JP5608751B2

JP5608751B2 - 生体注入型組織接着性ヒドロゲル及びその生医学的用途

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Publication number: JP5608751B2
Application number: JP2012527823A
Authority: JP
Inventors: キ−ドンパク; ユーン−キチョン; キュン−ミンパク; ユ−ジンリー
Original assignee: アジュユニバーシティインダストリー−アカデミックコーオペレーションファウンデーション
Priority date: 2009-09-04
Filing date: 2010-09-02
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2030-09-02
Also published as: EP2473210B1; KR20110025530A; EP2473210A4; JP2013503688A; WO2011028031A3; WO2011028031A2; EP2473210A2; US20120156164A1; CN102596275B; KR101103423B1; CN102596275A; US8968716B2

Description

本発明は、生体適合性及び機械的強度に優れ、ドーパ誘導体の結合を通じて優れた組織接着力を有する生体注入型組織接着性ヒドロゲル及びその生医学的用途に関する。

封止剤（Ｓｅａｌａｎｔ）と止血剤（ｈｅｍｏｓｔａｔｓ）とを含む傷の治療分野の研究開発は迅速に成長している。１９９８年に米ＦＤＡでフィブリン封止剤（Ｆｉｂｒｉｎｓｅａｌａｎｔ）が許可されながら、毎年新たな組織接着剤が絶え間なく開発されている。このような組織接着剤は、既存に外科的または内科的手術で使われている縫合術、クリップ術、灸術のような技術を代替しうる素材として脚光を浴びている。

縫合術のような既存の外科的な技術は、強い伸長力を有するが、患者の苦痛の誘発及び施術後の除去などの問題を有している。一方、組織接着剤は、早い接着時間、簡便な使用、施術後の除去不用などの多様な長所を有しているが、低接着性、悪い生体適合性及び低伸張力と水分存在下で、接着性が著しく落ちる制限点を有している。このような組織接着剤の限界点を克服するための研究が続けられている。

組織接着剤は、組織に直接接触するので、生体適合性が要求される。また、医療用接着剤の場合には、通常生体内で用いられるために、接着が本質的に体液と血液内に流れて行くと生体が直接関与するので、より厳格な条件で毒性と危害性とがあってはならず、より厳密な生体適合性と生分解性の素材が要求される。

一般的に、組織接着剤は、皮膚、血管、消化器、脳神経、成形外科、整形外科、一般外科などの多様な領域で用いられるために、それぞれ異なる特性が必要であるが、主に次のような特徴が要求される。すなわち、１）水分が存在する場合にも、常温、常圧で迅速に接着しなければならず、２）毒性があってはならず、滅菌が可能でなければならず、３）創傷面に密着して十分な機械的強度を保持しなければならず、４）生分解性であり、止血効果が可能でなければならず、５）生体治癒に効果がなければならない。

現在、商品化及び／または実用化されている組織接着剤は、大きくシアノアクリレート系瞬間接着剤、フィブリングルー、ゼラチングルー、及びポリウレタン系などがある。シアノアクリレート系瞬間接着剤は、最近、高接着力及び高性能を有する瞬間接着剤の研究で脚光を浴びている。特に、生体適合性、柔軟性及び低毒性の生体組織縫合用の医療用瞬間接着剤は、止血、抗菌効果だけではなく、縫合糸の代替も可能であるために、先進国を中心に研究が活発に進められている。

このようなシアノアクリレート系組織接着剤は、現在ダーマボンド（ジョンソン・アンド・ジョンソン社）とインダーミル（Ｉｎｄｅｒｍｉｌ；ＵＳＳｕｒｇｉｃａｌ社）などのブランドで商品化されている。このようなシアノアクリレート系組織接着剤は、単一物質として短時間で室温で開始剤なしに水分によって硬化され、外観が透明であり、かつ接着強度が大きいという長所があるが、衝撃に弱くて耐熱性が落ちるという短所を有している。また、毒性が高いため、現在、ほとんど使われず、アメリカを除いた他の国において、臨床的に部分的に使用されているが、一部の組織毒性と脆弱性とのために、その使用は制限されている。また、フィブリングルー接着剤は、１９９８年に初めてアメリカＦＤＡによって心臓外科への適用が許可された。次いで、フィブリン組織接着剤についての研究開発が活発になされ、現在、ＴｉｓｓｅｅｌＶＨ^（R）（バクスター社）とＥｖｉｃｅｌ^ＴＭ（ジョンソン・アンド・ジョンソン社）のような製品が商品化されている。

フィブリン系組織接着剤は、シアノアクリレート系と共に組織接着剤の市場のほとんどを占めている。フィブリン組織接着剤は、フィブリンの架橋反応を用いてフィブリノーゲン、トロンビン、塩化カルシウム及び第ＸＩＩＩ因子を組織接着剤として末梢神経の縫合、微小血管の縫合などに適用して、縫合の代用または補強のための臨床応用が実施されている。

このようなフィブリングルー接着剤は、接着部位の水分に影響を受けずに迅速に接着し、血小板の凝固障害がなく、生体適合性に優れるという長所を有している。しかし、接着力が弱く、生分解速度が速く、感染の危険がある、という欠点を有している。

また、ゼラチングルーとしては、生体来由の組織接着剤としてゼラチン−レゾルシノール−ホルマリン（ＧＲＦ）で架橋させたものが開発された。それ以外にゼラチン−グルタルアルデヒドのような組織接着剤が開発されたが、組織接着性は高いものの、架橋剤として用いられるホルマリンやグルタルアルデヒドが生体内のタンパク質とも架橋反応を起こして、組織毒性を起こすという短所を有している。

また、ポリウレタン系接着剤は、硬化後に接合部の柔軟性が保持される弾性接着剤の形態で開発された。この接着剤は、生体組織表面の水を吸収して組織との密着性を高め、水と反応して数分以内に硬化し、硬化物が柔軟性を有することが特徴であり、硬化された接着剤が適切に生分解される長所を有している。しかし、合成原料である芳香族ジイソシアネートが生体毒性があるという短所を有している。

既存に開発された組織接着剤は、高分子または架橋剤の毒性と弱い接着力などの問題点を依然として有している状況である。このような問題を克服するために、最近、イガイ由来タンパク質である３，４−ジヒドロキシフェニル−Ｌ−アラニン（ドーパ）を利用した組織接着剤の開発についての研究が進められている。

ドーパは、イガイの足糸に存在する足糸タンパク質から来由されたものであって、足糸タンパク質に存在するチロシンがポリフェノールオキシダーゼによって水和されて得られるアミノ酸である。この物質は、親水性表面と非常に強い水素結合を形成し、金属や半金属などとも強い配位結合ができる特徴を有する。また、ドーパ残基は、ドーパ−キノン形態に酸化されながら、タンパク質分子の架橋を図る。

ドーパを利用した組織接着剤は、現在Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ^ＴＭ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＣｌｏｎｔｅｃｈ社）とＭＡＰ^ＴＭ（ＳｗｅｄｉｓｈＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅＬａｂ．社）製品として商品化されている。しかし、このような製品は、１グラムのイガイの足糸タンパク質を得るために、１０，０００個のイガイが要求される。このような問題による低い抽出収率と高い生産コストとによって、細胞や組織培養の接着剤としてのみ使われるという欠点を有している。

一方、このような問題は、韓国の浦項工科大学のチャ・ヒョンジュン教授研究チームによって解決されている。チャ・ヒョンジュン教授研究チームは、新たなイガイ足糸タンパクの質抽出方法を開発し、それを利用した組織接着剤を開発し、該開発された接着剤は、既存に多く使われるフィブリングルーに比べて、４倍程度の高接着力を有するイガイ来由タンパク質を利用した組織接着剤を開発した（チャ・ヒョンジュンｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｄｈｅｓｉｏｎａｎｄＩｎｔｅｒｆａｃｅｓ２００８）。しかし、このような方法も、タンパク質の精製過程で５０〜６０％内外の収得率を得るなどの制限点を有している。

また、他のドーパ誘導体を利用した組織接着剤は、ＰｈｉｌｌｉｐＢ．Ｍｅｓｓｅｒｓｍｉｔｈ教授研究チームによって開発された。ＰｈｉｌｌｉｐＢ．Ｍｅｓｓｅｒｓｍｉｔｈ教授研究チームは、２００７年にＰＥＧ−ジアミンとグルタミン基質とを利用した酵素反応性注入型／組織接着性ヒドロゲルを開発した（ＰｈｉｌｌｉｐＢ．Ｍｅｓｓｅｒｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，ＵＳ７２０８１７１Ｂ２）。しかし、製造されたヒドロゲルの機械的強度が１００Ｐａ程度にしかならない、組織接着力がフィブリングルーと同等であるか、あるいは２倍程度にしかならない、いう欠点を有している。このような問題点を克服するために、ＰｈｉｌｌｉｐＢ．Ｍｅｓｓｅｒｓｍｉｔｈ教授研究チームは、多分枝−ＰＥＧ末端またはＰＭＭＡ−ＰｔＢＭＡ−ＰＭＭＡトリブロック末端にドーパ誘導体を結合させて、ｉｎｓｉｔｕ形成組織接着性ヒドロゲル及び表面コーティング技術を開発するのに至った（ＰｈｉｌｌｉｐＢ．Ｍｅｓｓｅｒｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，ＵＳ２００８／０２４７９８４Ａ１、ＵＳ２００７／０２０８１４１Ａ１、ＵＳ２００８／０４１４９５６６Ａ１、ＵＳ２００９／０１６３６６１Ａ１、ＵＳ２００３／００８７３３８Ａ１、ＷＯ２００８／０４９１０８Ａ１、ＷＯ２００８／０９１３８６Ａ２）。

