JP4415093B2 - 標識化複合体並びにその製造方法及び使用方法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、標識化複合体並びにその製造方法および使用方法に関する。単位体積当たりの表面積が大きい微小粒子等の担体は、生物学的分子を取り着けるための優れた固体を提供するとともに、これらの担体を蛍光等の発光物質で標識化することは、高い感度でのそれらの検出を可能にする。本発明は、農学、薬学、医学、化学または生物学等の理学、工学の分野で、遺伝子操作や医療、薬品、生理衛生、保健、生物、食品または材料等の種々の領域で、検査、測定、反応、生産、抽出または観察等を行うために用いるものである。
技術の背景
従来から、微小物質を標識化して、高い感度で識別するために、蛍光等の発光物質が用いられている。例えば、試料中の核酸を測定するため、蛍光性微小粒子を結合したＤＮＡプローブと、異なるＤＮＡプローブと結合した粒径の大きい非蛍光性微小粒子とを用いて、試料中のＤＮＡプローブとハイブリダイズして、二本鎖を形成させる。その後、２種類の微小粒子の粒径の中間径のフィルタで、未結合の余剰蛍光粒子を除去し、制限酵素を作用させて、２本鎖部位を切断し、遊離した蛍光性微小粒子をフィルタで分別し、フローセルに導入して蛍光によって粒子を識別し粒子数を計数することによって、試料中のＤＮＡプローブの濃度の測定の自動化を行うものがあった（特開平６−３４３４９６）。
または、被検物質中の特異性のある部分Ａに結合する物質を結合させた蛍光波長Ｘの蛍光微粒子Ｐと、被検物質中の上記部分Ａとは異なる、特異性のある部分Ｂに結合する物質を結合させた蛍光波長Ｙの蛍光微粒子Ｑとを用いて、被検物質中に蛍光微粒子Ｐ，Ｑの両者を特異的に結合させて、得られた混合液をフローサイトメータに一定量流し、上記溶液中の蛍光微粒子Ｐ，Ｑの発する前方散乱光、上記蛍光波長Ｘ，Ｙをそれぞれ含む２種類の蛍光を測定することによって、リガンドとの反応によるラテックス凝集を識別し、粒子計測装置で測定するものがあった（特開平５−１０７２４９）。
ところで、以上説明したように、従来では、各粒子にはせいぜい１種類の蛍光物質が付着させるか、または、蛍光物質そのものを微小粒子状に形成し、その粒子に結合物質を付着させて用いるものであった。一方、ＤＮＡ等の生体化合物に悪影響を与えずに、且つ高感度で識別可能な蛍光物質の種類は限られ、せいぜい数十種類である。そのため、従来のやり方では、せいぜい数十通りの識別を実現することしかできず、例えば、数千、または数万の種類の目的物を蛍光物質だけで識別することはできなかった。
一方、多数の種類の目的物を複数種類の蛍光物質によって、識別可能とするために、これらの蛍光物質を組み合わせて微小粒子に付着させて抗原および／または抗体を検出するものがあった（特開昭６０−３５２６５）。しかし、微小粒子表面のような狭い領域に、多数の蛍光物質を高密度に付着することは、蛍光物質間のエネルギ移動やクエンチング（消光）が発生して、スペクトルの識別および蛍光強度に悪影響を与える。そのため、安定した状態で、何千または何万以上の目的物の種類を、蛍光物質で微小粒子を標識化して識別するのは不可能であるという問題点を有していた。また、微小粒子表面への蛍光物質の付着量を増加させて、発光強度や識別数を増加させることと、微小粒子表面へ目的物質を捕獲させる能力を増加させたり、微小粒子表面が保有する情報量を増加させるために情報を保有するための領域面積を増加させることとは相矛盾し、その双方の能力を満足させることができないという問題点を有していた。
そこで、本発明は、第一には、コンビナトリアル・ケミストリにおける多分子マーキングとして、数百、数千、数万のオーダー以上の種々の微小物を高感度、高精度、安定的、且つ明瞭に峻別することを可能とする標識化複合体並びにその製造および使用方法を提供するものである。
第二には、物質の捕獲能力や情報保持能力の向上と、識別感度や識別数等の識別能力の向上との全てを同時に満足することができる優れた標識化複合体並びにその製造および使用方法を提供するものである。
第三には、微小粒子等の担体を用いることで、単位体積または単位質量当たり多くの情報量を標識化することによって、多数の標識化した容器の使用を省略することができるので、省空間、装置規模の縮小を図るとともに、一斉に同一の条件で処理を加えることによって、精度が高く、効率的且つ迅速な処理を行うことができる標識化複合体並びにその製造および使用方法を提供するものである。
第四には、磁性体粒子等の担体を標識化することによって、種々の多様な処理の自動化を分注から測定まで一貫して実現することができることによって、磁性体粒子の機能を飛躍的に増大することができる標識化複合体並びにその製造および使用方法を提供するものである。
第五には、安価に、容易に、且つ安定した品質で製造することができるとともに、識別または測定が容易、高精度、且つ信頼性が高い標識化複合体並びにその製造および使用方法を提供するものである。
第六には、汎用性または多様性のある使用をすることができる標識化複合体並びにその製造および使用方法を提供するものである。
第七には、種々の蛋白質等の物質と、種々の塩基配列に対して転写の制御を行うことができる転写制御因子および異なる塩基配列を有するＤＮＡ断片等の対応物質との間の関連性を見極めるためにきめ細かい標識化を可能にし、ガンや生物の発生等の研究、医薬や化学品製造や遺伝子技術等への多大の寄与をすることができる標識化複合体並びにその製造および使用方法を提供するものである。
発明の開示
以上の技術的課題を解決するために、第一の発明は、１個の担体と、その担体に結合した多数の標的保有体と、その担体が結合した部位と異なる部位で各標的保有体に結合した標識物質とからなり、その標的保有体は、１または２以上の種類の標的を保有しまたは保有可能であり、その標識物質の全体は、所定の種類が所定の量比含まれたものである。
ここで、「担体」は、特定の物質を保持可能であって、溶液に懸濁して用いられる微小物体であって、例えば、粒子状、繊維状もしくはゲル状等の物体（特に形状にはとらわれない）を含む。また、親水性ポリマー等からなる、溶媒に可溶性の高分子の物体を含めても良い。形状に特に限定はないが、例えば、球状である。その粒径の大きさは特に限定されるものではないが、好ましくは、約０．１μｍ〜約１ｍｍのオーダをもつものである。その微小粒子は、例えば、ポリスチレン、ナイロン等の合成樹脂のビーズ、ラテックス粒子、ガラスビーズ、ゲル状物質、または磁性粒子等の金属粒子で形成されるのが好ましい。
「標識物質」には、蛍光や燐光等の励起用光を必要とする発光物質に限られず、励起用光を必要としない化学発光、生物発光であっても良い。その他、例えば、特定の物質と特異的に反応する物質や、放射性同位元素等の放射性物質、赤外線等の電磁波放射物質等であっても良い。また、これらを組み合わせて用いることも可能である。尚、１個の担体に関する標識物質の全体は、１個の担体と結合する標的保有体の全てまたは略全てに分配されて結合されるのが好ましい。これは分配された個々の標識物質間が離れてクエンチングを防止することができるとともに、製造を容易にするからである。各標的保有体への分配のしかたは、例えば、標識物質の１分子毎、等分子量毎、等量毎または１種類毎等がある。
標識物質および標的保有体を別個に各々微小粒子等の担体に結合させずに、標識物質が結合した標的保有体をその担体に結合するのは次の理由からである。
（１）数千または数万以上の種類を識別するために「種類」および「量比」を変えた大量の標識物質を限られた担体の表面に直接結合させることは、検査用物質や標的を結合または保有するための領域を狭め保有または捕獲能力を劣化させるおそれがある。しかし、標的保有体自体に標識物質を結合させれば、標的や検査用物質の保有捕獲能力と識別能力の双方の能力の向上を図ることができる。
（２）標的保有体に標識物質を結合させることによって、標識物質を微小粒子等の担体に直接取り付ける場合に比較して、標識物質間の間隔、距離を広げ、標識物質間のエネルギ移動やクエンチングの発生を防止し、大量の標識物質をその担体にもたせても安定した発光等による識別の可能性をより確実に保証することができる。
（３）微小粒子等の担体に担持させているので、液体中での懸濁や分布を一様且つ均一に行うことができるので、統計上の誤差を小さくして信頼性および精度の高い処理を行うことができる。
標的保有体を微小粒子等の担体に固定するには、例えば、担体が有する多数の穴、間隙若しくは凹凸による付着、吸着、接着、ビオチンとアビジン等の特異的相互作用等の物理的若しくは化学的結合等を含む結合を利用して行われる。
「標的」は、例えば、遺伝情報、免疫情報等の生物情報や化合物の構造等の情報そのもの、または、その情報を有するＤＮＡ等、アミノ酸、糖等の生体化合物を含む化合物や、細胞、ウィルス、細菌等の生物体や生物体の一部や、その他の種々の物質があり得る。また、「標的を保有し」とは、標的保有体が標的自体または標的を含有しまたは標的保有体が標的を吸着、反応、相互作用等によって保持する場合も含む。
「１または２以上の種類の標的」であるので、例えば、１担体につき複数種類の標的群毎に標識化することができるので、その標的群毎の共通の性質等を検査測定することができる。
