JP4040087B2 - Ｐｃｒ増幅とハイブリダイゼーションプロービングアッセイとを組み合わせた方法およびそのための試薬 - Google Patents
Ｐｃｒ増幅とハイブリダイゼーションプロービングアッセイとを組み合わせた方法およびそのための試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4040087B2 JP4040087B2 JP53330996A JP53330996A JP4040087B2 JP 4040087 B2 JP4040087 B2 JP 4040087B2 JP 53330996 A JP53330996 A JP 53330996A JP 53330996 A JP53330996 A JP 53330996A JP 4040087 B2 JP4040087 B2 JP 4040087B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- oligonucleotide
- probe
- pcr
- polymerase
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 65
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title abstract description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 96
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims abstract description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 36
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 35
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 claims abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 15
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 13
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 claims description 3
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 17
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 abstract description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract description 8
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 abstract description 8
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 5
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 41
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 238000011160 research Methods 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 6
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 5
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 3
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009015 Human TaqMan MicroRNA Assay kit Methods 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- SLLFVLKNXABYGI-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-benzoxadiazole Chemical compound C1=CC=C2ON=NC2=C1 SLLFVLKNXABYGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGGCPIFVRJFAKF-UHFFFAOYSA-N 1-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 BGGCPIFVRJFAKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- PAOQTZWNYMMSEE-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxycarbonylbenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C(C(=CC=1)C([O-])=O)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O PAOQTZWNYMMSEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-ULQXZJNLSA-N 4-amino-1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-tritiopyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C([3H])=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-ULQXZJNLSA-N 0.000 description 1
- UKLNSYRWDXRTER-UHFFFAOYSA-N 7-isocyanato-3-phenylchromen-2-one Chemical compound O=C1OC2=CC(N=C=O)=CC=C2C=C1C1=CC=CC=C1 UKLNSYRWDXRTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-N 8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C=12C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=CC=CC=1NC1=CC=CC=C1 FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000212384 Bifora Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000003844 DNA helicases Human genes 0.000 description 1
- 108090000133 DNA helicases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 229940123066 Polymerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N Stilbene Natural products C=1C=CC=CC=1/C=C/C1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- FDSCVHSDEIYRLH-UHFFFAOYSA-N acridine;9-isothiocyanatoacridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21.C1=CC=C2C(N=C=S)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 FDSCVHSDEIYRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000007850 in situ PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 150000005002 naphthylamines Chemical class 0.000 description 1
- 125000005184 naphthylamino group Chemical group C1(=CC=CC2=CC=CC=C12)N* 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N phosphoramidous acid Chemical group NP(O)O SXADIBFZNXBEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N stilbene Chemical compound C=1C=CC=CC=1C=CC1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021286 stilbenes Nutrition 0.000 description 1
- 210000004895 subcellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 239000001018 xanthene dye Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
背景
本発明は、一般に、核酸増幅およびプロービングの分野に関し、そしてより詳細には、単一の試薬混合物を用いてPCRおよびプローブハイブリダイゼーションを行なうための方法および組成物に関する。
核酸増幅技術は、遺伝物質の研究のための強力な手段を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、特に、クローニング、遺伝子発現の分析、DNA配列決定、遺伝的マッピング、薬物の発見、犯罪の科学捜査などにおいて適用が見い出される、非常に重要な手段となっている。例えば、Innisら、PCR Protocols A guide to Methods and Applications，Academic Press，San Diego（1990）4,683,195号、4,683,202号。
多数の重要な適用に関して、標的核酸配列を増幅することに加えて、核酸ハイブリダイゼーションプローブ（すなわち、標的配列の全てまたは一部に相補的である、標識された１本鎖ポリヌクレオチド）を用いる処理により、このような配列をさらに特徴づけることが所望される（例えば、Nucleic Acid Hybridization，Hamesら編、IRL Press，Oxford（1985））。プローブハイブリダイゼーションは、通常のPCR増幅を上回るさらなる配列選択性を提供し得、そして独立した様式で、標的核酸配列内の複数の配列部位の特徴づけを可能にする。
伝統的には、PCRおよびプローブハイブリダイゼーションプロセスは、別の作業として行われている。しかし、PCR試薬およびプロービング試薬の両方を含有する単一の試薬混合物を用いて、PCRおよびプローブハイブリダイゼーション反応の両方を組み合わせた様式で行うことが非常に所望される。PCRおよびプロービングプロセスを組み合わせることによって得られる利点がいくつかある：（i）単一の試薬添加工程が必要とされるのみであり、これにより、反応チューブを開ける必要なく、この組み合わされた反応を進行させることが可能であり、これにより、サンプルの混同およびサンプルの汚染の機会を減少させる；（ii）必要とされる試薬がより少量である；（iii）必要とされる試薬添加工程がより少なく、自動化をより容易にする；そして（iv）インサイチュの方法の場合、熱循環の間に細胞サンプルの完全性を保護するのに使用されるサンプル封じ込め（containment）アセンブリを分解する必要がない。
単一の反応において、PCRをハイブリダイゼーションプロービングと組み合わせた、１つの存在する方法は、「Taqman」として知られる技術である。例えば、Hollandら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:7276-7280（1991）。Taqmanアッセイでは、３'末端で伸長性がなく、５'末端で標識され、かつ標的配列内でハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを、PCR反応内に導入する。増幅の間のPCR反応産物鎖へのプローブのハイブリダイゼーションは、PCRポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に適切な基質を生成する。従って、増幅の間、ポリメラーゼ酵素の５'→３'エキソヌクレアーゼ活性は、プローブを、より小さなフラグメントに分解し、このフラグメントは、分解されないプローブとは区別され得る。従来の方法を上回る顕著な改良の一方、Taqmanアッセイは、その有用性を制限する多数の重要な欠点を有する。これらの欠点には、（i）PCRに用いられるポリメラーゼ酵素は、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有さなければならないという必要条件、（ii）この５'→３'エキソヌクレアーゼ活性は、色素で標識されたヌクレオチドを効率的に消化し得なければならないこと、そして（iii）検出可能な消化産物は小さく、急速に拡散可能な種であり、これは、インサイチュの方法に適用される場合、標的配列を空間的に位置づける能力に影響を与え得ることが含まれる。
単一の反応においてPCRをプロービングと組み合わせる第２の存在する方法は、Higuchiら、Biotechnology，10:413-417（1992）に開示される方法である。この方法では、臭化エチジウムをPCR反応に添加する。そして、２本鎖DNAの存在下で臭化エチジウムの蛍光は増加するので、蛍光の増加は２本鎖PCR産物の蓄積に相関し得る。しかし、この方法は、PCR反応より優れた配列特異性を全く提供せず、かつ標的核酸配列内の単一の配列部位の検出に制限される。
増幅およびプロービング工程の組み合わせを可能にする第３の方法は、ヨーロッパ特許出願公開公報第0601889A2号のBagwellの方法である。Bagwellの方法におけるプローブは、（i）標的核酸に相補的なセグメント、および（ii）１つ以上のヘアピンを形成し得るセグメントを有するヌクレオチド配列を含む。このプローブはまた、共有結合した蛍光物質および消光物質の分子を含み、これは、ヘアピンが形成された場合に、蛍光物質および消光物質が、それらの間の共鳴エネルギーの転移を可能にするように極めて十分接近するように配置される。この方法は、可能なプローブ配列が、ヘアピン構造を形成し得るプローブ配列に制限されるという重大な欠点を有する。さらに、プローブ-標的結合の速度論および熱力学は、ヘアピン構造の存在により、好ましくない影響を受ける。
要旨
本発明は、一般に、単一の試薬を用いる単一の反応容器中における、増幅および増幅された核酸標的配列のハイブリダイゼーションプローブ検出の組み合わせのために有用な方法および試薬の本発明者らの発見に関する。
本発明の１つの目的は、増幅および増幅した標的配列のプローブ検出のための方法および試薬を提供することであり、ここで、増幅およびプロービングの工程は組み合わせれた様式で行われ、その結果、増幅工程後の試薬の添加は必要とされない。
本発明のさらなる目的は、増幅、および細胞または組織切片内に位置する増幅された標的配列のプローブ検出のための方法および試薬を提供することであり、ここで、増幅工程とプロービング工程との間で封じ込めアセンブリを分解する必要がない。
本発明の別の目的は、増幅および増幅された標的配列のプローブ検出のための方法および試薬を提供することであり、ここで、増幅工程およびプロービング工程の両方で、単一の試薬混合物が用いられる。
本発明のさらなる目的は、増幅、および細胞または組織切片内に位置する増幅された標的配列のプロービングのための方法および試薬を提供することであり、ここで、増幅工程とプロービング工程との間で洗浄工程は必要とされない。
本発明の別の目的は、上記の方法における使用のためのプローブ組成物を提供することであり、このプローブ組成物は、２本鎖状態（例えば、相補的標的配列にハイブリダイズした）であるか、または１本鎖状態であるかに依存して検出可能に異なる蛍光特性を有する。
本発明のなお別の目的は、ポリメラーゼ酵素の５'→３'エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性であるオリゴヌクレオチドプローブを提供することである。
本発明の別の目的は、標識されたプローブを提供することであり、ここで、検出時に、この標識は大きな、ゆっくりと拡散する種（すなわち、プローブのサイズ以上のサイズを有する種）に付着される。
本発明のさらなる目的は、２本鎖状態と１本鎖状態との間で差別的なシグナルを提供するためにヘアピン構造を必要としないプローブを提供することである。
本発明の別の目的は、増幅および増幅された標的配列のプローブ検出のための方法および試薬を提供することであり、ここで、ポリメラーゼは、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有する必要はない。
本発明のなお別の目的は、増幅および増幅された標的配列のプローブ検出のための方法および試薬を提供することであり、ここで、複数の配列部位が、単一の標的配列内で検出され得る。
本発明のさらに別の目的は、上記の方法の実施のために有用な種々の試薬キットを提供することである。
本発明の上記の目的および他の目的は、１つの局面において、標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドプローブによって達成される。このオリゴヌクレオチドは、５'末端をポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性による消化を受けないようにされ、そして３'末端をポリメラーゼの５'→３'伸長活性を受けないように改変される。さらに、このオリゴヌクレオチドプローブはオリゴヌクレオチドの第１の末端に付着した蛍光物質分子、およびこのオリゴヌクレオチドの第２の末端に付着した消光物質分子を含み、その結果、オリゴヌクレオチドプローブが、１本鎖状態である場合は常に、消光物質分子が蛍光物質分子の蛍光を実質的に消光させ、そしてオリゴヌクレオチドプローブが２本鎖状態である場合は常に、蛍光物質は実質的に消光されない。あるいは、蛍光物質と消光物質とは、少なくとも18ヌクレオチドにより隔てられる。
第２の局面では、本発明は、PCR増幅およびハイブリダイゼーションプロービングを組み合わせて行うための第１の方法を提供する。この方法では、標的核酸配列をPCR試薬と接触させる。このPCR試薬は、少なくとも２つのPCRプライマー、ポリメラーゼ酵素、および上記の本発明のオリゴヌクレオチドプローブを含む。次いで、この混合物を、熱循環に供する。この熱循環は、PCR試薬によって特定された標的核酸配列を増幅するために十分である。
第３の局面では、本発明は、PCR増幅およびハイブリダイゼーションプロービングを組み合わせて行うための第２の方法を提供し、ここで、標的核酸配列をPCR試薬と接触させる。このPCR試薬は、少なくとも２つのPCRプライマーおよび全ての５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠損したポリメラーゼ酵素、およびオリゴヌクレオチドプローブを含む。オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドの第１の末端に付着した蛍光物質分子およびオリゴヌクレオチドの第２の末端に付着した消光物質分子を含み、その結果、このオリゴヌクレオチドプローブが１本鎖状態である場合は常に、消光物質分子が蛍光物質分子の蛍光を実質的に消光させ、そしてこのオリゴヌクレオチドプローブが２本鎖状態である場合は常に、蛍光物質は実質的に消光されない。さらに、プローブの３'末端は、ポリメラーゼの５'→３'伸長活性を受けないようにされている。標的核酸配列、オリゴヌクレオチドプローブ、およびPCR試薬は、PCR試薬で特定された標的核酸配列を増幅するのに十分な熱循環に供される。
１つの好ましい実施態様では、全ての５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠損しているポリメラーゼ酵素を必要とするよりもむしろ、エキソヌクレアーゼ活性インヒビターを反応物に添加する。このインヒビターは、プローブのハイブリダイゼーション温度でポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を阻害するのに十分である。
