. 상기 α와 β 사슬은 모두 다형성이며 상기 HLA 유전자 복합체에 의해 인코딩된다. 상기 α 및 β 사슬의 조립시, 상기 α1 및 β2 도메인의 표면 상에 11 내지 30 아미노산의 항원 펩타이드 길이를 갖는 항원 결합 그루브가 형성된다. 본 발명의 구현예에 따르면, 환자-특이적 MHC 제 II 부류 항원은 환자의 HLA 유형에 상응하는 재조합 MHC 제 II 부류 복합체 상에 제시된다. 예를 들어, 상기 HLA 유전자는 HLA-DM, HLA-DO, HLA-DQ 및 HLA를 포함하며, 여기서 상기 MHC II a 사슬은 상기 HLA-A-DMA, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DQA2 또는 HLA-DRA 유전자에 의해 인코딩되고, 상기 β 사슬은 HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 또는 HLA-DRB5 유전자에 의해 인코딩된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 재조합 MHC 분자는 Novak et al., 1999, J. Clin. Invest. 104:R63-R67에 기재된 바와 같은 후보 항원 펩타이드가 함께 발현 및 적재되는 MHC 제 II 부류 분자이며, 이 문헌의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 재조합 MHC 분자는 조건부 리간드로서 발현되는 MHC 제 I 부류 분자이다. 상기 MHC 제 I 부류 분자는 펩타이드(즉, 항원 펩타이드)의 부재시 불안정하기 때문에, 재조합 MHC 제 I 부류 분자는, UV 광 조사시 상기 복합체로부터 해리되어 분해되는 절단성 모이어티(cleavable moiety)를 갖는 펩타이드와 함께 발현된다. 그러나, 도 3A에 도시되고 Toebes et al., 2006, Nat. Med. 12:246-251 및 Bakker et al., PNAS, 2008, 105:3825-3830에 개시된 바와 같이, 상기 절단성 펩타이드의 UV 분해가 "구조 펩타이드(rescue peptide)"의 존재 하에 수행되는 경우, 상기 구조 펩타이드는 상기 결합 그루브 내의 UV 조사된 펩타이드를 용이하게 대체할 것이다. 위 문헌들의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 이 기술을 사용하여 여러 개의 조립된 MHC 제 I 부류 분자에 후보 신생항원을 쉽게 적재하여 T 세포를 스크리닝하기 위한 MHC 제 I 부류 신생항원 라이브러리를 형성할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 재조합 MHC 분자는 각각 동일한 후보 항원 펩타이드로 적재된 4개의 MHC 분자의 사량체 복합체이다. 대부분의 신생항원은 MHC 단백질에 대해 낮은 결합 친화력(Kd)(예를 들어, 500 nM 이하)를 가지므로, 사량체 MHC 복합체는 결합 친화력을 증가시켜, 미량의 동족 T 세포와 짝을 이루는 이 항원-MHC 사량체 프로브의 민감성을 증가시킨다. 본 발명의 일부 구현예에서, MHC 사량체는 4개의 바이오틴-변형된 MHC 분자와 컨쥬게이트된 변형된 스트렙타비딘을 사용하여 형성된다. 상기 스트렙타비딘은 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, DNA 또는 RNA) 연결기(linker)의 결합이 가능하도록 변형된다. 상기 스트렙타비딘의 변형은 상기 폴리뉴클레오타이드 분자에 연결된 상응하는 동족 결합 모이어티와 짝을 이룰 수 있는(예를 들어, 공유 결합할 수 있는) 결합 모이어티를 포함한다. 임의의 적합한 결합 모이어티 쌍이 스트렙타비딘 및 연결될 폴리뉴클레오타이드를 변형시키는데 사용될 수 있다. 결합 모이어티 쌍의 비제한적인 예에는 티올기(예를 들어, 시스테인) 및 말레이미드, 아다만탄 및 시클로덱스트린, 아미노기 및 카르복시기 및 아지드기 및 알킨기(즉, 클릭 화학(click chemistry))가 포함된다. 도 3A는 말레이미드-변형된 DNA 혼성화 도메인에 연결된 시스테인-변형된 스트렙타비딘("DNA-표지된 사량체")의 예를 도시한다.
복수의 항원-MHC-T 세포 짝-형성의 스크리닝에 관한 현재의 과제 중 하나는 짝을 이룬 펩타이드 항원에 상응하는 T 세포 수용체 에피토프의 분리 및 확인이다. 본 발명의 구현예는 폴리뉴클레오타이드 검출 태그(즉, 바코드)에 연결된 변형된 나노 입자를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그는 하나 이상의 코딩 영역을 포함한다. 상기 복합체를 이용하는 방법과 상기 복합체는 나노 입자-바코드된 핵산 분류(NP-바코드된 NACS)(nanoparticle-barcoded nucleic acid cell sorting(NP-barcoded NACS)) 및 나노 입자 분류제(nanoparticle sorting agent)로 지칭된다. 일부 구현예에서, 상기 나노 입자는 자석을 사용하여 분리하기 위해 자성을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 나노 입자는 중력에 의해 분리되는 1㎛ 내지 15㎛ 폴리스티렌 입자이다. 본 발명의 구현예에 따르면, 상기 나노 입자는 상기 폴리뉴클레오타이드 코딩 영역에 연결하기 위한 결합 모이어티로 변형된다. 상기 나노 입자의 변형은 상기 폴리뉴클레오타이드 분자에 연결된 상응하는 동족 결합 모이어티와 짝을 이룰 수 있는(예를 들어, 공유 결합할 수 있는) 결합 모이어티를 포함한다. 임의의 적합한 결합 모이어티 쌍이 상기 나노 입자 및 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그를 변형시켜 결합시키는데 사용될 수 있다. 결합 모이어티 쌍의 비제한적인 예에는 티올기(예를 들어, 시스테인) 및 말레이미드, 아다만탄 및 시클로덱스트린, 아미노기 및 카르복시기 및 아지드기 및 알킨기가 포함된다.
본 발명의 구현예는 바코드된-나노 입자 복합체를 포함하며, 상기 바코드는 T 세포 분리 후 식별을 위한 고유한 항원-특이적 서열을 제공하는 코딩 영역으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 검출 태그이다. 본 명세서에서, "코딩 영역(coding region)"은 다른 폴리뉴클레오타이드와 별개인 고유하고 특이적인 서열을 갖는 뉴클레오타이드의 세트이다. 일부 구현예에서, 하나의 폴리뉴클레오타이드 코딩 영역은 5 내지 25개의 뉴클레오타이드 염기쌍으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 하나의 폴리뉴클레오타이드 코딩 영역은 7 내지 25개의 뉴클레오타이드 염기쌍, 8 내지 25개의 뉴클레오타이드 염기쌍, 9 내지 25개의 뉴클레오타이드 염기쌍, 10 내지 25개의 뉴클레오타이드 염기쌍, 10 내지 20개의 뉴클레오타이드 염기쌍, 10 내지 19개의 뉴클레오타이드 염기쌍, 10 내지 18개의 뉴클레오타이드 염기쌍, 10 내지 17개의 뉴클레오타이드 염기쌍, 또는 10 내지 16개의 뉴클레오타이드 염기쌍을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 바코드된 나노 입자 복합체는 하나 이상의 코딩 영역을 갖는 폴리뉴클레오타이드 검출 태그(즉, 1-위치 바코드)를 갖는다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 코딩 영역의 개수(n)는 함께 스크리닝되고 이어서 식별될 수 있는 상이한 항원의 개수에 상응한다. 코딩 영역을 계내에서(in situ) 분석하기 위해, 상이한 코딩 영역의 개수는 상이한 착색 형광 염료의 개수에 의해서만 제한된다. 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 디코딩을 위해, 상기 코딩 영역은 제 1 코딩 영역 또는 코딩 영역 1로 지칭되는 나노 입자에 부착된 코딩 영역부터 시작하여 "판독"된다. 상기 나노 입자로부터 멀어지는 방향의 임의의 다음 코딩 영역은 제 2 코딩 영역(코딩 영역 2)이며, 이어서 제 3 코딩 영역(코딩 영역 3) 등이 이어진다. 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, ssDNA) 혼성화 도메인(흑색)을 갖는 3개의 코딩 영역을 갖는 폴리뉴클레오타이드 검출 태그에 연결된 나노 입자의 예를 도 3B에 "NP 바코드 라이브러리"로 도시하였다. 본 발명의 구현예에 따른 바코드된-NP 복합체의 라이브러리에서, 각각의 폴리뉴클레오타이드 검출 태그 서열은 다른 모든 폴리뉴클레오타이드 검출 태그 서열에 대해 고유하다. 본 발명의 일부 구현예에서, 코딩 영역 서열은 하나 이상의 검출 태그 서열에서 발견될 수 있는 반면, 각 코딩 영역 서열은 하나의 코딩 영역 위치에만 존재할 수 있다. 예를 들어, ssDNA의 3-위치 코딩 영역 라이브러리는 코딩 영역 1 내의 코딩 영역 D1, 코딩 영역 D2 및 코딩 영역 D3, 코딩 영역 2 내의 코딩 영역 D5, 코딩 영역 D6 및 코딩 영역 D7, 및 코딩 영역 3 내의 코딩 영역 D9, 코딩 영역 D10 및 코딩 영역 D11을 포함하여, 도 4의 표에 열거된 바와 같이 27개의 상이한 검출 태그 서열로 이루어진다.
본 발명의 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인은 상기 바코드된 NP의 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 3' 말단에 연결되고, 제 2 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인은 상기 항원-MHC 복합체의 스트렙타비딘 스캐폴드(scaffold)에 연결된다. 따라서, 상기 항원-MHC 복합체는 상보적인 혼성화 도메인의 혼성화를 통해 바코드된 나노 입자에 연결된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 제 1 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인 및 상기 제 2 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인은 각각 제 1 및 제 2 혼성화 서열을 갖는 단일 가닥 DNA(ssDNA)일 수 있으며, 상기 제 1 및 상기 제 2 혼성화 서열은 상보적이어서, 도 3B 및 도 3C에서 겹치는 흑색 선으로 도시된 바와 같이, 혼성화된 이중 가닥 DNA(dsDNA)의 연결기를 형성한다. 일부 구현예에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 혼성화 도메인은 "보편적(universal)"이고, 라이브러리 내의 모든 항원-MHC 복합체 및 모든 바코드된 NP 복합체에 대해 동일하다. 보편적 혼성화 도메인을 사용하면, 상기 혼성화 도메인이 부착된 하나의 스트렙타비딘 분자의 합성이 가능하다. 또한, 제한 부위(restriction site) 또는 UV 절단성 서열을 인코딩하는 보편적 혼성화 도메인을 사용하면 상기 NP-바코드로부터 상기 항원-MHC 복합체를 신속하게 절단할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 제 1 및 상기 제 2 혼성화 도메인은 각 바코드된 NP-항원-MHC 복합체에 대해 상이하다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 각각의 고유한 항원-MHC 복합체는 고유한 바코드 서열에 연결된다(즉, 혼성화된다). 본 발명의 일부 구현예에서, 바코드된 NP-항원-MHC 복합체 라이브러리의 제조는 후보 항원 및 그의 상응하는 바코드(즉, 폴리뉴클레오타이드 검출 태그 서열)의 기록(예를 들어, 키(key) 또는 범례(legend))을 포함한다. 이 코딩 키는 T 세포와 짝을 이루는 특정 항원을 효율적으로 식별하는 데 도움이 된다. 도 4의 후보 항원(환자-특이적 후보 신생항원 및 MART-1 종양 항원)의 목록에 대한 항원 및 바코드 키를 도 5A 및 도 5B에 도시하였다.
본 발명의 구현예는 항원-특이적 T 세포를 스크리닝하는 데 사용하기 위한 바코드된 나노 입자-항원-MHC 복합체를 포함한다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 단일 항원은 T 세포의 존재 하에 상기 복합체를 사용하여 분석될 수 있다. 그러나 하나의 후보 항원을 분석하는 것은 복수의 후보 항원을 스크리닝하는 것만큼 효율적이지는 않다. 본 발명의 구현예에 따르면, 상이한 후보 항원과 바코드된 NP-항원-MHC 복합체의 라이브러리를 형성하는 상응하는 고유한 코딩 영역을 사용하여 상이한 바코드된 NP 항원-MHC 복합체가 제조된다. 하기 방법은 상기 바코드된 NP-항원-MHC 복합체의 라이브러리를 사용하여 기재되지만, 이 방법은 단일 후보 항원을 스크리닝하기 위해 수행되거나 쉽게 조정될 수 있다.
