CN101522915A - 用于检测和/或分选靶标的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本文提供了基于将以多核苷酸编码的蛋白质与衬底多核苷酸组合使用而检测和/或分选样品中靶标的方法和系统。所述以多核苷酸编码的蛋白质由与预定靶标特异性结合的蛋白质以及与衬底多核苷酸特异性结合的编码多核苷酸组成，其中所述衬底多核苷酸附着在衬底上。
Description
与相关申请交叉参考
本申请要求下列优先权：2006年8月2日提交的美国临时申请，卷号CIT-4707，序列号60/834,823，题为＂A unified Platform for MultiplexedCell Sorting and Detection of Genes and Proteins＂，以及2007年7月16日提交的美国临时申请，卷号CIT-4944，序列号60/959,665，题为＂DigitalDEAL：A quantitative and digital Protein Detection Immunoassay＂，其公开内容通过参考整体并入本文。
政府资助声明
根据由Frederick国立癌症研究院给予的资助号CA119347和由ARO-美国陆军Robert Morris采购中心给予的资助号DAAD19-03-D-0004/0008和资助号5U54CA 119347，美国政府对本公开内容享有某些权利。
技术领域
本公开内容涉及在样品如生物样品中检测一种或多种靶标，尤其是生物标志物。更具体地，其涉及用于检测和/或分选靶标的方法和系统。
背景技术
靶标(尤其是生物标志物)的高灵敏度检测是生物分子分析领域中的一个挑战，尤其是在企图检测多种靶标时。无论是用于病理学检查还是基础生物学研究，都有若干方法普遍用于检测多种类别的生物材料和生物分子。
在实验室中普遍用于检测单个生物靶标的一些技术包括凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、western印迹、荧光原位杂交(FISH)、荧光活化细胞分选(FACS)、聚合酶链式反应(PCR)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。这些方法提供了在生物样品如组织中检测一种或多种生物标志物的能力，并且也适用于诊断目的。
然而，目前对组织的全局性基因组及蛋白质组学分析正在影响我们在分子水平上对许多人类癌症的理解。整合了基因表达和蛋白组学数据二者的研究尤其具有信息性。这类多参数数据集已开始揭示定义癌症发生和发展的混乱的调节网络(Lin，B.；White，J.T.；Lu，W.；Xie，T.；Utleg，A.G；Yan，X.；Yi，E.C；Shannon，P.；Khretbukova，I.；Lange，P.H.；Goodlett，D.R.；Zhou，D.；Vasicek，T.J.；Hood，L.Cancer Res.2005，65，3081-3091.Kwong，K.Y.；Bloom，G C；Yang，I.；Boulware，D.；Coppola，D.；Haseman，J.；Chen，E.；McGrath，A.；Makusky，A.J.；Taylor，J.；Steiner，S.；Zhou，J.；Yeatman，T.J.；Quackenbush，J.Genomics 2005，86，142-158.Huber，M.；Bahr，L；Kratzchmar，J.R.；Becker，A.；Muller，E.-C；Donner，P.；Pohlenz，H.-D.；Schneider，M.R.；Sommer，A.Molec.Cell.Proteomics2004，3，43-55.Tian，Q.；Stepaniants，S.B.；Mao，M.；Weng，L.；Feetham，M.C；Doyle，M.J.；Yi，E.C；Dai，H.；Thorsson，V.；Eng，J.；Goodlett，D.；Berger，J.P.；Gunter，B.；Linseley，P.S.；Stoughton，R.B.；Aebersold，R.；Collins，S.J.；Hanlon，W.A.；Hood，L.E.Molec.Cell.Proteomics 2004，3，960-969.Chen，G；Gharib，.T.G；Huang，C-C；Taylor，J.M.G；Misek，D.E.；Kardia，S.L.R.；Giordano，T.J.；Iannettoni，M.D.；Orringer，M.B.；Hanash，S.M.；Beer，D.G Molec.Cell.Proteomics 2002，1，304-313)。对复杂疾病如癌症的这种新情况以及有前途的新癌症药物的出现(Prados，M.；Chang，S.；Burton，E.；Kapadia，A.；Rabbitt，J.；Page，M.；Federoff，A.；Kelly，S.；Fyfe，G Proc.Am.Soc.Clin.Oncology 2003，22，99.Rich，J.N.；Reardon，D.A.；Peery，T.；Dowell，J.M.；Quinn，J.A.；Penne，K.L.；Wikstrand，C J.；van Duyn，L.B.；Dancey，J.E.；McLendon，R.E.；Kao，J.C；Stenzel，T.T.；Rasheed，B.K.A.；Tourt-Uhlig，S.E.；Herndon，J.E.；Vredenburgh，J.J.；Sampson，J.H.；Friedman，A.H.；Bigner，D.D.；Friedman，H.S.J.Clin.Oncology 2004，22，133-142.)对临床病理学提出了新的要求(Mellinghoff，I.K.；Wang，M.Y.；Vivanco，I.；Haas-Kogan，D.A.；Zhu，S.；Dia，E.Q.；Lu，K.V.；Yoshimoto，K，；Huang，J.H.Y.；Chute，D.J.；Riggs，B.L.；Horvath，S.；Liau.，L.M.；Cavenee，W.K.；Rao，P.N.；Beroukhim，R.；Peck，T.C；Lee，J.C；Sellers，W.R.；Stokoe，D.；Prados，M.；Cloughesy，T.F；Sawyers，C.L.；Mischel，P.S.N.Engl.J.Med.2006，353，2012-2024)。例如，传统的病理学实践(即组织的显微镜分析)不能区分对新的癌症分子疗法的潜在应答者和非应答者(Betensky，R.A.；Louis，D.N.；Cairncross，J.G J.Clin.Oncology 2002，20，2495-2499)。最近有这样的实例，其中少量参数(pauciparameter)分子测量法被用于鉴定对至少两种疗法的潜在应答者(Hughes，T.；Branford，S.，2003.Semin Hematol.2 Suppl 2，62-68.Lamb，J.；Crawford，E.D.；Peck，D.；Modell，J.W.；Blat，I.C；Wrobel，M.J.；Lerner，J.；Brunet，J.P.；Subramanian，A.；Ross，K.N.；Reich，M.；Hieronymus，H.；Wei，G.；Armstrong，S.A.；Haggarty，S.J.；Clemons，P.A.；Wei，R.；Carr，S.A.；Lander，E.S.；Golub，T.R.，Science2006，313，(5795)，1929-1935.Martin，M.，CHn.Transl Oncol.8，(1)，7-14.Radich，J.P.；Dai，H.；Mao，M.；Oehler，V.；Schelter，J.；Druker，B.；Sawyers，C.L.；Shah，N.；Stock，W.；Willman，C.L.；Friend，S.；Linsley，P.S.，Proc.Natl.Acad.Sci.2006，103，(8)，2794-2799)。然而，单参数测量法不太可能成为普遍情况。取而代之，分子诊断学与分子疗法的联合最终会需要测量多参数(例如细胞、mRNA和蛋白质)生物标志物组合，其可用于指导患者进行适当的疗法或组合疗法。
目前，测量来自患病组织的多参数生物标志物组合需要组合显微镜分析、微阵列数据(Mischel，P.S.；Cloughesy，T.F.；＂Nelson，S.F.Nature Rev.Neuroseience 2004，5，782-794)、免疫组织化学染色、Western印迹(Mellinghoff，I.K.；Wang，M.Y.；Vivanco，I.；Haas-Kogan，D.A.；Zhu，S.；Dia，E.Q.；Lu，K.V.；Yoshimoto，K.；Huang，J.H.Y；Chute，D.J.；Riggs，B.L.；Horvath，S.；Liau.，L.M.；Cavenee，W.K.；Rao，P.N.；Beroukhim，R.；Peck，T.C；Lee，J.C.；Sellers，W.R.；Stokoe，D.；Prados，M.；Cloughesy，T.F.；Sawyers，C.L.；Mischel，P.S.N.Engl.J.Med.2006，353，2012-2024)和其他方法。将收集的数据整合进一些疾病模型中以产生诊断，所述模型例如癌症途径模型(Weinberg，R.A.，C ancer Biology.Garland Science：2006)。目前，进行这些多种测量法需要外科手术切除的组织样品。这类活检样品的异质性可导致显著的取样误差，因为细胞、mRNA和蛋白质的多种测量各自在组织的不同区域进行。
发明概述
本文提供了基于将以多核苷酸编码的蛋白质与衬底多核苷酸组合使用的方法和系统。本文公开的以多核苷酸编码的蛋白质由特异性结合靶标的蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸组成。所述编码多核苷酸由特异性结合衬底多核苷酸的序列组成。本文公开的衬底多核苷酸附着于衬底，并由特异性结合所述编码多核苷酸的序列组成。
根据本文公开的方法和系统可以进行多种测定，包括但不限于用于检测和/或分离靶标的测定，所述靶标尤其是生物标志物，例如细胞、蛋白质和/或多核苷酸。具体地，在使用本文公开的方法和系统的测定中，使用以多核苷酸编码的蛋白质在以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体中特异性结合靶标，并使用衬底多核苷酸将所述以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体与衬底结合用于检测。如技术人员阅读本公开内容后显而易见的，本文公开的方法和系统允许产生若干测定的有利性能，尤其是在微流体(microfluidic)环境中。
根据第一个方面，公开了检测样品中靶标的方法和系统，该方法和系统基于组合使用附着于衬底的衬底多核苷酸与以多核苷酸编码的蛋白质，所述以多核苷酸编码的蛋白质由蛋白质和编码多核苷酸组成，所述蛋白质特异性结合靶标，所述编码多核苷酸特异性结合附着于衬底的衬底多核苷酸。
在该方法中，将以多核苷酸编码的蛋白质与样品及衬底多核苷酸在一定条件下接触一定时间，以允许该以多核苷酸编码的蛋白质在以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体中与靶标结合，并且允许编码多核苷酸与衬底多核苷酸结合，从而提供与衬底多核苷酸结合的多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体。在该方法中，随后通过技术人员阅读本公开内容后可识别的检测技术来检测与衬底多核苷酸结合的多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体。
在该系统中，将衬底与多核苷酸编码蛋白质一起提供，所述衬底带有附着于该衬底的衬底多核苷酸，所述多核苷酸编码蛋白质包含特异性结合靶标的蛋白质和特异性结合衬底多核苷酸的编码多核苷酸。
根据第二个方面，公开了用于检测样品中多种靶标的方法和系统，该方法和系统基于组合使用附着于衬底的多种衬底多核苷酸以及多种以多核苷酸编码的抗体。
在该方法和系统中，各种衬底多核苷酸是序列特异性的，并且在位置上可彼此区分。在该方法和系统中，每种多核苷酸编码蛋白质由蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸组成，其中所述蛋白质与多个靶标的预定靶标特异性结合，且所述编码多核苷酸与所述多种衬底多核苷酸中序列特异性且位置可区分的衬底多核苷酸特异性结合。另外，在该方法和系统中，各种蛋白质和编码多核苷酸在结合方面可彼此区分。
在该方法中，将多种多核苷酸编码抗体与样品和多种衬底多核苷酸在一定条件下接触一定时间，以允许抗体与靶标在多种多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体中结合，并允许编码多核苷酸与衬底多核苷酸结合。在该方法中，随后通过技术人员阅读本公开内容后可识别的检测技术来检测与衬底上多种衬底多核苷酸结合的多种多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体。
在该系统中，包括了衬底和多种多核苷酸编码抗体，所述衬底带有附着于该衬底的多种衬底多核苷酸。
根据第三个方面，公开了用于检测样品中多种靶标的方法和系统，其中所述靶标包含至少一种靶多核苷酸。该方法和系统基于组合使用附着于衬底的多种衬底多核苷酸、至少一种多核苷酸编码蛋白质和至少一种经标记多核苷酸。
在该方法和系统中，各个衬底多核苷酸是序列特异性的，并且在位置上可彼此区分。在该方法和系统中，所述至少一种经标记多核苷酸与至少一种靶多核苷酸特异性结合，各种经标记多核苷酸在结合方面可彼此区分。在该方法和系统中，所述至少一种多核苷酸编码蛋白质由蛋白质和编码多核苷酸组成，所述蛋白质特异性结合所述多种靶标中的预定靶标，所述编码多核苷酸与所述多种衬底多核苷酸中序列特异性且位置可区分的衬底多核苷酸特异性结合。在该方法和系统中，各蛋白质和编码多核苷酸在结合方面可彼此区分，各蛋白质还与各种经标记多核苷酸在结合方面可彼此区分，且各多核苷酸编码蛋白质与各种经标记靶多核苷酸在结合方面可彼此区分。
在该方法中，将所述至少一种经标记多核苷酸与样品在一定条件下接触一定时间，以允许经标记多核苷酸与靶多核苷酸结合，从而提供至少一种经标记靶多核苷酸，其中所述至少一种经标记靶多核苷酸由这样的序列组成，所述序列与序列特异性且位置可区分的衬底多核苷酸特异性结合。此外，在该方法中，将所述至少一种多核苷酸编码蛋白质与样品在一定条件下接触一定时间，以允许该蛋白质与靶标在至少一种多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体中结合。另外，在该方法中，将所述至少一种经标记的靶多核苷酸和所述至少一种多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体与多种衬底多核苷酸在一定条件下接触一定时间，以允许所述至少一种经标记的靶多核苷酸与相应的衬底多核苷酸结合，并允许所述至少一种编码多核苷酸与相应的衬底多核苷酸结合。在该方法中，随后通过使用技术人员在阅读本公开内容后可识别的检测技术来检测与衬底上空间定位的多种衬底多核苷酸结合的经标记靶多核苷酸和多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体。
在该系统中，包括了衬底以及至少一种经标记多核苷酸和至少一种多核苷酸编码蛋白质，所述衬底带有附着于该衬底的多种衬底多核苷酸。在该系统中，该系统的至少一种经标记多核苷酸是用于生产标记的靶多核苷酸，所述经标记的靶多核苷酸与序列特异性且位置可区分的衬底多核苷酸特异性结合。
根据第四个方面，公开了用于分选多种靶标中的靶标的方法和系统，该方法和系统基于组合使用附着于衬底的多种衬底多核苷酸以及多种多核苷酸编码抗体。在一些实施方案中，靶标是细胞，该方法和系统用于分选多种细胞。
在该方法和系统中，各衬底多核苷酸是序列特异性的且在位置上可彼此区分。在该方法和系统中，各多核苷酸编码蛋白质由蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸组成，其中所述蛋白质与所述多种靶标中的预定靶标特异性结合，且所述编码多核苷酸与所述多种衬底多核苷酸中序列特异性且位置可区分的衬底多核苷酸特异性结合。在该方法和系统中，各蛋白质和编码多核苷酸在结合方面可彼此区分。
在该方法中，将多种多核苷酸编码抗体与样品在一定条件下接触一定时间，以允许抗体与靶标结合，从而提供多种多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体。在该方法中，然后将多种多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体与多种衬底多核苷酸在一定条件下接触一定时间，以允许该编码多核苷酸与附着于衬底的衬底多核苷酸结合，从而在与衬底结合的多种多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体中分选靶标。
在该系统中，包括了衬底和多种多核苷酸编码抗体，所述衬底带有附着于该衬底的多种衬底多核苷酸。
根据第五个方面，公开了用于检测样品流体中一种或多种靶标的阵列，该阵列包含衬底，所述衬底带有附着于所述衬底组件的多种衬底多核苷酸，该衬底多核苷酸序列是特异性的并在位置上可区分，其中各衬底多核苷酸由与另一衬底多核苷酸序列互不影响(orthogonal)的序列组成。
根据第六个方面，本文公开的各方法、系统和阵列中的衬底与微流体组件有效关联，所述微流体组件包含用于装载流体的微流体构件。因此在该方法中，至少编码多核苷酸和/或经标记多核苷酸靶标与衬底多核苷酸的接触可在微流体构件装载的流体中进行。另外，本文公开的各系统还可包含具有微流体构件的微流体组件。
本文公开的方法和系统的第一个优点是，在本文公开的各方法和系统中，多核苷酸编码蛋白质与靶标的接触可在该蛋白质与衬底结合之前进行。因此，在使用诸如细胞的靶标时，衬底不会损害靶标对蛋白质结合位点的接近，且在进行接触时蛋白质和靶分子均会具有完全的取向自由，从而提高了用所公开方法和系统进行的任何相关测定的灵敏度。
本文公开的方法和系统的第二个优点是，在本文公开的各方法和系统中，多核苷酸编码蛋白质可在溶液中装配，从而使现有技术方法相关的蛋白质变性作用最小化，所述现有技术方法包括在结合后干燥衬底和提高温度(例如接近100℃)。在一些这类现有技术方法中，通过使用细针(fine pin)在玻璃衬底上点样(spotting)来产生蛋白质阵列，从而制造步骤需要密切监测，以确保蛋白质不干燥过度并因而变性。相反，在本文公开的方法和系统中，可在溶液中将蛋白质装配在衬底上，从而将蛋白质干燥过度和变性最小化至零。
本文公开的方法和系统的第三个优点是，在本文公开的各方法和系统中，生物污着(biofouling，即非编码蛋白质与衬底的非特异性结合)与本领域基于蛋白质的方法和系统相比大幅降低，从而允许更有效的结合，并且允许在期望进行检测时，与本领域基于抗体的方法和系统相比更精确地定量检测样品中的靶分子。
本文公开的方法和系统的第四个优点是与本领域基于蛋白质的方法和系统相比，能够进行更高靶标数的多路(multiplexed)检测和/或分离。这归因于若干个因素。第一个因素是与组合使用多核苷酸编码蛋白质和附着于衬底的衬底多核苷酸相关的生物污着降低允许更有效地使多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体与衬底结合并进行检测。第二个因素是在本文公开的方法和系统中，衬底多核苷酸的尺寸与本领域基于蛋白质的方法和系统中使用的相应锚定分子相比小得多。因此，与现有技术相比，可在衬底上装配更高密度的蛋白质(例如每平方英寸约5,000个点，相比于例如ELISA技术的96孔板)。
本文公开的方法和系统的第五个优点是在本文公开的各方法和系统中，有可能在单个衬底中检测并分离化学性质不同的靶标，包括生物标志物如多核苷酸、蛋白质和具有不同表面标志物的细胞。因此，本文公开的方法和系统允许在相同的环境中对基因、蛋白质和细胞进行多路检测和/或分离。
