CN101684503A - 基于dna信号转换的磁颗粒/微电极检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于DNA作为信号放大的检测方法，将检测信号转换为检测DNA的信号，首先通过磁颗粒分离技术将待检测物分离富集，然后DNA杂交信号放大片段，通过DNA杂交得到DNA信号放大片段，然后利用磁颗粒-微电极检测方法检测DNA信号放大片断，即可得到待检测物的信息。

Description

基于DNA信号转换的磁颗粒/微电极检测方法

[技术领域]

本发明涉及生物医学领域的一种体外检测方法，将检测DNA、蛋白质、化学分子等信号均可转换为检测DNA的信号，通过DNA信号转换实现对多种样品的检测。

[背景技术]

目前生物检测通常采用是借助抗体、特异性配体进行检测，但抗体或配体蛋白活性不稳定，容易失活，而且所需条件严格，制备昂贵，不利于生物样品的检测。

而DNA则具有很好的稳定性，合成制备方便廉价，在生物检测中具有明显的优势，常能获得极高的信噪比和灵敏度。因此在生物样品检测中通过DNA信号转换，将检测抗体或配体蛋白的信号转换为检测DNA的信号，从而确定待测生物样品，成为生物样品检测的已大趋势。美国Northwest University的Mirkin教授实现了无需PCR扩增的炭疽DNA电学检测(Science 301，1884-1886，2003)，在检测前列腺肿瘤标志物PSA时，引入DNA作为信号放大分子，通过PCR或生物芯片技术检测DNA，从而实现了对PSA的高灵敏检测。

但是，使用PCR或生物芯片具有一定的局限性。PCR需要设备昂贵，耗时长，而且其灵敏度有限；生物芯片容易产生高背景，不易重复，生物芯片采用的是固液杂交，效率低。

[发明内容]

针对现有技术的上述缺点，本发明所要达到的技术目的是提供一种高灵敏、特异性好、稳定的检测方法，将检测信号转换为检测DNA的信号，所有的实验过程均是液相杂交。

技术方案，本发明提出DNA信号转换与磁颗粒分离-微电极检测相结合的路线，包括两种方案，第一种方案步骤如下(图1)：1)富集，利用特异性标记物1(L1)修饰的磁纳米颗粒在液相中富集待检测物质，待测物质可以为核酸、蛋白，包括DNA、RNA、抗原、抗体等；2)可加入亲和素标记的特异性标记物2(L2)；3)得到磁颗粒L1-待测物质-L2亲和素复合物后，加入生物素化的双链DNA(双链DNA只有其中一条的5’端被生物素化)；4)得到磁颗粒L1-待测物质-L2亲和素-生物素双链DNA复合物后，经94℃处理去杂交，得到游离的单链DNA；5)游离的单链DNA利用我们已经建立的磁颗粒分离-微电极检测方法(参见专利。。。。)进行检测，DNA的信号强度代表了待检测物质的信号强度，从而实现了待检测物质的检测。

第二种方案步骤如下(图2)：1)富集，利用特异性标记物1(L1)修饰的磁纳米颗粒在液相中富集待检测物质，待测物质可以为核酸、蛋白，包括DNA、RNA、抗原、抗体等；2)可加入纳米微球(如硅纳米颗粒，聚苯乙烯微球等)标记的特异性标记物2(L2)，同时在纳米微球表面还标有大量的双链DNA；3)得到磁颗粒L1-待测物质-L2纳米微球/DNA复合物后，经94℃处理去杂交，得到游离的单链DNA；5)游离的单链DNA利用我们已经建立的磁颗粒分离-微电极检测方法(参见专利200610086617.5)进行检测，DNA的信号强度代表了待检测物质的信号强度，从而实现了待检测物质的检测。

DNA信号转换，有以下优点：1)DNA性质稳定，不易失活，其杂交规律了解比较清楚，特异性高；2)DNA制备廉价快速，满足多种需要；3)DNA设计与改造方便，可以根据不同实验设计不同的DNA序列，便于多样化检测。

液相杂交，有以下优点：1)采用葡聚糖或琼脂糖或壳聚糖修饰的磁颗粒，能够减少杂交、银染过程中的非特异性吸附；2)磁颗粒直径小于1μm，特异性标记物L1可以较均匀、有序地修饰到磁纳米颗粒表面；3)磁纳米颗粒大大增加了特异性标记物分子与待测样品的反应界面，能够有效地富集待测物质(见图3)；4)磁纳米颗粒均一分散在反应液中，反应更加接近生理环境。均匀有序的修饰，高反应界面，液相中均一分散使得反应时间更快、灵敏度更高、特异性更好。

磁颗粒-微电极检测系统，参见专利检测系统灵敏、快速、稳定，特异性地检测生物大分子。可以结合自动化装置，构建一种生物大分子的杂交、银染、均借助一集成的自动化检测装置完成的自动化检测仪，无需手工逐步操作。

[附图说明]