본 발명의 구현예에 따르면, 바코드된-NP-항원-MHC 복합체의 라이브러리를 사용하여 환자-유래 및 항원-특이적 T 세포를 분리 및 확인하는 단계는 상기 후보 항원 복합체를 환자-유래 T 세포와 함께 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 환자-유래 T 세포는 환자의 말초혈액 단핵세포(PBMC) 또는 종양 침윤 림프세포(TIL)로부터 분리된다. 본 발명의 일부 구현예에서, CD4+ 또는 CD8+ 세포만을 분리하기 위해, CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두가, 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting)(FACS)을 사용하여 분류된 CD4+ 및 CD8+ 단일-양성 세포의 라이브 집단(live populations)과 항-CD4 및 항-CD8 형광 항체를 사용하여 표지되고 PBMC 또는 TIL로부터 분류된다. 본 발명의 일부 구현예에서, CD4 및 CD8 모두에 양성인 T 세포는 항-CD3 형광 항체 및 후속적으로 FACS를 사용하여 분리될 수 있다. 당업자는 사용되는 항원-MHC 복합체의 유형 또는 유형들에 대해 분리할 T 세포의 유형을 결정할 수 있다. 예를 들어, 상기 라이브러리가 독점적으로 MHC I 분자로 구성된 경우, T 세포 집단은 오로지 CD8+일 수 있는 반면, MCH II 분자는 CD4+ T 세포를 필요로 할 것이다. 다른 구현예에서, MHC I 및 MHC II 분자 모두를 갖는 항원 라이브러리는 CD4 및 CD8 모두에 양성인 T 세포와 함께 배양될 수 있다. 또 다른 구현예에서, MHC I 또는 MHC II 분자를 갖는 항원 라이브러리는 CD4 및 CD8 모두에 양성인 T 세포로 스크리닝될 수 있다.
본 발명의 구현예는 바코드된 NP-항원-MHC 복합체 라이브러리를 CD4+, CD8+ 또는 CD4+/CD8+ T 세포의 현탁액과 함께 배양하는 단계를 포함한다. 상기 T 세포 현탁액과 함께 상기 나노 입자 라이브러리를 배양하면 나노 입자-결합된 항원을 다양한 T-세포 수용체에 완전하고 철저하게 노출시킬 수 있다. 이 방법은 세포를 흔들거나 또는 회전하는 단계를 포함 할 수 있다. 상기 항원 복합체와 상기 T 세포의 배양 후, 상기 나노 입자는 선택적으로 분리되거나 선택적으로 수집된다. 예를 들어, 상기 나노 입자가 자성인 경우, 상기 현탁액에 자석을 적용하면, 복합체 내의 나노 입자를 항원과 짝을 이룬 T 세포와 분리하고 짝을 이루지 않은 T 세포를 제거할 수 있다. 짝을 이룬 T 세포와 함께 분리된 자성 나노 입자의 예를 도 6에 개략적으로 도시하였다. 대안적으로, 상기 나노 입자가 폴리스티렌 나노 입자인 경우, 상기 짝을 이루지 않은 T 세포는 중력(예를 들어, 원심 분리)에 의해 분리될 수 있다. 짝을 이루지 않은 T 세포의 분리 후, 일부 구현예에서, 상기 분리된 나노 입자를 1회 이상 세척하여 임의의 비특이적으로 결합된 T 세포를 제거한다.
상기 나노 입자 복합체로 분리된 짝을 이룬 T 세포의 분석을 위해, 상기 세포는 장치의 채널 내의 개별 위치("트랩")에서 단일 세포를 분리하고 배치시키는 미세유체 장치에 적재된다.
본 명세서에서, 상기 바코드된 나노 입자 항원-MHC 복합체와 관련하여, "짝을 이룬 T 세포(a paired T cell)"및 "T 세포와 짝을 이룬 항원 MHC 복합체(a T cell paired antigen MHC complex)"는 바코드된 나노 입자 항원-MHC 복합체 내의 항원 펩타이드와 결합한 T 세포 수용체 에피토프를 갖는 T 세포의 복합체를 지칭한다. 따라서, 상기 짝을 이룬 T 세포가 상기 세포 트래핑 장치 내에서 분리되면서, 상기 짝을 이룬 항원-MHC 복합체의 코딩 영역(바코드)이 계내에서(in situ) 확인되어 상기 동족 펩타이드 항원의 서열을 측정한다. 따라서, 각각의 코딩 영역은 코딩 영역 1부터 판독된다. 코딩 영역 1에 대한 모든 가능한 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열이 구별 가능한 형광 염료에 연결되어, 상기 나노 입자 상의 상보적 코딩 영역과 상기 형광을 혼성화시키는 염료-폴리뉴클레오타이드 디코더(decoder) 서열을 형성하여 코딩 영역 1을 "판독"한다. 본 명세서에서, "구별 가능한 형광 염료(distinguishable fluorescent dye)" 및 "구별 가능한 염료(distinguishable dye)"는 다른 염료와 시각적으로 구별되는 색상의 염료를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드에 연결될 수 있는 임의의 적합한 염료가 사용될 수 있다. 상기 제 2 코딩 영역을 판독하기 위해, "변위" 폴리뉴클레오타이드를 첨가하여 코딩 영역 1의 염료-폴리뉴클레오타이드 디코더와 동시에/또는 그 이후, 코딩 영역 2에 상응하는 가능한 모든 염료-폴리뉴클레오타이드 디코더 서열을 제거한다. 하나 이상의 코딩 영역의 상기 디코딩에서, 코딩 영역 1이 판독된 후, 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그는 부분적으로 디코딩된다. 즉, "부분적으로 디코드된 폴리뉴클레오타이드 검출 태그"는 하나 이상의, 그러나 전부는 아닌, 디코딩된 코딩 영역을 갖는다. 이러한 판독-변위/판독-변위/판독 방식을 사용하여 후속적인 코딩 영역을 판독한다. 이러한 계단식 판독 기술은 도 7에 도시된 바와 같이 바코드된 입자를 사용하여 검증되었다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 바코드된 나노 입자의 라이브러리 내의 코딩 영역의 형광 판독의 경우, 하나의 구별 가능한 형광 염료는 각 코딩 영역 위치에 대한 하나의 디코더 서열과만 관련될 수 있다. 예를 들어, 코딩 영역 2를 판독하는 경우, 적색 형광 염료는 코딩 영역 2를 디코딩하기 위한 하나의 특정 디코딩 서열에만 대응할 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 디코더 서열은 ssDNA 또는 RNA이다. 예를 들어, 도 8A의 표에 열거된 바와 같이, ssDNA 디코딩 서열 M1, M2, M3, M5, M6, M7, M9, M10 및 M11은 각각의 코딩 영역 D1, D2, D3, D5, D6, D7, D9, D10 및 D11에 혼성화하는 형광 염료-결합된 디코딩 서열이며(도 4), 각각의 디코딩 서열은 대응하는 형광 염료의 색상으로 도시된다. 도 8A의 각각의 디코딩 서열에 상응하는(즉, 혼성화하는) 변위 ssDNA 서열의 예에는 도 8B의 표에 열거된 바와 같이 M1comp, M2comp, M3comp, M5comp, M6comp, M7comp, M9comp, M10comp 및 M11comp가 포함된다.
본 발명의 일부 구현예에서, T 세포와 짝을 이룬-항원 MHC 복합체의 코딩 영역(바코드)은 상기 "변위" 폴리뉴클레오타이드 서열과 함께 상기 형광 염료-폴리뉴클레오타이드 디코딩 "리더(Reader)" 서열을 사용하여 계내에서(in situ) 확인된다. 이 방법은, 도 4에 열거된 NP 바코드(검출 태그) 서열을 갖는, 도 5A에 도시된 27개의 항원의 바코드된 NP-항원-MHC 라이브러리를 사용하여 수행되었다. 환자의 종양 침윤 림프세포(TIL)로부터 유래된 T 세포와 배양한 후, 분리된 자성 나노 입자와 결합된 세포를 도 9의 좌측의 10개의 세포 트랩을 갖춘 미세유체 챔버의 광학 현미경 사진에 나타난 바와 같은 미세유체 세포 트래핑 장치에서 분리하였다. 도시된 바와 같이, 상기 세포 트랩 중 단지 9개만이 단일 바코드된 T 세포를 함유한다. 이들 9개의 바코드된 T 세포를 도 8A 및 도 8B에 각각 나열된 형광 염료-결합된 디코딩 ssDNA 서열을 사용하여 판독 및 변위시켰다. 각각의 코딩 영역 리드(read)에 대한 형광 이미지를 도 9의 좌측에서 우측으로 도시하였으며, 코딩 영역 1 이미지는 1st로 표시하고, 코딩 영역 2 이미지는 2nd로 표시하고, 코딩 영역 3 이미지는 3rd로 표시하였다. 상기 9개의 트랩된 세포에 대한 비색(colorimetric) 판독값을 이미지 아래에 제공하였다(R=적색, G=녹색, Y=황색). 8번 위치의 세포는 명확한 리드를 제공하지 않으며 9번 위치의 세포는 손실되었음을 알 수 있다. 본 발명의 구현예에 따른 이 방법을 사용할 때, 분명하고 확실한 판독값을 제공하는 트랩된 세포만이 고려되며, 따라서 스크리닝 과정의 정확도를 제어할 수 있다. 도 5의 바코드 키를 사용하여, 상응하는 신생항원 및 종양 항원 MART-1을 측정하였다. 예를 들어, 도 9의 3번 위치의 세포는 도 5A에 열거된 신생항원 12에 해당하는 YRG를 나타내며, 4번 위치의 세포는 MART-1 종양 항원에 해당하는 RGY를 나타낸다.
본 발명의 구현예는 바코드된 나노 입자의 라이브러리를 제조하기 위한 키트를 포함하며, 상기 키트는 바코드(폴리뉴클레오타이드 검출 태그) 서열, 상기 바코드를 판독하기 위한 상응하는 형광 염료-결합된 폴리뉴클레오타이드 디코더 서열 및 상기 디코더 서열을 제거하기 위한 상응하는 변위 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 ssDNA 또는 RNA를 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 ssDNA이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그 서열은 이의 5' 말단에서 나노 입자를 부착시키기 위한 결합 모이어티로 변형된다. 예를 들어, 도 4의 폴리뉴클레오타이드 검출 태그(ssDNA 바코드)는 스트렙타비딘-나노 입자에 결합하기 위해 바이오틴 분자에 컨쥬게이트되지만, 임의의 적합한 결합 모이어티가 사용될 수 있다. 본 명세서에 기술되고 당업자에게 이해되는 바와 같이, 적합한 결합 모이어티 쌍은 당업계에 공지되어 있다. 결합 모이어티의 비제한적인 예에는 티올, 말레이미드, 아다만탄, 시클로덱스트린, 아민, 카르복시, 아지드 및 알킨이 포함된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 키트는 또한 상기 변형된 폴리뉴클레오타이드 검출 태그 상의 결합 모이어티에 상응하는 동족 결합 모이어티로 변형된, 변형된 나노 입자를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 바코드된 나노 입자의 라이브러리를 제조하기 위한 키트는 또한 임의의 MHC 항원 펩타이드가 적재될 수 있는 재조합 조건부 MHC 사량체 복합체를 포함한다. 상기 MHC는 MHC 제 I 부류 또는 MHC 제 II 부류일 수 있으며 환자의 일배체형(haplotype)에 상응하는 임의의 특정 일배체형을 포함한다. 예를 들어, 상기 키트는 표 7에 열거된 HLA 유형에 상응하는 MHC 제 I 부류 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 HLA-DM, HLA-DO, HLA-DQ 및 HLA에 상응하는 MHC 제 II 부류 분자를 포함할 수 있으며, 여기서 MHC II α 사슬은 HLA-A-DMA, HLA-DOA, HLA-DPA1, HLA-DQA2 또는 HLA-DRA 유전자에 의해 인코딩되고 β 사슬은 HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB1, HLA-DQB1, HLA-DQB2, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 또는 HLA-DRB5 유전자에 의해 인코딩된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 바코드된 나노 입자의 라이브러리를 제조하기 위한 키트는 나노 입자를 부착시키기 위한 변형된 폴리뉴클레오타이드 검출 태그 서열을 포함한다. 트랩된 바코드된 T 세포를 확인하기 위해 대안적인 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그 서열이 미세유체 장치로부터 증폭되고 염기서열 분석될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그 및 상기 트랩된 T 세포와 짝을 이룬 상응하는 항원을 확인하기 위한 계내(in situ) 디코딩 판독 방법을 사용하는 경우 T 세포를 파괴하거나 악영향을 미치지 않는다. 따라서, 항원이 확인된 후, 트랩된 T 세포는 추가 분석 및/또는 성장을 위해 미세유체 장치로부터 제거될 수 있다.
하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 본원의 범위 또는 내용을 한정하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1: 항원-특이적 T 세포의 포획 효율.
세포 혼합물로부터의 Mart-1 항원 특이적 T 세포의 선택적 포획을 이용하여 상기 바코드된 NP-항원-MHC 복합체 라이브러리를 확인하였다. 도 10A는 Mart-1 특이적 T 세포 수용체로 형질 도입된 쥬르카트 세포의 포획을 위한 NP-Mart-1 사량체의 개략도를 도시한다. 도 10B는 혼합된 쥬르카트(녹색 염색) 및 GBM U87 세포(청색 염색)를 나타낸다. 상기 NP-Mart-1 사량체를 상기 혼합된 세포 집단과 함께 배양하고 도 10C에 도시된 상청액으로부터의 세포 및 도 10D에 도시된 자성 풀다운으로부터의 세포와 함께 자기적으로 농축시킨다.
실시예 2: 바코드된 NP-항원-MHC 복합체 라이브러리의 사용.