本文公开的靶标分选方法和系统的又一个优点是，本文公开的方法和系统使得分选后的细胞可立刻用于分选后分析(post-sorting analysis)，这在靶标是能够用于分选后分析细胞中基因和蛋白质表达的细胞的实施方案中是尤其有关的。
用于进行诊断测定时本文公开的方法和系统的一种额外的优点是，可在单一衬底上对来自相同组织区域的多种生物标志物进行多路检测。用于进行诊断测定时该方法和系统的又一种优点是，所述生物标志物可以是化学性质不同的生物标志物，如细胞、mRNA和蛋白质，并且检测可以是定量检测和/或定性检测。用于进行诊断测定时本文公开的方法和系统的再一种优点是，它们允许检测复杂的基因组和/或蛋白质组谱，该谱在与预定谱比较后提供对以调节网络混乱为特征的疾病(如癌症)的诊断指示。用于进行诊断测定时本文公开的方法和系统的另一种优点是，有可能以多参数模式分析少量生物样品，并且能够将生物信息的三个相关领域，即基因(由DNA代表)、蛋白质和细胞联系在一起。
当衬底与微流体组件有效关联时，本文公开的所有方法和系统的又一种显著优点是，与相应的现有方法和系统相比，允许用尺寸显著减小的样品，在减少的时间内以减少的步骤数进行多路多参数测定。特别地，鉴于进行分析所需样品量的减少使得处死小鼠的需要最小化，本文公开的多路多参数微流体方法和系统在靶标是来自组织的生物标志物时是尤其有利的。由此，在本文公开的微流体环境中进行的方法和系统允许检测少量包含在样品中的靶标，从而允许检测以低至约10飞摩尔/升(femto Molar，fM)的浓度存在于样品中的分子。
当用于进行诊断测定时衬底与微流体组件有效关联时，本文公开的方法和系统的再一种优点是，允许进行生物标志物的多路检测，包括化学性质不同的生物标志物如多核苷酸、蛋白质和细胞。在其中衬底与微流体组件有效关联的实施方案中，本文公开的诊断方法和系统的又一种额外优点是，允许在来自异质组织中相同微观区域的单一样品上进行多路多参数测定。因此，本文公开的方法和系统还使与异质活检相关联的取样误差最小化，所述异质活检是进行本领域中用于检测多种化学性质不同的生物标志物的诊断方法和系统的多种测量所需的。
本公开内容的一种或多种实施方案的细节在附图和下文的描述中公开。其他特征、目标和优点从说明书和附图以及权利要求书中将是很明显的。
附图简述
附图说明了本公开内容的一种或多种实施方案，并与发明详述一起解释本公开内容的原理和实施，所述附图引入本文并构成说明书的一部分。
在附图中：
图1是用于制备本文公开的多核苷酸编码蛋白质的偶联策略的图解。图a是制备抗体的反应的图解；图b是制备多核苷酸的反应的图解；图c展示了通过缀合图a所示抗体与图b所示多核苷酸而获得的多核苷酸编码抗体；图d显示凝胶迁移率变动测定(gel mobility shift assay)，其显示可通过调节与图a中所示抗体偶联的分子的量来控制附着于抗体的多核苷酸链A1′的数目。此处泳道I-IV分别对应于300:1、100:1、50:1、25:1的偶联分子与抗体的化学计量比。
图2是本文公开的多核苷酸编码蛋白质的缀合化学的图解。图a显示多核苷酸和蛋白质链霉亲和素之间的缀合化学的图解；图b显示多核苷酸编码的链霉亲和素与含生物素的蛋白质的装配，生物素为链霉亲和素的配体；SA表示链霉亲和素蛋白，“生物素-蛋白质”表示含配体生物素的蛋白质。
图3显示了展示本文公开的用于细胞表面标志物识别的优化多核苷酸编码抗体的多核苷酸载荷的简图。图a显示FACS曲线，其将α-CD90.2/FITC-多核苷酸缀合物(FITC-DNA-标记的α-CD90.2)与抗体上不附着有多核苷酸的FITC α-CD90.2抗体(FITC α-CD90.2)和无抗体并且无多核苷酸编码抗体(未标记的)的阴性对照一起进行比较。对应于FITC通道的荧光强度在x轴上给出，y轴对应于空荧光通道；图b显示附着于抗体的不同数目FITC-多核苷酸平均荧光强度的直方图；x轴上报告了附着于抗体的多核苷酸数，y轴上报告了平均荧光强度。
图4是组合使用本文公开的多核苷酸编码抗体和衬底多核苷酸的图解。
图5展示了方法和系统的实施方案，其中多核苷酸编码蛋白质是基于链霉亲和素-生物素系统，且靶标是细胞。图a显示图2中多核苷酸编码的链霉亲和素的装配，其中含生物素的蛋白质是主要组织相容性复合体(MHC)，且在目的细胞与玻璃衬底接触前将多核苷酸编码的链霉亲和素预装配在衬底上。图b显示以多核苷酸编码的MHC与细胞在溶液中结合后与微阵列接触。
图6展示了使用本文公开的多核苷酸编码抗体和衬底多核苷酸来检测多种靶标的方法。图a显示组合使用本文公开的多种多核苷酸编码抗体与衬底多核苷酸组合的图解；图b显示使用本文公开的多核苷酸编码抗体和衬底多核苷酸进行的相关免疫测定。
图7显示使用本文公开的多核苷酸编码抗体和衬底多核苷酸进行的空间编码蛋白质测定。图a显示用三种相同的山羊抗人IgG(用Alexa 488、Alexa 594或Alexa 647染料标记)进行并分别用多核苷酸A1′、B1′和C1′标记的免疫测定；图6显示了来自于用白色线段指示的图a阵列部分的免疫测定结果的图示；图中显示的标度线段对应于1mm。
图8显示免疫测定的结果，其显示组合使用本文公开的多核苷酸编码抗体和衬底多核苷酸所导致的非特异性蛋白质吸收最小化。图a显示同时与山羊抗人IgG-Alexa488/A1′、山羊抗人IgG-Alexa647/C1′(各自与特异性多核苷酸缀合)和山羊抗人IgG-Alexa594(无附带的DNA)接触的微阵列；图b显示来自于用白色线段指示的图a阵列部分的免疫测定结果的图示，图中显示的标度线段对应于1mm。
图9阐述了衬底多核苷酸的计算机(in silico)无关化处理(orthogonalization)的结果，其中每种衬底多核苷酸都与其他衬底多核苷酸互不影响，并与其相应的抗体特异性多核苷酸结合。图a显示暴露于两种多核苷酸编码抗体的印有三种衬底多核苷酸的载玻片，所述两种多核苷酸编码抗体与三种衬底多核苷酸中的两种互补；图b显示由A1的计算机杂交以及与抗体特异性多核苷酸互补的两种衬底多核苷酸的计算机杂交所形成的二级结构；图c显示计算机产生其他衬底多核苷酸，其限制是各链彼此互不影响，并且与其相应互补序列互不影响；图d显示一组6条互不影响的序列，从5′到3′端列出。
图10展示了使用本文公开的多核苷酸编码抗体和衬底多核苷酸进行多路细胞分选的方法。图a显示均质测定，其中多核苷酸编码抗体与细胞组合，然后将混合物引入已点样的DNA阵列微芯片上；图b显示多核苷酸编码抗体被装配在已点样的DNA阵列上，然后引入细胞；图c显示多路细胞分选实验的亮视野和荧光显微镜图像，其中将表达mRFP的T细胞(红色通道)和表达EGFP的B细胞(绿色通道)的1:1混合物空间层积在点A1和C1上，对应于分别用A1′和C1′编码的α-CD90.2和α-B220抗体；图d是从小鼠收集的原代细胞多路分选的荧光显微照片。分别利用多核苷酸编码的缀合物抗CD4-A1′和抗CD8-C1′，将来自EGFP转基因小鼠的CD4+细胞和来自dsRed转基因小鼠的CD8+细胞的1:1混合物分离至点A1和C1。
图11是组合使用本文公开的多核苷酸编码抗体和衬底多核苷酸的图解，其用于细胞分选和/或共同检测化学性质不同的分子。
图12展示了根据本文公开的方法和系统的实施方案，多核苷酸编码蛋白质检测多种靶标的能力；图a显示暴露于抗体和多核苷酸的微阵列，所述抗体对以多核苷酸C1编码的抗原IL4具有特异性，所述多核苷酸与以荧光团标记的多核苷酸B1互补；图b显示用于进行测定的本文公开的方法和系统的实施方案的图示；图c显示图A中以白色线段标识的部分中所示测定结果的图示。
图13显示显微图像，其展示了同时进行细胞捕获和基因与蛋白质的多参数检测，图中显示的标度线段对应于300lμm。
图14显示一种蛋白质阵列，其用于检测在微流体中装配的本文所公开靶标的实施方案中。
图15显示在微流体通道中执行的以DNA为模板的蛋白质免疫测定的荧光图像和亮视野图像，用白色虚线画出600lμm宽的通道。图a显示使用本文公开的多核苷酸编码抗体与衬底多核苷酸的组合进行的双参数免疫测定；图b显示在本文所公开方法和系统的一个实施方案中检测靶标浓度系列，其中使用基于荧光的技术进行检测；图c显示在本文所公开方法和系统的一个实施方案中检测靶标浓度系列，其中使用金的非电沉积作为显影和放大策略进行检测。
图16是根据本文所公开方法和系统的一个实施方案组合使用多核苷酸编码抗体和衬底多核苷酸的图解，多核苷酸编码抗体用金属纳米颗粒标记。
图17是图16根据本文所公开方法和系统的一个实施方案组合使用的另一图解，其显示与衬底结合并用金属纳米颗粒标记的多核苷酸编码抗体-靶标复合体。
图18是根据本文所公开方法和系统检测信号的设备和相关方法的图解，所述信号来自用金属纳米颗粒标记的多核苷酸编码抗体。
图19显示用本文公开的方法和系统检测蛋白质组，其中使用金的非电沉积作为显影和放大策略进行检测。图a显示在约100pM的浓度下检测；图b显示在约100fM的浓度下检测；图c显示在约100aM的浓度下检测。
图20显示用本文公开的方法和系统检测蛋白质组，其中使用金的非电沉积作为显影和放大策略进行检测。图a显示在约100pM的浓度下检测；图b显示在约1pM的浓度下检测；图c显示在约10fM的浓度下检测；图d显示在约100aM的浓度下检测；图e显示直方图，其将计数的蛋白质数(y轴)与其在溶液中的浓度(x轴)相关联。
图21显示用本文公开的方法和系统检测三种蛋白质(IFN-γ、TNF-α和IL-2)在加有(spiked with)这3种蛋白质的组织培养基中的蛋白质组，其中使用金的非电沉积作为显影和放大策略进行检测。图a显示IFN-γ的检测；图b显示TNF-α的检测；图c显示IL-2的检测。
图22显示用本文公开的方法和系统检测三种蛋白质(IFN-γ、TNF-α和IL-2)在加有这三种蛋白质的血清样品(图a)中和健康人血清(图b)中的蛋白质组，其中使用金的非电沉积作为显影和放大策略进行检测。
图23是直方图，其展示用本文公开的方法和系统对蛋白质标志物Pten校准并定量；图a显示直方图，其中展示了从图b和c中所示微流体实验中检测到的平均荧光信号强度；图b显示来自校准泳道的针对重组pten的原始数据；图c显示来自样品的原始荧光数据，所述样品来自两种细胞系，一种是表达基底水平pten的空U87，另一种是过表达U-87-pten的细胞样品。
图24展示了从通过串联质谱法发现血清生物标志物(图a或1)到通过大规模SPR(图b或2)进行抗体确认和选择再到使用本文所公开方法和系统的一个实施方案确认临床途径(图c或3)的途径。
发明详述
本发明公开了检测样品中靶标的方法和系统。在本文公开的方法和系统中，将多核苷酸编码蛋白质与衬底多核苷酸组合使用，以检测样品中的一种或多种靶标。
本文使用术语“检测”表示确定有限的空间部分中靶标或信号的存在(existence)、出现(presence)或事实(fact)，所述有限的空间部分包括但不仅限于样品、反应混合物、分子复合体和衬底。当表示、涉及或包括测量靶标或信号的数量(quantity)或量(amount)时(也称作“定量”)，检测是“定量的”，其包括但不限于被设计为测定靶标或信号的量或比例的任何分析。当表示、涉及或包括就对另一靶标或信号(未定量)的相对丰度来鉴定靶标或信号的性质或种类时，检测是“定性的”。
本文使用术语“靶标”是指目的分析物。术语“分析物”是指待检测其在样品中存在与否的物质、化合物或组分。分析物包括但不限于生物分子，尤其是生物标志物。本文使用术语“生物分子”表示与生物环境相关联的物质、化合物或组分，包括但不限于糖、氨基酸、肽、蛋白质、寡核苷酸、多核苷酸、多肽、有机分子、半抗原、表位、生物细胞、生物细胞的部分、维生素、激素等等。术语“生物标志物”是指与生物环境的特定状态相关联的生物分子，所述状态包括但不限于细胞周期的阶段、健康和疾病状态。生物标志物的存在、缺失、减少、上调与特定状态相关联，或指示特定的状态。
本文使用术语“样品”是指代表着更大量物品的有限量的该物品，包括但不限于来自生物环境的流体、标本、培养物、组织、商品重组蛋白质、合成化合物或其部分。
本文使用术语“多核苷酸”是指由两个或更多单体组成的有机多聚体，所述单体包括核苷酸、核苷或其类似物。术语“核苷酸”是指若干以下化合物中的任何一种，所述化合物由与嘌呤或嘧啶碱基连接并与磷酸基连接的核糖或脱氧核糖组成，并且是核酸的基本结构单元。术语“核苷”是指这样的化合物(例如鸟苷或腺苷)，其由与脱氧核糖或核糖组合的嘌呤或嘧啶碱基组成，并且特别存在于核酸中。术语“核苷酸类似物”或“核苷类似物”分别是指其中一个或多个个体原子已被替换为不同原子或不同官能团的核苷酸或核苷。因此，术语“多核苷酸”包括任何长度的核酸，DNARNA类似物及其片段。三个或更多核苷酸的多核苷酸也被称作核苷酸寡聚物或寡核苷酸。
本文使用术语“多肽”是指由两个或更多氨基酸单体和/或其类似物组成的有机多聚体。术语“多肽”包括任何长度的氨基酸多聚体，包括全长的蛋白质和肽，及其类似物和片段。三个或更多氨基酸的多肽也称作蛋白质寡聚物或寡肽。本文使用术语“氨基酸”、“氨基酸单体”或“氨基酸残基”是指二十种天然存在氨基酸中的任何一种，包括具有非天然侧链的合成氨基酸，并包括D和L旋光异构体。术语“氨基酸类似物”是指这样的氨基酸，其中一个或多个个体原子被替换为不同的原子、同位素或不同的官能团，但是其他方面与其天然氨基酸类似物相同。
本文使用术语“蛋白质”是指具有特定的二级结构和三级结构的多肽，其能够参与(但不限于)与其他生物分子的相互作用，所述其他生物分子包括其他蛋白质、DNA、RNA、脂质、代谢物、激素、趋化因子和小分子。
本文使用术语“抗体”是指这样蛋白质，所述蛋白质在抗原刺激后由活化的B细胞产生，并与抗原特异性结合，在生物系统中促进免疫应答，所述蛋白质通常由四个亚基组成，包括两条重链和两条轻链。术语“抗体”包括天然抗体和合成抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体或其片段。示例性的抗体包括IgA、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgM等等。示例性的片段包括Fab Fv、Fab′F(ab′)2等等。单克隆抗体是这样的抗体，其与另一生物分子中称为“表位”的单个特定空间和极性结构特异性结合，并因而定义为与之互补。多克隆抗体是指单克隆抗体的混合物，各个单克隆抗体结合不同的抗原性表位。抗体可通过本领域公知的技术制备，例如免疫宿主并收集血清(多克隆抗体)，或通过制备连续杂交瘤细胞系并收集所分泌的蛋白质(单克隆抗体)。
本文在提及分子与另一分子结合时使用的措辞“特异性地”、“特异地”或“特异性”是指所述分子与该另一分子之间识别、接触并形成稳定复合体，并且所述分子和另一分子中的每一种与其他分子之间显著更少直至不发生识别、接触和形成稳定复合体。示例性的特异性结合是抗体-抗原相互作用、细胞受体-配体相互作用、多核苷酸杂交、酶-底物相互作用等等。本文在提及复合体的分子组分时使用的术语“特异性”是指该组分与其特定复合体的独特关联，所述组分是所述特定复合体的一部分。本文在提及多核苷酸序列时使用的术语“特异性”是指该序列与作为其互补序列的单个多核苷酸的独特关联。
措辞“多核苷酸编码蛋白质”是指多核苷酸-蛋白质复合体，其包含蛋白质组分和附着于该蛋白质组分的编码多核苷酸，所述蛋白质组分与靶标特异性结合并因而被定义为与该靶标互补。在一些实施方案中，附着于蛋白质的编码多核苷酸是蛋白质特异性的。这些实施方案可用于在任何靶标已知并需要灵敏检测该靶标的情况下进行利用蛋白质特异性相互作用检测其他蛋白质、细胞因子、趋化因子、小分子、DNA、RNA、脂质等等的测定。
本文使用术语“多核苷酸编码抗体”是指多核苷酸编码蛋白质，其中所述蛋白质组分是抗体。
本文使用术语“附着”或“附着的”是指通过键、连接(link)、力或联系(tie)连接或合并，从而将两个或更多的组分保持在一起，该术语包括直接或间接附着，使得例如其中第一分子与第二分子或材料直接结合，以及其中一种或多种中间体分子被置于该第一分子和第二分子或材料之间的实施方案。
本文使用措辞“衬底多核苷酸”是指附着于衬底从而维持结合其互补多核苷酸的能力的多核苷酸。衬底多核苷酸尤其可由下述序列组成，所述序列与多核苷酸编码蛋白质的编码多核苷酸特异性结合，并因而被定义为与之互补。
本文使用术语“衬底”是指底层的支持物或基底。示例性的衬底包括固体衬底，如玻璃板、微孔板、磁珠、硅晶片(silicon wafer)和技术人员阅读本公开内容后可识别的其他衬底。
在本文公开的多核苷酸编码蛋白质中，各蛋白质与预定的靶标特异性结合并因而被定义为与之互补，并且各编码多核苷酸与预定的衬底多核苷酸特异性结合并因而被定义为与之互补。
在其中蛋白质是抗体的实施方案中，蛋白质-靶标相互作用是抗体-抗原相互作用。在其中蛋白质不是抗体的实施方案中，相互作用可以是受体-配体相互作用、酶-底物相互作用和技术人员阅读本公开内容后可识别的其他蛋白质-蛋白质相互作用。例如，在其中蛋白质是链霉亲和素的实施方案中，蛋白质-靶标相互作用是受体-配体相互作用，其中受体是链霉亲和素，配体是游离或附着于任何其他生物分子的生物素。
另外，在本文公开的方法和系统中，各衬底多核苷酸和编码多核苷酸在结合方面可彼此区分。在本文公开的方法和系统的一些实施方案中，衬底中的各衬底多核苷酸是序列特异性的，并且在位置上可彼此区分。
本文涉及分子时使用的措辞“在结合方面可区分”是指可以基于与特定分子特异性结合并因而被定义为与之互补的能力而进行区分的分子。因此，如果第一分子与第三分子特异性结合并因而被定义为与第三分子互补，且第二分子与不同于第三分子的第四分子特异性结合并因而被定义为与第四分子互补，则第一分子与第二分子在结合方面可区分。
本文涉及分子时使用的措辞“位置上可区分”是指可以基于分子占据的点或区域而进行区分的分子。因此，位置上可区分的衬底多核苷酸是这样的衬底多核苷酸，其占据衬底上不同的点或位置，并因而是位置上可区分的。
本文公开的多核苷酸编码蛋白质可以用常见的生物缀合方法(bioconjugation method)来产生，例如化学交联，包括依赖于蛋白质中存在待结合伯胺(通常存在于赖氨酸残基上)的技术。特别地，多核苷酸编码蛋白质尤其可以通过图1和2中针对多核苷酸编码抗体(图1)和多核苷酸编码的链霉亲和素(图2)而显示的共价缀合策略来产生。
在图1显示的实施方案中，5′-胺化的多核苷酸通过腙键与抗体偶联(Kozlov，I.A.；Melnyk，P.C；Stromsborg，K.E.；Chee，M.S.；Barker，D.L.；Zhao，C.Biopolymers 2004，73，621-630)，如图1所示和实施例1的示例。
相同的生物缀合化学反应可用于生产任何多核苷酸编码蛋白质，例如以多核苷酸编码的链霉亲和素，如实施例2的示例和图2所示。
待缀合特定的多核苷酸编码蛋白质的编码多核苷酸数可以变化。尤其可以调控附着于蛋白质组分的多核苷酸数，以使待结合部分的大小最小化，因而使其位阻最小化，而同时仍然保持缀合特异性。可通过实施例3中示例并在相关的图3中图示的步骤进行优化。在实施例3和图3中，产生了不同批的多核苷酸编码抗体，其中与各抗体相连的多核苷酸总数不同。因为图3和实施例3的编码多核苷酸中含有荧光团，所以可使用FACS测出各变体对细胞表面标志物的结合效率。应当注意，存在测量和优化作为多核苷酸载荷函数的抗体亲和力的其他类似技术，包括直接测量抗体的结合动力学的技术，如表面等离振子共振(surface plasmon resonance，SPR)和等温滴定测热法(ITC)。
在一些实施方案中，待附着于每一蛋白质的编码多核苷酸数可以是从1到6的任何数目。在一些实施方案(例如细胞分选)中，每个蛋白质附着3个编码多核苷酸提供了使标记的空间效应最小化的额外优点，并因此允许用多种编码多核苷酸来标记多核苷酸编码蛋白质，用于与互补衬底多核苷酸的高亲和力杂交。
也可以控制形成待结合部分的多核苷酸的长度，以优化多核苷酸编码蛋白质与衬底的结合。特别地，可以为了无关化处理的目的而优化编码多核苷酸的长度，如实施例8和图9中所例证和下文进一步讨论的。
在以下的详细描述中，经常会参考其中多核苷酸编码蛋白质是多核苷酸编码抗体的实施方案。阅读本公开内容后，技术人员应当能够使针对多核苷酸编码抗体提供的教导适应于其他多核苷酸编码蛋白质。
可通过本领域的常见技术生产衬底多核苷酸。例如，首先可化学合成多核苷酸。然后根据Stanford的Pat Brown(Schena M，Shalon D，Davis RW，Brown PO.Science.1995 Oct 20；270(5235)：467-70指出的范例对多核苷酸进行针点样(pin spotted)。然后可根据技术人员阅读本公开内容后可识别的技术，将这样生产的衬底多核苷酸附着于衬底。特别地，用于生产衬底多核苷酸的合适多核苷酸包括多聚赖氨酸衬底上的至少75单体长度。
