JPH10505492A - 担体上で核酸の増幅を行う方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、担体上で核酸ハイブリダイゼーションおよび増幅方法を実施するための方法および装置を特徴とする。このような方法および装置は、核酸の合成ならびに診断および治療のための標的核酸の検出に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 担体上で核酸の増幅を行う方法および装置 発明の分野 本発明は、担体上で核酸ハイブリダイゼーションおよび増幅を行う方法および 装置を特徴とする。かかる方法および装置は、核酸を合成し、診断および治療の ために標的核酸を検出するのに有用である。 発明の背景 本発明の理解を容易にするため、つぎの定義を規定する。本願で使用する「生 物学的結合対」なる用語は、天然の親和性または結合能を示す、いずれかの一対 の分子を指す。本願の目的のため、「リガンド」なる用語は、生物学的結合対の １つの分子を指し、「アンチリガンド」または「受容体」なる用語は、該生物学 的結合対の反対の分子を指す。核酸の２つの相補性鎖は生物学的結合対である。 この鎖の１つをリガンドと称し、他の鎖をアンチリガンドと称する。しかしなが ら、生物学的結合対はまた、抗原および抗体、薬剤および薬剤の受容体部位なら びに酵素および酵素基質からなることもできる。 「プローブ」なる用語は、標的アンチリガンドに選択的に結合できる公知の性 質のリガンドを指す。核酸について用いる「プローブ」なる用語は、標的塩基配 列に対して相補性の塩基配列を有する核酸の鎖を指す。典型的には、プローブは 、プローブが結合する標的塩基配列を同定するための標識を伴うか、または標的 塩基配列と結合し、捕獲する担体を伴う。「プライマー」なる用語は、標的塩基 配列と相補性の塩基配列を有する核酸を指すために使用し、核酸ハイブリダイゼ ーションに際して反応を促進させるために使用する。これらの反応には、通常、 ポリメラーゼおよびトランスクリプターゼと称する酵素が関与する。 「標識」なる用語は、限定するものではないが、例えば、放射性同位元素、酵 素、発光試薬、染料（dye）および検出可能な挿入剤（intercalating agent）を 包含する検出できる分子部分を指す。標識に関する「剤」なる用語は広義の意味 に用い、検出可能な応答を導く反応に関与するいずれもの分子部分を包含する。 「コファクター」なる用語は、標識剤との反応に関与するいずれもの組成物を包 含する広義の意味に用いる。 「担体」なる用語は、ビーズ、粒子、デイップスティック（dipstick）、繊維 、濾紙、膜およびガラスのようなシランまたはシリケート担体のごとき通常の担 体を指す。 「増幅」なる用語は、例えば、さらなる標的分子または標的様分子または標的 分子に相補性の分子を包含する増幅生産物を創造するための広義の意味で使用し 、これらの分子は、試料中の標的細胞の存在により創造される。標的が核酸の場 合、増幅生産物は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼまたはトランスクリプター ゼにより酵素的に作成される。 遺伝情報は、生体細胞においてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の糸状分子中に保 存される。イン・ビボ（in vivo）で、ＤＮＡ分子は二重螺旋であり、その各鎖 はヌクレオチドの鎖である。各ヌクレオチドは４つの塩基：アデニン（Ａ）、グ アニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）のうちの１つによって特徴づ けられる。これらの塩基は、官能基の配向により、ある種の塩基対が吸引し、互 いに水素結合を介して結合するという点で相補性である。アデニンは、チミンを 対応する相補性の塩基とするＤＮＡ対の一方の塩基である。グアニンは、シトシ ンを対応する相補性の塩基とするＤＮＡ対の一方の塩基である。リボ核酸（ＲＮ Ａ）においては、アデニンを対応の相補性の塩基とする対のチミン塩基は、ウラ シル（Ｕ）により置き換わっている。 ＤＮＡは共有結合したデオキシリボ核酸の鎖からなり、ＲＮＡは共有結合した リボ核酸の鎖からなる。生体の遺伝コードはＤＮＡの塩基対の配列中に担持され ている。ＤＮＡ配列が、ＲＮＡ配列に転写され、ＲＮＡ配列が蛋白質に翻訳され る工程で、生体により蛋白質が生産または発現される。 各核酸は、１つのヌクレオチドの糖の５'ヒドロキシル基と、隣接するヌクレ オチドの糖の３'ヒドロキシル基の間のホスホジエステル架橋によって結合して いる。天然のＤＮＡおよびＲＮＡの各直鎖は、遊離の５'ヒドロキシル基を有す る１つの末端と、３'ヒドロキシル基を有する他の末端を持つ。ポリヌクレオチ ドの末端は、しばしば、各遊離のヒドロキシル基に関して、５'末端または３'末 端と称される。ＤＮＡおよびＲＮＡの相補性鎖は、１つの鎖の３'末端が対応す る鎖の５'末端に配向するアンチパラレル複合体を形成する。 核酸ハイブリダイゼーション分析は、それらが相補性配列領域を含む場合に、 非常に安定な対となる核酸鎖対の傾向を検出する。相補性ヌクレオチドの各対は 、２つの鎖の間で、２つの核酸の間で形成された生物学的結合対間の対形成（pa iring）の安定性を増加する。生長する生体から単離されたＤＮＡ断片は、一般 に、その対形成が非常に安定な一対の完全に相補性の鎖の二重鎖ＤＮＡである。 「ハイブリダイズ」なる用語は、そのような対形成を促進する条件を課すことを 指す。「変性」なる用語は、そのような対形成をはばむ条件を課すことを指す。 これらの条件は、イオン強度、ｐＨまたは温度を調整することにより課すことが できる。 ポリメラーゼおよびトランスクリプターゼは、適当な反応条件の存在下で、Ｄ ＮＡまたはＲＮＡ鎖の相補性コピーを生成する。コピーされる鎖は鋳型ＤＮＡま たはＲＮＡと称される。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、一対の核酸プライマーを用いて標的核酸 を合成する。１つのプライマーが第１の鎖上で標的配列にハイブリダイズし、第 ２のプライマーが第２の鎖の上で第２の標的配列にハイブリダイズする。これに より、プライマー対の１つによって指向される増幅生成物を、プライマー対の第 ２の構成員により指向される合成の鋳型として使用できる。ＰＣＲは、プライマ ー対の両方の構成員を含む溶液と、対形成したＤＮＡの変性に必要とされる条件 に耐えることのできるポリメラーゼを使用して行われる。 組織もしくは培養試料から抽出した総ＤＮＡまたはＲＮＡ中の特有のＤＮＡも しくはＲＮＡ配列または特異的な遺伝子の同定により生理的または病理的条件の 存在を表わすことができる。特に、ヒトまたは動物組織から抽出した総ＤＮＡま たはＲＮＡ中の、特有のＤＮＡもしくはＲＮＡまたは特定の遺伝子の同定は、鎌 状赤血球貧血のような遺伝的疾病または症状、組織適合性、ガンおよび前ガン状 態または細菌もしくはウイルス感染の存在を表わすことができる。細菌培養また は細菌を含有する組織から抽出した総ＤＮＡまたはＲＮＡ中の、特有のＤＮＡも しくはＲＮＡまたは特定の遺伝子の同定は、抗生物質耐性、毒素、ウイルスまた はプラスミドの存在を表すことができ、また、細菌の型間の同定を与えることが できる。 このように、核酸ハイブリダイゼーション分析は、疾患の診断、検出に大きな 可能性を有している。さらに、農業や食品加工においても可能性があり、そこで は、核酸ハイブリダイゼーション分析は、植物病原または毒素産生細菌の検出に 使用できる。 現在、多くの研究が、生体を規定する核酸配列の同定に向けられている。この 方法の最初の工程は、マッピング（mapping）として知られている核酸内の領域 の同定である。これらの領域はさらにシーケンシング（sequencing）に付すこと ができる。マッピング方法およびシーケンシング方法共に遅く、長たらしく、退 屈なものである。 発明の概要 本発明は、標的配列を有する第１の核酸の存在下に増幅生成物を生成させる方 法、製品（article of manufacture）および装置に関する。該方法、製品および 装置は、溶液ベースのプライマー対を使用しない第１の核酸の増幅を特徴とする 。この方法、製品および装置は、核酸の迅速分析用の多重（multiple）同時増幅 反応の遂行を可能にする。この増幅反応は外部反応チャンバーの存在を必要とせ ず、または増幅生成物の分析用のゲルの存在または使用を必要としない。 本発明の１つの具体例は、第１の標的配列を有する第１の核酸の存在下で増幅 生成物を形成させることを特徴とする。この方法は、第１の核酸含有の可能性の ある試料と、担体とからなる浸漬生成物を形成する工程を含む。担体は、該標的 配列に相補性の配列を有する第２の核酸を有する。第２の核酸は担体に共有的に 結合している。この方法は、さらに、試料中に第１の核酸が存在する場合、第１ の核酸と第２の核酸とのハイブリダイゼーション生成物形成の工程を含む。ハイ ブリダイゼーション生成物は、浸漬生成物にハイブリダイゼーション条件を課す ることにより形成される。この方法は、さらに、該第２の核酸から共有的に延長 している、第１の核酸に相補性の核酸からなる第１の増幅生成物を形成する工程 を含む。 