「担体が結合した部位」および「異なる部位」は、各々２箇所以上であっても良い。また、「担体が結合した部位」と「異なる部位」が離れていればいる程、クエンチング防止の効果は高い。したがって、「担体が結合した部位」が標的保有体の一端であり、「異なる部位」が標的保有体の他端であれば最も好ましい。一端および他端にはその近傍も含む。
本発明によれば、標識物質の種類および量比を種々に特定することによって、数百、数千、数万のオーダー以上の種々の標的を対応付けて識別することが可能となる。また、種々の標識化複合体を同一容器に混合して一斉に処理を行っても、各標的は標識化されているので、各標的毎に処理結果を得ることができる。従って、各標的を識別するために多数の容器を用意する必要がなく、迅速且つ効率的に行うことができる。
本発明によると、前述したように、微小粒子等の担体の表面上において、標識用領域の増加と、標的保有用領域の増加とが拮抗せず、むしろ、標的保有体の増加は、標的保有能力の増加と標識物質量の増加との双方をもたらし、識別数を含む識別能力を増加させることになる。また、標的保有体のみを変えることによって、多様で汎用的な処理が可能となる。また、本発明は標的保有体を介して標識物質を結合させ、微小粒子等の担体に直接標識物質を結合させるものではない。従って、標識物質間の間隔を、担体に直接結合するものに比べ、より広くとることができるので、標識物質間のエネルギ移動やクエンチング（発光物質を用いた場合）等の相互作用を防止して、多数の物質を高精度且つ安定的に識別することを可能とする。
第二の発明は、第一の発明において、前記標識物質の全体は、１個の担体と結合する標的保有体の略全てに分配され、１個の標的保有体は１種類の標識物質と結合したものである。本発明によると、結合する標識物質の種類が異なる標的保有体の個数を量比に応じて定めることができるので、構成が簡単かつ製造が容易となる。
第三の発明は、第一の発明または第二の発明のいずれかにおいて、前記標的保有体は、ある部位で前記担体と結合し、他の部位で前記標識物質と結合した線状、糸状、毛状、または棒状等の長細形状に形成されたものである。
「長細形状」のサイズには、特に限定はないが、例えば、前記微小粒子の粒径に比較して、その粒径よりも太さは十分に細く、長さがその太さよりも長く、例えば、その粒径と同程度またはそれ以上に十分に長い形状であり、例えば、粒径の約１０倍程度、例えば、約１０μｍである。
長細形状に形成するのは、その端に発光物質等の標識物質を取り付けることによって、標識物質を微小粒子等の担体に直接取り付ける場合に比較して、担体との間隔、さらには標識物質間の間隔、距離を広げ標識物質間のエネルギ移動やクエンチングの発生を防止し、大量の標識物質を担体にもたせても安定した発光等の識別の可能性をより確実に保証するスペーサとしての役割を担わせるためである。本発明によれば、標識物質間の間隔を、担体に直接結合するものに比べてより広くとることができるので、標識物質間のエネルギ移動やクエンチング（発光物資の場合）等による相互作用を防止して、例えば、数千、数万以上というような多数の物質を高精度且つ安定的に識別することができる。
第四の発明は、第一の発明ないし第三の発明のいずれかにおいて、前記標的保有体は、例えば、核酸、ペプチド、蛋白質、多糖体若しくは脂質等の生体高分子を含む化合物、または、ウィルス若しくは細菌等の生物体若しくはその一部、または、これらを保持し若しくは保持可能な物質である。本発明によれば、前記標的保有体として、核酸、または核酸以外の物質を用いることができる。例えば、核酸を用いた場合には、種々の蛋白質の中から、種々の塩基配列に対して転写の制御を行うことができる転写制御因子や異なる塩基配列を有するＤＮＡ断片を、多数の蛋白質または塩基配列等の物質をきめ細かく標識化することによって、迅速且つ容易に発見することができる。これによって、ガンや生物の発生等の研究への多大の寄与をすることができる。その他、種々の物質を用いることによって種々の物質間の関連性、例えば、相互作用の強さ、構造の類似性等を認識することができる。
ここで、「核酸」は、狭義には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）であり、広義には、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）を含めても良い。ＲＮＡには、ｍＲＮＡ，ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡがある。また、ＤＮＡ、ＲＮＡ体のみならず、そのＤＮＡ，ＲＮＡの断片である場合も含む。尚、蛋白質、多糖体、脂質等には、抗原または抗体も含む。
第五の発明は、第一の発明ないし第四の発明のいずれかにおいて、前記標的保有体は、二本鎖の所定塩基配列をもつ核酸からなり、前記標識物質は、ある部位における一本鎖にのみ結合し、他の部位における他の一本鎖に前記担体が結合したものである。標識物質が結合した部位と、担体が結合した部位はできるだけ離れた位置であるのが好ましい。二本鎖の一端と他端に相当する部位が最も好ましい。尚、例えば、標識物質として蛍光物質を用いた場合には、ＤＮＡまたはＲＮＡに蛍光物質を結合させる方法としては、例えば、チオカルバミド結合等の共有結合によるものがある。本発明によれば、二本鎮の核酸を標識物質によって、明瞭に識別することができる。
第六の発明は、第一の発明ないし第五の発明のいずれかにおいて、前記標的保有体は、二本鎖の所定塩基配列をもつ核酸からなり、前記標識物質は、一本鎖のある部位にのみ結合し、その一本鎖の他の部位に前記担体が固定したものである。本発明によれば、その標的保有体を一本鎖に変性することによって、相補性や相同性等の関連性の高い塩基配列の組み合わせをハイブリダイズによって、迅速且つ確実に見極めることができる。
第七の発明は、第一の発明ないし第五の発明のいずれかにおいて、前記標的保有体は一本鎖の核酸である。ここで、一本鎖を得るには、例えば、熱処理や、アルカリ性溶液等を加える変性によって行うことができる。本発明によれば、その標的保有体を一本鎖に変性することによって、相補性や相同性等の関連性の高い塩基配列の組み合わせをハイブリダイズによって、迅速且つ確実に見極めることができる。
第八の発明は、第一の発明ないし第五の発明において、前記標識物質は、蛍光物質、燐光物質または化学発光等の発光物質である。
ここで、蛍光物質は、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレッセイン イソチオシアネート）、ローダミン、イソチオシアネート、ＩＲＤ４０、ＣＹ３若しくはＣＹ５等の有機物質またはユウロピウム錯体等の長寿命の蛍光を発する無機物質がある。本発明は、標識物質として、蛍光または燐光等のルミネッセンス等による発光物質を用いたものである。これによって、標的の識別能力を高めるとともに、安定して且つ高い信頼性を得ることができる。
第九の発明は、第一の発明ないし第八の発明のいずれかにおいて、前記発光物質は、励起波長、発光波長、発光強度、発光偏光度、発光位相または発光寿命のいずれかによって、その種類識別可能である。ここで、「発光偏光度」とは、偏光した励起用光で蛍光分子を励起することにより、発生した蛍光がどの程度偏光しているかを測定する方法である。本発明によって、発光物質の種々の性質の相違を利用して、多数種類の標識化を可能とする。
第十の発明は、第九の発明において、前記担体には、アビジンおよびビオチン等の特異的に結合する化合物対の一方の化合物がコーティングされ、前記標的保有体は所定塩基配列をもつＤＮＡ断片であり、その一端には前記化合物対の他方の化合物が結合し、他端には前記蛍光物質が結合したものである。ここで、［特異的に結合する化合物対」には、アビジンおよびビオチンの対の他ＤＩＧ（ジゴキシンゲニン）およびアンチＤＩＧ抗体の対等のような抗原および抗体の対がある。本発明によれば、安価、簡単且つ確実に、標的保有体を担体に固定化することができる。
第十一の発明は、第一の発明ないし第十の発明のいずれかにおいて、前記担体は、遠隔操作可能な磁性体粒子等の遠隔作用体を有するものである。ここで、遠隔作用体には、磁性体粒子、荷電粒子、誘電体、走性徴生物等がある。磁性体粒子を用いた場合には、例えば、磁力体を組み込んだピペット手段によって作業を自動化することができる。荷電粒子を担体に用いた場合には、標識物質に同じ電荷をもつようにすれば、互いに反発しあって、標識物質を互いに離間させることができる。特に、磁性体粒子で担体を形成した場合には、磁力手段をピペット手段の液通路内に及ぼす装置を用いることによって、分注、移動、懸濁、攪拌、分離、洗浄、回収、再懸濁等の処理を処理の開始から測定に至るまでを完全に自動化することができる。
第十二の発明は、第一の発明ないし第十一の発明のいずれかに係る標識化複合体を製造する方法において、標識物質と結合し、且つ特定の標的を保有しまたは保有可能な標的保有体を生成する工程と、その標的保有体を担体に結合する工程とを有するものである。２つの工程の順序は問わず、また同時に行われても良い。本発明によれば、標識物質を、例えば、微小等量、等分子量ずつ多数形成し、多数の標的保有体とともに、懸濁または混合等を行えば、容易かつ均一に標識物質と結合した標的保有体を生成することができる。同様に、多数の標的保有体と多数の担体とを懸濁または混合等を行うことによって、統計的誤差内で、多数の均質な標識化複合体を容易に製造することができる。また、本発明によって製造された標識化複合体は、担体表面上、標識用領域の増加と、標的保有用領域の増加とが狭い担体表面で拮抗せず、むしろ、標的保有体の増加は、標的保有能力の増加と標識物質量の増加との双方をもたらし、識別数を含む識別能力を増加させることになる。また、標的保有体のみを変えることによって、多様で汎用的な処理が可能となる。また、本発明によって製造された標識化複合体は標的保有体を介して標識物質を結合させ、担体に直接標識物質を結合させるものではない。従って、標識物質間の間隔を、担体に直接結合するものに比べ、より広くとることができるので、標識物質間のエネルギ移動やクエンチング（発光物質を用いた場合）等の相互作用を防止して、多数の物質を高精度且つ安定的に識別することを可能とする。
