KR101040561B1

KR101040561B1 - 효소촉발형 생체주입형 하이드로젤과 그 생의학적 용도

Info

Publication number: KR101040561B1
Application number: KR1020080134113A
Authority: KR
Inventors: 박기동; 정윤기; 박경민
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2008-12-26
Filing date: 2008-12-26
Publication date: 2011-06-16
Anticipated expiration: 2028-12-26
Also published as: KR20100076173A

Abstract

본 발명은 페놀 (phenol) 혹은 아닐린 (aniline) 유도체가 결합된 다양한 합성, 천연, 합성/천연 하이브리드 고분자를 기재로 하여 효소 반응을 이용한 생체주입형 하이드로젤 개발에 관한 것이다. 상기 제조된 생체주입형 하이드로젤의 반응 속도 조절 용이성과 우수한 생체 적합성을 기반으로 조직공학 또는 약물 전달 시스템을 포함한 생의학적 용도에 관한 것이다.

테트로닉, 티라민, 합성, 고분자, 효소, 하이브리드, 주입형, 하이드로젤

Description

효소촉발형 생체주입형 하이드로젤과 그 생의학적 용도{Enzyme-triggered injectable hydrogels and their biomedical applications}

본 발명은 조직공학 또는 약물 전달 시스템을 포함한 다양한 생의학적 응용을 위한 효소 반응을 이용한 생체주입형 하이드로젤에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 페놀 (phenol) 유도체가 결합된 다양한 합성, 천연, 합성/천연 하이브리드 고분자를 기재로 하여 효소를 이용한 생체주입형 하이드로젤 개발에 관한 것이다. 상기 제조된 생체주입형 하이드로젤의 반응 속도 조절 용이성과 우수한 생체 적합성을 기반으로 조직공학 또는 약물 전달 시스템을 포함한 생의학적 용도에 관한 것이다.

하이드로젤은 그의 생체 적합성, 높은 수분 함량 및 영양분과 대사 산물의 우수한 투과성으로 인해 삽입물, 약물 및 세포 전달 담체와 같은 약학 및 생물 의 학적 응용을 위한 재료로서 널리 연구되었다. 천연 및 합성 중합체 모두는 하이드로젤 제조에 사용될 수 있다. 중합체 사슬의 교차-결합은 다양한 화학적 및 물리적 교차-결합 방법에 의해 달성될 수 있다. 지난 10년 간 연구 관심은 하이드로젤 삽입물에서 주입 위치에서 육안으로 측정할 수 있는 젤을 형성하는 주입형 형성물 형태로 개량화 되었다.

생체주입형 하이드로젤 시스템은 최소 침투 기술을 기반으로 한 환자에게 편안함을 부여하는 용이한 형태로의 응용이 많은 주목을 받아 왔다. 이들 시스템은 원하는 조직, 기관 또는 체강 내에서 응고되기 전에 최소 침투 방식으로 신체 내에 젤을 형성할 수 있는 주입형 유동체이다.

예를 들어 생체주입형 하이드로젤 시스템은 이식을 위한 외과적 시술을 필요로 하지 않고, 많은 치료 약물이 단순한 혼합을 통해 통합될 수 있다. 이들 하이드로젤을 이용하여 결함 또는 체강 함몰 부위를 충진시키는 것이 가능하다. 하이드로젤 시스템은 그의 기계적 물성이 존재하지 않으나 재료의 형태는 높은 세포 분주 효율, 연약한 약물(펩타이드, 단백질 및 DNA 포함)의 사용 및 세포 및 생성물로의 영양물의 우수한 운송과 같은 여러 장점을 지닌다.

더욱이 생체주입형 하이드로젤 시스템은 세포 부착 리간드로 용이하게 변형된다. 주입형 하이드로젤은 UV-중합반응, 비-공유결합 도입 후 또는 가역적 상호 작용 또는 비가역적 화학 반응에 의한 자가-조립을 통해 수득될 수 있다. 이들 주입형 시스템은 광-개시제, 교차-결합제와 같은 독성 첨가제의 사용, 약한 기계적 물성(물리적 교차-결합)과 같은 일부 제한을 지닌다. 최근 말단기-특이적 화학 반응(예를 들어 Micheal 추가 및 효소 반응)이 널리 조사되고 있다. 특히 효소적 교차-결합 시스템은 생체 적합성 및 반응 시간 제어의 용이성과 같은 장점을 지닌다.

덱스트란-티라민(dex-TA) 컨쥬게이트 및 히알루론산-티라민(HA-TA) 컨쥬게이트는 H₂O₂ 및 당근 과산화효소(HRP)의 존재 하에서 효소 반응을 통해 생체주입형 하이드로젤 시스템으로 개발되었고 이는 화학적 교차-결합을 지닌 높은 탄력성 및 분해 가능한 하이드로젤을 생성할 수 있게 한다. 컨쥬게이트 내 페놀 유도체의 HRP-매개된 커플링 반응은 오르토(ortho) 위치에서의 탄소-탄소 결합을 통하여 또는 오르토 위치에서의 탄소와 페녹시 산소 사이의 탄소-산소 결합을 통해 발생된다. 젤화 시간은 HRP 및 H₂O₂ 농도에 따라 상이하나 몇 초 내지 몇 분으로 제어될 수 있다. 이들은 효소 반응을 이용한 생체주입형 하이드로젤을 이용하여 시험관 내 및 생체 내 연구가 진행되고 있다.