第２の好ましい実施態様では、全ての５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠損しているポリメラーゼ酵素を必要とするよりもむしろ、またはエキソヌクレアーゼ活性インヒビターを添加するよりもむしろ、プローブを検出する前に、ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を非活性化させる。
【図面の簡単な説明】
図１は、第１の好ましい、PCRとプローブハイブリダイゼーションとを組み合せた方法の概略図を示す。ここで、プローブの融解温度（Tm）とPCR重合化工程の反応温度との間の温度差を用いて、プローブが、PCR重合化工程およびプローブの消化に干渉するのを防ぐ。
図２は、第２の好ましい、PCRとプローブハイブリダイゼーションとを組み合せた方法の概略図を示す。ここで、ストランドディスプレーサー（strand displacer）を用いて、プローブが、PCR重合化工程およびプローブの消化に干渉するのを防ぐ。
好ましい実施態様の説明
ここで、本発明の好ましい実施態様について詳細に言及する。本発明を、好ましい実施態様に関して記載するが、このことは本発明をこれらの実施態様に限定することを意図するものではないことが理解される。それどころか、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定される発明に含まれ得る代替物、改変物、および等価物を含むことが意図されている。
１．PCRおよびインサイチュPCR
本明細書中で使用される場合、用語「PCR試薬」は、標的核酸配列を除く、PCRプロセスを実行するために必要とされる化学薬品をいう。これらの化学薬品は、一般的に、以下の５つのクラスの成分からなる：（i）水性緩衝物、（ii）水溶性マグネシウム塩、（iii）少なくとも４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）、（iv）オリゴヌクレオチドプライマー（通常、それぞれの標的配列に対して２つのプライマー、その配列は、二本鎖標的配列の２つの相補鎖の５'末端を規定する）、および（v）ポリヌクレオチドポリメラーゼ、好ましくはDNAポリメラーゼ、より好ましくは熱安定性DNAポリメラーゼ（すなわち、少なくとも10分間の合計時間の間、その活性の約半分より多くを失うことなく、90℃と100℃との間の温度に耐え得るDNAポリメラーゼ）。
４種の通常のdNTPは、チミジン三リン酸（dTTP）、デオキシアデノシン三リン酸（dATP）、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）、およびデオキシグアノシン三リン酸（dGTP）である。これら通常の三リン酸は、通常の４種の塩基と同様にWatson-Crick塩基対合する塩基アナログを含むdNTP（例えば、デオキシウリジン三リン酸（dUTP））で補充または置換され得る。
「インサイチュPCR」は、特定の増幅された核酸が、標的核酸配列を元々含んでいた細胞または下位の細胞構造内に実質的に含まれるように、固定された細胞において実行されるPCR増幅をいう。細胞は、水性懸濁液中にあっても、または組織サンプルの部分（例えば、組織化学的切片または細胞化学的スメア）であってもよい。本明細書中で使用される場合、用語「組織化学的切片」は、凍結または化学的に固定され、ワックスまたはプラスチック中に包埋されることにより固められ、薄板（代表的には、数ミクロンの厚さ）にスライスされ、そして固体支持体（例えば、顕微鏡スライド）に付着された生物学的組織の固体サンプルをいい、そして用語「細胞化学的スメア」は、化学的に固定されそして顕微鏡スライドに付着された細胞（例えば、血球）の懸濁物をいう。好ましくは、細胞は、プロテイナーゼ消化、界面活性剤または有機溶媒を用いる液体抽出、または透過化（permeabilization）法のような他のものによって、PCR試薬に対して透過性にされている。
本明細書中で使用する場合、用語「固定された細胞」は、溶媒変化、温度変化、機械的ストレス、または乾燥による破裂に対して細胞構造（特に、膜）を強化するために化学的に処理された生物学的細胞のサンプルをいう。細胞は、懸濁物中に固定されても、または組織サンプルの部分として固定されても、いずれでもよい。細胞固定液は、一般に、細胞構造のタンパク質構成要素を、最も一般的には、タンパク質アミノ基と反応することによって架橋する化学薬品である。好ましい固定液には、緩衝化ホルマリン、95％エタノール、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒドが含まれる。固定された細胞の透過性は、プロテイナーゼ、または界面活性剤、または膜脂質を溶解する有機溶媒での処理により増加され得る。
２．オリゴヌクレオチドプローブ
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用する場合、規則的なパターンのモノマー−モノマー間の相互作用（例えば、Watson-Crick型の塩基対合など）によって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、天然のまたは改変されたモノマーまたは結合（linkage）（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドなどを含む）の直鎖状オリゴマーを包含する。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより結合されて、サイズが数個のモノマー単位（例えば、３〜４）から数十のモノマー単位の範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが、「ATGCCTG」のような文字の配列で表される場合はいつでも、他に注記がなければ、ヌクレオチドは左から右へ５'→３'の順序であること、および「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。ホスホジエステル結合のアナログには、ホスホロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが含まれる。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」は、例えば、KornbergおよびBaker、DNA Replication、第２版（Freeman，San Francisco，1992）に記載されるように、2'-デオキシ形態および2'-ヒドロキシル形態を含む天然のヌクレオチドを含む。ヌクレオチドに関しての「アナログ」には、例えば、Scheit、Nucleotide Analogs（John Wiley，New York，1980）；UhlmanおよびPeyman、Chemical Reviews，90:543-584（1990）などに記載されるように、改変された塩基部分および/または改変された糖部分を有する合成ヌクレオチドが、これらが特異的にハイブリダイズし得るという条件のみで含まれる。このようなアナログには、結合特性を高める、縮重を減少させる、特異性を増加させる、酵素基質としての活性を減少させるなどするように設計された合成ヌクレオチドが含まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、多くのアプローチ、例えば、Ozakiら、Nucleic Acids Research，20:5205-5214（1992）；Agrawalら、Nucleic Acids Research，18:5419-5423（1990）；などによって合成され得る。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、通常、例えば、以下の文献に開示されるホスホルアミダイト化学のような標準化学を使用して、自動化DNA合成機（例えば、Perkin-Elmer（Foster City，California）Model 392または394 DNA/RNA Synthesizer）で合成される：BeaucageおよびIyer、Tetrahedron，48:2223-2311（1992）；Molkoら、米国特許第4,980,460号；Kosterら、米国特許第4,725,677号；Caruthersら、米国特許第4,415,732号；第4,458,066号；および第4,973,679号など。例えば、非天然骨格基（例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデートなど）を生じる別の化学もまた、得られるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率が有害に影響しないという条件、用いられ得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、15〜150ヌクレオチド長の範囲である。より好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、18〜30ヌクレオチド長の範囲である。本発明のオリゴヌクレオチドプローブの正確な配列および長さは、それがハイブリダイズする標的核酸配列の性質に一部依存する。結合の位置および長さを変化させて特定の実施態様に適切なアニーリングおよび融解特性を達成し得る。このようなデザイン選択を行うためのガイダンスは、「Taqman」タイプのアッセイを記載する上記文献の多くに見出され得る。
好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの３'末端ヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼにより伸長し得ないようにされる。このようなブロッキングは、蛍光物質分子または消光物質分子を、結合部分（linking moiety）によってオリゴヌクレオチドプローブの末端３'炭素に付着させることにより、または３'末端ヌクレオチドをジデオキシヌクレオチドにすることにより実施され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブの３'末端は、そのオリゴヌクレオチドの３'末端中に１つ以上の改変されたヌクレオチド間結合を含ませることによって、ポリメラーゼの５'→３'伸長活性を受けないようにされる。最低限、３'末端のヌクレオチド間結合は改変されなければならないが、すべてのヌクレオチド間結合まで改変されてもよい。このようなヌクレオチド間改変には、ホスホロチオエート結合（例えば、Oligonucleotides and Analogs、第４章および第５章、IRL Press，New York（1991））；メチルホスホネート（methylyphosphonate）結合（Oligonucleotides and Analogs、第６章、IRL Press，New York（1991））；ボラノホスフェート結合（例えば、Shawら、Methods Mol.Biol．20:225-43（1993））；および他の同様なポリメラーゼ耐性ヌクレオチド間結合が含まれ得る。プローブの３'伸長をブロックする別の方法は、マイトマイシンＣまたは他の同様な抗腫瘍抗生物質（例えば、Basuら、Biochemistry，32:4708-4718（1993））を使用して、プローブの３'末端に付加物（adduct）を形成することである。
本発明の１つの実施態様の重要な局面において、オリゴヌクレオチドプローブは、核酸ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性による分解を受けないようにされる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの５'末端は、１つ以上の改変されたヌクレオチド間結合を、そのオリゴヌクレオチドの５'末端中に含むことによって、消化を受けないようにされる。最低限、５'末端のヌクレオチド間結合は改変されなければならないが、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチド間結合まで改変されてもよい。このようなヌクレオチド間改変には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成において使用されるタイプの改変された結合が含まれ得る。このようなヌクレアーゼ耐性結合の例には、ホスホロチオエート結合（例えば、Oligonucleotides and Analogs、第４章および第５章、IRL Press，New York（1991））；メチルホスホネート（methylyphosphonate）結合（Oligonucleotides and Analogs、第６章、IRL Press，New York（1991））；ボラノホスフェート結合（例えば、Shawら、Methods Mol.Biol．20:225-43（1993））；ポリアミド核酸（PNA）結合（例えば、Nielsenら、Science，254:1497-1500（1991））；および他の同様なエキソヌクレアーゼ耐性結合が含まれる。あるいは、ペプチド分子が、Soukchareunら、Bioconjugate Chemistry，6:43-53（1995）の様式と類似の様式で、プローブの５'末端に付着される。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブの別の重要な局面において、プローブは、オリゴヌクレオチドに結合した蛍光物質および消光物質分子を含む。本明細書中で用いられる用語「消光」または「蛍光エネルギー転移」は、蛍光物質分子および消光物質分子が近接しているときに、蛍光物質分子が励起される度に、励起状態のエネルギーの実質的部分が、消光物質に非放射的に転移し、そこでそのエネルギーは非放射的に消散するか、または蛍光物質の発光波長とは異なる発光波長で発光するプロセスをいう。
消光の効率は、蛍光物質および消光物質の近接度の強い関数であることは周知である。すなわち、その二つの分子が接近するにつれて、消光の効率が増大する。消光が、レポーター分子と消光物質分子の物理的な近接度に強く依存するので、消光物質およびレポーター分子は、互いに数ヌクレオチド内、通常約６〜16ヌクレオチド離れてプローブに付着していなければならないと仮定されてきた（例えば、Leeら、Nucleic Acids Research，21:3761-3766（1993）；Mergnyら、Nucleic Acids Research，22:920-928（1994）；Cardulloら、Proc.Natl.Acad.Sci.,85:8790-8794（1988）；Cleggら、Proc.Natl.Acad.Sci.,90:2994-2998（1993）；Ozakiら、Nucleic Acids Research，20:5205-5214（1992）;など）。代表的には、この分離は、レポーター-消光物質対の一方のメンバーをプローブの５'末端に付着させ、そして他方のメンバーを６〜16ヌクレオチド離れた塩基に付着させることにより達成される。
しかし、蛍光物質および消光物質分子を、オリゴヌクレオチド上の一見遠く見える部位に置くことにより、差分消光が、オリゴヌクレオチドプローブの一本鎖状態と二本鎖状態（すなわち、ハイブリダイズした状態）との間で見られ得ることが、本発明の一部として認識された（例えば、Bagwellら、Nucleic Acids Research，22（12）：2424-2425（1994）；Bagwell，EP 0 601 889 A2）。蛍光シグナルは、蛍光物質と消光物質が20塩基離れているときは、一本鎖状態と二本鎖状態の間で20のファクターほど異なり得る。この効果は、一本鎖状態において、オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの両端が近接し得る可とう性のランダムコイル構造として存在するのに対し、二本鎖状態においては、オリゴヌクレオチドが蛍光物質と消光物質を引き離す剛直な伸展した構造として存在するという事実に、最もおそらく起因する。従って、この配置を用いて、オリゴヌクレオチドプローブが一本鎖またはハイブリダイズしていない状態にあるとき、蛍光物質の比較的効率的な消光が見られ、そしてオリゴヌクレオチドプローブが二本鎖またはハイブリダイズした状態にあるとき、蛍光物質の比較的効率的な消光が見られる。
好ましくは、蛍光物質分子は、結合部分を介するプローブの末端３'炭素または末端５'炭素への付着のために誘導体化された蛍光有機色素である。好ましくは、消光物質分子もまた有機色素であり、これは、本発明の実施態様に依存して、蛍光性であってもなくてもよい。例えば、本発明の好ましい実施態様において、消光物質分子は蛍光性である。一般的に、消光物質分子が蛍光性であるかまたは非放射的減衰により蛍光物質から転移エネルギーを単に放出するかに関わらず、消光物質の吸収バンドは、蛍光物質分子の蛍光発光バンドに実質的に重複するはずである。励起した蛍光物質分子からエネルギーを吸収するが、放射的にエネルギーを放出しない非蛍光性消光物質分子は、本明細書中で色素原性分子と呼ばれる。
特定のプローブについての適切な蛍光物質-消光物質対を選択するために、文献で入手できる数多くの実践的ガイダンスがあり、以下の参照文献によって例示される：Clegg（上記）；Wuら、Anal.Biochem.,218:1-13（1994）；Pesceら編、Fluorescence Spectroscopy （Marcel Dekker、New York、1971）；Whiteら、Fluorescence Analysis:A Practical Approach（Marcel Dekker，New York，1970）；など。文献には、蛍光性および色素原性分子ならびに蛍光物質-消光物質対を選択するためのそれらの関連する光学的性質の網羅的なリストを提供する参照文献も含まれる。例えば、Berlman、Handbook of Fluorescence Sprectra of Aromatic Molecules、第２版（Academic Press、New York、1971）；Griffiths、Colour and Constitution of Organic Molecules （Academic Press、New York、1976）；Bishop編、Indicators（Pergamon Press、Oxford、1972）；Haugland Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals（Molecular Probes、Eugene、1992）；Pringsheim，Fluorescence and Phosphorescence（Interscience Publishers、New York、1949）；など。さらに、文献には、オリゴヌクレオチドに付加され得る共通の反応基を介する共有結合のために蛍光物質および消光物質分子を誘導体化するための広範なガイダンスが存在し、以下の参照文献によって例示される：Haugland（上記）；Ullmanら、米国特許第3,996,345号；Khannaら、米国特許第4,351,760号；など。
典型的な蛍光物質-消光物質対は、フルオレセインを含むキサンテン色素、およびローダミン色素から選択され得る。フェニル部分に置換基を有する多くの適切な形態のこれらの化合物が、広く市販され、そのフェニル部分は結合部位としてまたはオリゴヌクレオチドへの結合のための結合官能性として用いられ得る。別のグループの蛍光化合物は、α位またはβ位にアミノ基を有するナフチルアミンである。このようなナフチルアミノ化合物には、１-ジメチルアミノナフチル-５-スルホネート、１-アニリノ-８-ナフタレンスルホネートおよび２-p-トルイジニル（touidinyl）-６-ナフタレンスルホネートが含まれる。他の色素には、３-フェニル-７-イソシアナトクマリン、９-イソチオシアナトアクリジンアクリジンオレンジのようなアクリジン；N-（p-（2-ベンゾキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾキサジアゾール、スチルベン、ピレンなどが含まれる。
好ましくは、蛍光物質および消光物質分子はフルオレセインおよびローダミン色素から選択される。これらの色素およびオリゴヌクレオチドへの付着に適切な結合方法論は、多くの参照文献に記載されている。例えば、Khannaら（上記）；Marshall，Histochemical J.,7:299-303（1975）；Menchenら、米国特許第5,188,934号；Menchenら、欧州特許出願87310256.0;およびBergotら、国際出願PCT/US90/05565。後者の４つの文章は、本明細書中で参考として援用される。
