[go: up one dir, main page]

JP4781372B2 - 組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出 - Google Patents

組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出 Download PDF

Info

Publication number
JP4781372B2
JP4781372B2 JP2008000124A JP2008000124A JP4781372B2 JP 4781372 B2 JP4781372 B2 JP 4781372B2 JP 2008000124 A JP2008000124 A JP 2008000124A JP 2008000124 A JP2008000124 A JP 2008000124A JP 4781372 B2 JP4781372 B2 JP 4781372B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
primer
oligonucleotide
sequence
ligation
product
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP2008000124A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2008092959A5 (ja
JP2008092959A (ja
Inventor
フィリップ・ベルグレイダー
フランシス・バラニー
マシュー・ルビン
ジョージ・バラニー
ロバート・ピー・ハマー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cornell Research Foundation Inc
Original Assignee
Cornell Research Foundation Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=21788414&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP4781372(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Cornell Research Foundation Inc filed Critical Cornell Research Foundation Inc
Publication of JP2008092959A publication Critical patent/JP2008092959A/ja
Publication of JP2008092959A5 publication Critical patent/JP2008092959A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4781372B2 publication Critical patent/JP4781372B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6862—Ligase chain reaction [LCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

本発明は、米国保健研究所認可番号ＧＭ４１３３７−０６による政府資金でもってなされた。米国政府が一定の権利を有し得る。
本発明は、組み合せたリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて検出配列の相違を検出することに関する。本発明の１つの実施態様は、ポリメラーゼ連鎖反応に組み合せたリガーゼ検出反応の使用である。本発明の他の実施態様は、１次ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた２次ポリメラーゼ連鎖反応と組み合せたリガーゼ検出反応である。本発明の第３の実施態様は、１次ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた２次ポリメラーゼ連鎖反応である。
多重検出
高度に多形的な座の大規模多重解析が、父親検定および法医学（Reynolds et al., Anal. Chem., 63:2-15(1991)）、臓器移植のドナーとレシピエントの組み合わせ（Buyse et al., Tissue Antigens, 41:1-14(1993) and Gyllensten et al., PCR Meth. Appl, 1:91-98(1991)）、遺伝疾患の診断、予後および出産前の相談（Chamberlain et al., Nucleic Acids Res., 16:11141-11156(1988) and L. C. Tsui, Human Mutat., 1:197-203(1992)）および発ガン変異（Hollstein et al., Science, 253:49-53(1991)）などについて個体の実際的な同定に必要である。さらに、核酸解析による感染疾患診断の費用効率はパネル試験における多重規模で直接的に変動する。これらの適用の多くは、時に密接なスペース座の多重性において単一塩基の相違の識別力に依存している。
多数の配列領域を含むサンプル中に１以上の選択ポリヌクレオチド配列の存在を検出するのに、様々なＤＮＡハイブリダイゼーション技法が利用される。フラグメント捕捉と標識による簡単な方法において、選択された配列含有のフラグメントが固定化プローブにハイブリダイゼーションされる。捕捉フラグメントは検出可能なレポーター部分を含有する第２プローブへのハイブリダイゼーションによって標識される。
広く用いられている他の方法はサザンブロット法である。この方法において、サンプル中のＤＮＡフラグメントの混合物はゲル電気泳動により分別されて、ニトロセルローズ・フィルター上に固定される。フィルターをハイブリダイゼーション条件で１以上の標識プローブと反応さすことにより、プローブ配列含有のバンドが同定される。この方法は、与えられたプローブ配列含有の制限酵素ＤＮＡ消化においてフラグメントを同定するのに、および制限フラグメント長・多形性（“ＲＦＬＰ”）を解析するのに、特に有用である。
ポリヌクレオチドサンプル中の、与えられた単数または複数の配列の存在を検出する他の方法に、ポリメラーゼ連鎖反応による配列の選択的増幅がある。Mullis et alの米国特許第４,６８３,２０２号およびR. K. Saiki, et al., Science 230:1350(1985)。この方法において、選択した配列の反対側の末端部分に相補的なプライマーがプライマー開始複製の連続ラウンドを熱サイクリングと共に推進するのに用いられる。増幅配列は種々の技術により容易に同定することができる。この方法は、ポリヌクレオチド含有サンプル中の低コピー配列の存在を検出するのに、例えば体液サンプル中の病原菌配列を検出するのに特に有用である。
さらに最近、既知の標的配列をプローブ連結方法によって同定する方法が報告されている。N. M. Whiteley et al.の米国特許第４,８８３,７５０号、D. Y. Wu et al., Genomics 4:560(1989)、U. Landegren et al., Science 241:1077(1988)およびE. Winn-Deen et al., Clin. Chem. 37:1522(1991)。オリゴヌクレオチド連結アッセイ（“ＯＬＡ”）として知られる一つの方法において、所望の標的領域にまたがる２つのプローブまたはプローブエレメントが標的領域にハイブリダイズされる。プローブエレメントが隣接の標的塩基と塩基対になると、プローブエレメントの向かい合う末端は、連結反応により、例えばリガーゼ処理により結ばれる。連結プローブエレメントは検定されて、標的配列の存在が明らかにされる。
この方法の修飾として、連結プローブエレメントは相補的プローブエレメント対について鋳型として働く。対のプローブエレメントの存在における変性、ハイブリダイゼーションおよび連結反応の継続的サイクルでもって、標的配列は直線的に増幅され、非常に少量の標的配列が検出および／または増幅されるのを可能とする。この方法をリガーゼ検出反応と呼ぶ。プローブエレメントの２つの相補対が使用されるとき、そのプロセスはリガーゼ連鎖反応と呼ばれ、標的配列の指数的増幅を達成する。F. Barany, “Genetic Disease Detection and DNA Amplification Using Cloned Thermostable Ligase,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-93(1991)およびF. Barany, “The Ligase Chain Reaction (LCR) in a PCR World,” PCR Methods and Applications, 1:5-16(1991)。
核酸配列相違の多重検出についての他の方式はGrossman et al.の米国特許第５,４７０,７０５号に開示されている。そこでは、検出可能標識と電荷／翻訳摩擦ドラッグの顕著な比率とを有する配列特異的プローブが標的にハイブリダイズされ、そして一緒に連結される。この技法は、嚢胞性線維症・透過膜レギュレーター遺伝子の大規模多重解析についてGrossman, et al., “High-density Multiplex Detection of Nucleic Acid SequencesおよびOligonucleotide Ligation Assay and Sequence-coded Separation,” Nucl. Acids. Res. 22(21):4527-34(1994)で用いられた。
Jou, et al., “Deletion Detection in Dystrophin Gene by Multiplex Gap Ligase Chain Reaction and Immunochromatographic Strip Technology,” Human Mutation 5:86-93(1995)は、いわゆる“ギャップリガーゼ連鎖反応”の利用に関し、各エクソンについてのプローブ上の相違するハプテンに特異的な抗体を有する免疫クロマトグラフィー上で読まれる増幅産物でもって、多重エクソンの同時に選択された領域を増幅する。
標的ポリヌクレオチドにおける多数の配列の各々の存在・不存在を検出するのに有用な方法に関して、（例えば、遺伝子スクリーニング分野において）必要性が増大している。例えば４００種もの変異が嚢胞性線維症に関連している。この疾患に対する遺伝子的前処置のためのスクリーニングにおいて、“嚢胞性線維症”の積極的な同定を行うために、対象者のゲノムＤＮＡにおける可能性のある相違する遺伝子配列変異のすべてを検査することが最適である。１回のアッセイで可能性ある変異部位のすべての存在・不存在を検査するのが理想的である。しかし、上記した先行技術は、便利な自動的な単一アッセイとして多数の選択配列を検出するのに容易に用いることができない。
固相ハイブリダイゼーションアッセイにおいては、多数の液体処理工程を必要とし、単一ヌクレオチド・ミスマッチ識別に要するストリジェンシィを保持するために、いくつかのインキュベーションおよび洗浄温度を注意深くコントロールしなければならない。最適ハイブリダイゼーション条件がプローブ配列によって大きく変わるので、この方法の多重化は困難である。
等量の各ＰＣＲ産物を得る多重ＰＣＲプロセスの開発は、困難であり、労力を要する。これは、反応におけるプライマーのアニール比率の変動と与えられたＭｇ２＋濃度での各配列のポリメラーゼ伸長比率の変動によるものである。典型的には、アニール温度に加え、プライマー、Ｍｇ２＋および塩濃度は、反応におけるプライマーアニール比率とポリメラーゼ伸長比率のバランスを保つように調整される。残念ながら、各々新しいプライマーセットを反応に加えると、形成することのできる可能なアンプリコンとプライマー二量体の数が指数的に増加する。従って、各追加プライマーセットで、各々比較的等量の正確な産物を得る条件をつくりだすのがますます困難になり、時間を要することになる。
対立遺伝子特異的ＰＣＲ産物は一般に同じ大きさを有し、アッセイ結果は、各反応チューブに関連するゲル・レーンでの産物バンドの存在・不存在によって計られる。Gibbs et al., Nucleic Acids Res., 17:2437-2448(1989)。この方法は、異なるプライマーの組み合わせを有する多数の反応チューブに試験サンプルを分割することを要し、アッセイ費用が増大する。ＰＣＲも、１つの反応チューブ中で対立遺伝子プライマーを競合せしめるように相違する蛍光染料を付着せしめることにより、対立遺伝子を識別するが（F. F. Chehab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9178-9182(1989)）、多重解析へのこの経路は、現在の機器および染料化学でもっては経済的にスペクトル的に分解できる染色が比較的少ないので、規模が限られている。粗大側鎖による修飾塩基の取り込みが、その電気泳動運動性によって対立遺伝子ＰＣＲ産物を識別するのに用いられるが、この方法は、ポリメラーゼによるこれら修飾塩基の取り込みの成功性からして、およびこれらの基の唯一つによって大きさが相違する比較的大きいＰＣＲ産物を分解するための電気泳動性からして、限定されたものである。Livak et al., Nucleic Acids Res., 20:4831-4837(1989)。各ＰＣＲ産物は単一変異のみを探すのに用いられ、多重化を難しくする。
対立遺伝子特異的プローブの連結反応は一般的に、対立遺伝子シグナルを分解するのに、固相捕捉反応（U. Landegren et al., Science, 241:1077-1080(1988); Nickerson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8923-8927(1990)）またはサイズ依存分離法（D. Y. Wu, et al., Genomics, 4:560-569(1989) and F. Barany, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:189-193(1991)）を用い、後者の方法は連結プローブのサイズ幅が狭いので多重規模では限定されている。さらに、多重フォーマットにおいて、リガーゼ検出反応だけでは少量の標的配列を検出および計測するのに充分な産物をつくることができない。ギャップリガーゼ連鎖反応は追加の工程、すなわちポリメラーゼ伸長を必要とする。より複雑な多重化のために電荷／翻訳摩擦ドラッグ（translational frictional drag）の明白な比率を有するプローブを用いることは、長い電気泳動時間かあるいは検出の他の形態の使用を必要とする。
ポリヌクレオチドサンプルにおける多重選択配列の存在・不存在を検出するための迅速な単一アッセイ方式が必要である。
ミクロサテライト解析
ミクロサテライトとして知られる縦列反復ＤＮＡ配列は、ヒトゲノム中の遺伝子要素の非常に一般的で高度に多型性類を表す。小さい反復配列を含むこれらのミクロサテライトマーカーは、初期の遺伝子マッピングや連鎖解析に使用されている。Weber, J. L. et al., Am. J. Hum. Genet. 44:388-396(1989); Weissenbach, J. et al., Nature (London) 359:794-800(1992)。これらの反復体のＰＣＲ増幅によって、ヘテロ結合喪失を迅速に測定し、腫瘍抑制遺伝子マッピング方法を著しく簡素化することができる。Ruppert, J. M., et al., Cancer Res. 53:5093-94(1993); van der Riet, et al., Cancer Res. 54:1156-58(1994); Nawroz, H., et al., Cancer Res. 54:1152-55(1994); Cairns, P., et al., Cancer Res. 54: 1422-24(1994)。さらに最近、ハンチントン舞踏病、脆弱Ｘ症候群、筋緊張性ジストロフィー、脊髄小脳性運動失調Ｉ型、脊髄延髄性筋萎縮および遺伝性歯状赤色淡蒼球性萎縮（dentatorubral-pallidoluysian atrophy）を含む特定の遺伝性疾患における特異的変異を同定するために使用されている。The Huntington's Disease Collaborative Research Group Cell 72:971-83(1993); Kremer, E. J., et al., Science 252: 1711-14(1991); Imbert, G., et al., Nat. Genet. 4:72-76(1993); Orr, H.T., et al., Nat. Genet. 4:221-226(1993); Biancalana, V., et al., Hum. Mol. Genet. 1:255-258(1992); Chung, M.-Y., et al., Nat. Genet. 5:254-258(1993); Koide, R., et al., Nat. Genet. 6:9-13(1994)。これらの遺伝性疾患は、感受性遺伝子中のトリヌクレオチド反復ユニットの伸長が原因のようである。さらに広範なミクロサテライト不安定性は、腫瘍組織の反復要素の伸長および欠失から証明され、最初、結腸直腸腫瘍についてPeinado, M. A., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10065-69(1992); Ionov, Y., Nature (London) 363:558-61(1993); Thibodeau, S. N., et al., Science 260:816-819(1993)また後にいくつかの他の腫瘍型について（Risinger, J.I., Cancer Res. 53:5100-03(1993); Han, H.-J., et al., Cancer Res. 53:5087-89(1993); Peltomaki, P., Cancer Res. 53:5853-55(1993); Gonzalez-Zulueta, M., et al., Cancer Res. 53: 5620-23(1993); Merlo, A., et al., Cancer Res. 54:2098-2101(1994) 報告された。遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌患者において、この遺伝子不安定性はミスマッチ修復遺伝子における遺伝性および体細胞性変異によるようである。Leach, F., et al., Cell 75:1215-1225(1993); Fishel, R., et al., Cell 75: 1027-38(1993); Papadopoulos, N., et al., Science 263:1625-29(1994); Bronner, C. E., et al., Nature (London) 368:258-61(1994)。
ＰＣＲは、癌検知において新しい多型性の出現とヘテロ接合性喪失の両方を同定する際のミクロサテライト解析に一般に使用される。L. Mao, et al., “Microsatellite Alterations as Clonal Markers for the Detection of Human Cancer,” Proc. Natl. Acad. Sci USA 91(21):9871-75(1994); L. Mao, et. al., “Molecular Detection of Primary Bladder Cancer by Microsatellite Analysis,” Science 271:659-62(1996); D. Radford, et.al., “Allelotyping of Ductal Carcinoma in situ of the Breast: Detection of Loci on 8p, 13q, 161, 17p and 17q,” Cancer Res. 55(15):3399-05(1995)。このような目的のためにＰＣＲを使用するとき、各ＰＣＲ反応は個別に行われ、配列ゲル上で分離される。
これらの参考文献はＰＣＲが特定の癌の診断および予後に利用性があることを示しているにもかかわらず、このタイプの解析は高度な情報処理能力がなく、サイズ分割を要するので、欠点がある。さらに、ＰＣＲ滑りに問題があり、研究者をトリ−、テトラ−および高ヌクレオチド反復ユニットにシフトさせ、癌検知をさらに困難にする。
ミクロサテライトマーカーはまた、結腸癌検知（L. Cawkwell, et. al., “Frequency of Allele Loss of DCC, p53, RB1, WT1, NF1, NM23, and APC/MCC in Colorectal Cancer Assayed by Fluorescent Multiplex Polymerase Chain Reaction,” Br. J. Cancer 70(5):813-18(1994)）およびゲノムマッピング（P. Reed, et. al., “Chromosome‐specific Microsatellite Sets for Fluorescent-Based, Semi-Automated Genome Mapping,” Nat. Genet. 7(3):390-95(1994)）にも使用されている。しかしながら、このような多重プロセスのカギは、それを単一反応チューブで行う能力である。従来の多重ミクロサテライトマーカー技法はプライマー濃度および増幅条件に注意深い対応を要する。ＰＣＲ産物をセット中にためておくことができるが、混合物が各バンド中にほぼ等しい量のＤＮＡを有することを保証するために、アガロースゲル上で試用することを要する。
ヒト同定
ＰＣＲはまたヒト同定、例えば父親検定、犯罪捜査および軍部の人員同定に使用されている。A. Syvanen et. al., “Identification of Individuals by Analysis of Biallelic DNA Markers, Using PCR and Solid-Phase Mini-Sequencing” Am. J. Hum. Genet. 52(1):46-59(1993) にヒト同定についてのミニ配列決定技法が記載されている。この技法は、単一ＰＣＲチューブで多くても４ＰＣＲ反応が一度に行われ、個体マーカーのＰＣＲ増幅を要する。ミニ配列決定は個体の多型性を測定するのに行われる。
組み合せたプロセス
G. Deng, et. al., “An Improved Method of Competitive PCR for Quantitation of Gene Copy Number,” Nucl. Acids. Res. 21:4848-49(1993)は競合ＰＣＲプロセスを記述している。各遺伝子およびその等価標準について用いるプライマーの異なるセットを２ＰＣＲ工程に利用する。
T. Msuih, et. al., “Novel, Ligation-Dependent PCR Assay for Detection of Hepatitis C. Virus in Serum,” J. Clin. Microbio. 34:501-07(1996)およびY. Park, et. al.,“Detection of HCV RNA Using Ligation-Dependent Polymerase CHain Reaction in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Liver Tissue”（提出）は、ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスのＲＮＡとの併用について記述している。
本発明は核酸配列の相違を検出するための方法を提供することを目的とする。
本発明は、組み合せたＬＤＲおよびＰＣＲプロセスを用いて核酸配列の相違を検出することに関する。本発明は次の３実施態様の１つによって行われる。（１）ＬＤＰと組み合せたＰＣＲ、（２）１次ＰＣＲと組み合せた２次ＰＣＲと組み合せたＬＤＲ、および（３）１次ＰＣＲと組み合せた２次ＰＣＲ。これらの実施態様の各々がある種の性質を検出するのに特定の適用性を有する。しかし、各々において核酸配列の相違を多重的に検出するのに組み合せた反応を利用するものであり、そこでは各プロセスの初期段階由来のオリゴヌクレオチドがプロセスの後期段階由来のオリゴヌクレオチドで使用され得る配列を含有している。
Ｉ．１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセス
本発明の一つの実施態様は、複数の標的ヌクレオチド配列における１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の２以上を同定するための方法に関する。この方法は、第１ポリメラーゼ相、第２ポリメラーゼ相およびリガーゼ検出相を含む。このプロセスは、複数の配列相違がある１以上の標的ヌクレオチド配列を含有するかも知れないサンプルを分析することを含む。
第１ポリメラーゼ連鎖反応相において、１以上の１次オリゴヌクレオチドプライマー群が準備される。各群は１以上の１次オリゴヌクレオチドプライマー・セットを含有し、各セットは、標的特異的部分と５’上流２次プライマー特異的部分を有する第１ヌクレオチドプライマー、および標的特異的部分と５’上流２次プライマー特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドプライマーを含む。同じ群の各セットの第１オリゴヌクレオチドプライマーは同じ５’上流２次プライマー特異的部分を有し、同じ群の各セットの第２オリゴヌクレオチドプライマーは同じ５’上流２次プライマー特異的部分を有している。特定のセットのオリゴヌクレオチドプライマーは、対応する標的ヌクレオチド配列の相補的鎖でのハイブリダイゼーションに適しており、ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成をもたらす。しかし、１次オリゴヌクレオチドプライマーがサンプル中に他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに、該ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成に妨害するミスマッチがある。特定のセットにおけるポリメラーゼ連鎖反応産物は、同じ群での他のポリメラーゼ連鎖反応産物と識別され得る。１次オリゴヌクレオチドプライマー、サンプルおよびポリメラーゼは混合されて、１次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。
１次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、１次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異的部分が標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。伸長処理によってハイブリダイズした１次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、１次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列に相補的な１次伸長産物を形成する。
１次オリゴヌクレオチドプライマーの上流２次プライマー特異的部分は標的ＤＮＡに存在しないが、その配列は１次ポリメラーゼ連鎖反応相の第２以後のサイクルで複写される。結果として、第２サイクル後に産生された１次伸長産物は、その５’末端に２次プライマー特異的部分、およびその３’末端にプライマー特異的部分の補体を有する。
次は、第２ポリメラーゼ連鎖反応相である。この相では１つまたは複数の２次オリゴヌクレオチドプライマーセットが準備される。各セットは、第１の１次オリゴヌクレオチドプライマーの５’上流部分と同じ配列を含有する第１の２次オリゴヌクレオチドプライマー、および第１の２次プライマーに相補的な第１の１次オリゴヌクレオチドと同じ１次オリゴヌクレオチドプライマーセットに由来する第２の１次オリゴヌクレオチドプライマーの５’上流部分と同じ配列を含有する第２の２次オリゴヌクレオチドプライマーを有する。２次オリゴヌクレオチドプライマーのセットは、特定の群において１次伸長産物のすべてを増幅するのに使用され得る。２次オリゴヌクレオチドプライマーを１次伸長産物およびポリメラーゼと混合して、２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。
２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、２次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異部分が１次伸長産物上に存在する相補的配列にハイブリダイズし、元の標的配列にハイブリダイズしない。伸長処理によってハイブリダイズ２次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、１次伸長産物に相補的な２次伸長産物を形成する。
本発明の態様における最後の相はリガーゼ検出反応相である。ここでは、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットが準備され、各セットは、２次伸長産物特異的部分と検出可能レポーター標識を保持する第１オリゴヌクレオチドプローブ、および２次伸長産物特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプローブを有する。特定セットのオリゴヌクレオチドプローブは、相補的２次伸長産物特異的部分に互いに隣接してハイブリダイズしたときに一緒に連結反応するのに適している。しかし、オリゴヌクレオチドプローブがサンプル中の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を妨害するミスマッチがある。特定セットにおけるオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物は、プローブまたは他の連結反応産物のいずれかと識別され得る。複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを２次伸長産物およびリガーゼと混合して、リガーゼ検出反応混合物とする。
リガーゼ検出反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理およびハイブリダイゼーション処理を有する１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーション処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは、隣接部位で塩基特異的に、もし存在すれば夫々の２次伸長産物にハイブリダイズする。結果として、隣接プローブは互いに連結して、一緒に結合している検出可能レポーター標識および２次伸長産物特異的部分を含有する連結産物配列を形成する。オリゴヌクレオチドプローブセットは、その夫々の相補的２次伸長産物以外のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るが、１以上のミスマッチの存在のために一緒に連結しないで、変性処理の際に個々に分離している。リガーゼ検出反応サイクルに続いて、連結反応産物配列のレポーター標識が検出されて、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在が示される。
本発明の１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ/ＬＤＲプロセスは、単一ヌクレオチドおよび縦列反復多形性の多重的検出においてＰＣＲのみの使用よりも顕著な利点をもたらす。
上記したように、ＰＣＲのみの使用では、多重検出を行うための操作条件において厳しい最適化をなすことを要する。さらに、多数の標的ヌクレオチド配列を検出するためには、オリゴヌクレオチドプライマーの量を増加しなければならない。しかし、これが起きると、標的独立反応（例えばプライマー二量体作用）の可能性が増加する。加うるに、変異を知らねばならず、偽の正反応が正常なタンプレットのポリメラーゼ伸長によって生じることがあり、重複しているプライマーの干渉による近接クラスター部位では多重検出はできず、小さい反復配列における単一塩基または小さい挿入や欠失は検出できず、そして正常ＤＮＡの高バックグランドにおける変異ＤＮＡの定量が難しい。結果として、単一の多重ＰＣＲプロセスにおいて検出される標的ヌクレオチド配列の数は限られてくる。
直接的配列決定は、配列を正しく得るには豊富な変異サンプルを必要とし、多くのエクソン含有の大きい遺伝子について多重反応を必要とし、産物の電気泳動分離を必要とし、時間がかかり、正常ＤＮＡのバックグランド５％以下での変異ＤＮＡ検出には用いることができない。ミニ配列決定においては、変異を知らねばならず、重複しているプライマーの干渉による近接クラスター部位では多重検出はできず、小さい反復配列における単一塩基または小さい挿入や欠失は検出できず、そして４種の分離反応を必要とする。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＡＳＯ）においては、変異を知らねばならず、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を知らねばならず、交叉反応を防ぐのは難しく、重複するプライマーの干渉による近接クラスター部位では多重検出はできず、正常ＤＮＡのバックグランドの５％以下では変異ＤＮＡは検出できない。プライマー調節ＲＥＬＰは、正常ＤＮＡから変異体を識別するのに電気泳動分離を必要とし、制限部位に移行し得る部位に適用するには限界があり、変異の性質を調べるのに追加の解析を必要とし、変異ＤＮＡが正常のＤＮＡの高バックグランドにあるときは用いるのが難しい。単鎖立体配座多形性解析（ＳＳＣＰ）は、変異配座体を正常配座体と区別するのに電気泳動分離を必要とし、可能性のある変異の３０％を誤り、変異の性質を調べるために追加の解析を要し、サイレント多形性と変異を識別できない。ジデオキシヌクレオチドフィンガー・プリント（ｄｄＦ）の場合、正常ＤＮＡの高いバックグランドにおいては変異を検出するのは困難であり、変異配座体を正常配座体と区別するのに電気泳動を必要とし、変異の性質を調べるために追加の解析を要し、サイレント多形性と変異を識別できない。変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）は、変異配座体を正常配座体から電気泳動的に分離しなければならず、可能性のある変異の３０％を誤り、変異の性質を調べるために追加の解析を要し、サイレント多形性と変異を識別できない。そして前に得た結果を再現するのに技術的に熟練を要する。ＲＮａｓｅミスマッチ開裂法は、変異の性質を調べるのに追加の解析を要し、ＲＮａｓｅ抵抗性ミスマッチを排除するために両鎖の解析を必要とし、正常ＤＮＡの高いバックグランドにおいては変異を検出するのに困難がある。化学的ミスマッチ分裂法は、正常ＤＮＡのバックグランドが５％以下では変異ＤＮＡを検出することができず、すべての変異を検出するのに両鎖の解析を必要とする。Ｔ４ Ｅｎｄｏ ＶＩＩミスマッチ分裂法では、変異の性質を調べるのに追加の解析を要し、変異とサイレント多形性を区別できず、エンドヌクレアーゼが結果の注意深い解釈に必要なコントロールＤＮＡを分裂し、そして正常ＤＮＡの高いバックグランドでは変異の検出が困難である。
ＰＣＲの感受性とＬＤＲの特異性を組み合せた本発明の１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスにおいては、上記のような問題がない。１次ＰＣＲ相は２次プライマー特異的部分を有する１次伸長産物を産生する。この最初の相は、１次伸長産物の産生を最大にするのに効果的で、ＰＣＲのみのプロセスにおいて時々起きる有害反応を生じることのない条件で実施される。特に、本発明の１次ＰＣＲ相は、１５−２０ＰＣＲサイクルで実施され、ＰＣＲのみのプロセスで用いられるであろうよりも少ないプライマーが使用される。本発明の１次ＰＣＲ相は、いくつかの標的ヌクレオチド配列がよく増幅し、一方あるものは増幅しないので、非常に多様で、予想外に伸長産物を生み出す。しかし、２次ＰＣＲ相においては、すべての１次伸長産物が同じ２次プライマー特異的部分を有するので、ほぼ等しく増幅される。サンプル中に元から存在している標的ヌクレオチド配列は、これらの配列が２次プライマー特異的部分を含有しないので、２次ＰＣＲ相によっては増幅されない。結果として、本発明の１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスは、単一のチューブにおける数百のヌクレオチド配列相違の多重検出を、分析に供せられる各特定サンプルについての操作条件をその都度つくることなしに、達成することができる。変異配列の選択がＰＣＲよりもむしろＬＤＲで調節されるので、１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスは偽の正標的生成には感受性が低い。さらに、１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスは、近接クラスター変異の検出、小さい反復配列における単一塩基または小さい挿入や欠失の検出、正常ＤＮＡの高いバックグランドにおける１％以下の変異の定性的検出、およびアドレス可能アレイを用いる連結反応産物配列の検出を可能とする。唯一の主要な必要事項は、変異を知り、多数のオリゴヌクレオチドを合成することである。
単一ヌクレオチドおよび縦列反復多形性の検出ができることは、法医学的ＤＮＡ同定および遺伝子疾患の診断に特に重要である。
ＩＩ．ＬＤＲ／ＰＣＲプロセス
本発明の第２態様は、複数の標的ヌクレオチド配列における１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失および転座によって相違している１以上の複数配列を同定する方法に関する。この方法はリガーゼ検出反応相に続いてポリメラーゼ連鎖反応相を有する。この方法は、複数の配列相違を有する１以上の標的ヌクレオチド配列を含有する可能性のあるサンプルを準備することを含む。
リガーゼ検出反応相において１以上のオリゴヌクレオチドプローブが準備される。各セットは、標的特異的部分と５’上流プライマー特異的部分を保持する第１オリゴヌクレオチドプローブ、および標的特異的部分と３’下流プライマー特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプローブを有する。特定セットにおける標的ヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適している。しかし、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするときに、この連結反応を妨害するミスマッチがある。サンプル、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物とする。
リガーゼ検出反応混合物は１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけられる。これらのサイクルには変性処理とハイブリダイゼーション処理が含まれる。変性処理において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離される。ハイブリダイゼーション処理によって、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在しておればその夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ハイブリダイズされると、オリゴヌクレオチドプローブセットは互いに連結して、連結反応産物配列を形成する。この産物は、５’上流プライマー特異的部分、一緒に結合した標的特異的部分および３’下流プライマー特異的部分を含む。各セットの連結反応産物配列は連結検出反応混合物中の他の核酸と識別可能である。オリゴヌクレオチドプローブセットはその夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、１以上のミスマッチの存在によって連結せず、そして、次の変性処理の際に個々に分離している。
ポリメラーゼ連鎖反応において、１または複数のオリゴヌクレオチドプローブが準備される。各セットは、連結反応産物配列の５’上流プライマー特異的部分に同じ配列を含有する上流プライマー、および連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを有している。うち、１つのプライマーは検出可能レポーター標識を有する。リガーゼ検出反応混合物を１または複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびポリメラーゼと混合すると、ポリメラーゼ連鎖反応混合物が形成する。
ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。変性処理においてハイブリダイズ核酸配列が分離される。ハイブリダイゼーション処理によって、プライマーが連結反応産物配列の相補的プライマー特異的部分とハイブリダイズする。伸長処理において、ハイブリダイズプライマーが伸長されて、プライマーがハイブリダイズしている配列に相補的な伸長産物を形成する。ポリメラーゼ連鎖反応相の第１サイクルにおいて、下流プライマーが連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長されて連結反応産物配列に相補的な伸長産物を形成する。次のサイクルにおいて、上流プライマーが連結反応産物に相補的な伸長産物の５’上流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、下流プライマーが連結反応産物配列の３’下流部分にハイブリダイズする。
このプロセスのポリメラーゼ連鎖反応相に続いて、レポーター標識が検出され、伸長産物が識別されて、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在が表される。
本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスの一つの実施態様は、細胞中の遺伝子コピーの数（すなわち遺伝子量）の測定においてＬＤＲのみの使用に比べて改良された成果をもたらす。ＬＤＲのみを使用すると、複数の遺伝子を定量するの必要とする十分な標的コピーを産生するのが難しい。
本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスの他の実施態様において、ＬＤＲ連結反応産物配列がサンプル中に誘導された遺伝子の比率に応じた比率で産生される。同じプライマー特異的部分をＬＤＲ相のためのオリゴヌクレオチドプローブに合体することにより、ＰＣＲ相が連結反応産物配列をその比率の保持と同じ程度に増幅する。解析しようとするサンプル中に元から存在する標的配列は、この標的配列がＰＣＲプライマー特異的部分を含有しないので、ＰＣＲ相で増幅されない。さらに、ＰＣＲ相のためのオリゴヌクレオチドプライマーのみがレポーター標識を有し、この標識のある伸長産物のみが検出される。
遺伝子量の変化の測定は多くの生物医学での利用において重要である。
Ｘ染色体上の遺伝子が男性と女性では相違しており、女性は２コピーに対し男性は１コピーである。女性はＸ染色体について欠失の保持者となることがある。もしＸ染色体の欠失領域が１以上の遺伝子を含むとすると、女性は他のＸ−染色体の対応する非欠失域にこれらの遺伝子１コピーのみを有する。この結果（Ｘ−連結遺伝子の１コピーを有すること）は、男性細胞における状況に類似しており、遺伝された障害を発揮することなく、常に寛容されている。しかし、もしその女性の息子が彼女の欠失Ｘ染色体を受け継ぐと、彼は欠失領域に遺伝子コピーを所有しないので、遺伝子不存在によるＸ−関連障害にかかる。このように、染色体欠失の検出は、本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスの適用例である。
受精卵が染色体の異常補体を有すると、先天性の染色体障害が起きる。最も多い先天性染色体障害はダウン症候群であって、各細胞に追加の染色体（４７、ＸＸ＋２１または４７、ＸＹ＋２１と表される）が存在するときに、これは生じる。本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスは先天性染色体障害を同定できるように設計され得る。
本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスは、モノヌクレオチドおよびジヌクレオチド反復配列における多形性を識別するのに有用でもある。クローン性の検出のためにユニーク多形性を含有すの少数の細胞を識別するのにも有用である。
ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスはゲルおよび非ゲル（すなわちＤＮＡアレイ）の両方の技法で用いられる。多くの遺伝子の増幅および欠失の同時の多重分析、定量分析を可能にし、外部標準を必要としない。ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスにおける唯一の比較的小さい問題点は、染色体における大きい欠失の境界を測定するのが難しいことである。
一方、ミクロサテライト・マーカー分析は、欠失または増幅した小さい領域を検出するのに用いることはできず、増幅領域の同時検出に適合せず、情報マーカーの利用性に依存している。競合的ＰＣＲ（すなわち分別的ＰＣＲ）は、いくつもの欠失および増幅を同時に検出するために多重的に使用できないし、特に精密でない。サザン・ハイブリダイゼーションは、時間と労力がかかり、試験する各プローブについて多工程を要して多重化には適しておらず、そして大量のＤＮＡを必要とする。蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、特別の技術を要し、時間がかかり、調べようとする欠失または増幅領域を解析する大きいプローブを必要とする。このように本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスは先行プロセスに優れる顕著な進歩がある。
ＩＩＩ．１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセス
本発明の第三の実施態様は、１以上の標的ヌクレオチド配列における１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の２以上を同定するための方法に関する。この方法は、複数の配列相違がある１以上の標的ヌクレオチド配列を含有するかも知れないサンプルを２つの連続するポリメラーゼ連鎖反応相にかけることを含む。
第１ポリメラーゼ連鎖反応相において、１以上の１次オリゴヌクレオチドプライマー群が準備される。各群は２以上の１次オリゴヌクレオチドプライマー・セットを含有する。各セットは、標的特異的部分と５’上流第２プライマー特異的部分を保持する第１オリゴヌクレオチドプライマー、および標的特異的部分と５’上流第２プライマー特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプライマーを有する。同じ群の各セットの第１オリゴヌクレオチドプライマーは同じ５’上流第２プライマー特異的部分を有し、同じ群の各セットの第２オリゴヌクレオチドプライマーは同じ５’上流第２プライマー特異的部分を有している。特定のセットのオリゴヌクレオチドプライマーは、対応する標的ヌクレオチド配列の相補鎖でのハイブリダイゼーションに適しており、ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成をもたらす。しかし、１次オリゴヌクレオチドプライマーがサンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに、該ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を妨害するミスマッチがある。特定のセットにおけるポリメラーゼ連鎖反応産物は、同じ群または他の群を有する他のポリメラーゼ連鎖反応産物と識別され得る。１次オリゴヌクレオチドプライマーをサンプルおよびポリメラーゼと混合して、第１ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。
１次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、１次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異部分が標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。伸長処理によってハイブリダイズ１次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、１次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列に相補的な１次伸長産物を形成する。
１次オリゴヌクレオチドプライマーの上流２次プライマー特異的部分は標的ＤＮＡに存在しないが、その配列は１次ポリメラーゼ連鎖反応相の第２以後のサイクルで複写される。結果として、第２サイクル後の１次伸長産物は、その５’末端に２次プライマー特異的部分、そしてその３’末端にプライマー特異的部分の補体を有する。
本発明のこの実施態様での第２ポリメラーゼ連鎖反応相において１つまたは複数の２次オリゴヌクレオチドプライマーセットが準備される。各セットは、検出可能レポーター標識を保持し、かつ第１の１次オリゴヌクレオチドプライマーの５’上流部分と同じ配列を含有する第１の２次プライマー、および第１の２次プライマーに相補的な第１の１次オリゴヌクレオチドと同じ１次オリゴヌクレオチドプライマーセットに由来する第２の１次オリゴヌクレオチドプライマーの５’上流部分と同じ配列を含有する第２の２次プライマーを有する。２次オリゴヌクレオチドプライマーのセットは、各群において１次伸長産物を増幅する。２次オリゴヌクレオチドプライマーを１次伸長産物およびポリメラーゼと混合して、２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。
２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、２次オリゴヌクレオチドプライマーが１次伸長産物にハイブリダイズする。伸長処理によって、ハイブリダイズした２次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、１次伸長産物に相補的な２次伸長産物を形成する。２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を２以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに掛けた後に、標識２次伸長産物が検出される。これはサンプル中おける１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を表す。
本発明の１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセスは、サザンハイブリダイゼーション、競合的ＰＣＲ、および異型接合の損失を起こすヌクレオチド欠失の検出におけるミクロサテライト・マーカー解析法を上回る顕著な利点を有する。サザンハイブリダイゼーションは、競合的ＰＣＲより精密であるが、非常に労力を要し、多量のＤＮＡを必要とし、いかなる技法でも多重化されていない。現在の多重ミクロサテライト・マーカー法はプライマー濃度と増幅条件に非常な注意を要する。
本発明の１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセスは、これら先行技術における困難性を解決する。１次ＰＣＲ相において、１次オリゴヌクレオチドプライマーがジヌクレオチドまたは他の反復配列の両側に置かれ、２次プライマー特異的部分を含む。１次ＰＣＲ相は、これらのプライマーの低濃度で実施されて、同時にいくつかの部座の増幅を可能とする。２次ＰＣＲ相によって、選択される標的特異的２次プライマーと同じ速度で増幅が続けられて、隣接のセットからミクロサテライト・マーカーの１セットが並べられる。１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセスは、単一ＰＣＲチューブで、単一ゲルレーン解析で多重検出を実施するのに用いられる。
本発明のこの実施態様は、ミクロサテライト・マーカー分析を実施して遺伝子中のヌクレオチド欠失を同定するのに有用である。このような多重検出は単一の反応チューブで実施され得る。しかし、１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセスは、増幅と欠失を識別できないので、かかる識別をなそうとするときは、上記のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスすなわち分別ＰＣＲプロセスを併用しなければならない。
発明の詳細な記述
Ｉ．１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセス
本発明の一つの実施態様は、複数の標的ヌクレオチド配列における１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の２以上を同定するための方法に関する。この方法は、第１ポリメラーゼ相、第２ポリメラーゼ相およびリガーゼ検出相を含む。このプロセスは、複数の配列相違がある１以上の標的ヌクレオチド配列を含有するかも知れないサンプルを分析することを含む。
第１ポリメラーゼ連鎖反応相において、１以上の１次オリゴヌクレオチドプライマー群が準備される。各群は１以上の１次オリゴヌクレオチドプライマー・セットを含有し、各セットは、標的特異的部分と５’上流２次プライマー特異的部分を有する第１ヌクレオチドプライマー、および標的特異的部分と５’上流２次プライマー特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドプライマーを含む。同じ群の各セットの第１オリゴヌクレオチドプライマーは同じ５’上流２次プライマー特異的部分を有し、同じ群の各セットの第２オリゴヌクレオチドプライマーは同じ５’上流２次プライマー特異的部分を有している。特定のセットのオリゴヌクレオチドプライマーは、対応する標的ヌクレオチド配列の相補的鎖でのハイブリダイゼーションに適しており、ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成をもたらす。しかし、１次オリゴヌクレオチドプライマーがサンプル中に他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに、該ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成に妨害するミスマッチがある。特定のセットにおけるポリメラーゼ連鎖反応産物は、同じ群での他のポリメラーゼ連鎖反応産物と識別され得る。１次オリゴヌクレオチドプライマー、サンプルおよびポリメラーゼは混合されて、１次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する。
１次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、１次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異的部分が標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。伸長処理によってハイブリダイズした１次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、１次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列に相補的な１次伸長産物を形成する。
１次オリゴヌクレオチドプライマーの上流２次プライマー特異的部分は標的ＤＮＡに存在しないが、その配列は１次ポリメラーゼ連鎖反応相の第２以後のサイクルで複写される。結果として、第２サイクル後に産生された１次伸長産物は、その５’末端に２次プライマー特異的部分、およびその３’末端にプライマー特異的部分の補体を有する。
次は、第２ポリメラーゼ連鎖反応相である。この相では１つまたは複数の２次オリゴヌクレオチドプライマーセットが準備される。各セットは、第１の１次オリゴヌクレオチドプライマーの５’上流部分と同じ配列を含有する第１の２次オリゴヌクレオチドプライマー、および第１の２次プライマーに相補的な第１の１次オリゴヌクレオチドと同じ１次オリゴヌクレオチドプライマーセットに由来する第２の１次オリゴヌクレオチドプライマーの５’上流部分と同じ配列を含有する第２の２次オリゴヌクレオチドプライマーを有する。２次オリゴヌクレオチドプライマーのセットは、特定の群において１次伸長産物のすべてを増幅するのに使用され得る。２次オリゴヌクレオチドプライマーを１次伸長産物およびポリメラーゼと混合して、２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。
２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、２次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異部分が１次伸長産物上に存在する相補的配列にハイブリダイズし、元の標的配列にハイブリダイズしない。伸長処理によってハイブリダイズ２次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、１次伸長産物に相補的な２次伸長産物を形成する。
本発明の態様における最後の相はリガーゼ検出反応相である。ここでは、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットが準備され、各セットは、２次伸長産物特異的部分と検出可能レポーター標識を保持する第１オリゴヌクレオチドプローブ、および２次伸長産物特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプローブを有する。特定セットのオリゴヌクレオチドプローブは、相補的２次伸長産物特異的部分に互いに隣接してハイブリダイズしたときに一緒に連結反応するのに適している。しかし、オリゴヌクレオチドプローブがサンプル中の他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を妨害するミスマッチがある。特定セットにおけるオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物は、プローブまたは他の連結反応産物のいずれかと識別され得る。複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを２次伸長産物およびリガーゼと混合して、リガーゼ検出反応混合物とする。
リガーゼ検出反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理およびハイブリダイゼーション処理を有する１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーション処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは、隣接部位で塩基特異的に、もし存在すれば夫々の２次伸長産物にハイブリダイズする。結果として、隣接プローブは互いに連結して、一緒に結合している検出可能レポーター標識および２次伸長産物特異的部分を含有する連結産物配列を形成する。オリゴヌクレオチドプローブセットは、その夫々の相補的２次伸長産物以外のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るが、１以上のミスマッチの存在のために一緒に連結しないで、変性処理の際に個々に分離している。リガーゼ検出反応サイクルに続いて、連結反応産物配列のレポーター標識が検出されて、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在が示される。
図１、２および３は２種の検出手法のいずれかを用いた本発明の１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す流れ図である。１つの方法として、毛管電気泳動またはゲル電気泳動と蛍光定量の使用がある。他方、捕捉オリゴヌクレオチドアドレスのアレイ上の捕捉と蛍光定量によって検出が実施される。図１は生殖細胞系変異（例えば、点変異）の検出に関し、図２はバイ対立遺伝子多形性の検出であり、図３は癌関連変異の検出を示す。
図１は生殖系点変異の検出を表す。第１工程において、ＤＮＡサンプル作成後、Ｔａｑ（すなわちThermus aquaticus）ポリメラーゼを用いた１次ＰＣＲ増幅に、ホットスタート条件で、標的特異的部分と２次プライマー特異的部分とを有するオリゴヌクレオチドプライマーと共に、多重エクソンをかける。１次ＰＣＲ相の終了点で、Ｔａｑポリメラーゼは、１００℃で１０分間加熱するか、または凍結／解凍工程により不活性化される。１次ＰＣＲ増幅相の産物は、第２工程でＴａｑポリメラーゼを用いホットスタート条件で２次オリゴヌクレオチドプライマーと共に、２次ＰＣＲ増幅にかける。２次ＰＣＲ相の終了点で、Ｔａｑポリメラーゼは、１００℃で１０分間加熱するか、または凍結／解凍工程により不活性化される。第３工程において、２次ＰＣＲ相の産物は、対立遺伝子特異的部分と共通部分を有するＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブを含有する新鮮なＬＤＲ緩衝液に２０倍に希釈する。第４工程は、ＬＤＲ相であって、ホットスタート条件でＴａｑリガーゼを加えることにより始まる。ＬＤＲの際にオリゴヌクレオチドプローブはその隣接のオリゴヌクレオチドプローブに、接合部で完全な相補性を与える標的配列の存在においてのみ、連結する。
産物は２種の相違するホーマットにおいて検出される。第１ホーマット５ａでは、蛍光標識ＬＤＲプローブが相違する長さのポリＡまたはヘキサエチレンオキシド・テイルを含有する。このように各連結反応産物配列（正常ＤＮＡ上でハイブリダイズされた２プローブの連結反応の結果である）は、いくつかの連結反応産物配列がピークの段差を与えるように、少し相違する長さと運動性を有する。生殖細胞系変異は電気泳動濃度図上に新しいピークをつくることがある。他方、生殖細胞系変異連結反応産物配列が正常ＤＮＡ連結反応産物配列と同じ運動性を有して泳動するが、相違する蛍光レポーターで識別されるようにＬＤＲプローブは設計され得る。新しいピークのサイズはほぼ元のサンプルに存在する変異の量である。すなわち、ホモ接合正常は０％、ヘテロ接合保持は５０％、そしてホモ接合変異は１００％である。第２ホーマット５ｂにおいて、各対立遺伝子特異的プローブは、例えばその５’末に２４追加ヌクレオチド塩基を含有する。これらの配列はユニーク・アドレス可能配列であって、アドレス可能アレイ上でその相補的アドレス配列に特異的にハイブリダイズする。ＬＤＲ反応において、各対立遺伝子特異的プローブは、対応する標的配列の存在において隣接の蛍光標識共通プローブに連結できる。野生型および変異の対立遺伝子に対応する連結反応産物配列は、アレイ上の隣接アドレスに捕捉される。未反応のプローブは洗浄して除く。黒点は野生型対立遺伝子についての１００％シグナルを表す。白点は変異対立遺伝子についての０％シグナルを表す。灰色点は生殖細胞系変異の１つの位置、各対立遺伝子についての５０％シグナルを表す。
図２は、バイ対立遺伝子多形性の検出を表す。第１工程において、Ｔａｑポリメラーゼを用いた１次ＰＣＲ増幅に、ホットスタート条件で、標的特異的部分と２次プライマー特異的部分とを有するオリゴヌクレオチドプライマーと共に、多重エクソンをかける。１次ＰＣＲ増幅相の産物は、第２工程でＴａｑポリメラーゼを用いホットスタート条件で２次オリゴヌクレオチドプライマーと共に、２次ＰＣＲ増幅にかける。２次ＰＣＲ相の終了点で、Ｔａｑポリメラーゼは、１００℃で１０分間加熱するか、または凍結／解凍工程により不活性化される。第３工程において２次ＰＣＲ相の産物は対立遺伝子特異的部分と共通部分を有するＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブを含有する新鮮なＬＤＲ緩衝液に２０倍に希釈する。第４工程は、ＬＤＲ相であって、ホットスタート条件でＴａｑリガーゼを加えることにより始まる。ＬＤＲの際にオリゴヌクレオチドプローブはその隣接のオリゴヌクレオチドプローブに、接合部で完全な相補性を与える標的配列の存在においてのみ、連結する。第１ホーマット５ａでは、蛍光標識ＬＤＲプローブが相違する長さのポリＡまたはヘキサエチレンオキシド・テイルを含有する。各連結反応産物は、いくつかの連結反応産物配列がピークの段差を与えるように、少し相違する長さと運動性を有する。他方、多形性対立遺伝子の連結反応産物配列が同じ位置で移動するが、相違する蛍光レポーターで識別されるようにＬＤＲプローブは設計され得る。ピークのサイズはほぼ各対立遺伝子の量である。第２ホーマット５ｂにおいて、各対立遺伝子特異的プローブは、例えばその５’末に２４の追加ヌクレオチド塩基を有するユニーク・アドレス可能配列を含有する。これらの配列は、捕捉オリゴヌクレオチドアレイ上でその相補的アドレス配列に特異的にハイブリダイズする。ＬＤＲ反応において、各対立遺伝子特異的プローブは、対応する標的配列の存在において隣接の蛍光標識共通プローブに連結できる。各対立遺伝子に対応する連結反応産物配列は、アレイ上の隣接アドレスに捕捉される。未反応のプローブは洗浄して除く。黒点は両染色体が与えられた対立遺伝子を有すことを表す。白点はいずれの染色体もこの対立遺伝子を有さないことを表す。灰色点は１つの染色体が与えられた対立遺伝子を有することを表す。
図３は、癌関連変異を表す。第１工程において、ＤＮＡサンプル作成後、Ｔａｑポリメラーゼを用いた１次ＰＣＲ増幅に、ホットスタート条件で、標的特異的部分と２次プライマー特異的部分とを有するオリゴヌクレオチドプライマーと共に、多重エクソンをかける。１次ＰＣＲ増幅相の産物は、第２工程でＴａｑポリメラーゼを用いホットスタート条件で２次オリゴヌクレオチドプライマーと共に、２次ＰＣＲ増幅にかける。２次ＰＣＲ相の終了点で、Ｔａｑポリメラーゼは、１００℃で１０分間加熱するか、または凍結／解凍工程により不活性化される。ＰＣＲ産物の蛍光定量は第３工程において毛管またはゲル電気泳動により行うことができる。第４工程において、産物はマーカーＤＮＡの１／１００希釈（フラグメントの各々につき）でスパイクされる。このＤＮＡは、癌サンプルにみられないが、適当なＬＤＲプローブで容易に検出される変異を有することを除けば、野生型ＤＮＡに相同的である。第５工程において、２次ＰＣＲ相産物中の混合ＤＮＡ産物は、対立遺伝子特異的部分と共通部分を含有するＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブを含む新鮮なＬＤＲ緩衝液に２０倍に希釈される。第６工程は、ＬＤＲ相であって、ホットスタート条件でＴａｑリガーゼを加えることにより始まる。ＬＤＲの際に、接合部に完全な相補性を与える標的配列の存在においてのみ、オリゴヌクレオチドプローブがその隣接のオリゴヌクレオチドプローブに連結する。
産物は上記と同じホーマットで検出される。第７ａ工程のホーマットにおいて、毛管またはゲル電気泳動により産物が分離され、そして蛍光シグナルが定量される。変異ピークのマーカーピークに対する割合は、元のサンプル中に存在する癌変異の概量を１００で除して算出される。第７ｂ工程のホーマットにおいて、アドレス可能アレイ上の相補的配列についての特異的ハイブリダイゼーションによって産物が検出される。マーカー点に対する変異点中の蛍光シグナルの割合は、元のサンプル中に存在する癌変異の概量を１００で除して算出される。
図４に示すように、興味ある２種のＤＮＡフラグメントを本発明の１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスで処理する。最初に２重鎖ＤＮＡ分子を変性して、鎖をほどく。これは８０−１０５℃に加熱することによりなされる。３−標的特異的部分（影の部分）と５’２次プライマー特異的部分（黒い部分）を有する１次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを低濃度で加えて、典型的に５０−８５℃で鎖にハイブリダイズせしめる。熱安定性ポリメラーゼ（例えば、Taq aquanticusポリメラーゼ）も加え、温度を５０−８５℃に調節して、プライマーがハイブリダイズする核酸の長さに沿ってプライマーを伸長する。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長相の後に、得た２重鎖分子を８０−１０５℃に加熱して、分子を変性し、鎖を分離する。これらのハイブリダイゼーション、伸長、変性工程は数回繰り返して、標的を適当なレベルにまで増幅する。
２次ＰＣＲ相において、１次ＰＣＲ相産物を２次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーと混合して、典型的には５０−８５℃で互いにハイブリダイズせしめる。２次オリゴヌクレオチドプライマーは１次オリゴヌクレオチドプライマーよりも常に高い濃度で使用する熱安定性ポリメラーゼも加え、温度を５０−８５℃に調節して、プライマーがハイブリダイズする核酸の長さに沿ってプライマーを伸長する。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長相の後に、得た２重鎖分子を８０−１０５℃に加熱して、分子を変性し、鎖を分離する。これらのハイブリダイゼーション、伸長、変性工程は数回繰り返して、標的を適当なレベルにまで増幅する。
２次ＰＣＲ相が完了すると、図４に示すように、連結検出反応相が始まる。標的核酸変性後、もし存在すれば二重鎖ＤＮＡ分子として、温度８０−１０５℃、好ましくは９４℃で、標的ヌクレオチド配列の１本鎖のための連結検出反応オリゴヌクレオチドプローブがリガーゼと共に加えられる（例えば、図４に示すように、Taq aquanticusポリガーゼのような熱安定性リガーゼ）。オリゴヌクレオチドプローブは標的核酸分子とハイブリダイズし得て、典型的には４５−８５℃、好ましくは６５℃で連結する。連結部に完全な相補性があるとオリゴヌクレオチドは一緒に連結する。変わり得るヌクレオチドがＴまたはＡであると、標的ヌクレオチド配列におけるＴの存在は、Ｆ１レポーター標識を有するオリゴヌクレオチドプローブを５’ポリＡテイルＡｎを有する共通オリゴヌクレオチドプローブと連結せしめ、標的ヌクレオチド配列中のＡの存在は、Ｆ２レポーター標識を有するオリゴヌクレオチドプローブをＡｎを有する共通のオリゴヌクレオチドプローブと連結せしめる。同様に、変わり得るヌクレオチドがＡまたはＧであると、標的ヌクレオチド配列におけるＴの存在は、Ｆ３ＡＡレポーター標識（すなわち、５’ポリＡスペーサーを形成する２追加塩基にカップルしたＦ３レポーター標識）を有するオリゴヌクレオチドプローブを５’ポリＡテイルＡｎ＋４を有する共通オリゴヌクレオチドプローブと連結せしめ、標的ヌクレオチド配列中のＣの存在は、Ｆ３レポーター標識を有するオリゴヌクレオチドプローブをＡｎ＋４を有する共通のオリゴヌクレオチドプローブと連結せしめる。連結反応後に材料を変性にかけてハイブリダイズ鎖を分離する。ハイブリダイゼーション／連結反応および変性工程は１以上のサイクル（例えば１−５０サイクル）で実施されて、標的シグナルが増幅される。両Ｆ３−標識オリゴヌクレオチドの等モル連結反応は個体がその座についてヘテロ接合型であることを示し、一方、Ｆ２標識オリゴヌクレオチドの連結反応は個体が他の座についてホモ接合型であることを示す。
図４において、定量が毛管またはゲル電気泳動で実施されるとき、ポリＡｎおよびポリＡｎ＋４テイルが用いられる。異なった長さのテイルによって、対応する相違の連結反応産物配列がゲルまたは毛管における異なる位置でバンドを形成する。異なる位置でのバンドの存在は、解析されるＤＮＡにおける対応ヌクレオチド相違の同定を可能にする。連結反応産物配列が異なるレポーター標識の使用に基づいて識別できるけれども、異なるレポーター標識と異なる長さのテイルの組み合せは、より多数のヌクレオチド相違の識別を可能とする。これは多重検出プロセスに重要である。
図１−３について述べたように、ゲルまたは毛管電気泳動に代わって、アドレス可能アレイ上での検出を実施できる。かかるアドレス可能アレイの使用には、レポーター標識（すなわちテイルＡｎおよびＡｎ＋４）を含有しないＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブ上のポリＡが相違するアドレス可能アレイ特異的オリゴヌクレオチド部分で置き換えられることを要する。上記でより完全に説明したように、固体支持物は捕捉オリゴヌクレオチドのアレイと共に準備され、そのいくつかは相違するアドレス可能アレイ特異的オリゴヌクレオチド部分に相補的である。相補的捕捉オリゴヌクレオチドプローブのこれらの部分のハイブリダイゼーションは対応するヌクレオチド相違の存在を示す。
図５は、本発明のよる１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスについての模式図であり、興味ある２ＤＮＡ分子における可能性ある塩基が識別される。１次および２次ＰＣＲプロセスは、図４で述べたのと実質的に同じように実施される。左手のＤＮＡ分子と併せた蛍光レポーター標識Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ３の出現は、夫々ＤＮＡ分子におけるＡ、Ｇ、ＣおよびＴ対立遺伝子の存在を表す。図５に示すように、等量のＦ１およびＦ３レポーター標識は問題の個体がＡおよびＣ対立遺伝子についてヘテロ接合型であることを表す。図５における右手のＤＮＡ分子の分析について、同じレポーター標識が異なる対立遺伝子の存在を表すのに用いられる。しかし、識別塩基を有する各オリゴヌクレオチドプローブ上で、異なる５’ポリＡテイルが存在する。より特異的に２単位ポリＡテイル、４単位ポリＡテイル、６単位ポリＡテイルおよび８単位ポリＡテイルが、夫々ＤＮＡ分子におけるＴ、Ｃ、ＧおよびＡ対立遺伝子に対応する。図５に示すように、Ａ６およびＡ４テイルを有する等量のＦ１レポーター標識は、問題の個体がＧおよびＣ対立遺伝子についてヘテロ接合型であることを表す。
図６は、図５は、本発明のよる１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスについての模式図であり、興味ある２ＤＮＡ分子における２近接部位で可能性ある塩基が識別される。１次および２次ＰＣＲプロセスは、図４で述べたのと実質的に同じように実施される。ここではＬＤＲプローブは重複可能であり、接合部で完全な相補性が存在すると連結がなお可能である。これがＬＤＲを他の方法と区別することであって、対立遺伝子特異的ＰＣＲなどでは、重複プライマーが互いに妨害し合う。図６において、識別オリゴヌクレオチドプローブは、そのプローブの３末に識別塩基を有するレポーター標識を含有する。ポリＡテイルは共通オリゴヌクレオチドプローブの３’末上にある。左手のＤＮＡ分子において、レポーター標識Ｆ１およびＦ３を有する連結反応産物配列の等量の存在は、問題の個体が第１位置でＡおよびＣ対立遺伝子についてヘテロ接合であることを示す。同様に、左手のＤＮＡ分子の第２位置において、レポーター標識Ｆ２、Ｆ３およびＦ４を有する連結反応産物配列の存在は、問題の個体がＧ、ＣおよびＴ対立遺伝子についてヘテロ接合であることを示す。
右手のＤＮＡ分子にもどって、Ａ６およびＡ４テイルを持つレポーター標識Ｆ１を有する連結反応産物配列の等量の存在は、問題の個体が第１位置でＧおよびＣ対立遺伝子についてヘテロ接合であることを示す。右手のＤＮＡ分子の第２位置において、Ａ８およびＡ２テイルを持つレポーター標識Ｆ１を有する連結反応産物配列の等量の存在は、問題の個体がＡおよびＴ対立遺伝子についてヘテロ接合であることを示す。
図７は、正常配列の過剰存在で低存在量の変異を検出するための本発明の１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す模式図である。左手のＤＮＡ分子はＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２、配列ＧＧＴでグリシン（“Ｇly”）をコードする。小さい比率の細胞がＧＡＴにおけるＧからＡへの変異を含有し、アスパラギン酸（“Ａsp”）をコードする。野生型（すなわち正常）配列についてのＬＤＲプローブが反応から抜けている。正常ＬＤＲプローブ（Ｇである識別塩基と共）が挿入されると、このプローブは共通プローブに連結し、変異標的由来のいかなるシグナルにも打ち勝つ。代わりに、図７に示されるように、蛍光標識Ｆ１およびＡｎ＋２テイルを有する連結反応産物配列の存在は変異をコードするアスパルギン酸の存在を表している。右手のＤＮＡ分子において、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン６１配列ＣＡＧがあり、グルタミン（“Ｇln”）をコードする。小さい比率の細胞がＧＡＧにおけるＣからＧへの変異を含有し、グルタミン酸（“Ｇlu”）をコードする。さらに、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブが野生型に見られるＣおよびＡ塩基を含まず、変異シグナルに打ち勝つことはない。このＤＮＡ分子について、蛍光標識Ｆ２Ａｎ＋４テイルを有する連結反応産物配列の存在は変異をコードするグルタミン酸の存在を表す。
