JP3668075B2 - 遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰｓ高速スコアリング方法 - Google Patents
遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰｓ高速スコアリング方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高速スコアリング方法に関し、詳しくは、ＤＮＡ断片等の遺伝物質の塩基配列や、ＳＮＰs の特定を行うための遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高速スコアリング方法に関する。
【０００２】
本発明は、農学、工学、薬学、医学、心理学または化学若しくは生物学等の理学等の分野で、遺伝子の塩基配列の決定や操作や、医療、薬品、生理衛生、保健、生物または食品等の種々の領域において、遺伝物質の塩基配列の決定や、遺伝物質の塩基配列とヒトを含む種々の生物の形態、構造、性質、体質、病気、薬剤に対する感受性、気質、性格等との関係の解明に利用することができるものである。
【０００３】
【従来の技術】
従来、「ありふれた病気」の疾患感受性遺伝子の同定と薬剤に対する感受性を決定するＳＮＰs （single nucleotid polymorphisms、単一のヌクレオチド多型）を特定するために、全ゲノムにわたる高効率ＳＮＰs 検出のスコアリングシステムの開発が急務であった。現時点では、高効率でＳＮＰｓを検出スコアリングするシステムは開発段階にあり、ハイブリダイゼーションの原理に基づくいわゆるＤＮＡチップが予備的に検討されているにすぎない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、ＤＮＡチップは、半導体膜やスライドグラス等の平板にスポットされた既知のひとつのＳＮＰに対し、このＳＮＰを含む１０種類以上のオリゴヌクレオチドアレイを準備し、これらにＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片がハイブリダイズするか否かによりＳＮＰｓを検出するAffimetrix社等によるシステムが既に実用化されている。
【０００５】
しかし、このＤＮＡチップを用いた方法は、機器とランニングコストが高価であるという問題点を有していた。また、ＤＮＡチップは、ハイブリダイゼーション反応が非特異的物理化学反応であるために、このような複数オリゴヌクレオチドを利用した重複性（redundancy) のあるシステムが必要であり、このシステムを用いたとしても約１０％の誤り判定が生ずるという問題点をも有していた。
【０００６】
本発明は以上の課題を解決することを目的としてなされたものであり、その第一の目的は、従来のいわゆるＤＮＡチップ等の方法で行われている、スライドグラスのスポット内の限られた狭い平面上のハイブリダイゼーション反応ではなく、微小粒子（ビーズ）を用いることによって、反応面積を増加させ液体内での反応を促進させ、反応効率を飛躍的に上昇させて平衡に達するまでの時間を短縮させることができる遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高速スコアリング方法を提供することである。
【０００７】
第２の目的は、塩基配列を特異的に認識する酵素反応の高い特異性を用いることによって、重複性を必要とせず確実に塩基配列をスコアリングすることができる遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高速スコアリング方法を提供することである。
【０００８】
第３の目的は、スライドグラス上に固定化したオリゴヌクレオチドの位置に基づいて配列を決定するのではなく、コード化した多種類のビーズを用いることによって同一条件で一括して反応を進めることによって決定するものであり、高速かつ信頼性高い遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高速スコアリング方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
以上の目的を達成するために、第一の発明は、所定塩基数の１種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するようにコード化された第１のコード化オリゴヌクレオチドを、その塩基数における全種類若しくは特定種類の塩基配列を網羅するように包含し、その群に属するものとして各々選別可能に設けられた第１のコード化オリゴヌクレオチド群と、所定塩基数の１種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するようにコード化された第２のコード化オリゴヌクレオチドを、その塩基数における全種類若しくは特定種類の塩基配列を網羅するように包含し、その群に属するものとして各々選別可能に設けられた第２のコード化オリゴヌクレオチド群と、２つのコード化オリゴヌクレオチドが一本鎖の遺伝物質にハイブリダイズされてその塩基配列の末端ヌクレオチドが直接に隣接する場合であって、かつ、前記所定塩基数の塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と一定の関係にある場合にのみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボースを介して２つのオリゴヌクレオチド同士を特異的に結合させる酵素を容器内の液に懸濁させたものである。
【００１０】
ここで、「遺伝物質」は、主としてＤＮＡ（断片）であるが、ＲＮＡ（断片）を含めることもできる。「塩基」とは、ＤＮＡではチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）であり、ＲＮＡの場合は、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）を入れたものである。「特定種類」としたのは、その標的遺伝物質の塩基配列が大雑把にある程度知られている場合には、全種類の塩基配列でなくても、その種類をある程度絞り込むことができるからである。
【００１１】
「選別可能となるように設ける」やり方としては、２つのグループ自体を識別できるように標識物質でコード化を行うことによって、２つのグループで用いる標識物質の種類を異ならせることによって、または、一方のグループのコード化オリゴヌクレオチドに、遠隔操作可能な担体を有するように設け、そのグループを遠隔操作によって任意の位置に移動可能とすることによって選別可能とするような場合がある。「遠隔操作可能化」としては、例えば、磁性粒子をオリゴヌクレオチドに具備させることにより、磁場操作によって遠隔操作可能にしたり、荷電粒子をオリゴヌクレオチドに具備させることにより、またはオリゴヌクレオチド自体に電荷を帯びさせて電場によって遠隔操作可能にする場合がある。
【００１２】
「コード化」は、例えば、蛍光等の発光物質や、放射性物質等の標識物質を用いて、標識物質の種類および／またはその量比を変えることによって行う。また、「コード化オリゴヌクレオチド」は、例えば、１本のオリゴヌクレオチドに種々の標識物質をアダプタを介して結合することによって、または、第七の発明または第八の発明のように１種類の多数のオリゴヌクレオチドと標識物質を担体に保持させることによって行う。第七の発明や第八の発明のように標識物質は多数のオリゴヌクレオチドの一部にのみ分配して結合するのが好ましい。
【００１３】
第１のオリゴヌクオレオチドのコード化に用いる標識物質の種類と、第２のオリゴヌクオチドのコード化に用いる標識物質の種類は、異ならせるのが解析上妥当である。この場合には、コード化のみによって第１のオリゴヌクレオチド群と第２のオリゴヌクレオチド群とは選別されることになる。
【００１４】
「酵素」には、例えば、ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ連結酵素）のようにオリゴヌクレオチド同士が直接隣接する場合にそれらを結合する酵素がある。「一定の関係」とは、例えば、相補的な関係または同一の関係等である。
【００１５】
本発明によれば、一本鎖化した遺伝物質とハイブリダイスした各オリゴヌクレオチドの前記所定塩基数について、その遺伝物質と一定の関係がある場合のみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボース同士を特異的に結合させる酵素を有している。したがって、この懸濁系の中に、塩基配列を知ろうとする標的の一本鎖の遺伝物質を投入して懸濁させることによって、この塩基配列と一定の関係のあるオリゴヌクレオチドのみが結合することができる。そのため、一本鎖の遺伝物質を解離させるとともに、このオリゴヌクレオチドの対のコードを読むことによって、前記所定塩基数の塩基配列から、標的遺伝物質を高い信頼性をもって知ることができる。
【００１６】
第二の発明は、前記発明において、前記各第１のコード化オリゴヌクレオチドは、その群に属するものとして選別可能であるようにコード化されるとともに、前記各第２のコード化オリゴヌクレオチドは、磁場によって遠隔操作される磁性粒子に保持されるように設けることによって、その群に属するものとして選別可能としたものである。
【００１７】
第三の発明は、前記各発明において、前記各第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの前記所定塩基数は、少なくとも３塩基であり、第１のコード化オリゴヌクレオチド群は、その３塩基の各塩基を入れ換えて得られる少なくとも４3 種類の第１のコード化オリゴヌクレオチドを包含し、第２のコード化オリゴヌクレオチド群は、その３塩基の各塩基を入れ換えて得られる少なくとも４3 種類の第２のコード化オリゴヌクレオチドを包含するものである。
【００１８】
解析上、好ましくは、第１のコード化オリゴヌクレオチド群と、第２のコード化オリゴヌクレオチド群の各量（濃度および絶対量）は略同一であり、また、これらの各群における各種類ごとの量も略同一である。
【００１９】
第四の発明は、前記各発明において、前記酵素は、ＤＮＡリガーゼであって、一本鎖の遺伝物質にハイブリダイズされた２つのコード化オリゴヌクレオチドの３塩基以上からなる塩基配列の末端ヌクレオチド同士が直接に隣接する場合であって、かつ、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と相補的である場合のみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボース同士を特異的に結合させるものである。
【００２０】
ここで、「相補的」とは、２本鎖を構成するＤＮＡにおいて、互いに塩基対を形成し得るような関係である。ＤＮＡにおける塩基対は、アデニンとチミン、シトシンとグアニンであり、ＲＮＡにおける塩基対は、アデニンとウラシル、シトシンとグアニンである。
【００２１】
第五の発明は、前記各発明において、前記第１のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第１のコード化オリゴヌクレオチドは、所定の塩基配列をもつ１種類のオリゴヌクレオチドと、そのオリゴヌクレオチドと結合した標識物質とからなり、その標識物質は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は標識物質の種類および／またはその量比を変えることによって行われたものである。
【００２２】
第六の発明は、前記各発明において、前記第１のコード化オリゴヌクレオチド群に属する第１のコード化オリゴヌクレオチドの全部または一部について、その遊離末端に標識化されたジデオキシリボースを有しているものである。
【００２３】
ここで、「遊離末端」とは、オリゴヌクレオチドの末端のうち、他のオリゴヌクレオチドと結合しない末端、すなわち、標識物質が結合する末端をいう。第１のコード化オリゴヌクレオチドの３’末端に標識化したジデオキシリボースを結合させる。ジデオキシリボースを含ませることによって、その後にどのようなオリゴヌクレオチドが隣接しても結合を引き起こすことがない。
【００２４】
したがって、第１のコード化オリゴヌクレオチドの全部にジデオキシリボースを含ませるとともに、第２のコード化オリゴヌクレオチドについても全部にジデオキシリボースを同様に含ませたり、または第２のコード化オリゴヌクレオチドが担体を有するような場合には、第１のコード化オリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドが１個ずつ（前記所定塩基数ずつ）連結した二量体のみが得られることになる。これによって、塩基数列を揃えることができるので、例えば、発光物質によってコード化されている場合にはコードの読取りを確実かつ容易に行うことができる。
【００２５】
