CN110567861B - 基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的试剂盒及检测方法，利用质谱流式检测技术，针对临床及科研组织样本中的免疫细胞，能够确定特定的抗原肽是否具有特异性激活样品中免疫细胞的免疫原性，提高了样品检测的深度和精度，极大程度地拓展了筛选分析的通量和检测内涵。
Description
【技术领域】
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
质谱流式检测技术是在单细胞水平上通过质谱仪检测稀有金属标记的抗体，对每一个细胞进行多参数、高通量地定性分析的技术。该技术较传统的流式细胞术，具有检测参数更多以及信噪比更高的优势，是目前最先进的单细胞流式检测技术，在临床医学与生物研究领域里得到了越来越广泛的应用。
T淋巴细胞是机体获得性免疫反应响应中重要的调节细胞，能够对外源性的具有免疫原性的抗原物质进行免疫清除，从而维持机体自身内环境的稳定。当主要组织相容性复合物与抗原肽结合并被转运到细胞膜表面时，该类分子复合物能够被T细胞识别，进而激活T细胞的免疫功能。因此，通过标记主要组织相容性复合体提呈的待检测抗原肽，然后与待检测样品进行孵育，就能够确定该待检测样品中的细胞是否能够特异性识别该抗原肽，从而确定该抗原肽对于待检测样品细胞是否具有免疫原性。
主要组织相容性复合体形成的四聚体能够较其单体具有更强的检测精度，因此，四聚体技术在免疫细胞检测中具有重要意义。该技术允许研究者能够精准地检测在感染性疾病、肿瘤以及自身免疫性疾病等病理过程中免疫细胞对各类抗原的识别效果。
目前，商用的主要组织相容性复合体四聚体技术仅能从普通流式检测水平上评价抗原肽的检测活性，其可同步检测的参数少、检测通量低，并不能够很好的满足高通量抗原物质筛选的临床检验和科学研究的需求。基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的检测方法，能够极大程度地满足临床检验和科学研究对抗原物质进行筛选的需求，填补目前该领域在商业应用上的空白。
【发明内容】
本发明提供一种基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的试剂盒，能够筛查待检测的抗原肽是否具有免疫原性。
本发明还提供了上述基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的检测方法。
本发明的技术解决方案如下：
基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的试剂盒，其特征在于，包括LD液、B液、NB液、W液、P液、F液、T液、BC1-BC10液；
所述LD液包括194Pt、RPMI 1640基础培养基；
所述B液为用于流式细胞技术的含人免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白、大鼠免疫球蛋白、仓鼠免疫球蛋白、牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液的封闭缓冲液；
所述NB液为四聚体复合物封闭剂；
所述W液为通透缓冲液；
所述P液为固定/通透浓缩液、固定/通透稀释液；
所述T液为四聚体染色孵育液；
所述F液包括甲醛、磷酸盐缓冲液；
所述D液包括191/193Ir、甲醛、磷酸盐缓冲液；
所述BC1-BC10液包括磷酸盐缓冲液以及Pd104、Pd105、Pd106、Pd108、Pd110中的任两种组合。
进一步地，LD液为1体积份RPMI 1640基础培养基、0.01体积份1mM 194Pt(201194，Fluidigm)。
进一步地，B液为0.5-2体积份人免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2体积份小鼠免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2体积份大鼠免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2体积份仓鼠免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2质量份牛血清白蛋白、100体积份磷酸盐缓冲液(GNM20012)，所述质量份与体积份按照以mg为单位的质量和以mL为单位的体积换算，即1质量份/1体积份等于1mg/mL。
