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WO2014046415A1 - 효소 고정화 지지체를 이용한 in situ 형성 하이드로젤의 제조방법 및 이의 생의학적 용도 - Google Patents

효소 고정화 지지체를 이용한 in situ 형성 하이드로젤의 제조방법 및 이의 생의학적 용도 Download PDF

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WO2014046415A1
WO2014046415A1 PCT/KR2013/008202 KR2013008202W WO2014046415A1 WO 2014046415 A1 WO2014046415 A1 WO 2014046415A1 KR 2013008202 W KR2013008202 W KR 2013008202W WO 2014046415 A1 WO2014046415 A1 WO 2014046415A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
hydrogel
enzyme
support
functional group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2013/008202
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
박기동
배진우
박경민
이유진
김배영
이윤기
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation
Original Assignee
Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020130107937A external-priority patent/KR101522462B1/ko
Application filed by Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation filed Critical Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation
Priority to US14/429,576 priority Critical patent/US9844610B2/en
Publication of WO2014046415A1 publication Critical patent/WO2014046415A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing an in situ forming hydrogel having improved biosafety using an enzyme immobilized support, a biomedical use thereof, and a syringe for preparing a hydrogel comprising the support immobilized with the enzyme.
  • Hydrogels have been widely studied as materials for pharmaceutical and biomedical applications such as inserts, drugs and cell delivery carriers because of their biocompatibility, high water content and excellent permeability of nutrients and metabolites.
  • Such hydrogels can be prepared using natural and synthetic polymers, and can form hydrogels through various chemical and physical cross-linking.
  • research interests have been improved to in situ-forming hydrogels, in which polymer solutions are injected into the body to form hydrogels in the body.
  • Bio-injectable hydrogel systems have attracted much attention for their application in an easy form to provide comfort to patients based on minimal infiltration technology.
  • These systems are injectable fluids that can form hydrogels in the body in a minimally invasive manner prior to solidification in the desired tissue, organ or body cavity.
  • bioinjectable hydrogel systems do not require surgical procedures for implantation and can be integrated through simple mixing of many therapeutic drugs. These bio-injectable hydrogels can be used to fill defects or body cavity depressions. While hydrogel systems have low mechanical properties, they have several advantages, such as high cell dispensing efficiency, carriers for delivery of bioactive drugs such as peptides, proteins and DNA, and good nutritional transport into cells and products.
  • This hydrogel has been developed as an in situ forming hydrogel system through enzymatic oxidation in the presence of horseradish peroxidase (HRP) and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ). Disadvantages of hydrogel can improve mechanical strength and body stability.
  • HRP horseradish peroxidase
  • H 2 O 2 hydrogen peroxide
  • Tetronic-Tiramin (Park et al., Biomacromolecules 2010/2012, Soft Matter 2011), gelatin-polyethylene glycol-tyraamine (GPT) (Park et al., Journal of Materials Chemistry 2011) , Dextran-tyramine (dec-TA) (Jin et al., Biomaterials 2007), hyaluronic acid-tyramine (HATA) (Kurisawa et al., Chem. Commun.
  • GHPA gelatin-hydroxypropionic acid
  • GTA gelatin-tyramine
  • AHPA alginic acid-hydroxyphenylacetic acid
  • the enzyme-sensitive hydrogel contains a phenol derivative in the polymer chain, and the phenol derivative is a carbon-carbon bond at the ortho position or carbon between the ortho position and the phenoxyoxygen via an HRP mediated coupling reaction.
  • Hydrogels are formed through oxygen bonds.
  • physicochemical properties such as gel formation time, mechanical strength, and biodegradability of hydrogels can be easily controlled by adjusting the concentrations of HRP and H 2 O 2 , and various bioactive substances, drugs, and cells can be easily supported in the hydrogel.
  • these enzyme-sensitive hydrogels contain enzymes such as HRP derived from plants and animals inside the formed hydrogel, which may cause problems related to biosafety such as immune responses when injected into the body.
  • the present invention is to provide a method for producing a hydrogel so that the enzyme is not contained.
  • the present invention also provides a hydrogel prepared by the above method and its biomedical use.
  • the present invention is to provide a syringe for producing a hydrogel used in the production of the hydrogel.
  • the present invention comprises the steps of preparing a support to which the enzyme is immobilized; Contacting and crosslinking the polymer having a phenol or aniline functional group in the side chain with the support in the presence of hydrogen peroxide; And separating the support to which the enzyme is immobilized to obtain a hydrogel.
  • a method for preparing a hydrogel, and a hydrogel comprising the enzyme prepared by the method, are provided.
  • the present invention also provides an implant material for tissue regeneration and filling comprising the hydrogel.
  • the present invention also provides a carrier for physiologically active substance or drug delivery containing the hydrogel.
  • the present invention is a syringe in which a piston is built in a cylinder having an inner space and generates a discharge force by the slide operation of the piston to discharge the chemical liquid through the needle, the support is fixed to the enzyme inside the needle side of the cylinder Is provided, characterized in that the polymer having a phenol or aniline functional group in the side chain is filled in the cylinder, it provides a syringe for producing a hydrogel.
  • a polymer having a phenol or aniline functional group is crosslinked by an enzyme immobilized on a support to form a hydrogel, thereby obtaining a hydrogel that does not contain an enzyme. Therefore, it is possible to overcome the safety problems in the body, such as immune response due to enzymes can extend the biomedical coverage of the hydrogel.
  • the enzyme immobilized support of the present invention can be reused.
  • 1 is a schematic diagram of surface immobilization of HRP enzyme on glass particles using dopa (3,4-dihydroxyphenylalanine) and DHCA as dopa derivatives.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a method of introducing a carboxyl group after silanization and immobilizing HRP on the surface of glass particles using EDC / NHS.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a method for preparing iron-containing fine polymer particles by copolymerizing an iron compound and a monomer having an epoxy group and immobilizing HRP on the surface of the support.
  • Fig. 4 is a schematic diagram showing the synthesis of tetronic-tyramine (Tet-TA), which is a polymer having a phenol functional group in the side chain.
  • Tet-TA tetronic-tyramine
  • GHPA gelatin-hydroxyphenylacetic acid
  • Fig. 6 is a schematic diagram showing the synthesis of chitosan-hydroxyphenylacetic acid (CHPA), which is a polymer having a phenol functional group in the side chain.
  • CHPA chitosan-hydroxyphenylacetic acid
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing the synthesis of gelatin-poly (ethylene glycol) -tyramine (GPEG-TA), which is a polymer having a phenolic functional group in its side chain.
  • GPEG-TA gelatin-poly (ethylene glycol) -tyramine
  • CPTA chitosan-poly (ethylene glycol) -tyramine
  • H-PEG-TA hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) -tyramine
  • CMC-PEG-TA carboxymethyl cellulose-poly (ethylene glycol) -tyramine
  • Fig. 11 is a schematic diagram showing the synthesis of alginate-poly (ethylene glycol) -tyramine (ALG-PEG-TA), which is a polymer having a phenol functional group in the side chain.
  • ALG-PEG-TA alginate-poly (ethylene glycol) -tyramine
  • FIG. 12 is a schematic diagram of the syringe and gel formation used in the embodiment of the present invention.
  • Figure 13 is a schematic diagram of the production of a hydrogel schematic cross-section of the syringe according to an embodiment of the present invention.
  • 15 is a test result of growth factor release capacity of the hydrogel according to an embodiment of the present invention.
  • 16 is a tissue adhesion strength test results of the hydrogel according to an embodiment of the present invention.
  • 17 is an experimental result of the hydrogel formation reusability of the fine particles according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention comprises the steps of preparing a support to which the enzyme is immobilized; Contacting and crosslinking the polymer having a phenol or aniline functional group in the side chain and the support in the presence of hydrogen peroxide; And separating the support to which the enzyme is immobilized to obtain a hydrogel.
  • Enzymes have been used as chemical reaction catalysts in various fields because of their specific reactivity, high selectivity, and good reaction efficiency. However, mass synthesis and purification of enzymes are difficult and expensive, and the degradation of enzyme activity due to reaction conditions and storage has been pointed out. In order to improve this problem, a lot of researches have been conducted on techniques for chemically immobilizing enzymes on the surface of various forms and types of supports such as nano / microspheres. Enzyme-immobilized substrates prepared through surface immobilization of enzymes have been reported to be easily separable and recyclable after chemical reactions, and to increase storage stability while maintaining enzyme activity.
  • the inventors of the present invention while studying a method for producing a hydrogel through the surface-immobilization technology of the enzyme, while reacting the polymer having a phenol or aniline functional group in the side chain and the support in which the enzyme is immobilized in the presence of hydrogen peroxide It was confirmed that the separation can be prepared in situ-forming hydrogel containing no enzyme was completed the present invention.
  • the enzyme immobilized on the support is horseradish peroxidase (horseradish peroxidase), glutathione peroxidase (glutathione peroxidase), halo oxidase (haloperoxidase), myeloperoxidase (myeloperoxidase), Catalase, hemoprotein, peroxide, peroxiredoxin, animal heme-dependent peroxidases, thyroid peroxidase, It may be one or more selected from the group consisting of vanadium bromoperoxidase, lactoperoxidase, lactoperoxidase, tyrosinase, and catechol oxidase, but is not limited thereto. .
  • the support may be in the form of fine particles, porous sponge or porous sheet, the fine particulate support is in a non-porous or porous form, glass particles, metal particles, polymer particles and mixed particles thereof It may be made but is not limited thereto.
  • the mixed particle may be a polymer particle containing a metal, the polymer particle containing a metal may contain iron.
  • the iron-containing polymer particles are prepared by copolymerizing an iron compound with a monomer having an epoxy group.
  • the enzyme may be immobilized in a solid phase using a technique known in the art of chromatography and immunoassay, more specifically, the step of preparing a support to which the enzyme is immobilized, A surface modification step of introducing a functional group by modifying the surface of the support; And binding an enzyme to the functional group, wherein the functional group is a carboxyl group, an amine group, a hydroxyl group, an aldehyde group, an epoxy group, a thiol group, a maleimide group, a carbonate ester group, a cyano group, an acryl group, an acetylene group or It may be a diazo.
  • the surface modification is performed in the group consisting of 3,4-dihydroxy hydrocinnamic acid, dopamine, chloroacetylcatechol, aminomethylcatechol, deoxyepinephrine, dihydroxybenzohydrazide, caffeic acid phenethyl ester and hyruthenon.
  • One or more selected catechol derivatives may be used to introduce the functional group, but the present invention is not limited thereto in view of the same chemical bonds when using compounds similar in structure to those listed above.
  • the surface modification is 3-aminopropyl triethoxysilane, trimethoxy (7-octen-1-yl) silane, vinyl trimethoxysilane, 3-trimethoxysilyl-1-propanethiol, 3-aminopropyl Trimethoxysilane, aminoethyl trimethoxysilyl propylamine, triethoxyvinylsilane, isocyanatopropyl triethoxysilane, cyanoethyl triethoxysilane, mercaptopropyl triethoxysilane and triethoxysilyl
  • One or more silane derivatives selected from the group consisting of propyl diethanolamine may be used to introduce the functional group, but the present invention is not limited thereto in view of the same chemical bonds when using compounds similar in structure to those listed above.
  • glass particles are used as the fine particulate support, and the surface modification is 3,4-dihydroxy hydrocinnamic acid (Example 1, see FIG. 1) or 3-aminopropyl triethoxy Silane (Example 2, see FIG. 2), wherein a carboxyl functional group is introduced to the introduction of 3-aminopropyl triethoxysilane due to the introduction of 3,4-dihydroxy hydrocinnamic acid.
  • An amino functional group is introduce
  • functional groups can be introduced through conventional surface modification techniques such as chemical vapor deposition and plasma treatment.
  • the introduced functional groups are N-Ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), glutaraldehyde, diisothiocyanate, isocyanate, Dihydroxysuccinimide and avidin / biotin (avidin / biotin) can be activated using any one or more coupling agents (coupling agent) selected from the group consisting of, the enzyme is bound to the enzyme to the activated functional group It is immobilized on a fine particulate support.