また、第１のコード化オリゴヌクレオチドの一部にジデオキシリボースを含ませた場合には、第１のコード化オリゴヌクレオチドが１個、２個、３個、それ以上と多数結合して最後にジデオキシリボースが含まれた第１のコード化オリゴヌクレオチドが結合した結合体を同定することができる。これによって、ＤＮＡシーケンスを簡単に読み取ることができる。
【００２６】
第七の発明は、前記各発明において、前記第１のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第１のコード化オリゴヌクレオチドは、１個の非磁性の担体と、その担体に結合した所定の塩基配列をもつ多数の１種類のオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部にまたはオリゴヌクレオチドと結合した部位と異なる部位でその担体に結合した標識物質とからなり、その標識物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は、標識物質の種類および／または量比を変えることによって行われたものである。
【００２７】
ここで、各オリゴヌクレオチドの担体との結合は、例えば、オリゴヌクレオチドと特異的に結合する結合物質を担体にコーティングすることによって行う。これらの結合物質には、例えば、ビオチンとアビジンの組み合わせがある。
【００２８】
第八の発明は、前記各発明において、前記第２のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第２のコード化オリゴヌクレオチドは、１個の磁性の担体と、その担体に結合した所定の塩基配列をもつ１種類の多数のオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部とまたはオリゴヌクレオチドと結合した部位と異なる部位でその担体と結合した標識物質とからなり、その標識物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は、標識物質の種類および／または量比を変えることによって行われたものである。
【００２９】
第九の発明は、前記各発明において、前記オリゴヌクレオチドは、アームを介して担体または標識物質と結合したものである。
【００３０】
第十の発明は、第一の発明ないし第九の発明のいずれかの懸濁系に、前記所定塩基数よりも十分に大きい所定ベースの一本鎖の標的遺伝物質を投入懸濁させて、前記標的遺伝物質に前記第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる対合工程と、第１のコード化オリゴヌクレオチドまたは第２のコード化オリゴヌクレオチドを捕獲した前記標的遺伝物質を再び一本鎖に解離する解離工程と、前記懸濁液中から、第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの対を選別する選別工程と、選別された第１のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードとの組み合わせに基づいて、その標的遺伝物質の塩基配列を決定する決定工程とを有しているものである。
【００３１】
ここで、選別工程は、コード化が、蛍光等の発光物質で行われている場合には、例えば、フローサイトメーターを用いて、第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの発光波長の対が存在する場合のみそのオリゴヌクレオチド対を選別する。また、第１および第２のグループの一方のコード化オリゴヌクレオチドが磁性粒子を有する場合には、液通路内に外部から磁場を及ぼすことによってオリゴヌクレオチドを液通路内壁に吸着して分離して選別し、かつ、フローサイトメーターによって該当する発光波長が存在する場合のみを選別する。または、フローサイトメーターによって、各波長の発光強度を考慮することにより重複出現数を決定するようにしても良い。
【００３２】
第十一の発明は、前記発明において、前記対合工程において、前記第１のコード化オリゴヌクレオチドは、その群に属するものとして選別可能であるようにコード化されるとともに、前記各第２のコード化オリゴヌクレオチドは、磁場によって遠隔操作される磁性粒子に保持されるように設けることによって、その群に属するものとして選別可能であり、前記選別工程は、磁場操作によって第２のコード化オリゴヌクレオチドを分離する分離工程を有しているものである。
【００３３】
第十二の発明は、前記各発明において、第２のコード化オリゴヌクレオチドが担体として磁性粒子を有している場合には、前記選別工程は、液通路、その液通路に外部から磁場を及ぼしかつ除去する磁力部、およびその液通路内の圧力を制御して流体の吸引および吐出を行う圧力制御部を有する分注機を用いて、その液通路の外部から磁場を及ぼしまたは除去することによって、前記第２のコード化オリゴヌクレオチドが有する前記磁気粒子を前記液通路の内壁に吸着させまたは離脱するものである。
【００３４】
第十三の発明は、第一の発明ないし第九の発明のいずれかの２つの略同一の懸濁系を用意し、その一方に、第一の試料から抽出して得られた所定ベースの一本鎖の第一の標的遺伝物質を投入懸濁させ、他方に、第二の試料から抽出して得られた所定ベースの一本鎖の第二の標的遺伝物質を投入懸濁させ、各標的物質に前記第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる対合工程と、各々、第１のコード化オリゴヌクレオチドまたは第２のコード化オリゴヌクレオチドを捕獲した前記標的遺伝物質を再び一本鎖に解離する解離工程と、前記懸濁液中から、第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドを選別する選別工程と、各々、選別された第１のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードとの組み合わせに基づいて、その標的遺伝物質の塩基配列を決定する決定工程と、前記第一の標的遺伝物質について決定された塩基配列と、前記第二の標的遺伝物質について決定された塩基配列とを比較することによってＳＮＰs の同定を行う同定工程と、を有するものである。ここで、「略同一」とは、少なくとも構成要素とその量（濃度および絶対量）とが略同一であることを意味する。なお、第七の発明で用いた第１のコード化オリゴヌクレオチドと第八の発明で用いた第２のコード化オリゴヌクレオチドについては、町田雅之氏およびＰＳＳ株式会社等が出願中の特許出願（特願平１０−２０６,０５７号）および国際出願（ＰＣＴ／ＪＰ９９／０３８２４）の発明を利用したものである。
【００３５】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態に係る遺伝物質シーケンス方法について、図１および図２に基づいて説明する。その実施の形態は特に指定がない限り本発明を制限するものではない。
【００３６】
本実施の形態に係る方法は、次のような分注機（ＰＳＳ株式会社が特許出願中、出願番号：特願平６−１５７,９５９号および特願平７ー３９,４２５号）を利用したものである。その分注機（図示せず）は、着脱自在にピペットチップが各々挿着される８連のノズルと、液体の吸引吐出を行う吸引吐出機構と、そのノズルに挿着したピペットチップの液通路の外部から磁場を及ぼしまたは除去することが可能な磁力部とを有するものである。また、その分注機および分注機のノズルをステージの平面に平行および上下方向に沿って移動可能な移動部を有しているものである。
【００３７】
また、この分注機は前記吸引吐出機構の吸引吐出の制御や、磁力部の磁場の制御、および移動制御を行うための制御部を有する。制御部には、コンピュータを内蔵する処理手段と、ＣＲＴ、液晶等の表示部やプリンタ等の出力手段と、種々の処理手順の設定や指示、データの入力等を行うためのキーボード、マウス、フロッピー、ＣＤやＭＯ等のプログラムやデータが記録された記録媒体を読み取る読取装置等の入力手段と、通信網に接続する通信部とを有している。さらに、ＤＮＡシーケンスを決定するためにはフローサイトメーター（図示せず）を用いる。
【００３８】
また、本実施の形態に係る遺伝物質シーケンス決定を行うために次に示すような懸濁系を容器に収容しておく。
【００３９】
その懸濁系は、第１のコード化オリゴヌクレオチド群としての検出用オリゴヌクレオチド群と、第２のコード化オリゴヌクレオチド群としての磁力操作可能オリゴヌクレオチド群と、ＤＮＡリガーゼとを液体中に懸濁混合させて容器に収容したものである。ここで、第１のコード化オリゴヌクレオチド群と第２のコード化オリゴヌクレオチド群の量（濃度および絶対量) は解析を容易にするために略同一とする。
【００４０】
前記検出用オリゴヌクレオチド群は、少なくとも塩基数３の１種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するようにコード化された検出用オリゴヌクレオチドを、その塩基数３における全種類４3 （＝６４）種類の塩基配列を網羅するように包含し、その群に属するものとして識別できるようにコード化することによって各々選別可能に設けられたものである。また、前記磁力操作可能オリゴヌクレオチド群は、少なくとも塩基数３の１種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するようにコード化された磁力操作可能オリゴヌクレオチドを、その塩基数における全種類４3 （＝６４）種類の塩基配列を網羅するように包含し、磁力操作によって移動可能とすることによって、その群に属するものとして各々選別可能に設けられたものである。さらに、これら検出用オリゴヌクレオチドおよび磁力操作可能オリゴヌクレオチドの各種類の塩基配列の量は解析を容易にするために略同一となるようにしておく。
【００４１】
また、前記ＤＮＡリガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドが一本鎖の遺伝物質にハイブリダイズされてその塩基配列の末端オリゴヌクレオチドの糖であるデオキシリボース同士が直接に隣接する場合であって、各３塩基ずつの塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と相補的である場合にのみ、前記２つのオリゴヌクレオチドの末端のデオキシリボース同士を特異的に結合させる酵素である。
【００４２】
前記検出用オリゴヌクレオチドは、１個の非磁性の担体と、その担体に結合した３個の塩基の塩基配列をもつ多数の１種類のそのオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部と結合した標識物質である蛍光物質とからなり、その担体に保持された蛍光物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、４3 （＝６４）種類を識別するためのコード化は、蛍光物質の種類および／または量比を変えることによって行われるものである。ここで、蛍光物質は、例えば、検出用オリゴヌクレオチドに３種類、磁力操作用オリゴヌクレオチドにさらに３種類を用いる。蛍光物質の種類には、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレッセイン・イソチオシアネート）、ローダミン、イソチオシアネート、ＩＲＤ４０、ＣＹ３、ＣＹ５、ユウロピウム錯体等がある。
【００４３】
また、前記磁力操作可能オリゴヌクレオチドは、１個の磁性の担体と、その担体に結合した３個の塩基の塩基配列をもつ１種類の多数のそのオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部と結合した標識物質である蛍光物質とからなり、その担体に保持された蛍光物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、４3 （＝６４）種類を識別するためのコード化は、蛍光物質の種類および／または量比を変えることによって行われるものである。ここで、コード化のために使用される前記オリゴヌクレオチドには、ＩＭＰ（イノシン酸：プリン環にアミノ基や水酸基がついていない）等をアームまたはスペーサーとして、担体又は標識物質との間に設けることによって、蛍光物質のクエンチングを防止するのが好ましい。
【００４４】
続いて、本実施の形態に係る懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法を図１に基づいて説明する。
【００４５】
図１に示すように、本遺伝物質シーケンス決定方法は、ステップＳ１で、ＤＮＡの塩基配列を決定しようとする試料、例えば、ヒト等の細胞や細菌等から、標的ＤＮＡ断片を抽出する。標的ＤＮＡ断片を抽出するには、例えば、前記分注機を用いてベクターが導入された細菌コロニーとＤＮＡ抽出液とを混合して可溶化させ、磁性粒子を分注機を用いて混合することによって所定ベース（１〜数キロベース）の標的ＤＮＡ断片を磁性粒子に捕獲させる。その標的ＤＮＡ断片を捕獲した磁性粒子を含む懸濁液を前記分注機の液通路を通過させる際に、磁場を及ぼすことによって、液通路の内壁に吸着させて分離する。さらに、磁性粒子を前記液通路の内壁に吸着させたままで洗浄液を前記液通路を通して吸引することによって前記磁性粒子、その磁性粒子に捕獲された標的ＤＮＡ断片および液通路を洗浄する。その後、磁性粒子を液通路の内壁に吸着させたままでベクターを溶出する。