蛍光物質または消光物質分子をオリゴヌクレオチドの５'または３'末端に付着するための多くの結合部分および方法論が存在し、以下の参照文献に例示される：Eckstein編、Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach（IRL Press，Oxford，1991）；Zuckermanら、Nucleic Acids Research，15:5305-5321（1987）（オリゴヌクレオチドの３'チオール基）；Sharmaら、Nucleic Acids Research，19:3019（1991）（３'スルフヒドリル）；Giustiら、PCR Methods and Applications，2:223-227（1993）およびFungら、米国特許第4,757,141号（Applied Biosystems，Foster City，CAから入手可能なAminolinkTMIIを介する５'ホスホアミノ基）；Stabinsky,米国特許第4,739,044号（３'アミノアルキルホスホリル基）；Agrawalら、Tetrahedron Letters，31:1543-1546（1990）（ホスホルアミデート結合を介する付着）；Sproatら、Nucleic Acids Research，15:4837（1987）（５'メルカプト基）；Nelsonら、Nucleic Acids Research，17:7187-7194（1989）（３'アミノ基）；など。
好ましくは、市販の連結部分が利用され、それらは合成の間にオリゴヌクレオチドに付着され得る。例えば、Clontech Laboratories（Palo Alto，CA）から入手可能である。
ローダミンおよびフルオレセイン色素もまた、オリゴヌクレオチドの５'ヒドロキシルに、固相合成の最後に、ホスホルアミダイト部分で誘導体化された色素を使って、簡便に付着される。例えば、Wooら、米国特許第5,231,191号；およびHobbs，Jr．、米国特許第4,997,928号。
３.PCR増幅およびプローブハイブリダイゼーションの組み合わせ
PCRおよびプローブハイブリダイゼーションアッセイを組み合わせて行うときに明言されなければならない、３つの重要な問題がある：（i）オリゴヌクレオチドプローブは、PCR重合化工程をブロックまたはさもなくば干渉し、それによって、増幅の段階的効率を低減すべきではない。ここで、本明細書中で用いられるように、用語「重合化工程」は、プライマーが、ポリメラーゼ媒介反応によるヌクレオチド塩基の取り込みによって、その３'末端から伸長される、PCRプロセスの中の工程をいう；（ii）オリゴヌクレオチドプローブは、ポリメラーゼ酵素の５'→３'エキソヌクレアーゼ活性により消化されるべきではない；および（iii）プローブは、ポリメラーゼによる５'→３'伸長が不可能であるべきである。
本発明の１つの好ましい実施態様において、プローブは、プローブの融解温度がPCR重合工程の温度より低いようにプローブを設計することにより、PCR重合化工程との干渉から保護される。本明細書中で用いられる用語「融解温度」は、プローブの半分が標的配列にハイブリダイズされ、すなわち二本鎖状態であり、そして半分がハイブリダイズされていない、すなわち一本鎖状態にある温度として定義される。好ましくは、プローブの融解温度は40℃と55℃の間であり、PCRプライマーの融解温度は55℃と70℃の間である。
図１に関して、PCR重合化工程の間に、プローブはハイブリダイズされておらず、すなわち一本鎖状態にあり、そしてそのため消光される。さらに、プローブが標的配列に結合していないので、PCR重合化はプローブからの干渉なしに進行し得る。次いで、ハイブリダイゼーション工程の間、温度はハイブリダイゼーション温度、好ましくはプローブのＴm以下の温度に下げられ、それによって、プローブを標的にハイブリダイズさせる。プローブのハイブリダイゼーションは、消光の量の減少を引き起こし、標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションを示す測定可能なシグナルを生じる。このようなシグナルはまた、存在する標的配列の量に関して定量的な情報を提供する。ハイブリダイゼーション工程の間、プローブは、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって消化されない。なぜなら、上述のように、プローブはポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を受けないように設計されているからである。
上述のＴm媒介のPCRおよびプローブハイブリダイゼーションを組み合わせた方法に関するバリエーションにおいて、ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を受けないプローブを用いるよりもむしろ、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを用いることによって、ハイブリダイゼーション工程の間のプローブの消化を防ぐ。このような５'→３'欠損ポリメラーゼの例には、DNAポリメラーゼI Klenowフラグメント、T4 DNAポリメラーゼ、およびT7 DNAポリメラーゼ、ならびに他の同様な５'→３'エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼ（例えば、Amersham Life Science，Inc.，Arlington Heights，IL）が含まれる。
上述のＴm媒介のPCRおよびプローブハイブリダイゼーションを組み合わせた方法に関する第２のバリエーションにおいて、ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を受けないプローブを用いるよりも、またはエキソヌクレアーゼ消化からプローブを保護するためにエキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼを用いるよりもむしろ、ポリメラーゼを、ハイブリダイゼーション工程の間、エキソヌクレアーゼ活性に関して不活性にする。このような不活化は、以下を含む多くの方法によって達成され得る：（i）ハイブリダイゼーション温度でポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を阻害する温度感受性インヒビター（例えば、固体の吸着剤、特異的な抗体分子、または他の同様な可逆的または不可逆的ポリメラーゼインヒビター）を反応に導入すること；（ii）活性がハイブリダイゼーション温度で非常に減少するポリメラーゼを用いること；または（iii）ハイブリダイゼーション工程の前に、ポリメラーゼ酵素を不可逆的に失活させる（kill）酵素脱活性化工程（すなわち、高温での延長された期間）を導入すること。
本発明の第２の好ましい実施態様において、プローブは、ストランドディスプレーサーを反応に含めることによって、PCR重合化工程の干渉を免れる。ここで、本明細書中で用いられる用語「ストランドディスプレーサー」は、オリゴヌクレオチドプローブを、それがハイブリダイズする標的から置換（displacement）させ得る薬剤、例えば、DNAヘリカーゼ（例えば、Howardら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：12031-12035（1994）、または一本鎖結合タンパク質（E.G．Zijderveld，Journal of Virology 68（2）：1158-1164（1994））をいう。図２に関して、本実施態様では、重合化工程の間、ストランドディスプレーサーは、プローブを鋳型ストランドから置換し、それによって重合化工程がプローブからの干渉なしに進行することを可能にする。次いで、ハイブリダイゼーション工程の間に、プローブのハイブリダイゼーションを可能にするために、ストランドディスプレーサーは不活性にされる。このような不活化は、エキソヌクレアーゼ活性の不活化に関して上述された方法を含む多くの方法によって達成され得る。一般的に、ストランドディスプレーサーのストランド置換活性は、より長いオリゴヌクレオチド二重鎖についてより高く、従って、PCRプライマー自身は、PCR反応の間、ストランドの置換を受けない。
４.実施例
本発明は、以下の実施例を考慮することによりさらに明確にされる。これらの実施例は、本発明の単に例示的なものとして意図される。
実施例１
一本鎖状態と二本鎖状態とでのプローブの蛍光発光の比較
リンカーアームヌクレオチド（「LAN」）ホスホルアミダイトは、Glen Researchから入手した。標準DNAホスホルアミダイト、６-カルボキシフルオレセイン（「６-FAM」）ホスホルアミダイト、６-カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル（「TAMRA NHSエステル」）、および３'ブロッキングリン酸を付着するためのPhosphalinkTMは、Perkin-Elmer、Applied Biosystems Divisionから入手した。オリゴヌクレオチド合成を、モデル394 DNA Synthesizer（Applied Biosystems）で行った。オリゴヌクレオチドを、Oligo Purification Cartridges（Applied Bioststems）を用いて精製した。
５'末端に6-FAM標識ホスホルアミダイトを有し、オリゴヌクレオチド配列中の１つのＴをLANで置換され、そして３'末端にPhosphalinkTMを有する二重に標識されたプローブを合成した。脱保護およびエタノール沈澱の後に、TAMRA NHSエステルを、LANを含むオリゴヌクレオチドに、250 mM Na-バイカーボネート緩衝液（pH 9.0）中で室温でカップリングした。未反応の色素を、PD-10 Sephadexカラムに通して除去した。最後に、二重に標識されたプローブを、調製用HPLCによって標準的なプロトコルを用いて精製した。
プローブのオリゴヌクレオチド配列およびその相補体を表１に示す。本明細書中で用いられる用語「相補体」は、プローブ配列と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド配列をいう。
４対のプローブを研究した。各対について、一方のプローブは内部ヌクレオチドに付着したTAMRAを有し、他方は３'末端ヌクレオチドに付着したTAMRAを有する。両方のプローブが、５'末端に付着した6-FAMを有する。一本鎖状態のプローブの蛍光を測定するために、518 nmでの蛍光発光を、最終濃度で50 nMのプローブ、10 mMのTris-HCl（pH 8.3）、50 mMのKCl、および10 mMのMgCl2を含む溶液を用いて測定した。二本鎖状態のプローブの蛍光を測定するために、溶液は100 mMの相補体オリゴヌクレオチドをさらに含んだ。MgCl2を添加する前に、120μlの各サンプルを95℃で５分間加熱した。80μlの25 mM MgCl2を添加後、各サンプルを室温まで冷却しそして蛍光発光を測定した。報告した値は３回の測定の平均である。表２は、一本鎖状態および二本鎖状態における、表示されたプローブの蛍光測定の結果を与える。表２中のデータから理解され得るように、蛍光物質および消光物質をヌクレオチドの反対端に有するプローブについて、ハイブリダイゼーションは、蛍光物質および消光物質が互いにより近くにあるときに見られた差分消光の程度に対して、差分消光の程度の劇的な増加をもたらした。より長いプローブについては、蛍光物質と消光物質の間の最適な分離が存在し、よって蛍光物質および消光物質を反対端に置くよりもむしろ、これらはともに内部に位置するが、ある最適距離だけ離れていると本発明者らは考える。
上記において、ほんのわずかな実施態様を詳細に記載したのみであるが、分子生物学の分野の当業者は、多くの改変およびバリエーションが、上述の実施態様の教示から逸脱することなく、好ましい実施態様において可能であることを明確に理解する。
本発明は、一般に、核酸増幅およびプロービングの分野に関し、そしてより詳細には、単一の試薬混合物を用いてPCRおよびプローブハイブリダイゼーションを行なうための方法および組成物に関する。
核酸増幅技術は、遺伝物質の研究のための強力な手段を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、特に、クローニング、遺伝子発現の分析、DNA配列決定、遺伝的マッピング、薬物の発見、犯罪の科学捜査などにおいて適用が見い出される、非常に重要な手段となっている。例えば、Innisら、PCR Protocols A guide to Methods and Applications，Academic Press，San Diego（1990）4,683,195号、4,683,202号。
多数の重要な適用に関して、標的核酸配列を増幅することに加えて、核酸ハイブリダイゼーションプローブ（すなわち、標的配列の全てまたは一部に相補的である、標識された１本鎖ポリヌクレオチド）を用いる処理により、このような配列をさらに特徴づけることが所望される（例えば、Nucleic Acid Hybridization，Hamesら編、IRL Press，Oxford（1985））。プローブハイブリダイゼーションは、通常のPCR増幅を上回るさらなる配列選択性を提供し得、そして独立した様式で、標的核酸配列内の複数の配列部位の特徴づけを可能にする。
伝統的には、PCRおよびプローブハイブリダイゼーションプロセスは、別の作業として行われている。しかし、PCR試薬およびプロービング試薬の両方を含有する単一の試薬混合物を用いて、PCRおよびプローブハイブリダイゼーション反応の両方を組み合わせた様式で行うことが非常に所望される。PCRおよびプロービングプロセスを組み合わせることによって得られる利点がいくつかある：（i）単一の試薬添加工程が必要とされるのみであり、これにより、反応チューブを開ける必要なく、この組み合わされた反応を進行させることが可能であり、これにより、サンプルの混同およびサンプルの汚染の機会を減少させる；（ii）必要とされる試薬がより少量である；（iii）必要とされる試薬添加工程がより少なく、自動化をより容易にする；そして（iv）インサイチュの方法の場合、熱循環の間に細胞サンプルの完全性を保護するのに使用されるサンプル封じ込め（containment）アセンブリを分解する必要がない。
単一の反応において、PCRをハイブリダイゼーションプロービングと組み合わせた、１つの存在する方法は、「Taqman」として知られる技術である。例えば、Hollandら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:7276-7280（1991）。Taqmanアッセイでは、３'末端で伸長性がなく、５'末端で標識され、かつ標的配列内でハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを、PCR反応内に導入する。増幅の間のPCR反応産物鎖へのプローブのハイブリダイゼーションは、PCRポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に適切な基質を生成する。従って、増幅の間、ポリメラーゼ酵素の５'→３'エキソヌクレアーゼ活性は、プローブを、より小さなフラグメントに分解し、このフラグメントは、分解されないプローブとは区別され得る。従来の方法を上回る顕著な改良の一方、Taqmanアッセイは、その有用性を制限する多数の重要な欠点を有する。これらの欠点には、（i）PCRに用いられるポリメラーゼ酵素は、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有さなければならないという必要条件、（ii）この５'→３'エキソヌクレアーゼ活性は、色素で標識されたヌクレオチドを効率的に消化し得なければならないこと、そして（iii）検出可能な消化産物は小さく、急速に拡散可能な種であり、これは、インサイチュの方法に適用される場合、標的配列を空間的に位置づける能力に影響を与え得ることが含まれる。
単一の反応においてPCRをプロービングと組み合わせる第２の存在する方法は、Higuchiら、Biotechnology，10:413-417（1992）に開示される方法である。この方法では、臭化エチジウムをPCR反応に添加する。そして、２本鎖DNAの存在下で臭化エチジウムの蛍光は増加するので、蛍光の増加は２本鎖PCR産物の蓄積に相関し得る。しかし、この方法は、PCR反応より優れた配列特異性を全く提供せず、かつ標的核酸配列内の単一の配列部位の検出に制限される。
増幅およびプロービング工程の組み合わせを可能にする第３の方法は、ヨーロッパ特許出願公開公報第0601889A2号のBagwellの方法である。Bagwellの方法におけるプローブは、（i）標的核酸に相補的なセグメント、および（ii）１つ以上のヘアピンを形成し得るセグメントを有するヌクレオチド配列を含む。このプローブはまた、共有結合した蛍光物質および消光物質の分子を含み、これは、ヘアピンが形成された場合に、蛍光物質および消光物質が、それらの間の共鳴エネルギーの転移を可能にするように極めて十分接近するように配置される。この方法は、可能なプローブ配列が、ヘアピン構造を形成し得るプローブ配列に制限されるという重大な欠点を有する。さらに、プローブ-標的結合の速度論および熱力学は、ヘアピン構造の存在により、好ましくない影響を受ける。
要旨
本発明は、一般に、単一の試薬を用いる単一の反応容器中における、増幅および増幅された核酸標的配列のハイブリダイゼーションプローブ検出の組み合わせのために有用な方法および試薬の本発明者らの発見に関する。
本発明の１つの目的は、増幅および増幅した標的配列のプローブ検出のための方法および試薬を提供することであり、ここで、増幅およびプロービングの工程は組み合わせれた様式で行われ、その結果、増幅工程後の試薬の添加は必要とされない。
本発明のさらなる目的は、増幅、および細胞または組織切片内に位置する増幅された標的配列のプローブ検出のための方法および試薬を提供することであり、ここで、増幅工程とプロービング工程との間で封じ込めアセンブリを分解する必要がない。
本発明の別の目的は、増幅および増幅された標的配列のプローブ検出のための方法および試薬を提供することであり、ここで、増幅工程およびプロービング工程の両方で、単一の試薬混合物が用いられる。
本発明のさらなる目的は、増幅、および細胞または組織切片内に位置する増幅された標的配列のプロービングのための方法および試薬を提供することであり、ここで、増幅工程とプロービング工程との間で洗浄工程は必要とされない。
本発明の別の目的は、上記の方法における使用のためのプローブ組成物を提供することであり、このプローブ組成物は、２本鎖状態（例えば、相補的標的配列にハイブリダイズした）であるか、または１本鎖状態であるかに依存して検出可能に異なる蛍光特性を有する。
本発明のなお別の目的は、ポリメラーゼ酵素の５'→３'エキソヌクレアーゼ活性に対して抵抗性であるオリゴヌクレオチドプローブを提供することである。
本発明の別の目的は、標識されたプローブを提供することであり、ここで、検出時に、この標識は大きな、ゆっくりと拡散する種（すなわち、プローブのサイズ以上のサイズを有する種）に付着される。
本発明のさらなる目的は、２本鎖状態と１本鎖状態との間で差別的なシグナルを提供するためにヘアピン構造を必要としないプローブを提供することである。
本発明の別の目的は、増幅および増幅された標的配列のプローブ検出のための方法および試薬を提供することであり、ここで、ポリメラーゼは、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有する必要はない。
本発明のなお別の目的は、増幅および増幅された標的配列のプローブ検出のための方法および試薬を提供することであり、ここで、複数の配列部位が、単一の標的配列内で検出され得る。
本発明のさらに別の目的は、上記の方法の実施のために有用な種々の試薬キットを提供することである。
本発明の上記の目的および他の目的は、１つの局面において、標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドプローブによって達成される。このオリゴヌクレオチドは、５'末端をポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性による消化を受けないようにされ、そして３'末端をポリメラーゼの５'→３'伸長活性を受けないように改変される。さらに、このオリゴヌクレオチドプローブはオリゴヌクレオチドの第１の末端に付着した蛍光物質分子、およびこのオリゴヌクレオチドの第２の末端に付着した消光物質分子を含み、その結果、オリゴヌクレオチドプローブが、１本鎖状態である場合は常に、消光物質分子が蛍光物質分子の蛍光を実質的に消光させ、そしてオリゴヌクレオチドプローブが２本鎖状態である場合は常に、蛍光物質は実質的に消光されない。あるいは、蛍光物質と消光物質とは、少なくとも18ヌクレオチドにより隔てられる。
第２の局面では、本発明は、PCR増幅およびハイブリダイゼーションプロービングを組み合わせて行うための第１の方法を提供する。この方法では、標的核酸配列をPCR試薬と接触させる。このPCR試薬は、少なくとも２つのPCRプライマー、ポリメラーゼ酵素、および上記の本発明のオリゴヌクレオチドプローブを含む。次いで、この混合物を、熱循環に供する。この熱循環は、PCR試薬によって特定された標的核酸配列を増幅するために十分である。