ＩＩ．ＬＤＲ／ＰＣＲプロセス
本発明の第２態様は、複数の標的ヌクレオチド配列における１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失および転座によって相違している１以上の複数配列を同定する方法に関する。この方法はリガーゼ検出反応相に続いてポリメラーゼ連鎖反応相を有する。この方法は、複数の配列相違を有する１以上の標的ヌクレオチド配列を含有する可能性のあるサンプルを準備することを含む。
リガーゼ検出反応相において１以上のオリゴヌクレオチドプローブが準備される。各セットは、標的特異的部分と５’上流プライマー特異的部分を保持する第１オリゴヌクレオチドプローブ、および標的特異的部分と３’下流プライマー特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプローブを有する。特定セットにおける折後ヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適している。しかし、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするときに、この連結反応を妨害するミスマッチがある。サンプル、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物とする。
リガーゼ検出反応混合物は１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけられる。これらのサイクルには変性処理とハイブリダイゼーション処理が含まれる。変性処理において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離される。ハイブリダイゼーション処理によって、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在しておればその夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ハイブリダイズされると、オリゴヌクレオチドプローブセットは互いに連結して、連結反応産物配列を形成する。この産物は、５’上流プライマー特異的部分、一緒に結合した標的特異的部分および３’下流プライマー特異的部分を含む。各セットの連結反応産物配列は連結検出反応混合物中のたの核酸と識別可能である。オリゴヌクレオチドプローブセットはその夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、１以上のミスマッチの存在によって連結せず、そして、次の変性処理の際に個々に分離している。
ポリメラーゼ連鎖反応において、１または複数のオリゴヌクレオチドプローブが準備される。各セットは、連結反応産物配列の５’上流プライマー特異的部分に同じ配列を含有する上流プライマー、および連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを有している。うち、１つのプライマーは検出可能レポーター標識を有する。リガーゼ検出反応混合物を１または複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびポリメラーゼと混合すると、ポリメラーゼ連鎖反応混合物が形成する。
ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。変性処理においてハイブリダイズ核酸配列が分離される。ハイブリダイゼーション処理によって、プライマーが連結反応産物配列の相補的プライマー特異的部分とハイブリダイズする。伸長処理において、ハイブリダイズプライマーが伸長されて、プライマーがハイブリダイズしている配列に相補的な伸長産物を形成する。ポリメラーゼ連鎖反応相の第１サイクルにおいて、下流プライマーが連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長されて連結反応産物配列に相補的な伸長産物を形成する。次のサイクルにおいて、上流プライマーが連結反応産物に相補的な伸長産物の５’上流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、下流プライマーが連結反応産物配列の３’下流部分にハイブリダイズする。
このプロセスのポリメラーゼ連鎖反応相に続いて、レポーター標識が検出され、伸長産物が識別されて、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在が表される。
図８は、制限エンドヌクレアーゼ消化の有無および毛管電気泳動検出を用いた本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。第１工程において、ＤＮＡサンプルは、Ｔａｑリガーゼ、および標的特異的部分およびプライマー特異的部分を含有するオリゴヌクレオチドプローブと混合する。混合物はＬＤＲプロセスにかけられて、連結標的特異的部分およびプライマー特異的部分を含有する連結反応産物配列を産生する。第２工程で、連結反応産物配列をポリメラーゼおよびプライマーと混合し、この混合物をＰＣＲプロセスにかける。次の工程で連結反応産物配列が同じかまたは相違するサイズであるかの機能について測定する。連結反応産物配列が相違するサイズであると、第３ａ工程が選ばれてＰＣＲからの伸長細胞が毛管電気泳動またはゲル電気泳動にかけられる。いずれも続いて蛍光定量がなされる。連結反応産物配列が同じサイズのときは第３ｂ工程が用いられ、ＰＣＲ相からの伸長産物は制限エンドヌクレアーゼ消化にかけられる。毛管電気泳動またはゲル電気泳動にかけられるユニーク・サイズの消化フラグメントが産生され、第４ｂ工程による蛍光定量が行われる。第３ａ工程が選択されたときは、電気泳動の結果のカーブは、１０４、１０７および１１０に移行する３種の連結反応産物配列があり、ピーク域はそれぞれＨｅｒ２遺伝子増幅、ｐ５３遺伝子のヘテロ接合の喪失およびコントロールＳＯＤ遺伝子を表す。第３ｂおよび４ｂ工程による電気泳動曲線は、３種の連結反応産物配列制限フラグメントを５８、７０および７６に有し、ピーク域はそれぞれＨｅｒ２遺伝子増幅、ｐ５３遺伝子のヘテロ接合の喪失およびコントロールＳＯＤ遺伝子を表す。
図８の別法として、図９は本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表し、第３工程で伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドアドレスのアレイ上に捕捉される。捕捉オリゴヌクレオチドプローブは連結反応接合部を通じてヌクレオチド配列に相補的であり得る。捕捉オリゴヌクレオチドのアレイ上に捕捉された遺伝子コピー数は既知のコントロールと比較して蛍光定量で測定される。図８において、アレイのこのような分析は遺伝子特異的アドレスにハイブリダイズしている連結反応産物配列を表し、蛍光の強度がＨｅｒ−２遺伝子増幅、ｐ５３遺伝子へテロ接合の喪失およびコントロールＳＯＤ遺伝子をそれぞれ示す。
図１０は、遺伝子増幅および欠失の多重検出のためのＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す模式図である。染色体１７ｑ由来のＨｅｒ−２／ｎｅｕ、染色体１７ｐ由来のｐ５３遺伝子および染色体２１ｑ由来のＳＯＤ遺伝子の比率が検出される。９４℃でのＤＮＡの変性に続いて、標的特異的部分とプライマー特異的部分とを有するオリゴヌクレオチドプローブの対が標的核酸上で互いに隣接してアニールし、互いに連結する（ミスマッチの不存在で）。このリガーゼ検出反応はＴｔｈリガーゼでもってハイブリダイゼーション／連結反応温度６５℃で実施され、この温度はオリゴヌクレオチドプローブについてのＴｍ値７５℃より十分低い。次いで、連結反応産物配列は、Ｔａｑポリメラーゼとプライマー特異的部分に相補的な２つの共通プライマー（うち１つは蛍光標識されている）とを用いるＰＣＲによって増幅される。サンプル中に最初に存在していた標的配列の比率は保持される。伸長産物は、サンプル中に存在の各標的配列についてのユニーク・サイズ蛍光標識フラグメントを放出するＨａｅＩＩＩおよびＨｉｎｐ １Ｉで消化される。消化産物を分離し、３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif.）で分析する。ピークの高さおよび面積は最初の標的サンプルに存在する遺伝子の相対コピーに関する。
図１１は、対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスにおいて生じ得る問題を表す模式図である。ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスは非常に強力であるが、本発明の多重対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスが好ましくなる状況が存在する。ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブの１以上のセットを用い、各セットは、（ａ）標的特異的部分と５’上流プライマー特異的部分とを有する第１オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）標的特異的部分と３’下流プライマー特異的部分とを有する第２オリゴヌクレオチドプライマーを特徴とする。図１１の第１工程に示すように、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブは標的配列上で互いに隣接してアニールする。熱安定性リガーゼを用いるＬＤＲ反応（黒点）は、連結反応接合部に完全な相補性があれば、連結反応産物配列を形成する。第２工程において、連結反応産物配列はプライマーセットでＰＣＲ増幅される。この各セットは、（ａ）連結反応産物配列の５’上流プライマー特異的部分と同じ配列を含有する上流プライマー、および（ｂ）この連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを特徴とする。プライマーは第２工程に黒線として示される。１つのプライマーが蛍光標識されていると、様々な検出方法において検出され得る蛍光細胞を産生する。特異的であるべきＬＤＲ／ＰＣＲプロセスについて、ＰＣＲ伸長産物は連結反応の不存在では形成されるべきでない。不都合にも、ポリメラーゼが第１ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブ（正常標的から離れて）を伸長して、標的配列の長さと５’末のプライマー特異的部分を含有する産物を形成する可能性がある。一方、ポリメラーゼは、下流プライマーを用いる下流ＬＤＲプローブのいくつかの相補的コピーをつくり得る。第２増幅サイクルにおいて、この下流ＬＤＲプローブ伸長産物は標的配列から離れた上流ＬＤＲプローブ伸長産物にアニールし、２つのプライマー特異的配列で両側から挟まれた標的領域を含有する配列を生み出す。この産物はＬＤＲ産物として増幅され、偽の正シグナルをもたらす。
図１２は、中間エクソヌクレアーゼ消化工程を用いて対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲ問題の解決を表す模式図である。対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲは、バックグランド連結反応独立（正しくない）標的増幅を顕著に低下して、達成することができる。そのために、連結反応産物配列の情報内容を除去しないで、連結反応独立ＰＣＲ増幅に要する１以上の成分をなくすことが必要である。１つの解決法は、第２工程においてエクソヌクレアーゼを用い、第１工程からの未反応ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブを消化することである。連結していない末端、例えば下流オリゴヌクレオチドプローブの３’末をブロックすることにより、１つのプローブが実質的に消化に対し抵抗性となり、他は感受性となる。全長連結反応産物配列の存在のみが上流プライマーの消化を防止する。ブロック群には、骨格としてチオホスフェート類および／または２.０−メチルリボース糖類がある。エクソヌクレアーゼにはＥxoI(３'−５')、ＥxoＩＩＩ(３'−５')およびＥxoIV(５'−３'と３'−５'の両方)があり、後者は両側のブロックを必要とする。両プローブをブロックする便利な方法は、１つの長い“パドロック（padlock）”プローブ（参照、M. Nilsson et. al.,“Padlock Probes : Circularizing Oligonucleotides for Localized DNA Detection,”Science 265:2085-88(1994)（出典明示により本明細書の一部とする））を用いることであるが、必ずしも必要としない。エクソヌクレアーゼを用いる利点は、例えばＥxoI（単鎖特異的）とＥxoＩＩＩ（二重鎖特異的）との併用は、両標的および１つのプローブを破壊し得ることであり、連結反応産物配列は実質的に未消化で止まっていることである。ＰＣＲに先立つエクソヌクレアーゼ処理により、第３および４工程において、各セットの１つまたは両オリゴヌクレオチドプローブは実質的に減少し、残存のオリゴヌクレオチドプローブと元の標的ＤＮＡ（これもエクソヌクレオチド処理により実質的に減少）とのハイブリダイゼーション、およびオリゴヌクレオチドプローブセットによるＰＣＲ増幅のための適当な基質である連結反応産物配列の形成が実質的に低下させられる。換言すれば連結反応独立標識伸長産物の形成は実質的に減少し、またはなくなる。
図１３は、サイズまたはＤＮＡアレイのいずれかによる検出でエクソヌクレアーゼ消化を用いる対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。この流れ図は、多重対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスに要する３反応を示す。第１工程において、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブ（下流プローブがその３’末でブロックされている）が、ＴａｑＤＮＡリガーゼを用いて、正しい対立遺伝子標的の存在で連結される。第２工程で、未反応の上流プローブはエクソヌクレアーゼで消化され、同時に標的も消化される。最後に第３工程で、プライマーセットが用いられて、連結反応産物配列のプライマー特異的部分にハイブリダイズすることにより連結反応産物配列を増幅する。第４ａ工程において、与えられた特定のセットのＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブがユニーク長産物を産生し、オリゴヌクレオチドプローブまたは他の連結反応産物と識別される。ＬＤＲ反応の後に産物は産物はサイズまたは電気泳動運動性により分別される。ＰＣＲプライマー上の標識が検出され、サイズで産物が識別される。第４ｂ工程において、特定セットのＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブが、ＰＣＲプライマー配列での相違によってオリゴヌクレオチドプローブまたは他の連結反応産物配列と識別される。複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを使用することによりすべての産物が識別される。各セットは、（ａ）連結反応産物配列の５’上流プライマー特異的部分に同じ配列を含有する上流プライマーおよび（ｂ）連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを特徴とし、１つのプライマーは検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーはその５’末に連結したアドレス可能ヌクレオチド配列（アドレス可能ヌクレオチド配列がＰＣＲ反応後単鎖を残すように）を含有する。後者は、ポリメラーゼが伸長し得ないＰＣＲプライマー内の非天然塩基を用いて達成され、単鎖テイルを有するＰＣＲ産物を産生する。参照、Newton, et. al., “The Production of PCR Products with 5' Single-stranded Tails Using Primers that Incorporate Novel PhosphoramiditeI ntermediates”Nucl. Acids Res. 21(3):1155-62(1993)（出典明示により本明細書の一部とする）。相違する特定の部位に固定された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有するＤＮＡアレイを準備して（捕捉オリゴヌクレオチドはプライマー上のアドレス可能ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する）、ＰＣＲ伸長産物がＤＮＡアレイにハイブリダイズできる。最後に、特定部位でＤＮＡアレイに固定されたアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉された伸長産物配列の標識が検出される。これはサンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を表す。
図１４は、サイズを基とする、またはＤＮＡアレイを基とする検出によるエクソヌクレアーゼ消化を用いる対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。この流れ図は、ＬＤＲ反応の開始点で（第２工程）マーカー配列を加えること（第１工程）により相違する標的量（特に低存在癌変異）をいかに定量するかを示す。生化学的反応（すなわちＰＣＲ（第４工程））に続いて、図１３に示すように、マーカー産物に対する変異産物の相対量が毛管またはゲル電気泳動（第５ａ工程）またはアドレス可能アレイ上の捕捉（第５ｂ工程）を用いて定量される。元のサンプル中の変異標的の量が決定される。
図１５は、変異または多形性の検出のためのエクソヌクレアーゼ消化（第２工程）を有する対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す模式図である。変異および多形性は図１２に記載のように識別される。本例において、第１工程で、標的特異的部分の３’末に識別対立遺伝子特異的塩基を有する上流ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブは、相違する５’上流プライマー特異的部分を有する。このように、相違するプライマー（ＰＣＲ増幅工程（すなわち第３工程における））が相違する蛍光群（ＦａｍおよびＴｅｔ）で標識されて、産物の識別が可能となる（第４工程）。アレイに基づく検出法も用いられ、上流（対立遺伝子特異的）プローブが相違する５’上流プライマー特異的部分を有し、および相違するＰＣＲプライマーがＰＣＲ反応後に単鎖を残す相違するアドレス可能ヌクレオチド配列を含有する。
図１６は、モノヌクレオチドまたはジヌクレオチド反復多形性検出のためにエクソヌクレアーゼ消化を用いる（第２工程）対立遺伝子特異的ＬＤＲ（第１工程）／ＰＣＲ（第３工程）を表す模式図である。ＬＤＲ／ＰＣＲの最も強力な使用の１つは、ヌクレオチド反復多形性の検出であって、対立遺伝子特異的ＰＣＲでは達成できず（３’ヌクレオチドが常に同じであるから）、またＰＣＲ産物サイズ変化の観察でも容易に達成できない（増幅中にＴａｑポリメラーゼが滑ることによる）ものである。図１６において、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブはＡ９とＡ１０モノヌクレオチド反復配列を熱安定性ＤＮＡリガーゼの特異性によって識別する。ＬＤＲ産物のみが正しい長さの標的配列上で形成し、そしてこの標的の存在が識別される（第４工程）。
図１７は、低存在量のモノヌクレオチドまたはジヌクレオチド反復変異の検出のためにエクソヌクレアーゼ消化（第２工程）を用いる対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す模式図である。モノヌクレオチド反復長変異は図１２に記載のように識別される。図１７において、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブ（第１工程）はＡ８、Ａ９（変異）およびＡ１０（正常）モノヌクレオチド反復配列を熱安定性ＤＮＡリガーゼの特異性によって識別する。２つの上流ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブは、その標的特異的部分の３’末でモノヌクレオチド配列の長さが異なり、相違する５’上流プライマー特異的部分を有する。このように、相違するプライマー（ＰＣＲ増幅工程（第３工程）における）は異なる蛍光群（ＦａｍおよびＴｅｔ）で標識されて、産物の識別が可能となる（第４工程）。これには、サイズに代わり蛍光標識を基にしてモノヌクレオチド反復多形性が識別できるという顕著な利点がある。サイズによる識別はポリメラーゼ滑りのために偽の正反応をもたらしやすい。アレイに基づく検出法においては、上流（対立遺伝子特異的）プローブは相違する５’上流プライマー特異的部分を有し、相違するＰＣＲプライマーはＰＣＲ反応後に単鎖を残す相違のアドレス可能ヌクレオチド配列を含有する。
図１８は、サイズを基とする、またはＤＮＡアレイを基とする検出においてウラシルＮ−グリコシラーゼ選択を用いる対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。流れ図は、多重対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲに要する４反応を示す。ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブセット（うち、１または両方のプローブがデオキシチミジンの代わりにデオキシウラシルを含有する）は、第１工程においてＴａｑＤＮＡリガーゼを用いて正しい対立遺伝子標的の存在下に連結される。連結反応産物配列の相補的コピーが第２工程においてシクエナーゼでつくられる。シクエナーゼは修飾Ｔ７ポリメラーゼであって有用な容易に不活性化されるポリメラーゼ（すなわちＥ.coliポリメラーゼなどの中温性ポリメラーゼ）を有する。連結反応産物配列および未反応プローブの両方が第３工程においてウラシルＮ−グリコシラーゼで破壊される。ウラシルＮ−グリコシラーゼを用いる利点は、ＰＣＲの持ち越し防止についてその証明された能力である。最後にＰＣＲプライマーセットが利用されて、第４工程においてシクエノーゼ伸長産物が増幅される。第５ａ工程において、特定セットのＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブがユニーク長産物を産生し、プローブまたは他の連結反応産物と識別される。ＰＣＲ反応後、産物はサイズまたは電気泳動運動性により分離される。ＰＣＲプライマー上の標識が検出され、産物はサイズにより識別される。第５ｂ工程において、特定セットのＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブがユニーク長産物を産生し、プローブまたは他の連結反応産物と識別される。複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを使用することにより、すべての産物が識別される。各セットは、（ａ）連結反応産物配列の５’上流プライマー特異的部分に同じ配列を含有する上流プライマーおよび（ｂ）連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを特徴とする。１つのプライマーは検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーはその５’末に連結したアドレス可能ヌクレオチド配列（アドレス可能ヌクレオチド配列がＰＣＲ反応後単鎖を残すように）を含有する。相違する特定の部位に固定された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有するＤＮＡアレイを準備して（捕捉オリゴヌクレオチドはプライマー上のアドレス可能ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する）、ＰＣＲ伸長産物がＤＮＡアレイにハイブリダイズできる。最後に、特定部位でＤＮＡアレイに固定されたアドレス可能アレイ特異的部分を用いて、捕捉された伸長産物配列の標識が検出される。これはサンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を表す。
図１９は、サイズを基とする、またはＤＮＡアレイを基とする検出によるウラシルＮ−グルコシラーゼ選択を用いる定量的対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。この流れ図は、第２工程のＬＤＲ相開始点で第１工程におけるマーカー配列を加えることにより相違する標的（特に低存在量の癌変異）をいかに定量するかを示す。図１８で記載したように、生化学反応（すなわちシクエナーゼ処理(第３工程）、ウラシルＮ−グリコシラーゼ選択（第４工程）およびＰＣＲ（第５工程）が進められ、マーカー産物に対する変異産物の相対量が毛管またはゲル電気泳動（第６ａ工程）あるいはアドレス可能アレイ上の捕捉（第６ｂ工程）によって定量される。この情報から元のサンプル中の変異標的量が測定される。
図２０は、モノヌクレオチドまたはジヌクレオチド反復多形性検出のためにウラシルＮ−グルコシラーゼ選択を用いる（第２工程）対立遺伝子特異的ＬＤＲ（第１工程）／ＰＣＲ（第３工程）を表す模式図である。ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスの最も強力な使用の１つは、ヌクレオチド反復多形性の検出であって、対立遺伝子特異的ＰＣＲでは達成できず（３’ヌクレオチドが常に同じであるから）、またＰＣＲ産物サイズ変化の観察でも容易に達成できない（増幅中にＴａｑポリメラーゼが滑ることによる）ものである。図２０において、ＬＤＲ（第１工程）オリゴヌクレオチドプローブはＡ９とＡ１０モノヌクレオチド反復配列を熱安定性ＤＮＡリガーゼの特異性によって識別する。ＬＤＲ産物のみが正しい長さの標的配列上で形成し、そしてこの標的の存在が第５工程で識別される。
図２１は、低存在量のモノヌクレオチドまたはジヌクレオチド反復配列の検出のためのウラシルＮ−グリコシラーゼ選択を用いる対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。モノヌクレオチド反復長変異は図１８記載のように識別される。図２１において、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブは、Ａ８、Ａ９（変異）およびＡ１０（正常）モノヌクレオチド反復配列間を熱安定性ＤＮＡリガーゼの特異性によって識別する（第１工程）。シクエナーゼ処理（第２工程）次いでウラシルＮ−グリコシラーゼ選択（第３工程）が実施される。２つの上流ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブはその標的特異的部分の３’末でモノヌクレオチド配列の長さが異なり、相違する５’上流プライマー特異的部分を有する。このように、相違するプライマー（ＰＣＲ増幅（第４工程）における）は異なる蛍光群（ＦａｍおよびＴｅｔ）により標識されて、産物の検出が可能となる。これには、サイズの代わりに蛍光標識に基づいてモノヌクレオチド反復多形性を識別し得るという顕著な利点がある。サイズに基づくと、ポリメラーゼ滑りのために偽の正反応が起きやすい。アレイに基づく検出法では、上流（対立遺伝子特異的）プローブは異なる５’上流プライマー特異的部分を有し、異なるＰＣＲプライマーがＰＣＲ反応後に単鎖を残す相違アドレス可能アレイ特異的部分を含有する。
図１１−１７に関して記載されたＬＤＲ／エクソヌクレアーゼ／ＰＣＲプロセスおよび図１８−２１のＬＤＲ／シクナーゼ／ウラシルＮ−グリコシラーゼ／ＰＣＲプロセスのセットは、多重検出の利用をもたらし、そしてＰＣＲが多くの相違する標的配列を増幅して、すべて単一の反応チューブにおいて多重単一塩基または配列変化を識別する。これはＰＣＲの感受性とＬＤＲの選択性を組み合すことにより達成される。変異配列の選択がＰＣＲよりもむしろＬＤＲで調節されるので、１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスは偽の正反応シグナル産生が起こりにくい。さらに、１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスは、密接クラスター変異の検出、単一塩基または小さい反復配列における小さい挿入および欠失の検出、正常ＤＮＡの高バックグランドにおける１％以下の変異の定量的検出、および連結反応産物配列の検出をアドレス可能アレイを用いて可能とする。小さい反復配列における小さい挿入および欠失の検出は、１次増幅がＰＣＲであるとき、“どもり”を起こすことがある。現在の技術ではこの問題を適当に解決することができない。特に、モノヌクレオチド反復多形性を含有する標的配列が正常ＤＮＡよりも低い存在量で存在するときは、解決できない。実際、反復配列活性化を含むゲノム変異の解析はＰＣＲ“どもり”問題に深刻に悩んでいる。本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを用いることにより、正常ＤＮＡの高バックグランドにおける１％を下まわる変異を検出することが可能である。このプロセスにおいて当面している唯一の比較的軽い問題は、変異を知らねばならないことおよび３種の相違する酵素／反応条件を用いなければならないことである。
ＩＩＩ．１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセス
本発明の第三の実施態様は、１以上の標的ヌクレオチド配列における１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の２以上を同定するための方法に関する。この方法は、複数の配列相違がある１以上の標的ヌクレオチド配列を含有するかも知れないサンプルを２つの連続するポリメラーゼ連鎖反応相にかけることを含む。
第１ポリメラーゼ連鎖反応相において、１以上の１次オリゴヌクレオチドプライマー群が準備される。各群は２以上の１次オリゴヌクレオチドプライマー・セットを含有する。各セットは、標的特異的部分と５’上流第２プライマー特異的部分を保持する第１オリゴヌクレオチドプライマー、および標的特異的部分と５’上流第２プライマー特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプライマーを有する。同じ群の各セットの第１オリゴヌクレオチドプライマーは同じ５’上流第２プライマー特異的部分を有し、同じ群の各セットの第２オリゴヌクレオチドプライマーは同じ５’上流第２プライマー特異的部分を有している。特定のセットのオリゴヌクレオチドプライマーは、対応する標的ヌクレオチド配列の相補鎖でのハイブリダイゼーションに適しており、ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成をもたらす。しかし、１次オリゴヌクレオチドプライマーがサンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに、該ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成を妨害するミスマッチがある。特定のセットにおけるポリメラーゼ連鎖反応産物は、同じ群または他の群を有する他のポリメラーゼ連鎖反応産物と識別され得る。１次オリゴヌクレオチドプライマーをサンプルおよびポリメラーゼと混合して、第１ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。
１次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、１次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異部分が標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。伸長処理によってハイブリダイズ１次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、１次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列に相補的な１次伸長産物を形成する。
１次オリゴヌクレオチドプライマーの上流２次プライマー特異的部分は標的ＤＮＡに存在しないが、その配列は１次ポリメラーゼ連鎖反応相の第２以後のサイクルで複写される。結果として、第２サイクル後の１次伸長産物は、その５’末端に２次プライマー特異的部分、そしてその３’末端にプライマー特異的部分の補体を有する。
本発明のこの実施態様での第２ポリメラーゼ連鎖反応相において１つまたは複数の２次オリゴヌクレオチドプライマーセットが準備される。各セットは、検出可能レポーター標識を保持し、かつ第１の１次オリゴヌクレオチドプライマーの５’上流部分と同じ配列を含有する第１の２次プライマー、および第１の２次プライマーに相補的な第１の１次オリゴヌクレオチドと同じ１次オリゴヌクレオチドプライマーセットに由来する第２の１次オリゴヌクレオチドプライマーの５’上流部分と同じ配列を含有する第２の２次プライマーを有する。２次オリゴヌクレオチドプライマーのセットは、各群において１次伸長産物を増幅する。２次オリゴヌクレオチドプライマーを１次伸長産物およびポリメラーゼと混合して、２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。
２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、２次オリゴヌクレオチドプライマーが１次伸長産物にハイブリダイズする。伸長処理によって、ハイブリダイズした２次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、１次伸長産物に相補的な２次伸長産物を形成する。２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を２以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに掛けた後に、標識２次伸長産物が検出される。これはサンプル中おける１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を表す。
図２２は、ミクロサテライト反復体の検出のための本発明による１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。第１工程において（すなわち１次ＰＣＲ相）、ＤＮＡサンプル作成後、Ｔａｑポリメラーゼをホットスタート条件で用いて、標的特異的部分と２次プライマー特異的部分とを有するオリゴヌクレオチドプライマーと共に多重エクソンを増幅する。第２工程は２次ＰＣＲでありＴａｑポリメラーゼを用いて、１次ＰＣＲプライマーの２次プライマー特異的部分と同じ配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーと共に１次ＰＣＲ伸長産物を増幅する。２次ＰＣＲ相で得た伸長産物を第３工程において毛管電気泳動またはゲル電気泳動にかけ、次いで蛍光定量を行う。図の電気泳動の結果は、ＲＢＩおよびＮＭ２３を含有する両対立遺伝子（すなわち染色体）およびｐ５３についてのヘテロ接合の喪失（すなわち、１つの染色体上の対立遺伝子の喪失の存在を示す。）
図２３は、ミクロサテライト反復体における挿入および欠失によるヘテロ接合性の喪失を検出するために、本発明による１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセスを表す模式図である。第１工程の１次ＰＣＲ相は、９４℃でのサンプルＤＮＡの変性から始められる。ユニークＤＮＡ周ミクロサテライト反復変異に相補的な３’末および２次ＰＣＲ相で使用される２プライマーの１つに同じ配列を含有する５’末を有する長いＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、６５℃で標的ＤＮＡにアニールする。１次ＰＣＲ相を１０−１５サイクル実施する。１次ＰＣＲ相で使用された長いプライマーは、重複長の範囲を有する対立遺伝子を増幅しない限り、多重化され得る。これらの反応は腫瘍または対応正常ＤＮＡ上で実施されて、情報的（すなわち、ヘテロ接合）部座が同定されねばならない。第２工程（すなわち２次ＰＣＲ増幅）において、１次ＰＣＲプライマー（１つは蛍光標識されている）の５’末に相補的なプライマーが用いられて、ほぼ等しい効率で１次ＰＣＲ伸長産物を増幅する。２次ＰＣＲ伸長産物は分離され、ゲル電気泳動およびジーンスキャン６７２ソフトウェア−パッケージを用いた３７３Ａ ＤＮＡ（Applied Biosystems, Inc.）で解析される。情報部位でのヘテロ接合の喪失領域が同定される。図２３の解析は、ＲＢＩおよびＮＭ２３を含有する両対立遺伝子（すなわち、染色体）およびｐ５３についてのヘテロ接合の喪失（すなわち、１つの染色体上の対立遺伝子の喪失）を示す。
IV．一般的プロセス情報
リガーゼ検出反応は、Barany et al.によるWO90/17239、 F. Barany et al., “Cloning, Overexpression and Nucleotide Sequence of a Thermostable DNA Ligase-encoding Gene,” Gene, 109:1-11(1991),および F.Barany, “Genetic Disease Detection and DNA Amplification Using Cloned Thermostable Ligase,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193(1991)（出典明示により本明細書の一部とする）に一般的に記載されている。本発明において、リガーゼ検出反応で2セットの相補的オリゴヌクレオチドが用いられる。これはリガーゼ鎖反応として知られるもので上記３引用に記載されている。他方、リガーゼ検出反応には、オリゴヌクレオチド連結反応検出法として知られる単一サイクル法もある。参照、Landegren, et al., “A Ligase-Mediated Gene Detection Technique,” Science 241:1077-80(1988); Landegren, et al., “DNA Diagnostics -- Molecular Techniques and Automation,” Science 242:229-37(1988); およびLandegren et al. による米国特許第4,988,617号（出典明示により本発明の一部とする）。
リガーゼ検出反応相において、変性処理は温度８０−１０５℃でなされ、ハイブリダイゼーションは５０−８０℃で行われる。各サイクルは変性処理と熱ハイブリダイゼーションを含み、合計で約１−５分間の長さである。典型的には、連結検出反応は変性およびハイブリダイゼーションが２−５０サイクル反復される。リガーゼ検出反応相の全時間は１−２５０分である。
オリゴヌクレオチドプローブセットまたはプライマーは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシヌクレオチド、修飾ホスフェート−糖−骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよびこれらの混合物であり得る。
一つの変法において、オリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチド各々、ハイブリダイゼーションすなわち溶融温度（すなわち、Ｔｍ）６６−７０℃を有する。これらのオリゴヌクレオチドは長さが２０−２８ヌクレオチドである。
上記したように、オリゴヌクレオチドプローブセットまたはプライマーは検出に適したレポーター標識を有する。有用な標識には、発色団、蛍光分子、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、燐光性基、放射活性物質、化学ルミネセント分子および電気化学的検出分子がある。
ポリメラーゼ連鎖反応法はH. Erlich, et. al., “Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction,” Science 252:1643-50(1991); M. Innis, et. al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: New York(1990); およびR. Saiki, et. al., “Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase,” Science 239:487-91（出典明示により本明細書の一部とする）に完全に記載されている。
本発明の特に重要な態様は、サンプル中の標的ヌクレオチド配列を定量できる能力である。これは、内部（すなわち、標準確立物質をサンプルと共に増幅および検出するとき）または外部（すなわち、標準確立物質を増幅せずに、サンプルと共に検出するとき）的であり得る基準を確立して、多くの方法で達成される。
一つの定量法に従い、レポーター標識により発生したシグナルを検出する。このシグナルは、分析するサンプルから製造された連結反応産物を捕捉して得られる。このシグナルの強度は、サンプル中の連結反応産物配列の捕捉で生じるシグナルを既知量の標的ヌクレオチド配列とを比較して目盛曲線から得られる。結果として、分析サンプル中の標的ヌクレオチド配列の量が測定できる。この技法は外部標準を用いる。
本発明に関する別の定量法は内部標準を用いるものである。この方法では、サンプルに１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を加える。さらに、複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを加えて、リガーゼ、前記のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびサンプルと共に混合物とする。マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットは、（１）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブ、および（２）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドプローブおよび検出可能レポーター標識を含有する。特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列が互いに隣接してハイブリダイズするときに、連結反応するのに適している。しかし、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列または添加したマーカー配列がハイブリダイズするときに、このような連結反応を妨害するミスマッチがある。連結反応産物配列の存在は、レポーター標識の検出によって同定される。サンプル中の標的ヌクレオチド配列の量は、マーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から生じた連結反応産物配列の量と他の連結反応産物配列の量を比較することにより測定される。
本発明の別の定量法は、複数の配列相違を有する２以上の複数の標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルの分析である。標的ヌクレオチド配列に対応する連結反応産物配列は、前記の方法により検出および識別される。サンプル中の標的ヌクレオチド配列の相対量は、発生した捕捉連結反応産物配列の相対量と比較することにより定量される。これはサンプル中の標的ヌクレオチド配列の相対レベルの定量測定を提供する。
好ましい熱安定性リガーゼはThermus aquaticusから誘導される。この酵素は生体から単離される。M. Takahashi, et al., “Thermophillic DNA Ligase,” J. Biol. Chem. 259:10041-47(1984)（出典明示により本明細書の一部とする）。他方、これは組換え法でもつくられる。この単離方法およびThermus aquaticusリガーゼ（Thermus themopilusリガーゼも同様）の産生は、Barany, et al.によるWO90/17239およびF.Barany, et al., “Cloning Overexpression and Nucleotide Sequence of a Thermostable DNA-Ligase Encoding Gene” Gene 109:1-11(1991)（出典明示により本明細書の一部とする）に開示されている。
これらの引用には、このリガーゼおよびコードＤＮＡについての完全な配列情報が含まれている。他の適当なリガーゼにはE.coliリガーゼ、Ｔ４リガーゼおよびPycoccusリガーゼがある。
連結検出反応混合物は担体ＤＮＡやサケ精子ＤＮＡを含み得る。
連結検出反応でのハイブリダイゼーション段階は、好ましくは熱ハイブリダイゼーション処理であり、連結反応の接合部において識別されるヌクレオチドを基にしたヌクレオチド配列の間を識別する。標的ヌクレオチド配列間の相違は、例えば、単一核酸塩基の相違、核酸欠失、核酸挿入または再配置である。１以上の塩基を含むこのような配列相違もまた検出できる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブセットは、実質的に同じハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、実質的に同じ長さである。結果として、本発明のプロセスは、感染性疾患、遺伝的疾患および癌の検出を可能とする。環境監視、法医学および食物科学においても有用である。
広範囲の感染性疾患が本発明プロセスで検出できる。典型的には、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌感染作用因子によって起きる。種々の感染作用因子の薬剤に対する耐性も本発明を用いて測定できる。
本発明により検出できる細菌感染作用因子は、大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、クレブシエラ、シュードモナス、リステリア・モノサイトゲネス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラレ、エルシニア、フランシセラ、パスツレラ、ブルセラ、クロストリディア、ボルデテラ・ペルツシス、バクテリア状物、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・ニューモニア、Ｂ−溶血性連鎖球菌、コリネバクテリア・レジオネラ、ミコプラズマ、ウレアプラズマ、クラミジア、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティデス、ヘモフィラス・インフルエンザ、エンテロコッカス・ファエカリス、プロテウス・ブルガリス、プロテウス・ミラビリス、ヘリコバクター・ピロリ、トレポネマ・パラジウム、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・レクレンティス、リケッチア病原菌、ノカルディアおよびアクチノマイセテスを含む。
本発明で検出できる真菌感染作用因子は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ブラストミセス・デルマティティディス、ヒストプラスマ・カプスラタム、コシディオイデス・イミティス、パラコシシオイデス・ブラシリエンシス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガウトゥス、フィマイセテス(リゾプス)、スポロスリックス・シェンキー、クロモマイコシスおよびマドゥロマイコシスを含む。
本発明により検出できるウイルス感染作用因子は、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球好性ウイルス、肝炎ウイルス(例えば、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス)、エプスタイン−バールウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブニャウイルス、アレナウイルス、ルベラウイルスおよびレオウイルスを含む。
本発明により検出できる寄生虫作用因子は、プラスモジウム・ファルシパルム、プラスモジウム・マラリア、プラスモジウム・ビバックス、プラスモジウム・オバレ、オンコベルバ・ボルブルス、レイシュマニア、トリパノソーマ種、シストソーマ種、エンタモエバ・ヒストリティカ、クリプトスポリジウム、ギアルディア種、トリコモナス種、バラチジウム・コリ、ウシェレリア・バンクロフティ、トキソプラスマ種、エンテロビウス・バーミクラリス、アスカリス・ルンブリコイデス、トリシュリス・トリシウラ、ドラクンクルス・メディネシス、吸虫類、ジフィロボスリウム・ラトゥム、タエニア種、ニューモシスティス・カリニおよびネカター・アメリカニスを含む。
本発明はまた感染作用因子による医薬耐性の検出にも有用である。例えば、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・ファエシウム、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス、ペニシリン耐性ストレプトコッカス・ニューモニアエ、多剤耐性マイコバクテリウム・ツベルクローシスおよびＡＺＴ耐性ヒト免疫不全ウイルスを本発明によりまた同定できる。
遺伝的疾患もまた本発明の方法により検出できる。これは染色体および遺伝的異常のための出生前スクリーニングまたは遺伝的疾患のための出生後スクリーニングにより行い得る。検出可能な遺伝的疾患の例は：２１ヒドロキシラーゼ欠損症、嚢胞線維症、フラジレＸ症候群、ターナー症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ダウン症候群または他のトリソミー、心臓疾患、単一遺伝子疾患、ＨＬＡタイピング、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球性貧血、テイ・サックス病、サラセミア、クラインフェルター症候群、ハンチントン病、自己免疫疾患、リピドーシス、肥満欠損、血友病、代謝の先天性異常および糖尿病を含む。
本発明の方法により検出できる癌は、一般的にオンコジーン、腫瘍抑制遺伝子またはＤＮＡ増幅、複製、組換えまたは修復に関与する遺伝子を含む、これらの例は：ＢＲＣＡ１遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、Her2/Neu増幅、Bcr/Abl、Ｋ−ｒａｓ遺伝子、ヒト乳頭腫ウイルスタイプ１６および１８を含む。下記の一般的なヒト癌における上記遺伝子の増幅、大きい欠失、点変異および小さい欠失／挿入を同定するために、本発明の様々な態様が用いられる。白血病、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、膀胱癌、黒色腫、肝臓癌、骨肉腫および他の骨癌、精巣および卵巣癌、頭部・頚部腫瘍および脳新生物を含む。
環境監視の領域で、本発明は、天然および工学的生態系ならびに都市廃棄水浄化システムおよび貯水槽中または生物改善を行っている汚染領域のような微小生態系における病原性および常在性微生物の検出、同定および追跡に使用できる。新陳代謝生体異物であり得る遺伝子を含むプラスミドの検出もまた可能であり、集団機能的研究における特異的標的微生物の追跡、または環境的および工学的植物における遺伝的に修飾された微生物の検出、同定または追跡をする。
本発明は、また、軍務上の人的あるいは犯罪上の検査、父親検定および家族関係解析のためのヒト同定、ＨＬＡ適合性タイプ分類、および汚染に関する血液、精液または移植臓器のスクリーニングを含む種々の領域または法医学領域で使用できる。
食物および飼料産業において、本発明は広範囲の適用を有する。例えば、ビール、ワイン、チーズ、ヨーグルト、パン等の製造のための酵母のような製造生物の同定および特徴付けのために使用できる。使用の他の領域は汚染に対する産物および処理(例えば、家畜、滅菌および肉処理)の品質コントロールおよび保証に関する。他の使用は、育種目的の植物、球根および種子の特徴付け、植物特異的病原体の同定および種々の家畜感染の検出および同定を含む。
望ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、連結反応の接合部における完全相補性のため、対応する標的ヌクレオチド配列と互いに隣接してハイブリダイズするとき、連結反応の接合部で互いに連結するのに適している。しかしながら、セット中のオリゴヌクレオチドプローブがサンプル内に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするとき、連結を妨害する連結反応の接合部の塩基ミスマッチがある。最も好ましくは、ミスマッチは連結反応の接合部の３'塩基に隣接した塩基である。あるいは、ミスマッチは連結反応の接合部に隣接した塩基であり得る。
上述のように、検出および定量は、毛管またはゲル電気泳動あるいはアレイ捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物で実施され得る。
この目的のための毛管またはゲル電気泳動の使用は既知である。参照、例えば、Grossman, et al., “High-density Multiplex Detection of Nucleic Acid Sequences:Oligonucleotide Ligation Assay and Sequence-coded separation,” Nucl. Acids Res. 22(21): 4527-34(1994)（出典明示により本明細書の一部とする）。
捕捉オリゴヌクレオチドアレイを有する固体支持物の使用は、米国特許出願第60/011,359（出典明示により本明細書の一部とする）に完全に開示されている。このようなアレイを使用するときには、上記のＰＣＲ相およびＬＤＲ相において用いられるオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブはアドレス可能アレイ特異的部分を有する。ＬＤＲ相またはＰＣＲ相が完了した後、その産物についてのアドレス可能アレイ特異的部分は、単鎖を残し、捕捉相の際に捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。C. Newton, et al.,“The Production of PCR Products With 5' Single-Stranded Tails Using Primers That Incorporate Novel Phosphoramidite Intermediates,” Nucl. Acids Res. 21(5):1155-62(1993)（出典明示により本明細書の一部とする）。
本方法の捕捉相において、混合物は固体支持物と温度４５−９０℃および６０分間までの時間で接触する。ハイブリダイゼーションはカチオン、量排除またはカオトロピック剤を加えることにより促進される。アレイが何１０から１００アドレスよりなるとき、正しい連結反応産物配列が適切なアドレスにハイブリダイズする機会を持つことが重要である。これは、用いた高温でのオリゴヌクレオチドの熱運動、アレイ表面に接触する液体の機械的運動または電場でのアレイを通るオリゴヌクレオチドの運動により達成される。ハイブリダイゼーション後、アレイを低ストリジェンシー緩衝液および高ストリジェンシー緩衝液で順次洗う。
安定な状態でハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドおよびアドレス可能ヌクレオチド配列を選択することが重要である。それには、捕捉オリゴヌクレオチドがアドレス可能アレイ特異的部分にハイブリダイズする温度よりも低い温度で、オリゴヌクレオチドセットが標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、オリゴヌクレオチドセットと捕捉オリゴヌクレオチドが立体配座することが必要である。このようにオリゴヌクレオチドが設計されていないと、標的にハイブリダイズする同じオリゴヌクレオチドセットからの隣接未反応オリゴヌクレオチドの捕捉によって、偽の正シグナルが起きる。
捕捉オリゴヌクレオチドには、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシヌクレオチド、ペプチドヌクレオチドアナログ、修飾ペプチドヌクレオチドアナログ、修飾ホスフェート−糖−骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよびこれらの混合物がある。
アレイを使用するとき、本方法の検出相は、ＬＤＲまたはＰＣＲ産物が生じているかを走査および同定し、かかる産物の存在を試験サンプル中の標的ヌクレオチド配列の存在・不存在と相関せしめることを含む。走査は、走査電子顕微鏡、共焦顕微鏡、電子結合装置、走査透過電子顕微鏡、赤外線顕微鏡、原子力顕微鏡、電気的コンダクタンスおよび蛍光および燐光造影により行うことができる。相関処理はコンピューターで行う。
LDR/PCRプロセス
実施例１―ゲノムDNAの調製
ゲノムDNAを男女２人の健常者ボランティアの血液から標準技術に従って調製した。簡単に説明すると、EDTAを含有する集血管で約12mlの血液を採取した。そのサンプル血を４容量の溶解緩衝液(10mＭ Tris pＨ8.0、10mＭ EDTA)に混合して赤血球を溶解した。10分間氷上でときどき攪拌した後、懸濁物を遠心分離し上澄み液をデカントした。白血球ペレットを20mlの溶解緩衝液に再懸濁させ、上記のプロセスを繰り返した。その後、各ペレットを15mlの消化緩衝液(50 mM Tris pH 8.0、5 mM EDTA、100 mM NaCl、1% SDS)に懸濁し、それに３mg(0.2 mg/ml)のプロテイナーゼKを加えた。細胞を37℃で5時間消化した。消化産物を等量のフェノールで２度抽出し、それから等量の１：１フェノール：クロロホルム混合液で１度抽出し、最後に等量のクロロホルムで抽出した。抽出をするごとに混合液を遠心分離し、次の抽出に使用するために水相を除去した。最後の抽出の後に、水相を除去してから1/10量の３Ｍ酢酸ナトリウム、pH 6.5を加えた。次いで2倍量の氷温100% EtOHをそれぞれの溶液に加えてゲノムDNAを沈澱させ、溶液からガラスピペットにスプールした。そのDNA沈澱物を0.75ml量の70% EtOH中で２度洗った。つまり、２度とも手短かに遠心分離して上澄み液を除去できるようにした。２度目に上澄み液を除去した後、残存するEtOHを蒸発させてDNAを0.5mlのTE(10mM Tri-HCl pH 8.0、1mＭ EDT含有）溶液中に懸濁した。各DNA溶液の１／5希釈物もまたTE中で調製した。
第５DNA溶液の濃度を測定するために、それぞれの溶液の1μl、2μl、4μlアリコートを1%アガロース・ゲル上に対照としての既知の量のHindＩＩＩ消化lambdaDNAと共に装填した。そのゲルを１５０ボルトで２時間電気泳動緩衝液中の臭化エチジウムで試運転した。ゲルを写真撮影した後に、DNAバンドの明暗度を比較して、１/5希釈物が約100ng/mlの濃度を示すのを判定した。さまざまな腫瘍細胞ラインから抽出したDNA溶液は、他の研究所の好意で入手したものである。それらの溶液の濃度を同様の手法でチェックし、100ng/mlのTE溶液を調製した。
ゲノムDNAをTagIで消化するために、25μlの100ng/μl溶液を5μlの10X中程度塩緩衝液(0.5M NaCl、0.1M MgCl Tris、pH 8.0)、20μlの水性ME(すなわち、6mM ME(すなわち、メルカプトエタノール)を含む水)、および400UのTagI制限エンドヌクレアーゼと混合した。消化物を鉱油で覆い、65℃で１時間インキュベートした。1.2μlの500mM EDTAを加え、標本を85℃で10分間加熱して、反応を停止した。DNAの完全な消化を１％アガロース・ゲル上の電気泳動アリコートでチェックした。
実施例２−ＬＤＲプローブおよびＰＣＲプライマーのためのオリゴヌクレオチド調製
すべてのオリゴヌクレオチドは394A DNAシンセサイザー(Applied Biosystems Division of Perkin−Elmer Corp,Forter City,Ca.)で合成した。6−FAM標識のオリゴヌクレオチドは、合成サイクルに製造業者の指示する修飾（Applied Biosystems Inc.,1994）を使用して、合成し、55℃で４時間経過して脱保護した。LDRオリゴヌクレオチドは、55℃で一晩脱保護した後、エタノール沈澱で精製した。PCR増幅に使用するオリゴヌクレオチドのプライマー特異的部分は10%Aアクリルアミド/7M尿素ゲル上のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。オリゴヌクレオチドは電気泳動の後に照明スクリーン上で紫外線遮蔽法で視覚化し、ゲル（Applied Biosystems Inc.,1192）から削除した。次いでそれらオリゴヌクレオチドはTNE(すなわち、TrisナトリウムEDTA)緩衝液(100mM Tris/HCl、pH8.0、500mM NaClおよび５mM EDTA含有)の中で６４℃で一晩溶離し、業者の指示に従ってSep Pakカートリッジ（Millipore Corp.,Milford,MA.）を使用して溶解液から回収した。
オリゴヌクレオチドを100μl TE(すなわち、.10mM Tri−HCl pH8.0、1mM EDTA含有)中で再懸濁した。それらの元からのLDRプローブ溶液の典型的な濃度は、下記の公式で定義されるように、およそ1μg/μlすなわち約74pm/μlである。
[濃度(μg/μl)X10６/長さ(nt)X325]=pm/μl
LDRプローブの濃度を表１に示す。リガーゼ検出反応のオリゴヌクレオチドプローブに相補的なオリゴヌクレオチドの濃度は他と比較して高かった。上記の公式で算出すると、ZipALg1Fは3.75μg/μl、ZipBLg2Rは2.01μg/μl、すなわち、それぞれ524pm/μlおよび281pm/μlであった。
Figure 0004781372
LDR相のために前もって必要な下流LDRオリゴヌクレオチドプローブをＴ4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。200pmに等しい5下流オリゴヌクレオチドのアリコート（表１参照）を10μlの10Ｘキナーゼ緩衝液（500mＭ Tris/HCl、pH 8.0、100mＭ ＭgCl）、10μｌの10mＭ ＡＴＰ、20U T4キナーゼ、および十分な水-MEと混合して、最終容量を100μlとした。リン酸化を37℃で30分間実施し、次いで10分間85℃のインキュベーションによってT4酵素を不活性化した。その結果のキナーゼ化LDRプローブ溶液濃度はプローブごとに2pm/μlすなわち2000fm/μlであった。
キナーゼの反応は次のように要約される。
Figure 0004781372
 ＋２μｌ＝２０単位T4キナーゼ
３７℃で30分間
ヒート・キル・キナーゼ、８５℃で10分間
最終濃度＝2pm/μl=2000fm/μl
ＬＤＲおよびＰＣＲオリゴヌクレオチド溶液を実験に適した濃度に調節した。キナーゼＬＤＲプローブ溶液を水で4倍に希釈して、500fm/μlの濃度を得た。200pmに等しい容量のプローブを十分な水と合わせて上流LDRプローブ溶液をつくり、最終濃度400μlとなるようにした。これによって上流ＬＤＲプローブの各溶液は500fm/μlとなった。キナーゼおよび非キナーゼＬＤＲのアリコート(20μl)を次に行う実験に使用するために冷却した。9.5μlのZipALg1Fおよび17.8μlのZipBLg2Rと十分な水とを混合して、元の溶液からＰＣＲプライマーの標準溶液（10pm/μl）をつくり、総容量500μlとした。これらの溶液をLDR/PCRプロセスにおいて使用するために冷却した。
非キナーゼプローブを次の方法で製造した。
Figure 0004781372
 最終濃度=0.5pm/μl=500fm/μl
Figure 0004781372
図24は、LDR/PCRプロセスにおける遺伝子増幅および欠失を定量するためのＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブの設計図である。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、p53腫瘍抑制遺伝子の中のエクソン8(染色体17ｐ上)、int-2のエクソン3(染色体11q上)、HER-2/neu(すなわち、.HER-2/neu/erbBオンコジーン)中の内在エクソン(染色体17q上）、SOD(すなわち、スーパーオキシドディムスターゼ)中のエクソン3(染色体21q上)、G6PD(すなわち、グルコース6-リン酸塩脱水素酵素)中のエクソン6(染色体Xq上)などを確認できるように設計されている。それぞれの対をなすLDRオリゴヌクレオチドプローブは次のような特徴をもっている：(i)左手のヌクレオチドプローブは5'から3'までの18塩基配列を含み、これは蛍光標識の2次オリゴヌクレオチドプライマー(黒棒)、「アジャストメント配列」(白棒)および75℃のTmを有する22から28までの塩基の標識特異的配列（模様棒）と同一である。（ii）右手のオリゴヌクレオチドプローブは、75℃のTm(模様棒)を有する5'から3'までの20-25塩基の標的特異的配列、標的特異的配列内でわずかにずれた位置を占める一つのHaeＩＩＩまたはHinPlI制限部位および「アジャストメント配列」（白棒）を含有する。この２つのオリゴヌクレオチドプローブはこのように設計されているので、それらの合わせた長さは正確に96塩基で50G+C塩基および46A+T塩基を有する。ユニーク制限部位の位置は少なくとも2つの塩基の差で他と異なる産物を生じる。それぞれのオリゴヌクレオチドプローブセットは、選択されたエクソン特異的領域を有し、(A,T)C↓C(A,T)の接合配列を連結する。この接合配列はプロリン残基(CCNコドン)か、トリプトファン残基(TGG)に相補的な配列かのいずれかに対応する。これらの配列は、連結反応速度の相違および連結反応接合部における多形性の機会を最少にするように選択される。
ＬＤＲプローブ配列
Figure 0004781372
ＰＣＲプライマー：
Figure 0004781372
 （下線をほどこした配列は、ＬＤＲプローブとZipALg1FまたはZipBLg2Rとの補体の間で共通である。）
実施例3−緩衝液および試薬
Ａ．ＬＤＲ緩衝液および試薬：次のLDR緩衝液および試薬を選択した。
10X STリガーゼ緩衝液(0.2Ｍ Tris pH 8.5、0.1Ｍ ＭgCl2) [これはまたTris pH 7.6 でもって試験した。]
10X TTリガーゼ緩衝液（0.2Ｍ Tris pH 7.6、0.5Ｍ KCL、0.1Ｍ MgCl２、5mM EDTA)
ＮＡＤ(10mM)
ＤＴＴ(200mM)
各ＬＤＲプライマー混合液の1/10の濃度を含むＬＤＲプライマー溶液（1μlにつき各ＬＤＲプライマー50fm）
Ｔth ＤＮＡリガーゼ（625U/μl）
Ｂ.ＰＣＲ緩衝液および試薬：次のＰＣＲ緩衝液および試薬を選択した。
10X Stoffel 緩衝液（0,1M KCl、0.1M Tris-HCl pH 8.3、Perkin Elemer)
dNTP 溶液(総量100Mm、各dNTP 25mM、Perkin Elmer)。この溶液をdHOH 中で5倍に希釈して、各dNTP 5mM の最終濃度にした。
ZipALg1F(10pm/μl)
ZipBLg2R(10pm/μl)
実施例4-ＬＤＲおよびＰＣＲプロセス
各ＤＮＡについて、4つのＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを実施して、22、24、26、30サイクルに増幅したＰＣＲ増幅反応管で試験し１つの反応が指数増殖期において停止するかどうかを確認した。各ＬＤＲ反応（20μl）は熱循環であり、次いでＬＤＲプローブのプライマー特異的部分に相補的な部分を有するプライマーを含むＰＣＲ混合物（30μl）を各標本に加えて指数増幅した。反応管のあいだの差異を最小にするために、ＬＤＲおよびＰＣＲ試薬の原混合液を作成した。
ＬＤＲ試薬の原混合液は、すべての反応管に使用するに充分な量を作成した。１つの反応に対する混合比率および量は、次のとおりである。
Figure 0004781372
各反応管の標識ＤＮＡおよびＬＤＲプローブの混合度は次の比率で作成した。
Figure 0004781372
各反応に際して、試薬10μlを薄壁ＰＣＲ管に入れ、急速に10μlのＬＤＲ試薬液(リガーゼを含む)と混合し、鉱油で覆い、Perkin Elmer 9600熱循環器に入れた。ＬＤＲは96℃で2分間保持することから始め、次の10サイクルの94℃30秒間および65℃4分間でDNAを変性した。
各反応管に使用するPCR試薬混合液はつぎの比率で作成した。
Figure 0004781372
ＬＤＲ反応の完結でそれぞれの管を94℃で維持し、一方で30mlのＰＣＲ試混合液(Stoffelフラグメントを含む)をそれらの管に加えた。ＰＣＲ増幅を94℃で15秒、次いで60℃で50秒間の熱循環により実施した。それぞれ22、24、26、30サイクルで、それら４つの各ＤＮＡ標本の同一反応管の１つを取りだしドライアイスおよびETOHのスラリー中でクエンチした。
実施例5−アガロースゲルによる検定
26および30サイクル反応標本10マイクロリッターアリコートを2%アガロースゲル上で検定した。臭化エチジウムによる染色で予想したサイズ（104bp）のバンドが現れた。
実施例6−産物の消化、希釈剤の調製、および遺伝子スキャナーにおける装填
遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲ産物を分離するために、10μlアリコートの22、24、26サイクル反応物を各5UのHaeＩＩＩおよびHinP1I制限酵素(共にNew England BioLabs製)、2μlの10X制限酵素緩衝液No2（New England BioLabs製）、および8μlのdHOH(すなわち、蒸留水)を含有する10μlの溶液を加えて消化した。消化物を37℃で1時間インキュベートし、次いで1μlの0.5M EDTA(pH 8.0)を加えて消化を停止した。制限消化物は元のＬＤＴ／ＰＣＲ産物の1/2希釈で得た。5μlの各制限消化物を20μlのTE緩衝液に加えて各サンプルの１／１０希釈液調製した。
ABI373A DNAシーケンサー(Applied Biosystem)にサンプルを装填する前に、2%のブルーデキストランおよび非イオン化ホルムアミドを含む50mM EDTA(pH 8.0)と1;5の混合液を作成した。5μlのEDTAブルーデキストラン溶液に、5μlの消化ＬＤＴ／ＰＣＲ産物の希釈液および1μlのGENESCAN 1000ROXマーカー(Applied Biosystems)を加えた。これらの溶液を85℃まで10分間加熱し、素早く氷で冷却した後に5.5μlを変性ゲルに装填した。
サンプルを可視距離12ｃｍ、厚味0.4ｍｍの10%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲル上で、Applied Biosystems 373A DNAシーケンサーの中で分析した。ゲルマトリックスを1.2xTBE(106mM Tris-ホウ酸塩、2.4mM EDTA、pH 8.3)および、0.6×TBE(53.4mM Tris-ホウ酸塩、1.2mM EDTA、pH 8.3)を含む電気泳動チェンバー緩衝液とで処理した。ゲルを電極逆方向性（ゲルの頂上にあるサンプルウエルを有するチェンバーの陽極）でもって、サンプル装填に先立って1600ボルトで30分間試運転した。装填の後、遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲ産物を1200ボルトで電気泳動し、ABI762 Data Collection Software、V1.1(Applied Biosystems)を使用して第一次のデータを得た。
ABI672 Gene Scan Analysis Software、V1.2.2(Applied Biosystems)を使用して、結果のデータを電気泳動濃度図で表示し、ピーク値とピーク域を計算した。
健常女性において、ErbB2ピーク値は低く、ｐ53ピーク値は他の３つのピーク値よりわずかに低い。図25A-Dを参照されたい。いくつもの実験において、ErbB2ピーク値は常に低く、G6PD、Int.2、p53およびSODなどのピーク域はいくぶん異なるが、実験でサンプルを取り替えても、５つのピーク値すべてが同じ相対的なプロフィルを示す。男性のDNAを女性のと比較してみると、G6PDピーク値が他のピーク値のおよそ半分の範囲であり、男性の1個のX染色体と一致し、一方、その他のピーク値は基本的に同じであった。NM10乳癌細胞ラインについてのErB2ピークはわずかに上昇しており、これら細胞ラインにおける既知のErbB-2遺伝子の増幅を反映して、細胞ラインSKBR3におけるErB2ピークは健常女性のコントロール値より幾倍か大きい。加えて、NM10細胞ラインはp53のLOH(すなわち、ヘテロ接合性の喪失)を経たようであり、一方、SKBR3細胞ラインは、G6PDおよびp53のLOHを経たようである。SKBR3細胞ラインにおける細胞のいくつかは、p53遺伝子の両方の複製を喪失しているようである。ErbB2プライマーを欠いた状態でこれらの増幅の繰り返しを行い、これらの追加遺伝子欠失（下記参照）の存在を確認した。
これらの結果は、各ピーク値におけるピーク域を当該実験についての標準値の各ピーク（SODピーク域）に対する割合と比較することで定量化できる。ピーク域の生データおよび割合は下記に表示する。
Figure 0004781372
Figure 0004781372
各割合はそれぞれの遺伝子によって相異するが、（これは各遺伝子に対するLDR/PCRの効率の差異による）G6PD/SODの割合を除けば、それぞれ割合の値は男女間で概して同じである。女性のG6PD値は男性のおよそ2倍であり、それぞれX染色体が女性に2つ、男性に１つ存在することを正確に反映している。健常者DNAと癌細胞ラインとのピーク域の割合を比較することにより、ErbB2増幅を定量できる。
Figure 0004781372
これらの割合から、健常男女は17q(ErbB)、17p(p53)、11q(Int2)の染色体に同じ数の遺伝子を持つが、女性は2倍のG6PD遺伝子すなわちX染色体をもつと結論できる。
さらにこれに加えて、細胞ラインNM10はわずかなErbB-2遺伝子の増幅を示したが、一方で、細胞ラインSKBR3はErbA-2遺伝子、G6PDおよびp53でのLOHの顕著な増幅を示した。追加的遺伝子増幅および欠失を確認するために、大増幅の原因となるプライマー対をLDR/PCR反応から除去される（下記参照）。
健常女性において、ErbB2ピーク値は残りの4つのピーク値より低い。いくつかの実験において、G6PD、Int-2、p53、SOD等のピーク値は幾分の差異はあるが、サンプルを変えても同じ相対的プロフィルを示す。図26A−Cを参照されたい。ErbB2ピーク値は常に低く、理由はわからないがG6PDおよびSODピーク値においてわずかな特性曲線の肩が観察される。両方の細胞ラインサンプルにおけるErbB-2のピーク値は、健常女性コントロール値より幾倍か大きく、それら2つの細胞ラインの既知のErbB-2遺伝子増幅を反映している。さらに、ZR-75-30ラインはp53のLOHを示すようであり、一方、SKGT-2細胞ラインはInt-2領域のわずかな増幅を持つようである。ErbB-2プライマーの不存在でLDR/PCRの実験を繰り返すことにより、これらの結果が高レベルのErbB-2増幅の産物ではないことが判明した。図27A−Cを参照されたい。LDR/PCRフォーマットを使用した多重対立遺伝子の増幅および欠失について示した。図26A−Cおよび27A−Cを参照されたい。
繰り返すが、これらの結果は、各ピーク値におけるピーク域をその実験について標準値の各ピーク（SODピーク域）に対する割合と比較することによって定量できる。ピーク域の生データおよび割合を次に示す。
Figure 0004781372
Figure 0004781372
４つのプライマーセットと５つのプライマーセットの実験間で、比率は見事に一致している。唯一の例外はSKGT2細胞ラインに対するG6PDピーク値で、この場合は、ErbB-2に対する大きなピーク値がG6PDピーク値に追加されているようである。
ErbB2およびInt-2の増幅量をp53の欠失と同様に、正常DNAと癌細胞ラインとのピーク域割合を表８に示すように比較することで定量できる。
それに加えて、４つのセットのプライマー使用からの割合を5セットのプライマーと比較して、本技術の内在的一貫性を確かめることができる。

