CN101586150B - 检测探针、通用寡核苷酸芯片及核酸检测方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明是有关于一种检测探针、通用寡核苷酸芯片及核酸检测方法及其用途。通过设计线性检测探针对P1和P2实现对核酸样本上待测碱基或突变位点的高通量检测。将检测探针与核酸样本退火杂交，之后将其均分成四个反应体系，在每个体系中分别加入A，T，G，C，在DNA聚合酶和连接酶的作用下，将相应的检测探针对P1和P2连接成为一条探针，将此探针进行纯化和扩增后，与通用寡核苷酸微阵列上的对应区域进行杂交，最后对杂交结果进行检测和分析，确定核酸样本上待测位点碱基类型或突变位点基因型。本发明可应用于对目标核酸序列进行重测序分析、对已知核酸序列中的突变位点，插入/缺失位点进行检测分析及病原微生物的分型检测领域，具有低成本、高特异性、高灵敏度的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测探针、通用寡核苷酸芯片及核酸检测方法,特别是涉及一种用于核酸检测及序列分析的核酸检测方法及其所使用的检测探针、通用寡核苷酸芯片。
背景技术
基因突变是指基因组DNA分子在结构功能上发生碱基对组成或排列顺序的改变,主要包括碱基的替换和小片段的缺失或插入,它是导致基因型疾病的重要原因之一。而多态性是指在进化过程中已经在人群中积累起来的DNA序列变化。基因突变及多态性分析在生物医学研究中,尤其是在基因型疾病诊断及病理研究中有着非常重要的作用。随着人类基因组整体测序计划的发展,探索基因突变及多态性的任务变得十分迫切。
测定基因突变的方法很多,最经典的基因突变检测技术是核酸分子杂交.传统的核酸分子杂交方法有膜上印迹杂交(如Southern印迹、Northern印迹)和细胞原位杂交等.由于核酸分子杂交的高度特异性及检测的高度灵敏性,它的应用对分子生物学的迅猛发展起着重要的推动作用.但由于传统的核酸分子杂交方法整个过程繁杂,操作步骤多,特别是探针往往用放射性物质标记,容易对人体造成伤害。因此,迫切需要新的、快速、安全的检测分析技术。
自1985年PCR技术问世以后,由于它具有强大的DNA体外扩增能力,与核酸分子杂交技术相结合,使其敏感性和特异性都大大增强.因此基因突变检测技术得到了迅速的发展,不断衍生出许多新的检测手段和技术.它们中的许多方法适合于点突变的检测,亦应用于检测SNPs.目前常用于基于PCR技术的检测方法包括:检测已知突变和SNPs的方法有等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、连接酶链反应(LCR)、TaqMan技术，多聚酶链限制性长度多态性分析(PCR-RFLP)、短串联重复长度多态性(STR)等；检测未知突变的方法有单链构象多态性(SSCP)、异源双链多态性分析(HPA)、MALDI-TOF质谱分析(matrix assisted laserdesorptionion Ization time of flight mass spectrometry)，变性梯度凝胶电泳(DGGE)、酶促切割错配(EMC)、双脱氧指纹图谱法(ddF)以及DNA测序法等.这些方法的特点、原理及应用已有许多报道.虽然这些方法能够检测突变是否存在,但大多数方法不能确定突变的类型并且只能检测到SNP的一部分；同时大多数方法如琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,毛细管电泳,高效液相色谱等需要PCR后处理等检测手段才能分析判断结果,而且结果判断比较复杂.此外,上述大多数检测技术处理过程复杂,一次只能检测少量样品,很难满足自动化的需要。
DNA测序法是最根本的一种检测突变的方法,其虽然能准确确定突变的部位及性质,但目前以凝胶电泳为基础的测序技术费时,自动测序仪测序费用高,限制了其在实际中的应用。
生物微阵列(或称生物芯片)技术是近年来出现的快速、高通量的检测工具，它利用微点阵技术，将成千上万的生物组分(细胞、蛋白质和DNA等)排列在固相基质上，生物样品中被检测组分与基质上特定物质反应，然后引入相应的信号(如荧光)达到对生物样品分析的目的。生物微阵列技术使一些传统的生物学分析手段能够在尽量小的空间范围内，以尽量快的速度完成。目前，生物芯片技术飞速发展，包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片、细胞芯片、芯片实验室等多种芯片技术已经被研究者用于大规模突变检测和多态性筛选。
