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JP2018516922A - 抗原を用いて特異的集団に関してｔ細胞をスクリーニングするための組成物および方法 - Google Patents

抗原を用いて特異的集団に関してｔ細胞をスクリーニングするための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

患者由来の抗原特異的T細胞を単離するための組成物および方法は、ペプチド負荷ストレプトアビジン主要組織適合遺伝子複合体（MHC）テトラマーと複合体化したポリヌクレオチドバーコード化ナノ粒子選別物質を有する抗原複合体を含み、このバーコード化技術は、抗原特異的T細胞を容易に単離し同定するための抗原複合体のライブラリーの高忠実度スクリーニングを可能にする。

Description

連邦政府の後援による研究または開発に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって交付された助成金番号CA151819およびCA1710689の下に政府の後援を受けてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
背景
腫瘍細胞のネオ抗原は、突然変異を含有する突然変異型タンパク質のペプチドフラグメントであり、腫瘍内の細胞表面上で主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI分子の溝の中で提示されることができ、その状態でそれらネオ抗原は、CD8陽性T細胞による調査を受けることができる。ネオ抗原の腫瘍特異性は、がん細胞を特異的に殺すネオ抗原特異的T細胞の能力と相まって、がん免疫治療にとっての腫瘍ネオ抗原の重要度をますます高めている。加えて、特異的ネオ抗原を認識するT細胞受容体（TCR）は、ネオ抗原を生産する感染物質をターゲットとするための、TCR操作細胞に基づく治療法の候補である。
推定ネオ抗原は、以前に、腫瘍エクソーム分析によって同定されており、その後、インシリコ分析を使って、それらのMHC結合強度に従った順位付けがなされている。しかし、どの候補ネオ抗原が実際にT細胞の腫瘍浸潤を促進しているかを見いだすことには、いくつかの理由で、課題がある。第1に、発現するDNA塩基対100万個あたり10個の突然変異密度を有する患者腫瘍は、所与のヒト白血球抗原（HLA）遺伝子型MHCに対して500nM以下の結合定数（Kd）を呈する推定ネオ抗原を50個程度有すると予想されうる。さらにまた、どの特定ネオ抗原特異的T細胞集団も、患者には極めて少量しか存在しない可能性が高く、そのことが、ネオ抗原特異的T細胞の単離および/または同定を極めて困難にする。この問題に関連する課題には、ネオ抗原とそれらのコグネイトTCRとの対形成が含まれる。それでもなお、これらのネオ抗原-T細胞の対形成相互作用はがん免疫治療の核心であるため、これらの課題の解決に向けて多くの努力が払われてきた。ネオ抗原特異的T細胞の対形成のためのこれまでのアプローチは、手間がかかり、非定量的であることが明らかになっており、そして/または、それらのアプローチでは、感度の限界ゆえに、1つのHLA遺伝子型につき1つか2つのT細胞集団しか同定できない。
概要
本発明のいくつかの態様において、抗原複合体は、ナノ粒子と、少なくとも1つの符号化領域を有し、ナノ粒子にコンジュゲートされているポリヌクレオチド検出タグと、ポリヌクレオチド検出タグにコンジュゲートされている第1のポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメインとを含む、ナノ粒子選別物質を含む。抗原複合体は、修飾ストレプトアビジンタンパク質と、それぞれが独立して修飾ストレプトアビジンタンパク質にコンジュゲートされている4つのビオチン修飾主要組織適合遺伝子複合体（MHC）タンパク質と、ビオチン修飾MHCタンパク質に結合している抗原ペプチドと、第1のポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメインとは異なり、かつ修飾ストレプトアビジンタンパク質にコンジュゲートされている第2のポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメインとを含む、ペプチド負荷ストレプトアビジンMHCテトラマーも含み、ここで、ナノ粒子選別物質は、第2のポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメインへの第1のポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメインのハイブリッド形成によって、ペプチド負荷ストレプトアビジンMHCテトラマーに連結されている。
本発明のいくつかの態様において、抗原複合体のライブラリーは、複数の、上に開示した抗原複合体を含み、それら抗原複合体のそれぞれは、該複数の抗原複合体中の他のどの抗原複合体とも異なる抗原ペプチドおよび異なるポリヌクレオチド検出タグを有する。
本発明のいくつかの態様において、ネオ抗原特異的T細胞を検出するためのキットは、少なくとも1つの符号化領域を含むポリヌクレオチド検出タグを含み、ポリヌクレオチド検出タグはナノ粒子にコンジュゲートされている。また、キットは、ポリヌクレオチド検出タグの該少なくとも1つの符号化領域にハイブリッド形成する能力を有する符号解読ポリヌクレオチドも含む。いくつかの態様において、キットは、符号解読ポリヌクレオチドにハイブリッド形成する能力を有する置換ポリヌクレオチドも含む。いくつかの態様において、キットは、図4のポリヌクレオチド検出タグ配列のうちの少なくとも1つを含む。いくつかの態様において、キットは、図8Aの符号解読ポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つを含む。いくつかの態様において、キットは、図8Bの置換ポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つを含む。いくつかの態様において、キットは、修飾ストレプトアビジンタンパク質と、それぞれが独立して修飾ストレプトアビジンタンパク質にコンジュゲートされている4つのビオチン修飾主要組織適合遺伝子複合体（MHC）タンパク質と、ビオチン修飾MHCタンパク質に結合している抗原ペプチドとを含む、少なくとも1つのペプチド負荷ストレプトアビジンMHCテトラマーも含む。
本発明のいくつかの態様において、対象中の腫瘍に対するネオ抗原特異的T細胞を単離するための方法は、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）結合アルゴリズムを使って該腫瘍に関する候補T細胞エピトープを同定する工程、候補T細胞エピトープに対応する抗原ペプチドを合成する工程、該抗原ペプチドを使って抗原複合体のライブラリーを調製する工程、抗原複合体のライブラリーを該対象からのTILまたはPBMCと共にインキュベートする工程、および抗原複合体のライブラリー中のいずれかの抗原複合体のいずれかの抗原ペプチドと対形成したT細胞を含む対形成T細胞を、対形成していないT細胞から分離する工程を含む。
本発明のいくつかの態様において、対象中の腫瘍に対するネオ抗原特異的T細胞を単離するための前記方法は、前記対形成T細胞をマイクロ流体デバイスに添加して、該対形成T細胞を個々の対形成T細胞に分離する工程、および各々の対形成T細胞の抗原複合体のポリヌクレオチド検出タグの前記少なくとも1つの符号化領域の配列を検出する工程も含む。いくつかの態様において、各々の対形成T細胞の抗原複合体のポリヌクレオチド検出タグの前記少なくとも1つの符号化領域の配列を検出する工程は、各々の対形成T細胞のポリヌクレオチド検出タグを、少なくとも2種の標識符号解読ポリヌクレオチドと共にインキュベートする工程、およびハイブリッド形成した標識符号解読ポリヌクレオチドの存在を検出し、それによってポリヌクレオチド検出タグの該少なくとも1つの符号化領域の配列を決定する工程を含む。
本発明のいくつかの態様において、対象中の腫瘍に対するネオ抗原特異的T細胞を単離するための方法は、上記のとおりであって、抗原複合体のポリヌクレオチド検出タグの前記少なくとも1つの符号化領域が、少なくとも2つの符号化領域を含み、かつ各々の対形成T細胞の抗原複合体のポリヌクレオチド検出タグの該少なくとも2つの符号化領域の配列を検出する工程は、各々の対形成T細胞のポリヌクレオチド検出タグを少なくとも2種の第1の標識符号解読ポリヌクレオチドと共にインキュベートする工程、1種または複数種の第1のハイブリッド形成した標識符号解読ポリヌクレオチドの存在を検出し、それによってポリヌクレオチド検出タグの該少なくとも2つの符号化領域のうちの第1の符号化領域の配列を決定する工程、1種または複数種の第1のハイブリッド形成した標識符号解読ポリヌクレオチドを1種または複数種の置換ポリヌクレオチドと共にインキュベートして、第1の標識符号解読ポリヌクレオチドを第1のハイブリッド形成した標識符号解読ポリヌクレオチドから取り除き、部分的に符号解読されたポリヌクレオチド検出タグを得る工程、部分的に符号解読されたポリヌクレオチド検出タグを1種または複数種の第2の標識符号解読ポリヌクレオチドと共にインキュベートする工程、および第2のハイブリッド形成した標識符号解読ポリヌクレオチドの存在を検出し、それによって各々の対形成T細胞の抗原複合体のポリヌクレオチド検出タグの該少なくとも2つの符号化領域のうちの第2の符号化領域の配列を決定する工程を含む。
本特許または出願のファイルは、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含んでいる。カラー図面による本特許および特許出願公開の写しは、請求に応じて、必要な手数料が支払われた場合に、米国特許商標庁によって提供されるであろう。