합성 및 천연 유래 물질 모두는 재생 약물 및 조직공학에 널리 응용되고 있다. 일반적으로 천연 중합체는 수용체-결합 리간드의 존재를 포함한 생물학적 인 식 및 세포 기작을 이용한 단백질 분해성 분해(예를 들어 매트릭스 메탈로프로테나제(MMP)) 및 재형성에 대한 감수성과 같은 일부 이점을 지닌다. 이들 이점에도 불구하고 이들은 조직공학에 대해 약한 기계적 물성 및 생체 내 빠른 분해와 같은 제한을 지닌다. 한편 합성 중합체는 우수한 기계적 물성 및 화학적 변형 용이성을 지닌다. 따라서 많은 간행물들은 정제, 면역원성 및 병원체 전염과 관련된 복잡성을 포함한 세포 기질로서 합성/천연 하이브리드 생체 적합 물질의 개발을 진행하고 있다.

고분자 골격의 분해 속도는 세포 증식 및 생체 적합 물질의 합성에 영향을 미칠 수 있는 중요한 인자 중 하나이다. Catharina et al.은 매트릭스 메탈로프로테나제(MMP) 분해 가능 펩타이드와 교차 결합을 지닌 효소 분해 가능한 폴리(에틸렌 글리콜) 하이드로젤로 캡슐화된 세포의 행태를 조사하였다. 이들은 분해 가능 하이드로젤은 생체 적합 물질의 증가된 발현과 유효한 세포 증식을 유발함을 나타내었다.

따라서 본 발명은 테트로닉-티라민(Tet-TA), 젤라틴-하이드록시페닐아세트산(GHPA) 및 히알루론산-티라민(HA-TA) 컨쥬게이트로 구성된 효소 기작을 이용한 주입형 하이드로젤을 개발함으로서 본 발명을 완성하게 된 것이다. 즉 조직공학용 주입형 골격, 서방형 약물 전달(단백질, DNA, 성장 인자, 세포), 조직 충전제, 상처 치료 및 장 유착 방지 등의 다양한 생의학적 응용을 위해 생체주입형 하이드로젤을 개발한 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 효소 반응을 이용한 주입형 하이드로젤을 개발코자 한 것이다. 더욱 상세하게는 생체 안전성, 반응 속도의 쉬운 조절이 가능한 여러 가지 주입형 하이드로젤을 개발함으로서 주입형 하이드로젤의 생의학적 적용을 확장코자 한 것이다.

본 발명의 목적은 하기 식(Ⅱ)a로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 곁가지형(branched) 고분자, 하기 식(Ⅱ)b로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 스타형 고분자 및 하기 식(Ⅱ)c로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 선형 고분자에서 선택된 1종 이상의 고분자 혼합물에 당근 과산화효소(HRP)와 과산화수소를 첨가시켜 페놀 유사 체 간의 탈수소 결합을 통해 제조된 하기 식(Ⅰ)로 표시되는 효소 감응성 체내 주입형 하이드로젤을 제공하는 것이다.

또한 상기 식(Ⅱ)a, 식(Ⅱ)b 및 식(Ⅱ)c에 결합된 페놀 유사체는 카르복실기 또는 아미노기 등의 관능기를 지닌 고분자 사슬에 하기 식(Ⅲ)으로 표시되는 페놀 유도체를 아마이드 결합시켜 제조된 것임을 특징으로 한다:

식(Ⅲ)

상기 식에서 R은 카르복실기 또는 아미노기이다.

또한 상기 고분자는 천연 또는 합성 고분자이며, 고분자 내에 단백질 또는 단백질 유도체를 포함함을 특징으로 한다.

또한 상기 합성 고분자는 수용성 고분자이며, 다관능기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥시드(PEO), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리비닐알콜(PVA) 또는 이들의 공중합체에서 선택된 1종 이상의 고분자임을 특징으로 한다.

한편 상기 천연 고분자는 히알루론산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 알지네이트 또는 키토산에서 선택된 1종 이상의 천연 고분자임을 특징으로 한다.

또한 상기 단백질은 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 엘라스틴(elastin), 비트로넥틴(vitronectin) 또는 피브리노겐(fibrinogen)에서 선택된 1종 이상의 단백질임을 특징으로 한다.

또한 상기 페놀 유도체(Ⅲ)는 하기 반응식에 의거 아마이드 결합을 통해 상기 식(Ⅱ)a, 식(Ⅱ)b 및 식(Ⅱ)c로 표시되는 고분자에 도입시킴을 특징으로 한다:

상기 식에서 EDC는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드를 나타내고 NHS는 N-하이드록시숙신이미드를 나타내며 TEA는 트리에틸아민, DMAP는 디메틸암모늄피리딘을 나타낸다.

한편 상기 체내 주입형 하이드로젤은 당근 과산화효소와 과산화수소의 농도를 조절하여 젤화 시간, 분해 시간, 하이드로젤의 기계적 성질을 조절함을 특징으로 한다.

또한 상기 체내 주입형 하이드로젤은 과산화수소의 농도 조절을 통해 함수율 조절이 가능함을 특징으로 한다.

한편 본 발명의 또다른 목적은 상기 체내 주입형 하이드로젤을 체내 주입형 임플란트 소재로 사용하는 방법을 제공하는 것이다.

또한 상기 체내 주입형 하이드로젤은 분해속도 조절능 및 세포친화력을 통해 주름 제거용 충진제, 요실금 치료제에 적용함을 특징으로 한다.

또한 상기 체내 주입형 하이드로젤은 분사시켜 장유착 방지막또는 화상 치료제(wound dressing)로 적용함을 특징으로 한다.