进一步地，NB液为10-200质量份的N-乙基马来酰亚胺(E3876，Sigma)、0.0001-0.001质量份的生物素(即维生素B7)(V900418，Sigma)、1体积份双蒸水配制而成的封闭液，所述质量份与体积份按照以mg为单位的质量和以mL为单位的体积换算，即1质量份/1体积份等于1mg/mL。
进一步地，W液为1体积份10×通透液(00-8333-56，Invitrogen)、9体积份水。
进一步地，P液为1体积份固定/通透浓缩液(00-5123-43，Invitrogen)、3体积份固定/通透稀释液(00-5223-56，Invitrogen)。
进一步地，T液为0.001-0.01质量份的可订制的特定抗原肽的四聚体复合物、0.0005-0.002质量份的牛血清白蛋白、1体积份的磷酸盐缓冲液(GNM20012)配制而成的四聚体染色液，所述质量份与体积份按照以mg为单位的质量和以mL为单位的体积换算，即1质量份/1体积份等于1mg/mL。
进一步地，F液为0.9-1.3体积份16wt％甲醛溶液、9体积份磷酸盐缓冲液(GNM20012)。
进一步地，D液为0.005体积份Cell-IDTM Intercalator-Ir(201192B，Fluidigm)、0.9-1.3体积份16wt％甲醛溶液、9体积份的磷酸盐缓冲液(GNM20012)。
进一步地，
BC1液含1体积份Pd104(1.5-2μM，Fluidigm)，1体积份Pd105(1.5-2μM，Fluidigm)，100体积份磷酸盐缓冲液(GNM20012)；
BC2液含1体积份Pd106(1.5-2μM，Fluidigm)，1体积份Pd108(1.5-2μM，Fluidigm)，100体积份磷酸盐缓冲液(GNM20012)；
BC3液含1体积份Pd105(1.5-2μM，Fluidigm)，1体积份Pd110(1.5-2μM，Fluidigm)，100体积份磷酸盐缓冲液(GNM20012)；
BC4液含1体积份Pd104(1.5-2μM，Fluidigm)，1体积份Pd106(1.5-2μM，Fluidigm)，100体积份磷酸盐缓冲液(GNM20012)；
BC5液含1体积份Pd105(1.5-2μM，Fluidigm)，1体积份Pd108(1.5-2μM，Fluidigm)，100体积份磷酸盐缓冲液(GNM20012)；
BC6液含1体积份Pd106(1.5-2μM，Fluidigm)，1体积份Pd110(1.5-2μM，Fluidigm)，100体积份磷酸盐缓冲液(GNM20012)；
BC7液含1体积份Pd104(1.5-2μM，Fluidigm)，1体积份Pd108(1.5-2μM，Fluidigm)，100体积份磷酸盐缓冲液(GNM20012)；
BC8液含1体积份Pd105(1.5-2μM，Fluidigm)，1体积份Pd106(1.5-2μM，Fluidigm)，100体积份磷酸盐缓冲液(GNM20012)；
BC9液含1体积份Pd104(1.5-2μM，Fluidigm)，1体积份Pd110(1.5-2μM，Fluidigm)，100体积份磷酸盐缓冲液(GNM20012)；
BC10液含1体积份Pd108(1.5-2μM，Fluidigm)，1体积份Pd110(1.5-2μM，Fluidigm)，100体积份磷酸盐缓冲液(GNM20012)。
其中，每一种待检测样品选择BC(1-10)液当中的一种进行染色，不同样品必须选用不同种类的BC液，最多可以同时检测10种不同待检测样品。体积份以mL为计量单位。
进一步地，LD液、B液、NB液、W液、P液、F液、T液、BC1-BC10液配制完成后，保存在2-8℃。
该试剂盒的抗原肽四聚体复合物对可激活免疫活性的细胞的识别具有特异性，不能激活样品细胞免疫活性的抗原肽所组装的四聚体并不能识别样品细胞，利用该试剂盒，通过质谱流式检测结果与传统流式细胞技术检测的效果是一致的，且上机检测过程能够最多10个样品同时进行，避免了实验结果的批次误差，从而提高了样品细胞的筛选与检测的深度和精度，并通过兼容基于质谱流式技术检测样品细胞其他生理功能，如细胞周期、细胞信号通路检测等，拓展了该技术的分析通量与检测的内涵。
基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的的检测方法，其特征在于，使用上述试剂盒，包括以下步骤：
