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DE10117858A1 - MHC-Tetramere - Google Patents

MHC-Tetramere

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DE10117858A1
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DE
Germany
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mhc
protein
dsred
fusion protein
tetramer
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Withdrawn
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DE10117858A
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Markus Neumann
Volker Erfle
Horst Wolff
Dirk Busch
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Erfle Volker Prof Priv Doz Dr 81679 Muenchen
Original Assignee
Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
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Abstract

Die Erfindung betrifft MHC-Tetramer-Fusionsproteine, MHC-Monomer-Fusionsproteine, DNA, die für ein MHC-Fusionsprotein kodiert sowie RNA, die nach Transkription ein MHC-Monomer-Fusionsprotein ergibt. Die Erfindung offenbart weiterhin die Verwendung eines DsRed-Proteins als Mittel zur Tetramerisierung von MHC-Molekülen, Verfahren zur Herstellung von MHC und DsRed enthaltenden Fusionsproteinen und Verfahren zur Herstellung von MHC-Tetrameren. Die Erfindung beschreibt weiterhin Verfahren zur Untersuchung einer Antigen-spezifisch zellulären Immunantwort, insbesondere zum Nachweis von T-Lymphozyten, die spezifische T-Zell-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche tragen, Verwendungen der erfindungsgemäß hergestellten MHC-Monomere und -Tetramere sowie Testsysteme, die die MHC-Monomere oder MHC-Tetramere der Erfindung enthalten.

Description

Die Erfindung betrifft MHC-Tetramer-Fusionsproteine, MHC-Monomer-Fusionsproteine, DNA, die für ein MHC-Fusionsprotein kodiert sowie RNA, die nach Transkription ein MHC- Monomer-Fusionsprotein ergibt. Die Erfindung offenbart weiterhin die Verwendung eines DsRed-Proteins als Mittel zur Tetramerisierung von MHC-Molekülen, Verfahren zur Her­ stellung von MHC und DsRed enthaltenden Fusionsproteinen und Verfahren zur Herstellung von MHC-Tetrameren. Die Erfindung beschreibt weiterhin Verfahren zur Untersuchung einer Antigen-spezifischen zellulären Immunantwort, insbesondere zum Nachweis von T- Lymphozyten, die spezifische T-Zell-Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche tragen, Verwen­ dungen der erfindungsgemäß hergestellten MHC-Monomere und -Tetramere sowie Testsy­ steme, die die MHC-Monomere oder MHC-Tetramere der Erfindung enthalten.
Das zelluläre Immunsystem erkennt Antigenstrukturen über Vermittlung durch Oberflächen­ moleküle des "Major Histocompatibility Complex " (MHC). Antigen-präsentierende Zellen (APC) bereiten Antigene zu kurzen Peptiden auf, die nach Bindung in einer speziellen Pepid- Bindungsgrube des MHC-Moleküls präsentiert werden und so von T-Zellen erkannt werden können. Die spezifische Erkennung des Epitops (Peptidfragmentes) durch den T-Zell- Rezeptor (TCR) erfordert dabei die gleichzeitige Interaktion mit dem MHC Molekül ("MHC- Restriktion").
Die Bindung von MHC/Peptid Komplexen am TCR ist durch eine sehr niedrige Affinität cha­ rakterisiert, insbesondere durch eine sehr schnelle Dissoziation (Koff) des MHC vom TCR. Von daher ist es nicht möglich, T-Zellen direkt über die Verwendung einer löslichen Form des natürlichen Liganden (z. B. als Fluoreszenz-markierten MHC/Peptid Komplex) in Abhän­ gigkeit ihrer Epitop-Spezifität zu markieren. Durch die Multimerisierung von MHC/Peptid Komplexen zu z. B. MHC-Tetrameren ließ sich zeigen, daß die relative Avidität der Epitop­ spezifischen Bindung an der T-Zell-Oberfläche soweit erhöht werden kann, daß eine spezifi­ sche T-Zell-Markierung ermöglicht wird. Hierzu werden lösliche MHC-Moleküle in vitro generiert, spezifisch biotinyliert und über Fluoreszenz-markiertes Streptavidin multimerisiert.
Mit Hilfe solcher Reagentien kann die antigen-spezifische zelluläre Immunantwort im Tier­ modell und direkt am Menschen sehr genau untersucht werden.