한편 본 발명의 또다른 목적은 상기 체내 주입형 하이드로젤을 생리활성물질의 전달체로 사용하는 방법을 제공하는 것이다.

또한 상기 생리활성물질은 펩타이드 또는 단백질 의약품, 항균제, 항암제 또는 항염증제에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 한다.

또한 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 인간성장호르몬(hGH), 돼지성장호 르몬(pGH), 백혈구성장인자(G-CSF), 적혈구성장인자(EPO), 대식세포성장인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 상피세포 성장인자(EGF), 혈소판유도성장인자(PDGF), 인터페론-α,β 또는 γ(IFN-α,β 또는 γ), 인터루킨-2(IL-2), 칼시토닌, 신경성장인자(NGF), 성장호르몬 방출인자, 엔지오텐신, 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 작동약(LHRH agonist), 인슐린, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(TRH), 엔지오스태틴, 엔도스태틴, 소마토스타틴, 글루카곤, 엔도르핀, 바시트라신, 머게인, 콜리스틴, 바시트라신, 단일 항체, 백신류 또는 이들의 혼합물에서 선택된 1종 이상이고, 상기 항균제는 미노싸이클린, 테트라싸이클린, 오플록사신, 포스포마이신, 머게인, 프로플록사신, 암피실린, 페니실린, 독시싸이클린, 티에나마이신, 세팔로스포린, 노르카디신, 겐타마이신, 네오마이신, 가나마이신, 파로모마이신, 미크로 노마이신, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 세포탁신, 세파클러, 에리스로마이신, 싸이프로플록사신, 레보플록사신, 엔옥사신, 반코마이신, 이미페넴, 후시딕산 또는 이들의 혼합물에서 선택된 1종 이상이며, 상기 항암제는 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D 또는 이들의 혼합물에서 선택된 1종 이상이고, 상기 항염증제는 아세토아민펜, 아스피린, 이부프로펜, 디크로페낙, 인도메타신, 피록시캄, 페노프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 수프로펜, 록소프로펜, 시녹시캄, 테녹시캄 또는 이들의 혼합물에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 한다.

본 발명의 효과는 효소 기작을 이용한 주입형 하이드로젤을 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는 생체 안전성, 반응 속도의 쉬운 조절이 가능한 여러 가지 주입형 하이드로젤을 제공함으로서 주입형 하이드로젤의 생의학적 적용을 확장시킨 것이다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 Tet-TA 합성 하이드로젤, Tet-TA/GHPA 하이브리드 하이드로젤 또는 Tet-TA/HA 하이브리드 하이드로젤과 같은 다양한 형태의 생체주입형 하이드로젤을 제조할 수 있다. Tet-TA/GHPA 하이브리드 하이드로젤의 경우 젤라틴은 세포에 대한 MMP 및 생리활성 기질에 의한 단백질성 분해에 대한 역할을 지닌다. 이들의 젤화 시간, 팽윤 정도, 분해 및 기계적 물성과 같은 물리화학적 특성은 H₂O₂ 농도에 따라 다르게 특성화된다. 더욱이 시험관 내 세포 활성 측정은 그의 세포 적합성을 확인하기 위해 조사되었다.

또한 본 발명은 재생 약물용 및 조직공학용으로 하이브리드 인공 세포외 매트릭스(artificial extracellular matrix, aECM)로서 Tet-TA/GHPA로 구성된 효소 반응을 이용한 생체주입형 하이드로젤을 합성하였다.

조직공학용 유효 골격으로서 인공 세포외 매트릭스

효소로 생분해 가능함을 근거로 하여 매트릭스를 제조한다. 이때 하이드로젤의 분해 속도는 젤 내부에 있는 세포의 분화 및 성장에 매우 중요한 역할을 한다. 따라서 적절한 분해 속도 조절이 필수적이다. 특히, 젤라틴은 세포가 분비하는 매트릭스 메탈로프로테나제(MMP) 특히, MMP-2, 9에 의하여 특이적으로 분해된다. 젤라틴을 함유하는 하이드로젤 메트릭스는 이러한 효소들에 의해 분해가 되고 다시 세포가 분비하는 세포외 매트릭스(ECM)로 재형성되면서 하이드로젤 내부의 세포들이 효과적으로 성장하고 분화하는데 효과적이다.

효과적 3차원 세포 배양을 위한 매트릭스 경직도 효과

조직공학용 지지체로 사용되는 하이드로젤의 매트릭스 경직도 역시 젤 내부에 있는 세포의 성장과 분화에 많은 영향을 미친다. 또한 각 세포마다 적절한 매트릭스 경직도(stiffness)가 요구된다. 예를 들어 골세포는 경직도가 딱딱한 매 트릭스에서 잘 성장하는 것으로 나타났으며, 연조직 세포(섬유아세포, 근육모세포 등)는 부드러운 매트릭스에서 잘 성장하는 것으로 알려지고 있다. 효소 반응을 이용한 시스템에서는 과산화수소의 양을 조절함으로써 쉽게 하이드로젤의 가교를 조절할 수 있으며, 따라서 하이드로젤의 경직도를 쉽게 조절할 수 있다. 또한 합성고분자인 테트로닉을 사용함으로써 기계적 강도의 보완이 가능하며, 천연 고분자와의 혼합 사용으로 생리활성도(bioactivity)를 동시에 증가시킬 수 있는 장점이 있다.

