CN109642252A - 核酸反应及相关方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过PCR检测核酸分析物的方法。特别地，提供了用于检测多种核酸分析物并产生动力学特征的方法和试剂盒。进一步提供了使用限制性引物的巢式PCR和PCR的方法和试剂盒。

Description

核酸反应及相关方法和组合物

交叉引用

本申请要求于2016年6月17日提交的第62/351,411号美国临时申请的权益，该临时申请通过引用以其全文并入本文。

背景技术

聚合酶链反应是一种用于增加核酸靶标的量的技术。通过使短引物序列、游离核苷酸和DNA聚合酶的反应混合物进行热循环，可以复制模板链。对于聚合酶链反应(PCR)，通常需要以下温度平台：用于使感兴趣的扩增子变性的高温、用于使引物与模板结合的低温和用于合成互补链的中间温度。

引物与模板之间的结合的特异性允许选择性地扩增预期靶标。例如，典型的定量聚合酶链反应进行到“饱和”，其中扩增反应进行到至少一种反应物(如引物、聚合酶、探针或游离核苷酸)耗尽的点。当使用诸如TaqMan探针、FRET探针或嵌入染料等荧光报道分子来说明DNA扩增的程度时，可生成荧光曲线。当报道探针浓度以不断增加的速率耗尽时，经常出现“饱和”荧光曲线的S形特征。

然而，该反应(以及引申而言，其特征荧光)受到包括PCR引物在内的所有反应物浓度的限制。例如，当使用等浓度的单组引物时，并且当一种引物比另一种引物更有效地延伸时，该反应变成速率限制性的。与DNA的指数扩增相比，这导致DNA的线性扩增。

发明内容

在一些实施方案中，本文描述了检测样品中靶核酸分析物的存在或不存在的方法，所述方法包括：a)对所述样品进行扩增反应；b)测量在所述扩增反应期间生成的信号并从所测量的信号生成动力学特征；以及c)将所生成的动力学特征与参考特征进行比较，并确定所述生成的动力学特征是否对应于所述参考特征，从而检测所述样品中靶核酸分析物的存在或不存在。在一些实施方案中，动力学特征包括选自电磁信号、波长和荧光发射信号的信号。在一些实施方案中，所述动力学特征被绘制为曲线。在一些实施方案中，所述曲线包含指数区域、线性区域和平台区域中的至少一种。在一些实施方案中，所述动力学特征包括记录值。在一些实施方案中，将所述值记录在表中。在一些实施方案中，所述扩增反应是聚合酶链反应(PCR)。在一些实施方案中，所述参考特征对应于通过在一组受限扩增参数的一个或多个成员下扩增所述靶核酸分析物而生成的动力学特征。在一些实施方案中，该组受限扩增参数包括以下参数的任何组合：(i)正向和/或反向引物浓度的范围；(ii)聚合酶浓度的范围；(iii)聚合酶类型；(iv)核苷酸浓度的范围；(v)发色团浓度；和(vi)发色团类型；(vii)热循环数；(viii)热循环速率；(ix)一种或多种热循环阶段温度；和(x)一种或多种热循环阶段时间长度；(xi)靶标特异性分子探针的范围；(xii)与一种或多种靶标特异性探针相关的引物；以及(xiii)一种或多种酶辅因子的浓度。在一些实施方案中，所述扩增反应在一个或多个所述受限扩增参数内进行。

在一些实施方案中，本文描述了检测样品中靶核酸分析物的存在或不存在的方法，所述方法包括：a)在一组受限扩增参数下对样品进行扩增反应，该组包括以下一种或多种的任何组合：(i)正向和/或反向引物浓度的范围；(ii)聚合酶浓度的范围；(iii)聚合酶类型；(iv)核苷酸浓度的范围；(v)发色团浓度；(vi)发色团类型；(vii)热循环数；(viii)热循环速率；(ix)一种或多种热循环阶段温度；和(x)一种或多种热循环阶段时间长度；(xi)靶标特异性分子探针的范围；和(xii)与一种或多种靶标特异性探针相关的引物；以及(xiii)一种或多种酶辅因子的浓度；b)测量在所述扩增反应期间生成的信号并从所测量的信号生成动力学特征；c)将所生成的动力学特征与参考特征进行比较，所述参考特征对应于在该组受限扩增参数下对所述靶核苷酸分析物的扩增；以及d)确定所述生成的动力学特征是否对应于参考特征，从而检测所述样品中靶核酸分析物的存在或不存在。在一些实施方案中，所述扩增反应在一个或多个所述受限扩增参数内进行。在一些实施方案中，所述一种或多种酶辅因子选自镁、钾和钠。在一些实施方案中，所述核酸分析物来自选自动物、植物、细菌、寄生虫和病毒等来源。在一些实施方案中，所述动物是人。在一些实施方案中，所述核酸分析物选自人免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、疟原虫、分枝杆菌属(Mycobacterium)、登革病毒、肝炎病毒和流感病毒。在一些实施方案中，所述核酸分析物选自人免疫缺陷病毒多聚蛋白酶、人免疫缺陷病毒p17、人乳头瘤病毒E6和人乳头瘤病毒E7。在一些实施方案中，指数区域、线性区域和平台区域中的至少一种在至少4个循环内发生。在一些实施方案中，指数区域、线性区域和平台区域中的至少一种在至少8秒内发生。

在一些实施方案中，本文描述了检测样品中多种靶核酸分析物中的每一种的存在或不存在的方法，所述方法包括：a)将引物组添加至样品，所述引物组包含至少两个引物对，至少一个所述引物对包含限制性引物，并且每个引物对限定一种待扩增的所述靶核酸分析物的区域；对所述样品进行扩增反应；b)测量在所述扩增反应期间生成的信号；以及c)基于所测量的信号确定所述多种靶核酸分析物中的每一种是否存在。在一些实施方案中，步骤c)进一步包括由所测量的信号生成动力学特征的步骤，并且步骤d)进一步包括将所述动力学特征与参考特征进行比较的步骤，所述参考特征对应于通过用所述引物组扩增所述多种靶核酸分析物中的一种或多种而生成的动力学特征，从而进行确定。在一些实施方案中，所述引物组由三种引物组成。在一些实施方案中，所述三种引物由一种正向引物和两种反向引物或者两种正向引物和一种反向引物组成。在一些实施方案中，所述引物组包含两种或更多种巢式引物。在一些实施方案中，通过激发与扩增产物结合的分子来生成所述信号。在一些实施方案中，所述分子是杂交探针。在一些实施方案中，(A)所述引物组包含第一和第二引物对，所述第一引物对具有第一退火温度且所述第二引物对具有低于所述第一退火温度的第二退火温度，并且所述第一引物对限定一种所述靶核酸分析物的一部分，所述第二引物对限定另一种所述靶核酸分析物的一部分；并且(B)所述扩增反应包含一组温度循环的热循环，该组温度循环包含具有(i)不高于所述第一退火温度且(ii)高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环，所述反应进一步包含具有不高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个其他温度循环。在一些实施方案中，所述扩增反应包含具有不高于所述第一退火温度且高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环，随后是具有不高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环。在一些实施方案中，所述扩增反应包含具有不高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环，随后是具有(x)不高于所述第一退火温度且(y)高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环。在一些实施方案中，步骤c)进一步包括由所测量的信号生成动力学特征的步骤，并且步骤d)进一步包括将所述动力学特征与参考特征进行比较的步骤，所述参考特征对应于当用所述引物组通过包含该组温度循环的热循环反应扩增所述多种靶核酸分析物中的一种或多种时生成的信号，从而进行确定。在一些实施方案中，所述信号包括动力学特征。在一些实施方案中，所述动力学特征包括选自电磁信号、波长和荧光发射信号的信号。在一些实施方案中，所述动力学特征被绘制为曲线。在一些实施方案中，所述曲线包含指数区域、线性区域或平台区域中的至少一种。在一些实施方案中，所述动力学特征包括记录值。在一些实施方案中，将所述值记录在表中。在一些实施方案中，所述限制性引物以充分低于非限制性引物浓度的浓度存在，以生成特征信号。在一些实施方案中，所述限制性引物以充分低于非限制性引物浓度的浓度存在，以生成特征性动力学特征。在一些实施方案中，所述动力学特征包括选自电磁信号、波长和荧光发射信号的信号。在一些实施方案中，所述动力学特征被绘制为曲线。在一些实施方案中，所述曲线包含指数区域、线性区域或平台区域中的至少一种。在一些实施方案中，所述动力学特征包括记录值。在一些实施方案中，将所述值记录在表中。在一些实施方案中，所述第一和/或第二退火温度由所述限制性引物确定。在一些实施方案中，所述引物对中的一种或多种引物与抗体连接。

在一些实施方案中，本文描述了检测样品中多种靶核酸分析物中的每一种的存在或不存在的方法，所述方法包括：a)将引物组添加至样品，所述引物组包含至少两个引物对，至少一个所述引物对包含限制性引物，并且每个引物对限定一种待扩增的所述靶核酸分析物的区域；b)所述对样品进行热循环扩增反应，所述反应包含一组温度循环，该组温度循环包含具有(i)不高于第一退火温度且(ii)高于第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环，所述反应进一步包含具有不高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个其他温度循环；c)测量在所述扩增反应期间生成的信号；以及d)基于所测量的信号确定所述多种靶核酸分析物中的每一种是否存在。在一些实施方案中，所述引物对中的一种或多种引物与抗体连接。

在一些实施方案中，本文描述了检测样品中多种靶核酸分析物中的两种或更多种的存在或不存在的方法，所述方法包括：a)将包含第一和第二引物对的引物组添加至样品，所述第一引物对具有第一退火温度且所述第二引物对具有低于所述第一退火温度的第二退火温度，并且所述第一引物对限定一种所述靶核酸分析物的区域，所述第二引物对限定另一种所述核酸分析物的区域；b)对所述样品进行热循环扩增反应，所述反应包含一组温度循环，该组温度循环包含具有(i)不高于所述第一退火温度且(ii)高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环，所述反应进一步包含具有不高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个其他温度循环；c)测量所述扩增反应期间生成的信号；以及d)基于所生成的信号确定所述两种或更多种核酸分析物的存在或不存在。在一些实施方案中，步骤c)进一步包括由所测量的信号生成动力学特征的步骤，并且步骤d)进一步包括将所述动力学特征与参考特征进行比较的步骤，所述参考特征对应于当用所述引物组通过包含该组温度循环的热循环反应扩增所述多种靶核酸分析物中的一种或多种时生成的信号，从而进行确定。在一些实施方案中，所述第一和第二引物对包含三种引物。在一些实施方案中，所述三种引物包含一种正向引物和两种反向引物。在一些实施方案中，所述三种引物包含两种正向引物和一种反向引物。在一些实施方案中，所述引物组包含至少一对巢式引物。在一些实施方案中，所述扩增反应包含具有不高于所述第一退火温度且高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环，随后是具有不高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环。在一些实施方案中，所述扩增反应包含具有不高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环，随后是具有(x)不高于所述第一退火温度且(y)高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环。在一些实施方案中，至少一个所述引物对包含限制性引物。在一些实施方案中，所述限制性引物以小于1μM的浓度存在。在一些实施方案中，非限制性引物以至少两倍于所述限制性引物的初始浓度存在。在一些实施方案中，所述限制性引物具有等于或高于非限制性引物的浓度调节的解链温度。在一些实施方案中，所述信号由与扩增产物结合的分子生成。在一些实施方案中，所述分子是杂交探针。在一些实施方案中，所述最低温度对应于第一和第二引物对的退火温度。在一些实施方案中，所述方法包括使用n个引物对检测n种靶核酸分析物的存在，每个引物对具有与其他引物对不同的退火温度，并且该组温度循环包括散布在不同退火温度之间的一组最低温度。在一些实施方案中，n为3。在一些实施方案中，n为4。在一些实施方案中，n为5。在一些实施方案中，n为6。在一些实施方案中，n为7。在一些实施方案中，引物对中的一种或多种引物与抗体连接。

在一些实施方案中，本文描述了检测样品中多种靶核酸分析物中的每一种的存在或不存在的方法，所述方法包括：a)将包含第一和第二引物对的引物组添加至样品，所述第一引物对具有第一退火温度且所述第二引物对具有低于所述第一退火温度的第二退火温度，并且所述第一引物对限定一种所述靶核酸分析物的区域，所述第二引物对限定另一种所述核酸分析物的区域；b)对所述样品进行热循环扩增反应，所述反应包含一组温度循环，该组温度循环包含具有(i)不高于所述第一退火温度且(ii)高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环，所述反应进一步包含具有不高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个其他温度循环；c)测量所述扩增反应期间生成的信号，从而由所测量的信号生成动力学特征；以及d)将所述动力学特征与参考特征进行比较，所述参考特征对应于当在包含所述引物组的样品中通过热循环反应扩增所述多种靶核酸分析物中的一种或多种时生成的信号，所述热循环反应包含具有(x)不高于所述第一退火温度且(y)高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环，所述反应进一步包含具有不高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个其他温度循环，从而确定所述至少两种核酸分析物的存在或不存在。

在一个方面，本公开内容提供了用于检测核酸分析物的方法。所述方法包括对样品进行巢式不对称扩增反应，测量在所述巢式不对称扩增反应期间生成的信号，以及基于所述信号确定所述分析物是否存在。本公开内容的巢式不对称扩增反应可包含至少三种巢式引物，其中所述至少三种巢式引物中的至少一对引物包含限制性引物和过量引物。在一些情况下，所述至少三种巢式引物与单一分析物结合。在一些实例中，所述至少三种巢式引物可包含至少两对巢式引物。在一些进一步的实例中，所述至少三种巢式引物包含至少三对巢式引物。在一些情况下，所述至少三种巢式引物可包含至少两对与相同分析物结合的巢式引物。在一些情况下，所述至少三对巢式引物可与相同分析物结合。所述限制性引物可以以小于1μM的初始浓度存在。所述过量引物可以以至少2倍于所述限制性引物的初始浓度存在。所述限制性引物可具有等于或高于所述过量引物的浓度调节的解链温度。

本公开内容的方法可检测样品中多种分析物的存在或不存在。在一些情况下，本公开内容的方法可检测样品中至少一种分析物的存在或不存在。本公开内容的方法可进一步包括进行解链曲线分析。

所述信号可以是作为电磁信号的信号。例如，所述信号可以是荧光发射信号。所述信号可包括强度和频率。分析物可由特定波长的信号强度编码。分析物也可由多种波长的多种信号强度编码。所述多种波长可包括至少三种波长。在一些实例中，所述分析物可由选自来自所述信号的值和来自附加信号的值中的至少一种附加值编码。所述至少一种附加值可以选自福斯特共振能量转移(FRET)发射强度、FRET发射波长、电化学信号、化学发光波长、化学发光强度、荧光漂白速率和化学发光漂白速率。在一些情况下，所述至少一种附加值是福斯特共振能量转移(FRET)发射强度。

所述信号可由与扩增产物结合的分子生成。例如，所述信号可由杂交探针生成。所述杂交探针可包含荧光团和淬灭剂。所述扩增反应可包含多种杂交探针，这些杂交探针对不同分析物具有特异性并包含相同的荧光团。在一些实例中，所述杂交探针的数目可大于所述分析物的数目。

由单一分析物生成的信号可绘制为选自时间和循环数等变量的函数，从而生成图。所述图可包含选自指数区域、线性区域和平台区域中的至少两个相同区域。在一些情况下，两个所述指数区域均在至少4个循环内发生。在一些情况下，两个所述指数区域均在至少8秒内发生。在一些情况下，两个所述线性区域均在至少4个循环内发生。在一些情况下，两个所述线性区域均在至少8秒内发生。在一些情况下，两个所述平台区域均在至少4个循环内发生。在一些情况下，两个所述平台区域均在至少8秒内发生。

所述分析物可选自脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。本公开内容的方法可进一步包括对RNA进行逆转录。所述分析物可以以小于1,000个拷贝存在。所述样品可进一步包含参考分析物。所述分析物可来自选自动物、植物、细菌、真菌、寄生虫和病毒等来源。所述动物可以是人类。在一些情况下，所述分析物来自选自人免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、疟原虫、分枝杆菌属、登革病毒、肝炎病毒和流感病毒等来源。在一些情况下，所述分析物选自人免疫缺陷病毒多聚蛋白酶、人免疫缺陷病毒p17、人乳头瘤病毒E6和人乳头瘤病毒E7。所述分析物还可以是核酸变体。所述分析物可以是编码16S RNA序列的核酸。所述样品可选自临床样品、食物样品、环境样品、药物样品和来自消费品的样品。

本公开内容的方法可进一步包括将信号强度变换到频域，从而生成经变换的信号。所述变换可通过选自傅里叶变换、快速傅里叶变换、离散傅里叶变换、离散时间傅里叶变换和小波变换等方法来进行。所述方法可进一步包括将经变换的信号与参考信号进行比较。所述比较可用于确定所述分析物是否存在。