第十三の発明は、第十二の発明において、前記担体に標的保有体を結合する工程は、標識物質の全体が、その標的保有体の種類またはその種類および個数比に応じて定められた種類およびその量比となるように、標識物質と結合した標的保有体を多数懸濁させた液体中に、その標的保有体が結合されるべき担体を混合することによって行うものである。ここで、「多数」は統計誤差が無視できる程の数である必要がある。「量比」は、その統計誤差を越えるような大きさの明確なオーダーの比をもつように定める必要がある。また、「懸濁」は標的保有体が十分に均質になるように攪拌するのが好ましい
本発明によれば、標識物質の特定した種類が特定した量比をもつように結合した標的保有体を多数懸濁させた液体中に担体を混合させるようにしている。担体は多数のその標的保有体の中からランダムに選択した標的保有体の一部と接触し且つ結合することになる。従って、担体と接触且つ結合した標的保有体のもつ標識物質の種類および量比は、懸濁させた標的保有体全体がもつその標識物質の種類および量比を統計誤差内で反映し、標的保有体はランダムに選択されるので、意図した種類および量比を統計誤差内で忠実に反映した標識物質をもった標識化複合体を簡単に且つ精度良く製造することができる。
尚、標識物質と結合した標的保有体を生成する工程についても、標識物質の全体を、結合されるべき標的保有体の種類またはその種類および個数比に応じて定められた種類およびその量比となるように懸濁した液と、多数のその標的保有体とを混合することによって行うことができる。
第十四の発明は、第十二の発明において、前記標的保有体を生成する工程は、標識物質と結合し、所定塩基配列をもつ一本鎖の核酸を合成し、その塩基配列と関連性の高い、前記担体と結合可能に加工された他の一本鎖の核酸を合成し、これらをアニーリングによって二本鎖の核酸を生成する工程を有するものである。ここで、「関連性が高い」には、相補性または相同性の高い場合を、相互作用が強い（親和性が高い）場合を含む。本発明によれば、安価に且つ容易に種々の標的保有体を生成することができる。
第十五の発明は、第十三の発明において、前記標的保有体を生成する工程は、前記標識物質と結合し、所定塩基配列をもつ一本鎖の核酸の複製用の第１のプライマと、前記担体と結合すべき他の一本鎖の核酸の複製用の第２のプライマとを用いて、二本鎖のその核酸を合成しおよび増幅する工程を有するものである。第十六の発明によれば、容易、迅速且つ大量に標的保有体従って標識化複合体を製造することができる。
第十六の発明は、第十二の発明において、前記標的保有体を担体に結合する工程または前記標的保有体を生成する工程は、前記標識物質または前記担体のどちらか一方と結合し、所定塩基配列をもつ一本鎖の核酸の複製用の第１のプライマを用いて、二本鎖のその核酸を合成および増幅するとともに、前記標識物質または担体が結合している端部と反対側の端部に制限酵素処理を施し、制限酵素処理が施された端部にＤＮＡリガーゼ等からなるアダプタを介して担体または標識物質を、前記標識物質または担体が結合している一本鎖側に結合して、標的保有体を担体に結合し、または標的保有体を生成するものである。本発明によれば、標識の標的である塩基配列と相補性または相同性等の関連性の高い塩基配列を見出すための標識化複合体を容易且つ大量に製造することができる。
第十七の発明は、第十六の発明において、前記標的保有体を生成する工程は、前記標識物質および前記担体と結合していない方の一本鎖を変性によって除去する工程を含むものである。本発明によれば、標識の標的である塩基配列と相補性または相同性等の関連性の高い塩基配列を見出すための標識化複合体を容易且つ大量に製造することができる。
第十八の発明は、第十二の発明において、前記担体に標的保有体を結合する工程は、担体が有する多数の穴、間隙若しくは凹凸による付着、吸着、接着、ビオチンとアビジン等の特異的相互作用等の物理的または化学的結合を含む結合を利用して、前記標的保有体と担体とを懸濁することによって、前記標的保有体と担体とを結合するものである。これによって、種々の標識化複合体を得ることができるので多様な処理に使用することができる。
第十九の発明は、第十二の発明において、前記標的保有体を生成する工程は、ある部位で標識物質に結合し、他の部位で特異的に結合する化合物対の一方が結合した複数個の標的保有体を生成する工程であり、その標的保有体を担体に結合する工程は、前記化合物対の他方がコーティングされた担体と、その標識物質が結合した前記標的保有体とを液体中で懸濁することによって、その標的保有体を担体に結合する工程である。
第二十の発明は、第一の発明ないし第十一の発明のいずれかに係る標識化複合体の標的およびその標的に対応付けられた標識物質の種類若しくは量比が相互に異なる複数種類の標識化複合体を多数有する標識化複合体群の中から、目的とする種類の標識化複合体を選別する工程と、選別されたその標識化複合体が標識化した標的を識別する工程とを有するものである。
本発明によれば、標識物質の種類および量比を種々に特定することによって、数百、数千、数万のオーダー以上の種々の標的を対応付けて識別することが可能となる。本発明によれば、種々の標識化複合体を同一容器に混合して一斉に処理を行っても、各標的は標識化されているので、各標的毎に処理結果を得ることができる。従って、各標的を識別するために多数の容器を用意する必要がなく、迅速且つ効率的に行うことができる。
第二十一の発明は、第二十の発明において、前記選別工程は、液通路と、その液通路内に磁場作用を及ぼすことが可能な磁力手段とを有し、液体の吸引または吐出を行うピペット手段を用いて、前記標識化複合体に対して、またはその標識化複合体および選別用物質に対して、定量、分離、分取、分注、清澄、懸濁、攪拌、濃縮、希釈、混合、接触、保持、捕獲、洗浄、変性、インキュベーショシ、温度制御、抽出、回収または移送等の作業によりまたはこれらの作業の組み合わせによって、処理が行われるものである。
ここで、前記ピペット手段は、単一のもののみならず、複数の先端部、液通路、および貯溜部を集積化した装置であっても良い。また、液通路は、先端部と貯溜部とを有するピペット手段において、その先端部とその貯溜部とを結ぶものであっても良い。流体の吸引吐出は、液通路内の圧力を制御する圧力制御手段によって行う。本発明によれば、各種作業またはその組み合わせを自動的に、迅速、容易、効率的且つ精度良く実行することができる。
第二十二の発明は、第二十の発明または第二十一の発明のいずれかにおいて、前記選別工程は、前記標識化複合体群を懸濁する工程と、その標識化複合体群が懸濁した懸濁液と、目的とする標識化複合体を選別するための選別用物質とを接触させる工程と、その選別用物質と結合した標識化複合体を抽出または分離する工程とを有するものである。ここで、「接触」は、例えば、両者を混合することによって、または、一方が固定された容器へ他方を注入すること等によって行う。本発明によれば、各標的と親和性の高い、または何らかの相互作用のある標的保有体の組み合わせを知ることができる。これによって、相補性、相同性または類似性のある構造等の何らかの関連性を知ることができるので、例えば、転写制御因子や異なる塩基配列を有するＤＮＡ断片を見極めることができる。
第二十三の発明は、第二十二の発明において、前記選別工程は、前記選別用物質を、標識化複合体に含有される標識物質とは異なる種類の標識物質により標識化するとともに、その標識物資に基づいて、その選別用物質と結合した標識化複合体を抽出または分離する工程とを有するものである。本発明によれば、確実かつ容易に目的とする標識化複合体の選別および識別を行うことができる。
第二十四の発明は、第二十の発明または第二十一の発明のいずれかにおいて、前記識別工程は、前記標識物質が発光物質である場合には、その標識化複合体が発する発光波長の各強度の測定結果に基づいて、その種類の量比を割出して、該当する標的を識別するものである。本発明によれば、容易に且つ確実に該当する標的を識別することができる。
第二十五の発明は、第二十の発明または第二十一の発明のいずれかにおいて、前記選別工程は、前記標的保有体が二本鎖の所定塩基配列をもつ核酸であって、前記標識物質および前記担体はその片側の一本鎖にのみ結合している場合には、他方の一本鎖は変性によって除去するとともに、前記選別用物質として、所定塩基配列をもつ核酸を用いたものである。これによって、選別用物質の検査用塩基配列と相補性または相同性が高い構造をもつ標的保有体にハイブリダイズする。その標識物質を捕獲した標識化複合体を識別することによって、その標的の構造がわかる。本発明によれば、容易且つ効率的に、特定の塩基配列とハイブリダイズする、相補性または相同性等の関連性の高い塩基配列を見出すことができる。