조직공학용 및 약물 전달용 유효 골격(scaffold)으로서 하나의 인공 세포외 매트릭스

효소 반응에 이용되는 하이드록시 페놀 그룹을 가지고 있는 분자들을 이용하여 매트릭스를 제조한다. Tet-TA와 GHPA 하이브리드 하이드로젤을 기본 구조로 한다. 여기서 젤라틴은 MMP 민감성 분해 사이트로도 작용하여 생리활성적인 성질도 나타낸다. 다양한 성장인자들과 물리적 결합을 잘하는 헤파린에 티라민(TA)을 도입하여 성장인자를 효과적으로 담지하고 서방형 방출 거동을 가능하게 한다(성장 인자 결합 사이트). 티로신(하이드록시 페놀 역할)이 결합되어 있는 세포 접착 단백질을 이용하여 하이드로젤 메트릭스 내부의 세포 접착력을 향상시킨다.

효과적인 세포의 성장과 분화에 필요한 이러한 성분들을 효소 기작을 이용하 여 한 번에 인공 ECM을 만들 수 있다.

도 20은 효소 기작을 이용한 효과적인 인공 세포외 매트릭스의 모식도를 나타낸다.

효소 반응을 이용한 생체주입형 하이드로젤의 응용

조직공학용 주입형 골격을 지니고, 서방형 약물 전달(단백질, DNA, 성장 인자, 세포) 물질로 활용이 가능하며, 조직 충전제(요실금 치료, 주름 개선 등)로 사용될 수도 있다. 또한 주입형 하이드로젤은 상처 치료, 장 유착 방지막 등의 다양한 응용이 가능하며 특히 양쪽 주사기 끝에 분사 노즐을 연결하여 분사 가능한 하이드로젤 형태가 가능하여 그 응용성이 넓을 것으로 기대된다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

(제조실시예 1) 분해성 테트로닉-티라민의 합성

테트로닉-숙신산 무수물(Tet-SA)의 합성

테트로닉 30 g(1.67 mmol)을 디옥산 300 ml에 용해시킨 후 이 용액에 4-디메틸아미노피리딘(DMPA) 1.018 g(8.33 mmol)과 트리에티아민(TEA) 0.843 g(8.33 mmol)을 디옥산 40 ml에 용해시킨 용액과 숙신산 무수물 0.843 g(8.33 mmol)을 디옥산 40 ml에 용해시킨 용액을 순차적으로 혼합한다. 테트로닉 : 숙신산 무수물 : DMAP : TEA의 몰비율은 1 : 5 : 5 : 5이다. 이 때 반응 온도는 30℃이며 질소분위기에서 24시간 반응을 진행시킨다. 반응 종료 후 용액을 여과기를 이용하여 잔존하는 시약들을 제거한 후 회전식 증발 농축기를 이용하여 반응 용액을 농축시킨다. 농축 용액을 차가운 에테르 1600 ml에 한 방울씩 떨어뜨려 침전물을 생성시키고 이 침전물을 여과기를 이용하여 여과시켜 생성물을 수득한다. 수득된 생성물은 잔여 유기용매를 제거하기 위해 진공 오븐에 24시간 방치한 후 결과적으로 백색의 분말 형태의 생산물을 수득하게 된다.

분해성 테트로닉-티라민의 합성

Tet-SA 20 g(1.11 mmol)을 테트라하이드로푸란(THF) 200 ml에 용해시킨 후 이 용액에 디클로로카르보디이미드(DCC) 1.145 g(5.55 mmol)과 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 0.633 g (5.55 mmol)을 각각 THF 50 ml과 100 ml에 용해시킨 용액을 15분 간격으로 순차적으로 혼합한다. 이때 Tet-SA : DCC : NHS : TA의 몰비율은 1 : 5 : 5 : 5이다. 15분 후 티라민(TA) 0.761 g(5.55 mmol)을 THF 150 ml에 용해시킨 용액을 첨가하여 반응을 진행한다. 이 때 반응 온도는 30℃이며 질소분위 기에서 24시간 반응을 진행한다. 반응 종료 후 반응 용액을 아세톤을 이용하여 멤브레인 투석(3500 da의 분자량 차단)을 통해 반응하지 않은 TA를 제거한다. 투석이 완료된 후 용액을 여과기를 통하여 여과하고 회전식 증발농축기를 이용하여 용액을 농축시킨 후 차가운 에테르 1600 ml에 침전물을 생성시킨다. 생성된 침전물은 여과기를 통하여 여과하고, 여과된 침전물을 진공오븐에 24시간 방치한 후 백색의 분말 생성물(분해성 Tet-TA)을 수득하게 된다.

도 1은 분해성 Tet-TA 컨쥬게이트의 합성 모식도를 나타낸다.

(제조실시예 2) 비분해성 테트로닉-티라민의 합성

테트로닉-(p-니트로페닐 클로로포메이트)(Tet-PNC)의 합성

테트로닉 30 g(1.67 mmol)을 디옥산 300 ml에 용해시킨 후 이 용액에 4-디메틸아미노피리딘(DMPA) 1.018 g(8.33 mmol)과 트리에티아민(TEA) 0.843 g(8.33mmol)을 디옥산 40 ml에 용해시킨 용액과 p-니트로페닐 클로로메이트(PNC) 1.679 g(8.33 mmol)을 디옥산 50 ml에 용해시킨 용액을 순차적으로 혼합한다. 테트로닉 : 숙신산 무수물 : DMAP : TEA의 몰비율은 1 : 5 : 5 : 5이다. 이 때 반응 온도는 30℃이며, 질소분위기에서 24시간 반응을 진행한다. 반응 종료 후 용액을 여과기를 이용하여 잔존하는 시약들을 제거한 후 회전식 증발 농축기를 이용하여 반응 용액 을 농축시킨다. 농축 용액을 차가운 에테르 1600 ml에 한 방울씩 떨어뜨려 침전물을 생성시키고 이 침전물을 여과기를 이용하여 여과하여 생성물을 수득한다. 수득된 생성물은 잔여 유기용매를 제거하기 위해 진공 오븐에 24시간 방치한 후 결과적으로 백색의 분말 형태의 생산물을 수득하게 된다.