好ましくは、第１の核酸は、第２の標的配列と、第２の標的配列に相同な第３ の核酸を含む担体とからなる。好ましくは、この方法は、さらに、浸漬生成物に 変性条件を課し、第２の核酸から第１の核酸を遊離させる工程を含む。第１の核 酸の遊離は、第１の核酸のさらなるハイブリダイゼーション反応への関与を可能 にする。 好ましくは、第１の核酸の遊離はまた、増幅生成物がさらなるハイブリダイゼ ーション反応に関与し、第２のハイブリダイゼーション生成物を形成することを 可能にする。好ましくは、この方法は、ハイブリダイゼーション条件を課す第２ の工程をさらに含み、少なくとも１つの第２のハイブリダイゼーション生成物を 形成させる。第２のハイブリダイゼーション生成物は、第１の増幅生成物と、第 ３の核酸または第１の核酸と、さらなる第２の核酸からなる。好ましくは、浸漬 生成物に第２のハイブリダイゼーション条件を課す際に、第３の核酸が第１の増 幅生成物と第２のハイブリダイゼーション生成物を形成する。 第２のハイブリダイゼーション生成物の形成は、第３の核酸から共有的に延長 する第１の増幅生成物に相補性の核酸からなる第２の増幅生成を形成するさらな る工程を可能にする。すなわち、第１の核酸と、第１および第２の増幅生成物は 、第１の核酸の最初の存在および最初に存在する第２および第３の核酸にのみ制 限される以外、複数のハイブリダイゼーションおよび増幅方法に関与できる。好 ましくは、複数の第２および第３の核酸が担体に共有的に結合し、複数の第１お よび第２の増幅生成物を提供する。 好ましくは、第２の核酸および第３の核酸の担体上での位置は、第２および第 ３の核酸の間で増幅生成物を形成できるように、第１の核酸の長さよりも小さい 距離の間隔を置いている。好ましくは、複数の第２および第３の核酸が、第１の 核酸の長さよりも小さい距離を置いて担体上に位置し、複数の第１および第２の 増幅生成物を形成させる。 好ましくは、この方法は、さらに、担体について１つ以上の増幅生成物の存在 をモニターする工程を含み、１つ以上の増幅生成物の存在は１つ以上の標的配列 の存在を示し、その不存在は標的配列の不存在を示す。複数の第１および第２の 増幅生成物の形成は、標的配列を有する非常に少数の第１の核酸の検出を可能に する。 好ましくは、担体はエポキシシラン誘導体化シリカである。担体は、濾紙、繊 維、膜、ビーズ、粒子、デイップスティック、シート、ロッド等でよい。好まし くは、担体は、ビーズ、粒子、デイップスティック等に関してナイロンまたはラ テックスのようなプラスチック、ガラス繊維、ガラスシート、ビーズ、ロッド、 デイップスティックの形状のガラスまたは磁性粒子の形状の金属等の組成を有す る。好ましい担体は、第２および第３の核酸の正確な位置取りを可能にし、標的 配列の第１対に向けられる担体の区域および標的配列の第２対に向けられる担体 の区域を規定するための整合（alignment）特徴を有する表面を有するシートか らなる。これらの区域は、好ましくは、ピクセル（pixel）の格子型パターンに 配列される。 好ましくは、第２の核酸は、担体に共有結合しているヘキサエチレングリコー ル官能基に共有結合する。しかし、他の官能基も、担体とＤＮＡを共有結合させ るのに使用できる。好ましくは、第２の核酸は、５'アミノ基でヘキサエチレン グリコール官能基に共有結合させる。該ヘキサエチレングリコール官能基は、担 体から離れて第２の核酸を位置させ、第２の核酸を、使用した第１の核酸および 酵素と相互反応させて増幅生成物を形成できるようにする。 好ましくは、第１の核酸は約１〜１０ｋｂの大きさを有する。より大きい核酸 は酵素により容易に消化し、または容易に機械的に断片化できる。好ましくは、 第２および第３の核酸は、該第２および第３の核酸間の間隔が第１の核酸の大き さよりも小さくなるような担体上の密度または濃度を有する。すなわち、第１の 核酸の大きさと、第２および第３の核酸の密度、濃度または間隔が協力してその 間で増幅生成物の形成を可能にする。 ここで使用する「浸漬生成物」なる用語は、担体の表面に共有結合した核酸の 周囲で、試料と他の試薬とで被覆された担体を指す。例えば、浸漬生成物の調製 は、デイップスティックを溶液中に入れるか、ビーズを溶液中にいれるか、スラ イドまたはガラス表面を溶液で湿潤させることからなりうる。 「ハイブリダイゼーション生成物」なる用語は、ハイブリダイゼーション反応 の生成物を指す。「増幅生成物」なる用語は、別の分子の存在により作られ、ま たは伸長した分子または分子の部分を指す。好ましくは、増幅生成物は、浸漬生 成物に増幅条件を課することにより形成される。増幅条件は、耐熱性プロテアー ゼヌクレオチドおよびポリメラーゼ反応に必要な他の試薬を、ポリメラーゼ反応 を支持する温度、イオン強度およびpＨ条件下でハイブリダイゼーション生成物 に適用することからなる。ここで使用する「適用する」なる用語は、主体が意図 したように客体に作用するように客体と接触させるか、近くに置くことを意味す る。 好ましくは、増幅生成物は検出可能な標識と合体させる。好ましい標識には、 放射性同位元素、化学発光、発光および蛍光剤およびコファクターが包含される 。しかし、増幅生成物がハイブリダイゼーション反応に関与し、さらにハイブリ ダイゼーション生成物を形成する場合、そのような生成物は挿入剤により検出で きる、別法として、増幅生成物は、第１の核酸から誘導された第３の標的配列と 相補性または相同な第４の核酸プローブによって検出できる。第４の核酸プロー ブは、増幅生成物の正しい核酸配列を検出し、偽陽性を減少させる。本発明の具 体例は、標的配列を有する第１の核酸の定量に使用できることである。サイクル の数および増幅生成物から発生するシグナルの量は、最初に存在する標的配列を 有する第１の核酸の量と関係する。 本発明の１つの具体例は、各セットが異なる第１の核酸を検出する多数のセッ トを有する担体を特徴とする。好ましくは、第２、第３の核酸の各セットは担体 の分離した区域に位置する。各担体は、複数の第１の核酸および標的に対する複 数のセットからなってもよい。好ましくは、少なくとも１つのセットが、ハイブ リダイゼーションおよび増幅条件下で増幅生成物を生成することを意図されてい ないナンセンス配列を有する第２および第３の核酸をネガティブ・コントロール として有する。好ましくは、少なくとも１つのセットが、ほとんど全ての試料全 般に存在するか、試料に存在する核酸配列に指向する配列を有する第２および第 ３の核酸をポジティブ・コントロールとして有する。 本発明の具体例はまた、大きい核酸のマッピングにも有用である。本発明の１ つの具体例は、第２および第３の核酸の複数のセットを特徴とする。各セットは 、大きい核酸の一部である第１の核酸に指向する。該第２および第３の核酸のセ ットは、第１および第２の増幅生成物を生ずる。第１および第２の増幅生成物の セットは、該大きい核酸の重複配列にまたがる。ここで使用する「重複」なる用 語は、少なくとも１つの同じ塩基配列の領域を有する２つの核酸を指し、該２つ の核酸は該領域から誘導された、またはそれらは該領域にハイブリダイズするよ うに意図されている。これらの重複配列は、相関して該大きい核酸の地図を生ず る。本発明は、配列タグ（tag）部位の使用を一連の増幅生成物の使用で置き換 えるために使用できる。 本発明の１つの具体例は、標的配列を有する第１の核酸が存在下に、沈澱また は凝集生成物を形成できる方法を特徴とする。この方法は、第２の核酸を有する 第１の担体および第３の核酸を有する第２の担体を特徴とする。この方法は、第 １の核酸を含有する可能性のある試料を用いて第１および第２の担体の浸漬生成 物を形成させることを含む。つぎに、該浸漬生成物にハイブリダイゼーション条 件を課し、第１の核酸と第２の核酸からなるハイブリダイゼーション生成物を形 成する。つぎに、ハイブリダイゼーション生成物に増幅条件を課し、第１の増幅 生成物を形成させる。第３の核酸は第２の標的配列と等しい配列を有する。すな わち、第３の核酸は第１の増幅生成物の少なくとも一部と相補性である。この方 法はさらに、第３の核酸と第１の担体から伸長する第１の増幅生成物からなる第 ２のハイブリダイゼーション生成物の形成を含む。この第２のハイブリダイゼー ション生成物は、浸漬生成物の凝集または沈澱を促進することができる。 好ましくは、このハイブリダイゼーション生成物は、第１の増幅生成物と相補 性の第３の核酸から伸長する核酸からなる第２の増幅生成物を形成することによ り、さらに安定化される。 好ましくは、浸漬生成物は、複数の担体の懸濁液からなる。複数の第２および 第３の核酸を有する各担体は、ハイブリダイゼーション、変性および増幅条件を サイクルすると、凝集生成物を形成する。 本発明の方法は、第２のハイブリダイゼーション生成物または第２の増幅生成 物の形成により溶液から沈澱できるカルボキシル化ラテックス粒子、プラスチッ クまたはガラスビーズを利用する用途に理想的に適している。 本発明のさらなる具体例は、標的配列を有する第１の核酸の存在下で増幅生成 物を形成するための製品を特徴とする。該製品は、標的配列に相補性の塩基配列 を有する第２の核酸を有する担体からなり、該第２の核酸は担体と共有結合して いる。