在一些实施方案中，编码多核苷酸和/或衬底多核苷酸被无关化处理，以使编码多核苷酸与衬底多核苷酸之间的非特异性结合最小化。因此，无关化处理的多核苷酸包括这样的多核苷酸，其序列由计算机产生，以使不完全的碱基配对、亚稳态和/或其他二级结构最小化，从而使多核苷酸之间的非特异性相互作用最小化，以及使通常与相关序列的随机产生相关联的多核苷酸中的非线性次级相互作用最小化。
本文中使用术语“无关化处理”是指计算机产生一组多核苷酸的过程，其中不完全碱基配对、亚稳态和其他二级结构被最小化，以使多核苷酸仅与其互补链结合，不与其他任何链结合。本公开内容中使用的示例性无关化处理技术包括根据Dirks等(Dirks，R.M.；Lin，M.；Winfree，E.；Pierce，N.A.Nucleic Acids Research 2004，32，(4)，1392-1403)所述范例进行的无关化处理。
具体地，在一些实施方案中，编码多核苷酸和相应的互补衬底多核苷酸是具有SEQ ID NO：7到SEQ ID NO 18的序列的无关化处理多核苷酸(见实施例8和相关的表1)。
可通过方法和步骤(如实施例8中例证并在图9中阐述的多核苷酸的计算机无关化处理(即计算机化的无关化处理)和技术人员阅读本公开内容后会明白的其他步骤)进一步鉴定其他无关化处理的多核苷酸。
本文公开的方法和系统可用于进行检测靶标的测定，包括单参数测定和多参数测定，均可作为多路测定进行。
本文使用术语“单参数测定”是指用于测定一种靶标的存在、不存在或量的分析。术语“多参数测定”是指用于测定多种靶标的存在、不存在或量的分析。术语“多路”测定是指多种测定反应(例如同时测定多种分析物)在单一反应室中进行和/或以单一分离和检测形式中分析的测定。
在一些实施方案中，本文公开的方法和系统能够有利地用于进行诊断测定，其中待检测的靶标是与预定疾病相关联的预定生物标志物。这些实施方案在这样的诊断方法中是尤其有利的，其中不同种类的生物材料和生物分子各自在通常为异质的组织样品中不同区域进行测量，从而引入了不可避免的难以定量的噪音源。
在本文公开的方法和系统的一些实施方案中，多核苷酸编码蛋白质和衬底多核苷酸组合使用，如图4所示，其中所示多核苷酸编码蛋白质是多核苷酸编码抗体。
在图4的实施方案中，多核苷酸编码抗体(10)与衬底(100)组合提供。多核苷酸编码抗体(10)由抗体(11)和编码多核苷酸(12)组成。衬底(100)带有与衬底表面结合的衬底多核苷酸(120)。编码多核苷酸(12)与衬底多核苷酸(120)互补，以使衬底多核苷酸(120)和编码多核苷酸(12)在接触后杂交。
在图4所示的实施方案中，本文公开的多核苷酸编码抗体形成蛋白质阵列，其能够与样品接触，以检测样品中的靶标。图4的实施方案对于检测和/或分选蛋白质靶标而言尤其有利。
在另一些实施方案中，尤其是适用于检测和/或分选细胞靶标的实施方案中，在将多核苷酸编码抗体与互补的衬底多核苷酸接触之前，将一些或全部多核苷酸编码抗体与样品接触。在这另一些实施方案中，抗体与一种或多种相应的靶标能够在无衬底时(例如在溶液相中)结合，其中两种分子均具有完全的取向自由，并且靶标对抗体结合口袋(binding pocket)的接近不受衬底影响。另外，不发生表面诱导的蛋白质变性，因为多核苷酸编码抗体保留在溶液中，保持了蛋白质的三级折叠。另外，生物污着被最小化(也参见下文的描述)，从而与本领域的相应方法和系统相比改善了所进行测定的灵敏度和特异性，以及与衬底结合的抗体靶标复合体的可检测性。显示一些上述优点的示例性实施方案示于图5、7、8、11和13。
在本文公开的方法和系统中，最终从衬底上检测与衬底结合的抗体-靶标复合体。
在一些实施方案中，通过提供经标记的分子来进行复合体的检测，所述经标记的分子包括能够特异性结合待检测的多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体的任何分子(例如抗体、适配体、肽等)，以及提供标记信号的标记，所述经标记化合物附着于所述分子上。将经标记的分子与多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体接触，然后可以根据技术人员阅读本公开内容(尤其是实施例部分)后可识别的方法来检测标记信号，所述标记信号来自与衬底上多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体结合的经标记化合物。
在其中如下文更详细描述的检测一种或多种靶标和/或多种靶标的实施方案中，经标记分子可以由多种经标记分子组成。每种经标记分子包含与一种或多种靶标/多种靶标中的一种靶标特异性结合的分子，以及附着于该分子的标记化合物，该标记化合物提供标记信号，各经标记的分子在检测方面可彼此区分。
本文涉及经标记分子使用的措辞“在检测方面可区分”是指可以基于附着于该分子的标记化合物所提供的标记信号进行区分的分子。示例性的标记化合物(其能够用于提供在检测方面可区分的经标记分子)包括但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光染料、生色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、纳米颗粒、金属溶胶(metal sol)、配体(例如生物素、亲和素、链霉亲和素或半抗原)和技术人员阅读本公开内容后可识别的其他化合物。
在一些实施方案中，将多种经标记分子与多种多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体在一定条件下接触一定时间，以允许多种多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体与多种经标记分子结合。然后检测标记信号，该信号来自与衬底上多种多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体结合的多种经标记分子。
在一些实施方案中，检测方法可以通过基于荧光的读数(readout)来进行，其中经标记抗体用荧光团标记，所述荧光团包括但不仅限于小分子染料、蛋白质生色团、量子点(quantum dot)和金纳米颗粒。具体地，在一些实施方案中，在本文公开的任何方法和系统中，检测可在金纳米颗粒标记的二级检测系统上进行，其中常用的摄影显影液可放大金纳米颗粒，如下文进一步描述。另外，如果读数来自于金颗粒的暗视野(dark field)散射，则能够进行单分子数字蛋白质组分析。其他的技术是技术人员阅读本公开内容后可识别的，将不再进一步详细讨论。
本文用作复合体或分子之组分的术语“标记”和“经标记分子”是指能够检测的分子，包括但不限于放射性同位素、荧光团、化学发光染料、生色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、纳米颗粒、金属溶胶、配体(例如生物素、亲和素、链霉亲和素或半抗原)等等。术语“荧光团”是指能够在可检测的图像中显示出荧光的物质或其部分。因此，本文使用的措辞“标记信号”是指由标记发射的允许检测该标记的信号，包括但不限于放射性、荧光、化学发光、在酶反应的结果中产生化合物等等。
在一些实施方案中，检测一种特异性靶标。在这些实施方案中，可以在将多核苷酸编码抗体与衬底接触之前或之后将多核苷酸编码抗体与靶标接触。
其中在将多核苷酸编码抗体与衬底接触之前将多核苷酸抗体与靶标接触的实施方案尤其适用于分选或检测细胞。在这些实施方案中，抗体与靶标之间结合的效率和特异性被最大化，即便对于检测单个靶标也是如此。一种可能(但不确定)的解释是，在本文公开的方法和系统中，靶标捕获不是由抗体对细胞表面标志物的相互作用驱动，而是由通过协同结合提高的抗体特异性多核苷酸与微阵列上相应链的亲和力来驱动，这大幅提高了捕获效率。该优点尤其与这样的靶细胞相关，其能够被有效地捕获，从而使用该方法典型地观察到被汇合细胞层完全占据的DNA点(见实施例5和图5)。
其中在多核苷酸编码抗体与衬底接触之后将多核苷酸编码抗体与靶标接触的实施方案尤其适用于以高灵敏度分选或检测蛋白质。本文公开的其中在多核苷酸编码抗体与衬底接触之后将多核苷酸编码抗体与靶标接触的方法和系统的示例性实施方案示例于实施例12和13，并示于图15、19、20、21、22、23、24(c)。在这些实施方案中，能够消除已结合靶标的多核苷酸编码蛋白质与未结合靶标的多核苷酸编码蛋白质之间对同一特异性衬底多核苷酸的竞争，因而提高测定的灵敏度。另外，在这些实施方案中，通过决定各种结合的平衡热力学定律，可以优化衬底上多核苷酸的浓度，使得更高浓度的多核苷酸编码蛋白质能够与衬底结合，这进而会导致正确装配的复合体的浓度更高，进而提高整体检测灵敏度。
可使用图4和5以及实施例5中例证的方法和系统进行单参数测定，所述方法和系统包括但不限于：用于检测血清中单一标志物的任何测定，生物样品中单一蛋白质检测，根据一种表面标志物进行细胞分选，以及技术人员阅读本公开内容后可识别的其他测定。
在一些实施方案中，根据图6中所示的策略进行多种靶标的检测。
产生多种多核苷酸编码抗体(10、20和30)，每种多核苷酸编码抗体能够特异性结合带有抗体组分(11、21和31)的一种预定靶标，并能结合带有编码多核苷酸组分(12、22和32)的互补衬底多核苷酸。产生带有序列特异性并且位置可区分的衬底多核苷酸(112、122和132)的衬底。
然后将多核苷酸编码抗体(10)、(20)和(30)与衬底多核苷酸(112)、(122)和(132)接触，并且在抗体特异性多核苷酸与相应的衬底多核苷酸结合后，多核苷酸编码抗体复合体在衬底上自装配。
在图6中所示的实施方案中，产生由多种结合可区分且位置可区分的抗体组成的蛋白质阵列。这些实施方案对于以高灵敏度分选和/或检测不同的蛋白质-靶标是尤其有利的。这些实施方案的示例性展示在实施例9、10和12和图10、12、13和15a中显示。
在另一些实施方案中，在接触衬底多核苷酸之前将多种多核苷酸编码抗体与样品接触，用于检测相关靶标。在这些实施方案中，本文公开的方法和系统可用于进行多路多参数测定，其中由于与抗体和靶标在不存在衬底时结合相关联的灵敏度和选择性的提高，并鉴于生物污着和蛋白质变性的减少，可以以定量和/或定性的方式有效检测大量生物标志物。这些实施方案的示例性展示在实施例9、10和12和图10、12、13和15中显示。
可用实施例9、10和12中示例并示于图10、12、13和15的方法和系统进行的多参数测定包括但不限于任何蛋白质组学分析、组织分析、血清诊断、生物标志物、血清图谱(serum profiling)、多参数细胞分选、单细胞研究，以及本领域技术人员阅读本公开内容后可识别的其他测定。
在一些实施方案中，图6所示的组合使用可应用于分选多种靶标的方法中，这在所述多种靶标由不同类型的细胞(尤其是原代细胞)组成时是尤其有利的。在这些实施方案中，根据实施例9中示例并示于图10的方法，优选地在与衬底接触之前将多核苷酸编码抗体与包含细胞的样品接触。
其中多种靶标由不同类型细胞组成的方法和系统的实施方案尤其比相应的现有方法和系统例如淘洗(panning)更为有利，其中细胞与印在支持衬底上的表面标志物特异性抗体接触(Cardoso，A.A.；Watt，S.M.；Batard，P.；Li，M.L.；Hatzfeld，A.；Genevier，H.；Hatzfeld，J.Exp.Hematol.1995，23，407-412)。具体地，由于使用多核苷酸将抗体与衬底结合，所以相对于现有技术的方法和系统而言在衬底上的细胞捕获效率提高(见图5和图10)。另外，这些优选的实施方案没有与常规点样蛋白质微阵列相同的限制，例如不总是在表面上正确取向的抗体，和/或可能干燥过度并失去功能的抗体。
任何分选细胞的实施方案都具有优于本领域已知细胞分选方法和系统(如FACS)的若干优点，因为通过本文公开的方法和系统分选的细胞可立即用于分选后的基因和/或蛋白质表达分析。另外，本文公开的方法和系统对多种细胞进行空间多路分选，这在根据多种细胞表面标志物分选细胞中尤其有效，并且不受可用于标记分选用细胞表面标志物的光谱不同的荧光团数量的限制，如实施例9和相关的图10中所示。
在一些实施方案中，图6中所示的组合使用可用于根据图11所示方法检测多种化学性质不同的靶标。具体地，显示了该方法用于分离多种不同的生物标志物如DNA、细胞和蛋白质。在图11所示的实施方案中，在用于分析细胞、基因和蛋白质的多参数测定中，使用附着有多种衬底多核苷酸(3)的衬底(2)实施本文公开的方法和系统，以分离细胞(1)(见图11，箭头A1)并分析相关的基因组和蛋白质组学特征(signature)(见图11，箭头2)。
在一些这样的实施方案中，将样品与多种多核苷酸编码抗体接触，以允许形成多种以多核苷酸编码的生物标志物复合体，然后将其与衬底如DNA阵列接触，其中抗体特异性多核苷酸特异性结合相应的DNA链。在期望检测靶多核苷酸的一些实施方案中，还可将特异性结合靶多核苷酸的经标记多核苷酸与样品结合，产生经标记的靶多核苷酸，其与衬底上的预定DNA链特异性结合。经标记的靶多核苷酸最终与衬底多核苷酸结合并被检测。根据该方法，细胞、蛋白质和DNA生物标志物被分选，然后在单一衬底上检测，从而允许有利地进行多路多参数测定。
在这些实施方案中，通过使用多核苷酸作为细胞、cDNA和蛋白质的通用装配策略，可以针对点样衬底上的高DNA载荷和抗体上的互补DNA载荷优化衬底条件。该优化以及衬底上与抗体基于多核苷酸结合相关的生物污浊的降低允许进行用于蛋白质检测的高灵敏度夹心法测定，以及高效细胞分选(与传统淘洗相比)。进行化学性质不同的生物标志物检测的一种示例性方法和系统在实施例10中描述并示于图13中。
使用实施例9、10、12和13中示例并示于图13、10c、10d、15a、22、23、24的方法和系统可进行的靶标分选测定包括技术人员阅读本公开内容后可识别的任何需要检测混合物中特定靶标(包括但不限于细胞靶标、蛋白质靶标或基因靶标)的测定。
在一些实施方案中，可通过抗体进行单个或多种靶标的高灵敏度检测，所述抗体以用于检测的金属纳米颗粒进行标记，然后进行非电沉积沉积(electroless metal deposition)。
在这些实施方案中，可通过使用金属纳米颗粒(尤其是金纳米颗粒)作为标记分子来实施本文公开的任何方法和系统，以检测与衬底结合的以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体。具体地，金属纳米颗粒(如金纳米颗粒)与经标记的分子(例如第二抗体)缀合，用于标记与衬底结合的多核苷酸编码蛋白质-靶标复合体。金属颗粒(如金纳米颗粒)具有独特的光学特性，因为比可见光波长小得多的颗粒仍然能够使用光散射容易地成像。这允许使用光散射显微镜通过计数纳米颗粒标记(并从而计数蛋白质)而对免疫测定进行读数。该方法在本文中还被定义为数字方法和数字DEAL——假设每个纳米颗粒对应于单个蛋白质，则计数的颗粒数代表通过特异性抗体捕获的蛋白质的绝对数量。
图16和17显示了本文公开的方法和系统的一种示例性实施方案，其中标记分子包括金属纳米颗粒，如金纳米颗粒。具体地，金纳米颗粒(210)通过接头分子(211)附着于第二抗体(212)上。在第一抗体(213)上附着了一种或多种ssDNA寡聚体(214)。待检测的靶标(217)处于溶液或生物环境中。测定本身应在包被有ssDNA′(215)的表面(216)上测量。示例性的实施方案进一步展示于图18到22，并在实施例13中示例。
使用金属纳米颗粒进行标记时，本文公开的方法和系统的一些实施方案的一个优点是不需要每次都在进行蛋白质测量后对免疫测定进行校准，因为计数的蛋白量代表绝对测量值。相比较而言，荧光测定或吸光度测定代表了相对测量值，因为它们取决于背景荧光(吸光度)水平、光放大电子学、光漂白作用(对荧光而言)等等。本文公开的基于纳米颗粒的数字方法和系统可有利地用于：(1)在高aM水平(超出常规ELISA免疫测定103-106倍的改进)和广浓度范围下超灵敏地检测蛋白质；(2)在同一芯片上多路检测多种蛋白质；和(3)检测人患者血清中的胞外信号分子——细胞因子。
本文公开的方法和系统的一些实施方案(其中通过使用金属纳米颗粒进行标记和检测)是基于下述检测系统，如瑞利散射机制，其允许将与检测抗体缀合的个体等离振子纳米颗粒(plasmonic nanoparticle)间接显现，从而实现单一蛋白质计数，所述颗粒在该情况下为40nm的金纳米颗粒。可使用图形软件接口(graphical software interface)对颗粒的绝对数进行数码计数，从而定量蛋白质的量。这些实施方案与在放大后使用平均信号读数的常规定量方法截然相反。与DNA编码的抗体文库技术结合，本文公开的使用金属纳米颗粒作为标记化合物的方法和系统能够通过同时计数来自相同生物样品的不同种类蛋白质而使检测多路化。
本文公开的方法和系统(其中使用纳米颗粒作为标记化合物)优于现有的高灵敏蛋白质检测技术(其基于ELISA方案的变体)的又一种优点是，有可能消除信号放大和相关的额外噪音以及运行所需的时间。现有技术方法都需要某个放大步骤，并且每种方法都需要一定水平的校准，所述校准必须针对所实施的每个测定来进行。例如，已报道了其中使用DNA标记第二抗体并使用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA的方法。这种扩增后的该DNA被检测并随后与所测量的蛋白质浓度相关联。在另一变型中，用金纳米颗粒标记第二抗体，然后(通过非电沉积)将金属银沉积在金纳米颗粒上，从而产生放大的吸光度信号。对这两种情况而言，放大步骤本身都向测定中引入噪音，并且需要额外的时间，通常是大量的时间。
使用纳米颗粒的本文公开的方法和系统优于所述现有技术方法的另一个优点是现有技术方法均不是数字的，即这些方法均不涉及实际计数蛋白质数量，而是测量相对信号，如荧光或吸光度。这意味着它们必须被校准。相反，一旦表征了通过本文公开的方法和系统(其使用金属纳米颗粒作为标记化合物)进行的测定，则不需要校准，因为蛋白质的计数产生能够与蛋白质浓度相关联的绝对数。
该应用对于蛋白质组学领域中的检测(图21和22)和/或检测以极低浓度存在于小体积样品(例如一滴血)中的生物标志物(图19和20)而言是尤其有利的。
在另一些实施方案中，本文公开的任何方法和系统中的衬底可与微流体组件相关联，从而允许进行基于微流体的测定。基于微流体的测定提供下述优点，例如如减小的样品和试剂体积以及缩短的测定时间(Breslauer，D.N.；Lee，P.J.；Lee，L.P.Mol.BioSyst.2006，2，97-112)。例如，在某些操作条件下，表面结合测定动力学主要由分析物(蛋白质)浓度和分析物/抗原亲和力决定，而不是由扩散决定(Zimmermann，M.；Delamarche，E.；Wolf，M.；Hunziker，P.Biomedical Microdevices 2005，7，(2)，99-110.)。
本文使用术语“微流体”是指含有微流体构件的组件或系统，例如通常以微米或亚微米尺度制造的通道和/或腔室。例如，典型的通道或腔室具有至少一个为约0.1微米到约1500微米、更通常为约0.2微米到约1000微米、更通常为约0.4微米到约500微米的横截面尺寸(cross-sectionaldimension)。个体微流体构件通常载有非常少量的流体，例如从约10纳升到约5毫升，更通常从约100纳升到约2毫升，进一步更通常从约200纳升到约500微升，或仍然更通常从约500纳升到约200微升。
所述微流体组件可包含在集成设备(integrated device)中。本文使用“集成设备”是指具有两个(或更多)组件的设备，所述组件在物理上和操作上组合在一起。组件可以(完全或部分地)彼此独立制造并在其(完全或部分)制造后组合，或者所述集成设备可制成该集成设备中包含不同的组件。集成的微流体阵列(microfluidic array)设备包含与微流体组件组合的阵列，其中该微流体组件和阵列组件彼此可操作地相关联，从而该阵列组件的阵列衬底与微流体组件的微流体构件流体连通。微流体组件是这样的组件，其包含微流体构件，并且适于与阵列组件可操作地相关联。阵列组件是包含衬底并适于与微流体组件可操作地相关联的组件。