本公开内容的方法可用于明确地确定一种或多种分析物是否存在。本公开内容的方法还可包括确定样品中所述分析物的初始量。本公开内容的方法可进一步包括基于所述分析物是否存在来作出临床决策。所述临床决策可包括选择用于施用于有需要的受试者的药剂。所述药剂可以是治疗剂。所述治疗剂可选自抗生素或抗病毒剂。本公开内容的方法可进一步包括通过计算机网络传输关于所述分析物的信息。所述传输可向医生传输。在一些实例中，本公开内容的方法中的至少一个步骤可使用非易失性计算机可读介质上的指令来进行。所述指令可位于远程服务器上或热循环仪上。

本公开内容还提供了确定核酸分析物的量的方法。所述方法包括对样品进行扩增反应，测量在所述扩增反应期间生成的信号，将所述信号变换到频域从而生成经变换的信号，将来自所述经变换的信号的值与参考信号的值进行比较，以及基于所述比较确定所述分析物的量。所述变换可通过选自傅里叶变换、快速傅里叶变换、离散傅里叶变换、离散时间傅里叶变换和小波变换等方法来进行。变换可通过特征基分解(eigenbasisdecomposition)来进行。所述特征基分解可属于PCR曲线。所述特征基分解可属于特征PCR曲线。所述特征基分解可包括一种或多种特征函数。所述一种或多种特征函数可包括对应于一个或多个引物组的时移的成比例的S形、指数和/或线性曲线。变换可通过特征PCR曲线的特征基分解来进行，所述特征PCR曲线包括由对应于巢式PCR扩增内的特定引物组的时移的成比例的S形、指数和线性曲线组成的特征函数。本公开内容的方法检测多种分析物的存在或不存在。在一些实例中，每种所述分析物在所述分析物之间生成独特的经变换的信号。所述比较可包括比较在特定频率和时间下的强度值。在一些情况下，在扩增反应的每个循环期间生成至少约5个强度值。所述参考信号可在参考信号的数据库中。所述数据库可包含至少20个参考信号。所述数据库可包含至少30个参考信号。所述数据库可包含至少50个参考信号。所述数据库可包含少于500个参考信号。所述数据库可包含少于200个参考信号。所述数据库可包含少于100个参考信号。

本公开内容还提供了用于检测核酸分析物的试剂盒。本公开内容的试剂盒包含至少三种巢式引物。至少一对引物可包含限制性引物和过量引物。所述试剂盒还可包含实时检测剂。所述试剂盒可检测多种分析物的存在或不存在。至少一种所述引物可以是冻干的。在一些情况下，每种所述引物都是冻干的。所述试剂盒可进一步包含用于检测扩增分析物的试剂。所述用于检测扩增分析物的试剂可包含荧光团。所述用于检测扩增分析物的试剂可包含杂交探针。

在一些实例中，所述试剂盒中的至少三种巢式引物可与单一分析物结合。在一些情况下，所述试剂盒的至少三种巢式引物包含至少两对巢式引物。所述至少三种巢式引物可包含至少三对巢式引物。在一些进一步的实例中，所述至少三种巢式引物包含至少两对与相同分析物结合的巢式引物。在一些情况下，所述至少三种巢式引物包含至少三对与相同分析物结合的巢式引物。所述限制性引物可以以小于1μM的初始浓度存在。所述过量引物可以以至少2倍于所述限制性引物的初始浓度存在。所述限制性引物可具有等于或高于所述过量引物的浓度调节的解链温度。

援引并入

本说明书中提到的所有出版物和专利申请均通过引用以其全文并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每一个单独的出版物或专利申请均通过引用而并入。

附图说明

本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：

图1示出了图示巢式PCR方法的示意图。

图2示出了具有三个引物对(A、B、C)的巢式PCR。感兴趣的靶区域在框中示出。

图3示出了饱和的定量聚合酶链反应的荧光曲线。

图4示出了有偏向的引物的定量聚合酶链反应的荧光曲线。

图5示出了巢式定量聚合酶链反应的荧光曲线。

图6示出了两个聚合酶链反应的特征荧光曲线(曲线ABC和曲线DEF)。

图7示出了变换到频域的两个聚合酶链反应的特征荧光曲线(曲线ABC和曲线DEF)。

图8示出了图示可与本公开内容的示例性实施方案结合使用的计算机系统的第一示例性架构的框图。

图9示出了图示可与本公开内容的示例性实施方案结合使用的计算机网络的示意图。

图10示出了图示可与本公开内容的示例性实施方案结合使用的计算机系统的第二示例性架构的框图。

具体实施方式

I.总体概述

本公开内容涉及有关检测和/或量化样品中的一种或多种分析物的方法、系统、组合物和试剂盒。该方法对于检测多重反应中的多种分析物可能特别有用。多重反应可允许对同一样品进行平行反应、使用相同的室进行多个反应以及以快速有效的方式从样品中提取丰富信息的能力。本文公开的方法可允许在单一溶液中进行多重测定。这些方法可用于替代或补充光谱分辨荧光或化学发光(例如，PCR、ELISA)、空间分辨信号(例如，微阵列、凝胶电泳)、时间分辨信号(例如，毛细管电泳)或其组合(例如，Sanger测序)。

PCR引物与模板之间的结合的特异性允许选择性地扩增预期靶标。例如，典型的定量聚合酶链反应进行到“饱和”，其中扩增反应进行到至少一种反应物(如引物、聚合酶、探针或游离核苷酸)耗尽的点。当使用诸如TaqMan探针、FRET探针或嵌入染料等荧光报道分子来说明DNA扩增的程度时，可生成荧光曲线。当报道探针浓度以不断增加的速率耗尽时，经常出现“饱和”荧光曲线的S形特征。

然而，该反应(以及引申来说，其特征荧光)受到包括PCR引物在内的所有反应物浓度的限制。例如，当使用等浓度的单组引物时，并且当一种引物比另一种引物更有效地延伸时，该反应变成速率限制性的。与DNA的指数扩增相比，这导致DNA的线性扩增。

一般而言，本公开内容的方法包括进行扩增反应，测量在扩增反应期间生成的信号，并基于所测量的信号确定样品中存在的分析物的量。该方法还可包括将测量信号变换到第二域并将经变换的信号与参考信号进行比较。还可基于经变换的信号与测量的信号的比较来获得样品中存在的分析物的量或样品中存在的分析物的初始量。

信号可以是能够测量的任何事物。例如，信号可以是荧光信号。用于本公开内容的方法的扩增反应可包括半巢式或巢式PCR反应。在这些PCR反应中，至少两组引物用于至少两个连续反应。在第一PCR反应中，使用一对引物。然后将来自第一PCR反应的产物用作第二次PCR反应的模板，使用一种(半巢式PCR反应)或两种不同的引物(巢式PCR反应)。图1示出了图示巢式PCR方法的示意图，图2示出了具有三个引物对(A、B、C)的巢式PCR。

进行本公开内容的扩增反应以生成可指示一种或多种分析物的存在和/或不存在的特征信号曲线。特征曲线也可用于测量样品中存在的一种或多种分析物的量。可通过改变以下参数来生成这样的特征曲线：(i)每种靶分析物的引物对的数目，(ii)用于靶分析物的引物序列，和/或(iii)每个引物对中正向和反向引物的比例。

通常，进行本公开内容的扩增反应，使得每个引物对中的正向或反向引物是速率限制性的。这可通过添加每个引物组使得存在不同比例的反向和正向引物来完成。例如，不对称PCR反应、不对称巢式PCR反应或不对称半巢式PCR反应可用作本公开内容的方法中的扩增反应。通过选择正向与反向引物的合适比例，可以调整本公开内容的扩增反应以生成表现出分析物的特征线性扩增的曲线。虽然该线性扩增对于靶分析物的有效扩增可能是非理想的，但其可允许辨别靶标。此外，针对特定巢式反应的引物浓度和引物数目的调整允许为给定靶标设计特定的荧光标记。由分析物生成的荧光信号可被绘制为选自时间和循环数等变量的函数，从而生成图或特征曲线。优选地，荧光信号以AFU提供并且相对于循环数绘制。

由本公开内容的方法生成的特征曲线可包括一个或多个基线区域、一个或多个指数区域、一个或多个线性区域和/或一个或多个平台区域。在一些情况下，曲线包括选自基线区域、指数区域、线性区域和平台区域中的至少两个相同区域。例如，曲线包括至少两个基线区域、至少两个指数区域、至少两个线性区域和/或至少两个平台区域中的一个或多个。可进行本公开内容的扩增反应，使得样品中的每种靶分析物生成特征曲线，所述特征曲线可指示特定靶分析物的存在或不存在。曲线可以通过以下一个或多个来表征：(i)曲线中基线区域的数目，(ii)曲线中线性区域的数目，(iii)曲线中指数区域的数目，(iv)曲线中平台区域的数目，(v)曲线中一个或多个线性区域的斜率，(vi)曲线中一个或多个平台区域的持续时间/长度，(vii)曲线中一个或多个线性区域的持续时间/长度，(viii)曲线中一个或多个指数区域的持续时间/长度，(ix)曲线中一个或多个基线区域的持续时间/长度，(x)曲线中两个连续基线区域之间的持续时间，(xi)曲线中两个连续指数区域之间的持续时间，(xii)曲线中两个连续平台区域之间的持续时间，和/或(xiii)曲线中两个连续线性区域之间的持续时间。在一些情况下，曲线通过一个或多个前述性质以及一个或多个此处未列出的附加性质来表征。在一些情况下，曲线仅通过一个或多个此处未列出的附加性质来表征。

一旦生成特征曲线，可通过曲线拟合算法分析这些曲线。这些算法可确定曲线中基线区域的数目、曲线中线性区域的数目、曲线中指数区域的数目、曲线中平台区域的数目、曲线中一个或多个线性区域的斜率、曲线中一个或多个平台区域的持续时间/长度、曲线中一个或多个线性区域的持续时间/长度、曲线中一个或多个指数区域的持续时间/长度、曲线中一个或多个基线区域的持续时间/长度、曲线中两个连续基线区域之间的持续时间、曲线中两个连续指数区域之间的持续时间、曲线中两个连续平台区域之间的持续时间和/或曲线中两个连续线性区域之间的持续时间。此外，如果这些曲线是叠加的(例如，单个多重反应中的多于一种靶标)，如果曲线在荧光计的线性动态范围内，则可独特地鉴别每种靶标。例如，图6示出了可通过本公开内容的方法从包含两种靶分析物的样品生成的两条特征曲线。

本公开内容中呈现的方法可用于各种应用。例如，该方法可用于生成诊断数据，其中采用这些方法来检测可指示疾病或病况的一种或多种分析物的存在或不存在。进行该方法使得指示疾病的每种分析物生成特征曲线。可通过本公开内容的方法诊断的示例性疾病包括癌症、自身免疫疾病、心肺疾病、肝病、消化系疾病等。

在一些情况下，所述方法可用于检测一种或多种病原体的感染。本文提供的方法还可用于进行诊断并基于该诊断作出临床决策。例如，来自个体的样品中是否存在特定的靶分析物可帮助选择施用于受试者的药剂。该药剂是治疗剂，例如抗生素或抗病毒剂。在一些情况下，本公开内容的方法可指示取自受试者的样品中细菌多核苷酸的存在，这可导致通过向受试者施用抗生素来治疗受试者。在其他情况下，本公开内容的方法可指示取自受试者的样品中病毒多核苷酸的存在，这可导致向受试者施用抗病毒剂的临床决策。

所述方法可进一步用于监测个体中疾病的进展或监测治疗方法的疗效。这样的方法包括以有规律的时间间隔监测来自个体的样品，并研究由相应的一种或多种疾病指示性分析物生成的特征曲线的变化。

在其他实例中，本公开内容的方法还可用于鉴别个体或个体群体中的遗传标志物。遗传标志物可以是分子遗传标志物，例如基于PCR的标志物。可用于通过本公开内容的方法分析遗传标志物的技术的非限制性实例包括RAPD(随机扩增多态DNA)、SSR(简单序列重复(SSR，或微卫星，或短串联重复))、SCAR(序列特征性扩增区域)、AFLP(扩增片段长度多态性(AFLP))、SNP(单核苷酸多态性)、CAPS(切割扩增多态序列)等。

II.定义

如本说明书和所附权利要求书中所用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提及“该方法”包括一种或多种方法和/或本文所述类型的步骤，这些方法和步骤在阅读本公开内容等后对于本领域技术人员将变得显而易见。

当提及可测量值(如量、持续时间等)时，如本文所用的“约”意指包括指定值±20％或±10％或±5％甚至±1％的变化，因此，这些变化适合于所公开的组合物或执行所公开的方法。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所通常理解的相同的含义。

如本文所用的术语“退火温度”是指核酸在足以进行引物延伸的给定条件下与靶核酸退火的最高温度。当用于指示引物对的退火温度时，该术语是指在足以进行引物延伸的给定条件下，引物对的每个成员与待扩增的靶模板或分析物的其对应序列退火的最高温度。通常，在一对的每个成员与靶标双链核酸的相对链上的单独的序列结合的情况下，“退火温度”是该对的两个成员均与其互补序列结合的温度。在该对的一个成员相比另一个成员在较低的温度下结合时，该对的退火温度将会是该较低温度。因此，术语“退火温度”是指引物对中具有较低退火温度的引物的退火温度。引物或引物对的“退火温度”可低于引物或引物对的解链温度。“退火温度”可比“解链温度”低任何摄氏度，包括但不限于0.5℃、1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃、3.5℃、4.0℃、4.5℃、5.0℃、5.5℃、6.0℃、6.5℃、7.0℃、7.5℃、8.0℃、8.5℃、9.0℃、9.5℃、10.0℃。在一些实施方案中，本文所述的退火温度是浓度调节的退火温度。

如本文所用的术语“解链温度”是指DNA或核酸双链体的一半变成单链时的温度。术语“引物解链温度”是指与核酸分析物相关的引物的一半将解离时的温度。

如本文所用，术语“分析物”包括核酸、核酸的一部分、可读框、外显子区或内含子区。分析物可存在于染色体、基因组、质粒或cDNA上。例如，分析物可以是染色体或基因组的同一链上的重叠核酸序列。

如本文所用，术语“温度循环”是指在热循环扩增反应期间，样品在其间变化的温度。例如，在标准热循环反应中，样品可在退火温度与解链温度之间重复变化。如本文所用，每个“温度循环”将包括退火和延伸温度，以及一个或多个温度调节步骤。如本文所用，术语“n”是指任何正整数。

III.曲线特征

通常，本公开内容的方法包括作为选自时间和循环数等变量的函数绘制由分析物生成的荧光信号，从而生成图或特征曲线。优选地，荧光信号以AFU提供并且相对于循环数绘制。通常，AFU值可相对于固定的比例尺，例如相对于0至100的比例尺进行归一化。

通过本公开内容的方法生成的靶分析物的典型荧光曲线可包括一个或多个基线区域、平台区域、线性区域和指数区域。在一些情况下，曲线包括选自基线区域、指数区域、线性区域和平台区域的至少两个相同区域。如本文所述，曲线可通过以下性质中的任何一个或多个来表征：(i)曲线中基线区域的数目，(ii)曲线中线性区域的数目，(iii)曲线中指数区域的数目，(iv)曲线中平台区域的数目，(v)曲线中一个或多个线性区域的斜率，(vi)曲线中一个或多个平台区域的持续时间/长度，(vii)曲线中一个或多个线性区域的持续时间/长度，(viii)曲线中一个或多个指数区域的持续时间/长度，(ix)曲线中一个或多个基线区域的持续时间/长度，(x)曲线中两个连续基线区域之间的持续时间，(xi)曲线中两个连续指数区域之间的持续时间，(xii)曲线中两个连续平台区域之间的持续时间，和/或(xiii)曲线中两个连续线性区域之间的持续时间。在一些情况下，曲线通过一个或多个前述性质以及一个或多个此处未列出的附加性质来表征。在一些情况下，曲线仅通过一个或多个此处未列出的附加性质来表征。

在一些情况下，特征曲线可在任一个以上列出的性质方面有所不同。例如，曲线可在基线区域的数目方面有所不同；或者曲线可在平台区域的数目方面有所不同；或者曲线可在指数区域的数目方面有所不同；或者曲线可在线性区域的数目方面有所不同；或者曲线可在一个或多个线性区域的斜率方面有所不同；或者曲线可在一个或多个平台区域的持续时间/长度方面有所不同；或者曲线可在一个或多个线性区域的持续时间/长度方面有所不同；或者曲线可在一个或多个指数区域的持续时间/长度方面有所不同；或者曲线可在一个或多个基线区域的持续时间方面有所不同；或者曲线可仅在曲线的任何两个连续基线区域之间的持续时间方面有所不同；或者曲线可在曲线的任何两个连续指数区域之间的持续时间方面有所不同；或者曲线可在曲线的任何两个连续平台区域之间的持续时间方面有所不同；或者曲线可仅在曲线的任何两个连续线性区域之间的持续时间方面有所不同。例如，具有一个线性区域的曲线可指示样品中第一靶分析物的存在，而具有两个线性区域的另一个曲线可指示样品中第二靶分析物的存在。在另一个实例中，具有正斜率的线性区域的曲线可指示样品中第一靶分析物的存在，而具有负斜率的线性区域的另一个曲线可指示样品中第二靶分析物的存在。

在一些情况下，曲线将在任两个以上列出的性质方面有所不同。例如，曲线可在平台区域的数目和线性区域的数目方面有所不同；或者曲线可在一个或多个线性区域的斜率和平台区域的数目方面有所不同；或者曲线在一个或多个线性区域的长度/持续时间和一个或多个平台区域的长度/持续时间方面有所不同。