Figure 0004781372
表８における上半分の数値は、４つまたは５つのプライマーを使用して、LDR/PCR技術が内在的に一貫しているならば、すべて1.0に近くなるはずである。すべての数値が1.0に非常に近くなっている。繰り返すが、SKGT2に対するG6PDの数値は、すでに述べた理由で少し低い。
表８における下半分の数値は、ErbB-2増幅の程度を示す。数字は4プライマーおよび５プライマー増幅についてかなり一致している。（ただし、上記のとおりSKGT2−G6PDの場合は例外である。）ZR7530細胞ラインはp53に対する明確なLOHを示し、一方で、SKGT2細胞ラインはInt−2領域および存在する両p53遺伝子の増幅を示す。
一次PCR/二次PCR/LDRプロセス
実施例７−オリゴヌクレオチド合成法
オリゴヌクレオチドを標準ホスホラミジト化学によってExpedite DNAシンセサイザー（Perspective Biosystems, Framingham,MA）の上に集めた。6−FAM、TET、HEXによる5'−末標識のオリゴヌクレオチドを適切なダイ・ホスホルアミジド（Perkin Elmer-Applied Biosystems）を使用して合成し、製造業者のプロトコル(Applied Biosystems Division-Perkin Elmer Crop.,「ダイ・ホスホルアミジドを使用した蛍光標識オリゴヌクレオチドの合成と精製」“User Bulletin、第78号、Applied Biosystems Division, Foster City,Ca,(1994)(出典明示により本明細書の一部とする))に従って、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ（Perkin Elmer-Applied Biosystems）で精製した。すべてのオリゴヌクレオチドを、mPAGE−3カラム（Ｊ＆Ｗ Scientific, Folsom,CA）を使用してApplied Biosystems 270−HTの毛管電気泳動器で精製度をチェックした。精製度95％以上のオリゴヌクレオチドだけを実験に使用した。オリゴヌクレオチドを250ml TE(10mM Tris/HClおよび5mM EDTA、pH 8.0)中に再懸濁した。典型的濃度は未精製貯蔵溶液で300〜500mＭであり、OPC(すなわち、Oligonucleotide Purification Columns, Applied Biosystems市販)について100−200mMである。PCRおよびLDRについては、オリゴヌクレオチドを希釈して、10mM(10 pmoles/ml)または5mM(5pmoles/ml)を使用溶液とした。
実施例８−LDRオリゴヌクレオチドのリン酸化
12LDR共通オリゴヌクレオチドを5'末で蛍光標識オリゴヌクレオチドとに連結反応できるようにリン酸化した。そのオリゴヌクレオチドを下記の表に示す。
表９ LDRオリゴヌクレオチドの配列
Figure 0004781372
対立遺伝子オリゴヌクレオチドはＦＡＭ、ＴＥＴまたはＨＥＸのいずれかで５’末が標識されている。全共通オリゴヌクレオチドは５’末でリン酸化される。下線は標的配列に相補的でないテイルを表す。ＬＤＲプライマーは２方法により設計された：（ｉ）対立遺伝子プライマーは同じ長さであるが、ＦＡＭまたはＴＥＴ標識のいずれかを含有する、(ii)対立遺伝子プライマーは両者ともにＨＥＸで標識されるが、２塩基の長さで相違する。
このリン酸化は、製造業者の指示に従うPhosphate-ON(Clontech Laboeatories,Palo Alto.Ca)での合成工程の間か、あるいはT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Boehringer Manheim, Indianapolis,IN)を使用して合成後かのいずれかで達成した。後者の場合には共通オリゴマーを50μlのキナーゼ緩衝液（50mM Tris/HCl、10mM MgCl２、1mM ATP）で希釈し、最終濃度を1mM(50μl中500pmol)とした。10単位のＴ4キナーゼを加え、37℃で30分間培養した。Ｔ4キナーゼを95℃で10分間加熱して不活性化した。
キナーゼ反応を次のように実施した。
Figure 0004781372
 37℃で30分間
95℃で10分間
最終濃度＝10ｍM
実施例９−多重PCRの増幅
12の遺伝子領域(2−13)を同時ＰＣＲ増幅のために選んだ。これは下記の表10に示すHuman Genome Databaseから購入できる資料に基づいている。
Figure 0004781372
部位番号は、それぞれの遺伝子内に位置する特異的単鎖点変異である。すべての表記した変異はセンス鎖により定義する。遺伝子銀行番号は（）内の番号で示す。
表10の参考文献
２ M．Armstrong, et al., “A Polymorphic Cfo I Site In Exon 6 of the Human Cytochrome P450 CYPD6 Gene Detected by the Polymerase Chain Reaction, ”Human Genetics 91:616-17 (1993), which is hereby incorporated by reference.
３ S.C. Bock, et al., ”Antithrombin ＩＩＩ Utah: Proline-407 to Leucine Mutation in a Highly Conserved Region Near the Inhibitor Reactive Site, ”Biochemistry 28:3628(1991), which is hereby incorporated by reference.
４ G. Dewald, et al., ”Polymorphism of Human Complement Component C6: An Amino Acid Substitution(glu/ala)Within the Second Thrombospondin Repeat Differentiates Between the Two Common Allotypes C6 A and C6 B, ”Biochem, Biophys. Res. Commun.194:458-64(1993), which is hereby incorporated by reference.
５ P.A. Velden, et al., ”Amino Acid Dimorphism in IL1A is Detectable by PCR Amplification,” Hum. Mol. Genet. 2:1753(1993), which is hereby incorporated by reference.
６ R.M. Cawthon, et al., ”Identification and Characterization of Transcripts From Theneurofibromatosis 1 Region: The Sequence and Genomic Structure of EV12 and Mapping of Other Transcripts,” Genomics 7:555-65(1990), which is hereby incorporated by reference.
７ C.C. Brooks, et al.,” Association of the Widespread A149P Hereditary Fructose Intolerance Mutation With Newly Identified Sequence Polymprphisms in the Aldolase B Gene,” Am. J. Human Genetics 52:835-40(1993),which is hereby incorporated by reference.
８ W, Poller , et al., ”Sequence Polymorphism in the Human Alpha-2- Macroglobulin (A2M) Gene, ”Nucleic Acid Res. 19:198(1991), which is hereby incorporated by reference.
９ T. Gloudemans, “ An Ava ＩＩRestriction Fragment Length Polymorphism in the Insulin-Like Growth Factor ＩＩGene and the Occurrence of Smooth Muscle Tumors, ”Cancer Res.53:5754-58(1993) , which is hereby incorporated by reference.
10 C.M Diepstraten, et al., ”A CCA/CCG Neutral Dimorphism in the Codon for Pro 626 of the Human Protein S Gene Pa(PROS1),” Nucleic Acids Res. 19:5091(1991), which is hereby incorporated by reference.
11 M. Reina, et al., ”SSCP Polymorphism in the Human Hepatic Triglyceride Lipase(LIPC)Gene,”Hum.Mol.Genet.1:453(1992), which is hereby incorporated by reference.
12 S. Matuura, et al., “Investigation of the Polymorphic AvaＩＩ Site by a PCR-based Assay at the Human CD18 Gene Locus ,”Human Genetics 93:721(1994), which is hereby incorporated by reference.
13 L. Warnich, et al., ”Detection of a Frequent Polymorphism in Exon 10 of the Low-Density Lipoprotein Receptor Gene,” Human Genetics 89:362(1992), which is hereby incorporated by reference.
それぞれの領域はよく特徴が出ており、2つの公知の対立遺伝子だけが単塩基変異として表れている。PＣR増幅は全血から製造業者の掲示に従ってパージーンDNA単離キット(Gentra Systems, Inc., Minneapolis, MI)で分離したゲノムDNAを使用して実施した。
25μlのPCR緩衝液(10mM Tris/HCl、pH 8.3、10mM KCl、4mM MgCl2、0.4mM各々dNTP)、10−100ngのゲノム標識DNA、バイブリッドPCRプライマー対1〜12（各プライマー2pmol）、1.3単位のAmpliTaq DNAポリメラーゼStoffelフラグメント(Applied Biosystems)等を薄肉MicroAmp反応管（Applied Biosystems）に入れた。それぞれのハイブリッドプライマーは、遺伝子特異的3'領域(16〜29塩基)および5'領域(22塩基)から成り、1ないし2セットのユニバーサル（すなわち、プライマー特異的部分）のプライマー（図4参照。F1=Tet、F2=Fam、F3=Het)と対応する。これらのプライマーについては表11に示す。
表１１ １次ＰＣＲプライマー配列
Figure 0004781372
遺伝子座1，3，5，7，10，12における順方向および逆方向ハイブリッドプライマーはユニバーサルプライマーALg1およびBLg2のそれぞれと同一の5'末端領域を含んでいた。座２、4、6、8、９および11についての順・逆プライマーはそれぞれ、ユニバーサル・プライマーＣＬｇ３およびＤＬｇ4に同じ５’末端領域を含有していた。PCR相において、低密度のハイブリッドプライマーを使用する根本理由は、反応過程中にハイブリッドプライマーを空にするためである。これは、理論的には低増幅効率の産物が高増幅効率の産物に「追いつく」ことが可能であることを示す。増幅は、96℃で15秒間の1サイクルで変性させる熱循環と、それに次いで94℃で15秒間の15サイクルで変性させ、65℃で60秒間アニールして伸張することで達成した。
高濃度の2対のユニバーサルプライマー（各プライマーが25pmol；表２参照）と、それと同容量のAmplitaq DNAポリメラーゼStoffelフラグメントの1.3単位をMicroamp反応管に加え、別の25サイクルに対してアニール温度を55℃に下げて熱循環を実行した。上流ユニバーサルプライマーALg1およびCLg3をそれぞれ６−FAMおよびTETで蛍光標識した。すべての熱循環をGeneAmp PCR System 9600熱循環器（Applied Biosystems）で達成した。
一次PCRプロセスを次の條件で実行した。
Figure 0004781372
一次PCR循環條件は次の通り：
96℃15”
94℃15”、65℃１'x15
65℃ Hold(維持)
二次PCRプロセスを次の條件で実行した。
Figure 0004781372
二次PCR循環條件は次の通り：
94℃15”、55℃ 1'×25
4℃ Hold(維持)
PCR産物をApllied Bisystems 373 DNAシーケンサーで分離した。3mlアリコートのPCRサンプルを蛍光標識Genescan−2500[TAMRA]サイズスタンダード(Apllied Biosystems)を含む3mlのホルムアミドと混合した。50ml Genescan−2500サイズスタンダード[TAMR]を450mlのホルムアミドに加えることによって、ホルムアミドのスタンダード溶液を調製した。サンプルを95℃で2分間加熱し、氷中で急速に冷却し、Genescanのバージョン1.2ソフトウェアでApplied Biosystems 373 DNAシーケンサー中の変性化8％ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動させた。蛍光標識産物のサイズをGenescan分析ソフトウェアによって、局所サザン法を使って自動的に計算した。電気泳動濃度図で12の産物がはっきりと判明した(図28）。各産物の均等な量は、アンプリコンのサイズの類似および２次プライマーに対し相補的な部分を有する１次プライマーの使用に起因する。この２次プライマーは同一の親和力で12のアンプリコンに注意深い反応條件の調整をしなくてもアニールする。産物のコンピューターで計算したサイズは135〜1756pの範囲で、正確にそれらの実際のサイズと一致した（表12参照）。
表12−PCRおよびLDRの産物一覧表
Figure 0004781372
二重標識の方法（表12）によって、産物を電気泳動濃度図で識別するのがいっそう容易となった。（図28において、パネルAとパネルBおよびCとを比較されたい。）
実施例10−多重リガーゼ検出反応
標識PCR産物がリガーゼ産物の配列の検出を妨げるのを避けるために、PCR産物をLDRの標識として使用する非標識PCRのユニバーサルプライマーを使って、PCR産物を増幅した。PCR内のポリメラーゼを解凍法によるか、あるいはEDTA/プロテイナーゼKを加えて、それぞれ5mMおよび100mg/mlの最終濃度にし、37℃で30分間、さらに95℃10分間加熱することによって不活性化した。
プロテイナーゼK消化を次の條件で行った:
Figure 0004781372
 60℃で60分間
95℃で10分間、プロテイナーゼK加熱停止
4μｌのPCR産物を50mM Tris/HCl pH 8.5、50mM KCl、10mM MgCl２、lmM NAD+、10mM DTT、LDRオリゴヌクレオチドセット1〜2（各ヌクレオチドが200fmol）、10単位のThermus aquaticus DNAリガーゼ（Barany, F. and Gelfand, D.,“Cloning, Overexpression, and Nucleotide Sequence of a Thermostable DNA Ligase-Encoding Gene,” Gene,109:1−11(1991)、(出典明示により本明細書の一部とする。)を含む20μlのLDR混合液で希釈した。各LDRオリゴヌクレオチドプローブセットは、2つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドおよび1つの共通ヌクレオチドを含む。LDRオリゴヌクレオチドプローブセット1，2，3，4，5，6，7，8，9における識別可能な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの各一対は、サイズが等しく一方のオリゴヌクレオチドは6FAM標識であり、他のオリゴヌクレオチドはTET標識であった。LDRオリゴヌクレオチドプローブセット5，10，11，12に対して、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの各一対は、２つの塩基（大きい方のオリゴヌクレオチドは標的配列に相補的でない5'テイルを有する）で相異し、両方のオリゴヌクレオチドはHEX標識である。熱循環を実施して95℃2分間1サイクルで変性し、次いで95℃30秒間20サイクルで変性し、65℃4分間で連結反応した。
LDRプロセスを次のとおり実行した。
Figure 0004781372
リガーゼのストック：
0.5μlの625u/ml ＋3.2μl 10X緩衝液 ＋27.5μl H２O
LDRサイクリングの條件は次のとおり：
94℃ 2’
94℃ 30”, 65℃×20
4℃ Hold(維持)
3μlアリコートのLDRサンプルを3μlの標準サイズ（Applied Biosystems）蛍光標識Genescan−2500[TAMRA]と混合せしめた。サンプルを95℃で2分間加熱し、氷中で急速冷却し、Genescanの1.2バージョンソフトウエアでApplied Biosystems 373DNAシーケンサー中の変性化10％ポリアクリルアミドゲルを通して、電気泳動させた。蛍光標識産物のサイズをGenescan分析ソフトウエアによって、局所サザン法を使って自動的に計算した。２つの固体のLDRプロフィルを図29に示す。それぞれの蛍光着色を独立して分析すると（図29、パネルB−D,F−H）、各遺伝座ごとに存在する対立遺伝子の測定は非常に容易であった。各LDR産物（表12）に単純な”A”あるいは”B”コードをつけて、遺伝子型にコードを割り当てるのに使用した。次の表13を参照されたい。
表13-PCR-LDRで測定した5個体の遺伝子型
Figure 0004781372
最初の個体（図29A〜D；表13の個体1）は、多形体部位においてヘテロ接合体である。個体部位1〜4および6〜7におけるヘテロ接合体は、電気泳動濃度図上のそれぞれの位置における6-FAMおよびTET標識の産物(図29、パネルＢおよびＣ)両方を検出することによって判明した。個体部位5，11，12におけるヘテロ接合体はそれらの各遺伝子座（図29、パネルＤ）に対して2つの塩基のサイズが相異する２つのHEX標識産物の存在によって判明した。それに反して、個体部位8および９(図２９、パネルＢ、Ｃ)で検出した１つの産物によって、それらの各遺伝子座がそれぞれホモ接合体であることが立証された。
第２の個体（図29E〜FおよびG〜H、表13の個体2）がヘテロ接合体であったのは、個体部位3，5，6，9だけであり、1，2，4，7，8，10，11，12の個体部位でホモ接合体であった。2人の試験者の間のこれらの位置における遺伝子型には合計８つの相異があった。３人の試験者を加えて型を判別した結果、５人のすべての試験者が１２遺伝子座（表13）に基づいた明確な遺伝子型をもっていた。
本発明は、説明するために詳細に記載したが、説明のためのみに詳述したのであり、以下の請求の範囲で定義している本発明の精神および範囲からそれない限り、当業者は修飾を施すことができることを理解されたい。
電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による点変異などの生殖細胞系変異の検出のための１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す流れ図である。なお、図１および他の図における用語“ジップコード”は、後に用いられるプライマーまたはプローブの特異的な配列を意味するが、標的配列または他のゲノム配列を意味しない。 電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉によるバイ対立遺伝子多形性の検出のための１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す流れ図である。 電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による癌関連変異の検出のための１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す流れ図である。 バイ対立遺伝子多形性の検出のための１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す模式図である。 与えられた部位ですべての可能性ある塩基を識別するＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブを用いて、対立遺伝子の相違の検出のための１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す模式図である。 与えられた部位ですべての可能性ある塩基を識別するＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブを用いて、２つの近接する部位の可能性ある塩基の存在を検出のための１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す模式図である。 隣接する対立遺伝子での癌関連変異の検出のための１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す模式図である。 電気泳動検出を用いて制限エンドヌクレアーゼ消化の有無でのＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。 遺伝子特異的アドレスを用いるアドレス可能アレイでの検出のためのＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。 遺伝子増幅および欠失の多重検出のためのＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す模式図である。 ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスのための対立遺伝子特異的問題を表す模式図である。 図１１に表されたＬＤＲ／ＰＣＲプロセスのための対立遺伝子特異的問題の解決を表す模式図である。 電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による２対立遺伝子多形性の検出のための中間的エクソヌクレアーゼ消化相を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。 電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による癌関連変異の検出のための中間的エクソヌクレアーゼ消化相を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。 対立遺伝子特異的変異および多形性の検出のための中間的エクソヌクレアーゼ消化相を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す模式図である。 モノヌクレオチド反復多形性検出のための中間的エクソヌクレアーゼ消化相を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す模式図である。 低存在量のモノヌクレオチド反復多形性検出のための中間的エクソヌクレアーゼ消化相を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す模式図である。 中間的配列伸長相、およびＬＤＲ相の後でＰＣＲ相の前でのウラシルＮ−グリコシラーゼ消化相を有し、および電気泳動またはアドレス可能アレイによる検出を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを用いての多形性検出を表す流れ図である。 中間的配列伸長相、およびＬＤＲ相の後でＰＣＲ相の前でのウラシルＮ−グリコシラーゼ消化相を有し、および電気泳動またはアドレス可能アレイによる検出を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを用いての癌検出を表す流れ図である。 中間的配列伸長相、およびＬＤＲ相の後でＰＣＲ相の前でのウラシルＮ−グリコシラーゼ消化相を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを用いてのモノヌクレオチド反復体の検出を表す模式図である。 中間的配列伸長相、およびＬＤＲ相の後でＰＣＲ相の前でのウラシルＮ−グリコシラーゼ消化相を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを用いての低豊富であるモノヌクレオチド反復多形性の検出を表す模式図である。 ミクロサテライト反復体の検出のための１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。 ミクロサテライト反復体における挿入および欠失の多重検出のための１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセスを表す模式図である。 ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスにおける遺伝子増幅および欠失の定量のためのＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブの設計を示す。 図２５Ａ−Ｄは、ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスについての電気泳動濃度を示す。 図２６Ａ−Ｃは、正常女性ＤＮＡ、肺癌細胞系ＺＲ−７５−３０ ＤＮＡおよび消化器癌細胞系ＳＫＧＴ−２に由来するＥｒｂＢ、Ｇ６ＰＤ、Ｉｎｔ２、ｐ５３およびＳＯＤ遺伝子セグメントについてのＬＤＲ／ＰＣＲプロセスの電気泳動濃度を示す。ＥｒｂＢ遺伝子は癌細胞系で増幅することが知られている。１０４ｂｐの標的特異的連結反応産物配列は、各連結反応プライマー５００フェムトモル、ゲノムＤＮＡ５０ng、Thermus thermophillus（“Tth”）リガーゼ１２４単位、１０×緩衝液２μg（０.２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.５および０.１Ｍ ＭｇＣｌ２）、１０mＭ ＮＡＤ２μgおよび２００mＭ ＤＴＴ １μlを容量２０μlで用いて、ＬＤＲの１０サイクル（９４℃で３０秒、６５℃で４分）において生成せしめる。連結反応産物は、１０×ストフェル緩衝液（Perkin Elmer）５μｌ、各オリゴヌクレオチドプライマー２５ピコモル、Ｔａｑポリメラーゼ・ストフェル・フラグメント２５単位および各ｄＮＴＰ中の５mＭ溶液８μlを含有する溶液３０μlを加えて、ＰＣＲの２６サイクル（９４℃で１５秒、６５℃で５０秒）において比較的に増幅される。増幅後、産物をＨａｅＩＩＩおよびＨｉｎ Ｐ１Ｉで消化し、５８ｂｐ（ＥｒｂＢ（すなわちＨＥＲ−２／ｎｅｕ／ｅｒｂＢオンコジーン）、６１ｂｐ（Ｇ６ＰＤ）、６７ｂｐ（Ｉｎｔ２（すなわちｉｎｔ−２オンコジーン））、７０ｂｐ（ｐ５３）および７６ｂｐ（ＳＯＤ））のＦＡＭ標識産物を産生する。これらの産物を分離し、ジーンスキャン６７２ソフトウェア・パッケージ（Applied Biosystems,Inc., Foster City,Calif.）を用いて３７３Ａ ＤＮＡシクエンサー上で解析する。結果が電気泳動濃度図に表され、ピークの高さと面積がＰＣＲ産物の量を示している。図２６Ａは、正常女性ＤＮＡにおける５部位について遺伝子量測定を示す。Ｇ６ＰＤ、Ｉｎｔ２、ｐ５３およびＳＯＤについてのピークの高さおよび面積は非常に類似している。ＦｒｂＢについてのピークの高さおよび面積は正常ゲノムＤＮＡにおいて明らかに小さい。図２６Ｂは、既知のＥｒｂＢ増幅での細胞系、ＺＲ−７５−３０において遺伝子量を検査したので、ＥｒｂＢでのピークが高く、面積が大きいことを示している。図２６Ｃは、消化器細胞系であるＳＫＧＴ−２においてＥｒｂＢ遺伝子の劇的な増幅およびＩｎｔ２の中程度の増幅があることを示している。Ｇ６ＰＤ遺伝子ピークは、大きいＥｒｂＢピークにのみこまれたかも知れない。 図２７Ａ−Ｃは、Ｇ６ＰＤ、Ｉｎｔ２、ｐ５３およびＳＯＤについて他のＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブおよびＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーの相対的ピークの高さにＥｒｂＢ増幅が影響するかどうかを測定するためのＬＤＲ／ＰＣＲプロセスについての電気泳動濃度図を示す。図２７Ａは、正常女性ＤＮＡにおける４部位についての遺伝子量測定を示す。全５ＬＤＲプライマーを用いた実験でのようにＧ６ＰＤ、Ｉｎｔ２、ｐ５３およびＳＯＤについてのピークの高さおよび面積は類似している。図２７Ｂは、ＺＲ−７５−３０乳癌細胞系のＧ６ＰＤ、Ｉｎｔ２、ｐ５３およびＳＯＤが正常女性ＤＮＡに比較して類似の相対ピークの高さであることを示している。ｐ５３についてのピークは低下し、この細胞系における細胞部分でのこの遺伝子の欠失を示唆している。図２７Ｃは、消化器癌細胞系のＳＫＧＴ−２において、Ｇ６ＰＤおよびｐ５３が同等のピークを有することを示している。全５ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブを用いた実験でのように、Ｉｎｔ２のピークは比較的高い。このように、各産物のＬＤＲおよびＰＣＲ増幅は、実験中において他の産物と独立的とみられる。 図２８Ａ−Ｃは、１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスのＰＣＲ相についての電気泳動濃度図を示す。１次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いての１２部位の多重ＰＣＲ増幅は大略等量の産物をつくる。単一塩基多形性を有する８０以上の遺伝子領域がヒトゲノム・データベースから同定された。そのうち１２（表１０および図２９Ａ−Ｈ参照）は、１次ＰＣＲ相において次のように増幅された。２次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーの２セットの１つに相補的な遺伝子特異的３’末端および５’末端を有するように、長い１次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。上流１次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーはＦＡＭ（すなわち、６−カルボキシフルオレセイン：配列決定および変異検定に用いられる蛍光染料）またはＴＥＴ（すなわち、テトラクロリネート−６−カルボキシフルオレセイン：配列決定／変異検定に用いられる蛍光染料）のいずれかでの蛍光標識を持つように合成した。全２４塩基の長い１次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを低濃度（２０μl中各プライマー２ピコモル）で１５サイクルの１次ＰＣＲ相に用いた。その後、２次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーの２セットを高濃度（各２５ピコモル）で加え、２次ＰＣＲ相をさらに２５サイクル行った。産物を３７３ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems）で分離した。パネルＡは、ＦＡＭ−およびＴＥＴ−標識産物について合わせた電気泳動濃度図を示す。パネルＢは、ＦＡＭ標識産物のみを示す。パネルＣは、ＴＥＴ標識産物のみを示す。このプロセスは、プライマー濃度またはＰＣＲ条件を注意深く調節する必要なしに、多重的産物について同様の量を産生する。 図２９Ａ−Ｈは、法医学的同定のための１２バイ対立遺伝子の検出における１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスのＬＤＲ相についての電気泳動濃度図を表す。１２多形性遺伝子についての１次および２次ＰＣＲ相は、図２８Ａ−Ｃ記載のように行った。しかし、２次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを蛍光標識しなかった。２次ＰＣＲプロセス伸長産物を３６ＬＤＲ・オリゴヌクレオチドプローブ（各部座につき１通常および２識別プライマー）含有のリガーゼ緩衝液中に希釈した。ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブセットを次の２方法で設計した。（ｉ）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは同じ長さであるが、ＦＡＭかＴＥＴ標識のいずれかを含有する、（ii）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ両者をＨＥＸ（すなわち、ヘキサクロリネート−６−カルボキシフルオレセイン：配列決定および変異検出に用いられる蛍光染料）で標識するが、長さに２塩基対の相違がある。ＬＤＲ相の２０サイクル後、連結反応産物配列を３７３ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems）で１０％ポリアクリルアミド・シークエンシング・ゲルにより溶解した。パネルＡおよびＥは、２個体の１２座ＰＣＲ／ＬＤＲを示す。パネルＢ、ＣおよびＤは夫々、パネルＡにおける個体についてのＦＡＭ、ＴＥＴおよびＨＥＸを示す。パネルＡの個体は、座６（ＡＬＤＯＢ（すなわちアルドラーゼＢ））および座８（ＩＧＦ（すなわちインスリン生長因子））でのみ同型接合である。パネルＥの個体は、座３（Ｃ６（すなわち、補体成分Ｃ６））、座５（ＮＦ１（すなわち、神経線維腫症））、座６（ＡＬＤＯＢ）および座８（ＩＧＦ）でのみ異型接合であった。このことから、１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスが多数の位置における同型接合および異型接合の両方の遺伝子型を同時に識別し得ることが分かる。