也可以以模块形式提供微流体系统。“模块”描述了这样的系统或设备，其具有多种用于一起使用的标准化组件，其中一类组件的多种不同实例之一可被替换为同类组件中的另一种，以改变系统或设备的功能或能力；在这样的系统或设备中，每个标准化组件都是一个“模块”。
进行微流体测定的本文公开的方法和系统的示例性实施方案在实施例10和11中描述并示于图13和14。
在本文公开的方法和系统的微流体实施方案中，有可能在极小的样品体积中测量很大的蛋白质标志物谱，并可能得到非常低的背景/生物污着(见图14)。
在本文公开的方法和系统的微流体实施方案中，还可以提高测定的灵敏度，以检测浓度低至10fM的靶标，包括先前认为在任何其他技术的检测水平以下的生物标志物(例如人血清中的蛋白质)。
在示例性的实施方案中，通过以下步骤获得这样的结果：提高衬底的载荷能力和使用以用于检测的金属纳米颗粒标记的抗体，然后进行非电沉积沉积(见实施例11和图14(c))。
另外，因为在示例性的实施方案中，在本文公开的方法和系统中使用空间的而不是比色的多路化，所以可将基于荧光的读数转化为光学读数。因此，本文公开的微流体方法和系统允许对测定进行光学读数，这比相应的现有方法和系统灵敏100-1000倍(见图14)。因此，本文公开的微流体方法和系统的又一优点是，有可能使用所述方法和系统作为数字技术，即通过单分子计数来定量检测蛋白质的技术。这种应用尤其有利于蛋白质组学领域的检测(图14)和/或以极低浓度存在于小体积样品(例如一滴血)中的生物标志物的检测。
因此，与用于分子检测的相应的现有微流体方法和系统以及其他非微流体方法和系统相比，本文公开的微流体方法和系统允许在减少的时间量中使用尺寸减小的样品以更高的灵敏度进行(i)单步骤测定(其中多核苷酸编码抗体、靶标和经标记的抗体在单个步骤中接触)和(ii)多步骤测定(其中衬底先后与多核苷酸编码抗体、靶标接触，随后与第二抗体接触)(见实施例11和12)。
与本文公开的微流体方法和系统相关联的另一个优点包括，有可能在微流体环境中进行涉及以衬底支持的抗体的任何测定，它们在使用先前的技术时无法承受微流体芯片的装配。
与本文公开的方法和系统有关的另一些优点是：有可能使用低成本试剂如玻璃和塑料进行灵敏的测量；有可能将衬底与用于样品预处理和纯化的其他组件组合使用。
本文公开的方法和系统允许进行目的生物标志物的多路多参数检测、分选以及相关的诊断分析。用于诊断分析的本文方法和系统应用的示例性展示在实施例14中描述并在图23和24中展示，还有技术人员阅读本公开内容后可识别的任何其他测定。
本文公开的系统可以以阵列或试剂盒的形式提供。阵列有时称作“微阵列”，是指可寻址区域的任何一维、二维或三维排列，所述区域带有与该区域相关联的特定分子。通常特征性的特征尺寸为微米。图4、5、6、7、8、9和10提供了示例性的微阵列。
在试剂盒中，多核苷酸编码蛋白质和衬底独立地包含在试剂盒中。多核苷酸编码蛋白质包含在一种或多种组合物中，各多核苷酸编码蛋白质与合适的载体(vehicle)、运载体(carrier)或辅助剂(auxiliary agent)一起包含在组合物中。
系统中提供的衬底可带有附着于该衬底的多核苷酸。在一些实施方案中，衬底多核苷酸还可作为试剂盒的额外组件提供。额外组件可包括经标记多核苷酸、经标记抗体、标记、微流体芯片、参比标准品，以及技术人员阅读本公开内容后可识别的额外组件。具体地，试剂盒的组件可与合适的使用说明和其他必需试剂一起提供，以进行本文公开的方法。试剂盒通常在独立的容器中含有组合物。试剂盒中通常包含用于进行测定的说明书，例如纸或电子载体如磁带或CD-ROM上的文字或音频说明书。根据使用的具体方法，试剂盒也可含有其他包装在内的试剂和材料(即洗涤缓冲液等等)。
本领域技术人员阅读本公开内容后可识别涉及鉴定组合物的合适运载体试剂(carrier agent)或辅助剂以及试剂盒的一般制造和包装的其他细节。
实施例
本文公开的方法和系统在以下的实施例中进一步阐述，其以说明性方式提供，而不旨在限制。
实施例1：产生以多核苷酸编码的抗体
根据图1所示的两步骤策略产生以DNA编码的抗体。具体地，使用市售试剂通过琥珀酰亚胺化学反应向5-胺化的寡核苷酸中引入醛官能团(图1图a)。类似地，通过与相应抗体中赖氨酸侧链的反应引入酰肼部分(图1图a)。然后通过醛和酰肼官能团之间的化学当量的腙键形成来促进DNA-抗体缀合物形成。通过PAGE电泳验证缀合物形成并控制DNA载荷(图1图b)。
为了进行这些实验，从Invitrogen购买用AlexaFluor 488、594和647标记的多克隆山羊抗人IgG。单克隆兔抗人白介素-4(克隆8D4-8)、无荧光的和APC标记的兔抗人肿瘤坏死因子-α(分别为克隆MAb1和MAb11)，以及无荧光的和PE标记的兔抗人干扰素-γ(分别为克隆NIB42和4S.B3)均购自eBioscience。无荧光的和生物素标记的小鼠抗人白介素-2(分别为克隆5344.111和B33-2)购自BD Biosciences。所有的DNA链均以带有5′-氨基修饰的形式购自Midland Certified Reagent公司。所有六个26聚体及其相应的命名在下表1中与各自的名称/标识符一起给出，通过所述名称/标识符将序列列于附带的序列表中。
表1
| 名称/标识符 | 序列 |
| SEQ ID NO 1 | A1：5’-NH2-AAAAAAAAAACGTGACATCATGCATG-3’ |
| SEQ ID NO 2 | 3’-GCACTGTAGTACGTACAAAAAAAAAA-NH2-5’：A1’ |
| SEQ ID NO 3 | B1：5’-NH2-AAAAAAAAAAGGATTCGCATACCAGT-3’ |
| SEQ ID NO 4 | 3’-CCTAAGCGTATGGTCAAAAAAAAAAA-NH2-5’：B1’ |
| SEQ ID NO 5 | C1：5’-NH2-AAAAAAAAAATGGACGCATTGCACAT-3’ |
| SEQ ID NO 6 | 3’-ACCTGCGTAACGTGTAAAAAAAAAAA-NH2-5’：C1’ |
使用前将所有的抗体脱盐，将缓冲液更换为pH7.4PBS，并使用3000MWCO离心滤器(MilliporeTM)将其浓缩至～1mg/ml。
将酰肼基团平行引入单克隆抗体中，并从5′胺化的寡聚体制备5′醛修饰的单链DNA(见图1的图a)。
具体地，以琥珀酰4-肼基烟酸丙酮腙(succinimidyl4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone，SANH，SolulinkTM)对抗体不同的摩尔过量(1000:1到5:1)向抗体中添加DMF中的SANH。藉此改变引入抗体的酰肼基团数。独立地以20倍摩尔过量向PBS中5′胺化的26元寡聚体中添加DMF中的琥珀酰4-甲酰基苯甲酸酯(succinimidyl4-formylbenzoate，SFB，SolulinkTM)。SFB与DNA的这种比例确保5′胺基完全反应产生5′醛。在室温下4小时后，所述抗体以及寡核苷酸偶联反应二者均未观察到产率的进一步提高。去除过量的SANH和SFB，并使用蛋白脱盐离心柱(PierceTM)将样品的缓冲液更换为pH6.0柠檬酸盐缓冲液。
然后将20倍过量的衍生化DNA与抗体结合，并允许在室温下反应过夜，形成图1的图b中显示的DNA编码的抗体。用尺寸排阻离心柱(Bio-Gel P-30，Bio-RadTM)去除未偶联的DNA，或使用Pharmacia Superdex200凝胶过滤柱在0.5ml/分钟的PBS等强度流(isocratic flow)下纯化。在60℃的宽松变性条件下用非还原性7.5％ Tris-HCl SDS-PAGE验证DNA-抗体缀合物的合成5分钟，并用Molecular Imager FX凝胶扫描仪(Bio-Rad)显影。使用适当的激发和发射滤光片，类似地对涉及荧光抗体或荧光标记寡核苷酸的缀合反应进行成像。
通过凝胶迁移率变动测定来测量抗人IL-4上不同寡聚体(链A1′)的载荷)(见图1的图b)。通过改变SANH与抗体的化学计量比(泳道I-IV分别对应于300:1、100:1、50:1、25:1)，可以控制平均附着寡核苷酸数。
值得注意的是，尽管上述缀合物合成方法预计导致针对每个抗体的DNA载荷分布，但是该作用可受到进行PAGE分析的方法的影响。尤其观察到，凝胶电泳之前的热诱导变性的正常条件(100°5分钟)降低了显影的DNA链数量，这可能是由于DNA与蛋白质之间的腙键断裂所致。通过放松变性条件，在60°加热5分钟(良好凝胶所需最小值)的样品显示至多7条离散的条带，而在100°加热5分钟的相同样品显示没有附加的寡核苷酸。
实施例2：生产多核苷酸编码的链霉亲和素
DNA编码的链霉亲和素的产生根据实施例1中所述的用于生产DNA编码的抗体相同的途径进行。唯一的区别是SANH：链霉亲和素比例维持恒定为100:1。
实施例3：优化多核苷酸编码抗体的多核苷酸载荷
进行多种测定时要考虑用寡核苷酸标记抗体时的不利空间效应，所述测定例如本文所述的免疫测定和细胞分选/捕获实验。为此，研究了DNA所编码的抗体保持识别细胞表面标志物的能力，通过荧光活化细胞分选(FACS)来显现。通过使用共价标记在DNA上而不是抗体上的荧光团，使用FACS对多核苷酸编码的缀合物优化DNA载荷。为进行该分析，以SANH与抗体的不同化学计量比(5:1、25:1、50:1、100:1、300:1)将5′胺化的、3′FITC标记的DNA标记在抗CD90.2抗体上。这平均产生了分别具有1、2、3、4-5和6-7条FITC-DNA链的缀合物，如通过凝胶迁移率测定所测量的，见图1的图d。通过用流式细胞仪监测FITC荧光，测试这些缀合物结合T细胞系VL3(表达CD90.2)的能力。使用B细胞系A20(CD90.2阴性)作为阴性对照(见图3图a和b)。
具体地，将VL3和A-20细胞在冰上与0.5μg FITC-缀合的大鼠抗小鼠CD90.2(Thyl.2，BD Pharmingen，克隆30-H12，目录号553012)在100μL PBS-3％ FCS中孵育20分钟。还用等摩尔量的抗CD90.2/FITC-DNA缀合物孵育细胞，所述缀合物特征是不同的FITC-DNA载荷。用PBS-3％FCS将细胞洗涤一次，然后在运行BD FACSDivaTM软件的BDFACSCantoTM设备上通过流式细胞术进行分析。
结果在图3中显示，其中显示了将抗CD90.2/FITC-DNA缀合物与市售FITC抗CD90.2抗体(无DNA)进行比较的FACS曲线(图a)和直方图(图b)。
如图3所示，该缀合物结合VL3细胞(100％)，与A20具有很小的非特异性相互作用(1.3％)。与FITC抗CD90.2相比，总体荧光强度下降10倍，与A20的非特异性结合则稍高。图b所示针对多种FITC-DNA载荷的平均荧光强度的直方图显示，当DNA链的数量从1提高至2至3时荧光强度大致是线性的，对应于1、2和3个生色团(每条链1个)。对更高的载荷而言。荧光是稳定的，然后下降。
具体地，在更高的载荷下，荧光的增加首先稳定(4-5寡聚体)然后降低直至最高载荷(6-7寡聚体)。因此，过量的DNA标记(4-7寡聚体)确实在空间上降低了抗体识别细胞表面标志物的能力。用50:1的SANH：抗体比例(对应于约每个抗体三条DNA链)合成的抗体实现了对细胞表面标志物识别而言的最佳载荷。考虑这一观察结果而进行了随后的细胞分选实验。与FITC抗CD90.2对照相比，DNA抗体缀合物具有减少了10倍的荧光和对A20细胞稍高的非特异性结合。一个可能的因素是对于DNA抗体缀合物和市售抗体而言，荧光团与抗体的化学计量比是不同的。对DNA抗体缀合物而言，DNA的每条链仅附着于一个荧光团(即带有一条DNA链的缀合物具有1:1的荧光团：抗体比例)，而市售抗体通常每个抗体具有多于一个荧光团(即荧光抗体具有>1的荧光团：抗体比例)。
因此，减少了10倍的荧光不应被严格解释为DNA抗体缀合物亲和力减少了10倍，尽管上文讨论的寡聚体空间效应确实有可能解释相对荧光强度的一部分降低。与相应的未修饰抗体相比，使用如表面等离振子共振(SPR)的方法直接测量DNA抗体缀合物的亲和力能够提供更多的结论性信息。
如下进行多核苷酸编码抗体的多核苷酸载荷的进一步优化。研究了两种不同长度的互补多核苷酸。一组具有16个碱基的重叠，另一组具有20个碱基的重叠。根据以下实施例8中所示方法，针对16或20个的组设计互不影响的DNA序列，并且根据经验发现，16个碱基不具有可能产生大量互不影响序列数的序列总数变异性。在转向20个碱基时，可能序列的原始库显著增加，并且计算互不影响序列似乎容易得多。应当注意，可能序列的总数是指数性的(4n，其中n是互补区的长度)。
实施例4：制造微阵列
用Institute for Systems Biology(ISB-Seattle，WA)的微阵列设施通过标准方法将DNA微阵列印制在包被胺的载玻片上。具体地，印制具有多种寡聚体组合的DNA微阵列，所述寡聚体具有序列SEQ ID NO 2、SEQ IDNO 4、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 18。
典型的点大小和间隔分别为150和500μm。多聚赖氨酸玻片是自制的。在超声浴中用IPA和水各将空白的载玻片清洁10分钟。然后在150W下用氧等离子体将其处理60秒，然后迅速浸入去离子水中，产生硅醇末端的高亲水表面。用氮喷枪将其干燥后，用多聚-L-赖氨酸溶液(Sigma P8920，0.1％w/v，未稀释)应用于所述经等离子体处理的表面15分钟，然后用去离子水冲洗数秒。最后，将这些处理过的玻片在60℃烘烤1小时。然后将这些玻片送至ISB并如上所述进行印制。
实施例5：基于以多核苷酸编码的抗体的单参数免疫测定
图5是使用DNA编码的链霉亲和素进行细胞分选实验的一个实例。这时，首先以4:1的生物素-MHC：DNA所编码链霉亲和素的比例，将DNA所编码链霉亲和素与其配体生物素标记的蛋白质接触。在此，所述蛋白质是主要组织相容性复合体(MHC)。淘洗对应方案和溶液相细胞捕获实验二者平行进行。具体地，将5μl链霉亲和素-C3′与20μl酪氨酸酶MHC组合在200μl RPMI培养基中。使它们在冰上装配20分钟。之后，对淘洗对应方案而言，使四聚体与衬底结合30分钟并在PBS中冲洗，随后使2×106个细胞与阵列接触。在图b中，首先允许DNA编码的MHC与相同数量的细胞在冰上结合20分钟，之后与下层DNA阵列接触。两组之间的细胞捕获效率是明显的。pMHC复合体的溶液相捕获比淘洗对应方案高得多。值得注意的是，后一组事件的细胞捕获效率提高。
实施例6：包含以多核苷酸编码的抗体的蛋白质阵列
使用三种相同的山羊抗人IgG来展示用于空间定位抗体的多核苷酸编码蛋白质方法，所述三种IgG各自带有不同的分子荧光团并且各自以独特的DNA链编码。然后向用互补寡核苷酸点样的微阵列上引入含有所有三种抗体的溶液。杂交两个小时并进行衬底冲洗后，抗体根据Watson-Crick碱基配对进行自装配。
具体地，如下产生抗体微阵列：首先用0.1％ BSA在3×SSC中将DNA玻片在37℃下封闭30分钟。用dH2O洗涤玻片并吹干。含有DNA-抗体缀合物的30μl溶液(3×SSC、0.1％ SDS、0.1％ BSA、15ng/μl各种缀合物)夹在显微镜载玻片与阵列之间，并在37℃孵育4小时。然后于37℃下首先在1×SSC、0.05％ SDS中洗涤阵列并柔和搅动，然后在0.2×SSC中、最后在0.05×SSC中洗涤。将玻片吹干并用Gene Pix 4200 A双色阵列扫描仪(Axon InstrumentsTM)扫描。
对免疫测定而言，在单个试管中组合DNA编码的第一抗体(15ng/μl)、抗原(3ng/μl)和荧光标记的第二抗体(0.5ng/μl)。在37℃孵育2小时后，如上文实施例3中所述将形成的抗体-抗原-抗体复合体引入微阵列中。随后的洗涤步骤和显影是相同的。
具体地，分别用寡聚体A1′、B1′和C1′标记三种在生物化学方面相同的山羊抗人IgG(用Alexa488、Alexa594或Alexa647染料标记)。孵育2小时后，将抗体/DNA缀合物定位于下层DNA微阵列指示的特定位点。
结果显示于图6和7中，其中显示了具有标度片段的空间编码蛋白质阵列，所述标度片段对应于1mm。如图7所表明的，抗体与衬底上的DNA装配，从而将>900个点的互补DNA芯片转化为多元件抗体微阵列(见图7)。该观察结果意味着可以用类似的方式装配相当大的抗体阵列。
实施例7：减少生物污着
任何蛋白质阵列的临界大小很可能被蛋白质非特异性结合的干扰所限制。在显现非特异性结合的影响的尝试中，向微阵列上相似地引入三种抗体：两种带有以互补DNA标记点样的寡核苷酸的抗体，第三种是未修饰的抗体。具体地，使微阵列同时接触山羊抗人IgG-Alexa488/A1′、山羊抗人IgG-Alexa647/C1′多核苷酸编码的缀合物以及不带有附加的DNA的山羊抗人IgG-Alexa594。
为了展示目的，在杂交后不将玻片彻底冲洗，因此观察到由非编码的荧光标记抗体的非特异性吸附所引起的高背景信号。
结果在图8中显示，其显示了多核苷酸编码蛋白质的方法对非特异性蛋白质吸附的抗性。
当阵列未被完全封闭和/或冲洗时，在载玻片的表面上观察到非特异性结合，但是在印制的DNA非互补性点上未观察到，即B1点没有来自非互补性IgG缀合物的荧光，也不显示来自未以DNA编码的蛋白质(山羊抗人IgG-Alexa594)的荧光。
抗体未进行化学编码的点样核苷酸区域展示少得多的非特异性附着蛋白质，意味着DNA大幅减小了活跃区域的生物污着。这样的生物污着阻滞让人容易联想到以聚乙二醇(PEG)功能化的衬底(Prime，K.L.；Whitesides，G.M.Science1991，252，1164-1167.Prime，K.L.；Whitesides，G.M.J.Am.Chem.Soc.1993，115，(23)，10714-10721)。与PEG相关的推定机制进行类比(Jeon，S.I.；Lee，J.H.；Andrade，J.D.；De Gennes，P.GJournal of Colloid and Interface Science 1991，142，(1)，149-158.Jeon，S.I.；Andrade，J.D.Journal of Colloid and Interface Science1991，142，(1)，159-166.Andrade，J.D.；Hlady，V.Advances in Polymer Science1986，79，(1-63))，申请人推测点样寡核苷酸的亲水特性与非特异性吸附期间经常暴露的蛋白质疏水部分的相互作用最小化。还在计算的双链体解链温度的5度以内进行了缀合物杂交实验，利用Watson-Crick严格性并从而消除了非特异性的DNA相互作用。在任何情况下，这种减少的生物污着意味着多核苷酸编码蛋白质方法很可能能够用于在单一环境中检测相当大的蛋白质组合。
实施例8：以计算机进行多核苷酸无关化处理
另一个重要的经验性考量是非互补性DNA链之间的相互干扰(crosstalk)水平。DNA序列A1、B1和C1与其互补体一起随机产生。惟一的限制是包含用于实现灵活性(flexibility)的5’A10区段和16个碱基的识别长度。进行实验时，发现存在少量但是可感知的噪音，所述噪音来自由于非线性二级相互作用而错配的序列。仅使用严格洗涤不能明显清除噪音。在任何现实的多参数平台中，该噪音都可与研究中的参数数量成比例地增加。因此，模型平台应当利用这样的DNA序列，所述序列彼此互不影响并且与印制在DNA阵列上的所有暴露的互补链互不影响。
因此，以在37℃下所述序列与互补靶标之间的任何分子内和分子间相互作用最小化为目标来设计DNA序列。使用Dirks等(Dirks，R.M.；Lin，M.；Winfree，E.；Pierce，N.A.Nucleic Acids Research 2004，32，(4)，1392-1403)描述的范例进行计算机设计。具体地，设计并根据经验验证了六个互不影响的序列，并在表2中报道。
表2
| 编码多核苷酸 | 相应的基质多核苷酸 |
| SEQ ID NO：7AAAAAAAAAAATCCTGGAGCTAAGTCCGTA | SEQ ID NO：8AAAAAAAAAATACGGACTTAGCTCCAGGAT |
| SEQ ID NO：9AAAAAAAAAAGCCTCATTGAATCATGCCTA | SEQ ID NO：10AAAAAAAAAATAGGCATGATTCAATGAGGC |