Die Herstellung von MHC-Tetramer-Reagenzien involviert eine Reihe komplexer biochemi­ scher Reaktionen, wobei rekombinant exprimierte Proteine i. d. R. nach der Denaturierung korrekt in vitro gefaltet, biotinyliert und anschließend im richtigen molaren Verhältnis zur Tetramerbildung gebracht werden müssen.
Gegenwärtig werden die meisten MHC-Tetramer-Reagenzien über ein sehr komplexes und aufwendiges Verfahren hergestellt. Zunächst werden MHC-Komponenten als rekombinante Proteine in E. coli exprimiert und aus inclusion bodies aufgereinigt. Nach Harnstoffdenaturie­ rung werden die MHC-Anteile in der Gegenwart von hohen Peptid/Epitop-Konzentrationen durch Verdünnung in einem Arginin-reichen Puffer mit Glutathion-Redoxsystem gefaltet und isoliert. In einem weiteren Schritt wird das rekombinante MHC biotinyliert und nach erneuter Aufreinigung über Streptavidin multimerisiert. Das für die Multimerisierung verwendete Streptavidin ist für den späteren optischen Nachweis mit Phycoerythrin markiert. Diese Fluo­ reszenz-gekoppelten MHC-Multimer Reagenzien können mit komplexen T-Zellgemischen inkubiert und so selektiv die MHC/Peptid-spezifischen Zellen innerhalb der Gesamtpopulati­ on (z. B. per FACS-Analyse) bestimmt werden.
Die bestehende Technik der Herstellung von MHC-Multimer Reagenzien ist sehr aufwendig, empfindlich (z. B. die Effizienz der Biotinylierungsreaktion) und kostenintensiv. Eine Verein­ fachung des Herstellungsverfahrens würde den breiteren Einsatz dieser Methodik in der Grundlagenforschung wie auch im klinisch-diagnostischen Bereich wesentlich beschleunigen.
Es ist damit eine Aufgabe der Erfindung ein neues Mittel bereitzustellen, welches die Tetra­ merisierung von MHC-Molekülen verbessert und die oben dargestellten Nachteile vermeidet.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das in Anspruch 1 näher beschriebene MHC- Tetramerisierungsmittel gelöst. Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie den weiteren, unabhängigen Ansprüchen.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand einzelner Ausgestaltungen näher beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese speziellen Ausführungsformen beschränkt, sondern der Umfang der Erfindung wird durch die Patentansprüche in Verbindung mit der Beschreibung definiert.
Erfindungsgemäß wird eine Tetramerbildung von MHC-Molekülen unter Verwendung des DsRed-Proteins durchgeführt. DsRed ist ein rot fluoreszierendes Protein aus der Seeanemone Discosoma sp. und gehört wie das Grün Fluoreszierende Protein (GFP) zu einer Familie fluo­ reszierender Proteine. Nur beispielsweise wird hier auf die Veröffentlichung von Matz, M.V. et al., Nature Biotech. 17: 969-973, 1999 hingewiesen. Die Struktur von DsRed ist bekannt, und es kann beispielsweise von CLONTECH® in rekombinanter Form bezogen werden. Wei­ terhin ist bekannt, daß DsRed sowohl in vivo wie in vitro Tetramere ausbilden kann. Die Struktur dieser Tetramere ist ebenfalls bekannt (Nature Structural Biology, 2000, Seiten 1133 -1138).
Überraschend und unerwartet wurde von den Erfindern nunmehr festgestellt, daß DsRed auch zur Tetramerisierung von MHC-Molekülen und gleichzeitig für den späteren optischen Nachweis des Mittels herangezogen werden kann. Weder die Bindung des Antigen­ spezifischen Peptids an MHC-Moleküle noch die Bindung des MHC-Tetramers an die T-Zell- Rezeptoren einer T-Zelle wird durch die DsRed vermittelte Tetramerisierung gestört oder nachteilig beeinflußt. Insbesondere kann durch DsRed vermittelte Tetramerisierung die Te­ tramer-Herstellung wesentlich vereinfacht, beschleunigt und kostengünstig effizienter gestal­ tet werden, ohne die Funktionalität zu behindern. Der Nachweis des DsRed-Proteins erfolgt durch fluoreszenzdetektierende Verfahren in an sich bekannter Weise, wie es im Stand der Technik beispielsweise in den von den CLONTECH® Laboratories, Inc. veröffentlichten Protokollen dargestellt wird (CLONTECHniques XIV (4): 2-6). Dazu gehören neben FACS-analysen auch Fluoreszenzmikroskopie und fluoreszenzbasierende Scanningverfahren (z. B. Fluorimager von Molecular Dynamics).