Claims (25)

  1. 未知の量の複数の標的ヌクレオチド配列を含むサンプル中の、標的ヌクレオチド配列における１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の相対量を決定するための方法であって：
    相対量を決定する対象である該複数の標的ヌクレオチド配列を含有するサンプル、および１以上の既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し；
    複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットは（ａ）標的特異的部分と５’上流プライマー特異的部分を保持する第１オリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）標的特異的部分と３’下流プライマー特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプローブを特徴とし（特定セットにおける標的ヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適し、しかし、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするときに、この連結反応を妨害するミスマッチがある）、ここで複数のプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を構成し、各群は同一の５’上流プライマー特異的部分と同一の３’下流プライマー特異的部分を有する２以上のオリゴヌクレオチドプローブセットから構成される；
    リガーゼを準備し；
    サンプル、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物とし；
    リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ（変性処理において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、ハイブリダイゼーション処理により、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していればその夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いに連結して、連結反応産物配列を形成し、この産物配列は、（ａ）５’上流プライマー特異的部分、（ｂ）一緒に結合した標的特異的部分および（ｃ）３’下流プライマー特異的部分を含み、各セットの連結反応産物配列は連結検出反応混合物中の他の核酸と識別可能であり、オリゴヌクレオチドプローブセットはその夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、１以上のミスマッチの存在によって連結せず、そして、次の変性処理の際に個々に分離している）；
    １つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを準備する、ここで各プライマーのセットは特定のプローブ群内でオリゴヌクレオチドプローブにより形成された全ての連結反応産物を増幅するのに有用であり、各プライマーセットは、（ａ）連結反応産物配列の５’上流プライマー特異的部分と同じ配列を含有する上流プライマー、および（ｂ）連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを特徴とし（プライマーの１つは検出可能レポーターを有する）；
    ポリメラーゼを準備し；
    リガーゼ検出反応混合物を１または複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットおよびポリメラーゼと混合して、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成せしめ；
    ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ（変性処理において、ハイブリダイズ核酸配列が分離され、ハイブリダイゼーション処理において、プライマーが連結反応産物配列の相補的プライマー特異的部分とハイブリダイズし、伸長処理において、ハイブリダイズプライマーが伸長されて、プライマーがハイブリダイズしている配列に相補的な伸長産物を形成し、第１サイクルにおいて、下流プライマーが連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長されて連結反応産物配列に相補的な伸長産物を形成し、次のサイクルにおいて、上流プライマーが連結反応産物に相補的な伸長産物の５’上流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、３’下流プライマーが連結反応産物配列の３’下流部分にハイブリダイズする）；
    レポーター標識を検出し；
    伸長産物を識別し；そして
    サンプル中の１以上の既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生成された伸長産物の相対量と、サンプル中の１以上の未知量の標的ヌクレオチド配列から生成された伸長産物の相対量を比較して、該サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の定量を行う
    ことを含む方法。
  2. 請求項１の方法において、オリゴヌクレオチドが、各セットの連結反応接合部を通してのその連結反応産物配列がユニークであり、ポリメラーゼ連鎖反応混合物中の他の核酸と識別できるように、立体配座されるものであり、該方法がさらに、
    相違する特定部位で固定された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドが与えられたプローブセットの連結接合部を通ってユニークヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有している);
    １以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物上で伸長産物を捕捉する（該検出は、連結反応接合部のまわりのユニークヌクレオチド配列部分を用いて捕捉され、そして特定部位で固体支持物に固定化された伸長産物の存在を表し、それによってサンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を検出する）；
    ことを含む請求項１の方法。
  3. 請求項１の方法において、各プライマーセットが、１つのプライマーが検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応混合物を１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後にこのプライマー５’末に連結するアドレス可能アレイ特異的部分を含有するものであり、該方法がさらに、
    相違する特定部位で固定化された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドは与えられたプライマーセットの連結反応接合部を通してユニークヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する）；
    １以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物上で伸長産物を捕捉する（該検出が連結反応接合部のまわりのユニークヌクレオチド配列を用いて捕捉され、そして特定部位で固体支持物に固定化された伸長産物の存在を表し、それによってサンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を検出する）；
    ことを含む請求項１の方法。
  4. 請求項１の方法において、各セット中のオリゴヌクレオチドプローブの１つが制限部位を含有するものであり、該方法がさらに、
    制限部位で各伸長産物を制限消化して、標識伸長産物フラグメントを産生し（制限部位が各オリゴヌクレオチドプローブセットに位置して、該制限消化後にポリメラーゼ連鎖反応混合物における他の核酸と識別され得るように、ユニーク長を有する伸長産物フラグメントを産生する）；
    伸長産物フラグメントをサイズまたは電気泳動運動性によって分離する（該識別がサイズの異なる伸長産物フラグメントを区別する）；
    ことを含む請求項１の方法。
  5. 請求項１の方法において、同じ群のオリゴヌクレオチドプローブセットが同じ５’上流プライマー特異的部分と同じ３’下流プライマー特異的部分とを有し、そして特定セットにおけるオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がポリメラーゼ連鎖反応混合物中の他の核酸と識別できるようにユニーク長産物を有するものであり、該方法がさらに、
    伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離する（該検出および該識別が標識が標識伸長産物中のサイズの相違により実施される）；
    ことを含む請求項１の方法。
  6. 請求項１の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列が、ポリメラーゼ連鎖反応混合物中の他の核酸と識別され得るように、連絡接合部を通ってユニーク配列を含有するものであり、該方法がさらに、
    相違する特定部位で固定された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドが与えられたプローブセットの連結接合部を通ってユニークヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有している);
    １以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物上で伸長産物を捕捉する（該検出は、連結反応接合部を通ってユニークヌクレオチド配列部分を用いて捕捉され、そして特定部位で固体支持物に固定化された伸長産物の存在を表す）；
    ことを含む請求項１の方法。
  7. 複数の標的ヌクレオチド配列に対して１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の１以上を同定する方法であって、
    複数の配列相違を有する１以上の標的ヌクレオチド配列を有する可能性のあるサンプルを準備し、
    １以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットは（ａ）標的特異的部分と５’上流プライマー特異的部分を保持する第１オリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）標的特異的部分と３’下流プライマー特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプローブを特徴とし（特定セットにおける標的ヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適し、しかし、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするときに、この連結反応を妨害するミスマッチがある）、ここで特定セットの１つまたは両方のオリゴヌクレオチドプローブがその非連結末端にブロック群を有している；
    リガーゼを準備し；
    サンプル、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物とし；
    リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ（変性処理において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、ハイブリダイゼーション処理により、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していればその夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いに連結して、連結反応産物配列を形成し、この産物配列は、（ａ）５’上流プライマー特異的部分、（ｂ）一緒に結合した標的特異的部分、（ｃ）３’下流プライマー特異的部分および（ｄ）片方または両端のブロック群を含み、各セットの連結反応産物配列は連結検出反応混合物中の他の核酸と識別可能であり、実質的にエキソヌクレアーゼ消化に対して抵抗性であり、そしてオリゴヌクレオチドプローブセットはその夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、１以上のミスマッチの存在によって連結せず、そして、次の変性処理の際に個々に分離している）；
    リガーゼ検出反応混合物を１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけた後に、リガーゼ検出反応混合物をエクソヌクレアーゼ消化にかけ（エクソヌクレアーゼがブロックされないオリゴヌクレオチドプローブを実質的に破壊し、連結反応産物の実質部分を破壊せず、そして元の標的ヌクレオチド配列の存在を減少する);
    エキソヌクレアーゼを不活性化し；
    １つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを準備する、ここで各プライマーのセットは（ａ）連結反応産物配列の５’上流プライマー特異的部分と同じ配列を含有する上流プライマー、および（ｂ）連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを特徴とする（プライマーの１つは検出可能レポーターを有する）；
    ポリメラーゼを準備し；
    リガーゼ検出反応混合物を１または複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットおよびポリメラーゼと混合して、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成せしめ；
    ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ（変性処理において、ハイブリダイズ核酸配列が分離され、ハイブリダイゼーション処理において、プライマーが連結反応産物配列の相補的プライマー特異的部分とハイブリダイズし、伸長処理において、ハイブリダイズプライマーが伸長されて、プライマーがハイブリダイズしている配列に相補的な伸長産物を形成し、第１サイクルにおいて、下流プライマーが連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長されて連結反応産物配列に相補的な伸長産物を形成し、次のサイクルにおいて、上流プライマーが連結反応産物に相補的な伸長産物の５’上流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、３’下流プライマーが連結反応産物配列の３’下流部分にハイブリダイズする）、ここで該エクソヌクレアーゼ処理が連結反応独立伸長産物の形成を、ポリメラーゼ連鎖反応混合物の１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクル処理の際に減少する：
    レポーター標識を検出し；および
    サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を示す伸長産物を識別する
    ことを含む方法。
  8. 請求項７の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長産物を産生するものであり、該方法がさらに、
    伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離する（該識別がサイズの相違する伸長産物を分別する）；
    ことを含む請求項７の方法。
  9. 請求項８の方法において、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違する１以上の複数の配列が定量する複数の標的ヌクレオチド配列を有する未知量のサンプル中に存在するものであり、該方法がさらに、
    １以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し；
    １または複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を準備し、各群はマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む２以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し（特定セットの１または両方のオリゴヌクレオチドプローブはその非連結末端でブロックされ、同じ群のオリゴヌクレオチドプローブセットは同じ５’上流プライマー特異的部分または同じ３’下流プライマー特異的部分のいずれか、あるいは同じ５’上流プライマー特異的部分と同じ３’下流プライマー特異的部分の両方を有し、該リガーゼ検出反応混合物はさらにマーカー標的ヌクレオチド配列を含有し、プローブセットはマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む）；
    １または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が２以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含有し（各群のオリゴヌクレオチドプライマーセットは同じ５’上流プライマーまたは同じ３’下流プライマーのいずれか、あるいは５’上流プライマーと同じ３’下流プライマーの両方を含有し、オリゴヌクレオチドプライマー群は与えられた群での全連結反応産物配列の増幅に有用である）；
    該識別後に伸長産物量を定量し；
    未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の１以上のヌクレオチド配列レベルを定量する；
    ことを含む請求項８の方法。
  10. 請求項７の方法において、１つのプライマーが検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応混合物を１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後にこのプライマー５’末に連結し、単鎖を残すアドレス可能アレイ特異的部分を含有するものであり、該方法がさらに、
    相違する特定部位で固定化された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドがアドレス可能アレイ特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を有す）；
    １以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位でアドレス可能アレイ特異的部分を固体支持物に捕捉する（該検出がアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、そして特定部位で個体支持物に固定された伸長産物の存在を表す）；
    ことを含む請求項７の方法。
  11. 請求項１０の方法において、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違する１以上の複数の配列は、定量する複数の標的ヌクレオチド配列を有する未知量のサンプル中に存在し、１つのプライマーが検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応混合物を１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクル処理した後にそのプライマーの５’末に連結し、そして単鎖を残すアドレス可能アレイ特異的部分を含有し、同じ群のオリゴヌクレオチドプライマーが５’上流プライマーか、同じ３’下流プライマーのいずれかを含有し、オリゴヌクレオチドプライマー群が与えられた群の全連結反応産物配列を増幅するのに用い得るものであり、該方法がさらに、
    １以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し；
    １または複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を準備し、各群はマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む２以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し（同じ群のオリゴヌクレオチドプローブセットの１つまたは両方は、同じ５’上流プライマー特異的部分または同じ３’下流プライマー特異的部分のいずれかを含有する）；
    １または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が２以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含有し（同じ群のオリゴヌクレオチドプライマーセットは、同じ５’上流プライマーまたは同じ３’下流プライマーのいずれかを含有し、オリゴヌクレオチドプライマーの１群は群中の全連結反応産物配列の増幅に使用される）；
    マーカー標的ヌクレオチド配列とマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットとを連結反応検出反応混合物に混合し；
    伸長産物量を定量し；
    未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の１以上のヌクレオチド配列レベルを定量する
    ことを含む請求項１０の方法。
  12. 標的ヌクレオチド配列に対して１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の１以上を同定する方法であって、
    複数の配列相違を有する１以上の標的ヌクレオチド配列を有する可能性のあるサンプルを準備し、
    １以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットは（ａ）標的特異的部分と５’上流プライマー特異的部分を保持する第１オリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）標的特異的部分と３’下流プライマー特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプローブを特徴とし（特定セットにおける標的ヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適し、しかし、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするときに、この連結反応を妨害するミスマッチがある）ここで、特定セットの１または両方のオリゴヌクレオチドプローブがデオキシチミジンの代わりにデオキシウラシルを含有し、これによって該オリゴヌクレオチドプローブがウラシルＮ−グリコシラーゼに実質的に感受性となっている；
    リガーゼを準備し；
    サンプル、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物とし；
    リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ（変性処理において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、ハイブリダイゼーション処理により、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していればその夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いに連結して、連結反応産物配列を形成し、この産物配列は、（ａ）５’上流プライマー特異的部分、（ｂ）一緒に結合した標的特異的部分および（ｃ）３’下流プライマー特異的部分を含み、各セットの連結反応産物配列は連結検出反応混合物中の他の核酸と識別可能であり、オリゴヌクレオチドプローブセットはその夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズするが、１以上のミスマッチの存在によって連結せず、そして、次の変性処理の際に個々に分離している）；
    リガーゼ検出反応混合物の１以上のリガーゼ検出反応サイクル処理の後、リガーゼ検出反応混合物を、連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分に相補的な１または複数の下流オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼと混合して、伸長混合物を形成し；
    伸長混合物をハイブリダイズ処理にかけ（下流プライマーは連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長して、連結反応産物配列に相補的な伸長産物を形成する）；
    ポリメラーゼを不活性化し；
    該不活性化後に伸長混合物をウラシルＮ−グリコシラーゼと混合して、ウラシルＮ−グリコシラーゼ消化混合物を形成し；
    伸長混合物を実質的にウラシルＮ−グリコシラーゼ消化にかけて、オリゴヌクレオチドプローブ、連結反応産物配列、およびプライマーとして５’上流プライマーを用いる元の標的からの伸長産物を破壊し、連結反応産物配列からの下流プライマー伸長産物を破壊せず；
    ウラシルＮ−グリコシラーゼを不活性化し；
    連結産物配列の５’上流プライマー特異的部位と相補的な１または複数の上流オリゴヌクレオチドプライマーを準備し、ここで上流オリゴヌクレオチドプライマーまたは下流オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかは、検出可能なレポーター標識を有する；
    該ウラシルＮ−グリコシラーゼ不活性化後にポリメラーゼおよび複数の上流プライマーをウラシルＮ−グリコシラーゼ消化混合物と混合して、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し；
    ポリメラーゼ連鎖反応混合物を１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ、デオキシウラシルの代わりにデオキシチミジンを含むこと以外は実質的に同じ連結反応産物配列である第１サイクルにおいて伸長産物を形成し、続くサイクルにおいて、５’上流プライマーが連結反応産物配列に相補的な伸長産物の５’上流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、３’下流プライマーが伸長処理、連結反応産物配列に実質的に同じ伸長産物配列の３’下流部分にハイブリダイズしそれにより、伸長混合物のウラシルＮ−グリコシラーゼ消化処理が、連結反応産物配列、１または２のオリゴヌクレオチドプローブおよびポリメラーゼ連鎖反応混合物の１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクル処理からの連結反応独立伸長産物の量を減少する；
    レポーターラベルを検出し；および
    伸長産物を識別して、１以上の標的ヌクレオチド配列がサンプル中にあることを確認する
    ことを含む方法。
  13. 請求項１２の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列が、プライマーまたは他の連結反応産物配列と識別し得るユニーク長産物を産生するものであり、該方法がさらに、
    伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離する（該識別がサイズの相違する伸長産物を分別する）；
    ことを含む請求項１２の方法。
  14. 請求項１３の方法において、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違する１以上の複数の配列は定量する複数の標的ヌクレオチド配列を有する未知量のサンプル中に存在するものであり、該方法はさらに、
    １以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し；
    １以上のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプライマーセットを準備し、各セットは、（ａ）標的特異的部分および５’上流プライマー特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブおよび（ｂ）標的特異的部分および３’下流プライマー特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドプローブを特徴とし（特定セットの１または２オリゴヌクレオチドプローブはデオキシチミジンの代わりにデオキシウラシルを含有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブは対応するマーカー標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒の連結反応に適しており、しかし、サンプル中または加えられたマーカー配列中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときは、該連結反応を妨害するミスマッチを有し、該オリゴヌクレオチドプローブセットおよび該マーカー特異的オリゴヌクレオチドセットは複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長産物を産生し、そして同じ群または他の群におけるプローブまたは他の連結反応産物配列と識別され得る）；
    マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出混合物に混合し；
    １または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が２以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含有し（同じ群のオリゴヌクレオチドプライマーセットは同じ５’上流プライマーまたは同じ３’下流プライマーのいずれか、あるいは５’上流プライマーと同じ３’下流プライマーの両方を含有し、オリゴヌクレオチドプライマーの１群は与えられた群での全連結反応産物配列の増幅に使用される）；
    伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離し；
    該識別後に伸長産物量を定量し；
    未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列レベルを定量する；
    ことを含む請求項１３の方法。
  15. 請求項１２の方法において、各プライマーセットにおいて、１つのプライマーが検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応混合物を１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後にこのプライマー５’末に連結し、単鎖を残すアドレス可能アレイ特異的部分を含有するものであり、該方法がさらに、
    相違する特定部位で固定化された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドがアドレス可能アレイ特異的部分に相補的であるヌクレオチド配列を有する）；
    １以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位でアドレス可能アレイ特異的部分を固体支持物に捕捉する（該検出がアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、そして特定部位で固体支持物に固定された伸長産物の存在を表す）；
    ことを含む請求項１２の方法。
  16. 請求項１５の方法において、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違する１以上の複数の配列は定量する複数の標的ヌクレオチド配列を有する未知量のサンプル中に存在するものであり、該方法がさらに、
    １以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し；
    １または複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を準備し、各群はマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む２以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し（特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列は、同じ群または他の群のプローブまたは他の連結反応産物配列と識別される）；
    マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出混合物に混合し；
    １または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が２以上のオリゴヌクレオチドプライマーセットを含有し（同じ群のオリゴヌクレオチドプライマーセットは同じ５’上流プライマーまたは同じ３’下流プライマーのいずれかを含有し、オリゴヌクレオチドプライマーの１群は与えられた群での全連結反応産物配列の増幅に使用される）；
    該識別後に伸長産物量を定量し；
    未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列レベルを定量する；
    ことを含む請求項１５の方法。
  17. 各変性処理が温度８０−１０５℃である、請求項１、７または１２の方法。
  18. 変性処理またはハイブリダイゼーション処理を含むリガーゼ検出反応の各サイクルが３０秒−５分間の長さである、請求項１、７または１２の方法。
  19. リガーゼ検出反応混合物の１以上のリガーゼ検出反応サイクル処理が２−５０サイクルで反復される、請求項１、７または１２の方法。
  20. リガーゼ検出反応混合物の１以上のリガーゼ検出反応サイクル処理についての全時間が１−２５０分である、請求項１、７、または１２の方法。
  21. リガーゼがThermus aquaticusリガーゼ、Thermus thermophilusリガーゼ、E.coliリガーゼ、Ｔ４リガーゼおよびPyrococcusリガーゼからなる群より選ばれる、請求項１、７または１２の方法。
  22. 検出レポーター標識が発色団、蛍光分子、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、燐光性基、放射活性物質、化学ルミネセント分子および電気化学的検出分子からなる群より選ばれる、請求項１、７または１２の方法。
  23. オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分各々がハイブリダイゼーション温度５０−８５℃を有する、請求項１、７または１２の方法。
  24. オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が２０−２８ヌクレオチドの長さである、請求項１、７または１２の方法。
  25. オリゴヌクレオチドプローブセットがリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシヌクレオチド、修飾ホスフェート−糖−骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよびこれらの混合物からなる群より選ばれる、請求項１、７または１２の方法。
JP2008000124A 1996-05-29 2008-01-04 組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出 Expired - Lifetime JP4781372B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1853296P 1996-05-29 1996-05-29
US60/018,532 1996-05-29

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP54287897A Division JP4468488B2 (ja) 1996-05-29 1997-05-27 組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011096201A Division JP5634936B2 (ja) 1996-05-29 2011-04-22 組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2008092959A JP2008092959A (ja) 2008-04-24
JP2008092959A5 JP2008092959A5 (ja) 2010-06-24
JP4781372B2 true JP4781372B2 (ja) 2011-09-28

Family

ID=21788414

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP54287897A Expired - Lifetime JP4468488B2 (ja) 1996-05-29 1997-05-27 組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出
JP2008000124A Expired - Lifetime JP4781372B2 (ja) 1996-05-29 2008-01-04 組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出
JP2011096201A Expired - Lifetime JP5634936B2 (ja) 1996-05-29 2011-04-22 組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP54287897A Expired - Lifetime JP4468488B2 (ja) 1996-05-29 1997-05-27 組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011096201A Expired - Lifetime JP5634936B2 (ja) 1996-05-29 2011-04-22 組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出

Country Status (6)

Country Link
US (18) US6027889A (ja)
EP (3) EP2369007B1 (ja)
JP (3) JP4468488B2 (ja)
AU (1) AU730633B2 (ja)
CA (1) CA2255774C (ja)
WO (1) WO1997045559A1 (ja)