このように製造されたドーパ誘導体が結合されたヒドロゲルは、高接着力を示し、既存の問題を解決したが、ゲル化時間が最小３０秒以内であり、ヒドロゲル架橋時に使われる酸化剤が、ＮａＩＯ_４、ＦｅＣｌ_３などの毒性がある物質を使って限界点を有している。

したがって、このような限界点を克服するために、生体適合性に優れた架橋反応による速いゲル化時間、優れた機械的強度、優れた生体適合性、適切な生分解性、水分存在下での迅速で強い接着力を有するｉｎｓｉｔｕ形成組織接着性ヒドロゲルを開発する必要性が大きく注目されている。

前記従来技術の問題点を解決するために、本発明者は、合成高分子と天然高分子とのハイブリッド化によって生体適合性及び機械的強度に優れ、ドーパ誘導体の結合を通じて優れた組織接着力を有するヒドロゲルを開発することで本発明を完成した。

これにより、本発明の目的は、生体安定性、生体適合性及び優れた機械的強度を有し、同時に優れた組織接着力を有するｉｎｓｉｔｕ形成組織接着性ヒドロゲルを提供するところにある。

また、本発明の他の目的は、生体安定性、生体適合性及び優れた機械的強度を有し、同時に優れた組織接着力を有するｉｎｓｉｔｕ形成ヒドロゲルを組織接着及び止血用素材として応用するところにある。

また、本発明のまた他の目的は、生体安定性、生体適合性及び優れた機械的強度を有し、同時に優れた組織接着力を有するｉｎｓｉｔｕ形成組織接着性ヒドロゲルを組織再生及び充填用組織接着性インプラント素材として応用するところにある。

また、本発明のさらに他の目的は、生体安定性、生体適合性及び優れた機械的強度を有し、同時に優れた組織接着力を有するｉｎｓｉｔｕ形成組織接着性ヒドロゲルを生理活性物質及び薬物伝達体用担体として応用するところにある。

前記目的を果たすために、本発明は、ｉ）フェノール、アニリン、またはこれらの誘導体のうちから選択された１つ以上の化合物とドーパまたはその誘導体から選択された１つ以上の化合物とが結合された、下記化１で表されるスター型高分子、ｉｉ）フェノール、アニリン、またはこれらの誘導体のうちから選択された１つ以上の化合物とドーパまたはその誘導体から選択された１つ以上の化合物とが結合された、化１で表されるスター型高分子、及び高分子主鎖にフェノール、アニリン、またはこれらの誘導体のうちから選択された１つ以上の化合物が水溶性高分子をリンカーとして用いるか、あるいは用いずに結合された、化２で表される分枝状高分子の異種混合物、及びI I I）高分子主鎖にフェノール、アニリン、またはこれらの誘導体のうちから選択された１つ以上の化合物とドーパまたはその誘導体から選択された１つ以上の化合物とが水溶性高分子をリンカーとして用いるか、あるいは用いずに結合された、化３で表される分枝状高分子からなる群から同種または異種の高分子の２つ以上を含み、２つ以上の高分子間の隣接されたフェノール、アニリン、ドーパ、またはこれらの誘導体間の脱水素結合によって連結されることを特徴とする化４ないし化７で表される生体注入型組織接着性ヒドロゲルを提供する。

上記化学式で、Ｒは、フェノール、アニリン、ドーパ、ドーパキノン、及びこれらの誘導体のうちから選択された何れか１つであり、Ｘは、ヒドロキシ基またはアミン基であり、Ｌは、高分子リンカーであり、（Ｌ）は、リンカーを含むか、含まない。

前記高分子に西洋ワサビペルオキシダーゼ、及び過酸化水素を添加させて高分子が体内または体外で、ｉｎｓｉｔｕ架橋されうる。

前記化１ないし化３で表される高分子は、水溶性高分子をリンカーとして用いるか、用いずにアミノ基、ヒドロキシ基、またはカルボキシル基を有する高分子主鎖にフェノール、アニリン、ドーパ、ドーパキノン、及びこれらの誘導体のうちから選択された何れか１つの化合物をアミド、ウレタン、ウレア、またはエステル結合させることで製造可能である。

例えば、化１ないし化３で表される高分子を下記の反応式１ないし１３のように製造することができる。この際、反応式で、ＥＤＣは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、ＮＨＳは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＴＥＡは、トリエチルアミン、ＤＭＡＰは、ジメチルアンモ二ウムピリジン、ＮＰＣＦは、ｐ−ニトロフェニルクロロフォーメイトを意味する。

より詳細には、ヒドロキシ基、アミン基またはカルボキシル基を有する天然高分子または合成高分子に水溶性高分子をリンカーとして用いないか、用いてフェノールまたはアニリン誘導体、またはドーパ／ドーパキノン誘導体を結合して化１ないし化３で表される高分子を製造することができる。

前記水溶性高分子に無水コハク酸またはＮＰＣＦのうち何れか１つの化合物、ＴＥＡ及びＤＭＡＰを添加する段階をさらに含みうる。

前記フェノール誘導体またはアニリン誘導体の添加時にＥＤＣ及びＮＨＳを共に添加して活性化することができる。また、天然高分子または合成高分子主鎖の添加時にも、ＥＤＣ及びＮＨＳを共に添加して活性化することができる。

また、水溶性高分子にフェノール誘導体またはアニリン誘導体またはドーパ／ドーパキノン誘導体の結合時に、ジアミン化合物を添加する段階を追加することもできる。

本発明で用いられた高分子としては、ゼラチン、キトサン、ヘパリン、セルロース、デキストラン、デキストランサルフェート、コンドロイチンサルフェート、ケラタンサルフェート、デルマタンサルフェート、アルギン酸、コラーゲン、アルブミン、フィブロネクチン、ラミリン、エラスチン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸、フィブリノーゲン、及び多分枝−高分子からなる群から選択された１つまたは２つ以上の高分子を用いることができる。

前記多分枝−高分子としては、３分枝（３−ａｒｍ）−ポリエチレングリコール（３ａｒｍＰＥＧ）、４分枝（４−ａｒｍ）−ポリエチレングリコール（４ａｒｍＰＥＧ）、６分枝（６−ａｒｍ）−ポリエチレングリコール（６ａｒｍＰＥＧ）、または８分枝（８−ａｒｍ）−ポリエチレングリコール（８ａｒｍＰＥＧ）から選択された何れか１つまたは２つ以上の多分枝ポリエチレングリコールと、及びテトロン酸シリーズ（４ａｒｍ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）からなる群から選択された何れか１つまたは２つ以上の高分子を用いることができる。

本発明で用いられたフェノール誘導体としては、チラミン、ヒドロキシフェニル酢酸、ヒドロキシプロピオン酸、及びこれらの誘導体からなる群から選択された１つまたは２つ以上の誘導体を用い、前記アニリン誘導体としては、ヒドロキシエチルアニリン、アミノエチルアニリン、アミノベンジルアルコール、及びこれらの誘導体からなる群から選択された１つまたは２つ以上の誘導体を用い、前記ドーパ誘導体としては、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、及びこれらの誘導体からなる群から選択された、１つまたは２つ以上の誘導体を用いることができる。

本発明でリンカーとして用いられる水溶性高分子としては、陽イオン高分子、陰イオン高分子、両性高分子、非イオン性高分子、ポリペプチド、多価脂肪族、多環芳香族、ポリエステル、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、ポリウレタン、及びポリアミド鎖からなる群から選択された何れか１つであり得る。前記共重合体としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ｐｏｌｙＮＩＰＡＡＭ）、ポリフマレート、ポリオルガノホスファゼン、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙＡＡｃ）、ポリアクリルスルホン酸、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ｐｏｌｙＨＥＭＡ）、及びこれらの共重合体を含みうるが、これらに限定されるものではない。また、前記共重合体として、ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^(R)ｓｅｒｉｅｓ）、４−分枝（ａｒｍ）ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^(R)ｓｅｒｉｅｓ）、ＰＥＧ−ＰＥＩ、ＰＥＧ−ＰＶＡ、ＰＥＧ−ＰＥＩ−ＰＶＡ、ＰＥＩ−ＰＶＡ、ポリ（ＮＩＰＡＡＭ−ｃｏ−ＡＡｃ）、ポリ（ＮＩＰＡＡＭ−ｃｏ−ＨＥＭＡ）、及びこれらの組み合わせを含みうるが、これらに限定されるものではない。

また、本発明で用いられたリンカーであって、水溶性高分子としては、親水性線形または多分枝（ｍｕｌｔｉ−ａｒｍ）ブロック共重合体から選択されたものを使い、前記多分枝ブロック共重合体としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリ（ＤＬ−乳酸−ＣＯ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（（プロピレン）フマレート）、ポリ（（エチレン）フマレート）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されうるが、これらに限定されるものではない。

また、本発明におけるヒドロゲルは、西洋ワサビペルオキシダーゼ及び過酸化水素の濃度を調節してゲル化時間、ヒドロゲル安定性（分解時間）、機械的強度、または含水率から選択された物理化学的性質を調節することができる。また、本発明におけるヒドロゲルは、水溶性高分子の分子量を調節してゲル化時間、分解時間、機械的強度、または含水率から選択された物理化学的性質を調節することができる。