Erfindungsgemäß wird das DsRed-Fluoreszenzprotein zur Tetramerisierung sowohl von MHC-Klasse I als auch MHC-Klasse II-Molekülen eingesetzt.
Beispiele für einsetzbare Histokompatibilitätsantigene sind MHC-Klasse I-Antigene, bei­ spielsweise HLA-A (zum Beispiel A1, A2, A3, A11, A24, A31, A33 und A38), HLA-B und HLA-C, MHC-Klasse II-Antigene, beispielsweise HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DX, HLA-DO, HLA-DZ und HLA-DP.
MHC-Tetramere sind Komplexe aus vier MHC-Molekülen, die mit einem spezifischen Peptid assoziiert sein können und durch ihre Bindung an ein Fluorochrom nachweisbar sind. Diese Komplexe binden eine spezielle Gruppe von T-Zell-Rezeptoren auf CD8+-T-Zellen. Bei Ver­ mischung der so erhaltenen Tetramere mit PBLs oder Gesamtblut und Nachweis zur Verwen­ dung durchflusszytometrischer Verfahren kann die Menge aller T-Zellen, die für ein Peptid spezifisch sind und das damit verbundene Allel analysiert werden. Es ist also möglich, die zelluläre Immunantwort gegen ein spezifisches Peptid zu bestimmen.
MHC-Tetramere gemäß der Erfindung können beispielsweise eingesetzt werden, um die zel­ luläre Immunantwort unter nachfolgenden Bedingungen zu studieren:
  • 1. Bei allen Virusinfektionen, beispielsweise HIV, HBV, CMV, HPV, HBV, HCV, Influen­ za und Masern und viele anderen.
  • 2. Bakterielle Infektionen
  • 3. Parasiteninfektionen, beispielsweise Malaria.
  • 4. Tumoren, einschließlich Brust-Prostata, Melanom-, Colon-, Lungen- und Cervixtumoren.
  • 5. Autoimmunitätserkrankungen einschließlich Mutiplesklerose, Diabetes, Rheumatoide Arthritis usw.
  • 6. Allergische Erkrankungen wie Asthma bronchiale, Neurodermitis usw.
Durch die Tetramer-Technologie ist es möglich, individuelle T-Zellen auf Grundlage der Spe­ zifität der Bindung an den MHC-Peptid-Komplex zu identifizieren. Aufgrund der Spezifität der Tetramere bieten sich folgende Vorteile:
  • - Das Verfahren ist quantitativ;
  • - Es sind keine radioaktive Markierungen einzusetzen;
  • - Das Verfahren arbeitet schnell, so daß auch frische Blutproben oder Gewebekulturproben analysierbar sind, und große Probenmengen verarbeitet werden können;
  • - Durch die Verwendung eines Durchflusszytometers können die Zellen nicht nur mit dem Tetramer-Fluorochrom DsRed, sondern auch mit anderen Zelloberflächenmarkern zur gleichen Zeit markiert werden;
  • - Die markierten Zellen werden durch Tetrameranfärbung nicht abgetötet;
  • - Es können einheitliche Subpopulationen durch die Durchflusszytometrie sortiert werden und im Wege weiterer Testsysteme auf ihre Funktionalität überprüft werden;
  • - Spezifische T-Zellen können aus Blutproben ohne vorherige in vitro-Kultur analysiert werden;
  • - Alle spezifischen T-Zellen sind nachweisbar, unabhängig von ihrem funktionellem Status, wie z. B. zytotoxische T-Zellen, T-Helferzellen usw.