Families Citing this family (853)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6955915B2 (en) 1989-06-07 2005-10-18 Affymetrix, Inc. Apparatus comprising polymers
US6919211B1 (en) 1989-06-07 2005-07-19 Affymetrix, Inc. Polypeptide arrays
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US6652808B1 (en) * 1991-11-07 2003-11-25 Nanotronics, Inc. Methods for the electronic assembly and fabrication of devices
CA2130562A1 (en) * 1992-02-19 1993-09-02 Alexander B. Chetverin Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids
US5710000A (en) * 1994-09-16 1998-01-20 Affymetrix, Inc. Capturing sequences adjacent to Type-IIs restriction sites for genomic library mapping
USRE43097E1 (en) 1994-10-13 2012-01-10 Illumina, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
WO1998053300A2 (en) 1997-05-23 1998-11-26 Lynx Therapeutics, Inc. System and apparaus for sequential processing of analytes
US6852487B1 (en) 1996-02-09 2005-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US20020150921A1 (en) * 1996-02-09 2002-10-17 Francis Barany Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US6881571B1 (en) * 1998-03-11 2005-04-19 Exonhit Therapeutics S.A. Qualitative differential screening
US6458530B1 (en) 1996-04-04 2002-10-01 Affymetrix Inc. Selecting tag nucleic acids
CA2255599C (en) 1996-04-25 2006-09-05 Bioarray Solutions, Llc Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
EP2369007B1 (en) * 1996-05-29 2015-07-29 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US6312892B1 (en) * 1996-07-19 2001-11-06 Cornell Research Foundation, Inc. High fidelity detection of nucleic acid differences by ligase detection reaction
AU4220597A (en) * 1996-09-13 1998-04-02 Laboratory Of Molecular Biophotonics Solid phase for target nucleic acid detection, process for production thereof, and method of target nucleic acid detection
GB9624165D0 (en) * 1996-11-19 1997-01-08 Amdex A S Use of nucleic acids bound to carrier macromolecules
CA2276462C (en) * 1996-12-31 2007-06-12 Genometrix Incorporated Multiplexed molecular analysis system apparatus and method
US6327410B1 (en) 1997-03-14 2001-12-04 The Trustees Of Tufts College Target analyte sensors utilizing Microspheres
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US20030027126A1 (en) 1997-03-14 2003-02-06 Walt David R. Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
WO1998044151A1 (en) 1997-04-01 1998-10-08 Glaxo Group Limited Method of nucleic acid amplification
US6143496A (en) * 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
US6607878B2 (en) 1997-10-06 2003-08-19 Stratagene Collections of uniquely tagged molecules
US7115884B1 (en) 1997-10-06 2006-10-03 Trustees Of Tufts College Self-encoding fiber optic sensor
US7348181B2 (en) 1997-10-06 2008-03-25 Trustees Of Tufts College Self-encoding sensor with microspheres
GB9725197D0 (en) * 1997-11-29 1998-01-28 Secr Defence Detection system
US7569342B2 (en) 1997-12-10 2009-08-04 Sierra Molecular Corp. Removal of molecular assay interferences
US20030039967A1 (en) * 1997-12-19 2003-02-27 Kris Richard M. High throughput assay system using mass spectrometry
US20030096232A1 (en) * 1997-12-19 2003-05-22 Kris Richard M. High throughput assay system
US20100105572A1 (en) * 1997-12-19 2010-04-29 Kris Richard M High throughput assay system
US20020177144A1 (en) * 1997-12-30 2002-11-28 Jose Remacle Detection and/or quantification method of a target molecule by a binding with a capture molecule fixed on the surface of a disc
US20050053962A1 (en) * 1998-01-27 2005-03-10 Gary Blackburn Amplification of nucleic acids with electronic detection
US6759192B1 (en) * 1998-06-05 2004-07-06 Genset S.A. Polymorphic markers of prostate carcinoma tumor antigen-1(PCTA-1)
CA2335951C (en) 1998-06-24 2013-07-30 Mark S. Chee Decoding of array sensors with microspheres
US20040203078A1 (en) * 1998-07-22 2004-10-14 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Labeled complex, process for producing same and process for utilizing same
US6703228B1 (en) 1998-09-25 2004-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to genotyping and DNA analysis
EP1001037A3 (en) * 1998-09-28 2003-10-01 Whitehead Institute For Biomedical Research Pre-selection and isolation of single nucleotide polymorphisms
US6949370B1 (en) 1998-10-30 2005-09-27 Cornell Research Foundation, Inc. High fidelity thermostable ligase and uses thereof
ATE250784T1 (de) * 1998-11-27 2003-10-15 Synaptics Uk Ltd Positionssensor
CA2365125A1 (en) 1999-03-15 2000-09-21 Paul D. Grossman Probe/mobility modifier complexes for multiplex nucleic acid detection
US6506594B1 (en) * 1999-03-19 2003-01-14 Cornell Res Foundation Inc Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
EP1165838B1 (en) * 1999-03-19 2006-10-11 Cornell Research Foundation, Inc. Coupled polymerase chain reaction-restriction endonuclease digestion-ligase detection reaction process
US7014994B1 (en) 1999-03-19 2006-03-21 Cornell Research Foundation,Inc. Coupled polymerase chain reaction-restriction-endonuclease digestion-ligase detection reaction process
US20030215821A1 (en) * 1999-04-20 2003-11-20 Kevin Gunderson Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US20060275782A1 (en) 1999-04-20 2006-12-07 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
US6355431B1 (en) 1999-04-20 2002-03-12 Illumina, Inc. Detection of nucleic acid amplification reactions using bead arrays
US20030096321A1 (en) * 1999-05-19 2003-05-22 Jose Remacle Method for the identification and/or the quantification of a target compound obtained from a biological sample upon chips
US7056661B2 (en) * 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
CA2374390A1 (en) * 1999-05-20 2000-12-14 Illumina, Inc. Combinatorial decoding of random nucleic acid arrays
US6544732B1 (en) * 1999-05-20 2003-04-08 Illumina, Inc. Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals
US8481268B2 (en) 1999-05-21 2013-07-09 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
US8080380B2 (en) * 1999-05-21 2011-12-20 Illumina, Inc. Use of microfluidic systems in the detection of target analytes using microsphere arrays
JP3911909B2 (ja) * 1999-06-09 2007-05-09 株式会社日立製作所 Ｄｎａ試料調製方法及びｄｎａ試料調製装置
US20020119448A1 (en) * 1999-06-23 2002-08-29 Joseph A. Sorge Methods of enriching for and identifying polymorphisms
ATE409236T1 (de) * 1999-07-14 2008-10-15 Packard Bioscience Company Derivatisierte nukleinsäuren und deren verwendung
US6964847B1 (en) 1999-07-14 2005-11-15 Packard Biosciences Company Derivative nucleic acids and uses thereof
US7482443B2 (en) * 2000-03-09 2009-01-27 Genetag Technology, Inc. Systems and methods to quantify and amplify both signaling probes for cDNA chips and genes expression microarrays
US6692915B1 (en) 1999-07-22 2004-02-17 Girish N. Nallur Sequencing a polynucleotide on a generic chip
ATE542916T1 (de) 1999-08-18 2012-02-15 Illumina Inc Methoden zur erzeugung von oligonukleotidlösungen
KR20070112295A (ko) * 1999-09-10 2007-11-22 제론 코포레이션 올리고뉴클레오티드 엔3'→피5' 티오포스포라미데이트,이의 합성 및 용도
US6692918B2 (en) * 1999-09-13 2004-02-17 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
CN102586228A (zh) 1999-09-13 2012-07-18 纽亘技术公司 用于多核苷酸序列线性等温扩增的方法及组合物
FR2798673B1 (fr) * 1999-09-16 2004-05-28 Exonhit Therapeutics Sa Methodes et compositions pour la detection d'evenements pathologiques
EP1136568A4 (en) * 1999-10-04 2004-12-15 Olympus Optical Corp Ltd METHOD FOR DETERMINING NUCLEIC ACID
JP3668075B2 (ja) * 1999-10-12 2005-07-06 光夫 板倉 遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰｓ高速スコアリング方法
WO2001055454A1 (en) * 2000-01-28 2001-08-02 Althea Technologies, Inc. Methods for analysis of gene expression
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US20050214825A1 (en) * 2000-02-07 2005-09-29 John Stuelpnagel Multiplex sample analysis on universal arrays
US8076063B2 (en) * 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7611869B2 (en) 2000-02-07 2009-11-03 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US7361488B2 (en) 2000-02-07 2008-04-22 Illumina, Inc. Nucleic acid detection methods using universal priming
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US6913884B2 (en) * 2001-08-16 2005-07-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for repetitive use of genomic DNA
AU3806701A (en) 2000-02-07 2001-08-14 Illumina Inc Nucleic acid detection methods using universal priming
DE60136166D1 (de) * 2000-02-07 2008-11-27 Illumina Inc Nukleinsäure-nachweisverfahren mit universellem priming
US20020039728A1 (en) * 2000-02-10 2002-04-04 Robert Kain Alternative substrates and formats for bead-based array of arrays
US6770441B2 (en) * 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
EP1130113A1 (en) * 2000-02-15 2001-09-05 Johannes Petrus Schouten Multiplex ligation dependent amplification assay
DE60136335D1 (de) 2000-02-16 2008-12-11 Illumina Inc Parallele genotypisierung mehrerer patientenproben
DE10010281B4 (de) * 2000-02-25 2005-03-10 Epigenomics Ag Ligase/Polymerase-Verfahren zur Detektion von Cytosin-Methylierung in DNA Proben
US6368801B1 (en) 2000-04-12 2002-04-09 Molecular Staging, Inc. Detection and amplification of RNA using target-mediated ligation of DNA by RNA ligase
JP5508654B2 (ja) 2000-04-14 2014-06-04 コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド リガーゼ検出反応を用いた核酸配列の違いの検出のための位置特定可能なアレイの設計方法
WO2001085987A1 (en) * 2000-05-09 2001-11-15 Diatech Pty. Ltd. Methods for identifying polynucleotide repeat regions of defined length
CA2410950A1 (en) * 2000-05-30 2001-12-06 Hans-Michael Wenz Methods for detecting target nucleic acids using coupled ligation and amplification
US7087414B2 (en) 2000-06-06 2006-08-08 Applera Corporation Methods and devices for multiplexing amplification reactions
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
AU7299301A (en) * 2000-06-21 2002-01-02 Bioarray Solutions Ltd Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
US7846733B2 (en) * 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
EP1356094B1 (en) * 2000-06-26 2010-01-13 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
CA2412915C (en) * 2000-07-01 2009-04-21 Clondiag Chip Technologies Gmbh Method for qualitative and/or quantitative detection of molecular interactions on probe arrays
US6511810B2 (en) * 2000-07-03 2003-01-28 Applera Corporation Polynucleotide sequence assay
JP4310599B2 (ja) * 2000-07-05 2009-08-12 東洋紡績株式会社 塩基多型を検出する方法
WO2002002811A2 (fr) * 2000-07-06 2002-01-10 Bio Merieux Procede de controle de la qualite microbiologique d'un milieu aqueux et necessaire approprie
US20050260574A1 (en) * 2000-07-27 2005-11-24 Gibbs Mark J Combinatorial probes and uses therefor
AU2001285155A1 (en) * 2000-08-21 2002-03-04 Lynx Therapeutics, Inc. Polymorphic dna fragments and uses thereof
EP1978110B1 (en) * 2000-09-06 2010-05-26 Transnetyx, Inc. Computer-based method and system for screening genomic DNA
US20050272085A1 (en) * 2000-09-06 2005-12-08 Hodge Timothy A Methods for forensic and congenic screening
US20050239125A1 (en) * 2000-09-06 2005-10-27 Hodge Timothy A Methods for genotype screening
US20030207289A1 (en) * 2001-09-04 2003-11-06 Hodge Timothy A. Detection of genetic sequences using a bipartite probe
US20040185464A1 (en) * 2000-09-15 2004-09-23 Kris Richard M. High throughput assay system
DE10048944A1 (de) * 2000-10-03 2002-04-18 Andreas Kage Verfahren zur Selektion hochaffin an ein Target bindender Nukleinsäuren durch zweidimensionale Auftrennung
CA2426824A1 (en) 2000-10-24 2002-07-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Direct multiplex characterization of genomic dna
US20040018491A1 (en) * 2000-10-26 2004-01-29 Kevin Gunderson Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
DE60140563D1 (de) * 2000-11-30 2009-12-31 Boston Probes Inc Verfahren und zusammensetzungen zum aussortieren und/oder nachweis von mikroorganismen
WO2002048402A2 (en) * 2000-12-13 2002-06-20 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof
US6312929B1 (en) * 2000-12-22 2001-11-06 Cepheid Compositions and methods enabling a totally internally controlled amplification reaction
WO2002053778A2 (en) * 2001-01-05 2002-07-11 Genomicfx, Inc. Method for relative quantification of attached nucleic acids
FI115139B (fi) * 2001-01-10 2005-03-15 Valtion Teknillinen Menetelmä ja testipakkaus solu- tai kudosnäytteissä olevien polynukleotidien määrässä tapahtuvien vaihteluiden kvantitatiiviseen ja/tai vertailevaan arvioimiseen
EP1229128A1 (en) * 2001-01-31 2002-08-07 Boehringer Mannheim Gmbh New method for genotype determination
WO2002064743A2 (en) * 2001-02-12 2002-08-22 Rosetta Inpharmatics, Inc. Confirming the exon content of rna transcripts by pcr using primers complementary to each respective exon
WO2003012147A1 (en) * 2001-02-20 2003-02-13 Datascope Investment Corp. Method for reusing standard blots and microarrays utilizing dna dendrimer technology
CA2439074A1 (en) * 2001-03-09 2002-09-19 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for amplification of rna sequences
EP1366197B1 (en) 2001-03-09 2007-05-09 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for amplification of rna sequences
EP1247815A3 (en) * 2001-03-25 2003-01-29 Exiqon A/S Modified oligonucleotides and uses thereof
US7029919B2 (en) * 2001-05-04 2006-04-18 Agilent Technologies, Inc. Electro-optical device and methods for hybridization and detection
US20030104421A1 (en) * 2001-05-07 2003-06-05 Colangelo Christopher M. Methods and compositions for nucleic acid amplification
WO2004059289A2 (en) * 2001-05-22 2004-07-15 Epicentre Technologies Target-dependent transcription using deletion mutants of n4 rna polymerase
GB0112868D0 (en) * 2001-05-25 2001-07-18 Secr Defence Detection system
DE10126630A1 (de) * 2001-05-31 2003-01-09 Peter Und Traudl Engelhorn Sti Verfahren zur Zellsortierung
WO2002101358A2 (en) * 2001-06-11 2002-12-19 Illumina, Inc. Multiplexed detection methods
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
NZ530343A (en) * 2001-06-22 2007-01-26 Marshfield Clinic Methods and oligonucleotides for the detection of E. coli 0157:H7
US20030170695A1 (en) * 2001-06-29 2003-09-11 Liang Shi Enzymatic ligation-based identification of nucleotide sequences
US20030082584A1 (en) * 2001-06-29 2003-05-01 Liang Shi Enzymatic ligation-based identification of transcript expression
US7473767B2 (en) 2001-07-03 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Methods for detection and quantification of analytes in complex mixtures
AU2002327236A1 (en) * 2001-07-12 2003-01-29 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
AU2002365115A1 (en) * 2001-07-20 2003-09-02 North Carolina State University Light addressable electrochemical detection of duplex structures
WO2003020983A1 (en) * 2001-08-30 2003-03-13 Virginia Commonwealth University Allele specific pcr for genotyping
US20060014186A1 (en) * 2001-09-04 2006-01-19 Hodge Timothy A Methods for genotype screening of a strain disposed on an adsorbent carrier
US7153656B2 (en) * 2001-09-11 2006-12-26 Los Alamos National Security, Llc Nucleic acid sequence detection using multiplexed oligonucleotide PCR
AU2002336613A1 (en) * 2001-09-18 2003-04-01 U.S. Genomics, Inc. Differential tagging of polymers for high resolution linear analysis
WO2003027259A2 (en) * 2001-09-26 2003-04-03 Epigenx Pharmaceuticals, Inc. Assays for dna methylation changes
ES2712173T3 (es) * 2001-10-15 2019-05-09 Bioarray Solutions Ltd Análisis multiplexado de loci polimórficos mediante consulta simultánea y detección mediada por enzimas
US20070264641A1 (en) * 2001-10-15 2007-11-15 Li Alice X Multiplexed analysis of polymorphic loci by concurrent interrogation and enzyme-mediated detection
JP3829690B2 (ja) * 2001-10-30 2006-10-04 株式会社日立製作所 核酸配列の検査方法
US20110151438A9 (en) 2001-11-19 2011-06-23 Affymetrix, Inc. Methods of Analysis of Methylation
WO2003044216A2 (en) 2001-11-19 2003-05-30 Parallele Bioscience, Inc. Multiplex oligonucleotide addition and target amplification
EP1319718A1 (en) * 2001-12-14 2003-06-18 Keygene N.V. High throughput analysis and detection of multiple target sequences
WO2003054167A2 (en) * 2001-12-20 2003-07-03 Merck & Co., Inc. Identification of novel polymorphic sites in the human mglur8 gene and uses thereof
AU2002358353A1 (en) * 2001-12-28 2003-07-30 Keygene N.V. Discrimination and detection of target nucleotide sequences using mass spectrometry
EP1327682B1 (de) * 2002-01-11 2009-05-13 BioSpring Gesellschaft für Biotechnologie mbH Verfahren zur Herstellung von DNA
DE10201463B4 (de) 2002-01-16 2005-07-21 Clondiag Chip Technologies Gmbh Reaktionsgefäß zur Durchführung von Array-Verfahren
DE60324253D1 (de) * 2002-02-08 2008-12-04 Olympus Corp Spezifische multiplex-analyse von nukleinsäuren
WO2003069333A1 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Illumina, Inc. Automated information processing in randomly ordered arrays
AU2003220254B2 (en) * 2002-03-13 2008-09-18 Syngenta Participations, Ag. Nucleic acid detection method
US7081339B2 (en) * 2002-04-12 2006-07-25 Primera Biosystems, Inc. Methods for variation detection
DE10220935B3 (de) * 2002-05-10 2004-02-05 Siemens Ag Verfahren für die biochemische Analytik von DNA und zugehörige Anordnung
AU2003241620A1 (en) * 2002-05-24 2003-12-12 Cygene, Inc. Parallel stranded duplexes of deoxyribonucleic acid and methods of use
JP2005527220A (ja) * 2002-05-28 2005-09-15 ユー．エス． ジェノミクス， インコーポレイテッド 単一のポリマー分析を使用する方法および装置
CA2489022C (en) * 2002-06-12 2012-10-16 Genencor International, Inc. Methods for improving a binding characteristic of a molecule
FI20021325A0 (fi) * 2002-07-05 2002-07-05 Valtion Teknillinen Menetelmä ja reagenssipakkaus yksittäisten polynukleotidien määrän määrittämiseksi
US7192700B2 (en) * 2002-12-20 2007-03-20 Orchid Cellmark Inc. Methods and compositions for conducting primer extension and polymorphism detection reactions
CA2498713A1 (en) * 2002-09-17 2004-04-01 Richard Abraham Joseph Real-time detection of nucleic acid reactions
JP2006500034A (ja) * 2002-09-19 2006-01-05 アプレラ コーポレイション 標的を検出するための方法および組成物
CA2499077A1 (en) * 2002-09-19 2004-04-01 Applera Corporation Methods and composition for detecting targets
US20040259105A1 (en) * 2002-10-03 2004-12-23 Jian-Bing Fan Multiplex nucleic acid analysis using archived or fixed samples
GB0223563D0 (en) * 2002-10-10 2002-11-20 Secr Defence Detection system
US20040235005A1 (en) * 2002-10-23 2004-11-25 Ernest Friedlander Methods and composition for detecting targets
EP1558756A4 (en) * 2002-10-23 2006-09-27 Applera Corp METHODS AND COMPOSITION FOR TARGET DETECTION
US7526114B2 (en) 2002-11-15 2009-04-28 Bioarray Solutions Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
WO2004046344A2 (en) * 2002-11-19 2004-06-03 Applera Corporation Polynucleotide sequence detection assays
EP1572974A2 (en) * 2002-11-19 2005-09-14 Applera Corporation Polynucleotide sequence detection assays and analysis
GB2395557A (en) * 2002-11-22 2004-05-26 Dynal Biotech Ltd Nucleic acid probes
WO2004051218A2 (en) 2002-12-04 2004-06-17 Applera Corporation Multiplex amplification of polynucleotides
EP1578952B1 (en) * 2002-12-12 2011-11-23 Nanosphere, Inc. Direct snp detection with unamplified dna
US8206904B2 (en) 2002-12-18 2012-06-26 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acids
US7851150B2 (en) * 2002-12-18 2010-12-14 Third Wave Technologies, Inc. Detection of small nucleic acids
EP1608952B1 (en) 2002-12-20 2016-08-10 Life Technologies Corporation Assay apparatus and method using microfluidic arrays
EP1583771B1 (en) 2002-12-20 2013-04-03 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with myocardial infarction, methods of detection and uses thereof
US20060094108A1 (en) * 2002-12-20 2006-05-04 Karl Yoder Thermal cycler for microfluidic array assays
US9487823B2 (en) * 2002-12-20 2016-11-08 Qiagen Gmbh Nucleic acid amplification
US20040180369A1 (en) * 2003-01-16 2004-09-16 North Carolina State University Photothermal detection of nucleic acid hybridization
WO2004065000A1 (en) 2003-01-21 2004-08-05 Illumina Inc. Chemical reaction monitor
US6943768B2 (en) 2003-02-21 2005-09-13 Xtellus Inc. Thermal control system for liquid crystal cell
US8043834B2 (en) * 2003-03-31 2011-10-25 Qiagen Gmbh Universal reagents for rolling circle amplification and methods of use
DE10315074A1 (de) 2003-04-02 2004-10-14 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren
JP2006523465A (ja) 2003-04-14 2006-10-19 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド ランダムにプライミングされる複合プライマーを用いる大規模増幅
WO2004094653A2 (en) * 2003-04-22 2004-11-04 Irm Llc Differential tag length analysis of cell proliferation
US20040229269A1 (en) * 2003-05-15 2004-11-18 Ghazala Hashmi Hybridization-mediated analysis of polymorphisms
DE10323685A1 (de) * 2003-05-22 2004-12-09 Rühe, Jürgen, Prof. Dr. Verfahren zur kovalenten Immobilisierung von Sonden-Biomolekülen an organischen Oberflächen
ES2284021T3 (es) * 2003-06-02 2007-11-01 Check-Points Holding B.V. Procedimiento rapido para detectar microorganismos en muestras de alimentos.
WO2005001129A2 (en) * 2003-06-06 2005-01-06 Applera Corporation Mobility cassettes
US7799525B2 (en) 2003-06-17 2010-09-21 Human Genetic Signatures Pty Ltd. Methods for genome amplification
WO2005001113A2 (en) * 2003-06-27 2005-01-06 Thomas Jefferson University Methods for detecting nucleic acid variations
KR100683025B1 (ko) * 2003-06-30 2007-02-15 마츠시타 덴끼 산교 가부시키가이샤 뉴클레오티드쇄 수식방법
US20100291637A1 (en) * 2003-06-30 2010-11-18 Panasonic Corporation Method for modifying nucleotide chain
CN1580283A (zh) * 2003-08-13 2005-02-16 清华大学 一种检测核酸分子的方法
GB0319949D0 (en) * 2003-08-26 2003-09-24 Univ Strathclyde Nucleic acid sequence identification
ES2539784T3 (es) * 2003-09-02 2015-07-06 Keygene N.V. Procedimientos basados en OLA para la detección de secuencias de ácidos nucleicos objetivo
DE602004018801D1 (de) 2003-09-04 2009-02-12 Human Genetic Signatures Pty Nukleinsäurenachweistest
WO2005026329A2 (en) * 2003-09-12 2005-03-24 Cornell Research Foundation, Inc. Methods for identifying target nucleic acid molecules
US7927796B2 (en) * 2003-09-18 2011-04-19 Bioarray Solutions, Ltd. Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers
CN1882699A (zh) 2003-09-22 2006-12-20 佰尔瑞溶液有限公司 带有多个能共价结合生物分子的官能基团的表面固定化多电解质
EP1692298A4 (en) 2003-10-28 2008-08-13 Bioarray Solutions Ltd OPTIMIZATION OF GENE EXPRESSION ANALYSIS USING IMMOBILIZED CATCHES
WO2005045059A2 (en) * 2003-10-28 2005-05-19 Bioarray Solutions Ltd. Allele assignment and probe selection in multiplexed assays of polymorphic targets
JP2007509629A (ja) 2003-10-29 2007-04-19 バイオアレイ ソリューションズ リミテッド 二本鎖ｄｎａの切断による複合核酸分析
WO2005042783A1 (en) * 2003-10-30 2005-05-12 North Carolina State University Temperature-jump enhanced electrochemical detection of nucleic acid hybridization
WO2005042785A1 (en) * 2003-10-30 2005-05-12 North Carolina State University Electrochemical detection of nucleic acid hybridization
EP2405023B1 (en) 2003-11-26 2014-01-08 Celera Corporation Genetic Polymorphisms Associated with Cardiovascular Disorders and Drug Response, Methods of Detection and Uses Thereof
US20050130213A1 (en) * 2003-12-10 2005-06-16 Tom Morrison Selective ligation and amplification assay
US7582430B2 (en) * 2004-01-20 2009-09-01 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Immunoliposome-nucleic acid amplification (ILNAA) assay
DE102004003860A1 (de) 2004-01-26 2005-08-18 Clondiag Chip Technologies Gmbh Verfahren zur Geno- und Pathotypisierung von Pseudomonas aeruginosa
EP1561823A1 (de) * 2004-02-04 2005-08-10 Biotez Berlin-Buch GmbH Verfahren zum Nachweis von Einzelnukleotid-polymorphismen (SNP) in Genen des Arzneimittelmetabolismus und Testkit zur Durchführung des Verfahrens
AU2005213318B2 (en) * 2004-02-10 2010-06-10 Cornell Research Foundation, Inc. Method for detection of promoter methylation status
US7250260B2 (en) * 2004-02-18 2007-07-31 Applera Corporation Multi-step bioassays on modular microfluidic application platforms
EP1753873A4 (en) * 2004-03-05 2008-11-05 Ohio Med College METHOD AND COMPOSITIONS FOR THE ASSESSMENT OF NUCLEIC ACIDS AND ALLELES
US8679788B2 (en) 2004-03-22 2014-03-25 The Johns Hopkins University Methods for the detection of nucleic acid differences
US7601821B2 (en) * 2004-03-24 2009-10-13 Applied Biosystems, Llc Encoding and decoding reactions for determining target molecules
EP1745157A4 (en) * 2004-04-12 2008-06-11 Ohio Med College METHOD AND COMPOSITIONS FOR TESTING ANALYTES
US8168777B2 (en) 2004-04-29 2012-05-01 Human Genetic Signatures Pty. Ltd. Bisulphite reagent treatment of nucleic acid
US20050282195A1 (en) * 2004-04-30 2005-12-22 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for (MIS)ligating oligonucleotides
US7364855B2 (en) * 2004-04-30 2008-04-29 Applera Corporation Methods and kits for methylation detection
DE102004022263A1 (de) 2004-05-06 2005-12-15 Clondiag Chip Technologies Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen
DE102005052713A1 (de) 2005-11-04 2007-05-16 Clondiag Chip Tech Gmbh Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von molekularen Wechselwirkungen
US7820380B2 (en) 2004-05-07 2010-10-26 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with liver fibrosis
US7622281B2 (en) * 2004-05-20 2009-11-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for clonal amplification of nucleic acid
US7575863B2 (en) 2004-05-28 2009-08-18 Applied Biosystems, Llc Methods, compositions, and kits comprising linker probes for quantifying polynucleotides
WO2005118871A1 (en) * 2004-05-28 2005-12-15 The Arizona Board Of Regents Surface plasmon resonance sensor for detecting changes in polynucleotides mass
US7785843B2 (en) * 2004-06-23 2010-08-31 Sequenom, Inc. Target-specific compomers and methods of use
EP1761637A2 (en) * 2004-06-30 2007-03-14 Applera Corporation Methods reaction mixtures and kits for ligating polynucleotides
US7363170B2 (en) * 2004-07-09 2008-04-22 Bio Array Solutions Ltd. Transfusion registry network providing real-time interaction between users and providers of genetically characterized blood products
CN101087890A (zh) * 2004-07-26 2007-12-12 帕拉列勒生物科学公司 多个基因组的同时分析
DE102004037081A1 (de) * 2004-07-30 2006-03-23 Universität Bremen Verfahren zum Analysieren von Proben mittels einer Hybridisierung
DE112005001815A5 (de) * 2004-07-30 2007-06-14 Universität Bremen Verfahren zum Analysieren von Proben mittels einer Hybridisierung
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
EP1623996A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-08 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Improved method of selecting a desired protein from a library
US20060040258A1 (en) * 2004-08-23 2006-02-23 Huiyan Guo Water-soluble conjugates and methods of preparation
ATE476439T1 (de) 2004-09-10 2010-08-15 Human Genetic Signatures Pty Amplifikationsblocker umfassend interkalierende nukleinsäuren (ina) enthaltend interkalierende pseudonukleotide (ipn)
WO2006034387A1 (en) 2004-09-21 2006-03-30 Applera Corporation TWO-COLOR REAL-TIME/END-POINT QUANTITATION OF MICRORNAS (miRNAs)
ES2301268B1 (es) * 2004-10-25 2009-05-01 Centro De Investigacion Biomolecular Aplicada Salamanca, S.L. Empleo del gen slug, o de sus productos de replicacion, transcripcion o expresion, en la identificacion, diagnostico, prevencion o tratamiento de la diseminacion del cancer y/o desarrollo de metastasis.
WO2006059769A1 (ja) * 2004-12-03 2006-06-08 Aichi Prefecture 悪性リンパ腫の診断及び予後診断の方法
JP5116481B2 (ja) 2004-12-03 2013-01-09 ヒューマン ジェネティック シグネチャーズ ピーティーワイ リミテッド シトシンの化学修飾により微生物核酸を簡素化するための方法
US20060134650A1 (en) * 2004-12-21 2006-06-22 Illumina, Inc. Methylation-sensitive restriction enzyme endonuclease method of whole genome methylation analysis
WO2006071582A2 (en) * 2004-12-29 2006-07-06 Applera Corporation Methods, compositions, and kits for forming self-complementary polynucleotides
US20060211024A1 (en) * 2005-03-10 2006-09-21 Gwc Technologies Incorporated Methods for analysis of a nucleic acid sample
EP2113572B1 (en) 2005-03-11 2012-12-05 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with coronary heart disease, methods of detection and uses thereof
US20060205090A1 (en) * 2005-03-14 2006-09-14 Newton Michael W Water-soluble conjugates for electrochemical detection
US20070026423A1 (en) * 2005-03-16 2007-02-01 Thomas Koehler Method and test kit for the detection of target nucleic acids
EP1863908B1 (de) * 2005-04-01 2010-11-17 Qiagen GmbH Reverse transkription und amplifikation von rna bei simultaner degradierung von dna
US20060246463A1 (en) * 2005-04-20 2006-11-02 Vevea Dirk N Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes
US20060240442A1 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 Vevea Dirk N Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes
US20070009925A1 (en) * 2005-05-05 2007-01-11 Applera Corporation Genomic dna sequencing methods and kits
EP1883707B1 (en) 2005-05-26 2014-04-09 Human Genetic Signatures PTY Ltd Isothermal strand displacement amplification using primers containing a non-regular base
EP1896617B1 (en) * 2005-05-31 2013-01-02 Life Technologies Corporation Multiplex amplification of short nucleic acids
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
US20060276220A1 (en) * 2005-06-03 2006-12-07 Judith Schure Cell phone case with magnifier and method
US20070065844A1 (en) * 2005-06-08 2007-03-22 Massachusetts Institute Of Technology Solution-based methods for RNA expression profiling
US20070087360A1 (en) * 2005-06-20 2007-04-19 Boyd Victoria L Methods and compositions for detecting nucleotides
EP1913159B1 (en) * 2005-06-30 2010-12-01 GE Healthcare Bio-Sciences Corp. Detection method for gene expression
US7977108B2 (en) * 2005-07-25 2011-07-12 Roche Molecular Systems, Inc. Method for detecting a mutation in a repetitive nucleic acid sequence
US20070065847A1 (en) * 2005-08-11 2007-03-22 Affymetrix, Inc. Degeneratively Labeled Probes
ATE532878T1 (de) * 2005-08-24 2011-11-15 Life Technologies Corp Verfahren zur quantifizierung von sirnas, mirnas und polymorphen mirnas
EP1929046B1 (en) 2005-09-07 2012-07-11 Nugen Technologies, Inc. Improved nucleic acid amplification procedure
EP1762627A1 (de) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion
EP1762628B1 (en) * 2005-09-13 2008-03-12 Eppendorf Array Technologies SA Detection method of homologous sequences differing by one base on a microarray
ATE531820T1 (de) 2005-09-14 2011-11-15 Human Genetic Signatures Pty Gesundheitszustandstest
US7799530B2 (en) 2005-09-23 2010-09-21 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with cardiovascular disorders and drug response, methods of detection and uses thereof
US20070141604A1 (en) * 2005-11-15 2007-06-21 Gormley Niall A Method of target enrichment
WO2007065025A2 (en) * 2005-11-29 2007-06-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of dna analysis using micro/nanochannel
US20100009373A1 (en) * 2005-12-23 2010-01-14 Perkinelmer Health Sciences, Inc. Methods and compositions relating to multiplex genomic gain and loss assays
US7932037B2 (en) * 2007-12-05 2011-04-26 Perkinelmer Health Sciences, Inc. DNA assays using amplicon probes on encoded particles
US20090104613A1 (en) * 2005-12-23 2009-04-23 Perkinelmer Las, Inc. Methods and compositions relating to multiplexed genomic gain and loss assays
JP6148428B2 (ja) * 2005-12-23 2017-06-14 パーキンエルマー エルエーエス， インコーポレイテッド コードされた多重粒子での比較ゲノムハイブリダイゼーション
ATE525482T1 (de) * 2005-12-23 2011-10-15 Nanostring Technologies Inc Nanoreporter und verfahren zu deren herstellung und verwendung
EP2363205A3 (en) 2006-01-11 2014-06-04 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic Devices And Methods Of Use In The Formation And Control Of Nanoreactors
WO2007083766A1 (ja) 2006-01-20 2007-07-26 Olympus Corporation 分子内プローブによる核酸配列の検出方法
ATE541057T1 (de) 2006-02-13 2012-01-15 Us Gov Health & Human Serv Primer und sonden für den nachweis und die unterscheidung von typen und subtypen des influenzavirus
US20070196832A1 (en) * 2006-02-22 2007-08-23 Efcavitch J William Methods for mutation detection
WO2007101075A2 (en) * 2006-02-22 2007-09-07 Applera Corporation Double-ligation method for haplotype and large-scale polymorphism detection
DK1991698T3 (en) * 2006-03-01 2014-03-10 Keygene Nv "High-throughput" -sekvensbaseret detection of SNPs using ligeringsassays
US8673567B2 (en) * 2006-03-08 2014-03-18 Atila Biosystems, Inc. Method and kit for nucleic acid sequence detection
US7702468B2 (en) 2006-05-03 2010-04-20 Population Diagnostics, Inc. Evaluating genetic disorders
US10522240B2 (en) 2006-05-03 2019-12-31 Population Bio, Inc. Evaluating genetic disorders
DE102006020885A1 (de) * 2006-05-05 2007-11-08 Qiagen Gmbh Einführung von Sequenzelementen in Nukleinsäuren
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
EP3782722B1 (en) 2006-05-11 2022-07-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic devices
US7833716B2 (en) 2006-06-06 2010-11-16 Gen-Probe Incorporated Tagged oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification methods
US20080044822A1 (en) * 2006-08-21 2008-02-21 Gafur Zainiev Nucleic acid array with releaseable nucleic acid probes
US20090286694A1 (en) * 2006-08-21 2009-11-19 Gafur Zainiev Nucleic acid array with releaseable nucleic acid probes
US20080044821A1 (en) * 2006-08-21 2008-02-21 Gafur Zainiev Nucleic acid array having fixed nucleic acid anti-probes and complementary free nucleic acid probes
US20100056388A1 (en) * 2006-08-21 2010-03-04 Cnvgenes, Inc. Nucleic acid array having fixed nucleic acid anti-probes and complementary free nucleic acid probes
US20080050724A1 (en) * 2006-08-24 2008-02-28 Microfluidic Systems, Inc. Method of detecting one or more limited copy targets
JP2008072950A (ja) * 2006-09-21 2008-04-03 Sysmex Corp 変換処理の確認方法及びこれに用いられる核酸分子
WO2008045158A1 (en) * 2006-10-10 2008-04-17 Illumina, Inc. Compositions and methods for representational selection of nucleic acids fro complex mixtures using hybridization
US20080090238A1 (en) * 2006-10-12 2008-04-17 Dan-Hui Dorothy Yang Increased sensitivity of proximity ligation assays
CA2915679C (en) 2006-10-20 2017-12-12 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis, methods of detection and uses thereof
US20090074637A1 (en) * 2006-11-03 2009-03-19 Murphy Michael C Optimized Modular Microfluidic Devices
US7902345B2 (en) * 2006-12-05 2011-03-08 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
US8133701B2 (en) * 2006-12-05 2012-03-13 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
JP2008148570A (ja) * 2006-12-14 2008-07-03 Hitachi Ltd 微生物検出システム
EP3121286B1 (en) 2006-12-21 2019-11-20 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
CN103536915A (zh) 2006-12-27 2014-01-29 埃默里大学 用于治疗传染病和肿瘤的组合物和方法
WO2008085857A2 (en) 2007-01-04 2008-07-17 Children's Hospital Medical Center Processing text with domain-specific spreading activation methods
US20080182235A1 (en) * 2007-01-30 2008-07-31 Celsis International Plc Detection of Analytes in Samples Using Liposome-Amplified Luminescence and Magnetic Separation
US8772046B2 (en) 2007-02-06 2014-07-08 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
SG193026A1 (en) 2007-02-07 2013-09-30 Decode Genetics Ehf Genetic variants contributing to risk of prostate cancer
US8906620B2 (en) 2007-03-23 2014-12-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Exon grouping analysis
WO2008118998A2 (en) * 2007-03-27 2008-10-02 Primera Biosystems Inc. Method for multiplex detection and quantitation of nucleic acids
US8592221B2 (en) 2007-04-19 2013-11-26 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
US20080274458A1 (en) * 2007-05-01 2008-11-06 Latham Gary J Nucleic acid quantitation methods
EP3318643A3 (en) * 2007-05-21 2018-06-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for identifying and treating lupus
US20090036325A1 (en) * 2007-05-25 2009-02-05 Applera Corporation Directed assembly of amplicons to enhance read pairing signature with massively parallel short read sequencers
EA018444B1 (ru) 2007-05-25 2013-08-30 Декоуд Дженетикс Ехф. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ В Chr 5p12 И 10q26 В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРОВ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ОЦЕНКЕ РИСКА, ДИАГНОСТИРОВАНИИ, ПРОГНОЗИРОВАНИИ И ЛЕЧЕНИИ РАКА ГРУДИ
US7947446B2 (en) * 2007-05-29 2011-05-24 Ming-Sheng Lee High throughput mutation screening methods and kits using a universalized approach—differential sequence fill-in (DSF)-enabled sequential adapter ligation and amplification
WO2008151004A1 (en) 2007-05-31 2008-12-11 Yale University A genetic lesion associated with cancer
EP2150628B1 (en) * 2007-06-01 2013-12-11 Monoquant PTY LTD A method for dna breakpoint analysis
CA2690043A1 (en) * 2007-06-06 2008-12-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Signal amplification using circular hairpin probes
JP5165933B2 (ja) * 2007-06-12 2013-03-21 日本碍子株式会社 標的核酸中の特定部分配列の検出方法及びアレイ
US8008010B1 (en) 2007-06-27 2011-08-30 Applied Biosystems, Llc Chimeric oligonucleotides for ligation-enhanced nucleic acid detection, methods and compositions therefor
US9512470B2 (en) * 2007-07-11 2016-12-06 Pathofinder Holding B.V. Method for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample
US9404150B2 (en) 2007-08-29 2016-08-02 Sequenom, Inc. Methods and compositions for universal size-specific PCR
WO2009036525A2 (en) * 2007-09-21 2009-03-26 Katholieke Universiteit Leuven Tools and methods for genetic tests using next generation sequencing
MX2010003724A (es) * 2007-10-04 2010-09-14 Halcyon Molecular Secuenciacion de polimeros de acido nucleico con microscopia electronica.
CA2702169A1 (en) * 2007-10-12 2009-04-16 Decode Genetics Ehf Sequence variants for inferring human pigmentation patterns
US8298768B2 (en) 2007-11-29 2012-10-30 Complete Genomics, Inc. Efficient shotgun sequencing methods
US9428746B2 (en) 2007-10-31 2016-08-30 Akonni Biosystems, Inc. Method and kit for purifying nucleic acids
US20090111193A1 (en) 2007-10-31 2009-04-30 Cooney Christopher G Sample preparation device
US7759112B2 (en) * 2007-10-31 2010-07-20 Akonni Biosystems, Inc. Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids
US10125388B2 (en) 2007-10-31 2018-11-13 Akonni Biosystems, Inc. Integrated sample processing system
US8039212B2 (en) 2007-11-05 2011-10-18 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with liver fibrosis, methods of detection and uses thereof
CN101918595A (zh) 2007-11-27 2010-12-15 人类遗传标记控股有限公司 用于扩增和复制亚硫酸氢盐修饰的核酸的酶
US8093063B2 (en) * 2007-11-29 2012-01-10 Quest Diagnostics Investments Incorporated Assay for detecting genetic abnormalities in genomic nucleic acids
US8697360B2 (en) 2007-11-30 2014-04-15 Decode Genetics Ehf. Genetic variants on CHR 11Q and 6Q as markers for prostate and colorectal cancer predisposition
US20090181390A1 (en) * 2008-01-11 2009-07-16 Signosis, Inc. A California Corporation High throughput detection of micrornas and use for disease diagnosis
AU2009205523A1 (en) * 2008-01-14 2009-07-23 Applied Biosystems, Llc Compositions, methods, and kits for detecting ribonucleic acid
US20090203531A1 (en) * 2008-02-12 2009-08-13 Nurith Kurn Method for Archiving and Clonal Expansion
NZ587903A (en) * 2008-02-14 2013-05-31 Decode Genetics Ehf Susceptibility for lung cancer using the polymorphic marker rs1051730
US20090221620A1 (en) 2008-02-20 2009-09-03 Celera Corporation Gentic polymorphisms associated with stroke, methods of detection and uses thereof
CN102301000B (zh) * 2008-03-15 2015-04-29 豪洛捷公司 核酸分子扩增反应的分析组分及方法
US7846666B2 (en) 2008-03-21 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods of RNA amplification in the presence of DNA
JP5319148B2 (ja) * 2008-03-27 2013-10-16 日本碍子株式会社 標的核酸中の変異の検出方法及びアレイ
EP2274450A2 (en) 2008-04-01 2011-01-19 Decode Genetics EHF Susceptibility variants for peripheral arterial disease and abdominal aortic aneurysm
US7999092B2 (en) * 2008-04-03 2011-08-16 Hudsonalpha Institute For Biotechnology Amplicon rescue multiplex polymerase chain reaction for amplification of multiple targets
CA2758124A1 (en) * 2008-04-19 2009-10-22 New York University Immunodominant mycobacterium tuberculosis peptides from cell wall proteins for early diagnosis and immunization
JP2009268665A (ja) * 2008-05-07 2009-11-19 Canon Inc 吸入装置
WO2009140550A2 (en) 2008-05-14 2009-11-19 Dermtech International Diagnosis of melanoma and solar lentigo by nucleic acid analysis
CN101586150B (zh) * 2008-05-23 2016-09-28 陕西佰美基因股份有限公司 检测探针、通用寡核苷酸芯片及核酸检测方法及其用途
US20110111419A1 (en) * 2008-07-04 2011-05-12 deCODE Geneties ehf. Copy Number Variations Predictive of Risk of Schizophrenia
NZ590833A (en) 2008-07-07 2013-01-25 Decode Genetics Ehf Genetic variants for breast cancer risk assessment
WO2010006215A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof
WO2010009365A1 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Raindance Technologies, Inc. Droplet libraries
US12038438B2 (en) 2008-07-18 2024-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
US20100159506A1 (en) * 2008-07-25 2010-06-24 Cellscape Corporation Methods and systems for genetic analysis of fetal nucleated red blood cells
CA2735250A1 (en) * 2008-07-30 2010-02-04 Nippon Steel Kankyo Engineering Co., Ltd. Universal nucleic acid probe set and method for utilization thereof
CA2733910A1 (en) * 2008-08-12 2010-02-18 Decode Genetics Ehf. Genetic variants useful for risk assessment of thyroid cancer
US20110212855A1 (en) * 2008-08-15 2011-09-01 Decode Genetics Ehf. Genetic Variants Predictive of Cancer Risk
US8697363B2 (en) * 2008-08-26 2014-04-15 Fluidigm Corporation Methods for detecting multiple target nucleic acids in multiple samples by use nucleotide tags
US9422597B2 (en) 2008-11-07 2016-08-23 Biofire Diagnostics, Inc. Allele amplification bias
MX2011005691A (es) 2008-11-28 2011-07-20 Univ Emory Metodos para el tratamiento de infecciones y tumores.
CA2747026A1 (en) 2008-12-17 2010-07-08 Life Technologies Corporation Methods, compositions, and kits for detecting allelic variants
SG173081A1 (en) 2009-01-30 2011-08-29 Kantonsspital Aarau Ag Gene dosage analysis
EP2393939B1 (en) 2009-02-06 2014-09-17 Yale University A snp marker of breast and ovarian cancer risk
EP2399131B1 (en) 2009-02-20 2014-08-27 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method for the diagnosis of age-associated vascular disorders
EP3415235B1 (en) 2009-03-23 2025-11-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
JP5805064B2 (ja) 2009-03-27 2015-11-04 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 対立遺伝子変種を検出するための方法、組成物、およびキット
US20120021949A1 (en) * 2009-03-31 2012-01-26 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Methylation Ligation-Dependent Macroarray (MLM)
WO2010114599A1 (en) * 2009-04-01 2010-10-07 Dx Terity Diagnostics Inc. Chemical ligation dependent probe amplification (clpa)
CA3018687C (en) 2009-04-02 2021-07-13 Fluidigm Corporation Multi-primer amplification method for barcoding of target nucleic acids
NZ595918A (en) 2009-04-03 2013-07-26 Decode Genetics Ehf Genetic markers for risk management of atrial fibrillation and stroke
EP2256215A1 (en) 2009-04-30 2010-12-01 Steffen Mergemeier Assay system using a nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US20110003301A1 (en) * 2009-05-08 2011-01-06 Life Technologies Corporation Methods for detecting genetic variations in dna samples
EP2451975A4 (en) * 2009-05-08 2013-08-14 Decode Genetics Ehf GENETIC VARIANTS CONTRIBUTING TO A RISK OF PROSTATE CANCER
US20100299773A1 (en) * 2009-05-20 2010-11-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for selecting an improved plant
WO2010138908A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Ventana Medical Systems, Inc. Igfir gene copy number as a prognostic marker in a non-small cell lung cancer
US8835117B2 (en) 2009-05-29 2014-09-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Nucleic acids for detection and discrimination of genotypes of Chlamydophila psittaci
EP2446053A1 (en) 2009-05-29 2012-05-02 Ventana Medical Systems, Inc. Methods of scoring gene copy number in a biological sample using in situ hybridization
US20120156676A1 (en) 2009-06-25 2012-06-21 Weidhaas Joanne B Single nucleotide polymorphisms in brca1 and cancer risk
EP2449132B1 (en) 2009-07-01 2015-05-13 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
NZ598009A (en) 2009-07-10 2013-11-29 Decode Genetics Ehf Genetic markers associated with risk of diabetes mellitus
US9487839B2 (en) * 2009-09-29 2016-11-08 Case Western Reserve University Method for detecting single nucleotide polymorphisms
KR101953075B1 (ko) 2009-10-07 2019-02-27 제넨테크, 인크. 루푸스의 치료, 진단 및 모니터링 방법
CN102639714A (zh) * 2009-10-29 2012-08-15 日本碍子株式会社 靶核酸的检测方法
CN102648295B (zh) * 2009-12-07 2017-08-08 伊鲁米那股份有限公司 用于多重基因分型的多样品索引
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9499814B2 (en) 2010-01-22 2016-11-22 The Regents Of The University Of California Methods for identifying drug effects on a cell by determining changes in the cell's spliced message profile
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
JP5934657B2 (ja) 2010-02-12 2016-06-15 レインダンス テクノロジーズ， インコーポレイテッド デジタル検体分析
US8774488B2 (en) 2010-03-11 2014-07-08 Cellscape Corporation Method and device for identification of nucleated red blood cells from a maternal blood sample
EP2556171B1 (en) 2010-04-05 2015-09-02 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
WO2011133474A2 (en) 2010-04-18 2011-10-27 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods of predicting predisposition to or risk of kidney disease
EP2558596B1 (en) 2010-04-16 2018-03-14 The Government Of The United States Of America As Reresented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services Real time pcr assay for detection of bacterial respiratory pathogens
US20110269735A1 (en) 2010-04-19 2011-11-03 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with statin response and cardiovascular diseases, methods of detection and uses thereof
WO2012006056A2 (en) 2010-06-29 2012-01-12 Oregon Health & Science University Ccr6 as a biomarker of alzheimer's disease
US8586301B2 (en) 2010-06-30 2013-11-19 Stratos Genomics, Inc. Multiplexed identification of nucleic acid sequences
PL3360975T3 (pl) * 2010-07-09 2022-07-11 Cergentis B.V. Strategie sekwencjonowania 3d regionu genomowego będącego przedmiotem zainteresowania
EP2601609B1 (en) 2010-08-02 2017-05-17 Population Bio, Inc. Compositions and methods for discovery of causative mutations in genetic disorders
US8700338B2 (en) 2011-01-25 2014-04-15 Ariosa Diagnosis, Inc. Risk calculation for evaluation of fetal aneuploidy
US10533223B2 (en) 2010-08-06 2020-01-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US20130261003A1 (en) 2010-08-06 2013-10-03 Ariosa Diagnostics, In. Ligation-based detection of genetic variants
US11203786B2 (en) 2010-08-06 2021-12-21 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US20140342940A1 (en) 2011-01-25 2014-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of Target Nucleic Acids using Hybridization
US11031095B2 (en) 2010-08-06 2021-06-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Assay systems for determination of fetal copy number variation
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
US10167508B2 (en) 2010-08-06 2019-01-01 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
US20130040375A1 (en) 2011-08-08 2013-02-14 Tandem Diagnotics, Inc. Assay systems for genetic analysis
PT2611925T (pt) 2010-08-30 2018-03-02 Dow Agrosciences Llc Intensificador do vírus baciliforme da cana sacarina (scbv) e seu uso em genómica funcional de plantas
BR112013004691A2 (pt) 2010-08-30 2017-11-21 Dow Agrosciences Llc construto de dna de ativação gênica marcada de milho, população marcada de plantas de milho, método para geração da mesma e método para gerar uma planta de milho marcada
JP5871933B2 (ja) 2010-09-10 2016-03-01 バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド Ｄｎａ内のｒｎａ相互作用領域の検出
US9353406B2 (en) 2010-10-22 2016-05-31 Fluidigm Corporation Universal probe assay methods
US20120108651A1 (en) 2010-11-02 2012-05-03 Leiden University Medical Center (LUMC) Acting on Behalf of Academic Hospital Leiden (AZL) Genetic polymorphisms associated with venous thrombosis and statin response, methods of detection and uses thereof
WO2012076349A1 (en) * 2010-12-08 2012-06-14 Imec Heat-transfer resistance based analysis bioparticles