NP-항원-MHC 복합체 라이브러리 도구를 사용하여, 도 11에 나타난 바와 같이 생검시 항-PD-1 체크포인트 억제제(checkpoint inhibitor) 치료에 긍정적으로 반응한 2명의 전이성 흑색종 암 환자의 치료중 종양 생검(on-treatment tumor biopsies)으로 수집한 종양 침윤 림프세포(TIL)로부터 확장된 CD8+ 세포를 분석하였다. 이들 두 환자는 제 1상 시험에서 항-PD-1 항체인 펨브롤리주맙으로 치료 받았으며, 이 치료법에 대한 반응은 종양 침윤 CD8+ 세포에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다. 각 환자에 대해, 치료전 생검 또한 수집하였으며(도 11), 종양 엑솜 및 유전자 발현에 대해 분석하였다. 인 실리코 분석을 수행하여 추정 신생항원의 목록을 제작하였으며, HLA A*02.01에 대한 예측 Kd에 따라 순위가 매겨졌다(아래 표 1 내지 4). 각 환자에게 고유한 이들 목록으로부터, 상위 27개의 추정 신생항원 및 MART-1 멜라노솜 항원(신생항원 #8은 NP 응집으로 인해 제외됨)을 제시하도록 구성된 NP-바코드된 NACS 라이브러리가 구축되었음을 알 수 있다. 환자 #1의 경우, 신생항원 번호 3, 5, 11, 26, 31, 34, 36, 37, 46 및 48 에 상응하는 돌연변이된 단백질의 전사체는 제로 돌연변이 판독 결과를 나타내었으며(표 3), 상기 미세유체 장치로부터의 신생항원/MHC 결합 친화력의 표본 범위를 포괄하는 대조군으로서 추가 분석 및/또는 성장을 위해 모든 분석에 포함되었다.
[표 1] 환자 #1에 대한 추정 신생항원. 괄호 안의 문자는 천연 펩타이드를 나타냄.
Figure 112017130481021-pct00001
Figure 112017130481021-pct00002
[표 2] 환자 #2에 대한 추정 신생항원. 괄호 안의 문자는 천연 펩타이드를 나타냄.
Figure 112017130481021-pct00003
[표 3] 환자 #1의 신생항원 및 돌연변이된 유전자에 대한 완전 분석.
Figure 112017130481021-pct00004
[표 4] 환자 #2의 신생항원 및 돌연변이된 유전자에 대한 완전 분석.
Figure 112017130481021-pct00005
환자 #1에서 가장 강한 결합을 보인 27개의 신생항원을 도 5A에 나타내었다. 환자 #1의 경우, 상응하는 NP-바코드된 NACS 라이브러리는 4.5 내지 5%의 CD8+ TIL을 포획하였으며, 동일한 환자 종양 유래의 CD4+ T 세포에 대해 상기 라이브러리를 시험하여 측정된 0.5% 비선택적 포획을 포함하였다(도 12). 환자 #1 표본의 경우, 확장된 TIL의 두 개의 별도 바이알 상에서의 두 번의 별도의 런에서, 바코드된 T 세포를 미세유체 칩에 적재하고 순차적 형광 판독을 수행하여 동일한 8개의 신생항원-특이적 T 세포 집단(및 MART-1 특이적 세포)을 동시에 확인하였다(도 13). 모든 집단이 매우 적은 양으로(분석 당 1 또는 2건) 두 분석에서 모두 검출되었다. 가장 풍부한 집단은 신생항원 #12에 특이적이었고 1000개의 확장된 TIL 당 약 12개의 세포를 차지하였다. 환자 #1의 경우, 상기 NP-바코드된 NACS 라이브러리를 추가로 확장하여 28 내지 50 순위의 신생항원(최고 500 nM의 Kd 값)에 대한 특이성에 대해 TILS를 분석하였다. 2개의 추가 집단이 검출되었다(#38과 #45). 바코드된 형광 판독법의 값은 포획된 각 T 세포에 대해 정확도가 높은 리드(read) 또는 때로는 의미가 없는 리드가 존재한다는 것이다(예를 들어, 도 9의 세포 #8 참조). 따라서, 이 접근법의 노이즈 레벨은 매우 낮다. 검출된 신생항원-특이적 T 세포 집단은 3개 이상의 명확한 리드에 의해 확인되거나 환자 #1 TIL의 두 분석 모두에서 검출된 집단으로 정의된다. 50-요소 라이브러리에 대한 환자 #1 TIL의 합계 분석을 도 14B에 기재하였으며, 상응하는 병변 분석을 도 14A에 기재하였다.
실시예 3: PBMC 내의 바코드된 NP-항원-MHC 복합체 라이브러리의 스크리닝.
일부 생체 시료를 일련의 접근법을 사용하여 분석하였으며, 여기서 각 NP-바코드된 NACS 라이브러리 요소를 사용하여 특정 T 세포 집단을 검색하였다. 이 방법은 신생항원-특이적 T 세포 집단이 특히 드물고 희귀하며 형광 판독을 방해할 수 있는 모든 비결합 자성 NP를 제거하는 것이 어려울 수 있는 PBMC의 분석에 가장 유용하다. 이 접근법의 비특이적 풀다운 비율을 특징짓기 위해, 환자 #1을 위해 고안된 NP-바코드된 NACS 라이브러리를 사용하여 건강한 지원자의 PBMC뿐만 아니라 동일한 임상 시험 내의 추가적인, 비관련 흑색종 환자의 확장된 TIL도 분석하였다. 신생항원의 목록은 모든 환자에게 고유한 것이므로 환자 #1 용으로 고안된 라이브러리는 상기 두 대조군 환자 표본의 T 세포 집단을 포획하지 않을 것이다. 두 대조군의 결과는 다음과 같이 유사하였다. 도 15에 나타난 바와 같이, 환자 #1 신생항원 라이브러리는 표준 편차 1.4로 라이브러리 요소 당 평균 2개의 세포를 포획하였다. 따라서, 노이즈 레벨은 세포 5개(평균보다 표준 편차의 2배만큼 많음)로 설정하였다. 상기 두 대조군의 분석에서, 5개보다 많은 세포를 포획한 라이브러리 요소는 없었고, 대조군 간의 상관 관계도 없었으며(도 15), 이는 환자 #1 라이브러리 요소 중 본질적으로 선택성이 낮은 것은 없음을 나타낸다. 환자 #2에 대한 NP-바코드된 NACS 라이브러리에서 5-세포 컷오프(cut-off)을 사용했을 때, 이 환자의 TIL의 일련의 분석은 도 16에 도시된 바와 같이, 환자 #1의 TIL의 상응하는 분석에서 발견된 것과 유사한 수의 신생항원-특이적 T 세포 집단을 나타내었다.
실시예 4: 다중 흐름 분석과의 비교.
두 환자의 TIL 분석 결과 유사한 환자 표본의 다중 흐름 분석을 사용하여 보고된 것보다 더 많은 개수의 신생항원-특이적 T 세포 집단이 발견되었다. 환자 #1의 확장된 TIL은 Andersen et al., 2012, Nat. Protocols, 7:891-902에 기재된 다중 흐름 분석 방법을 사용하여 분석하였으며, 이 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 이 분석을 위해, 추정 신생항원 1-8, 12, 14, 15, 19, 27 및 Mart-1(이 중 8개는 NP-바코드된 NACS를 사용하여 검출됨)을 제시하는 14-요소 사량체 라이브러리를 제조하였다. 신생항원 #12에 특이적인 T 세포만이 2가지 색상으로만 그리고 10개 초과의 세포에서 검출되었다(도 17). 이는 NP-바코드된 NACS 방법으로 분석된 TIL에서 가장 풍부한 집단이었다. 그러나, 본 발명의 구현예에 따른 NP-NACS 기술로는 현재 가능한 개별 세포 분석이 상기 흐름 데이터에서는 불가능한 관계로, #7, #19, #27 및 Mart-1과 같은 다른 신생항원에 대한 결과는 모호하다.
실시예 5: 환자 #1 유래의 PMBC를 사용한 분석.
NP-바코드된 NACS 방법의 민감성은 신생항원-특이적 T 세포 집단에 대한 환자 #1의 말초혈액 분석을 촉진시켰다. 이러한 T 세포는 시험관 내에서 확장되지 않았으므로 이러한 확장과 수반될 수 있는 집단 바이어스(bias)를 피할 수 있었다. 상기 혈액 분석을 위해, 전체 50-요소 신생항원 라이브러리를 사용하여 4개의 시점에서 수집된 PBMC를 조사하였다. 종양이 수축되는 치료 반응 기간 동안 2개의 시점(187일째 및 208일째, 도 11)에서 수집되었고, 이는 TIL이 수집된 종양 생검(187일째) 일자와 밀접하게 일치 하였다. 이 두 PBMC 표본의 경우, 신생항원-특이적 T 세포 수준은 TIL에서 관찰된 수준보다 낮았으나(모든 CD8+ T 세포의 1% 대(vs) 7%) 0.05% 초과 수준의 여러 집단이 분명히 검출되었다. 대부분의 집단은 TIL에서 검출된 집단과 일치하였으며 2개의 새로운 집단(신생항원 #15과 #33에 특이적임)이 확인되었다. 439일째에 PBMC를 분석한 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이 신생항원-특이적 집단이 전혀 검출되지 않았다.
41일째의 PBMC는 엑솜 및 전사체 측정값이 나타난 생검에 가까운 시간 뿐만 아니라 치료에 대한 반응 이전의 환자 #1에서의 가성진행(pseudo-progression) 기간에도 해당한다(도 11). 이 초기 시점에 T 세포를 관찰하였고, 종양이 퇴행하는 이후 시점에 비해 이들 집단이 실질적으로 더 많은 개수(CD8+ PBMC의 약 2%)로 존재하였다. 187일째 및 208일째에 검출된 동일한 집단이 41일째에도 발견되었으며, 추가 집단에서도 발견되었다.
PBMC로부터 검출된 신생항원-특이적 T 세포 집단 중 몇몇은 비교적 약한 (Kd > 100 nM) 신생항원/MHC 결합 친화력에 해당한다. 치료전 전사체 분석로부터의 돌연변이된 단백질과 연관된 mRNA로부터의 돌연변이-함유 판독 개수를 도 14의 하단 그래프에 기재하였다. 결합이 약한 신생항원에 특이적인 T 세포 집단의 존재와 해당하는 돌연변이된 단백질의 발현 수준이 현저하게 일치한다. 예를 들어, mRNA 발현 수준에 따라 순위가 결정된 상위 12개의 신생항원 중 8개가 검출되었다(표 3). 또한, 해당 mRNA 수준이 0으로 측정된 패널의 신생항원 10개의 경우, 결합이 강한 신생항원 #5만이 임의의 검출된 집단(TIL 및 41일째 PBMC)과 연관되었다.
실시예 6: 포획된 T 세포가 파괴되지 않음.
상기 NP-바코드된 NACS 방법의 장점은 이 과정이 비파괴적이고, 이제 밝혀진 항원-특이성을 갖는 것으로 밝혀진 단일 T 세포가 상기 미세유체 장치에 의해 개별적으로 분리되어 TCR α 및 β 유전자 염기서열 분석과 같은 추가 분석에 사용될 수 있다는 것이다. 이를 위해, 환자 #1의 단일 T 세포 유래의 짝을 이룬 TCRα 및 TCRβ 유전자를 클로닝하여, 상기 바코드된 신생항원 특이성의 역량 및 유효성을 입증하였다. 상기 단일 미세유체 트래핑 장치(도 19A, 도 19B)에서 CD8+ T 세포를 포획하고, 바코드하여 신생항원 신원을 확인하였다(도 20A). 포획된 단일 T 세포를 펀치 아웃(punch out)하여 RT-PCR을 수행하여 TCR α 및 β 유전자 서열을 수득하였다. 쥬르카트 세포를 형질도입하여 상기 동족 신생항원 사량체에 결합하는 것으로 확인된 TCR을 발현하도록 하였다(도 20B).
항-PD1 치료에 반응하는 면역 요법 환자들의 두 종양으로부터 수집된 T 세포의 분석 결과, 상위 50개 추정 신생항원의 약 20%가 해당 종양 내의 CD8+ T 세포의 큰 부분(HLA A*02.01에 대해 ~7%)을 차지하는 것으로 밝혀졌다. 분석한 2명의 환자는 각각 6개의 HLA 유전자형을 발현한다. 추가적인 HLA 유전자형의 실제적인 표현에 대한 시험이 아직 더 필요하지만, 이는 이들 환자 종양 내의 CD8+ TIL의 40% 이상이 신생항원-특이적이라는 것을 암시한다. 이 수치는 다른 분석 방법을 사용하여 추측된 수치보다 훨씬 크며 항-PD-1 암 면역요법에서의 주요 반응기로서의 신생항원-특이적 T 세포 집단의 중요성을 강조한다. 두 번째로 관찰된 점은 신생항원-특이적 T 세포 집단의 측정 스펙트럼이 추정 신생항원의 예측 순위와 대략적으로만 상관 관계를 이룬다는 것이다. 그러나, mRNA 발현 수준과의 추가적인 상관 관계가 발견되었는데, 특히 결합이 약한 신생항원의 경우에 그러하다. 세 번째로 관찰된 점은 종양에서 검출된 동일한 신생항원-특이적 집단이 전체 CD8+ PBMC에 비해 상대적인 양은 작지만 혈액에서도 검출된다는 것이다. 환자 #1에 대해 본 명세서에서 보고된 분석에서, 이들 집단은 실제적인 종양 수축의 전통적인 임상 측정(생체내 이미징을 통한 측정) 2개월 전부터 검출된다.
실시예 7: 환자, 치료 및 시료 수집.