Ausgangspunkt der Erfindung ist die Herstellung eines Fusionsproteins aus einem für ein MHC-Protein kodierenden Gen und aus einem für ein DsRed-Protein kodierenden Gen. Hier­ zu werden bevorzugt beim MHC-Molekül die Transmembran-Anteile und die zytosolischen Anteile entfernt, um eine lösliche Form des MHC-Moleküls zu erhalten. Der MHC-Anteil und der DsRed-Anteil werden bevorzugt durch ein Linkermolekül miteinander verknüpft. Das nach Entfernung der transmembranen und zytosolischen Anteile erhaltene trunkierte MHC- Molekül wird dann über das Linker-Molekül an den N-Terminus von DsRed gekoppelt.
Es ist insbesondere darauf zu achten, daß durch das Einfügen des Linker-Moleküls die Tetra­ merbildung über den DsRed-Anteil nicht behindert wird. Da die räumliche Struktur des DsRed-Moleküls bekannt ist (je zwei N-terminale Regionen liegen sich gegenüber), können die Linker-Moleküle entsprechend gestaltet werden. Besonders bevorzugt wird ein Aminosäu­ relinker verwendet. Ein Beispiel für einen flexiblen Aminosäurenlinker ist ein Derivat des lacZ-Alpha-Peptids [angegeben im "single letter code": MASSG GTGGS GGTGG SGGGG ASPSL VPSSD PLVTA ASVLE FALAG AQE] oder der synthetische flexible Linker Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr[Gly Gly Ser Gly Gly Thr]3, der zwischen den beiden Protein­ anteilen des Fusionsproteins MHC und DsRed eingefügt wird und die Tetramerisierung ste­ risch nicht behindert.
Selbstverständlich stehen dem Fachmann auch andere Aminosäurelinker zur Verfügung. Ent­ sprechende Techniken sind bekannt. Es ist aber auch möglich, die Proteine selbst durch bei­ spielsweise peptidchemische Bindungen über Crosslinker oder ähnliche Verfahren miteinan­ der zu verbinden. Beispielsweise sei auf Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 1989 und Ansubel F. M. et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, NY) und nachfol­ gende Auflagen hingewiesen.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform der Erfindung kann auch eine Variante des Amino­ säurelinkers eingesetzt werden, die zumindest eine Erkennungssequenz für eine Protease ent­ hält, beispielsweise den Faktor Xa. Hierdurch wird eine vereinfachte Abspaltung der MHC- Moleküle vom DsRed-Tetramer ermöglicht.
Die erfindungsgemäß hergestellten rekombinanten MHC-DsRed-DNA-Moleküle können in an sich bekannter Weise in rekombinanter Form in Expressionsplasmiden kloniert und in pro­ karyonten Zellen, bevorzugt E. coli-Zellen, oder in eukaryonten Zellen, beispielsweise Hefe­ zellen oder etablierten menschlichen Zellen, exprimiert werden. Geeignete Techniken stehen auf diesem Fachgebiet zur Verfügung, und es wird hier wiederum auf die oben genannten Laborhandbücher verwiesen. Die erhaltenen rekombinanten monomeren DsRed-MHC- Proteinmoleküle werden durch an sich bekannte Verfahren aufgereinigt und können dann in vitro oder in vivo tetramerisiert werden.
Zur Tetramerisierung werden die löslichen Versionen der MHC-DsRed-Moleküle, wahlweise, insbesondere bei MHC-I, in Kombination mit beta2-Mikroglobulin, zur Tetramerisierung ge­ bracht. Die Tetramerisierung findet bevorzugt in Gegenwart des Antigen-spezifischen Peptids statt. Die Ausbildung von Tetrameren ist eine dem DsRed-Protein inne wohnende Eigenschaft und es bedarf nicht mehr der aus dem Stand der Technik bekannten komplizierten, zeitrau­ benden Methoden wie Biotinylierungen, Streptavidin-Bindungen sowie Fluorochrom- Kopplungsreaktionen, um die Tetramerbildung und die Fluoreszenzentwicklung zu gewähr­ leisten. Bei der Erfindung wirkt das eingesetzte DsRed-Protein sowohl als Tetramerisierung­ sagens als auch als fluoreszierendes Mittel.