目前,有多种基于DNA芯片的方法及专利技术用于基因突变检测(如SNPs检测)及核酸测序分析，如在以基于核酸杂交反应，单碱基延伸反应(Nikiforov et al.,1994；Bellet al.,2002)，等位基因特异性引物延伸和连接反应(Gunderson et al.,2005；Landegrenet al.,1988)，引物连接反应(Weiguo Cao，Clinical and Applied Immunology Reviews22001：33–43)，限制性内切酶反应，锁式探针反应(xiaoquan Qi,Nucleic AcidsResearch,2001,Vol.29,No.22e116)等原理的基础上出现了诸如贝克曼公司的SNP通量分析系统(SNPStream assay(Orchid Cellmark/Beckman Coulter))，伊路明纳公司的GoldenGate多重位点特异性延伸扩增分型系统(GoldenGate genotyping assay(Illumina))，昂飞公司的人全基因组图谱分析系统(GeneChip Human Mapping assays(Affymetrix))，伊路明纳公司的Infinium基因分型系统(Infinium genotyping assay(Illumina))，昂飞公司的药物代谢酶和转运体目标基因分型系统(Targeted GenotypingSystem for drug metabolizing enzymes and transports(DMETs)analysis(Affymetrix))等突变(如SNPs)检测平台，另外在相关的专利技术如US 5427930，US6479242，WO9300447，US 5871921，US 6858412，US 5866337等中对相关的基因突变检测(如SNPs检测)及核酸测序分析也有所介绍。
这些方法虽然都有自身的一些优势，但是也都存在各自的缺陷，如基于直接核酸杂交反应的芯片技术，其非特异性杂交导致分辨率不高，易产生假阳性结果；基于单碱基延伸反应和等位基因特异性引物延伸反应的芯片技术均需要多色荧光系统及需要对靶标进行扩增、制备和纯化等步骤，从而使大规模的突变检测工作费时耗力等。
有鉴于上述现有的基因突变检测(如SNPs检测)及核酸测序分析方法存在的缺陷，本发明人基于从事此类产品设计制造多年丰富的实务经验及专业知识，并配合学理的运用，积极加以研究创新，以期创设一种新的检测探针、通用寡核苷酸芯片及核酸检测方法，能够改进一般现有的基因突变检测及核酸测序分析方法，使其更具有实用性。经过不断的研究、设计,并经过反复试作样品及改进后，终于创设出确具实用价值的本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于，克服现有的基因突变检测及核酸测序分析方法存在的缺陷，而提供一种新的检测探针、通用寡核苷酸芯片及核酸检测方法，所要解决的技术问题是使其能够达到低成本、高特异性、高灵敏度的目的，非常适于实用。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种检测探针，其特征在于其是由针对各个待测位点的检测探针对P1，P2组成的，P1和P2分别含有与待测碱基位点两侧的序列互补的序列H1和H2，并各含有一条相关的通用寡核苷酸序列H3和H4，且在P1或P2上至少还含有某个特定的Tag序列，所述的检测探针对P1和P2通过下述方法连接成为一条探针：将检测探针对P1和P2与待测核酸样本退火杂交，通过H1和H2与待测碱基位点两侧的序列互补，在探针P1和P2间形成与待测碱基位点处的碱基相对应的缺口，将退火后的反应体系均分成A、T、G、C四个反应体系，在A体系中加入dATP，在T体系中加入dTTP，在G体系中加入dGTP，在C体系中加入dCTP，与待测碱基位点处的碱基互补的碱基在DNA聚合酶和连接酶的作用下就会填充上述缺口，将检测探针对P1和P2连接成为一条探针。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
前述的检测探针，其中所述的检测探针对还包括另一条探针P2’，且该探针含有与待测碱基位点一侧的序列互补的序列H1或H2，一条相关的通用寡核苷酸序列H3或H4，某个特定的Tag序列及与待测样本插入型位点的插入序列互补的序列H5。
前述的检测探针，在探针P1或P2上至少还含有生物素标记分子，且该生物素标记分子与探针的核苷酸序列之间还包含有一段连接臂。
前述的检测探针，其中所述的连接臂为碳连接臂，或非碳类型的连接臂。
前述的检测探针，其中所述的非碳类型的连接臂为聚乙二醇、polyA、polyT。
前述的检测探针，其可应用于对目标核酸序列进行重测序分析、对已知核酸序列中的突变位点和插入/缺失位点进行检测分析及病原微生物的分型检测领域。
本发明的目的及解决其技术问题还可以采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种通用寡核苷酸芯片，其包含分成A,T,G,C四个相同的区域，每个区域对应的各个位点上分别点制与对应的检测探针上的Tag序列相同的寡核苷酸序列。
前述的通用寡核苷酸芯片，其可以应用于对目标核酸序列进行重测序分析、对已知核酸序列中的突变位点和插入/缺失位点进行检测分析及病原微生物的分型检测领域。