該担体は、第１の核酸を含有している可能性のある試料と共に浸漬生成物 を形成することができ、ハイブリダイゼーション条件および増幅条件を受けて、 第１の核酸の存在下に、第１のハイブリダイゼーション生成物および第１の増幅 生成物を形成する。第１の増幅生成物は、第２の核酸から伸長し、第１の核酸に 対して相補性である。 好ましくは、該製品は、さらに、第１の増幅生成物と相補性の第３の核酸を含 む。第３の核酸は、ハイブリダイゼーション条件を課せられると、第１の増幅生 成物の標的配列と第２のハイブリダイゼーション生成物を形成することができる 。すなわち、第３の核酸は、第１の核酸の第２の標的配列と相同である。好まし くは、第３の核酸は、第２の増幅生成物を形成する反応をプライム（prime）す ることができる。 好ましくは、第２および第３の核酸は間隔を置いた関係にある。これらの位置 は第１の標的配列の長さより小さい距離で隔てられている。別法として、第２お よび第３のヌクレオチドを、第１および第２の核酸が間隔を置いた関係を有する ような濃度または密度で担体にランダムに固定化する。 好ましくは、各セットは担体上のある規定された領域を占め、ピクセル様の区 域を形成する。規定された領域内で増幅生成物が生じ、これをテスト部位または テスト・ピクセルと称する。 好ましくは、第１の核酸のマッピングを行うため、担体は、第２および第３の 核酸の複数のセットを有する。各セットは、大きな核酸の一部である第１の核酸 に対応する。各セットの第１の核酸は、好ましくは、重複配列で、重複部位のマ ッチング（matching）によって第１の核酸のマッピングを可能にする。 本発明の具体例は自動化によく適合する。本発明のさらなる具体例は、標的配 列を有する第１の核酸の存在下で増幅生成物を形成させるための器具を特徴とす る。この器具は、標的配列に相補性の塩基配列を有する第２の核酸を有する担体 を受ける手段を含む。第２の核酸は担体に共有結合している。この器具は、さら に、担体と試料からなる浸漬生成物形成用の手段を含む。さらに、この器具は、 第１の核酸の存在下にハイブリダイゼーション生成物を形成するために、浸漬生 成物にハイブリダイゼーション条件を課す手段を含む。さらに、この器具は、も し形成された場合、ハイブリダイゼーション生成物に増幅条件を課し、増幅生成 物を形成する手段を含む。増幅生成物の形成は、第１の核酸および標的配列の存 在と関係づけることができる。 浸漬生成物を形成する手段は、試料を、第２の核酸を含む担体に置く装置また は試料を含む収納容器内に固体担体を位置させる手段からなる。 ハイブリダイゼーション条件を課す手段は、適当な緩衝液を浸漬生成物に位置 させるための分配オリフィス、ピペット等のごとき装置、核酸のハイブリダイゼ ーションを行うための温度制御装置からなる。 増幅条件を課す手段は、酵素および核酸を伸長または核酸を複製する試薬を位 置させるための分配オリフィス、ピペット等のごとき装置からなる。典型的な試 薬には、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、緩衝液等が包含される。ハイブリダイゼ ーション条件および増幅条件を課す条件は、当業者によく知られている。 かくして、本発明は、溶液ベースのプライマー・セットを使用しない、特定の 標的配列を有する核酸の検出用の方法、装置および製品を特徴とする。本発明は 、同時標的増幅反応の実施を容易にし、核酸のマッピングに必要なデータを非常 に短時間で得ることができる。外部反応チャンバーと増幅生成物の分析のための ゲル・ベース系を要しないことは、分析結果の解析を非常に容易にする。 これらおよびその他の特徴は、以下の、例示であり、非常限定的な本発明の好 ましい具体例を記載した図面および詳細な説明から明らかである。 図面の簡単な説明 図１Ａ〜１Ｍは、増幅生成物製造用の方法、製品および器具を模式的に示す図 である。 図２Ａ〜２Ｌは、本発明に従って、増幅生成物を製造するための方法、製品お よび器具を模式的に示す図である。 図３は、本発明に従って第１の核酸の領域をマッピングするための、担体の形 態の製品を示す図である。 図４は、本発明に従う方法の動力学を示す図である。 発明の詳細な記載 本発明は、担体上で核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅プロセスを行う ための方法および装置を特徴とする。本発明の実施には、特に断らない限り、当 業者の技術範囲内の通常の化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免 疫学の技術を採用する。そのような技術は文献に十分に説明されている。例えば 、Maniatis，FritchおよびSambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual （１９８２）、DNA Cloning，Vol．１および２（D．N．Glover Ed．１９８５） ；Oligonucleotide Synthesis（M．J．Gait ed，１９８４）；Nucleic Acid Hyb ridization（B．D．HamesおよびS．J．Higgins eds．１９８４）；シリーズMeth ods in Enzymology（Academic Press，Inc.），特に、Vol．１５４および１ ５５（WuおよびGrossman，eds.）参照。 図１Ａおよび１Ｍには、全般的に１１ａおよび１１ｂで示す、増幅生成物製造 用の複数のカルボキシル化ラテックスビーズである製品を示す。ここでは、増幅 生成物の存在を、第１の核酸の２つの標的配列の存在を示すのに使用する。ラテ ックス・ビーズ１１ａおよび１１ｂは、増幅反応においてプライマーとして作用 する少なくとも１つの第２の核酸、好ましくは複数の第２の核酸を有する。第２ の核酸は、５'結合およびラテックス・ビーズのカルボキシル化官能基を介して 共有的に付加されている。単純にするために、各ラテックス・ビーズ１１ａおよ び１１ｂは、図示するように第２の核酸１３および第３の核酸１５を有している が、もっと多くの第２および第３の核酸１３および１５が存在していてもよいと 理解すべきである。ラテックス・ビーズ１１ａおよび１１ｂならびに第２および 第３の核酸１３および１５の表現は説明のためのもので、スケール（scale）に ついて示すものではない。 本発明の方法は、手動でも、自動化器具中で実施することもできる。器具フォ ーマットにおいて、図１Ａ〜１Ｍは１つの器具を表す。図１Ａ〜１Ｍの各々は１ つのワーク・ステーションを示し、太い矢印は運搬手段を表す。運搬手段は回転 ターンテーブル、コンベヤーベルト等からなることができる。 図１Ａにおいて、ラテックス・ビーズ１１ａおよび１１ｂは、容器１７中に入 れられた水溶液１９中に懸濁しているように示している。溶液１９および／また はビーズ１１ａおよび１１ｂは、分配オリフィス２１により容器１７中に分配さ れるか、予め容器１７中にパッケージされていてもよい。 図１Ｂは、試料から由来する第１の核酸２３の容器１７への添加を説明してい る。第１の核酸２３は、ビーズ１１ａおよび１１ｂより前に容器１７へ入れても よく、また、図示するように後でもよい。第１の核酸２３は、図１Ａに示したよ うなオリフィス２１のごときオリフィスにより容器１７へ入れてもよい。第１の 核酸２３は、第１の鎖２５および第２の鎖２７からなる二本鎖ＤＮＡである。各 鎖は２つの標的配列ａおよびｂを有している。第２の核酸１３は、鎖２５の標的 配列ａに相補性であり、鎖２７の配列ａと相同である。第３の核酸１５は鎖２５ の標的配列ｂと相同であり、鎖２７の配列ｂと相補性である。第１の核酸２３お よびラテックス・ビーズ１１ａおよび１１ｂは浸漬生成物を形成する。 図１Ｃは、変性条件を受ける浸漬生成物、ラテックス・ビーズ１１ａおよび１ １ｂならびに第１の核酸を示す。変性条件は、ワーク・ステーションにおいて、 容器１７に入れた溶液１９の温度および／またはイオン強度および／またはpＨ 調整のような適当な手段で課せられる。 つぎに、第１の核酸およびラテックス・ビーズ１１ａおよびｂからなる浸漬生 成物は、図１Ｄに示すごとく、ハイブリダイゼーション条件に付される。ハイブ リダイゼーション条件は、好ましくは、ワーク・ステーションで、温度および／ またはイオン強度およびpＨを含むハイブリダイゼーションに影響する１つ以上 のファクターを調整することにより行われる。 図１Ｄは、第１の核酸の鎖２５およびラテックス・ビーズ１１ａの第２の核酸 １３からなるハイブリダイゼーション生成物を示す。第１の核酸の鎖２７も、さ らなるプライマー（図示せず）と相互作用する標的領域（図示せず）を有してよ い。単純、明確にするため、鎖２５および標的配列ａおよびｂに焦点を絞って説 明する。 ついで、第１の核酸の鎖２５およびラテックス・ビーズ１１ａの第２の核酸１ ３からなるハイブリダイゼーション生成物は、図１Ｅで示すごとく、増幅条件に 付される。増幅条件は、好ましくは、ワーク・ステーションにおいて、耐熱性ポ リメラーゼ、ヌクレオチドおよび他の必要な試薬、緩衝液等を含む適当な増幅用 の試薬の添加により課す。例えば、図１Ｅに示すワーク・ステーションが容器１ ７を受け、図１Ａに示すごときオリフィス２１のようなオリフィスから適当な試 薬を加える。図１Ｅは第１の核酸１３から共有的に伸長した第１の増幅生成物３ １を示す。