본 분석을 위해, HLA-A*02:01 양성이고, 적절한 기준선 생검 및 치료중 생검을 갖고 있고, 펨브롤리주맙의 제 1상 임상 시험에 참여하면서 객관적인 종양 반응을 나타내는 전이성 흑색종 환자를 선택하였다. 환자 #1과 #2는 3주마다 정맥 내로 10 mg/kg의 단일 약제 펨브롤리주맙을 투여 받았다(10Q3W). 12주째부터 종양 반응을 평가하고, 첫 반응 후 4주 후에 확인하였으며, 이후 12주마다 이미지화하였다. 반응은 고체 종양에서의 반응 평가 기준(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)(RECIST)과 면역-관련 반응 기준(immune-related response criteria)(irRC)에 따라 특징지어졌다. 종양 생검 및 말초혈액 세포 수집 및 분석은 UCLA IRBs 11-001918 및 11-003066에 의해 승인되었다. 분석된 환자의 종양 생검은 기준선 및 치료 중에 수득되었으며, 병리학적 분석을 위해 포르말린에서 즉시 고정되고 파라핀으로 포매시킨 하나의 앨리쿼트(aliquot), 유전 분석을 위해 액체 질소에 즉시 침지하여 급속 냉동시킨 제 2 앨리쿼트 및 액체 질소에서 냉동보조하기 전에 멸균 조건에서 신선하게 다지고(minced fresh) DNAse/콜라게나아제 분해를 거쳐 단일 세포 현탁액(s.c.s)을 형성하는 제 3 앨리쿼트로 처리하였다. 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 피콜-파큐 밀도구배 원심분리(Ficoll-Paque density gradient centrifugation)에 의해 신선한 전혈로부터 준비하고 냉동 보존하였다.
실시예 8: TIL 분리 및 확장.
종양 침윤 림프세포를 항-CD3 항체(OKT3, 50ng/mL, 48시간 노출) 및 IL-2 (300IU/mL)를 사용하여 냉동 보존된 단일 세포 현탁액(s.c.s)으로부터 확장시키고 2 내지 4주 후에 5x106 세포/mL로 다시 냉동 보관하였다. 사용일 아침에 TIL을 해동시키고 DNAse로 45분 동안 처리하고 CD4(BV510, BioLegend, San Diego, CA) 및 CD8+(BV605, BioLegend, San Diego, CA)에 대한 항체로 염색하였다. CD4 및 CD8+ 단일-양성 세포의 라이브(7AAD-음성) 집단을 FACS Cell Sorter(BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 분류하였다.
실시예 9. 전장 엑솜 염기서열 분석(WES), 돌연변이 호출 및 HLA 타이핑.
DNA와 RNA 모두를 급속 냉동 종양 생검(Qiagen AllPrep Kit)으로부터 동시에 추출하였다. UCLA Clinical Microarray Core에서 종양 및 일치하는 정상 혈액 표본의 DNA에 대해 염기서열을 분석하였다. HiSeq 2000 플랫폼(Illumina, San Diego, CA)에서 페어드-엔드 2x100bp 염기서열 분석(paired-end 2x100bp sequencing)을 수행한 후, 65 Mb 게놈을 표적으로 하는 Nimblegen SeqCap EZ Human Exome Library v3.0 (Roche)을 사용하여 엑손 포획하였다. 염기서열 분석은 표본 당 60억 내지 100억 리드를 생성하였고 각 표적 염기는 평균 90 내지 150 리드로 처리되었다. BWA-mem 알고리즘(v0.7.9)을 사용하여 서열을 UCSC hg19 인간 게놈 기준과 맞추었다. 사전 처리는 중복 제거(Picard Tools), 삽입-결실 재정렬 및 염기 품질 스코어 재교정(base quality score recalibration)을 포함하는 GATK Best Practices Workflow v3을 따랐다. MuTect(v1.1.7)2, Varscan2 Somatic(v2.3.6)3, 및 GATK-HaplotypeCaller(HC, v3.3)를 사용하여 1에서 변형된 방법으로 체세포 돌연변이를 찾았다. 3개의 프로그램 중 2개 이상에 의해 확인된 것으로서 정의된 높은 정확도 돌연변이만을 유지하였다. GATK-HC의 경우 체세포 변이는 종양/정상 쌍의 단측 피셔 정확 검정(one-sided Fisher's Exact Test)(P값 컷-오프) ≤ 0.01)을 사용하여 측정하였다. 변이체에는 Oncotator 4를 사용하여 주석을 달았으며, 비동의 돌연변이(non-synonymous mutations)는 난센스(Nonsense), 미스센스(Missense), 스플라이스_사이트(Splice_Site) 또는 논스톱(Nonstop) 돌연변이 뿐만 아니라 격자_이동(Frame_Shift), 인_프레임(In_Frame) 또는 개시_코돈(Start_Codon) 변경 삽입/결실으로 분류하였다. 전장 엑솜 염기서열 분석 데이터로부터 ATHLATES을 사용하여 HLA-타이핑을 수행하였다.
실시예 10: RNA 염기서열 분석.
Illumina TruSeq RNA 표본 준비 키트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 제조된 100-bp 페어드-엔드 라이브러리 상에서 Illumina HiSeq 2500 플랫폼을 사용하여 RNA 염기서열 분석을 수행하였다. TopHat2 v2.0,5를 사용하여 리드를 hg19에 매핑하였고 Cufflinks v2.2.16 프로그램과 CuffNorm을 사용하여 정량화 및 정규화하여 기하학적 정규화 방법을 사용한 라이브러리 크기(맵핑된 백만개의 단편 당 엑손의 킬로베이스 당 단편, FPKM)에 따른 정규화된 수식 표를 생성하였다. Biopython 및 pysam 패키지를 사용하여 맞춤 파이썬(v2.7.3) 스크립트(custom Python(v2.7.3) script)로 돌연변이가 포함된 RNA 리드를 확인하고 Integrated Genomics Viewer(IGV)에서 육안 검사를 통해 검증하였다.
실시예 11: 펩타이드 HLA 결합 예측 및 신생항원 후보 확인.
HLA-A02:01에 대한 펩타이드 결합 예측은 각각의 비동의 아미노산-변경 돌연변이 근처의 슬라이딩 윈도우에서 9-mer 및 10-mer 펩타이드에 대해 netMHC3.47에 의해 생성되었다(펩타이드 서열은 Ensembl GRCh37 release 74로부터 도출되었다). 후보 펩타이드는 1) RNA-seq에 의해 확인된 돌연변이-함유 리드 값을 가진 것들, 2) RNA 발현(FPKM > 0)을 갖지만 확인된 돌연변이 리드가 없는 것들 및 3) 검출 가능한 RNA-seq 발현이 없는 이외 모든 것들의 빈(bin)으로 분류되었다. 펩타이드는 각 빈(bin) 내에서 HLA 결합 친화력에 의해 순위가 매겨지고 분류되었다.
실시예 12: ssDNA-SAC 컨쥬게이트의 제조.
ssDNA-SAC(스트렙타비딘 항원 복합체) 컨쥬게이트는 Kwong et al., 2009, J. Am. Chem Soc.,131:9695-9703에 기재된 이전의 공지된 프로토콜에 따라 제작되었으며, 이 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 간략히 설명하면, Sano et al., 1990, PNAS, 87:142-146 에 기재된 바와 같이, SAC 유전자(Addgene)를 함유하는 pTSA-C 플라스미드로부터 SAC를 먼저 발현시켰다. 위 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. DNA에 컨쥬게이트시키기 전에, 제바(zeba) 탈염 컬럼(Pierce)을 사용하여 SAC(1 mg/ml)를 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드 (TCEP, 5 mM)를 함유하는 PBS로 완충액 교환하였다. DMF 중의 MHPH(3-N-말레이미도-6-히드라지늄피리딘 하이드로클로라이드, 100 mM, Solulink)를 300:1의 몰 과량으로 SAC에 첨가하였다. 한편, DMF 중 SFB(숙신이미딜 4-포르밀벤조에이트, 100mM, Solulink)를 5'-아민 변형된 ssDNA(500 uM)(5'-NH2-AAA AAA AAA A TAG GCA TCC CGA GGA TTC AG)에 40:1의 몰비로 첨가하였다. 상온에서 4시간 동안 반응시킨 후, MHPH-표지된 SAC 및 SFB-표지된 DNA를 구연산염(50 mM 구연산 나트륨, 150 mM NaCl, pH 6.0)으로 완충액 교환한 다음, 20:1 비율의 DNA와 SAC를 혼합하여 상온에서 밤새 반응시켰다. DNA-SAC 컨쥬게이트를 Superdex 200 겔 여과 컬럼 (GE health)을 사용하여 정제하고 10K MWCO 초원심 분리 필터(Millipore)로 농축시켰다.
실시예 13: 인간 MHC 제 I 부류 신생항원 라이브러리 구축.
Rodenko et al., 2006, Nat. Protoc. 1:1120-1132에 기재된 UV-매개 펩타이드 교환 방법을 사용하여 MHC 라이브러리를 생성하였으며, 이 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 광분해성(photo-labile) 펩타이드 KILGFVFJV 및 다른 신생항원 펩타이드는 표준 자동 Fmoc-펩티드 합성 방법(광분해성 아미노산 잔기는 J, (S)-3-(Fmoc-아미노)-3-(2-니트로페닐)프로피온산임)으로 합성되었다. 인간 MHC 제 I 부류 중쇄 및 인간 b2m 함유 박테리아 균주를 인코딩하는 플라스미드는 Ton N M Schumacher로부터 제공받았다. 이전에 공지된 프로토콜 11에 따라 MHC 중쇄 봉입체(inclusion body), b2m 봉입체 및 광분해성 펩타이드로부터 MHC 광분해성 단백질을 접은 다음 BirA 바이오틴 리가아제를 사용하여 바이오틴화하였다. MHC 광분해성 단백질(0.5uM)과 신생항원 펩타이드(50uM)의 혼합물을 365 nm UV 광에 1 시간 동안 노출시켜 MHC 신생항원 라이브러리를 생성하였다.
실시예 14: NP MHC 신생항원 라이브러리 구축.
스트렙타비딘 자성 NP(1um, ThermoFisher scientific)를 바이오틴-DNA와 1:20의 비율로 혼합하여 NP-DNA를 수득하였다. 자성 NP를 3회 세척하여 과량의 DNA를 제거하였다. 병행하여 MHC 신생항원 라이브러리를 4:1의 비율로 ssDNA-SAC에 첨가하여 DNA-MHC 사량체를 형성하였다. 같은 양(DNA 비율 기준)의 NP-DNA 및 DNA-MHC 사량체를 37℃에서 30분 동안 혼성화하여 NP MHC 신생항원 라이브러리를 생성하였다.
실시예 15: 세포-트래핑 미세유체 장치 제조.
먼저, SU-8 2025 포토레지스트를 사용하여 세포 트랩(다중 트랩 또는 단일 트랩)을 갖는 마스터 주형(master mold)을 제조하였다. 그런 다음 Sylgard 184(A:B = 10:1) 혼합물을 상기 주형에 부어 넣고 가스를 제거하고 80℃에서 2시간 동안 경화시켰다. 한편, PDMS의 박층을 2000 rpm/분으로 유리 슬라이드 상에 스핀 코팅하고 80℃에서 1시간 동안 경화시켰다. 상기 PDMS 장치와 PDMS-코팅된 유리를 O2 플라즈마로 1분간 처리하고 함께 결합시켜 최종 세포-트래핑 미세유체 장치를 수득하였다.
실시예 16: TIL 풀다운 및 바코드.
NP MHC 신생항원 라이브러리를 상온에서 30분 동안 CD8+ 인간 T 세포에 첨가하였다. NP-결합된 T 세포를 자기적으로 농축시키고 PBS로 세척하여 임의의 비특이적으로 당겨진 T 세포를 제거 하였다. 이어서, 세포를 Costar 트랜스웰 폴리카보네이트 멤브레인(5 um 기공)에 적재하여 유리(free) NP를 제거하였다. 그런 다음, 상기 세포를 상기 세포-트래핑 미세유체 장치에 적재하고 순차적으로 바코드하였다. 먼저, 3가지 상이한 DNA 염료(cy3, cy5 및 Alex 488)를 상기 장치에 적재하여 상기 NP 상의 DNA와 37℃에서 15 분간 혼성화시켰다. 간단한 세척 후, 형광 이미지를 취하여 제 1 라운드 바코드를 수득하였다. 변위 DNA를 37℃에서 15분 동안 상기 장치에 첨가하여 상기 제 1 라운드 DNA 염료를 제거하였다. 유사한 절차를 사용하여 제 2 및 제 3 라운드 바코딩 이미지를 수득하였다.
실시예 17: PBMC로부터의 CD8+ T 세포 풀다운.
PBMC 유래의 CD8+ T 세포를 FACS를 사용하여 분류하였다. 그런 다음, CD8+ T 세포를 Calcein AM(ThermoFisher)으로 (10K) 염색하고 각 개별 NP-NACS 라이브러리와 함께 30분 동안 상온에서 배양하였다. 신생항원-특이적 세포를 자석 풀다운으로 농축하였다. 상청액 내의 포획되지 않은 T 세포는 다른 NP-NACS 라이브러리 요소와 추가로 배양하기 위해 수집하였다. 농축된 T 세포를 PBS로 1회 세척하여 임의의 비특이적 세포 풀다운을 제거하였다. 그런 다음 세포를 세포 혈구계에 적재하였다. 혈구계 칩의 전체 영역을 영상화하여 총 풀다운 세포 개수를 수득하였다. 건강한 기증자의 PBMC와 비관련 남성 흑색종 환자의 PBMC를 대조군으로 사용하여 백그라운드를 수득하였다.