本发明的目的及解决其技术问题另外还采用以下技术方案来实现。为达到上述目的，依据本发明提出的一种基于通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法，其包括以下步骤：①待测核酸样本的制备；②检测探针的制备，所述探针是由针对各个待测位点的检测探针对P1和P2组成的，P1和P2分别含有与待测碱基位点两侧的序列互补的序列H1和H2，并各含有一条相关的通用寡核苷酸序列H3和H4，且在P1或P2上至少还含有某个特定的Tag序列；③将各探针对P1和P2与核酸样本退火杂交，在探针间形成与待测碱基位点处的碱基相对应的缺口；④将退火后的反应体系均分成A、G、T、C四个反应体系，在A体系中加入dATP，在T体系中加入dTTP，在G体系中加入dGTP，在C体系中加入dCTP，在DNA聚合酶和连接酶的作用下，与待测碱基位点处的碱基互补的碱基就会填充上述缺口，将检测探针对P1和P2连接成为一条探针；⑤纯化上述连接的探针；⑥扩增纯化出的探针；⑦通用寡核苷酸芯片的制备，将每张芯片分成A,T,G,C四个杂交区域，每个区域对应的各个位点上分别点制与对应的检测探针P1或P2上的Tag序列相同的寡核苷酸序列；⑧将上述寡核苷酸芯片的A,T,G,C四个杂交区域用来分别和扩增后的四个反应体系中的探针进行杂交；⑨对芯片进行结果检测分析。
前述的核酸检测方法，其中所述的检测探针的制备步骤中，还包括另一条探针P2’，该探针含有与待测碱基位点一侧的序列互补的序列H1或H2，一条相关的通用寡核苷酸序列H3或H4，某个特定的Tag序列及与待测样本插入型位点的插入序列互补的序列H5。
前述的核酸检测方法，其中所述的待测核酸样本为动植物染色体DNA、目标核酸PCR扩增产物、线粒体DNA、cDNA、细菌或者病毒DNA或RNA。
前述的核酸检测方法，其中所述的检测探针P1或P2的不发生连接反应的一端至少还含有生物素标记分子，且该生物素标记分子与探针的核苷酸序列之间还含有一段连接臂，有利于后续的探针纯化和扩增。
前述的核酸检测方法，其中所述的连接臂为碳连接臂、聚乙二醇、polyA或者polyT。
前述的核酸检测方法，其中所述的探针的纯化步骤是采用链亲和素包被载体介质来完成的。
前述的核酸检测方法，其中所述的载体介质为磁性微粒或者聚苯乙烯微球。
前述的核酸检测方法，其中所述的探针的扩增步骤是利用通用引物进行的对称或不对称PCR扩增。
前述的核酸检测方法，如果利用通用引物进行常规PCR扩增，则在其中至少在一条通用引物的5’端还含有分子标记。如果利用通用引物进行不对称PCR扩增，则通用引物中至少有一个为限制性引物，另一个为非限制性引物，且在非限制性引物的5’端至少还含有分子标记。
前述的核酸检测方法，其中所述的分子标记为非同位素标记或放射性同位素标记。
前述的核酸检测方法，其中所述的非同位素标记为荧光物质标记如荧光素分子(cy3,cy5,FITC)，金属标记如Hg,半抗原标记如地高辛，酶类如辣根过氧化物酶(HRP)，半乳糖苷酶，碱性磷酸酶等。
前述的核酸检测方法，其中所述的放射性同位素标记为32P或35S。前述的核酸检测方法，其中所述的对芯片进行结果检测分析的步骤是对芯片进行单色荧光扫描并根据芯片上四个分区对应位点上的荧光信号出现情况确定检测结果，或者对芯片进行酶显色的方法确定检测结果。
前述的核酸检测方法，其可应用于对目标核酸序列进行重测序分析、对已知核酸序列中的突变位点和插入/缺失位点进行检测分析及病原微生物的分型检测领域。
本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。本发明所提出的基于通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法，使用检测探针对P1和P2对核酸序列中的某个碱基位点进行检测，此两条探针的5’端和3’端的一段序列分别与待测碱基位点左右两侧的核酸序列互补，当探针和模板退火杂交后，就在待测碱基位点处形成一个碱基的缺口，并且因为检测是在四个反应管中进行的，所以只有当在每个反应管中加入的一种脱氧核糖核苷酸与在此反应管中待测碱基位点处的碱基互补时，才能够在DNA聚合酶的作用下被引入从而补平缺口，然后，再在DNA连接酶的作用下把两条探针P1和P2连接成为一条探针，从而才能够进行下一步探针的纯化和扩增步骤。此外，本发明以通用芯片技术为基础，将芯片分为四个区，点制在芯片上每个区特定位点上的Tag序列都是一样的。在杂交时，四个反应管中的扩增体系分别与芯片上的四个区进行独立杂交，最后用单色荧光扫描仪来完成芯片的扫描，根据芯片上四个区的对应位点上荧光信号的有无来进行检测结果的分析，非常简单。同时在微阵列上选用通用Tag序列能够排除对序列特异性探针和微阵列杂交的条件选择和优化。
借由上述技术方案，本发明一种新的检测探针、通用寡核苷酸芯片及核酸检测方法，具有下列优点及有益效果：
1.成本低。在本发明的核酸检测方法中，从以下几方面都降低了核酸检测的成本：首先，采用一对通用引物能够对所有的检测探针进行扩增，节省了进行多重PCR扩增时要根据靶标序列设计和优化大量扩增引物的费用；其次，本方法以通用寡核苷酸芯片技术为基础，采用存在于检测探针上和点制在芯片特定位点上的Tag序列用来对待测位点进行定位分析，避免了对序列特异性探针和微阵列杂交的条件的选择和优化费用；再次，本方法在通用引物P3或P4的5’端进行荧光素cy3、cy5或FITC标记从而在探针扩增时引入单色荧光标记对待测碱基位点进行检测，使得检测所需的扫描及结果分析设备的成本进一步降低。