EP2663656B1 (en) 2011-01-13 2016-08-24 Decode Genetics EHF Genetic variants as markers for use in urinary bladder cancer risk assessment
US20120196294A1 (en) 2011-01-17 2012-08-02 Life Technologies Corporation Workflow for detection of ligands using nucleic acids
WO2012103031A2 (en) 2011-01-25 2012-08-02 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
EA201391074A1 (ru) 2011-01-25 2013-12-30 Олмак Дайэгностикс Лимитед Профили экспрессии генов рака толстой кишки и способы применения
US11270781B2 (en) 2011-01-25 2022-03-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination
US10131947B2 (en) 2011-01-25 2018-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies
US8756020B2 (en) 2011-01-25 2014-06-17 Ariosa Diagnostics, Inc. Enhanced risk probabilities using biomolecule estimations
US9994897B2 (en) 2013-03-08 2018-06-12 Ariosa Diagnostics, Inc. Non-invasive fetal sex determination
EP2675913B1 (en) 2011-02-15 2016-12-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detecting methylation in a subpopulation of genomic dna
EP2675819B1 (en) 2011-02-18 2020-04-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
EP2675914A1 (en) 2011-02-18 2013-12-25 Yale University, Inc. The kras-variant and endometriosis
US20120219950A1 (en) 2011-02-28 2012-08-30 Arnold Oliphant Assay systems for detection of aneuploidy and sex determination
EP2689030A1 (en) 2011-03-21 2014-01-29 Yale University The kras variant and tumor biology
US8759036B2 (en) 2011-03-21 2014-06-24 Affymetrix, Inc. Methods for synthesizing pools of probes
KR102165122B1 (ko) 2011-04-01 2020-10-13 제넨테크, 인크. 암 치료에 대한 감수성을 예측하기 위한 바이오마커
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
WO2012149193A2 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Monsanto Technology Llc Diagnostic molecular markers for seed lot purity traits in soybeans
CN103796508B (zh) 2011-05-02 2017-05-03 内布拉斯加大学评议会 具有有用性状的植物和相关方法
WO2012151111A1 (en) 2011-05-04 2012-11-08 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Quantitative nuclease protection assay (qnpa) and sequencing (qnps) improvements
CN103635594B (zh) 2011-05-09 2018-02-13 富鲁达公司 基于探针的核酸检测
CN106434871B (zh) * 2011-05-17 2020-08-18 德克斯特里蒂诊断公司 用于检测目标核酸的方法与组合物
EP2710172B1 (en) 2011-05-20 2017-03-29 Fluidigm Corporation Nucleic acid encoding reactions
EP3216872B1 (en) 2011-06-02 2020-04-01 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
EP3461807B1 (en) 2011-06-08 2023-07-12 Life Technologies Corporation Design and development of novel detergents for use in pcr systems
US9567628B2 (en) 2011-06-08 2017-02-14 Life Technologies Corporation Polymerization of nucleic acids using proteins having low isoelectric points
WO2013006684A1 (en) 2011-07-05 2013-01-10 The Gov. Of The U.S.A. As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health And Human Services. Hiv-1 genotyping assay for global surveillance of hiv-1 drug resistance
JP6028025B2 (ja) * 2011-07-08 2016-11-16 キージーン・エン・フェー オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイに基づく配列ベースの遺伝子型決定
EP2744916A4 (en) 2011-07-13 2015-06-17 Primeradx Inc MULTIMODAL PROCEDURE FOR THE SIMULTANEOUS DETECTION AND QUANTIFICATION OF MULTIPLE NUCLEIC ACIDS IN ONE SAMPLE
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
US9670540B2 (en) 2011-07-21 2017-06-06 Cornell University Methods and devices for DNA sequencing and molecular diagnostics
HUE059863T2 (hu) 2011-08-31 2023-01-28 Seminis Vegetable Seeds Inc Eljárás és készítmények görögdinnye keménységhez
US8712697B2 (en) 2011-09-07 2014-04-29 Ariosa Diagnostics, Inc. Determination of copy number variations using binomial probability calculations
CN103874766B (zh) 2011-09-07 2017-07-18 人类遗传标记控股有限公司 分子检测测定
US20130085078A1 (en) * 2011-09-29 2013-04-04 Luminex Corporation Hydrolysis Probes
WO2013049535A2 (en) 2011-09-30 2013-04-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Influenza vaccine
US10221454B2 (en) 2011-10-10 2019-03-05 The Hospital For Sick Children Methods and compositions for screening and treating developmental disorders
CA2852949A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing
WO2013067451A2 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Population Diagnostics Inc. Methods and compositions for diagnosing, prognosing, and treating neurological conditions
CA2854779A1 (en) 2011-11-10 2013-05-16 Genentech, Inc. Methods for treating, diagnosing and monitoring alzheimer's disease
DK2780466T3 (da) 2011-11-15 2019-05-13 Univ Bruxelles Detektering af streptococcus pneumoniae i blod
WO2013081645A2 (en) 2011-11-30 2013-06-06 Genentech, Inc. Erbb3 mutations in cancer
US9944985B2 (en) 2011-11-30 2018-04-17 Children's Hospital Medical Center Personalized pain management and anesthesia: preemptive risk identification and therapeutic decision support
EP2791365A1 (en) 2011-12-14 2014-10-22 De Staat der Nederlanden, Vert. Door de Minister van VWS Identification of poliovirus strains
US10648030B2 (en) 2012-01-13 2020-05-12 Affymetrix, Inc. Methods of determining the presence or absence of a plurality of target polynucleotides in a sample
CN105861487B (zh) 2012-01-26 2020-05-05 纽亘技术公司 用于靶向核酸序列富集和高效文库产生的组合物和方法
EP2812452B1 (en) 2012-02-09 2020-05-27 Population Bio, Inc. Methods and compositions for screening and treating developmental disorders
EP2823303A4 (en) * 2012-02-10 2015-09-30 Raindance Technologies Inc MOLECULAR DIAGNOSTIC SCREENING TEST
US20150045258A1 (en) * 2012-02-14 2015-02-12 Gnubio, Inc. Cascaded addition of target specific universal adapters to nucleic acids
EP2843047B1 (en) * 2012-02-27 2019-10-30 Toray Industries, Inc. Nucleic acid detection method
EP3321378B1 (en) 2012-02-27 2021-11-10 Becton, Dickinson and Company Compositions for molecular counting
US11177020B2 (en) 2012-02-27 2021-11-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
EP2820155B1 (en) 2012-02-28 2017-07-26 Population Genetics Technologies Ltd. Method for attaching a counter sequence to a nucleic acid sample
US9045803B2 (en) 2012-02-29 2015-06-02 Abbott Molecular Inc. Hepatitis B virus typing and resistance assay
CA2865977A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Dow Agrosciences Llc Sugarcane bacilliform viral (scbv) enhancer and its use in plant functional genomics
US9428813B2 (en) 2012-03-26 2016-08-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health & Human Services DNA methylation analysis for the diagnosis, prognosis and treatment of adrenal neoplasms
WO2013165551A1 (en) 2012-05-03 2013-11-07 The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Methods of detecting influenza virus
KR101184566B1 (ko) * 2012-05-11 2012-09-20 케이맥(주) 실시간 중합효소 연쇄반응과 ｄｎａ 칩이 통합된 검사 시스템 및 이를 이용한 통합 분석방법
US10289800B2 (en) 2012-05-21 2019-05-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Processes for calculating phased fetal genomic sequences
CA2874343C (en) 2012-05-21 2021-11-09 Fluidigm Corporation Single-particle analysis of particle populations
AU2012380717B2 (en) 2012-05-24 2018-08-16 Fundacio Institucio Catalana De Recerca I Estudis Avancats Method for the identification of the origin of a cancer of unknown primary origin by methylation analysis
US9394574B2 (en) 2012-06-12 2016-07-19 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Methods for detecting Legionella nucleic acids in a sample
US9951378B2 (en) 2012-06-14 2018-04-24 Life Technologies Corporation Compositions, methods and kits for real time polymerase chain reaction (PCR)
WO2013191775A2 (en) 2012-06-18 2013-12-27 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for negative selection of non-desired nucleic acid sequences
WO2013192292A1 (en) 2012-06-21 2013-12-27 Justin Lamb Massively-parallel multiplex locus-specific nucleic acid sequence analysis
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
WO2014015269A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Ariosa Diagnostics, Inc. Multiplexed sequential ligation-based detection of genetic variants
EP2885418A4 (en) 2012-08-14 2016-03-02 10X Genomics Inc MICROCAPSE COMPOSITIONS AND METHOD THEREFOR
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10059983B2 (en) 2012-09-10 2018-08-28 Genesky Diagnostics (Suzhou) Inc. Multiplex nucleic acid analysis
EP2895621B1 (en) 2012-09-14 2020-10-21 Population Bio, Inc. Methods and compositions for diagnosing, prognosing, and treating neurological conditions
CA2922005A1 (en) 2012-09-27 2014-04-03 Population Diagnostics, Inc. Methods and compositions for screening and treating developmental disorders
EP2900836B1 (en) 2012-09-28 2023-05-10 Cepheid Two-primer pcr for microrna multiplex assay
ES3019910T3 (en) 2012-10-17 2025-05-21 10X Genomics Sweden Ab Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
EP2914743B1 (en) 2012-11-02 2019-08-07 Life Technologies Corporation Small rna capture, detection and quantification
WO2014074942A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Illumina, Inc. Risk variants of alzheimer's disease
US10314253B2 (en) 2012-12-04 2019-06-11 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and compositions for watermelon sex expression
CN104995309B (zh) * 2012-12-07 2020-12-08 因维蒂公司 多重核酸检测方法
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014093676A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 10X Technologies, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9523121B2 (en) * 2013-01-13 2016-12-20 Uni Taq Bio Methods and compositions for PCR using blocked and universal primers
CA2900481A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 10X Genomics, Inc. Polynucleotide barcode generation
RU2015140573A (ru) 2013-02-25 2017-03-30 Дженентек, Инк. Способы и композиции для обнаружения и лечения устойчивого к лекарственным средствам мутанта акт
US9982255B2 (en) * 2013-03-11 2018-05-29 Kailos Genetics, Inc. Capture methodologies for circulating cell free DNA
WO2014165210A2 (en) 2013-03-12 2014-10-09 Life Technologies Corporation Universal reporter-based genotyping methods and materials
WO2014152155A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The Broad Institute, Inc. Massively multiplexed rna sequencing
US20140272959A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 President And Fellows Of Harvard College Methods of Hybridizing Probes to Genomic DNA
US10450595B2 (en) 2013-03-15 2019-10-22 Theranos Ip Company, Llc Nucleic acid amplification
US10294489B2 (en) 2013-03-15 2019-05-21 Board Of Trustees Of Southern Illinois University Soybean resistant to cyst nematodes
ES2908751T3 (es) 2013-03-15 2022-05-03 Labrador Diagnostics Llc Amplificación de ácidos nucleicos
EP2971130A4 (en) 2013-03-15 2016-10-05 Nugen Technologies Inc SEQUENTIAL SEQUENCING
CN116334193A (zh) 2013-03-15 2023-06-27 赛拉诺斯知识产权有限责任公司 核酸扩增
US10119134B2 (en) 2013-03-15 2018-11-06 Abvitro Llc Single cell bar-coding for antibody discovery
CA2906824C (en) 2013-03-15 2023-10-03 Theranos, Inc. Nucleic acid amplification
US9822418B2 (en) 2013-04-22 2017-11-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Mutations in PDGFRB and NOTCH3 as causes of autosomal dominant infantile myofibromatosis
US10059999B2 (en) 2013-06-10 2018-08-28 Monsanto Technology Llc Molecular markers associated with soybean tolerance to low iron growth conditions
CN112037860B (zh) 2013-06-13 2024-02-23 豪夫迈·罗氏有限公司 用于非入侵性性染色体非整倍性确定的统计分析
CN105473744B (zh) 2013-06-25 2020-06-19 普罗格诺西斯生物科学公司 采用微流控装置的空间编码生物分析
EP3726213A1 (en) * 2013-08-19 2020-10-21 Singular Bio Inc. Assays for single molecule detection and use thereof
ES2711168T3 (es) 2013-08-28 2019-04-30 Becton Dickinson Co Análisis masivo en paralelo de células individuales
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
SG10201908167YA (en) 2013-09-04 2019-10-30 Fluidigm Corp Proximity assays for detecting nucleic acids and proteins in a single cell
US10767188B2 (en) 2013-09-25 2020-09-08 Nutech Ventures Methods and compositions for obtaining useful plant traits
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
JP2017504307A (ja) 2013-10-07 2017-02-09 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド アレイ上のフィーチャーをデジタルカウントするための方法およびシステム
NZ630628A (en) 2013-10-08 2015-04-24 Seminis Vegetable Seeds Inc Methods and compositions for peronospora resistance in spinach
WO2015061475A2 (en) 2013-10-22 2015-04-30 THE GOVERNMENT OF THE USA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEATLH AND HUMAN SERV Compositions and methods for detection and discrimination of influenza viruses
JP6742238B2 (ja) 2013-10-25 2020-08-19 ライフ テクノロジーズ コーポレーション Ｐｃｒシステムにおいて使用するための新規化合物及びその用途
DK3511422T3 (da) 2013-11-12 2023-02-06 Population Bio Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til diagnosticering, prognose og behandling af endometriose
WO2015073080A1 (en) 2013-11-12 2015-05-21 Life Technologies Corporation Reagents and methods for sequencing
US9546399B2 (en) 2013-11-13 2017-01-17 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read
CN105765080A (zh) * 2013-11-26 2016-07-13 伯乐实验室公司 用于检测核酸相邻性的方法
NZ728726A (en) 2013-11-27 2018-09-28 Seminis Vegetable Seeds Inc Disease resistance loci in onion
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
WO2015106209A1 (en) * 2014-01-10 2015-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Intercalating dyes for differential detection
US10260111B1 (en) 2014-01-20 2019-04-16 Brett Eric Etchebarne Method of detecting sepsis-related microorganisms and detecting antibiotic-resistant sepsis-related microorganisms in a fluid sample
WO2019161126A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 Dermtech, Inc. Novel gene classifiers and uses thereof in non-melanoma skin cancers
EP3107930A1 (en) 2014-02-21 2016-12-28 THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by the S Hiv-2 nucleic acids and methods of detection
CN110607321A (zh) 2014-02-21 2019-12-24 先正达参股股份有限公司 与玉米增加的能育性相关的遗传基因座
US10878939B2 (en) 2014-02-24 2020-12-29 Children's Hospital Medical Center Methods and compositions for personalized pain management
NZ630710A (en) 2014-02-27 2016-03-31 Seminis Vegetable Seeds Inc Compositions and methods for peronospora resistance in spinach
US9745614B2 (en) 2014-02-28 2017-08-29 Nugen Technologies, Inc. Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors
WO2015147370A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures
WO2015153571A2 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Cornell University Detection of dna methylation using combined nuclease ligation reactions
US10844436B2 (en) 2014-04-01 2020-11-24 Cornell University Use of double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection
US20150284786A1 (en) * 2014-04-04 2015-10-08 Affymetrix, Inc. Compositions and Methods for Molecular Inversion Probe Assays
US9694361B2 (en) 2014-04-10 2017-07-04 10X Genomics, Inc. Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same
WO2015160536A1 (en) 2014-04-14 2015-10-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Methods for rapid detection and identification of viral nucleic acids
EP3146046B1 (en) 2014-05-23 2020-03-11 Digenomix Corporation Haploidome determination by digitized transposons
US10227638B2 (en) 2014-06-02 2019-03-12 Base4 Innovation Ltd. Nucleotide polymorphism detection method
ES2748457T3 (es) 2014-06-06 2020-03-16 Univ Cornell Procedimiento para identificación y enumeración de cambios en la secuencia de ácido nucleico, expresión, copia o metilación de ADN, usando reacciones combinadas de nucleasa, ligasa, polimerasa y secuenciación
WO2015199976A1 (en) 2014-06-24 2015-12-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Target activated microdissection
EP3161160B1 (en) 2014-06-26 2021-10-13 10X Genomics, Inc. Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations
US12312640B2 (en) 2014-06-26 2025-05-27 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
CN106536756A (zh) 2014-06-26 2017-03-22 10X基因组学有限公司 核酸序列的分析
US10316369B2 (en) 2014-06-27 2019-06-11 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and assays for male sterile watermelon
WO2016016897A1 (en) 2014-07-30 2016-02-04 Smadar Avigad Prognostic methods and systems of treatment for acute lymphoblastic leukemia
GB201413718D0 (en) * 2014-08-01 2014-09-17 Olink Ab Method for selecting a target nucleic acid sequence
US10422004B2 (en) 2014-08-08 2019-09-24 Children's Hospital Medical Center Diagnostic method for distinguishing forms of esophageal eosinophilia
CN108064315B (zh) 2014-08-22 2022-01-18 西菲伊德公司 检测流感的方法
GB2558326B (en) 2014-09-05 2021-01-20 Population Bio Inc Methods and compositions for inhibiting and treating neurological conditions
US11091810B2 (en) 2015-01-27 2021-08-17 BioSpyder Technologies, Inc. Focal gene expression profiling of stained FFPE tissues with spatial correlation to morphology
US10683534B2 (en) 2015-01-27 2020-06-16 BioSpyder Technologies, Inc. Ligation assays in liquid phase
US9856521B2 (en) 2015-01-27 2018-01-02 BioSpyder Technologies, Inc. Ligation assays in liquid phase
US10590483B2 (en) 2014-09-15 2020-03-17 Abvitro Llc High-throughput nucleotide library sequencing
WO2016044664A1 (en) * 2014-09-17 2016-03-24 Theranos, Inc. Diagnostic methods and compositions
JP6871160B2 (ja) 2014-10-08 2021-05-12 コーネル・ユニバーシティーＣｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 核酸の発現、スプライス変異体、転座、コピー数、またはメチル化変化を識別及び定量化するための方法
EP3005862A1 (en) 2014-10-10 2016-04-13 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Melon plants with improved disease tolerance
EP3207156A1 (en) 2014-10-13 2017-08-23 Life Technologies Corporation Methods, kits & compositions for determining gene copy numbers
WO2016069853A2 (en) 2014-10-30 2016-05-06 Cepheid Methods of detecting ebola
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
US10697004B2 (en) * 2014-11-06 2020-06-30 Osaka City University Clamping probe
CN114717264A (zh) 2014-11-14 2022-07-08 沃雅戈治疗公司 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法
WO2016089920A1 (en) 2014-12-01 2016-06-09 The Broad Institute, Inc. Method for in situ determination of nucleic acid proximity
US10085951B2 (en) 2014-12-11 2018-10-02 Designs For Health, Inc. Curcuminoid formulations and related methods of treatment
JP6804462B2 (ja) 2014-12-15 2020-12-23 セファイド 指数関数の底が２より大きい核酸増幅
CN107109398B (zh) * 2014-12-19 2020-08-18 荣研化学株式会社 单核苷酸多态性检测用寡核苷酸探针及单核苷酸多态性检测方法
KR101728023B1 (ko) * 2015-01-02 2017-04-18 주식회사 랩 지노믹스 Ｐｃｒ―ｌｄｒ을 이용한 ａｔｐ７ｂ 유전자의 돌연변이 검출
CN107427808B (zh) 2015-01-12 2020-10-23 10X基因组学有限公司 用于制备核酸测序文库的方法和系统以及用其制备的文库
US9984201B2 (en) 2015-01-18 2018-05-29 Youhealth Biotech, Limited Method and system for determining cancer status
EP3250716B1 (en) * 2015-01-30 2021-07-07 President and Fellows of Harvard College Microscope-free imaging
JP6580331B2 (ja) * 2015-01-30 2019-09-25 倉敷紡績株式会社 一本鎖ｄｎａ産物の調製方法
WO2016134078A1 (en) 2015-02-19 2016-08-25 Becton, Dickinson And Company High-throughput single-cell analysis combining proteomic and genomic information
WO2016137973A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 10X Genomics Inc Partition processing methods and systems
US20160246813A1 (en) * 2015-02-25 2016-08-25 International Business Machines Corporation System and method for machine information life cycle
CA2976681A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Fluidigm Corporation Single-cell nucleic acids for high-throughput studies
ES2836802T3 (es) 2015-02-27 2021-06-28 Becton Dickinson Co Códigos de barras moleculares espacialmente direccionables
CN107614700A (zh) 2015-03-11 2018-01-19 布罗德研究所有限公司 基因型和表型偶联
US9434996B1 (en) 2015-03-13 2016-09-06 Tracy Ann Hayden All mini-STR multiplex with increased C.E. through-put by STR prolongation template fusion
ES2934982T3 (es) 2015-03-30 2023-02-28 Becton Dickinson Co Métodos para la codificación con códigos de barras combinatorios
US20160299129A1 (en) * 2015-04-07 2016-10-13 Xiaolei Qiu Ultra Sensitive and Specific Multiplex Biosensor System Based on Multiple Cooperative Interactions
CN113186256B (zh) 2015-04-10 2025-05-23 十程基因技术瑞典公司 生物样本的空间区别、多重核酸分析
CN107532213B (zh) * 2015-04-23 2021-05-11 病理取景器控股有限责任公司 用于同时检测样品中多个核酸序列的方法
WO2016172373A1 (en) * 2015-04-23 2016-10-27 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
HUE053541T2 (hu) 2015-04-28 2021-07-28 Monsanto Technology Llc Eljárások és készítmények brachitikus kukoricanövények elõállítására
CA2981819A1 (en) 2015-04-30 2016-11-03 Monsanto Technology Llc Methods for producing canola plants with clubroot resistance and compositions thereof
US11124823B2 (en) 2015-06-01 2021-09-21 Becton, Dickinson And Company Methods for RNA quantification
US11603555B2 (en) 2015-06-15 2023-03-14 Cepheid Integrated purification and measurement of DNA methylation and co-measurement of mutations and/or MRNA expression levels in an automated reaction cartridge
CN108350500A (zh) 2015-07-29 2018-07-31 普罗格尼迪公司 用于检测染色体异常的核酸和方法
AU2016308049B2 (en) 2015-08-18 2022-03-17 Monsanto Technology Llc Methods for producing cotton plants with enhanced drought tolerance and compositions thereof
EP3337908A4 (en) 2015-08-18 2019-01-23 The Broad Institute, Inc. METHOD AND COMPOSITIONS FOR CHANGING THE FUNCTION AND STRUCTURE OF CHROMATIN GRINDING AND / OR DOMAINS
US10448595B2 (en) 2015-09-03 2019-10-22 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Downy mildew resistant lettuce plants
US11118216B2 (en) 2015-09-08 2021-09-14 Affymetrix, Inc. Nucleic acid analysis by joining barcoded polynucleotide probes
US10858709B2 (en) 2015-09-10 2020-12-08 Monsanto Technology Llc Methods for producing corn plants with downy mildew resistance and compositions thereof
EP3347465B1 (en) 2015-09-11 2019-06-26 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for nucleic acid library normalization
IL258248B (en) 2015-09-24 2022-07-01 Abvitro Llc Attraction Oligonucleotide Conjugates and Their Uses
ES2978717T3 (es) 2015-09-24 2024-09-18 Abvitro Llc PCR de exclusión activada por amplicón único
US10928392B2 (en) 2015-09-25 2021-02-23 Abvitro Llc High throughput process for T cell receptor target identification of natively-paired T cell receptor sequences
CN115418401A (zh) 2015-10-08 2022-12-02 会聚基因学有限公司 用于膀胱癌的尿监测的诊断测定
WO2017079442A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods of treating tumors and cancer, and identifying candidate subjects for such treatment
CN108779487A (zh) 2015-11-16 2018-11-09 普罗格尼迪公司 用于检测甲基化状态的核酸和方法
EP3377657B1 (en) * 2015-11-19 2020-11-11 10X Genomics, Inc. Transformable tagging methods
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
JP6703824B2 (ja) * 2015-11-30 2020-06-03 シスメックス株式会社 細胞選択方法、細胞検出方法、細胞選択装置、および細胞検出装置
PT3882357T (pt) 2015-12-04 2022-09-05 10X Genomics Inc Métodos e composições para análise de ácidos nucleicos
WO2017106777A1 (en) 2015-12-16 2017-06-22 Fluidigm Corporation High-level multiplex amplification
BR112018012039A2 (pt) 2015-12-18 2018-12-04 Monsanto Technology Llc métodos para produção de plantas de milho com resistência à helmintosporiose e composições dos mesmos
AU2017207341A1 (en) 2016-01-12 2018-08-02 Interleukin Genetics, Inc. Methods for predicting response to treatment
EP3402572B1 (en) 2016-01-13 2022-03-16 Children's Hospital Medical Center Compositions and methods for treating allergic inflammatory conditions
JP6735348B2 (ja) 2016-02-11 2020-08-05 １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド 全ゲノム配列データのデノボアセンブリのためのシステム、方法及び媒体
EP3448881B1 (en) 2016-04-26 2023-06-07 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Treatment of hippo pathway mutant tumors and methods of identifying subjects as candidates for treatment
WO2017189906A1 (en) 2016-04-27 2017-11-02 Mira Dx, Inc. Immune-based treatment of kras-variant cancer patients
JP7129343B2 (ja) 2016-05-02 2022-09-01 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 正確な分子バーコーディング
WO2017197343A2 (en) 2016-05-12 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic on-chip filters
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
EP3465502B1 (en) 2016-05-26 2024-04-10 Becton, Dickinson and Company Molecular label counting adjustment methods
WO2017210341A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 The Regents Of The University Of California Methods for evaluating, monitoring, and modulating aging process
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US20170362640A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Life Technologies Corporation Novel compositions, methods and kits for microorganism detection
WO2018005284A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 The United State Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods and compositions for influenza a virus subtyping
EP3481941A4 (en) 2016-07-06 2020-04-15 Youhealth Biotech, Limited METHYLIZATION MARKERS FOR BREAST AND OVARIAL CANCER AND THEIR USE
WO2018009705A1 (en) 2016-07-06 2018-01-11 Youhealth Biotech, Limited Liver cancer methylation markers and uses thereof
CN107847515B (zh) 2016-07-06 2021-01-29 优美佳生物技术有限公司 实体瘤甲基化标志物及其用途
US10093986B2 (en) 2016-07-06 2018-10-09 Youhealth Biotech, Limited Leukemia methylation markers and uses thereof
EP3481951A4 (en) 2016-07-06 2020-08-05 Youhealth Biotech, Limited COLON CANCER SPECIFIC METHYLATION MARKERS AND USES OF THESE MARKERS
US10822648B1 (en) 2016-07-29 2020-11-03 Labrador Diagnostics Llc Hybrid multi-step nucleic acid amplification
EP3496528A4 (en) 2016-08-11 2020-03-18 Monsanto Technology LLC METHODS AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING CORN PLANTS WITH RESISTANCE TO LATE FAILURE
WO2018039599A1 (en) 2016-08-26 2018-03-01 Life Technologies Corporation Nucleic acid extraction and amplification controls and methods of use thereof
WO2018039640A1 (en) 2016-08-26 2018-03-01 The Broad Institute, Inc. Nucleic acid amplification assays for detection of pathogens
US11359229B2 (en) 2016-09-20 2022-06-14 President And Fellows Of Harvard College Molecular verification systems
JP6929354B2 (ja) 2016-09-24 2021-09-01 アブビトロ， エルエルシー 親和性−オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびその使用
EP3516400B1 (en) 2016-09-26 2023-08-16 Becton, Dickinson and Company Measurement of protein expression using reagents with barcoded oligonucleotide sequences
AU2017232187B2 (en) 2016-09-30 2023-11-09 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Xanthomonas resistant brassica oleracea plants
US11725232B2 (en) 2016-10-31 2023-08-15 The Hong Kong University Of Science And Technology Compositions, methods and kits for detection of genetic variants for alzheimer's disease
CN110997700A (zh) 2016-12-06 2020-04-10 俄勒冈州立大学 用于在杀真菌素链霉菌的基因工程菌株中增强恩拉霉素的生产的组合物和方法
WO2018111935A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Cepheid Integrated purification and measurement of dna methylation and co-measurement of mutations and/or mrna expression levels in an automated reaction cartridge
US20180163270A1 (en) 2016-12-12 2018-06-14 Cepheid Integrated immuno-pcr and nucleic acid analysis in an automated reaction cartridge
WO2018118808A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 The Broad Institute, Inc. Methods of treating autism spectrum disorders
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP3565906B1 (en) 2017-01-05 2021-01-27 Tervisetehnoloogiate Arenduskeskus AS Quantifying dna sequences
US10337070B2 (en) 2017-01-12 2019-07-02 Cardioforecast Ltd. Methods and kits for treating cardiovascular disease
CN110573253B (zh) 2017-01-13 2021-11-02 赛卢拉研究公司 流体通道的亲水涂层
EP3571309A4 (en) 2017-01-20 2020-11-25 Children's Hospital Medical Center METHODS AND COMPOSITIONS RELATED TO THE METHYLATION OF OPRM1 DNA TO MANAGE PAIN IN PEOPLE
CN117512066A (zh) 2017-01-30 2024-02-06 10X基因组学有限公司 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和系统
US12264411B2 (en) 2017-01-30 2025-04-01 10X Genomics, Inc. Methods and systems for analysis
US11319583B2 (en) 2017-02-01 2022-05-03 Becton, Dickinson And Company Selective amplification using blocking oligonucleotides
US10240205B2 (en) 2017-02-03 2019-03-26 Population Bio, Inc. Methods for assessing risk of developing a viral disease using a genetic test
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
CN110603329B (zh) 2017-03-02 2023-12-05 优美佳肿瘤技术有限公司 用于诊断肝细胞癌和肺癌的甲基化标志物
EP3378950A1 (en) * 2017-03-21 2018-09-26 Sequencing Multiplex SLK Easy one-step amplification and labeling (eosal)
EP3601593B1 (en) 2017-03-24 2021-12-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. Universal hairpin primers
US12492430B2 (en) 2017-04-11 2025-12-09 Tecan Genomics, Inc. Library quantitation and qualification
EP3615695A1 (en) 2017-04-24 2020-03-04 Genentech, Inc. Erbb2/her2 mutations in the transmebrane or juxtamembrane domain
WO2018204175A1 (en) 2017-05-03 2018-11-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Rapid detection of zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification
EP3618839A4 (en) 2017-05-05 2021-06-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2018213803A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 Neon Therapeutics, Inc. Immunogenic neoantigen identification
EP3445876B1 (en) 2017-05-26 2023-07-05 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
US20180340169A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
EP3631012B1 (en) 2017-05-26 2022-06-08 AbVitro LLC High-throughput polynucleotide library sequencing and transcriptome analysis
CA3059559A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
US11466329B2 (en) 2017-06-14 2022-10-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Detection of blaIMP antibacterial resistance genes
EP3679370A1 (en) 2017-09-07 2020-07-15 Juno Therapeutics, Inc. Methods of identifying cellular attributes related to outcomes associated with cell therapy
WO2019055829A1 (en) 2017-09-15 2019-03-21 Nazarian Javad METHODS OF DETECTION OF CANCER BIOMARKERS
AU2018335575B2 (en) 2017-09-25 2024-07-04 Fred Hutchinson Cancer Center High efficiency targeted in situ genome-wide profiling
US20200255828A1 (en) 2017-10-04 2020-08-13 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for altering function and structure of chromatin loops and/or domains
US10837047B2 (en) 2017-10-04 2020-11-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
CA3077426A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
US11099202B2 (en) 2017-10-20 2021-08-24 Tecan Genomics, Inc. Reagent delivery system
WO2019084043A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS
EP3700672B1 (en) 2017-10-27 2022-12-28 10X Genomics, Inc. Methods for sample preparation and analysis
KR20200081476A (ko) 2017-11-13 2020-07-07 라이프 테크놀로지스 코포레이션 요로 미생물 검출을 위한 조성물, 방법 및 키트
EP3625361A1 (en) 2017-11-15 2020-03-25 10X Genomics, Inc. Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
WO2019108851A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis
CN111699388B (zh) 2017-12-12 2024-08-02 10X基因组学有限公司 用于单细胞处理的系统和方法
WO2019126209A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Cellular Research, Inc. Particles associated with oligonucleotides
WO2019126789A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing nucleic acid molecules from one or more cells
WO2019133727A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Universal influenza virus probe set for enrichment of any influenza virus nucleic acid
US11814674B2 (en) 2018-02-02 2023-11-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Random amplification methods for extremely low input nucleic acids
EP3752832A1 (en) 2018-02-12 2020-12-23 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
US11859250B1 (en) 2018-02-23 2024-01-02 Children's Hospital Medical Center Methods for treating eosinophilic esophagitis
WO2019169028A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 10X Genomics, Inc. Transcriptome sequencing through random ligation
WO2019183359A1 (en) 2018-03-22 2019-09-26 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for molecular authentication
CN120905352A (zh) 2018-04-02 2025-11-07 埃努梅拉分子股份有限公司 用于对核酸分子进行计数的方法、系统和组合物
CN112262218B (zh) 2018-04-06 2024-11-08 10X基因组学有限公司 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法
KR102833653B1 (ko) * 2018-04-20 2025-07-11 롱혼 백신즈 앤드 다이어그나스틱스, 엘엘씨 신속한 미생물 내성 검출 방법
WO2019204580A1 (en) 2018-04-20 2019-10-24 Children's Hospital Medical Center Blood biomarker for eosinophilic gastrointestinal disorders
ES2945191T3 (es) 2018-05-03 2023-06-29 Becton Dickinson Co Análisis de muestras multiómicas de alto rendimiento
JP7358388B2 (ja) 2018-05-03 2023-10-10 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 反対側の転写物末端における分子バーコーディング
US12235273B2 (en) 2018-05-04 2025-02-25 Abbott Laboratories HBV diagnostic, prognostic, and therapeutic methods and products
CN108531599A (zh) * 2018-05-08 2018-09-14 杭州泰领生物技术有限公司 一种人hla-b*5801基因型的试剂盒及方法
WO2019217758A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for molecular library generation
US11268102B2 (en) 2018-05-16 2022-03-08 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Compositions and methods for identifying and selecting brachytic locus in solanaceae
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
EP3807420A1 (en) 2018-06-12 2021-04-21 Keygene N.V. Nucleic acid amplification method
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
US12188014B1 (en) 2018-07-25 2025-01-07 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for nucleic acid processing using blocking agents
WO2020023943A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 Aperta Biosciences, Llc Spinosyn formulations for treatment of demodex-induced ocular and facial conditions
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
US12163179B2 (en) 2018-08-03 2024-12-10 10X Gemomics, Inc. Methods and systems to minimize barcode exchange
SI4177356T1 (sl) 2018-08-08 2025-04-30 Pml Screening, Llc Postopki za ocenjevanje tveganja za razvoj virusne bolezni z genetskim testom
US12065688B2 (en) 2018-08-20 2024-08-20 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for cellular processing
WO2020041148A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for detection of protein-dna interactions using proximity ligation
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
US11639517B2 (en) 2018-10-01 2023-05-02 Becton, Dickinson And Company Determining 5′ transcript sequences
WO2020077409A1 (en) 2018-10-17 2020-04-23 The University Of Queensland Epigenetic biomarker and uses therefor
EP3874064A1 (en) 2018-10-29 2021-09-08 Cepheid Exponential base-3 nucleic acid amplification with reduced amplification time using nested overlapping primers
JP7618548B2 (ja) 2018-11-08 2025-01-21 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー ランダムプライミングを使用した単一細胞の全トランスクリプトーム解析
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
CN113767177B (zh) 2018-12-10 2025-01-14 10X基因组学有限公司 生成用于空间分析的捕获探针
US12529094B2 (en) 2018-12-10 2026-01-20 10X Genomics, Inc. Imaging system hardware
US11492660B2 (en) 2018-12-13 2022-11-08 Becton, Dickinson And Company Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US12169198B2 (en) 2019-01-08 2024-12-17 10X Genomics, Inc. Systems and methods for sample analysis
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
CA3126761C (en) 2019-01-15 2023-01-10 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green bean plants with improved disease resistance
WO2020150356A1 (en) 2019-01-16 2020-07-23 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
EP4242322B1 (en) 2019-01-23 2024-08-21 Becton, Dickinson and Company Oligonucleotides associated with antibodies
EP3921418A4 (en) 2019-02-06 2023-02-08 Singular Genomics Systems, Inc. Compositions and methods for nucleic acid sequencing
US12305239B2 (en) 2019-02-12 2025-05-20 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
WO2020167862A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for transfer of reagents between droplets
WO2020167866A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 10X Genomics, Inc. Systems and methods for transposon loading
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
EP4674961A2 (en) 2019-02-12 2026-01-07 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
US12275993B2 (en) 2019-02-12 2025-04-15 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
WO2020167920A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Cellular Research, Inc. Hybrid targeted and whole transcriptome amplification
CN113474466A (zh) 2019-02-21 2021-10-01 主基因有限公司 多倍体基因分型
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
US12297501B2 (en) 2019-02-25 2025-05-13 Children's Hospital Medical Center Methods for diagnosing and treating eosinophilic gastritis
EP3938537A1 (en) 2019-03-11 2022-01-19 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing optically tagged beads
AU2020247911A1 (en) 2019-03-26 2021-11-11 Dermtech, Llc Novel gene classifiers and uses thereof in skin cancers
CN113924369A (zh) * 2019-03-27 2022-01-11 迪亚金诺德股份公司 一种高通量测序方法和试剂盒
WO2020206170A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 Progenity, Inc. Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules
US12009061B2 (en) 2019-04-10 2024-06-11 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Computational filtering of methylated sequence data for predictive modeling
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
US20220249660A1 (en) 2019-06-06 2022-08-11 Sitokine Limited Compositions and methods for treating lung, colorectal and breast cancer
CN114051534B (zh) 2019-07-22 2025-02-21 贝克顿迪金森公司 单细胞染色质免疫沉淀测序测定
WO2021028469A1 (en) 2019-08-12 2021-02-18 Sitokine Limited Compositions and methods for treating cytokine release syndrome and neurotoxicity
US12235262B1 (en) 2019-09-09 2025-02-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for single cell protein analysis
US11287422B2 (en) 2019-09-23 2022-03-29 Element Biosciences, Inc. Multivalent binding composition for nucleic acid analysis
US11542513B2 (en) 2019-09-26 2023-01-03 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Lettuce plants having resistance to Nasonovia ribisnigri biotype Nr:1
US11844800B2 (en) 2019-10-30 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia
EP3901286A1 (en) 2020-04-24 2021-10-27 Mirnax Biosens, S.L. Bivalent reverse primer
ES3030914T3 (en) 2019-11-04 2025-07-02 Mirnax Biosens S L Bivalent reverse primer
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
JP7522189B2 (ja) 2019-11-08 2024-07-24 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 免疫レパートリーシーケンシングのための完全長ｖ（ｄ）ｊ情報を得るためのランダムプライミングの使用
EP4055185A1 (en) 2019-11-08 2022-09-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
FI3891300T3 (fi) 2019-12-23 2023-05-10 10X Genomics Inc Menetelmät spatiaalista analyysiä varten rna-templatoitua ligaatiota käyttäen
US12241890B2 (en) 2019-12-23 2025-03-04 10X Genomics, Inc. Methods for generating barcoded nucleic acid molecules using fixed cells
US12365942B2 (en) 2020-01-13 2025-07-22 10X Genomics, Inc. Methods of decreasing background on a spatial array
US11649497B2 (en) 2020-01-13 2023-05-16 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for quantitation of proteins and RNA
US12405264B2 (en) 2020-01-17 2025-09-02 10X Genomics, Inc. Electrophoretic system and method for analyte capture
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US20210230681A1 (en) 2020-01-24 2021-07-29 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using proximity ligation
US11821035B1 (en) 2020-01-29 2023-11-21 10X Genomics, Inc. Compositions and methods of making gene expression libraries
CN115335520A (zh) 2020-01-29 2022-11-11 贝克顿迪金森公司 用于通过测序对单细胞进行空间映射的条形码化的孔
US12076701B2 (en) 2020-01-31 2024-09-03 10X Genomics, Inc. Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics
US12110541B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Methods for preparing high-resolution spatial arrays
US12059674B2 (en) 2020-02-03 2024-08-13 Tecan Genomics, Inc. Reagent storage system
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
WO2021158925A1 (en) 2020-02-07 2021-08-12 10X Genomics, Inc. Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics
US11835462B2 (en) 2020-02-11 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for partitioning a biological sample
US12449419B1 (en) 2020-02-12 2025-10-21 10X Genomics, Inc. Methods for detecting binding of peptide-MHC monomers to T cells
US12281357B1 (en) 2020-02-14 2025-04-22 10X Genomics, Inc. In situ spatial barcoding
US12399123B1 (en) 2020-02-14 2025-08-26 10X Genomics, Inc. Spatial targeting of analytes
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
EP4111168A1 (en) 2020-02-25 2023-01-04 Becton Dickinson and Company Bi-specific probes to enable the use of single-cell samples as single color compensation control
US11926863B1 (en) 2020-02-27 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Solid state single cell method for analyzing fixed biological cells
US11768175B1 (en) 2020-03-04 2023-09-26 10X Genomics, Inc. Electrophoretic methods for spatial analysis
WO2021205013A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Sitokine Limited Compositions and methods for treating covid-19
EP4139485B1 (en) 2020-04-22 2023-09-06 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
CN115702250A (zh) 2020-04-27 2023-02-14 塞弗德公司 使用循环探针的指数基数-3及以上的核酸扩增
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
CN115605614A (zh) 2020-05-14 2023-01-13 贝克顿迪金森公司（Us） 用于免疫组库谱分析的引物
US12416603B2 (en) 2020-05-19 2025-09-16 10X Genomics, Inc. Electrophoresis cassettes and instrumentation
EP4153776B1 (en) 2020-05-22 2025-03-05 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
EP4153775B1 (en) 2020-05-22 2024-07-24 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
AU2021283184A1 (en) 2020-06-02 2023-01-05 10X Genomics, Inc. Spatial transcriptomics for antigen-receptors
US12157913B2 (en) 2020-06-02 2024-12-03 Becton, Dickinson And Company Oligonucleotides and beads for 5 prime gene expression assay
US12265079B1 (en) 2020-06-02 2025-04-01 10X Genomics, Inc. Systems and methods for detecting analytes from captured single biological particles
WO2021247543A2 (en) 2020-06-02 2021-12-09 10X Genomics, Inc. Nucleic acid library methods
US12031177B1 (en) 2020-06-04 2024-07-09 10X Genomics, Inc. Methods of enhancing spatial resolution of transcripts
ES2981265T3 (es) 2020-06-08 2024-10-08 10X Genomics Inc Métodos para determinar un margen quirúrgico y métodos de uso del mismo
US12435363B1 (en) 2020-06-10 2025-10-07 10X Genomics, Inc. Materials and methods for spatial transcriptomics
ES2999535T3 (en) 2020-06-10 2025-02-26 10X Genomics Inc Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
WO2021252747A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 1Ox Genomics, Inc. Fluid delivery methods
EP4172362B1 (en) 2020-06-25 2024-09-18 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
WO2021263101A1 (en) 2020-06-26 2021-12-30 Cepheid Methods of detecting sars-cov-2, influenza, and rsv
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US12209280B1 (en) 2020-07-06 2025-01-28 10X Genomics, Inc. Methods of identifying abundance and location of an analyte in a biological sample using second strand synthesis
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
AU2021204717A1 (en) 2020-07-15 2022-02-03 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green Bean Plants with Improved Disease Resistance
CA3186955A1 (en) 2020-07-23 2022-01-27 Scott Benson Energy transfer dye conjugates for use in biological assays
EP4185858B1 (en) 2020-07-23 2025-05-21 Life Technologies Corporation Compositions, systems and methods for biological analysis using dyes
WO2022026909A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 Becton, Dickinson And Company Single cell assay for transposase-accessible chromatin
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US20220066190A1 (en) * 2020-08-31 2022-03-03 Applied Materials, Inc. Slides for calibration of mfish
WO2022056078A1 (en) 2020-09-11 2022-03-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Rnase h-assisted detection assay for rna (radar)
US20230351619A1 (en) 2020-09-18 2023-11-02 10X Genomics, Inc. Sample handling apparatus and image registration methods
AU2021345359A1 (en) 2020-09-21 2023-05-11 Enumera Molecular, Inc. Compositions and methods for isolation of cell-free dna
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US20220106627A1 (en) 2020-10-06 2022-04-07 Cepheid Methods of diagnosing tuberculosis and differentiating between active and latent tuberculosis
US12480158B1 (en) 2020-11-05 2025-11-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US12084715B1 (en) 2020-11-05 2024-09-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for reducing artifactual antisense products
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
CN116635533A (zh) 2020-11-20 2023-08-22 贝克顿迪金森公司 高表达的蛋白和低表达的蛋白的谱分析
CN116685850A (zh) 2020-12-15 2023-09-01 贝克顿迪金森公司 单细胞分泌组分析
WO2022140028A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
US12398262B1 (en) 2021-01-22 2025-08-26 10X Genomics, Inc. Triblock copolymer-based cell stabilization and fixation system and methods of use thereof
ES2989523T3 (es) 2021-02-19 2024-11-26 10X Genomics Inc Método de uso de un dispositivo modular de soporte para ensayos
CN117015617B (zh) 2021-02-23 2025-04-04 10X基因组学有限公司 基于探针的核酸和蛋白质分析
EP4301870B1 (en) 2021-03-18 2025-01-15 10X Genomics, Inc. Multiplex capture of gene and protein expression from a biological sample
EP4305196B1 (en) 2021-04-14 2025-04-02 10X Genomics, Inc. Methods of measuring mislocalization of an analyte
WO2022236054A1 (en) 2021-05-06 2022-11-10 10X Genomics, Inc. Methods for increasing resolution of spatial analysis
WO2022249185A1 (en) 2021-05-26 2022-12-01 Centarix Biotech Ltd Methods for identifying critically short telomeres
WO2022256503A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
CN116635538A (zh) 2021-10-22 2023-08-22 塞弗德公司 诊断和治疗结核病的组合物和方法
WO2023086880A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for determining the location of an analyte in a biological sample
EP4305195A2 (en) 2021-12-01 2024-01-17 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis
US20230193310A1 (en) 2021-12-10 2023-06-22 Seminis Vegetabe Seeds, Inc. Lettuce plants having resistance to downy mildew
EP4441711A1 (en) 2021-12-20 2024-10-09 10X Genomics, Inc. Self-test for pathology/histology slide imaging device
KR20250006970A (ko) 2022-04-29 2025-01-13 세페이드 열에 불안정한 실란 및 화학적으로 변형된 고체 지지체를 사용한 핵산 추출 및 단리
AU2023272957A1 (en) 2022-05-19 2024-11-14 Cepheid Mvp cartridge and methods of use and manufacture
WO2023250288A2 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Novel qtls conferring resistance to cucumber mosaic virus
AU2023325064A1 (en) 2022-08-15 2025-03-06 Element Biosciences, Inc. Spatially resolved surface capture of nucleic acids
CA3267471A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Abbott Laboratories METHODS AND PRODUCTS FOR DIAGNOSTIC, PROGNOSIS AND THERAPY OF HBV
EP4634409A2 (en) 2022-12-16 2025-10-22 Cepheid Mpox clade ii biomarker panel
WO2024158797A1 (en) 2023-01-23 2024-08-02 Next Gen Diagnostics Llc Methods for the rapid identification of cefepime-resistance in escherichia coli
AU2024214518A1 (en) 2023-01-30 2025-07-10 Cepheid Respiratory biomarker panel
WO2024191684A1 (en) 2023-03-10 2024-09-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Detection of hepatitis c virus ribonucleic acid from whole blood using reverse transcription loop-mediated isothermal amplification
EP4445723A1 (en) 2023-04-14 2024-10-16 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Methods and compositions for peronospora resistance in spinach
WO2025006633A1 (en) 2023-06-27 2025-01-02 Cepheid Pancoronavirus biomarker panel
US20250171840A1 (en) 2023-09-18 2025-05-29 Cepheid Three-phase nested amplification and multi-phasic detection
WO2025101548A2 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Cepheid Her2 low quantification method
WO2025175133A1 (en) 2024-02-14 2025-08-21 Cepheid Melt shape genotyping
WO2025179142A1 (en) 2024-02-22 2025-08-28 Cepheid Maximizing optical channel capabilities for target detection
WO2025199454A1 (en) 2024-03-21 2025-09-25 Cepheid Compositions and methods for selective extraction of oligonucleotides from complex matrices
WO2025207561A1 (en) 2024-03-27 2025-10-02 Cepheid Isothermal amplification using novel synthetic oligonucleotides
WO2026019604A1 (en) 2024-07-19 2026-01-22 Cepheid Exponential base-x amplification with hairpin nested primers and universal flanking primers
EP4686762A1 (en) * 2024-07-29 2026-02-04 ICHORtec GmbH A method to characterize nucleic acid