また、本発明におけるヒドロゲルは、ドーパまたはその誘導体の含有量と、または前記異種混合物でドーパまたはその誘導体を含む高分子とフェノール、アニリン、またはこれらの誘導体を含む高分子間の混合比率によって組織接着強度を調節することができる。

本発明におけるヒドロゲルは、二重注入式注射器キットを構成してｉｎｓｉｔｕ架橋形成し、前記二重注入式注射器キットに噴射ノズルを結合して噴射可能にする。また、前記二重注入式注射器キットとテフロン成形とを用いてヒドロゲルシートまたはディスクを製造することができる。

また、本発明におけるヒドロゲルは、さらにフェノール、アニリン、アミンまたはチオールグループを有する生理活性物質を含んでｉｎｓｉｔｕ架橋形成され、前記生理活性物質としては、チロシンを含むペプチドが挙げられる。

また、本発明は、前記生体注入型組織接着性ヒドロゲルを含む組織接着及び止血用素材を提供する。前記素材は、血管外科領域を含んだ脳神経外科手術と、骨の接着を含んだ整形外科手術と、裂傷患者の止血と、大腿動脈の縫合と、白内障切開縫合、軟骨及び関節軟骨治癒と、皮膚接合と、臓器／分泌腺切開面止血と、胃腸管分合と、及び筋及び靭帯治癒からなる群から選択された何れか１つに適用可能である。

また、本発明は、前記生体注入型組織接着性ヒドロゲルを含む組織再生及び充填用インプラント素材を提供する。

前記インプラント素材は、軟骨再生、骨再生、歯槽骨再生、皮膚再生、心筋再生、人工水晶体、脊髓神経再生、脳神経再生、声帯再生及び充填剤、癒着防止膜、尿失禁治療剤、シワ除去用充填剤、火傷治療剤、組織充填剤、及び脊椎椎間板治療剤からなる群から選択された何れか１つに適用可能である。

また、本発明は、前記生体注入型組織接着性ヒドロゲルを含む生理活性物質または薬物伝達体用担体を提供する。前記生理活性物質または薬物は、ペプチドまたはタンパク質医薬品、抗菌剤、抗癌剤、及び抗炎症剤からなる群から選択された何れか１つまたは２つ以上とすることができる。

前記ペプチドまたはタンパク質医薬品は、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）、白血球成長因子（Ｇ−ＣＳＦ）、赤血球成長因子（ＥＰＯ）、大食細胞成長因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、インターフェロン−α，β，γ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、カルシトニン、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子、アンジオテンシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン作動薬（ＬＨＲＨアゴニスト）、インシュリン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ソマトスタチン、グルカゴン、エンドルフィン、バシトラシン、マゲイン、コリスチン、単一抗体、ワクチン類、及びこれらの混合物からなる群から選択されうる。

前記抗菌剤は、ミノサイクリン、テトラサイクリン、オフロキサシン、ホスホマイシン、マゲイン、プロフロキサシン、アンピシリン、ペニシリン、ドキシサイクリン、チエナマイシン、セファロスポリン、ノルキサシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ミクロノマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ジベカシン、セフォタキシン、セファクロル、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、エノキサシン、バンコマイシン、イミペネム、フシジン酸、及びこれらの混合物からなる群から選択されうる。

前記抗癌剤は、パクリタキセル、タキソテール、アドリアマイシン、エンドスタチン、アンギオスタチン、マイトマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、カボプラチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、アクチノマイシン−Ｄ、及びこれらの混合物からなる群から選択されうる。

前記抗炎症剤は、アセトアミノフェン、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、ピロキシカム、フェノプロフェン、フルビプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、スプロフェン、ロキソプロフェン、シノキシカム、テノキシカム、及びこれらの混合物からなる群から選択されうる。

本発明の一実施例として、４分枝−ＰＰＯ−ＰＥＯ（テトロン酸）を用いてフェノール誘導体とドーパ／ドーパキノン誘導体とを結合させてテトロン酸−チラミン／ドーパミン（Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ）を合成し、ＨＲＰ及びＨ_２Ｏ_２存在下で前記高分子から単一生体注入型組織接着性ヒドロゲルを製造することができる。

また、高分子主鎖としてタンパク質及び酵素分解性天然高分子であるゼラチンとキトサンとを用いて、中間にリンカーとしてＰＥＧのような水溶性高分子を用いて、フェノール誘導体を結合させたゼラチン−ＰＥＧ−チラミン（ＧＰＥＧ−ＴＡ）とキトサン−ＰＥＧ−チラミン（ＣＰＥＧ−ＴＡ）とを合成し、高分子主鎖としてタンパク質及び酵素分解性天然高分子であるゼラチンとキトサンとを用いて、中間にリンカーを用いずにフェノール誘導体を結合させたゼラチン−ヒドロキシフェニル酢酸（ＧＨＰＡ）とキトサン−ヒドロキシフェニル酢酸（ＣＨＰＡ）とを合成し、前記高分子は、予め用意したＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ高分子と混合してＨＲＰ及びＨ_２Ｏ_２存在下で生体注入型組織接着性ヒドロゲルを製造することができる。

このように製造された組織接着性ヒドロゲルは、天然／合成高分子のハイブリッド化とドーパ／ドーパキノン誘導体の導入によって向上した機械的強度、生体適合性及び優れた組織接着力を図り、ＰＥＧリンカーを用いた場合、高分子溶液の溶解度、ゲル化時間短縮、機械的強度向上、及び体内安定性を図ることができる。

また、高分子主鎖として生体適合性天然高分子であるヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸を用いて、中間にリンカーとしてＰＥＧのような水溶性高分子を用いて、フェノール誘導体とドーパ／ドーパキノン誘導体とを結合させてヒアルロン酸−ＰＥＧ−チラミン／ドーパミン（ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ）、カルボキシメチルセルロース−ＰＥＧ−チラミン／ドーパミン（ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ）、アルギン酸−ＰＥＧ−チラミン／ドーパミン（ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ）を合成し、ＨＲＰ及びＨ_２Ｏ_２存在下で前記高分子から組織接着力に優れた生体注入型組織接着性ヒドロゲルを製造することができる。

このように製造された生体注入型組織接着性ヒドロゲルは、ＰＥＧリンカーを用いて高分子溶液の溶解度向上、ゲル化時間短縮、機械的強度向上、及び体内安定性向上を図り、ドーパ／ドーパキノン誘導体の導入で優れた組織接着力を図ることができる。

本発明における優れた組織接着性を有するヒドロゲルは、組織接着剤または止血剤と、組織工学用注入型骨格と、タンパク質、ＤＮＡ、成長因子、細胞のような薬物の徐放型薬物伝達体と、組織充填剤と、傷治療と、または腸癒着防止などの多様な生医学的応用が可能である。

より詳細には、本発明における生体注入型組織接着性ヒドロゲルは、組織封止剤、止血剤を含む組織接着剤用素材として用いられる。組織接着剤として用いるために、ｉ）使用の簡便さ、ｉｉ）滅菌可能であること、ｉｉｉI）適当な粘度、ｉｖ）低い発熱特性、ｖ）短いセッティング時間、ｖｉ）強い接着力、ｖｉｉ）低い毒性、ｖｉｉｉ）システムの無毒性、ｉｘ）適当な分解時間が要求され、本発明における生体注入型組織接着性ヒドロゲルは、このような組織接着剤としての要求条件を満足させることができる。

すなわち、本発明における生体注入型組織接着性ヒドロゲルは、西洋ワサビペルオキシダーゼと過酸化水素とによってフェノールまたはアニリン誘導体のｉｎｓｉｔｕ架橋を可能にし、この反応は、体内で起こる反応であって、発熱反応や毒性のない生体適合性に優れた反応であり、その反応速度は、数秒から数分と速い。また、西洋ワサビペルオキシダーゼの濃度を調節して架橋時間を数秒から数分の間に調節することができる。

また、本発明における生体注入型組織接着性ヒドロゲルは、物理的架橋ではない化学的架橋によってヒドロゲルが形成されるので、機械的強度に優れ、生体安定性に優れることを特徴とする。また、酵素またはタンパク質によって分解される高分子を高分子主鎖として用いるので、生分解性を有し、Ｈ_２Ｏ_２の濃度、すなわち、架橋濃度及び異種高分子の混合比率を調節して分解速度の調節が可能である。

また、本発明における生体注入型組織接着性ヒドロゲルは、合成された高分子溶液の粘度が低いために、既存に多く用いられる方法である２００ｎｍフィルターを通じて容易に滅菌が可能な特徴を有する。また、高分子にドーパ／ドーパキノン誘導体が導入されて、優れた組織接着力を有する。

また、本発明における生体注入型組織接着性ヒドロゲルは、組織工学用有効骨格としての人工細胞外マトリックスとして用いられる。この際、ヒドロゲルの分解速度は、ゲル内部にある細胞の分化及び成長に非常に重要な役割を行うので、適切な分解速度の調節が必須的である。

例えば、ゼラチンは、細胞が分泌するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、特に、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９によって特異的に分解される。ゼラチンを含有するヒドロゲルマトリックスは、このような酵素によって分解になり、再び細胞が分泌する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に再形成されながら、ヒドロゲル内部の細胞が効果的に成長し、分化するのに効果的である。