2.特异性强。在本发明的核酸检测方法中，检测探针对P1和P2特异性的识别待测核酸样本模板，在分离的四个反应体系中对P1和P2探针形成的缺口进行填充和连接，通过磁粒纯化经连接的探针，这些步骤都使得该方法具有很高的特异性。
3.灵敏度高。在本发明的核酸检测方法中，不是采用直接对靶标序列进行多重PCR扩增来放大检测信号，而是在进行探针设计时将一对通用引物P3和P4的相关序列引入了所有检测探针对P1和P2序列之中，并且，在扩增时，以P3和P4为通用引物，进行不对称PCR扩增，不但形成便于和芯片杂交的单链，而且克服了基于多重PCR方法的随着目标序列的增加导致的不可控的交叉反应性，进一步提高了检测的灵敏度和特异性。
4.高通量的检测能力。基于本发明的核酸检测方法特有的检测探针的设计方法、扩增体系和芯片设计法，使其具有高通量的检测能力，且由于独特的芯片设计体系，有利于新的待检测位点还可以很容易的加入到芯片阵列中。
综上所述，本发明通过设计线性检测探针对P1和P2对实现对待测碱基或突变位点的高通量检测。在探针和模板退火杂交后，将其平均分成A、G、T、C四个反应体系，分别加入一种对应的脱氧核糖核苷酸—dATP、dTTP、dGTP、dCTP，之后在DNA聚合酶和连接酶的作用下，在四个反应体系中将相应的检测探针对P1和P2连接成为一条探针，再经链亲和素磁性微粒将连接后的探针纯化出来，再经单色荧光标记的一对通用核酸序列进行不对称PCR扩增使信号放大用于和芯片进行杂交。本发明中芯片的设计为分别对应于A、G、T、C四个反应体系而设定A、G、T、C四个分区与四个反应体系中的最后扩增产物进行独立杂交，经清洗，用单色荧光扫描仪扫描并根据芯片上四个分区对应位点上信号的有无进行信号分析确定待测位点碱基类型或突变位点基因型。
本发明具有上述诸多优点及实用价值，其不论在方法或功能上皆有较大的改进，在技术上有显著的进步，并产生了好用及实用的效果，且较现有的基因突变检测及核酸测序分析方法具有增进的突出多项功效，从而更加适于实用，诚为一新颖、进步、实用的新设计。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图,详细说明如下。
附图说明
图1A-图1B为本发明通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法一实施例的检测探针的示意图。
图2A-图2F为本发明通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法的流程示意图。
图3为本发明通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法的芯片示意图。
图4为本发明通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法用于核酸序列重测序的芯片结果分析示意图。
图5为本发明通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法用于SNP位点检测的芯片结果分析示意图。
图6A-图6C为本发明通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法另一实施例的检测探针的示意图。
图7A-图7D为本发明通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法另一实施例的核酸检测方法的流程示意图。
图8为本发明通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法用于插入/缺失位点检测的芯片结果分析示意图。
图9A－图9C为本发明通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法对存在于克隆人基因组P450药物代谢酶基因片段上的突变位点的检测结果的验证电泳图。
图10是本发明通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法对存在于克隆人基因组P450药物代谢酶基因片段上的突变位点进行芯片杂交后的结果扫描图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的检测探针、通用寡核苷酸芯片及核酸检测方法及其用途其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
本发明的原理在于，以通用寡核苷酸基因芯片为基础，通过设计线性检测探针对P1和P2对实现对待测碱基或突变位点的高通量检测。在探针和模板退火杂交后将反应分成A、G、T、C四个体系，在DNA聚合酶和连接酶的作用下完成探针P1和P2的连接，经过纯化和扩增及荧光信号的引入后，与芯片上对应的A、G、T、C四个杂交区域杂交。而芯片上的四个区域不同的对应位点都点制有和探针上相应的Tag序列。杂交后清洗芯片，用单色荧光扫描仪扫描并根据芯片上四个分区对应位点上信号的有无进行信号分析确定待测位点碱基类型或突变位点基因型。