在其他情况下，曲线将在任何3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个以上列出的性质方面有所不同。在一些情况下，曲线将在所有13个这些性质方面都有所不同。在一些情况下，曲线将在这些性质的组合加上一个或多个此处未列出的附加性质方面有所不同。

可通过改变用于靶分析物的巢式引物的数目来改变指示特定靶分析物的曲线中的基线区域、平台、指数区域和线性区域的数目。如果对靶分析物使用单个引物对，则所得曲线通常会具有单个基线区域、单个平台、单个指数区域和单个线性区域。随着巢式引物对的数目增加至2、3、4等，基线区域、平台、指数区域和线性区域的数目可以相应地增加。

特征曲线可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个基线区域。例如，曲线可包含15、20、25个，甚至更多个基线区域。特征曲线可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个平台区域。例如，曲线可包含15、20、25个，甚至更多个平台区域。特征曲线可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个指数区域。例如，曲线可包含15、20、25个，甚至更多个指数区域。特征曲线可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个线性区域。例如，曲线可包含15、20、25个，甚至更多个线性区域。

在一些情况下，特征曲线将包含相等数目的基线区域、平台区域、指数区域和线性区域。例如，特征曲线可以包含1个基线区域、1个指数区域、1个线性区域和1个平台区域。类似地，特征曲线可以包含2个基线区域、2个指数区域、2个线性区域和2个平台区域。或者，特征曲线可以包含3个基线区域、3个指数区域、3个线性区域和3个平台区域。特征曲线还可包含4、5、6、7、8、9、10个或更多个基线区域、指数区域、线性区域和平台区域中的每种。例如，特征曲线可包含15、20、25个，甚至更多个基线区域、指数区域、线性区域和平台区域中的每种。

在一些情况下，特征曲线将包含不同数目的基线区域、平台区域、指数区域和线性区域。在一些情况下，特征曲线将包含相等数目的基线区域、平台区域和指数区域但包含不同数目的线性区域。在一些情况下，特征曲线将包含相等数目的基线区域、指数区域和线性区域但包含不同数目的平台区域。在一些情况下，特征曲线将包含相等数目的基线区域、平台区域和线性区域但包含不同数目的指数区域。在一些情况下，特征曲线将包含相等数目的平台区域、指数区域和线性区域但包含不同数目的基线区域。

曲线可在一个或多个平台区域的长度或持续时间方面有所变化。曲线中的平台区域的长度/持续时间可以是例如至少2个循环，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或100个循环。在一些情况下，平台区域的长度或持续时间将会是至多100个循环，例如至多50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个循环。在一些情况下，曲线中的平台区域的长度/持续时间以时间单位计算。在这样的情况下，曲线中的平台区域的长度/持续时间可以是例如至少30秒，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100分钟。在一些情况下，平台区域的长度或持续时间将会是至多100分钟，例如至多95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟。此外，曲线的多个平台区域可全部具有相同或不同的长度/持续时间。

类似地，曲线也可在线性区域的长度或持续时间方面有所变化。曲线中的线性区域的长度/持续时间可以是例如至少2个循环，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或100个循环。在一些情况下，线性区域的长度或持续时间将会是至多100个循环，例如至多50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个循环。在一些情况下，曲线中的线性区域的长度/持续时间以时间单位计算。在这样的情况下，曲线中的线性区域的长度/持续时间可以是例如至少30秒，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100分钟。在一些情况下，线性区域的长度或持续时间将会是至多100分钟，例如至多95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟。曲线的多个线性区域可全部具有相同或不同的长度/持续时间。

曲线可在一个或多个基线区域的长度或持续时间方面有所变化。曲线中的基线区域的长度/持续时间可以是例如至少2个循环，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或100个循环。在一些情况下，基线区域的长度或持续时间将会是至多100个循环，例如至多50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个循环。在一些情况下，曲线中的基线区域的长度/持续时间以时间单位计算。在这样的情况下，曲线中的基线区域的长度/持续时间可以是例如至少30秒，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100分钟。在一些情况下，基线区域的长度或持续时间将会是至多100分钟，例如至多95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟。此外，曲线的多个基线区域可全部具有相同或不同的长度/持续时间。

曲线可在一个或多个指数区域的长度或持续时间方面有所变化。曲线中的指数区域的长度/持续时间可以是例如至少2个循环，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或100个循环。在一些情况下，指数区域的长度或持续时间将会是至多100个循环，例如至多50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个循环。在一些情况下，曲线中的指数区域的长度/持续时间以时间单位计算。在这样的情况下，曲线中的指数区域的长度/持续时间可以是例如至少30秒，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100分钟。在一些情况下，指数区域的长度或持续时间将会是至多100分钟，例如至多95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟。此外，曲线的多个指数区域可全部具有相同或不同的长度/持续时间。

可通过改变相应的正向和反向引物的比例来改变曲线中线性区域的斜率(或梯度)。曲线的一个或多个线性区域的斜率可具有任何值。曲线的不同线性区域可具有相同或不同的值。在一些情况下，曲线的多个线性区域中的一些具有相同的值。在其他情况下，多个线性区域将全部具有不同的值。在一些情况下，多个线性区域中的一些将具有相同的值，而其他将具有不同的值。斜率可以是陡峭的(例如，陡峭上升或陡峭下降)或平缓的(例如，平缓上升或平缓下降)。曲线的线性区域的斜率值可以是正或负的。在一些情况下，斜率为正，其数值范围为0-0.01、0-0.1、0-1、0-2、1-3、0-4、0-5、0-6、0-7、0-8、0-9、0-10、0-20、0-30、0-40、0-50、0-60、0-70、0-80、0-90或0-100。在一些情况下，斜率为正，其数值大于100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。在一些情况下，斜率为负，其数值范围为0-0.01、0-0.1、0-1、0-2、1-3、0-4、0-5、0-6、0-7、0-8、0-9、0-10、0-20、0-30、0-40、0-50、0-60、0-70、0-80、0-90或0-100。在一些情况下，斜率为负，其数值大于100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。

曲线可在两个连续指数区域之间的持续时间方面有所变化。在一些情况下，曲线的两个连续指数区域相隔至少1个循环，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或10,000个循环。在一些情况下，曲线的两个连续指数区域的出现相隔至多10,000个循环，例如至多900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个循环。在一些情况下，曲线的两个连续指数区域相隔至少1个循环，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100分钟。在一些情况下，曲线的两个连续指数区域相隔至多100分钟，例如至多95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟。此外，如果曲线包含多于两个指数区域，则每对连续指数区域可相隔相同或不同的循环数。

曲线可在两个连续基线区域之间的持续时间方面有所变化。在一些情况下，曲线的两个连续基线区域相隔至少1个循环，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或10,000个循环。在一些情况下，曲线的两个连续基线区域的出现相隔至多10,000个循环，例如至多900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个循环。在一些情况下，曲线的两个连续基线区域相隔至少30秒，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100分钟。在一些情况下，曲线的两个连续基线区域相隔至多100分钟，例如至多95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟。此外，如果曲线包含多于两个基线区域，则每对连续基线区域可相隔相同或不同的循环数。

曲线可在两个连续平台区域之间的持续时间方面有所变化。在一些情况下，曲线的两个连续平台区域相隔至少1个循环，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或10,000个循环。在一些情况下，曲线的两个连续平台区域的出现相隔至多10,000个循环，例如至多900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个循环。在一些情况下，曲线的两个连续平台区域相隔至少30秒，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100分钟。在一些情况下，曲线的两个连续平台区域相隔至多100分钟，例如至多95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟。此外，如果曲线包含多于两个平台区域，则每对连续平台区域可相隔相同或不同的循环数。

曲线可在两个连续线性区域之间的持续时间方面有所变化。在一些情况下，曲线的两个连续线性区域相隔至少1个循环，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或10,000个循环。在一些情况下，曲线的两个连续线性区域的出现相隔至多10,000个循环，例如至多900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个循环。在一些情况下，曲线的两个连续线性区域相隔至少30秒，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100分钟。在一些情况下，曲线的两个连续线性区域相隔至多100分钟，例如至多95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1分钟。此外，如果曲线包含多于两个线性区域，则每对连续线性区域可相隔相同或不同的循环数。

当本公开内容的方法与多重PCR测定一起使用时，获得的曲线可以是组分曲线的组合/相加。本公开内容还提供了解释组合的曲线的方法。例如，两条或更多条曲线的线性区域的组合将产生线性区域，其中所得斜率是各个斜率的总和。这可允许两个或更多个反应由其斜率编码和解码。类似地，一条曲线的线性区域和另一条曲线的指数区域可组合成可既不是纯线性也不是纯指数的特征。可通过对实验数据的数学拟合来解码这种组合，以说明两种靶标均可存在和扩增。此外，将曲线的平台区域与另一条曲线的线性区域组合可产生可具有关于两者的独特可解码信息的结果，例如，斜率可鉴别后者，而在组合区域的起始循环处的信号幅度可帮助鉴别平台。

IV.方法

本公开内容提供了用于快速和同时对个体的多种遗传标志物进行基因型分析的方法和材料。该方法包括从待基因分型的个体获得核酸样品，使样品进行本文公开的扩增方法以扩增含有待检测的遗传标志物的区段，绘制在扩增反应期间测量的信号以生成特征曲线，以及基于获得的特征曲线确定样品中遗传标志物的存在或不存在。可以通过使样品与一个或多个巢式引物对(例如，等位基因特异性引物)接触来进行扩增反应。可调节巢式引物对的数目、引物序列及其浓度，使得每种遗传标志物可生成特征信号曲线。因此，存在于个体的核酸样品中的每种遗传标志物将生成特征曲线。对于大量个体也可以重复这些方法以获得个体群体中遗传标志物的遗传谱。

本公开内容还提供了用于检测个体中的一种或多种疾病的方法。例如，该方法可用于检测与疾病的发作和进展相关的特定突变。可通过本公开内容的方法检测的疾病的非限制性实例包括癌症、囊性纤维化、心脏病和白血病。可通过本公开内容的方法检测的其他疾病包括软骨发育不全、X-连锁肾上腺脑白质营养不良、X-连锁无丙种球蛋白血症、Alagille综合征、X-连锁α-地中海贫血、智力迟钝综合征、阿尔茨海默病、早发家族性阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症概括性(Amyotrophic Lateral Sclerosis Overview)、雄激素不敏感综合征、安吉尔曼综合征(angelman syndrome)、遗传性共济失调概括性(AtaxiaOverview)、共济失调-毛细血管扩张症、贝克尔肌萎缩(Becker Muscular Dystrophy，也称抗肌萎缩蛋白病)、贝-维综合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome)、β-地中海贫血、生物素酶缺乏症、鳃-耳-肾综合征、遗传性BRCA1和BRCA2乳腺/卵巢癌、乳腺癌、CADASIL、卡纳范病(Canavan Disease)、癌症、遗传性Charcot-Marie-Tooth神经病变、Charcot-Marie-Tooth神经病变1型、Charcot-Marie-Tooth神经病变2型、Charcot-Marie-Tooth神经病变4型、Charcot-Marie-Tooth神经病变X型、科凯恩综合征(Cockayne Syndrome)、结肠癌、先天性挛缩性细长指、颅缝早闭综合征(FGFR相关)、囊性纤维化、胱氨酸贮积症、耳聋和遗传性听力损失、DRPLA(齿状核红核苍白球路易体萎缩症)、德乔治综合征(DiGeorge Syndrome，也称22ql 1缺失综合征)、X连锁扩张性心肌病、唐氏综合征(21三体)、迪谢内肌营养不良(Duchenne Muscular Dystrophy，也称抗肌萎缩蛋白病)、早发性原发性肌张力障碍(DYT1)、抗肌萎缩蛋白病、脊柱后凸侧弯型埃勒斯-当洛综合征(Ehlers-DanlosSyndrome)、血管型埃勒斯-当洛综合征、单纯性大疱性表皮松解症、遗传性多发性外生骨疣、面肩肱型肌营养不良症、莱顿第五因子血栓形成倾向(Factor V LeidenThrombophilia)、家族性腺瘤性息肉病(FAP)、家族性地中海热、脆性X综合征、弗里德赖希共济失调(Friedreich Ataxia)、伴有帕金森综合征-17的额颞叶痴呆、半乳糖血症、戈谢病(Gaucher Disease)、遗传性血色素沉着、血友病A、血友病B、遗传性55出血性毛细血管扩张症、非综合征型DFNA(连接蛋白26)型听力损失和耳聋、非综合征型DFNB 1(连接蛋白26)型听力损失和耳聋、遗传性痉孪性截瘫、赫曼斯基-普德拉克综合征(Hermansky-PudlakSyndrome)、己糖胺酶A缺乏症(也称泰-萨克斯病(Tay-Sachs))、亨廷顿病(HuntingtonDisease)、季肋发育不全、先天性常染色体隐性鱼鳞病、色素失调症、肯尼迪病(KennedyDisease，也称脊髓延髓肌肉萎缩症)、克拉伯病(Krabbe Disease)、Leber遗传性视神经神经病变、Lesch-Nyhan综合征、白血病、Li-Fraumen综合征、肢带型肌营养不良症、家族性无脑回性脂蛋白脂肪酶缺乏症、马方综合征(Marfan Syndrome)、性MELAS(线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和卒中样发作)、多发性内分泌瘤病2型、多发性外生骨疣、先天性遗传性肌营养不良症、肌强直性营养不良、肾性尿崩症、神经纤维瘤病1、神经纤维瘤病2、遗传性压迫易感性神经病、尼曼-皮克病C型(Niemann-Pick Disease Type C)、Nijmegen奈梅亨断裂综合征、诺里病(Norrie Disease)、眼皮肤白化病1型、眼咽肌营养不良症、卵巢癌、Pallister-Hall综合征、Parkin型青少年帕金森病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-MerzbacherDisease)、彭德莱综合征(Pendred Syndrome)、波伊茨-耶格综合征(Peutz-JeghersSyndrome)、苯丙氨酸羟化酶缺乏症、普拉德-威利综合征(Prader-Willi Syndrome)、PROP1相关的联合垂体激素缺乏症(CPHD)、前列腺癌、视网膜色素变性、视网膜母细胞瘤、罗-汤综合征(Rothmund-Thornson syndrome)、史-莱-奥综合征(Smith-Lemli-OpitzSyndrome)、痉挛性截瘫、脊髓延髓肌萎缩症(也称肯尼迪病)、脊髓性肌萎缩、脊髓小脑共济失调1型、脊髓小脑共济失调2型、脊髓小脑共济失调3型、脊髓小脑共济失调6型、脊髓小脑共济失调7型、施蒂克勒综合征(Stickler Syndrome)(遗传性关节眼病)、泰-萨克斯病(也称GM2神经节苷脂贮积症)、三体症、结节性硬化症、厄舍尔综合征(Usher Syndrome)I型、厄舍尔综合征II型、腭心面综合征(也称22q 1缺失综合征)、希佩尔-林道综合征(VonRippel-Lindau Syndrome)、威廉斯综合征(Williams Syndrome)、威尔逊病(WilsonDisease)、X-连锁肾上腺脑白质营养不良、X-连锁无丙种球蛋白血症、X-连锁扩张性心肌病(也称抗肌萎缩蛋白病)和X-连锁低张力脸-智力迟钝综合征。本文提供的方法还可应用于在疾病治疗的治疗性干预过程中检测突变，该突变可决定给定治疗的疗程和疗效。

所述方法可进一步用于测量治疗效果。在这样的情况下，将会在一段时间内监测来自患者的样品的特征曲线的变化。类似地，本文所述的方法可用于监测疾病的进程。

本文公开的方法可以用于有发生疾病或病症的风险的受试者、可能已经或可能尚未被诊断为患有疾病或病症的受试者以及正在接受疾病或病症的治疗和/或疗法的受试者。本公开内容的方法还可用于为患有疾病或病症的受试者监测或选择治疗方案。

本公开内容还提供了用于检测一种或多种病原体的存在的方法。在一些情况下，该方法可用于确定一种或多种病毒、细菌或真菌的存在。例如，该方法可用于检测DNA病毒、RNA病毒、逆转录病毒。在一些情况下，该方法可用于检测/定量dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒、(+)ssRNA病毒、(-)ssRNA病毒、ssRNA-RT病毒或dsDNA-RT病毒。该方法可用于检测/量化革兰氏阳性的(例如，革兰氏阳性球菌和革兰氏阳性杆菌)和革兰氏阴性的(例如，革兰氏阴性球菌和革兰氏阴性杆菌)。这些方法可进一步包括提取靶病原体的细胞组分，诸如基因组DNA、核糖体RNA、转移RNA或信使RNA。在这些方法中，样品中每种病原体的存在将通过相应的特征曲线来指示。可通过本公开内容的方法检测的病原体的非限制性实例包括：HIV-1、乙型肝炎和丙型肝炎、人乳头瘤病毒、沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、巨细胞病毒、流感、伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)、西尼罗病毒、腺病毒、放线菌(actinomyces)和结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)。本公开内容的方法还能够实现GMO(遗传修饰的生物体)的鉴别。