第３の局面では、本発明は、PCR増幅およびハイブリダイゼーションプロービングを組み合わせて行うための第２の方法を提供し、ここで、標的核酸配列をPCR試薬と接触させる。このPCR試薬は、少なくとも２つのPCRプライマーおよび全ての５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠損したポリメラーゼ酵素、およびオリゴヌクレオチドプローブを含む。オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドの第１の末端に付着した蛍光物質分子およびオリゴヌクレオチドの第２の末端に付着した消光物質分子を含み、その結果、このオリゴヌクレオチドプローブが１本鎖状態である場合は常に、消光物質分子が蛍光物質分子の蛍光を実質的に消光させ、そしてこのオリゴヌクレオチドプローブが２本鎖状態である場合は常に、蛍光物質は実質的に消光されない。さらに、プローブの３'末端は、ポリメラーゼの５'→３'伸長活性を受けないようにされている。標的核酸配列、オリゴヌクレオチドプローブ、およびPCR試薬は、PCR試薬で特定された標的核酸配列を増幅するのに十分な熱循環に供される。
１つの好ましい実施態様では、全ての５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠損しているポリメラーゼ酵素を必要とするよりもむしろ、エキソヌクレアーゼ活性インヒビターを反応物に添加する。このインヒビターは、プローブのハイブリダイゼーション温度でポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を阻害するのに十分である。
第２の好ましい実施態様では、全ての５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠損しているポリメラーゼ酵素を必要とするよりもむしろ、またはエキソヌクレアーゼ活性インヒビターを添加するよりもむしろ、プローブを検出する前に、ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を非活性化させる。
【図面の簡単な説明】
図１は、第１の好ましい、PCRとプローブハイブリダイゼーションとを組み合せた方法の概略図を示す。ここで、プローブの融解温度（Tm）とPCR重合化工程の反応温度との間の温度差を用いて、プローブが、PCR重合化工程およびプローブの消化に干渉するのを防ぐ。
図２は、第２の好ましい、PCRとプローブハイブリダイゼーションとを組み合せた方法の概略図を示す。ここで、ストランドディスプレーサー（strand displacer）を用いて、プローブが、PCR重合化工程およびプローブの消化に干渉するのを防ぐ。
好ましい実施態様の説明
ここで、本発明の好ましい実施態様について詳細に言及する。本発明を、好ましい実施態様に関して記載するが、このことは本発明をこれらの実施態様に限定することを意図するものではないことが理解される。それどころか、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定される発明に含まれ得る代替物、改変物、および等価物を含むことが意図されている。
１．PCRおよびインサイチュPCR
本明細書中で使用される場合、用語「PCR試薬」は、標的核酸配列を除く、PCRプロセスを実行するために必要とされる化学薬品をいう。これらの化学薬品は、一般的に、以下の５つのクラスの成分からなる：（i）水性緩衝物、（ii）水溶性マグネシウム塩、（iii）少なくとも４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dNTP）、（iv）オリゴヌクレオチドプライマー（通常、それぞれの標的配列に対して２つのプライマー、その配列は、二本鎖標的配列の２つの相補鎖の５'末端を規定する）、および（v）ポリヌクレオチドポリメラーゼ、好ましくはDNAポリメラーゼ、より好ましくは熱安定性DNAポリメラーゼ（すなわち、少なくとも10分間の合計時間の間、その活性の約半分より多くを失うことなく、90℃と100℃との間の温度に耐え得るDNAポリメラーゼ）。
４種の通常のdNTPは、チミジン三リン酸（dTTP）、デオキシアデノシン三リン酸（dATP）、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）、およびデオキシグアノシン三リン酸（dGTP）である。これら通常の三リン酸は、通常の４種の塩基と同様にWatson-Crick塩基対合する塩基アナログを含むdNTP（例えば、デオキシウリジン三リン酸（dUTP））で補充または置換され得る。
「インサイチュPCR」は、特定の増幅された核酸が、標的核酸配列を元々含んでいた細胞または下位の細胞構造内に実質的に含まれるように、固定された細胞において実行されるPCR増幅をいう。細胞は、水性懸濁液中にあっても、または組織サンプルの部分（例えば、組織化学的切片または細胞化学的スメア）であってもよい。本明細書中で使用される場合、用語「組織化学的切片」は、凍結または化学的に固定され、ワックスまたはプラスチック中に包埋されることにより固められ、薄板（代表的には、数ミクロンの厚さ）にスライスされ、そして固体支持体（例えば、顕微鏡スライド）に付着された生物学的組織の固体サンプルをいい、そして用語「細胞化学的スメア」は、化学的に固定されそして顕微鏡スライドに付着された細胞（例えば、血球）の懸濁物をいう。好ましくは、細胞は、プロテイナーゼ消化、界面活性剤または有機溶媒を用いる液体抽出、または透過化（permeabilization）法のような他のものによって、PCR試薬に対して透過性にされている。
本明細書中で使用する場合、用語「固定された細胞」は、溶媒変化、温度変化、機械的ストレス、または乾燥による破裂に対して細胞構造（特に、膜）を強化するために化学的に処理された生物学的細胞のサンプルをいう。細胞は、懸濁物中に固定されても、または組織サンプルの部分として固定されても、いずれでもよい。細胞固定液は、一般に、細胞構造のタンパク質構成要素を、最も一般的には、タンパク質アミノ基と反応することによって架橋する化学薬品である。好ましい固定液には、緩衝化ホルマリン、95％エタノール、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒドが含まれる。固定された細胞の透過性は、プロテイナーゼ、または界面活性剤、または膜脂質を溶解する有機溶媒での処理により増加され得る。
２．オリゴヌクレオチドプローブ
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用する場合、規則的なパターンのモノマー−モノマー間の相互作用（例えば、Watson-Crick型の塩基対合など）によって標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る、天然のまたは改変されたモノマーまたは結合（linkage）（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドなどを含む）の直鎖状オリゴマーを包含する。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより結合されて、サイズが数個のモノマー単位（例えば、３〜４）から数十のモノマー単位の範囲のオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが、「ATGCCTG」のような文字の配列で表される場合はいつでも、他に注記がなければ、ヌクレオチドは左から右へ５'→３'の順序であること、および「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、そして「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。ホスホジエステル結合のアナログには、ホスホロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが含まれる。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」は、例えば、KornbergおよびBaker、DNA Replication、第２版（Freeman，San Francisco，1992）に記載されるように、2'-デオキシ形態および2'-ヒドロキシル形態を含む天然のヌクレオチドを含む。ヌクレオチドに関しての「アナログ」には、例えば、Scheit、Nucleotide Analogs（John Wiley，New York，1980）；UhlmanおよびPeyman、Chemical Reviews，90:543-584（1990）などに記載されるように、改変された塩基部分および/または改変された糖部分を有する合成ヌクレオチドが、これらが特異的にハイブリダイズし得るという条件のみで含まれる。このようなアナログには、結合特性を高める、縮重を減少させる、特異性を増加させる、酵素基質としての活性を減少させるなどするように設計された合成ヌクレオチドが含まれる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、多くのアプローチ、例えば、Ozakiら、Nucleic Acids Research，20:5205-5214（1992）；Agrawalら、Nucleic Acids Research，18:5419-5423（1990）；などによって合成され得る。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、通常、例えば、以下の文献に開示されるホスホルアミダイト化学のような標準化学を使用して、自動化DNA合成機（例えば、Perkin-Elmer（Foster City，California）Model 392または394 DNA/RNA Synthesizer）で合成される：BeaucageおよびIyer、Tetrahedron，48:2223-2311（1992）；Molkoら、米国特許第4,980,460号；Kosterら、米国特許第4,725,677号；Caruthersら、米国特許第4,415,732号；第4,458,066号；および第4,973,679号など。例えば、非天然骨格基（例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデートなど）を生じる別の化学もまた、得られるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率が有害に影響しないという条件、用いられ得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、15〜150ヌクレオチド長の範囲である。より好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、18〜30ヌクレオチド長の範囲である。本発明のオリゴヌクレオチドプローブの正確な配列および長さは、それがハイブリダイズする標的核酸配列の性質に一部依存する。結合の位置および長さを変化させて特定の実施態様に適切なアニーリングおよび融解特性を達成し得る。このようなデザイン選択を行うためのガイダンスは、「Taqman」タイプのアッセイを記載する上記文献の多くに見出され得る。
好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの３'末端ヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼにより伸長し得ないようにされる。このようなブロッキングは、蛍光物質分子または消光物質分子を、結合部分（linking moiety）によってオリゴヌクレオチドプローブの末端３'炭素に付着させることにより、または３'末端ヌクレオチドをジデオキシヌクレオチドにすることにより実施され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドプローブの３'末端は、そのオリゴヌクレオチドの３'末端中に１つ以上の改変されたヌクレオチド間結合を含ませることによって、ポリメラーゼの５'→３'伸長活性を受けないようにされる。最低限、３'末端のヌクレオチド間結合は改変されなければならないが、すべてのヌクレオチド間結合まで改変されてもよい。このようなヌクレオチド間改変には、ホスホロチオエート結合（例えば、Oligonucleotides and Analogs、第４章および第５章、IRL Press，New York（1991））；メチルホスホネート（methylyphosphonate）結合（Oligonucleotides and Analogs、第６章、IRL Press，New York（1991））；ボラノホスフェート結合（例えば、Shawら、Methods Mol.Biol．20:225-43（1993））；および他の同様なポリメラーゼ耐性ヌクレオチド間結合が含まれ得る。プローブの３'伸長をブロックする別の方法は、マイトマイシンＣまたは他の同様な抗腫瘍抗生物質（例えば、Basuら、Biochemistry，32:4708-4718（1993））を使用して、プローブの３'末端に付加物（adduct）を形成することである。
本発明の１つの実施態様の重要な局面において、オリゴヌクレオチドプローブは、核酸ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性による分解を受けないようにされる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの５'末端は、１つ以上の改変されたヌクレオチド間結合を、そのオリゴヌクレオチドの５'末端中に含むことによって、消化を受けないようにされる。最低限、５'末端のヌクレオチド間結合は改変されなければならないが、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチド間結合まで改変されてもよい。このようなヌクレオチド間改変には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成において使用されるタイプの改変された結合が含まれ得る。このようなヌクレアーゼ耐性結合の例には、ホスホロチオエート結合（例えば、Oligonucleotides and Analogs、第４章および第５章、IRL Press，New York（1991））；メチルホスホネート（methylyphosphonate）結合（Oligonucleotides and Analogs、第６章、IRL Press，New York（1991））；ボラノホスフェート結合（例えば、Shawら、Methods Mol.Biol．20:225-43（1993））；ポリアミド核酸（PNA）結合（例えば、Nielsenら、Science，254:1497-1500（1991））；および他の同様なエキソヌクレアーゼ耐性結合が含まれる。あるいは、ペプチド分子が、Soukchareunら、Bioconjugate Chemistry，6:43-53（1995）の様式と類似の様式で、プローブの５'末端に付着される。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブの別の重要な局面において、プローブは、オリゴヌクレオチドに結合した蛍光物質および消光物質分子を含む。本明細書中で用いられる用語「消光」または「蛍光エネルギー転移」は、蛍光物質分子および消光物質分子が近接しているときに、蛍光物質分子が励起される度に、励起状態のエネルギーの実質的部分が、消光物質に非放射的に転移し、そこでそのエネルギーは非放射的に消散するか、または蛍光物質の発光波長とは異なる発光波長で発光するプロセスをいう。
消光の効率は、蛍光物質および消光物質の近接度の強い関数であることは周知である。すなわち、その二つの分子が接近するにつれて、消光の効率が増大する。消光が、レポーター分子と消光物質分子の物理的な近接度に強く依存するので、消光物質およびレポーター分子は、互いに数ヌクレオチド内、通常約６〜16ヌクレオチド離れてプローブに付着していなければならないと仮定されてきた（例えば、Leeら、Nucleic Acids Research，21:3761-3766（1993）；Mergnyら、Nucleic Acids Research，22:920-928（1994）；Cardulloら、Proc.Natl.Acad.Sci.,85:8790-8794（1988）；Cleggら、Proc.Natl.Acad.Sci.,90:2994-2998（1993）；Ozakiら、Nucleic Acids Research，20:5205-5214（1992）;など）。代表的には、この分離は、レポーター-消光物質対の一方のメンバーをプローブの５'末端に付着させ、そして他方のメンバーを６〜16ヌクレオチド離れた塩基に付着させることにより達成される。
しかし、蛍光物質および消光物質分子を、オリゴヌクレオチド上の一見遠く見える部位に置くことにより、差分消光が、オリゴヌクレオチドプローブの一本鎖状態と二本鎖状態（すなわち、ハイブリダイズした状態）との間で見られ得ることが、本発明の一部として認識された（例えば、Bagwellら、Nucleic Acids Research，22（12）：2424-2425（1994）；Bagwell，EP 0 601 889 A2）。蛍光シグナルは、蛍光物質と消光物質が20塩基離れているときは、一本鎖状態と二本鎖状態の間で20のファクターほど異なり得る。この効果は、一本鎖状態において、オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの両端が近接し得る可とう性のランダムコイル構造として存在するのに対し、二本鎖状態においては、オリゴヌクレオチドが蛍光物質と消光物質を引き離す剛直な伸展した構造として存在するという事実に、最もおそらく起因する。従って、この配置を用いて、オリゴヌクレオチドプローブが一本鎖またはハイブリダイズしていない状態にあるとき、蛍光物質の比較的効率的な消光が見られ、そしてオリゴヌクレオチドプローブが二本鎖またはハイブリダイズした状態にあるとき、蛍光物質の比較的効率的な消光が見られる。
好ましくは、蛍光物質分子は、結合部分を介するプローブの末端３'炭素または末端５'炭素への付着のために誘導体化された蛍光有機色素である。好ましくは、消光物質分子もまた有機色素であり、これは、本発明の実施態様に依存して、蛍光性であってもなくてもよい。例えば、本発明の好ましい実施態様において、消光物質分子は蛍光性である。一般的に、消光物質分子が蛍光性であるかまたは非放射的減衰により蛍光物質から転移エネルギーを単に放出するかに関わらず、消光物質の吸収バンドは、蛍光物質分子の蛍光発光バンドに実質的に重複するはずである。励起した蛍光物質分子からエネルギーを吸収するが、放射的にエネルギーを放出しない非蛍光性消光物質分子は、本明細書中で色素原性分子と呼ばれる。
特定のプローブについての適切な蛍光物質-消光物質対を選択するために、文献で入手できる数多くの実践的ガイダンスがあり、以下の参照文献によって例示される：Clegg（上記）；Wuら、Anal.Biochem.,218:1-13（1994）；Pesceら編、Fluorescence Spectroscopy （Marcel Dekker、New York、1971）；Whiteら、Fluorescence Analysis:A Practical Approach（Marcel Dekker，New York，1970）；など。文献には、蛍光性および色素原性分子ならびに蛍光物質-消光物質対を選択するためのそれらの関連する光学的性質の網羅的なリストを提供する参照文献も含まれる。例えば、Berlman、Handbook of Fluorescence Sprectra of Aromatic Molecules、第２版（Academic Press、New York、1971）；Griffiths、Colour and Constitution of Organic Molecules （Academic Press、New York、1976）；Bishop編、Indicators（Pergamon Press、Oxford、1972）；Haugland Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals（Molecular Probes、Eugene、1992）；Pringsheim，Fluorescence and Phosphorescence（Interscience Publishers、New York、1949）；など。さらに、文献には、オリゴヌクレオチドに付加され得る共通の反応基を介する共有結合のために蛍光物質および消光物質分子を誘導体化するための広範なガイダンスが存在し、以下の参照文献によって例示される：Haugland（上記）；Ullmanら、米国特許第3,996,345号；Khannaら、米国特許第4,351,760号；など。