图1A-图1B为本发明通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法一实施例的检测探针的示意图，对于某个待测碱基位点来说，检测所需探针的设计方法为：用两条线性探针P1和P2对其进行检测，所设计的寡核苷酸序列详细说明如下。
请参阅图1A所示，为本发明所设计的探针P1的寡核苷酸序列，该序列由H1,H3和连接臂(spacer)三部分组成，其中在探针P1的5’端的H3为一段20nt左右的通用寡核苷酸序列，用来对用于对探针进行对称或不对称PCR扩增；探针P1的3’端的H1为一段20nt左右的与模板上待测碱基位点一侧的核酸序列互补的序列；此外，为了对探针进行纯化以便于后续操作，在探针P1的5’端还有生物素标记分子；为了利于对探针进行纯化和PCR扩增，在生物素标记分子和探针P1的5’端核苷酸之间设计有一段连接臂，此连接臂可以为碳连接臂，也可以是其它类型的连接臂。
请参阅图1B所示，为本发明所设计的探针P2的寡核苷酸序列由H2,H4和tag三部分组成，其中在探针P2的5’端的20nt左右的序列为与待测碱基位点另一侧的核酸序列互补的序列H2；在探针P2的3’端的20nt左右的序列为与另一条通用引物P4互补的序列H4，并且对此条通用引物P4序列的5’端进行荧光素分子cy3标记；此外，探针P2中所含有某个特定的Tag序列，用于和芯片上特定位点进行杂交和识别。
图2A-图2F为本发明通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法的流程示意图。请参阅图2A所示，为将检测所需的探针和核酸样本在适合的温度条件下进行退火杂交的过程，探针和模板退火杂交后，在探针P1的3’端和P2的5’端形成一个碱基的缺口，使此缺口处的碱基刚好与待测碱基位点处碱基相对应。
图2B所示在探针和模板退火杂交后，如果加入到反应体系中的碱基和模板上待测碱基位点处碱基互补时，则在DNA聚合酶和连接酶的作用下将探针P1和P2连接成一条探针。该缺口的填充以及探针的连接的详细过程为，将检测所需探针、DNA模板、核酸样本及反应缓冲液混合后，等量分成四个反应管，标记为A,T,G,C，经过退火和杂交后，在每对探针P1的3’端和P2的5’端形成一个碱基的缺口，使此缺口和待测碱基位点处的碱基相对应，然后在A,T,G,C四个反应管中分别加入一种对应的脱氧核糖核苷酸—dATP、dTTP、dGTP、dCTP及反应所需的DNA聚合酶，连接酶。只有当在四个反应管中加入的脱氧核糖核苷酸碱基和模板上待测碱基位点处的碱基互补配对时，其才能够在DNA聚合酶的作用下被引入由探针和模板退火后形成的缺口从而完成缺口填充(gap-填充)的过程，而在这一过程完成后，在DNA连接酶的作用下，探针P1和P2就完成连接(连接)过程从而连接成为一条完整的探针。
图2C-图2D所示为用链亲和素磁粒对完成连接后的探针进行纯化的过程，具体过程如下：在检测所需的各对探针P1和P2完成gap-填充和连接过程而成为一条完整的探针后，需要用链亲和素包被的磁性微球对其进行纯化。即在四个反应管中分别加入2×反应缓冲液，在37℃，180rpm恒温摇床中反应20分钟。反应完毕后，磁性分离，弃上清，用清洗缓冲液清洗磁粒三次。之后超纯水中保存。经纯化后，在每个反应体系中完成连接的探针就被链亲和素磁粒所捕获。
为了放大检测信号，需要分别对四个反应体系中的探针进行不对称PCR扩增后用于和芯片上的对应区域进行杂交。图2E-2F所示为探针的扩增过程，以经过缺口填充和连接过程而完成连接并被链亲和素包被磁粒纯化的探针为模板，以序列H3和P4作为一对通用引物进行对称或不对称PCR扩增。加入DNA聚合酶和反应缓冲液，以序列H3为限制性引物，P4为非限制性引物进行不对称扩增，且P4的5’端有荧光分子标记cy3。经过扩增，形成大量的cy3标记的单链探针，之后经磁性分离，移取上清用于和芯片对应区域进行杂交。由于探针P2含有的特定Tag序列，使得在完成PCR扩增后荧光素分子cy3标记的扩增产物序列中含有一条与其互补的Anti-Tag序列，用四个体系中的扩增产物与点制有Tag序列的芯片上的对应的各个区域进行杂交，经清洗和扫描分析来确定检测结果。
图3为本发明通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法的芯片示意图。在一张芯片上，分为A,T,G,C四个区，用来分别和对称或不对称PCR扩增后的四个反应体系中的探针进行杂交，每个区的对应位置上都分别点制一种和探针P2上的Tag序列相同的序列，用来对这一特定待测碱基位点进行识别和定位，此四个区分别用来与加入对应碱基的体系的扩增产物进行杂交。如图3所示，其以点制15个Tag序列为例说明芯片的分区情况，而此15个Tag序列对应的位点可以对15个待测碱基位点进行检测，并且随着每区点制的Tag序列的数目的增加，本技术的检测通量也随着增大，因此，本技术可达到相当大的检测通量。