また、組織工学用有効骨格として用いられるヒドロゲルのマトリックス剛度も、ゲル内部にある細胞の成長と分化とに多くの影響を及ぼす。また、各細胞ごとに適切なマトリックス剛度が要求される。例えば、骨細胞は、剛度の高いマトリックスでよく成長することが示されており、軟組織細胞、例えば、繊維芽細胞、筋肉母細胞などは、柔らかいマトリックスでよく成長すると知られている。酵素反応を利用したシステムでは、過酸化水素の量を調節することで容易にヒドロゲルの架橋を調節し、したがって、ヒドロゲルの剛度を容易に調節することができる。

また、本発明における生体注入型組織接着性ヒドロゲルは、薬物伝達用有効骨格としての人工細胞外マトリックスとして用いられる。例えば、多様な成長因子との物理的結合を向上させるヘパリンにチラミンを導入して、成長因子を効果的に担持し、徐放型放出挙動を可能にする（成長因子結合サイト）。

フェノールが結合されている細胞接着ペプチドまたはタンパク質、例えば、ＲＧＤＹまたはＹＩＧＳＲを用いて、ヒドロゲルマトリックス内部の細胞接着力を向上させることができる。

ーパキノン形態とアミン基またはチオール基の化学的結合が可能であるので、タンパク質及びペプチドを含む生理活性物質を容易にヒドロゲルマトリックス内部に固定化して、細胞接着力及び活性を向上させることができる。効果的な細胞の成長と分化とに必要なこのような成分を、酵素機序を用いて導入し、ｉｎｓｉｔｕ形態で組織接着性人工ＥＣＭを作ることができる。

本発明によれば、合成高分子と天然高分子とのハイブリッド化によって生体適合性及び機械的強度に優れ、ドーパ誘導体の結合を通じて優れた組織接着力を有するｉｎｓｉｔｕ形成組織接着性ヒドロゲルを提供することができる。特に、このようなｉｎｓｉｔｕ形成組織接着性ヒドロゲルを用いて組織接着または止血用素材と、組織工学用注入型骨格と、タンパク質、ＤＮＡ、成長因子、細胞のような薬物の徐放型薬物伝達体と、組織充填剤と、傷治療と、または腸癒着防止などのように多様な生医学的用途として適用することができる。

Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡの合成模式図を示す。ＧＨＰＡの合成模式図を示す。ＣＨＰＡの合成模式図を示す。ＧＰＥＧ−ＴＡ共重合体の合成模式図を示す。ＣＰＥＧ−ＴＡ共重合体の合成模式図を示す。ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ共重合体の合成模式図を示す。ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ共重合体の合成模式図を示す。ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ共重合体の合成模式図を示す。酵素反応を利用した生体注入型組織接着性ヒドロゲルの製造の模式図を示す。酵素反応を利用した生体注入型組織接着性ヒドロゲルの製造の模式図を示す。酵素反応を利用した生体注入型組織接着性ヒドロゲルの製造の模式図を示す。酵素反応を利用した生体注入型組織接着性ヒドロゲルの製造の模式図を示す。二重注入式注射器キットまたはノズル搭載二重注入式注射器キットを利用したｉｎｓｉｔｕ形成組織接着性ヒドロゲルの製造方法を示す図である。ＨＲＰの濃度に生体注入型組織接着性ヒドロゲルのゲル化時間の比較評価を示す図である。Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡＩとＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ IIヒドロゲルの機械的強度の比較及びＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II高分子濃度によるＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの機械的強度の変化を示す図である。製造された生体組織接着性ヒドロゲルのｉｎｖｉｔｒｏ安全性を示す図である。Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＴＡ、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＡＧＬ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡヒドロゲルの２Ｄ細胞適合性の評価を示す図である。フィブリングルーとシアノアクリレートとを対照群として、（Ａ）Ｔｅｔ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、（Ｂ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＨＰＡ、（Ｃ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、（Ｄ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、（Ｅ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｆ）ＧＰＥＧ−ＴＡ、ＣＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｇ）ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡヒドロゲルのそれぞれの接着力の評価結果を示す図である。フィブリングルーとシアノアクリレートとを対照群として、（Ａ）Ｔｅｔ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、（Ｂ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＨＰＡ、（Ｃ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、（Ｄ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、（Ｅ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｆ）ＧＰＥＧ−ＴＡ、ＣＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｇ）ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡヒドロゲルのそれぞれの接着力の評価結果を示す図である。フィブリングルーとシアノアクリレートとを対照群として、（Ａ）Ｔｅｔ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、（Ｂ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＨＰＡ、（Ｃ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、（Ｄ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、（Ｅ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｆ）ＧＰＥＧ−ＴＡ、ＣＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｇ）ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡヒドロゲルのそれぞれの接着力の評価結果を示す図である。フィブリングルーとシアノアクリレートとを対照群として、（Ａ）Ｔｅｔ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、（Ｂ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＨＰＡ、（Ｃ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、（Ｄ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、（Ｅ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｆ）ＧＰＥＧ−ＴＡ、ＣＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｇ）ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡヒドロゲルのそれぞれの接着力の評価結果を示す図である。フィブリングルーとシアノアクリレートとを対照群として、（Ａ）Ｔｅｔ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、（Ｂ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＨＰＡ、（Ｃ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、（Ｄ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、（Ｅ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｆ）ＧＰＥＧ−ＴＡ、ＣＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｇ）ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡヒドロゲルのそれぞれの接着力の評価結果を示す図である。フィブリングルーとシアノアクリレートとを対照群として、（Ａ）Ｔｅｔ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、（Ｂ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＨＰＡ、（Ｃ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、（Ｄ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、（Ｅ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｆ）ＧＰＥＧ−ＴＡ、ＣＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｇ）ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡヒドロゲルのそれぞれの接着力の評価結果を示す図である。フィブリングルーとシアノアクリレートとを対照群として、（Ａ）Ｔｅｔ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、（Ｂ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＨＰＡ、（Ｃ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、（Ｄ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、（Ｅ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｆ）ＧＰＥＧ−ＴＡ、ＣＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｇ）ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡヒドロゲルのそれぞれの接着力の評価結果を示す図である。Ｔｅｔ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルのｉｎｖｉｖｏ接着力の評価結果を示す図である。Ｔｅｔ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルのｉｎｖｉｖｏ止血作用の評価結果を示す図である。

本発明の一実施例として製造されたｉｎｓｉｔｕ形成組織接着性ヒドロゲルの組織接着性及び止血作用をｉｎｖｉｔｒｏ／ｉｎｖｉｖｏ試験を通じて評価し、組織接着性及び止血作用の評価は、単一または異種混合高分子によって差異を設けて比較評価し、物理化学的特性、例えば、ゲル化時間、ゲル安定性、分解時間、膨潤程度、及び機械的強度は、異種高分子の混合比率及び過酸化水素の濃度に応じて変化させることにより評価した。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。しかし、このような実施例によって、本発明の範囲を限定するものではない。

＜製造例１＞テトロン酸−チラミン／ドーパミン（Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ）の合成
図１は、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡの合成模式図を示す。

１．テトロン酸−（ｐ−ニトロフェニルクロロフォーメイト）［Ｔｅｔｒｏｎｉｃ−（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ；Ｔｅｔ−ＰＮＣ］の合成
テトロン酸３０ｇ（１．６７ｍｍｏｌ）をジオキサン３００ｍｌに溶解させた後、この溶液に、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）１．０１８ｇ（８．３３ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（ＴＥＡ）０．８４３ｇ（８．３３ｍｍｏｌ）とをジオキサン４０ｍｌに溶解させた溶液と、ｐ−ニトロフェニルクロロフォーメイト（ＰＮＣ）１．６７９ｇ（８．３３ｍｍｏｌ）をジオキサン５０ｍｌに溶解させた溶液とを順次混合した。この際、テトロン酸：ＰＮＣ：ＤＭＡＰ：ＴＥＡのｍｏｌ比率は１：５：５：５とし、反応温度は３０℃とし、窒素雰囲気下で２４時間反応を進行させた。

反応終了後、濾過器を用いて残存する試薬を除去した後、回転式蒸発濃縮器を用いて反応溶液を濃縮させた。濃縮溶液を冷たいエーテル１６００ｍｌに一滴ずつ落として沈殿物を生成させ、この沈殿物を濾過器を用いて回収して生成物を得た。

該得られた生成物を、残余有機溶媒を除去するために、真空オーブンに２４時間放置し、白色の粉末形態の生産物（Ｔｅｔ−ＰＮＣ）を得た。

２．テトロン酸−チラミン／ドーパミン（Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ）の合成
予め用意したＴｅｔ−ＰＮＣをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１００ｍｌに溶解させた溶液にチラミン（ＴＡ）とドーパミン（ＤＡ）とをＤＭＳＯ５０ｍｌにそれぞれ溶解させた溶液を添加して反応を進行させた。Ｔｅｔ−ＰＮＣ：ＴＡ：ＤＡのｍｏｌ比率は、次の表１の通りである。この際、反応温度は３０℃とし、窒素雰囲気下で２４時間反応を進行させた。

反応終了後、反応溶液を、メタノールで、１次メンブレン透析（３５００Ｄａ分子量遮断）を通じて、反応していないＴＡとＤＡとを除去し、アセトンで、二次メンブレン透析（３５００ｄａ分子量遮断）を通じて、反応していないＴＡとＤＡとを完全に除去した。