この増幅生成物は、第１の核酸の鎖２５と相補性である。すなわち、 増幅生成物３１は、ラテックス・ビーズ１１ａおよび１１ｂの第３の核酸１５に 相補性の標的配列ｂを有する。 つぎに、第１の増幅配列は、図１Ｆに示すように、さらなるワーク・ステーシ ョンで変性条件に付される。変性条件を課すと、図１Ｆに説明するごとく、第１ の 核酸の鎖２５および２７、ラテックス・ビーズ１１ａおよび１１ｂの第２および 第３の核酸１３および１５ならびに第１の増幅生成物３１からなる変性生成物が 形成される。変性条件は、高温、高塩濃度および／または低pＨからなる。この ワーク・ステーションは、試薬を添加するための図１Ａに示したオリフィス２１ または加熱エレメント（図示せず）のような変性条件を課すための手段を有する 。 つぎに、変性生成物は、図１Ｇに示すような、さらなるワーク・ステーション でハイブリダイゼーション条件に付される。ハイブリダイゼーション条件を課す と、ハイブリダイゼーション生成物が形成される。別法として、ハイブリダイゼ ーション生成物は、第１の増幅生成物３１およびラテックス・ビーズ１１ｂの第 ３の核酸１５ならびにラテックス・ビーズ１１ｂの第１の核酸の鎖２５および第 ２の核酸１３からなる。この別法においては、図１Ｇに示すように、ラテックス ・ビーズ１１ａの第１の増幅生成物３１および第３の核酸１５およびラテックス ・ビーズ１１ｂの第１の核酸の鎖２５および第２の核酸１３からなるハイブリダ イゼーション生成物が形成される。 図１Ｈに示すごとく、増幅条件を課すと、第２の増幅生成物３３が形成される 。第２の増幅生成物はラテックス・ビーズ１１ａの第３の核酸１５から伸長する 。別法では、第２の変性生成物３３は、ラテックス・ビーズ１１ｂの第３の核酸 １５から伸長して形成される。さらなる第１の増幅生成物３１が、ラテックス・ ビーズ１１ｂの第１の核酸１３から形成される。 図１Ｉ〜図１Ｌに示すごとく、変性、ハイブリダイゼーション、増幅および変 性のさらなるサイクルを課すことにより、各ラテックス・ビーズ１１ａおよびｂ の各第２および第３の核酸１３および１５から伸長する第１および第２の増幅生 成物３１および３３がさらに形成される。好ましくは、変性、ハイブリダイゼー ション、増幅および変性のサイクルをワーク・ステーションで行う。これらのサ イクルは、第２および第３の核酸１３および１５が消尽するまで所望の回数繰り 返すことができる。 図１Ｍに示すように、第１および第２の増幅生成物３１および３３は相互にハ イブリダイズでき、隣接するラテックス・ビーズ１１ａおよび１１ｂの間でハイ ブリダイゼーションを可能にする。好ましくは、器具のワーク・ステーションで ハイブリダイゼーション条件を課す。隣接するラテックス・ビーズ１１ａおよび １１ｂの第１および第２の増幅生成物のハイブリダイゼーションは、懸濁を破壊 し、ビーズ１１ａおよび１１ｂは、検出できる塊に沈澱または凝集する。好まし くは、この検出できる塊をモニター装置（図示せず）で検出する。検出できる塊 の形成は、第１の核酸、特に、鎖２５の標的配列ａおよびｂの存在を示す。 図２Ａ〜２Ｊにおいて、特に、第１の核酸の存在下で増幅生成物を生成するた めの、全般的に１１１で示す製品を示す。この製品は、２つの区域１２１および １２３を有する平らな上部表面１１７を有する、エポキシシラン誘導体化担体１ １３からなる。区域１２１および１２３は、各々、第２および第３の核酸を含む プローブ・セットを含んでる。区域１２１の第２および第３の核酸を、各々、１ ２５および１２７で示す。区域１２３の第２および第３の核酸を、各々、１２５ 'および１２７'で示す。核酸および区域１２１および１２３の表現は、説明のた めだけのものであり、スケールについて示すものではない。区域は、好ましくは 、テレビジョン・スクリーンに関して使用される用語であるピクセルとしての、 ピクセル・サイズである。好ましくは、これらの区域は、１０μ²〜１mm²の面積 である。 担体１１３は、ガラスシート、ビーズまたはディップスティックのような種々 の異なった形状を取ることができる。当業者は、個々の要求に応じて担体の形状 および大きさを容易に修正できる。担体１１３全体はいずれかの都合よい大きさ でよいが、好ましくは、約１mm²の平らな上部表面１１７を与える形状とする。 図２Ｂに示すごとく、全般的に１３１で示す試料を担体１１３の上に載せ、浸 漬生成物を形成する。試料を区域１２１および１２３の核酸に適用するために、 担体に表面に載せられた溶液に担体１１３が完全に浸漬されることは当業者に容 易に認識できるであろう。試料１３１は、区域１２１および１２３の第２の核酸 に相補性の標的配列を有する第１の核酸１３３を有する。図示するごとく、試料 １３１を担体１１３へ適用する手段は試料分配オリフィス１３５からなる。 本発明の方法は、手動でも、自動化器具中でも行える。器具フォーマットにお いて、各図はワーク・ステーションを示し、太い矢印は運搬手段である。運搬手 段は回転ターンテーブル、コンベヤーベルト等からなることができる。 もう１つ別のフォーマットでは、本発明の方法は内蔵反応カートリッジ中で行 うことができる。典型的には、カートリッジは、分析に必要な全ての試薬を含む 。カートリッジは、試料導入口、緩衝液用の複数の分れた単離チャンバー、酵素 および検出試薬、例えば、染料または標識オリゴヌクレオチドを有する。微小組 立技術（microfabrication technique）を使用してカートリッジを製造すること により、反応速度を上げ、試薬濃度を少なくすることができる。プログラムされ た間隔で、試薬を試薬チャンバーから放出し、第１の標的ヌクレオチドおよび固 定化された第２および第３のオリゴヌクレオチドを含む中央反応部位に送達する 。 図２Ｃに戻って、ここには、浸漬生成物にハイブリダイゼーション条件を課す 第３のワーク・ステーションを示す。ハイブリダイゼーション条件を課すと、第 １の核酸１３３および第２の核酸１２５を含む区域１２１内でハイブリダイゼー ション生成物が形成される。ハイブリダイゼーション条件は、第１および第２の 核酸のハイブリダイゼーションを行うための、溶液のイオン強度またはpＨの変 化あるいは温度低下からなることができる。ハイブリダイゼーション条件を課す 手段を、ハイブリダイゼーション分配オリフィス１３７および冷却ファン１３９ で示す。 図２Ｄは、第１の増幅生成物を形成させるために、ハイブリダイゼーション生 成物に増幅条件を課すワーク・ステーションを示す。第１の増幅生成物１４５は 、第１の核酸１３３に対応する第２の核酸１２５から伸長する核酸からなる。増 幅条件は、増幅反応を行うのに必要なポリメラーゼおよびトランスクリプターゼ 、ヌクレオチド、緩衝液等の添加からなることができる。第１の増幅生成物１４ ５を形成するための試薬は分配オリフィス１４３を介して分配される。 図２Ｅは、１つ以上の機能を果たす第５のワーク・ステーションを示す。増幅 生成物に取り込まれたヌクレオチドは、検出するために標識することもできる。 例えば、第５のワーク・ステーションは、増幅生成物の存在について１１３をモ ニターするための検出手段（図示せず）を含んでいてもよい。しかし、大半の検 出フォーマットについては、追加の増幅生成物を与えてシグナルを増加させるこ とが有用である。すなわち、図示するように、第５ワーク・ステーションは、増 幅生成物１４５に変性条件を課して第１の核酸の鎖１３３を第２の核酸１２５お よび第１の増幅生成物１４５から解離させる。変性試薬は、オリフィス１４７を 介して担体１１３上に分散させる。 追加のシグナルは、追加のハイブリダイゼーション生成物を再度形成させるこ とにより得ることができる。図２Ｆは、第２のハイブリダイゼーション生成物を 形成するための第６ワーク・ステーションを説明している。試料が除去されてい ない場合は、第１の核酸１３３もやはり残っており、区域１２３の核酸１２５' とハイブリダイズし、さらなる第１のハイブリダイゼーション生成物を形成する 。区域１２１に関しては、第２のハイブリダイゼーション生成物が、第１の増幅 生成物１４５と第３の核酸１２７の間で形成される。ハイブリダイゼーション条 件を課す手段は上記した。図示するごとく、ハイブリダイゼーション分配オリフ ィス１４１および冷却ファン１５１が、適当な緩衝液、溶液および塩を添加し、 温度を調節することによりハイブリダイゼーション条件が課せられる。 図２Ｇは、区域１２１における第２の増幅生成物１４７および区域１２３にお けるさらなる第１の増幅生成物１４５'の生成のための第７のワーク・ステーシ ョンを示す。増幅条件を課すと、第２の増幅生成物１４７が第１の区域１２１内 で形成される。第２の増幅生成物は、第１の増幅生成物１４５と相補性の核酸か らなる。第２の増幅生成物１４７は、第３の核酸１２７から伸長する。さらなる 第１の増幅生成物１４５'が第２区域１２３内で形成され、第２の核酸１２５'か ら伸長する。増幅試薬は、分配オリフィス１５３により担体１１３に適用される 。 図２Ｈは、変性条件を課す第８のワーク・ステーションを説明している。変性 後、第１および第２の増幅生成物１４５および１４７が、区域１２１の第２およ び第３の核酸１２５および１２７から伸長し、第１の増幅生成物が１４５'が、 区域１２３の第２の核酸１２５'から伸長する。