Coulie et al., 2014, Nat Rev Cancer 14: 135-146（この文献の内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている、T細胞（青色で示す）上のT細胞受容体（TCR）と抗原提示細胞（APC）（赤色で示す）上の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）によって提示された抗原との間の相互作用を図示した概略図である。 図2A〜2Bは、Fritsch et al., 2014, Cancer Immunol Res., 2:522-529（この文献の内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている、TCR（紫色）と相互作用しているMHC分子（緑色）中のペプチド抗原（黄色）との間の特異的結合相互作用、およびネイティブエピトープ残基と比較した突然変異型エピトープ残基の予想IC50結合を示している。 本発明の態様による、DNA標識抗原-MHC複合体のライブラリーを形成させるための、4つのビオチン-MHC分子が結合したDNA標識（黒色）・システイン修飾ストレプトアビジン（茶色）を使った、異なる候補抗原ペプチドを負荷するためのコンディショナル抗原MHC分子（緑色および紫色）の構築を示す概略図である。 本発明の態様による、バーコード化NP-抗原-MHC複合体のライブラリーを形成させるための、DNAバーコード化ナノ粒子（NP）とDNA標識抗原-MHC複合体との会合および連結を示す概略図である。ここでは、DNAバーコード（すなわちポリヌクレオチド検出タグ）が、ナノ粒子に取り付けられた3つの相異なる符号化領域（赤色、緑色、または黄色）を含み、バーコードの3'端にあるハイブリッド形成DNA（黒色）は、DNA標識抗原-MHC複合体のハイブリッド形成DNAと複合体化することで、バーコード化NP-抗原-MHC複合体ライブラリーを形成する。 本発明の態様による、3ポジション符号化領域バーコード（赤色、緑色、または黄色）の例を示す概略図である。 本発明の態様による、抗原特異的T細胞の同定のためのバーコード化NP-抗原-MHC複合体のライブラリーを調製するための3ポジションDNAバーコード（ポリヌクレオチド検出タグ）（赤色、緑色、または黄色）配列の例を列挙した表である。 本発明の態様による、抗原特異的T細胞の同定のためのバーコード化NP-抗原-MHC複合体のライブラリーを調製するための3ポジションDNAバーコード（ポリヌクレオチド検出タグ）（赤色、緑色、または黄色）配列の例を列挙した表である。 本発明の態様による、バーコード化NP-抗原-MHC複合体ライブラリーにおける27の候補抗原および対応バーコード配列ならびに符号解読配列用の蛍光色素の色（赤色、黄色、または緑色）を列挙した抗原バーコードキーである。 本発明の態様による、符号解読配列の対応蛍光色素（赤色、黄色または緑色）と共に示された対応符号化領域配列（D1、D2、D3、D5、D6、D7、D9、D10、またはD11）による、各抗原に対応する読出しを示す、抗原バーコードキーである。 本発明の態様による、T細胞上のコグネイトT細胞受容体（TCR）と対形成したバーコード化磁性NP-抗原-MHC複合体、および磁石による磁性NPの単離を図示した概略図である。 本発明の態様による、DNA逐次的バーコード読出しの概略図（A）および蛍光像（B〜G）である。ここでは、まず、NP-DNAを読取り（Read）1 DNAにハイブリッド形成させることで、画像Bに示すように赤色蛍光を得る。置換1 DNAおよび読取り2 DNAを導入することで、画像Cに示すように読取り1 DNAを取り除き、図Dに示すように緑色蛍光を得る。同様のプロセスを経て、画像Eに示すように読取り2 DNAを取り除き、画像Fに示すように第3の黄色蛍光シグナルを生成させる。スケールバーは50umである。 図8Aは、本発明の態様による、図4および図5Bの符号化領域のそれぞれを符号解読するための、蛍光色素標識DNA（ポリヌクレオチド符号解読配列）（M1、M2、M3、M5、M6、M7、M9、M10、およびM11）の一覧であり、配列は取り付けられる色素の色（赤色、黄色または緑色）で示されている。図8Bは、本発明の態様による、図9Aに列挙した符号解読配列のそれぞれを置換するための、置換DNA（ポリヌクレオチド置換配列）（M1 comp、M2 comp、M3 comp、M5 comp、M6 comp、M7 comp、M9 comp、M10 comp、およびM11 comp）の一覧である。 本発明の態様による、患者（患者＃1）からの増殖した腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）の試料から収集された、バーコード化しかつ沈降させたネオ抗原特異的T細胞の単一細胞分析を示す図である。ここで、左端の画像は10個の細胞トラップを備えたマイクロ流体チャンバーの光学顕微鏡像であり、それら10個の細胞トラップのうちの9個は単一のバーコード化T細胞を含有している。蛍光像は（左から右に向かって）符号化領域1の読出し（1st）、符号化領域2の読出し（2nd）、および符号化領域3の読出しを示しており、読出しの結果はR＝赤色、Y＝黄色、およびG＝緑色として画像の下に示されている。 本発明の態様による、Mart-1特異的T細胞受容体が形質導入されたJurkat細胞（緑色の細胞）を、Jurkat細胞とGBM U876細胞（青色の細胞）との混合物から捕獲するためのバーコード化NP-Mart-1 MHCテトラマーの模式図である。 本発明の態様による、混合されたJurkat細胞（緑色に染色）およびGBM U87細胞（青色に染色）の蛍光像を示す。 本発明の態様による、図10BのJurkat細胞（緑色の細胞）とGBM U876細胞（青色の細胞）との混合物からバーコード化NP-Mart-1 MHCテトラマーを単離した後の細胞上清の画像を示す。 本発明の態様による、図10BのJurkat細胞（緑色の細胞）とGBM U876細胞（青色の細胞）との混合物からのバーコード化NP-Mart-1 MHCテトラマーの磁性プルダウンに随伴する細胞の画像を示す。 患者＃1の胸壁、胸膜および肺における黒色腫腫瘍のコンピュータ体軸断層撮影（CAT）スキャンを示す。 本発明の態様による、図5に列挙した27の推定抗原のバーコード化NP-抗原-MHC複合体ライブラリーによる、2つの独立した細胞捕獲物（橙色の増殖培養物＃1および青色の増殖培養物＃2）を使った、患者＃1に関するネオ抗原特異的CD8＋ T細胞の捕獲パーセンテージを示すグラフである。同じ方法を使って捕獲されるCD4＋陽性T細胞の数から非選択的捕獲は約0.5％と推定される。 本発明の態様による、患者＃1の腫瘍からの増殖TILから検出されたネオ抗原集団を示すグラフである。ここでは、表示した3回のラン（ラン＃1＝緑色、ラン＃2＝赤色、およびラン＃3＝青色）のランごとに、およそ10,000個のCD8＋ TILを分析し、取り付けられたNP-バーコードの蛍光ベースの読出しのために、マイクロ流体チップの細胞捕獲チャンバー内で単離した。ラン＃1およびラン＃2では、図5の27のネオ抗原による同じ27要素NPバーコード化抗原-MHCライブラリーを利用し、ラン＃3では、28〜50の順位を有するネオ抗原に特異的なCD8＋ T細胞が捕獲されるように設計されたNP-バーコード化抗原-MHCライブラリーを利用した。 本発明の態様による、患者＃1における病変サイズの時系列である。ここでは、0日目が抗PD1治療の開始時点に対応し、ベースライン腫瘍生検材料（赤色の星印で示す）を、28日目のゲノム分析およびトランスクリプトーム分析のために収集した。黒いドットは図11に示すCTスキャン測定日に対応し、色つきの矢印（橙色、紫/ピンク色、青色、緑色、および黒色）は、図14Bにおける同じ色つきデータバーに対応する。 本発明の態様による、患者＃1の治療の過程で、187日目に収集されたTIL（一番上の図）（紫/ピンク色のバー）およびPBMC（図14Aに示す対応病変サイズを持ち、橙色、緑色、および青色のバーは同じ色の矢印に対応している）から検出されたネオ抗原特異的T細胞集団、ならびにベースラインRNAシークエンシングからの突然変異体タンパク質に関する突然変異含有mRNAリードカウント（一番下のグラフ）のグラフである。ここで、PBMC分析グラフにおける水平の破線はシグナルしきい値を表し、これを上回れば、そのT細胞集団の同定は統計的に有意である。垂直の灰色破線は異なる時点および患者材料で検出されたT細胞集団を示し、一方、垂直の橙色破線は、転写産物および41日目に検出された対応するT細胞集団に対応している。また、TIL分析については、MART-1腫瘍抗原をライブラリー要素＃50として含め、一方、PBMCについては、コンディショナル抗原（MHC-J）を含有するライブラリー要素を、その要素として含めた。 本発明の態様による、健常ドナーPBMC（橙色）および同じ臨床治験の無関係な黒色腫患者のPBMC（青色）からCD8＋ T細胞を捕獲するために患者＃1用に設計されたNP-バーコード化抗原-MHCライブラリーを使って単離されたT細胞の平均数を示す対照実験のグラフである。 本発明の態様による、x軸上の数字ラベルが推定ネオ抗原の順位に対応しているグラフであり、図15Aにおける2つの対照の間に相関関係がないことを例証している。橙色のバーは健常PMBCを表し、青色のバーは異なる患者（患者＃1でない）からの黒色腫PMBCを表す。 本発明の態様による、患者＃2について予測された上位28の推定ネオ抗原およびMART-1腫瘍抗原に基づくNP-バーコードNACSライブラリーを使った、ネオ抗原特異的CD8＋ T細胞集団に関する、患者＃2 TILのグラフ分析である（上側のグラフ、緑色のバー）。ここでは、TIL 3000個あたり5細胞を上回る頻度で検出されたT細胞集団だけを統計的に有意と見なした。また、下側のグラフ（灰色のバー）は、ネオ抗原の由来源となる突然変異型タンパク質について測定されたmRNAコピー数を表す。 患者＃1 TILのマルチプレックスフロー分析からのデータ。ここでは、T細胞が蛍光ストレプトアビジンコンジュゲートネオ抗原マルチマーで染色されており、2色バーコードは凡例に示すとおりである。ネオ抗原＃12が＞10細胞で2色だけであること、そしてフローデータでは個々の細胞を解析できないという事実により、このマルチプレックス法では、他のネオ抗原、例えば＃7、Mart-1、＃19および＃27（破線の枠）は曖昧であったことが、フローデータによって明確に確認される。 本発明の態様による、抗PD-1治療の開始から439日後に収集した採血物でスクリーニングした、患者＃1特異的バーコード化NP-抗原-MHCライブラリーを使って患者＃1 PBMC中で分析されたT細胞の数を示すグラフである。平均の2標準偏差（1ライブラリー要素あたり2.2±1.4細胞）を上回るT細胞集団は単離されなかった。 本発明の態様による、互いに2mm離れるように設計された単一細胞トラップ（一番上のチャネルに黒い矢印で示されている）を持つ単一細胞捕捉デバイスの模式図である。これにより、捕捉された特定細胞を、捕捉された他の細胞に外乱を与えることなく、1mm細胞パンチャーによって単離することが可能である。スケールバーは2mmを示す。 本発明の態様による、単一細胞トラップの顕微鏡像であり、スケールバーは50umを表す。 本発明の態様による、（左から右に向かって）患者＃1から捕獲されたバーコード化T細胞、続いてネオ抗原＃12に対する特異性を同定するための3つの逐次的な蛍光読出し工程（それぞれ黄色、赤色、および緑色）を示す光学顕微鏡像である。スケールバーは20umである。次に、捕獲された単一T細胞は打ち抜かれて、TCRα遺伝子配列とTCRβ遺伝子配列（DNAラダー:100bp）を得るためにRT-PCRが行われ、次に、得られたTCR遺伝子をアセンブルしてレトロウイルスベクター（概略図を示す）に移し、フローサイトメトリーによる分析のためにJurkat T細胞（緑色で模式的に示す）中に送達した。 本発明の態様による、非形質導入Jurkat細胞（左）、LNGFR発現レポーターが形質導入されたJurkat細胞（中央）およびNGFRとネオ抗原12に特異的なTCRとの両方が形質導入されたJurkat細胞（右）に関するフローサイトメトリー結果を示す。
詳細な説明
T細胞媒介性免疫は、図1に図示するように、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）中の外来抗原のエピトープを細胞表面に示す細胞においてアポトーシスを誘発することができる抗原特異的細胞傷害性T細胞の活性化を特徴とする。外来抗原が負荷されたMHC複合体を示すこれらの細胞には、ウイルス感染細胞、細胞内細菌を持つ細胞、および腫瘍抗原を示すがん細胞が含まれる。T細胞媒介性免疫プロセスを、例えば患者特異的がん免疫療法などに利用するためには、初期工程の1つに、患者の腫瘍特異的抗原（すなわちネオ抗原）の同定が含まれる。患者の推定ネオ抗原（腫瘍または病原体）の同定には、発現していると推定されるネオ抗原に対応する体細胞突然変異を同定するために腫瘍、ウイルスまたは細菌のシークエンシングデータを分析するインシリコ予測アルゴリズムプログラムが利用される。加えて、前記Fritsch et al., 2014によって検証され、図2A〜2Bに図示されているように、ヒト白血球抗原（HLA）タイピングが患者の腫瘍試料または血液試料から決定され、このHLA情報を、同定された推定ネオ抗原ペプチド配列と一緒に、MHC結合に関する予測アルゴリズムにおいて使用する。これらのインシリコ分析により、患者の候補ネオ抗原ペプチドのランク付けリストが得られ、それら患者の候補ネオ抗原ペプチドは、コグネイト抗原特異的T細胞のスクリーニングのために容易に合成することができる。本明細書において「抗原特異的T細胞」とは、細胞にそれぞれの抗原特異性を与えるそれぞれのT細胞受容体（TCR）によって互いに識別される細胞を指す。