第二十六の発明は、第二十の発明または第二十一の発明のいずれかにおいて、前記選別工程は、選別用物質が固定された固定相と前記標識化複合体群が懸濁した液とを接触させる工程と、洗浄して懸濁液を除去することによって、固定相にその選別用物質と結合した標識化複合体を選別する工程とを有するものである。本発明によれは、固定相に捕獲された標識化複合体以外のものを洗浄して除去して標識化複合体を選別するので、選別が容易且つ確実である。
第二十七の発明は、第二十六の発明において、前記選別工程は、前記固定相から物理的または化学的に標識化複合体を溶出して抽出、分離または洗浄等によって選別する工程を有するものである。ここで、「物理的な溶出」には、振動、衝撃、圧力、熱等を与える場合があり、「化学的な溶出」には、溶液等を加える場合がある。本発明によれば、確実且つ容易に標識化複合体を識別することができる。
第二十八の発明は、第二十六の発明において、前記固定相として磁性体粒子を用い、前記標識化複合体の担体は磁性体粒子または非磁性体粒子で形成されるとともに、その標識化複合体の磁性体粒子は、固定相の磁性体粒子と比較して、同一の外部磁場に対してより小さい磁力を受けるものである。本発明によれば、遠隔操作を利用することができるので、作業や処理を自動化し、迅速且つ容易に処理を行うことができる。
第二十九の発明は、第二十六の発明において、前記選別用物質は、特異的な結合をする化合物対の一方を標識物質として標識化されるとともに、前記・別工程において、前記化合物対の他方を固定化した固定相にその選別用物質および標識化複合体の結合体を懸濁した液を接触させて、前記固定相にその結合体を結合させ、その固定相に結合した物以外の物を洗浄して除去し、前記標的保有体を変性して一本鎖にして標識化複合体を溶出して抽出または分離によって回収するものである。本発明によれば、先ず、複合体を固定相に捕獲するとともに、捕獲された複合体を抽出して選別するようにしているので、標識化複合体を確実に且つ精度良く識別することができる。
第三十の発明は、第二十の発明または第二十一の発明のいずれかにおいて、前記選別工程は、前記標識化複合体を発光物質によって標識化し、選別用物質をその標識物質とは異なる種類の発光物質により標識化するとともに、その標識化複合体群が懸濁した液と選別用物質とを混合して接触させる工程と、透光性の細管内に、その選別用物質と結合した標識化複合体を含む標識化複合体群の懸濁液を通過させる工程とを有し、前記識別工程は、前記標識化複合体群の懸濁液の前記細管の通過の際に受光する工程と、その選別用物質が発する光の強度の測定により選別された標識化複合体について、その標識化複合体が発する光の強度の測定結果に基づいて、その種類およびその量比を割り出して、該当する標的を識別する工程とを有するものである。
ここで、懸濁液のその細管内の流速は、例えば、その細管内において標識化複合体が１粒子ずつ重ならないように通過するように調節するようにしても良い。その流速は、細管の内径、懸濁液の濃度等によって定まる。本発明によれば、光の強度の測定によって、標識化複合体の選別と標的の識別を同時に行うことができるので、効率良く且つ信頼性良く標的を検出することができる。
第三十一の発明は、第三十の発明において、前記識別物質または選別用物質が蛍光物質または燐光物質である場合には、前記懸濁液を前記細管内を通過させる工程において、前記細管に向けて、その物質を励起させる励起用光を照射するものである。本発明によれば、確実かつ信頼性高く標的を検出することができる。
第三十二の発明は、標識化複合体群が懸濁する液を搬送するための搬送用ポンプと、その懸濁液が内部を通過する透光性の細管と、その細管を通過する際に、その標識化複合体の識別物質および選別用物質からの光を受光する受光手段と、前記受光手段が受光した光の強度を解析して、その標識化複合体を選別し、且つ、標的を識別する解析手段と、を有するものである。
前記搬送用ポンプは、例えば、前記細管内で、標識化複合体が重ならないように流れるような流速を与えるように制御する。本発明によれば、光の強度の測定によって、標識化複合体の選別と標的の識別を同時に行うことができるので、効率良く且つ信頼性良く標的を検出ことができる。
また、前記細管の径は、使用する標識化複合体の大きさや濃度、流速、液体の量等に応じて定める。
第三十三の発明は、第三十二の発明において、前記識別物質または選別用物質が蛍光物質または燐光物質である場合には、前記細管に向けて、該物質を励起させる励起用光または該物質からの散乱光を得るための散乱用光を外部から照射する照射手段をさらに設けたものである。
第三十四の発明は、第三十二の発明において、前記細管は、閉路の一部を形成するとともに、該閉路によって前記標識化複合体群の懸濁液を循環させるものである。
本発明によれば、懸濁液を循環させて繰り返して測定を行うことができるので、測定の精度を高めることができる。
本発明を実施する最良の形態
続いて、本発明の実施の形態に係る標識化複合体並びにその製造方法および使用方法について、第１図〜第１０図に基づいて説明する。また、この実施例の形態は特に指定のない限り本発明を制限するものではない。
第１図には、第一の実施の形態に係る標識化複合体としての標識化複合粒子１０および標識化複合粒子１６を示す。該標識化複合粒子１０は、第１図（ａ）に示すように、１個の担体である微小粒子としての磁性体粒子１１と、全体として所定の種類（説明の簡単のため２種類としている）が所定の量比で含まれる標識物質としての蛍光物質１３（○），１５（△）と、一端１４で該微小粒子１１にビオチンとアビジンとの特異的結合、吸着または共有結合等の化学的物理的結合を含む結合を利用して前記磁性体粒子１１に結合され、他端が蛍光物質１３、１５に結合し、所定の塩基配列をもつＤＮＡ断片（実線）を標的として保有する多数本の標的保有体１２とを有する。尚、前記蛍光物質１３は、例えば、ＦＩＴＣ（緑色）であり、蛍光物質１５は、例えば、ローダミン（オレンジ色）またはＣｙ５（サイ・ファイブ、赤色）である。該蛍光物質１３と蛍光物質１５は、励起波長、発光波長等で識別されるものである。
第１図（ａ）では、蛍光物質１３と蛍光物質１５との量比が、全体として例えば４対１の場合を、説明の簡単のために５本の標的保有体１２で図示する。他方、第１図（ｂ）に示す標識化複合粒子１６は、前記標的保有体１２であるＤＮＡ断片とは異なる種類の塩基配列をもつＤＮＡ断片（点線）をもつ標的保有体１７を示す。尚、第１図（ａ）と同一の符号は同一の物を示すものである。本実施の形態では、微小粒子に磁性体粒子１１を用いているので、単に標的保有体１２をまとめて担持するだけでなく、磁場によって標識化複合粒子１１、１６を遠隔操作することができる。特に、磁力手段を設けたピペット手段を用いることによって、種々の操作を自動化することができる。
次に、このような標識化複合粒子が、蛍光を用いた標識物質によって識別可能であることを簡単な実施例で以下に示す。
該実施例では、ビーズ（微小粒子）に、前記標的保有体として適当な塩基配列をもつＤＮＡ断片の一端を固定し、他端に２種類の蛍光物質、ここでは、Ｃｙ５（赤色）とＦＩＴＣ（緑色）の量比を変えたものを結合した標識化複合粒子について、個々に蛍光強度を測定して、測定結果について統計処理を行ったものである。
本実施例では、２種類の蛍光物質、Ｃｙ５とＦＩＴＣの総量を変えず全光量を略一定にし、量比のみを８通りに変えて標識化した標識化複合粒子について、識別の程度を測定したものである。やり方は、個々のビーズのＣｙ５とＦＩＴＣとの各蛍光強度を測定して数値化し、Ｃｙ５とＦＩＴＣの蛍光強度の比を計算し、第２図に示すビーズの蛍光強度の分布を示す実験結果を得たものである。
第２図中「Ｎ」，「Ｍｉｎ」，「Ｍａｘ」，「Ａｖｒ．」，「ＳＤ」は、それぞれ、測定したビーズの個数、比の最小値、比の最大値、比の平均、比の標準偏差を示すものである。サンプルｆ０１は、Ｃｙ５：ＦＩＴＣ＝０．１：０．９，サンプルｆ０２は、Ｃｙ５：ＦＩＴＣ＝０．２：０．８ …のように、総量を一定にし、量比のみを８通り変えたものを用意している。蛍光強度の分布が正規分布をしていると仮定すると、Ａｖｒ．−ＳＤとＡｖｒ．＋ＳＤの範囲に入る蛍光強度比を有するビーズは約６８％であり、Ａｖｒ．−２ＳＤからＡｖｒ．＋２ＳＤの範囲に入るものは約９５％となる。第２図のＡＶｒ．−２ＳＤとＡｖｒ．＋２ＳＤの列をみていくと、
ｆ０１ ０．１４〜０．３７
ｆ０３ ０．４６〜０．４７
ｆ０４ ０．４９〜０．８６
ｆ０８ ０．８９〜１．００
となる。このように選択するとどの区分も重なり合わないことから、少なくともこの４階調は危険率５％以下で分離、識別できることになる。この実験例では、時間を節約するために、個々の測定したビーズの蛍光の絶対強度が異常なものや複数のビーズが重なったもの等を完全には除外していないが、これらを除外することによってさらに階調度の分離精度を上げることができる。また、サンプル数を増加させることによって、統計誤差をさらに小さくすることができる。
この実施例では、全量がＣｙ５の場合を含めると、５階調を分離することができることになる。同様にして、さらに蛍光物質の種類を増やし、単純にこのような組み合わせを、例えば９組用いれば、約２００万種類を識別することができることになる。
続いて、第二の実施の形態に係る標識化複合体の製造方法について、第３図に基づいて説明する。