変性条件を課す手段を、一般的 に、分配オリフィス１５５および加熱エレメント（図示せず）により示す。 図２Ｉは、担体１１３にハイブリダイゼーション条件を課す第９のワーク・ス テーションを示す。ハイブリダイゼーション条件を課すと、区域１２１の第１お よび第２の増幅生成物１４５および１４７がハイブリダイズし、区域１２３の第 １の増幅生成物１４５'が第３の核酸１２７'とハイブリダイズする。ハイブリダ イゼーション条件を課す手段は、適当な緩衝液、塩等の分配オリフィス１６７を 介して適用されるハイブリダイゼーション試薬および冷却ファン１６９で表され る温度調節からなる。 図２Ｊは、担体１１３に増幅条件を課す第１０のワーク・ステーションを示す 。増幅条件を課すと、第２の核酸１２５'から伸長する第１の増幅生成物に相補 性の第３の核酸１２７'から伸長する核酸からなる第２の増幅生成物１４７'が形 成される。増幅条件を課す手段は、分配オリフィス１７１を介して適用される増 幅試薬からなる。増幅試薬は、緩衝液、塩、酵素、ヌクレオチド等からなる。 図２Ｋは、担体１１３洗浄のための第１１ワーク・ステーションを示す。厳密 な（stringent）な洗浄を行い、シグナルを妨害しうる取り込まれないヌクレオ チドおよび外来物質を除去する。図示するごとく、洗浄分配オリフィス１７３が 、洗浄試薬および溶液を担体１１３に適用する。 図２Ｌに示す第１２ワーク・ステーションは、本発明の方法を、核酸の合成よ りも、診断または検出の目的に使用する場合の検出工程を表している。検出手段 １７５は、標識したヌクレオチドを使用して増幅生成物１４５、１４５'、１４ ７および１４７'を形成した場合に、該核酸を検出する。検出手段は、化学発光 、発光、蛍光または放射能標識を検出するための光センサーからなっていてもよ い。シグナルを発生させるための追加の試薬を担体１１３に適用する。 第１および第２の増幅生成物を標識ヌクレオチドで作成した場合、コファクタ ーまたは標識が感応する波長の光を加えるような検出条件を課すと、シグナルが 生じ、第１の核酸の存在を示す。 別法では、挿入剤の存在下にハイブリダイゼーション条件を担体に適用し、第 １および第２の増幅生成物の存在下にシグナルを発生させることができる。 さらに、第１または第２の増幅生成物に相補性の第４の標識オリゴヌクレオチ ド（図示せず）をプローブとして使用し、標的第１オリゴヌクレオチドの存在を 検出することもできる。第４のヌクレオチドは、正しい増幅生成物のみを検出す るのに有用である。図示するごとく、区域１２１および１２３は、同じ第２およ び第３の核酸１２５および１２７または１２５'および１２７'を有している。し かしながら、担体１１３は、複数の標的に向けられた複数の区域を有することが 好ましい。好ましくは、少なくとも１つの区域は、ナンセンス配列を有する第２ および第３の核酸を含む。この区域は、ネガティブ・コントロールとしてシグナ ルを生じさせない。ナンセンス配列であることが明らかな、このような第２およ び第３の核酸からのシグナルの存在はシステム・エラーを示す。 好ましくは、少なくとも１つの区域が、第１の核酸に相当する配列を有し、そ の存在が普遍的な存在を確認する第２および第３の核酸を有するか、試料に添加 された当該核酸を有している。この区域は、ポジティブ・コントロールとして各 々の場合にシグナルを生じさせるようにする。シグナルの不存在はシステム・エ ラーを示す。 図３に戻り、第１の核酸を一般的に２１１で示す。第１の核酸２１１は、その 長さに沿ってａ〜ｆの領域を有している。装置２１３は、第１の核酸の領域マッ ピングのためのもので、平らな表面２１５を有している。表面２１５は区域２１ ７、２１９、２２１、２２３、２２５および２２７を有している。 各区域２１７〜２２７は、各々、第２の核酸２３１ａ〜ｆおよび、各々、第３ の核酸２３３ａ〜ｆを有している。各区域の第２および第３の核酸２３１ａ〜ｆ および２３３ａ〜ｆは、核酸２１１の領域ａ〜ｆと対応する。すなわち、担体２ １５上の、各区域の存在は、核酸２１１の領域ａ〜ｆの存在範囲に依存する。例 えば、核酸２１１が、断片ｂ、ｃおよびｄを含む場合、区域２１９、２２１およ び２２３が検出される。 操作するにおいて、装置２１３は図１Ａ〜１Ｌについて記載した方法に従って 処理される。すなわち、第１の核酸２１１または、好ましくは、核酸２１１の断 片を１つ以上の装置２１３に適用する。装置をモニターして区域２１７、２１９ 、２２１、２２３、２２５および２２７における増幅生成物の存在を検出する。 ２つの異なる断片で、１つの区域にシグナルが存在することは、そのような断片 が 重複していることを示す。１つの断片で、２つの区域にシグナルが存在すること は、そのような区域が隣接していることを示す。 本発明のこれらの、また、他の特徴および利点を、以下の本発明の好ましい具 体例を表す実施例により示す。 実施例 実施例１ 増幅生成物の形成 この実施例は、標的配列を有する第１の核酸の存在下での第１の増幅生成物の 形成を記載する。第１の核酸は、約１ｋｂの長さを生じるように超音波処理され た、より長い核酸の断片である。 第２の核酸は、第１の核酸の標的配列に相補性のヌクレオチド配列を用いて合 成したもので、５'アミノ基によりエポキシシラン誘導体化された固体担体に固 定化されている。第２の核酸の合成の間に、ヘキサエチレングリコールのスペー サー基を含有させて、ハイブリダイゼーション反応の間の立体障害を除く。スペ ーサー領域を、アミノ基付加の前に合成オリゴマーに導入し、２５Åの計算され たスペーサー領域長とする。 耐熱性ポリメラーゼ、酵素緩衝液、Ｐ³²標識した、または標識しないｄＮＴＰ の存在下、第２の核酸を、第１の核酸の標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズさせて 反応混合物を形成させる。反応混合物を９４℃で１分間加熱して変性させ、５５ ℃で１分間冷却し、ついで７５℃で５分間加温して、固定化した第２の核酸から 伸長した、第１の核酸と相補性の増幅生成物を形成させる。 反応混合物を反応表面から洗浄し、増幅生成物を検出する。放射能標識された 増幅生成物を、固体担体と接触したエマルジョンにより配置した写真フィルムを 用いて検出する。 実施例２ 協同する第１および第２の増幅生成物の形成 この実施例は、標的配列を有する第１の核酸の存在下、第１および第２の増幅 生成物を形成させるためのプロトコルを記載する。第１の核酸は、ゲノムＤＮＡ から由来したもので、約１ｋｂの大きさの断片を生じるように超音波処理されて いる。 誘導体化された担体、例えば、顕微鏡スライド、マイクロタイタープレートま たはガラスビーズに、各々、±５０８遺伝子配列の明らかにされた領域に相補性 の第２および第３の核酸の等モル分配物を、５'端を介して固定する。断片化さ れたゲノムＤＮＡを、耐熱性ポリメラーゼ、酵素緩衝液、ビオチン標識した、ま たは標識しないｄＮＴＰの存在下、第１および第２の核酸とハイブリダイズさせ て反応混合物を形成させる。反応混合物を９４℃で１分間加熱して変性させ、５ ５℃で１分間冷却してアニーリングし、７５℃で１分間加温して増幅させる。増 幅後、加熱および冷却サイクルを３０回続け、多くの第１および第２の増幅生成 物を形成させる。反応は自己限定性で、予め定めた数の増幅生成物が形成される ように設計できる。 このサイクルの繰り返しにより、第１および第２の増幅生成物が隣接する固定 化された第２および第３の核酸へハイブリダイズできる。増幅条件を課すと、追 加の第１および第２の増幅生成物が形成される。最初の標的配列はまた、さらな るハイブリダイゼーションおよび伸長反応への関与に利用される。サイクルは、 全ての固定化された第２および第３の核酸が伸長し、適当なヌクレオチドで標識 されるまで繰り返すことができる。 反応混合物を反応表面から洗浄し、固定化された増幅生成物を検出する。ラン ダムなバックグラウンド・ノイズを除くため、反応表面を非常に厳密な条件を用 いて洗浄する。 ビオチン化された増幅生成物を、Ｘ線フィルムを用い、ストレパビジン（stre pavidin）−アルカリホスファターゼ結合体（conjugate）による化学発光基質の 変換を分析することにより検出する。シグナル検出の他の形態には、蛍光鏡検法 、ファイバーオプチック装置、共焦点（confocal）鏡検法、シンチレーション検 出、ピエゾ電気（piezoelectric）物質およびシリコン・ベース・システム （charged coupled device）が包含される。 実施例３ 単一ポリメラーゼ伸長 この実施例は、標的配列を有する第１の核酸の定量用の１回のハイブリダイゼ ーション工程およびポリメラーゼ工程を行うためのプロトコルを記載する。 各々、２つ以上の同じ方向に向かう配列であって、標的配列に相補性で、予め 定めた長さの非標的配列により分けられている複数の第２の核酸を合成する。第 ２の核酸を担体に固定化する。第１の核酸を含む試料を担体に適用して浸漬生成 物を形成する。浸漬生成物を変性、ハイブリダイゼーションおよび増幅条件に付 す。増幅条件下で、同時に標的配列および非標的配列に相補性の、増幅生成物を 形成させる。好ましくは、１回のアニーリングおよび伸長が起こる。反応はリニ アーで、反応シグナルは標的配列の数と直接対応している。 第２の核酸は、いずれかの標的配列に相補性の配列を用いて合成できる。