| SEQ ID NO：11AAAAAAAAAAAGCACTCGTCTACTATCGCTA | SEQ ID NO：12AAAAAAAAAATAGCGATAGTAGACGAGTGC |
| SEQ ID NO：13AAAAAAAAAAATGGTCGAGATGTCAGAGTA | SEQ ID NO：14AAAAAAAAAATACTCTGACATCTCGACCAT |
| SEQ ID NO：15AAAAAAAAAAATGTGAAGTGGCAGTATCTA | SEQ ID NO：16AAAAAAAAAATAGATACTGCCACTTCACAT |
| SEQ ID NO：17AAAAAAAAAAATCAGGTAAGGTTCACGGTA | SEQ ID NO：18AAAAAAAAAATTACCGTGAACCTTACCTGAT |
技术人员能够在阅读本公开内容后识别其他的无关化处理多核苷酸。
实施例9：细胞捕获、分离和分选方法
通过使用DNA标记的抗体来展示多核苷酸编码蛋白质用于多路细胞分选的优化和用途。
使用标准逆转录病毒转导方案将两种鼠细胞系VL-3T细胞(胸腺淋巴瘤细胞系(Groves，T.；Katis，P.；Madden，Z.；Manickam，K.；Ramsden，D.；Wu，G.；Guidos，C.J.J.Immunol.1995，154，5011-5022))和A20 B细胞(小鼠B细胞淋巴瘤(Kim，K.J.；Langevin，C.K.；Merwin，R.M.；Sachs，D.H.；Asfsky，R.J.Immunol.1979，122，549-554)，购自ATCC)设计为分别表达mRFP和EGFP。如上所述，将针对这些细胞系各自表面标志物的抗体(VL-3为抗CD90.2，A20为抗B220(eBioscience))分别以DNA链A1′和B1′编码。
对分选实验而言，以106个细胞/100μl培养基的浓度将细胞传代至新鲜的培养基[RPMI.1640(ATCC)，补充有10％胎牛血清、0.1mM非必需氨基酸和0.05mM β-巯基乙醇]，并与DNA-抗体缀合物(0.5μg/100μl)在冰上孵育30分钟。离心后从上清液中去除过量的缀合物，之后将细胞重悬于新鲜培养基中。细胞孵育之前，通过将残余胺基与pH＝7.4PBS中10mM甲基-PEO12-NHS酯(Pierce)在室温下反应4小时而将微阵列玻片钝化，以减少非特异性的细胞粘附。将细胞均匀地涂在微阵列表面上，并使其在冰上定位1小时。这段时间过后，在室温下用含1mM MgCl2的Tris缓冲盐溶液轻柔洗涤，去除未粘附细胞。同样地进行细胞富集实验，只是孵育步骤在T细胞和B细胞(各106个/100μl)二者的1:1混合物存在下进行。
使用标准磁珠负选择方案和BD IMagTM细胞分离系统，分别从EGFP和dsRed转基因小鼠(得自Jackson Laboratories)中纯化原代CD4+和CD8+T细胞。在基于多核苷酸编码的分级前，通过FACS分析这些群体的纯度，发现其高于80％。
与先前所述类似，在PEG化的微阵列机制上同时进行细胞、基因和蛋白质实验。
简言之，在用抗B220-B1′(0.5μg/100μl)标记后，将表达GFP的B细胞(106个/100μl)定位于B1点上。去除未粘附的细胞后，将带有C1′编码的第一抗体和APC标记的第二抗体的TNF-α ELISA对与0.5ng/μl FITC标记的A1′一起引入，并使其在室温下杂交30分钟。然后用TBS+MgCl2冲洗玻片并通过亮视野和荧光显微术显影。
平行进行均质细胞实验和淘洗细胞实验。对均质细胞捕获过程而言，将5×106个Jurkats(ATCC)与5μg抗CD3/C3′缀合物一起悬浮在1mlRPMI培养基中，并在冰上孵育1小时。通过离心去除过量的缀合物，并将Jurkats重悬于200μl新鲜培养基中，之后与DNA微阵列接触。在冰上孵育1小时后，用TBS柔和地冲洗玻片。平行进行细胞淘洗实验；在冰上将1ml RPMI中5μg抗CD3/C3′缀合物在微阵列上孵育1小时，之后在0.5×PBS中冲洗，然后在去离子水中冲洗。不要吹干玻片，而是轻叩玻片，以去除大多数过量的溶液，保持阵列湿润。在冰上将Jurkats(5×106个/200μL)立即置于阵列上1小时。随后的洗涤和显影步骤是相同的。
这些实验的结果示于图10，其中图a和b显示亮视野图像，其显示根据本文公开的方法和系统的实施方案的均质细胞捕获过程的效率。
具体地，在图a中描述了均质测定，其中将以DNA标记的抗体与细胞组合，然后将混合物引入点样的DNA阵列微芯片上。在图b中，首先在点样的DNA阵列上装配以DNA标记的抗体，然后引入细胞。这些异质过程与使用表面结合抗体诱捕特定细胞的传统淘洗方法是类似的。
通过比较图a和b中所示结果，通过评价均质细胞捕获(溶液相细胞捕获)和非均质细胞捕获(表面限定细胞捕获)，将基于多核苷酸编码蛋白质的细胞分选与淘洗进行比较。均质的DNA编码蛋白质方法显示更高的细胞捕获效率。
捕获效率的提高可能是由于若干因素。在均质细胞捕获中，DNA-抗体缀合物可以正确取向并与溶液中的细胞表面标志物结合。细胞捕获不是由抗体与细胞表面标志物的相互作用驱动的，而是由多价DNA-抗体缀合物与微阵列上互补DNA链通过协同结合而提高的亲和力驱动的，这大幅提高了捕获效率。对纳米颗粒、DNA杂交方案已报道了类似的趋势(Taton，T.A.；Mirkin，C.A.；Letsinger，R.L.Science 2000，289，1757-1760)。使用淘洗方法(其与本文公开的非均质DNA-抗体定义的阵列相似)时，捕获剂被限制为在表面上采取随机方向。抗体的活性被降低，就是因为与细胞表面标志物相互作用的不正确取向，降低了最大亲和力和与相邻抗体的协作。
在图c中显示了多路细胞分选实验的亮视野和荧光显微图像，其中表达mRFP的T细胞(红色通道)和表达EGFP的B细胞(绿色通道)的1:1混合物被空间层叠在点A1和C1上，这两点分别对应于A1′和C1′对抗CD90.2和抗B220抗体的编码。具体地，在图10c的实验中，两条独特的DNA链与分别针对T细胞标志物CD90.2(Thy1.2)和B细胞标志物CD45R(B220)产生的抗体缀合。通过将表达单体红色荧光蛋白(Campbell，R.E.；Tour，O.；Palmer，A.E.；Steinbach，P.A.；Baird，G.S.；Zacharias，D.A.；Tsien，R.Y.Proc.Natl Acad.Sci.2002，99，7877-7882)(mRFP)的T细胞(VL-3，鼠胸腺淋巴瘤)和表达EGFP的B细胞(小鼠B细胞淋巴瘤)的1∶1混合物空间分离，展示了基于DNA-抗体的多路细胞分选。将该混合物与针对T和B细胞标志物二者的独特编码的DNA-抗体缀合物一起孵育，并引入适当点样的微阵列。结果显示，亮视野和假色荧光显微照片都显示表达mRFP的T细胞在点A1富集，而表达EGFP的B细胞定位于B1，与各自抗体的DNA编码一致。
在图d中，展示了从小鼠收集的原代细胞多路分选的荧光显微照片。通过分别使用以多核苷酸编码的缀合物抗CD4-A1′和抗CD8-C1′，将来自EGFP转基因小鼠的CD4+细胞和来自dsRed转基因小鼠的CD8+细胞的1:1混合物分离至点A1和C1。原代细胞通常比已建立的细胞系更加脆弱。这是由于它们必须从周围组织中提取出来(通常通过酶消化)，这是可导致生存力降低的过程。另外，培养过程常选择特征是生存力和增殖潜能大幅提高的克隆。因此，一般性(generalized)的细胞分选技术还必须以最小的样品处理适用于原代细胞。为了展示以多核苷酸编码的蛋白质方法用于原代细胞分选的效用，通过磁性负排除分别从EGFP-和dsRED-转基因小鼠中分离CD4+和CD8+T细胞的合成混合物。使用抗CD4和抗CD8DNA-抗体缀合物使混合物成层(stratified)。如图10d中所示，这两种细胞类型根据附加的DNA编码被分离至不同的空间位置。
实施例10：使用以DNA编码的抗体与DNA印刷阵列的组合来进行多参数多路分析
根据图12所示策略进行多参数分析(细胞、mRNA和蛋白质)。
图11显示了用于细胞分选以及共检测蛋白质和cDNA(mRNA)的以多核苷酸编码蛋白质方法。用不同的DNA寡聚体标记针对蛋白质(用于细胞分选)的抗体或者其他蛋白质(包括细胞表面标志物)。然后将这些缀合物与生物样品(细胞、组织等)组合，在那里它们与其相应的抗原结合。引入DNA微阵列上时，根据Watson-Crick碱基配对进行的平行自装配将结合的物质(bound species)定位至特定的空间位置，允许进行多路多参数分析。
进行了免疫测定来展示本文公开的多核苷酸编码蛋白质检测多种靶标(包括化学性质不同的靶标)的能力。具体地，进行该测定来检测蛋白靶标IL4和多核苷酸B1。为此目的，用多核苷酸C1编码对蛋白靶标IL4具有特异性的抗体，并制备与多核苷酸B1互补的多核苷酸。如上所述将与多核苷酸B1互补的多核苷酸和C1′编码的抗IL4一起孵育。特异性结合后，引入针对IL4的荧光团第二抗体，并如图12中所示进行蛋白靶标IL4和寡核苷酸B1的同时检测。
为了强调图11所示平台的普遍多样性，将表达GFP的B细胞用B1′DNA编码的抗体缀合物进行标记，并空间定位于以互补寡核苷酸编码的点(B1)上。细胞定位后，组合成FITC标记的A1′DNA和以C1′编码的TNF-α的免疫夹层，并引入相同的微阵列平台中。图13中所示的所得亮视野和荧光显微图像显示了本文所公开方法和系统一个实施方案的平台用于同时扩展至不同生物学复杂性水平的有效性。
具体地，图13显示显微图像，其显示了同时发生的B1点细胞捕获以及A1与C1点分别进行的基因和蛋白质多参数检测。亮视野图像显示位于点B1的表达EGFP的B细胞(绿色通道)、A1处FITC标记的(绿色)cDNA，和编码至C1的APC标记的TNF-α夹层免疫测定(蓝色)。标度线段对应于300μm。
本文示例的多核苷酸编码蛋白质方法和系统的效率可能是由于使用了将抗体锚定在衬底上的多核苷酸特异性结合。用于蛋白质检测或用于淘洗细胞的常规抗体阵列(Wysocki，L.J.；Sato，V.L.，Proc.Nαtl.Acad.Sci.1978，75，(6)，2844-2848)需要将抗体固定在醛、环氧、马来酰亚胺或疏水固体支持物上(Liu，X.；Wang，H.；Herron，J.；Prestwich，G.，BioconjugateChem.2000，11，(755-761).Macbeath，G；Schreiber，S.L.Science2000，289，1760-1763.Pal5 M.；Moffa，A.；Sreekumar，A.；Ethier，S.；Barder，T.；Chinnaiyan，A.；Lubman，D.Anal.Chem.2006，78，702-710.Thirumalapura，N.R.；Morton，R.J.；Ramachandran，A.；Malayef，J.R.Journal of Immunological Methods 2005，298，73-81)。由于表面诱导的变性，通常难以保持折叠的(活性的)抗体构象，所述变性取决于许多变量，包括pH、离子强度、温度和浓度(Seigel，R.R.；Harder，P.；Dahint，R.；Grunze，M.；Josse，F.；Mrksich，M.；Whitesides，G.M.Anal.Chem.1997，69，3321-3328.Ramsden，J.J.Chem.Soc.Rev.1995，24，73-78.Fainerman，V.B.；Lucassen-Reynders，E.；Miller，R.Colloids Surf.A 1998，143，141)。这促进了对保持蛋白质天然构象的替代方法的开发，包括3维衬底如水凝胶和聚丙烯酰胺(Arenkov，P.；Kukhtin，A.；Gemmel，A.；Voloshchuk，S.；Chupeeva，V.；Mirzabekov，A.Anal.Biochem.2000，278，123-131.Kiyonaka，S.；Sada，K.；Yoshimura，l.；Shinkai，S.；Kato，N.；Hamachi，I.Nature Materials 2004，3，58-64.)，角质酶指导抗体在SAM上的固定(Kwon，Y.；Han，Z.；Karatan，E.；Mrksich，M.；Kay，B.K.Anal.Chem.2004，76，5713-5720)，和生物素化抗体在链霉亲和素包被表面上的偶联(Peluso，P.；Wilson，D.；Do，D.；Tran，H.；Venkatasubbaiah，M.；Quincy，D.；Heidecker，B.；Poindexter，K.；Tolani，N.；Phelan，M.；Witte，K.；Jung，L.；Wagner，P.；Nock，S.Anal.Biochem.2003，312，113-124)。另外，阵列在整个制造过程中需要始终维持湿润，以防止蛋白质变性(Macbeath，G.；Schreiber，S.L.Science2000，289，1760-1763)。另一方面，DNA微阵列通常被静电吸附(通过点样)在胺表面上。
在同一玻片上同时检测DNA和蛋白质的一种选择可以是在同一衬底上形成用于固定DNA和蛋白质的两种官能团，但这会显著提高系统的复杂性和设计。或者，兼容性表面可以是活化酯载玻片，胺-DNA和蛋白质均可与之共价附着。然而，发明人发现，与印制在共价制备的胺玻片上的DNA相比，这些玻片对DNA的载荷能力是减小的，导致较差的信号强度。另外，未反应的酯被水解成羧酸，其在正常的杂交缓冲液(pH7)中带负电，通过静电作用降低了DNA相互作用。另外，为了研究细胞和蛋白质，减少细胞非特异性结合而同时维持完整抗体功能性的最佳表面为丙烯酰胺(Soen，Y.；Chen，D.S.；Kraft，D.L.；Davis，M.M.；Brown，P.O.PLoSBiology2003，1，(3)，429-438.Boozer，C；Ladd，J.；Chen，S.；Yu，Q.；Homola，J.；Jiang，S.Anal.Chem.2004，76，6967-6972)，其与DNA是不兼容的。
另外，通过使用DNA作为用于细胞、cDNA和蛋白质的通用装配策略，能够优化用于点样衬底上高DNA载荷和用于抗体上互补DNA载荷的衬底条件。这导致用于蛋白质检测的高灵敏夹层测定以及高效细胞分选(与传统淘洗相比)。
实施例11：制造微流体设备
基于微流体的测定提供了优点，如降低的样品和试剂体积，以及缩短的测定时间(Breslauer，D.N.；Lee，P.J.；Lee，L.P.MoI.BioSyst.2006，2，97-112)。例如在某些操作条件下，表面结合测定动力学主要由分析物(蛋白质)浓度和分析物/抗原亲和力决定，而不是由扩散决定(Zimmermann，M.；Delamarche，E.；Wolf，M.；Hunziker，P.Biomedical Microdevices 2005，7，(2)，99-110)。通过将基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的微流体通道结合在DNA微阵列顶部来评价基于微流体的多核苷酸编码蛋白质途径。
具体地，使用常规软平版印刷(soft lithographic)技术由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制造微流体通道。目标是制造坚固的微流体通道，其在表面测定完成后能够解体用于光学分析。通过光刻工艺(photolithographically)由高分辨率透明掩蔽物(CadArt)制造主模，使得得到的流体网络由20条平行的通道组成，每条通道具有10×600μm的横截面轮廓并且长为2cm。这对应于120nl的通道体积。混合硅酮弹性体(Dow Corning Sylgard 184TM)并将其倾倒在模具的顶部。固化后从模具上去除PDMS并用20号钢针(Technical InnovationsTM)刺出样品输入口和输出口。然后将微流体通道对准微阵列顶部并在80℃烤箱与衬底结合过夜。
实施例12：使用以DNA编码的抗体进行基于微流体的测定步骤
用23号钢针和TygonTM管连接微流体设备，允许产生～0.5μl/分钟的气动控制流速。在Tris缓冲盐水(TBS)中进行多种测定，已发现TBS在降低背景噪音方面比1×SSC和PBS更好。用TBS中的1.0％ BSA封闭各通道，然后在流动条件下与DNA-抗体缀合物或免疫测定对接触10分钟。在流动条件下与缀合物或抗原接触10分钟后，用缓冲液将通道洗涤2分钟，并且将所述微流体构件从载玻片上取下，以用于扫描。在临成像前将整个玻片在TBS中简单冲洗、吹干并在如上所述的阵列扫描仪上成像。
在第一系列测定中，分别用寡聚体A1′和B1′标记两种山羊抗人IgG(用Alexa594或Alexa647标记)，并将其引入结合在微阵列DNA顶部的微流体设备中，所述微阵列带有相应的互补链A1和B1及非互补链C1。不添加编码至点C1的多核苷酸编码的缀合物。在～0.5μl/分钟流动10分钟后，去除微流体PDMS板并对载玻片成像。图14所示结果显示，抗体缀合物在<10分钟内自装配在附加的寡核苷酸所编码的精确空间位置上(见图14)，与微流体中DNA杂交所报道的时间尺度一致(Erickson，D.；Li，D.；Krull，U.Anal.Biochem.2003，317，186-200.Bunimovich，Y.；Shin，Y.；Yeo，W.；Amori，M.；Kwong，G.；Heath，J.J.Am，Chem.Soc.2006网络公开时间2006年12月1日)DOI：10.1021/ia065923u.Wei，C；Cheng，J.；Huang，C；Yen，M.；Young，T.Nucleic Acids Research2005，33，(8)，1-11)。为了确认用于蛋白质检测的多核苷酸编码蛋白质策略，进行了其它测定，其中利用编码抗体在多种标准免疫测定中检测相关抗原。
在标准免疫测定(Engvall，E.；Perlmann，P.O.J.Immunol.1972，109，129-135)中，第一抗体被吸附在固体支持物上，然后依次引入含抗原样品和标记的第二“读数抗体”并孵育，其间进行冲洗步骤。为了简化这种常规的五步式免疫测定，使用DNA所编码抗体的编码能力将整个夹层复合体定位至用于多路读数的适当位置，将该测定减少至单步骤。
具体地，将非荧光的、DNA编码的第一抗体与抗原和荧光标记的(无DNA)第二抗体组合。在这些条件下，只有当抗体-抗原-抗体夹层在均质溶液中成功形成并定位在微阵列上时，才能空间编码荧光信号。
具体地，在其他的第一系列测定中，引入针对两种细胞因子(人IFN-γ和TNF-α)的DNA编码的抗体、相应抗原以及荧光标记的第二抗体。DNA编码的抗体夹层测定自装配至其特定的空间位置，并在那里被检测，如图15a所示。完成这种多蛋白质免疫测定法也需要10分钟。
在使用第三白介素IL-2的第二系列测定中研究了基于微流体DNA编码抗体的夹层免疫测定法的灵敏度极限。结果显示于图15b和图15c中，其中使用荧光第二抗体(图b)显影并分别使用金非电沉积作为显影和放大策略(图c)。
使用荧光读数策略，该测定法在以5μM饱和浓度的互补DNA印制的玻片上达到约1nM的灵敏度极限峰值(数据未显示)。对人IL-2-浓度系列而言，首先将第一DNA-抗体缀合物铺在表面上，然后与抗原和第二抗体接触。这是因为在较低的抗原浓度下信号减弱，因为高比例的未结合抗原的第一抗体与结合有抗原的第一抗体竞争与DNA阵列杂交。通过先将阵列与第一DNA-抗体缀合物接触，在随后与抗原和第二抗体接触之前洗掉了过量物，增强了信号。
使用了多种策略来提高灵敏度。首先，申请人推断，提高载玻片对DNA的载荷能力会提高定位的多核苷酸编码缀合物的密度，因而提高可能的捕获事件数。常规DNA微阵列被印制在胺基硅烷与玻璃反应而产生的伯胺表面上(Pirrung，M.Angew.Chem.Int.Ed.2002，41，1276-1289)。通过DNA磷酸主链上的负电荷与来自质子化胺的正电荷之间的静电相互作用，在中性pH条件下固定DNA链。为了提高玻片的载荷能力，产生了多聚赖氨酸表面，从而提高电荷密度以及与DNA相互作用的表面积。通过采用这些改变，有可能以100μM的饱和浓度在载玻片上印制互补DNA。相应地，基于荧光的测定法的灵敏度提高至10pM(图15b)。