本公开内容的方法还将用于跟踪患者和相关模式生物中的突变的存在和/或进展。在一些情况下，患者可以是癌症患者，并且本公开内容的方法可用于获得关于耐药性突变的存在或不存在的信息。这样的信息可具有临床意义和效用，例如，KRAS突变可指示结直肠癌，并且EGFR的T790M突变可指示肺癌。类似地，本发明的方法可用于当模式生物或模式生物群体在药物研究中暴露于不同的实验药物时跟踪它们的遗传信息。在一些情况下，模式生物可以是小鼠或大鼠。

本公开内容的方法还可用于档案组织与患者病史和结果和实施的用药方案互相参照的遗传追溯研究。这样的研究可在流行病学和对疾病如癌症的基本理解方面产生新的见解。本文公开的方法进一步提供了对生物样品(例如，血液、唾液、脑脊液等)进行多重表达分析的手段，这些手段可同时具有基础效用和临床效用。

V.扩增反应

A.聚合酶链反应(PCR)

扩增是指增加靶序列的拷贝数的任何过程。用于扩增靶多核苷酸的方法是本领域已知的，并且包括但不限于基于PCR的方法。有利于通过PCR扩增靶序列的条件是本领域已知的，可在该过程的各个步骤中进行优化，并且取决于反应中元件的特征，诸如靶标类型、靶标浓度、待扩增的序列长度、靶标和/或一种或多种引物的序列、引物长度、引物浓度、使用的聚合酶、反应体积、一种或多种元件与一种或多种其他元件的比例等等，其中一些或全部特征可进行改变。

通常，PCR涉及待扩增的靶标的变性(如果是双链的)、一种或多种引物与靶标的杂交以及通过DNA聚合酶的引物延伸的步骤，这些步骤进行重复(或“循环”)以扩增靶序列。可针对各种结果优化该过程中的步骤，诸如以提高产率、减少假产物的形成以及/或者提高或降低引物退火的特异性。

优化方法是本领域熟知的，并且包括调节扩增反应中元件的类型或量以及/或者过程中给定步骤的条件，诸如特定步骤的温度、特定步骤的持续时间和/或循环数。在一些实施方案中，扩增反应包含5、10、15、20、25、30、35、50个或更多个循环。在一些实施方案中，扩增反应包含不多于5、10、15、20、25、35、50个或更多个循环。循环可含有任何数目的步骤，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个步骤。步骤可包括适合于实现给定步骤目的的任何温度或温度梯度，该给定步骤包括但不限于3’端延伸(例如接头补平)、引物退火、引物延伸和链变性。步骤可具有任何持续时间，包括但不限于约、小于约或大于约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、180、240、300、360、420、480、540、600秒或更多秒，包括无限期直到手动中断为止。包含不同步骤的任何数目的循环可以以任何顺序组合。在一些实施方案中，将包含不同步骤的不同循环进行组合，使得组合中循环的总数目是约、小于约或大于约5、10、15、20、25、30、35、50个或更多个循环。在一些实施方案中，在补平反应后进行扩增。扩增可在来自独立样品的靶多核苷酸合并之前或之后进行。

(i)巢式PCR反应

在本公开内容的方法中，PCR反应可以以传统方式进行，其中针对信号核酸靶标选择一组特异性引物。然而，还可使用策略来增加PCR靶标产率。例如，扩增反应可在巢式PCR条件下进行，其中使用至少两对引物，即一对外引物和一对内引物。每个引物对包含正向引物和反向引物。常规的巢式PCR程序利用两个连续的扩增过程。具体地，两个连续扩增过程包括第一扩增过程和随后的第二扩增过程，第一扩增过程包括用于扩增延伸的靶序列的至少一个扩增步骤，第二扩增过程包括用于扩增来自第一扩增过程产物的内部序列的至少一个扩增步骤，其中所述内部序列可以与或可以不与扩增的序列的一个端部重叠。第一扩增过程的每个扩增步骤使用通常包含一对外引物的外引物组。类似地，第二扩增过程的每个扩增步骤使用通常包含一对内引物的内引物组。图1示出了图示巢式PCR反应的方法的示意图，图2示出了具有三个引物对(A、B、C)的巢式PCR。感兴趣的靶区域在框中示出。如本文所用，巢式PCR反应还意在包括部分巢式(semi-nested)或半巢式(hemi-nested)PCR反应，其中用于第二扩增过程中的至少一种引物与第一扩增过程中的相同。

本公开内容的巢式PCR方法可使用多种引物进行，例如至少3种巢式引物、至少4种巢式引物、至少5种巢式引物、至少6种巢式引物、至少7种巢式引物、至少8种巢式引物、至少9种巢式引物、至少10种巢式引物、至少11种巢式引物、至少12种巢式引物、至少13种巢式引物、至少14种巢式引物或至少15种巢式引物。在一些实例中，该方法可使用多于15种巢式引物，例如20、25、30、35种，甚至更多种巢式引物。在一些实施方案中，本公开内容的巢式PCR方法可使用至多35种巢式引物、30种巢式引物、25种巢式引物、20种巢式引物、15种巢式引物、14种巢式引物、13种巢式引物、12种巢式引物、11种巢式引物、10种巢式引物、9种巢式引物、8种巢式引物、7种巢式引物、6种巢式引物、5种巢式引物、4种巢式引物、3种巢式引物或2种巢式引物进行。在一些实例中，该方法可使用35、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2种巢式引物。

所述多种引物可包括至少2对巢式引物、至少3对巢式引物、至少4对巢式引物、至少5对巢式引物、至少6对巢式引物、至少7对巢式引物、至少8对巢式引物、至少9对巢式引物、至少10对巢式引物、至少11对巢式引物、至少12对巢式引物、至少13对巢式引物、至少14对巢式引物、至少15对巢式引物、至少16对巢式引物、至少17对巢式引物、至少18对巢式引物、至少19对巢式引物或至少20对巢式引物。在一些实施方案中，所述多种引物可包括至多20对巢式引物、19对巢式引物、18对巢式引物、17对巢式引物、16对巢式引物、15对巢式引物、14对巢式引物、13对巢式引物、12对巢式引物、11对巢式引物、10对巢式引物、9对巢式引物、8对巢式引物、7对巢式引物、6对巢式引物、5对巢式引物、4对巢式引物、3对巢式引物或2对巢式引物。

例如，如图2所示，可使用三个巢式引物对A、B和C。在该情况下，所有三种引物均有效扩增感兴趣的靶区域。通过针对结合能细致选择引物序列，它们可表现出不同的解链温度。这将允许每种引物的反应动力学根据温度进行调整。

通过选择巢式引物对的温度和控制PCR扩增的退火温度，可调整扩增反应的荧光标记以生成多个平台。例如，如图5所示，来自图2的三个巢式引物对可生成独特的荧光标记。因为可在反应开始时细致选择引物组A、B和C的浓度，所以在平台A、B和C处的核酸靶标的浓度也可以是确定的。该信息可用于选择线性PCR区域的进行应当处于的靶标浓度。

(ii)不对称PCR反应

本公开内容的巢式PCR反应可进一步以这样的方式进行：巢式引物对中的正向或反向引物都可以是速率限制性的(不对称PCR条件)。这可通过添加每个引物组使得存在不同比例的反向和正向引物来完成。在一些情况下，这可通过滴定每个引物组使得存在不同比例的反向和正向引物来完成。因此，可能生成表现出DNA的特征性线性扩增的曲线。虽然线性扩增对于DNA的有效扩增可能是非理想的，但其可适合于细致辨别DNA靶标。图3示出了饱和的定量PCR反应的荧光曲线，图4示出了不对称(有偏向的引物)定量PCR反应的荧光曲线。此外，调整特定巢式反应的引物浓度和引物数可允许针对给定靶标设计特定荧光标记。

在某些实施方案中，限制性引物的起始摩尔浓度小于过量引物的起始摩尔浓度。过量引物与限制性引物的起始浓度之比可以是至少2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1、450:1、500:1、550:1、600:1、650:1、700:1、750:1、800:1、850:1、900:1、950:1、1000:1或更大。

在某些实施方案中，限制性引物的起始摩尔浓度小于过量引物的起始摩尔浓度。过量引物与限制性引物的起始浓度之比可以是至多1000:1、950:1、900:1、850:1、800:1、750:1、700:1、650:1、600:1、550:1、500:1、450:1、400:1、350:1、300:1、250:1、200:1、150:1、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1或更小。

在某些实施方案中，正向引物包括限制性引物且反向引物包括过量引物，其中将过量引物以限制性引物浓度的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍或1000倍的浓度添加至组合样品，并且其中扩增条件包括不对称PCR条件。

在某些实施方案中，正向引物包括限制性引物且反向引物包括过量引物，其中将过量引物以限制性引物浓度的至多1000倍、900倍、950倍、850倍、800倍、750倍、700倍、650倍、600倍、550倍、500倍、450倍、400倍、350倍、300倍、250倍、200倍、150倍、100倍、95倍、90倍、85倍、80倍、75倍、70倍、65倍、60倍、55倍、50倍、45倍、40倍、35倍、30倍、25倍、24倍、23倍、22倍、21倍、20倍、19倍、18倍、17倍、16倍、15倍、14倍、13倍、12倍、11倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍的浓度添加至组合样品，并且其中扩增条件包括不对称PCR条件。

在一些实施方案中，正向引物包括过量引物且反向引物包括限制性引物，其中将过量引物以限制性引物浓度的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍或1000倍的浓度添加至组合样品，并且其中扩增条件包括不对称PCR条件。

在某些实施方案中，正向引物包括过量引物且反向引物包括限制性引物，其中将过量引物以限制性引物浓度的至多1000倍、900倍、950倍、850倍、800倍、750倍、700倍、650倍、600倍、550倍、500倍、450倍、400倍、350倍、300倍、250倍、200倍、150倍、100倍、95倍、90倍、85倍、80倍、75倍、70倍、65倍、60倍、55倍、50倍、45倍、40倍、35倍、30倍、25倍、24倍、23倍、22倍、21倍、20倍、19倍、18倍、17倍、16倍、15倍、14倍、13倍、12倍、11倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍的浓度添加至组合样品，并且其中扩增条件包括不对称PCR条件。

可调节或修饰引物长度和序列，使得在反应开始时限制性引物的浓度调节的解链温度高于或等于过量引物的浓度调节的解链点。在一些实施方案中，限制性引物与过量引物的浓度调节的解链温度的差异可以是至少0℃、0.5℃、1℃、1.5℃、2℃、2.5℃、3℃、3.5℃、4℃、4.5℃、5℃、5.5℃、6℃、6.5℃、7℃、7.5℃、8℃、8.5℃、9℃、9.5℃、10℃或更大。在一些实施方案中，限制性引物与过量引物的浓度调节的解链温度的差异可以是至多10℃、9.5℃、9℃、8.5℃、8℃、7.5℃、7℃、6.5℃、6℃、5.5℃、5℃、4.5℃、4℃、3.5℃、3℃、2.5℃、2℃、1.5℃、1.0℃、0.5℃、0℃或更小。

可用具有浓度范围的靶分子和引物的初始反应混合物进行根据本公开内容的实施方案的扩增和测定。所述方法可用于测定含有少于100个拷贝、1000个拷贝、10,000个拷贝、20,000个拷贝、30,000个拷贝、40,000个拷贝、50,000个拷贝、60,000个拷贝、70,000个拷贝、80,000个拷贝、90,000个拷贝、100,000个拷贝、200,000个拷贝、300,000个拷贝、400,000个拷贝、500,000个拷贝、600,000个拷贝、70,000个拷贝、800,000个拷贝、900,000个拷贝或1000,000个拷贝的靶分析物的样品。

所述方法可用于测定含有多于1000,000个拷贝、900,000个拷贝、800,000个拷贝、700,000个拷贝、600,000个拷贝、500,000个拷贝、400,000个拷贝、300,000个拷贝、200,000个拷贝、100,000个拷贝、90,000个拷贝、80,000个拷贝、70,000个拷贝、60,000个拷贝、50,000个拷贝、40,000个拷贝、30,000个拷贝、20,000个拷贝、10,000个拷贝、1,000个拷贝或100个拷贝的靶分析物的样品。

所述方法可用于测定包含0-100个拷贝、0-1000个拷贝、0-10,000个拷贝、0-20,000个拷贝、0-30,000个拷贝、0-40,000个拷贝、0-50,000个拷贝、0-60,000个拷贝、0-70,000个拷贝、0-80,000个拷贝、0-90,000个拷贝、0-100,000个拷贝、0-200,000个拷贝、0-300,000个拷贝、0-400,000个拷贝、0-500,000个拷贝、0-600,000个拷贝、0-70,000个拷贝、0-800,000个拷贝、0-900,000个拷贝或0-1000,000个拷贝的靶分析物的样品。

限制性引物的浓度范围可为几纳摩尔(nM)至几百纳摩尔。例如，限制性引物的浓度可以是1-50nM、1-100nM、1-150nM、1-200nM、1-250nM、1-300nM、1-350nM、1-400nM、1-450nM、1-500nM、50-100nM、50-150nM、50-200nM、50-250nM、50-300nM、50-350nM、50-400nM、50-450nM、50-500nM、100-150nM、100-200nM、100-250nM、100-300nM、100-350nM、100-400nM、100-450nM、100-500nM、150-200nM、150-250nM、150-300nM、150-350nM、150-400nM、150-450nM、150-500nM、200-250nM、200-300nM、200-350nM、200-400nM、200-450nM、200-500nM、250-300nM、250-350nM、250-400nM、250-450nM、250-500nM、300-350nM、300-400nM、300-450nM、300-500nM、350-400nM、350-450nM、350-500nM、400-450nM、400-500nM或450-500nM。本领域技术人员应当理解，限制性引物的浓度可落入由这些值中的任何值为界限的任何范围内。

在一些实例中，限制性引物的浓度小于10nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM或500nM。在一些实例中，限制性引物的浓度大于10nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM或500nM。

本公开内容的不对称巢式PCR方法包括通过解链、引物退火和引物延伸等步骤的重复热循环。在第一阶段聚合酶链反应中，将特异性外引物添加至样品核酸混合物，并使所得混合物进行初始变性步骤以获得单链DNA模板。变性后，使混合物进行初始退火步骤，其中所述外引物与靶核苷酸序列的相反链进行杂交。然后升高温度以允许跨越两个引物之间的区域的特定DNA区段通过热稳定DNA聚合酶进行延伸或复制。然后使反应进行热循环以允许重复进行变性、退火和延伸，使得在每个循环中，表现出两个外引物之间的靶核苷酸序列的DNA的量加倍。

第一变性温度可以是70-110℃，例如70-75℃、75-80℃、80-85℃、85-90℃、90-95℃、95-100℃、100-105℃或105-110℃。第一退火温度可以是35-65℃，例如35-40℃、40-45℃、45-50℃、50-55℃、55-60℃或60-65℃。第一延伸温度可以在40-80℃的范围内，例如40-45℃、45-50℃、50-55℃、55-60℃、60-65℃、65-70℃、70-75℃或75-80℃。

在第一阶段聚合酶链反应结束时，将所得混合物转入第二阶段聚合酶链反应中。在该第二阶段反应中，第一阶段反应的产物与特定的内引物结合。使该混合物再次进行初始变性、退火和延伸步骤，然后如前所述进行热循环，以允许靶核苷酸序列重复的变性、退火和延伸。

第二变性温度可以是70-110℃，例如70-75℃、75-80℃、80-85℃、85-90℃、90-95℃、95-100℃、100-105℃或105-110℃。第二退火温度可以是35-65℃，例如35-40℃、40-45℃、45-50℃、50-55℃、55-60℃或60-65℃。第二延伸温度可以是40-80℃，例如40-45℃、45-50℃、50-55℃、55-60℃、60-65℃、65-70℃、70-75℃或75-80℃。