本发明所提出的通用寡核苷酸微阵列，可以用于对目标核酸序列进行重测序分析。所述的核酸序列重测序的芯片结果分析示意图如图4所示。若在芯片上的A区1位点有荧光信号出现，则说明与1位点Tag序列对应的检测探针的H1和H2序列存在于目标核酸序列中，并且目标核酸序列中所测位点处碱基为T。若在芯片上的G区2位点有荧光信号出现，则说明与2位点Tag序列对应的检测探针的H1和H2序列存在于目标核酸序列中，并且目标核酸序列中所测位点处碱基为C。若在芯片上的T区3位点有荧光信号出现，则说明与3位点Tag序列对应的检测探针的H1和H2序列存在于目标核酸序列中，并且目标核酸序列中所测位点处碱基为A。
本发明所提出的通用寡核苷酸微阵列，还可以用于对已知核酸序列的突变进行检测，如对SNPs突变位点检测。所述的SNP位点检测的芯片结果分析示意图如图5所示。用1位点，2位点和3位点分别对应于SNP1，SNP2和SNP3三个突变位点，如果芯片扫描后的结果如图所示，即1位点的A区和G区有荧光信号出现，2位点的C区有荧光信号出现，3位点的C区和T区有荧光信号出现，那么SNP1位点的基因型为T/C杂合型，SNP2位点的基因型为G/G纯合型，SNP3位点的基因型为G/A杂合型。
此外，本发明所提出的通用寡核苷酸微阵列还可用于插入/缺失位点进行检测分析。对于某个短片段的(一个或几个碱基的)插入/缺失型多态性位点的分型，采用三条探针P1，P2’和P2对其进行分型，探针的序列设计请参见图6A－图6C所示。图6A所示探针P1的寡核苷酸序列，由H1,H3和连接臂三部分组成，另外在其5’端为生物素标记。图6B所示探针P2’的寡核苷酸序列，由H2,H4,H5和tag四部分组成。图6C所示探针P2的寡核苷酸序列，由H2,H4和tag’三部分组成。其中H1为与模板上插入/缺失突变位点一侧序列互补的序列，H5为探针P2’上5’端与插入型多态性位点的序列互补的序列，H2为与模板上插入/缺失突变位点另一侧的序列互补的序列，H5为与插入型多态性位点一个或几个碱基的序列互补的序列，它只存在于探针P2’上5’端，而在探针P2的5’端却没有，这样，由探针P1和P2’对插入型模板进行分型检测，由探针P1和P2对缺失型模板进行分型检测。另外，H3和H4是用来对探针进行扩增的一对相关的通用寡核苷酸序列。在探针P2’和P2中还各含有某个特定的Tag序列用于和芯片上特定位点进行杂交和识别。
图7A-图7D为此实施例的核酸检测方法的流程示意图。图7A和7B所示为将检测所需的探针和模板在适合的温度下进行退火杂交的过程，以与模板上插入/缺失突变位点相邻的一个碱基做为探针和模板退火后形成的缺口处对应的碱基。在探针和模板退火杂交后，在探针P1的3’端和P2或P2’的5’端形成一个碱基的缺口。
图7C和7D所示为在探针和模板退火杂交后，如果加入到反应体系中的碱基和探针与模板退火后形成缺口处的碱基互补时，则在DNA聚合酶和连接酶的作用下将探针P1和P2或P2’连接成一条探针。之后探针的纯化，扩增及杂交过程与以上所述的检测过程相同。
所述的插入/缺失位点检测的芯片结果分析示意图如图8所示。对插入/缺失位点进行检测时，用芯片上各区的两个位点对一个插入/缺失位点进行检测。即若用芯片上的4位点和5位点对一个插入/缺失位点X进行检测，并且4位点所点制的tag序列对应于对插入型位点检测的探针P2’上的tag序列，5位点所点制的tag’序列对应于对缺失型位点检测的探针P2上的tag’序列；探针和模板退火后形成的缺口处对应的碱基为G；而用6位点和7位点对另一个插入/缺失位点Y进行检测，并且6位点所点制的tag序列对应于对插入型位点检测的探针P2’上的tag序列，7位点所点制的tag’序列对应于对缺失型位点检测的探针P2上的tag序列；探针和模板退火后形成的缺口处对应的碱基为T时，如图8所示，若4位点和5位点在C区都有荧光信号出现，那么位点X的基因型为插入/缺失杂合基因型，若只有7位点在A区有荧光信号而6位点无荧光信号出现时，那么位点Y的基因型为缺失/缺失纯合基因型。
以下是采用本发明所提出的通用寡核苷酸微阵列对存在于克隆人基因组P450药物代谢酶基因片段上的CYP3A4*17,c.566T>C(F189S)突变进行检测的实施例，其具体步骤如下：
(1)检测探针的设计及合成：所需检测探针对序列如下。
P1(53nt):
5’
P2(71nt):
P3(24nt):
5’cy3-CCAGA CGACA CCGAG ATAGC AGCC-3’
P4(24nt):
5’-GGGTTCGTGGTAGAGCGTCGGAGT-3’
tag sequence(24nt):
5’-GCCGTGTCTGCCGCTGGGTTATCA-3’
(2)检测探针P1和P2的连接：通过填充和连接过程填补探针P1和P2之间的缺口，反应体系配制如下：探针P1和P2各取10fmol，模板取1～5ng。各加入0.1μl的DNA polymerase和DNA Ligase，再加入10×反应缓冲液，平均分成四个反应管，每个反应管中分别加入0.1μl的dATP、dTTP、dGTP、dCTP,超纯水补足20μl。在以下反应条件下反应：94℃，5min；94℃，1min，57℃，2min；30个循环，57℃，5min。
(3)探针连接后的纯化：
a.连接反应完毕，将四个反应体系94℃，10min，冰上骤冷。