好ま しくは、プローブ配列は、１００、２００、４００または１０００塩基対で分け られており、対応する長さの標識され、伸長した鎖を形成する。増幅生成物は、 使用した標識のタイプによって、先に述べた適当な手段で検出される。 実施例４ 凝集分析 この実施例は、第１の核酸、ＨＩＶ核酸の検出方法を記載する。ＨＩＶ遺伝子 配列に相補性の、約２０ヌクレオチド長の第２および第３の核酸を、１群の誘導 体化ガラスビーズに固定化する。ガラスビーズの１／２は第２の核酸を含み、残 りの１／２は第３の核酸を含む。この実施例では、カルボキシル化誘導体化ラテ ックス粒子を該誘導体化ガラスビーズと置き換えてもよい。 ウイルスの核酸を含有する可能性のあるテスト試料を、ガラスビーズを含有す る反応チャンバー容器に導入し、反応混合物を形成する。この反応混合物を１回 以上の加熱、冷却サイクルに付す。 ウイルスの核酸は第２の核酸と結合し、第１の反応生成物が形成される。この 第１の反応生成物は第２の核酸から伸長し、第３の核酸に相補性である。第１の 増幅生成物の第３の核酸とのハイブリダイゼーションは、第２のハイブリダイゼ ーション生成物および第２の増幅生成物を形成させる。第２の増幅生成物は、第 １の増幅生成物に相補性である。ハイブリダイゼーション条件を課すと、第１お よび第２の増幅生成物の結合により、ビーズは凝集または沈澱する。凝集または 凝結した複合体は、分光光度分析的に光学密度の減少として見ることができる。 反応液の濁度が分析感度および標的特異性の関数となる。 実施例５ 細菌の核酸の定量測定法 この実施例は、細菌、ウイルスまたは他の生物の第１の核酸の定量測定法のプ ロトコルを記載する。 第１の核酸の定量測定は、パネル・フォーマットにおいて、第２の核酸および 第３の核酸の実質的に等モル量の混合物の量を変化させて固定化することにより 行うことができる。一系列の濃度の変化する第２の核酸および第３の核酸を固定 化したディップスティック装置を、食品、血液、組織または他の生物的物質中に おける細菌汚染物の定量分析に使用する。 第１の核酸に相補性の配列を有する第２および第３の核酸を、５'アミノ基を 介してエポキシシラン誘導体化ディップスティック担体に固定する。ディップス ティック担体は、ガラス、プラスチックまたは金属からなることができる。誘導 体化担体に沿って隔離された複数の区域に、単位表面積当たりの濃度を増加させ て第２および第３の核酸を固定する。 テスト試料の一部を、反応緩衝液、ポリメラーゼおよびビオチン標識核酸を含 む反応混合物に導入する。ディップスティックを反応混合物に入れ、浸漬生成物 を形成する。浸漬生成物に変性、ハイブリダイゼーションおよび増幅条件を課す 。 予め定めた回数のサイクルの後、ディップスティックを反応混合物から取り出 し、洗浄する。ついで、ディップスティックは、アビジン・パーオキシダーゼ結 合体を含む第２の反応混合物に入れ、５分間インキュベートする。ディップステ ィックを第２の反応混合物から取り出し、洗浄する。ついで、ディップスティッ クを、パーオキシダーゼに特異的な色素生成基質からなる発色混合物中に入れ、 ５ 分間反応させる。発色混合物からディップスティックを取り出し、変色をモニタ ーする。ディップスティックに沿った異なる区域における定めた第２の核酸濃度 系列および各区域の変色量が、テスト試料中の細菌菌体の量の関数となる。例え ば、１００個の細菌を含むテスト試料は、２０回の反応後、mm²当たり、１０３ および１０４個の第２の核酸分子を含むディップスティックの区域に鮮やかな発 色を生じることが期待される。 実施例６ マッピング この実施例は、第１の核酸のマッピングのためのプロトコルを示す。平面の誘 導体化ガラス担体に第２の核酸の複数のセットを固定する。各第２の核酸は約２ ０のヌクレオチドを有する。第２の核酸の各セットは、第１の核酸の領域に沿っ たＳＴＳマーカーに対応する異なる配列に相補性である。各セットは、ガラス担 体の予め定めた区域に位置させる。各セットは、約１００,０００個の５'アミノ 結合第２核酸からなる。 第１の核酸を含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）ライブラリーを、プールに分 け、スクリーニングする。各ＹＡＣプールの内容物を、ポリメラーゼ、緩衝液お よび蛍光標識デオキシ−トリヌクレオチドを含む反応混合物と共に、第２の核酸 プローブの列（array）を有する担体に適用する。 反応は、３０サイクルの変 性、ハイブリダイゼーションおよび増幅を進行させる。反応サイクルが完了した ら、担体を洗浄して、取り込まれないヌクレオチドおよびＹＡＣを除去する。 個々のＹＡＣプールに対応する増幅生成物の存在を検出することにより、担体 をモニターする。１つのＹＡＣプールの存在下で、２つの列において増幅生成物 が形成されることは、そのＹＡＣプールが隣接配列を含むことを示している。２ つの異なるＹＡＣで、１つの増幅生成物が形成されることは、該２つの異なるＹ ＡＣが重複配列を有することを示している。 実施例７ この実施例は、シリカ微小球上での増幅生成物の形成を説明する。連結した複 数のビースまたは微小球形成よりも、図２と同様な方法に従って、各球上で増幅 生成物が形成する。 ここで使用する「（４−OmeT）₈」なる用語は、４−Ｏ−メチルチアミン塩基 を含有する８個のヌクレオチド長（stretch）を示す。「５'−ＮＨ₂−（Ｃ６− リンカー）」は、プライマーが、その５'端に６個の炭素鎖で結合した１級アミ ン基を有することを示す。 この実施例に示す架橋（Bridge）増幅反応に用いる最初の標的は、溶液相増幅 反応から生成した２６８塩基対二本鎖ＰＣＲ生成物である。溶液相増幅反応はBa glo−（＋）およびBaglo−（−）プライマーならびにヒト・ゲノムＤＮＡ試料を 用いた。この実施例で使用した該特定の標的断片の配列は決定しなかったが、他 の、以前に配列決定したヒトβ−グロビン遺伝子と実際上同じと推定できる。以 下の表１および配列番号１に示す標的配列は、上記のBaglo−（＋）およびBaglo −（−）プライマーの配列を用い、ジーン・バンク（GenBank）配列番号＃２６ ４６２から推定したものである。標的領域は、ヒトβ−グロビン遺伝子のコード 配列の５'−端と重複する。エクソン１のＡＴＧ開始コドンに下線を付している 。mＲＮＡと同じ配列を有する鎖を示す。 市販の固体のシリカ微小球（径０.４ミクロン）（Bangs Laboratories， Carmel，Indiana，USA）を購入した。Chang，Gooding and Regnier，1976，J．C hromat．１２０，３２１−３３３に記載の方法を使用し、以下の記載のごとく微 小球上に表面エポキシド層を析出させた。３−グリシドキシプロピルトリメトキ シシラン（３−ＧＰＴＳ）の１０％水溶液を調製し、１mmol水酸化カリウムでp Ｈ５.７に調製し、この１０％３−ＧＰＴＳ溶液０.５mlを脱イオン水０.５mlに 懸濁させた該微小球１００mgと混合した。混合液を８８〜９０℃で３０分間保持 した。インキュベーションの間、試験管をボーテックス・ミキサー（vortex mix er）で、５分間隔で簡単に混合した。加熱後、ビーズを、遠心分離および脱イオ ン水中への再懸濁（各洗浄当たり１.５ml、２０００×ｇ、２分間）により、２ 回洗浄した。 エポキシ−シリカ微小球５０mgを０.１mol水酸化カリウム１.５mlで１回洗浄 した。微小球を上記と同様に遠心分離し、各２９μmolの濃度のBaglo−（＋）お よびBaglo−（−）プライマー、オリゴヌクレオチドの結合レベルをモニターす るためのトレーサーとして０.２nmolの、ddＡＴＰ−α−³⁵Ｓで３'端標識された 追跡オリゴヌクレオチドＤ−１３−Ｒおよびターミナル・トランスフェラーゼを 含む０.１mol水酸化カリウム７５μlに再懸濁した。ボーテックス・ミキサーで 間歇的に混合して微小球を再懸濁させながら、３７℃で８時間反応させた。微小 球を、遠心分離および０.１Ｍ水酸化カリウムへの再懸濁により３回、脱イオン 水中で２回（各洗浄当たり０.５ml）洗浄した。ついで、微小球を２０％（w／v ）エタノールアミン（pＨ８.２）２００μlに再懸濁し、間歇的に混合しながら 、３７℃で８時間インキュベートした。ついで、微小球を、遠心分離および０. ５％（v／v）Tween−２０水溶液、１００μg／mlのウシ血清アルブミン（０.５m l／洗浄）への再懸濁により３回洗浄した。結合した³⁵Ｓ−標識−Ｄ−１３−Ｒ プライマーのレベルから推定した微小球上の全プライマー濃度（等モル（＋）お よび（−）プライマー）は、微小球mg当たり、２.１〜２.２pmolであった。 ５'アミノ・リンカーを持つプライマーを、このエポキシ・ビーズと、０.１Ｎ ＫＯＨ中、３７℃にて１２時間反応させた。この実験に使用したプライマーは 、ヒトβ−グロビン遺伝子からの２６８ｂｐ標的を増幅する。ビーズを２Ｍエタ ノ ールアミン（pＨ８.０）で３７℃において、さらに１２時間反応させて、未反応 のエポキシ基を除いた。 オリゴヌクレオチドが表面に四角の配列で結合するという単純化した推定を使 用し、隣接するプライマーの間隔は７６７Åと推定される。この距離は、二本鎖 ＤＮＡの２２５ｂｐ断片の長さに等しい。 プライマー修飾ビーズ２mgを、１０mＭトリスＨＣｌ（２５℃にてpＨ８.