ネオ抗原特異的T細胞をスクリーニングするための現在公知の方法は時間がかかり、かつ/または感度が低く、大半の方法では、1つのHLA遺伝子型あたり2、3のT細胞しか同定されない。本発明の態様には、ネオ抗原などの患者特異的抗原をターゲットとする患者特異的T細胞集団を高い忠実度で迅速かつ非破壊的に単離および同定するための、組換え抗原負荷MHC組成物および容易な符号解読方法が含まれる。本発明の態様には、独特な組換え抗原-MHC複合体に連結された、独特なポリヌクレオチドバーコードを有するナノ粒子（NP）が含まれる。バーコード化ナノ粒子-抗原-MHC複合体を利用すれば、その抗原-MHC複合体と対形成するT細胞が、ナノ粒子の選択的単離により、この抗原-MHC-T細胞複合体の状態で単離される。次に、単離された抗原-MHC-T細胞複合体を細胞捕捉プラットフォームに移して、個々の抗原-MHC複合体-T細胞を分離することができる。本発明の態様によれば、単離された各NPの独特なバーコードが、インサイチュー増幅によって、または蛍光標識バーコードセンス鎖「リーダー」を使って同定される。このナノ粒子単離およびバーコード同定の方法論を使うと、個々の抗原-MHC-T細胞複合体は同定されるが、破壊されることがない。したがって、単離されたT細胞は、同定後に、さらなる特徴付け（例えば腫瘍バイオマーカー分析）のための、またはさらなる増殖のための、貴重な供給源として利用することができる。T細胞のさらなる成長は、患者特異的抗原をターゲットとする患者由来T細胞の濃縮された集団をもたらす。患者特異的抗原をターゲットとする患者由来T細胞のこの集団は、腫瘍または病原体をターゲットとする免疫治療の一手段として、患者への養子細胞移入に使用しうる。
本発明の態様による組成物は、バーコード化ナノ粒子（NP）選別物質と複合体化してバーコード化NP-抗原-MHC複合体を形成している組換え抗原-MHCを含む。バーコード化NP-抗原-MHC複合体は図3Aおよび3Bに模式的に示すようにモジュール形式である。バーコード化NP-抗原-MHC複合体は、ポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメイン（図3Bでは黒色で示されている）によって互いに連結された抗原-MHC複合体とバーコード化NP複合体とで構成されている。バーコード化NP-抗原-MHC複合体がモジュール形式であることにより、特異性を付加するために、そして一緒にアッセイした後に単離および同定することができる異なる複合体の数を増加させるために、バーコード化符号化領域を容易に修飾することが可能になる。ポリヌクレオチド検出タグを形成するバーコード化符号化領域により、各抗原は、独特なnポジションバーコードポリヌクレオチド配列に関連づけられ、これにより、各ポジションにつきn個の配列が可能になる。3ポジションバーコードの一例を、図3Bおよび3Cでは異なる色（黄色、赤色、または緑色）として示す。この3ポジションバーコードでは、33プレックス、すなわち27プレックスの抗原ライブラリーが得られ、27の異なる抗原のそれぞれは、複合体の単離後に容易に決定することのできる特異的バーコードを有することになる。1つのT細胞懸濁液で27の異なる抗原をスクリーニングできることは、現在のもっと時間のかかる方法と比べて、著しい利点である。バーコード化NP-抗原-MHC複合体のモジュール構成要素のそれぞれを以下に詳述する。
ネオ抗原の同定にはインシリコ分析を使用することができる。推定ネオ抗原を同定するためのインシリコ分析には、患者における腫瘍、ウイルス、または細菌のゲノム（DNA）配列またはエクソーム（RNA）配列が必要である。患者に見いだされるウイルスおよび細菌の大半は一人の患者に独特なものではないので、これらの病原体のゲノム配列は公知の場合があり、入手可能な配列データを使用しうる。それでも、未知の（新しい）ウイルスおよび細菌と同定済みのウイルスおよび細菌はどちらも、DNAシークエンシングまたはRNAシークエンシングのために、患者から（例えば血液試料から）単離されうる。
腫瘍がんは患者特異的な突然変異を含むので、患者の腫瘍生検材料または血液試料からの腫瘍細胞のDNAシークエンシングまたはRNAシークエンシングは、最初の工程として実行される。腫瘍ネオ抗原の例を用いると、本発明の態様によれば、患者に特異的な腫瘍ネオ抗原の同定には、患者の腫瘍生検材料または血液試料からの腫瘍細胞のDNAおよび/またはRNAシークエンシングならびにHLAタイピングが含まれる。体細胞突然変異同定（すなわち体細胞突然変異コーリング）のために、対応する正常患者の腫瘍試料または血液試料でのDNAシークエンシングまたはRNAシークエンシングも行われる。次に、集約した腫瘍-正常シークエンシングデータを少なくとも1つの（例えば2つまたは3つの）アルゴリズムプログラム（例えばMuTect v1.1.7、Varscan2 Somatic（V2.3.6）、および/またはGATK-HaplotypeCaller（HC、v3.3））に入力することで、ネオ抗原を発現する（ネオ抗原に対応する）と推定される体細胞突然変異を同定する。本発明のいくつかの態様において、突然変異量（mutation burden）が低い腫瘍を有する患者の場合は、インシリコで同定された体細胞突然変異のすべてを利用して、T細胞スクリーニング用の一組の候補腫瘍ネオ抗原を形成させることができる。あるいは、同定された体細胞突然変異をすべてアッセイしてもよいが、突然変異量が高い腫瘍を有する患者には数多くの体細胞突然変異が同定されうるので、同定された突然変異のすべてをスクリーニングすることは、効率的でないか、必ずしも有効でない場合もありうる。そこで本発明のいくつかの態様では、インシリコで同定された体細胞突然変異をランク付けして、最高ランクの体細胞突然変異は少なくとも3つのアルゴリズムプログラムで観察され、少なくとも2つのアルゴリズムプログラムがそれに続くようにする。扱いやすい数の候補ネオ抗原ペプチドをスクリーニングするために、HLAタイピング用のソフトウェア（例えばATHLATES）を使って、患者のHLAタイプを腫瘍エクソームシークエンシングデータから決定する。患者特異的HLAタイプのためのソフトウェア（例えばNetMHC3.4サーバー）を使って、患者の生検腫瘍試料または血液試料から推定ネオ抗原配列が同定される。
本発明の態様には、コグネイトT細胞と対形成する能力を有する組換え抗原-MHC複合体が含まれる。本明細書において、「抗原複合体」、「抗原-MHC」、「抗原-MHC複合体」、「組換え抗原-MHC複合体」、「ペプチドMHC」、および「p/MHC」は、抗原結合溝にペプチドを持つ組換え主要組織適合遺伝子複合体を指すために相互可換的に使用される。本明細書にいう「抗原」には、患者特異的ネオ抗原を含む任意の抗原が包含される。
本発明の態様による組換え抗原-MHC複合体は組換えMHC分子を含む。本発明のいくつかの態様において、MHC複合体は、CD8陽性（CD8＋）T「キラー」細胞と対形成するMHCクラスI（MHC I）複合体でありうる。本発明の別の態様において、MHC複合体は、CD4＋「ヘルパー」T細胞と対形成するMHCクラスII（MHC II）複合体であってもよい。MHCクラスI複合体によって提示される抗原がサイトゾルタンパク質であるのに対し、MHCクラスII複合体によって提示される抗原は細胞外タンパク質に由来する。腫瘍細胞は突然変異を発現する内因性由来の細胞なので、腫瘍抗原は一般的にはMHCクラスI分子によって提示され、それによってCD8＋ T細胞と対形成する。同様に、ウイルスタンパク質は患者の細胞から内因性に発現され、やはりMHCクラスI分子によってCD8＋ T細胞に提示される。しかし細菌細胞は、自分自身の細胞機構を使ってタンパク質を発現させ、それは、患者における感染後は、外因性に発現すると見なされ、患者のMHCクラスII分子によってCD4＋ Tヘルパー細胞に提示される。MHCクラスIII分子には、他の免疫構成要素、例えば補体成分（例えばC2、C4、B因子）などと、サイトカイン（例えばTNF-a）および熱ショックタンパク質（hsp）をコードするいくつかとが含まれる。
本発明の態様では、患者のHLAタイプに対応するように、組換え抗原MHC複合体のMHC I分子またはMHC II分子が合成される。多型はMHC I分子にもMHC II分子にも見いだされる。MHCクラスI分子は、2本のポリペプチド鎖、すなわちα鎖およびβ2-ミクログロブリン（b2m）鎖で構成されるヘテロ二量体である。α鎖はα1、α2、およびα3を含む3つのドメインを有する。α鎖およびb2m鎖は、b2mとα鎖のα3ドメインとの相互作用によって、非共有結合的に連結される。α鎖は多型であり、HLA遺伝子複合体によってコードされ、一方、b2mサブユニットは多型ではなく、b2m遺伝子によってコードされる。α鎖とb2m鎖との会合は、α1ドメインおよびα2ドメインの表面上の抗原結合溝に負荷された9〜11アミノ酸ペプチド抗原の存在によって安定化される。本発明の態様によれば、患者特異的MHCクラスI抗原が、患者のHLAタイプに対応する組換えMHCクラスI複合体上に提示される。例えばMHC Iα鎖はHLA-A遺伝子、HLA-B遺伝子、またはHLA-C遺伝子によってコードされる。HLA-A遺伝子、HLA-B遺伝子、およびHLA-C遺伝子のそれぞれは、アレル特異的サブタイプを発現するが、その一部を実施例19の表7に示す。
MHCクラスII分子は、2本のポリペプチド鎖、すなわちα鎖およびβ鎖で構成されるヘテロ二量体である。α鎖とb鎖はそれぞれ2つのドメイン、すなわち、それぞれα1およびα2、ならびにβ1およびβ2を有する。α鎖とβ鎖はどちらも多型であり、HLA遺伝子複合体によってコードされる。α鎖とβ鎖の会合はα1ドメインとβ2ドメインの両方の表面に抗原結合溝を形成し、その抗原ペプチド長は11〜30アミノ酸である。本発明の態様によれば、患者特異的MHCクラスII抗原が、患者のHLAタイプに対応する組換えMHCクラスII複合体上に提示される。例えばHLA遺伝子には、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DQ、および、MHCIIα鎖がHLA-A-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DQA2、またはHLA-DRA遺伝子によってコードされ、β鎖がHLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、またはHLA-DRB5遺伝子によってコードされるHLAが含まれる。
本発明のいくつかの態様において、組換えMHC分子は、Novak et al., 1999, J. Clin. Invest.104:R63-R67（この文献の内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているように、発現させて候補抗原ペプチドが負荷されたMHCクラスII分子である。