步骤一、制备单细胞悬液：
收集消化细胞，用移液枪轻柔吹打，得到单细胞悬液；
步骤二、确定细胞死活：
加入1mL LD液，LD液具体由1mL RPMI 1640基础培养基、0.01mL 1mM 194Pt(201194，Fluidigm)配制而成，轻柔吹打管底的细胞沉淀使细胞重悬，37℃细胞培养箱中孵育，优选5分钟；
步骤三、封闭：
向每个样品加入50μL的B液重悬细胞沉淀，冰上孵育，优选20分钟；B液具体由0.5-2mL人免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2mL小鼠免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2mL大鼠免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2mL仓鼠免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2mg牛血清白蛋白、100mL磷酸盐缓冲液(GNM20012)配制而成；
步骤四、四聚体复合物封闭：
将50mL的T液加入到50mL的NB液中，使得最终体积为100μL；混匀后室温孵育一定时间(优选10分钟)。其中，T液为0.001-0.01mg的可定制的特定抗原肽的四聚体复合物、0.0005-0.002mg的牛血清白蛋白、1mL的磷酸盐缓冲液配制而成的四聚体染色孵育液；NB液为10-200mg的N-乙基马来酰亚胺(E3876，Sigma)、0.0001-0.001mg的生物素(V900418，Sigma)、1mL双蒸水配制而成；
步骤五、四聚体复合物染色：
每支细胞样品中加入100μLT液与NB液的混合液，室温孵育一定时间(优选1小时)；
步骤六、细胞表面抗体染色：
用牛血清白蛋白溶液(0.5-2％质量体积比，溶于磷酸盐缓冲液中)以适量稀释比例加入细胞表面抗体后与样品混匀，冰上孵育一定时间，优选30分钟；
步骤七、通透：
每支细胞样品中加入100μL的P液重悬细胞，P液具体由1mL固定/通透浓缩液(00-5123-43，Invitrogen)、3mL固定/通透稀释液(00-5223-56，Invitrogen)配制，室温孵育一定时间，优选30分钟；
步骤八、细胞胞内抗体染色：
配制细胞胞内抗体染色液，以适量比例加入抗体至100μL的W液后，加入到细胞沉淀中，混匀后冰上孵育一定时间，优选30分钟；W液由1mL 10×通透液(00-8333-56，Invitrogen)、9mL水配制而成；
步骤九、细胞固定：
向每支EP管中加入1mL的F液，移液枪吹吸混匀重悬细胞，室温孵育一定时间，优选10分钟；F II液由0.9-1.3mL 0.16mg/mL甲醛溶液、9mL磷酸盐缓冲液(GNM20012)；
步骤十、DNA染色、固定：
向每支EP管中加入1mL的D液，移液枪吹吸混匀重悬细胞后，置于4℃冰箱中静置过夜；D液由0.005mL Cell-IDTM Intercalator-Ir(201192B，Fluidigm)、0.9-1.3mL 0.16mg/mL甲醛溶液、9mL的磷酸盐缓冲液(GNM20012)配制而成；
步骤十一、细胞条形码标记：
向样品细胞中加入100μL的BC液，BC液含包括磷酸盐缓冲液以及Pd104、Pd105、Pd106、Pd108、Pd110中的任两种组合，重悬细胞后置于冰上孵育一定时间，优选30分钟；
步骤十二、漂洗、上机检测：
用双蒸水漂洗细胞后，转移至流式管中，计数后上机检测。
本发明的整体有益效果如下：
本发明通过质谱流式细胞技术对细胞群体进行精准的免疫分型，对细胞内信号传导网络进行全面的分析，分析细胞亚群之间的功能联系，以及对于大量样品的高通量多参数检测，结合MHC-Tetramer技术用于抗原特异性的T细胞检测、分选、活化及扩增，从而可用于T细胞识别表位的筛选及特异性T细胞的检测，能够实现特异地、有效地、高通量地以及单细胞水平地筛查激活组织器官样品中免疫细胞的具有免疫原性的抗原肽，大大提高了样品检测的深度和精度，极大程度地拓展了筛选分析的通量和检测内涵。
【附图说明】
图1为基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的检测方法流程示意图；
图2为抗原肽A四聚体复合物与阴性对照样品抗原肽B四聚体复合物的流式检测结果；