  • EDC N-Ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • glutaraldehyde glutaraldehyde
  • diisothiocyanate isocyanate
  • Dihydroxysuccinimide and avidin / biotin avidin / biotin (avi
  • the concentration of the immobilized enzyme may be an enzyme concentration of 0.001 to 10 mg / g, 0.1 to 10 mg / g, or 0.5 to 7 mg / g, but is not limited thereto.
  • polyethylene glycol PEG
  • polyethylene oxide PEO
  • polyethyleneimine PEI
  • polyvinyl alcohol PVA
  • polyacrylic acid PAA
  • the polymers used in the present invention are tetronic, polyfunctional polyethyleneglucol, gelatin, chitosan, hyaluronic acid, heparin, cellulose, dextran, dextran sulfate, chondroitin sulfate, keratan sulfate, It may be one or more polymers selected from the group consisting of dermatan sulfate, alginate, collagen, albumin, fibronectin, laminin, elastin, vitronectin and fibrinogen.
  • the polymer used in the present invention is a polymer having a phenol or aniline functional group in the side chain, and one or two or more selected from the group consisting of tyramine, hydroxyphenylacetic acid, hydroxypropionic acid and derivatives thereof may be used to introduce the phenolic functional group.
  • One or two or more selected from the group consisting of hydroxyethyl aniline, aminoethylaniline, aminobenzyl alcohol and derivatives thereof may be used for introduction of the aniline functional group, but is not limited thereto.
  • the contacting and separation between the polymer having a phenol or aniline functional group in the side chain and the support to which the enzyme is immobilized is performed by applying pressure to the polymer present on one side of the support to which the enzyme is immobilized. It may be carried out by a method of passing, and more specifically, the method may be carried out through a syringe kit or a spray kit that enables spraying at the end of the syringe.
  • the polymer inside the syringe kit or the spray kit may be extruded by in situ crosslinking through a support on which an enzyme is immobilized.
  • hydrogen peroxide may be present with the polymer having a phenol or aniline functional group in the side chain, or may be present separately from the polymer using a dual injection syringe kit or spray kit.
  • the hydrogel in the form of a sheet or disc may be prepared using the syringe kit or the spray kit and a teflon mold.
  • the present invention also provides a syringe in which a piston is embedded in a cylinder having an inner space and generates a discharge force by the slide operation of the piston to discharge the chemical liquid through the needle.
  • a support provided with an enzyme immobilized, characterized in that the polymer having a phenol or aniline functional group in the side chain is filled in the cylinder, it provides a syringe for producing a hydrogel.
  • the hydrogel produced by the method does not contain enzymes as can be seen in Example 6 below. Therefore, it is possible to overcome the safety problems in the body, such as immune response due to enzymes can extend the biomedical coverage of the hydrogel. Therefore, the present invention is a hydrogel, characterized in that it does not include the enzyme prepared according to the method, a tissue regeneration and filling implant material including the hydrogel and a biologically active substance or carrier for drug delivery comprising the hydrogel To provide.
  • the implant material may be cartilage regeneration, bone regeneration, periodontal bone regeneration, skin regeneration, cardiac tissue regeneration, artificial intraocular lens, spinal cord nerve regeneration. cord regeneration, cranial regeneration, vocal regeneration and augmentation, adhesion barrier, urinary incontinence treatment, fillers for wrinkles removal, burns dressing, tissue augmentation, and intervertebral disc treatment.
  • the bioactive substance or drug may be any one or two or more selected from the group consisting of peptide or protein drugs, antibacterial agents, anticancer agents and anti-inflammatory agents.
  • the peptide or protein drug may include fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor (TGF), and bone morphogenetic factor.
  • FGF fibroblast growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TGF transforming growth factor
  • protein (BMP) human growth hormone (hGH), pig growth hormone (pGH), leukocyte growth factor (G-CSF), erythrocyte growth factor (EPO), macrophage growth factor (M-CSF), tumor necrosis factor (TNF) ), Epidermal growth factor (EGF), platelet-induced growth factor (PDGF), interferon- ⁇ , ⁇ , ⁇ , interleukin-2 (IL-2), calcitonin, nerve growth factor (NGF), growth hormone release factor, ENGIO Tensine, Progesterone-releasing hormone (LHRH), Progesterone-releasing hormone agonist (LHRH agonist), Insulin, Thyroid-stimulating hormone-releasing hormone (TRH),
  • the antimicrobial agent may be minocycline, tetracycline, oploxacin, phosphomycin, mergaine, profloxacin, ampicillin, penicillin, doxycycline, thienamycin, cephalosporin, norcardycin, gentamicin, neomycin, kanamycin , Paromomycin, micronomycin, amikacin, tobramycin, dibecasin, cytotaxin, cefacller, erythromycin, ciprofloxacin, levofloxacin, endoxacin, vancomycin, imipenem, fusidic acid and mixtures thereof It may be selected from the group consisting of.
  • the anticancer agents include paclitaxel, taxotier, adriamycin, endostatin, angiostatin, mitomycin, bleomycin, cisplatin, carboplatin, doxorubicin, daunorubicin, idarubicin, 5-fluorouracil, methotrexate, exec Tinomycin-D and mixtures thereof.
  • the anti-inflammatory agents may be acetoaminephene, aspirin, ibuprofen, diclofenac, indomethacin, pyricampam, phenopropene, flubiprofen, ketoprofen, naproxen, supropene, roxofene, synoxy Can be selected from the group consisting of cam, tenoxycamp and mixtures thereof.
  • a polymer main chain is used tetronic, and by combining phenol derivatives through tyramine to synthesize tetronic-tyramine (Tet-TA), HRP is fixed in the presence of H 2 O 2 fine Hydrogel was prepared from the polymer by contacting with particles and then separating.
  • Tet-TA tetronic-tyramine
  • Hydrogel did not detect the enzyme inside, it was found that the gel formation time, improved mechanical strength and improved body safety.
  • the release of the growth factor introduced into the sustained release it can be usefully used as a carrier for a bioactive substance or drug delivery.
  • Hydrogel according to the present invention is an injection type skeleton for tissue engineering; Sustained-release drug delivery of drugs such as proteins, DNA, growth factors, cells, and the like; Tissue fillers; Wound healing; And various biomedical applications such as intestinal adhesion prevention.
  • hydrogel according to the present invention can be used as an artificial extracellular matrix as an effective scaffold for tissue engineering.
  • the rate of degradation of the hydrogel plays a very important role in the differentiation and growth of cells inside the gel, it is necessary to control the proper rate of degradation.
  • gelatin is specifically degraded by matrix metalloproteinases (MMPs), especially MMP-2, 9, which cells secrete.
  • MMPs matrix metalloproteinases
  • the matrix stiffness of the hydrogel which is used as an effective skeleton for tissue engineering, also affects the growth and differentiation of cells inside the gel.
  • an appropriate matrix stiffness is required for each cell.
  • bone cells have been shown to grow well in a rigid matrix
  • soft tissue cells such as fibroblasts and myoblasts are known to grow well in soft matrices.
  • the hydrogel according to the present invention can be used as an artificial extracellular matrix as an effective scaffold for drug delivery.
  • introduction of tyramine in heparin which is well physically coupled to various growth factors, can effectively support growth factors and enable sustained release behavior (growth factor binding sites).
  • Cell adhesion peptides or proteins bound to phenols, such as RGDY or YIGSR can be used to enhance cell adhesion within the hydrogel matrix.
  • the two phenolic hydroxyl groups present in the dopa (3,4-dihydroxyphenylalanine) derivatives are known to be oxidized in the form of quinones and to bind strongly to various material surfaces, using polymers and metal particles including glass particles.
  • a functional group for chemical immobilization of the enzyme can be introduced to the surface and a coupling agent can be used to immobilize HRP.
  • FIG. 1 A schematic diagram of a method of surface-immobilizing HRP enzyme on glass particles using dopa (3,4-dihydroxyphenylalanine) and DHCA as the dopa derivative is shown in FIG. 1. The detailed process is as follows.
  • DHCA (3,4-dihydoxyhydrocinnamic acid) was reacted in Tris buffer (10 mM, pH 8.5) for 12 hours at room temperature to obtain DHCA-coupled glass particles (diameter 212-300 ⁇ m).
  • the carboxyl group-introduced glass particles contained N-Ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and NHS (N-) in MES (2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid) buffer (0.1 M, pH 4.5). hydroxysuccinimide) was activated for 2 hours, and excess EDC and NHS were removed by washing with PBS and distilled water.
  • the activated glass particles were dispersed in sodium phosphate (0.1M, pH 7.2), HRP solution was added and reacted at room temperature for 6 hours. The remaining HRP and HRP adsorbed on the surface of glass particles were washed with excess PBS and distilled water. It was removed and dried to obtain a glass particle HRP is fixed.
  • sodium phosphate 0.1M, pH 7.2
  • FIG. 2 shows a method of introducing a carboxyl group after silanization and immobilizing HRP on the surface of glass particles using EDC / NHS.
  • Various silane coupling agents other than APTES may be used according to the chemical reaction to be used as the above reaction, and after the silanization reaction, various chemical functional groups are introduced for HRP surface immobilization.
  • glutaraldehyde Various coupling agents can be used, such as isothiocyanate, dihydoxysuccinimide, avidin / biotin.
  • polyethylene glycol PEG, polyethylene glycol
  • PEG polyethylene glycol
  • the solution was added and reacted at room temperature for 5 hours.
  • the mixture was washed with toluene and baked at 110 ° C. for 1 hour to obtain glass particles into which an amine group was introduced.
  • SA succinic anhydride
  • glutaraldehyde-treated glass particles into which aldehyde groups were introduced 2.5 wt% glutaraldehyde solution was added to 1 g of glass particles introduced with amine groups through APTES, and stirred at room temperature for 12 hours.
  • the aldehyde surface-activated glass particles were washed with PBS and distilled water and separated. Then, the glass particles were added to sodium phosphate buffer (0.05 M, pH 7) and HRP was added and reacted at 4 ° C. for 12 hours. After the reaction, the HRP-fixed glass particles were washed with PBS and distilled water and dried.
  • FIG. 3 shows a method of immobilizing HRP on a support obtained by copolymerizing a monomer having an epoxy functional group and iron chloride.
  • Iron ions contained in such copolymers may directly induce hydroxyl radical production or induce synergistic effects to assist the role of HRP enzymes, and the monomers may have various functions other than epoxy functional groups depending on the chemical reaction to be used. The use of groups is possible.
  • the detailed method is as follows.
  • Ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) was used and stirred for 3 hours at about 80 ° C. The product was washed with ethanol and distilled water and dried to obtain polymer particles containing iron ions.
  • Immobilization is easily achieved through the combination of the epoxy functional group and the amine functional group of the HRP enzyme included in the prepared particles. After 1 g of particles were dispersed in PBS by stirring for about 30 minutes, HRP solution was added and reacted at room temperature for 2 hours. The remaining HRP and HRP adsorbed on the surface of the support were removed by washing with excess PBS and distilled water and dried. To obtain a support to which HRP was immobilized.
  • the HRP immobilization amount according to the immobilization method and HRP concentration according to Example 1 and Example 2 was quantitatively analyzed using the micro BCA analysis method.
  • HRP immobilized particle sample 0.1 g was placed in a tube, pre-wetting for 1 hour in 1 mL PBS solution, and then 1 mL of BCA solution was added and incubated at 60 ° C. for 1 hour.
  • the UV absorbance of the 1 mL supernatant was measured at 562 nm, and the absorbance according to the albumin concentration, a standard solution, was analyzed to determine the concentration of HRP.
  • Table 1 shows the results of HRP immobilization according to Example 1
  • Table 2 shows the results of HRP immobilization according to 'A' of Example 2
  • Table 3 shows the results of HRP immobilization according to 'B' of Example 2
  • Table 4 shows Example 3 Immobilization results according to.
  • FIG. 4 shows the schematic diagram of the synthesis of phenol-bonded Tetronic Tylamin (Tet-TA). The detailed process thereof is as follows.
  • the molar ratio of tetronic: succinic anhydride: DMAP: TEA is 1: 5: 5: 5.
  • the reaction temperature was 30 °C, the reaction proceeded for 24 hours in a nitrogen atmosphere.
  • the solution was removed using a filter to remove the remaining reagents.
  • the reaction solution was concentrated using a rotary evaporator and slowly dropped into 1600 ml of cold ether to form a precipitate.