本発明のいくつかの態様において、組換えMHC分子は、コンディショナルリガンドとして発現するMHCクラスI分子である。MHCクラスI分子はペプチド（すなわち抗原ペプチド）の非存在下では不安定なので、組換えMHCクラスI分子は、UV光を照射すると複合体から解離して崩壊する切断性部分を有するペプチドと共に発現させる。しかし、図3Aに図示し、Toebes et al., 2006, Nat. Med. 12:246-251およびBakker et al., PNAS, 2008, 105:3825-3830（これら両文献の内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているように、切断性ペプチドのUV崩壊を「レスキューペプチド」の存在下で行えば、レスキューペプチドは結合溝中のUV照射されたペプチドと容易に置き換わるであろう。この技術を使えば、T細胞をスクリーニングするためのMHCクラスIネオ抗原ライブラリーを形成させるために、いくつかの会合したMHCクラスI分子に候補ネオ抗原を容易に負荷することができる。
本発明のいくつかの態様において、組換えMHC分子は、それぞれに同じ候補ペプチドが負荷された4つのMHC分子のテトラマー複合体である。大半のネオ抗原はMHCタンパク質に対して低い結合アフィニティー（Kd）（例えば500nM以下）を有するので、テトラマー型MHC複合体は、結合アビディティの増加を可能にし、それにより、存在量の低いコグネイトT細胞との対形成に関して、この抗原-MHCテトラマープローブの感度を増加させる。本発明のいくつかの態様において、MHCテトラマーは、4つのビオチン修飾MHC分子にコンジュゲートされた修飾ストレプトアビジンコンジュゲートを使って形成される。ストレプトアビジンは、ポリヌクレオチド（例えばDNAまたはRNA）リンカーの結合が可能になるように修飾される。ストレプトアビジンの修飾には、ポリヌクレオチド分子に連結された対応コグネイト結合部分と対形成（例えば共有結合）することができる結合部分が含まれる。ストレプトアビジンとポリヌクレオチドとを連結のために修飾するには、任意の適切な結合部分の対を使用することができる。結合部分の対の非限定的な例としては、チオール基（例えばシステイン）とマレイミド、アダマンタンとシクロデキストリン、アミノ基とカルボキシ基、およびアジド基とアルキニル（alkynl）基（すなわちクリックケミストリー）が挙げられる。マレイミド修飾DNAハイブリッド形成ドメインに連結されたシステイン修飾ストレプトアビジン（「DNA標識テトラマー」）の一例を図3Aに示す。
現在、複数の抗原-MHC-T細胞の対形成をスクリーニングすることに伴う課題の1つは、対形成したペプチド抗原に対応するT細胞受容体エピトープの単離および同定である。本発明の態様は、ポリヌクレオチド検出タグ（すなわちバーコード）に連結された修飾ナノ粒子を包含し、ここで、ポリヌクレオチド検出タグは少なくとも1つの符号化領域を含む。この複合体およびこの複合体を使用する方法を、ナノ粒子-バーコード化核酸細胞選別（NP-バーコード化NACS）物質およびナノ粒子選別物質ともいう。いくつかの態様において、ナノ粒子は、磁石を使って単離するために磁性を帯びている。いくつかの態様において、ナノ粒子は重力によって単離される1um〜15umのポリスチレン粒子である。本願の態様によれば、ナノ粒子は、ポリヌクレオチド符号化領域に連結するための結合部分で修飾される。ナノ粒子の修飾には、ポリヌクレオチド分子に連結された対応コグネイト結合部分と対形成（例えば共有結合）することができる結合部分が含まれる。連結のためにナノ粒子とポリヌクレオチド検出タグとを修飾するには、任意の適切な結合部分の対を使用することができる。結合部分の対の非限定的な例としては、チオール基（例えばシステイン）とマレイミド、アダマンタンとシクロデキストリン、アミノ基とカルボキシ基、およびアジド基とアルキニル（alkynl）基が挙げられる。
本発明の態様はバーコード化ナノ粒子複合体を包含し、ここでバーコードは、T細胞単離後の同定のために独特な抗原特異的配列を提供する符号化領域で構成されるポリヌクレオチド検出タグである。本明細書にいう「符号化領域」とは、別のポリヌクレオチドから独立した独特かつ特異的な配列を持つ一組のヌクレオチドである。いくつかの態様において、1つのポリヌクレオチド符号化領域は5〜25個のヌクレオチド塩基対で構成される。いくつかの態様において、1つのポリヌクレオチド符号化領域は、7〜25個のヌクレオチド塩基対、8〜25個のヌクレオチド塩基対、9〜25個のヌクレオチド塩基対、10〜25個のヌクレオチド塩基対、10〜20個のヌクレオチド塩基対、10〜19個のヌクレオチド塩基対、10〜18個のヌクレオチド塩基対、10〜17個のヌクレオチド塩基対、または10〜16個のヌクレオチド塩基対で構成される。いくつかの態様において、バーコード化ナノ粒子複合体は、少なくとも1つの符号化領域（すなわち1ポジションバーコード）を持つポリヌクレオチド検出タグを有する。当業者には理解されるとおり、符号化領域の数（n）は、一緒にスクリーニングした後に同定することができる異なる抗原の数に対応する。インサイチューで符号化領域を分析する場合、異なる符号化領域の数を制限するのは、異なる色の蛍光色素の数だけである。ポリヌクレオチド検出タグの符号解読のために、符号化領域は、ナノ粒子に取り付けられた符号化領域（これを第1の符号化領域または符号化領域1という）から順に、「読取り（read）」が行われる。その後、ナノ粒子から離れる方向に、符号化領域はいずれも、第2の符号化領域（符号化領域2）、続いて第3の符号化領域（符号化領域3）などとなる。ポリヌクレオチド（例えばssDNA）ハイブリッド形成ドメイン（黒色）を伴う3つの符号化領域を有するポリヌクレオチド検出タグに連結されたナノ粒子の例を、「NPバーコードライブラリー」として図3Bに図示する。本発明の態様によれば、バーコード化NP複合体のライブラリーにおいて、各ポリヌクレオチド検出タグ配列は、他のどのポリヌクレオチド検出タグ配列からも独特である。本発明のいくつかの態様では、ある符号化領域配列が2つ以上の検出タグ配列中に見いだされうるが、各符号化領域配列は、1つの符号化領域ポジションにしか現れない。例えば、ssDNAの3ポジション符号化領域ライブラリーは、符号化領域1に符号化領域D1、D2、およびD3を、符号化領域2にD5、D6、およびD7を、そして符号化領域3にD9、D10、およびD11を含み、結果として、図4の表に列挙するとおり、27の異なる検出タグ配列を与える。
本発明の態様によれば、ポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメインは、バーコード化NPのポリヌクレオチド検出タグの3'端に連結され、第2のポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメインは、抗原-MHC複合体のストレプトアビジンスキャフォールドに連結される。したがって、抗原-MHC複合体は、相補的なハイブリッド形成ドメインのハイブリッド形成によって、バーコード化ナノ粒子に連結される。本発明のいくつかの態様において、第1のポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメインおよび第2のポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメインは、それぞれ第1のハイブリッド形成配列および第2のハイブリッド形成配列を有する一本鎖DNA（ssDNA）であり、ここで、第1のハイブリッド形成配列と第2のハイブリッド形成配列とは相補的であって、図3B、図3Cではオーバーラップした黒い線として示されているハイブリッド形成した二本鎖DNA（dsDNA）のリンカーをもたらす。いくつかの態様において、第1のハイブリッド形成ドメインおよび第2のハイブリッド形成ドメインは「普遍的」であり、ライブラリー中のどのバーコード化NP複合体およびどの抗原-MHC複合体についても同じである。普遍的ハイブリッド形成ドメインを使用すれば、ハイブリッド形成ドメインが取り付けられたストレプトアビジン分子を1種類合成すればすむことになる。加えて、制限部位またはUV切断性配列をコードする普遍的ハイブリッド形成ドメインを使用すれば、NP-バーコードから抗原-MHC複合体の迅速な開裂が可能になる。本発明の他の態様では、第1のハイブリッド形成ドメインおよび第2のハイブリッド形成ドメインが、バーコード化NP-抗原-MHC複合体ごとに異なる。
当業者には理解されるとおり、独特な各抗原-MHC複合体は、独特なバーコード配列に連結される（すなわちハイブリッド形成される）。本発明のいくつかの態様において、バーコード化NP-抗原-MHC複合体ライブラリーの調製には、候補抗原とそれぞれの対応バーコード（すなわちポリヌクレオチド検出タグ配列）との記録（例えばキーまたは説明文）が含まれる。この符号化キーは、T細胞と対形成する特異的抗原の効率のよい同定を助ける。図4の候補抗原（患者特異的候補ネオ抗原およびMART-1腫瘍抗原）のリストに関する抗原およびバーコードキーの例を図5A〜5Bに示す。
本発明の態様は、抗原特異的T細胞のスクリーニングに使用するためのバーコード化ナノ粒子-抗原-MHC複合体を包含する。当業者には理解されるとおり、T細胞の存在下で、複合体を使って、単一の抗原をアッセイしてもよい。しかし、1つの候補抗原をアッセイすることは、複数の候補抗原をスクリーニングすることほど効率がよくない。本発明の態様では、異なる候補抗原を、対応する独特な符号化領域と共に使って、異なるバーコード化NP抗原-MHC複合体を調製することで、バーコード化NP-抗原-MHC複合体のライブラリーを形成させる。以下の方法は、バーコード化NP-抗原-MHC複合体のライブラリーを使って説明するが、この方法に従って単一候補抗原のスクリーニングを行うこと、または単一候補抗原のスクリーニングにこの方法を容易に適合させることもできる。
本発明の態様によれば、バーコード化NP-抗原-MHC複合体のライブラリーを使った患者由来の抗原特異的T細胞の単離と同定は、候補抗原複合体を患者由来T細胞と共にインキュベートする工程を含む。いくつかの態様では、患者由来T細胞が、患者の末梢血単核球（PBMC）または腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）から単離される。本発明のいくつかの態様では、抗CD4蛍光抗体および抗CD8蛍光抗体を使って、CD4＋ T細胞とCD8＋ T細胞の両方が標識されると共に、PBMCまたはTILから選別され、CD4＋細胞だけまたはCD8＋細胞だけを単離するには、蛍光活性化細胞選別法（FACS）を使って、CD4＋単独陽性細胞およびCD8＋単独陽性細胞の生細胞集団が選別される。本発明のいくつかの態様では、抗CD3蛍光抗体を使用し、続いてFACSを行うことにより、CD4とCD8の両方について陽性であるT細胞を、単離することができる。当業者は、使用している抗原-MHC複合体の1つまたは複数のタイプに合わせて、単離すべきT細胞のタイプを決定することができる。例えば、ライブラリーがもっぱらMHC I分子で構成されているのであれば、T細胞集団はCD8＋だけでよいが、MCH II分子はCD4＋ T細胞を必要とするだろう。別の態様では、MHC I分子とMHC II分子をどちらも含む抗原ライブラリーを、CD4およびCD8両陽性であるT細胞と共にインキュベートする。さらに別の態様では、MHC I分子またはMHC II分子のどちらかを含む抗原ライブラリーを、CD4およびCD8の両方について陽性であるT細胞でスクリーニングしうる。