【００４６】
次に、ステップＳ２で、前記抽出した環状の前記標的ＤＮＡ断片が組み込まれたベクターについて、その環状標的ＤＮＡ断片を切断する。ここで、ベクターには、プラスミドまたはバクテリオファージ等を含む。
【００４７】
ここで、前記切断工程は、前記標的ＤＮＡ断片が組み込まれたベクターと所定試薬を各々収容した各収容部から前記分注機の液通路を介して吸引し、恒温機能を有する収容部に移動し、かつ吐出して環状の標的ＤＮＡ断片を切断する。また前記所定試薬とは、水、切断用バッファおよび切断酵素である。
【００４８】
ステップＳ３で、このようにして得られた標的ＤＮＡ断片が懸濁する液に熱を加えた後、急冷することによって、その標的ＤＮＡ断片を一本鎖に解離する。
【００４９】
ステップＳ４で、このようにして得られた標的ＤＮＡ断片が懸濁する液を前記懸濁系に投入し、両者を懸濁混合させる。すると、一本鎖化された標的ＤＮＡ断片の塩基配列の３塩基ごとに、それと略相補的な前記検出用オリゴヌクレオチドまたは磁力操作可能オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。このようにして、その標的ＤＮＡ断片の塩基配列を介して、１種または２種の検出用オリゴヌクレオチドのみ、１種または２種の磁力操作可能オリゴヌクレオチドのみ、検出用オリゴヌクレオチドと磁力操作可能オリゴヌクレオチドの組み合わせたものが得られる。さらに、この懸濁液中には、全くハイブリダイズされない標的ＤＮＡ断片や、その標的ＤＮＡ断片とハイブリダイズされない磁力操作可能オリゴヌクレオチドや検出用オリゴヌクレオチドが懸濁されている状態となっている。
【００５０】
標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズされている検出用オリゴヌクレオチドまたは磁力操作可能オリゴヌクレオチドとの３塩基を含む塩基配列端同士が隣接している場合、前記ＤＮＡリガーゼの働きにより、これらの３塩基ずつが標的ＤＮＡ断片の塩基配列と完全に相補的である場合には、このオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボース同士が結合し、各々６塩基配列のオリゴヌクレオチドが得られることになる。
【００５１】
なお、前記標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズされた２つのオリゴヌクレオチドは必ずしも検出用オリゴヌクレオチドと磁力操作可能オリゴヌクレオチドの組み合わせとは限らないし、また、塩基配列端同士が隣接するものとも限られないが、ある確率でこれらの組み合わせが必ず存在することは明らかである。
【００５２】
図２は、この段階で、懸濁液中に存在する標的ＤＮＡ断片１０にハイブリダイズされた、検出用オリゴヌクレオチド１２と、磁力操作可能オリゴヌクレオチド１１の組み合わせの例を示すものである。図２（ａ）は、検出用オリゴヌクレオチド１１と磁力操作可能オリゴヌクレオチド１１の３塩基ずつの塩基配列が標的ＤＮＡ断片１０の塩基配列と相補的になるとともに、その端塩基が隣接してハイブリダイズされている場合を示す。この場合には、前記ＤＮＡリガーゼの働きによって、両者の末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボース同士が結合して６塩基配列のオリゴヌクレオチドが得られることになる。
【００５３】
一方、図２（ｂ）は、検出用オリゴヌクレオチド１２と、磁力操作可能オリゴヌクレオチド１１の３塩基ずつの塩基配列が標的ＤＮＡ断片の塩基配列と相補的となっていないため、その端塩基が隣接してハイブリダイズされているが、両者の末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボーズ同士が結合しない場合を示している。
【００５４】
図２中小さい白丸○は各種塩基を表す。また、二重丸◎は例えば、ＩＭＰ（イノシン酸）等の物質を表す。黒丸●は、図１（ａ）の標的ＤＮＡ断片１０と、図１（ｂ）の標的ＤＮＡ断片１０ｓのうち異なる塩基（ＳＮＰ）を表すものである。
【００５５】
同図に示すように、磁力操作可能オリゴヌクレオチド１１は、３塩基１５をもつ１種類の多数のオリゴヌクレオチドがアーム１６およびビオチン１７を介して磁性の担体である磁性粒子１８に結合している。磁性粒子１８の表面は、前記ビオチンと特異的に結合するアビジンでコーティングされている。また、一部のオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドには、標識化物質である蛍光物質１３、１４が結合して、そのオリゴヌクレオチドを識別する。検出用オリゴヌクレオチド１２は、３塩基１９をもち、アーム２０を介して図示しない非磁性の担体と結合する構造である。
【００５６】
ここで、「一部のオリゴヌクレオチド」とは、磁性粒子１８または図示しない非磁性の粒子に保持された全オリゴヌクレオチドの１％または１０％以下である。また、量比は例えば、０．２５％、０．５％、０．７５％および１．０％（または、２．５％、５．０％、７．５％、および１０．０％）のように変えることによって、蛍光物質の各種類について、４段階を識別するようにコード化する。また、検出用オリゴヌクレオチドと磁力操作可能オリゴヌクレオチドに使用する蛍光物質の種類を異ならせることによって、各々が選別可能である。
【００５７】
ステップＳ５で、この懸濁液全体を、前記分注機で吸引し、一定の温度状態に保たれている恒温槽に移送し吐出することによって加熱する。これによって、前記標的ＤＮＡ断片が一本鎖化されることによって、その標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズされているオリゴヌクレオチドが解離する。その際、図２（ａ）に示すように２つのオリゴヌクレオチドが前記ＤＮＡリガーゼによって結合している場合には、６塩基配列のオリゴヌクレオチドが得られることになるが、図２（ｂ）に示すように、たとえ、ハイブリダイズした２つのオリゴヌクレオチドであっても、完全に相補的でないために、ＤＮＡリガーゼによって結合していない場合には、３塩基配列のままのオリゴヌクレオチドとして懸濁液中に懸濁することになる。したがって、この段階では、６塩基の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ断片の塩基配列に完全に相補的になっている塩基配列のみが存在することになる。
【００５８】
ステップＳ６で、前記分注機がこの懸濁液を吸引する際に、磁場を分注機の液通路内に及ぼすことによって、前記オリゴヌクレオチドのうち、磁性粒子を有するオリゴヌクレオチドのみを液通路の内壁に吸着させて分離する。液通路の内壁にオリゴヌクレオチドを吸着させたまま、洗浄液等の吸引および吐出を繰り返すことによって、吸着させたオリゴヌクレオチドを洗浄する。これによって、磁性粒子をもっていない単独の検出用オリゴヌクレオチドや、検出用オリゴヌクレオチド同士が結合したものや、単独の標的ＤＮＡ断片や夾雑物等を除去することができる。洗浄されかつ分注機の液通路の内壁に吸着したオリゴヌクレオチドを別容器にまで移送し、磁場を除去した状態で吸引吐出を繰り返すことによって、液通路の内壁から磁性粒子を離脱させ、液中に再懸濁させる。
【００５９】
こうして得られた懸濁液中には、単独の磁力操作可能オリゴヌクレオチド、磁力操作可能オリゴヌクレオチド同士が結合したもの、磁力操作可能オリゴヌクレオチドと検出用オリゴヌクレオチドとが結合したものが懸濁液中に存在することになる。
【００６０】
ステップＳ７で、この懸濁液をフローサイトメーターの管路を通過させることによって前記オリゴヌクレオチドのコードを読み取る。このフローサイトメーターの管路には、一定の励起波長の光を照射させる発光手段と、励起された標識物質である蛍光物質からの光を受光する受光手段と、受光した光を解析する解析部が設けられたものである。
【００６１】
前記解析部は、単独の磁力操作可能オリゴヌクレオチドを排除するために検出用オリゴヌクレオチドのグループを識別するコードである蛍光物質の種類があるもののみを選別して、そのコードの組み合わせである蛍光物質の種類を特定する。これによって、磁力操作可能オリゴヌクレオチドと検出用オリゴヌクレオチドのコードの組み合わせを読み取ることになる。
【００６２】
ステップＳ８で、読み取られたコードの組み合わせから、標的ＤＮＡ断片に存在するの６塩基分の塩基配列を決定することができる。このようなコードの組み合わせを、その標的ＤＮＡ断片の塩基配列が順次つながるように、配列を決定することによって、標的ＤＮＡ断片に存在する全塩基配列を決定することができることになる。もし、前記標的ＤＮＡ断片のベースが、４０９６塩基配列よりも長い場合、または繰返しを含む配列である場合には、重複出現数を発光強度に基づいて決定するようにする。本実施の形態によれば、６塩基ずつのコードの組み合わせによる発光を測定することができるので、高い信頼性で測定を行うことができる。
【００６３】
続いて、本実施の形態に係るＳＮＰs のスコアリング方法について、図３に基づいて説明する。
本実施の形態に係るＳＮＰs のスコアリング方法においても、前述したように、分注機、移動部、制御部、ステージおよびフローサイトメーターを用いる。
【００６４】
本実施の形態に係るＳＮＰs のスコアリング方法を行うためには、解析の容易化のため前述した懸濁系を同量（濃度および絶対量）および同じ構成要素のものを第一の懸濁系および第二の懸濁系として、予め２つの別の容器に用意しておく。
【００６５】
図３に示すように、本ＳＮＰs のスコアリング方法は、２つの異なる第一の試料および第二の試料から各々抽出した第一のＤＮＡ断片および第二のＤＮＡ断片の塩基配列を比較することによって、ＳＮＰs （多型の塩基配列）を決定しようとするものである。
【００６６】
図３のステップＳ１１で、第一の試料から所定ベースの第一のＤＮＡ断片が組み込まれたベクターを抽出し、ステップＳ２１で、第二の試料から所定ベースの第二のＤＮＡ断片が組み込まれたベクターを抽出する。抽出の方法については、既に、ステップＳ１で説明したとおりである。ここで、「所定ベース」は、その断片中に数個のＳＮＰｓが含まれる場合に検出可能であるので、３００〜５００塩基対にひとつＳＮＰｓが存在し、特定の６塩基配列が平均４０９６（＝４6 ）塩基対にひとつ存在することから、１〜数キロベースである。
【００６７】
ステップＳ１２およびステップＳ２２で、各々、環状の第一のＤＮＡ断片および環状の第二のＤＮＡ断片を切断する。その方法については、前述したステップＳ２で説明した通りである。
【００６８】
ステップＳ１３およびステップＳ２３で、各々、第一のＤＮＡ断片および第二のＤＮＡ断片が懸濁する液に熱を加えた後、急冷することによって二本鎖を一本鎖化する。
【００６９】
ステップＳ１４およびステップＳ２４で、このようにして得られた第一のＤＮＡ断片を、第一の懸濁系に投入して懸濁混合させるとともに、第二のＤＮＡ断片を第二の懸濁系に投入して懸濁混合させる。
【００７０】
ステップＳ１５およびステップＳ２５において、各懸濁液全体を、前記分注機で吸引し、一定の温度状態に保たれている恒温槽に移送し吐出することによって加熱する。これによって、前記第一のＤＮＡ断片および第二のＤＮＡ断片が一本鎖化されることになる。
【００７１】
ステップＳ１６およびステップＳ２６で、前記分注機が各懸濁液を吸引する際に、磁場を分注機の液通路内に及ぼすことによって、前記オリゴヌクレオチドのうち磁性粒子を有するオリゴヌクレオチドのみをその液通路の内壁に吸着させて分離する。液通路の内壁にオリゴヌクレオチドを吸着させたまま、洗浄液等の吸引および吐出を繰り返すことによって、吸着させたオリゴヌクレオチドを洗浄する。これによって、磁性粒子をもっていない単独の検出用オリゴヌクレオチオドや、検出用オリゴヌクレオチド同士を結合したものや、第１のＤＮＡ断片や夾雑物等を除去することができる。洗浄されかつ分注機の液通路の内壁に吸着したオリゴヌクレオチドを別容器にまで移送し、吸引吐出を繰り返すことによて再懸濁させる。
【００７２】
ステップＳ１７およびステップＳ２７において、前記フローサイトメーターを用いて、前述した方法で、解析部は、単独の磁力操作可能オリゴヌクレオチドを排除するために検出用オリゴヌクレオチドのグループを識別するコードである蛍光物質があるもののみを選択して、そのコードの組み合わせである蛍光物質の種類を特定する。これによって、磁力操作可能オリゴヌクレオチドと検出用オリゴヌクレオチドのコードの組み合わせを読み取ることができる。
【００７３】