透析が完了した後の溶液を、濾過器を通じて濾過し、回転蒸発濃縮器を用いて濃縮させた後、冷たいエーテル１６００ｍｌに滴下して沈殿物を生成させた。該生成された沈殿物を、濾過器を通じて濾過し、該濾過された沈殿物を真空オーブンに２４時間放置し、白色の粉末生成物（Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ）を得た。

一方、下記の表１のように、テトロン酸高分子４個の分枝（ａｒｍ）にＴＡグループがいずれも導入された高分子は、Ｔｅｔ−ＴＡと、ＤＡグループがいずれも導入された高分子は、Ｔｅｔ−ＤＡと名付け、テトロン酸高分子４個の分枝にＴＡグループ３個とＤＡグループ１個とが導入された高分子は、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡＩ、ＴＡグループ２個とＤＡグループ２個とが導入された高分子は、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、ＴＡグループ１個とＤＡグループ３個とが導入された高分子は、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ IIIと名付けた。テトロン酸高分子末端に、ＴＡグループまたはＤＡグループが単一／混合導入された高分子を通称する場合、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡと名付けた。

＜製造例２＞ゼラチン−ヒドロキシフェニル酢酸（ＧＨＰＡ）の合成
図２は、ＧＨＰＡの合成模式図を示す。
すなわち、１０ｇのゼラチンを０．１Ｍ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）２００ｍｌに溶解させて溶液Ａを製造した。４−ヒドロキシフェニル酢酸（ＨＰＡ）０．６０９ｇ（４ｍｍｏｌ）を０．１ＭＭＥＳ５０ｍｌに溶解させて溶液Ｂを製造した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）０．９２ｇ（４．８ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）０．２７６ｇ（２．４ｍｍｏｌ）とをそれぞれ５ｍｌの０．１ＭＭＥＳに溶解させた。次いで、ＥＤＣ溶液とＮＨＳ溶液とを溶液Ｂに１５分間隔で順次加えた。１５分後、ＥＤＣ／ＮＨＳが含まれた溶液Ｂを溶液Ａに混合して反応を始めた。

この際、反応温度は４０℃とし、反応時間は２４時間とし、反応終了後、反応溶液を注射器フィルター（４５０ｎｍ）を用いて濾過した。次いで、蒸留水で３〜４日間メンブレン透析（３５００Ｄａ分子量遮断）を施行した。透析が完了した溶液を凍結乾燥することにより、白色粉末形態のＧＨＰＡを得た。

＜製造例３＞キトサン−ヒドロキシフェニル酢酸（ＣＨＰＡ）の合成
図３は、ＣＨＰＡの合成模式図を示す。
すなわち、ジアセチル化７５〜８５％の低分子量キトサン０．６４４ｇに蒸留水８０ｍｌを添加し、１ＮＨＣｌを用いて溶液をｐＨ３まで低下させ、溶解させた。ＨＰＡ０．４０４ｇ（２．６ｍｍｏｌ）を添加した後、０．１ＭＮａＯＨを用いて溶液をｐＨ５とした。ＥＤＣ０．７６８ｇ（４ｍｍｏｌ）を添加し、反応温度３０℃で２４時間反応させた。

反応終了後、蒸留水によるメンブレン透析（３５００Ｄａ分子量遮断）を行うことで、反応溶液から反応していないＨＰＡを除去した。透析後の溶液を凍結乾燥することにより、半透明の不織布形態のＣＨＰＡを収得した。

＜製造例４＞ゼラチン−ポリ（エチレングリコール）−チラミン（ＧＰＥＧ−ＴＡ）の合成
図４は、ＧＰＥＧ−ＴＡ共重合体の合成模式図を示す。

１．ポリ（エチレングリコール）−（ｐ−ニトロフェニルクロロフォーメイト）（ＰＥＧ−ＰＮＣ）の合成
ＰＥＧ１０ｇ（２．９ｍｍｏｌ）をメチレンクロライド（ＭＣ）１００ｍｌに溶解させた後、この溶液に、ＤＭＡＰ０．７７９ｇ（６．３８ｍｍｏｌ）とＴＥＡ０．６４５ｇ（６．３８ｍｍｏｌ）とをＭＣ１０ｍｌに溶解させた溶液とＰＮＣ１．２８６ｇ（６．３８ｍｍｏｌ）をＭＣ５０ｍｌに溶解させた溶液とを順次混合した。この際、ＰＥＧ：ＤＭＡＰ：ＴＥＡ：ＰＮＣのｍｏｌ比率は１：２．２：２．２：２．２とし、反応温度は３０℃とし、窒素雰囲気下で２４時間反応を進行させた。

反応終了後、濾過器を用いて残存する試薬を除去した後、回転式蒸発濃縮器を用いて溶液を濃縮させた。濃縮した溶液を冷たいエーテル１６００ｍｌに滴下して沈澱を生成させ、この沈殿物を濾過器を用いて回収して生成物を得た。該収得された生成物を、残余有機溶媒を除去するために、真空オーブンに２４時間放置し、白色の粉末形態の生産物（ＰＥＧ−ＰＮＣ）を得た。

２．ＧＰＥＧ−ＴＡの合成
ＰＥＧ−ＰＮＣ５ｇ（１．４７１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ１００ｍｌに溶解させた溶液にＴＡ０．２０２ｇ（１．４７１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ５０ｍｌに溶解させた溶液を添加して反応を進行させた。ＰＥＧ−ＰＮＣ：ＴＡのｍｏｌ比率は１：１とし、反応温度は３０℃とし、窒素雰囲気下で６時間反応を進行させた。６時間後、ゼラチン溶液（１ｇ／２００ｍｌｉｎＤＭＳＯ）を混合して、３０℃窒素雰囲気下で２４時間反応を進行させた。

反応終了後、反応溶液を水でメンブレン透析（６０００〜８０００Ｄａ分子量遮断）して反応していないＰＥＧ−ＴＡを除去した。透析が完了した後、溶液を凍結乾燥して白色の粉末生成物（ＧＰＥＧ−ＴＡ）を得た。合成されたＧＰＥＧ−ＴＡの化学構造は、^１ＨＮＭＲを通じてＴＡ置換物の特性ピーク（６．９１〜７．２３ｐｐｍ）であることを確認し、合成がよく行われたということを確認した。

＜製造例５＞キトサン−ポリ（エチレングリコール）−チラミン（ＣＰＥＧ−ＴＡ）の合成
図５は、ＣＰＥＧ−ＴＡ共重合体の合成模式図を示す。
ＰＥＧ−ＰＮＣ５ｇ（１．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ１００ｍｌに溶解させた溶液にＴＡ０．１７４ｇ（１．２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ５０ｍｌに溶解させた溶液を添加して反応を進行させた。ＰＥＧ−ＰＮＣ：ＴＡのｍｏｌ比率は１：１とし、反応温度は３０℃とし、窒素雰囲気下で６時間反応を進行させた。６時間後、酢酸（７０重量％）を含むＤＭＳＯ５０ｍｌにキトサン０．５ｇが溶解された溶液を反応フラスコに混合して反応温度３０℃の窒素雰囲気下で２４時間反応を進行させた。

反応が終了した溶液を水でメンブレン透析（６０００〜８０００Ｄａ分子量遮断）して反応していないＰＥＧ−ＴＡを除去した。透析が完了した溶液を凍結乾燥して白色粉末形態の生成物（ＣＰＥＧ−ＴＡ）を得た。

＜製造例６＞ヒアルロン酸−ポリ（エチレングリコール）−チラミン／ドーパミン（ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ）の合成
図６は、ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ共重合体の合成模式図を示す。
１．アミノ化ポリ（エチレングリコール）−チラミン／ドーパミン（ＰＴＡ／ＤＡ）の合成
ＰＥＧ−ＰＮＣ５ｇ（１．２５ｍｍｏｌ）をＭＣ１００ｍｌに溶解させた溶液に、ＴＡ０．１７４ｇ（１．２５ｍｍｏｌ）またはＤＡ０．２３７ｇをＭＣ５０ｍｌに溶解させた溶液を添加して反応を進行させた。ＰＥＧ−ＰＮＣ：ＴＡ（または、ＤＡ）のｍｏｌ比率は１：１とし、反応温度は３０℃とし、窒素雰囲気下で６時間反応を進行させた。６時間後、エチレンジアミン２．２５４ｇ（３７．５ｍｍｏｌ）をＭＣ５０ｍｌに溶解させた溶液を混合して、３０℃窒素雰囲気下で２４時間反応を進行させた。この際、ＰＥＧ−ＰＮＣ：エチレンジアミンのｍｏｌ比率は、１：３０とした。

反応が終了した溶液は、濾過器を用いて残存する試薬を除去した後、回転式蒸発濃縮器を用いて濃縮させた。濃縮溶液を冷たいエーテル１６００ｍｌに滴下して沈澱を生成させ、この沈殿物を濾過器を用いて回収して生成物を得た。該収得された生成物を、残余有機溶媒を除去するために、真空オーブンに２４時間放置し、白色の粉末形態の生産物（ＰＴＡ／ＤＡ）を得た。

２．ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡの合成
ヒアルロン酸１ｇを蒸留水３００ｍｌに溶解させた溶液にＥＤＣ１．３０７ｇ（６．８２ｍｍｏｌ）とＮＨＳ０．３９２ｇ（３．４１ｍｍｏｌ）とをそれぞれ１５分間隔で順次に加えた。引き続き反応フラスコにＰＴＡ２．５ｇ（０．６２５ｍｍｏｌ）とＰＤＡ２．５ｇ（０．６２５ｍｍｏｌ）とを蒸留水１００ｍｌに溶解させた溶液を混合して３０℃で２４時間反応を進行させた。