비분해성 테트로닉-티라민의 합성

Tet-PNC 20 g(1.11 mmol)을 테트라하이드로푸란(THF) 200 ml에 용해시킨 용액에 티라민(TA) 0.761 g(5.55 mmol)을 THF 150 ml에 용해시킨 용액을 첨가하여 반응을 진행한다. Tet-PNC : TA의 몰비율은 1 : 5이다. 이 때 반응 온도는 30℃이며 질소분위기에서 24시간 반응을 진행한다. 반응 종료 후 반응 용액을 아세톤을 이용하여 멤브레인 투석(3500 da 분자량 차단)을 통하여 반응하지 않은 TA를 제거한다. 투석이 완료된 후 용액을 여과기를 통하여 여과하고 회전식 증발농축기를 이용하여 용액을 농축시킨 후 차가운 에테르 1600 ml에 침전물을 생성시킨다. 생성된 침전물은 여과기를 통하여 여과하고, 여과된 침전물을 진공오븐에 24시간 방치한 후 백색의 분말 생성물(비분해성 Tet-TA)을 수득하게 된다.

도 2는 비분해성 Tet-TA 컨쥬게이트의 합성 모식도를 나타낸다.

(제조실시예 3) 효소 반응을 이용한 Tet-TA 하이드로젤의 제조

당근 과산화효소(HRP): 단일 사슬의 α-타입 헴단백질로 방향족 전자 공여자 존재시 과산화수소(H₂O₂)를 분해하여 라디칼을 형성하고 이로 인하여 탄소-탄소 결합 혹은 탄소-산소 결합을 형성하게 한다.

용액 A [Tet-TA (20 wt%)과 동량의 HRP를 포함하는 수용액]와 용액 B [Tet-TA (20 wt%)과 동량의 H₂O₂를 포함하는 수용액]를 동량 혼합함으로써 하이드로젤을 형성시킨다. 최종 고분자 농도가 10 wt% 되도록 용액의 수분을 조절한다. 이때 양쪽 주사기를 사용하여 하이드로젤 형성 가능하다.

도 3은 효소 반응을 이용한 Tet-TA 하이드로젤 형성 모식도를 나타낸다.

도 4는 양쪽 주사기를 이용한 하이드로젤의 제조와 테프론 몰드를 이용한 하이드로젤 격자 형성을 나타낸다.

(실시예 1) Tet-TA 하이드로젤의 젤화 시간 및 함수율 평가

1) ¹H NMR을 통한 화학적 구조 분석

TA 치환물의 특성 최고점인 h 및 i(6.91-7.23 ppm)를 확인함으로써 합성이 잘 수행되었음을 확인하였다.

도 5는 Tet-TA 컨쥬게이트의 ¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다.

2) 젤화 시간 평가

HRP, H₂O₂, 고분자 농도에 따른 젤화 시간의 조절이 가능하다. 또한 각 요소에 따라 젤화 시간을 최소 2초에서 최대 2분까지 조절 가능하다. 즉 HRP의 농도가 증가함에 따라 젤화 시간이 짧아지고, HRP의 농도가 증가할수록 과산화수소의 분해가 촉진되어 결국 라디칼의 생성 속도가 빨라지게 된다. 따라서 생성된 라디칼에 의하여 젤이 형성되기 때문에 젤화 시간이 빨라지게 된다.

한편 H₂O₂의 농도가 증가함에 따라 젤화 시간이 다소 느려진다. 즉 H₂O₂의 농도가 증가하게 되면 과산화가 되어 HRP의 활성이 줄어들게 되며 따라서 젤화 시간이 느려진다.

한편 고분자의 농도가 증가할수록 젤화 시간이 짧아진다. 고분자의 농도가 증가하게 되면 방향족 전자 공여자가 증가하게 됨으로 젤화 시간이 빨라지게 된다.

도 6은 Tet-TA 하이드로젤의 젤화 시간 변화를 나타낸다: (a) HRP의 농도 영향에 의한 젤화 시간의 변화, (b) H₂O₂의 농도 영향에 의한 젤화 시간의 변화, (c) 고분자 농도의 영향에 의한 젤화 시간의 변화를 나타낸다.

3) 함수율 평가

HRP와 H₂O₂의 농도를 조절하여 가교 정도를 조절하고 그에 따른 함수율을 평가하였다. HRP 농도는 가교 속도에 영향을 미치기 때문에 함수율에 크게 영향을 미치지 않는다. H₂O₂의 농도가 낮을수록 함수율이 낮아지고 이는 이론적으로 가교 정도가 적어지면 함수율이 증가하지만 Tet-TA 하이드로젤의 경우, 과산화 수소의 농도가 낮으면서 분해 속도가 빨라지기 때문에 이와 같은 결과를 나타낸다.

도 7은 Tet-TA 하이드로젤의 함수율 측정 결과를 나타낸다: (a) HRP 농도에 따른 영향에 따른 하이드로젤의 함수율 측정 결과, (b) H₂O₂의 농도에 따른 영향에 따른 하이드로젤의 함수율 측정 결과를 나타낸다.