第３図に示すように、標識化複合体としての標識化複合粒子１０を製造するには、例えば、二本鎖のＤＮＡ２０について、ＤＮＡ領域２０ａの一本鎖に対応するＤＮＡ断片を第１のプライマ２１とし、ＤＮＡ領域２０ｃの他の一本鎖に対応するＤＮＡ断片を第２のプライマ２２とする。第１のプライマ２１は、蛍光物質１３または蛍光物質１５と共有結合等で予め結合させている。また、第２のプライマ２２はビオチン１８と予め共有結合等で結合している。こうして、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）によって、２種類の前記プライマ２１、２２とＤＮＡ合成酵素（ポリメラーゼ）によってＤＮＡ合成反応を繰り返すことによって、一端に蛍光物質、他端にビオチンを有するＤＮＡ断片２０全体を、無制限に増幅することができる。この時、蛍光物質１３と蛍光物質１５が４対１の本数比で結合した第１のプライマを用いることにより、第２図（ｃ）に示すような、二本鎖のＤＮＡ断片２０の一本鎖２３に蛍光１３が結合し、他の一本鎖２４にビオチン１８が結合した標的保有体と、一本鎖２３に蛍光１５が結合し、他の一本鎖２４にビオチン１８が結合した標的保有体とが、４対１の本数比で増幅して得られる。
このようにして得られた数万以上というオーダの標的保有体１２が懸濁した溶液の中に、磁性体粒子で形成された複数個の微小粒子（ビーズ）１１が懸濁した液または微小粒子１１のみを、例えば、液通路と、磁力手段をその液通路に近接且つ離間可能に備えたピペット手段を用いて、分注することによって混合、懸濁または攪拌する。
その微小粒子１１は、予め、前記ビオチン１８と特異的に反応して結合するアビジンを表面にコーティングしておく。すると、その微小粒子１１を標的保有体１２の懸濁液中に混合、懸濁または攪拌することによって、各微小粒子１１の表面にビオチン１８が結合している標的保有体１２の一端が反応して結合し固定化される。その際、標的保有体１２の数が多数であるため、微小粒子１１に結合した標的保有体１２の他端に結合されている前記蛍光物質１３および蛍光物質１５の量比は、その懸濁液中の量比をほぼ忠実に反映し、一定の統計誤差内で４対１で結合することになる。この統計誤差は、一様且つ均一に懸濁している前記標的保有体１２の量を増加させるに従って、殆ど無視しうる程度にまで収束する。
その微小粒子１１に結合する標的保有体１２の数は、標的保有体１２の数や、反応時間等の条件を変えることによって、コントロールすることができる。その数については、蛍光物質間にエネルギ移動やクエンチングによる大きな影響が生じない範囲で、増加させることにより、発光強度や捕獲能力を高めることができる。
次に、第４図に基づいて、第三の実施の形態に係る該標識化複合体の製造方法について説明する。
第４図（ａ）に示すように、蛍光物質２５と結合したプライマ２６、および５’末端に制限酵素の認識配列２９を有するプライマ２８を用いて、前述したＰＣＲによって、標的保有体２７を複製且つ増幅する。二本鎖の前記鋳型ＤＮＡ断片２７とプライマ２６および２８を用いて、ＤＮＡ合成酵素によって、ＤＮＡ断片２７を例えば数十万倍以上に増幅する。
第４図（ｂ）に示すように、このようにして得られた二本鎖のＤＮＡ断片に対し、制限酵素を加える。制限酵素は、その蛍光物質２５が結合していない方に存在する前記切断可能配列２９を認識して、そのＤＮＡ断片を切断する。
第４図（ｃ）で、切断処理された端部と結合可能なＤＮＡリガーゼからなるアダプタ３１と結合したビオチン３０をそのＤＮＡ断片の懸濁液に加える。その際、そのビオチン３０は、前記蛍光が結合している方の一本鎖側に結合するようにアダプタ３１と結合する。第４図（ｄ）で、そのビオチン３０はアダプタ３１を介して前記切断処理された標的保有体に結合することになる。このようにして、一本鎖の片側にのみ蛍光物質２５と、ビオチン３０が結合している標的保有体が得られたことになる。尚、その標的保有体を微小粒子に結合して固定化する工程は、既に説明した工程と同様なので、説明を省略する。
続いて、第四の実施の形態に係る標識化複合体の使用方法について説明する。
ここでは、蛋白質３２と相互作用を有するＤＮＡ断片の塩基配列を見出すために標識化複合粒子を用いるものである。
第５図に示すように、複数種類の標識化複合粒子群、ここでは、説明の簡単のために２種類の標識化複合粒子３３、３４を用意する。標識化複合粒子３３と標識化複合粒子３４が含有する標的保有体は異なり、別種の塩基配列をもつＤＮＡ断片で形成されている。その標的保有体の一端は両粒子３３、３４とも各微小粒子に固定されているが、その他端は２種類の蛍光物質１３（○）、１５（△）が、標識化複合粒子３３では４対１の量比で結合し、標識化複合粒子３４では１対４の異なる量比で結合している。この量此の差によってその標識化複合粒子３３、３４が有する塩基配列を標識化している。
最初に、その標識化複合粒子３３、３４を混合した懸濁液を容器に収容しておく。その容器内に、その標識化複合粒子３３、３４を標識化した標識物質である蛍光物質１３（○）、１５（△）と異なる蛍光物質１９（□）で標識化した選別用物質である蛋白質３２を加える。一定時間経過後にその蛍光物質１９を追跡することによって、蛋白質３２がどちらの標識化複合粒子３３、３４に保持されたか、または保持されなかったかを調べる。蛋白質３２が標識化複合粒子３３、３４のどちらにも保持されなかった場合には、その蛋白質３２とそのＤＮＡ断片の塩基配列との間の関連性がないまたは極めて低いことが見出される。
一方、蛋白質３２が標識化複合粒子３３、３４のいずれかに保持されたと解析した場合には、その蛋白質３２が結合した標識化複合粒子（３３）を選別する。選別された標識化複合粒子（３３）の前記蛍光物質１３（○）、１５（△）の発光強度を測定することによって、その量比を算定し、蛋白質３２を保持した標識化複合粒子３３から、標識化された塩基配列を識別することができる。これによって、蛋白質３２と結合しうる親和性の高い、または関連性の高い塩基配列が特定される。
もし、その標識化複合粒子３３、３４の双方に蛋白質３２が保持されたことを解析した場合には、蛋白質３２との親和性等の関連性の程度は、各標識化複合粒子３３、３４が保持した蛋白質３２の量の比較または蛋白質３２を保持した標識化複合粒子３３、３４の個数比によって親和性の程度等の関連性の高低を判断することもできる。
本実施の形態において、前記標的保有体を複数種類のＤＮＡ断片で形成する代わりに、複数種類の蛋白質等で形成し、その標識化複合粒子を懸濁した液に、選別用物質として、その標識化複合粒子に用いた標識物質と異なる種類の標識物質で標識化した特定の塩基配列をもつＤＮＡ断片を混合するようにしても良い。この場合には、その塩基配列をもつＤＮＡ断片と親和性の高い蛋白質が逆に特定されことになる。
本実施の形態は、蛋白質とＤＮＡ断片との間に限られず、ＤＮＡ断片同士間についても適用することができる。これによって、ＤＮＡ断片の塩基配列間の相補性、相同性の高い構造、相互作用の強さ等の関連性を見出すことができる。また、蛋白質同士間についても適用することができる。これによって、蛋白質間の相互作用を見いだすことができる。尚、本実施形態では、各標識化複合粒子に磁性体粒子を用い、磁力手段を設けたピペット手段またはこれらのピペット手段を複数集積化した装置を用いることによって、その懸濁、攪拌、分離、移送等の作業を自動化することができる。
次に、第五の実施の形態に係る標識化複合体の使用方法について、第６図に基づいて説明する。
第６図（ａ）に示すように、複数種類の標識化複合粒子、例えば、２種類の標識化複合粒子３５、３６を用意する。各標識化複合粒子３５と標識化複合粒子３６が含有する標的保有体は異なり、別種の塩基配列をもつＤＮＡ断片で形成されている。その標的保有体の一端は両粒子３５、３６とも各微小粒子に固定されているが、その他端は２種類の蛍光物質１３（○）、１５（△）が、標識化複合粒子３５では４対１の量比で結合し、標識化複合粒子３６では１対４の量比で結合したものである。その２種類の標識化複合粒子３５、３６を混合した懸濁液を、選別用物質であるＤＮＡ結合蛋白質３８が固定化されたマトリクス（固定相）３７と接触させるために、そのマトリクス３７が設けられている容器に分注する。
すると、そのＤＮＡ蛋白質３８と特異的に反応して結合する塩基配列をもつＤＮＡ断片の標的保有体をもつ標識化複合粒子３５がその蛋白質３８と結合してそのマトリクス３７に捕獲される。その後、そのマトリクス３７に捕獲されていない標識化複合粒子３５、３６を洗浄した後、捕獲されたその標識化複合粒子３５を塩溶液で溶出することによって該当する標識化複合粒子３５が選別され、蛍光スペクトルを観測して標識化複合粒子３５を識別する。
このようにして、その塩基配列との結合に特異性をもつ蛋白質を同定することによって、転写制御因子のような、遺伝子をコントロールすることのできる蛋白質を見出し、生物の発生、ガン等の研究に役立たせることができる。
第五の実施の形態の他の応用例として、第６図（ｄ）に示す例を説明する。第６図（ｄ）に示すように、例えば、２種類の標識化複合粒子３５ａ，３６ａを用意する。標識化複合粒子３５ａと標識化複合粒子３６ａが含有する標的保有体は異なり、別種の塩基配列をもつＤＮＡ断片で形成されている。標的保有体には、２種類の蛍光物質１３（○）、１５（△）が、その標識化複合粒子３５ａでは４対１の量比で結合し、標識化複合粒子３６ａでは１対４の量比で結合している。本実施の形態では、その２種類の標識化複合粒子３５ａ，３６ａの微小粒子は磁性体粒子で形成され、外部磁場が及ぼされると磁化され外部磁場が除去されると消磁される。その２種類の標識化複合粒子３５ａ，３６ａを混合した懸濁液を、選別用物質であるＤＮＡ結合蛋白質３８が固定化された磁性体粒子３７ａと接触させるために、ピペット手段等によって、その磁性体粒子３７ａが懸濁する液が収容された容器またはカラム３９等に分注する。