图3为使用本发明试剂盒进行抗原肽检测结果；
图4为使用本发明试剂盒检测A抗原肽细胞的同时对胞内信号进行检测的结果。
【具体实施方式】
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
以下所提供的实施例并非用以限制本发明所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序，所述溶液如无特别说明即指水溶液，浓度以单位区别不同的浓度类型，如“mg/mL”即表示溶质质量与溶液体积之比，以此类推。本领域技术人员结合现有公知常识对本发明做显而易见的改进，亦落入本发明要求的保护范围之内。
基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的试剂盒，其特征在于，包括LD液、B液、NB液、W液、P液、F液、T液、BC1-BC10液；
所述LD液包括194Pt、RPMI 1640基础培养基；
所述B液为用于流式细胞技术的含人免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白、大鼠免疫球蛋白、仓鼠免疫球蛋白、牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液的封闭缓冲液；
所述NB液为四聚体复合物封闭剂；
所述W液为通透缓冲液；
所述P液为固定/通透浓缩液、固定/通透稀释液；
所述T液为四聚体染色孵育液；
所述F液包括甲醛、磷酸盐缓冲液；
所述D液包括191/193Ir、甲醛、磷酸盐缓冲液；
所述BC1-BC10液包括磷酸盐缓冲液以及Pd104、Pd105、Pd106、Pd108、Pd110中的任两种组合。
基于上述质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的试剂盒，另外使用CD45(Biolegend)和Ki67(eBiosciences)对样品细胞胞外、胞内目标蛋白进行检测，具体如下：
步骤一、样品单细胞悬液制备：
1)收集消化后所得单细胞悬液，细胞计数，此次实例进行测试的样品细胞为小鼠m33细胞，分为对照组和染色组进行实验；
2)取107单细胞，室温离心400g/5min，弃上清；
3)以107/mL细胞密度加入37℃预热的无血清RPMI 1640培养基，室温离心400g/5min，弃上清；
步骤二、确定细胞死活：
4)加入1mL LD液，LD液具体由1mL RPMI 1640基础培养基、0.01mL 1mM 194Pt(201194，Fluidigm)配制而成，轻柔吹打管底的细胞沉淀使细胞重悬，37℃细胞培养箱中孵育5min；
5)加入5mL 37℃预热的含血清的RPMI 1640培养基，室温离心400g/5min，弃上清；
步骤三、封闭：
6)向每个样品加入50μL的B液重悬细胞沉淀，并转移到干净的1.5mL的EP管中，做好标记，冰上孵育20分钟；B液具体由0.5-2mL人免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2mL小鼠免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2mL大鼠免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2mL仓鼠免疫球蛋白溶液(2mg/mL)、0.5-2mg牛血清白蛋白、100mL磷酸盐缓冲液(GNM20012)配制而成；
步骤四、四聚体复合物封闭：
7)细胞样品冰上孵育期间配制四聚体复合物封闭混合液，T液中加入NB液，使得最终体积为100μL，混匀后室温孵育10min；T液为0.001-0.01质量份的可定制的特定抗原肽的四聚体复合物、0.0005-0.002质量份的牛血清白蛋白、1体积份的磷酸盐缓冲液配制而成的四聚体染色液；NB液为10-200质量份的N-乙基马来酰亚胺(E3876，Sigma)、0.001-0.01质量份的生物素(V900418，Sigma)、1体积份双蒸水配制而成；
步骤五、四聚体复合物染色：
8)向每支EP管中加入1mL的牛血清白蛋白溶液(0.5％质量体积比，溶于磷酸盐缓冲液中)清洗细胞，4℃离心800g/5min，弃上清；
9)向每支EP管中加入100μLT液与NB液的混合液，室温孵育60min；
步骤六、细胞表面抗体染色：