ステップＳ１８で、読み取られたコードの組み合わせによって得られた第一のＤＮＡ断片の塩基配列と第二のＤＮＡ断片の塩基配列とを比較し、１または２以上の異なる塩基があれば、各々がＳＮＰ(s) である。例えば、第一の試料から得られた第一の標的ＤＮＡ断片１０については、図２（ａ）の塩基配列であるが、第２の試料から得られた第二の標的ＤＮＡ断片１０ｓについては、第一の標的ＤＮＡ断片１０と塩基２１が異なることが、コードの解析によって判明したとすれば、塩基２１の塩基配列の位置において多型であることが決定される。本実施の形態によれば、リガーゼ反応産物の差を見るだけでＳＮＰs を検出することができるので、高い信頼性で容易に結果を得ることができる。
【００７４】
これらの実施の形態は本発明をより良く理解させるために具体的に説明したものであって、別形態を制限するものではない。したがって、発明の主旨を変更しない範囲で変更可能である。例えば、以上の説明では、ＤＮＡ断片については、ベクターを利用して増殖および抽出を行って得るようにしたが、この場合に限られることなく、例えば、抽出したＤＮＡ断片にＰＣＲプライマを結合しＰＣＲ法によって増幅することによってＤＮＡを得て、熱変成させた一本鎖化ＤＮＡを用いるようにしても良く、またはクローン化を行うことによって、同一の塩基配列をもつ標的ＤＮＡ断片を得ることができる。さらに、前記一本鎖化を行うには、熱した後急冷する方法の他に、アルカリ溶液を加えることによって行っても良い。この場合には緩衝剤が必要になる。
【００７５】
以上の例では、予め用意した懸濁系には、所定塩基数である３個の全種類である４3 種類ずつの１２８種類のオリゴヌクレオチドを懸濁させていたが、この種類を絞り込むことができる場合には、特定種類のオリゴヌクレオチドを懸濁させておくようにしても良い。また、所定塩基数として、３個の場合についてのみ説明したが、３個以上の場合であっても良い。
【００７６】
さらに、前記酵素として、２つのオリゴヌクレオチドが標的の一本鎖のＤＮＡ断片に隣接してハイブリダイズした場合に、３つの塩基ずつを認識して２つのオリゴヌクレオチドを特異的に結合するようにしているが、このような場合に限られない。
【００７７】
また、塩基配列を決定するには、１個１個のオリゴヌクレオチドのコードを読み取ることによって、コードの組み合わせから、６つの塩基配列を決定する場合について説明したが、このような場合に限られず、複数個または多数個のオリゴヌクレオチド対について蛍光等の強度を測定することによって、塩基配列を決定するようにしても良い。また、以上の例では、第１のコード化オリゴヌクレオチドは非磁性の担体を有するものを用いたが、担体を有しないものを用いても良い。また、その全部または一部について、ジデオキシリボースを設けたものを用いても良い。さらに、第２のコード化オリゴヌクレオチドに磁性担体を用いずに、コードによって選別可能なものを用いても良い。
【００７８】
【発明の効果】
第一の発明に係る懸濁系、第十の発明に係る方法または第十三の発明に係るＳＮＰs の決定方法は、所定塩基数の塩基配列をもつコード化された第１のコード化オリゴヌクレオチド群および第２のコード化オリゴヌクレオチド群の２つのグループを用いるとともに、遺伝物質と一定の関係がある場合のみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボース同士を特異的に結合させる酵素を有している。したがって、ＤＮＡチップのように単にハイブリダイゼーションを利用して、相補的なオリゴヌクレオチドの塩基配列を得る場合に比較して、より高い信頼性で、かつ容易に遺伝物質のシーケンスを決定することができる。
【００７９】
さらに、ＳＮＰs を特定するために塩基配列の種々の態様のオリゴヌクレオチドをＤＮＡチップに固定するという加工作業を行うことなく、種々の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを懸濁させるという作業によって、簡単かつ容易に塩基配列を決定することができる。
【００８０】
また、本発明では、スライドグラス等の平板上のスポット内の限られた狭い平面上のハイブリダイゼーション反応ではなく、懸濁系内の広い範囲内で、反応を行うことができるので、反応効率を飛躍的に上昇させ、平行に達するまでの時間を短縮することができる。
【００８１】
さらに、スライドグラス上に固定化したオリゴヌクレオチドの位置によりその配列を区別する方法と異なり、コード化した多種類のオリゴヌクレオチドは同一の反応液の中に共存するので、同一条件下で一括して反応を進めることができる。
【００８２】
また、本発明では、長い塩基配列を一挙に決定するのではなく、酵素が特異的結合を行うために認識できる短い塩基配列を繰り返して適用することによって、長い塩基配列を決定するようにしている。したがって、決定に使用する第１のコード化オリゴヌクレオチド群と第２のオリゴヌクレオチド群で必要とする塩基配列の種類は、これらの塩基数の和に相当する塩基配列の決定に必要とするオリゴヌクレオチドの種類数に比べて非常に小さくて済むので、これらのコード化の作業が容易である。例えば、前述した実施の形態では、全塩基配列種類数は６４＋６４の１２８あれば足りる。一方、６塩基配列についてのオリゴヌクレオチドを用意しようとすると、４6 ＝４０９６種類のものを用意する必要があり、塩基配列の種類は圧倒的に少なくて済む。
【００８３】
第二の発明または第十一の発明は、前記各第１のコード化オリゴヌクレオチドと第２のコード化オリゴヌクレオチドの一方を遠隔操作される磁性粒子に保持されるように設けたものである。本発明によれば、磁場を分注機のノズル等の液通路内に及ぼすことによって、分離することができるので、磁性粒子を有していないコード化オリゴヌクレオチドを排除することができるので、磁性粒子を有しているコード化オリゴヌクレオチドを容易かつ確実に選別することができる。
【００８４】
第三の発明および第四の発明では、前記各第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの所定塩基数は、少なくとも３塩基である。したがって、第１のコード化オリゴヌクレオチド群および第２のコード化オリゴヌクレオチド群の種類は各々４3 種類で足りるので、６塩基をもつオリゴヌクレオチドのように４０９６種類を用意する必要がないので、圧倒的に小さい種類のものを用意すれば足りるので、作業が容易である。
【００８５】
第五の発明によれば、種類および／または量比を変えた標識物質をオリゴヌクレオチドに結合させることによってコード化したものである。本発明によれば、遺伝物質に応じて、数珠繋ぎに連結したオリゴヌクレオチドを得ることができる。
【００８６】
第六の発明によれば、全部にジデオキシリボースを設けた場合には第１のコード化オリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドが１個ずつ（前記所定塩基数ずつ）連結した二量体のみが得られることになる。これによって、塩基数列を揃えることができるので、例えば、発光物質によってコード化されている場合にはコードの読取りを確実かつ容易に行うことができる。また、一部にジデオキシリボースを設けた場合には第１のコード化オリゴヌクレオチドが１個、２個、３個、それ以上と多数結合して最後にジデオキシリボースが含まれた第１のコード化オリゴヌクレオチドが結合した結合体を同定することができる。これによって、ＤＮＡシーケンスを比較的簡単に読み取ることができる。
【００８７】
第七の発明および第八の発明は、非磁性または磁性の担体にオリゴヌクレオチドを担持させ、一部のオリゴヌクレオチドまたは担体に結合する標識物質の種類および／または量比を変えることによってコード化を行うものである。したがって、例えば、数十〜数百程度の多種類の塩基配列を、確実明瞭にコード化して識別することができる。さらに、微小粒子等の担体の表面上で反応させることにより反応面積が増加し、反応効率を飛躍的に上昇させることができる。
【００８８】
第九の発明は、アームを介してオリゴヌクレオチドを担体または標識物質と結合したものである。本発明によれば、標識物質間がより一層離れることになるので、クエンチング（消光）を有効に防止することができるので、高い信頼性で塩基配列を決定することができる。
【００８９】
第十二の発明は、液通路および磁力部等を有する分注機を用いて、その液通路の外部から磁場を及ぼしまたは除去することによって、第２のコード化オリゴヌクレオチドが有する磁気粒子を前記液通路の内壁に吸着させまたは離脱するものである。これによって、塩基配列の決定を、自動的、効率的かつ迅速に一貫して行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る遺伝物質シーケンス決定方法を示す流れ図
【図２】本発明の実施の形態に係る標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを示す概念図
【図３】本発明の実施の形態に係るＳＮＰs のスコアリング方法を示す流れ図
【符号の説明】
１０，１０ｓ…標的ＤＮＡ断片
１１…磁力操作可能オリゴヌクレオチド（第２のコード化オリゴヌクレオチド）
１２…検出用オリゴヌクレオチド（第１のコード化オリゴヌクレオチド）
１３、１４…蛍光物質（標識物質）
１５…３塩基
１６…アーム
１８…磁性粒子
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高速スコアリング方法に関し、詳しくは、ＤＮＡ断片等の遺伝物質の塩基配列や、ＳＮＰs の特定を行うための遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高速スコアリング方法に関する。
【０００２】
本発明は、農学、工学、薬学、医学、心理学または化学若しくは生物学等の理学等の分野で、遺伝子の塩基配列の決定や操作や、医療、薬品、生理衛生、保健、生物または食品等の種々の領域において、遺伝物質の塩基配列の決定や、遺伝物質の塩基配列とヒトを含む種々の生物の形態、構造、性質、体質、病気、薬剤に対する感受性、気質、性格等との関係の解明に利用することができるものである。
【０００３】
【従来の技術】
従来、「ありふれた病気」の疾患感受性遺伝子の同定と薬剤に対する感受性を決定するＳＮＰs （single nucleotid polymorphisms、単一のヌクレオチド多型）を特定するために、全ゲノムにわたる高効率ＳＮＰs 検出のスコアリングシステムの開発が急務であった。現時点では、高効率でＳＮＰｓを検出スコアリングするシステムは開発段階にあり、ハイブリダイゼーションの原理に基づくいわゆるＤＮＡチップが予備的に検討されているにすぎない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、ＤＮＡチップは、半導体膜やスライドグラス等の平板にスポットされた既知のひとつのＳＮＰに対し、このＳＮＰを含む１０種類以上のオリゴヌクレオチドアレイを準備し、これらにＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片がハイブリダイズするか否かによりＳＮＰｓを検出するAffimetrix社等によるシステムが既に実用化されている。
【０００５】
しかし、このＤＮＡチップを用いた方法は、機器とランニングコストが高価であるという問題点を有していた。また、ＤＮＡチップは、ハイブリダイゼーション反応が非特異的物理化学反応であるために、このような複数オリゴヌクレオチドを利用した重複性（redundancy) のあるシステムが必要であり、このシステムを用いたとしても約１０％の誤り判定が生ずるという問題点をも有していた。
【０００６】
本発明は以上の課題を解決することを目的としてなされたものであり、その第一の目的は、従来のいわゆるＤＮＡチップ等の方法で行われている、スライドグラスのスポット内の限られた狭い平面上のハイブリダイゼーション反応ではなく、微小粒子（ビーズ）を用いることによって、反応面積を増加させ液体内での反応を促進させ、反応効率を飛躍的に上昇させて平衡に達するまでの時間を短縮させることができる遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高速スコアリング方法を提供することである。
【０００７】
第２の目的は、塩基配列を特異的に認識する酵素反応の高い特異性を用いることによって、重複性を必要とせず確実に塩基配列をスコアリングすることができる遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高速スコアリング方法を提供することである。
【０００８】
第３の目的は、スライドグラス上に固定化したオリゴヌクレオチドの位置に基づいて配列を決定するのではなく、コード化した多種類のビーズを用いることによって同一条件で一括して反応を進めることによって決定するものであり、高速かつ信頼性高い遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰs 高速スコアリング方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