３） 、１００μg／mlＢＳＡ、０.５％Tween２０、５Ｕ Tth ポリメラーゼ、２００μ Ｍの各dＮＴＰおよび０．２５μＭ dＣＴＰ−α−³²Ｐ（８００Ｃｉ／mmol）を 含有する反応混合液１００μl中でサイクルした。使用した最初の標的は、セン トリコン（Centricon）−１００限外濾過により溶液相ＰＣＲ反応から精製した ２６８ｂｐβ−グロビンＰＣＲ生成物０.４５pmolであった。９４℃で１分、つ いで６０℃で５分のサイクルを使用して３５サイクル行った。 各時点で、ビーズ０.３５mgを含む反応混合液の一部を取り出し、０.２ミクロ ン遠心濾紙で、１０mトリスＨＣｌ（pＨ７.６）、１mＭ ＥＤＴＡ、０.５％Twee n２０を用いて洗浄した。濾紙上のビーズ結合放射能をセレンコフ（Cerenkov） 計数器で測定した。結合放射能は９４℃の洗浄では除去できず、測定した放射能 は、表面に共有結合しており、単にプライマーに吸収またはハイブリダイズして いるものでないことを示している。 これらのデータは、放射性dＣＴＰのビーズ結合形態への標的およびプライマ ー依存性取り込みを示唆している。これらのデータを図４にカウント／分（ＣＰ Ｍ）として示す。図４で用いる中空の丸および三角は、（＋）および（−）プラ イマーを担持するビーズの、標的の存在下での反応を示す。黒丸は（＋）および （−）プライマーを担持するビーズの、標的の不存在下での反応を示す。黒四角 は標的存在下の、（＋）および（−）プライマーなしのビーズを示し、黒三角は 、標的不存在下の、（＋）および（−）プライマーなしのビーズを示す。標的の 不存在下でのプライマー修飾ビーズ（黒丸）または標的の存在または不存在下で のプライマー未修飾ビーズ（各々、黒四角および黒三角）からは何の取り込みシ グナルも得られない。これらの結果は、添加した標的分子の上での特定のプライ マ ー介在ポリメラーゼ伸長による取り込みであることを示している。 標的の存在下の（＋）および（−）プライマーを有するビーズが関与する反応 において、２０回目のサイクルの後の５回のサイクルの間に取り込みが６.５倍 増加した。この割合は、最大５倍の増加が予想される溶液相標的んのみを鋳型と して使用するプライマー伸長について予想されるよりも大きい。このことは、ビ ーズの表面で増幅が起こったことを示している。対数増幅反応と仮定して、サイ クル当たりの取り込みの増加は、２１〜２５回目のサイクルについて約１.４倍 である。 ビーズ結合生成物が予想した架橋構造を有することを証明するため、ヒト・ジ ストロフィン遺伝子断片に指向するプライマーを修飾して制限酵素部位を含ませ た。（＋）プライマーはＸbaＩ部位を、（−）プライマーはＣlaＩ部位を含む。 増幅後、２種のビーズ結合生成物が期待される。溶液相標的およびプライマー との相互反応により形成された生成物は、単一の末端のみが結合した単一の伸長 生成物を生じる。これらの一次伸長生成物は、伸長したプライマーによって、Ｘ baＩまたはＣalＩかの、単一の酵素での開裂により遊離する。反対に、架橋増幅 生成物は、両端で結合しており、両方の酵素での開裂によってのみ遊離する。 増幅は、ジストロフィン・プライマーで修飾したエポキシ−シリカ・ビーズを 用い、精製５４５ｂｐジストロフィンＰＣＲ生成物を標的として行った。３５サ イクルの後、ビーズを洗浄して、非結合の放射能を除去し、４等分した。その１ つの部分を酵素を含まない制限緩衝液に残し、２つの部分をＣlaＩまたはＸbaＩ の単独で消化し、１つの部分を２つの酵素で同時に消化した。消化後、ビーズを 遠心分離してペレット化し、上澄液を、アクリルアミドゲル電気泳動およびオー トラジオグラフィーで分析した。 標的含有反応からのレーンでは、顕著な５４５ｂｐ生成物が明らかに認められ たが、標的−（−）対照では認められなかった。 いずれかの酵素による単一酵素開裂で、図３によって予測されるように少量の 一次伸長生成物が遊離し、二重消化により大量が遊離した。ビーズ結合試料のデ ンシトメーター分析は、図４の下部に示す。２つの単一消化からの組み合わせた 積算容量は１.２５（０.８６"Ｃ" ＋ ０.３９"Ｘ" ）で、二重消化からの積算容 量は約２.７倍大きい。これらのデータは、ビーズに見られる生成物の７２％が 架橋配座であることを示している。 これらのデータは、取り込みの割合が対数プロセスと一致しており、取り込み がサイクル当たり約１.４倍増加していることを示している。予想された特異的 増幅標的が、ビーズ結合形態で製造され、結合生成物の大部分が架橋配座で結合 している。 以上、好ましい具体例を説明したが、本発明は、変形および修飾することがで き、したがって、上記した詳細そのものに限定されるものではなく、そのような 変形および修飾も以下の請求の範囲に包含されるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年８月２１日 【補正内容】 請求の範囲 １．標的核酸を含有する可能性のある試料中の、標的配列の存在または不存在 を検出する方法であって、 （ａ）試料と、少なくとも１つの核酸のプライマー・セットとを含む浸漬生成 物を形成し、ここに、プライマー・セットは、少なくとも１つの第２の核酸およ び少なくとも１つの第３の核酸を含み、第２および第３の核酸は共有結合により 担体に固定され、担体上で、標的核酸の長さより少ない距離で隔てられており、 第２の核酸は標的核酸とハイブリダイゼーション生成物を形成することができ、 第３の核酸は標的核酸のアンチセンス鎖と相補性である； （ｂ）浸漬生成物にハイブリダイゼーション条件を課すことにより、標的核酸 が存在すれば、標的核酸と、第２の核酸とを含むハイブリダイゼーション生成物 を形成させ； （ｃ）標的核酸に相補性のヌクレオチドにより伸長された第２の核酸を含む第 １の増幅生成物を形成させ、ここに、第１の増幅生成物は、第３の核酸とハイブ リダイゼーション生成物を形成することができる； （ｄ）標的核酸から第１の増幅生成物を変性させ； （ｅ）浸漬生成物にハイブリダイゼーション条件を課して、第１の増幅生成物 と、第３の核酸を含む第２のハイブリダイゼーション生成物を形成させ； （ｆ）第１の増幅生成物と相補性のヌクレオチドによって伸長された第３の核 酸を含む第２の増幅生成物を形成させ；および （ｇ）これらの増幅生成物の１つの存在について担体をモニターし、その存在 が標的核酸の存在を示し、その不存在が標的核酸の不存在を示す； ことを特徴とする方法。 ２．担体が、エポキシシラン誘導体化担体である請求項１記載の方法。 ３．第２の核酸が、担体に共有結合しているヘキサエチレングリコール官能基 に共有結合した５'アミノ基を有する請求項１記載の方法。 ４．第１の核酸が、約１〜１０キロベースの大きさを有する請求項１記載の方 法。 ５．浸漬生成物に増幅条件を課すことによって増幅生成物を形成させ、増幅条 件が、耐熱性ポリメラーゼをハイブリダイゼーション生成物に適用することから なる請求項１記載の方法。 ６．増幅生成物が検出用の標識を有する請求項１記載の方法。 ７．ヌクレオチドが放射能で標識されている請求項６記載の方法。 ８．ヌクレオチドが、化学発光剤、放射能、発光剤および蛍光剤からなる群か ら選ばれる１つ以上で標識されている請求項６記載の方法。 ９．第１および第２増幅生成物を同時に形成させる請求項１記載の方法。 １０．プライマー・セットが、複数の第２の核酸および複数の第３の核酸を含 み、第１の増幅生成物が、複数の第３の核酸と１つのハイブリダイゼーション生 成物を形成でき、第２の増幅生成物が、複数の第２の核酸と１つのハイブリダイ ゼーション生成物を形成でき、第１の核酸の存在すると、複数の第１および第２ の増幅生成物が形成できるようにする請求項１記載の方法。 １１．プライマー・セットが、担体上で一定の区域に閉じ込められている請求 項１記載の方法。 １２．標的配列を有する標的核酸を含有する可能性のある試料中の、標的核酸 の存在下で１つ以上の増幅生成物を形成させるための製品であって、 核酸のセットを持つ担体からなり、ここに、該セットは、少なくとも１つの第 ２の核酸と、少なくともとも１つの第３の核酸からなり、第２の核酸は、標的配 列と相補性の塩基配列を有し、担体に共有結合しており、第３の核酸は、標的核 酸のアンチセンス鎖と相補性で、ハイブリダイゼーション条件を課すと、第１の 増幅生成物と共に第２のハイブリダイゼーション生成物を形成し、標的核酸の長 さより短い距離で担体に共有的に結合しており、第２の増幅生成物を形成する反 応をプライムし、担体は、１つ以上の試料と共に浸漬生成物を形成し、ハイブリ ダイゼーション条件および増幅条件を受けて、標的核酸の存在下に、第１のハイ ブリダイゼーション生成物、第２のハイブリダイゼーション生成物、第１の増幅 生成物および第２の増幅生成物を形成することができ、該第１の増幅生成物が第 ２の核酸から伸長し、標的核酸に相補性であり、該第２の増幅生成物が第３の核 酸から伸長し、第１の増幅生成物に相補性である製品。 １３．標的核酸が、複数の標的核酸からなる大きな核酸の部分であり、担体が 、標的核酸の１つに対応する第２および第３の核酸の第１のセットと、他の標的 核酸に対応する第２および第３の核酸の少なくとも１つの第２のセットとを有し 、該大きな核酸のマッピングを行う請求項１１記載の製品。 １４．試料中の標的核酸のマッピング方法であって、 （ａ）標的核酸の多重コピーを用意し、該標的核酸を、重複配列を有する複数 の断片に分割し； （ｂ）核酸の複数のプライマー・セットを用意し、ここに、各プライマー・セ ットは、少なくとも１つの第２および第３の核酸からなり、該第２および第３の 核酸は、担体上で、標的核酸の第１の断片よりも少ない距離だけ隔てられて担体 に共有的に固定されており、第２の核酸は、該標的核酸の断片とハイブリダイゼ ーション生成物を形成することができ、第３の核酸は、該断片のアンチセンス鎖 と相補性であり、各プライマー・セットは、１つの断片に指向する第２および第 ３の核酸を有し、他の核酸のプライマー・セットとは分離されている； （ｃ）核酸の複数のプライマー・セットを有する担体および標的核酸断片から なる浸漬生成物を形成し； （ｄ）浸漬生成物にハイブリダイゼーション条件を課して、断片が存在すれば 、該断片と、各セットの第２の核酸からなるハイブリダイゼーション生成物を形 成させ； （ｅ）標的核酸の断片に相補性のヌクレオチドによって伸長した第２の核酸か らなる第１の増幅生成物を形成させ、ここに、第１の増幅生成物は第３の核酸と ハイブリダイゼーション生成物を形成することができる； （ｆ）標的核酸の断片から第１の増幅生成物を変性させ； （ｇ）浸漬生成物にハイブリダイゼーション条件を課して、第１の増幅生成物 および第３の核酸からなる第２のハイブリダイゼーション生成物を形成させ； （ｈ）第１の増幅生成物に相補性のヌクレオチドにより伸長した第３の核酸か らなる第２の増幅生成物を形成させ； （ｉ）該増幅生成物の１つの存在について担体をモニターし、ここに、その存 在が、断片の存在を示し、その不存在は断片の不存在を示し、同じセットにおい て増幅生成物を形成する断片は、該断片の重複配列の存在を示す； ことを特徴とする方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アダムス，クリストファー・ピー アメリカ合衆国02145マサチューセッツ州 ウィンター・ヒル、ブロードウェイ255 番 (72)発明者 クロン，スティーブン・ジョゼフ アメリカ合衆国02115マサチューセッツ州 ボストン、マールボロー・ストリート 427番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試料中の、標的配列を有する第１の核酸の存在下に、増幅生成物を形成さ せる方法であって、 （ａ）試料と、標的配列に相補性の、かつ担体に共有結合している第２の核酸 とを含む浸漬生成物を形成し、 （ｂ）浸漬生成物にハイブリダイゼーション条件を課し、第１の核酸が存在す れば、第１の核酸と、第２の核酸とを含むハイブリダイゼーション生成物を形成 させ、 （ｃ）第１の核酸が存在すれば、第１の核酸に相補性のヌクレオチドにより伸 長された該第２の核酸を含む増幅生成物を形成させて、担体に共有的に固定され た核酸を形成させることを特徴とする方法。 ２．さらに、増幅生成物の存在について担体をモニターする工程を含み、増幅 生成物の存在により標的の存在を示し、その不存在で標的の不存在を示す請求項 １記載の方法。 ３．担体が、エポキシシラン誘導体化担体である請求項１記載の方法。 ４．第２の核酸が、担体に共有結合しているヘキサエチレングリコール官能基 に共有結合した５'アミノ基を有する請求項１記載の方法。 ５．第１の核酸が、約１〜１０キロベースの大きさを有する請求項１記載の方 法。 ６．浸漬生成物に増幅条件を課すことによって増幅生成物を形成させ、増幅条 件が、耐熱性ポリメラーゼをハイブリダイゼーション生成物に適用することから なる請求項１記載の方法。 ７．増幅生成物が検出用の標識を有する請求項１記載の方法。 ８．ヌクレオチドが放射能で標識されている請求項７記載の方法。 ９．ヌクレオチドが、化学発光剤、放射能、発光剤および蛍光剤からなる群か ら選ばれる１つ以上で標識されている請求項７記載の方法。 １０．さらに、浸漬生成物に変性条件を課し、第２の核酸から第１の核酸を遊 離させる工程を含む請求項１記載の方法。 １１．さらに、第２のハイブリダイゼーション生成物を形成させる工程を含み 、第２のハイブリダイゼーション生成物が、第１の増幅生成物と、第３の核酸と を含み、第３の核酸が、担体と共有結合しており、かつ、第１の増幅生成物と相 補性のヌクレオチドを有し、浸漬生成物にハイブリダイゼーション条件を課すと 、第３の核酸と、第１の増幅生成物とが第２のハイブリダイゼーション生成物を 形成する請求項１０記載の方法。 １２．さらに、第１の増幅生成物と相補性の第３の核酸から伸長する核酸を含 む第２の増幅生成物を形成させる工程を含む請求項１０記載の方法。 １３．さらに、少なくとも１つの増幅生成物を検出する工程を含む請求項１２ 記載の方法。 １４．第２の核酸が担体上に１つの位置を有し、第３の核酸が担体上に１つの 位置を有し、両方の位置が、第１の核酸の長さよりも小さい間隔をあけて、第２ および第３の核酸の間に増幅生成物が形成されるようにしている請求項１記載の 方法。 １５．浸漬生成物が、第１の増幅生成物に相補性の第３の核酸を含む第２の担 体を含み、さらに、第３の核酸と、第１の増幅生成物とからなる第２のハイブリ ダイゼーション生成物を形成させる請求項１０記載の方法。 １６．第２のハイブリダイゼーション生成物が、浸漬生成物の凝集または沈澱 を促進する請求項１５記載の方法。 １７．さらに、第１の増幅生成物に相補性の第３の核酸から伸長する核酸を含 む第２の増幅生成物を形成させる請求項１５記載の方法。 １８．第２の増幅生成物が、浸漬生成物の凝集または沈澱を促進する請求項１ ７記載の方法。 １９．第２の核酸の担体および第３の核酸の担体が、ガラスビーズまたはカル ボキシル化ラテックス粒子からなる請求項１８記載の方法。 ２０．第１および第２増幅生成物を同時に形成させる請求項１１記載の方法。 ２１．形成される増幅生成物の量をモニターして存在する標的の量を示す請求 項１１記載の方法。 ２２．第１の核酸が大きな核酸の部分であり、第２および第３の核酸が、第１ の核酸を検出するためのセットであり、該大きな核酸の第１の核酸の各々に対す る複数のセットを含み、該複数のセットが、１つの第１の核酸を検出すると、重 複配列を示し、複数の第１の核酸を１つのセットが検出すると、隣接する配列を 示す請求項１０記載の方法。 ２３．さらに、全ての隣接配列の重複を組み合わせて、それらの配列の該大き な核酸上におけるマッピングを行う工程を含む請求項２３記載の方法。 ２４．試料中に存在する可能性のある、標的配列を有する第１の核酸の存在下 に、増幅生成物を形成させるための製品であって、 標的配列と相補性の塩基配列を有する第２の核酸を持つ担体からなり、ここに 、第２の核酸は、担体に共有結合しており、該担体は、第１の核酸を含有する可 能性のある１つ以上の担体と浸漬生成物を形成させ、ハイブリダイゼーション条 件および増幅条件を受けて、第１の核酸の存在下で第１のハイブリダイゼーショ ン生成物および第１の増幅生成物を形成させるためのもので、第１の増幅生成物 は、第２の核酸から伸長し、かつ第１の核酸に相補性である製品。 ２５．担体が、さらに、第３の核酸を含み、第３の核酸は第１の増幅生成物と 相補性で、ハイブリダイゼーション条件を課すと、第２のハイブリダイゼーショ ン生成物を形成する請求項２４記載の製品。 ２６．第３の核酸が、第２の増幅生成物を形成する反応をプライムする請求項 ２５記載の製品。 ２７．第２および第３の核酸が担体上で、第１の核酸の長さより小さい距離を おいた間隔で位置する請求項２５記載の製品。 ２８．第１の核酸が、複数の第１の核酸を含む大きい核酸の一部であり、担体 が、第１の核酸の１つと対応する第２および第３の核酸の第１セットと、２番目 の第１の核酸に対応する第２および第３の核酸の第２セットを、少なくとも１つ 有し、該大きい核酸のマッピングができるようにする請求項２５記載の製品。 ２９．標的配列を有する第１の核酸の存在下に、増幅生成物を形成させる器具 であって、 （ａ）標的配列と相補性の塩基配列を有する第２の核酸を有する担体を受ける 手段、ここに、第２の核酸は担体と共有結合しており、担体が、第１の核酸を含 有する可能性のある試料と浸漬生成物を形成させ、ハイブリダイゼーション条件 および増幅条件を受けて、第１の核酸の存在下で第１のハイブリダイゼーション 生成物および第１の増幅生成物を形成させるためのもので、第１の増幅生成物は 、第２の核酸から伸長し、第１の核酸と相補性である； （ｂ）担体にハイブリダイゼーション条件を課して、第１の核酸の存在下にハ イブリダイゼーション生成物を形成させるための手段；および （ｃ）ハイブリダイゼーション生成物に増幅条件を課して、もしハイブリダイ ゼーション生成物が形成していたら、増幅生成物を形成させる手段、 からなる器具。 ３０．担体が、第１の増幅生成物とハイブリダイゼーション生成物を形成でき る第３の核酸を有する請求項２９記載の器具。 ３１．第１の核酸が大きな核酸の部分で、第２および第３の核酸がセットから なり、担体が複数のセットを有し、各セットが相互のセットと分離した位置を有 し、各位置が担体の上の整合手段と協同する請求項３０記載の器具。 ３２．さらに、担体上の整合手段を受けるための整合検出手段を含む請求項３ １記載の器具。