图1为本发明所创新DNA信号转换与磁颗粒-微电极检测相结合的检测系统(方案一)。

1为磁颗粒，2为能够结合磁颗粒的特异性标记物L1，3为待测物质，4为特异性标记物L2，5为标记L2的亲和素，6为生物素，7为双链DNA，8为磁颗粒-微电极检测系统中与信号转换DNA特异识别的DNA探针1，9为双链DNA中去杂交获得的单链DNA，用于信号转换放大，10为特异识别信号转换DNA的探针2标记的金颗粒。

图2为本发明所创新DNA信号转换与磁颗粒-微电极检测相结合的检测系统(方案二)。

1为磁颗粒，2为能够结合磁颗粒的特异性标记物L1，3为待测物质，4为特异性标记物L2，5为纳米微球，6为双链DNA，含有用于信号转换的DNA，7为磁颗粒-微电极检测系统中与信号转换DNA特异识别的DNA探针1，8为双链DNA中去杂交获得的单链DNA，用于信号转换放大，9为特异识别信号转换DNA的探针2标记的金颗粒。

图3为本发明的检测方法检测炭疽核酸片断。

图4为本发明的检测方法检测鼠AA98单克隆抗体。

[具体实施方式]

生物样本检测实例1

利用本发明的实验方案1进行鼠AA98单克隆抗体的检测，所用50nm磁颗粒由Dynal公司购买，A蛋白在磁颗粒上标记参照说明书，亲和素标记的羊抗鼠二抗购自sigma公司，探针1在磁颗粒上标记参照说明书，银染试剂盒Sigma公司购买，银染过程参照说明书，金颗粒标记的探针2见文献(Science 295，1503-1506，2002)，生物素化的双链DNA(其中一条用于信号转换)人工合成，间隙为50μm的微电极通过光刻方法制备，具体实施步骤如下：

1)待测样品富集：100μL的A蛋白修饰的磁纳米颗粒，100μL的鼠IgG单克隆抗体样品混合，室温下杂交120分钟，外加磁场吸附磁颗粒，PBS清洗三次后重新分散到100μL杂交液中。

2)DNA信号转换：加入亲和素标记的羊抗鼠二抗20μL、室温下杂交20分钟，形成复合体，外加磁场吸附复合体，PBS清洗三次；然后加入生物素标记的双链DNA10μL、室温下杂交20分钟，形成复合体，外加磁场吸附复合体，PBS清洗三次后重新分散到100μL杂交液中。94℃处理去杂交，外加磁场处理，收集上清液，得到游离的单链DNA。

3)磁颗粒-微电极检测单链DNA

方法参见专利200610086617.5

结果显示炭疽DNA片断个数的对数和测得相应电阻的对数呈近似线性关系(如图3)，可以用于定量分析。空白对照组的测得电阻为10⁶，含有10⁴个炭疽DNA片断组测得电阻为10³，信号噪声比约10³。同探针分子固定在电极间基片上的检测，信号噪声比提高了两个数量级以上(Science 295，1503-1506，2002)。

生物样本检测实例2

利用本发明的实验方案2进行鼠AA98单克隆抗体的检测，所用50nm磁颗粒由Dynal公司购买，A蛋白在磁颗粒上标记参照说明书，羊抗鼠二抗购自sigma公司，探针1在磁颗粒上标记参照说明书，银染试剂盒Sigma公司购买，银染过程参照说明书，探针2标记的金颗粒见文献(Science 295，1503-1506，2002)，双链DNA(其中一条用于信号转换)人工合成，双链DNA和羊抗鼠二抗共同标记于纳米微球(1μm)见参考文献(Small 2，103-108，2006)间隙为50μm的微电极通过光刻方法制备，具体实施步骤如下：

1)待测样品富集：100μL的A蛋白修饰的磁纳米颗粒，100μL的鼠IgG单克隆抗体混合，室温下120分钟，外加磁场吸附磁颗粒，PBS清洗三次后重新分散到100μL杂交液中。

2)DNA信号转换：加入纳米微球/双链DNA标记的羊抗鼠二抗20μL、室温下杂交20分钟，形成复合体，外加磁场吸附复合体，PBS清洗三次后重新分散到100μL杂交液中。94℃处理去杂交，外加磁场处理，收集上清液，得到游离的单链DNA。

3)磁颗粒-微电极检测单链DNA

方法参见专利200610086617.5

结果显示抗体浓度的对数和测得相应电阻的对数呈近似线性关系，可以用于定量分析(如图4)。

Claims (4)

1.一种DNA信号转换的磁颗粒/微电极检测方法，其特征是将DNA信号转换与磁颗粒-微电极检测技术结合起来，建立高效、稳定的检测方法，待测物质通过磁颗粒富集后，经DNA信号转换后，利用磁颗粒-微电极检测技术检测DNA信号，即可反应出待检测物质的信号。

2.根据权利要求1所述的DNA信号转换的磁颗粒/微电极检测方法，其特征在于使用双链DNA作为信号转换。

3.根据权利要求1所述的DNA信号转换的磁颗粒/微电极检测方法，其特征在于使用磁颗粒-微电极检测方法。

4.根据权利要求1所述的DNA信号转换的磁颗粒/微电极检测方法的应用，其特征在于所述待测物质是核酸，蛋白质，病毒生物样品及化学物质。

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