可用于所提供的公开内容的方法中的其他PCR技术包括，例如，AFLP(扩增片段长度多态性)PCR(参见例如：Vos等人，1995.AFLP:a new technique for DNAfingerprinting.Nucleic Acids Research 23:4407-14)、等位基因特异性PCR(参见例如，Saiki R K、Bugawan T L、Horn G T、Mullis K B、Erlich H A(1986).Analysis ofenzymatically amplified beta-globin and HLA-DQ alpha DNA with allele-specificoligonucleotide probes Nature 324:163-166)、Alu PCR、装配PCR(参见例如，Stemmer WP、Crameri A、Ha K D、Brennan T M、Heyneker H L(1995).Single-step assembly of agene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides Gene164:49-53)、不对称菌落PCR、解旋酶依赖性PCR(参见例如，Myriam Vincent、Yan Xu和Huimin Kong(2004).Helicase-dependent isothermal DNA amplification EMBOreports 5(8):795-800)、热启动PCR、反向PCR(参见例如，Ochman H、Gerber A S、Hartl DL.Genetics.1988年11月；120(3):621-3)、原位PCR、序列间特异性PCR或称IS SR PCR、数字PCR、指数后线性PCR(linear-after-the-exponential-PCR)或称晚PCR(Late PCR)(参见例如，Pierce K E和Wangh L T(2007).Linear-after-the-exponential polymerase chainreaction and allied technologies Real-time detection strategies for rapid,reliable diagnosis from single cells Methods Mol.Med.132:65-85)、长PCR、巢式PCR、实时PCR、双重PCR、多重PCR、定量PCR或单细胞PCR。可与本公开内容的方法一起使用的PCR技术的进一步实例包括但不限于定量PCR、定量荧光PCR(QF-PCR)、多重荧光PCR(MF-PCR)、实时PCR、逆转录酶PCR(RT-PCR)、单细胞PCR、限制性片段长度多态性PCR(PCR-RFLP)、PCR-RFLP/RT-PCR-RFLP、热启动PCR、巢式PCR、原位聚合酶克隆(polonony)PCR、原位滚环扩增(RCA)、桥式PCR、微微升(picotiter)PCR和乳液PCR。在一些实例中，本公开内容的巢式PCR反应通过在PCR反应一开始时添加所有引物并通过对PCR机器进行编程以在反应过程中在不同的PCR温度组之间循环以使得不同的引物组仅在它们各自的阶段被激活来进行。例如，巢式PCR反应可用同时存在的被称为A、B和C的三对巢式引物进行。可以以这样的方式对反应进行编程，使该反应在序列A的引物的杂交温度下运行循环的前三分之一，该温度对于B和C的引物而言太高而不能杂交。然后在适合于B的引物的温度下运行循环的中间三分之一，但该温度对引物C的杂交而言仍然太热。最后，在对于引物对C的杂交而言足够低的温度下运行循环的最后三分之一。设计本公开内容的方法的控制杠杆包括序列信息以及PCR循环的温度和持续时间的编程。在一些情况下，本发明的方法可涉及在反应过程中改变退火和延伸温度，以使得不同的引物在同一PCR反应期间的不同时间得到激活以进行延伸。

在一些情况下，也可能对Taqman探针进行编程以在反应的不同时间激活。例如，外巢式引物可具有高于内巢式引物和Taqman探针的退火温度。这可能意味着在“预扩增”期间Taqman探针可以被保护免于水解，因为在扩增模板时，探针不杂交，因此不能水解。因此，在扩增的第一阶段期间不会生成信号，但是当通过降低退火温度使内引物对参与反应时，探针也将会杂交，并且将会开始信号生成。该特征可用于保持信号干净并帮助诊断该测定的问题。

B.SPIA扩增

可使用采用线性扩增方法如单引物等温扩增(SPIA)对感兴趣的分析物的扩增。SPIA能够生成感兴趣的链特异性序列区域的多个拷贝并使用单一扩增引物，从而降低与多种寡核苷酸设计和制造相关的复杂性，实现通用扩增引物的使用，并且可以是线性的。

通过SPIA的扩增可以在允许复合引物杂交、通过具有链置换活性的DNA聚合酶的引物延伸、来自RNA/DNA异源双链体的RNA切割和链置换的条件下发生。就复合扩增引物与通常包含复合扩增引物序列的至少一部分的互补体的3’单链部分(属于通过切割包含RNA/DNA部分异源双链体的复合物中的RNA形成的部分双链多核苷酸)杂交而言，复合引物杂交可在允许特异性杂交的条件下进行。在SPIA中，所有步骤都是等温的(在某种意义上，不需要热循环)，但每个步骤的温度可以相同或可以不同。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施方案。例如，如本文描述和例示的，可在温度改变(例如，升高或降低)时进行某些步骤。

尽管上文通常描述仅一种复合扩增引物，但应当进一步理解，SPIA扩增方法可在两种或更多种不同的第一和/或第二复合引物的存在下进行，所述第一和/或第二复合引物随机充当模板多核苷酸的引物。此外，可将使用两种或更多种不同的第一和/或第二复合引物进行的两个或更多个单独扩增反应的扩增多核苷酸产物进行组合，所述第一和/或第二复合引物随机充当模板多核苷酸的引物。

复合扩增引物是由RNA和DNA部分组成的引物。在复合引物的扩增中，RNA和DNA部分通常与待复制或扩增的扩增准备产物中的序列互补的，并且可以与该序列杂交。在一些实施方案中，扩增复合引物的3’部分是DNA，且复合扩增引物的5’部分是RNA。设计复合扩增引物使得引物从3’-DNA部分延伸以产生引物延伸产物。RNA/DNA异源双链体中的该引物延伸产物的5’-RNA部分易于被RNA酶H切割，从而释放一部分多核苷酸以与另外的复合扩增引物杂交。通过具有链置换活性的DNA聚合酶对扩增复合引物的延伸从原始引物释放引物延伸产物，并产生多核苷酸序列的另一拷贝。重复循环的引物杂交、用链置换DNA合成进行引物延伸以及RNA切割，产生多核苷酸的链特异性序列的多个拷贝。

在一些实施方案中，在来自茎-环嵌合前引物(pro-primer)的扩增反应混合物中产生复合扩增引物。扩增反应混合物可包含靶标部分双链核酸(例如靶标部分双链体DNA)、嵌合茎-环前引物、具有链置换活性的DNA聚合酶以及靶向RNA/DNA异源双链体中的RNA的RNA酶(例如RNA酶H)。在嵌合茎-环前引物的茎处的RNA/DNA异源双链体的RNA部分可被RNA酶H切割，以产生例如包含3’-DNA和5’-RNA的线性复合引物。线性化的扩增引物可与靶标部分双链体的3’-单链DNA部分(突出端)杂交，并且可通过具有链置换活性的DNA聚合酶进行延伸。异源双链体中的杂交引物的RNA部分可被RNA酶H切割以释放一部分引物结合位点。第二线性复合扩增引物可与释放的引物结合位点杂交，并且可沿着靶DNA链延伸。预先合成的引物延伸产物(扩增产物)可以被新延伸的引物置换。重复循环的引物杂交、通过链置换DNA聚合酶的引物延伸和杂交引物的RNA部分的切割，可产生靶核酸的多个拷贝。

C.其他扩增方法

另一种扩增方法包括使用单一寡核苷酸引物对单链多核苷酸的扩增。待扩增的单链多核苷酸包含两个非相邻序列，它们基本上或完全彼此互补，因此能够杂交在一起以形成茎-环结构。该单链多核苷酸可能已经是多核苷酸分析物的一部分，或者可作为多核苷酸分析物的存在的结果而产生。

用于获得核酸扩增结果的另一种方法被称为连接酶链反应(LCR)。该方法使用连接酶来连接预先形成的核酸探针对。探针与核酸分析物(若存在)的每条互补链杂交，并且采用连接酶来将每对探针结合在一起，从而产生两个模板，这两个模板在下一个循环中可用于重复迭代(reiterate)特定核酸序列。

用于实现核酸扩增的另一种方法是基于核酸序列的扩增(NASBA)。该方法是启动子引导的酶促过程，其诱导特定核酸在体外的连续、均匀及等温的扩增以提供核酸的RNA拷贝。用于进行NASBA的试剂包括具有包含启动子的5’-尾的第一DNA引物、第二DNA引物、逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶、NTP和dNTP。

用于扩增特定的一组核酸的另一种方法是Q-β-复制酶方法，该方法依赖于Q-β-复制酶以指数方式扩增其RNA底物的能力。用于进行这样的扩增的试剂包括“中度变异RNA(midi-variant RNA)”(可扩增的杂交探针)、NTP和Q-β-复制酶。

用于扩增核酸的另一种方法被称为3SR，且类似于NASBA，不同之处在于逆转录酶中存在RNA酶H活性。通过3SR进行的扩增是一种RNA特异性靶向方法，通过该方法在组合了启动子引导的RNA聚合酶、逆转录酶和RNA酶H与靶RNA的等温过程中扩增RNA。参见，例如Fahy等人,PCR Methods Appl.9:129-33(1991)。

用于扩增核酸的另一种方法是由Gen-Probe使用的转录介导的扩增(TMA)。该方法与NASBA在以下方面相似：在自动维持序列复制中使用两种酶。参见美国专利号5,299,491，该专利通过引用并入本文。

用于扩增核酸的另一种方法是链置换扩增(SDA)(Westin等人,2000,NatureBiotechnology,18,199-202；Walker等人,1992,Nucleic Acids Research,20,7,1691-1696)，它是一种等温扩增技术，基于限制性内切核酸酶如HincII或BsoBI使其识别位点的半硫代磷酸形式的未修饰链产生切口的能力，以及外切核酸酶缺陷型DNA聚合酶如Klenowexo minus聚合酶或Bst聚合酶在切口处延伸3’端并置换下游DNA链的能力。指数式扩增是由偶合有义和反义反应导致的，其中从有义反应置换的链作为反义反应的靶标，反之亦然。

用于扩增核酸的另一种方法是滚环扩增(RCA)(Lizardi等人,1998,NatureGenetics,19:225-232)。RCA可用于以核酸环形式扩增单链分子。在其最简单的形式中，RCA包括单个引物与环状核酸的杂交。通过具有链置换活性的DNA聚合酶对引物的延伸导致产生串连成单个DNA链的环状核酸的多个拷贝。

在本公开内容的一些实施方案中，RCA与连接偶合。例如，单个寡核苷酸既可用于连接又可作为RCA的环状模板。这一类型的多核苷酸可称为“挂锁探针(padlock probe)”或“RCA探针”。对于挂锁探针，寡核苷酸的两个末端均包含与感兴趣的核酸序列内的结构域互补的序列。挂锁探针的第一端与感兴趣的核酸序列上的第一结构域基本上互补，而挂锁探针的第二端与第一结构域附近邻近第一结构域的第二结构域基本上互补。寡核苷酸与靶核酸的杂交导致形成杂交复合物。挂锁探针端部的连接导致形成包含环状多核苷酸的修饰的杂交复合物。在一些情况下，在连接之前，聚合酶可通过延伸挂锁探针的一端来补平间隙。这样形成的环状多核苷酸可作为RCA的模板，其在添加聚合酶时导致形成扩增产物核酸。本文描述的本公开内容的方法可产生在5’端和3’端均具有确定序列的扩增产物。此类扩增产物可用作挂锁探针。

本公开内容的一些方面利用核酸或多核苷酸的线性扩增。线性扩增通常是指这样的方法，其包括形成核酸或多核苷酸分子(通常为核酸或多核苷酸分析物)的仅一条链的互补体的一个或多个拷贝。因此，线性扩增与指数式扩增之间的主要差别是：在后一过程中，产物作为用于形成更多产物的底物，而在前一过程中，起始序列是用于形成产物的底物，但反应产物，即起始模板的复制产物，并不是用于生成产物的底物。在线性扩增中，形成的产物的量作为时间的线性函数而增加，不同于其中形成的产物的量为时间的指数函数的指数扩增。

在一些实施方案中，扩增方法可以是固相扩增、聚合酶克隆扩增、菌落扩增、乳液PCR、珠RCA、表面RCA、表面SDA等，如本领域技术人员将认识到的。在一些实施方案中，可以使用以下扩增方法，该扩增方法导致溶液中的游离DNA分子的扩增，或仅通过DNA分子的一端链接到合适的基质上的DNA分子的扩增。可使用依赖于桥式PCR的方法，在该方法中两条PCR引物附着至表面上(参见例如，WO 2000/018957；以及Adessi等人,Nucleic AcidsResearch(2000):(20):E87)。在一些情况下，本公开内容的方法可形成“聚合酶克隆技术”或“聚合酶克隆”，其指维持相同扩增子的空间群集的多重扩增(参见哈佛大学分子技术组及计算遗传学Lipper中心(Harvard Molecular Technology Group and Lipper Centerfor Computational Genetics)的网站)。这些包括例如，原位聚合酶克隆(Mitra和Church,Nucleic Acid Research 27,e34,1999年12月15日)、原位滚环扩增(RCA)(Lizardi等人,Nature Genetics 19,225,1998年7月)、桥式PCR(美国专利号5,641,658)、picotiter PCR(Leamon等人,Electrophoresis 24,3769,2003年11月)和乳液PCR(Dressman等人,PNAS100,8817,2003年7月22日)。本发明的方法为产生和使用聚合酶克隆提供了新的方法。

其他合适的扩增方法包括转录扩增、自动维持序列复制、靶多核苷酸序列的选择性扩增、共有序列引物聚合酶链反应(CP-PCR)、随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)、简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)和基于核酸的序列扩增(NABSA)。可用于本文的其他扩增方法包括描述于美国专利号5,242,794；5,494,810；4,988,617和6,582,938的方法。在一些实施方案中，靶核酸的扩增可在珠上发生。在其他实施方案中，扩增不在珠上发生。

多重测定

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于同时扩增、检测和/或量化样品中的多种靶分析物的多重测定。多重测定或语法等同语是指在单一反应混合物中检测、分析或扩增多于一种感兴趣的靶分析物。在一些实施方案中，本公开内容的方法可用于检测和/或量化样品中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、2000、3000种或更多的不同靶分析物。在一些实施方案中，本公开内容的方法可用于检测和/或量化样品中的至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、2000、3000种或更少的不同靶分析物。因此，在一些情况下，本文描述的方法可用于同时检测多种疾病。在其他情况下，该方法可用于同时检测样品中的多种感染原。在一些其他情况下，该方法可用于同时检测样品中的多种遗传标志物。

在一些实施方案中，本公开内容的方法涉及多重PCR反应。在一些实施方案中，该方法可涉及多重巢式PCR反应或多重不对称PCR反应。

VI.分析物

分析物可以是可通过本文提供的方法检测的任何分子。分析物可以是多核苷酸，例如DNA、RNA及其任何杂交物，其中多核苷酸含有脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的任何组合。多核苷酸可以是指明的单链或双链，或者含有同时有双链或单链序列的部分。多核苷酸可含有核苷酸的任何组合，该核苷酸包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤及其任何核苷酸衍生物。如本文所用，术语“核苷酸”可包括核苷酸和核苷，以及核苷和核苷酸类似物和修饰的核苷酸，其包括合成和天然存在的种类。

分析物可包含RNA。例如，分析物可包含信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、核RNA(nRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、Cajal体特异性小RNA(scaRNA)、微小RNA(miRNA)、双链(dsRNA)、核酶、核糖开关16SRNA或病毒RNA。在一些情况下，本发明的方法可进一步包括通过使用逆转录酶将RNA分析物逆转录成其互补DNA(cDNA)。随后，可通过本公开内容的方法扩增和测定cDNA。

分析物可包含DNA或复合DNA，例如基因组DNA。包含基因组DNA的分析物可从任何来源并使用本领域已知的任何方法获得。基因组DNA可从天然存在的或遗传修饰的生物体或从人工或合成产生的基因组获得。基因组DNA可在伴有或没有扩增的情况下分离。扩增可包括PCR扩增、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增和其他扩增方法。基因组DNA还可通过克隆或重组方法获得，诸如涉及质粒和人工染色体的方法或其他常规方法(参见Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.，引用如上)。分析物也可包含cDNA。cDNA可产生于RNA，例如mRNA。DNA可以是由不同物种的基因组的混合物产生的cDNA。DNA可以是线粒体DNA(mtDNA)。DNA可以是无细胞DNA。无细胞DNA可从例如血清或血浆样品获得。DNA可包含一种或多种染色体。例如，如果DNA来自人，则DNA可包含染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X或Y中的一种或多种。DNA可来自线性或环状基因组。DNA可以是质粒DNA、粘粒DNA、细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)。

DNA可以是特定物种的，例如人、大鼠、小鼠、其他动物、植物、细菌、藻类、病毒等的。DNA还可来自不同物种的基因组的混合物，诸如宿主病原体、细菌群体等。DNA可来自多于一个个体或生物体。DNA可以是双链或单链的。DNA可以是染色质的一部分。DNA可以与组蛋白缔合。本文所述的方法可应用于高分子量DNA，例如从组织或细胞培养物中分离的DNA，以及高度降解的DNA，例如来自血液和尿液的无细胞DNA和/或从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中提取的DNA。

分析物可以是来自特定病原体如细菌、病毒、真菌或蠕虫的多核苷酸。例如，分析物可以是来自人免疫缺陷病毒(HIV，例如人免疫缺陷病毒p17)、疟原虫、单纯疱疹病毒、登革病毒、肝炎病毒、人乳头瘤病毒(例如人乳头瘤病毒E6或人乳头瘤病毒E7)、流感病毒、分枝杆菌属、腺病毒科(Adenoviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、乳头多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)、多瘤病毒科(Polyomavirus)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、链球菌属(Streptococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、志贺氏菌属(Shigella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)或埃希氏菌属(Escherichia)的多核苷酸。

分析物也可编码酶、蛋白质或多肽。分析物可指示碳水化合物、糖、小分子、药物或代谢物(例如，抗癌药物、化疗药物、抗病毒药物、抗生素药物或任何其他分子，如辅因子、受体、受体配体、激素、细胞因子、血液因子、抗原、类固醇或抗体)的存在和/或量。