在一种不同的显影途径中，使用以金纳米颗粒标记的第二抗体，然后使用非电沉积沉积(Hainfeld，J.F.；Powell，R.D.，Silver-and Gold-BasedAutometallography of Nanogold.Gold and Silver Staining：Techniques inMolecular Morphology，Hacker，G.W.；Gu，J.，Eds.CRC Press：Washington，DC，2002；29-46页)进一步放大信号，并将基于荧光的读数转化为光读数。这是可能的，因为使用了空间而不是比色的多路化。
具体地，以与上文公开相似的方式进行基于微流体的金放大实验，重要的区别是使用生物素-第二抗体代替荧光标记的抗体。随后向每条通道(3ng/μl)中引入金-链霉亲和素(Nanoprobes)保持10分钟，之后用缓冲液将通道彻底冲洗。去除PDMS后，根据制造商的方案用金增强试剂盒(Nanoprobes)对整个玻片进行放大。
采用这些改进后，可在低于10fM的浓度极限下容易地检测IL-2白介素的存在(图15c)，这代表高于基于荧光的微流体免疫测定法至少1000倍的灵敏度。相比较而言，该方法比常规的ELISA灵敏度高100-1000倍(Crowther，J.R.，ELISA；Theory and Practice.In Methods in MolecularBiology，Humana Press Inc.：Totowa，New Jersey，1995)，比来自制造商的相应人IL-2 ELISA数据灵敏度高150倍(http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.isp？prodId＝6725)。
这些实验的结果显示，与1步式免疫测定法相比，特别是在低抗原浓度下，通过与试剂依次接触进行的测定法具有提高的灵敏度。这很可能是由于带有或不带有载荷的DNA抗体缀合物之间对下层DNA微阵列上杂交的竞争性结合。通过将阵列依次与多核苷酸编码的缀合物、抗原接触，然后与第二抗体接触，提高了灵敏度。最合适的方法必须根据在便利性和灵敏度方面所期望的结果来进行选择。然而仍然要强调，在微流体流动条件下对各步骤而言仍然在10分钟内达到最大信号。因此在完全自动化的设备中，可在1小时(包括30分钟的金放大步骤)内以低至10fM的灵敏度获得完整的微流体免疫测定。
实施例13：使用以金属纳米颗粒标记的DNA编码抗体进行靶标定量
使用以DNA编码的抗体与DNA阵列组合，根据图16和17中所述策略检测数字蛋白质组学情况。具体地，进行测定来检测某些细胞因子(IL2、TNF-α和IFN-γ)。以与上述3步式免疫测定相似的方式进行所有的实验，重要的区别是使用40nm金颗粒并且检测方案是暗视野光散射显微镜。
具体地，在数字方法中，用40nm金纳米颗粒标记第二抗体，所述金纳米颗粒通过暗视野光散射显微术可容易地检测。更具体地，使用40纳米的金纳米颗粒-链霉亲和素缀合物作为数字测定的检测探针。
用图18所示方法进行相关数字免疫测定的检测。根据图18所示方法，使用暗视野显微镜的物镜测量散射光。即便是非常小的金纳米颗粒的等离振子应答也容易地选取和检测。手动或使用颗粒计数的自动化软件包计数个体颗粒。注意所有颗粒的散射颜色是非常类似的-黄至绿色。这是因为金纳米颗粒(10)具有相当窄的尺寸范围(～60纳米直径)。在光散射显微镜中可使用滤光片消除所有其它散射颜色，因而降低背景。
实验结果显示于图19到22中，其中使用瑞利光散射来显影缀合物。
在图19和20中显示了根据本文所公开方法和系统的一个实施方案进行的数字测定法的灵敏度，其中展现了TNF-α的浓度系列。来自该蛋白质的信号可在低至100aM的浓度下被容易地鉴定。图19和20显示用本文公开的方法和系统在不同的浓度下进行的TNF-α数字免疫测定的代表性暗视野图像。使用由NIH提供的一种科学图像处理软件ImageJ TM来自动计数颗粒数。金纳米颗粒和TNF-α浓度绘制在图20的直方图中。
为了进一步评价该新技术在血清测量中的能力，在人血清(购自Sigma-Aldrich)中加入上述三种细胞因子蛋白(IL2、TNF-α和IFN-γ)并进行与上文相同的基于金纳米颗粒的测定法。结果显示于图21中。具体地，图a的图像从加入了下述三种蛋白质的血清样品中收集：IFN-γ、TNF-α和IL-2。图b的图像来自数字免疫测定，其根据本文公开的方法和系统的一种实施方案从健康人血清中测量。所有这三种蛋白质通常均以低于可检测的浓度存在于人血清中。TNF-α低于检测限，但是IFN-γ和IL-2以数飞摩尔/升(10-15M)的浓度水平存在。这一蛋白量远低于常规吸光度或荧光ELISA或甚至用本文公开的方法和系统的另一实施方案进行的免疫检测的检测限。
发现根据上文所述的实施方案的方法在血清中运行良好，具有高灵敏度和非常小的背景噪音。重要的是，数字免疫测定实施方案对这样的细胞因子是灵敏的，所述细胞因子是生物信息性分子，但是以痕量存在于纯的健康人血清中。如图21右侧显示，存在对应于人IFN-γ和IL-2的信号，但是未检测到TNF-α。该结果显示了其中使用金属纳米颗粒进行检测的本文所公开方法和系统的能力。
测试了均以相同浓度制备的上述三种人细胞因子蛋白的检测(图22)。具体地，将三种不同的ssDNA′分子点样到衬底上，各个ssDNA′与标记在第一抗体(抗IFN-γ；抗TNF-α和抗IL-2)上的ssDNA寡聚体互补。在衬底与血清/蛋白质混合物接触后，引入用60纳米直径金纳米颗粒标记的第二抗体。使用暗视野光散射显微镜显影纳米颗粒。
图22中所示结果可明确地显示出来，并且与基于荧光的测定一致的是，由于与第一抗TNF-α抗体的高亲和力，TNF-α显示最佳信号强度。
应当注意，背景接近零，并且检测到蛋白质的动态范围为至少106。这些类型的测定已被用于从健康人血清中检测某些细胞因子(IL2、TNF-α和IFN-γ)。这在之前是不可能的，因为这些蛋白质仅以1-5飞摩尔/升的水平存在(通过我们的测量)。应当注意，一旦表征了抗体/蛋白质亲和力，则这些类型的测定就是绝对和定量的，意味着它们不需要校准。
用本文公开的方法和系统对分子的数字检测易于适用于微流体环境(来自图21的结果在微流体环境中进行)。除了这类微流体免疫测定带来的样品大小和时间尺度益处外，还存在其它优点。例如，因为在读数之前整个测定在溶液中进行，所以蛋白质变性(点样抗体微阵列的一个问题)不降低结合效率。另外，涉及衬底支持抗体的任何测定都无法承受微流体芯片装配(其涉及在80℃的长时间烘烤)。将该方法设计成得到坚固的PDMS微流体通道，其随后可解体用于光学读数步骤。
进行溶液相测定的另一益处是抗原和抗体均享有取向自由，确保固体支持物不会限制分析物对捕获剂结合口袋的接近。
实施例14：诊断方法和系统
用于分析生物标志物的本文所公开方法和系统的一些初步校正和定量在PI3K通路中进行，该通路在许多癌症中尤其是在成胶质细胞瘤中是混乱的。具体地，在图23中显示了一种实施方案，其中应用该技术检测生物标志物pten，它是成胶质细胞瘤(脑癌)中的重要标志物。
本文公开的方法和系统首先被用于基于荧光的测定中，以通过使用pten作为标准品校准设备(图23，图a和b)。蛋白pten的校准用左侧7个格表示，范围从25nM到375pM。右侧三个格代表pten阳性和pten空白的样品。通过与校准格比较。能够内插得到pten的浓度在1nM附近。发明人随后继续定量成胶质细胞瘤细胞系U87中的pten表达水平(图a和c)。显然，如图23所示，合理的pten水平(1nM)使用本文公开的方法和系统是可检测的。
使用本文公开的方法和系统还可以在血清中进行生物标志物的检测和相关分析，作为个体健康状态的指示。具体地，可使用本文公开的方法和系统进行肝毒性研究。肝中的结果是特别有意义的，因为肝是人体中第二大的器官(第一是皮肤)，并且与血持续接触。因此很有可能该器官中的混乱会导致血清中所存在的肝特异性蛋白质生物标志物数量发生显著改变。
从血清生物标志物发现到临床确认的示例性途径示于图24。
血清生物标志物发现的第一个步骤涉及通过现有方法在串联质谱法中对血中蛋白质进行蛋白质组学分析。因此，使用串联质谱法发现在对鼠模型施用高水平对乙酰氨基酚(acetomaniphen)后，约25种蛋白质的初步蛋白质列表被上调或下调(图24的图a(1))。具体地，将所检测的肽回复作图(map back)，产生候选蛋白质生物标志物的列表。使用现有方法在表面等离振子共振中筛选和验证这些生物标志物及其相关的捕获剂(抗体)。具体地，使用SPR确认尤其有效的抗体对(图24的图b(2))。最后，为了能够进行高灵敏度的多路监测，将这些经证实的蛋白质捕获剂转变到根据本文公开的实施方案的微流体系统，使得可以监测血中的血清生物标志物。具体地，设计并测试芯片，以检测来自全血清的4种肝特异性血清蛋白和3种免疫特异性蛋白(图24的图c(3))。图24所示的结果表明，从血清中毫无困难地检测出了所有的靶标。
所有上述证实均已在鼠或人或二者的血清样品中完成。
总而言之，本文提供了用于在样品中检测和/或分选靶标的方法和系统，其基于组合使用多核苷酸编码蛋白质和衬底多核苷酸。所述以多核苷酸编码的蛋白质由特异性结合预定靶标的蛋白质和特异性结合衬底多核苷酸的编码多核苷酸组成，其中所述衬底多核苷酸附着于衬底。
提供了上文公开的实施例以对本领域普通技术人员完整公开和描述如何制造和使用本公开内容的设备、系统和方法的实施方案，而不旨在限制发明人认为的公开内容的范围。用于实施本公开内容的上述模式的修改对本领域技术人员是显而易见的，并且旨在包含于以下的权利要求范围内。说明书中提到的所有专利和出版物代表了本公开内容所属领域技术人员的技术水平。本公开内容中引用的所有参考文献均通过引用并入，其程度相当于各参考文献单独地通过引用以其整体并入。
在背景技术、发明详述和实施例中引用的每篇文献(包括专利、专利申请、杂志文章、摘要、实验手册、书籍或其他公开内容)的全部公开内容均通过引用并入本文。另外，与本文一起提交的序列表的硬拷贝和相应的计算机可读形式均通过引用整体并入本文。
应当理解，本公开内容不限于具体的组合物或生物系统，它们当然可以变化。还应当理解，本文使用的命名法仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在限制。本说明书及所附权利要求书中使用的无数量词修饰的名词均包括其复数含义，除非上下文明确表明不是这样。术语“多个”包括两个或更多个指代物，除非上下文明确表明不是这样。除非另有说明，否则本文使用的所有科技术语都具有与本公开内容所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管实践中能够使用与本文公开的相似或等同的所有方法和材料，但是在本文中描述了用于测试具体实例的合适材料和方法。
已描述了本公开内容的大量实施方案。尽管如此，应当理解，可进行多种修改而不偏离本公开内容的构思和范围。因此，其他实施方案也在以下权利要求书的范围之内。
序列表
<110>加州理工学院
Kwong，Gabe
Bailey，Ryan
Fan，Rog
Heath，James R.
<120>用于检测和/或分选包被的方法和系统
<130>P017-CIT
<140>待确定
<141>2007-08-01
<150>60/834,823
<151>2006-08-02
<150>60/959,665
<151>2007-07-16
<160>18
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>1
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>2
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>3
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>4
<210>5
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<223>合成寡核苷酸
<400>5
<210>6
<211>26
<212>DNA
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<220>
<223>合成寡核苷酸
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<210>7
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<223>合成寡核苷酸
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<210>8
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<220>
<223>合成寡核苷酸
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<210>9
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<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>9
<210>10
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<211>31
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<223>合成寡核苷酸
<400>11
<210>12
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>12
<210>13
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>13
<210>14
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>14
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>15
<210>16
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>16
<210>17
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>17
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>18
Bailey Ryan
Fan，Rong
Heath，James R.
<120>用于检测和/或分选包被的方法和系统
<130>P017-CIT
<140>待确定
<141>2007-08-01
<150>60/834,823
<151>2006-08-02
<150>60/959,665
<151>2007-07-16
<160>18
<170>PatentIn version3.4
<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>合成寡核苷酸
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<213>人工序列
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<223>合成寡核苷酸
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<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>3
<210>4
<211>26
Claims (28)
1.检测样品中靶标的方法，该方法包括：
将附着于衬底的衬底多核苷酸与以多核苷酸编码的蛋白质相组合，该以多核苷酸编码的蛋白质包含蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸，其中所述蛋白质与所述靶标特异性结合，且所述编码多核苷酸与所述衬底多核苷酸特异性结合；和
检测与附着于衬底的衬底多核苷酸相结合的以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体。
2.权利要求1的方法，其中如下进行附着于衬底的衬底多核苷酸与以多核苷酸编码的蛋白质的组合：
提供附着于衬底的衬底多核苷酸；
提供以多核苷酸编码的蛋白质，其包含蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸，其中所述蛋白质与所述靶标特异性结合，且所述编码多核苷酸与所述衬底多核苷酸特异性结合；和
将该以多核苷酸编码的蛋白质与样品和衬底在一定条件下接触一定时间，以允许所述以多核苷酸编码的蛋白质在以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体中与靶标结合，并且允许所述编码多核苷酸与所述衬底多核苷酸结合。
3.权利要求2的方法，其中如下进行所述以多核苷酸编码的蛋白质与样品和与衬底的接触：
将所述以多核苷酸编码的蛋白质与样品在一定条件下接触一定时间，以允许该以多核苷酸编码的蛋白质在以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体中与靶标结合；和
将所述以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体与衬底在一定条件下接触一定时间，以允许所述编码多核苷酸与所述衬底多核苷酸结合。
4.权利要求2的方法，其中如下进行所述以多核苷酸编码的蛋白质与样品和与衬底的接触：
将所述以多核苷酸编码的蛋白质与所述衬底在一定条件下接触一定时间，以允许所述编码多核苷酸与所述衬底多核苷酸结合；和
将所述以多核苷酸编码的蛋白质与样品在一定条件下接触一定时间，以允许所述以多核苷酸编码的蛋白质在以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体中结合。
5.权利要求1到4中任一项的方法，其中如下对衬底上所述以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体进行检测：
提供经标记的分子，其包含与靶标特异性结合的分子和附着于该分子的标记化合物，该标记化合物提供标记信号；
将所述经标记的分子与所述以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体在一定条件下接触一定时间，以允许所述经标记的分子与所述以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体结合；和
检测来自与衬底上以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体相结合的经标记分子的标记信号。
6.权利要求5的方法，其中所述标记化合物是金属纳米颗粒。
7.权利要求1到6中任一项的方法，其中所述以多核苷酸编码的蛋白质是抗体。
8.权利要求1到4中任一项的方法，其中所述靶标是多种靶标，且其中如下将附着于衬底的衬底多核苷酸与以多核苷酸编码的蛋白质相组合：
提供多种附着于衬底的衬底多核苷酸，各种衬底多核苷酸是序列特异性的，并且在位置上可彼此区分；
提供多种以多核苷酸编码的蛋白质，每种以多核苷酸编码的蛋白质包含蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸，其中所述蛋白质与所述多种靶标中的靶标结合，且所述编码多核苷酸与所述多种衬底多核苷酸中的序列特异性且位置上可区分的衬底多核苷酸特异性结合，各种蛋白质和编码多核苷酸在结合方面可彼此区分；和
将所述多种以多核苷酸编码的蛋白质与样品和所述多种衬底多核苷酸在一定条件下接触一定时间，以允许所述蛋白质与靶分子在多种以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体中结合，并且允许所述编码多核苷酸与所述衬底多核苷酸结合。
9.权利要求8的方法，其中如下对衬底上多种以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体的进行检测：
提供多种经标记的分子，每种经标记的分子包含与所述多种靶标的一种靶标特异性结合的分子以及提供标记信号的标记化合物，该标记化合物附着于所述经标记的分子，各种经标记的分子在检测方面可彼此区分；