(실시예 2) 하이드로젤 안정성 평가

HRP와 H₂O₂의 농도에 따라 분해성 및 비분해성 Tet-TA 하이드로젤의 안정성 평가를 수행하였다. 분해성 Tet-TA 하이드로젤의 경우 초기 100∼200%의 함수율을 나타내나 고분자의 에스테르 결합의 가수 분해로 인하여 3∼6일 후 하이드로젤이 분해된다.

한편 비분해성 Tet-TA 하이드로젤의 경우 2달 이상 초기 중량의 50% 정도 유지할 수 있다.

도 8은 Tet-TA 하이드로젤의 중량 변화에 따른 안정성 평가를 나타낸다: (a) HRP의 영향에 따른 중량 변화, (b) H₂O₂의 영향에 따른 중량 변화를 나타낸다.

(실시예 3) Tet-TA 하이드로젤의 기계적 강도 평가

레오미터(rheometer)를 이용하여 하이드로젤의 기계적 강도 측정하였다. H₂O₂의 농도에 따라 기계적 강도 조절 가능하다. 테트로닉 자체가 온도감응성 재료이기 때문에 온도에 따라 약간의 기계적 강도 차이를 나타낼 수 있다. 통상 10³∼10⁴ Pa 정도의 기계적 강도를 나타낸다.

도 9는 Tet-TA 하이드로젤의 온도 및 시간 경과에 따른 기계적 강도 측정을 나타낸 도표이다.

(실시예 4) Tet-TA 하이드로젤의 배지 투과 평가

세포 배양시 사용되는 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM))을 사용하여 하이드로젤의 배지 투과 정도를 평가하였다. 60분 후 배지가 완전히 하이드로젤 메트릭스 안에 투과됨을 확인하였다.

도 10은 Tet-TA 하이드로젤의 배지 투과를 0, 10, 20, 40, 60분 후에 측정한 사진을 나타낸다.

(실시예 5) Tet-TA 하이드로젤의 세포 독성 평가

HRP와 H₂O₂ 농도에 따라 골아세포를 사용하여 초기 세포 독성을 평가하였다. 생존/사멸 에세이를 통하여 살아있는 세포는 녹색으로 죽은 세포는 빨간색으로 표시한다. H₂O₂ 1 wt% 이상에서는 세포독성을 나타내지만 그 이하의 농도에서는 세포독성을 나타내지 않는다.

도 11은 Tet-TA 하이드로젤의 초기 세포 독성 평가(생존/사멸 에세이)를 나타낸 사진이다. 상단의 사진은 0.25 중량% H₂O₂를 고정시킨 후 HRP의 함량을 변화시켜 2시간 동안 배양 후 세포의 생존 사멸을 나타낸 사진이다. 하단의 사진은 0.6 mg/ml로 HRP를 고정시킨 후 H₂O₂의 함량을 변화시켜 2시간 동안 배양 후 세포의 생존 사멸을 나타낸 사진이다.

(실시예 6) Tet-TA/생리활성 분자 혼성 하이드로젤

1) 다양한 생리활성 물질을 포함하는 Tet-TA 하이드로젤을 제조할 수 있다. 즉 생리활성 물질인 헤파린, 젤라틴, 올리고키토산, 히알루론산을 Tet-TA 하이드로젤에 단순히 혼합해줌으로써 생리활성을 증가시킬 수 있다.

2) 젤화 시간 평가

각 생리활성 물질의 혼합에 따른 젤화 시간 변화 평가를 수행하였다. 각각 Tet-TA : 생리활성 물질의 비율은 1 : 1 (부피 : 부피)로 조정하였으며 그 결과 젤화 시간은 전반적으로 Tet-TA 하이드로젤과 유사한 결과를 나타내었으나 상대적으로 분자량이 큰 히알루론산의 경우 젤화 시간이 늦어짐을 확인하였다. 표 1은 생리활성 물질을 함유한 Tet-TA 하이드로젤의 젤화 시간을 나타낸 것이다.

3) 함수율 평가

친수성 생리활성 물질들이 도입됨에 따라 기존 Tet-TA의 함수율이 증가한다. 즉 250∼300% 정도의 함수율을 나타내었다.

도 12는 헤파린, 젤라틴, 올리고키토산, 히알루론산 등의 생리활성 물질을 함유한 Tet-TA 하이드로젤의 함수율을 나타낸 도표이다.

(제조실시예 4) 합성고분자/천연고분자의 하이브리드 하이드로젤의 제조

Tet-TA(합성 고분자)와 GHPA(천연 단백질) 하이브리드 하이드로젤 제조

도 13은 효소 반응에 의한 Tet-TA와 GHPA 하이브리드 하이드로젤의 형성 모식도를 나타낸다.

천연 단백질(GHPA)의 합성 방법

10 g의 젤라틴을 0.1 M MES 200 ml에 용해시킨다(용액A). 4-하이드록시페닐아세트산 0.609g(4 mmol)을 0.1M MES 50 ml에 용해시킨다(용액B). 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC) 0.92 g(4.8 mmol)과 NHS 0.276 g(2.4 mmol)을 각각 5 ml의 0.1 M MES에 용해시킨다. 그 후 EDC 용액과 NHS 용액을 용액 B에 15분 간격으로 순차적으로 가한다. 15분 후 EDC/NHS가 포함된 용액 B를 용액 A에 혼합하여 반응을 시작한다. 이때 반응온도는 40℃이며, 반응시간은 24시간이다. 반응 종료 후 반응 용액을 주사기 필터(450 nm)를 사용하여 여과한다. 그 후 증류수에서 3∼4일 동안 멤브레인 투석(분자량 차단 = 3500 Da)을 시행한다. 투석이 완료된 용액은 동결건조를 통하여 백색 분말형태의 GHPA를 수득하게 된다.