ここで、前記標識化複合粒子３５ａ，３６ａが有する磁性体粒子は、ＤＮＡ結合蛋白質３８が固定化された磁性体粒子３７ａに比べ同一磁場から受ける磁力が小さいものとする。受ける磁力を小さくするには、同一素材で径を小さく形成するかまたは磁化率の小さい素材を用いる。磁力体がピペット手段の液通路の外部に組み込まれて、液通路内へ磁場を及ぼしまたは除去可能なピペット手段を用いることによって、標識化複合粒子３５ａ，３６ａや磁性体粒子３７ａの移送や分離等の作業が容易化され且つ自動化される。
また、その磁性体粒子３７ａは、同一の磁場に対して、その標識化複合粒子３５ａ，３６ａに含有する磁性体粒子よりも強い磁力を受ける。したがって、その磁性体粒子３７ａおよび標識化複合粒子３５ａ，３６ａが懸濁する液体が収容された容器、ピペット手段の液通路やカラム３９に所定の磁場をかけた状態で、その懸濁液を所定の流速で流すことによって、その磁性体粒子３７ａのＤＮＡ結合蛋白質３８に捕獲された標識化複合粒子は、磁性体粒子３７ａとともに、その容器等の内壁に吸着して分離されるが、その磁性体粒子３７ａに捕獲されなかった標識化複合粒子は、内壁に吸着する磁力が弱いため、懸濁液とともに流出することによって選別される。
尚、前記標識化複合粒子の微小粒子として、非磁性体粒子を用いても良い。この場合には、標識化複合粒子に対する磁場の影響は０であるので、捕獲されなかった標識化複合粒子の流出を確実に行うことができる。
続いて、第六の実施の形態に係る標識化複合粒子の使用方法について、第７図に基づいて説明する。
第７図（ａ）に示すように、例えば、２種類の標識化複合粒子４０、４１を用意する。標識化複合粒子４０と標識化複合粒子４１が含有する標的保有体は異なり、別種の塩基配列をもつ二本鎖のＤＮＡ断片で形成されている。その標識化複合粒子４０、４１を標識化するために、その標的保有体の他端には、２種類の蛍光物質１３（○）、蛍光物質１５（△）が標識化複合粒子４０では４対１の量比で結合したものであり、標識化複合粒子４１では１対４の量比で結合したものである。第７図（ｂ）で、その２種類の標識化複合粒子４０、４１の標的保有体をアルカリ性溶液等で変性して一本鎖化する。
第７図（ｃ）で、検査用ＤＩＧ４２で標識化された選別用物質である一本鎖ＤＮＡ断片４３を、前記変性された標識化複合粒子４０、４１が懸濁している懸濁液中に混合し、第７図（ｄ）で示すように、その一本鎖ＤＮＡ断片４３と、その標識化複合粒子４０、４１の一方とハイブリダイズするか否かを試みる。ここでは、ＤＩＧ４２は、アンチＤＩＧ抗体４４と特異的に反応する性質をもつ標識化物質として利用したものである。第７図（ｅ）で、その一本鎖ＤＮＡ断片４３がハイブリダイズした標識化複合粒子４０とハイブリダイズしなかった標識化複合粒子４１の混合した懸濁液を、アンチＤＩＧ抗体４４が固定化されたマトリクス４５を収容した容器に分注する。第７図（ｆ）で、そのマトリクス４５に捕獲されなかった標識化複合粒子４０、４１を洗浄して選別した後、変性して標識化複合粒子４０を溶出し、蛍光スペクトルで識別する。
第六の実施の形態に係る標識化複合体の使用方法の他の応用例として、第７図（ｇ）に基づいて説明する。
第７図（ｇ）に示すように、例えば、標識化複合体として２種類の標識化複合粒子４０ａ，４１ａを用意する。標識化複合粒子４０ａと標識化複合粒子４１ａが含有する各標的保有体は異なり、別種の塩基配列をもつＤＮＡ断片で形成されている。標的保有体には、２種類の蛍光物質１３（○）、１５（△）が、その標識化複合粒子４０ａでは４対１の量比で結合し、標識化複合粒子４１ａでは、１対４の量比で結合している。本例では、その２種類の標識化複合粒子４０ａ，４１ａの微小粒子は磁性体粒子で形成され、外部磁場が及ぼされると磁化され外部磁場が除去されると消磁される。その２種類の標識化複合粒子４０ａ、４１ａの標的保有体はアルカリ性溶液等で変性して一本鎖化されている。
検査用のＤＩＧ４２で標識化された一本鎖ＤＮＡ断片４３を前記変性された標識化複合粒子４０ａ，４１ａが懸濁している懸濁液中に混合し、その一本鎖ＤＮＡ断片４３と、その標識化複合粒子４０ａ，４１ａの一方とハイブリダイスするか否かを試みる。第７図（ｇ）に示すように、その一本鎖ＤＮＡ断片４３がハイブリダイズした標識化複合粒子４０とハイブリダイズしなかった標識化複合粒子４１の混合した懸濁液を、アンチＤＩＧ抗体４４が固定化された磁性体粒子４５ａの懸濁液を収容した容器、カラム３９等に分注する。ここで、その標識化複合粒子４０ａ，４１ａが有する磁性体粒子は、アンチＤＩＧ抗体４４が固定化された磁性体粒子４５ａに比べ同一磁場から受ける磁力が小さいものとする。磁力体がピペット手段の液通路の外部に組み込まれて、液通路内への磁場を及ぼしまたは除去可能なピペット手段を用いることによって、標識化複合粒子４０ａ、４１ａや磁性体粒子４５ａの移送や分離等の作業が容易化され且つ自動化される。
また、その磁性体粒子４５ａは、同一の磁場に対して、その標識化複合粒子４０ａ，４１ａに含有する磁性体粒子よりも強い磁力を受ける。したがって、その磁性体粒子４５ａおよび標識化複合粒子４０ａ，４１ａが懸濁する液体が収容された容器、ピペット手段の液通路やカラム３９に所定の磁場をかけた状態で、その懸濁液を所定の収束で流すことによって、その磁性体粒子４５ａのアンチＤＩＧ抗体４４に捕獲された標識化複合粒子は、磁性体粒子４５ａとともに、その容器等の内壁に吸着して分離されるが、その磁性体粒子４５ａに捕獲されなかった標識化複合粒子は、内壁に吸着する磁力が弱いため、懸濁液とともに流出して選別することができる。
尚、前記標識化複合粒子の微小粒子として、非磁性体粒子を用いても良い。この場合には、標識化複合粒子に対する磁場の影響は０であるので、捕獲されなかった標識化複合粒子の流出による選別はより確実に行うことができる。
第七の実施の形態に係る標識化複合体の使用方法について、第８図に基づいて説明する。
第８図（ａ）に示すように、例えば、標識化複合体として２種類の標識化複合粒子４６、４７を用意する。標識化複合粒子４６と標識化複合粒子４７が含有する標的保有体は異なり、別種の塩基配列をもつＤＮＡ断片で形成されている。標的保有体には、２種類の蛍光物質１３（○）、蛍光物質１５（△）がその標識化複合粒子４６では４対１で結合し、その標識化複合粒子４７では１対４の量比で結合している。第８図（ｂ）で、その２種類の標識化複合粒子４６、４７を混合した懸濁液中１、蛍光物質４８で標識化された標的であるＤＮＡ結合蛋白質４８が混合される。
第８図（ｃ）で、その標識化複合粒子４６にそのＤＮＡ結合蛋白質４８が結合したとする。第８図（ｄ）でＤＮＡ結合蛋白質４８が標識化する蛍光物質４８の蛍光スペクトルを測定することによって、そのＤＮＡ結合蛋白質４８が捕獲された標識化複合粒子４６を選別する。その後、第８図（ｅ）で、標識化されたその蛋白質４８を除去した後、その標識化複合粒子４６を蛍光で識別する。
次に、第八の実施の形態に係る標識化複合体の使用方法について、第９図に基づいて説明する。
第９図（ａ）に示すように、例えば、標識化複合体として２種類の標識化複合粒子５０、５１を用意する。各標識化複合粒子５０、５１には、各々標的保有体がその一端で固定きれている。標識化複合粒子５０と標識化複合粒子５１の標的保有体は異なり、別種の塩基配列をもつＤＮＡ断片で形成されている。標的保有体の他端は、２種類の蛍光物質１３（○）、蛍光物質１５（△）が、標識化複合粒子５０では４対１の量比で結合し、標識化複合粒子５１では１対４の量比で結合している。第９図（ｂ）で、その２種類の標識化複合粒子５０、５１を変性して一本鎖化する。第９図（ｃ）で、選別用物質として蛍光５２で標識化した一本鎖ＤＮＡ５３を前記懸濁液中に混合させる。
第９図（ｄ）で、例えば、標識化複合粒子５０の標的保有体とのハイブリダイズによって捕獲される。第９図（ｅ）で、蛍光スペクトルで各標識化複合粒子５０、５１で１粒子毎に、前記蛍光５２の有無を蛍光スペクトルを測定することによって、標識化されたその一本鎖ＤＮＡを捕獲した標識化複合粒子５０を選別する。その後、第９図（ｆ）で、標識化されたその一本鎖５３を除去した後、その標識化複合粒子５０を蛍光で識別する。
第九の実施の形態として、明瞭に外見上個々には現れにくい影響や変化を明瞭且つ効率良く識別観測するために標識化複合体を使用する方法について説明する。
温度、放射線量、圧力、重力、磁場、電場、濃度（毒性、試薬等）、電磁波（可視光線、紫外線、Ｘ線等）、粒子線、音響等またはこれらを組み合わせたものによる影響が明瞭に外見上の差異が現れにくい程度である場合に、その影響を顕在化しまたは統計的に測定するために標識化複合粒子を使用するものである。本例では、蛋白質やＤＮＡ断片等の同一の標的を多数含有したサンプル群を予め用意し、各サンプルに前記影響を及ぼし若しくは段階的に変えたレベル若しくはそれらの組み合わせを及ぼしたものと、及ぼさなかったものとを作る。これらの各サンプルを識別するために、そのサンプル数分の種類の標識化複合粒子の懸濁液を用意して、各サンプルと混合させて前記標的を各標的保有体に保持させて標識化する。ここで、各標識化複合粒子の標的保有体は、例えば、特殊なノリ物質が繊維状物質に付着され、種々の標的を保有することができるものである。