실시예 18: 단일 세포 TCR 클로닝.
단일 세포 트랩을 갖는 미세유체 장치 내에서 신생항원 특이적 T 세포를 트랩하였다(도 19A 내지 도 19B). 그 후 세포를 PDMS 펀처로 회수하였다. 짧은 초음파처리를 적용하여 상기 펀치 아웃된 PDMS로부터의 세포를 세포 용해 완충액(1U/ul의 RNAse 억제제, 프로메가(Promega)사, 와 10mM 트리스, pH=8)에 방출시켰다. OneStep RT PCR 키트(Qiagen)를 사용하여, TRAV 및 TRBV 유전자 분획에 결합하는 다중 순방향 프라이머(표 5 내지 표 6)와 불변 Cα(5'-GCCACAGCACTGTTGCTCTTGAAGTCC-3')및 Cβ (5'-CCACCAGCTCAGCTCCACGTG-3') 도메인 유전자에 결합하는 역방향 프라이머로 단일 세포로부터 재배열된 Vα 및 Vβ 도메인 유전자를 클로닝하였다. 보편적 프라이머 세트(알파 순방향 프라이머: 5'-TGGCCTGCTTTGTTTGCCGTGGTTACAGGAAGCCTCAGCA-3', 알파 역방향 프라이머: 5'-GCCACAGCACTGTTGCTCTTGAAGTCCATAG-3', 베타 순방향 프라이머: 5'-CGGGCTCCTTTGCCTACCGTGCCTGCAGGAGGGCTCGGCA-3', 베타 역방향 프라이머: 5'-CGTGCTGACCCCACTGTGCACCTCCTTCCCATTCACCCACCAGCTCAGCTCCACGTGGTC-3')을 사용한 제 2 반-중첩 증폭(semi-nested amplification)에서의 주형으로 cDNA 생성물을 사용하였다. Vα 및 Vβ cDNA를 염기서열 분석하고 단일 TRAV/TRBV 순방향 프라이머를 사용하여 재증폭하여 다중 PCR을 통해 도입된 잘못된 프라이밍 생성물을 교정하였다. PCR 조립을 통한 기능 시험을 위해 레트로바이러스 벡터를 제작하였다. Vα 및 Vβ 도메인 유전자를 인간 성장 호르몬(HGH) 신호 펩타이드, TCRα 및 TCRβ 사슬의 불변 영역, 및 2A 리보솜 스키핑 서열(ribosomal skipping sequence)과 조립한 후, 제한 효소로 분해하고 MSCV계 비복제성 레트로바이러스 백본(backbone)에 연결하였다.
[표 5] 단일 세포 TCRα 클로닝 프라이머
Figure 112017130481021-pct00006
Figure 112017130481021-pct00007
[표 6] 단일 세포 TCRβ 클로닝 프라이머.
Figure 112017130481021-pct00008
Figure 112017130481021-pct00009
레트로바이러스를 생산하기 위해, HEK-293T/17 세포를 TCR 벡터, gag-pol을 코딩하는 패키징 벡터 및 RD114 외피 당단백질(envelope glycoprotein)을 인코딩하는 슈도타입화 벡터(pseudotyping vector)로 인산 칼슘 침전을 통해 형질 주입시켰다. 형질 주입 후 24시간 후에 배지를 교체하고 형질 주입 후 48시간 후에 바이러스 상청액을 수집하였다. 동일 부피의 바이러스 상청액을 RPMI-기재 배지 내의 쥬르카트 T 세포에 첨가하고(최종 밀도: 0.5 x 106 세포/mL) 폴리브렌을 5㎍/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 세포를 30℃, 1350xg에서 90분 동안 회전 감염(spinfection)시킨 다음 37℃, 5% CO2에서 바이러스와 함께 밤새 배양하였다. 감염 후 24시간 후에 배지의 절반을 교체하고, 동종 형광 펩타이드-MHC 사량체를 사용한 유세포 분석을 통해, 감염 후 48시간째의 TCR 특이성에 대해 세포를 분석하였다.
실시예 19: MHC I HLA 아형.
[표 7] MHC I HLA 대립 유전자 아형
Figure 112017130481021-pct00010
본 발명은 특정 예시적인 구현예를 참조하여 설명하고 기재되었지만, 첨부되는 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 상기 기재된 구현예에 다양한 수정 및 변경이 행해질 있음이 당업자에게 이해될 것이다.
<110> CALIFORNIA INSTITUTE OF TECHNOLOGY <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR SCREENING T CELLS WITH ANTIGENS FOR SPECIFIC POPULATIONS <130> IF17P243US <140> PCT/US2016/035357 <141> 2016-06-01 <150> 62/169,337 <151> 2015-06-01 <160> 331 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Phe Leu Gly Ser Leu Leu Ile Leu Val 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Leu Ser Ser Cys Phe Asp Tyr Val 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Leu Met Asn Glu Asp Phe Ile Leu 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Phe Leu Gly Ser Leu Leu Ile Leu Val Val 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Leu Met Asn Glu Asp Phe Ile Leu Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ser Leu His Asp Leu Thr Asp Gly Val 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Lys Ala Trp Glu Asn Phe Pro Asn Val 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Leu Leu Ser Glu 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Ile Val Pro Leu Ser Thr Ile 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gly Leu Ser Glu Lys Cys Ser Leu Val Val 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Phe Leu His Gly Asn Ser Leu Tyr Gln Lys Val 1 5 10 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Phe Leu Arg Glu Ser Gln Glu Thr Leu 1 5 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Leu Leu Ser Glu Phe Phe Ser Cys Leu Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gln Leu Asp Ser Gly Thr Leu Ile Val 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Trp Met Gly Leu Leu Asp Leu Glu Val 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Phe Val Leu Glu His Glu Asp Gly Leu 1 5 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Thr Leu Val Ser Leu Ala Thr Glu Thr Val 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Lys Met Gly Lys Thr Ile Tyr Lys Tyr Val 1 5 10 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asn Leu Phe 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sapiens <400> 58 Leu Leu Ser Glu Phe Ser Ser Cys Leu 1 5 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Lys Leu Leu Ser Glu Phe Ser Ser Cys Leu 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Leu Arg Asp Ser Gly Leu Trp Phe Pro Val 1 5 10 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Pro Leu Met Asn Glu Asp Phe Ile Leu Ala Val 1 5 10 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Asp Leu Tyr His Arg Val Asp Val Ile 1 5 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Phe Val Ala Asn Leu Phe Asn Thr Tyr Pro 1 5 10 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Gly Leu Phe Arg Ser Leu Tyr Arg Ser Val 1 5 10 <210> 65 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Gly Leu Ser Gly Lys Cys Ser Leu Val 1 5 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 His Leu Arg Asp Ser Gly Leu Trp Phe Pro Val 1 5 10 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Thr Leu Ala Asn Arg Phe Pro Ala Val 1 5 <210> 68 <211> 10 <212> PRT 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 157 aaaaaaaaaa taggcatccc gaggattcag 30 <210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> (S)-3-(Fmoc-amino)-3-(2-nitrophenyl)propionic acid <400> 158 Lys Ile Leu Gly Phe Val Phe Xaa Val 1 5 <210> 159 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 159 gccacagcac tgttgctctt gaagtcc 27 <210> 160 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 160 ccaccagctc agctccacgt g 21 <210> 161 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 161 tggcctgctt tgtttgccgt ggttacagga agcctcagca 40 <210> 162 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 162 gccacagcac tgttgctctt gaagtccata g 31 <210> 163 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 163 cgggctcctt tgcctaccgt gcctgcagga gggctcggca 40 <210> 164 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 164 cgtgctgacc ccactgtgca cctccttccc attcacccac cagctcagct ccacgtggtc 60 60 <210> 165 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 165 tacaggaagc ctcagcagga caaagccttg agcagccctc 40 <210> 166 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 166 tacaggaagc ctcagcagga caaaacattg accagcccac tg 42 <210> 167 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 167 tacaggaagc ctcagcaaag gaccaagtgt ttcagccttc cac 43 <210> 168 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 168 tacaggaagc ctcagcagct cagtcagtgg ctcagccgga 40 <210> 169 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 169 tacaggaagc ctcagcactt gctaagacca cccagcccat c 41 <210> 170 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 170 tacaggaagc ctcagcagga gaggatgtgg agcagagtct tttcc 45 <210> 171 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 171 tacaggaagc ctcagcaagc caaaagatag aacagaattc cgaggc 46 <210> 172 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 172 tacaggaagc ctcagcagag gccctgaaca ttcaggaggg 40 <210> 173 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 173 tacaggaagc ctcagcagaa aaccaggtgg agcacagccc 40 <210> 174 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 174 tacaggaagc ctcagcagcc cagtctgtga gccagcataa cc 42 <210> 175 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 175 tacaggaagc ctcagcagcc cagtcggtga cccagcttg 39 <210> 176 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 176 tacaggaagc ctcagcagcc cagtcggtga cccagcttag 40 <210> 177 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 177 tacaggaagc ctcagcagcc cagtcagtga cccagcctg 39 <210> 178 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 178 tacaggaagc ctcagcactc ttctggtatg tgcaataccc caacc 45 <210> 179 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 179 tacaggaagc ctcagcagtt gaaccatatc tcttctggta tgtgcaatac c 51 <210> 180 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 180 tacaggaagc ctcagcagcc cagtctgtga cccagcttga c 41 <210> 181 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 181 tacaggaagc ctcagcaacc cagtcggtga cccagcttg 39 <210> 182 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 182 tacaggaagc ctcagcagga gattcagtgg tccagacaga aggc 44 <210> 183 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 183 tacaggaagc ctcagcagga aattcagtga cccagatgga agg 43 <210> 184 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 184 tacaggaagc ctcagcagga gattcagtga cccagatgga agg 43 <210> 185 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Synthetic primer <400> 190 tacaggaagc ctcagcacag aaggaggtgg agcaggatcc tg 42 <210> 191 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 191 tacaggaagc ctcagcagga gagaatgtgg agcagcatcc ttc 43 <210> 192 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 192 tacaggaagc ctcagcagga gagagtgtgg ggctgcatct tc 42 <210> 193 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 193 tacaggaagc ctcagcagcc cagaagataa ctcaaaccca accag 45 <210> 194 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 194 tacaggaagc ctcagcacag aagataactc aaacccaacc aggaatg 47 <210> 195 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 195 tacaggaagc ctcagcagcc cagagagtga ctcagcccga 40 <210> 196 <211> 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Synthetic primer <400> 201 tacaggaagc ctcagcagga atacaagtgg agcagagtcc tccag 45 <210> 202 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 202 tacaggaagc ctcagcacag cagcaggtga aacaaagtcc tca 43 <210> 203 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 203 tacaggaagc ctcagcacag caggtgaaac aaagtcctca atctttg 47 <210> 204 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 204 tacaggaagc ctcagcaata ctgaacgtgg aacaaagtcc tcagtcac 48 <210> 205 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 205 tacaggaagc ctcagcagga caacaggtaa tgcaaattcc tcagtacc 48 <210> 206 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 206 tacaggaagc ctcagcagat gctaagacca cccagccccc 40 <210> 207 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 207 tacaggaagc ctcagcagat gctaagacca cccagcccac c 41 <210> 208 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 208 tacaggaagc ctcagcagat gctaagacca cacagccaaa ttcaatg 47 <210> 209 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 209 tacaggaagc ctcagcaacc cagctgctgg agcagagcc 39 <210> 210 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 210 tacaggaagc ctcagcagac cagcaagtta agcaaaattc accatc 46 <210> 211 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 211 tacaggaagc ctcagcacaa caaccagtgc agagtcctca agc 43 <210> 212 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 212 tacaggaagc ctcagcaagc caagaactgg agcagagtcc tcag 44 <210> 213 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 213 tacaggaagc ctcagcaggt caacagctga atcagagtcc tcaatc 46 <210> 214 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 214 tacaggaagc ctcagcagaa gacaaggtgg tacaaagccc tctatctc 48 <210> 215 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 215 tacaggaagc ctcagcagaa gacaaggtgg tacaaagccc tcaatc 46 <210> 216 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 216 tacaggaagc ctcagcagcc cagacagtca ctcagtctca accag 45 <210> 217 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 217 tacaggaagc ctcagcagcc cagacagtca ctcagtccca 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Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 223 caggagggct cggcagaacc tgaagtcacc cagactccca g 41 <210> 224 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 224 caggagggct cggcagacac agctgtttcc cagactccaa aatac 45 <210> 225 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 225 caggagggct cggcagacac agccgtttcc cagactcca 39 <210> 226 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 226 caggagggct cggcagacac tgaagttacc cagacaccaa aacac 45 <210> 227 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 227 caggagggct cggcacacct ggtcatggga atgacaaata agaag 45 <210> 228 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 228 caggagggct cggcagaaac gggagttacg 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Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 234 caggagggct cggcacagca agtgacactg agatgctctt ctcag 45 <210> 235 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 