Das an sich bekannte DsRed-Protein kann selbstverständlich durch an sich bekannte Metho­ den abgeändert werden, um beispielsweise die Tetramerisierung, die Bindung an das MHC- Molekül und/oder die Fluoreszenzaktivität zu verbessern. Üblicherweise werden für derartige Mutagenisierungen zufallsgenerierte Mutanten auf ihre neuen Charakteristika ausgetestet, oder es wird in gezielter Weise nach Strukturuntersuchungen eine Mutagenisierung des DsRed-Proteins vorgenommen, um seine Aktivitäten zu verbessern. Selbstverständlich sind auch andere DsRed-ähnliche Proteine einsetzbar, die aus anderen Organismen gewonnen wurden. Voraussetzung hierbei ist natürlich immer ihre Fähigkeit zur Ausbildung von Tetra- bzw. Multimeren und ihre fluoreszierende Aktivität.
Die erfindungsgemäß ausgebildeten Tetramere werden mit der zu analysierenden Zellpopula­ tion gemischt. Unter Zellpopulation versteht man insbesondere PBMC-Populationen (periphe­ re Blut mononukleäre Zellen) oder T-Lymphozyten (T-Zellen). Nur T-Zellen mit T-Zell- Rezeptoren, die zur Bindung an die spezielle MHC-Peptid-Kombination, die im Tetramer vorliegt, befähigt sind, können an das Tetramer bilden. Derartige Zellen werden durch das DsRed-Fluorochrom markiert. Selbstverständlich können auch weitere Fluoreszenzmarkie­ rungen zusätzlich zum DsRed eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein für einen T-Zell- Marker spezifischer monoklonaler Antikörper in Kombination mit einem unterschiedlichen Fluorochrom, beispielsweise FITC, eingesetzt werden. Die Zellen können dann unter Ver­ wendung eines Durchflusszytometrieverfahrens analysiert werden. Der Anteil der CD8+ T- Zell-Population, die mit Hilfe des Tetramers positiv gefärbt wurde, wird bestimmt. Mit Hilfe von Fluoreszenznachweisverfahren, beispielsweise der Durchflusszytometrie, können die MHC-Tetramer-T-Zell-Komplexe auch sortiert werden und beispielsweise die so erkannten T-Zellen in einen Patienten appliziert werden.
In einer weiteren Ausgestaltungsform der Erfindung liegen die MHC-Monomere oder -Te­ tramere in einem Testsystem vor, das in Form eines Kits angeboten werden kann.
Der Lösungsansatz der Erfindung reduziert die zur Herstellung von MHC-Multimer- Reagenzien benötigten Komponenten (2 MHC-Ketten [z. B. MHC-I: schwere Kette und beta- 2-Mikroglobulin, MHC-II: alpha und beta Kette], d-Biotin, Peptid, Streptavidin-PE) auf 4 (MHC-linker-DsRed Fusionsprotein, 2. MHC-Kette und das jeweilige MHC-bindende Pep­ tid/Epitop). Außerdem wird die hohe Anzahl der benötigten Reaktionsabläufe (Extraktion von rekombinanten MHC Anteilen, in vitro Faltung in Gegenwart des Peptides, Biotinylierung, chromatographische Aufreinigung Multimerisierung unter Zugabe von Streptavidin-PE, weite­ re Reinigung über Molekularsiebohromatographie) auf z. B. 3 (Extraktion von rekombinan­ tem HLA-linker-DsRedRefolding in Anwesenheit des Peptids und anschließende Aufreini­ gung) reduziert. Alleine die Reduktion der Anzahl der notwendigen Aufreinigungsschritte, welche immer mit starken Verlusten verbunden sind, steigert die Gesamtausbeute an Reagenz deutlich. Außerdem ist der generierte MHC-Multimer Komplex relativ klein und sehr viel stabiler, wodurch Vorteile gegenüber bisher verwendeten Reagenzien entstehen.

Claims (25)

1. MHC-Tetramer, enthaltend vier MHC-Moleküle sowie ein Tetramerisierungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß das Tetramerisierungsmittel ein DsRed-Fluoreszenzprotein ist.
2. MHC-Tetramer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Tetramerisierungsmittel ein rekombinantes DsRed-Fluoreszenzprotein ist.
3. MHC-Tetramer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das DsRed-Fluoreszenzprotein über ein Linkermolekül an das MHC-Protein gekoppelt ist.
4. MHC-Tetramere nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Linkermolekül aus mehreren Aminosäuren besteht.
5. MHC-Tetramer nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Linkermolekül so ausgestaltet ist, daß eine Abspaltung der MHC-Moleküle vom DsRed-Protein ermöglicht wird.