样品可来源于动物、植物、细菌、真菌、寄生虫或病毒。在一些情况下，样品来源于于人。分析物所来源于的不同样品可包括来自相同个体的多个样品、来自不同个体的样品或其组合。在一些实施方案中，样品包含来自单个个体的多种多核苷酸。在一些实施方案中，样品包含来自两个或更多个个体的多种多核苷酸。个体是靶多核苷酸可来源于的任何生物体或其部分，其非限制性实例包括植物、动物、真菌、原生生物、原核生物(moneran)、病毒、线粒体和叶绿体。样品多核苷酸可从受试者如由其衍生的细胞样品、组织样品或器官样品中分离，该样品包括例如培养的细胞系、活检物、血液样品或含有细胞的流体样品。细胞可包括特定的细胞类型，诸如体细胞、生殖细胞、野生型细胞、癌症或肿瘤细胞或者病变或感染的细胞。细胞可以指来源于靶生物体中的特定组织或特定基因座的细胞。细胞可包含完好无损的细胞或细胞制品。在一些情况下，样品可从体液获得，该体液可包括血液、尿液、血清、淋巴液、唾液、粘膜分泌物、汗液或精液。受试者可以是动物，包括但不限于诸如牛、猪、小鼠、大鼠、鸡、猫、狗等动物，并且受试者通常是哺乳动物，如人。

样品还可从制造品(诸如化妆品和食品)、药品或消费品获得。在一些情况下，样品可从包括空气、农产品、水和土壤在内的环境样品获得。样品也可以是人工产生的，诸如通过化学合成。在其他情况下，样品可以是实验操作的产物，该实验操作包括重组克隆、多核苷酸扩增、聚合酶链反应(PCR)扩增、纯化方法(诸如基因组DNA或RNA的纯化)和合成反应。

用于提取和纯化核酸的方法是本领域公知的。例如，核酸可通过采用苯酚、苯酚/氯仿/异戊醇或类似的制剂(包括TRIzol和TriReagent)进行有机提取来纯化。提取技术的其他非限制性实例包括：(1)有机提取，然后进行乙醇沉淀，例如，在使用或不使用自动化核酸提取器例如可从Applied Biosystems(Foster City,Calif.)获得的型号341DNA提取器的情况下，使用苯酚/氯仿有机试剂(Ausubel等人，1993)；(2)固定相吸附法(美国专利号5,234,809；Walsh等人，1991)；和(3)盐诱导的核酸沉淀法(Miller等人，(1988))，这样的沉淀法通常被称为“盐析”法。核酸分离和/或纯化的另一个实例包括使用核酸可特异性或非特异性结合的磁性粒子，然后使用磁体分离珠子，洗涤珠子并从珠子上洗脱核酸(参见例如美国专利号5,705,628)。在一些实施方案中，以上的分离方法可在酶消化步骤之前进行，以帮助从样品中除去不需要的蛋白质，例如，采用蛋白酶K或其他类似的蛋白酶进行消化。参见例如，美国专利号7,001,724。在需要时，可向裂解缓冲液中添加RNA酶抑制剂。对于某些细胞或样品类型，可能需要在方案中添加蛋白质变性/消化步骤。纯化方法可针对分离DNA、RNA或二者。当DNA和RNA二者在提取程序过程中或之后被一起分离出时，可采用进一步的步骤通过使彼此分离而纯化其中的一种或二者。还可以生成提取的核酸的亚级分，例如，按大小、序列或者其他物理或化学特征进行纯化。除了初始的核酸分离步骤以外，还可在本公开内容的方法中的任何步骤之后进行核酸的纯化，如用于去除过量的或不需要的试剂、反应物或产物。

VII.引物

根据本公开内容，术语“引物”涉及核酸序列，其能够与例如靶核酸序列、靶序列附近的核酸序列或与靶核酸序列重叠的核酸序列杂交。或者，引物可以能够与靶核酸序列的互补序列、靶核酸序列附近的核酸序列的互补序列或与靶核酸序列重叠的核酸序列的互补序列杂交。

引物通常包含寡核苷酸。引物可包含5-50个核苷酸，例如5-10个核苷酸、5-15个核苷酸、5-20个核苷酸、5-25个核苷酸、5-30个核苷酸、5-35个核苷酸、5-40个核苷酸、5-45个核苷酸、5-50个核苷酸、10-15个核苷酸、10-20个核苷酸、10-25个核苷酸、10-30个核苷酸、10-35个核苷酸、10-40个核苷酸、10-45个核苷酸、10-50个核苷酸、15-20个核苷酸、15-25个核苷酸、15-30个核苷酸、15-35个核苷酸、15-40个核苷酸、15-45个核苷酸、15-50个核苷酸、20-25个核苷酸、20-30个核苷酸、20-35个核苷酸、20-35个核苷酸、20-40个核苷酸、20-45个核苷酸、20-50个核苷酸、25-30个核苷酸、25-35个核苷酸、25-40个核苷酸、25-45个核苷酸、25-50个核苷酸、30-35个核苷酸、30-40个核苷酸、30-45个核苷酸、30-50个核苷酸、35-40个核苷酸、35-45个核苷酸、35-50个核苷酸、40-45个核苷酸、40-50个核苷酸或45-50个核苷酸。在一些实施方案中，引物包含5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。引物还可包含多于50个核苷酸，例如55、60、65、70个，甚至更多个核苷酸。

可以通过常规方法从限制酶切消化物中纯化引物，或者可合成产生引物。引物优选是单链的以在扩增中获得最大效率，但引物也可以是双链的。双链引物可进行变性，即处理引物以使链分离。使双链核酸变性的一种方法是通过加热。

设计和制备适合于扩增反应的引物的方法是本领域普通技术人员公知的。在设计待用作扩增引物的寡核苷酸时，重要特征包括但不限于适当大小的扩增产物以便于检测(例如，通过电泳)、引物对的成员的解链温度以及每个引物的长度(即，引物需要足够长从而以序列特异性退火并启动合成，但不要太长以使得寡核苷酸合成期间的保真性降低)。扩增引物的长度取决于若干因素，包括核苷酸序列同一性以及在体外核酸扩增期间杂交或使用这些核酸的温度。可使用例如计算机程序如OLIGO(Molecular Biology Insights,Inc.,Cascade,Colo.)设计引物。

在一些实施方案中，引物可包含可检测的标记物，但标记物也可以在扩增测定期间通过其他方式(例如通过标记的探针)引入。在前一种情况下，标记的引物将产生标记的扩增产物，因为该标记的引物被掺入产物中。标记的引物可从商业供应商如CPG,Inc.(Lincoln Park,N.J.)获得，或者标记的引物可通过将标记物与未标记的引物缀合来制备。标记寡核苷酸(如引物)可使用常规偶联程序进行。然而，具体的偶联过程将根据标记物和/或寡核苷酸上存在的反应基团而变化。优选的标记物包括可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的那些部分。这样的标记物包括但不限于荧光、化学发光、染料、生物素、半抗原、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、酶亚基、金属离子、电子致密试剂和放射性同位素(例如，³²P)。标记物部分可直接或间接连接到引物。

例如，引物在5’端用荧光团标记，扩增的靶序列将用可检测的荧光材料标记，并且由荧光材料发射的荧光强度可使用荧光分光光度计测量。可与本公开内容的引物一起使用的合适的荧光团包括以上所述的那些。例如，引物可用以下物质进行标记：6-FAM；Alexafluor 405、430、488、532、546、555、568、594、633、647或660；CY2；Cy3；CY3.5；Cy5；Cy5.5；Cy7；羟基香豆素；甲氧基香豆素；氨基香豆素；荧光素；HEX；R-藻红蛋白；罗丹明红-X；ROX；红613；德克萨斯红；别藻蓝蛋白；TruRed；BODIPY 630/650；BODIPY 650/665；BODIPY-FL；BODIPY-R6G；BODIPY-TMR；BODIPY-TRX；羧基荧光素；级联蓝(Cascade Blue)；6-JOE；丽丝胺罗丹明B；俄勒冈绿488、500或514；太平洋蓝；REG；罗丹明绿；SpectrumAqua；TAMRA；TET；和四甲基罗丹明。

VIII信号

本公开内容中呈现的方法涉及信号的测量。信号可包括强度和/或频率。在本公开内容中描述的许多示例性实施方案中，可使用荧光信号。荧光信号通常被描述为以颜色(即，波长)和强度测量。可通过使用分光光度计或通过使用仅允许特定波长的光到达光检测器的带通滤波器来测量颜色。这样的带通滤波器通常用于qPCR机器中。强度通过使用光检测器来测量。在一些情况下，每种分析物由特定波长下的信号强度编码。在一些情况下，每种分析物由多种波长下的多种信号强度编码。例如，每种分析物可用1、2、3、4、5种或更多种波长的单一强度标记。在一些情况下，分析物由选自来自所述信号的值和来自附加信号的值的至少一种附加值编码。在一些情况下，所述一种附加值选自福斯特共振能量转移(FRET)发射强度、FRET发射波长、电化学信号、化学发光波长、化学发光强度、荧光漂白速率和化学发光漂白速率。在一些情况下，至少一种附加值是福斯特共振能量转移(FRET)发射强度。

尽管在荧光信号方面描述了本公开内容中描述的许多示例性实施方案，但这决不是限制性的。本公开内容提供的方法可与任何信号一起使用，该信号例如是福斯特共振能量转移(FRET)发射强度、FRET发射波长、化学发光波长、化学发光强度、电磁信号、荧光漂白速率或化学发光漂白速率。

本公开内容中提供的一些方法使用在分析物的存在下生成信号的试剂。在一些情况下，这些试剂是探针。该探针可以是杂交探针。该杂交探针可以是与荧光团和淬灭剂连接的寡核苷酸探针(例如，TAQMAN探针)。

本公开内容的方法可使用一种或多种试剂或探针来检测每种分析物的存在。例如，可使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或更多种试剂或探针来检测分析物的存在。在一些情况下，可使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或更多种试剂或探针来检测分析物的存在。在一些情况下，可以使用少于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或更多种试剂或探针来检测分析物的存在。

如上所述，与荧光团和淬灭剂连接的寡核苷酸探针可用于在多核苷酸扩增测定中检测分析物的存在。只要淬灭剂与荧光团接近，淬灭剂就会淬灭由荧光团在被光源激发时发射的荧光。寡核苷酸探针的序列被设计成与分析物中存在的多核苷酸序列互补，因此能够与分析物中存在的多核苷酸序列杂交。寡核苷酸探针的杂交可在包含引物的核酸扩增反应(例如，聚合酶链反应)中进行。当通过DNA聚合酶延伸引物时，聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解探针，将荧光团和淬灭剂释放到介质中。荧光团与淬灭剂之间的接近得以破坏，并且来自荧光团的信号不再被淬灭。因此，检测到的荧光的量是存在的分析物的量的函数。如果不存在分析物，则探针将不会与分析物杂交，而荧光团和淬灭剂将保持紧密接近。将会产生少量信号或无信号。

寡核苷酸探针的每个探针可具有一种或多种荧光团和淬灭剂。例如，在一些实施方案中，寡核苷酸探针可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种荧光团。寡核苷酸探针可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种荧光团。寡核苷酸探针可包含少于2、3、4、5、6、7、8、9或10种荧光团。寡核苷酸探针可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种淬灭剂。寡核苷酸探针可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种淬灭剂。寡核苷酸探针可包含少于2、3、4、5、6、7、8、9或10种淬灭剂。探针和淬灭剂与探针的连接可在同一反应中或在系列反应中进行。可进行一系列反应以用至少一种荧光团标记探针，并且可将反应产物混合以产生具有不同荧光团的探针的混合物。

用于本公开内容的合适的荧光团包括但不限于荧光镧系金属络合物(包括铕和铽的络合物)、荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、茋、荧光黄、级联蓝、德克萨斯红和Richard P.Haugland所著的Molecular ProbesHandbook第11版中描述的其他荧光团，其通过引用以其全文明确并入本文。

容易掺入标记寡核苷酸中的市售荧光核苷酸类似物包括，例如，Cy3-dCTP、Cy3-dUTP、Cy5-dCTP、Cy5-dUTP(GE Healthcare)、荧光素-12-dUTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、得克萨斯红(Texas Red) FL-14-dUTP、R-14-dUTP、TR-14-dUTP、罗丹明绿(Rhodamine Green)TM-5-dUTP、俄勒冈绿488-5-dUTP、 630/650-14-dUTP、650/665-14-dUTP、Alexa488-5-dUTP、Alexa532-5-dUTP、Alexa 568-5-dUTP、Alexa594-5-dUTP、Alexa546-14-dUTP、荧光素-12-UTP、四甲基罗丹明-6-UTP、 FL-14-UTP、TMR-14-UTP、TR-14-UTP、罗丹明绿(Rhodamine Green)TM-5-UTP、Alexa488-5-UTP和Alexa546-1 4-UTP(Invitrogen)。

其他可用于合成后连接的荧光团还包括Alexa350、Alexa532、Alexa546、Alexa568、Alexa594、Alexa647、BODIPY493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY630/650、BODIPY650/665、级联蓝、级联黄(Cascade Yellow)、Dansyl、丽丝胺罗丹明B、Marina蓝(MarinaBlue)、俄勒冈绿488、俄勒冈绿514、太平洋蓝(Pacific Blue)、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明、德克萨斯红(可从Invitrogen获得)以及Cy2、Cy3.5、Cy5.5和Cy7(GEHealthcare)。

如果寡核苷酸探针包含两种或更多种荧光团，则这些荧光团可被布置成允许荧光团之间发生福斯特(荧光)共振能量转移(FRET)。简而言之，FRET是荧光团之间能量转移的机制。使用基于FRET的探针允许一个激发源通过激发单个荧光团产生两种不同的荧光发射信号。例如，本文所述的方法可以使用成对探针，其中该对中的一个探针与荧光团和淬灭剂连接，而第二探针与两个荧光团(足够紧密接近以发生FRET)和淬灭剂连接。可使用提供FRET的荧光团和淬灭剂的任何组合。这样的方法使可与激发源一起使用的荧光探针的数目加倍，因为单个激发源可用于产生两种信号：一种来自具有一个荧光团的探针，一种来自具有足够紧密接近以提供FRET的两个荧光团的探针。例如，使用表8中描述的编码方法，通过使表8中的每个探针与相应的FRET探针配对，可将明确可检测的分析物的数目从16增加至32。

在一个实例中，第一探针可用荧光团5’-荧光素亚酰胺(5’-FAM)和淬灭剂黑洞淬灭剂1(BHQ-1)标记。第二探针可用与花青5.5(Cy5.5)紧密接近(例如，连接)的5’-FAM以及淬灭剂黑洞淬灭剂3(BHQ-3)标记。在通过聚合酶的核酸酶活性消化探针后，从单一激发波长(例如，470nm)生成两种荧光信号。来自第一探针的荧光团将在约520nm下发荧光。第二探针上的荧光团进行FRET。供体荧光团FAM被激发光源(例如，470nm)激发并将其能量转移给受体荧光团Cy5.5。受体荧光团在约705nm下发射。这些荧光团和淬灭剂仅仅是示例性的。可进行FRET的任何荧光团和可淬灭荧光的任何淬灭剂都适合与本公开内容一起使用。用于产生基于FRET的探针的方法描述于Jothikumar等人，BioTechniques,2009,46(7):519-524中。

尽管使用基于核酸的探针例示了本公开内容的许多方面，但是本领域普通技术人员将容易认识到，其他形式的探针将与本文中描述的公开内容起到同样有效的作用。例如，对分析物具有特异性的结合分子可用作探针。结合分子的非限制性实例包括识别分析物并在分析物的存在下生成信号的抗体。

类似地，尽管使用连接探针的荧光标记物例示了本公开内容的许多方面，但是许多其他类型的标记物也可以与本公开内容的方法一起使用。本公开内容可与能够生成可测量信号的任何标记物一起使用。

对于多色成像，可使用RGB检测器或分析整个光谱来通过多次采集或通过借助分离信号而同时采集来获得不同波长的信号(Richard Levenson,Cambridge HealthtechInstitutes,Fifth Annual meeting on Advances in Assays,Molecular Labels,Signaling and Detection,5月17至18日Washington D.C.)。通过使用滤光轮或单色仪可获得几条谱线。可使用电子可调谐滤波器如声光可调谐滤波器或液晶可调滤波器来获得多光谱成像(例如，Oleg Hait、Sergey Smirnov和Chieu D.Tran,2001,AnalyticalChemistry 73:732-739)。获得光谱的替代方法是高光谱成像(Schultz等人，2001,Cytometry 43:239-247)。

用于信号检测和强度数据处理的方法和装置公开于例如美国专利号5,143,854、5,547,839、5,578,832、5,631,734、5,800,992、5,834,758；5,856,092、5,902,723、5,936,324、5,981,956、6,025,601、6,090,555、6,141,096、6,185,030、6,201,639；6,218,803；和6,225,625、7,689,022以及WO99/47964中，其各自同样出于所有目的通过引用以其全文并入本文。可与本公开内容一起使用的荧光团不限于本文所述的任何荧光团。例如，具有改良性质的荧光团不断得到开发，并且这些荧光团可以容易地与本公开内容提供的方法一起使用。这类改良的荧光团包括量子点，其在单一波长下被激发后可发射不同波长的能量。使用这类荧光团的优点是仅需要单一激发源，但可以量化许多不同的信号，例如在颜色和强度方面。