b.在四个反应体系中分别加入2×纯化缓冲液和5μl的链亲和素磁粒。恒温摇床中37℃，180rpm,20min.反应完毕，磁性分离，弃上清。加入80μl清洗缓冲液清洗两次。磁性分离，弃上清。
c.5μl超纯水重悬磁粒。
(4)纯化探针的PCR扩增：扩增体系如下，取1μl重悬的磁粒做为模板，各取0.1μl的通用引物P3和P4，加入7.5μl的2×Taq PCR mastermix和6.5μl的dH2O使反应体系为15μl，以下列条件做PCR扩增：94℃，5min；94℃，1min，55℃，1min，72℃，1min；20个循环，72℃，5min，4℃保存。反应完毕，四个体系分别磁性分离，移取上清备用。
(5)7μl的PCR产物做1.5％琼脂糖凝胶电泳或12％PAGE凝胶电泳验证反应体系的正确性。预测结果为当对野生型(T)模板进行检测时，只有在A反应体系中才能完成探针P1和P2的连接及后续的以连接产物为模板的PCR的扩增，因此也只应在A反应体系产物所在泳道出现PCR产物。当对野生型(T)和突变型(G)模板的混合检测时，只有在A和G反应体系中才能完成探针P1和P2的连接及后续的以连接产物为模板的PCR的扩增，因此也只应在A和G反应体系产物所在泳道出现PCR产物。结果如图9A-图9C所示。
(6)寡核苷酸芯片的制备：制备醛基化的片基，并按照权利要求书中要求分为四个杂交区域，并在各个区域点制相应的Tag序列。烘干备用。
(7)探针的杂交:将步骤(5)的PCR扩增产物与杂交缓冲液混合，与对应的芯片区域在60℃杂交4h.杂交完毕，经清洗后甩干。
(8)芯片扫描及结果分析：用单色荧光扫描仪对芯片进行扫描，结果如图5所示。根据扫描图进行结果分析。
图9A－图9C为利用本发明通用寡核苷酸微阵列的核酸检测方法对存在于克隆人基因组P450药物代谢酶基因片段上的突变位点的检测结果的验证电泳图。
图9A为对存在于克隆人基因组P450药物代谢酶基因片段上的CYP3A4*17,c.566T>C(F189S)突变的野生型(T)模板的检测结果。四个反应体系在经过探针纯化和PCR扩增后，将扩增产物做1.5％琼脂糖凝胶电泳。泳道M为DNA Marker2000.泳道A,C,G,T分别为四个反应体系所在的泳道。从图上可以看出，只有在A泳道中出现了一条长度为100nt以上的条带，而在其余三个泳道中都没有相应的条带出现。这与实验的预期是相同的。为了验证在A泳道中出现的条带是否就是理论上应该出现的条带，因此，对出现的条带进行了胶回收，并将回收产物用通用引物P3和P4做PCR扩增，扩增产物做1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果如图9B所示。由如图9B可以看出，在和图9A泳道A相同位置也出现了一条条带，这也证明了图9A泳道A中出现的条带确实是探针P1和P2完成连接后，以其为模板，以通用引物P3和P4为引物做PCR扩增后的产物。
图9C为对存在于克隆人基因组P450药物代谢酶基因片段上的CYP3A4*17,c.566T>C(F189S)突变的野生型(T)和突变型(G)模板的混合检测结果。四个反应体系在经过探针纯化和PCR扩增后，将扩增产物做12％PAGE凝胶电泳。泳道M为DNA Marker2000.泳道A,C,G,T分别为四个反应体系所在的泳道。从图上可以看出，同时在A泳道和G泳道中出现了一条长度为100nt以上的条带，而在其余两个泳道中都没有相应的条带出现。这与实验中对野生型(T)和突变型(G)混合模板的检测的预期结果是相同。
图10是对存在于克隆人基因组P450药物代谢酶基因片段上的CYP3A4*17,c.566T>C(F189S)突变的野生型(T)模板进行检测的芯片杂交后的结果扫描图。
在图10中，芯片上各区分别点制6个点，其中两个空白对照点，四个Tag序列所在点。图上A区和T区分别是A和T反应体系在经过探针纯化后，做PCR扩增，取6μl扩增产物的杂交扫描结果。从扫描结果可以看出，只有在A区的四个Tag序列所在点均有较强荧光信号出现，而在T区对应各点仅有非常微弱的荧光信号出现。A区和T区Tag序列所在点的荧光信号比值可达10以上。
从图9A-图9C及图10表明此方法可以作为对SNP进行分析的新方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (14)
1.一种核酸检测方法，应用于包括对目标核酸序列进行重测序分析、对已知核酸序列中的突变位点和插入/缺失位点进行检测分析在内的非疾病诊断治疗目的，其中核酸序列中的突变位点和插入/缺失位点差异为单个核苷酸残基，或者为多个核苷酸残基但所述多个核苷酸残基为连续的相同的核苷酸残基；其特征在于其包括以下步骤：
①待测核酸样本的制备；
②检测探针的制备，所述检测探针是由针对各个待测位点的检测探针对P1、P2组成，且所述检测探针对P1、P2分别含有一条核苷酸序列H1、H2,且H1、H2序列和紧邻待测碱基位点两侧的序列互补；检测探针对P1、P2还各含有一条通用寡核苷酸序列H3、H4，H3序列和H4序列的互补序列作为一对通用引物的序列用来对检测探针对进行扩增；且在该检测探针对上至少还含有一个用于与检测芯片上特定位点进行杂交和识别的Tag序列，且该Tag序列位于检测探针P1或P2中间部分，也即H1与H3、或H2与H4的中间部分；