  • the precipitate was filtered using a filter to obtain a product. It was.
  • the product obtained was left in a vacuum oven for 24 hours to remove residual organic solvents, resulting in a white powdery product (Tetronic-PNC).
  • reaction solution was removed with unreacted TA through membrane dialysis (3500 Da molecular weight blocking) using acetone. After dialysis was completed, the solution was filtered and the solution was concentrated using a rotary evaporator to produce a precipitate in 1600 ml of cold ether. The resulting precipitate was filtered through a filter, and the filtered precipitate was left in a vacuum oven for 24 hours to obtain a white powdery product (non-degradable Tetronic-TA).
  • FIG. 5 shows a synthetic schematic of gelatin-hydroxyphenylacetic acid (GHPA). The detailed process thereof is as follows.
  • Solution A was prepared by dissolving 10 g of gelatin in 200 ml of 0.1 M 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES).
  • Solution B was prepared by dissolving 0.609 g (4 mmol) of 4-hydroxyphenylacetic acid (HPA) in 50 ml of 0.1 M MES. 0.92 g (4.8 mmol) of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDC) and 0.276 g (2.4 mmol) of N-hydroxysuccinimide (NHS) each 5 ml of 0.1 M Dissolved in MES. Thereafter, the EDC solution and the NHS solution were sequentially added to Solution B at 15 minute intervals. After 15 minutes, the reaction was started by mixing Solution B with EDC / NHS into Solution A.
  • HPA 4-hydroxyphenylacetic acid
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the reaction temperature was 40 °C
  • the reaction time was 24 hours
  • the reaction solution was filtered using a syringe filter (450 nm).
  • membrane dialysis 3500 Da molecular weight blocking
  • the dialysis solution was lyophilized to obtain GHPA in the form of a white powder.
  • FIG. 6 shows a schematic of the synthesis of chitosan-hydroxyphenylacetic acid (CHPA). The detailed process thereof is as follows.
  • reaction solution was membrane dialysis (blocking 3500 Da molecular weight) in distilled water to remove unreacted HPA.
  • the dialysis solution was freeze-dried to obtain CHPA in the form of a translucent non-woven fabric.
  • FIG. 7 shows a synthetic schematic of gelatin-poly (ethylene glycol)-tyramine (GPEG-TA). The detailed process thereof is as follows.
  • the solution was removed by using a filter, and then the reaction solution was concentrated using a rotary evaporator.
  • the concentrated solution was dropped dropwise into 1600 ml of cold ether to form a precipitate, which was filtered using a filter to obtain a product.
  • the product obtained was left in a vacuum oven for 24 hours to remove residual organic solvents, which resulted in a white powdery product (PEG-PNC).
  • reaction solution was membrane dialysis (block 6000-8000 Da molecular weight) in water to remove unreacted PEG-TA. After dialysis was complete, the solution was lyophilized to give a white powdery product (GPEG-TA).
  • CPTA chitosan-poly (ethylene glycol) -tyramine
  • the reaction was performed by adding a solution of 0.174 g (1.25 mmol) of TA in 50 ml of DMSO to a solution of 5 g (1.25 mmol) of PEG-PNC in 100 ml of DMSO.
  • the molar ratio of PEG-PNC: TA was 1: 1, the reaction temperature was 30 ° C., and the reaction was carried out for 6 hours in a nitrogen atmosphere.
  • a solution in which 0.5 g of chitosan was dissolved in 50 ml of DMSO containing acetic acid (70% by weight) was mixed in a reaction flask, and the reaction was performed for 24 hours in a nitrogen atmosphere at a reaction temperature of 30 ° C.
  • the reaction was terminated by membrane dialysis (6000-8000 Da molecular weight blocking) in water to remove unreacted PEG-TA.
  • the dialysis solution was lyophilized to give the product in the form of a white powder (CPTA).
  • FIG. 9 shows a synthetic schematic diagram of hyaluronic acid-poly (ethylene glycol) -tyramine (HA-PEG-TA). The detailed process thereof is as follows.
  • CMC-PEG-TA carboxymethyl cellulose-poly (ethyleneglycol) -tyramine
  • Fig. 11 shows a schematic of the synthesis of alginate-poly (ethylene glycol) -tyramine (ALG-PEG-TA). The detailed process thereof is as follows.
  • Example 5-1 to 5-8 A glass containing a mixture of a phenolic functional group-containing polymer compound (Examples 5-1 to 5-8) (10%) and 0.1% hydrogen peroxide (500 ⁇ L) synthesized in Example 4 with different amounts of HRP And the iron-containing particles were put in a syringe filled and extruded. In order to compare the physicochemical properties between the particles, fine particles having the same amount of immobilized HRP were quantified to form gels and analyzed.
  • FIGS. 12 and 13 Schematics of the syringe and gel formation used for the gel formation are shown in FIGS. 12 and 13.
  • 12 is related to a syringe used in the embodiment of the present invention
  • the support is provided with an enzyme immobilized inside the needle side of the cylinder
  • a phenol-containing polymer compound (Examples 5-1 to 5-8) ( 10%) and 0.1% hydrogen peroxide mixed solution (500 ⁇ L) is filled in the cylinder.
  • the mixed aqueous solution passes through the enzyme fixation support by the slide operation of the piston, thereby forming in situ crosslinked hydrogel when discharged to the outside of the needle.
  • Fig. 13 is a schematic diagram of a hydrogel production of the present invention in which a cross section of the syringe is illustrated.
  • the quantitative results of the HRP content of the hydrogel formed by the method using the micro BCA analysis method are shown in Tables 5 and 6 below.
  • the enzyme is fixed to the support and is not discharged to the outside of the needle, it can be seen that a hydrogel containing no enzyme is obtained.
  • Example 5 The phenolic functional group-containing polymer compound synthesized in Example 5 of 10% containing 0.1% hydrogen peroxide was filled by quantitatively filling the fine particles having HRP immobilized therein in the syringe, and containing 0.1% hydrogen peroxide (Examples 5-1 to 5). -8)
  • the hydrogel formation time and mechanical strength according to the amount of HRP-immobilized fine particles when 500 ⁇ L of the aqueous solution is inserted into the syringe and extruded are shown in Table 6 below.
  • Table 8 Amount of iron-containing polymer particles (g) 369 ug of HRP / g of bead Hydrogel Formation Time (sec) Hydrogel Mechanical Strength (KPa) Tet-TA 0.2 52 10.2 0.4 21 11.9 0.8 10 13.2 GHPA 0.2 26 5.3 0.4 11 9.2 0.8 ⁇ 5 13.4 CHPA 0.2 62 1.3 0.4 42 3.1 0.8 20 5.7 GPEG-TA 0.2 39 8.1 0.4 17 10.1 0.8 6 11.9 CPTA 0.2 34 2.0 0.4 17 3.3 0.8 ⁇ 5 5.1 HA-PEG-TA 0.2 39 10.1 0.4 16 11.4 0.8 6 13.8 CMC-PEG-TA 0.2 83 6.2 0.4 44 7.5 0.8 24 8.0 ALG-PEG-TA 0.2 52 3.7 0.4 22 5.1 0.8 12 8.3
  • the hydrogel was prepared by the method described in Example 6 using the Tetronic-Tyramine (Tet-TA) polymer of Example 5-1, and then fibroblasts were prepared inside the prepared hydrogel. ) was cultured to evaluate cytotoxicity.
  • the concentration of cells used in the experiment was 1 ⁇ 10 5 cells / well, and the cultured cells were stained with a live / dead assay kit and observed with a fluorescence microscope.
  • Growth factor release behavior was evaluated using an in situ forming hydrogel prepared by an enzyme immobilization method.
  • a hydrogel was prepared by the method described in Example 6 using the Tetronic-Tyramine (Tet-TA) polymer of Example 5-1, and the concentration of the growth factor (bFGF) introduced was 300 ng / mL. The release behavior was confirmed for 1 week.
  • Tet-TA Tetronic-Tyramine
  • bFGF growth factor
  • hydrogel curing degree can be controlled by adjusting the concentration of hydrogen peroxide or polymer, so increasing the degree of curing will increase the mechanical properties (H) and the drug release behavior will be slower. On the contrary, lowering the degree of curing will lower the mechanical properties (L) and speed up the drug release behavior. It was possible to control the rate of drug release.
  • Tet-TA (10 wt%) hydrogel of the present invention prepared by the enzyme immobilization method shows an adhesive strength of 45 ⁇ 83 KPa and about 3 to 6 times increased compared to the control fibrin glue Showed strength.
  • the iron particles when used, they showed a higher adhesive strength of 52 to 95 KPa compared to the glass particles.
  • the amount of hydrogen peroxide L: 0.016 wt%, M: 0.063 wt%, H: 0.25) By controlling the wt%) was confirmed the property to control the tissue adhesion.
  • ABTS (2,2'-azobis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) reagent which can confirm radical generating ability and oxidation inducing ability, reusability of immobilized HRP according to the number of gel formation injections was confirmed.
  • a hydrogel was prepared by the method described in Example 6 using the Tetronic-Tyramine (Tet-TA) polymer of 5-1, and after the gel formation, fine particles in the syringe were prepared using PBS. After washing for a sufficient time, the experiment was conducted to confirm the reusability.
  • the in suit forming hydrogel can be used as a bio-injectable hydrogel system, which can form a hydrogel in the body such as desired tissues, organs or body cavity to fill in vivo defects or body cavity depressions.
  • it can be used as a carrier for delivery of peptides, proteins and DNA as a bioactive drug through simple mixing of many therapeutic drugs, and can be used for excellent nutritional transport of cells and products.

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Abstract

본 발명은 효소가 고정화된 지지체를 제조하는 단계; 측쇄에 페놀 또는 아닐린 관능기를 갖는 고분자와 상기 지지체를 과산화수소 존재 하에서 접촉시켜 가교시키는 단계; 및 상기 효소가 고정화된 지지체를 분리하여 하이드로젤을 수득하는 단계;를 포함하는 하이드로젤의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 지지체에 고정화된 효소에 의해 측쇄에 페놀 또는 아닐린 관능기를 갖는 고분자가 가교되어 하이드로젤이 형성되며, 이에 따라 효소를 포함하지 않는 하이드로젤이 얻어진다. 따라서 효소로 인한 면역 반응과 같은 체내 안전성 문제점을 극복할 수 있어 하이드로젤의 생의학적 적용 범위를 확장시킬 수 있다.

Description

효소 고정화 지지체를 이용한 IN SITU 형성 하이드로젤의 제조방법 및 이의 생의학적 용도
본 발명은 효소가 고정화된 지지체를 사용하여 향상된 생체 안전성을 갖는 in situ 형성 하이드로젤의 제조방법, 이의 생의학적 용도 및 상기 효소가 고정화된 지지체를 포함하는 하이드로젤 제조용 주사기에 관한 것이다.
하이드로젤은 그의 생체 적합성, 높은 수분 함량 및 영양분과 대사 산물의 우수한 투과성으로 인해 삽입물, 약물 및 세포 전달 담체와 같은 약학 및 생물 의학적 응용을 위한 재료로서 널리 연구되었다. 이러한 하이드로젤은 천연 및 합성 고분자를 이용하여 제조가 가능하며, 다양한 화학적 및 물리적 교차-결합을 통하여 하이드로젤 형성이 가능하다. 지난 10년간 연구 관심은 고분자 용액을 체내에 주입하여 체내에서 하이드로젤을 형성하는 in situ 형성 하이드로젤 형태로 개량화 되었다.
이러한 in situ 형성 하이드로젤은 생체 주입형 하이드로젤 시스템으로 사용이 가능하다. 생체 주입형 하이드로젤 시스템은 최소 침투 기술을 기반으로 환자에게 편안함을 부여하는 용이한 형태로의 응용이 많은 주목을 받아 왔다.
이들 시스템들은 원하는 조직, 기관 또는 체강 내에서 응고되기 전에 최소 침투 방식으로 신체 내에서 하이드로젤을 형성할 수 있는 주입형 유동체이다.