10)向每支EP管中加入1mL的牛血清白蛋白溶液(0.5％质量体积比，溶于磷酸盐缓冲液中)清洗细胞，4℃离心800g/5min，弃上清；
11)配制细胞表面标记物抗体混合液，以适量稀释比例加入抗体CD45(1:100体积比)至牛血清白蛋白溶液(0.5-2％质量体积比，溶于磷酸盐缓冲液中)后，每支样品加入100μL，配制300μL；
12)向每支EP管中加入100μL的细胞表面标记物抗体混合液，混匀后冰上孵育30min；
步骤七、通透：
13)向每支EP管中加入1mL的W液，4℃离心800g/5min，弃上清；
14)每支细胞样品中加入100μL的P液重悬细胞，P液具体由1mL固定/通透浓缩液(00-5123-43，Invitrogen)、3mL固定/通透稀释液(00-5223-56，Invitrogen)配制二横，室温孵育30min；
15)向每支EP管中加入1mL的W液，4℃离心800g/5min，弃上清，第一遍；
16)向每支EP管中加入1mL的W液，4℃离心800g/5min，弃上清，第二遍；
步骤八、细胞胞内抗体染色：
17)配制细胞胞内抗体染色液，以适量比例加入抗体Ki67(1:200体积比)至100μL的W液后，加入到细胞沉淀中，混匀后冰上孵育30min；W液由1mL 10×通透液(00-8333-56，Invitrogen)、9mL水配制而成；
18)向每支EP管中加入1mL P液终止清洗细胞，P液由1mL固定/通透浓缩液(00-5123-43，Invitrogen)、3mL固定/通透稀释液(00-5223-56，Invitrogen)配制而成，4℃离心800g/5min，弃上清；
19)向每支EP管中加入1mL的牛血清白蛋白溶液(0.5％质量体积比，溶于磷酸盐缓冲液中)清洗细胞，4℃离心800g/5min，弃上清；
步骤九、细胞固定：
20)向每支EP管中加入1mL的F液，移液枪吹吸混匀重悬细胞，室温孵育10min；F液由0.9-1.3mL 16％甲醛溶液、9mL磷酸盐缓冲液(GNM20012)；
21)4℃离心800g/5min，弃上清；
步骤十、DNA染色、固定：
22)向每支EP管中加入1mL的D液，移液枪吹吸混匀重悬细胞后，置于4℃冰箱中静置过夜；D液由0.0005mL Cell-IDTM Intercalator-Ir(201192B，Fluidigm)、0.09-0.13mL16％(质量体积比，mg/mL)甲醛溶液、0.9mL的磷酸盐缓冲液(GNM20012)配制而成；
步骤十一、细胞条形码标记：
23)从4℃冰箱中取出细胞样品，4℃离心800g/5min，弃上清；
24)向每支EP管中加入1mL磷酸盐缓冲液(GNM20012)，4℃离心800g/5min，弃上清；
25)向样品细胞中加入100μL的BC1液，BC1液含1mLPd104(1.5-2μM，Fluidigm)、1mLPd105(1.5-2μM，Fluidigm)、100mL磷酸盐缓冲液(GNM20012)，重悬细胞后置于冰上孵育30min；
26)向每支EP管中加入1mL牛血清白蛋白溶液(0.5-2质量份牛血清白蛋白，100体积份磷酸盐缓冲液GNM20012，其中质量份以mg为单位，体积份以mL为单位)，4℃离心800g/5min，弃上清；
27)向每支EP管中加入1mL水重悬细胞，4℃离心800g/5min，弃上清；
28)预备带滤膜滤头的流式管，管壁上做好标记；
步骤十三、漂洗、上机检测：
29)向每支EP管中加入1mL水重悬细胞后，用移液枪吸取细胞悬液过流式管滤头滤膜转移到相应流式管中。再次加入1mL水清洗EP管壁数次后，将清洗液用移液枪吸取后过滤同一个流式管滤膜后到同一个流式管中；
30)4℃离心800g/5min，弃上清；
31)向每支流式管中加入1mL水重悬细胞后，分别取10μL进行细胞计数。
32)根据细胞计数结果，取等量细胞数的对照组及处理组细胞，混合后，用水再次清洗细胞样品数次后，加入适量的平衡磁珠，在Helios质谱细胞仪(Fluidigm)上机进行检测，并对两组数据进行处理分析。