本発明の態様は、バーコード化NP-抗原-MHC複合体ライブラリーをCD4＋、CD8＋、またはCD4＋/CD8＋ T細胞の懸濁液と共にインキュベートする工程を含む。ナノ粒子ライブラリーをT細胞懸濁液と共にインキュベートすることにより、ナノ粒子に結合した抗原の、さまざまなT細胞受容体への、完全かつ徹底的な曝露が可能になる。この方法は、細胞を揺動する工程または細胞を回転させる工程を含みうる。抗原複合体とT細胞とのインキュベーション後に、ナノ粒子は選択的に単離または選択的に収集される。例えば、ナノ粒子が磁性を帯びているのであれば、懸濁液への磁石の適用により、複合体中のナノ粒子を抗原と対形成しているT細胞と共に分離し、対形成していないT細胞を除去することが可能になる。対形成したT細胞を持つ単離された磁性ナノ粒子の例を、図6に模式的に示す。あるいは、ナノ粒子がポリスチレンナノ粒子であれば、重力（例えば遠心分離）によって、対形成していないT細胞を分離しうる。対形成していないT細胞の分離後に、いくつかの態様では、非特異的に会合しているT細胞をすべて除去するために、単離されたナノ粒子を少なくとも1回は洗浄する。
ナノ粒子複合体と共に単離された対形成T細胞を分析するために、デバイスの流路中の個々の場所（「トラップ」）に単一細胞を分離し静止させるマイクロ流体デバイスに、細胞を負荷する。
バーコード化ナノ粒子抗原-MHC複合体に関して本明細書にいう「対形成T細胞」および「T細胞と対形成した抗原MHC複合体」とは、バーコード化ナノ粒子抗原-MHC複合体中の抗原ペプチドに結合するT細胞受容体エピトープを有するT細胞の複合体をいう。したがって、細胞捕捉デバイス中で分離された対形成T細胞を使って、対形成した抗原-MHC複合体の符号化領域（バーコード）をインサイチューで同定することで、コグネイトペプチド抗原の配列が決定される。したがって各符号化領域は、符号化領域1から順に、読取りが行われる。符号化領域1について考えうるすべての相補的ポリヌクレオチド配列を識別可能な蛍光色素に連結することで、ナノ粒子上の相補的符号化領域に蛍光をハイブリッド形成させることによって符号化領域1の「読取り」を行う色素-ポリヌクレオチド符号解読因子配列を形成させる。本明細書において「識別可能な蛍光色素」および「識別可能な色素」とは、他の色素とは視覚的に相異なる色の色素をいう。ポリヌクレオチドに連結することができる任意の適切な色素を使用しうる。第2の符号化領域の読取りを行うために、「置換」ポリヌクレオチドを添加することで符号化領域1の色素-ポリヌクレオチド符号解読因子を取り除き、引き続いて、またはそれと一緒に、符号化領域2に対応する考えうる色素-ポリヌクレオチド符号解読因子配列のすべてを添加する。2つ以上の符号化領域の符号解読において、符号化領域1の読取り後は、ポリヌクレオチド検出タグが部分的に符号解読された状態にある。すなわち、「部分的に符号解読されたポリヌクレオチド検出タグ」は、少なくとも1つの符号化領域が符号解読されているが、すべての符号化領域が符号解読されているわけではない。後続の符号化領域は、この読取り-置換/読取り-置換/読取り形式を使って、読取りが行われる。この段階的読出し技術を、図7に図解し示すように、バーコード化粒子を使って検証した。当業者には理解されるとおり、バーコード化ナノ粒子のライブラリー中の符号化領域のこの蛍光読取りの場合、1つの識別可能な蛍光色素は、符号化領域ポジションごとに1つの符号解読因子配列とだけ関連づけることができる。例えば符号化領域2の読取りの場合、赤色蛍光色素は、符号化領域2を符号解読するための特異的符号解読配列のうちの1つだけに対応しうる。本発明のいくつかの態様において、ポリヌクレオチド符号解読因子配列はssDNAまたはRNAである。例えば、図8Aの表に列挙するように、ssDNA符号解読配列M1、M2、M3、M5、M6、M7、M9、M10、およびM11は、D1、D2、D3、D5、D6、D7、D9、D10、およびD11のそれぞれの符号化領域（図4）にハイブリッド形成する蛍光色素連結した符号解読配列であり、各符号解読配列は対応蛍光色素の色で示されている。図8Aの各符号解読配列に対応する（すなわちそれとハイブリッド形成する）置換ssDNA配列の例としては、図8Bの表に列挙するssDNA配列M1 comp、M2 comp、M3 comp、M5 comp、M6 comp、M7 comp、M9 comp、M10 comp、およびM11 compが挙げられる。
本発明のいくつかの態様では、T細胞と対形成した抗原MHC複合体の符号化領域（バーコード）が、蛍光色素-ポリヌクレオチド符号解読「読取り」配列を「置換」ポリヌクレオチド配列と組み合わせて使用することにより、インサイチューで同定される。この方法を、図4に列挙するNPバーコード（検出タグ）配列を有する図5Aの27抗原のバーコード化NP-抗原-MHCライブラリーを使って実行した。患者の腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）に由来するT細胞とのインキュベーション後に、単離された磁性ナノ粒子と会合している細胞を、図9の左側の、10個の細胞トラップを備えたマイクロ流体チャンバーの光学顕微鏡像に示すように、マイクロ流体細胞捕捉デバイスで分離した。示されているように、細胞トラップのうちの9個だけが、単一のバーコード化T細胞を含んでいる。これら9個のバーコード化T細胞の読取りおよび置換を、図8Aおよび図8Bにそれぞれ列挙する蛍光色素連結した符号解読ssDNA配列を使って行った。図9の左から右に向かって各符号化領域の読取りに関する蛍光像を示す。ここでは、符号化領域1の画像には1stと記し、符号化領域2の画像には2ndと記し、符号化領域3には3rdと記している。捕捉された9個の細胞に関する色彩読出し情報を画像の下に記載する（R＝赤色、G＝緑色、Y＝黄色）。位置8の細胞が明瞭な読取りを与えないこと、そして位置9の細胞が欠損していることに注意されたい。本発明の態様によるこの方法を使用する場合、明瞭で疑う余地のない読出しを与える捕捉された細胞だけを考慮することにより、スクリーニングプロセスの忠実度の制御が可能になる。図5のバーコードキーを使って、対応するネオ抗原および腫瘍抗原MART-1が決定された。例えば、図9の位置3の細胞は、図5Aに掲載するネオ抗原12に対応するYRGを示し、位置4の細胞はMART-1腫瘍細胞に対応するRGYを示す。
本発明の態様は、バーコード（ポリヌクレオチド検出タグ）配列、バーコードの読取りを行うための対応する蛍光色素連結ポリヌクレオチド符号解読因子配列、および符号解読因子配列を取り除くための対応する置換ポリヌクレオチド配列を含む、バーコード化ナノ粒子のライブラリーを調製するためのキットを包含する。ポリヌクレオチド配列にはssDNAまたはRNAが含まれる。本発明のいくつかの態様では、ポリヌクレオチド配列がssDNAである。本発明のいくつかの態様では、ポリヌクレオチド検出タグ配列が、それぞれの5'端で、ナノ粒子への取り付けのための結合部分に修飾される。例えば、図4のポリヌクレオチド検出タグ（ssDNAバーコード）配列は、ストレプトアビジン-ナノ粒子への結合のためにビオチン分子にコンジュゲートされているが、任意の適切な結合分部を使用しうる。本明細書に記載するように、また当業者には理解されるとおり、適切な結合部分の対は当技術分野において公知である。結合部分の非限定的な例としては、チオール、マレイミド、アダマンタン、シクロデキストリン、アミン、カルボキシ、アジド、およびアルキンが挙げられる。本発明のいくつかの態様において、キットは、修飾ポリヌクレオチド検出タグ上の結合部分に対応するコグネイト結合部分で修飾された修飾ナノ粒子も含みうる。
本発明のいくつかの態様において、バーコード化ナノ粒子のライブラリーを調製するためのキットは、任意のMHC抗原ペプチドを負荷することができる組換えコンディショナルMHCテトラマー複合体も包含する。MHCは、MHCクラスIまたはMHCクラスIIであることができ、患者のハプロタイプに対応する任意の特異的ハプロタイプを含む。例えばキットは、表7に列挙するHLAタイプに対応するMHCクラスI分子を含みうる。例えばキットは、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DQ、およびMHC IIα鎖がHLA-A-DMA、HLA-DOA、HLA-DPA1、HLA-DQA2、またはHLA-DRA遺伝子によってコードされ、かつβ鎖がHLA-DMB、HLA-DOB、HLA-DPB1、HLA-DQB1、HLA-DQB2、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、またはHLA-DRB5遺伝子によってコードされるHLAに対応するMHCクラスII分子を含みうる。
本発明のいくつかの態様において、バーコード化ナノ粒子のライブラリーを調製するためのキットは、ナノ粒子に取り付けるための修飾ポリヌクレオチド検出タグ配列を含む。捕捉されたバーコード化T細胞を同定するための代替的方法も使用しうる。例えばポリヌクレオチド検出タグ配列を、マイクロ流体デバイスから増幅し、配列決定することができる。
ポリヌクレオチド検出タグを同定し、捕捉されたT細胞と対形成した対応抗原を同定するために、インサイチュー符号解読読出し法を使用することは、T細胞を破壊することも、T細胞に有害な影響を与えることもない。したがって抗原が同定された後に、捕捉されたT細胞を、さらなる分析および/または成長のために、マイクロ流体デバイスから取り出すことができる。
以下の実施例は例示を目的として提示するに過ぎず、本願の範囲および内容を限定するものではない。
実施例1.抗原特異的T細胞の捕獲効率
細胞混合物からのMart-1抗原特異的T細胞の選択的捕獲を使用することにより、バーコード化NP-抗原-MHC複合体ライブラリーを検証した。図10Aに、Mart-1特異的T細胞受容体が形質導入されたJurkat細胞を捕獲するためのNP-Mart-1テトラマーの模式図を示す。図10Bは、混合されたJurkat細胞（緑色に染色）とGBM U87細胞（青色に染色）を示す。NP-Mart-1テトラマーを、この混合細胞集団と共にインキュベートし、図10Cに示す上清および図10Dに示す磁性プルダウンから、細胞と共に磁気的に濃縮する。
実施例2.バーコード化NP-抗原-MHC複合体ライブラリーの使用
NP-抗原-MHC複合体ライブラリーツールを使って、図11に示すように生検の時点で抗PD-1チェックポイント阻害薬治療に陽性に応答している2人の転移性黒色腫がん患者の処置中の腫瘍生検材料から収集された腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）から増殖させたCD8＋細胞を分析した。これら2人の患者は、第I相治験において、抗PD-1抗体ペンブロリズマブで処置された。この治療に対する応答が腫瘍浸潤性CD8＋細胞によって媒介されることは公知である。各患者について、処置前生検材料も収集され（図11）、腫瘍エクソームに関する分析および遺伝子発現に関する分析がどちらも行われた。HLA A*02.01に対する予測Kdに従って順位付けられた推定ネオ抗原のリスト（下記表1〜4）を作成するために、インシリコ分析を実行した。患者ごとに独特なこれらのリストが、上位27の推定ネオ抗原＋MART-1黒色腫抗原（ネオ抗原＃8はNP凝集をもたらすので除外した）を提示するように構築されたNP-バーコード化NACSライブラリーの構築を特徴づけた。患者＃1の場合、ネオ抗原番号3、5、11、26、31、34、36、37、46および48に対応する突然変異型タンパク質の転写産物はゼロ個の突然変異リードを与え（表3）、これらを、サンプリングした範囲のネオ抗原/MHC結合アフィニティーにまたがる対照として、すべてのアッセイに含めた。さらなる分析および/または成長のためにマイクロ流体デバイスから。