以上の目的を達成するために、第一の発明は、所定塩基数の１種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するようにコード化された第１のコード化オリゴヌクレオチドを、その塩基数における全種類若しくは特定種類の塩基配列を網羅するように包含し、その群に属するものとして各々選別可能に設けられた第１のコード化オリゴヌクレオチド群と、所定塩基数の１種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するようにコード化された第２のコード化オリゴヌクレオチドを、その塩基数における全種類若しくは特定種類の塩基配列を網羅するように包含し、その群に属するものとして各々選別可能に設けられた第２のコード化オリゴヌクレオチド群と、２つのコード化オリゴヌクレオチドが一本鎖の遺伝物質にハイブリダイズされてその塩基配列の末端ヌクレオチドが直接に隣接する場合であって、かつ、前記所定塩基数の塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と一定の関係にある場合にのみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボースを介して２つのオリゴヌクレオチド同士を特異的に結合させる酵素を容器内の液に懸濁させたものである。
【００１０】
ここで、「遺伝物質」は、主としてＤＮＡ（断片）であるが、ＲＮＡ（断片）を含めることもできる。「塩基」とは、ＤＮＡではチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）であり、ＲＮＡの場合は、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）を入れたものである。「特定種類」としたのは、その標的遺伝物質の塩基配列が大雑把にある程度知られている場合には、全種類の塩基配列でなくても、その種類をある程度絞り込むことができるからである。
【００１１】
「選別可能となるように設ける」やり方としては、２つのグループ自体を識別できるように標識物質でコード化を行うことによって、２つのグループで用いる標識物質の種類を異ならせることによって、または、一方のグループのコード化オリゴヌクレオチドに、遠隔操作可能な担体を有するように設け、そのグループを遠隔操作によって任意の位置に移動可能とすることによって選別可能とするような場合がある。「遠隔操作可能化」としては、例えば、磁性粒子をオリゴヌクレオチドに具備させることにより、磁場操作によって遠隔操作可能にしたり、荷電粒子をオリゴヌクレオチドに具備させることにより、またはオリゴヌクレオチド自体に電荷を帯びさせて電場によって遠隔操作可能にする場合がある。
【００１２】
「コード化」は、例えば、蛍光等の発光物質や、放射性物質等の標識物質を用いて、標識物質の種類および／またはその量比を変えることによって行う。また、「コード化オリゴヌクレオチド」は、例えば、１本のオリゴヌクレオチドに種々の標識物質をアダプタを介して結合することによって、または、第七の発明または第八の発明のように１種類の多数のオリゴヌクレオチドと標識物質を担体に保持させることによって行う。第七の発明や第八の発明のように標識物質は多数のオリゴヌクレオチドの一部にのみ分配して結合するのが好ましい。
【００１３】
第１のオリゴヌクオレオチドのコード化に用いる標識物質の種類と、第２のオリゴヌクオチドのコード化に用いる標識物質の種類は、異ならせるのが解析上妥当である。この場合には、コード化のみによって第１のオリゴヌクレオチド群と第２のオリゴヌクレオチド群とは選別されることになる。
【００１４】
「酵素」には、例えば、ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ連結酵素）のようにオリゴヌクレオチド同士が直接隣接する場合にそれらを結合する酵素がある。「一定の関係」とは、例えば、相補的な関係または同一の関係等である。
【００１５】
本発明によれば、一本鎖化した遺伝物質とハイブリダイスした各オリゴヌクレオチドの前記所定塩基数について、その遺伝物質と一定の関係がある場合のみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボース同士を特異的に結合させる酵素を有している。したがって、この懸濁系の中に、塩基配列を知ろうとする標的の一本鎖の遺伝物質を投入して懸濁させることによって、この塩基配列と一定の関係のあるオリゴヌクレオチドのみが結合することができる。そのため、一本鎖の遺伝物質を解離させるとともに、このオリゴヌクレオチドの対のコードを読むことによって、前記所定塩基数の塩基配列から、標的遺伝物質を高い信頼性をもって知ることができる。
【００１６】
第二の発明は、前記発明において、前記各第１のコード化オリゴヌクレオチドは、その群に属するものとして選別可能であるようにコード化されるとともに、前記各第２のコード化オリゴヌクレオチドは、磁場によって遠隔操作される磁性粒子に保持されるように設けることによって、その群に属するものとして選別可能としたものである。
【００１７】
第三の発明は、前記各発明において、前記各第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの前記所定塩基数は、少なくとも３塩基であり、第１のコード化オリゴヌクレオチド群は、その３塩基の各塩基を入れ換えて得られる少なくとも４3 種類の第１のコード化オリゴヌクレオチドを包含し、第２のコード化オリゴヌクレオチド群は、その３塩基の各塩基を入れ換えて得られる少なくとも４3 種類の第２のコード化オリゴヌクレオチドを包含するものである。
【００１８】
解析上、好ましくは、第１のコード化オリゴヌクレオチド群と、第２のコード化オリゴヌクレオチド群の各量（濃度および絶対量）は略同一であり、また、これらの各群における各種類ごとの量も略同一である。
【００１９】
第四の発明は、前記各発明において、前記酵素は、ＤＮＡリガーゼであって、一本鎖の遺伝物質にハイブリダイズされた２つのコード化オリゴヌクレオチドの３塩基以上からなる塩基配列の末端ヌクレオチド同士が直接に隣接する場合であって、かつ、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と相補的である場合のみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボース同士を特異的に結合させるものである。
【００２０】
ここで、「相補的」とは、２本鎖を構成するＤＮＡにおいて、互いに塩基対を形成し得るような関係である。ＤＮＡにおける塩基対は、アデニンとチミン、シトシンとグアニンであり、ＲＮＡにおける塩基対は、アデニンとウラシル、シトシンとグアニンである。
【００２１】
第五の発明は、前記各発明において、前記第１のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第１のコード化オリゴヌクレオチドは、所定の塩基配列をもつ１種類のオリゴヌクレオチドと、そのオリゴヌクレオチドと結合した標識物質とからなり、その標識物質は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は標識物質の種類および／またはその量比を変えることによって行われたものである。
【００２２】
第六の発明は、前記各発明において、前記第１のコード化オリゴヌクレオチド群に属する第１のコード化オリゴヌクレオチドの全部または一部について、その遊離末端に標識化されたジデオキシリボースを有しているものである。
【００２３】
ここで、「遊離末端」とは、オリゴヌクレオチドの末端のうち、他のオリゴヌクレオチドと結合しない末端、すなわち、標識物質が結合する末端をいう。第１のコード化オリゴヌクレオチドの３’末端に標識化したジデオキシリボースを結合させる。ジデオキシリボースを含ませることによって、その後にどのようなオリゴヌクレオチドが隣接しても結合を引き起こすことがない。
【００２４】
したがって、第１のコード化オリゴヌクレオチドの全部にジデオキシリボースを含ませるとともに、第２のコード化オリゴヌクレオチドについても全部にジデオキシリボースを同様に含ませたり、または第２のコード化オリゴヌクレオチドが担体を有するような場合には、第１のコード化オリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドが１個ずつ（前記所定塩基数ずつ）連結した二量体のみが得られることになる。これによって、塩基数列を揃えることができるので、例えば、発光物質によってコード化されている場合にはコードの読取りを確実かつ容易に行うことができる。
【００２５】
また、第１のコード化オリゴヌクレオチドの一部にジデオキシリボースを含ませた場合には、第１のコード化オリゴヌクレオチドが１個、２個、３個、それ以上と多数結合して最後にジデオキシリボースが含まれた第１のコード化オリゴヌクレオチドが結合した結合体を同定することができる。これによって、ＤＮＡシーケンスを簡単に読み取ることができる。
【００２６】
第七の発明は、前記各発明において、前記第１のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第１のコード化オリゴヌクレオチドは、１個の非磁性の担体と、その担体に結合した所定の塩基配列をもつ多数の１種類のオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部にまたはオリゴヌクレオチドと結合した部位と異なる部位でその担体に結合した標識物質とからなり、その標識物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は、標識物質の種類および／または量比を変えることによって行われたものである。
【００２７】
ここで、各オリゴヌクレオチドの担体との結合は、例えば、オリゴヌクレオチドと特異的に結合する結合物質を担体にコーティングすることによって行う。これらの結合物質には、例えば、ビオチンとアビジンの組み合わせがある。
【００２８】
第八の発明は、前記各発明において、前記第２のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第２のコード化オリゴヌクレオチドは、１個の磁性の担体と、その担体に結合した所定の塩基配列をもつ１種類の多数のオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部とまたはオリゴヌクレオチドと結合した部位と異なる部位でその担体と結合した標識物質とからなり、その標識物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は、標識物質の種類および／または量比を変えることによって行われたものである。
【００２９】
第九の発明は、前記各発明において、前記オリゴヌクレオチドは、アームを介して担体または標識物質と結合したものである。
【００３０】
第十の発明は、第一の発明ないし第九の発明のいずれかの懸濁系に、前記所定塩基数よりも十分に大きい所定ベースの一本鎖の標的遺伝物質を投入懸濁させて、前記標的遺伝物質に前記第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる対合工程と、第１のコード化オリゴヌクレオチドまたは第２のコード化オリゴヌクレオチドを捕獲した前記標的遺伝物質を再び一本鎖に解離する解離工程と、前記懸濁液中から、第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの対を選別する選別工程と、選別された第１のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードとの組み合わせに基づいて、その標的遺伝物質の塩基配列を決定する決定工程とを有しているものである。
【００３１】
ここで、選別工程は、コード化が、蛍光等の発光物質で行われている場合には、例えば、フローサイトメーターを用いて、第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの発光波長の対が存在する場合のみそのオリゴヌクレオチド対を選別する。また、第１および第２のグループの一方のコード化オリゴヌクレオチドが磁性粒子を有する場合には、液通路内に外部から磁場を及ぼすことによってオリゴヌクレオチドを液通路内壁に吸着して分離して選別し、かつ、フローサイトメーターによって該当する発光波長が存在する場合のみを選別する。または、フローサイトメーターによって、各波長の発光強度を考慮することにより重複出現数を決定するようにしても良い。
【００３２】
第十一の発明は、前記発明において、前記対合工程において、前記第１のコード化オリゴヌクレオチドは、その群に属するものとして選別可能であるようにコード化されるとともに、前記各第２のコード化オリゴヌクレオチドは、磁場によって遠隔操作される磁性粒子に保持されるように設けることによって、その群に属するものとして選別可能であり、前記選別工程は、磁場操作によって第２のコード化オリゴヌクレオチドを分離する分離工程を有しているものである。