典型的な蛍光物質-消光物質対は、フルオレセインを含むキサンテン色素、およびローダミン色素から選択され得る。フェニル部分に置換基を有する多くの適切な形態のこれらの化合物が、広く市販され、そのフェニル部分は結合部位としてまたはオリゴヌクレオチドへの結合のための結合官能性として用いられ得る。別のグループの蛍光化合物は、α位またはβ位にアミノ基を有するナフチルアミンである。このようなナフチルアミノ化合物には、１-ジメチルアミノナフチル-５-スルホネート、１-アニリノ-８-ナフタレンスルホネートおよび２-p-トルイジニル（touidinyl）-６-ナフタレンスルホネートが含まれる。他の色素には、３-フェニル-７-イソシアナトクマリン、９-イソチオシアナトアクリジンアクリジンオレンジのようなアクリジン；N-（p-（2-ベンゾキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾキサジアゾール、スチルベン、ピレンなどが含まれる。
好ましくは、蛍光物質および消光物質分子はフルオレセインおよびローダミン色素から選択される。これらの色素およびオリゴヌクレオチドへの付着に適切な結合方法論は、多くの参照文献に記載されている。例えば、Khannaら（上記）；Marshall，Histochemical J.,7:299-303（1975）；Menchenら、米国特許第5,188,934号；Menchenら、欧州特許出願87310256.0;およびBergotら、国際出願PCT/US90/05565。後者の４つの文章は、本明細書中で参考として援用される。
蛍光物質または消光物質分子をオリゴヌクレオチドの５'または３'末端に付着するための多くの結合部分および方法論が存在し、以下の参照文献に例示される：Eckstein編、Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach（IRL Press，Oxford，1991）；Zuckermanら、Nucleic Acids Research，15:5305-5321（1987）（オリゴヌクレオチドの３'チオール基）；Sharmaら、Nucleic Acids Research，19:3019（1991）（３'スルフヒドリル）；Giustiら、PCR Methods and Applications，2:223-227（1993）およびFungら、米国特許第4,757,141号（Applied Biosystems，Foster City，CAから入手可能なAminolinkTMIIを介する５'ホスホアミノ基）；Stabinsky,米国特許第4,739,044号（３'アミノアルキルホスホリル基）；Agrawalら、Tetrahedron Letters，31:1543-1546（1990）（ホスホルアミデート結合を介する付着）；Sproatら、Nucleic Acids Research，15:4837（1987）（５'メルカプト基）；Nelsonら、Nucleic Acids Research，17:7187-7194（1989）（３'アミノ基）；など。
好ましくは、市販の連結部分が利用され、それらは合成の間にオリゴヌクレオチドに付着され得る。例えば、Clontech Laboratories（Palo Alto，CA）から入手可能である。
ローダミンおよびフルオレセイン色素もまた、オリゴヌクレオチドの５'ヒドロキシルに、固相合成の最後に、ホスホルアミダイト部分で誘導体化された色素を使って、簡便に付着される。例えば、Wooら、米国特許第5,231,191号；およびHobbs，Jr．、米国特許第4,997,928号。
３.PCR増幅およびプローブハイブリダイゼーションの組み合わせ
PCRおよびプローブハイブリダイゼーションアッセイを組み合わせて行うときに明言されなければならない、３つの重要な問題がある：（i）オリゴヌクレオチドプローブは、PCR重合化工程をブロックまたはさもなくば干渉し、それによって、増幅の段階的効率を低減すべきではない。ここで、本明細書中で用いられるように、用語「重合化工程」は、プライマーが、ポリメラーゼ媒介反応によるヌクレオチド塩基の取り込みによって、その３'末端から伸長される、PCRプロセスの中の工程をいう；（ii）オリゴヌクレオチドプローブは、ポリメラーゼ酵素の５'→３'エキソヌクレアーゼ活性により消化されるべきではない；および（iii）プローブは、ポリメラーゼによる５'→３'伸長が不可能であるべきである。
本発明の１つの好ましい実施態様において、プローブは、プローブの融解温度がPCR重合工程の温度より低いようにプローブを設計することにより、PCR重合化工程との干渉から保護される。本明細書中で用いられる用語「融解温度」は、プローブの半分が標的配列にハイブリダイズされ、すなわち二本鎖状態であり、そして半分がハイブリダイズされていない、すなわち一本鎖状態にある温度として定義される。好ましくは、プローブの融解温度は40℃と55℃の間であり、PCRプライマーの融解温度は55℃と70℃の間である。
図１に関して、PCR重合化工程の間に、プローブはハイブリダイズされておらず、すなわち一本鎖状態にあり、そしてそのため消光される。さらに、プローブが標的配列に結合していないので、PCR重合化はプローブからの干渉なしに進行し得る。次いで、ハイブリダイゼーション工程の間、温度はハイブリダイゼーション温度、好ましくはプローブのＴm以下の温度に下げられ、それによって、プローブを標的にハイブリダイズさせる。プローブのハイブリダイゼーションは、消光の量の減少を引き起こし、標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションを示す測定可能なシグナルを生じる。このようなシグナルはまた、存在する標的配列の量に関して定量的な情報を提供する。ハイブリダイゼーション工程の間、プローブは、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって消化されない。なぜなら、上述のように、プローブはポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を受けないように設計されているからである。
上述のＴm媒介のPCRおよびプローブハイブリダイゼーションを組み合わせた方法に関するバリエーションにおいて、ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を受けないプローブを用いるよりもむしろ、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを用いることによって、ハイブリダイゼーション工程の間のプローブの消化を防ぐ。このような５'→３'欠損ポリメラーゼの例には、DNAポリメラーゼI Klenowフラグメント、T4 DNAポリメラーゼ、およびT7 DNAポリメラーゼ、ならびに他の同様な５'→３'エキソヌクレアーゼ欠損DNAポリメラーゼ（例えば、Amersham Life Science，Inc.，Arlington Heights，IL）が含まれる。
上述のＴm媒介のPCRおよびプローブハイブリダイゼーションを組み合わせた方法に関する第２のバリエーションにおいて、ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を受けないプローブを用いるよりも、またはエキソヌクレアーゼ消化からプローブを保護するためにエキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼを用いるよりもむしろ、ポリメラーゼを、ハイブリダイゼーション工程の間、エキソヌクレアーゼ活性に関して不活性にする。このような不活化は、以下を含む多くの方法によって達成され得る：（i）ハイブリダイゼーション温度でポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を阻害する温度感受性インヒビター（例えば、固体の吸着剤、特異的な抗体分子、または他の同様な可逆的または不可逆的ポリメラーゼインヒビター）を反応に導入すること；（ii）活性がハイブリダイゼーション温度で非常に減少するポリメラーゼを用いること；または（iii）ハイブリダイゼーション工程の前に、ポリメラーゼ酵素を不可逆的に失活させる（kill）酵素脱活性化工程（すなわち、高温での延長された期間）を導入すること。
本発明の第２の好ましい実施態様において、プローブは、ストランドディスプレーサーを反応に含めることによって、PCR重合化工程の干渉を免れる。ここで、本明細書中で用いられる用語「ストランドディスプレーサー」は、オリゴヌクレオチドプローブを、それがハイブリダイズする標的から置換（displacement）させ得る薬剤、例えば、DNAヘリカーゼ（例えば、Howardら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：12031-12035（1994）、または一本鎖結合タンパク質（E.G．Zijderveld，Journal of Virology 68（2）：1158-1164（1994））をいう。図２に関して、本実施態様では、重合化工程の間、ストランドディスプレーサーは、プローブを鋳型ストランドから置換し、それによって重合化工程がプローブからの干渉なしに進行することを可能にする。次いで、ハイブリダイゼーション工程の間に、プローブのハイブリダイゼーションを可能にするために、ストランドディスプレーサーは不活性にされる。このような不活化は、エキソヌクレアーゼ活性の不活化に関して上述された方法を含む多くの方法によって達成され得る。一般的に、ストランドディスプレーサーのストランド置換活性は、より長いオリゴヌクレオチド二重鎖についてより高く、従って、PCRプライマー自身は、PCR反応の間、ストランドの置換を受けない。
４.実施例
本発明は、以下の実施例を考慮することによりさらに明確にされる。これらの実施例は、本発明の単に例示的なものとして意図される。
実施例１
一本鎖状態と二本鎖状態とでのプローブの蛍光発光の比較
リンカーアームヌクレオチド（「LAN」）ホスホルアミダイトは、Glen Researchから入手した。標準DNAホスホルアミダイト、６-カルボキシフルオレセイン（「６-FAM」）ホスホルアミダイト、６-カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル（「TAMRA NHSエステル」）、および３'ブロッキングリン酸を付着するためのPhosphalinkTMは、Perkin-Elmer、Applied Biosystems Divisionから入手した。オリゴヌクレオチド合成を、モデル394 DNA Synthesizer（Applied Biosystems）で行った。オリゴヌクレオチドを、Oligo Purification Cartridges（Applied Bioststems）を用いて精製した。
５'末端に6-FAM標識ホスホルアミダイトを有し、オリゴヌクレオチド配列中の１つのＴをLANで置換され、そして３'末端にPhosphalinkTMを有する二重に標識されたプローブを合成した。脱保護およびエタノール沈澱の後に、TAMRA NHSエステルを、LANを含むオリゴヌクレオチドに、250 mM Na-バイカーボネート緩衝液（pH 9.0）中で室温でカップリングした。未反応の色素を、PD-10 Sephadexカラムに通して除去した。最後に、二重に標識されたプローブを、調製用HPLCによって標準的なプロトコルを用いて精製した。
プローブのオリゴヌクレオチド配列およびその相補体を表１に示す。本明細書中で用いられる用語「相補体」は、プローブ配列と特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド配列をいう。
Claims (12)
- PCR増幅およびハイブリダイゼーションプロービングを組み合わせて行なう方法であって、以下の工程：
標的核酸配列を、少なくとも２つのPCRプライマーおよびポリメラーゼ酵素を含むPCR試薬、ならびに以下のもの：
標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド；
該オリゴヌクレオチドの第１の位置に付着した蛍光物質分子；
該オリゴヌクレオチドの第２の位置に付着した消光物質分子であって、これにより、該オリゴヌクレオチドプローブが該標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされない場合はいつも、該消光物質分子が、該蛍光物質分子の蛍光を実質的に消光し、そして該オリゴヌクレオチドプローブが該標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされる場合はいつも、該蛍光物質が実質的に消光されない、消光物質分子；
ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによって認識されない５'末端；および
ポリメラーゼの５'→３'伸長活性を有するポリメラーゼによって認識されない３'末端、
を含むオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程；および
該標的核酸配列、該オリゴヌクレオチドプローブ、および該PCR試薬を、重合化工程を含む熱循環に供する工程であって、該熱循環は該PCR試薬により特定される該標的核酸配列を増幅するに十分である、工程、
を包含する、方法。 - 前記蛍光物質分子がフルオレセイン色素であり、そして前記消光物質分子がローダミン色素である、請求項１に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記第１の位置が５'末端である、請求項２に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記第１の位置は、５’末端であり、該オリゴヌクレオチドの前記第２の位置は、３’末端である、請求項１に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの蛍光消光の程度を測定する工程をさらに包含し、該測定は熱循環の後に、かつプローブハイブリダイゼーション温度で行われる、請求項１に記載の方法。
- 前記標的核酸配列が、１つ以上の固定された細胞中に位置づけられる、請求項１に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブの蛍光消光の程度を、前記標的核酸配列を元々含有する個々の前記細胞内に該プローブを配置する様式で、プローブハイブリダイゼーション温度で測定する工程をさらに包含する、請求項６に記載の方法。
- 前記固定された細胞、前記PCR試薬、および前記オリゴヌクレオチドプローブを、封じ込めアセンブリー中に配置する、請求項６に記載の方法。
- 前記プローブハイブリダイゼーション温度が、前記熱循環の前記重合化工程の温度以下である、請求項１に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが前記重合化工程の間の上流PCRプライマーの５'→３'伸長をブロックするのを防ぐために、熱循環の前にストランドディスプレーサーを添加する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
- 前記ストランドディスプレーサーが、ヘリカーゼである、請求項１０に記載の方法。
- 前記蛍光物質および前記消光物質が、少なくとも１８ヌクレオチドだけ離れている、請求項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US43550995A | 1995-05-05 | 1995-05-05 | |
| US08/435,509 | 1995-05-05 | ||
| PCT/US1996/004693 WO1996034983A1 (en) | 1995-05-05 | 1996-04-05 | Methods and reagents for combined pcr amplification and hybridization probing assay |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003099758A Division JP4040519B2 (ja) | 1995-05-05 | 2003-04-02 | Ｐｃｒ増幅とハイブリダイゼーションプロービングアッセイを組み合わせた方法およびそのための試薬 |
| JP2004259091A Division JP2005110666A (ja) | 1995-05-05 | 2004-09-06 | Ｐｃｒ増幅とハイブリダイゼーションプロービングアッセイを組み合わせた方法およびそのための試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11504219A JPH11504219A (ja) | 1999-04-20 |
| JP4040087B2 true JP4040087B2 (ja) | 2008-01-30 |
Family
ID=23728690
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53330996A Expired - Fee Related JP4040087B2 (ja) | 1995-05-05 | 1996-04-05 | Ｐｃｒ増幅とハイブリダイゼーションプロービングアッセイとを組み合わせた方法およびそのための試薬 |
| JP2003099758A Expired - Fee Related JP4040519B2 (ja) | 1995-05-05 | 2003-04-02 | Ｐｃｒ増幅とハイブリダイゼーションプロービングアッセイを組み合わせた方法およびそのための試薬 |
| JP2004259091A Ceased JP2005110666A (ja) | 1995-05-05 | 2004-09-06 | Ｐｃｒ増幅とハイブリダイゼーションプロービングアッセイを組み合わせた方法およびそのための試薬 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003099758A Expired - Fee Related JP4040519B2 (ja) | 1995-05-05 | 2003-04-02 | Ｐｃｒ増幅とハイブリダイゼーションプロービングアッセイを組み合わせた方法およびそのための試薬 |
| JP2004259091A Ceased JP2005110666A (ja) | 1995-05-05 | 2004-09-06 | Ｐｃｒ増幅とハイブリダイゼーションプロービングアッセイを組み合わせた方法およびそのための試薬 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (8) | US5691146A (ja) |
| EP (1) | EP0826066B1 (ja) |
| JP (3) | JP4040087B2 (ja) |
| AT (1) | ATE196322T1 (ja) |
| AU (1) | AU693023B2 (ja) |
| CA (1) | CA2219891C (ja) |
| DE (1) | DE69610304T2 (ja) |
| WO (1) | WO1996034983A1 (ja) |
Families Citing this family (142)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6787304B1 (en) | 1994-12-28 | 2004-09-07 | Georgetown University | Fluorometric assay for detecting nucleic acid cleavage |
| US20030165908A1 (en) * | 1994-12-30 | 2003-09-04 | Georgetown University | Fluorometric assay for detecting nucleic acid cleavage |
| US5801155A (en) * | 1995-04-03 | 1998-09-01 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates |
| CA2219891C (en) | 1995-05-05 | 2002-01-29 | The Perkin-Elmer Corporation | Methods and reagents for combined pcr amplification and hybridization probing assay |
| US6706471B1 (en) * | 1996-01-24 | 2004-03-16 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage |
| US7070925B1 (en) | 1996-07-16 | 2006-07-04 | Gen-Probe Incorporated | Method for determining the presence of an RNA analyte in a sample using a modified oligonucleotide probe |
| DK0912767T3 (da) * | 1996-07-16 | 2006-10-30 | Gen Probe Inc | Fremgangsmåde til sporing og forstærkning af nukleinsyresekvenser ved anvendelse af modificerede oligonukleotider med foröget targetspecifikt TM |
| US5853990A (en) | 1996-07-26 | 1998-12-29 | Edward E. Winger | Real time homogeneous nucleotide assay |
| DE19782089T1 (de) | 1996-10-29 | 1999-12-23 | Univ Nebraska At Lincoln Linco | Verfahren zum Nachweisen von Punktmutationen in DNA unter Verwendung von Fluoreszenzenergieübergang |
| US6017702A (en) * | 1996-12-05 | 2000-01-25 | The Perkin-Elmer Corporation | Chain-termination type nucleic acid sequencing method including 2'-deoxyuridine-5'-triphosphate |
| US6060242A (en) * | 1997-02-27 | 2000-05-09 | Lorne Park Research, Inc. | PNA diagnostic methods |
| US5846729A (en) * | 1997-02-27 | 1998-12-08 | Lorne Park Research, Inc. | Assaying nucleotides in solution using a fluorescent intensity quenching effect |
| US6251591B1 (en) | 1997-02-27 | 2001-06-26 | Lorne Park Research, Inc. | Quantitative method for detecting nucleotide concentration |
| JP3016759B2 (ja) * | 1997-02-28 | 2000-03-06 | スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション | 競争的ハイブリダイゼーションによる蛍光エネルギー転移 |
| US7803528B1 (en) | 1997-02-28 | 2010-09-28 | Quest Diagnostics Incorporated | Fluorescence energy transfer by competitive hybridization |
| EP1666609B1 (en) * | 1997-02-28 | 2012-09-26 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Fluorescence energy transfer by competitive hybridization |
| CA2303945A1 (en) * | 1997-09-18 | 1999-03-25 | Erasmus Universiteit Rotterdam | Detection of minimal residual disease in lymphoid malignancies |
| US5935791A (en) * | 1997-09-23 | 1999-08-10 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acids by fluorescence quenching |
| FR2769323B1 (fr) * | 1997-10-08 | 2001-07-13 | Suez Lyonnaise Des Eaux | Moyens pour l'analyse qualitative et quantitative des populations microbiennes eventuellement presentes dans un echantillon |
| DE69841849D1 (de) * | 1997-10-27 | 2010-09-30 | Boston Probes Inc | Sich auf "pna molecular beacons" beziehende verfahren, testsätze und zusammensetzungen |
| US6485901B1 (en) | 1997-10-27 | 2002-11-26 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions pertaining to linear beacons |
| US6080868A (en) | 1998-01-23 | 2000-06-27 | The Perkin-Elmer Corporation | Nitro-substituted non-fluorescent asymmetric cyanine dye compounds |
| GB9803382D0 (en) | 1998-02-19 | 1998-04-15 | Secr Defence | Detection system |
| US7090975B2 (en) | 1998-03-13 | 2006-08-15 | Promega Corporation | Pyrophosphorolysis and incorporation of nucleotide method for nucleic acid detection |
| US6277578B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-08-21 | Promega Corporation | Deploymerization method for nucleic acid detection of an amplified nucleic acid target |
| US6270973B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-08-07 | Promega Corporation | Multiplex method for nucleic acid detection |
| US6391551B1 (en) | 1998-03-13 | 2002-05-21 | Promega Corporation | Detection of nucleic acid hybrids |
| US6235480B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-05-22 | Promega Corporation | Detection of nucleic acid hybrids |
| US6270974B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-08-07 | Promega Corporation | Exogenous nucleic acid detection |
| US6268146B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-07-31 | Promega Corporation | Analytical methods and materials for nucleic acid detection |
| US6703211B1 (en) | 1998-03-13 | 2004-03-09 | Promega Corporation | Cellular detection by providing high energy phosphate donor other than ADP to produce ATP |
| US6312902B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-11-06 | Promega Corporation | Nucleic acid detection |
| US6361942B1 (en) | 1998-03-24 | 2002-03-26 | Boston Probes, Inc. | Method, kits and compositions pertaining to detection complexes |
| US6255050B1 (en) | 1998-05-22 | 2001-07-03 | Lorne Park Research, Inc. | Dynamic hybridization system |
| GB9812768D0 (en) * | 1998-06-13 | 1998-08-12 | Zeneca Ltd | Methods |
| DE69941333D1 (de) * | 1998-07-02 | 2009-10-08 | Gen Probe Inc | Molekulare fackeln |
| GB9819418D0 (en) * | 1998-09-07 | 1998-10-28 | Secr Defence | Amplification method |
| US6153411A (en) * | 1998-10-30 | 2000-11-28 | American Water Works Company, Inc. | Methods and kits for detection of Cryptosporidium parvum using immunomagnetic separation and amplification |
| US7141417B1 (en) * | 1999-02-25 | 2006-11-28 | Thomas Jefferson University | Compositions, kits, and methods relating to the human FEZ1 gene, a novel tumor suppressor gene |
| US6221635B1 (en) | 1999-05-06 | 2001-04-24 | The Wistar Institute | Methods for solid-phase amplification of DNA template (SPADT) using multiarrays |
| US6645733B1 (en) | 1999-06-25 | 2003-11-11 | Ingeneus Corporation | Fluorescent intensity method for assaying binding between proteins or peptides |
| US6692834B1 (en) * | 1999-06-28 | 2004-02-17 | Medtronic, Inc. | Method for coating implantable devices |
| AU780156B2 (en) * | 1999-09-22 | 2005-03-03 | Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd | Hybridization self-recognition type probe |
| WO2001038585A2 (en) | 1999-11-24 | 2001-05-31 | The Regents Of The University Of California | Polymer arrays and methods of using labeled probe molecules to identify and quantify target molecule expression |
| GB2359625B (en) * | 1999-12-10 | 2004-10-20 | Molecular Light Tech Res Ltd | Monitoring oligonucleotide binding process using chemiluminescence quenching |
| US7354707B2 (en) * | 2000-06-27 | 2008-04-08 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Nucleic acid probes, method for determining concentrations of nucleic acid by using the probes, and method for analyzing data obtained by the method |
| DE60121342T2 (de) | 2000-08-11 | 2007-06-28 | Idaho Technology, Inc., Salt Lake City | Einfach markierte oligonukleotidsonden |
| CN1348096A (zh) | 2000-10-10 | 2002-05-08 | 栾国彦 | 一种均相特异性检测核酸的探针及应用方法 |
| JP2002125688A (ja) * | 2000-10-30 | 2002-05-08 | Tosoh Corp | Ｃ型肝炎ウイルスの高感度検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法 |
| JP2002360257A (ja) * | 2001-06-05 | 2002-12-17 | Fuji Photo Film Co Ltd | Ｄｎａマイクロアレイにおける遺伝子の検出法 |
| US6902900B2 (en) * | 2001-10-19 | 2005-06-07 | Prolico, Llc | Nucleic acid probes and methods to detect and/or quantify nucleic acid analytes |
| US6946245B2 (en) | 2001-12-04 | 2005-09-20 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Oligonucleotides and methods for detecting hepatitis C viral nucleic acids |
| US6818420B2 (en) * | 2002-02-27 | 2004-11-16 | Biosource International, Inc. | Methods of using FET labeled oligonucleotides that include a 3′-5′ exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same |
| JP4481656B2 (ja) * | 2002-02-27 | 2010-06-16 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | ３’→５’エキソヌクレアーゼ耐性クエンチャードメインを含むｆｅｔ標識オリゴヌクレオチドを使用する方法およびそれを実施するための組成物 |
| DK1342794T3 (da) * | 2002-03-05 | 2006-04-24 | Epigenomics Ag | Fremgangsmåde og anordning til at bestemme vævsspecificitet af fritflydende DNA i legemsvæsker |
| US7081339B2 (en) * | 2002-04-12 | 2006-07-25 | Primera Biosystems, Inc. | Methods for variation detection |
| US7445893B2 (en) * | 2002-04-12 | 2008-11-04 | Primera Biosystems, Inc. | Sampling method for amplification reaction analysis |
| US20070059690A1 (en) * | 2002-05-31 | 2007-03-15 | Amirul Islam | "Met/fret based method of target nucleic acid detection whereby the donor/acceptor moieties are on complementary strands" |
| EP1543156A4 (en) * | 2002-07-18 | 2005-12-21 | Univ Leland Stanford Junior | DETECTION OF CHEMICAL LIGATION USING FLUORESCENCE QUENCHER SUB-GROUPS |
| US7452712B2 (en) | 2002-07-30 | 2008-11-18 | Applied Biosystems Inc. | Sample block apparatus and method of maintaining a microcard on a sample block |
| US7364848B2 (en) | 2002-09-02 | 2008-04-29 | Pamgene B.V. | Integrated microarray analysis |
| US20040067492A1 (en) * | 2002-10-04 | 2004-04-08 | Allan Peng | Reverse transcription on microarrays |
| US20050089875A1 (en) * | 2002-11-21 | 2005-04-28 | Sention Inc. | Quantitative analysis of expression profiling information produced at various stages of an amplification process |
| WO2004051218A2 (en) | 2002-12-04 | 2004-06-17 | Applera Corporation | Multiplex amplification of polynucleotides |
| WO2004068112A2 (en) * | 2003-01-28 | 2004-08-12 | Gorilla Genomics, Inc. | Hairpin primer amplification |
| US20040219533A1 (en) * | 2003-04-29 | 2004-11-04 | Jim Davis | Biological bar code |
| AU2004235747B2 (en) * | 2003-05-01 | 2009-05-28 | Gen-Probe Incorporated | Oligonucleotides comprising a molecular switch |
| WO2005028629A2 (en) * | 2003-09-19 | 2005-03-31 | Applera Corporation | Whole genome expression analysis system |
| US20060024690A1 (en) * | 2003-09-19 | 2006-02-02 | Kao H P | Normalization of data using controls |
| US7439341B2 (en) | 2003-11-14 | 2008-10-21 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Fluorescence quenching azo dyes, their methods of preparation and use |
| CN101076537B (zh) * | 2003-11-19 | 2012-07-04 | 阿莱洛吉克生物科学公司 | 标记有多个荧光团的寡核苷酸 |
| US20090041782A1 (en) * | 2003-12-30 | 2009-02-12 | Takashi Ooshima | Novel serotype streptococcus mutans and utilization of the same |