효소 반응을 이용한 Tet-TA/GHPA 하이브리드 하이드로젤의 제조방법

용액 A [Tet-TA(20 wt%)과 GHPA(10 wt%) 동량의 HRP을 포함한 수용액( Tet-TA : GHPA : HRP = 7 : 3 : 10 (부피비)]와 용액 B [Tet-TA(20 wt%)과 GHPA(10 wt%) 동량의 H₂O₂를 포함한 수용액(Tet-TA : GHPA : HRP = 7 : 3 : 10 (부피비)]를 동량 혼합함으로써 하이드로젤을 형성한다. 이때 양쪽 주사기를 사용하여 하이드로젤이 형성 가능하다.

도 14는 효소 반응을 이용한 Tet-TA/GHPA 하이브리드 하이드로젤을 나타낸 사진이다.

(실시예 7) Tet-TA/GHPA 하이브리드 하이드로젤의 체외 세포 적합성 평가

골아세포를 이용하여 세포 적합성 및 세포 부착 평가를 수행하였다. 3일 동안 배양한 결과 Tet-TA 하이드로젤에 비하여 GHPA를 함유한 Tet-TA/GHPA 하이브리드 하이드로젤 시험군에서 우수한 체외 세포 적합성 결과를 얻을 수 있다.

도 15는 Tet-TA 하이드로젤 상의 시험관 내 세포 부착 시험을 나타낸다.

(제조실시예 5) Tet-TA/히알루론산-티라민(HA-TA) 하이브리드 하이드로젤의 제조

도 16은 효소 반응을 이용한 Tet-TA/HA-TA 하이브리드 하이드로젤의 형성 모식도를 나타낸다.

HA-TA의 합성

1 g의 히알루론산(HA)을 0.1 M MES 400 ml에 용해시킨다(용액A). 티라민(TA) 0.108 g(0.787 mmol)을 0.1 M MES 30 ml에 용해시킨다(용액B). 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC) 0.151 g(0.787 mmol)과 NHS 0.109 g(0.109 mmol)을 각각 10 ml의 0.1 M MES에 용해시킨다. 그 후 EDC 용액과 NHS 용액을 용액 B에 15분 간격으로 순차적으로 첨가한다. 또 15분 후 EDC/NHS 용액 B를 용액 A에 혼합하여 반응을 시작한다. 이때 반응온도는 30℃이며, 반응시간은 24시간이다. 반응 종료 후 증류수에서 3∼4일 동안 멤브레인 투석(분자량 차단 = 3500 Da)을 시행한다. 투석이 끝난 용액은 동결건조를 통하여 HA-TA를 수득하게 된다.

(실시예 8) Tet-TA/히알루론산-티라민(HA-TA) 하이브리드 하이드로젤의 젤화 시간 및 함수율 평가

HA-TA의 화학적 구조 분석

도 17은 ¹H NMR을 이용한 HA-TA의 화학적 구조 분석을 나타낸다.

치환 정도(DS) = HA의 100 반복 유니트 당 23

젤화 시간 평가

Tet-TA와 HA-TA의 비율을 조절하여 젤화 시간을 측정한다. 표 2는 테트로닉-PCN-TA와 HA-TA 혼합 비율의 변화에 따른 젤화 시간의 차이를 나타낸다.

함수율 및 팽윤 정도 평가

Tet-TA/HA-TA 하이브리드 하이드로젤의 Tet-TA와 HA-TA 혼합비율에 따른 함수율과 팽윤 정도를 측정하였다. 통상 150∼200%의 함수율을 나타낸다.

도 18은 Tet-TA/HA-TA 하이브리드 하이드로젤의 Tet-TA와 HA-TA 혼합비율에 따른 함수율과 팽윤 정도를 나타낸다.

하이드로젤의 안정성 평가

Tet-TA/HA-TA 하이브리드 하이드로젤의 Tet-TA와 HA-TA 혼합비율에 따른 안정성을 측정하였다. 안정성의 측정은 0일부터 60일까지 하이드로젤의 중량 감소를 측정한 것이다. 통상 2달이 경과한 후에도 초기 하이드로젤 중량의 10∼20%가 잔존한다.

도 19는 Tet-TA/HA-TA 하이브리드 하이드로젤의 Tet-TA와 HA-TA 혼합비율에 따른 안정성 평가를 나타내는 그래프이다.

도 1은 분해성 Tet-TA 컨쥬게이트의 합성 모식도를 나타낸다.

도 3은 효소 기작을 이용한 Tet-TA 하이드로젤 형성 모식도를 나타낸다.

도 5는 Tet-TA 컨쥬게이트의 ¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 13은 효소 기작에 의한 Tet-TA와 GHPA 하이브리드 하이드로젤의 형성 모식도를 나타낸다.

도 14는 효소 기작을 이용한 Tet-TA/GHPA 하이브리드 하이드로젤을 나타낸 사진이다.

도 16은 효소 기작을 이용한 Tet-TA/HA-TA 하이브리드 하이드로젤의 형성 모식도를 나타낸다.

도 20은 효소 기작을 이용한 효과적인 인공 세포외 매트릭스 모식도를 나낸 것이다.