その標的を保持した各標識化複合粒子を同一容器に混合して、同一時間、同一濃度等の同一条件で同一処理を一斉に加える。この処理とは、例えば、その蛋白質とＤＮＡ断片との親和性への影響を見るため、選別用物質として、別種の標識物質で標識化されたそのＤＮＡ断片を多数混合させる。その標識物質を解析することによって、そのＤＮＡ断片が保持された前記標識化複合粒子を選別し、その標識化複合粒子の標識物質を解析することによって、最初に受けた影響を統計的に明瞭に顕在化させて迅速、且つ効率的に測定することができる。また、本例によれば、木目の細かいレベルによる標識化が可能なので、所定の影響を受ける臨界レベル等を精密に測定または見出すことができる。
第十の実施の形態に係る標識化複合体の使用方法および使用装置について、第１０図に基づいて説明する。
本実施の形態に係る標識化複合体の使用方法に用いる使用装置である標的解析装置６０は標識化複合粒子の選別および標的の識別に使用するものである。ここでは、蛍光物質または燐光物質をその標識化複合粒子および選別用物質の標識物質として用いた例について説明する。その装置６０は、液体が内部を通過する管路（または流路）６１を有し、その管路６１は内部を液体が循環可能となるように閉路を形成している。その管路６１の一部は、透明ガラス等の透光性の部材で形成された細管６２が設けられている。その細管６２の外部には、前記蛍光物質または燐光物質を励起するための励起用光を細管６２内に照射する照射手段６３が設けられている。また、その細管６２の外部には、その細管６２を挟んで前記照射手段６３に向き合うように受光手段６４が設けられている。照射手段６３は、レーザ光源、キセノンランプやキセノン−水銀ランプ等の光源を具備し、前記蛍光物質等に応じて波長幅を選択する。受光手段は光電子増倍管を具備している。また、各手段においてフィルタを用いて必要な波長を選択するようにしても良い。受光手段６４には、光の波長とその強度を測定する測定手段を具備している。
さらに、標的解析装置６０は、その受光手段６４が受光した光の波長の強度を解析して、選別用物質が結合した標識化複合粒子を選別し、選別された標識化複合粒子の標識物質の種類および量比からその標識化複合粒子の標的を識別する解析手段６５を具備している。その解析手段６５は、測定された各波長から、蛍光物質等の種類、その相対的な光の強度からその量比を割り出すための演算を行い、その種類または量比と、対応する標的との関係を示す情報等を格納するためのＣＰＵ、メモリ、表示手段等からなる情報処理装置を有している。
その標的解析装置６０の前記管路６１に沿った適当な位置には、その管路６１内に液体を流すための搬送用ポンプ６６を設ける。また、その管路６１は、前記選別用物質を含む前記標識化複合粒子の懸濁液を収容する容器６７、廃棄すべき液を収容する廃棄用タンク６８、流路内の液体を収容するタンク６９と、前記容器６７に収容されている懸濁液を管路６１内に吸引するための吸引機構７０とが設けられている。これらの要素は、開閉自在に分岐接続する弁７１、７２、７３、７４を介して連通する。ここで、前記吸引機構７０は、吸引吐出手段を有する前記ピペット手段を用いても良いし、その吸引吐出手段を直接設けたものであっても良い。管路または細管の内径は、使用する標識化複合粒子の径、流速等に応じて定められる。
続いて、本実施の形態に係る標識化複合体使用方法について説明する。
蛍光物質または燐光物質を標識物質に用いた前記標識化複合粒子が懸濁した液と、その標識物質とは異なる種類の発光物質により標識化した選別用物質とを混合する。すると、選別されるべき標識化複合粒子にその選別用物質が結合する。選別用物質と結合した標識化複合粒子を含む標識化複合粒子群の懸濁液を前記容器６７に収容し、弁７１を開いて、吸引機構７０によって管路６１系内にその懸濁液を吸引する。次に弁７１の容器６７側を閉じて容器６７との間を遮断し、弁７３を開いてタンク６９から必要量の液体を取り入れた後弁７３を閉じて、搬送用ポンプ６６を駆動させ懸濁液を管路６１系内を循環させる。流速は、前記細管６２内において、各標識化複合粒子が測定可能な速度に設定する。このような流速は、管路や細管の内径、その標識化複合粒子の径、濃度等によって定められる。
その懸濁液が細管６２を通過する際に、細管６２の外部からその細管６２に照射手段６３から励起用光を照射し、識別化複合粒子が発するその細管６２からの光を受光手段６４によって受光する。受光手段６４は各粒子毎に光を受光することが可能なので、受光手段６４が得た各波長の光の強度の測定から、前記解析手段６５は選別用物質が結合している標識化複合粒子を割り出し、割り出された標識化複合粒子の標識物質の種類およびその量比から、標的を識別する。尚、受光手段６４が複数の標識化複合粒子が重なった光を受光したとしても、本実施の形態では、その管路６１系は閉じているので、十分な測定精度を得るために、必要な回数繰り返して懸濁液を循環させることによって、このような誤検出を排除することできる。処理が終了した後は、弁７２を開いて廃棄用タンク６８に収容する。
本実施の形態によれば、標識化複合粒子の選別と識別とを同時に行うことができるので処理の効率が良く、信頼性が高い。また、本実施の形態によれば、懸濁液を循環させることができるので、精度の高い測定を行うことができるのでやはり信頼性が高い。
以上説明した各実施の形態は、本発明をより良く理解させるために具体的に説明したものであって、別形態を制限するものではない。したがって、発明の主旨を変更しない範囲で変更可能である。例えば、以上の説明では、担体として微小粒子を用いた標識化複合粒子の場合についてのみ説明したが、その場合に限られることなく、例えば、繊維状物質やゲル状物質等の物質や、不定形の物質等を用いたものであっても良い。また標識物質として２種類の蛍光物質を用いたが、その場合に限られることなく多種類または燐光物質であっても良い。また、あたかも５個の標的保有体が微小粒子に固定されている場合のみについて説明したが、これは説明の簡単のためで、量比を説明しやすくするために用いたものであって、実際には多数の標識物質を用いるものである。さらに、以上の説明は、標的保有体として、ＤＮＡ断片を用いた場合のみを説明したがこの場合に限定されるものではない。また、以上の実施の形態では、標識化複合粒子を製造する際に、核酸をＰＣＲ法を用いて合成および増幅する場合について説明したが、その場合に限られることなく、例えば、互いに相補的な一本鎖を合成してアニーリングによって二本鎖を形成することによって製造するものであっても良い。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の第一の実施の形態に係る標識化複合粒子を示す図である。
第２図は、本発明の第一の実施の形態に係る標識化複合粒子の実施例を示す図である。
第３図は、本発明の第二の実施の形態に係る標識化複合粒子の製造方法を示す図である。
第４図は、本発明の第三の実施の形態に係る標識化複合粒子の製造方法を示す図である。
第５図は、本発明の第四の実施の形態に係る標識化複合粒子の使用方法を示す図である。
第６図は、本発明の第五の実施の形態に係る標識化複合粒子の使用方法を示す図である。
第７図は、本発明の第六の実施の形態に係る標識化複合粒子の使用方法を示す図である。
第８図は、本発明の第七の実施の形態に係る標識化複合粒子の使用方法を示す図である。
第９図は、本発明の第八の実施の形態に係る標識化複合粒子の使用方法を示す図である。
第１０図は、本発明の第十の実施の形態に係る標識化複合粒子の使用装置を示す図である。

Claims (30)

1. １個の担体と、その担体に結合した多数の標的保有体と、その担体が結合した部位と異なる部位で各標的保有体に結合した標識物質とからなり、その標的保有体は、核酸を含む化合物からなり、前記２つの部位間で１または２以上の種類の標的を保有しまたは保有可能であり、１個の担体上の標識物質の全体は、前記標的保有体の種類に応じて定められ、２以上の所定の種類が所定の量比含まれたものであることを特徴とする標識化複合体。
2. 前記標識物質の全体は、１個の担体と結合する標的保有体の略全てに分配され、１個の前記標的保有体は１種類の標識物質と結合したものであることを特徴とする請求項１に記載の標識化複合体。
3. 前記標的保有体は、二本鎖の所定塩基配列をもつ核酸からなり、前記標識物質は、ある部位における一本鎖とのみ結合し、他の部位における他の一本鎖が前記担体と結合したものであることを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の標識化複合体。
4. 前記標的保有体は、二本鎖の所定塩基配列をもつ核酸からなり、前記標識物質は、一本鎖のある部位にのみ結合し、その一本鎖の他の部位に前記担体が固定したものであることを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の標識化複合体。
5. 前記標的保有体は、一本鎖の核酸であることを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の標識化複合体。
6. 前記標識物質は、蛍光物質、燐光物質、および化学発光による発光物質の中から選択された物質であることを特徴とする請求項１、請求項２、または請求項４のいずれかに記載の標識化複合体。