| WO2005077125A2 (en) * | 2004-02-11 | 2005-08-25 | Applera Corporation | Methods and compositions for detecting nucleic acids |
| WO2005085475A1 (en) | 2004-03-01 | 2005-09-15 | Applera Corporation | Methods, compositions and kits for use in polynucleotide amplification |
| US20050255485A1 (en) * | 2004-05-14 | 2005-11-17 | Livak Kenneth J | Detection of gene duplications |
| ATE557090T1 (de) * | 2004-05-20 | 2012-05-15 | Aes Chemunex S A | Polynukleotide zum nachweis von escherichia coli o157:h7- und escherichia coli o157:nm- verotoxinproduzenten |
| US20060003337A1 (en) * | 2004-06-30 | 2006-01-05 | John Brandis | Detection of small RNAS |
| CA2579349A1 (en) | 2004-09-07 | 2006-03-16 | Telethon Institute For Child Health Research | Agents for treatment or prevention of an allergic disorder |
| ATE482288T1 (de) | 2004-11-18 | 2010-10-15 | Eppendorf Array Technologies | Echtzeit-pcr von zielen auf einem mikroarray |
| US20090068650A1 (en) * | 2005-02-11 | 2009-03-12 | Southern Illinois University | Metabolic Primers for the Detection of (Per) Chlorate-Reducing Bacteria and Methods of Use Thereof |
| US20060194240A1 (en) * | 2005-02-28 | 2006-08-31 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods of detecting an analyte by using a nucleic acid hybridization switch probe |
| US8263330B1 (en) | 2005-03-08 | 2012-09-11 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Detection of Mycobacterium tuberculosis complex nucleic acids |
| WO2006099255A2 (en) | 2005-03-10 | 2006-09-21 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods to perform assays for detecting or quantifying analytes within samples |
| US7601498B2 (en) * | 2005-03-17 | 2009-10-13 | Biotium, Inc. | Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection and associated technology |
| US7776567B2 (en) | 2005-03-17 | 2010-08-17 | Biotium, Inc. | Dimeric and trimeric nucleic acid dyes, and associated systems and methods |
| CA2601554A1 (en) | 2005-05-20 | 2006-11-30 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Compounds and methods for labeling oligonucleotides |
| GB0514889D0 (en) | 2005-07-20 | 2005-08-24 | Lgc Ltd | Oligonucleotides |
| CA2627967A1 (en) | 2005-11-10 | 2007-05-24 | Panomics, Inc. | Detection of nucleic acids through amplification of surrogate nucleic acids |
| CA2637600A1 (en) | 2006-01-17 | 2007-07-26 | Health Research, Inc. | Heteroduplex tracking assay |
| US7824858B2 (en) * | 2006-01-23 | 2010-11-02 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Assay for mycobacterium avium/intracellulare nucleic acid |
| CA2645136C (en) * | 2006-03-16 | 2017-09-19 | Pentabase Aps | Oligonucleotides comprising signalling pairs and hydrophobic nucleotides, stemless beacons, for detection of nucleic acids, methylation status and mutants of nucleic acids |
| WO2007115059A2 (en) | 2006-03-29 | 2007-10-11 | Merial Limited | Vaccine against streptococci |
| US8078264B2 (en) | 2006-07-11 | 2011-12-13 | Case Western Reserve University | Intra-operative molecular imaging |
| US7700756B2 (en) * | 2006-07-27 | 2010-04-20 | Southern Illinois University | Metabolic primers for the detection of perchlorate-reducing bacteria and methods of use thereof |
| WO2008021446A2 (en) * | 2006-08-15 | 2008-02-21 | Genetag Technology, Inc. | Probe-antiprobe compositions and methods for dna or rna detection |
| CA2668457C (en) * | 2006-11-02 | 2016-10-04 | Veridex, Llc | Imaging of activated vascular endothelium using immunomagnetic mri contrast agents |
| CN101595231A (zh) * | 2006-12-29 | 2009-12-02 | 霍尼韦尔国际公司 | 用于微阵列的反应缓冲液 |
| US9271653B2 (en) | 2007-06-12 | 2016-03-01 | Case Western Reserve University | Intra-operative molecular imaging |
| DE102007029772B4 (de) | 2007-06-22 | 2011-12-08 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren und Schnelltest zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen |
| IL184478A (en) * | 2007-07-08 | 2017-07-31 | Hadasit Medical Res Services & Development Ltd | Preparations, methods and kits for identifying carriers of mutations in genes 1brca and 2brca and for the early detection of cancers associated with mutations in these genes |
| EP2107125A1 (en) | 2008-03-31 | 2009-10-07 | Eppendorf Array Technologies SA (EAT) | Real-time PCR of targets on a micro-array |
| US20100143901A1 (en) * | 2008-12-09 | 2010-06-10 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nuclease-Free Real-Time Detection of Nucleic Acids |
| CN102449167B (zh) * | 2009-05-26 | 2014-12-17 | 厦门大学 | 一种检测核酸序列变异的方法 |
| EP2488548A1 (en) | 2009-10-14 | 2012-08-22 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung | A low density lipoprotein-related protein 1 splice variant as cancer marker |
| US8877437B1 (en) | 2009-12-23 | 2014-11-04 | Biotium, Inc. | Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection |
| US9506057B2 (en) | 2010-03-26 | 2016-11-29 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Modifications for antisense compounds |
| US20120108799A1 (en) | 2010-09-07 | 2012-05-03 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Modifications for Antisense Compounds |
| WO2011120049A1 (en) | 2010-03-26 | 2011-09-29 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Methods for enhancing nucleic acid hybridization |
| DE102010003781B4 (de) * | 2010-04-08 | 2012-08-16 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen |
| DE102010003782B4 (de) | 2010-04-08 | 2023-09-28 | Ist Innuscreen Gmbh | Vorrichtung zum Nachweis von Nukleinsäuren |
| EP2593569B1 (en) | 2010-07-12 | 2018-01-03 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and assays to detect seasonal h1 influenza a virus nucleic acids |
| US9046507B2 (en) | 2010-07-29 | 2015-06-02 | Gen-Probe Incorporated | Method, system and apparatus for incorporating capacitive proximity sensing in an automated fluid transfer procedure |
| DE102010033107A1 (de) | 2010-08-02 | 2012-02-02 | Aj Innuscreen Gmbh | Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen mittels Fluoreszenzlöschung |
| WO2012016936A1 (de) | 2010-07-31 | 2012-02-09 | Aj Innuscreen Gmbh | Nachweis spezifischer nukleinsäuresequenzen mittels fluoreszenz - quenching |
| WO2012034130A2 (en) | 2010-09-10 | 2012-03-15 | Qiagen | Methods and compositions for nucleic acid detection |
| WO2012042516A2 (en) | 2010-09-29 | 2012-04-05 | Mor Research Applications Ltd. | Prognostic methods, compositions and kits for prediction of acute lymphoblastic leukemia (all) relapse |
| WO2012116308A1 (en) | 2011-02-24 | 2012-08-30 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods for distinguishing optical signals of different modulation frequencies in an optical signal detector |
| DE102011078342A1 (de) | 2011-06-29 | 2013-01-03 | Aj Innuscreen Gmbh | Rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von spezifischen Nukleinsäuren in Echtzeit |
| US20140228243A1 (en) | 2011-09-04 | 2014-08-14 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Prognostic methods and compositions for predicting interferon treatment eficacy in a subject |
| CN107326085B (zh) | 2012-02-03 | 2022-05-03 | 加州理工学院 | 多路生化测定中信号的编码和解码 |
| WO2013131083A1 (en) | 2012-03-02 | 2013-09-06 | Winthrop-University Hospital | METHOD FOR USING PROBE BASED PCR DETECTION TO MEASURE THE LEVELS OF CIRCULATING DEMETHYLATED β CELL DERIVED DNA AS A MEASURE OF β CELL LOSS IN DIABETES |
| US9133509B2 (en) | 2012-03-22 | 2015-09-15 | Lgc Genomics Limited | Polymerase chain reaction detection system |
| US20150119447A1 (en) | 2012-05-09 | 2015-04-30 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Clustered single nucleotide polymorphisms in the human acetylcholinesterase gene and uses thereof in diagnosis and therapy |
| CN104662172B (zh) | 2012-08-03 | 2018-07-06 | 加州理工学院 | Pcr中具有减少的硬件和要求的多重化和定量 |
| ES2556852T3 (es) | 2012-09-26 | 2016-01-20 | 3A Composites Gmbh | Techo de vehículo abombado con elemento de refuerzo y amortiguación |
| CN103114131B (zh) | 2012-11-30 | 2018-10-02 | 珠海市坤元农业科技有限公司 | 一种引物中部序列干扰pcr技术 |
| AU2013202805B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-07-16 | Gen-Probe Incorporated | System and method for extending the capabilities of a diagnostic analyzer |
| US20160265058A1 (en) | 2013-11-01 | 2016-09-15 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Diagnostic methods and kits for determining a personalized treatment regimen for a subject suffering from a pathologic disorder |
| ES2703792T3 (es) | 2013-11-22 | 2019-03-12 | Orion Diagnostica Oy | Detección de ácidos nucleicos mediante amplificación basada en invasión de hebra |
| EP2933341B1 (en) | 2014-04-18 | 2017-10-04 | Schweitzer Biotech Company Ltd. | Methods for detecting pathogen in coldwater fish |
| GB201410022D0 (en) | 2014-06-05 | 2014-07-16 | Orion Diagnostica Oy | Method |
| US20170268070A1 (en) | 2014-07-30 | 2017-09-21 | Mor Research Applications Ltd. | Prognostic methods and systems of treatment for acute lymphoblastic leukemia |
| US11091810B2 (en) * | 2015-01-27 | 2021-08-17 | BioSpyder Technologies, Inc. | Focal gene expression profiling of stained FFPE tissues with spatial correlation to morphology |
| US10683534B2 (en) * | 2015-01-27 | 2020-06-16 | BioSpyder Technologies, Inc. | Ligation assays in liquid phase |
| US9856521B2 (en) * | 2015-01-27 | 2018-01-02 | BioSpyder Technologies, Inc. | Ligation assays in liquid phase |