将所述多种经标记的分子与所述多种以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体在一定条件下接触一定时间，以允许所述多种以多核苷酸编码的靶标复合体与所述多种经标记的分子结合；和
检测来自与衬底上多种以多核苷酸编码的靶标复合体结合的多种标记分子的标记信号。
10.权利要求9的方法，其中所述标记化合物是金属纳米颗粒。
11.权利要求8到10中任一项的方法，其中所述以多核苷酸编码的蛋白质中的蛋白质组分是抗体。
12.权利要求1到4中任一项的方法，其中所述靶标是多种靶标，该靶标包含至少一种靶多核苷酸，且其中如下将附着于衬底的衬底多核苷酸与以多核苷酸编码的蛋白质相组合：
提供多种附着于衬底的衬底多核苷酸，各种衬底多核苷酸是序列特异的并且在位置上可彼此区分；
提供至少一种经标记的多核苷酸，其特异性结合至少一种靶多核苷酸，各种标记多核苷酸在结合方面可彼此区分；
将所述至少一种经标记的多核苷酸与样品在一定条件下接触一定时间，以允许所述经标记的多核苷酸与靶多核苷酸结合从而提供至少一种经标记的靶多核苷酸，其中所述至少一种经标记的靶多核苷酸由这样的序列组成，所述序列与序列特异性且位置上可区分的衬底多核苷酸特异性结合；
提供至少一种以多核苷酸编码的蛋白质，其包含蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸，其中所述蛋白质与所述多种靶标中的靶标特异性结合，且所述编码多核苷酸与序列特异性且位置上可区分的衬底多核苷酸特异性结合，各种蛋白质和编码多核苷酸在结合方面可彼此区分，各种蛋白质在结合方面与各种经标记的多核苷酸可区分，各种以多核苷酸编码蛋白质在结合方面与各种经标记的靶多核苷酸可区分；
将所述至少一种以多核苷酸编码的蛋白质与样品在一定条件下接触一定时间，以允许所述蛋白质与靶标在至少一种以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体中结合；和
将所述至少一种经标记的靶多核苷酸与所述至少一种以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体和多种衬底多核苷酸在一定条件下接触一定时间，以允许所述至少一种经标记的靶多核苷酸与相应的衬底多核苷酸结合，并且允许所述至少一种编码多核苷酸与相应的衬底多核苷酸结合；
该方法还包括：
检测与衬底上多种空间定位的衬底多核苷酸相结合的所述经标记的靶多核苷酸。
13.权利要求12的方法，其中如下对衬底上所述以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体进行检测：
提供多种经标记的蛋白质，每种经标记的分子包含与所述多种靶标的一种靶标特异性结合的分子组分以及提供标记信号的标记化合物；该标记化合物附着于所述经标记的分子；
将所述多种经标记的分子与所述多种以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体在一定条件下接触一定时间，以允许所述多种以多核苷酸编码的靶标复合体与所述多种经标记的分子结合；和
检测来自与衬底上多种以多核苷酸编码的靶标复合体相结合的所述多种经标记蛋白质的标记信号。
14.权利要求13的方法，其中所述标记化合物是附着于该蛋白质的金属纳米颗粒。
15.权利要求12到14中任一项的方法，其中所述以多核苷酸编码的蛋白质中的蛋白质组分是抗体。
16.用于检测样品中的靶分子的系统，该系统包含
衬底，带有附着于该衬底上的衬底多核苷酸；和
以多核苷酸编码的蛋白质，其包含蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸，其中所述蛋白质与靶标特异性结合，且所述编码多核苷酸与所述衬底多核苷酸特异性结合。
17.权利要求16的系统，该系统还包含：
经标记的分子，其包含特异性结合靶标的分子和附着于所述蛋白质的标记化合物，该标记化合物提供标记信号。
18.权利要求16的系统，其中靶标是多种靶标，该系统包含：
衬底，其带有附着于该衬底上的多种衬底多核苷酸，所述多种附着于衬底上的衬底多核苷酸中的各种多核苷酸是序列特异性的且在位置上可彼此区分；和
多种以多核苷酸编码的蛋白质，每种以多核苷酸编码的蛋白质包含蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸，其中所述蛋白质与所述多种靶标中的预定靶标特异性结合，且所述编码多核苷酸与所述多种附着于衬底上的多核苷酸中序列特异性且在位置上可区分的多核苷酸特异性结合，各种蛋白质和编码多核苷酸在结合方面可彼此区分。
19.权利要求18的系统，该系统还包含：
多种经标记的分子，每种经标记的分子包含与所述多种靶标中一种靶标特异性结合的分子以及附着于该蛋白质组分的标记化合物，该标记化合物提供标记信号，各种经标记的分子在检测方面可彼此区分。
20.权利要求16的系统，其中所述靶标是多种靶标，所述多种靶标包含至少一种靶多核苷酸，该系统包含：
衬底，其带有附着于该衬底的多种衬底多核苷酸，各种衬底多核苷酸是序列特异性的且在位置上可彼此区分；
至少一种经标记的多核苷酸，其与所述至少一种靶多核苷酸特异性结合，各种标记多核苷酸在结合方面可彼此区分，各种经标记的多核苷酸用于生产经标记的靶多核苷酸，所述经标记的靶多核苷酸与所述多种空间定位的衬底多核苷酸中序列特异性且在位置上可区分的衬底多核苷酸特异性结合；
至少一种以多核苷酸编码的蛋白质，其包含蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸，其中所述蛋白质与所述多种靶标的靶标特异性结合，且所述编码多核苷酸与序列特异性且在位置上可区分的衬底多核苷酸特异性结合，各种蛋白质和编码多核苷酸在结合方面可彼此区分；
各种蛋白质在结合方面可与各种经标记的多核苷酸区分；
各种以多核苷酸编码的蛋白质在结合方面可与各种经标记的靶多核苷酸区分。
21.权利要求20的系统，该系统还包含：
至少一种经标记的分子，其包含与至少一种靶标特异性结合的分子以及附着于该分子的标记化合物，该标记化合物提供标记信号。
22.从多种靶标中分选靶标的方法，该方法包括：
提供附着于衬底的多种衬底多核苷酸，各种衬底多核苷酸是序列特异性的并且在位置上可彼此区分；
提供多种以多核苷酸编码的蛋白质，每种以多核苷酸编码的蛋白质包含蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸，其中该蛋白质与所述多种靶标中的预定靶标特异性结合，且所述编码多核苷酸与所述多种衬底多核苷酸中序列特异性且在位置上可区分的衬底多核苷酸特异性结合，各种蛋白质和编码多核苷酸在结合方面可彼此区分；
将所述多种以多核苷酸编码的抗体与样品在一定条件下接触一定时间，以允许所述抗体与靶标结合，从而提供多种以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体；和
将所述多种以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体与所述多种衬底多核苷酸在一定条件下接触一定时间，以允许所述编码多核苷酸与附着于衬底的衬底多核苷酸结合；
由此在与衬底结合的多种以多核苷酸编码的蛋白质-靶标复合体中分选所述多种靶标。
23.权利要求22的方法，其中所述靶标是细胞。
24.分选多种靶标的系统，该系统包含：
衬底，其带有附着于该衬底的多种衬底多核苷酸，所述附着于衬底的多种衬底多核苷酸中的各种多核苷酸是序列特异性的且在位置上可彼此区分；和
多种以多核苷酸编码的蛋白质，每种以多核苷酸编码的蛋白质包含蛋白质和附着于该蛋白质的编码多核苷酸，其中所述蛋白质与所述多种靶标中的预定靶标特异性结合，且所述编码多核苷酸与所述多种附着于衬底的多核苷酸中序列特异性且在位置上可区分的多核苷酸特异性结合，各种蛋白质在结合方面可彼此区分，各种编码多核苷酸在结合方面可彼此区分。
25.用于在样品流体中检测一个或多个靶标的微流体阵列，其包含：
具有用于装载样品流体的微流体构件的微流体组件，和
衬底组件，其带有多种附着于该衬底组件的衬底多核苷酸，该衬底多核苷酸是序列特异性的且在位置上可区分，该衬底组件与用于分析样品流体的微流体组件中的微流体构件有效关联；
其中每种所述衬底多核苷酸由与其他衬底多核苷酸的序列互不影响的序列组成。
26.在样品流体中检测一种或多种靶标的方法，包括用权利要求25的微流体阵列进行权利要求1到7中任一项的方法。
27.在样品流体中检测一种或多种靶标的方法，包括用权利要求25的微流体阵列进行权利要求8到11中任一项的方法。
28.在样品流体中检测一种或多种靶标的方法，包括用权利要求25的微流体阵列进行权利要求12到15中任一项的方法。
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|---|---|---|---|
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|---|---|
| CN (1) | CN101522915A (zh) |
Cited By (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103589629A (zh) * | 2013-11-15 | 2014-02-19 | 上海康微健康科技有限公司 | 循环肿瘤细胞分离系统 |
| CN103642755A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-03-19 | 上海交通大学 | 从血液中分离循环肿瘤细胞的方法 |
| CN103642756A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-03-19 | 上海交通大学 | 从血液中分离高纯度循环肿瘤细胞的方法 |
| CN107636162A (zh) * | 2015-06-01 | 2018-01-26 | 加利福尼亚技术学院 | 用针对特定群体的抗原筛选t细胞的组合物和方法 |
| CN108603879A (zh) * | 2016-02-08 | 2018-09-28 | 卢纳福雷技术公司 | 样品多重循环和原位成像的方法 |
| CN111500680A (zh) * | 2013-06-25 | 2020-08-07 | 普罗格诺西斯生物科学公司 | 检测样品中生物靶标的空间分布的方法和系统 |
| CN112424371A (zh) * | 2018-06-07 | 2021-02-26 | 美国安进公司 | 蛋白质-多核苷酸缀合物的检测测定 |
| CN114878553A (zh) * | 2022-07-05 | 2022-08-09 | 山东大学 | 一种基于光谱分辨原理同步实施电化学发光免疫分析与核酸检测的多组分分析方法 |
| US11661626B2 (en) | 2020-06-25 | 2023-05-30 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis of DNA methylation |
| US11680260B2 (en) | 2020-12-21 | 2023-06-20 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for spatial analysis of analytes in a biological sample |
| US11702698B2 (en) | 2019-11-08 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Enhancing specificity of analyte binding |
| US11702693B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells |
| US11732299B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial assays with perturbed cells |
| US11732300B2 (en) | 2020-02-05 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample |
| US11733238B2 (en) | 2010-04-05 | 2023-08-22 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11732292B2 (en) | 2010-04-05 | 2023-08-22 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays correlating target nucleic acid to tissue section location |
| US11739372B2 (en) | 2015-04-10 | 2023-08-29 | Spatial Transcriptomics Ab | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
| US11753675B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-09-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| US11753673B2 (en) | 2021-09-01 | 2023-09-12 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array |
| US11761038B1 (en) | 2020-07-06 | 2023-09-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample |
| US11773433B2 (en) | 2020-04-22 | 2023-10-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using targeted RNA depletion |
| US11781130B2 (en) | 2020-06-08 | 2023-10-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof |
| US11788122B2 (en) | 2011-04-13 | 2023-10-17 | 10X Genomics Sweden Ab | Methods of detecting analytes |
| US11795507B2 (en) | 2019-12-23 | 2023-10-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using RNA-templated ligation |
| US11827935B1 (en) | 2020-11-19 | 2023-11-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes |
| US11866767B2 (en) | 2020-05-22 | 2024-01-09 | 10X Genomics, Inc. | Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity |
| US11891654B2 (en) | 2020-02-24 | 2024-02-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of making gene expression libraries |
| US11898205B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-02-13 | 10X Genomics, Inc. | Increasing capture efficiency of spatial assays |
| US11926867B2 (en) | 2019-01-06 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| US11926822B1 (en) | 2020-09-23 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
| US11933957B1 (en) | 2018-12-10 | 2024-03-19 | 10X Genomics, Inc. | Imaging system hardware |
| US11959130B2 (en) | 2020-05-22 | 2024-04-16 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis to detect sequence variants |
| US11965213B2 (en) | 2019-05-30 | 2024-04-23 | 10X Genomics, Inc. | Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample |
| US11981958B1 (en) | 2020-08-20 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using DNA capture |
| US11981960B1 (en) | 2020-07-06 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis utilizing degradable hydrogels |
| US12031177B1 (en) | 2020-06-04 | 2024-07-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods of enhancing spatial resolution of transcripts |
| USRE50065E1 (en) | 2012-10-17 | 2024-07-30 | 10X Genomics Sweden Ab | Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample |
| US12071655B2 (en) | 2021-06-03 | 2024-08-27 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis |
| US12076701B2 (en) | 2020-01-31 | 2024-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics |
| US12110541B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-10-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods for preparing high-resolution spatial arrays |
| US12117439B2 (en) | 2019-12-23 | 2024-10-15 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for using fixed biological samples |
| US12129516B2 (en) | 2020-02-07 | 2024-10-29 | 10X Genomics, Inc. | Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics |
| US12195790B2 (en) | 2021-12-01 | 2025-01-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods for improved in situ detection of nucleic acids and spatial analysis |
| US12203134B2 (en) | 2021-04-14 | 2025-01-21 | 10X Genomics, Inc. | Methods of measuring mislocalization of an analyte |
| US12209280B1 (en) | 2020-07-06 | 2025-01-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods of identifying abundance and location of an analyte in a biological sample using second strand synthesis |
| US12270077B2 (en) | 2018-08-28 | 2025-04-08 | 10X Genomics, Inc. | Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample |
| US12275988B2 (en) | 2024-04-29 | 2025-04-15 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample |
-
2007
- 2007-08-01 CN CNA2007800367254A patent/CN101522915A/zh active Pending
Cited By (68)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US12234505B2 (en) | 2010-04-05 | 2025-02-25 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11733238B2 (en) | 2010-04-05 | 2023-08-22 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11732292B2 (en) | 2010-04-05 | 2023-08-22 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays correlating target nucleic acid to tissue section location |
| US11761030B2 (en) | 2010-04-05 | 2023-09-19 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11866770B2 (en) | 2010-04-05 | 2024-01-09 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11767550B2 (en) | 2010-04-05 | 2023-09-26 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US11795498B2 (en) | 2011-04-13 | 2023-10-24 | 10X Genomics Sweden Ab | Methods of detecting analytes |
| US11788122B2 (en) | 2011-04-13 | 2023-10-17 | 10X Genomics Sweden Ab | Methods of detecting analytes |
| USRE50065E1 (en) | 2012-10-17 | 2024-07-30 | 10X Genomics Sweden Ab | Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample |
| CN111500680B (zh) * | 2013-06-25 | 2024-04-16 | 普罗格诺西斯生物科学公司 | 检测样品中生物靶标的空间分布的方法和系统 |
| US11821024B2 (en) | 2013-06-25 | 2023-11-21 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
| CN111500680A (zh) * | 2013-06-25 | 2020-08-07 | 普罗格诺西斯生物科学公司 | 检测样品中生物靶标的空间分布的方法和系统 |
| US11753674B2 (en) | 2013-06-25 | 2023-09-12 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample |
| CN103642755A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-03-19 | 上海交通大学 | 从血液中分离循环肿瘤细胞的方法 |
| CN103642755B (zh) * | 2013-11-06 | 2016-06-29 | 上海交通大学 | 从血液中分离循环肿瘤细胞的方法 |
| CN103642756A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-03-19 | 上海交通大学 | 从血液中分离高纯度循环肿瘤细胞的方法 |
| CN103589629A (zh) * | 2013-11-15 | 2014-02-19 | 上海康微健康科技有限公司 | 循环肿瘤细胞分离系统 |
| US11739372B2 (en) | 2015-04-10 | 2023-08-29 | Spatial Transcriptomics Ab | Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens |
| CN107636162B (zh) * | 2015-06-01 | 2021-12-10 | 加利福尼亚技术学院 | 用针对特定群体的抗原筛选t细胞的组合物和方法 |
| CN107636162A (zh) * | 2015-06-01 | 2018-01-26 | 加利福尼亚技术学院 | 用针对特定群体的抗原筛选t细胞的组合物和方法 |
| CN108603879A (zh) * | 2016-02-08 | 2018-09-28 | 卢纳福雷技术公司 | 样品多重循环和原位成像的方法 |
| CN108603879B (zh) * | 2016-02-08 | 2021-06-22 | 卢纳福雷技术公司 | 样品多重循环和原位成像的方法 |
| CN112424371A (zh) * | 2018-06-07 | 2021-02-26 | 美国安进公司 | 蛋白质-多核苷酸缀合物的检测测定 |
| US12270077B2 (en) | 2018-08-28 | 2025-04-08 | 10X Genomics, Inc. | Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample |
| US11933957B1 (en) | 2018-12-10 | 2024-03-19 | 10X Genomics, Inc. | Imaging system hardware |
| US12180543B2 (en) | 2018-12-10 | 2024-12-31 | 10X Genomics, Inc. | Imaging system hardware |
| US11753675B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-09-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| US11926867B2 (en) | 2019-01-06 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| US11965213B2 (en) | 2019-05-30 | 2024-04-23 | 10X Genomics, Inc. | Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample |
| US11702698B2 (en) | 2019-11-08 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Enhancing specificity of analyte binding |
| US11981965B2 (en) | 2019-12-23 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using RNA-templated ligation |
| US11795507B2 (en) | 2019-12-23 | 2023-10-24 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using RNA-templated ligation |
| US12241890B2 (en) | 2019-12-23 | 2025-03-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods for generating barcoded nucleic acid molecules using fixed cells |
| US12117439B2 (en) | 2019-12-23 | 2024-10-15 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for using fixed biological samples |
| US11702693B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-07-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells |
| US11732299B2 (en) | 2020-01-21 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Spatial assays with perturbed cells |
| US12076701B2 (en) | 2020-01-31 | 2024-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics |
| US11898205B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-02-13 | 10X Genomics, Inc. | Increasing capture efficiency of spatial assays |
| US12110541B2 (en) | 2020-02-03 | 2024-10-08 | 10X Genomics, Inc. | Methods for preparing high-resolution spatial arrays |
| US11732300B2 (en) | 2020-02-05 | 2023-08-22 | 10X Genomics, Inc. | Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample |
| US12129516B2 (en) | 2020-02-07 | 2024-10-29 | 10X Genomics, Inc. | Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics |
| US11891654B2 (en) | 2020-02-24 | 2024-02-06 | 10X Genomics, Inc. | Methods of making gene expression libraries |
| US11773433B2 (en) | 2020-04-22 | 2023-10-03 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using targeted RNA depletion |
| US11866767B2 (en) | 2020-05-22 | 2024-01-09 | 10X Genomics, Inc. | Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity |
| US11959130B2 (en) | 2020-05-22 | 2024-04-16 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis to detect sequence variants |
| US12031177B1 (en) | 2020-06-04 | 2024-07-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods of enhancing spatial resolution of transcripts |
| US11781130B2 (en) | 2020-06-08 | 2023-10-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof |
| US11661626B2 (en) | 2020-06-25 | 2023-05-30 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis of DNA methylation |
| US12060604B2 (en) | 2020-06-25 | 2024-08-13 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis of epigenetic modifications |
| US11952627B2 (en) | 2020-07-06 | 2024-04-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample |
| US11981960B1 (en) | 2020-07-06 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Spatial analysis utilizing degradable hydrogels |
| US12209280B1 (en) | 2020-07-06 | 2025-01-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods of identifying abundance and location of an analyte in a biological sample using second strand synthesis |
| US11761038B1 (en) | 2020-07-06 | 2023-09-19 | 10X Genomics, Inc. | Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample |
| US11981958B1 (en) | 2020-08-20 | 2024-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using DNA capture |
| US11926822B1 (en) | 2020-09-23 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Three-dimensional spatial analysis |
| US11827935B1 (en) | 2020-11-19 | 2023-11-28 | 10X Genomics, Inc. | Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes |
| US11873482B2 (en) | 2020-12-21 | 2024-01-16 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for spatial analysis of analytes in a biological sample |
| US11680260B2 (en) | 2020-12-21 | 2023-06-20 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for spatial analysis of analytes in a biological sample |
| US11959076B2 (en) | 2020-12-21 | 2024-04-16 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes |
| US12241060B2 (en) | 2020-12-21 | 2025-03-04 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes |
| US12203134B2 (en) | 2021-04-14 | 2025-01-21 | 10X Genomics, Inc. | Methods of measuring mislocalization of an analyte |
| US12071655B2 (en) | 2021-06-03 | 2024-08-27 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis |
| US11753673B2 (en) | 2021-09-01 | 2023-09-12 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array |
| US11840724B2 (en) | 2021-09-01 | 2023-12-12 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array |
| US12195790B2 (en) | 2021-12-01 | 2025-01-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods for improved in situ detection of nucleic acids and spatial analysis |
| CN114878553B (zh) * | 2022-07-05 | 2022-10-14 | 山东大学 | 一种基于光谱分辨原理同步实施电化学发光免疫分析与核酸检测的多组分分析方法 |
| CN114878553A (zh) * | 2022-07-05 | 2022-08-09 | 山东大学 | 一种基于光谱分辨原理同步实施电化学发光免疫分析与核酸检测的多组分分析方法 |
| US12275988B2 (en) | 2024-04-29 | 2025-04-15 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample |
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