7. 前記発光物質は、励起波長、発光波長、発光強度、発光偏光度、発光位相または発光寿命のいずれかによって、その種類が識別可能であることを特徴とする請求項６に記載の標識化複合体。
8. 前記担体には、特異的に結合する化合物対の一方の化合物がコーティングされ、前記標的保有体は所定塩基配列をもつＤＮＡ断片であり、ある部位には前記化合物対の他方の化合物が結合し、他の部位には前記蛍光物質が結合したものであることを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の標識化複合体。
9. 前記担体は、遠隔操作可能な遠隔作用体を有することを特徴とする請求項１、請求項２、請求項３ないし請求項８のいずれかに記載の標識化複合体。
10. 請求項１、請求項２、または、請求項４ないし請求項９のいずれかに係る標識化複合体を製造する方法において、ある部位で標識物質と結合し、且つ特定の標的を保有しまたは保有可能な標的保有体を生成する工程と、その標的保有体を担体に結合する工程とを有することを特徴とする標識化複合体製造方法。
11. 前記担体に標的保有体を結合する工程は、標識物質の全体が、その標的保有体の種類に応じて定められた種類およびその量比となるように、その標識物質と結合した標的保有体を多数懸濁させた液体中に、その標的保有体が結合されるべき担体を混合することによって行うことを特徴とする請求項１０に記載の標識化複合体製造方法。
12. 前記標的保有体を生成する工程は、標識物質と結合し且つ所定塩基配列をもつ一本鎖の核酸を合成し、その塩基配列と関連性の高い、前記担体と結合可能に加工された他の一本鎖の核酸を合成し、これらをアニーリングによって二本鎖の核酸を生成する工程を有することを特徴とする請求項１０に記載の標識化複合体製造方法。
13. 前記標的保有体を生成する工程は、前記標識物質と結合し且つ所定塩基配列をもつ一本鎖の核酸の複製用の第１のプライマと、前記担体と結合すべき他の一本鎖の核酸の複製用の第２のプライマとを用いて、二本鎖のその核酸を合成しかつ増幅する工程を有することを特徴とする請求項１０に記載の標識化複合体製造方法。
14. 前記標的保有体を担体に結合する工程または前記標的保有体を生成する工程は、前記標識物質または前記担体のどちらか一方と結合し且つ所定塩基配列をもつ一本鎖の核酸の複製用の第１のプライマを用いて、二本鎖のその核酸を合成および増幅するとともに、前記標識物質または担体が結合している端部と反対側の端部に制限酵素処理を施し、制限酵素処理が施された端部にアダプタを介して担体または標識物質を、前記標識物質または担体が結合している一本鎖側に結合して、標的保有体を担体に結合し、または標的保有体を生成することを特徴とする請求項１０に記載の標識化複合体製造方法。
15. 前記標的保有体を生成する工程は、前記標識物質および前記担体と結合していない方の一本鎖を変性によって除去する工程を含むことを特徴とする請求項１４に記載の標識化複合体製造方法。
16. 前記担体に標的保有体を結合する工程は、担体が有する多数の穴、間隙若しくは凹凸による付着、吸着、接着、および特異的相互作用の中から選択された物理的若しくは化学的結合を含む結合を利用して、前記標的保有体と担体とを懸濁することによって、前記標的保有体と担体とを結合することを特徴とする請求項１０に記載の標識化複合体製造方法。
17. 前記標的保有体を生成する工程は、ある部位でその標識物質と結合し且つ他の部位で特異的に結合する化合物対の一方と結合した多数の標的保有体を生成する工程であり、前記標的保有体を担体に結合する工程は、前記化合物対の他方がコーティングされた担体と、その標識物質が結合した前記標的保有体とを液体中で懸濁することによって、その標的保有体を担体に結合することを特徴とする請求項１０に記載の標識化複合体製造方法。
18. 請求項１、請求項２、または請求項４ないし請求項９のいずれかに係る標識化複合体の標的およびその標的に対応付けられた標識物質の種類若しくは量比が相互に異なる複数種類の標識化複合体を多数有する標識化複合体群の中から、目的とする種類の標識化複合体を選別する工程と、選別されたその標識化複合体が標識化した標的を識別する工程とを有することを特徴とする標識化複合体使用方法。
19. 前記選別工程は、液通路と、その液通路内に磁場作用を及ぼすことが可能な磁力手段とを有し、液体の吸引または吐出を行うピペット手段を用いて、前記標識化複合体に対して、またはその標識化複合体および選別用物質に対して、定量、分離、分取、分注、清澄、懸濁、攪拌、濃縮、希釈、混合、接触、捕獲、保持、洗浄、変性、インキュベーション、温度制御、抽出、回収および移送の中から選択された作業によりまたはこれらの作業の組み合わせによって、行われることを特徴とする請求項１８に記載の標識化複合体使用方法。
20. 前記選別工程は、前記標識化複合体群を懸濁する工程と、その標識化複合体群が懸濁した懸濁液と、目的とする標識化複合体を選別するための選別用物質とを接触させる工程と、その選別用物質と結合した標識化複合体を抽出または分離する工程とを有することを特徴とする請求項１８または請求項１９のいずれかに記載の標識化複合体使用方法。
21. 前記選別工程は、前記選別用物質を、標識化複合体に含有される標識物質とは異なる種類の標識物質により標識化するとともに、その標識物質に基づいて、その選別用物質と結合した標識化複合体を抽出または分離する工程を有することを特徴とする請求項２０に記載の標識化複合体使用方法。
22. 前記識別工程は、前記標識物質が発光物質である場合には、その標識化複合体が発する発光波長の各強度の測定結果に基づいて、その種類の量比を割出して、該当する標的を識別することを特徴とする請求項１８または請求項１９のいずれかに記載の標識化複合体使用方法。
23. 前記選別工程は、前記標的保有体が二本鎖の所定塩基配列をもつ核酸であって、前記標識物質および前記担体はその片側の一本鎖にのみ結合している場合には、他方の一本鎖は変性によって除去するとともに、前記選別用物質として、所定塩基配列をもつ核酸を用いたことを特徴とする請求項１８または請求項１９のいずれかに記載の標識化複合体使用方法。
24. 前記選別工程は、選別用物質が固定された固定相と前記標識化複合体群が懸濁した液とを接触させる工程と、洗浄して懸濁液を除去することによって、固定相にその選別用物質と結合した標識化複合体を選別する工程とを有することを特徴とする請求項１８または請求項１９のいずれかに記載の標識化複合体使用方法。
25. 前記選別工程は、前記固定相から物理的または化学的に標識化複合体を溶出して抽出、分離、および洗浄の中から選択されたものによって選別する工程を有することを特徴とする請求項２４に記載の標識化複合体使用方法。
26. 前記固定相として磁性体粒子を用い、前記標識化複合体の担体は磁性体粒子または非磁性体粒子で形成されるとともに、その標識化複合体の磁性体粒子は、固定相の磁性体粒子と比較して、同一の外部磁場に対してより小さい磁力を受けることを特徴とする請求項２４に記載の標識化複合体使用方法。
27. 前記選別用物質は、特異的な結合をする化合物対の一方の標識物質で標識化されるとともに、前記選別工程において、前記化合物対の他方を固定化した固定相にその選別用物質および標識化複合体の結合体を懸濁した液を接触させて、前記固定相にその結合体を結合させ、その固定相に結合した物以外の物を洗浄して除去し、前記標的保有体を変性して一本鎖にして標識化複合体を溶出して抽出または分離によって選別する工程を有することを特徴とする請求項２４に記載の標識化複合体使用方法。
28. 前記選別工程は、前記標識化複合体を発光物質によって標識化し、選別用物質をその標識物質とは異なる種類の発光物質により標識化するとともに、その標識化複合体群が懸濁した液と選別用物質とを混合して接触させる工程と、透光性の細管内に、その選別用物質と結合した標識化複合体を含む標識化複合体群の懸濁液を通過させる工程とを有し、前記識別工程は、前記標識化複合体群の懸濁液の前記細管の通過の際に受光する工程と、その選別用物質が発する光の強度の測定により選別された標識化複合体について、その標識化複合体が発する光の強度の測定結果に基づいて、その種類およびその量比を割り出して、該当する標的を識別する工程とを有することを特徴とする請求項１８または請求項１９のいずれかに記載の標識化複合体使用方法。
29. 前記識別物質または選別用物質が蛍光物質または燐光物質である場合には、前記懸濁液を前記細管内を通過させる工程において、前記細管に向けて、その物質を励起させる励起用光を照射することを特徴とする請求項２８に記載の標識化複合体使用方法。
30. １個の担体と、その担体に結合した多数の標的保有体と、その担体が結合した部位と異なる部位で各標的保有体に結合した標識物質とからなり、その標的保有体は、核酸を含む化合物からなり、１または２以上の種類の標的を保有しまたは保有可能であり、１個の担体上の標識物質の全体は、前記標的保有体の種類に応じて定められ、２以上の所定の種類が所定の量比含まれた標識化複合体について、その標的およびその標的に対応付けられた標識物質の種類若しくは量比が相互に異なる複数種類の標識化複合体を多数有する標識化複合体群を液体中に懸濁した標識化複合体懸濁液。

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