反応が終了した溶液は、濾過器を用いて残存する試薬を除去した後、蒸留水で３〜４日間メンブレン透析（６０００〜８０００Ｄａ分子量遮断）を施行した。透析が完了した溶液を凍結乾燥して、白色粉末形態の生成物（ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ）を得た。

＜製造例７＞カルボキシメチルセルロース−ポリ（エチレングリコール）−チラミン／ドーパミン（ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ）の合成
図７は、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ共重合体の合成模式図を示す。
カルボキシメチルセルロース１ｇを蒸留水３００ｍｌに溶解させた溶液にＥＤＣ１．３０７ｇ（６．８２ｍｍｏｌ）とＮＨＳ０．３９２ｇ（３．４１ｍｍｏｌ）とをそれぞれ１５分間隔で順次加えた。引き続き反応フラスコにＰＴＡ２．５ｇ（０．６２５ｍｍｏｌ）とＰＤＡ２．５ｇ（０．６２５ｍｍｏｌ）とを蒸留水１００ｍｌに溶解させた溶液を混合して３０℃で２４時間反応を進行させた。

反応が終了した溶液は、濾過器を用いて残存する試薬を除去した後、蒸留水で３〜４日間メンブレン透析（６０００〜８０００Ｄａ分子量遮断）を施行した。透析が完了した溶液を凍結乾燥して、白色粉末形態の生成物（ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ）を得た。

＜製造例８＞アルギン酸−ポリ（エチレングリコール）−チラミン／ドーパミン（ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ）の合成
図８は、ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ共重合体の合成模式図を示す。
アルギン酸１ｇを蒸留水３００ｍｌに溶解させた溶液にＥＤＣ１．３０７ｇ（６．８２ｍｍｏｌ）とＮＨＳ０．３９２ｇ（３．４１ｍｍｏｌ）とをそれぞれ１５分間隔で順次加えた。引き続き反応フラスコにＰＴＡ２．５ｇ（０．６２５ｍｍｏｌ）とＰＤＡ２．５ｇ（０．６２５ｍｍｏｌ）とを蒸留水１００ｍｌに溶解させた溶液を混合して３０℃で２４時間反応を進行させた。

反応が終了した溶液は、濾過器を用いて残存する試薬を除去した後、蒸留水で３〜４日間メンブレン透析（６０００〜８０００Ｄａ分子量遮断）を施行した。透析が完了した溶液を凍結乾燥して白色粉末形態の生成物（ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ）を得た。

本実施例で用いられるヒドロゲルの高分子構成及びヒドロゲルの名称は、次の表２のようである。

＜実験例１＞酵素反応を利用したヒドロゲルの製造
まず、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ高分子をＨＲＰ溶液に溶かした溶液（溶液Ａ）とＨ_２Ｏ_２溶液に溶かした溶液（溶液Ｂ）とを混合して、ヒドロゲルを製造した。また、ＣＰＥＧ−ＴＡ、ＧＰＥＧ−ＴＡ、ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ高分子をそれぞれＨＲＰ溶液（溶液Ａ）とＨ_２Ｏ_２溶液（溶液Ｂ）に溶かした溶液とを混合することによって、ヒドロゲルを製造した。

この際、高分子溶液の最終濃度は、１〜２０重量％まで調節が可能であり、二重注入式注射器キット、及び噴射キットなどを用いて多様な形態への応用が可能であった。

また、Ｈ_２Ｏ_２溶液に、ＧＨＰＡ及びＣＨＰＡ、ＧＰＥＧ−ＴＡ、ＣＰＥＧ−ＴＡ高分子を溶かしたそれぞれの溶液（溶液Ｂ）とＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ高分子をＨＲＰ溶液に溶かした溶液（溶液Ａ）とを混合することによって、ヒドロゲルを製造した。

この際、ＧＨＰＡとＣＨＰＡは、最終濃度を５〜１０重量％、０．０５〜１．５重量％まで調節が可能であり、それ以上の濃度では、粘度が高くなるため、実際の高分子溶液が取り扱いにくいという問題を生じる。

相対的にＰＥＧが導入されたＧＰＥＧ−ＴＡ、ＣＰＥＧ−ＴＡ、ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡの場合、水に対する優れた溶解度を有し、粘度が低いため、高分子溶液の取り扱いが容易であった。

実施例で言及されるヒドロゲルの濃度は、ヒドロゲルが含む高分子の最終濃度である。

図９ないし図１２は、酵素反応を利用した生体注入型組織接着性ヒドロゲルの製造の模式図を示す。

＜実施例２＞二重注入式注射器キットを利用したｉｎｓｉｔｕ形成組織接着性ヒドロゲルの製造
Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ高分子をＨＲＰ溶液に溶かした溶液（溶液Ａ）とＧＨＰＡ、ＣＨＰＡ、ＧＰＥＧ−ＴＡ、ＣＰＥＧ−ＴＡ高分子をＨ_２Ｏ_２溶液に溶かした溶液（溶液Ｂ）とを二重注入式注射器キットを用いてｉｎｓｉｔｕ形成ヒドロゲルを製造した。この際、溶液Ａと溶液Ｂは、それぞれの注射器に入る。また、二重注入式注射器キットに噴射ノズルを用いて生体注入型組織接着性ヒドロゲルの噴射することもできる。

また、ＣＰＥＧ−ＴＡ、ＧＰＥＧ−ＴＡ、ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ高分子をそれぞれＨＲＰ溶液（溶液Ａ）とＨ_２Ｏ_２溶液（溶液Ｂ）とに溶かした溶液を二重注入式注射器キットを用いてｉｎｓｉｔｕ形成ヒドロゲルを先と同様に製造した。

図１３は、二重注入式注射器キットを利用したｉｎｓｉｔｕ形成組織接着性ヒドロゲルの製造の模式図を示す。

＜実施例３＞ＨＲＰ濃度による生体注入型組織接着性ヒドロゲルのゲル化時間の比較評価
ＨＲＰ濃度による生体注入型組織接着性ヒドロゲルのゲル化時間の変化を評価した。実験のために、各高分子をＨ_２Ｏ_２溶液に溶かした溶液（溶液Ａ）と濃度別ＨＲＰ溶液（溶液Ｂ）とを準備し、２つの溶液を同量で混合してヒドロゲルを製造した。

ヒドロゲルの形成時間は、バイアル傾斜法（ｖｉａｌｔｉｌｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）を用いて、流れなくなる時間を測定して分析した。実験結果、ＨＲＰの濃度を調節してゲル化時間を３〜３００秒まで調節が可能であり、高分子濃度によって１〜８秒までゲル化時間を調節した。Ｈ_２Ｏ_２の濃度変化は、ゲル化時間に大きな影響を及ぼさなかった。

ＨＲＰの濃度が増加するにつれてゲル形成時間が短くなるが、その理由は、ＨＲＰの濃度が増加するにつれて、Ｈ_２Ｏ_２の分解が促進されてラジカルの生成速度が速くなり、生成されたラジカルによってゲルが形成されるためである。また、高分子濃度が増加するにつれて、単位時間当たりにＴＡ−ＴＡ複合体を形成することができる高分子鎖の数が増加し、ヒドロゲル形態を保持させる最小ネットワーク数の生成速度に影響を与えてゲル形成時間を短くする。

図１４は、ＨＲＰの濃度による生体注入型組織接着性ヒドロゲルのゲル化時間の比較評価を示す図である。

＜実施例４＞生体注入型組織接着性ヒドロゲルの機械的強度の比較評価
粘弾性測定装置（レオメーター）を用いてＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡＩヒドロゲルとＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ IIヒドロゲルの濃度変化による機械的強度を比較測定し、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＨＰＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡヒドロゲルとＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルでＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II高分子濃度を調節して機械的強度の変化評価を行った。

また、ＧＰＥＧ−ＴＡ、ＣＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＧＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＣＰＥＧ−ＴＡヒドロゲル及びＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡヒドロゲルの機械的強度も評価した。

Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡＩヒドロゲルとＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ IIヒドロゲルは、高分子濃度が５重量％から１０重量％に増加するにつれて、機械的強度が４５０Ｐａから１９００Ｐａ、１９０Ｐａから２５００Ｐａにそれぞれ増加し、５重量％のヒドロゲルでは、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡＩがさらに高い機械的強度を示した一方、１０重量％のヒドロゲルでは、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ IIがさらに優れた機械的強度を表した。

これは、ＴＡ−ＴＡ複合体によるヒドロゲル架橋度と、ＤＡグループとレオメーターメタル表面とのリガンド結合という、２つのヒドロゲルの機械的物性に寄与する要素によって説明可能である。低濃度のヒドロゲルでは、架橋度に影響を受けてＴＡグループが相対的に多くのＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡＩヒドロゲルで強い機械的強度を示した一方で、高い濃度のヒドロゲルでは、ＤＡグループとレオメーターメタル表面とのリガンド結合の増加が影響を与えて、ＤＡグループが相対的に多くのＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ IIヒドロゲルで優れた機械的強度を有すると予想される。

Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＨＰＡとＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡヒドロゲル、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡとＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルで、高分子濃度が１、３、５重量％と増加するほど、機械的強度も次第に増加した。ヒドロゲルを構成する高分子の種類及び濃度によって、１３００〜２８５００Ｐａの機械的強度の変化を示した。ヒドロゲルの全体高分子濃度の上昇と天然高分子のＴＡグループによる架橋度の増加、天然高分子のアミン基と合成高分子のＤＡグループの共有結合の形成などをその理由として挙げられる。

ＧＰＥＧ−ＴＡ５重量％ヒドロゲルとＣＰＥＧ−ＴＡ５重量％ヒドロゲルは、それぞれ２７００Ｐａと６５００Ｐａの機械的強度を示し、Ｔｅｔ−ＴＡ７重量％高分子溶液と共に混合した時、Ｔｅｔ−ＴＡ７＋ＧＰＥＧ−ＴＡ５ヒドロゲルは、１５５００Ｐａ、Ｔｅｔ−ＴＡ７＋ＣＰＥＧ−ＴＡ５ヒドロゲルは、１８９００Ｐａに機械的強度が増加した。より詳細な生体注入型組織接着性ヒドロゲルの機械的強度を表３に示す。

実験結果、高分子の種類と濃度、組み合わせによって多様な機械的強度を有するｉｎｓｉｔｕ形成組織接着性ヒドロゲルを製造できるということを確認した。

図１５は、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡＩとIIヒドロゲルの機械的強度の比較及びＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II高分子濃度によるＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡII＋ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの機械的強度の変化を示す。

＜実施例５＞製造された生体組織接着性ヒドロゲルの生体外安定性の評価
製造された生体組織接着性ヒドロゲルを０．０１Ｍのリン酸緩衝溶液に浸漬して３７℃インキュベーターで体外安定性を評価した。安定性の測定は、０日から３０日までヒドロゲルの重量減少を測定した。一ヶ月が経過した後にも、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ IIヒドロゲルの形態と重量はほぼ１００％保持され、ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡとＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡヒドロゲルは、７０〜８０％、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡヒドロゲルは、４０〜６０％程度保持された。

図１６は、製造された生体組織接着性ヒドロゲルの生体外での（ｉｎｖｉｔｒｏ）安定性を示す。

＜実施例６＞ヒドロゲルの２Ｄ細胞適合性の評価
体外生体適合性の評価のために、テフロン成形を用いて前記ヒドロゲルディスクを製造した後、該製造されたヒドロゲルディスクの表面に骨芽細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１）を培養して細胞の毒性評価を行った。実験に用いられた細胞の濃度は、１×１０^４細胞／ウェルであり、生／死（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ）分析を通じて評価した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ分析は、細胞毒性によって死滅した細胞は赤い色に、生きている細胞は緑色として、毒性の有無を評価する方法である。

その結果、図１７のように、前記製造された生体注入型組織接着性ヒドロゲルで死滅した細胞が観察されないことを確認することによって、ヒドロゲルの優れた体外細胞適合性の結果が得られた。

図１７は、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＴＡ、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＡＧＬ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡヒドロゲルの２Ｄ細胞適合性の評価を示す。

＜実施例７＞ヒドロゲルを利用したｉｎｖｉｔｒｏ接着力の評価
油圧式万能材料試験機（ＵＴＭ）を用いてブタの皮膚でヒドロゲルの接着強度を比較評価し、フィブリングルーとシアノアクリレートを対照群として実験した。

Ｔｅｔ−ＴＡとＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡヒドロゲルは、０．０６２〜０．１２２ＭＰａの接着強度を示し、対照群のフィブリングルーと比較して約６倍の接着強度を示した。Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＨＰＡヒドロゲルの場合、高分子の濃度が増加するにつれて、接着強度も０．１３７〜０．２６０ＭＰａに増加しながら、フィブリングルーの接着強度と比較して約１３倍程度の高い接着強度を示した。

Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡヒドロゲルで高分子の濃度を調節して接着強度を比較した結果、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II ７重量％とＣＨＰＡ５重量％とを混合したヒドロゲルは、０．５４４ＭＰａの接着強度を示した。Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II７＋ＧＰＥＧ−ＴＡ７ヒドロゲルとＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II７＋ＣＰＥＧ−ＴＡ７ヒドロゲルは、それぞれ０．３２５ＭＰａと０．５２８ＭＰａとの接着強度を示し、ＧＰＥＧ−ＴＡ７重量％とＣＰＥＧ−ＴＡ７重量％高分子は、Ｔｅｔ−ＴＡ７重量％高分子と混合されてヒドロゲルを形成しながら、０．２６３ＭＰａと０．３１０ＭＰａとの接着強度を示し、フィブリングルーに比べて、優れた接着強度を示した。

また、ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡヒドロゲルの場合、それぞれ０．２１８、０．２５４、０．１８６ＭＰａの接着強度を示し、この数値は、フィブリングルーに比べて、８〜１１倍程度の高接着力を有することを意味する。

実験結果、高分子の種類と濃度とによって多様な接着強度を示し、対照群として用いられたフィブリングルーに比べて、優れた組織接着性ヒドロゲルを製造できるということを確認した。

図１８ないし図２４は、フィブリングルーとシアノアクリレートとを対照群として、（Ａ）Ｔｅｔ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、（Ｂ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＨＰＡ、（Ｃ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、（Ｄ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、（Ｅ）Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｆ）ＧＰＥＧ−ＴＡ、ＣＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＧＰＥＧ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ＋ＣＰＥＧ−ＴＡ、（Ｇ）ＨＡ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＣＭＣ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡ、ＡＬＧ−ＰＥＧ−ＴＡ／ＤＡヒドロゲルのそれぞれの接着力の評価結果を示す。

＜実施例８＞ヒドロゲルを利用したｉｎｖｉｖｏ接着力の評価
白ウサギを用いてＴｅｔ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの接着力を評価した。実験のために、１つの注射器にＴｅｔ−ＴＡまたはＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II高分子をＨＲＰ溶液に溶かした溶液（溶液Ａ）を入れ、他の一つの注射器にＨ_２Ｏ_２溶液またはＣＨＰＡ、ＧＰＥＧ−ＴＡ高分子をＨ_２Ｏ_２溶液に溶かした溶液（溶液Ｂ）を入れて、二重注入式注射器キットを構成した。白ウサギの背中に５ｃｍサイズの傷をつけ、構成されたキットを用いて傷を縫合した。縫合糸を用いて傷を縫合したモデルを対照群として比較した。

縫合糸で傷を完全に縫合するのに１０分が必要となった一方、構成された二重注入式注射器キットを傷の上に分周すると１分以内にゲル化が進行して迅速に傷を縫合した。傷の縫合後、１０分が経過するとＴｅｔ−ＴＡヒドロゲルを施術した群では傷が開き始めたが、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ IIとＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルは、縫合された状態をよく保持した。

このような結果から、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ IIヒドロゲルとＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II高分子に天然高分子が混合されたヒドロゲルが組織接着剤として効果的に使用可能であるということを確認した。

図２５は、Ｔｅｔ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルのｉｎｖｉｖｏ接着力の評価結果を示す。

＜実施例９＞ヒドロゲルを利用したｉｎｖｉｖｏ止血作用の評価
白ウサギを用いてＴｅｔ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの止血効果を比較評価した。実験のために、生体内接着力の評価と同様の条件で二重注入式注射器キットを構成した。白ウサギの背中に５ｃｍサイズの傷をつけ、構成されたキットを用いて迅速に傷を縫合し、１０分後にヒドロゲルで縫合された傷の上にガーゼを載せて、そっと押してガーゼに付けて出る血痕を肉眼で確認した。

ガーゼに付けられた血痕のサイズは、Ｔｅｔ−ＴＡ＞Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＞＞Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡ≒Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡヒドロゲル順序で小さくなった。特に、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡヒドロゲルとＴｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルとが施術された部位では、ほとんど血痕を確認することができなかった。これは、ヒドロゲルが有する接着力と関連して、優れた接着強度を有するヒドロゲルが傷をさらに完璧に縫合し、これにより、止血効果まで奏すると予想される。

図２６は、Ｔｅｔ−ＴＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＣＨＰＡ、Ｔｅｔ−ＴＡ／ＤＡ II＋ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルのｉｎｖｉｖｏ止血作用の評価結果を示す。

本発明は、生体注入型組織接着性ヒドロゲル及びその生医学的用途に関連する分野に適用可能である。

Claims

ｉ）フェノール、アニリン、フェノール誘導体及びアニリン誘導体から選択された１つ以上の化合物と、ドーパまたはドーパ誘導体から選択された１つ以上の化合物とが結合した、化１で表されるスター型高分子；
ｉｉ）フェノール、アニリン、フェノール誘導体及びアニリン誘導体から選択された１つ以上の化合物と、ドーパ及びドーパ誘導体から選択された１つ以上の化合物とが結合した、化１で表されるスター型高分子、及び、高分子主鎖にフェノール、アニリン、またはこれらの誘導体のうちから選択された１つ以上の化合物が、水溶性高分子をリンカーとして用いるか、あるいは用いずに結合した、化２で表される分枝状高分子の異種混合物；及び
ｉｉｉ）高分子主鎖にフェノール、アニリン、フェノール誘導体及びアニリン誘導体から選択された１つ以上の化合物と、ドーパ及びドーパ誘導体から選択された１つ以上の化合物とが、水溶性高分子をリンカーとして用いるか、あるいは用いずに結合した、化３で表される分枝状高分子；
からなる群から選択された同種または異種の高分子の２つ以上を含み、
前記フェノール誘導体は、チラミン、ヒドロキシフェニル酢酸、及びヒドロキシプロピオン酸からなる群から選択された１つまたは２つ以上であり、
前記アニリン誘導体は、ヒドロキシエチルアニリン、アミノエチルアニリン、及びアミノベンジルアルコールからなる群から選択された１つまたは２つ以上であり、
前記ドーパ誘導体は、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）、ドーパミン、ノルエピネフリン、及びエピネフリンからなる群から選択された１つまたは２つ以上であり、
２つ以上の高分子間の隣接するフェノール、アニリン、ドーパ、フェノール誘導体、アニリン誘導体、またはドーパ誘導体の間の脱水素結合によって連結されることを特徴とする、化４ないし化７で表される生体注入型組織接着性ヒドロゲル：