235 caggagggct cggcaactgt gtcctggtac caacaggccc t 41 <210> 236 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 236 caggagggct cggcagacgc tggagtcacc caaagtcc 38 <210> 237 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 237 caggagggct cggcagaggc tggagtcaca caaagtccca c 41 <210> 238 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 238 caggagggct cggcaaggac agcaagcgac tctgagatgc 40 <210> 239 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 239 caggagggct cggcaaatgc tggtgtcact cagacccca 39 <210> 240 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Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 251 caggagggct cggcaatatc tggagtctcc cacaacccca gac 43 <210> 252 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 252 caggagggct cggcacacaa ccgcctttat tggtaccgac ag 42 <210> 253 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 253 caggagggct cggcagattc tggagtcaca caaaccccaa agc 43 <210> 254 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 254 caggagggct cggcagatgc tgaaatcacc cagagcccaa g 41 <210> 255 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 255 caggagggct cggcagatgc tggaatcacc cagagccca 39 <210> 256 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 256 caggagggct cggcaaaggc aggtgacctt 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of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 262 caggagggct cggcagatgc tggcattatc cagtcaccca ag 42 <210> 263 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 263 caggagggct cggcagatgc tggagttatc cagtcacccc 40 <210> 264 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 264 caggagggct cggcagatgc tagagtcacc cagacaccaa gg 42 <210> 265 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 265 caggagggct cggcagctgc tggagtcatc cagtcccc 38 <210> 266 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 266 caggagggct cggcagaagc tggagttact cagttcccca gc 42 <210> 267 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 267 caggagggct cggcagatgc catggtcatc cagaacccaa g 41 <210> 268 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 268 caggagggct cggcaggtga agaagtcgcc cagactcca 39 <210> 269 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 269 caggagggct cggcagagcc tggagtcagc cagaccc 37 <210> 270 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 270 caggagggct cggcaaatgc cggcgtcatg cagaac 36 <210> 271 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 271 caggagggct cggcagatgg tggaatcact cagtccccaa ag 42 <210> 272 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 272 caggagggct cggcaggtgc tgtcgtctct caacatccga g 41 <210> 273 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 273 caggagggct cggcaagtgc tgtcgtctct caacatccga g 41 <210> 274 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 274 caggagggct cggcagacac caaggtcacc cagagaccta gac 43 <210> 275 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 275 caggagggct cggcagacac caaggtcacc cagagaccta gatttc 46 <210> 276 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 276 caggagggct cggcacatgc caaagtcaca cagactccag g 41 <210> 277 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 277 caggagggct cggcagatgc tgatgttacc cagaccccaa g 41 <210> 278 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 278 caggagggct cggcagaagc tgacatctac cagaccccaa gatac 45 <210> 279 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 279 caggagggct cggcagatgc tgtagttaca caattcccaa gacacag 47 <210> 280 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 280 caggagggct cggcagatgc tgtagttaca caattctcaa gacacagaat c 51 <210> 281 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 281 caggagggct cggcagaagc ccaagtgacc cagaaccc 38 <210> 282 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 282 caggagggct cggcagatgt gaaagtaacc cagagctcga gatatc 46 <210> 283 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 283 caggagggct cggcaagtgc tgtcatctct caaaagccaa gc 42 <210> 284 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer 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289 aaaaaaaaag tgatgagttt caaatcagtc aagagaatgt ctctaagtga actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 290 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 290 aaaaaaaaag tgatgagttt caagtattcg tcatcaactc gttcactata actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 291 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 291 aaaaaaaaag tgatgagttt caagtattcg tcatcaactt acgagtgtaa actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 292 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 292 aaaaaaaaag tgatgagttt caagtattcg tcatcaatgt ctctaagtga actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 293 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 293 aaaaaaaaag tgatgagttt caagtcagat agttcaactc gttcactata actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 294 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 294 aaaaaaaaag tgatgagttt caagtcagat agttcaactt acgagtgtaa actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 295 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 295 aaaaaaaaag tgatgagttt caagtcagat agttcaatgt ctctaagtga actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 296 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 296 aaaaaaaaac tatgtcgata caaatcagtc aagagaactc gttcactata actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 297 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 297 aaaaaaaaac tatgtcgata caaatcagtc aagagaactt acgagtgtaa actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 298 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 298 aaaaaaaaac tatgtcgata caaatcagtc aagagaatgt ctctaagtga actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 299 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 299 aaaaaaaaac tatgtcgata caagtattcg tcatcaactc gttcactata actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 300 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 300 aaaaaaaaac tatgtcgata caagtattcg tcatcaactt acgagtgtaa actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 301 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 301 aaaaaaaaac tatgtcgata caagtattcg tcatcaatgt ctctaagtga actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 302 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 302 aaaaaaaaac tatgtcgata caagtcagat agttcaactc gttcactata actgaatcct 60 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 307 aaaaaaaaat acatccaaga caaatcagtc aagagaatgt ctctaagtga actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 308 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 308 aaaaaaaaat acatccaaga caagtattcg tcatcaactc gttcactata actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 309 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 309 aaaaaaaaat acatccaaga caagtattcg tcatcaactt acgagtgtaa actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 310 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 310 aaaaaaaaat acatccaaga caagtattcg tcatcaatgt ctctaagtga actgaatcct 60 cgggatgcct a 71 <210> 311 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 311 aaaaaaaaat acatccaaga caagtcagat agttcaactc 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 323 gtgatgagtt tccctgtgct 20 <210> 324 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 324 ctatgtcgat acgatgatgc 20 <210> 325 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 325 tacatccaag accgaaccat 20 <210> 326 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 326 atcagtcaag agcattggcg 20 <210> 327 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 327 gtattcgtca tcgaagtcct 20 <210> 328 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 328 gtcagatagt tcgcaaggat 20 <210> 329 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 329 ctcgttcact atgatacggc 20 <210> 330 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 330 cttacgagtg taatcgctgg 20 <210> 331 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 331 tgtctctaag tgcaggtctg 20

Claims (20)

  1. 항원 복합체로서, 나노입자 분류제(sorting agent) 및 펩타이드-적재된 스트렙타비딘 주조직 적합성 복합체(ＭＨC) 사량체를 포함하며,
    상기 나노입자 분류제는
    나노 입자;
    하나 이상의 코딩 영역을 가지며 상기 나노 입자에 컨쥬케이트된 폴리뉴클레오타이드 검출 태그; 및
    상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그에 컨쥬게이트된 제 1 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인을 포함하고,
    상기 펩타이드-적재된 스트렙타비딘 주조직 적합성 복합체(ＭＨC) 사량체는
    변형된 스트렙타비딘 단백질;
    상기 변형된 스트렙타비딘 단백질에 각각 독립적으로 컨쥬게이트된 4개의 바이오틴-변형된 MHC 단백질;
    상기 바이오틴-변형된 MHC 단백질에 결합된 항원 펩타이드; 및
    상기 제 1 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인과 상이하며 상기 변형된 스트렙타비딘 단백질에 컨쥬게이트된 제 2 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인을 포함하며,
    상기 나노 입자 분류제는 상기 제 1 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인과 상기 제 2 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인의 혼성화에 의해 상기 펩타이드-적재된 스트렙타비딘 MHC 사량체에 연결되는, 항원 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 변형된 스트렙타비딘 단백질이 시스테인, 티올기, 말레이미드기, 아다만탄기, 시클로덱스트린기, 아민기, 카르복시기, 아지드기 및 알킨기로 이루어진 군으로부터 선택된 결합 모이어티(binding moiety)로 변형되는, 항원 복합체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 변형된 스트렙타비딘 단백질이 시스테인으로 변형되는, 항원 복합체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 제 2 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인이 시스테인, 티올기, 말레이미드기, 아다만탄기, 시클로덱스트린기, 아민기, 카르복시기, 아지드기 및 알킨기로 이루어진 군으로부터 선택된 결합 모이어티로 변형되는, 항원 복합체.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 제 2 폴리뉴클레오타이드 혼성화 도메인이 말레이미드로 변형되는, 항원 복합체.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 나노 입자가 자성 나노 입자 또는 폴리스티렌 나노 입자인, 항원 복합체.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 상기 하나 이상의 코딩 영역이 3개 이상의 상이한 코딩 영역을 포함하는, 항원 복합체.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 나노 입자가 스트렙타비딘, 바이오틴, 시스테인, 티올기, 말레이미드기, 아다만탄기, 시클로덱스트린기, 아민기, 카르복시기, 아지드기 및 알킨기로 이루어진 군으로부터 선택된 결합 모이어티로 변형되는, 항원 복합체.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 나노 입자가 스트렙타비딘으로 변형되고 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그는 바이오틴으로 변형되는, 항원 복합체.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 항원 펩타이드가 종양 항원, 종양 신생항원, 바이러스 항원, 인산항원(phosphoantigen) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항원 복합체.
  11. 항원 복합체의 라이브러리로서,
    복수의 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 항원 복합체를 포함하며, 상기 항원 복합체 각각은 상기 복수의 항원 복합체 내의 임의의 다른 항원 복합체와 상이한 항원 펩타이드 및 상이한 폴리뉴클레오타이드 검출 태그를 갖는, 항원 복합체의 라이브러리.
  12. 신생항원-특이적 T 세포를 검출하기 위한 키트로서,
    제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 항원 복합체; 및
    상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 상기 하나 이상의 코딩 영역과 혼성화할 수 있는 디코딩 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 신생항원-특이적 T 세포를 검출하기 위한 키트.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 디코딩 폴리뉴클레오타이드는 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드이고, 상기 키트는:
    상기 디코딩 폴리뉴클레오타이드와 혼성화할 수 있는 변위(displacement) 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는, 키트.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드는 구별 가능한 형광 염료에 컨쥬게이트된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 키트.
  15. 대상 내의 종양에 대한 신생항원-특이적 T 세포를 분리하는 방법으로서,
    주조직 적합성 복합체(MHC) 결합 알고리즘을 사용하여 상기 종양에 대한 후보 T 세포 에피토프를 확인하는 단계;
    상기 후보 T 세포 에피토프에 상응하는 항원 펩타이드를 합성하는 단계;
    상기 항원 펩타이드를 사용하여 항원 복합체의 라이브러리를 제조하는 단계로서, 상기 라이브러리는 복수의 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 항원 복합체를 포함하며, 상기 항원 복합체 각각은 상기 복수의 항원 복합체 내의 임의의 다른 항원 복합체와 상이한 항원 펩타이드 및 상이한 폴리뉴클레오타이드 검출 태그를 갖는, 단계;
    상기 항원 복합체의 라이브러리를 상기 대상 유래의 TIL 또는 PBMC와 함께 배양하는 단계; 및
    짝을 이룬 T 세포를 짝을 이루지 않은 T 세포로부터 분리하는 단계로서, 상기 짝을 이룬 T 세포는 상기 항원 복합체의 라이브러리 내의 항원 복합체 중 어느 하나의 항원 펩타이드와 짝을 이룬 T 세포를 포함하는, 단계;를 포함하는, 대상 내의 종양에 대한 신생항원-특이적 T 세포를 분리하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 후보 T 세포 에피토프를 확인하는 단계는 상기 종양의 게놈 또는 엑솜 서열을 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제 15 항에 있어서,
    상기 짝을 이룬 T 세포를 미세유체 장치에 첨가하여, 상기 짝을 이룬 T 세포를 짝을 이룬 개별 T 세포로 분리하는 단계; 및
    상기 짝을 이룬 개별 T 세포 각각의 항원 복합체의 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 하나 이상의 코딩 영역의 서열을 검출하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 짝을 이룬 개별 T 세포 각각의 항원 복합체의 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 하나 이상의 코딩 영역의 서열을 검출하는 상기 단계는:
    상기 짝을 이룬 개별 T 세포 각각의 폴리뉴클레오타이드 검출 태그를 2개 이상의 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드와 함께 배양하는 단계; 및
    혼성화된 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출하여 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 하나 이상의 코딩 영역의 서열을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 항원 복합체의 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 하나 이상의 코딩 영역이 2개 이상의 코딩 영역을 포함하며, 상기 짝을 이룬 개별 T 세포 각각의 항원 복합체의 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 상기 2개 이상의 코딩 영역의 서열을 검출하는 단계는:
    상기 짝을 이룬 개별 T 세포 각각의 폴리뉴클레오타이드 검출 태그를 2개 이상의 제 1 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드와 함께 배양하는 단계;
    하나 이상의 제 1 혼성화된 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출하여 상기 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 상기 2개 이상의 코딩 영역 중 제 1 코딩 영역의 서열을 결정하는 단계;
    상기 하나 이상의 제 1 혼성화된 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상의 변위 폴리뉴클레오타이드와 배양하여 상기 제 1 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드를 상기 제 1 혼성화된 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드로부터 제거하여 부분적으로 디코딩된 폴리뉴클레오타이드 검출 태그를 생산하는 단계;
    상기 부분적으로 디코딩된 폴리뉴클레오타이드 검출 태그를 하나 이상의 제 2 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드와 배양하는 단계; 및
    제 2 혼성화된 표지된 디코딩 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출하여 상기 짝을 이룬 개별 T 세포 각각의 항원 복합체의 폴리뉴클레오타이드 검출 태그의 상기 2개 이상의 코딩 영역 중 제 2 코딩 영역의 서열을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4270006A3 (en) 2014-06-13 2024-01-10 Immudex ApS General detection and isolation of specific cells by binding of labeled molecules
WO2018085453A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 California Institute Of Technology Microfluidic devices and methods for purifying rare antigen-specific t cell populations
WO2018165475A1 (en) * 2017-03-08 2018-09-13 California Institute Of Technology Pairing antigen specificity of a t cell with t cell receptor sequences
EP3658683A4 (en) * 2017-07-25 2021-04-21 California Institute of Technology DISCOVERY OF TROGOCYTOSIS-MEDIATED EPITOPIA
KR20190050523A (ko) 2017-11-03 2019-05-13 광주과학기술원 면역세포 진단칩
RU2020135720A (ru) * 2018-04-02 2022-05-04 Пэкт Фарма, Инк. Пептид-мнс compact
CN108865993A (zh) * 2018-06-11 2018-11-23 深圳市第二人民医院 肿瘤新抗原的筛选方法和试剂盒
EP3807636B1 (en) * 2018-06-15 2024-01-31 F. Hoffmann-La Roche AG A system for identification of antigens recognized by t cell receptors expressed on tumor infiltrating lymphocytes
CN110687298A (zh) * 2018-09-06 2020-01-14 天津美瑞特医疗科技有限公司 一种以Chitosan多糖为骨架制备MHC抗原肽多聚体检测试剂的新方法
WO2020056173A1 (en) * 2018-09-13 2020-03-19 Pact Pharma, Inc. Antigen specific tcr identification using single-cell sorting
EP3867353A4 (en) * 2018-10-18 2022-07-27 Berkeley Lights, Inc. PROTO-ANTIGEN PRESENTING SYNTHETIC SURFACES, ACTIVATED T-CELLS AND THEIR USES
CN113302491A (zh) * 2018-12-18 2021-08-24 Mbl国际公司 pMHC占有率的链霉亲和素-寡核苷酸缀合物的组成
TWI852977B (zh) 2019-01-10 2024-08-21 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
US11513113B2 (en) * 2019-02-12 2022-11-29 Pact Pharma, Inc. Compositions and methods for identification of antigen specific T cells
WO2020180713A1 (en) * 2019-03-01 2020-09-10 Flow Pharma, Inc. Design, manufacture, and use of personalized cancer vaccines
CN111696628A (zh) * 2019-03-15 2020-09-22 痕准生物科技有限公司 新生抗原的鉴定方法
CN110567861B (zh) * 2019-09-09 2021-12-21 浙江普罗亭健康科技有限公司 基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的试剂盒及检测方法
CN111234002A (zh) * 2020-01-15 2020-06-05 华东师范大学 肽-主要组织相容性复合物多聚体DNA-pMHC及其制备方法和应用
TW202144388A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途
TW202144389A (zh) 2020-02-14 2021-12-01 美商健生生物科技公司 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途
KR102376443B1 (ko) 2020-02-26 2022-03-17 포항공과대학교 산학협력단 나노구조체, 나노구조체를 포함하는 바이오센서, 및 스크리닝 방법
WO2022009052A2 (en) 2020-07-06 2022-01-13 Janssen Biotech, Inc. Prostate neoantigens and their uses

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040072231A1 (en) 1996-07-29 2004-04-15 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US20090036324A1 (en) 2007-07-16 2009-02-05 Rong Fan Arrays, substrates, devices, methods and systems for detecting target molecules
JP2011518553A (ja) 2008-04-09 2011-06-30 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 標的を検出及び／又は分類する捕捉剤および関連する方法およびシステム

Family Cites Families (163)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4818680A (en) * 1985-12-18 1989-04-04 Mary Collins Method and kit involving displacement and rehybridization of labeled polynucleotide
US5423778A (en) 1989-12-14 1995-06-13 Elof Eriksson System and method for transplantation of cells
GB9010138D0 (en) 1990-05-04 1990-06-27 Slater James H An ultrasensitive microtrace procedure for monitoring the origin,movement and fate of any liquid or solid material
AU1272292A (en) 1990-10-30 1992-05-26 Immulogic Pharmaceutical Corporation Peptide binding assays with mhc antigens
US5635602A (en) 1993-08-13 1997-06-03 The Regents Of The University Of California Design and synthesis of bispecific DNA-antibody conjugates
US6037167A (en) 1994-10-03 2000-03-14 Ericomp Magnetic polynucleotide separation and analysis
US5989813A (en) 1995-07-13 1999-11-23 Molecular Innovations, Inc. Detection of amplified nucleic acid sequences using bifunctional haptenization and dyed microparticles
US6153425A (en) 1995-07-13 2000-11-28 Xtrana, Inc. Self-contained device integrating nucleic acid extraction, amplification and detection
US20030219752A1 (en) 1995-12-07 2003-11-27 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
EP0885958B1 (en) 1996-02-25 2008-06-25 Precision System Science Co., Ltd. Method for treating biopolymers, microorganisms or materials by using more than one type of magnetic particles
US7169556B2 (en) 1996-07-29 2007-01-30 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US7098320B1 (en) 1996-07-29 2006-08-29 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US6582921B2 (en) 1996-07-29 2003-06-24 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses thereof
US5994089A (en) 1997-05-16 1999-11-30 Coulter International Corp. Simultaneous analyses of white blood cell subsets using multi-color, multi-intensity fluorescent markers in flow cytometry
IL133948A0 (en) 1997-07-11 2001-04-30 Brax Group Ltd Characterising nucleic acids
US6974669B2 (en) 2000-03-28 2005-12-13 Nanosphere, Inc. Bio-barcodes based on oligonucleotide-modified nanoparticles
US6261779B1 (en) 1998-11-10 2001-07-17 Bio-Pixels Ltd. Nanocrystals having polynucleotide strands and their use to form dendrimers in a signal amplification system
GB9828785D0 (en) 1998-12-30 1999-02-17 Amersham Pharm Biotech Ab Sequencing systems
JP2004501340A (ja) 2000-01-13 2004-01-15 ナノスフェアー　インコーポレイテッド オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子とその使用方法
AU2010202492A1 (en) 2000-03-28 2010-07-08 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
ATE294960T1 (de) 2000-06-14 2005-05-15 Univ Texas Dielektrisch-hergestellte mikropartikel
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
AU2002211899A1 (en) 2000-10-12 2002-04-22 Amnis Corporation Methods for synthesizing reporter labeled beads
WO2002100325A2 (en) 2000-10-13 2002-12-19 Ligocyte Pharmaceuticals, Inc. Polyvalent nanoparticles
WO2002034769A2 (en) 2000-10-20 2002-05-02 City Of Hope Immunoreactive peptide ctl epitopes of human cytomegalovirus pp150
US20020168663A1 (en) 2001-02-27 2002-11-14 Phan Brigitte Chau Methods for DNA conjugation onto solid phase including related optical biodiscs and disc drive systems
US20060040286A1 (en) 2001-03-28 2006-02-23 Nanosphere, Inc. Bio-barcode based detection of target analytes
US7094555B2 (en) 2001-04-05 2006-08-22 Benaroya Research Institute At Virginia Mason Methods of MHC class II epitope mapping, detection of autoimmune T cells and antigens, and autoimmune treatment
DE10117858A1 (de) 2001-04-10 2002-10-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt MHC-Tetramere
GB0109545D0 (en) 2001-04-18 2001-06-06 Scient Generics Ltd Chemical libraries based on coded particles
US7147687B2 (en) 2001-05-25 2006-12-12 Nanosphere, Inc. Non-alloying core shell nanoparticles
US7902121B2 (en) 2001-07-02 2011-03-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University MHC-antigen arrays for detection and characterization of immune responses
US20030027234A1 (en) 2001-07-30 2003-02-06 Pandian Murugan R. Methods for detecting Down's syndrome
EP1478774A4 (en) 2001-10-09 2006-11-29 Nanosphere Inc ELECTRONIC DETECTION OF DNA BASED ON AN ASSEMBLY AND IMPLEMENTING NANOPARTICLE-LIKE PROBES
DE60228128D1 (de) 2001-11-09 2008-09-18 Nanosphere Inc Biokonjugat-nanopartikelsonden
JP3897285B2 (ja) 2002-02-05 2007-03-22 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 生体高分子検出用試薬及び生体高分子検出方法
CN1464070A (zh) 2002-06-20 2003-12-31 中国科学院化学研究所 提高dna检测灵敏度的方法
EP1539929B1 (en) 2002-06-28 2013-04-10 Life Technologies Corporation Methods for restoring immune repertoire in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation
US20050084967A1 (en) 2002-06-28 2005-04-21 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation
CA2534874A1 (en) 2002-08-13 2004-02-19 National Jewish Medical And Research Center Method for identifying mhc-presented peptide epitopes for t cells
US7361821B2 (en) 2002-09-20 2008-04-22 Intel Corporation Controlled alignment of nanobarcodes encoding specific information for scanning probe microscopy (SPM) reading
DE10247014A1 (de) 2002-10-09 2004-04-22 Erfle, Volker, Prof. Priv.-Doz. Dr. MHC-Multimere
US20040102369A1 (en) 2002-11-27 2004-05-27 The Regents Of The University Of California Transport of basic fibroblast growth factor across the blood brain barrier
JP2004187606A (ja) 2002-12-12 2004-07-08 Institute Of Physical & Chemical Research 核酸アイソフォームの同定、分析および／またはクローニング方法
JP4761202B2 (ja) 2003-01-31 2011-08-31 学校法人慶應義塾 切断可能な対応付け分子およびそれを用いるスクリーニング方法
JP2004354164A (ja) 2003-05-28 2004-12-16 Olympus Corp 微粒子を用いた検体の検査方法及びその検査システム
DE10324912A1 (de) 2003-05-30 2005-01-05 Siemens Ag Verfahren zur Detektion von DNA-Punktmutationen (SNP-Analyse) sowie zugehörige Anordnung
US20050250094A1 (en) 2003-05-30 2005-11-10 Nanosphere, Inc. Method for detecting analytes based on evanescent illumination and scatter-based detection of nanoparticle probe complexes
US20070111204A1 (en) 2003-06-27 2007-05-17 Kathleen Delgrosso Methods for detecting nucleic acid variations
WO2005020890A2 (en) 2003-07-11 2005-03-10 Surromed, Inc. Multiplexed molecular beacon assay for detection of pathogens
WO2005021800A2 (en) 2003-08-22 2005-03-10 Sirna Therapeutics, Inc. Detection and quantitation of nucleic acid molecules in biological samples
WO2005108612A2 (en) 2003-11-28 2005-11-17 Genorx, Inc. Nanoscale biosensor device, system and technique
US7381529B2 (en) 2003-12-31 2008-06-03 Intel Corporation Methods and compositions for detecting nucleic acids using scanning probe microscopy and nanocodes
JP2007536522A (ja) 2004-05-07 2007-12-13 ベックマン コールター インコーポレーティッド Ｃｔｌの媒介による抗原提示細胞の溶解を検出するためのｍｈｃ架橋系
WO2006078289A2 (en) 2004-05-12 2006-07-27 Nanosphere, Inc. Bio-barcode based detection of target analytes
WO2006031883A2 (en) 2004-09-13 2006-03-23 Xencor, Inc. Analysis of mhc-peptide binding interactions
JP2006158276A (ja) 2004-12-06 2006-06-22 Institute Of Physical & Chemical Research Ｄｎａコンジュゲート、ｄｎａコンジュゲートの作製方法、及びｄｎａ検出方法
WO2006076793A1 (en) 2005-01-19 2006-07-27 Grade Biosense Inc. Dna sequence recognition
JP2006328032A (ja) 2005-05-30 2006-12-07 Fujifilm Holdings Corp 核酸プローブ及び多重鎖核酸蛍光検出方法
US20080220982A1 (en) 2005-07-26 2008-09-11 Vu Tania Q Nanoparticle Probes for Capture, Sorting and Placement of Targets
EP1915466B1 (en) 2005-08-19 2010-11-24 Nanosphere, Inc. Methods for preparing hybrid substrates comprising dna and antibodies and uses thereof
WO2007024840A2 (en) 2005-08-22 2007-03-01 Critical Therapeutics, Inc. Method of quantitating nucleic acids by flow cytometry microparticle-based array
ES2324435B1 (es) 2005-10-27 2010-05-31 Fundacion Para El Estudio De La Hematologia Y Hemoterapia De Aragon (Fehha) Procedimiento y dispositivo de analisis in vitro de mrna de genes implicados en neoplasias hematologicas.