③将各检测探针对与核酸样本退火杂交，在各检测探针对间形成与待测碱基位点处的碱基相对应的缺口；
④将退火后的反应体系均分成A、T、G、C四个反应体系，在A体系中加入dATP，在T体系中加入dTTP，在G体系中加入dGTP，在C体系中加入dCTP，在DNA聚合酶和连接酶的作用下，与待测碱基位点处的碱基互补的碱基就会填充上述缺口，将各检测探针对连接成为一条检测探针；
⑤纯化上述连接的检测探针；
⑥扩增纯化出的检测探针；
⑦通用寡核苷酸芯片的制备，将每张芯片分成A,T,G,C四个杂交区域，每个区域在检测探针对P1、P2间形成与待测碱基位点处的碱基相对应的各个位点上分别点制与对应的检测探针上的Tag序列相同的寡核苷酸序列；
⑧将上述寡核苷酸芯片的A,T,G,C四个杂交区域用来分别和扩增后对应的四个反应体系中的检测探针进行杂交；
⑨对芯片进行结果检测分析。
2.一种核酸检测方法，应用于包括对目标核酸序列进行重测序分析、对已知核酸序列中的突变位点和插入/缺失位点进行检测分析在内的非疾病诊断治疗目的；其特征在于：采用权利要求1所述的核酸检测方法，其中所述的各检测探针对的制备步骤中，还包括另一条检测探针P2’，由探针P1和P2’对插入型模板进行分型检测，由探针P1和P2对缺失型模板进行分型检测；该检测探针P2’含有一条核苷酸序列H1或H2，且H1或H2序列和紧邻待测碱基位点一侧的序列互补；检测探针P2’还含有一条通用寡核苷酸序列H3或H4，H3序列和H4序列的互补序列作为一对通用引物的序列用来对检测探针对进行扩增；检测探针P2’还含有一个用于与检测芯片上特定位点进行杂交和识别的Tag序列及与待测样本插入型多态性位点的插入序列互补的序列H5，且该Tag序列位于H1与H3、或H2与H4的中间部分。
3.根据权利要求1或2所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的待测核酸样本为动植物染色体DNA、目标核酸PCR扩增产物、线粒体DNA、cDNA、细菌或者病毒DNA或RNA。
4.根据权利要求1或2所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的检测探针对中检测探针的不发生连接反应的一端至少还含有生物素标记分子，且该生物素标记分子与检测探针的核苷酸序列之间还含有一段连接臂，有利于后续的检测探针纯化和扩增。
5.根据权利要求4所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的连接臂为碳连接臂、聚乙二醇、polyA或polyT。
6.根据权利要求1或2所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的检测探针的纯化步骤是采用链亲和素包被载体介质来完成的。
7.根据权利要求6所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的载体介质为磁性微粒或聚苯乙烯微球。
8.根据权利要求1或2所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的检测探针的扩增步骤是利用与所述各检测探针对上的通用寡核苷酸序列H3，H4对应的通用引物进行的对称或不对称PCR扩增。
9.根据权利要求8所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的对称PCR扩增，至少在一条通用引物的5’端还含有分子标记；其中所述的不对称PCR扩增，至少有一条为限制性通用引物，另一条为非限制性通用引物，且在非限制性通用引物的5’端至少还含有分子标记。
10.根据权利要求9所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的分子标记为非同位素标记或放射性同位素标记。
11.根据权利要求10所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的非同位素标记为荧光素分子,金属标记，半抗原标记或酶类。
12.根据权利要求11所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的荧光素分子为cy3,cy5,FITC，金属标记为Hg，半抗原标记为地高辛，酶类为辣根过氧化物酶HRP，半乳糖苷酶，碱性磷酸酶。
13.根据权利要求11或12所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的对芯片进行结果检测分析的步骤是对芯片进行单色荧光扫描并根据芯片上四个分区对应位点上的荧光信号出现情况确定检测结果，或者对芯片进行酶显色的方法确定检测结果。
14.根据权利要求10所述的核酸检测方法，其特征在于其中所述的放射性同位素标记为32P或35S。
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