（表１）患者＃1に関する推定ネオ抗原。括弧内の文字はネイティブペプチドを示す。
Figure 2018516922
（表２）患者＃2に関する推定ネオ抗原。括弧内の文字はネイティブペプチドを示す。
Figure 2018516922
（表３）患者＃1に関するネオ抗原および変異型遺伝子の完全分析
Figure 2018516922
（表４）患者＃2に関するネオ抗原および変異型遺伝子の完全分析
Figure 2018516922
患者＃1に関して最も強く結合する27のネオ抗原を図5Aに列挙する。患者＃1の場合、対応するNP-バーコード化NACSライブラリーは、CD8＋ TILの4.5〜5％を捕獲し、ライブラリーを同じ患者腫瘍からのCD4＋ T細胞に対して試験することによって判断したところ、非選択的捕獲は0.5％であった（図12）。患者＃1試料の場合、2本の独立した増殖TILバイアルで行われた2回の独立したランでは、バーコード化T細胞をマイクロ流体チップに負荷し、逐次的な蛍光読取りを行うことで、同じ8つのネオ抗原特異的T細胞集団（＋MART-1特異的細胞）が並行して同定された（図13）。どちらのアッセイでも、すべての、ただし存在量の極めて低い集団（1分析あたり1または2インシデント）が検出された。最も豊富な集団はネオ抗原＃12に特異的であり、1000個の増殖TILあたり約12細胞を占めた。患者＃1について、NP-バーコード化NACSライブラリーをさらに拡張して、順位28〜50のネオ抗原（Kd値は最大500nM）に対する特異性に関してTILを分析した。新たに2つの集団が検出された（＃38および＃45）。バーコード化蛍光読出しアプローチの価値は、捕獲された各T細胞について、忠実度の高い読取り、または場合により、意味のない読取り（例えば図9の細胞＃8）のどちらかが得られることである。このように、このアプローチのノイズレベルは極めて低い。検出されたネオ抗原特異的T細胞集団は、3回またはそれ以上の疑う余地のない読取りによって同定されたもの、または患者＃1 TILの両分析において検出されたものと定義される。50要素のライブラリーに関する患者＃1 TILの分析を合わせたものを、図14Bに掲載し、対応する病変分析を図14Aに示す。
実施例3.PBMCにおけるバーコード化NP-抗原-MHC複合体ライブラリーのスクリーニング
いくつかの生物検体を、各NP-バーコード化NACSライブラリー要素を使って特異的T細胞集団を検索する連続的アプローチを使って分析した。ネオ抗原特異的T細胞集団が特に乏しく、蛍光読出しに干渉しうる非結合磁性NPをすべて除去することが困難な場合がある、PBMCの分析には、この方法が最も有用である。このアプローチの非特異的プルダウン率を特徴づけるために、患者＃1用に設計したNP-バーコード化NACSライブラリーを使って、同じ臨床治験に参加しているさらにもう一人の無関係な黒色腫患者からの増殖TIL、および健常ボランティアからのPBMCを分析した。ネオ抗原のリストは患者ごとに独特であるから、患者＃1用に設計されたライブラリーは、これら2つの対照患者試料ではT細胞集団を捕獲しないはずである。両対照の結果は類似していた。図15に示すとおり、患者＃1ネオ抗原ライブラリーは、1ライブラリー要素あたり平均で2つの細胞を捕獲し、標準偏差は1.4であった。したがって、ノイズレベルを5細胞（平均を2標準偏差上回る値）に設定した。上記2つの対照の分析では、5個を上回る細胞を捕獲したライブラリー要素はなく、対照間に相関関係はなかったことから（図15）、患者＃1ライブラリー要素のいずれも本質的に低選択性でないことが示された。患者＃2用のNP-バーコード化NACSライブラリーに5細胞カットオフを使用したところ、当該患者のTILの連続分析は、図16に示すように、患者＃1のTILの対応する分析で見いだされたものと類似する数のネオ抗原特異的T細胞集団を与えた。
実施例4.マルチプレックスフロー分析との比較
両患者のTILの分析により、類似する患者試料のマルチプレックスフロー分析を使って報告されたものより、多くのネオ抗原特異的T細胞集団が明らかになった。増殖した患者＃1 TILを、Andersen et al., 2012, Nat. Protocol, 7:891-902（この文献の内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているように、マルチプレックスフロー法を使って分析した。この分析のために、推定ネオ抗原1〜8、12、14、15、19、27およびMart-1（このうちの8つはNP-バーコード化NACSを使って検出されたものである）を提示する14要素のテトラマーライブラリーを調製した。ネオ抗原＃12に特異的なT細胞だけが、2色のみ、かつ＞10細胞で検出された（図17）。これは、NP-バーコード化NACS法によって分析した場合に、TILに見いだされる最も豊富な集団であった。しかし、他のネオ抗原、例えば＃7、＃19、＃27およびMart-1に関する結果は曖昧である。これは、フローデータでは個々の細胞を解析できないという事実によるが、本発明の態様による本発明のNP-NACS技術では、それが可能になっている。
実施例5.患者＃1からのPMBCを用いた分析
NP-バーコード化NACS法は感度が高いので、患者＃1からの末梢血を、ネオ抗原特異的T細胞集団について分析することにした。増殖に付随する可能性がある集団バイアスを避けるために、これらのT細胞はインビトロでの増殖を行わなかった。この血液分析では、全50要素のネオ抗原ライブラリーを使って、4つの時点で収集したPBMCを調べた。2つの時点（187日目および208日目、図11）は、治療に対する応答中、腫瘍が退縮している時に収集され、TILを収集した腫瘍生検の日（187日目）と密接に対応した。これら2つのPBMC試料では、ネオ抗原特異的T細胞レベルはTILに見いだされるものより低かったが（全CD8＋ T細胞の1％対7％）、いくつかの集団が＞0.05％のレベルで陽性に検出された。大半の集団はTILから検出されたものと一致し、新たに2つの集団（ネオ抗原#15および＃33に特異的なもの）が同定された。439日目におけるPBMCの分析で検出されたネオ抗原特異的集団は図18に示すようにゼロだった。
41日目のPBMCは、エクソームおよびトランスクリプトームの測定を行った生検材料に近い時点に対応するが、患者＃1にとっては応答前の疑似増悪期間中の時点にも対応する（図11）。この初期時点ではT細胞が観察され、それらの集団は、腫瘍が消失しつつある後の時点と比較して、実質的に多数存在した（CD8＋ PBMCの約2％）。187日目および208日目に検出されたものと同じ集団は、追加の集団と共に、41日目にも検出された。
PBMCから検出されたネオ抗原特異的T細胞集団のいくつかは、比較的弱い（Kd＞100nM）ネオ抗原/MHC結合アフィニティーに対応する。処置前のトランスクリプトーム分析で得られた突然変異型タンパク質に関連するmRNAからの突然変異含有リード数を図14の一番下のグラフに掲載する。弱く結合するネオ抗原に特異的なT細胞集団の出現と、対応する突然変異型タンパク質の発現レベルとの間には、際立った対応がある。例えば、mRNA発現レベルによってランク付けした上位12個のネオ抗原のうちの8個が検出された（表3）。さらに、対応するmRNAレベルがゼロと測定されたパネル中の10個のネオ抗原の場合、検出されたいずれかの集団と関連づけられたのは、強く結合するネオ抗原＃5だけであった（TILおよび41日目のPBMC）。
実施例6.捕獲されたT細胞は破壊されない。
NP-バーコード化NACS法の利点は、このプロセスが非破壊的であり、抗原特異性が明らかになった単一T細胞が、マイクロ流体デバイスで個別に単離され、TCRαおよびβ遺伝子シークエンシングを含むさらなる分析に利用できることである。この目的のために、バーコード化ネオ抗原特異性の能力の証明および検証として、患者＃1からの単一T細胞から、対形成したTCRαおよびTCRβ遺伝子をクローニングした。CD8＋ T細胞が、単一マイクロ流体捕捉デバイス（図19A、19B）で捕獲され、ネオ抗原の実体を同定するためにバーコード化された（図20A）。捕獲された単一T細胞を打ち抜いて、TCRαおよびβ遺伝子配列を得るためのRT-PCRを行った。そのTCRを発現するように形質導入されたJurkat細胞は、コグネイトネオ抗原テトラマーに結合することがわかった（図20B）。
抗PD1治療に応答する免疫治療患者の2つの腫瘍から収集されたT細胞を解析すると、上位50の予想ネオ抗原の20％前後が、腫瘍中のCD8＋ T細胞の大きな部分（HLA A*02.01の場合、約7％）を占めることが明らかである。ここで分析した2人の患者はそれぞれ6つのHLA遺伝子型を発現する。さらなるHLA遺伝子型の実際の表現は、まだ試験する必要があるが、これらの患者腫瘍内のCD8＋ TILの40％以上がネオ抗原特異的であることが暗示される。この数は、代替的分析法を使って推測されてきたものより有意に高く、抗PD-1がん免疫治療における主要エフェクターとしてのネオ抗原特異的T細胞集団の重要性を強く浮き彫りにしている。第2の知見は、測定されたネオ抗原特異的T細胞集団のスペクトルが推定ネオ抗原の予想順位とは弱い相関しかないことである。ただし、mRNA発現レベルとの追加の相関関係が、特に、弱く結合するネオ抗原では見いだされた。第3の知見は、腫瘍に検出されたものと同じネオ抗原特異的集団が、全CD8＋ PBMCに対して低い相対的存在量ではあるが、血液にも検出されることである。ここに報告する患者＃1に関する分析では、実際の腫瘍退縮が従来の方法で（インビボイメージングにより）臨床的に計測されるより丸2ヶ月早く、これらの集団が検出される。
実施例7.患者、処置および検体収集
ペンブロリズマブの第1相治験に参加していて、HLA-A*02:01陽性であること、十分なベースライン生検材料および処置中の生検材料があること、ならびに客観的腫瘍応答を呈することにより、転移性黒色腫を持つ患者を、本分析のために選択した。患者＃1および患者＃2には、3週間ごとに10mg/kgの単剤ペンブロリズマブを静脈内投与した（10Q3W）。腫瘍応答は12週目から評価を開始し、最初の応答の4週間後に確認し、その後、12週間ごとに撮像した。固形腫瘍の応答評価基準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors）（RECIST）および免疫関連応答基準（immune-related response criteria）（irRC）の両方によって応答を特徴づけた。腫瘍生検材料および末梢血細胞の収集および分析は、UCLA IRB 11-001918および11-003066によって承認された。分析対象患者からの腫瘍生検材料は、ベースライン時および治療中に取得して加工し、1つのアリコートは病理学的分析のために直ちにホルマリンで固定した後、パラフィン包埋し、第2のアリコートは遺伝子分析のために液体窒素に直ちに浸漬することによって急速凍結し、第3のアリコートは新鮮時に滅菌条件下で細かく刻んだ後、DNAse/コラゲナーゼ消化を行うことで、単一細胞懸濁液（s.c.s）を作製してから、冷凍保存した。末梢血単核球（PBMC）は、Ficoll-Paque密度勾配遠心分離によって新鮮全血から調製し、凍結保存した。