IX.其他添加剂

PCR试剂可进一步包括添加剂，诸如DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)、脱氧核苷酸三磷酸(例如dATP、dCTP、dTTP和dGTP)、盐(例如KCl和MgCl₂)、缓冲液(例如Tris-HCl)、生物防腐剂(例如叠氮化钠)、PCR增强剂(例如甜菜碱、海藻糖等)和抑制剂(例如RNA酶抑制剂)、去污剂(例如Triton X-100、Triton X-114、NP-40、吐温20、吐温80和类似的非离子去污剂)。其他添加剂可包括2-吡咯烷酮、乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、B-羟乙基吡咯烷酮(HEP)、丙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基甲酰胺(MMP)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺、N-甲基乙酰胺(MMA)、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇、甜菜碱、四甲基氯化铵(TMAC)、7-脱氮-2’-脱氧鸟苷、T4基因32蛋白、2-巯基乙醇或甘油。

X.特征曲线的分析

一旦生成一组反应的特征曲线，可通过曲线拟合算法分析这些曲线。可使用例如线性回归、非线性回归(例如Levenberg-Marquardt(LM)方法)来拟合曲线，或者可简单地用平滑线或非平滑线连接来自相邻循环的荧光数据。然后可使用拟合曲线来确定扩增反应在其线性态中的斜率。在这些曲线中的两条或更多条叠加(即，两种或更多种靶标以多重方式存在)的实施方案中，只要曲线处于荧光计的线性动态范围内，就可以独特地鉴别每种靶标。借助反应速率在单个反应中多重辨别多种靶标允许产生多重PCR的另一个正交轴。

在一些情况下，可以通过相对于循环数对信号求导数并生成导数图来分析由本公开内容的方法生成的曲线。在导数图中，平台将显示为零或接近零。正常的饱和扩增将显示为两个零之间的正弦样峰。线性扩增将显示为平台，其中幅度将提供斜率信息并且将与相应引物的浓度成比例。

用于辨别曲线的另一种策略是将它们变换到变换域，从而生成经变换的信号。例如，可将信号变换到频域。可通过任何合适的方法进行变换，该方法包括傅里叶变换、快速傅里叶变换(FFT)、离散时间傅里叶变换(DTFT)、离散时间傅里叶变换(DTFT)、短时傅里叶变换、分数阶傅里叶变换、线调频小波变换或小波变换。通常，作为共形映射的任何特征值变换均可用于提取PCR曲线的固有频率。一旦获得该固有频率，可使用每个反应的频率空间特征(图7)来解析存在哪些靶标。引物和探针的细致设计也将允许解析反应速率信息，从而允许以内在的方式测量PCR反应的质量或效率。此外，该频率空间特征可与已知靶标组合的数据库交叉关联，以确定特定反应中最可能的靶标混合物。

因此，在另一个方面，本公开内容提供了检测样品中的核酸分析物的方法。该方法包括对样品进行扩增反应，测量在所述扩增反应期间生成的信号，将信号变换到频域从而生成经变换的信号，将经变换的信号与参考信号进行比较，以及基于该比较确定分析物是否存在。

参考信号可以是参考信号的数据库中的信号。数据库可包含至少1、5、10、50、100、200、300、400、500种或更多种信号。在一些情况下，数据库包含至多500、400、300、200、100、50、10、5或1种信号。

XI.试剂盒

在一个方面，本公开内容提供了包含上述方法和组合物中公开的任一种或多种元件的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含在一个或多个容器中的本公开内容的组合物。试剂盒可进一步包含如上所述的附加试剂，用于根据本公开内容的方法使用。试剂盒元件可在任何合适的容器中提供，该容器包括但不限于试管、小瓶、烧瓶、瓶、安瓿、注射器等。

本公开内容的示例性试剂盒可包含至少三种巢式引物、至少一对包含限制性引物和过量引物的引物和实时检测剂。试剂盒可进一步包含一种或多种PCR试剂，例如盐、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲液、去污剂、PCR抑制剂、PCR增强剂和核酸聚合酶。试剂盒还可包含添加剂，诸如2-巯基乙醇、2-吡咯烷酮、乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、B-羟乙基吡咯烷酮(HEP)、丙酰胺、N,N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基甲酰胺(MMP)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺、N-甲基乙酰胺(MMA)、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇、甜菜碱、四甲基氯化铵(TMAC)、7-脱氮-2’-脱氧鸟苷、T4基因32蛋白或甘油。试剂盒可另外包含关于使用试剂盒组分以及使用试剂盒中未包含的任何其他试剂的说明书。说明书可包括可实施的改变。

试剂盒的容器通常可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器，组分可置于其中，并且优选地进行适当等分。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，试剂盒通常还可包含第二、第三或其他另外的容器，其他组分可分别置于其中。然而，容器中可包含组分的各种组合。

当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液的形式提供时，所述液体溶液可以是水溶液。然而，试剂盒的组分可以以干粉形式提供。药剂可以以用于单次使用的等分试样的形式提供，或者以可从其获得多次使用(如在许多反应中)的储备液的形式提供。当试剂和/或组分以干粉提供时，可通过添加合适的溶剂来使粉末重建。试剂盒的元件可进一步但不限于以任何合适的量和/或使用任何上述组合(如在相同的试剂盒或相同的容器中)或本领域已知的任何其他合适的组合提供。

药剂可以以能够直接用于本公开内容的方法的形式提供，或者以需要在使用前进行准备的形式提供，诸如对冻干药剂的重建。例如，本文提供的试剂盒中的引物可处于冻干或非冻干状态。在一些实施方案中，试剂盒中提供的至少一种引物是冻干的。在一些情况下，试剂盒中提供的多于一种，例如两种、三种、四种、五种、六种甚至更多种引物处于冻干状态。在一些实例中，本公开内容的试剂盒中含有的所有引物都是冻干的。

在某些实施方案中，试剂盒中过量引物的浓度是限制性引物浓度的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍或1000倍。

在某些实施方案中，试剂盒中过量引物的浓度是限制性引物浓度的至多1000倍、900倍、950倍、850倍、800倍、750倍、700倍、650倍、600倍、550倍、500倍、450倍、400倍、350倍、300倍、250倍、200倍、150倍、100倍、95倍、90倍、85倍、80倍、75倍、70倍、65倍、60倍、55倍、50倍、45倍、40倍、35倍、30倍、25倍、24倍、23倍、22倍、21倍、20倍、19倍、18倍、17倍、16倍、15倍、14倍、13倍、12倍、11倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍。

可调节或改变试剂盒中的引物的长度和序列，使得限制性引物的浓度调节的解链温度高于或等于过量引物的浓度调节的解链点。例如，限制性引物与过量引物的浓度调节的解链温度的差异可以是至少0℃、1℃、1.5℃、2℃、2.5℃、3℃、3.5℃、4℃、4.5℃、5℃、5.5℃、6℃、6.5℃、7℃、7.5℃、8℃、8.5℃、9℃、9.5℃、10℃或更大。在一些实施方案中，限制性引物与过量引物的浓度调节的解链温度的差异可以是至少10℃、9.5℃、9℃、8.5℃、8℃、7.5℃、7℃、6.5℃、6℃、5.5℃、5℃、4.5℃、4℃、3.5℃、3℃、2.5℃、2℃、1.5℃、1℃、0℃或更小。

试剂盒中限制性引物的初始浓度可小于500nM。例如，限制性引物的初始浓度可小于10nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、300nM、350nM、400nM、450nM或500nM。在一些实施方案中，试剂盒中限制性引物的初始浓度可大于500nM。例如，限制性引物的初始浓度可大于500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM、50nM或10nM。

本文提供的试剂盒中的至少一种实时检测剂可以是在分析物的存在下生成信号的任何试剂。在一些情况下，这些试剂是探针。该探针可以是杂交探针。该杂交探针可以是与荧光团和淬灭剂连接的寡核苷酸探针(例如，TAQMAN探针)。

试剂盒可用于检测病原体，如细菌、病毒、真菌或蠕虫。例如，本文提供的试剂盒可用于检测人免疫缺陷病毒、疟原虫、单纯疱疹病毒、登革病毒、肝炎病毒、人乳头瘤病毒、流感病毒、分枝杆菌属、腺病毒科、小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳头多瘤空泡病毒科、多瘤病毒科、弹状病毒科、披膜病毒科、链球菌属、假单胞菌属、志贺氏菌属、弯曲杆菌属、沙门氏菌属、淋病奈瑟氏球菌或埃希氏菌属。

XII.分析技术和仪器

本文提供的方法适用于多种检测方法。例如，可使用测量荧光信号的波长和强度的分析技术来应用该方法。这可通过测量波长谱上的信号强度或者通过使用限制某些波长的光通过从而仅允许某些波长的光到达光探测器的带通滤波器来实现。许多实时PCR和定量PCR仪器包含激发光源和带通滤波器，其能够检测四种颜色(例如，蓝色、绿色、黄色和红色)的荧光信号。因此，使用本领域广泛使用的仪器可容易地应用本公开内容的方法。

所述方法还与终点PCR和数字PCR方法相容。数字PCR方法(例如DROPLET DIGITAL(BIORAD)和DYNAMIC ARRAY(FLUIDIGM))产生多核苷酸拷贝数的高灵敏度定量。本文提供的方法可容易地集成到这些系统中，以通过允许在小液滴或动态阵列中进行多路化(multiplexing)来显著扩大其通量。

在一些情况下，可改变或构造仪器，例如以提供多种波长的另外的激发光源，和/或提供另外的带通滤波器或测定完整光谱的能力。包含另外的激发源将允许激发更多种的荧光团。包含另外的带通滤波器或者对仪器进行能够测定整个光谱的改变或构造允许检测来自荧光团的更多种类的发射。这些技术可用于增加可与本公开内容中描述的方法一起使用的荧光团的数目，从而增加同时检测的分析物的数目。

XIII.系统和软件

本公开内容的方法还可作为系统的一部分来进行。例如，本文所述的方法的一个或多个步骤可通过包含在计算机可读介质上的软件来进行。该软件可用于将在仪器(例如，PCR机器)上进行的测量转换成分析物的存在或不存在。该软件可用于计算生成的特征曲线的线性区域的斜率。该软件还可用于将测量的信号变换到变换域，从而生成经变换的信号。该软件可将经变换的信号与参考信号进行比较，并且基于该比较确定样品中存在的分析物的量。在一些情况下，样品中分析物的测定量可用于推断样品中是否存在所述分析物。

在一个实例中，软件嵌入在进行测量的仪器中。在另一个实例中，软件安装在连接到进行测量的仪器的计算机上。在另一个实例中，软件位于“云”中，即位于另一个计算机可通过网络与其通信的计算机上。这些元件中的每一个均可连接到控制器，该控制器与每个元件通信并协调它们的动作。例如，控制器可启动信号的测量和特征曲线的生成。控制器可执行软件以将信号变换到变换域，从而生成经变换的信号。控制器还可启动所测量的信号或经变换的信号与参考信号的比较。

或者，控制器可操作能够合成适当的探针的寡核苷酸合成仪器。在对仪器上的样品进行分析之后(这也可以是自动化的)，控制器可使用参考信号值处理分析结果。然后，控制器可将这些结果提供给用户。

图8是示出可结合本公开内容的示例性实施方案使用的计算机系统100的示例性架构的框图。如图8中所示，示例性计算机系统可包含用于处理指令的处理器102。处理器的非限制性实例包括：Intel Xeon^TM处理器、AMD Opteron^TM处理器、Samsung 32-bit RISCARM1176JZ(F)-S v1.0^TM处理器、ARM Cortex-A8Samsung S5PC100^TM处理器、ARM Cortex-A8Apple A4^TM处理器、Marvell PXA 930^TM处理器或功能相当的处理器。多个执行线程可用于并行处理。在一些实施方案中，无论是在单个计算机系统中、集群中，还是通过包括多个计算机、蜂窝电话和/或个人数据助理设备的网络的跨系统分布，也均可使用多个处理器或具有多个核的处理器。

如图8中所示，高速缓冲存储器104可连接至或并入处理器102中，以为处理器102最近使用或频繁使用的指令或数据提供高速缓冲存储。处理器102通过处理器总线108与北桥106连接。北桥106通过存储器总线112与随机存取存储器(RAM)110连接，并且管理处理器102对RAM 110的访问。北桥106还通过芯片组总线116与南桥114连接。南桥114进而与外围总线118连接。外围总线可以是例如PCI、PCI-X、PCI Express或其他外围总线。北桥和南桥通常被称为处理器芯片组，并且管理处理器、RAM以及外围总线118上的外围组件之间的数据传送。在一些替代的架构中，北桥的功能可被并入处理器中，而不是使用单独的北桥芯片。

在一些实施方案中，系统100可包含附接到外围总线118的加速器卡122。加速器可包括现场可编程门阵列(FPGA)或用于加速某些处理的其他硬件。例如，加速器可用于自适应数据重组或评价在扩展集处理中使用的代数表达式。

软件和数据被存储在外部存储124中，并且可被加载到RAM110和/或高速缓冲存储器104中以供处理器使用。系统100包括用于管理系统资源的操作系统；操作系统的非限制性实例包括：Linux、Windows^TM、MACOS^TM、BlackBerry OS^TM、iOS^TM和其他功能相当的操作系统，以及用于根据本公开内容的示例性实施方案管理数据存储和优化的、运行于操作系统之上的应用软件。

在该实例中，系统100还包括与外围总线连接的网络接口卡(NIC)120和121，以用于向外部存储如网络附加存储(NAS)和可用于分布式并行处理的其他计算机系统提供网络接口。

图9为示出具有多个计算机系统202a和202b、多个蜂窝电话和个人数据助理202c以及网络附加存储(NAS)204a和204b的网络200的示意图。在示例性实施方案中，系统202a、202b和202c可管理数据存储并优化对网络附加存储(NAS)204a和204b中存储的数据的数据访问。可将数学模型用于数据，并且使用在计算机系统202a和202b以及蜂窝电话和个人数据助理系统202c之间的分布式并行处理进行评价。计算机系统202a和202b以及蜂窝电话和个人数据助理系统202c还可提供并行处理，以供存储在网络附加存储(NAS)204a和204b中的数据进行自适应数据重组。图9仅示出了示例，并且可结合本公开内容的各种实施方案使用多种其他计算机架构和系统。例如，可使用刀片服务器提供并行处理。处理器刀片可通过背板连接以提供并行处理。存储也可与背板连接或通过单独的网络接口连接为网络附加存储(NAS)。

在一些示例性实施方案中，处理器可维持单独的存储器空间，并通过网络接口、背板或其他连接器传送数据以供由其他处理器进行并行处理。在其他实施方案中，一些或全部处理器可使用共享虚拟地址存储器空间。

图10为根据示例性实施方案使用共享虚拟地址存储器空间的多处理器计算机系统300的框图。该系统包含可访问共享存储器子系统304的多个处理器302a-f。该系统在存储器子系统304中包含多个可编程硬件存储器算法处理器(MAP)306a-f。每个MAP 306a-f可包含存储器308a-f以及一个或多个现场可编程门阵列(FPGA)310a-f。MAP提供可配置的功能单元，并且可向FPGA 310a-f提供特定算法或算法部分以供与相应处理器紧密配合进行处理。例如，在示例性实施方案中，MAP可用于评估关于数据模型的代数表达式并执行自适应数据重组。在该实例中，为达到这些目的，每个MAP均可被所有处理器全局访问。在一种配置中，每个MAP可使用直接存储器访问(DMA)来访问相关联的存储器308a-f，从而使其与相应的微处理器302a-f独立地且异步地执行任务。在该配置中，MAP可将结果直接提供给另一个MAP以供流水操作和算法的并行执行。

上述计算机架构和系统仅是示例性的，并且可结合示例性实施方案使用多种其他计算机、蜂窝电话和个人数据助理架构和系统，包括使用通用处理器、协同处理器、FPGA和其他可编程逻辑设备的任意组合的系统，片上系统(SOC)，专用集成电路(ASIC)，以及其他处理和逻辑元件。在一些实施方案中，计算机系统的全部或部分可以以软件或硬件实现。任何种类的数据存储介质均可与示例性实施方案结合使用，包括随机存取存储器、硬盘驱动器、闪速存储器、磁带驱动器、磁盘阵列、网络附加存储(NAS)以及其他局部或分布式数据存储设备和系统。

在示例性实施方案中，可使用在上述任一种或其他计算机架构和系统上执行的软件模块来实现计算机系统。在其他实施方案中，该系统的功能可部分地或完全地在固件、可编程逻辑设备如图10所示的现场可编程门阵列(FPGA)、片上系统(SOC)、专用集成电路(ASIC)或其他处理和逻辑元件中实现。例如，可通过使用硬件加速卡，如图8所示的加速卡122，采用硬件加速来实现集处理器和优化器。

XIV.服务

本文提供的方法也可作为服务来执行。例如，服务提供商可获得客户希望分析的一系列分析物的身份。然后，服务提供商可通过本文所述的任何方法对待检测的每种分析物进行编码，并向客户提供适当的试剂用于测定。客户可进行测定并将结果提供给服务提供商以供解码。然后，服务提供商可将解码的结果提供给客户。客户还可通过与本地(在客户位置处)或远程(例如，在通过网络可到达的服务器上)安装的软件交互来编码分析物、生成探针和/或解码结果。示例性的客户包括临床实验室、医生、制造商等。

实施例

实施例1：常规材料和方法

1.DNA序列、引物和探针

用于以下实施例的寡核苷酸的合成由INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES(Coralville,Iowa)进行。选择来自Los Alamos National Laboratory参考序列的HSV-1和HSV-2序列用于示例性研究。