6. MHC-Tetramer nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Linkermolekül eine Erkennungssequenz für eine Protease enthält.
7. MHC-Tetramer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sich bei der Tetramerbildung die N-terminalen Abschnitte des DsRed-Proteins gegenüber liegen.
8. MHC-Tetramer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das MHC-Molekül trunkiert ist.
9. MHC-Tetramer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das MHC-Molekül durch Deletion des Transmembran- und/oder des Cytosolanteils trunkiert ist.
10. MHC-Tetramer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form eines Epitopspezifischen DsRed-MHC-Peptid-Komplexes, wahlweise in Verbindung mit einem T-Zell-Rezeptor, vorliegt.
11. MHC-Tetramer nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das MHC-Molekül ein Säuger, bevorzugt Maus- oder Human-MHC-Molekül ist.
12. MHC-Monomer-Fusionsprotein, dadurch gekennzeichnet, daß es in Verbindung mit einem DsRed-Fluoreszenzprotein, wahlweise verbunden über ein Linkermolekül, vorliegt.
13. Fusionsprotein nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das MHC-Molekül trunkiert ist.
14. Fusionsprotein nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das MHC-Molekül durch Deletion des Transmembran und/oder des Zytosolanteils trunkiert ist.
15. DNA, die für ein Fusionsprotein nach Anspruch 12, 13 oder 14 kodiert.
16. RNA, die nach Transkription ein Fusionsprotein nach Anspruch 12, 13 oder 14 ergibt.
17. Prokaryontenzelle oder Eukaryontenzelle, enthaltend eine DNA oder RNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.
18. Verwendung eines DsRed-Proteins als Mittel zur Tetramerisierung oder Multimerisierung von MHC-Molekülen.
19. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) eine für ein MHC-Protein kodierende DNA, wahlweise über einen Linker, mit einer für ein DsRed-Protein kodierenden DNA zu einer für ein Fusionsprotein kodierenden DNA verbunden und das Fusionsprotein exprimiert wird; oder
    ein MHC-Protein, wahlweise über einen Linker, mit einem DsRed-Protein zu einem Fusionsprotein verbunden wird;
  • b) das Fusionsprotein wahlweise aufgereinigt wird.
20. Verfahren zur Herstellung eines MHC-Tetrameren, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) eine für ein MHC-Protein kodierende DNA, wahlweise über über einen Linker, mit einer für ein DsRed-Protein kodierenden DNA zu einer für ein Fusionsprotein kodierenden DNA verbunden und das Fusionsprotein exprimiert wird; oder
    ein MHC-Protein, wahlweise über einen Linker, mit einem DsRed-Protein zu einem Fusionsprotein verbunden wird;
  • b) das Fusionsprotein wahlweise aufgereingt wird;
  • c) das MHC-Fusionsprotein, wahlweise in Anwesenheit der Antigen-spezifischen Peptide, tetramerisiert wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Tetramerisierung in Anwesenheit von beta-2-Mikroglobulin erfolgt.
22. Verfahren zur Untersuchung einer Antigen-spezifischen zellulären Immunantwort, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) ein MHC-Tetramer oder seine monomere Form nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche mit T-Zellen, bevorzugt mit CD8+-T-Zellen, in Gegenwart eines Peptids in Kontakt gebracht werden, um T-Antigen-MHC-Tetramere zu erhalten;
  • b) die erhaltenen Tetramere nachgewiesen werden, bevorzugt durch ein Durchflußzytometrie-Verfahren oder andere zur Detektion von Fluoreszenzemissionen geeigneten Detektionsverfahren, wie Fluoreszenzmikroskopie oder Fluoreszenzscanning- Verfahren.
23. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) die T-Zellen in Gesamtblut oder PBLs vorliegend eingesetzt werden, oder
  • b) die T-Zellen aus Lymphknoten bzw. extralymphoiden Geweben eingesetzt werden.
24. Testsystem, enthaltend MHC-Monomere oder MHC-Tetramere nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.
25. Verwendung von MHC-Tetrameren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Untersuchung einer Antigenspezifischen Immunantwort, zum Nachweis oder zur Sortierung von T-Zellen, die spezifisch T-Zell-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche tragen, und zur weiteren Verwendung so gewonnener T-Zellen zur Rückführung in einen Patienten.
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