実施例8. TILの単離および増殖
腫瘍浸潤性リンパ球を抗CD3抗体（OKT3、50ng/mL、48時間曝露）およびIL-2（300IU/mL）を使って凍結保存s.c.sから増殖し、2〜4週間後に5×106細胞/mLで再び冷凍保存した。使用する日の朝にTILを融解してDNAseで45分間処置し、CD4に対する抗体（BV510、BioLegend、カリフォルニア州サンディエゴ）およびCD8＋に対する抗体（BV605、BioLegend, カリフォルニア州サンディエゴ）で染色した。FACSセルソーター（BD Biosciences、カリフォルニア州サンホゼ）を使って、CD4およびCD8＋単独陽性細胞の生細胞（7AAD陰性）集団を選別した。
実施例9.全エクソームシークエンシング（WES）、突然変異コーリングおよびHLAタイピング
急速凍結腫瘍生検材料からDNAとRNAの両方を同時に抽出した（Qiagen AllPrepキット）。腫瘍および対応する正常血液試料からのDNAは、UCLA Clinical Microarray Coreで配列決定された。65MbのゲノムをターゲットとするNimblegen SeqCap EZ Human Exome Library v3.0（Roche）を使ったエクソンキャプチャー後に、HiSeq 2000プラットフォーム（Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ）でペアエンド2×100bpシークエンシングを実行した。シークエンシングにより、1試料あたり60億〜100億個のリードが生成し、各ターゲット塩基は、平均90〜150個のリードによってカバーされた。BWA-memアルゴリズム（v0.7.9）を使って配列をUCSC hg19ヒトゲノムリファレンスにアライメントした。前処理は、重複配列の除去（duplicate removal）（Picard Tools）、インデル・リアライメント（indel realignment）、およびベースクオリティスコアの再較正（base quality score recalibration）を含めて、GATK Best Practices Workflow v3に従った。体細胞突然変異は、1の変法により、MuTect（v1.1.7）2、Varscan2 Somatic（v2.3.6）3、およびGATK-HaplotypeCaller（HC、v3.3）を使って、コールした。高信頼度の突然変異だけを残し、それを、3つのプログラムのうちの少なくとも2つによって同定されたものと規定した。GATK-HCでは、腫瘍/正常ペア間の片側フィッシャー正確確率検定（P値カットオフ≦0.01）を使って、体細胞変異体が決定された。変異体にはOncotator4によって注釈を付けた。非同義突然変異は、ナンセンス（Nonsense）、ミスセンス（Missense）、スプライス部位（Splice_Site）、またはノンストップ（Nonstop）突然変異、ならびに挿入/欠失を改変するフレームシフト（Frame_Shift）、インフレーム（In_Frame）、またはスタートコドン（Start_Codon）と分類されるものである。HLAタイピングは全エクソームシークエンシングデータからATHLATESによって行われた。
実施例10. RNAシークエンシング
IlluminaTruSeq RNA試料調製キットを製造者の説明書に従って使用することによって調製した100bpペアエンドライブラリーに対して、RNAシークエンシングを、Illumina HiSeq 2500プラットフォームを使って行った。TopHat2 v2.0,5を使ってリードをhg19にマッピングし、幾何正規化法を使ってライブラリーサイズ（100万マッピングフラグメントあたりの、エキソン1キロベースのリード数（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped、FPKM））によって、正規化された発現量の表を作成するために、Cufflinks v2.2.16プログラムおよびCuffNormを使って定量し、正規化した。突然変異含有RNAリードは、Biopythonおよびpysamパッケージを利用してカスタムPython（v2.7.3）スクリプトによって同定し、Integrated Genomics Viewer（IGV）での目視検査によって検証した。
実施例11.ペプチドのHLA結合の予測およびネオ抗原候補の同定
HLA-A02:01に対するペプチド結合の予測を、各非同義アミノ酸改変突然変異前後のスライディングウィンドウ中の9マーおよび10マーのペプチドについてnetMHC3.47によって生成した（ペプチド配列はEnsembl GRCh37リリース74から得た）。候補ペプチドを、1）RNA-seqによって同定された突然変異含有リードを持つもの、2）RNA発現量（FPKM＞0）はあるが、同定されていない突然変異型リード、および3）検出可能なRNA-seq発現がない他のすべて、によってビニングした。各ビン内でHLA結合アフィニティーによってペプチドをランク付けし、選別した。
実施例12. ssDNA-SACコンジュゲートの生産
Kwong et al., 2009, J. Am. Chem Soc., 131:9695-9703（この文献の内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている既報のプロトコールに従って、ssDNA-SAC（ストレプトアビジン抗原複合体）コンジュゲートを生産した。簡単に述べると、まず、Sano et al., 1990, PNAS, 87:142-146（この文献の内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているように、SAC遺伝子を含有するpTSA-Cプラスミド（Addgene）から、SACを発現させた。DNAへのコンジュゲーション前に、zeba脱塩カラム（Pierce）を使って、SAC（1mg/ml）を、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP、5mM）を含有するPBSに緩衝液交換した。次に、DMF中のMHPH（3-N-マレイミド-6-ヒドラジニウムピリジン塩酸塩、100mM、Solulink）を300:1のモル過剰量でSACに加えた。その一方で、DMF中のSFB（4-ホルミル安息香酸スクシンイミジル、100mM、Solulink）を5'-アミン修飾ssDNA（500uM）
Figure 2018516922
に40:1のモル比で加えた。室温で4時間反応させた後、MHPH標識SACおよびSFB標識DNAを、クエン酸緩衝液（citrated）（50mMクエン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH6.0）に緩衝液交換してから、20:1のDNA対SAC比で混合して、室温で終夜反応させた。Superdex 200ゲル濾過カラム（GE health）を使ってDNA-SACコンジュゲートを精製し、10K MWCO限外濾過フィルタ（Millipore）で濃縮した。
実施例13.ヒトMHCクラスIネオ抗原ライブラリー構築
Rodenko et al., 2006, Nat. Protoc. 1:1120-1132（この文献の内容はすべて参照により本明細書に組み入れられる）に記載のUV媒介ペプチド交換法を使ってMHCライブラリーを生成させた。光不安定ペプチドKILGFVFJVおよび他のネオ抗原ペプチドは、標準的な自動Fmocペプチド合成法で合成した（J、すなわち（S）-3-（Fmoc-アミノ）-3-（2-ニトロフェニル）プロピオン酸は、光不安定アミノ酸残基である）。ヒトMHCクラスI重鎖およびヒトb2mをコードするプラスミドを含有する細菌株は、Ton N M Schumacherの厚意で寄贈された。MHC光不安定タンパク質は、MHC重鎖封入体、b2m封入体および光不安定ペプチドから、既報のプロトコール11に従ってフォールディングされ、次にBirAビオチンリガーゼを使ってビオチン化された。MHC光不安定タンパク質（0.5uM）とネオ抗原ペプチド（50uM）との混合物を365nmのUV光に1時間曝露することにより、MHCネオ抗原ライブラリーを生成させた。
実施例14. NP MHCネオ抗原ライブラリー構築
ストレプトアビジン磁性NP（1um、ThermoFisher scientific）をビオチン-DNAと1:20の比で混合することにより、NP-DNAを得た。磁性NPを3回洗浄することによって過剰のDNAを除去した。並行して、MHCネオ抗原ライブラリーをssDNA-SACに4:1の比で加えることで、DNA-MHCテトラマーを形成させた。（DNA比で）等量のNP-DNAとDNA-MHCテトラマーとを37℃で30分ハイブリッド形成させることにより、NP MHCネオ抗原ライブラリーを生成させた。
実施例15.細胞捕捉マイクロ流体デバイスの製作
まず、SU-8 2025フォトレジストを使って細胞トラップ（多重トラップまたは単一トラップ）を持つマスター型を調製した。次に、Sylgard 184（A:B＝10:1）を使って型に注入し、脱気し、80℃で2時間硬化させた。一方、PDMSの薄層をガラススライド上に2000rpm/分でスピンコーティングし、80℃で1時間硬化させた。PDMSデバイスとPDMS被覆ガラスとをO2プラズマで1分間処理し、1つに結合することで、最終的な細胞捕捉マイクロ流体デバイスを得た。
実施例16. TILプルダウンおよびバーコード
NP MHCネオ抗原ライブラリーをCD8＋ヒトT細胞に室温で30分加えた。NP結合T細胞を磁気的に濃縮し、PBSで洗浄することで、非特異的に沈降したT細胞をすべて除去した。次に細胞をトランスウェルポリカーボネート膜（5umポア）に負荷することで、遊離NPを除去した。次に、細胞を細胞捕捉マイクロ流体デバイスに負荷し、逐次的にバーコード化した。まず、3つの異なるDNA色素（cy3、cy5およびAlex488）をデバイスに負荷して、NP上のDNAと37℃で15分、ハイブリッド形成させた。手早く洗浄した後、1ラウンド目のバーコードを得るために、蛍光像を撮影した。置換DNAをデバイスに37℃で15分間加えて、1ラウンド目のDNA色素を除去した。同様の手順を使って、2回目および3回目のバーコード化像を得た。
実施例17. PBMCからのCD8＋ T細胞プルダウン
CD8＋ T細胞をPBMCからFACSによって選別した。次に、CD8＋ T細胞（10K）をカルセインAM（ThermoFisher）で染色し、各々のNP-NACSライブラリーと共に、室温で30分間インキュベートした。ネオ抗原特異的細胞を磁石プルダウンによって濃縮した。上清中の捕獲されていないT細胞を収集して、別のNP-NACSライブラリー要素と共にさらにインキュベートした。濃縮されたT細胞をPBSで1回洗浄して非特異的細胞プルダウンをすべて除去した。次に、細胞を細胞血球計に負荷した。血球計チップの全領域を撮像することで、総プルダウン細胞数を得た。健常ドナーPBMCおよび無関係な男性黒色腫細胞からのPBMCを、バックグラウンドを得るための対照として使用した。
実施例18.単一細胞TCRクローニング