【００３３】
第十二の発明は、前記各発明において、第２のコード化オリゴヌクレオチドが担体として磁性粒子を有している場合には、前記選別工程は、液通路、その液通路に外部から磁場を及ぼしかつ除去する磁力部、およびその液通路内の圧力を制御して流体の吸引および吐出を行う圧力制御部を有する分注機を用いて、その液通路の外部から磁場を及ぼしまたは除去することによって、前記第２のコード化オリゴヌクレオチドが有する前記磁気粒子を前記液通路の内壁に吸着させまたは離脱するものである。
【００３４】
第十三の発明は、第一の発明ないし第九の発明のいずれかの２つの略同一の懸濁系を用意し、その一方に、第一の試料から抽出して得られた所定ベースの一本鎖の第一の標的遺伝物質を投入懸濁させ、他方に、第二の試料から抽出して得られた所定ベースの一本鎖の第二の標的遺伝物質を投入懸濁させ、各標的物質に前記第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる対合工程と、各々、第１のコード化オリゴヌクレオチドまたは第２のコード化オリゴヌクレオチドを捕獲した前記標的遺伝物質を再び一本鎖に解離する解離工程と、前記懸濁液中から、第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドを選別する選別工程と、各々、選別された第１のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードとの組み合わせに基づいて、その標的遺伝物質の塩基配列を決定する決定工程と、前記第一の標的遺伝物質について決定された塩基配列と、前記第二の標的遺伝物質について決定された塩基配列とを比較することによってＳＮＰs の同定を行う同定工程と、を有するものである。ここで、「略同一」とは、少なくとも構成要素とその量（濃度および絶対量）とが略同一であることを意味する。なお、第七の発明で用いた第１のコード化オリゴヌクレオチドと第八の発明で用いた第２のコード化オリゴヌクレオチドについては、町田雅之氏およびＰＳＳ株式会社等が出願中の特許出願（特願平１０−２０６,０５７号）および国際出願（ＰＣＴ／ＪＰ９９／０３８２４）の発明を利用したものである。
【００３５】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態に係る遺伝物質シーケンス方法について、図１および図２に基づいて説明する。その実施の形態は特に指定がない限り本発明を制限するものではない。
【００３６】
本実施の形態に係る方法は、次のような分注機（ＰＳＳ株式会社が特許出願中、出願番号：特願平６−１５７,９５９号および特願平７ー３９,４２５号）を利用したものである。その分注機（図示せず）は、着脱自在にピペットチップが各々挿着される８連のノズルと、液体の吸引吐出を行う吸引吐出機構と、そのノズルに挿着したピペットチップの液通路の外部から磁場を及ぼしまたは除去することが可能な磁力部とを有するものである。また、その分注機および分注機のノズルをステージの平面に平行および上下方向に沿って移動可能な移動部を有しているものである。
【００３７】
また、この分注機は前記吸引吐出機構の吸引吐出の制御や、磁力部の磁場の制御、および移動制御を行うための制御部を有する。制御部には、コンピュータを内蔵する処理手段と、ＣＲＴ、液晶等の表示部やプリンタ等の出力手段と、種々の処理手順の設定や指示、データの入力等を行うためのキーボード、マウス、フロッピー、ＣＤやＭＯ等のプログラムやデータが記録された記録媒体を読み取る読取装置等の入力手段と、通信網に接続する通信部とを有している。さらに、ＤＮＡシーケンスを決定するためにはフローサイトメーター（図示せず）を用いる。
【００３８】
また、本実施の形態に係る遺伝物質シーケンス決定を行うために次に示すような懸濁系を容器に収容しておく。
【００３９】
その懸濁系は、第１のコード化オリゴヌクレオチド群としての検出用オリゴヌクレオチド群と、第２のコード化オリゴヌクレオチド群としての磁力操作可能オリゴヌクレオチド群と、ＤＮＡリガーゼとを液体中に懸濁混合させて容器に収容したものである。ここで、第１のコード化オリゴヌクレオチド群と第２のコード化オリゴヌクレオチド群の量（濃度および絶対量) は解析を容易にするために略同一とする。
【００４０】
前記検出用オリゴヌクレオチド群は、少なくとも塩基数３の１種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するようにコード化された検出用オリゴヌクレオチドを、その塩基数３における全種類４3 （＝６４）種類の塩基配列を網羅するように包含し、その群に属するものとして識別できるようにコード化することによって各々選別可能に設けられたものである。また、前記磁力操作可能オリゴヌクレオチド群は、少なくとも塩基数３の１種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するようにコード化された磁力操作可能オリゴヌクレオチドを、その塩基数における全種類４3 （＝６４）種類の塩基配列を網羅するように包含し、磁力操作によって移動可能とすることによって、その群に属するものとして各々選別可能に設けられたものである。さらに、これら検出用オリゴヌクレオチドおよび磁力操作可能オリゴヌクレオチドの各種類の塩基配列の量は解析を容易にするために略同一となるようにしておく。
【００４１】
また、前記ＤＮＡリガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドが一本鎖の遺伝物質にハイブリダイズされてその塩基配列の末端オリゴヌクレオチドの糖であるデオキシリボース同士が直接に隣接する場合であって、各３塩基ずつの塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と相補的である場合にのみ、前記２つのオリゴヌクレオチドの末端のデオキシリボース同士を特異的に結合させる酵素である。
【００４２】
前記検出用オリゴヌクレオチドは、１個の非磁性の担体と、その担体に結合した３個の塩基の塩基配列をもつ多数の１種類のそのオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部と結合した標識物質である蛍光物質とからなり、その担体に保持された蛍光物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、４3 （＝６４）種類を識別するためのコード化は、蛍光物質の種類および／または量比を変えることによって行われるものである。ここで、蛍光物質は、例えば、検出用オリゴヌクレオチドに３種類、磁力操作用オリゴヌクレオチドにさらに３種類を用いる。蛍光物質の種類には、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレッセイン・イソチオシアネート）、ローダミン、イソチオシアネート、ＩＲＤ４０、ＣＹ３、ＣＹ５、ユウロピウム錯体等がある。
【００４３】
また、前記磁力操作可能オリゴヌクレオチドは、１個の磁性の担体と、その担体に結合した３個の塩基の塩基配列をもつ１種類の多数のそのオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部と結合した標識物質である蛍光物質とからなり、その担体に保持された蛍光物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、４3 （＝６４）種類を識別するためのコード化は、蛍光物質の種類および／または量比を変えることによって行われるものである。ここで、コード化のために使用される前記オリゴヌクレオチドには、ＩＭＰ（イノシン酸：プリン環にアミノ基や水酸基がついていない）等をアームまたはスペーサーとして、担体又は標識物質との間に設けることによって、蛍光物質のクエンチングを防止するのが好ましい。
【００４４】
続いて、本実施の形態に係る懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法を図１に基づいて説明する。
【００４５】
図１に示すように、本遺伝物質シーケンス決定方法は、ステップＳ１で、ＤＮＡの塩基配列を決定しようとする試料、例えば、ヒト等の細胞や細菌等から、標的ＤＮＡ断片を抽出する。標的ＤＮＡ断片を抽出するには、例えば、前記分注機を用いてベクターが導入された細菌コロニーとＤＮＡ抽出液とを混合して可溶化させ、磁性粒子を分注機を用いて混合することによって所定ベース（１〜数キロベース）の標的ＤＮＡ断片を磁性粒子に捕獲させる。その標的ＤＮＡ断片を捕獲した磁性粒子を含む懸濁液を前記分注機の液通路を通過させる際に、磁場を及ぼすことによって、液通路の内壁に吸着させて分離する。さらに、磁性粒子を前記液通路の内壁に吸着させたままで洗浄液を前記液通路を通して吸引することによって前記磁性粒子、その磁性粒子に捕獲された標的ＤＮＡ断片および液通路を洗浄する。その後、磁性粒子を液通路の内壁に吸着させたままでベクターを溶出する。
【００４６】
次に、ステップＳ２で、前記抽出した環状の前記標的ＤＮＡ断片が組み込まれたベクターについて、その環状標的ＤＮＡ断片を切断する。ここで、ベクターには、プラスミドまたはバクテリオファージ等を含む。
【００４７】
ここで、前記切断工程は、前記標的ＤＮＡ断片が組み込まれたベクターと所定試薬を各々収容した各収容部から前記分注機の液通路を介して吸引し、恒温機能を有する収容部に移動し、かつ吐出して環状の標的ＤＮＡ断片を切断する。また前記所定試薬とは、水、切断用バッファおよび切断酵素である。
【００４８】
ステップＳ３で、このようにして得られた標的ＤＮＡ断片が懸濁する液に熱を加えた後、急冷することによって、その標的ＤＮＡ断片を一本鎖に解離する。
【００４９】
ステップＳ４で、このようにして得られた標的ＤＮＡ断片が懸濁する液を前記懸濁系に投入し、両者を懸濁混合させる。すると、一本鎖化された標的ＤＮＡ断片の塩基配列の３塩基ごとに、それと略相補的な前記検出用オリゴヌクレオチドまたは磁力操作可能オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする。このようにして、その標的ＤＮＡ断片の塩基配列を介して、１種または２種の検出用オリゴヌクレオチドのみ、１種または２種の磁力操作可能オリゴヌクレオチドのみ、検出用オリゴヌクレオチドと磁力操作可能オリゴヌクレオチドの組み合わせたものが得られる。さらに、この懸濁液中には、全くハイブリダイズされない標的ＤＮＡ断片や、その標的ＤＮＡ断片とハイブリダイズされない磁力操作可能オリゴヌクレオチドや検出用オリゴヌクレオチドが懸濁されている状態となっている。
【００５０】
標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズされている検出用オリゴヌクレオチドまたは磁力操作可能オリゴヌクレオチドとの３塩基を含む塩基配列端同士が隣接している場合、前記ＤＮＡリガーゼの働きにより、これらの３塩基ずつが標的ＤＮＡ断片の塩基配列と完全に相補的である場合には、このオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボース同士が結合し、各々６塩基配列のオリゴヌクレオチドが得られることになる。
【００５１】
なお、前記標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズされた２つのオリゴヌクレオチドは必ずしも検出用オリゴヌクレオチドと磁力操作可能オリゴヌクレオチドの組み合わせとは限らないし、また、塩基配列端同士が隣接するものとも限られないが、ある確率でこれらの組み合わせが必ず存在することは明らかである。
【００５２】
図２は、この段階で、懸濁液中に存在する標的ＤＮＡ断片１０にハイブリダイズされた、検出用オリゴヌクレオチド１２と、磁力操作可能オリゴヌクレオチド１１の組み合わせの例を示すものである。図２（ａ）は、検出用オリゴヌクレオチド１１と磁力操作可能オリゴヌクレオチド１１の３塩基ずつの塩基配列が標的ＤＮＡ断片１０の塩基配列と相補的になるとともに、その端塩基が隣接してハイブリダイズされている場合を示す。この場合には、前記ＤＮＡリガーゼの働きによって、両者の末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボース同士が結合して６塩基配列のオリゴヌクレオチドが得られることになる。
【００５３】
一方、図２（ｂ）は、検出用オリゴヌクレオチド１２と、磁力操作可能オリゴヌクレオチド１１の３塩基ずつの塩基配列が標的ＤＮＡ断片の塩基配列と相補的となっていないため、その端塩基が隣接してハイブリダイズされているが、両者の末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボーズ同士が結合しない場合を示している。
【００５４】
図２中小さい白丸○は各種塩基を表す。また、二重丸◎は例えば、ＩＭＰ（イノシン酸）等の物質を表す。黒丸●は、図１（ａ）の標的ＤＮＡ断片１０と、図１（ｂ）の標的ＤＮＡ断片１０ｓのうち異なる塩基（ＳＮＰ）を表すものである。