我们使用特定的能够结合m33细胞表面T细胞受体的抗原肽A组装成四聚体复合物，并利用质谱流式技术验证组装的特定抗原肽四聚体复合物是否能够识别m33细胞表面的T细胞受体。同时，我们选择与m33细胞表面T细胞受体弱结合的抗原肽B组装成四聚体复合物作为阴性对照样品。抗原肽A四聚体复合物与阴性对照样品抗原肽B四聚体复合物的流式检测结果如图2所示。而使用基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的试剂盒进行抗原肽检测后，我们同样能够成功检测到m33细胞中能够特异地识别A抗原肽的细胞群，获得类似于流式细胞检测的有效检测结果，检测结果如图3所示。另外，使用基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的试剂盒，能够同时对样品细胞胞内信号Ki67进行检测，可以看到空白染色组与A抗原肽四聚体染色效果没有明显差异，表明四聚体染色不影响样品细胞的胞内染色效果，如图4所示。目前的使用方法允许在检测样品细胞中是否存在响应特异抗原肽激活免疫反应的细胞的同时，利用基于质谱流式检测技术的信号通路检测试剂盒或者基于质谱流式检测技术的细胞周期检测试剂盒及检测方法，同时检测被该特异抗原肽激活的免疫细胞内的信号通路、细胞周期调控的变化，拓展了该试剂盒的应用内涵。
Claims (4)
1.基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的试剂盒，其特征在于，包括LD液、B液、NB液、T液、P液、W液、F液、D液、BC1液、BC2液、BC3液、BC4液、BC5液、BC6液、BC7液、BC8液、BC9液和BC10液；
所述LD液包括194Pt和RPMI 1640基础培养基；
所述B液为用于流式细胞技术的含人免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白、大鼠免疫球蛋白、仓鼠免疫球蛋白、牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲液的封闭缓冲液；
所述NB液为四聚体复合物封闭剂，由10-200质量份的N-乙基马来酰亚胺、0.0001-0.001质量份的生物素和1体积份双蒸水配制而成；
所述T液为四聚体染色孵育液，由0.001-0.01质量份的可定制的特定抗原肽的四聚体复合物、0.0005- 0.002质量份的牛血清白蛋白和1体积份的磷酸盐缓冲液配制而成；所述T液中特定抗原肽的四聚体复合物为特定的能够结合m33细胞表面T细胞受体的抗原肽组成的四聚体复合物；
所述P液为固定通透液；
所述W液为通透缓冲液；
所述F液为包括甲醛和磷酸盐缓冲液的细胞固定液；
所述D液为0.005体积份Cell-IDTM Intercalator-Ir、0.9-1.3体积份16wt％甲醛溶液和9体积份的磷酸盐缓冲液；
所述BC1液含1体积份的1.5-2 μM Pd104、1体积份的1.5-2 μM Pd105和100体积份磷酸盐缓冲液；
所述BC2液含1体积份的1.5-2 μM Pd106、1体积份的1.5-2 μM Pd108和100体积份磷酸盐缓冲液；
所述BC3液含1体积份的1.5-2 μM Pd105、1体积份的1.5-2 μM Pd110和100体积份磷酸盐缓冲液；
所述BC4液含1体积份的1.5-2 μM Pd104、1体积份的1.5-2 μM Pd106和100体积份磷酸盐缓冲液；
所述BC5液含1体积份的1.5-2 μM Pd105、1体积份的1.5-2 μM Pd108和100体积份磷酸盐缓冲液；
所述BC6液含1体积份的1.5-2 μM Pd106、1体积份的1.5-2 μM Pd110和100体积份磷酸盐缓冲液；
所述BC7液含1体积份的1.5-2 μM Pd104、1体积份的1.5-2 μM Pd108和100体积份磷酸盐缓冲液；
所述BC8液含1体积份的1.5-2 μM Pd105、1体积份的1.5-2 μM Pd106和100体积份磷酸盐缓冲液；
所述BC9液含1体积份的1.5-2 μM Pd104、1体积份的1.5-2 μM Pd110和100体积份磷酸盐缓冲液；
所述BC10液含1体积份的1.5-2 μM Pd108、1体积份的1.5-2 μM Pd110和100体积份磷酸盐缓冲液；
所述质量份与体积份按照以mg为单位的质量和以mL为单位的体积换算。
2.根据权利要求1所述的基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的试剂盒，其特征在于，
所述LD液为1体积份RPMI 1640基础培养基和0.01体积份1mM 194Pt；