単一細胞トラップを持つマイクロ流体デバイスにおいてネオ抗原特異的T細胞を捕捉した（図19A〜19B）。次にPDMSパンチャーによって細胞を回収した。簡単に述べると、超音波処理を適用して、打ち抜いたPDMSから細胞溶解緩衝液（10mM Trisトリス、pH＝8、1U/ul RNAseインヒビター含有、Promega）へと細胞を遊離させた。OneStep RT PCRキット（Qiagen）をTRAV遺伝子セグメントおよびTRBV遺伝子セグメント（表5〜6）に結合するマルチプレックス化フォワードプライマーならびに
Figure 2018516922
に結合するリバースプライマーと共に使って、再編成されたVαおよびVβドメイン遺伝子を、単一細胞からクローニングした。cDNA産物を、ユニバーサルプライマーセット
Figure 2018516922
による第2セミネステッド増幅のテンプレートとして使用した。VαおよびVβ cDNAを配列決定し、マルチプレックスPCRによって導入されたミスプライミングアーチファクトを補正するために、単一TRAV/TRBVフォワードプライマーを使って再増幅した。PCRアセンブリにより、機能的試験のためのレトロウイルスベクターを構築した。VαおよびVβドメイン遺伝子を、ヒト成長ホルモン（HGH）シグナルペプチド、TCRアルファおよびTCRベータ鎖の定常領域、ならびに2Aリボソームスキップ配列と共にアセンブルした後、制限酵素で消化し、MSCVベースの非複製レトロウイルスバックボーンにライゲートした。
（表５）単一細胞TCRαクローニングプライマー
Figure 2018516922
Figure 2018516922
（表６）単一細胞TCRβクローニングプライマー
Figure 2018516922
Figure 2018516922
レトロウイルスを生産するために、HEK-293T/17細胞に、リン酸カルシウム沈殿法によって、TCRベクター、gag-polをコードするパッケージングベクター、およびRD114エンベロープ糖タンパク質をコードするシュードタイピングベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に培地を交換し、トランスフェクションの48時間後にウイルス上清を収集した。等量のウイルス上清を、RPMIベースの培地中のJurkat T細胞（最終密度: 0.5×106細胞/mL）に加え、ポリブレンを最終濃度が5μg/mLになるように加えた。細胞を、1350×g、30℃で90分間、スピンフェクト（spinfect）し、次に、ウイルスと共に37℃、5％CO2で終夜、インキュベートした。感染の24時間後に培地の半分を置き換え、感染の48時間後に、コグネイト蛍光ペプチド-MHCテトラマーを使用し、フローサイトメトリーによって、TCR特異性をアッセイした。
実施例19. MHC I HLAサブタイプ
（表７）MHC I HLAアレルサブタイプ
Figure 2018516922
一定の例示的態様に関して本発明を例証し、説明したが、添付の特許請求の範囲に規定する本発明の要旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更および改変を上記の態様に加えうることは、当業者には理解されるであろう。

Claims (20)

  1. ナノ粒子;
    少なくとも1つの符号化領域を有し、該ナノ粒子にコンジュゲートされているポリヌクレオチド検出タグ;および
    該ポリヌクレオチド検出タグにコンジュゲートされている第1のポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメイン
    を含むナノ粒子選別物質と、
    修飾ストレプトアビジンタンパク質;
    それぞれが独立して該修飾ストレプトアビジンタンパク質にコンジュゲートされている4つのビオチン修飾主要組織適合遺伝子複合体（MHC）タンパク質;
    該ビオチン修飾MHCタンパク質に結合している抗原ペプチド;および
    第1のポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメインとは異なり、かつ該修飾ストレプトアビジンタンパク質にコンジュゲートされている、第2のポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメイン
    を含むペプチド負荷ストレプトアビジンMHCテトラマーと
    を含む抗原複合体であって、該ナノ粒子選別物質が、第2のポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメインへの第1のポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメインのハイブリッド形成によって、該ペプチド負荷ストレプトアビジンMHCテトラマーに連結されている、抗原複合体。
  2. 修飾ストレプトアビジンタンパク質が、システイン、チオール基、マレイミド基、アダマンタン基、シクロデキストリン基、アミン基、カルボキシ基、アジド基、およびアルキン基からなる群より選択される結合部分で修飾されている、請求項1記載の抗原複合体。
  3. 修飾ストレプトアビジンタンパク質がシステインで修飾されている、請求項1記載の抗原複合体。
  4. 第2のポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメインが、システイン、チオール基、マレイミド基、アダマンタン基、シクロデキストリン基、アミン基、カルボキシ基、アジド基、およびアルキン基からなる群より選択される結合部分で修飾されている、請求項1記載の抗原複合体。
  5. 第2のポリヌクレオチドハイブリッド形成ドメインがマレイミドで修飾されている、請求項1記載の抗原複合体。
  6. ナノ粒子が磁性ナノ粒子またはポリスチレンナノ粒子である、請求項1記載の抗原複合体。
  7. ポリヌクレオチド検出タグの前記少なくとも1つの符号化領域が、少なくとも3つの異なる符号化領域を含む、請求項1記載の抗原複合体。
  8. ナノ粒子が、ストレプトアビジン、ビオチン、システイン、チオール基、マレイミド基、アダマンタン基、シクロデキストリン基、アミン基、カルボキシ基、アジド基、およびアルキン基からなる群より選択される結合部分で修飾されている、請求項1記載の抗原複合体。
  9. ナノ粒子がストレプトアビジンで修飾されており、かつポリヌクレオチド検出タグがビオチンで修飾されている、請求項1記載の抗原複合体。
  10. 抗原ペプチドが、腫瘍抗原、腫瘍ネオ抗原、ウイルス抗原、リン酸抗原（phosphoantigen）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の抗原複合体。
  11. 複数の請求項1記載の抗原複合体を含み、該抗原複合体のそれぞれが、該複数の抗原複合体中の他のどの抗原複合体とも異なる抗原ペプチドおよび異なるポリヌクレオチド検出タグを有する、抗原複合体のライブラリー。
  12. 少なくとも1つの符号化領域を含み、ナノ粒子にコンジュゲートされているポリヌクレオチド検出タグ;および
    該ポリヌクレオチド検出タグの該少なくとも1つの符号化領域にハイブリッド形成する能力を有する符号解読ポリヌクレオチド
    を含む、ネオ抗原特異的T細胞を検出するためのキット。
  13. 符号解読ポリヌクレオチドが標識符号解読ポリヌクレオチドであり、キットが、該符号解読ポリヌクレオチドにハイブリッド形成する能力を有する置換ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項12記載のキット。
  14. 修飾ストレプトアビジンタンパク質と;
    それぞれが独立して該修飾ストレプトアビジンタンパク質にコンジュゲートされている4つのビオチン修飾主要組織適合遺伝子複合体（MHC）タンパク質と;
    該ビオチン修飾MHCタンパク質に結合している抗原ペプチドと
    を含むペプチド負荷ストレプトアビジンMHCテトラマーをさらに含む、請求項12記載のキット。
  15. 標識符号解読ポリヌクレオチドが、識別可能な蛍光色素にコンジュゲートされているヌクレオチド配列を含む、請求項13記載のキット。
  16. 対象中の腫瘍に対するネオ抗原特異的T細胞を単離するための方法であって、
    主要組織適合遺伝子複合体（MHC）結合アルゴリズムを使って該腫瘍に関する候補T細胞エピトープを同定する工程;
    該候補T細胞エピトープに対応する抗原ペプチドを合成する工程;
    該抗原ペプチドを使って請求項11記載の抗原複合体のライブラリーを調製する工程;
    該抗原複合体のライブラリーを該対象からのTILまたはPBMCと共にインキュベートする工程;および
    該抗原複合体のライブラリー中のいずれかの抗原複合体のいずれかの抗原ペプチドと対形成したT細胞を含む対形成T細胞を、対形成していないT細胞から分離する工程
    を含む、方法。
  17. 候補T細胞エピトープを同定する工程が、前記腫瘍のゲノム配列またはエクソーム配列を取得する工程を含む、請求項16記載の方法。
  18. 前記対形成T細胞をマイクロ流体デバイスに添加して、該対形成T細胞を個々の対形成T細胞に分離する工程;および
    各々の対形成T細胞の抗原複合体のポリヌクレオチド検出タグの前記少なくとも1つの符号化領域の配列を検出する工程
    をさらに含む、請求項16記載の方法。
  19. 各々の対形成T細胞の抗原複合体のポリヌクレオチド検出タグの前記少なくとも1つの符号化領域の配列を検出する工程が、
    各々の対形成T細胞のポリヌクレオチド検出タグを、少なくとも2種の標識符号解読ポリヌクレオチドと共にインキュベートする工程;および
    ハイブリッド形成した標識符号解読ポリヌクレオチドの存在を検出し、それによって該ポリヌクレオチド検出タグの該少なくとも1つの符号化領域の配列を決定する工程
    を含む、請求項18記載の方法。
  20. 抗原複合体のポリヌクレオチド検出タグの前記少なくとも1つの符号化領域が、少なくとも2つの符号化領域を含み、かつ各々の対形成T細胞の抗原複合体のポリヌクレオチド検出タグの該少なくとも2つの符号化領域の配列を検出する工程が、
    各々の対形成T細胞のポリヌクレオチド検出タグを少なくとも2種の第1の標識符号解読ポリヌクレオチドと共にインキュベートする工程;
    1種または複数種の第1のハイブリッド形成した標識符号解読ポリヌクレオチドの存在を検出し、それによって該ポリヌクレオチド検出タグの該少なくとも2つの符号化領域のうちの第1の符号化領域の配列を決定する工程;
    該1種または複数種の第1のハイブリッド形成した標識符号解読ポリヌクレオチドを1種または複数種の置換ポリヌクレオチドと共にインキュベートして、第1の標識符号解読ポリヌクレオチドを第1のハイブリッド形成した標識符号解読ポリヌクレオチドから取り除き、部分的に符号解読されたポリヌクレオチド検出タグを得る工程;
    該部分的に符号解読されたポリヌクレオチド検出タグを1種または複数種の第2の標識符号解読ポリヌクレオチドと共にインキュベートする工程:および
    第2のハイブリッド形成した標識符号解読ポリヌクレオチドの存在を検出し、それによって各々の対形成T細胞の該抗原複合体の該ポリヌクレオチド検出タグの該少なくとも2つの符号化領域のうちの第2の符号化領域の配列を決定する工程
    を含む、請求項18記載の方法。
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