예를 들어, 생체 주입형 하이드로젤 시스템은 이식을 위한 외과적 시술을 필요로 하지 않고, 많은 치료 약물의 단순한 혼합을 통해 통합될 수 있다. 이들 생체 주입형 하이드로젤을 이용하여 결함 또는 체강 함몰 부위를 충진시키는 것이 가능하다. 하이드로젤 시스템은 기계적 물성이 낮은 반면, 높은 세포 분주 효율, 생리활성 약물 예를들어, 펩타이드, 단백질 및 DNA 등의 전달용 담체, 및 세포 및 생성물로의 우수한 영양물 운송과 같은 여러 장점을 지니고 있다.
하지만 온도나 UV 조사 등을 통해 개발된 기존의 주입형 하이드로젤은 고분자 수용액 제조시 시간이 많이 소요되거나, 높은 용액점도 및 느린 상전이 시간과 같은 문제점들을 가지고 있다. 최근에는 이러한 기존 in situ 형성 하이드로젤의 문제점을 개선하기 위하여 효소 반응을 이용한 in situ 하이드로젤들이 많이 개발되고 있다.
이러한 하이드로젤은 호스라디시 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase, HRP)와 과산화수소(H2O2)의 존재 하에 효소 산화반응을 통하여 in situ 형성 하이드로젤 시스템으로 개발되었고 이는 화학적 가교반응에 의해 제조되는 기존의 하이드로젤의 단점인 기계적 강도와 체내 안정성 등을 향상시킬 수 있다.
현재 개발되어 있는 효소 감응성 in situ 형성 하이드로젤의 종류는 다음과 같다. 테트로닉-타이라민 (Tet-TA) (Park et al., Biomacromolecules 2010/2012, Soft Matter 2011), 젤라틴-폴리에틸렌 글라이콜-타이라민(GPT) (Park et al., Journal of Materials Chemistry 2011), 덱스트란-티라민(dec-TA)( Jin et al., Biomaterials 2007), 히알루론산-티라민(HATA)(Kurisawa et al., Chem. Commun. 2005), 젤라틴-하이드록시프로피오닉산(GHPA)(Wang et al., Biomaterials 2009), 젤라틴-티라민(GTA)(Sakai et al., Biomaterials 2009), 알긴산-하이드록시페닐아세트산(AHPA)(Sakai et al., Acta Biomaterialia 2007) 등이 이에 속한다.
상기 효소 감응성 하이드로젤은 고분자 사슬 내 페놀유도체를 포함하고 있으며, 이 페놀유도체가 HRP 매개 커플링 반응을 통하여 오르토(ortho) 위치에서의 탄소-탄소 결합 또는 오르토 위치의 탄소와 페녹시산소 사이의 탄소-산소 결합을 통해 하이드로젤이 형성하게 된다. 또한 하이드로젤의 젤형성 시간, 기계적 강도, 생분해성 등의 물리화학적 특성은 HRP 와 H2O2 의 농도 조절에 의해 쉽게 조절할 수 있으며, 다양한 생리활성물질 및 약물, 세포를 하이드로젤 내에 쉽게 담지할 수 있는 장점이 있다. 하지만 이러한 효소 감응성 하이드로젤은 형성된 하이드로젤 내부에 동식물 유래의 HRP와 같은 효소들을 함유하고 있어 체내에 주입되었을 때 면역 반응 등과 같은 생체 안전성과 관련된 문제를 야기할 수 있다.
따라서 본 발명은 효소가 함유되지 않도록 하이드로젤을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 하이드로젤 및 이의 생의학적 용도를 제공하고자 한다.
또한 본 발명은 상기 하이드로젤 제조시 사용되는 하이드로젤 제조용 주사기를 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 효소가 고정화된 지지체를 제조하는 단계; 측쇄에 페놀 또는 아닐린 관능기를 갖는 고분자와 상기 지지체를 과산화수소 존재 하에서 접촉시켜 가교시키는 단계; 및 상기 효소가 고정화된 지지체를 분리하여 하이드로젤을 수득하는 단계;를 포함하는 하이드로젤의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 효소를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 하이드로젤을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 하이드로젤을 포함하는 조직재생 및 충진용 임플란트 소재를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 하이드로젤을 포함하는 생리활성 물질 또는 약물 전달용 담체를 제공한다.
또한 본 발명은 내공간을 갖는 실린더에 피스톤이 내장되고 피스톤의 슬라이드 작동에 의하여 배출력을 발생시켜 주사바늘을 통하여 약액을 배출토록 되는 주사기에 있어서, 실린더의 주사바늘쪽 내부에 효소가 고정화된 지지체가 구비되며, 측쇄에 페놀 또는 아닐린 관능기를 갖는 고분자가 실린더에 충진된 것을 특징으로 하는, 하이드로젤 제조용 주사기를 제공한다.
본 발명에 따르면, 지지체에 고정화된 효소에 의해 측쇄에 페놀 또는 아닐린 관능기를 갖는 고분자가 가교되어 하이드로젤이 형성되며, 이에 따라 효소를 포함하지 않는 하이드로젤이 얻어진다. 따라서 효소로 인한 면역 반응과 같은 체내 안전성 문제점을 극복할 수 있어 하이드로젤의 생의학적 적용 범위를 확장시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 효소 고정화된 지지체는 재사용이 가능하다.
도 1은 도파 유도체로 도파(3,4-디하이드록시페닐알라닌), DHCA를 사용하여 HRP 효소를 유리입자상에 표면 고정화시키는 방법의 모식도이다.
도 2는 실란화 반응 이후에 카르복실기를 도입하고 EDC/NHS 를 이용하여 유리입자 표면 위에 HRP을 고정화하는 방법에 대한 모식도이다.
도 3은 철화합물과 에폭시기를 가지는 단량체를 공중합시켜 철입자 함유 미세 고분자입자를 제조하고 지지체 표면위에 HRP를 고정화하는 방법의 모식도이다.
도 4는 측쇄에 페놀 관능기를 갖는 고분자인 테트로닉-타이라민 (Tet-TA)의 합성 모식도이다.
도 5는 측쇄에 페놀 관능기를 갖는 고분자인 젤라틴-하이드록시페닐아세트산(GHPA)의 합성 모식도이다.
도 6는 측쇄에 페놀 관능기를 갖는 고분자인 키토산-하이드록시페닐아세트산(CHPA)의 합성 모식도이다.
도 7은 측쇄에 페놀 관능기를 갖는 고분자인 젤라틴-폴리(에틸렌글리콜)-티라민(GPEG-TA)의 합성 모식도이다.
도 8은 측쇄에 페놀 관능기를 갖는 고분자인 키토산-폴리(에틸렌글리콜)-티라민(CPTA)의 합성 모식도이다.
도 9은 측쇄에 페놀 관능기를 갖는 고분자인 히알루론산-폴리(에틸렌글리콜)-티라민 (HA-PEG-TA)의 합성 모식도이다.
도 10은 측쇄에 페놀 관능기를 갖는 고분자인 카르복시메틸 셀룰로스-폴리(에틸렌글리콜)-티라민 (CMC-PEG-TA)의 합성 모식도이다.
도 11은 측쇄에 페놀 관능기를 갖는 고분자인 알지네이트-폴리(에틸렌글리콜)-티라민 (ALG-PEG-TA)의 합성 모식도이다.
도 12는 본 발명의 실시예에서 사용한 주사기 및 젤 형성 모식도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 주사기의 단면을 도식화한 하이드로젤의 제조 모식도이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 하이드로젤의 세포 독성 실험 결과이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 하이드로젤의 성장인자 방출능 검토 실험 결과이다.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 하이드로젤의 조직 접착 강도 실험 결과이다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 미세 입자의 하이드로젤 형성 재사용능에 관한 실험 결과이다.
본 발명은 효소가 고정화된 지지체를 제조하는 단계; 측쇄에 페놀 또는 아닐린 관능기를 갖는 고분자와 상기지지체를 과산화수소 존재 하에서 접촉시켜 가교시키는 단계; 및 상기 효소가 고정화된 지지체를 분리하여 하이드로젤을 수득하는 단계;를 포함하는 하이드로젤의 제조방법을 제공한다.
효소는 특이적 반응성 및 높은 선택성, 그리고 우수한 반응효율로 인해 다양한 분야의 화학반응 촉매로서 이용되어 왔다. 하지만 효소의 대량합성 및 정제가 어렵고 가격이 비싸며, 반응조건과 보관에 따른 효소활성의 저하가 지적되어 왔다. 이를 개선하기 위해 효소를 나노/마이크로 미립구 등 다양한 형태 및 종류의 지지체 표면에 화학적으로 고정화하여 응용목적에 따른 화학반응에 이용하는 기술에 관한 연구가 많이 진행되었다. 효소의 표면 고정화를 통해 제조된 효소-지지체(enzyme immobilized substrates)는 화학반응 후 쉽게 분리가 가능하고 재활용이 가능하며, 효소의 활성을 유지하는 동시에 저장 안정성을 높일 수 있다고 보고되어 있다. 따라서 본 발명의 발명자들은 이러한 효소의 표면 고정화 기술을 통해 하이드로젤을 제조하는 방법에 대해 연구하던 중, 측쇄에 페놀 또는 아닐린 관능기를 갖는 고분자와 효소가 고정화된 지지체를 과산화수소 존재 하에서 반응시킨 후 지지체를 분리하면 효소가 포함되지 않은 in situ 형성 하이드로젤을 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 지지체에 고정화되는 효소는 호스래디시 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase), 글루타치온 퍼록시데이즈(glutathione peroxidase), 할로버록시데이즈(haloperoxidase), 미엘로퍼옥시데이즈(myeloperoxidase), 카탈라아제(catalase), 헤모프로틴(hemoprotein), 퍼록사이드(peroxide), 퍼록시레독신(peroxiredoxin), 동물 헴-의존적 퍼록시데이즈(animal heme-dependent peroxidases), 티로이드 퍼록시데이즈(thyroid peroxidase), 바나듐 브로모퍼록시데이즈(vanadium bromoperoxidase), 락토퍼록시데이즈(lactoperoxidase), 티로시네이즈(tyrosinase), 및 카테콜 옥시데이즈(catechol oxidase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상일 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 지지체는 미세 입자 , 다공성 스폰지 또는 다공성 시트 형태일 수 있으며, 미세 입자형 지지체는 비다공성 또는 다공성 형태이며, 유리입자, 금속입자, 고분자입자 및 이들의 혼합입자로 이루어진 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 혼합입자는 금속이 함유된 고분자입자일 수 있으며, 상기 금속이 함유된 고분자입자는 철을 함유할 수 있다.
또한, 상기 철이 함유된 고분자 입자는 에폭시기를 갖는 단량체와 철화합물을 공중합하여 제조한 것이다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 효소는 크로마토그래피와 면역분석법 분야에서 알려진 기술을 이용하여 고상(solid phase)에 고정화될 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 효소가 고정화된 지지체를 제조하는 단계는, 지지체의 표면을 개질하여 관능기를 도입하는 표면개질 단계; 및 상기 관능기에 효소를 결합시키는 단계를 포함하며, 이때 상기 관능기는 카르복실기, 아민기, 하이드록실기, 알데히드기, 에폭시기, 티올기, 말레이미드기, 카보네이트 에스터기, 시아노기, 아크릴기, 아세틸렌기 또는 디아조기일 수 있다.
상기 표면개질은 3,4-디하이드록시 하이드로신남산, 도파민, 클로로아세틸카테콜, 아미노메틸카테콜, 디옥시에피네프린, 디하이드록시벤조히드라지드, 카페익산 펜에틸에스터 및 히루테논으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 카테콜 유도체를 사용하여 관능기를 도입할 수 있지만, 상기 열거된 카테콜 유도체와 구조적으로 유사한 화합물을 사용할 경우 화합적 결합의 동일함에 비춰볼 때 이에 한정하는 것은 아니다.
또한, 상기 표면개질은 3-아미노프로필 트리에톡시실란, 트리메톡(7-옥텐-1-일)실란, 비닐트리메톡시실란, 3-트리메톡시실릴-1-프로판티올, 3-아미노프로필 트리메톡시실란, 아미노에틸 트리메톡시실릴 프로필아민, 트리에톡시비닐실란, 이소시아네이토프로필 트리에톡시실란, 시아노에틸 트리에톡시실란, 머캡토프로필 트리에톡시실란 및 트리에톡시실릴프로필 디에탄올아민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 실란 유도체를 사용하여 관능기를 도입할 수 있지만, 상기 열거된 실란 유도체와 구조적으로 유사한 화합물을 사용할 경우 화합적 결합의 동일함에 비춰볼 때 이에 한정하는 것은 아니다.