Family Cites Families (129)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5258506A (en) * 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4883750A (en) * 1984-12-13 1989-11-28 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4925785A (en) * 1986-03-07 1990-05-15 Biotechnica Diagnostics, Inc. Nucleic acid hybridization assays
US5525464A (en) * 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
US5202231A (en) * 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
JP2846018B2 (ja) 1988-01-21 1999-01-13 ジェネンテク，インコーポレイテッド 核酸配列の増幅および検出
GB8810400D0 (en) * 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US4988617A (en) * 1988-03-25 1991-01-29 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids
US5700637A (en) * 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US5185243A (en) * 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
AU629845B2 (en) 1988-08-30 1992-10-15 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
DE69031318D1 (de) 1989-03-17 1997-10-02 Abbott Lab Verfahren und Vorrichtung zur Hybridisierung von Nukleinsäure mit verbesserter Reaktionskinetik
AU5640090A (en) * 1989-03-21 1990-11-05 Collaborative Research Inc. A dna diagnostic test using an exonuclease activity
US5035996A (en) * 1989-06-01 1991-07-30 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US5527681A (en) * 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US5424186A (en) * 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5744101A (en) * 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5143854A (en) * 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
GB8920097D0 (en) * 1989-09-06 1989-10-18 Ici Plc Amplification processes
US5104792A (en) * 1989-12-21 1992-04-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for amplifying unknown nucleic acid sequences
US5516663A (en) * 1990-01-26 1996-05-14 Abbott Laboratories Ligase chain reaction with endonuclease IV correction and contamination control
JPH04222599A (ja) 1990-04-20 1992-08-12 Syntex Usa Inc 二重受容体ポリヌクレオチド検定方法
US5494810A (en) 1990-05-03 1996-02-27 Cornell Research Foundation, Inc. Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease
DE69133629D1 (de) 1990-05-03 2010-04-15 Cornell Res Foundation Inc nssystem zur Bestimmung von genetischen Krankheiten
DK0540693T3 (da) * 1990-07-24 1999-09-13 Hoffmann La Roche Reduktion af ikke-specifik amplifikation under in vitro-nukleinsyreamplifikation under anvendelse af modificerede nukleinsy
US5484699A (en) * 1990-09-28 1996-01-16 Abbott Laboratories Nucleotide sequences useful as type specific probes, PCR primers and LCR probes for the amplification and detection of human papilloma virus, and related kits and methods
CA2046713A1 (en) * 1990-10-16 1992-04-17 Richard M. Martinelli Amplification of midivariant dna templates
US5700636A (en) * 1990-10-19 1997-12-23 Becton Dickinson And Company Methods for selectively detecting microorganisms associated with vaginal infections in complex biological samples
CA2055755A1 (en) 1990-11-22 1992-05-23 Toshihiko Kishimoto Method of immobilizing single-stranded dna on carrier at terminal
AU1248292A (en) * 1990-12-06 1992-07-08 Affymax Technologies N.V. Sequencing by hybridization of a target nucleic acid to a matrix of defined oligonucleotides
DE4039348A1 (de) 1990-12-10 1992-06-11 Henkel Kgaa Teppichreinigungsmittel
WO1992010566A1 (en) 1990-12-13 1992-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System In-situ hybridization probes for identification and banding of specific human chromosomes and regions
WO1992011390A1 (en) * 1990-12-17 1992-07-09 Idexx Laboratories, Inc. Nucleic acid sequence detection by triple helix formation
US5290925A (en) * 1990-12-20 1994-03-01 Abbott Laboratories Methods, kits, and reactive supports for 3' labeling of oligonucleotides
RU1794088C (ru) * 1991-03-18 1993-02-07 Институт Молекулярной Биологии Ан@ Ссср Способ определени нуклеотидной последовательности ДНК и устройство дл его осуществлени
DE69212156T2 (de) * 1991-05-24 1996-12-05 Harvard College Paralleler und sequentieller reaktor
US5278298A (en) * 1991-05-29 1994-01-11 Merck & Co., Inc. Eimeria brunetti 16s rDNA probes
GB9112251D0 (en) 1991-06-07 1991-07-24 Amersham Int Plc Quantitative detection of nucleic acid amplification products
ES2091976T3 (es) * 1991-06-20 1996-11-16 Hoffmann La Roche Metodos perfeccionados para la amplificacion del acido nucleico.
US5371241A (en) * 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
WO1993004199A2 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Scientific Generics Limited Methods of detecting or quantitating nucleic acids and of producing labelled immobilised nucleic acids
DK0608370T3 (da) * 1991-10-15 1998-09-07 Multilyte Ltd Bindingsassay med anvendelse af mærket reagens
EP0672173B1 (en) 1991-11-01 2002-08-28 Diatech Pty. Ltd. Solid phase amplification process
US5594121A (en) * 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5412087A (en) * 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
US5324633A (en) * 1991-11-22 1994-06-28 Affymax Technologies N.V. Method and apparatus for measuring binding affinity
CA2130562A1 (en) 1992-02-19 1993-09-02 Alexander B. Chetverin Novel oligonucleotide arrays and their use for sorting, isolating, sequencing, and manipulating nucleic acids
AU3942993A (en) 1992-03-31 1993-11-08 Abbott Laboratories Method of multiplex ligase chain reaction
EP0636186B1 (en) * 1992-04-03 1998-11-25 The Perkin-Elmer Corporation Probe composition and method
US5470705A (en) 1992-04-03 1995-11-28 Applied Biosystems, Inc. Probe composition containing a binding domain and polymer chain and methods of use
EP1262560A2 (en) 1992-05-29 2002-12-04 Abbott Laboratories Method of forming cDNA from an RNA target sequence present in a sample
US5981176A (en) * 1992-06-17 1999-11-09 City Of Hope Method of detecting and discriminating between nucleic acid sequences
JPH06509946A (ja) 1992-06-17 1994-11-10 シティ・オブ・ホープ 核酸を検出し識別する方法
WO1994001446A2 (en) 1992-07-09 1994-01-20 Beckman Instruments, Inc. Derivatized organic solid support for nucleic acid synthesis
GB9214873D0 (en) 1992-07-13 1992-08-26 Medical Res Council Process for categorising nucleotide sequence populations
CA2140331C (en) 1992-08-03 2000-01-18 John J. Carrino Detecting and amplifying target nucleic acids using exonucleolytic activity
US6180338B1 (en) 1992-08-04 2001-01-30 Beckman Coulter, Inc. Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences
WO1994006906A1 (en) 1992-09-18 1994-03-31 Merck & Co., Inc. DNA ENCODING MURINE PRECURSOR INTERLEUKIN 1β CONVERTING ENZYME
AU4848393A (en) 1992-09-25 1994-04-26 Abbott Laboratories Ligase chain reaction method for detecting small mutations
WO1994009022A1 (en) * 1992-10-09 1994-04-28 Oncor, Inc. Methods for the detection of chromosome structural abnormalities by in situ hybridization to fixed tissue
US5795714A (en) * 1992-11-06 1998-08-18 Trustees Of Boston University Method for replicating an array of nucleic acid probes
JP2575270B2 (ja) * 1992-11-10 1997-01-22 浜松ホトニクス株式会社 核酸の塩基配列決定方法、単一分子検出方法、その装置及び試料の作成方法
US5605798A (en) * 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
AU6088094A (en) 1993-01-15 1994-08-15 General Hospital Corporation, The Rna assays using rna binary probes and ribozyme ligase
DE69434688T2 (de) 1993-01-15 2007-01-11 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Diagnostischer nachweis von rna und reagentiensätze unter verwendung binärer rna proben und einer rna-abhängigen rna ligase
JP3778925B2 (ja) 1993-01-15 2006-05-24 ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティチュート オブ ザ シティー オブ ニューヨーク インク 高感度核酸サンドイッチハイブリダイゼーション検定法及びキット
EP0686200A4 (en) * 1993-01-27 1997-07-02 Oncor Inc AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACID SEQUENCES
US5593840A (en) * 1993-01-27 1997-01-14 Oncor, Inc. Amplification of nucleic acid sequences
WO1994017206A1 (en) * 1993-01-27 1994-08-04 Oncor, Inc. Method for amplifying nucleic acid sequences
US5985548A (en) 1993-02-04 1999-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Amplification of assay reporters by nucleic acid replication
DE69413574T2 (de) * 1993-02-09 1999-05-12 Agfa-Gevaert N.V., Mortsel Eine Verarbeitungslösung und Verfahren zur Herstellung einer lithographischen Offsetdruckplatte nach dem Silbersalz-Diffusionsübertragungsverfahren
US5593826A (en) 1993-03-22 1997-01-14 Perkin-Elmer Corporation, Applied Biosystems, Inc. Enzymatic ligation of 3'amino-substituted oligonucleotides
US5422252A (en) * 1993-06-04 1995-06-06 Becton, Dickinson And Company Simultaneous amplification of multiple targets
CA2122203C (en) * 1993-05-11 2001-12-18 Melinda S. Fraiser Decontamination of nucleic acid amplification reactions
US6709813B1 (en) 1993-05-14 2004-03-23 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of human CMV DNA using primers having matched melting temperatures
US5652106A (en) * 1993-06-04 1997-07-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Rapid amplification-based subtyping of mycobacterium tuberculosis
DK72493D0 (da) 1993-06-18 1993-06-18 Risoe Forskningscenter Solid supports for use in peptide synthesis and assays
US5837832A (en) * 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US5858659A (en) * 1995-11-29 1999-01-12 Affymetrix, Inc. Polymorphism detection
US5731171A (en) * 1993-07-23 1998-03-24 Arch Development Corp. Sequence independent amplification of DNA
US5601978A (en) * 1993-09-03 1997-02-11 Abbott Laboratories Oligonucleotides and methods for the detection of chlamydia trachomatis
US5415839A (en) * 1993-10-21 1995-05-16 Abbott Laboratories Apparatus and method for amplifying and detecting target nucleic acids
US6156501A (en) * 1993-10-26 2000-12-05 Affymetrix, Inc. Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use
US5352582A (en) * 1993-10-28 1994-10-04 Hewlett-Packard Company Holographic based bio-assay
US5429807A (en) * 1993-10-28 1995-07-04 Beckman Instruments, Inc. Method and apparatus for creating biopolymer arrays on a solid support surface
US5415087A (en) * 1994-01-21 1995-05-16 Norfolk Southern Railway Co. Mobile tie banding apparatus
US5631130A (en) 1994-05-13 1997-05-20 Abbott Laboratories Materials and methods for the detection of Mycobacterium tuberculosis
JPH10500567A (ja) 1994-05-13 1998-01-20 アボツト・ラボラトリーズ マイコバクテリアの検出用材料及び検出方法
US5508168A (en) * 1994-05-16 1996-04-16 Hoffmann-La Roche Inc. Methods and reagents for the detection of herpes simplex virus, treponema pallidum, and haemophilus ducreyi
US7378236B1 (en) 1994-06-17 2008-05-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for analyzing gene expression patterns
EP0717782A1 (en) * 1994-06-22 1996-06-26 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Ligation-dependent amplification for the detection of infectious pathogens and abnormal genes
US5876924A (en) * 1994-06-22 1999-03-02 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM)
US5942391A (en) * 1994-06-22 1999-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM)
US5834181A (en) * 1994-07-28 1998-11-10 Genzyme Corporation High throughput screening method for sequences or genetic alterations in nucleic acids
CA2195562A1 (en) * 1994-08-19 1996-02-29 Pe Corporation (Ny) Coupled amplification and ligation method
US5648213A (en) * 1994-08-30 1997-07-15 Beckman Instruments, Inc. Compositions and methods for use in detection of analytes
US5695934A (en) * 1994-10-13 1997-12-09 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
US5604097A (en) * 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
US5512441A (en) * 1994-11-15 1996-04-30 American Health Foundation Quantative method for early detection of mutant alleles and diagnostic kits for carrying out the method
WO1996015271A1 (en) * 1994-11-16 1996-05-23 Abbott Laboratories Multiplex ligations-dependent amplification
ES2294787T3 (es) 1995-06-05 2008-04-01 Biomerieux, Inc. Dispositivo y metodo para detectar microorganismos.
US5667974A (en) * 1995-06-07 1997-09-16 Abbott Laboratories Method for detecting nucleic acid sequences using competitive amplification
HUP9900910A2 (hu) 1995-06-07 1999-07-28 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonukleotid jelzések osztályozáshoz és azonosításhoz
US5728526A (en) 1995-06-07 1998-03-17 Oncor, Inc. Method for analyzing a nucleotide sequence
US5723320A (en) * 1995-08-29 1998-03-03 Dehlinger; Peter J. Position-addressable polynucleotide arrays
US5759779A (en) 1995-08-29 1998-06-02 Dehlinger; Peter J. Polynucleotide-array assay and methods
US5695937A (en) * 1995-09-12 1997-12-09 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method for serial analysis of gene expression
US5856096A (en) 1995-09-20 1999-01-05 Ctrc Research Foundation Rapid and sensitive assays for detecting and distinguishing between processive and non-processive telomerase activities
ATE199572T1 (de) * 1995-11-21 2001-03-15 Univ Yale Unimolekulare segmentamplifikation und bestimmung
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
EP0880598A4 (en) 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US6962263B2 (en) * 1996-01-24 2005-11-08 Sambrailo Packaging, Inc. Produce packaging system having produce containers with double-arched ventilation channels
US20020150921A1 (en) * 1996-02-09 2002-10-17 Francis Barany Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
EP2574617B1 (en) 1996-02-09 2016-04-20 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US6852487B1 (en) * 1996-02-09 2005-02-08 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US5868136A (en) * 1996-02-20 1999-02-09 Axelgaard Manufacturing Co. Ltd. Medical electrode
EP2369007B1 (en) * 1996-05-29 2015-07-29 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US6312892B1 (en) 1996-07-19 2001-11-06 Cornell Research Foundation, Inc. High fidelity detection of nucleic acid differences by ligase detection reaction
EP0991419A1 (en) 1997-02-25 2000-04-12 Eli Lilly And Company Treatment of infertility with leptin receptor ligands
US6313048B1 (en) * 1997-03-03 2001-11-06 Micron Technology, Inc. Dilute cleaning composition and method for using same
US5932711A (en) * 1997-03-05 1999-08-03 Mosaic Technologies, Inc. Nucleic acid-containing polymerizable complex
US6899889B1 (en) * 1998-11-06 2005-05-31 Neomend, Inc. Biocompatible material composition adaptable to diverse therapeutic indications
US6506594B1 (en) 1999-03-19 2003-01-14 Cornell Res Foundation Inc Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays
US7014994B1 (en) * 1999-03-19 2006-03-21 Cornell Research Foundation,Inc. Coupled polymerase chain reaction-restriction-endonuclease digestion-ligase detection reaction process
CA2366459A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 Affymetrix, Inc. Universal arrays
US20030215821A1 (en) 1999-04-20 2003-11-20 Kevin Gunderson Detection of nucleic acid reactions on bead arrays
CA2426824A1 (en) 2000-10-24 2002-07-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Direct multiplex characterization of genomic dna