US7625702B2 (en) 2005-12-20 2009-12-01 International Business Machines Corporation Helical wrapping of single-walled carbon nanotubes by genomic DNA
JP2007262114A (ja) 2006-03-27 2007-10-11 Jsr Corp 磁性粒子およびその製造方法、ならびに磁性粒子分散体
US20070264652A1 (en) 2006-05-10 2007-11-15 National Institute Of Immunology Method for detection of a sequence
EP2019691B1 (en) 2006-05-15 2020-08-12 Massachusetts Institute of Technology Polymers for functional particles
WO2008001376A2 (en) 2006-06-28 2008-01-03 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Detection of analytes in a medium
WO2008091364A2 (en) 2006-06-30 2008-07-31 Intel Corporation Nanoparticles as tags for bioanalyte detection by nuclear magnetic resonance or electron spin resonance
US8394590B2 (en) 2006-08-02 2013-03-12 California Institute Of Technology Capture agents and related methods and systems for detecting and/or sorting targets
AU2007281479A1 (en) * 2006-08-02 2008-02-07 California Institute Of Technology Methods and systems for detecting and/or sorting targets
CN101522915A (zh) * 2006-08-02 2009-09-02 加州理工学院 用于检测和/或分选靶标的方法和系统
GB2442001A (en) 2006-08-11 2008-03-26 Chembiotech Nanoparticle - i-motif nucleic acid bioconjugates
KR100904825B1 (ko) 2006-09-09 2009-06-25 재단법인서울대학교산학협력재단 산란 현상을 이용한 ｄｎａ혼성화 측정방법
KR100823684B1 (ko) 2006-12-06 2008-04-21 한국전자통신연구원 바코드 ｄｎａ를 이용한 생물학적 표적 물질의 검출 방법
EP2126039A4 (en) 2007-01-23 2011-03-16 Yeda Res & Dev MICROFLUIDIC DEVICES AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME
TWI388831B (zh) 2007-01-30 2013-03-11 Academia Sinica 溶液中基因微陣列分析
AU2016203838A1 (en) 2007-03-07 2016-06-30 The General Hospital Corporation Compositions and methods for the prevention and treatment of autoimmune conditions
AU2008222678B2 (en) 2007-03-07 2013-01-17 The General Hospital Corporation Compositions and methods for the prevention and treatment of autoimmune conditions
US7807372B2 (en) 2007-06-04 2010-10-05 Northwestern University Screening sequence selectivity of oligonucleotide-binding molecules using nanoparticle based colorimetric assay
WO2008157649A1 (en) 2007-06-18 2008-12-24 Northwestern University Non-enzymatic detection of bacterial genomic dna
EP3023436A1 (en) 2007-07-03 2016-05-25 Dako Denmark A/S Improved methods for generation, labeling and use of mhc multimers
JP2009068869A (ja) 2007-09-11 2009-04-02 Panasonic Corp 生体分子検出方法
AU2007100888A4 (en) 2007-09-13 2007-11-01 Shan, Jianguo Dr Design and synthesis of streptavidin-DNA conjugates
US8993714B2 (en) 2007-10-26 2015-03-31 Imiplex Llc Streptavidin macromolecular adaptor and complexes thereof
WO2009055068A1 (en) 2007-10-26 2009-04-30 Imiplex Llc Streptavidin macromolecular adaptor and complexes thereof
WO2009083856A2 (en) 2007-12-20 2009-07-09 Koninklijke Philips Electronics N.V. Concentrated unbound magnetic particle assay for biosensors
DE102008013715B4 (de) 2008-02-29 2011-12-08 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Verfahren zur DNA-Analyse
US9738888B2 (en) 2008-03-24 2017-08-22 Universidade Federal de Pernambuco—UFPE Magnetic nanocomposite retrieval of nucleotide sequence
AU2009231585B2 (en) 2008-04-04 2014-08-14 Novozymes A/S Method of enhancing enzyme activity
CN102203246A (zh) 2008-06-02 2011-09-28 布鲁克哈文科学协会有限公司 通过蛋白质和dna剂可控组装和解组装的纳米颗粒体系
CN101684503A (zh) 2008-09-23 2010-03-31 武汉哇哇噻纳技术开发有限公司 基于dna信号转换的磁颗粒/微电极检测方法
WO2010037395A2 (en) 2008-10-01 2010-04-08 Dako Denmark A/S Mhc multimers in cancer vaccines and immune monitoring
WO2010037397A1 (en) 2008-10-01 2010-04-08 Dako Denmark A/S Mhc multimers in cmv immune monitoring
WO2010042823A1 (en) 2008-10-09 2010-04-15 Northeastern Universtiy Multifunctional self-assembling polymeric nanosystems
US20110171749A1 (en) 2009-03-02 2011-07-14 Board Of Trustees Of Michigan State University Nanoparticle tracer-based electrochemical dna sensor for detection of pathogens-amplification by a universal nano-tracer (aunt)
US8999263B2 (en) 2009-05-29 2015-04-07 Ondavia, Inc. Microfluidic separation device
WO2011050000A2 (en) 2009-10-20 2011-04-28 The Regents Of The University Of California Single molecule nucleic acid nanoparticles
PT2491056T (pt) 2009-10-22 2021-10-26 Univ Of Twente Vhh para aplicação na reparação de tecidos, regeneração de órgãos, substituição de órgãos e engenharia de tecidos
US9023650B2 (en) 2009-11-02 2015-05-05 Lawrence Livermore National Security, Llc DNA tagged microparticles
US20110237449A1 (en) 2010-01-07 2011-09-29 Affymetrix, Inc. Methods and Compositions for Nucleic Acid Purification
WO2011090445A1 (en) 2010-01-22 2011-07-28 Huseyin Avni Oktem Method for detection of non-labeled pcr products on sandwich hybridization based array platforms
WO2011100669A2 (en) 2010-02-15 2011-08-18 North Carolina State University Office Of Technology Transfer Lable-free multiplexing bioassays using fluorescent conjugated polymers and barcoded nanoparticles
GB201003088D0 (en) 2010-02-24 2010-04-14 Univ Exeter Method for the preparation of a novel nanoparticle conjugate
KR101100664B1 (ko) 2010-03-25 2012-01-03 충남대학교산학협력단 디지털 바코드 나노 와이어 및 이를 이용한 바이오 센싱 시스템
CN102234682B (zh) 2010-04-20 2012-11-28 中国科学院广州生物医药与健康研究院 基于生物条码的核酸纳米金生物传感器
CN101852808A (zh) 2010-05-18 2010-10-06 中国医学科学院生物医学工程研究所 应用生物条码与基因芯片检测蛋白浓度的方法
KR101171738B1 (ko) 2010-06-07 2012-08-07 터프츠 유니버시티 복제몰딩에 의한 ｄｎａ-컨쥬게이티드 하이드로겔 마이크로입자의 제조 방법 및 이를 이용한 핵산의 혼성화 분석 방법
US20150050747A1 (en) 2010-07-19 2015-02-19 Board Of Trustees Of Michigan State University DIRECTED DNA CO-POLYMER MASS AMPLIFICATION FOR ssDNA DETECTION
US10023657B2 (en) 2010-10-01 2018-07-17 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Reversible protein multimers, methods for their production and use
US9511151B2 (en) 2010-11-12 2016-12-06 Uti Limited Partnership Compositions and methods for the prevention and treatment of cancer
CN102072931B (zh) 2010-12-09 2013-07-17 华东师范大学 一种基于硅纳米线的生物传感器制备方法及在dna检测中的应用
CN102147414B (zh) 2010-12-30 2013-07-03 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于纳米探针的微流体芯片检测微量蛋白的方法
CN102168066A (zh) 2011-01-31 2011-08-31 浙江大学 体外诱导乙型肝炎病毒特异性细胞毒性t淋巴细胞的方法
WO2012111686A1 (ja) 2011-02-15 2012-08-23 協和メデックス株式会社 ストレプトアビジン結合磁性粒子の製造方法
CN103443626B (zh) 2011-02-15 2015-07-08 协和梅迪克斯株式会社 链霉亲和素结合磁性粒子及其制造方法
JPWO2012111687A1 (ja) 2011-02-15 2014-07-07 協和メデックス株式会社 ストレプトアビジン結合磁性粒子の製造方法
WO2012148960A2 (en) 2011-04-25 2012-11-01 University Of Notre Dame Du Lac Systems and methods for detecting and quantifying a sequence of nucleotides
KR20220002713A (ko) 2011-04-29 2022-01-06 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. 치료적 단백질에 대해 면역 반응을 감소시키는 관용원성 합성 나노운반체
SG188068A1 (en) 2011-08-24 2013-03-28 Agency Science Tech & Res Method for detecting dna-binding proteins
WO2013036826A2 (en) 2011-09-09 2013-03-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Streptavidin complexes and uses thereof
CN102321762B (zh) 2011-09-14 2014-07-30 上海德诺产品检测有限公司 一种高灵敏度快速检测单增李斯特菌的方法及其试剂盒
HK1201565A1 (en) * 2011-10-21 2015-09-04 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
JP2013092501A (ja) 2011-10-27 2013-05-16 Toyohashi Univ Of Technology バイオ物質の検出方法
CN103998625B (zh) 2011-11-18 2017-06-06 华大生物科技（武汉）有限公司 用于病毒检测的方法和系统
KR101355994B1 (ko) 2011-11-22 2014-01-29 한국과학기술원 병원체 검출용 마이크로디바이스
US20150031571A1 (en) 2012-02-07 2015-01-29 University Of Kansas Chemiluminescent nanoparticles and uses thereof
US10988516B2 (en) 2012-03-26 2021-04-27 Uti Limited Partnership Methods and compositions for treating inflammation
KR101360405B1 (ko) 2012-04-10 2014-02-11 서강대학교산학협력단 신경전달-관련 물질 검출용 센서
KR20130121550A (ko) 2012-04-27 2013-11-06 서강대학교산학협력단 티로신 수산화효소 검출용 센서
FR2998899B1 (fr) 2012-11-30 2015-07-17 Commissariat Energie Atomique Methode de criblage a haut-debit pour l'identification de biomarqueurs, cibles therapeutiques ou d'agents therapeutiques
WO2014070652A1 (en) 2012-10-29 2014-05-08 New York University Colloids with valence: fabrication, functionalization and directional bonding
KR101488436B1 (ko) 2013-01-28 2015-02-04 고려대학교 산학협력단 금 나노입자를 이용한 ｄｎａ 혼성화 반응의 단일 부정합 검출방법
JP2016507067A (ja) 2013-02-15 2016-03-07 ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニヴァーシティー オブ トロントＴｈｅ Ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ 金属ナノシェル被覆バーコード
US9914960B2 (en) 2013-03-15 2018-03-13 Boise State University Enhanced DNA sensing via catalytic aggregation of gold nanoparticles by DNA hybridization chain reaction
EP2970767B1 (en) 2013-03-15 2017-06-28 Massachusetts Institute of Technology Rare earth spatial/spectral microparticle barcodes for labeling of objects and tissues
CN103266170A (zh) 2013-05-13 2013-08-28 江南大学 一种基于pcr组装磁性纳米粒子进行dna检测的方法
KR101580360B1 (ko) 2013-05-22 2015-12-28 김성천 연자성미세구조물을 이용한 리간드의 스크리닝 시스템 및 그 용도
EP2993460B1 (en) 2013-05-30 2019-07-03 Osaka Prefecture University Public Corporation Target-substance detection apparatus and method
CN103276087B (zh) 2013-05-30 2015-03-18 杭州金溪生物技术有限公司 高灵敏度的蛋白检测方法
WO2014197840A1 (en) 2013-06-07 2014-12-11 Massachusetts Institute Of Technology Affinity-based detection of ligand-encoded synthetic biomarkers
CN103333967B (zh) 2013-07-12 2016-06-22 湖南工程学院 一种基于微流控微珠阵列芯片的核酸检测方法
CA2929042A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 The Foundation For The Promotion Of Industrial Science Dna detection method
KR101537165B1 (ko) 2013-10-30 2015-07-15 서울대학교산학협력단 바코드 dna를 이용한 겔 전기영동 기반 생물물질의 분석방법
WO2015066635A1 (en) 2013-11-01 2015-05-07 Daniel Irimia Cell sorting
KR102475314B1 (ko) 2013-12-23 2022-12-06 일루미나, 인코포레이티드 광 방출의 검출을 개선시키기 위한 구조화 기판 및 이와 관련한 방법
GB201404552D0 (en) 2014-03-14 2014-04-30 Philochem Ag Purification of dna-conjugate products
JP2015173626A (ja) 2014-03-14 2015-10-05 ジェノダイブファーマ株式会社 次世代シークエンサーのためのｄｎａライブラリー調製方法
WO2015161173A1 (en) 2014-04-18 2015-10-22 William Marsh Rice University Competitive compositions of nucleic acid molecules for enrichment of rare-allele-bearing species
US10788483B2 (en) 2014-05-15 2020-09-29 Victoria Link Limited Optimization method of a polynucleotide sequence
KR20150144644A (ko) 2014-06-17 2015-12-28 건국대학교 산학협력단 Dna 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법
WO2015200384A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Abreos Biosciences, Inc. Multiplex dna nanoparticle protein assay and quantitation
WO2016015027A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 SeLux Diagnostics, Inc. Assay methods involving dissociable nanoparticles
DE102014116567A1 (de) 2014-11-12 2016-05-12 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren und Vorrichtung zum Sortieren von Mikropartikeln in einem Fluidstrom
WO2016090115A1 (en) 2014-12-04 2016-06-09 The Regents Of The University Of California Novel multivalent bioassay reagents
BR112017015203A2 (pt) 2015-01-16 2018-03-13 Hope City anticorpos de penetração celular
AU2016215058B2 (en) 2015-02-06 2021-06-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Systems and methods for high-resolution imaging
WO2016160908A1 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Verily Life Sciences Llc Methods for combining single cell profiling with combinatorial nanoparticle conjugate library screening
WO2016160822A1 (en) 2015-03-30 2016-10-06 Verily Life Sciences Llc Functionalized nanoparticles, methods and in vivo diagnostic system
CN104962570A (zh) 2015-06-03 2015-10-07 湖北文理学院 一种高均一性单价链霉亲和素四聚体的制备方法
CN105651992B (zh) 2016-02-16 2018-10-12 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 三唑磷生物条形码免疫分析测定试剂盒及其应用
CN105648069A (zh) 2016-02-25 2016-06-08 青岛科技大学 基于适体的靶向激活循环放大spr检测蛋白质的方法
CN105755118B (zh) 2016-03-10 2020-01-21 杭州市疾病预防控制中心 免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040072231A1 (en) 1996-07-29 2004-04-15 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses therefor
US20090036324A1 (en) 2007-07-16 2009-02-05 Rong Fan Arrays, substrates, devices, methods and systems for detecting target molecules
JP2011518553A (ja) 2008-04-09 2011-06-30 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 標的を検出及び／又は分類する捕捉剤および関連する方法およびシステム

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