所述B液为0.5-2体积份的浓度为2mg/mL的人免疫球蛋白溶液、0.5-2体积份的浓度为2mg/mL的小鼠免疫球蛋白溶液、0.5-2体积份的浓度为2mg/mL的大鼠免疫球蛋白溶液、0.5-2体积份的浓度为2mg/mL的仓鼠免疫球蛋白溶液、0.5-2质量份牛血清白蛋白和100体积份磷酸盐缓冲液；
所述P液为1体积份固定通透浓缩液和3体积份固定通透稀释液；
所述W液为1体积份10×通透液和9体积份水；
所述F液为0.9-1.3体积份16wt％甲醛溶液和9体积份磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的试剂盒，其特征在于，所述LD液、B液、NB液、W液、P液、F液、T液、BC1液、BC2液、BC3液、BC4液、BC5液、BC6液、BC7液、BC8液、BC9液和BC10液配制完成后，保存在2-8℃。
4.基于质谱流式检测技术筛查具有免疫原性抗原肽的检测方法，其特征在于，使用权利要求1-3任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：
步骤一、制备单细胞悬液：
收集消化细胞，用移液枪轻柔吹打，得到单细胞悬液；
步骤二、确定细胞死活：
加入1mL LD液，LD液具体由RPMI 1640基础培养基和194Pt配制而成，轻柔吹打管底的细胞沉淀使细胞重悬，37℃细胞培养箱中孵育；
步骤三、封闭：
向每个样品加入50μL的B液重悬细胞沉淀，冰上孵育；B液由浓度为2mg/mL的人免疫球蛋白溶液、浓度为2mg/mL的小鼠免疫球蛋白溶液、浓度为2mg/mL的大鼠免疫球蛋白溶液、浓度为2mg/mL的仓鼠免疫球蛋白溶液、牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲液配制而成；
步骤四、四聚体复合物封闭：
向T液中加入NB液，使得最终体积为100μL，混匀后室温孵育；T液为可定制的特定抗原肽的四聚体复合物、牛血清白蛋白和磷酸盐缓冲液配制而成的四聚体染色液；NB液由N-乙基马来酰亚胺、生物素和双蒸水配制而成；
步骤五、四聚体复合物染色：
每支细胞样品中加入100μL T液与NB液的混合液，室温孵育；
步骤六、细胞表面抗体染色：
用溶于磷酸盐缓冲液中、质量体积比0 .5-2mg/mL的牛血清白蛋白溶液以适量稀释比例加入细胞表面抗体后与样品混匀，冰上孵育；
步骤七、通透：
每支细胞样品中加入100μL的P液重悬细胞，P液由1mL固定通透浓缩液、3mL固定通透稀释液配制，室温孵育；
步骤八、细胞胞内抗体染色：
配制细胞胞内抗体染色液，以适量比例加入抗体至100μL的W液后，加入到细胞沉淀中，混匀后冰上孵育；W液由1mL 10×通透液和9mL水配制而成；
步骤九、细胞固定：
向每支EP管中加入1mL的F液，移液枪吹吸混匀重悬细胞，室温孵育；F液包括0.9-1.3mL16wt％甲醛溶液和9mL磷酸盐缓冲液；
步骤十、DNA染色和固定：
向每支EP管中加入1mL的D液，移液枪吹吸混匀重悬细胞后，置于4℃冰箱中静置过夜；D液由0.0005mL Cell-IDTM Intercalator-Ir、0.09-0.13mL质量体积比16wt％甲醛溶液和0.9mL的磷酸盐缓冲液配制而成；
步骤十一、细胞条形码标记：
向样品细胞中加入100μL的BC1液、BC2液、BC3液、BC4液、BC5液、BC6液、BC7液、BC8液、BC9液或BC10液，重悬细胞后置于冰上孵育；
步骤十二、漂洗和上机检测：
用双蒸水漂洗细胞后转移至流式管中，计数后上机检测。
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Denomination of invention: A kit and detection method for screening immunogenic antigen peptides based on mass spectrometry flow cytometry technology Granted publication date: 20211221 Pledgee: Guotou Taikang Trust Co.,Ltd. Pledgor: ZHEJIANG PLTTECH HEALTH TECHNOLOGY CO.,LTD. Registration number: Y2024980011422 |
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