그러나, 이미 표면에 상기 관능기를 포함하고 있는 고분자 비드인 폴리스티렌 비드, SiO2 비드 등의 미세 지지체를 사용하는 경우에는 상기 별도의 표면개질 단계 없이 효소의 결합이 가능함은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
본 발명의 이하 실시예에서, 미세 입자형 지지체로는 유리입자가 사용되고, 상기 표면개질은 3,4-디하이드록시 하이드로신남산 (실시예 1, 도 1 참조) 또는 3-아미노프로필 트리에톡시실란 (실시예 2, 도 2 참조)을 사용하여 수행된 바 있고, 이때, 3,4-디하이드록시 하이드로신남산의 도입으로 인해 카르복실 관능기가, 3-아미노프로필 트리에톡시실란의 도입에 의해 아미노 관능기가 도입된다. 이외에도 화학기상증착법, 플라즈마 처리 기법 등 종래의 표면개질 기술을 통한 관능기의 도입이 가능함은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
상기 도입된 관능기는 EDC(N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), NHS(N-hydroxysuccinimide), 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 이소티오시아네이트(diisothiocyanate), 이소시아네이트(isocyanate), 디하이드록시숙시이미드(dihydoxysuccinimide) 및 아비딘/바이오틴(avidin/biotin)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 커플링제(coupling agent)를 사용하여 활성화될 수 있으며, 상기 활성화된 관능기에 효소가 결합하여 효소가 미세 입자형 지지체에 고정화된다.
또한 본 발명의 실시예에서, 철입자가 함유된 고분자입자의 경우 표면에 에폭시 관능기가 존재하여 추가적인 과정없이 효소를 바로 첨가함으로써 효소가 화학적으로 표면 고정화된 고분자입자가 제조된다.
본 발명의 다른 일실시예에서, 상기 고정화된 효소의 농도는 효소농도가 0.001 ~ 10 mg/g, 0.1 내지 10 mg/g, 또는 0.5 내지 7 mg/g 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
이때, 상기 결합한 효소의 활성을 높이기 위하여 다관능기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리비닐알콜(PVA) 또는 폴리아크릴산(PAA)이 스페이서(spacer)로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명에 사용되는 고분자는 테트로닉, 다관능성 폴리에틸렌글루콜, 젤라틴, 키토산, 히알루론산, 헤파린, 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 알지네이트, 콜라겐, 알부민, 피브로넥틴, 라미닌, 엘라스틴, 비트로넥틴 및 피브리노겐으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 고분자일 수 있다. 상기 본 발명에 사용되는 고분자는 측쇄에 페놀 또는 아닐린 관능기를 갖는 고분자로, 상기 페놀 관능기의 도입을 위해 티라민, 하이드록시페닐아세트산, 하이드록시프로피온산 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상이 사용될 수 있고, 상기 아닐린 관능기의 도입을 위해 하이드록시에틸아닐린, 아미노에틸아닐린, 아미노벤질알콜 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 측쇄에 페놀 또는 아닐린 관능기를 갖는 고분자와 효소가 고정화된 지지체간의 접촉 및 분리는 효소가 고정화된 지지체 일방에 존재하는 고분자에 압력을 가하여 고분자를 지지체의 타방으로 통과시키는 방법으로 수행될 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 방법은 주사기 키트(syringe kit) 또는 상기 주사기 끝에 스프레이 가능하도록 한 스프레이 키트(spray kit)를 통해 수행될 수 있다.
보다 더 구체적으로, 상기 주사기 키트 또는 스프레이 키트 내부의 고분자가 효소가 고정화된 지지체를 통과하며 in situ 가교되어 압출되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 과산화수소는 측쇄에 페놀 또는 아닐린 관능기를 갖는 고분자와 함께 존재하거나, 이중 주입식 주사기 키트 또는 스프레이 키트를 사용하여 고분자와 별도로 존재할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 주사기 키트 또는 스프레이 키트와 테프론 성형(teflon mold)을 이용하여 쉬트 또는 디스크 형태의 하이드로젤을 제조할 수 있다.
상기 방법을 위해, 본 발명은 또한 내공간을 갖는 실린더에 피스톤이 내장되고 피스톤의 슬라이드 작동에 의하여 배출력을 발생시켜 주사바늘을 통하여 약액을 배출토록 되는 주사기에 있어서, 실린더의 주사바늘쪽 내부에 효소가 고정화된 지지체가 구비되며, 측쇄에 페놀 또는 아닐린 관능기를 갖는 고분자가 실린더에 충진된 것을 특징으로 하는, 하이드로젤 제조용 주사기를 제공한다.
상기 방법에 의해 제조된 하이드로젤은 이하의 실시예 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 효소를 포함하지 않는다. 따라서 효소로 인한 면역 반응과 같은 체내 안전성 문제점을 극복할 수 있어 하이드로젤의 생의학적 적용 범위를 확장시킬 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 효소를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 하이드로젤, 상기 하이드로젤을 포함하는 조직재생 및 충진용 임플란트 소재 및 상기 하이드로젤을 포함하는 생리활성 물질 또는 약물 전달용 담체를 제공한다.
상기 임플란트 소재는 연골 재생(cartilage regeneration), 골 재생(bone regeneration), 치주골 재생, 피부 재생(skin regeneration), 심근 재생(cardiac tissue regeneration), 인공 수정체(artificial intraocular lens), 척수 신경 재생(spinal cord regeneration), 뇌신경 재생(cranial regeneration), 성대 재생 및 충진제(vocal regeneration and augmentation), 유착 방지막 (adhesion barrier), 요실금 치료제(urinary incontinence treatment), 주름 제거(wrinkles removal)용 충진제, 화상 치료제(wound dressing), 조직 충진제(tissue augmentation) 및 척추 추간판 치료제(intervertebral disc treatment)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 적용될 수 있다.
또한 하이드로젤이 생리활성 물질 또는 약물 전달용 담체의 용도로 사용되는 경우, 상기 생리활성물질 또는 약물은 펩타이드 또는 단백질 의약품, 항균제, 항암제 및 항염증제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
상기 펩타이드 또는 단백질 의약품은 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 전환 성장인자(transforming growth factor; TGF), 골형성 성장인자(bone morphogenetic protein; BMP), 인간성장호르몬(hGH), 돼지성장호르몬(pGH), 백혈구성장인자(G-CSF), 적혈구성장인자(EPO), 대식세포성장인자(M-CSF), 종양 괴사 인자(TNF), 상피세포 성장인자(EGF), 혈소판유도성장인자(PDGF), 인터페론-α,β,γ, 인터루킨-2(IL-2), 칼시토닌, 신경성장인자(NGF), 성장호르몬 방출인자, 엔지오텐신, 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 작동약(LHRH agonist), 인슐린, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(TRH), 엔지오스태틴, 엔도스태틴, 소마토스타틴, 글루카곤, 엔도르핀, 바시트라신, 머게인, 콜리스틴, 바시트라신, 단일 항체, 백신류 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 항균제는 미노싸이클린, 테트라싸이클린, 오플록사신, 포스포마이신, 머게인, 프로플록사신, 암피실린, 페니실린, 독시싸이클린, 티에나마이신, 세팔로스포린, 노르카디신, 겐타마이신, 네오마이신, 가나마이신, 파로모마이신, 미크로 노마이신, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 세포탁신, 세파클러, 에리스로마이신, 싸이프로플록사신, 레보플록사신, 엔옥사신, 반코마이신, 이미페넴, 후시딕산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 항암제는 파클리탁셀, 텍소티어, 아드리아마이신, 엔도스타틴, 앤지오스타틴, 미토마이신, 블레오마이신, 시스플레틴, 카보플레틴, 독소루비신, 다우노루비신, 이다루비신, 5-플로로우라실, 메토트렉세이트, 엑티노마이신-D 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 항염증제는 아세토아민펜, 아스피린, 이부프로펜, 디크로페낙, 인도메타신, 피록시캄, 페노프로펜, 플루비프로펜, 케토프로펜, 나프록센, 수프로펜, 록소프로펜, 시녹시캄, 테녹시캄 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 고분자 주사슬로 테트로닉을 사용하며, 이에 티라민을 통해 페놀 유도체를 결합시켜 테트로닉-티라민(Tet-TA)를 합성하였으며, H2O2 존재 하에서 HRP가 고정화된 미세입자와 접촉 후 분리시켜 상기 고분자로부터 하이드로젤을 제조하였다. 이렇게 제조된 하이드로젤은 내부에 효소가 검출되지 않았으며, 젤 형성 시간, 기계적 강도 향상 및 체내 안전성이 향상된 것을 알 수 있었다. 또한, 도입된 성장인자를 서방형으로 방출하는 것을 확인할 수 있어, 생리활성 물질 또는 약물 전달용 담체의 용도로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에 따른 하이드로젤은 조직공학용 주입형 골격; 단백질, DNA, 성장인자, 세포 등과 같은 약물의 서방형 약물 전달체; 조직 충진제; 상처 치료; 및 장유착 방지 등의 다양한 생의학적 응용이 가능하다.
보다 상세하게는, 본 발명에 따른 하이드로젤은 조직공학용 유효 골격(scaffold)으로서의 인공 세포외 매트릭스로 사용될 수 있다.
이때, 하이드로젤의 분해 속도는 젤 내부에 있는 세포의 분화 및 성장에 매우 중요한 역할을 하므로, 적절한 분해 속도 조절이 필수적이다. 예를들어, 젤라틴은 세포가 분비하는 매트릭스 메탈로프로테나제(MMP) 특히, MMP-2, 9에 의하여 특이적으로 분해된다.
또한, 조직공학용 유효 골격으로 사용되는 하이드로젤의 매트릭스 경직도(stiffness) 역시 젤 내부에 있는 세포의 성장과 분화에 많은 영향을 미친다. 또한 각 세포마다 적절한 매트릭스 경직도가 요구된다. 예를 들어 골세포는 경직도가 딱딱한 매트릭스에서 잘 성장하는 것으로 나타났으며, 연조직 세포 예를들어, 섬유아세포, 근육모세포 등은 부드러운 매트릭스에서 잘 성장하는 것으로 알려지고 있다. 효소 반응을 이용한 시스템에서는 과산화수소의 양을 조절함으로써 쉽게 하이드로젤의 가교를 조절할 수 있으며, 따라서 하이드로젤의 경직도를 쉽게 조절할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 하이드로젤은 약물 전달용 유효 골격(scaffold)으로서 의 인공 세포외 매트릭스로 사용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 성장인자들과 물리적 결합을 잘하는 헤파린에 티라민을 도입하여 성장인자를 효과적으로 담지하고 서방형 방출 거동을 가능하게 할 수 있다(성장 인자 결합 사이트). 페놀이 결합되어 있는 세포 접착 펩타이드 또는 단백질 예들들어, RGDY 또는 YIGSR을 이용하여 하이드로젤 메트릭스 내부의 세포 접착력을 향상시킬 수 있다. 효과적인 세포의 성장과 분화에 필요한 이러한 성분들을 효소 기작을 이용하여 in situ 형태로 인공 ECM을 만들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 도파 유도체를 이용한 HRP 의 표면 고정화
도파(3,4-디하이드록시페닐알라닌) 유도체에 존재하는 두 개의 페놀릭 하이드록실기는 퀴논 형태로 산화하여 다양한 재료 표면에 강하게 결합하는 것으로 알려져 있으며, 이를 이용하여 유리입자를 포함한 고분자 및 금속입자 표면에 효소의 화학적 고정화를 위한 관능기를 도입할 수 있고 커플링 에이전트를 사용하여 HRP를 고정화할 수 있다.
도파 유도체로 도파(3,4-디하이드록시페닐알라닌), DHCA를 사용하여 HRP 효소를 유리입자상에 표면 고정화시키는 방법의 모식도를 도 1에 나타내었다. 상세한 과정은 다음과 같다.