上記化学式で、
Ｒは、フェノール、アニリン、ドーパ、ドーパキノン、並びに、チラミン、ヒドロキシフェニル酢酸、及びヒドロキシプロピオン酸からなる群から選択されたフェノール誘導体、並びに、ヒドロキシエチルアニリン、アミノエチルアニリン、及びアミノベンジルアルコールからなる群から選択されたアニリン誘導体、並びに、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）、ドーパミン、ノルエピネフリン、及びエピネフリンからなる群から選択されたドーパ誘導体のうちから選択された何れか１つであり、
Ｘは、ヒドロキシ基またはアミン基であり、
Ｌは、高分子リンカーであり、（Ｌ）は、リンカーを含むか、含まない。
前記高分子に西洋ワサビペルオキシダーゼ及び過酸化水素を添加して、高分子を体内または体外でｉｎｓｉｔｕ架橋させたことを特徴とする、請求項１に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
前記化１ないし化３で表される高分子は、水溶性高分子をリンカーとして用いるか、用いずに、アミノ基、ヒドロキシ基、またはカルボキシル基を有する高分子主鎖に、フェノール、アニリン、ドーパ、及びドーパキノンのうちから選択された何れか１つの化合物を、アミド、ウレタン、ウレア、またはエステル結合させて製造されたことを特徴とする、請求項１に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
前記高分子は、ゼラチン、キトサン、ヘパリン、セルロース、デキストラン、デキストランサルフェート、コンドロイチンサルフェート、ケラタンサルフェート、デルマタンサルフェート、アルギン酸、コラーゲン、アルブミン、フィブロネクチン、ラミリン、エラスチン、ビトロネクチン、ヒアルロン酸、フィブリノーゲン、及び多分枝−高分子からなる群から選択された１つまたは２つ以上の高分子であることを特徴とする、請求項１に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
前記多分枝−高分子は、３分枝−ポリエチレングリコール（３ａｒｍＰＥＧ）、４分枝−ポリエチレングリコール（４ａｒｍＰＥＧ）、６分枝−ポリエチレングリコール（６ａｒｍＰＥＧ）、または８分枝−ポリエチレングリコール（８ａｒｍＰＥＧ）から選択された何れか１つまたは２つ以上の多分枝ポリエチレングリコールと、及びＴｅｔｒｏｎｉｃ（商標）シリーズ（４ａｒｍ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）からなる群から選択された何れか１つまたは２つ以上の高分子であることを特徴とする、請求項４に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
前記リンカーは、陽イオン高分子、陰イオン高分子、両性高分子、非イオン性高分子、及びこれらの組み合わせからなる群から選択された１つまたは２つ以上の水溶性高分子であることを特徴とする、請求項１に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
前記リンカーは、ポリエステル、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、ポリウレタン、ポリアミド、ポリペプチド、多価脂肪族、多環芳香族、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されたことを特徴とする、請求項１に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
前記リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリ（ＤＬ−乳酸−ＣＯ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（（プロピレン）フマレート）、ポリ（（エチレン）フマレート）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されたことを特徴とする、請求項１に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
前記リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ｐｏｌｙＮＩＰＡＡＭ）、ポリフマレート、ポリオルガノホスファゼン、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙＡＡｃ）、ポリアクリルスルホン酸、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ｐｏｌｙＨＥＭＡ）、及びこれらの共重合体からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項１に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
前記共重合体は、ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）シリーズ）、４−分枝ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（商標）シリーズ）、ＰＥＧ−ＰＥＩ、ＰＥＧ−ＰＶＡ、ＰＥＧ−ＰＥＩ−ＰＶＡ、ＰＥＩ−ＰＶＡ、ポリ（ＮＩＰＡＡＭ−ｃｏ−ＡＡｃ）、ポリ（ＮＩＰＡＡＭ−ｃｏ−ＨＥＭＡ）、及びこれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項１２に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
前記ヒドロゲルは、西洋ワサビペルオキシダーゼ、及び過酸化水素の濃度を調節してゲル化時間、ゲル安定性、機械的強度、または含水率から選択された物理化学的性質を調節したことを特徴とする、請求項１に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
前記ヒドロゲルは、水溶性高分子の分子量を調節してゲル化時間、ゲル安定性、機械的強度、または含水率から選択された物理化学的性質を調節したことを特徴とする、請求項１に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
前記ヒドロゲルは、ドーパまたはドーパ誘導体の含有量と、または前記異種混合物でドーパまたはドーパ誘導体を含む高分子とフェノール、アニリン、フェノール誘導体、またはアニリン誘導体を含む高分子間の混合比率によって組織接着の強度調節が可能であることを特徴とする、請求項１に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
前記ヒドロゲルは、二重注入式注射器キット（ｄｕａｌｓｙｒｉｎｇｅｋｉｔ）を構成してｉｎｓｉｔｕ架橋形成したことを特徴とする請求項１に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
前記二重注入式注射器キット（ｄｕａｌｓｙｒｉｎｇｅｋｉｔ）に噴射ノズルを結合して噴射（ｓｐｒａｙ）可能にしたことを特徴とする請求項１４に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
前記二重注入式注射器キットとテフロン成形とを用いて、ヒドロゲルシートまたはディスクを製造したことを特徴とする、請求項１４に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
チロシンを含むペプチドをさらに含有することを特徴とする、請求項１６に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲル。
請求項１ないし請求項１７のうち何れか一項に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲルを含む、組織接着及び止血用素材。
前記素材は、血管外科領域を含んだ脳神経外科手術と、骨の接着を含んだ整形外科手術と、裂傷患者の止血と、大腿動脈の縫合と、白内障切開縫合、軟骨及び関節軟骨治癒と、皮膚接合と、臓器／分泌腺切開面止血と、胃腸管分合と、及び筋及び靭帯治癒からなる群から選択された何れか１つに適用されたことを特徴とする、請求項１８に記載の組織接着剤及び止血剤用素材。
請求項１ないし請求項１７のうち何れか一項に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲルを含む、組織再生及び充填用インプラント素材。
前記インプラント素材は、軟骨再生、骨再生、歯槽骨再生、皮膚再生、心筋再生、人工水晶体、脊髓神経再生、脳神経再生、声帯再生及び充填剤、癒着防止膜、尿失禁治療剤、シワ除去用充填剤、火傷治療剤、組織充填剤、及び脊椎椎間板治療剤からなる群から選択された何れか１つに適用されたことを特徴とする、請求項２０に記載の組織再生及び充填用インプラント素材。
請求項１ないし請求項１７のうち何れか一項に記載の生体注入型組織接着性ヒドロゲルを含む、薬物伝達用担体。
前記生理活性物質または薬物は、ペプチドまたはタンパク質医薬品、抗菌剤、抗癌剤、及び抗炎症剤からなる群から選択された何れか１つまたは２つ以上であることを特徴とする、請求項２２に記載の薬物伝達用担体。
前記ペプチドまたはタンパク質医薬品は、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、骨成長因子（ＢＭＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）、白血球成長因子（Ｇ−ＣＳＦ）、赤血球成長因子（ＥＰＯ）、大食細胞成長因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、インターフェロン−α，β，γ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、カルシトニン、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子、アンジオテンシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン作動薬（ＬＨＲＨアゴニスト）、インシュリン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ソマトスタチン、グルカゴン、エンドルフィン、バシトラシン、マゲイン、コリスチン、単一抗体、ワクチン類、及びこれらの混合物からなる群から選択された何れか１つであることを特徴とする、請求項２３に記載の薬物伝達用担体。
前記抗菌剤は、ミノサイクリン、テトラサイクリン、オフロキサシン、ホスホマイシン、マゲイン、プロフロキサシン、アンピシリン、ペニシリン、ドキシサイクリン、チエナマイシン、セファロスポリン、ノルキサシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ミクロノマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ジベカシン、セフォタキシン、セファクロル、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、エノキサシン、バンコマイシン、イミペネム、フシジン酸、及びこれらの混合物からなる群から選択された何れか１つであることを特徴とする、請求項２３に記載の薬物伝達用担体。
前記抗癌剤は、パクリタキセル、タキソテール、アドリアマイシン、エンドスタチン、アンギオスタチン、マイトマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、カボプラチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、アクチノマイシン−Ｄ、及びこれらの混合物からなる群から選択された何れか１つであることを特徴とする、請求項２３に記載の薬物伝達用担体。
前記抗炎症剤は、アセトアミノフェン、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、ピロキシカム、フェノプロフェン、フルビプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、スプロフェン、ロキソプロフェン、シノキシカム、テノキシカム、及びこれらの混合物からなる群から選択された何れか１つであることを特徴とする、請求項２３に記載の薬物伝達用担体。