【００５５】
同図に示すように、磁力操作可能オリゴヌクレオチド１１は、３塩基１５をもつ１種類の多数のオリゴヌクレオチドがアーム１６およびビオチン１７を介して磁性の担体である磁性粒子１８に結合している。磁性粒子１８の表面は、前記ビオチンと特異的に結合するアビジンでコーティングされている。また、一部のオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドには、標識化物質である蛍光物質１３、１４が結合して、そのオリゴヌクレオチドを識別する。検出用オリゴヌクレオチド１２は、３塩基１９をもち、アーム２０を介して図示しない非磁性の担体と結合する構造である。
【００５６】
ここで、「一部のオリゴヌクレオチド」とは、磁性粒子１８または図示しない非磁性の粒子に保持された全オリゴヌクレオチドの１％または１０％以下である。また、量比は例えば、０．２５％、０．５％、０．７５％および１．０％（または、２．５％、５．０％、７．５％、および１０．０％）のように変えることによって、蛍光物質の各種類について、４段階を識別するようにコード化する。また、検出用オリゴヌクレオチドと磁力操作可能オリゴヌクレオチドに使用する蛍光物質の種類を異ならせることによって、各々が選別可能である。
【００５７】
ステップＳ５で、この懸濁液全体を、前記分注機で吸引し、一定の温度状態に保たれている恒温槽に移送し吐出することによって加熱する。これによって、前記標的ＤＮＡ断片が一本鎖化されることによって、その標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズされているオリゴヌクレオチドが解離する。その際、図２（ａ）に示すように２つのオリゴヌクレオチドが前記ＤＮＡリガーゼによって結合している場合には、６塩基配列のオリゴヌクレオチドが得られることになるが、図２（ｂ）に示すように、たとえ、ハイブリダイズした２つのオリゴヌクレオチドであっても、完全に相補的でないために、ＤＮＡリガーゼによって結合していない場合には、３塩基配列のままのオリゴヌクレオチドとして懸濁液中に懸濁することになる。したがって、この段階では、６塩基の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡ断片の塩基配列に完全に相補的になっている塩基配列のみが存在することになる。
【００５８】
ステップＳ６で、前記分注機がこの懸濁液を吸引する際に、磁場を分注機の液通路内に及ぼすことによって、前記オリゴヌクレオチドのうち、磁性粒子を有するオリゴヌクレオチドのみを液通路の内壁に吸着させて分離する。液通路の内壁にオリゴヌクレオチドを吸着させたまま、洗浄液等の吸引および吐出を繰り返すことによって、吸着させたオリゴヌクレオチドを洗浄する。これによって、磁性粒子をもっていない単独の検出用オリゴヌクレオチドや、検出用オリゴヌクレオチド同士が結合したものや、単独の標的ＤＮＡ断片や夾雑物等を除去することができる。洗浄されかつ分注機の液通路の内壁に吸着したオリゴヌクレオチドを別容器にまで移送し、磁場を除去した状態で吸引吐出を繰り返すことによって、液通路の内壁から磁性粒子を離脱させ、液中に再懸濁させる。
【００５９】
こうして得られた懸濁液中には、単独の磁力操作可能オリゴヌクレオチド、磁力操作可能オリゴヌクレオチド同士が結合したもの、磁力操作可能オリゴヌクレオチドと検出用オリゴヌクレオチドとが結合したものが懸濁液中に存在することになる。
【００６０】
ステップＳ７で、この懸濁液をフローサイトメーターの管路を通過させることによって前記オリゴヌクレオチドのコードを読み取る。このフローサイトメーターの管路には、一定の励起波長の光を照射させる発光手段と、励起された標識物質である蛍光物質からの光を受光する受光手段と、受光した光を解析する解析部が設けられたものである。
【００６１】
前記解析部は、単独の磁力操作可能オリゴヌクレオチドを排除するために検出用オリゴヌクレオチドのグループを識別するコードである蛍光物質の種類があるもののみを選別して、そのコードの組み合わせである蛍光物質の種類を特定する。これによって、磁力操作可能オリゴヌクレオチドと検出用オリゴヌクレオチドのコードの組み合わせを読み取ることになる。
【００６２】
ステップＳ８で、読み取られたコードの組み合わせから、標的ＤＮＡ断片に存在するの６塩基分の塩基配列を決定することができる。このようなコードの組み合わせを、その標的ＤＮＡ断片の塩基配列が順次つながるように、配列を決定することによって、標的ＤＮＡ断片に存在する全塩基配列を決定することができることになる。もし、前記標的ＤＮＡ断片のベースが、４０９６塩基配列よりも長い場合、または繰返しを含む配列である場合には、重複出現数を発光強度に基づいて決定するようにする。本実施の形態によれば、６塩基ずつのコードの組み合わせによる発光を測定することができるので、高い信頼性で測定を行うことができる。
【００６３】
続いて、本実施の形態に係るＳＮＰs のスコアリング方法について、図３に基づいて説明する。
本実施の形態に係るＳＮＰs のスコアリング方法においても、前述したように、分注機、移動部、制御部、ステージおよびフローサイトメーターを用いる。
【００６４】
本実施の形態に係るＳＮＰs のスコアリング方法を行うためには、解析の容易化のため前述した懸濁系を同量（濃度および絶対量）および同じ構成要素のものを第一の懸濁系および第二の懸濁系として、予め２つの別の容器に用意しておく。
【００６５】
図３に示すように、本ＳＮＰs のスコアリング方法は、２つの異なる第一の試料および第二の試料から各々抽出した第一のＤＮＡ断片および第二のＤＮＡ断片の塩基配列を比較することによって、ＳＮＰs （多型の塩基配列）を決定しようとするものである。
【００６６】
図３のステップＳ１１で、第一の試料から所定ベースの第一のＤＮＡ断片が組み込まれたベクターを抽出し、ステップＳ２１で、第二の試料から所定ベースの第二のＤＮＡ断片が組み込まれたベクターを抽出する。抽出の方法については、既に、ステップＳ１で説明したとおりである。ここで、「所定ベース」は、その断片中に数個のＳＮＰｓが含まれる場合に検出可能であるので、３００〜５００塩基対にひとつＳＮＰｓが存在し、特定の６塩基配列が平均４０９６（＝４6 ）塩基対にひとつ存在することから、１〜数キロベースである。
【００６７】
ステップＳ１２およびステップＳ２２で、各々、環状の第一のＤＮＡ断片および環状の第二のＤＮＡ断片を切断する。その方法については、前述したステップＳ２で説明した通りである。
【００６８】
ステップＳ１３およびステップＳ２３で、各々、第一のＤＮＡ断片および第二のＤＮＡ断片が懸濁する液に熱を加えた後、急冷することによって二本鎖を一本鎖化する。
【００６９】
ステップＳ１４およびステップＳ２４で、このようにして得られた第一のＤＮＡ断片を、第一の懸濁系に投入して懸濁混合させるとともに、第二のＤＮＡ断片を第二の懸濁系に投入して懸濁混合させる。
【００７０】
ステップＳ１５およびステップＳ２５において、各懸濁液全体を、前記分注機で吸引し、一定の温度状態に保たれている恒温槽に移送し吐出することによって加熱する。これによって、前記第一のＤＮＡ断片および第二のＤＮＡ断片が一本鎖化されることになる。
【００７１】
ステップＳ１６およびステップＳ２６で、前記分注機が各懸濁液を吸引する際に、磁場を分注機の液通路内に及ぼすことによって、前記オリゴヌクレオチドのうち磁性粒子を有するオリゴヌクレオチドのみをその液通路の内壁に吸着させて分離する。液通路の内壁にオリゴヌクレオチドを吸着させたまま、洗浄液等の吸引および吐出を繰り返すことによって、吸着させたオリゴヌクレオチドを洗浄する。これによって、磁性粒子をもっていない単独の検出用オリゴヌクレオチオドや、検出用オリゴヌクレオチド同士を結合したものや、第１のＤＮＡ断片や夾雑物等を除去することができる。洗浄されかつ分注機の液通路の内壁に吸着したオリゴヌクレオチドを別容器にまで移送し、吸引吐出を繰り返すことによて再懸濁させる。
【００７２】
ステップＳ１７およびステップＳ２７において、前記フローサイトメーターを用いて、前述した方法で、解析部は、単独の磁力操作可能オリゴヌクレオチドを排除するために検出用オリゴヌクレオチドのグループを識別するコードである蛍光物質があるもののみを選択して、そのコードの組み合わせである蛍光物質の種類を特定する。これによって、磁力操作可能オリゴヌクレオチドと検出用オリゴヌクレオチドのコードの組み合わせを読み取ることができる。
【００７３】
ステップＳ１８で、読み取られたコードの組み合わせによって得られた第一のＤＮＡ断片の塩基配列と第二のＤＮＡ断片の塩基配列とを比較し、１または２以上の異なる塩基があれば、各々がＳＮＰ(s) である。例えば、第一の試料から得られた第一の標的ＤＮＡ断片１０については、図２（ａ）の塩基配列であるが、第２の試料から得られた第二の標的ＤＮＡ断片１０ｓについては、第一の標的ＤＮＡ断片１０と塩基２１が異なることが、コードの解析によって判明したとすれば、塩基２１の塩基配列の位置において多型であることが決定される。本実施の形態によれば、リガーゼ反応産物の差を見るだけでＳＮＰs を検出することができるので、高い信頼性で容易に結果を得ることができる。
【００７４】
これらの実施の形態は本発明をより良く理解させるために具体的に説明したものであって、別形態を制限するものではない。したがって、発明の主旨を変更しない範囲で変更可能である。例えば、以上の説明では、ＤＮＡ断片については、ベクターを利用して増殖および抽出を行って得るようにしたが、この場合に限られることなく、例えば、抽出したＤＮＡ断片にＰＣＲプライマを結合しＰＣＲ法によって増幅することによってＤＮＡを得て、熱変成させた一本鎖化ＤＮＡを用いるようにしても良く、またはクローン化を行うことによって、同一の塩基配列をもつ標的ＤＮＡ断片を得ることができる。さらに、前記一本鎖化を行うには、熱した後急冷する方法の他に、アルカリ溶液を加えることによって行っても良い。この場合には緩衝剤が必要になる。
【００７５】
以上の例では、予め用意した懸濁系には、所定塩基数である３個の全種類である４3 種類ずつの１２８種類のオリゴヌクレオチドを懸濁させていたが、この種類を絞り込むことができる場合には、特定種類のオリゴヌクレオチドを懸濁させておくようにしても良い。また、所定塩基数として、３個の場合についてのみ説明したが、３個以上の場合であっても良い。
【００７６】
さらに、前記酵素として、２つのオリゴヌクレオチドが標的の一本鎖のＤＮＡ断片に隣接してハイブリダイズした場合に、３つの塩基ずつを認識して２つのオリゴヌクレオチドを特異的に結合するようにしているが、このような場合に限られない。
【００７７】
また、塩基配列を決定するには、１個１個のオリゴヌクレオチドのコードを読み取ることによって、コードの組み合わせから、６つの塩基配列を決定する場合について説明したが、このような場合に限られず、複数個または多数個のオリゴヌクレオチド対について蛍光等の強度を測定することによって、塩基配列を決定するようにしても良い。また、以上の例では、第１のコード化オリゴヌクレオチドは非磁性の担体を有するものを用いたが、担体を有しないものを用いても良い。また、その全部または一部について、ジデオキシリボースを設けたものを用いても良い。さらに、第２のコード化オリゴヌクレオチドに磁性担体を用いずに、コードによって選別可能なものを用いても良い。
【００７８】
【発明の効果】
第一の発明に係る懸濁系、第十の発明に係る方法または第十三の発明に係るＳＮＰs の決定方法は、所定塩基数の塩基配列をもつコード化された第１のコード化オリゴヌクレオチド群および第２のコード化オリゴヌクレオチド群の２つのグループを用いるとともに、遺伝物質と一定の関係がある場合のみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボース同士を特異的に結合させる酵素を有している。したがって、ＤＮＡチップのように単にハイブリダイゼーションを利用して、相補的なオリゴヌクレオチドの塩基配列を得る場合に比較して、より高い信頼性で、かつ容易に遺伝物質のシーケンスを決定することができる。
【００７９】
さらに、ＳＮＰs を特定するために塩基配列の種々の態様のオリゴヌクレオチドをＤＮＡチップに固定するという加工作業を行うことなく、種々の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを懸濁させるという作業によって、簡単かつ容易に塩基配列を決定することができる。
【００８０】
また、本発明では、スライドグラス等の平板上のスポット内の限られた狭い平面上のハイブリダイゼーション反応ではなく、懸濁系内の広い範囲内で、反応を行うことができるので、反応効率を飛躍的に上昇させ、平行に達するまでの時間を短縮することができる。
【００８１】
さらに、スライドグラス上に固定化したオリゴヌクレオチドの位置によりその配列を区別する方法と異なり、コード化した多種類のオリゴヌクレオチドは同一の反応液の中に共存するので、同一条件下で一括して反応を進めることができる。