먼저 DHCA (3,4-dihydoxyhydrocinnamic acid)를 트리스(Tris) 버퍼용액(10 mM, pH 8.5)에서 상온 12시간 동안 반응을 보내어 DHCA가 결합된 유리입자(직경 212-300 μm) 표면을 얻었다. 카르복실기가 도입된 유리입자는 MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 버퍼(0.1 M, pH 4.5)에서 EDC(N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)와 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 이용하여 2시간 동안 활성화시킨 다음 과량의 EDC와 NHS를 PBS와 증류수로 세척하여 제거하였다.
그 다음 활성화된 유리입자를 sodium phosphate (0.1M, pH 7.2)에 분산시키고 HRP용액을 첨가하여 상온에서 6시간 동안 반응시키고 잔존하는 HRP와 유리입자 표면에 흡착된 HRP를 과량의 PBS와 증류수로 세척하여 제거하고 건조시켜 HRP가 고정화된 유리입자를 얻었다.
<실시예 2> 실란화 반응을 이용한 HRP 의 표면 고정화
도 2는 실란화 반응 이후에 카르복실기를 도입하고 EDC/NHS를 이용하여 유리입자 표면 위에 HRP을 고정화하는 방법을 나타내고 있다. 상기와 같은 반응으로 이용하고자 하는 화학반응에 따라 APTES 외의 다양한 실란 커플링 에이전트들이 사용될 수 있으며, 실란화 반응 이후에 HRP표면 고정화를 위해 다양한 화학적 관능기가 도입되며, 이에 따라 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 이소티오시아네이트 (diisothiocyanate), 디하이드록시숙시이미드 (dihydoxysuccinimide), 아비딘/바이오틴 (avidin/biotin) 등 다양한 커플링 에이전트들이 사용될 수 있다. 이때 HRP 의 효소활성을 높이기 위해 폴리에틸렌글리콜(PEG, polyethylene glycol)을 스페이서(spacer)로 사용할 수 있다.
가. EDC/NHS를 통한 HRP 고정
도 2는 실란화 반응 이후에 카르복실기를 도입하고 EDC/NHS를 이용하여 유리입자 표면 위에 HRP을 고정화하는 방법을 나타내고 있으며, 이의 상세한 과정은 다음과 같다.
먼저 피라냐(piranha) 용액(황산:과산화수소=3:1)을 이용하여 유리입자를 세척하고 질소로 건조시킨 후, 세척된 유리입자를 톨루엔을 사용하여 제조된 2 vol%의 APTES(3-aminopropyl triethoxysilane)용액에 첨가하고 상온에서 5시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 톨루엔으로 세척하고 110 ℃에서 1시간 동안 베이킹(baking)을 하여 아민기가 도입된 유리입자를 얻었다. 이후 5wt% 썩시닉 안하이드라이드(SA, succinic anhydride) 용액에서 상온에서 24시간 반응시켜 카르복실기가 도입된 유리입자을 얻은 후, 과량의 PBS와 증류수로 세척하여 잔존하는 SA를 제거하였다.
EDC와 NHS를 함유한 MES버퍼에 유리입자를 넣어 2시간 동안 반응시킨 후, 세척하여 카르복실기가 활성화된 유리입자를 얻고 마지막으로 HRP를 6시간 반응시켜 HRP가 고정화된 유리입자를 얻었다.
나. 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 통한 HRP 고정
글루타르알데히드를 처리하여 알데히드기가 도입된 유리입자를 얻기 위해 상기 APTES를 통해 아민기가 도입된 유리입자 1 g 에 2.5 wt% 글루타르알데히드용액을 넣고 12시간 동안 상온에서 교반시켰다. 알데히드로 표면이 활성화된 유리입자를 PBS와 증류수로 세척하고 분리한 다음, 나트륨 포스페이트 버퍼(0.05 M, pH 7)에 유리입자를 넣고 HRP를 추가하여 4 ℃ 에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응 후, HRP가 고정화된 유리입자를 PBS와 증류수로 세척하고 건조하였다.
<실시예 3> 철 이온이 포함된 지지체를 이용한 HRP의 표면 고정화
도 3은 에폭시(epoxy)기능기를 가지는 단량체와 염화철을 공중합하여 얻은 지지체에 HRP를 고정화하는 방법을 나타내고 있다. 상기와 같은 공중합체에 포함된 철이온은 하이드록실라디칼 생성을 직접 유도하거나 HRP 효소의 역할을 돕는 상승 효과를 유도할 수 있으며, 상기 단량체는 이용하고자 하는 화학반응에 따라 에폭시 기능기 이외의 다양한 기능기들의 사용이 가능하다. 상세한 방법은 아래와 같다.
염화철 분자와 에폭시 기능기늘 가지는 비닐(vinyl)계의 단량체인 글리시딜 메타크릴레이트(Glycyl methacrylate(GMA)) 와 메틸메타크릴레이트(Methyl methacrylate(MMA)) 그리고, 가교제로서 에틸렌그리콜디메타크릴레이트(Ethylene glycol dimethacrylate(EGDMA)를 사용하여, 약 80 ℃ 에서 3시간 동안 교반하였다. 생성물을 에탄올과 증류수로 세척하고 건조하여 철이온이 포함된 고분자 입자를 얻었다.
상기 제조된 입자에 포함된 에폭시 기능기와 HRP 효소의 아민 기능기의 결합을 통해 쉽게 고정화가 가능하다. 1g의 입자를 PBS에 30분 가량의 교반시켜 분산시킨 후, HRP 용액을 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시키고 잔존하는 HRP와 지지체 표면에 흡착된 HRP를 과량의 PBS와 증류수로 세척하여 제거하고 건조시켜 HRP가 고정화된 지지체를 얻었다.
<실시예 4> 고정화된 HRP 정량화
상기 실시예 1 및 실시예 2에 따른 고정화 방법 및 HRP 사용농도에 따른 HRP 고정화량을 micro BCA 분석방법을 이용하여 정량 분석하였으며 그 방법은 다음과 같다.
0.1 g 의 HRP 고정화 입자 샘플을 튜브에 넣고 1 mL PBS용액에서 1시간 동안 프리웨팅(pre-wetting)시킨 후, 1 mL의 BCA 용액을 넣고 60 ℃ 에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 562 nm 에서 1 mL 상층액의 UV 흡광도를 측정하고 표준용액인 알부민 농도에 따른 흡광도를 분석하여 HRP 의 농도를 확인하였다.
결과는 아래 표 1 내지 3과 같다. 표 1은 실시예 1에 따른 HRP 고정화 결과, 표 2는 실시예 2의 ‘가’에 따른 HRP 고정화 결과, 표 3은 실시의 2의 ‘나’에 따른 HRP 고정화 결과, 표 4는 실시예 3에 따른 고정화 결과이다.
표 1
유리입자 양 (g) HRP 사용 농도(mg/mL) HRP 고정화량 (μg)
1 0.5 387
1 2.5 655
1 5 805
표 2
유리입자 양 (g) HRP 사용 농도(mg/mL) HRP 고정화량 (μg)
1 0.5 51
1 2.5 80
1 5 114
표 3
유리입자 양 (g) HRP 사용 농도(mg/mL) HRP 고정화량 (μg)
1 0.5 72
1 2.5 105
1 5 146
표 4
철 함유 고분자입자양 (g) HRP 사용 농도(mg/mL) HRP 고정화량(μg)
1 0.5 369
1 2.5 821
1 5 1103
<실시예 5> 페놀이 결합된 합성 공중합체의 제조
1. 테트로닉-타이라민(Tet-TA)의 합성
도 4은 페놀이 결합된 합성 공중합체인 테트로닉-타이라민 (Tet-TA)의 합성 모식도를 나타낸 것이다. 이의 상세한 과정은 다음과 같다.
테트로닉 30 g(1.67 mmol) 을 디옥산 300 ml 에 용해시킨 후 이 용액에 4-디메틸아미노피리딘(DMPA) 1.018 g(8.33 mmol)과 트리에티아민(TEA) 0.843 g(8.33mmol)을 디옥산 40 ml 에 용해시킨 용액과 p-니트로페닐클로로 메이트(PNC) 1.679 g(8.33 mmol)을 디옥산 50 ml 에 용해시킨 용액을 순차적으로 혼합하였다.
테트로닉 : 숙신산 무수물 : DMAP : TEA 의 몰비율은 1:5:5:5이다. 이때 반응온도는 30 ℃ 이며, 질소 분위기에서 24 시간 반응을 진행하였다. 반응 종료 후 용액을 여과기를 이용하여 잔존하는 시약들을 제거한 후 회전식 증발 농축기를 이용하여 반응 용액을 농축시키고 차가운 에테르 1600 ml 에 서서히 떨어뜨려 침전물을 생성시키고 이 침전물을 여과기를 이용하여 여과하여 생성물을 수득하였다. 수득된 생성물은 잔여 유기용매를 제거하기 위해 진공 오븐에 24시간 방치한 후 결과적으로 백색의 분말 형태의 생성물(테트로닉-PNC)을 수득하였다.
이후 상기 테트로닉-PNC 20 g(1.11 mmol)을 테트라하이드로푸란(THF) 200 ml 에 용해시킨 용액에 티라민(TA) 0.761 g(5.55 mmol)을 THF 150 ml 에 용해시킨 용액을 첨가하여 반응을 진행하였다. 테트로닉-PNC : TA 의 몰비율은 1 : 5이다. 이 때 반응 온도는 30 ℃ 이며 질소분위기에서 24시간 반응을 진행하였다.
반응 종료 후 반응 용액을 아세톤을 이용하여 멤브레인 투석(3500 Da 분자량 차단)을 통하여 반응하지 않은 TA를 제거하였다. 투석이 완료된 후 용액을 여과하고 회전식 증발농축기를 이용하여 용액을 농축시킨 후 차가운 에테르 1600 ml 에 침전물을 생성시켰다. 생성된 침전물은 여과기를 통하여 여과하고, 여과된 침전물을 진공오븐에 24시간 방치한 후 백색의 분말 생성물(비분해성 테트로닉-TA)을 수득하였다.
2. 젤라틴-하이드록시페닐아세트산(GHPA)의 합성
도 5는 젤라틴-하이드록시페닐아세트산(GHPA)의 합성 모식도를 나타낸 것이다. 이의 상세한 과정은 다음과 같다.
10 g 의 젤라틴을 0.1 M 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 200 ml 에 용해시켜 용액 A를 제조하였다. 4-하이드록시페닐아세트산(HPA) 0.609 g(4 mmol)을 0.1 M MES 50 ml 에 용해시켜 용액 B를 제조하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC) 0.92 g (4.8 mmol)와 N-히드록시숙신이미드(NHS) 0.276 g (2.4 mmol)을 각각 5 ml 의 0.1 M MES에 용해시켰다. 그 후 EDC 용액과 NHS 용액을 용액 B에 15분 간격으로 순차적으로 가하였다. 15분 후 EDC/NHS가 포함된 용액 B를 용액 A에 혼합하여 반응을 시작하였다.
이때 반응 온도는 40 ℃ 이며, 반응 시간은 24시간 이었고, 반응 종료 후 반응 용액을 주사기 필터(450 nm)를 사용하여 여과하였다. 그 후 증류수에서 3~4일 동안 멤브레인 투석(3500 Da 분자량 차단)을 시행하였다. 투석이 완료된 용액은 동결 건조를 통하여 백색 분말 형태의 GHPA를 수득하였다.
3. 키토산-하이드록시페닐아세트산(CHPA)의 합성
도 6는 키토산-하이드록시페닐아세트산(CHPA)의 합성 모식도를 나타낸 것이다. 이의 상세한 과정은 다음과 같다.
디아세틸레이션 75 - 85 % 의 저분자량 키토산 0.644 g 에 증류수 80 ml 를 첨가하고 1N HCl을 이용하여 용액의 산도를 pH 3으로 낮춰 용해시켰다. HPA 0.404 g(2.6 mmol)을 첨가한 후 0.1 M NaOH를 이용하여 용액의 산도를 pH 5로 맞추었다. EDC 0.768 g (4 mmol)을 첨가하고, 반응 온도 30 ℃ 에서 24시간 동안 반응을 진행하였다.
반응 종료 후, 반응 용액을 증류수에서 멤브레인 투석(3500 Da 분자량 차단)하여 반응하지 않은 HPA를 제거하였다. 투석이 완료된 용액은 동결 건조를 통하여 반투명의 부직포(non-woven fabric) 형태의 CHPA를 수득하였다.