Claims

하기 식(Ⅱ)a로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 곁가지형(branched) 고분자, 하기 식(Ⅱ)b로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 스타형 고분자 및 하기 식(Ⅱ)c로 표시되는 페놀 유사체가 결합된 선형 고분자에서 선택된 1종 이상의 고분자 사슬 내에 단백질 또는 단백질 유도체를 포함하는 천연 또는 합성 고분자 혼합물에 당근 과산화효소(HRP)와 과산화수소를 첨가시켜 페놀 유사체 간의 탈수소 결합을 통해 제조된 하기 식(Ⅰ)로 표시되는 효소 감응성 체내 주입형 하이드로젤에 있어서,

상기 페놀 유사체는 카르복실기 또는 아미노기 등의 관능기를 지닌 상기 식(Ⅱ)a, 식(Ⅱ)b 및 식(Ⅱ)c 고분자 사슬에 하기 식(Ⅲ)으로 표시되는 페놀 유도체를 아마이드 결합을 통해 고분자 사슬에 도입시킨 것임을 특징으로 하는 효소 감응성 체내 주입형 하이드로젤

식(Ⅲ)

상기 식에서 R은 카르복실기 또는 아미노기이다.
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제 1항에 있어서, 상기 합성 고분자는 수용성 고분자이며, 다관능기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥시드(PEO), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리비닐알콜(PVA) 또는 이들의 공중합체에서 선택된 1종 이상의 고분자임을 특징으로 하는 체내 주입형 하이드로젤
제 1항에 있어서, 상기 천연 고분자는 히알루론산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 알지네이트 또는 키토산에서 선택된 1종 이상의 천연 고분자임을 특징으로 하는 체내 주입형 하이드로젤
제 1항에 있어서, 상기 단백질은 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 알부민(albumin), 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), 엘라스틴(elastin), 비트로넥틴(vitronectin) 또는 피브리노겐(fibrinogen)에서 선택된 1종 이상의 단백질임을 특징으로 하는 체내 주입형 하이드로젤
제 1항에 있어서, 상기 페놀 유도체(Ⅲ)는 하기 반응식에 의거 아마이드 결합을 통해 상기 식(Ⅱ)a, 식(Ⅱ)b 및 식(Ⅱ)c로 표시되는 고분자에 도입시킴을 특징으로 하는 체내 주입형 하이드로젤

상기 식에서 EDC는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드를 나타내고 NHS는 N-하이드록시숙신이미드를 나타내며 TEA는 트리에틸아민, DMAP는 디메틸암모늄피리딘을 나타낸다.
제 1항에 있어서, 상기 체내 주입형 하이드로젤은 당근 과산화효소와 과산화수소의 농도를 조절하여 젤화 시간, 분해 시간, 하이드로젤의 기계적 성질을 조절함을 특징으로 하는 체내 주입형 하이드로젤
제 1항에 있어서, 상기 체내 주입형 하이드로젤은 과산화수소의 농도 조절을 통해 함수율 조절이 가능함을 특징으로 하는 체내 주입형 하이드로젤
제 1항의 체내 주입형 하이드로젤을 체내 주입형 임플란트 소재로 사용하는 방법
제 10항에 있어서, 상기 체내 주입형 하이드로젤은 분해속도 조절능 및 세포친화력을 통해 주름 제거용 충진제, 요실금 치료제에 적용함을 특징으로 하는 방법
제 10항에 있어서, 상기 체내 주입형 하이드로젤은 분사시켜 장유착 방지막또는 화상 치료제(wound dressing)로 적용함을 특징으로 하는 방법
생리활성물질의 전달체로서 제 1항의 체내 주입형 하이드로젤
제 13항에 있어서, 상기 생리활성물질은 펩타이드 또는 단백질 의약품, 항균제, 항암제 또는 항염증제에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 체내 주입형 하이드로젤
제 14항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 인간성장호르몬(hGH), 돼지성장호르몬(pGH), 백혈구성장인자(G-CSF), 적혈구성장인자(EPO), 대식세포성장인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 상피세포 성장인자(EGF), 혈소판유도성장인자(PDGF), 인터페론-α,β 또는 γ(IFN-α,β 또는 γ), 인터루킨-2(IL-2), 칼시토닌, 신경성장인자(NGF), 성장호르몬 방출인자, 엔지오텐신, 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 작동약(LHRH agonist), 인슐린, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(TRH), 엔지오스태틴, 엔도스태틴, 소마토스타틴, 글루카곤, 엔도르핀, 바시트라신, 머게인, 콜리스틴, 바시트라신, 단일 항체, 백신류 또는 이들의 혼합물에서 선택된 1종 이상이고, 상기 항균제는 미노싸이클린, 테트라싸이클린, 오플록사신, 포스포마이신, 머게인, 프로플록사신, 암피실린, 페니실린, 독시싸이클린, 티에나마이신, 세팔로스포린, 노르카디신, 겐타마이신, 네오마이신, 가나마이신, 파로모마이신, 미크로 노마이신, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 세포탁신, 세파클러, 에리스로마이신, 싸이프로플록사신, 레보플록사신, 엔옥사신, 반코마이신, 이미페넴, 후시딕산 또는 이들의 혼합물에서 선택된 1종 이상이며, 상기 항암제는 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D 또는 이들의 혼합물에서 선택된 1종 이상이고, 상기 항염증제는 아세토아민펜, 아스피린, 이부프로펜, 디크로페낙, 인도메타신, 피록시캄, 페노프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 수프로펜, 록소프로펜, 시녹시캄, 테녹시캄 또는 이들의 혼합물에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 체내 주입형 하이드로젤