【００８２】
また、本発明では、長い塩基配列を一挙に決定するのではなく、酵素が特異的結合を行うために認識できる短い塩基配列を繰り返して適用することによって、長い塩基配列を決定するようにしている。したがって、決定に使用する第１のコード化オリゴヌクレオチド群と第２のオリゴヌクレオチド群で必要とする塩基配列の種類は、これらの塩基数の和に相当する塩基配列の決定に必要とするオリゴヌクレオチドの種類数に比べて非常に小さくて済むので、これらのコード化の作業が容易である。例えば、前述した実施の形態では、全塩基配列種類数は６４＋６４の１２８あれば足りる。一方、６塩基配列についてのオリゴヌクレオチドを用意しようとすると、４6 ＝４０９６種類のものを用意する必要があり、塩基配列の種類は圧倒的に少なくて済む。
【００８３】
第二の発明または第十一の発明は、前記各第１のコード化オリゴヌクレオチドと第２のコード化オリゴヌクレオチドの一方を遠隔操作される磁性粒子に保持されるように設けたものである。本発明によれば、磁場を分注機のノズル等の液通路内に及ぼすことによって、分離することができるので、磁性粒子を有していないコード化オリゴヌクレオチドを排除することができるので、磁性粒子を有しているコード化オリゴヌクレオチドを容易かつ確実に選別することができる。
【００８４】
第三の発明および第四の発明では、前記各第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの所定塩基数は、少なくとも３塩基である。したがって、第１のコード化オリゴヌクレオチド群および第２のコード化オリゴヌクレオチド群の種類は各々４3 種類で足りるので、６塩基をもつオリゴヌクレオチドのように４０９６種類を用意する必要がないので、圧倒的に小さい種類のものを用意すれば足りるので、作業が容易である。
【００８５】
第五の発明によれば、種類および／または量比を変えた標識物質をオリゴヌクレオチドに結合させることによってコード化したものである。本発明によれば、遺伝物質に応じて、数珠繋ぎに連結したオリゴヌクレオチドを得ることができる。
【００８６】
第六の発明によれば、全部にジデオキシリボースを設けた場合には第１のコード化オリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドが１個ずつ（前記所定塩基数ずつ）連結した二量体のみが得られることになる。これによって、塩基数列を揃えることができるので、例えば、発光物質によってコード化されている場合にはコードの読取りを確実かつ容易に行うことができる。また、一部にジデオキシリボースを設けた場合には第１のコード化オリゴヌクレオチドが１個、２個、３個、それ以上と多数結合して最後にジデオキシリボースが含まれた第１のコード化オリゴヌクレオチドが結合した結合体を同定することができる。これによって、ＤＮＡシーケンスを比較的簡単に読み取ることができる。
【００８７】
第七の発明および第八の発明は、非磁性または磁性の担体にオリゴヌクレオチドを担持させ、一部のオリゴヌクレオチドまたは担体に結合する標識物質の種類および／または量比を変えることによってコード化を行うものである。したがって、例えば、数十〜数百程度の多種類の塩基配列を、確実明瞭にコード化して識別することができる。さらに、微小粒子等の担体の表面上で反応させることにより反応面積が増加し、反応効率を飛躍的に上昇させることができる。
【００８８】
第九の発明は、アームを介してオリゴヌクレオチドを担体または標識物質と結合したものである。本発明によれば、標識物質間がより一層離れることになるので、クエンチング（消光）を有効に防止することができるので、高い信頼性で塩基配列を決定することができる。
【００８９】
第十二の発明は、液通路および磁力部等を有する分注機を用いて、その液通路の外部から磁場を及ぼしまたは除去することによって、第２のコード化オリゴヌクレオチドが有する磁気粒子を前記液通路の内壁に吸着させまたは離脱するものである。これによって、塩基配列の決定を、自動的、効率的かつ迅速に一貫して行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る遺伝物質シーケンス決定方法を示す流れ図
【図２】本発明の実施の形態に係る標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを示す概念図
【図３】本発明の実施の形態に係るＳＮＰs のスコアリング方法を示す流れ図
【符号の説明】
１０，１０ｓ…標的ＤＮＡ断片
１１…磁力操作可能オリゴヌクレオチド（第２のコード化オリゴヌクレオチド）
１２…検出用オリゴヌクレオチド（第１のコード化オリゴヌクレオチド）
１３、１４…蛍光物質（標識物質）
１５…３塩基
１６…アーム
１８…磁性粒子
Claims (10)
- ３塩基数の１種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するようにコード化された第１のコード化オリゴヌクレオチドを、その塩基数における特定種類の塩基配列を網羅するように包含し、この群に属するものとして各々選別可能に設けられた第１のコード化オリゴヌクレオチド群と、
３塩基数の１種類の塩基配列をもちその塩基配列を識別するとともに、前記第1のコード化オリゴヌクレオチドと異なるようにコード化された第２のコード化オリゴヌクレオチドを、その塩基数における特定種類の塩基配列を網羅するように包含し、この群に属するものとして各々選別可能に設けられた第２のコード化オリゴヌクレオチド群と、
２つのコード化オリゴヌクレオチドが一本鎖の遺伝物質にハイブリダイズされて各コード化オリゴヌクレオチドの前記塩基配列の末端ヌクレオチド同士が直接に隣接する場合であって、かつ、前記３塩基数の塩基配列がその遺伝物質の塩基配列と相補的である場合にのみ、その末端ヌクレオチドの糖であるデオキシリボースを介して２つのオリゴヌクレオチド同士を特異的に結合させるＤＮＡリガーゼと、
前記第２のコード化オリゴヌクレオチドが保持されるとともに、該第２のコード化オリゴヌクレオチドまたは前記第１のコード化オリゴヌクレオチドを捕獲した前記一本鎖の遺伝物質を再び一本鎖に解離した後に磁場によって遠隔操作される磁性粒子とを容器内の液に懸濁させた遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。 - 前記第１のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第１のコード化オリゴヌクレオチドは、３塩基配列をもつ１種類のオリゴヌクレオチドと、そのオリゴヌクレオチドと結合した標識物質とからなり、その標識物質は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は、標識物質の種類および／またはその量比を変えることによって行われたことを特徴とする請求項１に記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。
- 前記第１のコード化オリゴヌクレオチド群に属する第１のコード化オリゴヌクレオチドの全部または一部について、その遊離末端に標識化されたジデオキシリボースを有していることを特徴とする請求項２に記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。
- 前記第１のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第１のコード化オリゴヌクレオチドは、１個の非磁性の担体と、その担体に結合した３塩基配列をもつ多数の１種類のオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部にまたはオリゴヌクレオチドと結合した部位と異なる部位でその担体に結合した標識物質とからなり、その標識物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は、標識物質の種類および／または量比を変えることによって行われたことを特徴とする請求項１に記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。
- 前記第２のコード化オリゴヌクレオチド群に属する各第２のコード化オリゴヌクレオチドは、１個の磁性の担体と、その担体に結合した３塩基配列をもつ１種類の多数のオリゴヌクレオチドと、その担体が結合した部位と異なる部位でそのオリゴヌクレオチドの一部にまたはオリゴヌクレオチドと結合した部位と異なる部位でその担体に結合した標識物質とからなり、その標識物質の全体は所定の種類が所定の量比含まれるとともに、コード化は、標識物質の種類および／または量比を変えることによって行われたことを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。
- 前記オリゴヌクレオチドは、アームを介して担体または標識物質と結合したことを特徴とする請求項２ないし請求項５のいずれかに記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系。
- 請求項１ないし請求項６のいずれかに記載された懸濁系に、前記３塩基数よりも十分に大きい所定ベースの一本鎖の標的遺伝物質を投入懸濁させて、前記標的遺伝物質に前記第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる対合工程と、
第１のコード化オリゴヌクレオチドまたは第２のコード化オリゴヌクレオチドを捕獲した前記標的遺伝物質を再び一本鎖に解離する解離工程と、
解離工程の後、前記懸濁液中から、第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの対を選別する選別工程と、
選別された第１のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードとの組み合わせに基づいて、その標的遺伝物質の塩基配列を決定する決定工程とを有している遺伝物質シーケンス決定用懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法。 - 前記対合工程において、前記第１のコード化オリゴヌクレオチドは、その群に属するものとして選別可能であるようにコード化されるとともに、前記各第２のコード化オリゴヌクレオチドは、磁場によって遠隔操作される磁性粒子に保持されるように設けることによって、その群に属するものとして選別可能であり、前記選別工程は、磁場操作によって第２のコード化オリゴヌクレオチドを分離する分離工程を有していることを特徴とする請求項７に記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法。
- 第２のコード化オリゴヌクレオチドが担体として磁性粒子を有している場合には、前記選別工程は、液通路、その液通路に外部から磁場を及ぼしかつ除去する磁力部、およびその液通路内の圧力を制御して流体の吸引および吐出を行う圧力制御部を有する分注機を用いて、その液通路の外部から磁場を及ぼしまたは除去することによって、前記第２のコード化オリゴヌクレオチドが有する前記磁気粒子を前記液通路の内壁に吸着させまたは離脱するものであることを特徴とする請求項７に記載の遺伝物質シーケンス決定用懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法。
- 請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の２つの略同一の懸濁系を用意し、その一方に、第一の試料から抽出して得られた所定ベースの一本鎖の第一の標的遺伝物質を投入懸濁させ、他方に、第二の試料から抽出して得られた所定ベースの一本鎖の第二の標的遺伝物質を投入懸濁させ、各標的物質に前記第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる対合工程と、
各々、第１のコード化オリゴヌクレオチドまたは第２のコード化オリゴヌクレオチドの対を捕獲した前記標的遺伝物質を再び一本鎖に解離する解離工程と、
前記懸濁液中から、第１のコード化オリゴヌクレオチドおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドを選別する選別工程と、
各々、選別された第１のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードおよび第２のコード化オリゴヌクレオチドの示す塩基配列を識別するコードとの組み合わせに基づいて、その標的遺伝物質の塩基配列を決定する決定工程と、
各々、前記第一の標的遺伝物質について決定された塩基配列と、前記第二の標的遺伝物質について決定された塩基配列とを比較することによって単一ヌクレオチド多型の同定を行う同定工程を有することを特徴とする遺伝物質シーケンス決定用懸濁系を用いたＳＮＰs 高速スコアリング方法。
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