4. 젤라틴-폴리(에틸렌글리콜)-티라민(GPEG-TA)의 합성
도 7은 젤라틴-폴리(에틸렌글리콜)-티라민(GPEG-TA)의 합성 모식도를 나타낸 것이다. 이의 상세한 과정은 다음과 같다.
1) 폴리(에틸렌글리콜)-(p-니트로페닐 클로로포메이트)(PEG-PNC) 합성
PEG 10 g(2.9 mmol)을 메틸렌 클로라이드(MC) 100 ml 에 용해시킨 후 이 용액에 DMAP 0.779 g(6.38 mmol)과 TEA 0.645 g(6.38 mmol)을 MC 10 ml 에 용해시킨 용액과 PNC 1.286 g(6.38 mmol)를 MC 50 ml 에 용해시킨 용액을 순차적으로 혼합하였다. 이때 PEG : DMAP : TEA : PNC의 몰비율은 1 : 2.2 : 2.2 : 2.2 이었고, 반응 온도는 30 ℃ 이며, 질소 분위기에서 24시간 동안 반응을 진행하였다.
반응 종료 후 용액을 여과기를 이용하여 잔존하는 시약들을 제거한 후 회전식 증발 농축기를 이용하여 반응 용액을 농축시켰다. 농축 용액을 차가운 에테르 1600 ml 에 한 방울씩 떨어뜨려 침전을 생성시키고 이 침전물을 여과기를 이용하여 여과하여 생성물을 수득하였다. 수득된 생성물은 잔여 유기 용매를 제거하기 위해 진공 오븐에 24시간 방치한 후 결과적으로 백색의 분말 형태의 생산물(PEG-PNC)을 수득하였다.
2) GPEG-TA의 합성
PEG-PNC 5 g(1.471 mmol)을 DMSO 100 ml 에 용해시킨 용액에 TA 0.202 g(1.471 mmol)을 DMSO 50 ml 에 용해시킨 용액을 첨가하여 반응을 진행하였다. PEG-PNC : TA의 몰비율은 1 : 1 이며 반응 온도는 30 ℃ 이고, 질소 분위기에서 6시간 반응을 진행하였다. 6시간 후, 젤라틴 용액(1 g/200 ml in DMSO)을 혼합하여 30 ℃ 질소 분위기에서 24시간 동안 반응을 진행하였다.
반응 종료 후, 반응 용액을 물에서 멤브레인 투석(6000 - 8000 Da 분자량 차단)하여 반응하지 않은 PEG-TA를 제거하였다. 투석이 완료된 후, 용액을 동결 건조하여 백색의 분말 생성물(GPEG-TA)을 수득하였다.
5. 키토산-폴리(에틸렌글리콜)-티라민(CPTA)의 합성
도 8은 키토산-폴리(에틸렌글리콜)-티라민(CPTA)의 합성 모식도를 나타낸 것이다. 이의 상세한 과정은 다음과 같다.
PEG-PNC 5 g(1.25 mmol)을 DMSO 100 ml 에 용해시킨 용액에 TA 0.174 g(1.25 mmol)을 DMSO 50 ml 에 용해시킨 용액을 첨가하여 반응을 진행하였다. PEG-PNC : TA의 몰비율은 1 : 1이며, 반응 온도는 30 ℃ 이고, 질소 분위기에서 6시간 동안 반응을 진행하였다. 6시간 후, 아세트산(70 중량%)을 포함하는 DMSO 50 ml 에 키토산 0.5 g 가 용해된 용액을 반응 플라스크에 혼합하여 반응 온도 30 ℃ 의 질소 분위기에서 24시간 동안 반응을 진행하였다.
반응이 종료된 용액을 물에서 멤브레인 투석(6000 - 8000 Da 분자량 차단)하여 반응하지 않은 PEG-TA를 제거하였다. 투석이 완료된 용액을 동결 건조하여 백색 분말 형태의 생성물(CPTA)를 수득하였다.
6. 히알루론산-폴리(에틸렌글리콜)-티라민 (HA-PEG-TA)의 합성
도 9는 히알루론산-폴리(에틸렌글리콜)-티라민 (HA-PEG-TA)의 합성 모식도를 나타낸 것이다. 이의 상세한 과정은 다음과 같다.
1) 아미네이티드 폴리(에틸렌글리콜)-티라민 (PTA)의 합성
PEG-PNC 5 g(1.25 mmol)을 MC 100 ml에 용해시킨 용액에 TA 0.174 g(1.25 mmol)을 MC 50 ml 에 용해시킨 용액을 첨가하여 반응을 진행하였다. PEG-PNC : TA 의 몰비율은 1 : 1이며, 반응 온도는 30 ℃ 이고 질소 분위기에서 6시간 동안 반응을 진행하였다. 6시간 후, 에틸렌디아민 2.254 g(37.5 mmol)을 MC 50 ml 에 용해시킨 용액을 혼합하여 30 ℃ 질소 분위기에서 24시간 동안 반응을 진행하였다. 이때 PEG-PNC : 에틸렌디아민의 몰비율은 1 : 30 이었다.
반응이 종료된 용액은 여과기를 이용하여 잔존하는 시약들을 제거한 후 회전식 증발 농축기를 이용하여 반응 용액을 농축시켰다. 농축 용액을 차가운 에테르 1600 ml 에 한 방울씩 떨어뜨려 침전을 생성시키고 이 침전물을 여과기를 이용하여 여과하여 생성물을 수득하였다. 수득된 생성물은 잔여 유기 용매를 제거하기 위해 진공 오븐에 24시간 방치한 후 결과적으로 백색의 분말 형태의 생산물(PTA)을 수득하였다.
2) HA-PEG-TA 합성
히알루론산 1 g 을 증류수 300 ml 에 용해시킨 용액에 EDC 1.307 g(6.82 mmol)과 NHS 0.392 g(3.41 mmol)을 각각 15분 간격으로 순차적으로 가하였다. 이후 반응 플라스크에 PTA 2.5 g(0.625 mmol)을 증류수 100 ml 에 용해시킨 용액을 혼합하여 30 ℃ 에서 24시간 동안 반응을 진행하였다.
반응이 종료된 용액은 여과기를 이용하여 잔존하는 시약들을 제거한 후, 증류수에서 3~4일 동안 멤브레인 투석(6000 - 8000 Da 분자량 차단)을 시행하였다. 투석이 완료된 용액은 동결 건조를 통하여 백색 분말 형태의 생성물 (HA-PEG-TA)을 수득하였다.
7. 카르복시메틸 셀룰로스-폴리(에틸렌글리콜)-티라민 (CMC-PEG-TA)의 합성
도 10은 카르복시메틸 셀룰로스-폴리(에틸렌글리콜)-티라민 (CMC-PEG-TA)의 합성 모식도를 나타낸 것이다. 이의 상세한 과정은 다음과 같다.
카르복시메틸 셀룰로스 1 g 을 증류수 300 ml 에 용해시킨 용액에 EDC 1.307 g(6.82 mmol)과 NHS 0.392 g(3.41 mmol)을 각각 15분 간격으로 순차적으로 가하였다. 이후 반응 플라스크에 PTA 2.5 g(0.625 mmol)을 증류수 100 ml 에 용해시킨 용액을 혼합하여 30 ℃ 에서 24시간 동안 반응을 진행하였다.
반응이 종료된 용액은 여과기를 이용하여 잔존하는 시약들을 제거한 후, 증류수에서 3~4일 동안 멤브레인 투석(6000 - 8000 Da 분자량 차단)을 시행하였다. 투석이 완료된 용액은 동결 건조를 통하여 백색 분말 형태의 생성물(CMC-PEG-TA)을 수득하였다.
8. 알지네이트-폴리(에틸렌글리콜)-티라민 (ALG-PEG-TA)의 합성
도 11은 알지네이트-폴리(에틸렌글리콜)-티라민 (ALG-PEG-TA)의 합성 모식도를 나타낸 것이다. 이의 상세한 과정은 다음과 같다.
알지네이트 1 g 을 증류수 300 ml 에 용해시킨 용액에 EDC 1.307 g(6.82 mmol)과 NHS 0.392 g(3.41 mmol)을 각각 15분 간격으로 순차적으로 가하였다. 이후 반응 플라스크에 PTA 2.5 g(0.625 mmol)을 증류수 100 ml 에 용해시킨 용액을 혼합하여 30 ℃ 에서 24시간 동안 반응을 진행하였다.
반응이 종료된 용액은 여과기를 이용하여 잔존하는 시약들을 제거한 후, 증류수에서 3~4일 동안 멤브레인 투석(6000 - 8000 Da 분자량 차단)을 시행하였다. 투석이 완료된 용액은 동결 건조를 통하여 백색 분말 형태의 생성물 (ALG-PEG-TA)을 수득하였다.
<실시예 6> HRP 고정화 입자를 이용한 주입형 하이드로젤의 제조 및 HRP 정량 결과
상기 실시예 4에서 합성된 페놀 관능기 함유 고분자화합물(실시예 5-1 내지 실시예 5-8) (10 %)과 0.1 % 과산화수소의 혼합 수용액(500 μL)을 각기 다른 양의 HRP가 고정화된 유리 및 철 함유 입자를 충진한 주사기에 넣고 압출하였다. 각각의 입자 간의 물리화학적 특성 비교를 위해 고정화된 HRP의 양이 동일한 미세 입자를 정량하여 젤을 형성시킨 후 분석을 진행하였다.
상기 젤 형성에 사용한 주사기 및 젤 형성 모식도를 도 12 및 도 13에 나타내었다. 도 12은 본 발명의 실시예에서 사용한 주사기에 관한 것으로, 실런더의 주사바늘쪽 내부에 효소가 고정화된 지지체가 구비되며, 페놀 함유 고분자화합물(실시예 5-1 내지 실시예 5-8) (10%)과 0.1 % 과산화수소의 혼합 수용액(500 μL)이 실린더에 충전되어 있다. 이후 피스톤의 슬라이드 작동에 의하여 상기 혼합 수용액은 효소고정화지지체를 통과하고, 이를 통해 주사바늘 외부로 배출시 in situ 가교된 하이드로젤이 형성되게 된다.
도 13는 상기 주사기의 단면을 도식화한 본 발명의 하이드로젤 제조 모식도이다. 상기 방법으로 형성된 하이드로젤의 HRP 함량을 마이크로 BCA 분석방법을 이용한 정량 결과는 아래 표 5, 표6과 같다.
표 5
형성된 하이드로젤의 HRP 정량값 (mg/mL) 유리입자 양(g)(146ug of HRP/g of bead)
0.5 1.0 2.0
Tet-TA(실시예 4-1) N.D. N.D. N.D.
GHPA(실시예 4-2) N.D. N.D. N.D.
CHPA(실시예 4-3) N.D. N.D. N.D.
GPEG-TA(실시예 4-4) N.D. N.D. N.D.
CPTA(실시예 4-5) N.D. N.D. N.D.
HA-PEG-TA(실시예 4-6) N.D. N.D. N.D.
CMC-PEG-TA(실시예4-7) N.D. N.D. N.D.
ALG-PEG-TA(실시예4-8) N.D. N.D. N.D.
N.D.: 검출되지 않음.
표 6
형성된 하이드로젤의 HRP 정량값 (mg/mL) 철 함유 고분자입자 양(g)(369ug of HRP/g of bead)
0.2 0.4 0.8
Tet-TA(실시예 4-1) N.D. N.D. N.D.
GHPA(실시예 4-2) N.D. N.D. N.D.
CHPA(실시예 4-3) N.D. N.D. N.D.
GPEG-TA(실시예 4-4) N.D. N.D. N.D.
CPTA(실시예 4-5) N.D. N.D. N.D.
HA-PEG-TA(실시예 4-6) N.D. N.D. N.D.
CMC-PEG-TA(실시예4-7) N.D. N.D. N.D.
ALG-PEG-TA(실시예4-8) N.D. N.D. N.D.
N.D.: 검출되지 않음.
상기 표 5와 표6를 참조하면, 효소는 지지체에 고정되어 있고 주사바늘 외부로 배출되지 않으며, 이에 따라 효소를 포함하지 않는 하이드로젤이 얻어짐을 알 수 있었다.