以1.7μM的浓度用TE缓冲液重建198-聚体HSV-2寡核苷酸。分别以100μM和1μM的浓度用TE缓冲液重建针对HSV-2寡核苷酸的正向和反向引物A。分别以40μM和1μM的浓度用TE缓冲液重建针对HSV-2寡核苷酸的正向和反向引物B。分别以3μM和1μM的浓度用TE缓冲液重建针对HSV-2寡核苷酸的正向和反向引物C。合成TAQMAN有义探针(“HSV-2_探针l”)，其在5’端具有6-FAM荧光团且在3’端具有BHQ-1淬灭剂。

以1.5μM的浓度用TE缓冲液重建199-聚体HSV-1寡核苷酸。分别以1μM和100μM的浓度用TE缓冲液重建针对HSV-1寡核苷酸的正向和反向引物D。分别以1μM和40μM的浓度用TE缓冲液重建针对HSV-1寡核苷酸的正向和反向引物E。分别以1μM和3μM的浓度用TE缓冲液重建针对HSV-1寡核苷酸的正向和反向引物F。合成TAQMAN有义探针(“HSV-1_探针l”)，其在5’端具有6-FAM荧光团且在3’端具有BHQ-1淬灭剂。合成另外的TAQMAN有义探针(“HSV-1_探针2”)，其在5’端具有Cy3且在3’端具有BHQ-2。

2.聚合酶链反应

在ROCHE 480LIGHTCYCLER仪器中进行所有PCR反应。进行45次热循环，在95℃下进行60秒的热启动。变性、退火和延伸的循环条件分别是95℃45秒、65℃ 50秒和70℃ 60秒。每个实验一式五份进行，反应体积为15μL。在每次退火步骤后，在以下通道中获得荧光测量值：483nm至533nm(FAM)、523nm至568nm(Cy3)、558nm至610nm(ROX)和615nm至670nm(Cy5)。

实施例2：来自病原体的多核苷酸标志物的检测

本实施例描述了对来自HSV-1和HSV-2的多核苷酸的检测。

1.PCR反应组分

使用表1中所述的试剂装配三个PCR反应。

表1.三个PCR反应的试剂。

以任意荧光单位(AFU)测量由PCR反应1-3产生的信号，并作为循环数的函数绘制。通过单重PCR反应(例如反应1和2)生成的典型曲线示于图5中。

由本公开内容的多重PCR反应(例如，来自反应3，其中单个多重反应中存在两种靶标)生成的典型曲线示于图6中。通过曲线拟合算法分析生成的曲线。这些算法计算反应在其线性区域中的斜率。只要曲线处于荧光计的线性动态范围内，就可以独特地鉴别这些多重反应中存在的每种靶标。

实施例3：特征曲线的生成

图5示出了由正常扩增区域分隔开的三个连续平台。这样的绘图可根据起始试剂通过不同的反应生成。

(i)三种独立的序列A、B和C同时存在，并用单一嵌入染料和对称引物通过标准PCR进行处理，该对称引物针对最大指数性能进行优化，但以使它们在不同温度下杂交的方式进行设计。以这样的方式对反应进行编程，使其在序列A的引物的杂交温度下运行循环的前三分之一，该温度对于B和C的引物而言太高而不能杂交。然后在适合于B的引物杂交的温度下运行循环的中间三分之一，但是该温度对于C的引物而言仍然太热。最后，在对于C的杂交而言足够低的温度下运行循环的最后三分之一。由于在循环的前三分之一存在正常扩增，结论是A存在。由于在循环的中间三分之一存在正常扩增，结论是B存在。由于在循环的最后三分之一存在正常扩增，结论是C存在。因此，该曲线在该设置下解码为对于A、B和C均为阳性结果。如果缺少任何平台，我们会得出缺失各自的序列的结论。

(ii)多重PCR反应包含针对序列#1的两对对称引物A和B的巢式组以及针对序列#2的引物C的正常组。序列#1的外引物A具有最高的解链温度，其次是内引物序列#1B，再次是序列#2的引物C。PCR程序在仅允许外引物组与序列#1杂交的杂交温度下运行前三分之一，导致序列#1的外引物组进行正常对称指数扩增。在循环的前三分之一结束时反应饱和。然后程序降低杂交温度，使得内部对杂交，但该温度对于序列#2的引物而言仍然太热。因此，中间三分之一观察到内引物的正常对称指数扩增。最后，在循环的最后三分之一中，温度足够低，使得序列#2进行对称的指数扩增，并且在反应结束时饱和。观察曲线和试剂设置，得出两种序列都存在的结论。

(iii)三对巢式引物A、B和C用于相同的序列。图中的A、B和C表明测定的正确工作和序列的成功检测。与仅使用一个引物对相比，使用三对巢式引物可提供增加的可靠性。例如，如果使用单对引物，并且该引物错误地在另一个序列上(例如在基因组DNA中)引发，扩增仍然会发生，并且嵌入染料会进行报告，从而导致假阳性。当使用巢式引物对时，这也许是不可能的，因为并非所有平台都将存在。例如，如果序列不存在但最外面的引物错误引发，则A将被视为正常，但B和C将不会发生，因此结果将为阴性。

图6可以用与上文关于图5所述的非常类似的术语来解释，但扩增是线性不对称的，因此通过不对称选择的引物对进行相应的编码。A与D之间的差异是限制性引物的浓度，其可用作编码方法。例如，如果曲线看起来像DEF而不是ABC，则使用相同的多重测定检测到了不同的一组靶序列。

实施例4：通过基变换(basis transformation)对曲线的辨别

使用基变换对由类似于实施例2中的测定的3靶标多重qPCR测定生成的qPCR信号进行变换，以获得反应的频率空间特征。这些频率空间特征可用于解析存在哪些靶标。在本实施例中，靶标1具有在qPCR反应重复中可再现的独特特征。该靶标由仅对靶标1特定的特定(高度，宽度)元组(tuple)来鉴别。对于这种多重反应化学，单峰特征(0.096,14)鉴别靶标1。此外，靶标2具有与靶标1不同的特征。当该qPCR反应化学表明靶标2存在时，观察到的动力学特征是具有(0.01,7)和(0.1,10)的(高度，宽度)元组的双峰曲线。此外，当该多重测定表明靶标1和2存在于qPCR反应中时，生成的动力学特征是独特且高度可再现的。在本实施例中，特征是具有(0.018,7)和(0.09,12)的(高度，宽度)元组的双峰。通过本实施例的测定组，我们证明了使用基变换的qPCR信号对靶标进行明确辨别的原理验证。从本公开内容的多重PCR反应获得的另一典型频率空间特征示于图7中。

实施例5：一种或多种核酸分析物的检测

本实施例说明了用于检测样品中的一种或多种核酸分析物的方法。

在一个方面，检测样品中靶核酸分析物的存在或不存在。对样品进行扩增反应，并测量在扩增反应期间生成的信号。从测量的信号生成动力学特征，将该动力学特征与参考特征进行比较，以确定生成的动力学特征是否对应于参考特征。生成的动力学特征与参考特征的比较允许检测样品中靶核酸分析物的存在或不存在。例如，如果生成的动力学特征对应于参考特征，则确定样品中存在核酸分析物。相反，如果生成的动力学特征不对应于参考特征，则确定核酸分析物不存在。

在另一个方面，检测样品中多种靶核酸分析物中的每一种的存在或不存在。将引物组添加至样品，其包含至少两个引物对。至少一个引物对包含限制性引物，并且每个引物对限定一种待扩增靶核酸分析物的区域。对样品进行扩增反应，并测量在扩增反应期间生成的信号。使用所测量的信号确定多种靶核酸分析物中的每一种的存在或不存在。在一些方面，限制性引物的浓度相对于扩增反应中的其他引物可以足够低，以便影响生成的信号。例如，在将生成的信号绘制为扩增曲线的情况下，限制性引物的浓度可以足够低，以使得生成的扩增曲线不是S形的。

在又一个方面，检测样品中多种靶核酸分析物中的两种或更多种的存在或不存在。将第一和第二引物对添加至样品，每个引物对限定核酸分析物的区域并分别具有第一退火温度和第二退火温度。对样品进行热循环扩增反应。热循环扩增反应包括一组温度循环。进行至少一个温度循环，其具有最低温度即退火温度，所述最低温度不高于对应于第一退火温度的第一引物对的退火温度，但是高于第二引物对的退火温度即第二退火温度。进行至少一个其他温度循环，其具有最低温度即退火温度，所述最低温度不高于第二引物对的退火温度即第二退火温度。测量在扩增反应期间生成的信号，并且使用所测量的信号确定多种靶核酸分析物中的两种或更多种中各自的存在或不存在。

除非上下文另有要求，否则在本说明书和权利要求书中，与“包含”、“含有”或“特征在于”可互换使用的词语“包括”及其变体(如“包含”)是包含性或开放式语言，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。短语“由……组成”不包括权利要求中未指明的任何要素、步骤或组分。短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指明的材料或步骤以及不会实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些。本公开内容考虑到对应于这些短语中的每一个的范围的本发明组合物和方法的实施方案。因此，包含所列举的要素或步骤的组合物或方法涉及其中所述组合物或方法基本上由那些要素或步骤组成或者由那些要素或步骤组成的特定实施方案。

整个本说明书中提及的“一个实施方案”或“实施方案”或“方面”意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施方案中。因此，整个本说明书在各个位置出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定指同一实施方案。此外，特定特征、结构或特性可在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合。

上述各种实施方案可进行组合以提供进一步的实施方案。根据以上详细描述，可对实施方案进行这些和其他改变。通常，在以下权利要求中，所用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中公开的具体实施方案，而应该解释为包括所有可能的实施方案以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围。因此，权利要求不受本公开内容的限制。

虽然本文已显示并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅通过示例的方式来提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，本文描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。旨在由以下权利要求来限定本发明的范围，以及旨在由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (33)

1.一种检测样品中靶核酸分析物的存在或不存在的方法，所述方法包括：

a)对所述样品进行扩增反应；

b)测量在所述扩增反应期间生成的信号并由所测量的信号生成动力学特征；以及

c)将所生成的动力学特征与参考特征进行比较，并确定所述生成的动力学特征是否对应于所述参考特征，从而检测所述样品中靶核酸分析物的存在或不存在。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述动力学特征包括选自电磁信号、波长和荧光发射信号的信号。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述动力学特征被绘制为曲线。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述参考特征对应于通过在一组受限扩增参数的一个或多个成员下扩增所述靶核酸分析物而生成的动力学特征，该组受限扩增参数包括以下参数的任何组合：(i)正向和/或反向引物浓度的范围；(ii)聚合酶浓度的范围；(iii)聚合酶类型；(iv)核苷酸浓度的范围；(v)发色团浓度；和(vi)发色团类型；(vii)热循环数；(viii)热循环速率；(ix)一种或多种热循环阶段温度；和(x)一种或多种热循环阶段时间长度；(xi)靶标特异性分子探针的范围；(xii)与一种或多种靶标特异性探针相关的引物；以及(xiii)一种或多种酶辅因子的浓度。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述扩增反应在一个或多个所述受限扩增参数内进行。

6.如权利要求3所述的方法，其中所述曲线的指数区域、线性区域和平台区域中的至少一个在至少4个热循环或至少8个热循环内发生。

7.一种检测样品中多种靶核酸分析物中的每一种的存在或不存在的方法，所述方法包括：

a)将引物组添加至所述样品，所述引物组包含至少两个引物对，所述引物对中的至少一对包含限制性引物，并且每个引物对限定一种待扩增的所述靶核酸分析物的区域；

b)对所述样品进行扩增反应；

c)测量在所述扩增反应期间生成的信号；以及

d)基于所测量的信号确定所述多种靶核酸分析物中的每一种是否存在。

8.如权利要求7所述的方法，其中步骤c)进一步包括由所测量的信号生成动力学特征的步骤，并且其中步骤d)进一步包括以下步骤

将所述动力学特征与参考特征进行比较，所述参考特征对应于通过用所述引物组扩增所述多种靶核酸分析物中的一种或多种而生成的动力学特征，从而进行确定。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述引物组包含一种正向引物和两种反向引物或者两种正向引物和一种反向引物。

10.如权利要求7所述的方法，其中所述引物组包含两种或更多种巢式引物。

11.如权利要求7所述的方法，其中通过激发与扩增产物结合的分子来生成所述信号。

12.如权利要求7所述的方法，其中

(A)所述引物组包含第一和第二引物对，所述第一引物对具有第一退火温度且所述第二引物对具有低于所述第一退火温度的第二退火温度，并且所述第一引物对限定一种所述靶核酸分析物的区域，所述第二引物对限定另一种所述核酸分析物的区域；

并且其中

(B)所述扩增反应包括一组温度循环的热循环，该组温度循环包含具有(i)不高于所述第一退火温度且(ii)高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环，所述反应进一步包含具有不高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个其他温度循环。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述扩增反应包含具有不高于所述第一退火温度且高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环，随后是具有不高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述扩增反应包含具有不高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环，随后是具有(x)不高于所述第一退火温度且(y)高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环。

15.如权利要求7所述的方法，其中步骤c)进一步包括由所测量的信号生成动力学特征的步骤，并且其中步骤d)进一步包括将所述动力学特征与参考特征进行比较的步骤，所述参考特征对应于当用所述引物组通过包含该组温度循环的热循环反应扩增所述多种靶核酸分析物中的一种或多种时生成的信号，从而进行确定。

16.如权利要求12所述的方法，其中所述限制性引物以充分低于非限制性引物浓度的浓度存在，以生成特征性动力学特征。

17.如权利要求12所述的方法，其中所述第一和/或第二退火温度由所述限制性引物确定。

18.一种检测样品中多种靶核酸分析物中的两种或更多种的存在或不存在的方法，所述方法包括：

a)将包含第一和第二引物对的引物组添加至样品，所述第一引物对具有第一退火温度且所述第二引物对具有低于所述第一退火温度的第二退火温度，并且所述第一引物对限定一种所述靶核酸分析物的区域，所述第二引物对限定另一种所述核酸分析物的区域；

b)对所述样品进行热循环扩增反应，所述反应包含一组温度循环，该组温度循环包括具有(i)不高于所述第一退火温度且(ii)高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环，所述反应进一步包含具有不高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个其他温度循环；

c)测量在所述扩增反应期间生成的信号；以及

d)基于所生成的信号确定所述两种或更多种核酸分析物的存在或不存在。

19.如权利要求18所述的方法，其中步骤c)进一步包括由所测量的信号生成动力学特征的步骤，并且其中步骤d)进一步包括以下步骤

将所述动力学特征与参考特征进行比较，所述参考特征对应于当用所述引物组通过包括该组温度循环的热循环反应扩增所述多种靶核酸分析物中的一种或多种时生成的信号，从而进行确定。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述第一和第二引物对包含一种正向引物和两种反向引物。

21.如权利要求18所述的方法，其中所述引物组包含至少一对巢式引物。

22.如权利要求18所述的方法，其中所述扩增反应包含具有不高于所述第一退火温度且高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环，随后是具有不高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环。

23.如权利要求18所述的方法，其中所述扩增反应包含具有不高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环，随后是具有(x)不高于所述第一退火温度且(y)高于所述第二退火温度的最低温度的至少一个温度循环。

24.如权利要求18所述的方法，其中至少一个所述引物对具有限制性引物，所述限制性引物具有等于或高于非限制性引物的浓度调节的解链温度。

25.如权利要求18所述的方法，其中所述方法包括使用n个引物对检测n种靶核酸分析物的存在，并且其中每个温度循环的最低温度低于先前温度循环的最低温度。

26.如权利要求18所述的方法，其中引物对中的一种或多种引物与抗体连接。

27.一种检测核酸分析物的方法，其包括：

a.对样品进行巢式不对称扩增反应，其中所述巢式不对称扩增反应包含：

至少三种巢式引物，其中所述至少三种巢式引物中的至少一对引物包含限制性引物和过量引物；

b.测量在所述巢式不对称扩增反应期间生成的信号；以及

c.基于所述信号确定所述分析物是否存在。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述至少三种巢式引物与单一分析物结合。

29.如权利要求27所述的方法，其中所述限制性引物具有等于或高于所述过量引物的浓度调节的解链温度。

30.如权利要求27所述的方法，其中所述分析物由选自来自所述信号的值和来自附加信号的值中的至少一种附加值编码。

31.如权利要求27所述的方法，其中所述至少一种附加值选自福斯特共振能量转移(FRET)发射强度、FRET发射波长、电化学信号、化学发光波长、化学发光强度、荧光漂白速率和化学发光漂白速率，其中所述至少一种附加值是福斯特共振能量转移(FRET)发射强度。

32.一种测定核酸分析物的量的方法，其包括：

a.对样品进行扩增反应；

b.测量在所述扩增反应期间生成的信号；

c.将所述信号变换到频域，从而生成经变换的信号；

d.将来自所述经变换的信号的值与参考信号的值进行比较；以及

e.基于所述比较测定所述分析物的所述量。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述变换通过选自傅里叶变换、快速傅里叶变换、离散傅里叶变换、离散时间傅里叶变换和小波变换的方法来进行，其中所述方法检测多种分析物的存在或不存在，并且其中所述参考信号在参考信号的数据库中。