Also Published As

Publication number Publication date
JP5634936B2 (ja) 2014-12-03
US8597891B2 (en) 2013-12-03
US8802373B2 (en) 2014-08-12
US20120252696A1 (en) 2012-10-04
US20040203061A1 (en) 2004-10-14
US8642269B2 (en) 2014-02-04
JP2000511060A (ja) 2000-08-29
US7312039B2 (en) 2007-12-25
CA2255774A1 (en) 1997-12-04
US20100006437A1 (en) 2010-01-14
US6797470B2 (en) 2004-09-28
EP2369007B1 (en) 2015-07-29
US20080171330A1 (en) 2008-07-17
AU730633B2 (en) 2001-03-08
EP1736554A2 (en) 2006-12-27
US7332285B2 (en) 2008-02-19
AU3216097A (en) 1998-01-05
US7556924B2 (en) 2009-07-07
US20130224746A1 (en) 2013-08-29
US7166434B2 (en) 2007-01-23
US20150018249A1 (en) 2015-01-15
EP1736554B1 (en) 2013-10-09
US6027889A (en) 2000-02-22
EP0912761A4 (en) 2004-06-09
EP0912761A1 (en) 1999-05-06
US20120270272A1 (en) 2012-10-25
US20070042419A1 (en) 2007-02-22
US20120270220A1 (en) 2012-10-25
US20040214224A1 (en) 2004-10-28
CA2255774C (en) 2008-03-18
US8597890B2 (en) 2013-12-03
US20140315757A1 (en) 2014-10-23
US7429453B2 (en) 2008-09-30
EP1736554A3 (en) 2007-02-21
US20070054306A1 (en) 2007-03-08
JP4468488B2 (ja) 2010-05-26
JP2011139718A (ja) 2011-07-21
JP2008092959A (ja) 2008-04-24
US8283121B2 (en) 2012-10-09
US20060024731A1 (en) 2006-02-02
US20070054305A1 (en) 2007-03-08
WO1997045559A1 (en) 1997-12-04
US20070048783A1 (en) 2007-03-01
EP2369007A1 (en) 2011-09-28
US7364858B2 (en) 2008-04-29
US7320865B2 (en) 2008-01-22
US20030032016A1 (en) 2003-02-13
US7097980B2 (en) 2006-08-29
US6268148B1 (en) 2001-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4781372B2 (ja) 組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出
US7244831B2 (en) High fidelity detection of nucleic acid differences by ligase detection reaction

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080204

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20080204

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080912

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080917

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100510

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20101124

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110223

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110228

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20110324

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20110329

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110422

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20110422

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20110422

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20110607

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20110705

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140715

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term