<시험예 1> 젤형성 시간/기계적 강도 검토
HRP가 고정화된 미세 입자를 동량의 HRP가 주사기 내에 존재하도록 정량하여 충진하고 0.1% 과산화수소를 함유한 10 % 의 상기 실시예 5에서 합성된 페놀 관능기 함유 고분자화합물(실시예 5-1 내지 실시예 5-8) 수용액 500 μL 를 상기 주사기에 넣고 압출하였을 때 HRP 고정화 미세 입자양에 따른 하이드로젤의 형성 시간 및 기계적 강도는 아래 표 6와 같다.
표 7
유리입자 양 (g)146ug of HRP/g of bead 하이드로젤형성시간(초) 하이드로젤기계적 강도(KPa)
Tet-TA 0.5 70 8.6
1.0 44 9.3
2.0 20 10.5
GHPA 0.5 41 3.1
1.0 29 7.9
2.0 < 5 11.2
CHPA 0.5 95 0.7
1.0 66 1.9
2.0 38 3.5
GPEG-TA 0.5 62 6.1
1.0 40 8.6
2.0 16 9.8
CPTA 0.5 50 1.2
1.0 32 3.0
2.0 10 4.2
HA-PEG-TA 0.5 62 8.9
1.0 36 10.5
2.0 15 12.5
CMC-PEG-TA 0.5 145 5.1
1.0 71 5.9
2.0 42 6.2
ALG-PEG-TA 0.5 81 2.7
1.0 39 3.1
2.0 18 7.3
표 8
철 함유 고분자입자 양 (g)369ug of HRP/g of bead 하이드로젤형성시간(초) 하이드로젤기계적 강도(KPa)
Tet-TA 0.2 52 10.2
0.4 21 11.9
0.8 10 13.2
GHPA 0.2 26 5.3
0.4 11 9.2
0.8 < 5 13.4
CHPA 0.2 62 1.3
0.4 42 3.1
0.8 20 5.7
GPEG-TA 0.2 39 8.1
0.4 17 10.1
0.8 6 11.9
CPTA 0.2 34 2.0
0.4 17 3.3
0.8 < 5 5.1
HA-PEG-TA 0.2 39 10.1
0.4 16 11.4
0.8 6 13.8
CMC-PEG-TA 0.2 83 6.2
0.4 44 7.5
0.8 24 8.0
ALG-PEG-TA 0.2 52 3.7
0.4 22 5.1
0.8 12 8.3
시험예 2> 세포 독성 실험
세포 독성 평가를 위하여, 실시예 5-1의 테트로닉-타이라민(Tet-TA) 고분자를 사용하여 실시예 6에 개시된 방법으로 하이드로젤을 제조 한 후, 제조된 하이드로젤 내부에 섬유아세포(fibroblast)를 배양하여 세포독성을 평가하였다. 실험에 사용된 세포의 농도는 1×105 cells/well 이었으며, 배양된 세포는 live/dead 분석 키트로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다.
결과를 도 14에 나타내었다. 도 14을 참조하면, 우수한 세포의 부착 및 증식을 확인되는 바, 본 발명을 통해 제조된 하이드로젤의 우수한 세포 적합성을 확인할 수 있었다.
<시험예 3> 생리활성 물질 방출능 검토
효소 고정화 방법을 통해 제조된 in situ 형성 하이드로젤을 이용하여 성장인자 방출 거동 평가를 수행하였다. 실험을 위하여 실시예 5-1의 테트로닉-타이라민(Tet-TA) 고분자를 사용하여 실시예 6에 개시된 방법으로 하이드로젤을 제조하였으며, 도입된 성장인자(bFGF)의 농도는 300 ng/mL 이며 방출 거동 확인은 1 주일 동안 진행하였다.
그 결과, 도 15와 같이 효소 고정화 방법을 통해 제조된 in situ 형성 하이드로젤에서 성장인자가 서방형으로 방출되는 것을 확인하였다. 또한, 과산화수소 또는 고분자 농도 조절을 통하여 하이드로젤 경화도 조절이 가능함으로 경화도를 높이면 기계적 물성을 높아져(H) 약물 방출 거동이 느려지고 반대로, 경화도를 낮추면 기계적 물성이 낮아져(L) 약물 방출 거동을 빠르게 할 수 있어 약물 방출 속도 조절이 가능하였다.
이러한 결과를 통하여 효소 고정화 방법을 통해 제조된 본 발명의 in situ 형성 하이드로젤을 성장인자와 같은 생리활성 물질 전달체로 효과적으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
<시험예 4> 조직 접착력 검토
유압식 만능 재료 시험기 (universal testing machine, UTM)를 이용하여 하이드로젤의 접착 강도를 비교 평가하였다. 실험의 대조군으로는 현재 가장 많이 사용되고 있는 피브린 글루 (fibrin glue) 이용하였다. 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16을 참조하면, 효소 고정화 방법으로 제조된 본 발명의 Tet-TA(10 wt%) 하이드로젤은 45~83 KPa의 접착 강도를 나타내며 대조군인 피브린 글루와 비교하여 약 3~6배 증가된 접착 강도를 보였다. 또한, 철 입자를 이용한 경우에 유리 입자와 비교하여 52~95 KPa의 더 높은 접착 강도를 나타내었으며, 미세 입자의 경우, 과산화수소의 양(L: 0.016 wt%, M: 0.063 wt%, H: 0.25 wt%)을 조절함으로서 조직 접착력을 조절할 수 있는 성질을 확인하였다.
<시험예 5> 재사용능 검토
라디칼 생성능 및 산화반응 유도능을 확인할 수 있는 ABTS (2,2'-azobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 시약을 이용하여, 젤 형성 주사횟수에 따른 고정화된 HRP의 재사용능을 확인하였다. 실험을 위하여, 5-1의 테트로닉-타이라민(Tet-TA) 고분자를 사용하여, 실시예 6에 개시된 방법으로 하이드로젤을 제조하였으며, 젤 형성 후 주사기 내부의 미세 입자를 PBS를 이용하여 충분한 시간동안 세척한 후, 재사용능을 확인하는 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 17과 같이 입자에 고정화된 HRP의 재사용능은 미세 입자의 종류에 따라 재사용 횟수가 증가하여도, 약 40-60 % 가량 활성도를 가짐을 확인하였다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 다양한 형태의 미세 입자를 이용한 젤 형성 주사제로서 지속적인 사용이 가능함을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
in suit 형성 하이드로젤은 생체 주입형 하이드로젤 시스템으로 사용이 가능한데, 원하는 조직, 기관 또는 체강 내와 같은 신체 내에서 하이드로젤을 형성하여 생체내 결함 또는 체강 함몰 부위를 충진시킬 수 있다. 또한 많은 치료 약물의 단순 혼합을 통하여 생리활성약물로 펩타이드, 단백질 및 DNA 등의 전달용 담체로 이용될 수 있으며, 세포 및 생성물의 우수한 영양물 운송에 이용될 수 있다.

Claims (20)

  1. 효소가 고정화된 지지체를 제조하는 단계; 측쇄에 페놀 또는 아닐린 관능기를 갖는 고분자와 상기 지지체를 과산화수소 존재 하에서 접촉시켜 가교시키는 단계; 및 상기 효소가 고정화된 지지체를 분리하여 하이드로젤을 수득하는 단계;를 포함하는 하이드로젤의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효소는 호스래디시 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase), 글루타치온 퍼록시데이즈(glutathione peroxidase), 할로퍼록시데이즈(haloperoxidase), 미엘로퍼옥시데이즈(myeloperoxidase), 카탈라아제(catalase), 헤모프로틴(hemoprotein), 퍼록사이드(peroxide), 퍼록시레독신(peroxiredoxin), 동물 헴-의존적 퍼록시데이즈(animal heme-dependent peroxidases), 티로이드 퍼록시데이즈(thyroid peroxidase), 바나듐 브로모퍼록시데이즈(vanadiumbromoperoxidase), 락토퍼록시데이즈(lactoperoxidase), 티로시네이즈(tyrosinase), 및 카테콜 옥시데이즈(catechol oxidase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상인 하이드로젤의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 지지체는 미세 입자, 다공성 스폰지 또는 다공성 시트 형태인 하이드로젤의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 미세 입자형 지지체는 비다공성 또는 다공성 형태이며, 유리입자, 금속입자, 고분자입자 및 이들의 혼합입자로 이루어진 군에서 선택된 것인 하이드로젤의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 혼합입자는 금속이 함유된 고분자입자인 것인 하이드로젤의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 금속이 함유된 고분자입자는 철이 함유된 고분자입자인 것인 하이드로젤의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 철이 함유된 고분자입자는 에폭시기를 갖는 단량체와 철화합물을 공중합하여 제조한 것인 하이드로젤의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 효소가 고정화된 지지체를 제조하는 단계는, 지지체의 표면을 개질하여 관능기를 도입하는 표면개질 단계; 및 상기 관능기에 효소를 결합시키는 단계를 포함하며, 상기 관능기는 카르복실기, 아민기, 하이드록실기, 알데히드기, 에폭시기, 티올기, 말레이미드기, 카보네이트 에스터기, 시아노기, 아크릴기, 아세틸렌기 및 디아조기로 이루어진 군에서 선택된 것인 하이드로젤의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 표면개질 단계는 3,4-디하이드록시 하이드로신남산, 도파민, 클로로아세틸카테콜, 아미노메틸카테콜, 디옥시에피네프린, 디하이드록시벤조히드라지드, 카페익산 펜에틸에스터 및 히루테논으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 카테콜 유도체를 사용하여 관능기를 도입하는 것인 하이드로젤의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 표면개질 단계는 3-아미노프로필 트리에톡시실란, 트리메톡(7-옥텐-1-일)실란, 비닐트리메톡시실란, 3-트리메톡시실릴-1-프로판티올, 3-아미노프로필 트리메톡시실란, 아미노에틸 트리메톡시실릴 프로필아민, 트리에톡시비닐실란, 이소시아네이토프로필 트리에톡시실란, 시아노에틸 트리에톡시실란, 머캡토프로필 트리에톡시실란 및 트리에톡시실릴프로필 디에탄올아민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 실란 유도체를 사용하여 관능기를 도입하는 것인 하이드로젤의 제조방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 관능기에 효소를 결합시키는 단계에서 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리비닐알콜(PVA) 및 폴리아크릴산(PAA)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 고분자를 스페이서(spacer)로 도입하는 단계를 추가로 포함하는 하이드로젤의 제조방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 관능기에 효소를 결합시키는 단계에서 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리비닐알콜(PVA) 및 폴리아크릴산(PAA)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 고분자를 스페이서(spacer)로 도입하는 단계를 추가로 포함하는 하이드로젤의 제조방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 접촉 및 분리는 효소가 고정화된 지지체 일방에 존재하는 고분자에 압력을 가하여 고분자를 지지체의 타방으로 통과시키는 방법으로 수행되는 것인 하이드로젤의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 방법은 주사기 키트(syringe kit) 또는 스프레이 키트(spray kit)를 통해 수행되는 것인 하이드로젤의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 주사기 키트 또는 스프레이 키트 내부의 고분자가 지지체를 통과하며 in situ 가교되어 압출되는 것인 하이드로젤의 제조방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 주사기 키트 또는 스프레이 키트와 테프론 성형(teflon mold)을 이용하여 하이드로젤을 쉬트 또는 디스크 형태로 제조하는 것인 하이드로젤의 제조방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따라 제조된, 효소를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 하이드로젤.
  18. 제17항에 따른 하이드로젤을 포함하는 조직재생 및 충진용 임플란트 소재.
  19. 제17항에 따른 하이드로젤을 포함하는 생리활성 물질 또는 약물 전달용 담체.
  20. 내공간을 갖는 실린더에 피스톤이 내장되고 피스톤의 슬라이드 작동에 의하여 배출력을 발생시켜 주사바늘을 통하여 약액을 배출토록 되는 주사기에 있어서, 실린더의 주사바늘쪽 내부에 효소가 고정화된 지지체가 구비되며, 측쇄에 페놀 또는 아닐린 관능기를 갖는 고분자가 실린더에 충진된 것을 특징으로 하는, 하이드로젤 제조용 주사기.
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