| US20180305761A1 (en) | 2015-10-09 | 2018-10-25 | Genefron Ltd. | METHODS AND KITS FOR PREDICTION AND DIAGNOSIS OF HUMAN CYTOMEGALOVIRUS (hCMV) CONGENITAL TRANSMISSION |
| CN109642252A (zh) | 2016-06-17 | 2019-04-16 | 加州理工学院 | 核酸反应及相关方法和组合物 |
| JP6853523B2 (ja) * | 2016-07-27 | 2021-03-31 | 国立大学法人京都大学 | ヘリカーゼを用いたｐｃｒ |
| US12203129B2 (en) | 2018-07-03 | 2025-01-21 | ChromaCode, Inc. | Formulations and signal encoding and decoding methods for massively multiplexed biochemical assays |
| CN111004865A (zh) | 2018-10-05 | 2020-04-14 | 福又达生物科技股份有限公司 | 鱼病原体检测方法 |
| IT202100009338A1 (it) | 2021-04-14 | 2022-10-14 | Celera Digital S R L | Sistema di interconnessione e predizione aziendale e metodo di funzionamento di sistema di segnalazione |
| DK181862B1 (en) | 2022-03-21 | 2025-02-24 | Samplix Aps | Method and kit for targeted enrichment of large dna molecules for long-read sequencing using facs or microfluidic partitioning |
Family Cites Families (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4220450A (en) | 1978-04-05 | 1980-09-02 | Syva Company | Chemically induced fluorescence immunoassay |
| US4766064A (en) | 1984-05-07 | 1988-08-23 | Allied Corporation | Displacement polynucleotide assay employing polyether and diagnostic kit |
| CA1273552A (en) * | 1985-12-23 | 1990-09-04 | Michael J. Heller | Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization assays |
| EP0232967B1 (en) | 1986-01-10 | 1993-04-28 | Amoco Corporation | Competitive homogeneous assay |
| US5635347A (en) | 1986-04-30 | 1997-06-03 | Igen, Inc. | Rapid assays for amplification products |
| US5466591A (en) * | 1986-08-22 | 1995-11-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable DNA polymerases |
| US5273879A (en) * | 1987-07-23 | 1993-12-28 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Amplification method for polynucleotide assays |
| US5118801A (en) | 1988-09-30 | 1992-06-02 | The Public Health Research Institute | Nucleic acid process containing improved molecular switch |
| WO1990003445A1 (en) | 1988-09-30 | 1990-04-05 | The Salk Institute For Biological Studies | Target nucleic acid amplification/detection systems |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| WO1992014845A1 (en) * | 1991-02-26 | 1992-09-03 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Diagnosing cystic fibrosis and other genetic diseases using fluorescence resonance energy transfer (fret) |
| DE69213112T2 (de) * | 1991-06-20 | 1997-04-03 | Hoffmann La Roche | Verbesserte Methoden zur Nukleinsäure-Amplifizierung |
| CA2218875C (en) | 1991-07-23 | 2000-11-07 | The Research Foundation Of State University Of New York | Improvements in the in situ pcr |
| ES2112302T3 (es) | 1991-10-11 | 1998-04-01 | Behringwerke Ag | Metodo para producir un polinucleotido para uso en amplificacion con un unico cebador y oligonucleotidos que contienen fosforotioato como cebadores para la amplificacion de acidos nucleicos. |
| JP2788786B2 (ja) * | 1991-11-15 | 1998-08-20 | イゲン，インコーポレーテッド | 増幅生成物の迅速アッセイ |
| US5332659A (en) | 1992-04-09 | 1994-07-26 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Light emission-or absorbance-based binding assays for polynucleic acids |
| US6020124A (en) | 1992-04-27 | 2000-02-01 | Trustees Of Dartmouth College | Detection of soluble gene sequences in biological fluids |
| GB9211979D0 (en) | 1992-06-05 | 1992-07-15 | Buchard Ole | Uses of nucleic acid analogues |
| EP0656068B1 (en) | 1992-07-24 | 1999-12-15 | University Of South Australia | Amplification and detection process |
| JP4372837B2 (ja) * | 1992-08-04 | 2009-11-25 | ジェン−プローブ・インコーポレイテッド | 核酸配列増幅 |
| EP0599388B1 (en) | 1992-11-20 | 2000-08-02 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Semiconductor device provided with a programmable element |
| JPH06153997A (ja) | 1992-11-27 | 1994-06-03 | Canon Inc | 検出信号増幅による標的核酸の検出方法 |
| EP0601889A2 (en) * | 1992-12-10 | 1994-06-15 | Maine Medical Center Research Institute | Nucleic acid probes |
| US5364790A (en) | 1993-02-16 | 1994-11-15 | The Perkin-Elmer Corporation | In situ PCR amplification system |
| US5422252A (en) * | 1993-06-04 | 1995-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Simultaneous amplification of multiple targets |
| GB9311386D0 (en) | 1993-06-02 | 1993-07-21 | Pna Diagnostics As | Nucleic acid analogue assay procedures |
| EP0648055B1 (en) * | 1993-10-12 | 2000-01-19 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Scrambling system, scrambling apparatus and descrambling apparatus |
| DK1921169T3 (da) | 1993-11-12 | 2012-06-04 | Phri Properties Inc | Hybridiseringssonder til nukleinsyredetektion, universelle stamceller, fremgangsmåder og kits |
| US5925517A (en) | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
| US5538848A (en) | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| US5629178A (en) | 1994-10-28 | 1997-05-13 | Genetics & Ivf Institute | Method for enhancing amplification in the polymerase chain reaction employing peptide nucleic acid (PNA) |
| IE72524B1 (en) | 1994-11-04 | 1997-04-23 | Elan Med Tech | Analyte-controlled liquid delivery device and analyte monitor |
| CA2219891C (en) | 1995-05-05 | 2002-01-29 | The Perkin-Elmer Corporation | Methods and reagents for combined pcr amplification and hybridization probing assay |
| JP3418622B2 (ja) | 1995-08-14 | 2003-06-23 | アボツト・ラボラトリーズ | オールインワン核酸増幅アッセイ |
-
1996
- 1996-04-05 CA CA002219891A patent/CA2219891C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-05 DE DE69610304T patent/DE69610304T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-05 JP JP53330996A patent/JP4040087B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-04-05 WO PCT/US1996/004693 patent/WO1996034983A1/en active IP Right Grant
- 1996-04-05 EP EP96911592A patent/EP0826066B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-05 AU AU54428/96A patent/AU693023B2/en not_active Expired
- 1996-04-05 AT AT96911592T patent/ATE196322T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-09-11 US US08/710,075 patent/US5691146A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-04-03 US US08/826,538 patent/US6485903B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-05-19 US US08/859,472 patent/US6395518B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-11-12 US US10/293,236 patent/US20030215826A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-04-02 JP JP2003099758A patent/JP4040519B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-09-06 JP JP2004259091A patent/JP2005110666A/ja not_active Ceased
- 2004-09-20 US US10/946,458 patent/US7241596B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-07-09 US US11/775,151 patent/US7413708B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-08-18 US US12/193,667 patent/US7847076B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-10-27 US US12/913,714 patent/US20110275071A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20080050742A1 (en) | 2008-02-28 |
| EP0826066B1 (en) | 2000-09-13 |
| JP2004000185A (ja) | 2004-01-08 |
| EP0826066A1 (en) | 1998-03-04 |
| US20030215826A1 (en) | 2003-11-20 |
| US7241596B2 (en) | 2007-07-10 |
| ATE196322T1 (de) | 2000-09-15 |
| AU693023B2 (en) | 1998-06-18 |
| US6485903B1 (en) | 2002-11-26 |
| US20090258351A1 (en) | 2009-10-15 |
| JP4040519B2 (ja) | 2008-01-30 |
| WO1996034983A1 (en) | 1996-11-07 |
| DE69610304D1 (de) | 2000-10-19 |
| AU5442896A (en) | 1996-11-21 |
| CA2219891A1 (en) | 1996-11-07 |
| US20110275071A1 (en) | 2011-11-10 |
| JP2005110666A (ja) | 2005-04-28 |
| US6395518B1 (en) | 2002-05-28 |
| DE69610304T2 (de) | 2001-04-05 |
| JPH11504219A (ja) | 1999-04-20 |
| US20050227247A1 (en) | 2005-10-13 |
| CA2219891C (en) | 2002-01-29 |
| US7413708B2 (en) | 2008-08-19 |
| US5691146A (en) | 1997-11-25 |
| US7847076B2 (en) | 2010-12-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4040087B2 (ja) | Ｐｃｒ増幅とハイブリダイゼーションプロービングアッセイとを組み合わせた方法およびそのための試薬 | |
| US5538848A (en) | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe | |
| US6821727B1 (en) | Hybridization assay using self-quenching fluorescence probe | |
| US6803201B2 (en) | Compositions and methods for polynucleotide sequence determination | |
| JP3016759B2 (ja) | 競争的ハイブリダイゼーションによる蛍光エネルギー転移 | |
| EP1585832B1 (en) | Compositions and methods for polynucleotide detection | |
| AU695561C (en) | Self-quenching fluorescence probe and method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040906 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051129 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20060222 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20060424 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060519 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20071023 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20071107 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101116 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101116 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101116 Year of fee payment: 3 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101116 Year of fee payment: 3 |
|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111116 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111116 Year of fee payment: 4 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111116 Year of fee payment: 4 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121116 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131116 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |