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JP7522189B2 - 免疫レパートリーシーケンシングのための完全長ｖ（ｄ）ｊ情報を得るためのランダムプライミングの使用 - Google Patents

免疫レパートリーシーケンシングのための完全長ｖ（ｄ）ｊ情報を得るためのランダムプライミングの使用 Download PDF

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Description

関連出願
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． §１１９（ｅ）のもとに、２０１９年１１月8日に出願された米国仮特許出願第６２／９３３２８５号の利益を主張し、この関連出願の内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、概して、分子生物学の分野に関し、より具体的には、分子バーコード化を使用するマルチオミクス分析に関する。
分子バーコード化の方法および技法は、例えば、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して、細胞の状態を決定するために、遺伝子発現プロファイルを解読することなど、単一細胞トランスクリプトミクス分析に有用である。核酸標的（例えば、Ｖ（Ｄ）Ｊを含有する転写物）の完全長発現プロファイリングのための方法および技法に対する必要性が存在する。核酸標的（例えば、Ｖ（Ｄ）Ｊを含有する転写物）の同定と計数の両方を可能にし得る組成物および方法に対する必要性が存在する。
本明細書の開示は、試料中の核酸標的を標識するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、第１のユニバーサル配列、分子標識（例えば、第１の分子標識）、および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと；それぞれが、標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと；各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子のうちの１つまたは複数の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと；複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと；核酸標的の配列にハイブリダイズすることが可能な標的特異的プライマーおよび第１のユニバーサル配列を含むプライマーを使用して、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、それによって、核酸標的の配列、またはその一部分を含む第１の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと；ランダムプライマーを第１の複数のバーコード化されたアンプリコンにハイブリダイズさせ、ランダムプライマーを伸長させて、複数の伸長産物を生成するステップであって、ランダムプライマーが、第２のユニバーサル配列、またはその相補体を含む、ステップと；第１のユニバーサル配列および第２のユニバーサル配列、またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して、複数の伸長産物を増幅させて、それによって、第２の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップとを含む。一部の実施形態では、本方法は、第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、またはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識、別個の配列を有する第２の分子標識、またはこれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、断片化、タグメンテーション、またはその両方を含まない。
本明細書の開示は、試料中の核酸標的の数を決定する方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、第１のユニバーサル配列、分子標識（例えば、第１の分子標識）、および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと；それぞれが、標的結合領域および標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと；各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子のうちの１つまたは複数の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと；複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと；核酸標的の配列にハイブリダイズすることが可能な標的特異的プライマーおよび第１のユニバーサル配列を含むプライマーを使用して、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、それによって、核酸標的の配列、またはその一部分を含む第１の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと；ランダムプライマーを第１の複数のバーコード化されたアンプリコンにハイブリダイズさせ、ランダムプライマーを伸長させて、複数の伸長産物を生成するステップであって、ランダムプライマーが、第２のユニバーサル配列、またはその相補体を含む、ステップと；第１のユニバーサル配列および第２のユニバーサル配列、またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して、複数の伸長産物を増幅させて、それによって、第２の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと；第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、またはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識、別個の配列を有する第２の分子標識、またはこれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップとを含む。
一部の実施形態では、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップは、（ａ）第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、またはその産物と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップ、および／または（ｂ）第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、またはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせる前に、複数のバーコード化された核酸分子を変性させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させる前に、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を変性させるステップを含む。
一部の実施形態では、本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させる前に、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を変性させるステップを含む。一部の実施形態では、複数の核酸標的のそれぞれの配列は、複数の核酸標的のそれぞれの部分配列を含む。一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子中の核酸標的の配列は、核酸標的の部分配列を含む。一部の実施形態では、第１の分子標識は、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させた後に、第２の分子標識にハイブリダイズされる。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子はそれぞれ、第１の分子標識、第２の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む。一部の実施形態では、標的結合領域の相補体は、標的結合領域の一部分に相補的である。一部の実施形態では、標的結合領域は、遺伝子特異的配列を含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、遺伝子特異的配列、ポリ（ｄＴ）配列、または両方を含む。
一部の実施形態では、それぞれが、標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップは、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードを使用して、試料中の核酸標的のコピーをバーコード化して、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、および標的結合領域を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと；（ｉｉ）標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを複数のバーコード化された核酸分子に結合させて、それぞれが、標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップとを含む。
一部の実施形態では、それぞれが、標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップは、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードを使用して、試料中の核酸標的のコピーをバーコード化して、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、および標的結合領域を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと；（ｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子を増幅させて、複数の増幅したバーコード化された核酸分子を生成するステップと；（ｉｉｉ）標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを複数の増幅したバーコード化された核酸分子に結合させて、それぞれが、標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップとを含む。
一部の実施形態では、試料中の核酸標的のコピーをバーコード化するステップは、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップを含む。一部の実施形態では、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させるステップは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードにハイブリダイズした核酸標的のコピーを逆転写するステップを含む。一部の実施形態では、標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを結合させるステップは、該標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを、複数のバーコード化された核酸分子および／または増幅したバーコード化された核酸分子にライゲーションさせるステップを含む。一部の実施形態では、標的結合領域はポリ（ｄＴ）配列を含み、該標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを結合させるステップは、末端デオキシヌクレオチド転移酵素を使用して、複数のアデノシン一リン酸を複数のバーコード化された核酸分子および／または増幅したバーコード化された核酸分子に付加するステップを含む。
一部の実施形態では、それぞれが、標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップは、逆転写酵素および標的結合領域またはその一部分を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および該標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップを含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、末端転移酵素活性の能力がある。一部の実施形態では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の３’リボヌクレオチド、例えば、３つの３’リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’リボヌクレオチドは、グアニンを含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ウイルス逆転写酵素、例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）逆転写酵素またはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素を含む。一部の実施形態では、本方法は、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、７－デアザ－ＧＴＰ、アセトアミド、塩化テトラメチルアンモニウム塩、ベタイン、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させるステップを含む。
一部の実施形態では、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体をバーコード化された核酸分子自体の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップは、ステムループを形成する、バーコード化された核酸分子内の標的結合領域と該標的結合領域の相補体との分子内ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体である。
一部の実施形態では、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域とハイブリダイズさせるステップは、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体の、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識は第１の分子標識と異なり、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体ではない。一部の実施形態では、本方法は、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドバーコードの３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識の相補体および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識の配列は、第１の分子標識の配列と異なり、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体ではない。
一部の実施形態では、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップは、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体の、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識の配列は第１の分子標識の配列と異なり、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体ではない。
一部の実施形態では、試料は、単一細胞、複数の細胞、複数の単一細胞、組織、腫瘍試料、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、単一細胞は、免疫細胞または循環腫瘍細胞を含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞またはＴ細胞である。一部の実施形態では、標的特異的プライマーは、免疫受容体に特異的にハイブリダイズする。一部の実施形態では、標的特異的プライマーは、免疫受容体の定常領域、免疫受容体の可変領域、免疫受容体の多様性領域、免疫受容体の可変領域と多様性領域の接合部、またはこれらの組合せに特異的にハイブリダイズする。一部の実施形態では、免疫受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）受容体である。一部の実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、ＢＣＲ受容体は、ＢＣＲ重鎖および／またはＢＣＲ軽鎖を含む。
一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させるステップは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させるステップを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含む。一部の実施形態では、本方法は、第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、またはその産物の配列情報を得るステップを含む。一部の実施形態では、配列情報を得るステップは、シーケンシングアダプターを、第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、またはその産物に結合させるステップを含む。一部の実施形態では、複数の伸長産物を増幅させるステップは、シーケンシングプライマーおよび／もしくはシーケンシングアダプターの結合部位の配列、その相補配列、ならびに／またはその一部分を、複数の伸長産物に付加するステップを含む。一部の実施形態では、シーケンシングアダプターは、Ｐ５配列、Ｐ７配列、その相補配列、またはその一部分を含む。一部の実施形態では、シーケンシングプライマーは、リード１シーケンシングプライマー、リード２シーケンシングプライマー、その相補配列、またはその一部分を含む。一部の実施形態では、第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、またはその産物の配列情報を得るステップは、第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、またはその産物の複数のシーケンシングリードを含むシーケンシングデータを得るステップであって、複数のシーケンシングリードのそれぞれが、（１）細胞標識配列、（２）分子標識配列、および／または（３）核酸標的の部分配列を含む、ステップを含む。
一部の実施形態では、本方法は、試料の単一細胞を示す、それぞれ固有の細胞標識配列について、核酸標的の複数のシーケンシングリードのそれぞれをアライメントさせて、核酸標的のアライメントされた配列を生成するステップを含む。一部の実施形態では、核酸標的のアライメントされた配列は、核酸標的のｃＤＮＡ配列の少なくとも５０％、核酸標的のｃＤＮＡ配列の少なくとも７０％、核酸標的のｃＤＮＡ配列の少なくとも９０％、または核酸標的のｃＤＮＡ配列の完全長を含む。一部の実施形態では、核酸標的は、免疫受容体である。一部の実施形態では、免疫受容体は、ＢＣＲ軽鎖、ＢＣＲ重鎖、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、核酸標的のアライメントされた配列は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、可変領域、可変領域の完全長、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、核酸標的のアライメントされた配列は、可変領域、多様性領域、可変領域、多様性領域および／もしくは定常領域の接合部、またはこれらの任意の組合せを含む。
一部の実施形態では、配列情報を得るステップは、単一細胞のＢＣＲ軽鎖およびＢＣＲ重鎖の配列情報を得るステップを含む。一部の実施形態では、ＢＣＲ軽鎖およびＢＣＲ重鎖の配列情報は、ＢＣＲ軽鎖および／またはＢＣＲ重鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含む。一部の実施形態では、方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖を対合させるステップを含む。一部の実施形態では、試料は、複数の単一細胞を含み、本方法は、得られた配列情報に基づいて、前記単一細胞の少なくとも５０％のＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖を対合させるステップを含む。
一部の実施形態では、配列情報を得るステップは、単一細胞のＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列情報を得るステップを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列情報は、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含む。一部の実施形態では、本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を対合させるステップを含む。一部の実施形態では、試料は、複数の単一細胞を含み、本方法は、得られた配列情報に基づいて、前記単一細胞の少なくとも５０％のＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を対合させるステップを含む。
一部の実施形態では、配列情報を得るステップは、単一細胞のＴＣＲガンマ鎖およびＴＣＲデルタ鎖の配列情報を得るステップを含む。一部の実施形態では、ＴＣＲガンマ鎖およびＴＣＲデルタ鎖の配列情報は、ＴＣＲガンマ鎖および／またはＴＣＲデルタ鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含む。一部の実施形態では、本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖を対合させるステップを含む。一部の実施形態では、試料は、複数の単一細胞を含み、本方法は、得られた配列情報に基づいて、前記単一細胞の少なくとも５０％のＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖を対合させるステップを含む。
一部の実施形態では、標的結合領域の相補体は、標的結合領域の逆相補配列または標的結合領域の相補配列を含む。一部の実施形態では、分子標識の相補体は、分子標識の逆相補配列、または分子標識の相補配列を含む。一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子は、バーコード化されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、バーコード化されたリボ核酸（ＲＮＡ）分子、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、核酸標的は、核酸分子を含む。一部の実施形態では、核酸分子は、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、ポリ（Ａ）テールを含むＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫受容体をコードする。一部の実施形態では、核酸標的は、細胞成分結合試薬を含む、および／または核酸分子は、細胞成分結合試薬に会合している。一部の実施形態では、本方法は、核酸分子と細胞成分結合試薬を解離させるステップを含む。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個は、異なる分子標識配列を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードは、固体支持体に会合している。一部の実施形態では、同じ固体支持体に会合した複数のオリゴヌクレオチドバーコードはそれぞれ、同一の試料標識を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードはそれぞれ、細胞標識を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、同じ固体支持体に会合したオリゴヌクレオチドバーコードは、同じ細胞標識を含む。一部の実施形態では、異なる固体支持体に会合したオリゴヌクレオチドバーコードは、異なる細胞標識を含む。一部の実施形態では、複数の伸長したバーコード化された核酸分子はそれぞれ、細胞標識および該細胞標識の相補体を含む。一部の実施形態では、細胞標識の相補体は、細胞標識の逆相補配列、または細胞標識の相補配列を含む。
一部の実施形態では、固体支持体は、合成粒子、平面表面、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、試料は、単一細胞を含み、本方法は、複数のオリゴヌクレオチドバーコードを含む合成粒子を、試料中の単一細胞と会合させるステップを含む。本方法は、合成粒子を単一細胞と会合させた後に、単一細胞を溶解させるステップを含んでもよい。一部の実施形態では、単一細胞を溶解させるステップは、試料を加熱するステップ、試料を界面活性剤と接触させるステップ、試料のｐＨを変更するステップ、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、合成粒子と単一細胞は、同じ区画中に存在する。一部の実施形態では、区画は、ウェルまたは液滴である。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に固定化されているかもしくは部分的に固定化されている、または複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子内に封入されているかもしくは部分的に封入されている。一部の実施形態では、合成粒子は、崩壊可能である。一部の実施形態では、合成粒子は、崩壊可能ハイドロゲル粒子である。一部の実施形態では、合成粒子は、ビーズを含む。一部の実施形態では、ビーズは、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、合成粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性体（paramagnetic）、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれは、リンカー官能基を含み、合成粒子は、固体支持体官能基を含み、ならびに支持体官能基およびリンカー官能基は互いに会合している。一部の実施形態では、リンカー官能基および支持体官能基は、独立して、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
本明細書の開示は、キットを含む。一部の実施形態では、キットは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、分子標識および標的結合領域を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が異なる分子標識配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドバーコード；逆転写酵素；標的結合領域またはその一部分を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド；ならびに５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを含む。
一部の実施形態では、逆転写酵素は、ウイルス逆転写酵素、例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）逆転写酵素またはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素を含む。一部の実施形態では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の３’リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、３つの３’リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’リボヌクレオチドは、グアニンを含む。キットは、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、７－デアザ－ＧＴＰ、アセトアミド、塩化テトラメチルアンモニウム塩、ベタイン、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数を含み得る。
本明細書の開示は、キットを含む。一部の実施形態では、キットは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、分子標識および標的結合領域を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が異なる分子標識配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドバーコード；末端デオキシヌクレオチド転移酵素；ならびに５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含む。キットは、緩衝液、カートリッジ、または両方を含み得る。キットは、逆転写反応および／または増幅反応のための１種または複数の試薬を含み得る。一部の実施形態では、標的結合領域は、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダム多量体、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、同一の試料標識および／または同一の細胞標識を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識および／または細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に固定化されているかもしくは部分的に固定化されている、または合成粒子内に封入されているかもしくは部分的に封入されている。一部の実施形態では、合成粒子は、崩壊可能（例えば、崩壊可能ハイドロゲル粒子）である。一部の実施形態では、合成粒子は、ビーズを含む。一部の実施形態では、ビーズは、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、合成粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれは、リンカー官能基を含み、合成粒子は、固体支持体官能基を含み、ならびに支持体官能基およびリンカー官能基は互いに会合している。一部の実施形態では、リンカー官能基および支持体官能基は、独立して、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
非限定的な例示的バーコードを示す図である。 バーコード化および電子計数の非限定的な例示的ワークフローを示す図である。 複数の標的から３’末端でバーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するための非限定的な例示的プロセスを示す略図である。 ５’末端において核酸標的を遺伝子特異的に標識する非限定的な例示的方法の略図を示す。 ５’末端において核酸標的を遺伝子特異的に標識する非限定的な例示的方法の略図を示す。 全トランスクリプトーム分析のために５’末端において核酸標的を標識する非限定的な例示的方法の略図を示す。 全トランスクリプトーム分析のために５’末端において核酸標的を標識する非限定的な例示的方法の略図を示す。 核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。 完全長発現プロファイリングを実施する非限定的な例示的ワークフローの略図である。 本明細書において提供される方法に従って生成された非限定的な例示的バイオアナライザーによる追跡を示す。 免疫受容体ｍＲＮＡの発現プロファイリングの非限定的な例示的略図を示す。 免疫受容体ｍＲＮＡの発現プロファイリングの非限定的な例示的略図を示す。 本明細書において提供されるランダムプライミングベースの方法に関するデータを示す。現在利用可能な方法（図１０Ｂおよび１０Ｄ）と比較した、本明細書において提供されるランダムプライミングベースのアプローチ（図１０Ａおよび１０Ｃ）で得られたＴＣＲ産物（図１０Ａ～１０Ｂ）およびＢＣＲ産物（図１０Ｃ～１０Ｄ）のバイオアナライザーによる追跡が示される。 本明細書において提供されるランダムプライミングベースの方法に関するデータを示す。現在利用可能な方法（図１０Ｂおよび１０Ｄ）と比較した、本明細書において提供されるランダムプライミングベースのアプローチ（図１０Ａおよび１０Ｃ）で得られたＴＣＲ産物（図１０Ａ～１０Ｂ）およびＢＣＲ産物（図１０Ｃ～１０Ｄ）のバイオアナライザーによる追跡が示される。 本明細書において提供されるランダムプライミングベースの方法に関するデータを示す。現在利用可能な方法（図１０Ｂおよび１０Ｄ）と比較した、本明細書において提供されるランダムプライミングベースのアプローチ（図１０Ａおよび１０Ｃ）で得られたＴＣＲ産物（図１０Ａ～１０Ｂ）およびＢＣＲ産物（図１０Ｃ～１０Ｄ）のバイオアナライザーによる追跡が示される。 本明細書において提供されるランダムプライミングベースの方法に関するデータを示す。現在利用可能な方法（図１０Ｂおよび１０Ｄ）と比較した、本明細書において提供されるランダムプライミングベースのアプローチ（図１０Ａおよび１０Ｃ）で得られたＴＣＲ産物（図１０Ａ～１０Ｂ）およびＢＣＲ産物（図１０Ｃ～１０Ｄ）のバイオアナライザーによる追跡が示される。 本明細書において提供されるランダムプライミングベースの方法に関するデータを示す。全長である（図１１Ｂ）および細胞に由来する（図１１Ａ）ＶＤＪ配列のパーセンテージは、現在利用可能な方法と比較して、本明細書において提供されるランダムプライミングベースのアプローチ（－Ｐｒｅｔ）に関して示される。 本明細書において提供されるランダムプライミングベースの方法に関するデータを示す。現在利用可能な方法（図１２Ｂおよび１２Ｄ）と比較した、本明細書において提供されるランダムプライミングベースのアプローチ（図１２Ａおよび１２Ｃ）で得られたＢＣＲ対合（図１２Ａ～１２Ｂ）およびＴＣＲ対合（図１２Ｃ～１２Ｄ）が示される。
以下の詳細な説明において、本明細書の一部を形成する添付の図面への参照がなされる。図面では、類似の記号は、文脈により別途示されない限り、典型的には類似の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載される例示的な実施形態は、制限することを意味するものではない。本明細書に提示される主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の実施形態を用いることができ、他の変更を行うことができる。概して本明細書に記載され、図面で図示されている本開示の態様は、広範な異なる構成で配置、置換え、組合せ、分離、および設計がなされてもよく、それらのすべてが、本明細書において明示的に企図され、本明細書の開示の一部をなすことが、容易に理解される。
本明細書において参照されるすべての特許、公開特許出願、他の刊行物、およびＧｅｎＢａｎｋからの配列、ならびに他のデータベースは、関連技術に関してその全体が参照により組み込まれる。
少数の核酸、例えば、メッセンジャーリボヌクレオチド酸（ｍＲＮＡ）分子を定量することは、例えば、異なる発生段階にあるかまたは異なる環境条件下にある細胞において発現される遺伝子を決定するために、臨床上重要である。しかしながら、特に分子の数が非常に少ない場合には、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ分子）の絶対数を決定することも非常に困難であり得る。試料中の分子の絶対数を決定する１つの方法は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。理想的には、ＰＣＲにより、それぞれのサイクルで同一の分子コピーが得られる。しかしながら、ＰＣＲは、それぞれの分子が確率的な見込みで複製し、この見込みは、ＰＣＲサイクルおよび遺伝子配列によって変動し、増幅バイアスおよび不正確な遺伝子発現測定値をもたらすため、欠点を有し得る。固有の分子標識（分子インデックス（ＭＩ）とも称される）を有する確率的バーコードを使用して、分子数を計数し、増幅バイアスを補正することができる。Ｐｒｅｃｉｓｅ（商標）アッセイ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ））およびＲｈａｐｓｏｄｙ（商標）アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ））などの確率的バーコード化によって、ＰＣＲおよび逆転写（ＲＴ）の間にｍＲＮＡを標識するために分子標識（ＭＬ）を使用することによるライブラリー調製ステップによって誘導されるバイアスを補正することができる。
Ｐｒｅｃｉｓｅ（商標）アッセイは、ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドに、多数の、例えば、６５６１～６５５３６個の固有の分子標識配列を有する確率的バーコードの枯渇しないプールを利用して、ＲＴステップの間に試料中のすべてのポリ（Ａ）－ｍＲＮＡにハイブリダイズさせることができる。確率的バーコードは、ユニバーサルＰＣＲプライミング部位を含み得る。ＲＴの間に、標的遺伝子分子は、確率的バーコードとランダムに反応する。それぞれの標的分子は、確率的バーコードにハイブリダイズし、その結果、確率的にバーコード化された相補リボヌクレオチド酸（ｃＤＮＡ）分子を生成し得る。標識した後、マイクロウェルプレートのマイクロウェルから得られた確率的にバーコード化されたｃＤＮＡ分子を、ＰＣＲ増幅およびシーケンシングのために単一のチューブにプールしてもよい。生のシーケンシングデータを分析して、リードの数、固有の分子標識配列を有する確率的バーコードの数、およびｍＲＮＡ分子の数を得ることができる。
本明細書の開示は、試料中の核酸標的を標識する方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、第１のユニバーサル配列、分子標識、および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと；それぞれが、標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと；各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子のうちの１つまたは複数の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと；複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと；核酸標的の配列にハイブリダイズすることが可能な標的特異的プライマーおよび第１のユニバーサル配列を含むプライマーを使用して、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、それによって、核酸標的の配列、またはその一部分を含む第１の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと；ランダムプライマーを第１の複数のバーコード化されたアンプリコンにハイブリダイズさせ、ランダムプライマーを伸長させて、複数の伸長産物を生成するステップであって、ランダムプライマーが、第２のユニバーサル配列、またはその相補体を含む、ステップと；第１のユニバーサル配列および第２のユニバーサル配列、またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して、複数の伸長産物を増幅させて、それによって、第２の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップとを含む。
本明細書の開示は、試料中の核酸標的の数を決定する方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、第１のユニバーサル配列、分子標識（例えば、第１の分子標識）、および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと；それぞれが、標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと；各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子のうちの１つまたは複数の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと；複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと；核酸標的の配列にハイブリダイズすることが可能な標的特異的プライマーおよび第１のユニバーサル配列を含むプライマーを使用して、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、それによって、核酸標的の配列、またはその一部分を含む第１の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと；ランダムプライマーを第１の複数のバーコード化されたアンプリコンにハイブリダイズさせ、ランダムプライマーを伸長させて、複数の伸長産物を生成するステップであって、ランダムプライマーが、第２のユニバーサル配列、またはその相補体を含む、ステップと；第１のユニバーサル配列および第２のユニバーサル配列、またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して、複数の伸長産物を増幅させて、それによって、第２の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと；第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、またはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識、別個の配列を有する第２の分子標識、またはこれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップとを含む。
本明細書の開示は、キットを含む。一部の実施形態では、キットは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、分子標識および標的結合領域を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が異なる分子標識配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドバーコード；逆転写酵素；標的結合領域またはその一部分を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド；ならびに５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを含む。
本明細書の開示は、キットを含む。一部の実施形態では、キットは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、分子標識および標的結合領域を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が異なる分子標識配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドバーコード；末端デオキシヌクレオチド転移酵素；ならびに５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを含む。
定義
別途定義されない限り、本明細書に使用される技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。例えば、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY 1989)を参照されたい。本開示の目的で、次の用語を、以下に定義する。
本明細書で使用される場合、「アダプター」という用語は、会合した核酸の増幅またはシーケンシングを容易にするための配列を意味し得る。会合した核酸は、標的核酸を含み得る。会合した核酸は、空間標識、標的標識、試料標識、インデックス化標識、またはバーコード配列（例えば、分子標識）のうちの１つまたは複数を含み得る。アダプターは、線形であり得る。アダプターは、事前にアデニル化されたアダプターであってもよい。アダプターは、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。１つまたは複数のアダプターが、核酸の５’末端または３’末端に配置され得る。アダプターが５’末端および３’末端に公知の配列を含む場合、公知の配列は、同じ配列であっても異なる配列であってもよい。ポリヌクレオチドの５’末端および／または３’末端に配置されるアダプターは、表面に固定化された１つまたは複数のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能であり得る。アダプターは、一部の実施形態では、ユニバーサル配列を含み得る。ユニバーサル配列は、２つ以上の核酸分子に共通しているヌクレオチド配列の領域であり得る。２つ以上の核酸分子はまた、異なる配列の領域を有し得る。したがって、例えば、５’アダプターは、同一および／またはユニバーサル核酸配列を含み得、３’アダプターは、同一および／またはユニバーサル配列を含み得る。複数の核酸分子の異なるメンバーにユニバーサル配列が存在し得ることにより、ユニバーサル配列に相補的である単一のユニバーサルプライマーを使用した複数の異なる配列の複製または増幅が可能となり得る。同様に、少なくとも１つ、２つ（例えば、１対）、またはそれ以上のユニバーサル配列が、核酸分子の集合体の異なるメンバーに存在し得ることにより、ユニバーサル配列に相補的である少なくとも１つ、２つ（例えば、１対）、またはそれ以上の単一のユニバーサルプライマーを使用した複数の異なる配列の複製または増幅が可能となり得る。したがって、ユニバーサルプライマーには、そのようなユニバーサル配列にハイブリダイズすることができる配列が含まれる。標的核酸配列を有する分子を、異なる標的核酸配列の一方または両方の末端にユニバーサルアダプター（例えば、非標的核酸配列）を付加するように改変してもよい。標的核酸に結合した１つまたは複数のユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマーのハイブリダイゼーションのための部位を提供し得る。標的核酸に結合した１つまたは複数のユニバーサルプライマーは、互いに同じであっても異なってもよい。
本明細書で使用される場合、「会合した」または「と会合した」という用語は、２つ以上の種が、ある時点で一緒に位置しているとして特定可能であることを意味し得る。会合は、２つ以上の種が、類似の容器内にあるかまたはそこにあったことを意味し得る。会合は、情報的会合であってもよい。例えば、２つ以上の種に関するデジタル情報は、記憶され得、種のうちの１つまたは複数がある時点で一緒に位置していたことを決定するために使用され得る。会合はまた、物理的会合であってもよい。一部の実施形態では、２つ以上の会合した種は、互いにまたは共通の固体もしくは半固体表面に「係留されている」、「結合している」、または「固定化されている」。会合は、ビーズなどの固体または半固体支持体に標識を結合させるための共有結合的または非共有結合的手段を指し得る。会合は、標的と標識との間の共有結合であってもよい。会合は、２つの分子（例えば、標的分子および標識）間のハイブリダイゼーションを含み得る。
本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、２つのヌクレオチド間の正確な対合の能力を指し得る。例えば、核酸の所与の位置にあるヌクレオチドが、別の核酸のヌクレオチドと水素結合することができる場合、２つの核酸は、その位置において互いに相補的であると考えられる。２つの一本鎖核酸分子間の相補性は、ヌクレオチドのうちのいくつかだけが結合する「部分的」であってもよく、または一本鎖分子間に全相補性が存在する完全なものであってもよい。第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列に相補的である場合、第２の配列の「相補体」であると称され得る。第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列が第２の配列の逆転物である（すなわち、ヌクレオチドの順序が逆転している）配列に相補的である場合、第２の配列の「逆相補体」であると称され得る。本明細書で使用される場合、「相補」配列は、配列の「相補体」または「逆相補体」を指し得る。ある分子が別の分子にハイブリダイズすることができる場合、それは、ハイブリダイズしている分子に相補的であるか、または部分的に相補的であり得ることが、本開示から理解される。
本明細書で使用される場合、「デジタル計数」という用語は、試料中の標的分子の数を概算するための方法を指し得る。デジタル計数は、試料中の標的と会合している固有の標識の数を決定するステップを含み得る。本質的に確率的であり得るこの方法論は、分子計数の問題を、同一の分子の位置決定および同定のうちの１つを、事前に定義した標識セットの検出に関する一連のはい／いいえ式のデジタル質問に変換する。
本明細書で使用される場合、「標識」または「複数の標識」という用語は、試料内の標的と会合した核酸コードを指し得る。標識は、例えば、核酸標識であり得る。標識は、全体的または部分的に増幅可能な標識であってもよい。標識は、全体的または部分的にシーケンシング可能な標識であってもよい。標識は、異なるものとして特定可能な天然の核酸の一部分であってもよい。標識は、公知の配列であってもよい。標識は、核酸配列の接合部、例えば、天然および非天然の配列の接合部を含み得る。本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、「インデックス」、「タグ」、または「標識タグ」という用語と互換可能に使用することができる。標識は、情報を運ぶことができる。例えば、様々な実施形態では、標識は、試料の同一性、試料の供給源、細胞の同一性、および／または標的を判定するために使用することができる。
本明細書で使用される場合、「枯渇しないリザーバ」という用語は、多数の異なる標識で構成されるバーコード（例えば、確率的バーコード）のプールを指し得る。枯渇しないリザーバは、枯渇しないリザーバを標的のプールと会合させたときに、それぞれの標的が固有のバーコードと会合する可能性が高くなるように、多数の異なるバーコードを含み得る。それぞれの標識した標的分子の固有性は、ランダム選択の統計学によって決定することができ、標識の多様性と比較して、集団内の同一な標的分子のコピー数に依存する。結果として得られる標識した標的分子のサイズは、バーコード化プロセスの確率的性質によって決定することができ、次いで、検出されたバーコードの数の分析により、もともとの集団または試料中に存在している標的分子数の計算が可能となる。固有のバーコードの数に対する存在する標的分子の数の比が、低い場合、標識した標的分子は、固有性が高い（すなわち、１つを上回る標的分子が１つの所与の標識で標識されることになる確率は非常に低い）。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド配列またはその断片を指す。核酸は、ヌクレオチドを含み得る。核酸は、細胞に対して外因性であっても内因性であってもよい。核酸は、無細胞環境で存在してもよい。核酸は、遺伝子またはその断片であり得る。核酸は、ＤＮＡであり得る。核酸は、ＲＮＡであり得る。核酸は、１つまたは複数のアナログ（例えば、改変された骨格、糖、または核酸塩基）を含み得る。アナログの一部の非限定的な例としては、５－ブロモウラシル、ペプチド核酸、ゼノ核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コーディセピン、７－デアザ－ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に連結したローダミンまたはフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン連結ヌクレオチド、蛍光塩基アナログ、ＣｐＧアイランド、メチル－７－グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシン、およびワイオシンが挙げられる。「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「標的ポリヌクレオチド」、および「標的核酸」は、互換可能に使用することができる。
核酸は、新しいかまたは亢進された特性（例えば、改善された安定性）を有する核酸をもたらすように、１つまたは複数の改変（例えば、塩基改変、骨格改変）を含んでもよい。核酸は、核酸親和性タグを含んでもよい。ヌクレオシドは、塩基－糖の組合せであり得る。ヌクレオシドの塩基部分は、複素環式塩基であり得る。そのような複素環式塩基の２つのもっとも一般的なクラスは、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されたリン酸基をさらに含んだヌクレオシドであり得る。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについては、リン酸基は、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分に連結され得る。核酸を形成する際、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合的に連結させて、線形ポリマー化合物を形成し得る。次に、この線形ポリマー化合物のそれぞれの末端が、さらに結合されて、環状化合物が形成され得るが、線形化合物が、一般的には好適である。加えて、線形化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有し得、したがって、完全または部分的に二本鎖の化合物が生じるような様式でフォールディングし得る。核酸内において、リン酸基は、一般に、核酸のヌクレオシド間骨格を形成すると称され得る。連結または骨格は、３’と５’のホスホジエステル連結であり得る。
核酸は、改変された骨格および／または改変されたヌクレオシド間連結を含み得る。改変された骨格には、骨格にリン原子を保持するものおよび骨格にリン原子を有さないものが含まれ得る。リン原子を中に含む好適な改変された核酸骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、例えば、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば、３’－アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、およびノルマル３’－５’連結を有するボラノホスフェート、２’－５’連結アナログ、ならびに逆極性を有するものを挙げることができ、ここで、１つまたは複数のヌクレオチド間連結は、３’と３’、５’と５’、または２’と２’の連結である。
核酸は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つもしくは複数のヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結によって形成されるポリヌクレオチド骨格を含み得る。これらには、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有するもの、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ2成分部分を有するその他のものを挙げることができる。
核酸は、核酸模倣体を含み得る。「模倣体」という用語は、フラノース環のみ、またはフラノース環およびヌクレオチド間連結の両方が、非フラノース基で置き換えられたポリヌクレオチドを含むことを意図し得、フラノース環のみの置換えはまた、糖代理物であると称され得る。複素環式塩基部分または改変された複素環式塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持され得る。１つのそのような核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）であり得る。ＰＮＡでは、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置き換えられ得る。ヌクレオチドは保持されてもよく、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物における骨格は、２つ以上の連結されたアミノエチルグリシン単位を含み得、これにより、ＰＮＡにアミド含有骨格が提供される。複素環式塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合され得る。
核酸は、モルホリノ骨格構造を含み得る。例えば、核酸は、リボース環の代わりに６員モルホリノ環を含み得る。これらの実施形態のうちのいくつかでは、ホスホロジアミデートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間連結により、ホスホジエステル連結を置き換えることができる。
核酸は、モルホリノ環に結合した複素環式塩基を有する連結されたモルホリノ単位（例えば、モルホリノ核酸）を含み得る。連結基は、モルホリノ核酸においてモルホリノモノマー単位を連結し得る。非イオン性モルホリノベースのオリゴマー化合物は、細胞内タンパク質との望ましくない相互作用をあまり有さない可能性がある。モルホリノベースのポリヌクレオチドは、核酸の非イオン性模倣体であり得る。モルホリノクラス内の様々な化合物は、異なる連結基を使用して結合することができる。ポリヌクレオチド模倣体のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と称され得る。核酸分子に通常存在するフラノース環を、シクロヘキセニル環で置き換えることができる。ＣｅＮＡ ＤＭＴで保護されたホスホロアミダイトモノマーを調製し、ホスホロアミダイトケミストリーを使用したオリゴマー化合物の合成に使用することができる。ＣｅＮＡモノマーを核酸鎖に組み込むことにより、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性を増加させることができる。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然の複合体に類似する安定性で、核酸相補体と複合体を形成することができる。さらなる改変には、２’－ヒドロキシル基が糖環の４’炭素原子に連結され、それによって２’－Ｃ，４’－Ｃ－オキシメチレン連結が形成され、それによって二環式糖部分が形成される、ロックド核酸（ＬＮＡ）を挙げることができる。連結は、２’酸素原子および４’炭素原子を架橋するメチレン（－ＣＨ2）基であり得、ここで、ｎは、１または２である。ＬＮＡおよびＬＮＡアナログは、相補性核酸との非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３～＋１０℃）、３’－エクソヌクレアーゼ分解に対する安定性、および良好な可溶性特性を示し得る。
核酸はまた、核酸塩基（単純に「塩基」と称されることが多い）改変または置換も含み得る。本明細書で使用される場合、「改変されていない」または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基（例えば、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））、ならびにピリミジン塩基（例えば、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ））を挙げることができる。改変された核酸塩基としては、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、ピリミジン塩基の５－プロピニル（－Ｃ＝Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびに他のアルキル誘導体、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、および他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、および他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンを挙げることができる。改変された核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド（５，４－ｂ）（１，４）ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－クランプ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド（５，４－（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド（４，５－ｂ）インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）を挙げることができる。
本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、標的を含む組成物を指し得る。開示される方法、デバイス、およびシステムによる分析に好適な試料としては、細胞、組織、器官、または生物が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「試料採取デバイス」または「デバイス」という用語は、試料の切片を採取し、かつ／または基質上に切片を配置することができる、デバイスを指し得る。試料デバイスは、例えば、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）機、細胞分取機、生検ニードル、生検デバイス、組織切片化デバイス、マイクロ流体デバイス、ブレードグリッド、および／またはミクロトームを指し得る。
本明細書で使用される場合、「固体支持体」という用語は、複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）が結合され得る別々の固体または半固体表面を指し得る。固体支持体は、核酸を（例えば、共有結合的または非共有結合的に）固定化することができる、プラスチック、セラミック、金属、またはポリマー材料（例えば、ハイドロゲル）で構成される任意の種類の固体、多孔質、または中空の球体、ボール、ベアリング、シリンダー、または他の類似の構成を包含し得る。固体支持体は、球状（例えば、マイクロスフェア）であり得る別個の粒子を含み得るか、または非球状もしくは不規則な形状、例えば、立方体、立方体様、ピラミッド形、円筒形、円錐形、長方形、もしくは円盤形などを有し得る。ビーズは、非球体の形状であり得る。アレイに離間配置された複数の固体支持体は、基質を含まない場合がある。固体支持体は、「ビーズ」という用語と互換可能に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「確率的バーコード」という用語は、本開示の標識を含むポリヌクレオチド配列を指し得る。確率的バーコードは、確率的バーコード化に使用することができるポリヌクレオチド配列であり得る。確率的バーコードは、試料内の標的を定量するために使用することができる。確率的バーコードは、標識を標的に会合させた後に発生し得るエラーを制御するために使用することができる。例えば、確率的バーコードは、増幅またはシーケンシングエラーを評価するために使用することができる。標的と会合した確率的バーコードは、確率的バーコード－標的または確率的バーコード－タグ－標的と称され得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝子特異的確率的バーコード」という用語は、標識および遺伝子特異的である標的結合領域を含むポリヌクレオチド配列を指し得る。確率的バーコードは、確率的バーコード化に使用することができるポリヌクレオチド配列であり得る。確率的バーコードは、試料内の標的を定量するために使用することができる。確率的バーコードは、標識を標的に会合させた後に発生し得るエラーを制御するために使用することができる。例えば、確率的バーコードは、増幅またはシーケンシングエラーを評価するために使用することができる。標的と会合した確率的バーコードは、確率的バーコード－標的または確率的バーコード－タグ－標的と称され得る。
本明細書で使用される場合、「確率的バーコード化」という用語は、核酸のランダムな標識化（例えば、バーコード化）を指し得る。確率的バーコード化は、ポアソン再帰戦略を利用して、標識を会合させ、標的と会合した標識を定量することができる。本明細書で使用される場合、「確率的バーコード化」という用語は、「確率的標識化」と互換可能に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、バーコード（例えば、確率的バーコード）と会合され得る組成物を指し得る。本開示の方法、デバイス、およびシステムによる分析に好適な例示的な標的としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｔＲＮＡなどが挙げられる。標的は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一部の実施形態では、標的は、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであってもよい。一部の実施形態では、標的は、脂質である。本明細書で使用される場合、「標的」は、「種」と互換可能に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「逆転写酵素」という用語は、逆転写酵素活性を有する（すなわち、ＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの合成を触媒する）酵素の群を指し得る。一般に、そのような酵素としては、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、細菌逆転写酵素、ＩＩ群イントロン由来逆転写酵素、およびこれらの変異体、バリアント、または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。非レトロウイルス逆転写酵素としては、非ＬＴＲレトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、およびＩＩ群イントロン逆転写酵素が挙げられる。ＩＩ群イントロン逆転写酵素の例としては、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＬＩ．ＬｔｒＢイントロン逆転写酵素、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）ＴｅＩ４ｃイントロン逆転写酵素、またはゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＧｓＩ－ＩＩＣイントロン逆転写酵素が挙げられる。逆転写酵素の他のクラスとしては、非レトロウイルス逆転写酵素の多数のクラス（すなわち、とりわけ、レトロン、ＩＩ群イントロン、および多様性発生レトロエレメント）を挙げることができる。
「ユニバーサルアダプタープライマー」、「ユニバーサルプライマーアダプター」または「ユニバーサルアダプター配列」という用語は、バーコード（例えば、確率的バーコード）にハイブリダイズし、遺伝子特異的バーコードを生成するために使用することができるヌクレオチド配列を指すために、互換可能に使用される。ユニバーサルアダプター配列は、例えば、本開示の方法において使用されるすべてのバーコードにわたりユニバーサルである公知の配列であり得る。例えば、複数の標的が、本明細書に開示される方法を使用して標識される場合、標的特異的配列のそれぞれは、同じユニバーサルアダプター配列に連結され得る。一部の実施形態では、２つ以上のユニバーサルアダプター配列は、本明細書に開示される方法において使用することができる。例えば、複数の標的が、本明細書に開示される方法を使用して標識される場合、標的特異的配列のうちの少なくとも２つは、異なるユニバーサルアダプター配列に連結される。ユニバーサルアダプタープライマーおよびその相補体は、２つのオリゴヌクレオチド中に含まれてもよく、そのうちの一方は標的特異的配列を含み、他方はバーコードを含む。例えば、ユニバーサルアダプター配列は、標的核酸に相補的であるヌクレオチド配列を生成するために、標的特異的配列を含むオリゴヌクレオチドの一部であってもよい。バーコードおよびユニバーサルアダプター配列の相補配列を含む第２のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、標的特異的バーコード（標的特異的な確率的バーコード）を生成し得る。一部の実施形態では、ユニバーサルアダプタープライマーは、本開示の方法において使用されるユニバーサルＰＣＲプライマーと異なる配列を有する。
バーコード
バーコード化、例えば、確率的バーコード化は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０２９９７８４号、国際公開第ＷＯ２０１５／０３１６９１号、およびFu et al, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2011 May 31;108(22):9026-31に記載されており、これらの刊行物の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるバーコードは、標的を確率的に標識する（例えば、バーコード化する、タグ付けする）ために使用することができるポリヌクレオチド配列であり得る、確率的バーコードであり得る。バーコードは、確率的バーコードの異なるバーコード配列の数の、標識しようとする標的のうちの任意のものの発生の数に対する比が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る場合に、確率的バーコードと称され得る。標的は、同一またはほぼ同一な配列を有するｍＲＮＡ分子を含むｍＲＮＡ種であり得る。バーコードは、確率的バーコードの異なるバーコード配列の数の、標識しようとする標的のうちの任意のものの発生の数に対する比が、少なくとも、または最大で１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１である場合に、確率的バーコードと称され得る。確率的バーコードのバーコード配列は、分子標識と称され得る。
バーコード、例えば、確率的バーコードは、１つまたは複数の標識を含み得る。例示的な標識としては、ユニバーサル標識、細胞標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、試料標識、プレート標識、空間標識、および／または空間前（ｐｒｅ－ｓｐａｔｉａｌ）標識を挙げることができる。図１は、空間標識を有する例示的なバーコード１０４を示す。バーコード１０４は、バーコードを固体支持体１０５に連結させることができる５’アミンを含み得る。バーコードは、ユニバーサル標識、次元標識（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｌａｂｅｌ）、空間標識、細胞標識、および／または分子標識を含み得る。バーコード内の異なる標識（ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、および分子標識を含むがこれらに限定されない）の順序は、変動し得る。例えば、図１に示されるように、ユニバーサル標識がもっとも５’側の標識であってもよく、分子標識がもっとも３’側の標識であってもよい。空間標識、次元標識、および細胞標識は、任意の順序であってよい。一部の実施形態では、ユニバーサル標識、空間標識、次元標識、細胞標識、および分子標識は、任意の順序である。バーコードは、標的結合領域を含み得る。標的結合領域は、試料内の標的（例えば、標的核酸、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ）と相互作用し得る。例えば、標的結合領域は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部と相互作用することができるオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る。一部の事例では、バーコードの標識（例えば、ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、およびバーコード配列）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド、またはそれ以上離間していてもよい。
標識、例えば、細胞標識は、エラー補正能力を提供するように設計され得る、定義された長さ、例えば、それぞれが７ヌクレオチドずつの（一部のハミングエラー補正コードにおいて使用されるビット数と同等の）固有の核酸部分配列セットを含み得る。７ヌクレオチドの配列を含むエラー補正用部分配列セットは、セット内の配列の任意の対での組合せが、定義された「遺伝子距離」（またはミスマッチ塩基数）を呈するように設計することができ、例えば、エラー補正用部分配列セットは、３ヌクレオチドの遺伝子距離を呈するように設計することができる。この場合、標識した標的核酸分子の配列データセットにおけるエラー補正配列の考察（以下により詳細に記載される）により、増幅またはシーケンシングエラーを検出または補正することが可能となり得る。一部の実施形態では、エラー補正コードを作成するために使用される核酸部分配列の長さは、変動し得、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、３１、４０、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。一部の実施形態では、他の長さの核酸部分配列が、エラー補正コードを作成するために使用されてもよい。
バーコードは、標的結合領域を含み得る。標的結合領域は、試料内の標的と相互作用し得る。標的は、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、それぞれがポリ（Ａ）尾部を含むＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せであり得るか、またはこれらを含み得る。一部の実施形態では、複数の標的は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み得る。
一部の実施形態では、標的結合領域は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部と相互作用することができるオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る。バーコードの標識（例えば、ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、およびバーコード配列（例えば、分子標識））のうちの１つまたは複数は、バーコードの残りの標識のうちの別の１つまたは２つから、スペーサーによって離間していてもよい。スペーサーは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。一部の実施形態では、バーコードの標識のいずれも、スペーサーによって離間していない。
ユニバーサル標識
バーコードは、１つまたは複数のユニバーサル標識を含み得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のユニバーサル標識は、所与の固体支持体に結合したバーコードのセットにおいて、すべのバーコードについて同じであり得る。一部の実施形態では、１つまたは複数のユニバーサル標識は、複数のビーズに結合したすべてのバーコードについて同じであり得る。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、シーケンシングプライマーにハイブリダイズすることができる核酸配列を含み得る。シーケンシングプライマーは、ユニバーサル標識を含むバーコードをシーケンシングするために使用することができる。シーケンシングプライマー（例えば、ユニバーサルシーケンシングプライマー）は、高スループットのシーケンシングプラットフォームと会合したシーケンシングプライマーを含み得る。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、ＰＣＲプライマーにハイブリダイズすることができる核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、シーケンシングプライマーおよびＰＣＲプライマーにハイブリダイズすることができる核酸配列を含み得る。シーケンシングプライマーまたはＰＣＲプライマーにハイブリダイズすることができるユニバーサル標識の核酸配列は、プライマー結合部位と称され得る。ユニバーサル標識は、バーコードの転写を開始させるために使用することができる配列を含み得る。ユニバーサル標識は、バーコードまたはバーコード内の領域の伸長のために使用することができる配列を含み得る。ユニバーサル標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。例えば、ユニバーサル標識は、少なくとも約１０個のヌクレオチドを含み得る。ユニバーサル標識は、例えば、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチドの長さであり得る。一部の実施形態では、バーコードを支持体から切断することを可能にするために、切断可能なリンカーまたは改変されたヌクレオチドが、ユニバーサル標識配列の一部となっていてもよい。
次元標識
バーコードは、１つまたは複数の次元標識を含み得る。一部の実施形態では、次元標識は、標識化（例えば、確率的標識化）が発生した次元に関する情報を提供する核酸配列を含み得る。例えば、次元標識は、標的がバーコード化された時間に関する情報を提供することができる。次元標識は、試料におけるバーコード化（例えば、確率的バーコード化）の時間と関連付けられてもよい。次元標識は、標識化の時点で活性化され得る。異なる次元標識は、異なる時点で活性化され得る。次元標識は、標的、標的の群、および／または試料がバーコード化された順序に関する情報を提供する。例えば、細胞集団は、細胞周期のＧ０期に、バーコード化され得る。細胞は、細胞周期のＧ１期に、バーコード（例えば、確率的バーコード）で再びパルスされ得る。細胞は、細胞周期のＳ期に、バーコードで再びパルスされ得るなどとなり得る。それぞれのパルス（例えば、細胞周期のそれぞれの段階）におけるバーコードは、異なる次元標識を含み得る。このようにすると、次元標識により、細胞周期のどの段階でどの標的が標識されたかに関する情報が得られる。次元標識は、多くの異なる生物学的時間を調べることができる。例示的な生物学的時間としては、細胞周期、転写（例えば、転写開始）、および転写物分解を挙げることができるが、これらに限定されない。別の例では、試料（例えば、細胞、細胞集団）は、薬物および／または治療法での処置の前および／または後に、確率的に標識され得る。別個の標的のコピー数の変化により、薬物および／または治療法に対する試料の応答を示すことができる。
次元標識は、活性化可能であり得る。活性化可能な次元標識は、特定の時点で活性化させることができる。活性化可能な標識は、例えば、継続的に活性化させることができる（例えば、停止されない）。活性化可能な次元標識は、例えば、可逆的に活性化可能であってもよい（例えば、活性化可能な次元標識は、作動させることができ、停止させることができる）。次元標識は、例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上、可逆的に活性化可能であってもよい。次元標識は、例えば、少なくとも１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上、可逆的に活性化可能であってもよい。一部の実施形態では、次元標識は、蛍光、光、化学的事象（例えば、切断、別の分子のライゲーション、改変の付加（例えば、ペグ化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、脱アセチル化、脱メチル化）、光化学的事象（例えば、光ケージング）、および非天然のヌクレオチドの導入により活性化させることができる。
次元標識は、一部の実施形態では、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に結合したすべてのバーコード（例えば、確率的バーコード）について同一であってもよいが、異なる固体支持体（例えば、ビーズ）については異なり得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％が、同じ次元標識を含み得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％が、同じ次元標識を含み得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも９５％が、同じ次元標識を含み得る。
複数の固体支持体（例えば、ビーズ）に、１０6個以上もの多くの固有の次元標識配列が提示されてもよい。次元標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。次元標識は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチド長であり得る。次元標識は、約５～約２００個のヌクレオチドを含み得る。次元標識は、約１０～約１５０個のヌクレオチドを含み得る。次元標識は、約２０～約１２５ヌクレオチドの長さを含み得る。
空間標識
バーコードは、１つまたは複数の空間標識を含み得る。一部の実施形態では、空間標識は、バーコードと会合した標的分子の空間配向に関する情報を提供する、核酸配列を含み得る。空間標識は、試料における座標と関連付けられ得る。座標は、固定座標であってもよい。例えば、座標は、基質に関連して固定され得る。空間標識は、二次元または三次元グリッドを参照するものであってもよい。座標は、ランドマークに対して固定され得る。ランドマークは、空間内で特定可能であり得る。ランドマークは、画像化することができる構造体であり得る。ランドマークは、生物学的構造体、例えば、解剖学的ランドマークであり得る。ランドマークは、細胞ランドマーク、例えば、オルガネラであり得る。ランドマークは、非天然のランドマーク、例えば、特定可能な識別子、例えば、カラーコード、バーコード、磁気特性、蛍光、放射性、もしくは固有のサイズもしくは形状を有する構造体であってもよい。空間標識は、物理的区画（例えば、ウェル、容器、または液滴）と関連付けられていてもよい。一部の実施形態では、複数の空間標識が、空間内の１つまたは複数の位置をコードするために、一緒に使用される。
空間標識は、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に結合したすべてのバーコードについて同一であってもよいが、異なる固体支持体（例えば、ビーズ）については異なり得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の同じ空間標識を含むバーコードのパーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の同じ空間標識を含むバーコードのパーセンテージは、少なくとも、または最大で６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％であり得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％が、同じ空間標識を含み得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも９５％が、同じ空間標識を含み得る。
複数の固体支持体（例えば、ビーズ）に、１０6個以上もの多くの固有の空間標識配列が提示されてもよい。空間標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。空間標識は、例えば、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチドの長さであり得る。空間標識は、約５～約２００の間のヌクレオチド、例えば、約１０～約１５０の間のヌクレオチド、または約２０～約１２５の間のヌクレオチドの長さを含み得る。
細胞標識
バーコード（例えば、確率的バーコード）は、１つまたは複数の細胞標識を含み得る。一部の実施形態では、細胞標識は、どの標的核酸がどの細胞を起源としているかを決定するための情報を提供する、核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、細胞標識は、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に結合したすべてのバーコードについて同一であるが、異なる固体支持体（例えば、ビーズ）については異なる。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の同じ細胞標識を含むバーコードのパーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。一部の実施形態では、同じ固体支持体上の同じ細胞標識を含むバーコードのパーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％であり得るか、またはおよそでこれらの値であり得る。例えば、同じ固体支持体上のバーコードのうちの少なくとも６０％、または少なくとも９５％が、同じ細胞標識を含み得る。
複数の固体支持体（例えば、ビーズ）に、１０6個以上もの多くの固有の細胞標識配列が提示されてもよい。細胞標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。細胞標識は、例えば、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチドの長さであり得る。例えば、細胞標識は、約５～約２００の間のヌクレオチド、約１０～約１５０の間のヌクレオチド、または約２０～約１２５の間のヌクレオチドの長さを含み得る。
バーコード配列
バーコードは、１つまたは複数のバーコード配列を含み得る。一部の実施形態では、バーコード配列は、バーコードにハイブリダイズした標的核酸種の特定の種類に関する情報の特定をもたらす、核酸配列を含み得る。バーコード配列は、バーコード（例えば、標的結合領域）にハイブリダイズした標的核酸種の特定の発生に関するカウンタを提供する（例えば、およその近似値を提供する）、核酸配列を含む。
一部の実施形態では、バーコード配列の多様なセットが、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に結合される。一部の実施形態では、１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の固有の分子標識配列が存在し得る。例えば、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５６１個のバーコード配列を含み得る。別の例として、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５５３６個のバーコード配列を含み得る。一部の実施形態では、少なくとも、または最大で１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、または１０9個の固有のバーコード配列が存在し得る。固有の分子標識配列は、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に結合していてもよい。一部の実施形態では、固有の分子標識配列は、粒子（例えば、ハイドロゲルビーズ）によって部分的または全体的に包含される。
バーコードの長さは、異なるインプリメンテーションにおいて異なっていてもよい。例えば、バーコードは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。別の例として、バーコードは、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチド長であってもよい。
分子標識
バーコード（例えば、確率的バーコード）は、１つまたは複数の分子標識を含み得る。分子標識は、バーコード配列を含み得る。一部の実施形態では、分子標識は、バーコードにハイブリダイズした標的核酸種の特定の種類に関する情報の特定をもたらす、核酸配列を含み得る。分子標識は、バーコード（例えば、標的結合領域）にハイブリダイズした標的核酸種の特定の発生に対するカウンタを提供する、核酸配列を含む。
一部の実施形態では、分子標識の多様なセットが、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に結合される。一部の実施形態では、１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲の固有の分子標識配列、または約１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲の固有の分子標識配列が存在し得る。例えば、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５６１個の分子標識を含み得る。別の例として、複数のバーコードは、別個の配列を有する約６５５３６個の分子標識を含み得る。一部の実施形態では、少なくとも、または最大で１０2個、１０3個、１０4個、１０5個、１０6個、１０7個、１０8個、もしくは１０9個の固有の分子標識配列が存在し得る。固有の分子標識配列を有するバーコードは、所与の固体支持体（例えば、ビーズ）に結合していてもよい。
複数の確率的バーコードを使用するバーコード化（例えば、確率的バーコード化）については、異なる分子標識配列の数と、標的のうちのいずれかの発生の数との比は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。標的は、同一またはほぼ同一な配列を有するｍＲＮＡ分子を含むｍＲＮＡ種であり得る。一部の実施形態では、異なる分子標識配列の数と、標的のうちのいずれかの発生の数との比は、少なくとも、または最大で１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、もしくは１００：１である。
分子標識は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。分子標識は、例えば、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、または３００ヌクレオチドの長さであり得る。
標的結合領域
バーコードは、１つまたは複数の標的結合領域、例えば、捕捉プローブを含み得る。一部の実施形態では、標的結合領域は、目的の標的とハイブリダイズし得る。一部の実施形態では、標的結合領域は、標的（例えば、標的核酸、標的分子、例えば、分析しようとする細胞核酸）、例えば、特定の遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、標的結合領域は、特定の標的核酸の特定の位置に結合（例えば、ハイブリダイズ）することができる核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、標的結合領域は、制限酵素部位オーバーハング（例えば、ＥｃｏＲＩ粘着末端オーバーハング）への特異的ハイブリダイゼーションが可能である核酸配列を含み得る。バーコードは、次いで、制限部位オーバーハングに相補的な配列を含む任意の核酸分子にライゲーションすることができる。
一部の実施形態では、標的結合領域は、非特異的標的核酸配列を含み得る。非特異的標的核酸配列は、標的核酸の特定の配列とは独立して、複数の標的核酸に結合することができる配列を指し得る。例えば、標的結合領域は、ランダム多量体配列、またはｍＲＮＡ分子上のポリ（Ａ）尾部にハイブリダイズするオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る。ランダム多量体配列は、例えば、ランダム二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体、または任意の長さのそれ以上の多量体配列であり得る。一部の実施形態では、標的結合領域は、所与のビーズに結合したすべてのバーコードについて、同じである。一部の実施形態では、所与のビーズに結合した複数のバーコードの標的結合領域は、２つ以上の異なる標的結合配列を含み得る。標的結合領域は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。標的結合領域は、最大で約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。
一部の実施形態では、標的結合領域は、ポリアデニル化末端を含むｍＲＮＡとハイブリダイズすることができるオリゴ（ｄＴ）を含み得る。標的結合領域は、遺伝子特異的であり得る。例えば、標的結合領域は、標的の特定の領域にハイブリダイズするように構成され得る。標的結合領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、３０、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。標的結合領域は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの長さであり得る。標的結合領域は、約５～３０ヌクレオチドの長さであり得る。バーコードが遺伝子特異的標的結合領域を含む場合、バーコードは、本明細書において、遺伝子特異的バーコードと称され得る。
配向特性
確率的バーコード（例えば、確率的バーコード）は、バーコードを配向する（例えば、アライメント）するために使用することができる１つまたは複数の配向特性を含み得る。バーコードは、等電点電気泳動のための部分を含み得る。異なるバーコードは、異なる等電点電気泳動点を含み得る。これらのバーコードを試料に導入すると、試料は、バーコードを公知の様式で配向するために、等電点電気泳動を受け得る。このようにして、配向特性を使用して、試料におけるバーコードの公知のマップを展開することができる。例示的な配向特性としては、電気泳動移動度（例えば、バーコードのサイズに基づく）、等電点、スピン、導電性、および／または自己アセンブリを挙げることができる。例えば、自己アセンブリの配向特性を有するバーコードは、活性化されると、特定の配向（例えば、核酸ナノ構造）に自己アセンブルし得る。
親和性特性
バーコード（例えば、確率的バーコード）は、１つまたは複数の親和性特性を含み得る。例えば、空間標識は、親和性特性を含み得る。親和性特性としては、別の実体（例えば、細胞受容体）へのバーコードの結合を促進することができる化学的および／または生物学的部分を挙げることができる。例えば、親和性特性は、抗体、例えば、試料上の特定の部分（例えば、受容体）に特異的な抗体を含み得る。一部の実施形態では、抗体は、バーコードを、特定の細胞種または分子へと誘導し得る。特定の細胞種または分子にあるおよび／またはその近傍にある標的を、標識（例えば、確率的に標識）することができる。親和性特性は、一部の実施形態では、抗体がバーコードを特定の位置へと誘導し得るため、空間標識のヌクレオチド配列に加えて、空間情報を提供することができる。抗体は、治療用抗体、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。抗体は、ヒト化またはキメラであってもよい。抗体は、ネイキッド抗体または融合抗体であってもよい。
抗体は、全長（すなわち、天然に存在するかもしくは通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスによって形成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（すなわち、特異的結合）部分、例えば、抗体断片であり得る。
抗体断片は、例えば、抗体の一部分、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどであり得る。一部の実施形態では、抗体断片は、全長抗体によって認識されるものと同じ抗原に結合することができる。抗体断片としては、抗体の可変領域からなる単離された断片、例えば、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、ならびに軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）を挙げることができる。例示的な抗体としては、がん細胞に対する抗体、ウイルスに対する抗体、細胞表面受容体（ＣＤ８、ＣＤ３４、ＣＤ４５）に結合する抗体、および治療用抗体を挙げることができるが、これらに限定されない。
ユニバーサルアダプタープライマー
バーコードは、１つまたは複数のユニバーサルアダプタープライマーを含み得る。例えば、遺伝子特異的バーコード、例えば、遺伝子特異的確率的バーコードは、ユニバーサルアダプタープライマーを含み得る。ユニバーサルアダプタープライマーは、すべてのバーコードにわたってユニバーサルなヌクレオチド配列を指し得る。ユニバーサルアダプタープライマーは、遺伝子特異的バーコードを構築するために使用することができる。ユニバーサルアダプタープライマーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、３０ヌクレオチド、またはこれらのうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチドの長さであり得る。ユニバーサルアダプタープライマーは、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６ ２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドの長さであり得る。ユニバーサルアダプタープライマーは、５～３０ヌクレオチドの長さであり得る。
リンカー
バーコードが、１つを上回る種類の標識（例えば、１つを上回る細胞標識または１つを上回るバーコード配列、例えば、１つの分子標識）を含む場合、標識には、リンカー標識配列が散在していてもよい。リンカー標識配列は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。リンカー標識配列は、最大で約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり得る。一部の事例では、リンカー標識配列は、１２ヌクレオチドの長さである。リンカー標識配列は、バーコードの合成を容易にするために使用することができる。リンカー標識は、エラー補正（例えば、ハミング）コードを含み得る。
固体支持体
本明細書において開示されるバーコード、例えば、確率的バーコードは、一部の実施形態では、固体支持体と会合していてもよい。固体支持体は、例えば、合成粒子であり得る。一部の実施形態では、バーコード配列の一部またはすべて、例えば、固体支持体上の複数のバーコード（例えば、第１の複数のバーコード）の確率的バーコード（例えば、第１のバーコード配列）の分子標識は、少なくとも１つのヌクレオチドが異なる。同じ固体支持体上のバーコードの細胞標識は、同じであり得る。異なる固体支持体上のバーコードの細胞標識は、少なくとも１つのヌクレオチドが異なり得る。例えば、第１の固体支持体上の第１の複数のバーコードの第１の細胞標識は、同じ配列を有してもよく、第２の固体支持体上の第２の複数のバーコードの第２の細胞標識は、同じ配列を有してもよい。第１の固体支持体上の第１の複数のバーコードの第１の細胞標識および第２の固体支持体上の第２の複数のバーコードの第２の細胞標識は、少なくとも１つのヌクレオチドが異なり得る。細胞標識は、例えば、約５～２０ヌクレオチド長であり得る。バーコード配列は、例えば、約５～２０ヌクレオチド長であり得る。合成粒子は、例えば、ビーズであり得る。
ビーズは、例えば、シリカゲルビーズ、細孔制御ガラスビーズ、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄ、ｓｅｐｈａｄｅｘ／ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ、またはこれらの任意の組合せであり得る。ビーズは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、またはこれらの任意の組合せなどの材料を含み得る。
一部の実施形態では、ビーズは、ポリマービーズ、例えば、バーコードまたは確率的バーコードで官能化された変形可能なビーズまたはゲルビーズ（例えば、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）からのゲルビーズ）であり得る。一部の実装形態では、ゲルビーズは、ポリマー系ゲルを含み得る。ゲルビーズは、例えば、１つまたは複数のポリマー前駆体を液滴に封入することによって、生成することができる。ポリマー前駆体を、促進剤（例えば、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ））に曝露すると、ゲルビーズが生成され得る。
一部の実施形態では、粒子は、崩壊可能（例えば、溶解可能、分解可能）であり得る。例えば、ポリマービーズは、例えば、所望される条件下において、溶解、融解、または分解し得る。所望される条件には、環境条件が含まれ得る。所望される条件は、制御された様式で、ポリマービーズの溶解、融解、または分解をもたらし得る。ゲルビーズは、化学的刺激、物理的刺激、生物学的刺激、熱刺激、磁気刺激、電気刺激、光刺激、またはこれらの任意の組合せに起因して、溶解、融解、または分解し得る。
分析物および／または試薬、例えば、オリゴヌクレオチドバーコードは、例えば、ゲルビーズの内部表面（例えば、オリゴヌクレオチドバーコードおよび／またはオリゴヌクレオチドバーコードを生成するために使用される材料の拡散を通じてアクセス可能な内部）、および／またはゲルビーズもしくは本明細書に記載の任意の他のマイクロカプセルの外部表面に連結／固定化されていてもよい。連結／固定化は、任意の形態の化学結合（例えば、共有結合、イオン結合）または物理的現象（例えば、ファンデルワールス力、双極子間相互作用など）を介してもよい。一部の実施形態では、試薬の、ゲルビーズまたは本明細書に記載の任意の他のマイクロカプセルへの連結／固定化は、例えば、不安定性部分を介する（例えば、本明細書に記載の化学的架橋剤を含む、化学的架橋剤を介する）ものなど、可逆的であってもよい。刺激を適用すると、不安定性部分は、切断され、固定化された試薬が遊離され得る。一部の実施形態では、不安定性部分は、ジスルフィド結合である。例えば、オリゴヌクレオチドバーコードがジスルフィド結合を介してゲルビーズに固定化されている事例では、ジスルフィド結合を還元剤に曝露することにより、ジスルフィド結合が切断され、オリゴヌクレオチドバーコードがビーズから遊離され得る。不安定性部分は、ゲルビーズもしくはマイクロカプセルの一部として、試薬もしくは分析物をゲルビーズもしくはマイクロカプセルに連結させる化学的リンカーの一部として、および／または試薬もしくは分析物の一部として含まれてもよい。一部の実施形態では、複数のバーコードのうちの少なくとも１つのバーコードは、粒子に固定化されていてもよく、粒子に部分的に固定化されていてもよく、粒子に封入されていてもよく、粒子に部分的に封入されていてもよく、またはこれらの任意の組合せであってもよい。
一部の実施形態では、ゲルビーズは、ポリマー、熱感受性ポリマー、光感受性ポリマー、磁性ポリマー、ｐＨ感受性ポリマー、塩感受性ポリマー、化学感受性ポリマー、高分子電解質、多糖、ペプチド、タンパク質、および／またはプラスチックを含むがこれらに限定されない、広範な異なるポリマーを含み得る。ポリマーとしては、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（スチレンスルホネート）（ＰＳＳ）、ポリ（アリルアミン）（ＰＡＡｍ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（ジアリルジメチル－アンモニウムクロリド）（ＰＤＡＤＭＡＣ）、ポリ（ピロール）（ＰＰｙ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰＯＮ）、ポリ（ビニルピリジン）（ＰＶＰ）、ポリ（メタクリル酸）（ＰＭＡＡ）、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ（テトラヒドロフラン）（ＰＴＨＦ）、ポリ（フタルアルデヒド）（ＰＴＨＦ）、ポリ（ヘキシルビオロゲン）（ＰＨＶ）、ポリ（Ｌ－リシン）（ＰＬＬ）、ポリ（Ｌ－アルギニン）（ＰＡＲＧ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）などの材料を挙げることができるが、これらに限定されない。
多数の化学的刺激を使用して、ビーズの崩壊、溶解、または分解をトリガーすることができる。これらの化学変化の例としては、ビーズ壁へのｐＨに媒介される変化、架橋結合の化学的切断を介したビーズ壁の崩壊、ビーズ壁の脱重合のトリガー、およびビーズ壁のスイッチング反応を挙げることができるが、これらに限定されない。バルク変化を使用して、ビーズの崩壊をトリガーすることもできる。
様々な刺激を通じたマイクロカプセルに対するバルク変化または物理的変化はまた、試薬を放出するためのカプセルの設計において、多くの利点を提供する。バルク変化または物理的変化は、巨視的規模で発生し、ビーズの破裂は、刺激によって誘導される機械－物理力の結果である。これらのプロセスとしては、圧力に誘導される破裂、ビーズ壁の融解、またはビーズ壁の多孔性の変化を挙げることができるが、これらに限定されない。
生物学的刺激もまた、ビーズの崩壊、溶解、または分解をトリガーするために使用することができる。一般に、生物学的トリガーは、化学的トリガーに似ているが、多くの例では、生体分子、または酵素、ペプチド、糖、脂肪酸、核酸などといった生体系において一般に見出される分子を使用する。例えば、ビーズは、特定のプロテアーゼによる切断に対して感受性であるペプチド架橋を有するポリマーを含み得る。より具体的には、１つの例では、ＧＦＬＧＫペプチド架橋を含むマイクロカプセルを含み得る。プロテアーゼカテプシンＢなどの生物学的トリガーを添加すると、シェル壁のペプチド架橋が切断され、ビーズの内容物が放出される。他の事例では、プロテアーゼは、熱活性化され得る。別の例では、ビーズは、セルロースを含むシェル壁を含む。加水分解性酵素であるキトサンの添加が、セルロース結合の切断、シェル壁の脱重合、およびその内部の内容物の放出の生物学的トリガーとしての機能を果たす。
ビーズはまた、熱刺激を適用するとその内容物を放出するように誘導することもできる。温度の変化は、ビーズに様々な変化を引き起こし得る。熱の変化は、ビーズ壁が崩壊するようにビーズの融解を引き起こし得る。他の事例では、熱は、ビーズが崩壊または爆発するように、ビーズの内部成分の内圧を増加させ得る。なおも他の事例では、熱は、ビーズを圧縮され脱水された状態へと変換させ得る。熱はまた、ビーズの壁内の熱感受性ポリマーに対して作用して、ビーズの崩壊を引き起こすことができる。
マイクロカプセルのビーズ壁に磁性ナノ粒子を含めることにより、ビーズの崩壊をトリガーすること、ならびにビーズをアレイにおいて誘導することができる。本開示のデバイスは、いずれかの目的で磁性ビーズを含み得る。１つの例では、Ｆｅ3Ｏ4ナノ粒子を高分子電解質含有ビーズに組み込むことにより、振動磁界刺激の存在下において崩壊がトリガーされる。
ビーズはまた、電気刺激の結果として、崩壊、溶解、または分解され得る。前の節に記載されている磁性粒子と同様に、電気感受性ビーズにより、ビーズの崩壊、ならびに電界におけるアライメント、電気伝導、または酸化還元反応などの他の機能の両方をトリガーすることが可能となり得る。１つの例では、電気感受性材料を含有するビーズは、内部試薬の放出を制御することができるように、電界においてアライメントされる。他の例では、電界は、ビーズ壁自体内における酸化還元反応を誘導し得、これにより多孔性が増加し得る。
光刺激もまた、ビーズを崩壊させるために使用することができる。多数の光トリガーが、可能であり、これには、特定の範囲の波長の光子を吸収することができるナノ粒子および発色団などの様々な分子を使用するシステムが含まれ得る。例えば、金属酸化物コーティングを、カプセルトリガーとして使用することができる。ＳｉＯ2をコーティングした高分子電解質カプセルのＵＶ照射は、ビーズ壁の崩壊をもたらし得る。さらに別の例では、光スイッチ可能な材料、例えば、アゾベンゼン基を、ビーズ壁に組み込んでもよい。ＵＶまたは可視光を適用すると、これらのような化学物質は、光子を吸収して可逆的なシスからトランスへの異性化を受ける。この態様では、光スイッチの組込みにより、光トリガーを適用すると崩壊し得るかまたはより多孔性となり得るビーズ壁が得られる。
例えば、図２に示されるバーコード化（例えば、確率的バーコード化）の非限定的な例では、ブロック２０８において、細胞、例えば、単一細胞を、マイクロウェルアレイの複数のマイクロウェルに導入した後、ブロック２１２において、ビーズを、マイクロウェルアレイの複数のマイクロウェルに導入することができる。それぞれのマイクロウェルは、１つのビーズを含み得る。ビーズは、複数のバーコードを含み得る。バーコードは、ビーズに結合した５’アミン領域を含み得る。バーコードは、ユニバーサル標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、標的結合領域、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
本明細書において開示されるバーコードは、固体支持体（例えば、ビーズ）と会合していてもよい（例えば、それに結合していてもよい）。固体支持体と会合しているバーコードは、それぞれが、固有の配列を有する少なくとも１００または１０００個のバーコード配列を含む群から選択される、バーコード配列を含み得る。一部の実施形態では、固体支持体と会合した異なるバーコードは、異なる配列を有するバーコードを含み得る。一部の実施形態では、固体支持体と会合しているあるパーセンテージのバーコードは、同じ細胞標識を含む。例えば、パーセンテージは、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、１００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。別の例として、パーセンテージは、少なくとも、または最大で６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％であり得る。一部の実施形態では、固体支持体と会合しているバーコードは、同じ細胞標識を有し得る。異なる固体支持体と会合しているバーコードは、固有の配列を有する少なくとも１００または１０００個の細胞標識を含む群から選択される、異なる細胞標識を有し得る。
本明細書において開示されるバーコードは、固体支持体（例えば、ビーズ）に会合していてもよい（例えば、それに結合していてもよい）。一部の実施形態では、試料における複数の標識をバーコード化するステップは、複数のバーコードと会合した複数の合成粒子を含む固体支持体を用いて行うことができる。一部の実施形態では、固体支持体は、複数のバーコードと会合した複数の合成粒子を含み得る。異なる固体支持体上の複数のバーコードの空間標識は、少なくとも１つのヌクレオチドが異なり得る。固体支持体は、例えば、二次元または三次元で複数のバーコードを含み得る。合成粒子は、ビーズであり得る。ビーズは、シリカゲルビーズ、細孔制御ガラスビーズ、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ／Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、セルロースビーズ、ポリスチレンビーズ、またはこれらの任意の組合せであり得る。固体支持体としては、ポリマー、マトリックス、ハイドロゲル、ニードルアレイデバイス、抗体、またはこれらの任意の組合せを挙げることができる。一部の実施形態では、固体支持体は、自由に浮動することができる。一部の実施形態では、固体支持体は、半固体または固体アレイに包埋されていてもよい。バーコードは、固体支持体と会合していなくてもよい。バーコードは、個別のヌクレオチドであってもよい。バーコードは、基質と会合していてもよい。
本明細書で使用される場合、「係留された」、「結合した」、および「固定化された」という用語は、互換可能に使用され、バーコードを固体支持体に結合させるための共有結合的または非共有結合的手段を指し得る。様々な異なる固体支持体のうちのいずれかを、事前に合成したバーコードを結合させるため、またはバーコードのインサイツでの固相合成のための固体支持体として使用することができる。
一部の実施形態では、固体支持体は、ビーズである。ビーズは、核酸を（例えば、共有結合的または非共有結合的に）固定化することができる１つまたは複数の種類の固体、多孔質、または中空の球体、ボール、ベアリング、シリンダー、または他の類似の構成を含み得る。ビーズは、例えば、プラスチック、セラミック、金属、ポリマー材料、またはこれらの任意の組合せから構成され得る。ビーズは、球状（例えば、マイクロスフェア）である別個の粒子であるか、もしくはそれを含み得るか、または非球状もしくは不規則な形状、例えば、立方体、立方体様、ピラミッド形、円筒形、円錐形、長方形、もしくは円盤形などを有し得る。一部の実施形態では、ビーズは、非球体の形状であり得る。
ビーズは、常磁性材料（例えば、マグネシウム、モリブデン、リチウム、およびタンタル）、超常磁性材料（例えば、フェライト（Ｆｅ3Ｏ4、マグネタイト）ナノ粒子）、強磁性材料（例えば、鉄、ニッケル、コバルト、これらの一部の合金、および一部の希土類金属化合物）、セラミック、プラスチック、ガラス、ポリスチレン、シリカ、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、アガロース、ハイドロゲル、ポリマー、セルロース、ナイロン、またはこれらの任意の組合せを含むがこれらに限定されない、様々な材料を含み得る。
一部の実施形態では、ビーズ（例えば、標識が結合されるビーズ）は、ハイドロゲルビーズである。一部の実施形態では、ビーズは、ハイドロゲルを含む。
本明細書において開示される一部の実施形態は、１つまたは複数の粒子（例えば、ビーズ）を含む。粒子のそれぞれは、複数のオリゴヌクレオチド（例えば、バーコード）を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、バーコード配列（例えば、分子標識配列）、細胞標識、および標的結合領域（例えば、オリゴ（ｄＴ）配列、遺伝子特異的配列、ランダム多量体、またはこれらの組合せ）を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれの細胞標識配列は、同じであってもよい。異なる粒子上のオリゴヌクレオチドの細胞標識配列は、異なる粒子上のオリゴヌクレオチドを特定することができるように、異なってもよい。異なる細胞標識配列の数は、異なる実装形態では異なり得る。一部の実施形態では、細胞標識配列の数は、１０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、これらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、またはそれ以上であってもよい。一部の実施形態では、細胞標識配列の数は、少なくとも、または最大で１０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、１０6個、１０7個、１０8個、または１０9個であり得る。一部の実施形態では、複数の粒子のうちの１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、２０個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下、６０個以下、７０個以下、８０個以下、９０個以下、１００個以下、２００個以下、３００個以下、４００個以下、５００個以下、６００個以下、７００個以下、８００個以下、９００個以下、１０００個以下、またはそれ以上を上回らないものが、同じ細胞配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、同じ細胞配列を有するオリゴヌクレオチドを含む複数の粒子は、最大で０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはそれ以上であり得る。一部の実施形態では、複数の粒子のうちのいずれもが、同じ細胞標識配列を有さない。
それぞれの粒子上の複数のオリゴヌクレオチドは、異なるバーコード配列（例えば、分子標識）を含み得る。一部の実施形態では、バーコード配列の数は、１０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、１０6個、１０7個、１０8個、１０9個、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。一部の実施形態では、バーコード配列の数は、少なくとも、または最大で１０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、２０００個、３０００個、４０００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１００００個、２００００個、３００００個、４００００個、５００００個、６００００個、７００００個、８００００個、９００００個、１０００００個、１０6個、１０7個、１０8個、または１０9個であり得る。例えば、複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１００個は、異なるバーコード配列を含む。別の例として、単一の粒子において、複数のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１００個、５００個、１０００個、５０００個、１００００個、１５０００個、２００００個、５００００個、これらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはそれよりも多くが、異なるバーコード配列を含む。一部の実施形態は、バーコードを含む複数の粒子を提供する。一部の実施形態では、標識しようとする標的の発生（またはコピーもしくは数）と、異なるバーコード配列との比は、少なくとも１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、またはそれ以上であり得る。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、試料標識、ユニバーサル標識、または両方をさらに含む。粒子は、例えば、ナノ粒子またはマイクロ粒子であり得る。
ビーズのサイズは、変動し得る。例えば、ビーズの径は、０．１マイクロメートル～５０マイクロメートルの範囲に及び得る。一部の実施形態では、ビーズの径は、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０マイクロメートル、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲であり得る。
ビーズの径は、基質のウェルの径に関連し得る。一部の実施形態では、ビーズの径は、ウェルの径よりも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、長いかまたは短くてもよい。ビーズの径は、細胞（例えば、基質のウェルによって包囲される単一細胞）の径と関連し得る。一部の実施形態では、ビーズの径は、ウェルの径よりも、少なくとも、または最大で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％、長いかまたは短くてもよい。ビーズの径は、細胞（例えば、基質のウェルによって包囲される単一細胞）の径と関連し得る。一部の実施形態では、ビーズの径は、細胞の径よりも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、長いかまたは短くてもよい。一部の実施形態では、ビーズの径は、細胞の径よりも、少なくとも、または最大で１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、または３００％、長いかまたは短くてもよい。
ビーズは、基質に結合および／または包埋されていてもよい。ビーズは、ゲル、ハイドロゲル、ポリマー、および／またはマトリックスに結合および／または包埋されていてもよい。基質（例えば、ゲル、マトリックス、スキャフォールド、またはポリマー）内のビーズの空間位置は、位置アドレスとしての機能を果たし得るビーズ上のバーコードに存在する空間標識を使用して特定することができる。
ビーズの例としては、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）、ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ、抗体コンジュゲートビーズ（例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ）、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、およびＢｃＭａｇ（商標）カルボキシル末端化磁性ビーズを挙げることができるが、これらに限定されない。
ビーズは、量子ドットまたは蛍光色素と会合（例えば、それを含浸）させて、それを１つの蛍光光学チャネルまたは複数の光学チャネルにおいて蛍光性にすることができる。ビーズは、酸化鉄または酸化クロムと会合させて、それを常磁性または強磁性にすることができる。ビーズは、特定可能であり得る。例えば、ビーズは、カメラを使用してイメージングすることができる。ビーズは、ビーズと会合した検出可能なコードを有し得る。例えば、ビーズは、バーコードを含み得る。ビーズは、例えば、有機または無機溶液中での膨張に起因して、サイズが変化し得る。ビーズは、疎水性であり得る。ビーズは、親水性であり得る。ビーズは、生体適合性であり得る。
固体支持体（例えば、ビーズ）は、視覚化することができる。固体支持体は、視覚化タグ（例えば、蛍光色素）を含み得る。固体支持体（例えば、ビーズ）は、識別子（例えば、数字）をエッチングすることができる。識別子は、ビーズのイメージングを通じて視覚化することができる。
固体支持体は、不溶性、半可溶性、または不溶性材料を含み得る。固体支持体は、そこに結合したリンカー、スキャフォールド、構築ブロック、または他の反応性部分が含まれる場合、「官能化」されたと称され得るが、固体支持体は、そこに結合したそのような反応性部分が欠如している場合、「非官能化」であり得る。固体支持体は、溶液中、例えばマイクロタイターウェル形式において、フロースルー形式、例えばカラムにおいて、またはディップスティックにおいて、自由に用いることができる。
固体支持体は、膜、紙、プラスチック、コーティング表面、平坦面、ガラス、スライド、チップ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。固体支持体は、樹脂、ゲル、マイクロスフェア、または他の幾何構成の形態をとり得る。固体支持体は、シリカチップ、マイクロ粒子、ナノ粒子、プレート、アレイ、キャリパー、平坦支持体、例えば、ガラス繊維フィルタ、ガラス面、金属面、金属面（鋼、金銀、アルミニウム、シリコン、および銅）、ガラス支持体、プラスチック支持体、シリコン支持体、チップ、フィルタ、膜、マイクロウェルプレート、スライド、多重ウェルプレートもしくは膜を含むプラスチック材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、二フッ化ポリビニリデンか形成される）、および／またはウエハ、コーム、ピンもしくはニードル（例えば、コンビナトリアル合成もしくは分析に好適なピンのアレイ）、または平坦面の穴もしくはナノリットルウェルのアレイ、例えば、ウエハ（例えば、シリコンウエハ）、底部がフィルタになっているか、もしくはなっていない穴を有するウエハにおけるビーズを含み得る。
固体支持体は、ポリマーマトリックス（例えば、ゲル、ハイドロゲル）を含み得る。ポリマーマトリックスは、細胞内空間（例えば、オルガネラの周囲）に浸透することが可能であり得る。ポリマーマトリックスは、循環系を通して送り出すことが可能であり得る。
基質およびマイクロウェルアレイ
本明細書で使用される場合、基質は、ある種の固体支持体を指し得る。基質は、本開示のバーコードまたは確率的バーコードを含み得る固体支持体を指し得る。基質は、例えば、複数のマイクロウェルを含み得る。例えば、基質は、２つ以上のマイクロウェルを含むウェルアレイであり得る。一部の実施形態では、マイクロウェルは、容積が定義されている小さな反応チャンバを含み得る。一部の実施形態では、マイクロウェルは、１つまたは複数の細胞を取り込むことができる。一部の実施形態では、マイクロウェルは、１つのみの細胞を取り込むことができる。一部の実施形態では、マイクロウェルは、１つまたは複数の固体支持体を取り込むことができる。一部の実施形態では、マイクロウェルは、１つのみの固体支持体を取り込むことができる。一部の実施形態では、マイクロウェルは、単一の細胞および単一の固体支持体（例えば、ビーズ）を取り込む。マイクロウェルは、本開示のバーコード試薬を含み得る。
バーコード化の方法
本開示は、身体試料（例えば、組織、器官、腫瘍、細胞）の別個の位置における別個の標的の数を概算するための方法を提供する。本方法は、試料に近接してバーコード（例えば、確率的バーコード）を配置するステップ、試料を溶解させるステップ、別個の標的をバーコードと会合させるステップ、標的を増幅させるステップ、および／または標的をデジタル計数するステップを含み得る。本方法は、バーコードの空間標識から得られる情報を分析および／または視覚化するステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、方法は、試料中の複数の標的を視覚化するステップを含む。複数の標的を試料のマップにマッピングするステップは、試料の二次元マップまたは三次元マップを作成するステップを含み得る。二次元マップおよび三次元マップは、試料中の複数の標的をバーコード化（例えば、確率的バーコード化）する前または後に作成され得る。試料中の複数の標的を視覚化するステップは、複数の標的を試料のマップにマッピングするステップを含み得る。複数の標的を試料のマップにマッピングするステップは、試料の二次元マップまたは三次元マップを作成するステップを含み得る。二次元マップおよび三次元マップは、試料中の複数の標的をバーコード化する前または後に作成され得る。一部の実施形態では、二次元マップおよび三次元マップは、試料を溶解させるステップの前または後に作成され得る。二次元マップまたは三次元マップを作成する前または後に試料を溶解させるステップは、試料を加熱するステップ、試料を界面活性剤と接触させるステップ、試料のｐＨを変更するステップ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
一部の実施形態では、複数の標的をバーコード化するステップは、複数のバーコードを複数の標的にハイブリダイズさせ、バーコード化された標的（例えば、確率的にバーコード化された標的）を作製するステップを含む。複数の標的をバーコード化するステップは、バーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するステップを含み得る。バーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するステップは、複数のバーコード（例えば、確率的バーコード）を含む固体支持体を用いて実施され得る。
試料とバーコードを接触させるステップ
本開示は、試料（例えば、細胞）を本開示の基質に接触させるための方法を提供する。例えば、細胞、臓器、または組織の薄切片を含む試料を、バーコード（例えば、確率的バーコード）に接触させることができる。例えば、重力流によって、細胞を接触させることができ、その場合、細胞は定着して単層を形成し得る。試料は、組織薄片であってもよい。薄片を基質上に配置することができる。試料は、一次元であってもよい（例えば、平面表面を形成してもよい）。例えば、基質上で細胞を増殖させる／培養することによって、試料（例えば、細胞）を基質全体に広げることができる。
バーコードが標的と近接して存在する場合、標的は、バーコードにハイブリダイズし得る。それぞれ別個の標的が、本開示の別個のバーコードと会合し得るように、バーコードを、非枯渇的比率で接触させることができる。標的とバーコードとの間の効率的な会合を確実にするために、標的をバーコードと架橋させてもよい。
細胞溶解
細胞およびバーコードの分配後に、細胞を溶解させて、標的分子を遊離させることができる。細胞溶解は、種々の手段のいずれかによって、例えば、化学的もしくは生化学的手段によって、浸透圧ショックによって、または熱溶解、機械溶解、もしくは光学溶解によって達成することができる。界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、Ｌｉドデシルスルフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｗｅｅｎ－２０、またはＮＰ－４０）、有機溶媒（例えば、メタノールまたはアセトン）、もしくは消化酵素（例えば、プロテイナーゼＫ、ペプシン、またはトリプシン）、またはこれらの任意の組合せを含む細胞溶解緩衝液を添加することによって、細胞を溶解させてもよい。標的とバーコードとの会合を増加させるために、例えば、温度を低下させるおよび／またはライセートの粘度を増加させることによって、標的分子の拡散速度を変化させてもよい。
一部の実施形態では、濾紙を使用することによって、試料を溶解させてもよい。濾紙は、濾紙の上を溶解緩衝液で浸漬可能である。試料の溶解および基質への試料の標的のハイブリダイゼーションを促進可能な圧力で試料に適用することができる。
一部の実施形態では、溶解は、機械溶解、熱溶解、光学溶解、および／または化学溶解によって実施することができる。化学溶解には、プロテイナーゼＫ、ペプシン、およびトリプシンなどの消化酵素の使用が含まれてもよい。溶解は、基質への溶解緩衝液の添加によって実施することができる。溶解緩衝液は、トリスＨＣｌを含んでもよい。溶解緩衝液は、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．５、もしくは１Ｍまたはそれより多いトリスＨＣｌを含んでもよい。溶解緩衝液は、最大で約０．０１、０．０５、０．１、０．５、もしくは１Ｍまたはそれより多いトリスＨＣｌを含んでもよい。溶解緩衝液は、約０．１ＭのトリスＨＣｌを含んでもよい。溶解緩衝液のｐＨは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより高い値であってもよい。溶解緩衝液のｐＨは、最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより高い値であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液のｐＨは、約７．５である。溶解緩衝液は、塩（例えば、ＬｉＣｌ）を含んでもよい。溶解緩衝液中の塩濃度は、少なくとも約０．１、０．５、もしくは１Ｍまたはそれより高くてもよい。溶解緩衝液中の塩濃度は、最大約０．１、０．５、もしくは１Ｍまたはそれより高くてもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の塩濃度は、約０．５Ｍである。溶解緩衝液は、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、Ｌｉドデシルスルフェート、ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、ｔｗｅｅｎ、ＮＰ－４０）を含んでもよい。溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、少なくとも約０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、もしくは７％、またはそれより高い割合であってもよい。溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、最大約０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、もしくは７％、またはそれより高い割合であってもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の界面活性剤の濃度は、約１％のＬｉドデシルスルフェートである。溶解のための方法において使用される時間は、使用される界面活性剤の量に依存し得る。一部の実施形態では、使用される界面活性剤が多いほど、溶解のために必要とされる時間は少ない。溶解緩衝液は、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ）を含んでもよい。溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、もしくは３０ｍＭ、またはそれより高くてもよい。溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、最大約１、５、１０、１５、２０、２５、もしくは３０ｍＭ、またはそれより高くてもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中のキレート剤の濃度は、約１０ｍＭである。溶解緩衝液は、還元試薬（例えば、ベータ－メルカプトエタノール、ＤＴＴ）を含んでもよい。溶解緩衝液中の還元試薬の濃度は、少なくとも約１、５、１０、１５、もしくは２０ｍＭまたはそれより高くてもよい。溶解緩衝液中の還元試薬の濃度は、最大約１、５、１０、１５、もしくは２０ｍＭまたはそれより高くてもよい。一部の実施形態では、溶解緩衝液中の還元試薬の濃度は、約５ｍＭである。一部の実施形態では、溶解緩衝液は、約０．１ＭのトリスＨＣｌ（約ｐＨ７．５）、約０．５ＭのＬｉＣｌ、約１％のリチウムドデシルスルフェート、約１０ｍＭのＥＤＴＡ、および約５ｍＭのＤＴＴを含んでもよい。
溶解は、約４、１０、１５、２０、２５、または３０℃の温度で実施することができる。溶解は、約１、５、１０、１５、２０分、またはそれより長い時間実施することができる。溶解された細胞は、少なくとも約１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００個、またはそれより多い標的核酸分子を含んでもよい。溶解された細胞は、最大約１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７０００００個、またはそれより多い標的核酸分子を含んでもよい。
標的核酸分子へのバーコードの結合
細胞の溶解およびそれからの核酸分子の放出の後に、核酸分子は、共局在化された固体支持体のバーコードとランダムに会合し得る。会合には、標的核酸分子の相補的部分へのバーコードの標的認識領域のハイブリダイゼーションが含まれ得る（例えば、バーコードのオリゴ（ｄＴ）は、標的のポリ（Ａ）テールと相互作用し得る）。ハイブリダイゼーションに使用されるアッセイ条件（例えば、緩衝液のｐＨ、イオン強度、温度など）は、特定の安定なハイブリッドの形成を促進するように選択することができる。一部の実施形態では、溶解された細胞から放出された核酸分子は、基質上の複数のプローブと会合し得る（例えば、基板上のプローブとハイブリダイズする）。プローブが、オリゴ（ｄＴ）を含む場合、ｍＲＮＡ分子は、プローブにハイブリダイズし、逆転写され得る。オリゴヌクレオチドのオリゴ（ｄＴ）部分は、ｃＤＮＡ分子の第１鎖合成のためのプライマーとして作用し得る。例えば、図２のブロック２１６に示すバーコード化の非限定的な例において、ｍＲＮＡ分子は、ビーズ上のバーコードにハイブリダイズし得る。例えば、一本鎖ヌクレオチド断片は、バーコードの標的結合領域にハイブリダイズし得る。
結合は、バーコードの標的認識領域と標的核酸分子の一部分とのライゲーションをさらに含み得る。例えば、標的結合領域は、制限部位オーバーハング（例えば、ＥｃｏＲＩ付着末端オーバーハング）への特異的ハイブリダイゼーションが可能となり得る核酸配列を含み得る。アッセイの手順は、制限酵素（例えば、ＥｃｏＲＩ）で標的核酸を処置して、制限部位オーバーハングを生成することをさらに含み得る。次いで、バーコードは、制限部位オーバーハングに相補的な配列を含む任意の核酸分子にライゲートされ得る。２つの断片を接続するために、リガーゼ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）を使用することができる。
例えば、図２のブロック２２０に示すバーコード化の非限定的な例では、複数の細胞（または複数の試料）に由来する標識標的（例えば、標的－バーコード分子）を、次に、例えば、チューブ中にプールすることができる。例えば、バーコードおよび／または標的－バーコード分子が結合したビーズを回収することによって、標識標的をプールすることができる。
結合した標的－バーコード分子の固体支持体ベースのコレクションの回収は、磁性ビーズおよび外部から印加された磁界の使用によって実現され得る。標的－バーコード分子がプールされたら、すべてのさらなる処理を単一反応槽内で進行させることができる。さらなる処理としては、例えば、逆転写反応、増幅反応、切断反応、解離反応、および／または核酸伸長反応が挙げることができる。さらなる処理反応は、マイクロウェル内で、すなわち、複数の細胞から標識標的核酸分子を最初にプールすることなく、実施することができる。
逆転写
本開示は、逆転写（例えば、図２のブロック２２４）を使用して、標的－バーコードコンジュゲートを作製するための方法を提供する。標的－バーコードコンジュゲートは、バーコードと標的核酸のすべてまたは一部分の相補配列（すなわち、バーコード化されたｃＤＮＡ分子、例えば、確率的にバーコード化されたｃＤＮＡ分子）とを含み得る。会合したＲＮＡ分子の逆転写は、逆転写酵素と一緒に逆転写プライマーを添加することによって起こり得る。逆転写プライマーは、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー、または標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーであってもよい。オリゴ（ｄＴ）プライマーは、１２～１８ヌクレオチド長であってもよく、または約１２～１８ヌクレオチド長であってもよく、哺乳動物ｍＲＮＡの３’末端の内在性ポリ（Ａ）テールに結合する。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、種々の相補部位でｍＲＮＡに結合し得る。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、目的のｍＲＮＡを選択的にプライミングする。
一部の実施形態では、標識ＲＮＡ分子の逆転写は、逆転写プライマーの添加によって起こり得る。一部の実施形態では、逆転写プライマーは、オリゴ（ｄＴ）プライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー、または標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーである。一般的に、オリゴ（ｄＴ）プライマーは、１２～１８ヌクレオチド長であり、哺乳動物ｍＲＮＡの３’末端の内在性ポリ（Ａ）テールに結合する。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、種々の相補部位でｍＲＮＡに結合し得る。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、目的のｍＲＮＡを選択的にプライミングする。
逆転写は、繰返し起こり、複数の標識ｃＤＮＡ分子を生じ得る。本明細書に開示される方法は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回の逆転写反応を行うステップを含み得る。本方法は、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００回の逆転写反応を行うステップを含み得る。
増幅
標識標的核酸分子の複数のコピーを作製するために、１または複数回の核酸増幅反応（例えば、図２のブロック２２８）を実施することができる。増幅は、複数の標的核酸配列が同時に増幅される、多重方式で実施することができる。増幅反応を使用して、核酸分子にシーケンシングアダプターを付加することができる。増幅反応は、存在する場合、試料標識のうちの少なくとも一部分を増幅することを含み得る。増幅反応は、細胞標識および／またはバーコード配列（例えば、分子標識）の少なくとも一部分を増幅させるステップを含み得る。増幅反応は、試料タグ、細胞標識、空間標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、標的核酸、またはこれらの組合せのうちの少なくとも一部分を増幅することを含み得る。増幅反応は、複数の核酸の０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、１００％、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲もしくは数を増幅することを含み得る。本方法は、試料標識、細胞標識、空間標識、および／またはバーコード配列（例えば、分子標識）を含む標的－バーコード分子のｃＤＮＡコピーを１つまたは複数生成するために、１または複数回のｃＤＮＡ合成反応を行うステップをさらに含み得る。
一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、増幅を実施することができる。本明細書で使用する場合、ＰＣＲは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長により特定のＤＮＡ配列をｉｎ ｖｉｔｒｏで増幅するための反応を指し得る。本明細書で使用する場合、ＰＣＲは、以下に限定されないが、ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、およびアセンブリＰＣＲを含む、反応の派生形を包含し得る。
標識核酸の増幅は、非ＰＣＲベースの方法を含み得る。非ＰＣＲベースの方法の例としては、以下に限定されないが、多重置換増幅（ＭＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ローリングサークル増幅、またはサークル－サークル増幅が挙げられる。他の非ＰＣＲベースの増幅方法としては、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的を増幅するためのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ駆動ＲＮＡ転写増幅またはＲＮＡ指向ＤＮＡ合成および転写の多重サイクル、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ならびにＱβレプリカーゼ（Ｑβ）法、パリンドロームプローブの使用、鎖置換増幅、制限エンドヌクレアーゼを使用するオリゴヌクレオチド駆動増幅、プライマーが核酸配列にハイブリダイズされかつ得られた二本鎖が伸長反応および増幅の前に切断される増幅方法、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く核酸ポリメラーゼを使用する鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、ならびに分岐伸長増幅（ＲＡＭ）が挙げられる。一部の実施形態では、増幅は、環化転写物を生成しない。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、標識核酸（例えば、標識ＲＮＡ、標識ＤＮＡ、標識ｃＤＮＡ）上でポリメラーゼ連鎖反応を行い、標識アンプリコン（例えば、確率標識アンプリコン）を生成するステップをさらに含む。標識アンプリコンは、二本鎖分子であってもよい。二本鎖分子は、二本鎖ＲＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、またはＤＮＡ分子にハイブリダイズされたＲＮＡ分子を含み得る。二本鎖分子の一方または両方の鎖は、試料標識、空間標識、細胞標識、および／またはバーコード配列（例えば、分子標識）を含み得る。標識アンプリコンは、一本鎖分子であってもよい。一本鎖分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せを含み得る。本開示の核酸は、合成核酸または改変核酸を含み得る。
増幅は、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドの使用を含み得る。非天然ヌクレオチドは、光不安定性またはトリガー性のヌクレオチドを含み得る。非天然ヌクレオチドの例としては、以下に限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸およびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）を挙げることができる。非天然ヌクレオチドを増幅反応の１または複数回のサイクルに添加することができる。非天然ヌクレオチドの添加を使用して、増幅反応の特定のサイクルまたは時点として産物を同定することができる。
１または複数回の増幅反応を行うことは、１つまたは複数のプライマーの使用を含み得る。１つまたは複数のプライマーは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５またはそれより多いヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５またはそれより多いヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、１２未満～１５ヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識標的（例えば、確率標識標的）のうちの少なくとも一部分にアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識標的の３’末端または５’末端にアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識標的の内部領域にアニールし得る。内部領域は、複数の標識標的の３’末端から少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００または１０００ヌクレオチドであってもよい。１つまたは複数のプライマーは、プライマーの一定パネルを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数のカスタムプライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の対照プライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数の遺伝子特異的プライマーを含み得る。
１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含み得る。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニールし得る。１つまたは複数のカスタムプライマーは、第１の試料標識、第２の試料標識、空間標識、細胞標識、バーコード配列（例えば、分子標識）、標的、またはこれらの任意の組合せにアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーおよびカスタムプライマーを含み得る。カスタムプライマーは、１つまたは複数の標的を増幅するように設計され得る。標的は、１つまたは複数の試料中の全核酸のサブセットを含み得る。標的は、１つまたは複数の試料中の全標識標的のサブセットを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも９６個またはそれより多いカスタムプライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも９６０個またはそれより多いカスタムプライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも９６００個またはそれより多いカスタムプライマーを含み得る。１つまたは複数のカスタムプライマーは、２つ以上の異なる標識核酸にアニールし得る。２つ以上の異なる標識核酸は、１つまたは複数の遺伝子に対応し得る。
任意の増幅スキームを本開示の方法において使用することができる。例えば、一スキームでは、１回目のＰＣＲによって、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプライマー１の配列に対するプライマーを使用して、ビーズに結合した分子を増幅することができる。２回目のＰＣＲでは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプライマー２の配列に隣接するネステッド遺伝子特異的プライマー、およびユニバーサルＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプライマー１の配列に対するプライマーを使用して、第１のＰＣＲ産物を増幅することができる。３回目のＰＣＲでは、Ｐ５およびＰ７ならびに試料インデックスが付加されて、ＰＣＲ産物をＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリーに入れる。１５０ｂｐ×２シーケンシングを使用するシーケンシングは、リード１上の細胞標識およびバーコード配列（例えば、分子標識）、リード２上の遺伝子、ならびにインデックス１リード上の試料インデックスを明らかにし得る。
一部の実施形態では、化学的切断を使用して基質から核酸を除去することができる。例えば、核酸中に存在する化学基または修飾塩基を使用して、固体支持体からのその除去を促進することができる。例えば、酵素を使用して、核酸を基質から除去することができる。例えば、核酸は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって、基質から除去することができる。例えば、ｄＵＴＰまたはｄｄＵＴＰを含有する核酸のウラシル－ｄ－グリコシラーゼ（ＵＤＧ）による処理を使用して、核酸を基質から除去することができる。例えば、ヌクレオチド切除を実施する酵素、例えば、塩基除去修復酵素、例えば、脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼを使用して、核酸を基質から除去することができる。一部の実施形態では、光切断可能な基と光とを使用して、核酸を基質から除去することができる。一部の実施形態では、切断可能なリンカーを、核酸を基質から除去するために使用することができる。例えば、切断可能なリンカーは、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／ニュートラアビジン、Ｉｇ－プロテインＡ、光不安定性リンカー、酸もしくは塩基不安定性リンカー基、またはアプタマーのうちの少なくとも１つを含み得る。
プローブが遺伝子特異的である場合、分子は、プローブにハイブリダイズし、逆転写および／または増幅され得る。一部の実施形態では、核酸が合成された（例えば、逆転写された）後に、増幅され得る。増幅は、複数の標的核酸配列が同時に増幅される多重方式で実施することができる。増幅によって、核酸にシーケンシングアダプターを付加し得る。
一部の実施形態では、増幅は、例えば、ブリッジ増幅を用いて基質上で実施することができる。基質上でオリゴ（ｄＴ）プローブを使用するブリッジ増幅に適合する末端を生成するために、ｃＤＮＡにホモポリマーテールを付加することができる。ブリッジ増幅では、テンプレート核酸の３’末端に相補的なプライマーは、固体粒子に共有結合される各対の第１のプライマーであってもよい。テンプレート核酸を含有する試料が粒子に接触しており、かつ１回の熱サイクルが実施される場合、テンプレート分子は第１のプライマーにアニールされ、かつ第１のプライマーはヌクレオチドの添加によって順方向に伸長して、テンプレート分子とテンプレートに相補的な新たに形成されたＤＮＡ鎖とからなる二本鎖分子を形成し得る。次のサイクルの加熱ステップでは、二本鎖分子は変性されて、粒子からテンプレート分子を放出し、第１のプライマーを通じて粒子に結合した相補的ＤＮＡ鎖を残存させ得る。続くアニーリングおよび伸長ステップのアニーリング段階では、相補鎖は、第１のプライマーから除去された位置の相補鎖のセグメントに相補的な第２のプライマーにハイブリダイズし得る。このハイブリダイゼーションにより、相補鎖は、共有結合により第１のプライマーにかつハイブリダイゼーションにより第２のプライマーに固定化されたブリッジを第１および第２のプライマー間に形成し得る。伸長段階では、第２のプライマーは、同一の反応混合物中にヌクレオチドを添加することにより逆方向に伸長し、それにより、ブリッジを二本鎖ブリッジに変換し得る。次いで、次のサイクルが開始し、二本鎖ブリッジは変性されて、それぞれ第１および第２のプライマーを通じて粒子表面に結合した一方の末端と、それぞれ未結合の他方の末端とを有する２つの一本鎖核酸分子を得ることができる。この第２のサイクルのアニーリングおよび伸長ステップでは、各鎖は同一の粒子上のこれまで未使用であったさらなる相補的プライマーにハイブリダイズして、新たな一本鎖ブリッジを形成し得る。この時点でハイブリダイズされる２つのこれまで未使用であったプライマーは、伸長して２つの新たなブリッジを二本鎖ブリッジに変換する。
増幅反応は、複数の核酸の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または１００％を増幅することを含み得る。
標識核酸の増幅は、ＰＣＲベースの方法または非ＰＣＲベースの方法を含み得る。標識核酸の増幅は、標識核酸の指数関数的増幅を含み得る。標識核酸の増幅は、標識核酸の線形増幅を含み得る。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による特定のＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅のための反応を指し得る。ＰＣＲは、以下に限定されないが、ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、サプレッションＰＣＲ、セミサプレッシブＰＣＲ、およびアセンブリＰＣＲを含む、反応の派生形を包含し得る。
一部の実施形態では、標識核酸の増幅は、非ＰＣＲベースの方法を含む。非ＰＣＲベースの方法の例としては、以下に限定されないが、多重置換増幅（ＭＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、リアルタイムＳＤＡ、ローリングサークル増幅、またはサークル－サークル増幅が挙げられる。他の非ＰＣＲベースの増幅方法としては、ＤＮＡもしくはＲＮＡ標的を増幅するためのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ駆動ＲＮＡ転写増幅もしくはＲＮＡ指向ＤＮＡ合成および転写の多重サイクル、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、にＱβレプリカーゼ（Ｑβ）法、パリンドロームプローブの使用、鎖置換増幅、制限エンドヌクレアーゼを使用するオリゴヌクレオチド駆動増幅、プライマーが核酸配列にハイブリダイズされかつ得られた二本鎖が伸長反応および増幅の前に切断される増幅方法、５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く核酸ポリメラーゼを使用する鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、ならびに／または分岐伸長増幅（ＲＡＭ）が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、増幅アンプリコン（例えば、標的）上でネステッドポリメラーゼ連鎖反応を行うステップをさらに含む。アンプリコンは二本鎖分子であってもよい。二本鎖分子は、二本鎖ＲＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、またはＤＮＡ分子にハイブリダイズされたＲＮＡ分子を含み得る。二本鎖分子の一方または両方の鎖は、試料タグまたは分子識別子標識を含み得る。代替的に、アンプリコンは、一本鎖分子であってもよい。一本鎖分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せを含み得る。本発明の核酸は、合成核酸または改変核酸を含み得る。
一部の実施形態では、本方法は、多数のアンプリコンを生成するために標識核酸を繰返し増幅するステップを含む。本明細書に開示される方法は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回の増幅反応を行うステップを含み得る。代替的に、本方法は、少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００回の増幅反応を行うステップを含む。
増幅は、複数の核酸を含む１つまたは複数の試料に１つまたは複数の対照核酸を添加することをさらに含み得る。増幅は、複数の核酸に１つまたは複数の対照核酸を添加することをさらに含み得る。対照核酸は、対照標識を含み得る。
増幅は、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドの使用を含み得る。非天然ヌクレオチドは、光不安定性および／またはトリガー性ヌクレオチドを含み得る。非天然ヌクレオチドの例としては、以下に限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸およびロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が挙げられる。非天然ヌクレオチドを増幅反応の１または複数回のサイクルに添加することができる。非天然ヌクレオチドの添加を使用して、増幅反応の特定のサイクルまたは時点として産物を同定することができる。
増幅反応を１または複数回行うことは、１つまたは複数のプライマーの使用を含み得る。１つまたは複数のプライマーは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約７～９ヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、１２未満～１５ヌクレオチドを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識核酸のうちの少なくとも一部分にアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識核酸の３’末端および／または５’末端にアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、複数の標識核酸の内部領域にアニールし得る。内部領域は、複数の標識核酸の３’末端から少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または１０００ヌクレオチドであってもよい。１種または複数のプライマーは、プライマーの一定パネル、少なくとも１種もしくは複数のカスタムプライマー、少なくとも１種もしくは複数の対照プライマー、またはこれらの組合せを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、少なくとも１つまたは複数のハウスキーピング遺伝子プライマーを含み得る。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーを含み得る。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニールし得る。１つまたは複数のカスタムプライマーは、第１の試料タグ、第２の試料タグ、分子識別子標識、核酸またはその産物にアニールし得る。１つまたは複数のプライマーは、ユニバーサルプライマーおよびカスタムプライマーを含み得る。カスタムプライマーは、１つまたは複数の標的核酸を増幅するように設計され得る。標的核酸は、１つまたは複数の試料中の全核酸のサブセットを含み得る。一部の実施形態では、プライマーは、本開示のアレイに結合したプローブである。
一部の実施形態では、試料中の複数の標的をバーコード化するステップ（例えば、確率的にバーコード化するステップ）は、バーコード化された標的（例えば、確率的にバーコード化された標的）またはそれらの標的のバーコード化された断片のインデックス化されたライブラリーを生成するステップをさらに含む。異なるバーコードのバーコード配列（例えば、異なる確率的バーコードの分子標識）は、互いに異なっていてもよい。バーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するステップは、試料中の複数の標的から複数のインデックス化されたポリヌクレオチドを生成するステップを含む。例えば、第１のインデックス化された標的と第２のインデックス化された標的とを含むバーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーについて、第１のインデックス化されたポリヌクレオチドの標識領域は、第２のインデックス化されたポリヌクレオチドの標識領域と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０ヌクレオチド、またはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲で異なっていてもよい。一部の実施形態では、バーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するステップは、複数の標的、例えば、ｍＲＮＡ分子を、ポリ（Ｔ）領域および標識領域を含む複数のオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、各々がｃＤＮＡ領域および標識領域を含む一本鎖標識ｃＤＮＡ分子を生成するために、逆転写酵素を使用して第１鎖合成を行うステップとを含み、ここで、複数の標的は、異なる配列のうちの少なくとも２つのｍＲＮＡ分子を含み、複数のオリゴヌクレオチドは、異なる配列のうちの少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。バーコード化された標的のインデックス化されたライブラリーを生成するステップは、一本鎖標識ｃＤＮＡ分子を増幅して、二本鎖標識ｃＤＮＡ分子を生成するステップと、二本鎖標識ｃＤＮＡ分子上でネステッドＰＣＲを行って、標識アンプリコンを生成するステップとをさらに含み得る。一部の実施形態では、本方法は、アダプター－標識アンプリコンを生成するステップを含み得る。
バーコード化するステップ（例えば、確率的にバーコード化するステップ）は、核酸バーコードまたはタグを使用して、個々の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子を標識するステップを含み得る。一部の実施形態では、これは、ＤＮＡバーコードまたはタグがｍＲＮＡから生成される際に、ｃＤＮＡ分子にこれらを付加するステップを含む。ネステッドＰＣＲは、ＰＣＲ増幅バイアスの最小化を実施することができる。例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用するシーケンシングのためにアダプターを付加することができる。例えば、図２のブロック２３２の標的の１つまたは複数のコピーの細胞標識、分子標識、およびヌクレオチド断片の配列を決定するために、シーケンシング結果を使用することができる。
図３は、バーコード化された標的（例えば、確率的にバーコード化された標的）、例えば、バーコード化されたｍＲＮＡまたはその断片のインデックス化されたライブラリーを生成する非限定的な例示的プロセスを示す略図である。ステップ１に示されるように、逆転写プロセスによって、固有の分子標識配列、細胞標識配列、およびユニバーサルＰＣＲ部位を含む各ｍＲＮＡ分子がコードされ得る。特に、ＲＮＡ分子３０２のポリ（Ａ）テール領域３０８への、バーコード（例えば、確率的バーコード）３１０のセットのハイブリダイゼーション（例えば、確率的ハイブリダイゼーション）によって、ＲＮＡ分子３０２を逆転写して、ｃＤＮＡ領域３０６を含む標識ｃＤＮＡ分子３０４を生成することができる。バーコード３１０のそれぞれは、標的結合領域、例えば、ポリ（ｄＴ）領域３１２、標識領域３１４（例えば、バーコード配列または分子）、およびユニバーサルＰＣＲ領域３１６を含み得る。
一部の実施形態では、細胞標識配列は、３～２０ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、分子標識配列は、３～２０ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、複数の確率的バーコードのそれぞれは、ユニバーサル標識および細胞標識のうちの１つまたは複数をさらに含み、ユニバーサル標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードについて同じであり、細胞標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードについて同じである。一部の実施形態では、ユニバーサル標識は、３～２０ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、細胞標識は、３～２０ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、標識領域３１４は、バーコード配列または分子標識３１８および細胞標識３２０を含み得る。一部の実施形態では、標識領域３１４は、ユニバーサル標識、次元標識、および細胞標識のうちの１つまたは複数を含み得る。バーコード配列または分子標識３１８は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。細胞標識３２０は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサル標識は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。ユニバーサル標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードについて同じであってもよく、細胞標識は、固体支持体上の複数の確率的バーコードについて同じであってもよい。次元標識は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。
一部の実施形態では、標識領域３１４は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、もしくはこれらの値のいずれかの間の数もしくは範囲の異なる標識、例えば、バーコード配列もしくは分子標識３１８および細胞標識３２０を含むか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なる標識、例えば、バーコード配列もしくは分子標識３１８および細胞標識３２０を含むか、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なる標識、例えば、バーコード配列もしくは分子標識３１８および細胞標識３２０を含むか、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なる標識、例えば、バーコード配列もしくは分子標識３１８および細胞標識３２０を含み得る。各標識は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよく、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のヌクレオチド長であってもよい。バーコードまたは確率的バーコード３１０のセットは、１０、２０、４０、５０、７０、８０、９０、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０20、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲のバーコードもしくは確率的バーコード３１０を含有するか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のバーコードもしくは確率的バーコード３１０を含有するか、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のバーコードもしくは確率的バーコード３１０を含有するか、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲のバーコードもしくは確率的バーコード３１０であり得る。また、バーコードまたは確率的バーコード３１０のセットは、例えば、それぞれ、特有の標識領域３１４を含有し得る。過剰なバーコードまたは確率的バーコード３１０を除去するために、標識ｃＤＮＡ分子３０４は精製されてもよい。精製には、Ａｍｐｕｒｅビーズ精製が含まれてもよい。
ステップ２に示すように、ステップ１の逆転写プロセスからの産物は、１チューブ中にプールされ、第１のＰＣＲプライマープールおよび第１のユニバーサルＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ増幅され得る。プールすることは、特有の標識領域３１４によって可能である。特に、標識ｃＤＮＡ分子３０４を増幅して、ネステッドＰＣＲ標識アンプリコン３２２を生成することができる。増幅は、多重ＰＣＲ増幅を含み得る。増幅は、単一反応量で９６多重プライマーを用いる多重ＰＣＲ増幅を含み得る。一部の実施形態では、多重ＰＣＲ増幅は、単一反応量で、１０、２０、４０、５０、７０、８０、９０、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13、１０14、１０15、１０20、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲の多重プライマーを利用するか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の多重プライマーを利用するか、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の多重プライマーを利用するか、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の多重プライマーを利用することができる。増幅は、特定の遺伝子を標的化するカスタムプライマー３２６Ａ～Ｃを含む第１のＰＣＲプライマープール３２４およびユニバーサルプライマー３２８を含み得る。カスタムプライマー３２６は、標識ｃＤＮＡ分子３０４のｃＤＮＡ部分３０６’内の領域とハイブリダイズし得る。ユニバーサルプライマー３２８は、標識ｃＤＮＡ分子３０４のユニバーサルＰＣＲ領域３１６とハイブリダイズし得る。
図３のステップ３に示すように、ステップ２のＰＣＲ増幅からの産物は、ネステッドＰＣＲプライマープールおよび第２のユニバーサルＰＣＲプライマーを用いて増幅され得る。ネステッドＰＣＲは、ＰＣＲ増幅バイアスを最小限に抑えることができる。特に、ネステッドＰＣＲ標識アンプリコン３２２は、ネステッドＰＣＲによってさらに増幅することができる。ネステッドＰＣＲは、単一反応量でネステッドＰＣＲプライマー３３２ａ～ｃのネステッドＰＣＲプライマープール３３０と、第２のユニバーサルＰＣＲプライマー３２８’とを含む多重ＰＣＲを含み得る。ネステッドＰＣＲプライマープール３２８は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、またはこれらの値のうちのいずれかの間の数もしくは範囲の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有するか、またはおよそでこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有するか、または少なくともこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有するか、または最大でこれらの値もしくはそのような数もしくは範囲の異なるネステッドＰＣＲプライマー３３０を含有し得る。ネステッドＰＣＲプライマー３３２は、アダプター３３４を含有し、標識アンプリコン３２２のｃＤＮＡ部分３０６’’内の領域とハイブリダイズし得る。ユニバーサルプライマー３２８’は、アダプター３３６を含有し、標識アンプリコン３２２のユニバーサルＰＣＲ領域３１６とハイブリダイズし得る。よって、ステップ３は、アダプター標識アンプリコン３３８を生成する。一部の実施形態では、ネステッドＰＣＲプライマー３３２と第２のユニバーサルＰＣＲプライマー３２８’は、アダプター３３４および３３６を含有しなくてもよい。代わりに、アダプター３３４および３３６は、ネステッドＰＣＲの産物とライゲートして、アダプター標識アンプリコン３３８を生成することができる。
ステップ４に示すように、ステップ３からのＰＣＲ産物は、ライブラリー増幅プライマーを使用するシーケンシングのためにＰＣＲ増幅され得る。特に、アダプター３３４および３３６を使用して、アダプター標識アンプリコン３３８に関する１または複数回の追加のアッセイを行うことができる。アダプター３３４および３３６は、プライマー３４０および３４２とハイブリダイズされ得る。１つまたは複数のプライマー３４０および３４２は、ＰＣＲ増幅プライマーであってもよい。１つまたは複数のプライマー３４０および３４２は、シーケンシングプライマーであってもよい。アダプター標識アンプリコン３３８のさらなる増幅のために、１つまたは複数のアダプター３３４および３３６を使用することができる。アダプター標識アンプリコン３３８のシーケンシングのために、１つまたは複数のアダプター３３４および３３６を使用することができる。プライマー３４２は、プレートインデックス３４４を含有することができ、これによって、バーコードまたは確率的バーコード３１０の同じセットを使用して生成されたアンプリコンを、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用する１回のシーケンシング反応でシーケンシングすることができる。
核酸標的の５’末端のバーコード化
本明細書の開示は、分子標識（または分子インデックス）を有するバーコード（例えば、確率的バーコード）の、バーコード化または標識化されている核酸標的（例えば、デオキシリボ核酸分子、およびリボ核酸分子）の５’末端への結合のための、システム、方法、組成物、およびキットを含む。本明細書に開示される５’ベースの転写物計数方法は、例えば、３’ベースの転写物計数方法（例えば、Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ））、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（商標） Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）））を補うか、または補足することができる。バーコード化された核酸標的は、配列同定、転写物の計数、選択的スプライシング分析、変異スクリーニング、および／またはハイスループット方式の全長シーケンシングのために使用され得る。５’末端（標識されている標的核酸標的に対して５’側）での転写物計数によって、核酸分子の５’末端における、またはそれにより近い選択的スプライシングアイソフォームおよびバリアント（以下に限定されないが、スプライスバリアント、一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、置換を含む）が明らかとなり得る。一部の実施形態では、本方法は、分子内ハイブリダイゼーションに関与し得る。
図４Ａ～４Ｂは、５’末端において核酸標的を遺伝子特異的に標識する非限定的な例示的方法４００の略図を示す。標的結合領域（例えば、ポリ（ｄＴ）テール４２２）を含むバーコード４２０（例えば、確率的バーコード）は、標識化またはバーコード化（例えば、固有の標識化）するために、ポリ（ｄＡ）テール４２６を介してポリアデニル化ＲＮＡ転写物４２４、または他の核酸標的に結合し得る。バーコード４２０は、後続反応のために各バーコード４２０の分子標識（ＭＬ）４２８／試料標識（ＳＬ）４３０領域に隣接する、１つまたは複数の追加の配列（例えば、アダプター配列４３２などのコンセンサス配列）と一緒に、それぞれ、転写物４２４を標識し、ＲＮＡ転写物４２４の試料起源を追跡するための分子標識４２８および試料標識４３０を含み得る。試料ごとのバーコードにおける分子標識の配列のレパートリーは、ＲＮＡ転写物の確率的標識化に対して十分に多量であり得る。
ＲＮＡ転写物４２４（またはその一部分）を含むバーコード化されたｃＤＮＡ分子４３４を生成するためのブロック４０２におけるｃＤＮＡ合成後に、遺伝子特異的方法を５’分子バーコード化のために使用することができる。選択的であり得るブロック４０４における遺伝子特異的増幅の後に、ブロック４０６において末端転写酵素およびデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）を添加し、３’ポリ（ｄＡ）テーリングを促進して、ポリ（Ａ）テール４３８を含むアンプリコン４３６を生成し得る。ブロック４０８における短い変性ステップによって、アンプリコン４３６のフォワード鎖４３６ｍおよびリバース鎖４３６ｃ（ポリ（ｄＡ）テールを含むバーコード化されたｃＤＮＡ分子）の離間が可能となる。アンプリコン４３６のリバース鎖４３６ｃは、鎖の３’末端およびポリ（ｄＴ）領域４２２末端におけるそのポリ（ｄＡ）テール４３８を介して分子内でハイブリダイズし、ブロック４１０において、ヘアピンまたはステムループ４４０を形成し得る。次いで、ポリメラーゼ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ断片）を使用して、バーコードを複製するためにポリ（ｄＡ）テール４３８から伸長させて、ブロック４１２において、伸長したバーコード化されたリバース鎖４４２を形成することができる。次いで、ブロック４１４（例えば、任意に）における遺伝子特異的増幅を、目的の遺伝子を増幅するために実施して、ブロック４１６において、シーケンシングのために、５’末端（ＲＮＡ転写物４２４に対して）においてバーコードを含むアンプリコン４４４を生成することができる。一部の実施形態では、方法４００は、ブロック４０４におけるバーコード化されたｃＤＮＡ分子４３４の遺伝子特異的増幅とブロック４１４における伸長したバーコード化されたリバース鎖４４２の遺伝子特異的増幅のうちの一方または両方を含む。
図５Ａ～５Ｂは、全トランスクリプトーム分析のために５’末端において核酸標的を標識する非限定的な例示的方法５００の略図を示す。標的結合領域（例えば、ポリ（ｄＴ）テール４２２）を含むバーコード４２０（例えば、確率的バーコード）は、標識化またはバーコード化（例えば、固有の標識化）するために、ポリ（ｄＡ）テール４２６を介してポリアデニル化されたＲＮＡ転写物４２４、または他の核酸標的に結合し得る。例えば、標的結合領域を含むバーコード４２０は、標識化またはバーコード化のために、核酸標的に結合し得る。バーコード４２０は、分子標識（ＭＬ）４２８および試料標識（ＳＬ）４３０を含み得る。分子標識４２８および試料標識４３０は、転写物４２４、または核酸標的（例えば、抗体と会合したかまたは抗体から解離した、抗体オリゴヌクレオチド）を標識し、転写物４２４の試料起源を追跡するために、それぞれ、後続反応のための各バーコード４２０の分子標識４２８／試料標識４３０領域に隣接する、１つまたは複数の追加の配列（例えば、アダプター配列４３２などのコンセンサス配列）と一緒に、使用することができる。試料ごとのバーコードにおける分子標識４２８の配列のレパートリーは、ＲＮＡ転写物４２４、または核酸標的の確率的標識化に対して十分に多量であり得る。
ブロック４０２におけるバーコード化されたｃＤＮＡ分子４３４を生成するためのｃＤＮＡ合成の後に、末端転移酵素を、バーコード化されたｃＤＮＡ分子４３４の３’末端（標識されたＲＮＡ転写物の５’末端に等しい）のＡ－テーリングのために使用し、ブロック４０６において、３’ポリ（ｄＡ）テール４３８をそれぞれ含むｃＤＮＡ分子４３６ｃを生成することができる。ｃＤＮＡ分子４３６ｃの３’ポリ（ｄＡ）テール４３８との分子内ハイブリダイゼーションが開始され（例えば、加熱および冷却サイクルによるか、またはバーコード化されたｃＤＮＡ分子４３６ｃをポリ（ｄＡ）テール４３８で希釈することによって）、その結果、新たな３’ポリ（ｄＡ）テール４３８が、同じ標識されたｃＤＮＡ分子のポリ（ｄＴ）テール４２２とアニーリングし、ブロック４１０において、バーコード化されたｃＤＮＡ分子のヘアピンまたはステムループ構造４４０を生成することができる。ブロック４１２では、新たな３’ポリ（ｄＡ）テール４３８を超える３’伸長を促進するために、ｄＮＴＰと共にポリメラーゼ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ酵素）を添加し、バーコード（例えば、ステムループ４４０を有する標識されたｃＤＮＡ分子の５’末端に存在する分子標識４２８）を複製することができる。ブロック４１４では、鏡像化したアダプター４３２、４３２ｒｃまたはアダプター４３２、４３２ｒｃの配列（または部分配列）を含有するプライマーを使用して、全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）を実施することができる。ブロック４１８では、シーケンシングのために（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．）シーケンサーを使用して）、タグメンテーションまたはランダムプライミングなどの方法を使用して、シーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５ ４４６およびＰ７ ４４８配列）を含むより小さなアンプリコン４４４の断片を生成することができる。一部の実施形態では、他のシーケンシング方法またはシーケンサー（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳ）またはＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）からのシーケンサー）のためのシーケンシングアダプターを直接ライゲーションさせて、シーケンシングのためのアンプリコンを生成することができる。
本明細書の開示は、試料中の核酸標的の数を決定するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、試料中の核酸標的４２４のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０に接触させるステップであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のそれぞれが、分子標識配列４２８および核酸標的４２４にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域（例えば、ポリ（ｄＴ）配列４２２）を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１０個が、異なる分子標識配列４２８を含む、ステップと、オリゴヌクレオチドバーコード４２０にハイブリダイズした核酸標的４２４のコピーを伸長させて、ブロック４０２において、それぞれが、核酸標的４２４の少なくとも一部分に相補的な配列４５０ｃを含む、複数の核酸分子４３４を生成するステップと、ブロック４０４において、複数のバーコード化された核酸分子４３４を増幅させて、複数の増幅したバーコード化された核酸分子４３６を生成するステップと、標的結合領域４２２の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを複数の増幅したバーコード化された核酸分子４３６に結合させて、ブロック４０６において、それぞれが、標的結合領域４２２および標的結合領域の相補体４３８を含む、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃを生成するステップと、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのそれぞれにおいて、標的結合領域４２２と標的結合領域４２２の相補体４３８とをハイブリダイズさせて、ブロック４１０において、ステムループ４４０を形成するステップと、ブロック４１２において、それぞれ、ステムループ４４０を含む複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、ステムループ４４０を伸長させ、それぞれが、分子標識４２８および該分子標識の相補体４２８ｒｃを含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を生成するステップと、ブロック４１４において、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を増幅させて、それぞれが、分子標識の相補体４２８ｒｃを含む、複数の単一標識核酸分子４４４ｃを生成するステップと、複数の単一標識核酸分子と会合した別個の配列を有する分子標識の相補体４２８ｒｃの数に基づいて、試料中の核酸標的の数を決定するステップとを含む。
一部の実施形態では、分子標識４２８は、ステムループ４４０を有する複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させた後に、分子標識の相補体４２８ｒｃにハイブリダイズされる。本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を増幅させる前に、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を変性させて、複数の単一標識核酸分子４４４ｃ（アンプリコン４４４ｃの一部であってもよい）を生成するステップを含み得る。試料中の核酸標的４２４のコピーを接触させるステップは、複数の核酸標的４２４のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０に接触させるステップを含み得る。核酸標的４２４のコピーを伸長させるステップは、オリゴヌクレオチドバーコード４２０にハイブリダイズした複数の核酸標的４２４のコピーを伸長させて、それぞれが、複数の核酸標的４２４のうちの１つの少なくとも一部分に相補的な配列４５０ｃを含む、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃを生成するステップを含み得る。核酸標的４２４の数を決定するステップは、複数の核酸標的４２４のそれぞれの配列４５２ｃを含む、複数の単一標識核酸分子４４４ｃのうちの単一標識核酸分子と会合した、別個の配列を有する分子標識の相補体４２８ｒｃの数に基づいて、試料中の複数の核酸標的４２４のそれぞれの数を決定するステップを含み得る。複数の核酸標的のそれぞれの配列４５２ｃは、複数の核酸標的４２４のそれぞれの部分配列（相補体または逆相補体を含む）を含み得る。
本明細書の開示は、試料中の標的の数を決定するための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０を使用して、試料中の核酸標的４２４のコピーをバーコード化して（４０２）、それぞれが、核酸標的４２４の配列４５０ｃ（例えば、相補配列、逆相補配列、またはこれらの組合せ）、分子標識４２８、および標的結合領域（例えば、ポリ（ｄＴ）領域４２２）を含む、複数のバーコード化された核酸分子４３４を生成するステップであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１０個が、異なる分子標識配列４２８を含む、ステップと、標的結合領域４２２の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを複数のバーコード化された核酸分子４３４に結合して（４０６）、それぞれが、標的結合領域４２２および該標的結合領域４２２の相補体４３８を含む、複数のバーコード化された核酸分子４３６を生成する、ステップと、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのそれぞれにおいて、標的結合領域４２２と該標的結合領域の相補体４３８とをハイブリダイズさせて（４１０）、ステムループ４４０を形成するステップと、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて（４１２）、ステムループ４４０を伸長させ、それぞれが、分子標識４２８および該分子標識の相補体４２８ｒｃを含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２と会合した別個の配列を有する分子標識の相補体４２８ｒｃの数に基づいて、試料中の核酸標的４２４の数を決定するステップとを含む。
本明細書の開示は、オリゴヌクレオチドバーコードを試料中の標的に結合させるための方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０を使用して、試料中の核酸標的４２４のコピーをバーコード化して（４０２）、それぞれが、核酸標的４２４の配列４５０ｃ、分子標識４２８、および標的結合領域４２２を含む、複数のバーコード化された核酸分子４３４を生成するステップであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１０個が、異なる分子標識配列４２８を含む、ステップと、標的結合領域４２２の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを複数のバーコード化された核酸分子４３４に結合させて、それぞれが、標的結合領域４２２および該標的結合領域４２２の相補体４３８を含む、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃを生成するステップと、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのそれぞれにおいて、標的結合領域４２２と該標的結合領域４２２の相補体４３８とをハイブリダイズさせて（４１０）、ステムループ４４０を形成するステップと、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて（４１２）、ステムループ４４０を伸長させ、それぞれが、分子標識４２８および該分子標識４２８の相補体４２８ｒｃを含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を生成するステップとを含む。一部の実施形態では、本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２と会合した、別個の配列を有する分子標識４２８、その相補体４２８ｒｃ、またはこれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的４２４の数を決定するステップを含む。例えば、核酸標的４２４の数は、別個の配列を有する分子標識４２８、その相補体４２８ｒｃのうちの一方または両方に基づいて決定され得る。
一部の実施形態では、複数の標的４２４のコピーをバーコード化するステップ（４０２）は、核酸標的４２４のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０に接触させるステップであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のそれぞれが、核酸標的４２４にハイブリダイズさせることが可能な標的結合領域４２２を含む、ステップと、オリゴヌクレオチドバーコード４２０にハイブリダイズした核酸標的４２４のコピーを伸長させて（４０２）、複数のバーコード化された核酸分子４３４を生成するステップとを含む。
一部の実施形態では、本方法は、複数のバーコード化された核酸分子４３４を増幅させて（４０４）、複数の増幅したバーコード化された核酸分子４３６ｃを生成するステップであって、標的結合領域４２２の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを結合させるステップが、標的結合領域の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを複数の増幅したバーコード化された核酸分子に結合させて、それぞれが、標的結合領域４２２および該標的結合領域の相補体４３８を含む、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｒを生成するステップを含む、ステップを含む。
遺伝子特異的分析。一部の実施形態では、本方法（例えば、方法４００）は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を増幅させて（４１４）、それぞれが、分子標識４２８の相補体４２８ｒｃを含む、複数の単一標識核酸分子４４４ｃを生成するステップを含む。単一標識核酸分子４４４ｃは、それらを含有するアンプリコン４４４が変性される場合に生成され得る。試料中の核酸標的４２４の数を決定するステップは、複数の単一標識核酸分子４４４ｃと会合した、別個の配列を有する分子標識４２８の相補体４２８ｒｃの数に基づいて、試料中の核酸標的４２４の数を決定するステップを含み得る。
全トランスクリプトーム分析。一部の実施形態では、本方法（例えば、方法５００）は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を増幅させて（４１４）、複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピー４４４ｃを生成するステップを含む。試料中の核酸標的４２４の数を決定するステップは、複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピー４４４ｃと会合した、別個の配列を有する分子標識４２８の相補体４２８ｒｃの数に基づいて、試料中の核酸標的４２４の数を決定するステップを含む。複数の伸長したバーコード化された核酸分子のコピー４４４ｃは、それらを含有するアンプリコン４４４が変性される場合に形成され得る。
一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子中の核酸標的の配列は、核酸標的の部分配列４５２ｃを含む。標的結合領域は、遺伝子特異的配列を含み得る。標的結合領域４２２の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを結合させるステップ（４０６）は、標的結合領域４２２の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを複数のバーコード化された核酸分子４３４にライゲーションさせるステップを含み得る。
一部の実施形態では、標的結合領域は、ポリ（ｄＴ）配列４２２を含み得る。標的結合領域４２２の相補体４３８を含むオリゴヌクレオチドを結合させるステップは、末端デオキシヌクレオチド転移酵素を使用して、複数のアデノシン一リン酸を複数のバーコード化された核酸分子４３４に付加するステップを含む。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコード４２０にハイブリダイズした核酸標的４２４のコピーを伸長させるステップは、オリゴヌクレオチドバーコード４２０にハイブリダイズした核酸標的４２４のコピーを逆転写して、複数のバーコード化された相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）分子４３４を生成するステップを含み得る。オリゴヌクレオチドバーコード４２０にハイブリダイズした核酸標的４２４のコピーを伸長させるステップは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して、オリゴヌクレオチドバーコード４２０にハイブリダイズした核酸標的４２４のコピーを伸長させるステップ（４０２）を含み得る。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含んでもよい。
一部の実施形態では、本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２の配列情報を得るステップを含む。配列情報を得るステップは、シーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５ ４４６およびＰ７ ４４８アダプター）を複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２に結合させるステップを含み得る。
一部の実施形態では、標的結合領域の相補体４３８は、標的結合領域の逆相補配列を含み得る。標的結合領域の相補体４３８は、標的結合領域の相補配列を含み得る。分子標識の相補体４２８ｒｃは、分子標識の逆相補配列を含み得る。分子標識の相補体は、分子標識の相補配列を含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子４３４は、バーコード化されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含み得る。バーコード化された核酸分子４３４は、バーコード化されたリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含み得る。核酸標的４２４は、核酸分子を含み得る。核酸分子は、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、ポリ（Ａ）テールを含むＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
抗体オリゴヌクレオチド。一部の実施形態では、核酸標的は、細胞成分結合試薬を含み得る。核酸標的（例えば、試料インデックス化オリゴヌクレオチドなどの抗体オリゴヌクレオチド）に会合した細胞結合試薬については、ＵＳ２０１８／００８８１１２、および２０１８年３月２７日に出願された米国出願第１５／９３７，７１３号に記載されており、これらの出願のそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本開示の５’バーコード化方法を使用して、ゲノミクス、クロマチンアクセシビリティ、メチロミクス、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクスなどの単一細胞のマルチオミクス情報を得ることができる。核酸分子は、細胞成分結合試薬に会合していてもよい。本方法は、核酸分子と細胞成分結合試薬を解離させるステップを含み得る。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの各分子標識４２８は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドバーコード４２０は、同一の試料標識４３０を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの各試料標識４３０は、少なくとも６個のヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドバーコード４２０は、同一の細胞標識を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの各細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのうちの少なくとも１つは、該複数のバーコード化された核酸分子のそれぞれにおいて、標的結合領域と該標的結合領域の相補体とをハイブリダイズさせて（４１０）、ステムループを形成する場合に、固体支持体と会合している。複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのうちの少なくとも１つは、該複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのそれぞれにおいて、標的結合領域４２２と該標的結合領域４２２の相補体４３８とをハイブリダイズさせて（４１０）、ステムループ４４０を形成する場合に、固体支持体から解離し得る。複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのうちの少なくとも１つは、該複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのそれぞれにおいて、標的結合領域４２２と該標的結合領域の相補体４３８とをハイブリダイズさせて（４１０）、ステムループ４４０を形成する場合に、固体支持体と会合していてもよい。
一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子のうちの少なくとも１つは、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて（４１２）、ステムループ４４０を伸長させ、それぞれが、分子標識４２８および該分子標識の相補体４２８ｒｃを含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を生成する場合に、固体支持体と会合している。複数のバーコード化された核酸分子のうちの少なくとも１つは、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて（４１２）、ステムループ４４０を伸長させ、それぞれが、分子標識４２８および該分子標識の相補体４２８ｒｃを含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を生成する場合に、固体支持体から解離し得る。複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのうちの少なくとも１つは、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて（４１２）、ステムループ４４０を伸長させ、それぞれが、分子標識４２８および該分子標識の相補体４２８ｒｃを含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を生成する場合に、固体支持体と会合していてもよい。固体支持体は、合成粒子４５４を含み得る。固体支持体は、平面表面または実質的平面表面（例えば、顕微鏡スライドまたはカバーガラスなどのスライド）を含み得る。
一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのうちの少なくとも１つは、複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃのそれぞれにおいて、標的結合領域４２２と該標的結合領域４２２の相補体４３８とをハイブリダイズさせて（４１０）、ステムループ４４０を形成する場合に、溶液中にある。例えば、溶液中の複数のバーコード化された核酸分子４３６ｃの濃度が十分に低い場合に、このような分子内ハイブリダイゼーションが起こり得る。複数のバーコード化された核酸分子のうちの少なくとも１つは、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて（４１２）、ステムループ４４０を伸長させ、それぞれが、分子標識４２８および該分子標識の相補体４２８ｒｃを含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子４４２を生成する場合に、溶液中にあり得る。
一部の実施形態では、試料は、単一細胞を含み、本方法は、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０を含む合成粒子４５４を、試料中の単一細胞と会合させるステップを含む。本方法は、合成粒子４５４を単一細胞と会合させた後に、単一細胞を溶解させるステップを含み得る。単一細胞を溶解させるステップは、試料を加熱するステップ、試料を界面活性剤と接触させるステップ、試料のｐＨを変更するステップ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。合成粒子と単一細胞は、同じウェル中にあり得る。合成粒子と単一細胞は、同じ液滴中にあり得る。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４上に固定化されていてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４上に部分的に固定化されていてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４内に封入されていてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４内に部分的に封入されていてもよい。合成粒子４５４は、崩壊可能であり得る。合成粒子４５４は、ビーズを含み得る。ビーズは、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。合成粒子４５４は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含み得る。合成粒子４５４は、崩壊可能ハイドロゲル粒子を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のそれぞれは、リンカー官能基を含み得る。合成粒子４５４は、固体支持体官能基を含み得る。支持体官能基およびリンカー官能基は、互いに会合していてもよい。リンカー官能基および支持体官能基は、独立して、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
核酸標的の５’末端におけるバーコード化のためのキット
本明細書の開示は、オリゴヌクレオチドバーコード４２０を試料中の標的４２４に結合させる、試料中の標的４２４の数を決定する、および／または試料中の核酸標的４２４の数を決定するためのキットを含む。一部の実施形態では、キットは、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０であって、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のそれぞれが、分子標識４２８および標的結合領域（例えば、ポリ（ｄＴ）配列４２２）を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１０個が異なる分子標識配列４２８を含む、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０；末端デオキシヌクレオチド転移酵素またはリガーゼ；ならびに５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを含む。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含み得る。キットは、緩衝液および／またはカートリッジを含み得る。キットは、逆転写反応のための１つまたは複数の試薬を含み得る。キットは、増幅反応のための１つまたは複数の試薬を含み得る。
一部の実施形態では、標的結合領域は、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダム多量体、またはこれらの任意の組合せを含む。オリゴヌクレオチドバーコードは、同一の試料標識および／または同一の細胞標識を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識および／または細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含み得る。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４上に部分的に固定化されている。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４上に部分的に固定化されていてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４内に封入されていてもよい。複数のオリゴヌクレオチドバーコード４２０のうちの少なくとも１つは、合成粒子４５４内に部分的に封入されていてもよい。合成粒子４５４は、崩壊可能であり得る。合成粒子４５４は、ビーズを含み得る。ビーズは、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。合成粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含み得る。合成粒子４５４は、崩壊可能ハイドロゲル粒子を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれは、リンカー官能基を含み得る。合成粒子４５４は、固体支持体官能基を含み得る。支持体官能基およびリンカー官能基は、互いに会合していてもよい。リンカー官能基および支持体官能基は、独立して、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。
完全長発現プロファイリング
ハイスループット単一細胞ＲＮＡシーケンシングによって、複雑かつ不均一な生体試料についての理解は変化した。しかし、ほとんどの方法はｍＲＮＡ転写物情報の３’のみの分析しか可能にせず、スプライスバリアント、選択的転写開始部位およびＴ細胞およびＢ細胞の受容体と抗体とのＶＤＪ接合などの再編成による可変性の高い遺伝子座の分析が制限される場合がある。５’バーコード化および／または３’バーコード化を使用して、核酸標的（例えば、免疫受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域）の配列を決定するための方法は、その内容が参照によりその全体として本明細書に組み込まれる、２０１９年９月３０日に出願された、米国特許出願第１６／５８８，４０５号に記載されている。図９Ａは、免疫受容体ｍＲＮＡの５’発現プロファイリングの非限定的な例示的略図である。免疫受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域の５’発現プロファイリングによって、ＴＣＲ／ＢＣＲ被覆率を改善することができ、ＣＤＲ３配列情報を得ることができるが、このアプローチは、Ｖ領域を失う場合がある（図９Ａにおいて点線のボックスによって示される）。Ｔ細胞とＢ細胞の両方に関して、現在利用可能なＣプライミングベースのアプローチは、Ｖ（Ｄ）Ｊ中へと読み進むことができるが、上流のＶ領域を失う。よって、現在利用可能な方法は、完全長核酸標的（例えば、Ｖ（Ｄ）Ｊを含有する転写物）の情報を得るための能力を限定する場合がある。当技術分野における特定の問題は、多数の再構成事象が起こり得ることにより多くのＶＤＪが存在するため、より長いリードとしてＶＤＪ配列を知る必要があるということである。配列（例えば、Ｖ（Ｄ）Ｊを含有する転写物）の計数と前記配列の同定（特に、完全長配列の同定）の両方の方法に対する必要性が存在する。
一部の実施形態では、ランダムプライミングアプローチを使用して、完全長Ｖ（Ｄ）Ｊ情報を得るための方法（例えば、ＲｈａｐｓｏｄｙシステムでのＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングによる）が提供される。ＴおよびＢ細胞受容体は、Ｖセグメント、Ｄセグメント（ＴＣＲベータおよびＢＣＲ重鎖のみに関する）、ＪセグメントおよびｍＲＮＡの３’末端の定常領域を含有する。Ｖ（Ｄ）Ｊ接合部により構成されたＣＤＲ３は、レパートリー多様性のバルクを含有し、Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリードプラットフォームでシーケンシングされるのに十分短い。しかし、Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリードの性能では完全長Ｖ（Ｄ）Ｊ情報を得るための能力が限定されるため、完全長Ｖセグメント情報も有用であり、これは、ロングリードシーケンシング技術を用いなければ容易に得ることができない。本明細書において提供される方法は、ランダムプライミングおよび伸長を用いて、完全長Ｖ（Ｄ）Ｊアンプリコンと、部分的なＶセグメント配列しか含有しないより短いアンプリコンの両方を含有するライブラリーを作成することができ、これにより、ユーザーは、単一のライブラリーおよびＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサーに対応するシーケンシングのランからＣＤＲ３情報と完全長Ｖセグメント配列の両方を得ることが可能になる。よって、本明細書において提供される方法の一部の実施形態により、完全長免疫受容体ｍＲＮＡ配列が得られる。
現在利用可能な５’ＶＤＪアッセイによって、断片化アプローチを使用して完全長の情報を取得することができ、これはＲｈａｐｓｏｄｙでも可能であるが、よりコストのかかる酵素と試薬が必要とされる。さらに、本明細書において提供されるランダムプライミングアプローチ（ランダムプライミングおよび伸長のみを含む）に比べて、より多くの酵素ステップが、この断片化ベースのアプローチ（例えば、断片化、末端修復、ａ－テーリング、ライゲーション）に関与する。断片化は、プライマー部位を付加するために酵素の使用を必要とする場合もあるが、本明細書において提供されるランダムプライミングベースの方法の一部の実施形態は公知のプライマー部位のライゲーションを必要としない。
図７は、完全長発現プロファイリングを実施する非限定的な例示的ワークフローの概略図である。本方法は、ＴＣＲ／ＢＣＲ濃縮ＰＣＲ産物に関するランダムプライミングを含み得る。ＴＣＲ／ＢＣＲ濃縮ＰＣＲ産物は、本明細書において提供される伸長したバーコード化された核酸分子の増幅の産物であり得る（例えば、第１の複数のバーコード化されたアンプリコン）。ＴＣＲ／ＢＣＲ濃縮ＰＣＲ産物は、核酸標的の配列にハイブリダイズすることが可能な標的特異的プライマーおよび第１のユニバーサル配列を含むプライマーを使用して、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅する結果であり得る。ランダムプライミングの性能により、より短い産物が生成され得る。センス鎖プライミングおよびアンチセンス鎖プライミングにより、ランダムプライミング伸長産物を得ることができる。本方法は、ＰＣＲ３を実施することを含み得る。細胞バーコードおよびＵＭＩを含有するセンス鎖産物のＰＣＲ３増幅によって、シーケンシングライブラリーが作成され得る。しかし、細胞バーコードとＵＭＩがないアンチセンス鎖産物の増幅は生じない。ランダムプライマーの結合部位に応じて、様々な伸長産物が生成され得る。図８は、本明細書において提供される方法に従って生成された非限定的な例示的バイオアナライザーによる追跡を示す。したがって、本発明では、Ｖ領域のより長いリードを得るための手段が提供される（特定の試料のＶＤＪを同定するために）。ＩｌｌｕｍｉｎａはＣ領域から読み取り、正常なリード長は約１５０ｂｐであり、Ｖの末端に達するシーケンシングデータが得られる（本明細書において提供される伸長したバーコード化された核酸分子で開始する場合）。ＰＣＲ３プライマーは、オーバーハングによって、シーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５およびＰ７）および試料インデックス（例えば、ｉ５、ｉ７）を付加し得る。本方法は、完全長Ｖ（Ｄ）Ｊをシーケンシングするステップと、生物情報学的に再構築するステップ（例えば、図９Ｂに示されるように複数のシーケンシングリードをアライメントするステップ）を含み得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法は、核酸標的（例えば、Ｖ（Ｄ）Ｊを含有する転写物）を同定し、かつ前記核酸標的のコピー数を計数する。
一部の実施形態では、全長核酸標的（例えば、転写物）の情報を得るための組成物、方法、システム、およびキットが提供される。一部の実施形態では、本発明において提供される方法に従って生成された伸長したバーコード化された核酸分子が、ランダムプライミングおよび伸長を実施するためのテンプレートとして用いられる。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子が増幅され（例えば、標的特異的プライマーおよび第１のユニバーサル配列を含むプライマーを用いて）、第１の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成する。一部の実施形態では、第１の複数のバーコード化されたアンプリコンをランダムプライミングおよび伸長を実施するためのテンプレートとして使用して（例えば、第２のユニバーサル配列、またはその相補体を含むランダマーを使用して）、複数の伸長産物を生成する。ランダムプライマーは、すべての転写物のコード配列に沿って様々な位置に結合し、伸長して、複数の伸長産物（例えば、直線的に増幅された産物）を生成することができる。伸長産物は、ランダムプライマーの結合部位に応じて様々な長さであるｃＤＮＡを含み得る。伸長産物は、シーケンシングライブラリー増幅プライマーを用いて増幅され、第２の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成することができる。シーケンシングライブラリー増幅は、オーバーハングによってシーケンシングアダプターおよび／またはライブラリーインデックスを付加するライブラリーフォワードおよびリバースプライマーを使用することを含んでもよい。ライブラリー増幅は、ライブラリーフォワードプライマーおよびライブラリーリバースプライマーにおいて、オーバーハングによってシーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５およびＰ７配列）および試料インデックス（例えば、ｉ５、ｉ７）を付加し得る。本方法は、第２の複数のバーコード化されたアンプリコン（またはその産物）の配列情報を得るステップを含んでもよい。第２の複数のバーコード化されたアンプリコンをシーケンシングし、本開示の下流方法に供することができる。１５０ｂｐ×２シーケンシングリードを生成するために使用するペアエンドシーケンシングによって、細胞標識、固有の分子インデックス、ポリ（Ａ）テール、および／またはリード１上の遺伝子（または遺伝子の部分的配列）、リード２上の遺伝子（または遺伝子の部分的配列）および／またはポリ（Ａ）テール、ならびにインデックス１リード上の試料インデックスが明らかになり得る。第２の複数のバーコード化されたアンプリコン（またはその産物）の配列情報を得るステップは、第２の複数のバーコード化されたアンプリコン（またはその産物）の複数のシーケンシングリードを含むシーケンシングデータを得ることを含み得る。本方法は、複数のシーケンシングリードのそれぞれをアライメントすることによって、核酸標的の完全長配列を生成することを含んでもよい。
Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および抗体のＶＤＪ領域を同定するために、本開示の方法を使用することができる。体細胞組換えとしても公知の、ＶＤＪ組換えは、免疫系の免疫グロブリン（Ｉｇ）（例えば、ＢＣＲ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）産生の初期段階における遺伝子組換えの機序である。ＶＤＪ組換えによって、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）および接合性（Ｊ）遺伝子セグメントが、ほぼランダムに組み合わされ得る。様々な遺伝子を選択する際のそのランダム性のために、細菌、ウイルス、寄生生物、腫瘍細胞などの機能不全細胞および花粉に由来する抗原に適合するタンパク質を多様にコードすることが可能となる。
ＶＤＪ領域は、可変（Ｖ）遺伝子、多様性（Ｄ）遺伝子および接合性（Ｊ）遺伝子を含む３Ｍｂの大きな遺伝子座を含み得る。これらは、ＶＤＪ組換えに関与し得るセグメントである。ＶＤＪ組換えを受けない可能性もある定常遺伝子も存在し得る。この遺伝子座のＶＤＪ組換えにおける最初の事象は、Ｄ遺伝子のうちの１つをＪ遺伝子のうちの１つに対して再編成することであり得る。この後に、Ｖ遺伝子のうちの１つがこのＤＪ再編成に付加されて、後に重鎖タンパク質の可変セグメントをコードする機能的なＶＤＪ再編成遺伝子を形成することができる。これらのステップの両方が、介在ＤＮＡを欠失し得るリコンビナーゼ酵素によって触媒され得る。
この組換えプロセスは、前駆体Ｂ細胞において段階的に起こり、抗体レパートリーに必要とされる多様性をもたらす。各Ｂ細胞は、１つの抗体（例えば、ＢＣＲ）のみを生じ得る。この特異性は、１つの対立遺伝子の機能的再編成によって、第２の対立遺伝子のさらなる組換えを防ぐためのシグナルが伝達されるような、対立遺伝子排除によって達成され得る。
一部の実施形態では、試料は、免疫細胞を含む。免疫細胞としては、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、リンパ球系幹細胞、骨髄前駆細胞、リンパ球、顆粒球、Ｂ細胞前駆体、Ｔ細胞前駆体、ナチュラルキラー細胞、Ｔｃ細胞、Ｔｈ細胞、形質細胞、メモリー細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、単球、樹状細胞および／もしくはマクロファージ、またはこれらの任意の組合せを挙げることができる。
Ｔ細胞は、単一Ｔ細胞に由来するか、または同一のＴＣＲを有するＴ細胞を指し得るＴ細胞クローンであってもよい。Ｔ細胞は、Ｔ細胞クローンおよび異なるＴＣＲであるが、そのすべてが同じ標的（例えば、抗原、腫瘍、ウイルス）を認識することができる、ＴＣＲを有するＴ細胞の混合集団を含み得るＴ細胞株の一部であってもよい。末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾組織、および腫瘍を含む、いくつかの供給源からＴ細胞を得ることができる。Ｆｉｃｏｌｌ分離を使用するなどして、対象から採取された血液単位からＴ細胞を得ることができる。アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって、個体の循環血に由来する細胞を得ることができる。アフェレーシス産物は、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含み得る。細胞を洗浄し、培地中に再懸濁させて、目的の細胞を単離することができる。
赤血球を溶解させ、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球からＴ細胞を単離することができる。ポジティブまたはネガティブ選択技法によって、Ｔ細胞の特異的亜集団、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ４、ＣＤＣ、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋ Ｔ細胞をさらに単離することができる。例えば、所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な時間、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）コンジュゲートビーズ、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標） Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ、またはＸＣＹＴＥ ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）とのインキュベーションによって、Ｔ細胞を単離することができる。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞）は、抗原特異的（例えば、腫瘍に対して特異的）であり得る。
一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞、リンパ節由来の活性化Ｂ細胞、リンパ芽球様細胞、休止Ｂ細胞、または例えば、リンパ腫由来の新生物Ｂ細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）であってもよい。ＡＰＣは、表面にＢＣＲＣタンパク質のうちの少なくとも１つを発現するＢ細胞または濾胞樹状細胞を指し得る。
本開示の方法を使用して、単一Ｔ細胞の分子表現型を追跡することができる。Ｔ細胞の様々なサブタイプは、様々な分子マーカーの発現によって識別することができる。Ｔ細胞は、ＴＣＲの多様なレパートリーから固有のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。ほとんどのＴ細胞では、ＴＣＲは、αおよびβ鎖のヘテロ二量体から構成されてもよく、各機能鎖は、Ｔ細胞発生中の体細胞ＤＮＡ組換え事象の産物であってもよく、単一の個体において１００万を超える異なるＴＣＲの発現を可能にする。ＴＣＲを使用して、個々のＴ細胞の同一性を定義することができ、免疫応答中のＴ細胞クローン増殖の系統追跡が可能となる。本開示の免疫学的方法は、以下に限定されないが、単一Ｔ細胞における固有のＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の対合を特定すること、単一細胞レベルでＴＣＲおよびマーカーの発現を定量すること、個体におけるＴＣＲの多様性を特定すること、異なるＴ細胞集団において発現されるＴＣＲレパートリーを特徴付けること、ＴＣＲのアルファ鎖およびベータ鎖の対立遺伝子の機能性を決定すること、および免疫応答の間のＴ細胞のクローン増殖を特定することを含む、様々な方法で使用され得る。
Ｔ細胞受容体鎖の対合
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔリンパ球表面に存在する認識分子である。Ｔ細胞表面に見られるＴ細胞受容体は、アルファ鎖およびベータ鎖と称される２つの糖タンパク質サブユニットから構成され得る。両鎖は、約４０ｋＤａの分子量を含み、可変ドメインおよび定常ドメインを有し得る。アルファ鎖とベータ鎖をコードする遺伝子は、遺伝子再編成によって遺伝子が形成されるＶ、ＤおよびＪ領域のライブラリーにおいて編成され得る。ＴＣＲは、組織適合遺伝子によってコードされる特異的自己分子との複合体の一部としての抗原提示細胞によって提示される抗原を認識し得る。ほとんどの有力な組織適合遺伝子は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）として公知である。したがって、Ｔ細胞受容体によって認識される複合体は、ＭＨＣ／ペプチドリガンドからなる。
一部の実施形態では、本開示の方法、デバイス、およびシステムは、Ｔ細胞受容体のシーケンシングおよび対合に使用することができる。本開示の方法、デバイス、およびシステムは、Ｔ細胞受容体アルファ鎖およびベータ鎖をシーケンシングする、アルファ鎖およびベータ鎖を対合させる、ならびに／またはＴ細胞受容体アルファ鎖の機能的コピーを決定するために使用することができる。単一細胞を単一の固体支持体（例えば、ビーズ）を含む単一の区画（例えば、ウェル）に含有させることができる。細胞は溶解されてもよい。ビーズは、ＴＣＲのアルファ鎖および／またはベータ鎖内の特定の位置に結合することができる確率的標識を含み得る。固体支持体に会合したＴＣＲのアルファ分子およびベータ分子は、逆転写、増幅、およびシーケンシングを含む本開示の分子生物学的方法に供することができる。同じ細胞標識を含むＴＣＲのアルファ鎖およびベータ鎖は、同じ単一細胞に由来すると考えられ、それによって、ＴＣＲのアルファ鎖とベータ鎖を対合させることができる。
抗体レパートリーにおける重鎖と軽鎖の対合
本開示の方法、デバイスおよびシステムは、ＢＣＲの受容体および抗体の重鎖と軽鎖の対合に使用することができる。本開示の方法は、決定される個々の生物または細胞集団における免疫受容体および抗体のレパートリーを可能にする。本開示の方法は、免疫受容体を構成するポリペプチド鎖の対を決定するのを助け得る。Ｂ細胞およびＴ細胞はそれぞれ、免疫受容体を発現し、Ｂ細胞は、免疫グロブリンおよびＢＣＲを発現し、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。両タイプの免疫受容体は、２つのポリペプチド鎖を含み得る。免疫グロブリンは、可変重（ＶＨ）鎖および可変軽（ＶＬ）鎖を含み得る。２つのタイプのＴＣＲが存在し、１つは、アルファ鎖およびベータ鎖からなり、１つは、デルタ鎖およびガンマ鎖からなる。免疫受容体におけるポリペプチドは、定常領域および可変領域を含み得る。可変領域は、Ｂ細胞またはＴ細胞の染色体における遺伝子断片の組換えおよび末端接合再編成から生じ得る。Ｂ細胞では、可変領域のさらなる多様化が体細胞超変異によって生じ得る。
免疫系は、受容体の大きなレパートリーを有し、リンパ球によって発現される任意の所与の受容体対は、別々の、固有の転写物の対によってコードされ得る。単一細胞において発現される免疫受容体鎖の対の配列についての知識を使用して、所与の個体または細胞集団の免疫レパートリーを確認することができる。
一部の実施形態では、本開示の方法、デバイス、およびシステムは、抗体のシーケンシングおよび対合に使用することができる。本開示の方法、デバイス、およびシステムは、抗体重鎖および軽鎖のシーケンシング（例えば、Ｂ細胞における）、ならびに／または重鎖および軽鎖の対合に使用することができる。単一細胞を単一の固体支持体（例えば、ビーズ）を含む単一の区画（例えば、ウェル）に含有させることができる。細胞は溶解されてもよい。
ビーズは、抗体の重鎖および／または軽鎖（例えば、Ｂ細胞における）内の特異的位置に結合することができる確率的標識を含み得る。固体支持体に会合した重鎖および軽鎖の分子は、逆転写、増幅、およびシーケンシングを含む本開示の分子生物学的方法に供することができる。同じ細胞標識を含む抗体の重鎖および軽鎖は、同じ単一細胞に由来すると考えられ、それによって、抗体の重鎖と軽鎖を対合させることができる。
完全長発現プロファイリングの方法
一部の実施形態では、試料中の核酸標的を標識する方法が提供される。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、第１のユニバーサル配列、分子標識（例えば、第１の分子標識）、および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと；それぞれが、標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと；各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子のうちの１つまたは複数の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと；複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと；核酸標的の配列にハイブリダイズすることが可能な標的特異的プライマーおよび第１のユニバーサル配列を含むプライマーを使用して、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、それによって、核酸標的の配列、またはその一部分を含む第１の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと；ランダムプライマーを第１の複数のバーコード化されたアンプリコンにハイブリダイズさせ、ランダムプライマーを伸長させて、複数の伸長産物を生成するステップであって、ランダムプライマーが、第２のユニバーサル配列、またはその相補体を含む、ステップと；第１のユニバーサル配列および第２のユニバーサル配列、またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して、複数の伸長産物を増幅させて、それによって、第２の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップとを含む。一部の実施形態では、本方法は、第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、またはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識、別個の配列を有する第２の分子標識、またはこれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む。一部の実施形態では、第１のユニバーサル配列と第２のユニバーサル配列は同一である。一部の実施形態では、第１のユニバーサル配列と第２のユニバーサル配列は異なる。
一部の実施形態では、試料中の核酸標的の数を決定する方法が提供される。一部の実施形態では、本方法は、核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、第１のユニバーサル配列、分子標識（例えば、第１の分子標識）、および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと；それぞれが、標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと；各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子のうちの１つまたは複数の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと；複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと；核酸標的の配列にハイブリダイズすることが可能な標的特異的プライマーおよび第１のユニバーサル配列を含むプライマーを使用して、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させて、それによって、核酸標的の配列、またはその一部分を含む第１の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと；ランダムプライマーを第１の複数のバーコード化されたアンプリコンにハイブリダイズさせ、ランダムプライマーを伸長させて、複数の伸長産物を生成するステップであって、ランダムプライマーが、第２のユニバーサル配列、またはその相補体を含む、ステップと；第１のユニバーサル配列および第２のユニバーサル配列、またはその相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して、複数の伸長産物を増幅させて、それによって、第２の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと；第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、またはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識、別個の配列を有する第２の分子標識、またはこれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップとを含む。
試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップは、（ａ）第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、もしくはその産物と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップ、および／または（ｂ）第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、もしくはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含み得る。一部の実施形態では、本方法は、各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせる前に、複数のバーコード化された核酸分子を変性させるステップを含む。
本方法は、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させる前に、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を変性させるステップを含み得る。複数の核酸標的のそれぞれの配列は、複数の核酸標的のそれぞれの部分配列を含み得る。複数のバーコード化された核酸分子中の核酸標的の配列は、核酸標的の部分配列を含み得る。一部の実施形態では、第１の分子標識は、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させた後に、第２の分子標識にハイブリダイズされる。伸長したバーコード化された核酸分子はそれぞれ、第１の分子標識、第２の分子標識、標的結合領域、および該標的結合領域の相補体を含み得る。一部の実施形態では、標的結合領域の相補体は、標的結合領域の一部分に相補的である。標的結合領域は、遺伝子特異的配列、ポリ（ｄＴ）配列、または両方を含み得る。
それぞれが、標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップは、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードを使用して、試料中の核酸標的のコピーをバーコード化して、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、および標的結合領域を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと；（ｉｉ）標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを複数のバーコード化された核酸分子に結合させて、それぞれが、標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップとを含み得る。
それぞれが、標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップは、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードを使用して、試料中の核酸標的のコピーをバーコード化して、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、および標的結合領域を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと；（ｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子を増幅させて、複数の増幅したバーコード化された核酸分子を生成するステップと；（ｉｉｉ）標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを複数の増幅したバーコード化された核酸分子に結合させて、それぞれが、標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップとを含み得る。
試料中の核酸標的のコピーをバーコード化するステップは、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップを含み得る。核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させるステップは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードにハイブリダイズした核酸標的のコピーを逆転写するステップを含み得る。標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを結合させるステップは、該標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを、複数のバーコード化された核酸分子および／または増幅したバーコード化された核酸分子にライゲーションさせるステップを含み得る。一部の実施形態では、標的結合領域はポリ（ｄＴ）配列を含み、該標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを結合させるステップは、末端デオキシヌクレオチド転移酵素を使用して、複数のアデノシン一リン酸を複数のバーコード化された核酸分子および／または増幅したバーコード化された核酸分子に付加するステップを含む。それぞれが、標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップは、逆転写酵素および標的結合領域またはその一部分を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが、核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および該標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップを含む。一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させるステップは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させるステップを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含む。
ランダムプライミングおよび伸長のサイクル数は、異なる実装形態では異なり得る。一部の実施形態では、ランダムプライミングおよび伸長のサイクル数は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、２５回、２６回、２７回、２８回、２９回、３０回、３１回、３２回、３３回、３４回、３５回、３６回、３７回、３８回、３９回、４０回、４１回、４２回、４３回、４４回、４５回、４６回、４７回、４８回、４９回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回、１００回の、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲の、ランダムプライミングおよび伸長のサイクルを含み得るか、または約１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、２５回、２６回、２７回、２８回、２９回、３０回、３１回、３２回、３３回、３４回、３５回、３６回、３７回、３８回、３９回、４０回、４１回、４２回、４３回、４４回、４５回、４６回、４７回、４８回、４９回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回、１００回の、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲の、ランダムプライミングおよび伸長のサイクルを含み得る。一部の実施形態では、ランダムプライミングおよび伸長のサイクル数は、少なくとも、または最大で１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、２５回、２６回、２７回、２８回、２９回、３０回、３１回、３２回、３３回、３４回、３５回、３６回、３７回、３８回、３９回、４０回、４１回、４２回、４３回、４４回、４５回、４６回、４７回、４８回、４９回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回、もしくは１００回の、ランダムプライミングおよび伸長のサイクルを含み得る。第１の複数のバーコード化されたアンプリコンにハイブリダイズしたランダムプライマーを伸長させるステップは、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ断片）のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを使用することを含み得る。一部の実施形態では、伸長酵素は、ＫｌｅｎｏｗまたはＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏ－である。
ランダムプライマーは、ヌクレオチドのランダム配列を含み得る。ヌクレオチドのランダム配列は、約４～約３０ヌクレオチドの長さであり得る。一部の実施形態では、ヌクレオチドの前記ランダム配列は、６または９ヌクレオチドの長さである。ヌクレオチドのランダム配列は、異なる実装形態では異なる長さを有し得る。一部の実施形態では、ランダムプライマー内のヌクレオチドのランダム配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲のヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ランダムプライマー内のヌクレオチドのランダム配列は、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチドの長さである。ランダムプライマーは、異なる実装形態におけるランダムプライミングステップの間に異なる濃度を有し得る。一部の実施形態では、ランダムプライマーは、ランダムプライミングの間、少なくとも、または最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２８、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲のｕＭの濃度である。
バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体をバーコード化された核酸分子自体の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップは、ステムループを形成するために、バーコード化された核酸分子内の標的結合領域と該標的結合領域の相補体との分子内ハイブリダイゼーションを含み得る。一部の実施形態では、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体である。
バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域とハイブリダイズさせるステップは、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体の、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含み得る。一部の実施形態では、第２の分子標識は第１の分子標識と異なり、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体ではない。一部の実施形態では、本方法は、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドバーコードの３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識の相補体および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識の配列は、第１の分子標識の配列と異なり、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体ではない。
バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップは、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体の、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含み得る。一部の実施形態では、第２の分子標識の配列は第１の分子標識の配列と異なり、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体ではない。
一部の実施形態では、本方法は、標的結合領域の相補体の、バーコード化された核酸分子の末端（例えば、３’末端）への付加（例えば、テンプレートスイッチング反応による）を含む。一部の実施形態では、本方法は、ｉ）分子内ハイブリダイゼーションおよび／またはｉｉ）オリゴヌクレオチドバーコード（またはその産物、例えば、別のバーコード化された核酸分子、またはそのアンプリコンなど）の標的結合領域の分子間ハイブリダイゼーションと、それに続く、伸長したバーコード化された核酸分子を生成するための伸長、を含む。伸長したバーコード化された核酸分子は、３’末端と５’末端の両方でバーコード化され得る。一部の実施形態では、バーコード化された分子の分子内ハイブリダイゼーションによって、３’ポリ（ｄＴ）捕捉ビーズ上に捕捉ｍＲＮＡ転写物を含むヘアピンループが形成される。ｍＲＮＡ分子は、オリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域に結合しているポリ（Ａ）テールによってビーズ上に捕捉され得る。ハイブリダイゼーション後に、テンプレートスイッチングを使用して、捕捉された転写物の５’末端にポリ（ｄＡ）テールを結合させることができる。次いで、新たなポリ（ｄＡ）テールがハイブリダイズし、同じビーズ上の捕捉オリゴヌクレオチド（例えば、確率的バーコードなどのバーコード）を遊離し得る。伸長後に、ｍＲＮＡ分子は、３’末端と５’末端の両方でバーコード化され得る。これにより、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａのシーケンシングプラットフォームでシーケンシングされ得る３’および５’でバーコード化された転写物の生成が可能となる。バーコード化された５’配列へのアクセスにより、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＢ細胞受容体（ＢＣＲ）の可変領域、ならびに転写物の５’末端において生じるスプライスバリアントおよび配列多様性の検出を可能とすることができる。
図６Ａ～６Ｏは、５’バーコード化および／または３’バーコード化を使用して、核酸標的（例えば、免疫受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。ＢＤ（登録商標）Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）ビーズは、幅広い物理的および化学的操作によって完全性を維持する、固体のバーコード化されたビーズである。ビーズ上でのｍＲＮＡのポリ（Ａ）捕捉後に、逆転写およびテンプレートスイッチングを実施して、ポリ（ｄＡ）テールをバーコード化されたｃＤＮＡの３’末端に付加することができる。付加されたポリ（ｄＡ）テールによって、ビーズに結合したｃＤＮＡが同じビーズ上のバーコード（例えば、確率的バーコード）のオリゴ（ｄＴ）領域に自己ハイブリダイズし、架橋ループ構造を形成することが可能となる。架橋ループのＫｌｅｎｏｗ伸長によって、反対方向に第１のバーコード化されたｃＤＮＡを有する、同じｍＲＮＡ転写物に由来する新たなバーコード化されたｃＤＮＡ分子を生成することができ、３’末端と５’末端の両方を分子バーコードに連結させることが可能となる。
本明細書に開示される方法によって、３’ベースおよび／または５’ベースの完全長配列決定を可能にすることができる。この方法は、配列決定に柔軟性を与えることを可能にすることができる。一部の実施形態では、本方法は、使用されるプライマーは別として、プロトコールまたは産物の立体構造を変化させずに、試料、例えば、マウスおよびヒトの試料について、Ｒｈａｐｓｏｄｙ（商標）システムにおけるＴ細胞とＢ細胞の両方の免疫レパートリーのプロファイリングを可能にすることができる。一部の実施形態では、Ｖ（Ｄ）Ｊの３’および／または５’ベースの完全長遺伝子発現プロファイリングが実施され得る。一部の実施形態では、表現型マーカーと単一細胞プラットフォームにおけるＴ細胞およびＢ細胞のＶ（Ｄ）Ｊ配列の両方が調査され得る。一部の実施形態では、それらの転写物の３’と５’の両方の情報が、単回の実験で捕捉され得る。本明細書に開示される方法は、Ｔ細胞とＢ細胞の両方のＶ（Ｄ）Ｊ検出を可能にすることができる（例えば、超変異）。
本明細書に記載の方法およびシステムは、オリゴヌクレオチド（本明細書において、ＡｂＯまたはＡｂＯｌｉｇｏとも称される）と会合した（例えば、それに結合した、またはそれとコンジュゲートした）抗体を使用する、方法およびシステムに関して使用することができる。単一細胞におけるタンパク質発現プロファイルを決定するためにＡｂＯを使用し、試料起源を追跡する実施形態については、米国特許出願公開第２０１８／００８８１１２号として公開された米国特許出願第１５／７１５，０２８号、および米国特許出願第１５／９３７，７１３号に記載されており、それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、Ｔ細胞およびＢ細胞の完全長Ｖ（Ｄ）Ｊプロファイリング、３’標的化、５’標的化、３’全トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）、５’ＷＴＡ、ＡｂＯを用いるタンパク質発現プロファイリング、ならびに／または単回実験での試料多重化を可能にする。
テンプレートスイッチング反応
図６Ａ～６Ｏは、５’バーコード化および／または３’バーコード化を使用して、核酸標的（例えば、免疫受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域）の完全長配列を決定する非限定的な例示的ワークフローの略図を示す。バーコード（例えば、確率的バーコード、オリゴヌクレオチドバーコード６０２）は、標識化またはバーコード化（例えば、固有の標識化）のために、ポリ（ｄＡ）テール６０８によって核酸標的（例えば、ポリアデニル化ＲＮＡ転写物６０６）に、または他の核酸標的に結合し得る標的結合領域（例えば、ポリ（ｄＴ）６０４）を含み得る。標的結合領域は、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダム多量体、またはこれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、バーコードは、固体支持体（例えば、粒子６１０）に会合している。複数のバーコード６０２は、粒子６１０と会合していてもよい。一部の実施形態では、粒子は、ビーズである。ビーズは、ポリマービーズ、例えば、バーコードまたは確率的バーコードで機能化された変形可能なビーズまたはゲルビーズ（例えば、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）からのゲルビーズ）であり得る。一部の実装形態では、ゲルビーズは、ポリマー系ゲルを含み得る。ゲルビーズは、例えば、１つまたは複数のポリマー前駆体を液滴中に封入することによって、生成することができる。ポリマー前駆体を、促進剤（例えば、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ））に曝露すると、ゲルビーズが生成され得る。
図６Ａは、逆転写反応６００ａの非限定的な例示的実施形態を示す。逆転写６００ａ中に、オリゴヌクレオチドバーコード６０２の末端に到達すると、酵素（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）などの逆転写酵素）の末端転移酵素の活性によって、新たに合成されたｃＤＮＡ配列鎖６１４ｃ（ＲＮＡ配列６１４ｒのアンチセンス配列）の３’末端に、いくつかの追加のヌクレオチド（例えば、デオキシシチジン、ＣＣＣ ６１２）が付加される。これらのＣＣＣ塩基６１２は、テールを付加した配列に相補的な配列（例えば、ｒＧｒＧｒＧ６１８）を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド６１６（例えば、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド）のアンカー部位として機能し得る。テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド６１６は、標的結合領域６０４の少なくとも一部を含み得る。ｒＧｒＧｒＧ６１８と付加されたデオキシシチジンストレッチ６１２との間の塩基対合の際に、酵素は、オリゴヌクレオチドバーコード６０２からテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド６１６にテンプレート鎖を「切り替え」、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド６１６の５’末端への複製を継続する。よって、得られた第１の鎖で標識されたｃＤＮＡ（例えば、バーコード化された核酸分子６２０）は、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド６１６の逆相補配列を含有し、よって、標的結合領域（例えば、ポリ（ｄＡ）６０８）の相補体（例えば、逆相補体）を含み得る。バーコード化された核酸分子６２０は、ｃＤＮＡ６１４ｃ（ＲＮＡ配列６１４ｒの逆相補配列）を含み得る。反応は、二次構造（例えば、エチレングリコール）を低減するよう構成された１つまたは複数の添加剤の存在下で実施することができる。バーコード化された核酸分子６２０は、いくつかの標識も含み得る。オリゴヌクレオチドバーコード６０２は、転写物６０６を標識し、ＲＮＡ転写物６０６（または例えば、抗体と会合したかもしくは抗体から解離した、抗体オリゴヌクレオチドなどの核酸標的）の試料起源を追跡するための第１の分子標識（ＭＬ１）６２２および試料標識（例えば、区画標識、細胞標識（ＣＬ）６２４）を、それぞれ、後続反応のための各バーコード６０２の第１の分子標識６２２／細胞標識６２４領域に隣接する、１つまたは複数の追加の配列、例えば、第１のユニバーサル配列６２６（例えば、リード１配列）などと一緒に、含み得る。試料ごとのオリゴヌクレオチドバーコードにおける分子標識の配列のレパートリーは、ＲＮＡ転写物の確率的標識化に対して十分に多量であり得る。一部の実施形態では、試料標識は、区画標識である。一部の実施形態では、試料標識は、細胞標識である。バーコード化された核酸分子６２０は、変性ステップ６００ｂ（例えば、変性するステップ）を受け、それによって、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１を生じ得る。
一部の実施形態では、第１の分子標識は、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させた後に、第２の分子標識にハイブリダイズされる。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子はそれぞれ、第１の分子標識、第２の分子標識、標的結合領域、および標的結合領域の相補体を含む。一部の実施形態では、標的結合領域の相補体は、標的結合領域の一部分に相補的である。一部の実施形態では、標的結合領域は、遺伝子特異的配列を含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、ポリ（ｄＴ）配列を含む。
用語「テンプレートスイッチング」は、初期核酸配列テンプレートから、初期テンプレートから合成された核酸の３’末端に対してわずかな相補性を有するかまたは相補性を有さない新たな核酸配列テンプレートの３’末端に切り替える、逆転写酵素の能力を指し得る。テンプレートスイッチングの例は、初期核酸配列テンプレート／プライマー基質から、核酸プライマー鎖の３’末端に対してわずかな相補性を有するかまたは相補性を有さない新たな核酸配列テンプレートの３’末端に切り替える、逆転写酵素の能力である。テンプレートスイッチングは、例えば、ＤＮＡコピーが、初期核酸配列テンプレートから、初期テンプレートから合成されたＤＮＡの３’末端に対してわずかな相補性を有するかまたは相補性を有さない新たな核酸配列テンプレートの３’末端に切り替える、逆転写酵素を使用して調製されるのを可能にし、それによって、アダプター配列をライゲーションなしで標的オリゴヌクレオチド配列に直接的に連結させる、連続的産物ＤＮＡの合成を可能にする。テンプレートスイッチングは、アダプターのライゲーション、ホモポリマーのテーリング（例えば、ポリアデニル化）、ランダムプライマー、またはポリメラーゼが会合し得るオリゴヌクレオチドを含み得る。上述の実施形態のいずれかでは、テンプレートスイッチングを使用して、標的結合領域またはその相補体を導入してもよい。
一部の実施形態では、逆転写酵素は、末端転移酵素活性の能力がある。一部の実施形態では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の３’リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、３つの３’リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’リボヌクレオチドは、グアニンを含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ウイルス逆転写酵素を含む。一部の実施形態では、ウイルス逆転写酵素は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）逆転写酵素である。一部の実施形態では、ウイルス逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素である。
標的結合領域の相補体は、該標的結合領域の逆相補配列を含み得るか、または該標的結合領域の相補配列を含み得る。分子標識の相補体は、該分子標識の逆相補配列を含み得るか、または該分子標識の相補配列を含み得る。一部の実施形態では、複数のバーコード化された核酸分子は、バーコード化されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子および／またはバーコード化されたリボ核酸（ＲＮＡ）分子を含み得る。一部の実施形態では、核酸標的は、核酸分子（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、ポリ（Ａ）テールを含むＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫受容体をコードする。核酸標的は、細胞成分結合試薬を含み得る。一部の実施形態では、核酸分子は、細胞成分結合試薬に会合している。本方法は、核酸分子と細胞成分結合試薬を解離させるステップを含み得る。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個は、異なる分子標識配列を含む。複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含み得る。
一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードは、固体支持体に会合している。同じ固体支持体に会合した複数のオリゴヌクレオチドバーコードはそれぞれ、同一の試料標識を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコードはそれぞれ、細胞標識を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含み得る。同じ固体支持体に会合したオリゴヌクレオチドバーコードは、同じ細胞標識を含み得る。異なる固体支持体に会合したオリゴヌクレオチドバーコードは、異なる細胞標識を含み得る。複数の伸長したバーコード化された核酸分子はそれぞれ、細胞標識および該細胞標識の相補体を含み得る。細胞標識の相補体は、細胞標識の逆相補配列、または細胞標識の相補配列を含み得る。本方法は、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、７－デアザ－ＧＴＰ、アセトアミド、塩化テトラメチルアンモニウム塩、ベタイン、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させるステップを含み得る。一部の実施形態では、固体支持体は、合成粒子を含み得る。一部の実施形態では、固体支持体は、平面表面を含み得る。
試料は、単一細胞を含んでもよく、本方法は、複数のオリゴヌクレオチドバーコードを含む合成粒子を、試料中の単一細胞と会合させるステップを含み得る。本方法は、合成粒子を単一細胞と会合させた後に、単一細胞を溶解させるステップを含み得る。単一細胞を溶解させるステップは、試料を加熱するステップ、試料を界面活性剤と接触させるステップ、試料のｐＨを変更するステップ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、合成粒子と単一細胞は、同じウェル中にある。一部の実施形態では、合成粒子と単一細胞は、同じ液滴中にある。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に固定化されている。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に部分的に固定化されている。複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子内に封入されていてもよい。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子内に部分的に封入されている。一部の実施形態では、合成粒子は、崩壊可能である。合成粒子は、ビーズを含み得る。ビーズは、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。合成粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含み得る。一部の実施形態では、合成粒子は、崩壊可能ハイドロゲル粒子を含み得る。複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれは、リンカー官能基を含んでもよく、合成粒子は、固体支持体官能基を含んでもよく、ならびに／または支持体官能基およびリンカー官能基は互いに会合していてもよい。一部の実施形態では、リンカー官能基および支持体官能基は、独立して、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
バーコード化された核酸分子の分子内ハイブリダイゼーション
一部の実施形態では、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体をバーコード化された核酸分子自体の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップは、ステムループを形成する、バーコード化された核酸分子内の標的結合領域と該標的結合領域の相補体との分子内ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体である。
ワークフローは、図６Ｂの非限定的な例示的略図に示されるように、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の分子内ハイブリダイゼーションを含み得る。ワークフローは、ステムループを形成するための、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１内の標的結合領域６０４および標的結合領域６０８の相補体の分子内ハイブリダイゼーション６００ｃ１を含み得る。ワークフローは、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１のステムループの３’末端を伸長させて（６００ｃ２）、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃを生成することを含み得る。伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃは、第１の分子標識６２２ｒｃの相補体（例えば、逆相補体）、細胞標識６２４ｒｃの相補体（例えば、逆相補体）、および／または第１のユニバーサル配列６２６ｒｃの相補体（例えば、逆相補体）を含み得る。ワークフローは、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃを変性させて（６００ｃ３）、一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄを生成することを含み得る。一部の実施形態では、分子間ハイブリダイゼーション６００ｃ１および／または伸長６００ｃ２は、高塩濃度緩衝液および／またはＰＥＧの存在下で実施される。一部の実施形態では、伸長は、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ断片）のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。
一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄは、標的核酸分子（例えば、転写物）の５’末端と３’末端の両方にバーコード（例えば、細胞標識および分子標識）を含んでもよく、それによって、配列同定、転写物の計数、選択的スプライシング分析、変異スクリーニング、および／または全長シーケンシングに関して、一方の末端に１つのバーコードのみを有する標的核酸分子の分析と比較して、標的核酸分子のより広範な分析が可能となる。一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄは、例えば、図６Ｃ～６Ｅに示される非限定的な例示的スキームなどの１つまたは複数の伸長反応（例えば、ランダムプライミングおよび伸長）および／または増幅反応（例えば、ＰＣＲ）に関するテンプレートとしての役割を果たし得る。増幅は、標的特異的（例えば、遺伝子特異的）ｃＤＮＡ増幅を含み得る。例えば、一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄは、第１のユニバーサル配列（またはその相補体）の配列を含むユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６および標的特異的プライマー（例えば、標的特異的プライマー６５０）を用いる１回目の増幅（「ＰＣＲ１」）６００ｃ４を受けて、それによって、それぞれが、分子標識（例えば、第１の分子標識）、細胞標識、第１のユニバーサル配列および部分的アンチセンスｃＤＮＡ６１４ｃａｓ１（その長さは、ｃＤＮＡ６１４ｃ内の標的特異的プライマー６５０の結合部位に応じて変わる）を含む第１の複数のアンプリコン６２０ｃａｓ１を生成することができる。ＰＣＲ１ ６００ｃ４は、１～３０サイクル（例えば、１５サイクル）を含み得る。
ワークフローは、ランダムプライミングおよび伸長６００ｃ５を含み得る。ランダムプライマー６７０は、第１の複数のバーコード化されたアンプリコン６２０ｃａｓ１とハイブリダイズされ得、ランダムプライマー６７０は、伸長されて、複数の伸長産物６２０ｅ２ｃ１および６２０ｅ２ｃ２を生成し得る。ランダムプライマー６７０は、例えば、第２のユニバーサル配列６３８（またはその相補体、例えば、逆相補体６３８ｒｃ）を含み得るか、またはそれであり得るオーバーハングを含み得る（例えば、ユニバーサルＰＣＲハンドルである、リード２配列）。伸長産物６２０ｅ２ｃ１は、第１のユニバーサル配列、第２のユニバーサル配列、細胞標識、および分子標識（例えば、第１の分子標識）、またはこれらの相補体を含み得る。伸長産物６２０ｅ２ｃ１は、例えば、部分的ｃＤＮＡ６１４ｃ２ａ、６１４ｃ２ｂ、６１４ｃ２ｃ、および６１４ｃ２ｄ（そのそれぞれの長さは、部分的ｃＤＮＡ内のランダムプライマー６７０の結合部位に応じて変わる）を含み得る。伸長産物６２０ｅ２ｃ２は、第２のユニバーサル配列（またはその相補体）を含み得る。伸長産物６２０ｅ２ｃ２は、例えば、部分的アンチセンスｃＤＮＡ６１４ｃａｓ２ｅ、６１４ｃａｓ２ｆ、６１４ｃａｓ２ｇ、および６１４ｃａｓ２ｈ（そのそれぞれの長さは、部分的ｃＤＮＡ内のランダムプライマー６７０の結合部位に応じて変わる）を含み得る。
ワークフローは、ライブラリー増幅（「ライブラリーＰＣＲ」）６００ｃ６を含み得る。ライブラリーＰＣＲ６００ｃ６は、シーケンシングライブラリー増幅プライマー６５６および６５８を用いる伸長産物６２０ｅ２ｃ１のライブラリー増幅を含み得る。シーケンシングライブラリー増幅プライマー６５６および６５８は、それぞれが、第１のユニバーサル配列６２６および第２のユニバーサル配列６３８（またはそれらの相補体）にアニーリングし得る。ライブラリーＰＣＲ６００ｃ６は、シーケンシングライブラリー増幅プライマー６５６および６５８におけるオーバーハングによって、シーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５ ６４０およびＰ７ ６４２）および試料インデックス６４４（例えば、ｉ５、ｉ７）を付加し得る。ライブラリーＰＣＲアンプリコン６２０ｃＬ（例えば、第２の複数のバーコード化されたアンプリコン）は、核酸標的のｍＲＮＡ配列の一部またはすべてを合わせて包含し得る様々なｃＤＮＡの長さ（例えば、部分的アンチセンスｃＤＮＡ６１４ｃａｓ２ａ、６１４ｃａｓ２ｂ、６１４ｃａｓ２ｃ、６１４ｃａｓ２ｄ）を含み得る。ライブラリーアンプリコン６２０ｃＬをシーケンシングし、本開示の下流方法に供することができる。１５０ｂｐ×２シーケンシングを使用するシーケンシング６００ｃ７によって、細胞標識、固有の分子標識および／またはリード１上の遺伝子（または遺伝子の部分的配列）、リード２上の遺伝子（または遺伝子の部分的配列）、ならびにインデックス１リードおよび／またはインデックス２リード上の試料インデックスが明らかになり得る。ライブラリーＰＣＲ ６００ｃ６は、１～３０サイクル（例えば、１５サイクル）を含み得る。本方法は、図９Ｂに示されるように、複数のリード１ ９１０およびリード２ ９２０のリードをアライメントすることによって、核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ９３０）の完全長配列の生物情報学的再構築９００を含み得る。
一部の実施形態では、免疫受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域の３’および／または５’ベースの完全長発現プロファイリングが実施され得る。一部の実施形態では、表現型マーカーと単一細胞プラットフォームにおけるＴ細胞および／またはＢ細胞の免疫受容体Ｖ（Ｄ）Ｊ配列の両方が調査され得る。本明細書に開示される方法は、Ｔ細胞とＢ細胞の両方のＶ（Ｄ）Ｊ検出を可能にすることができる（例えば、超変異）。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄの３’領域と５’領域の両方が増幅される。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄの５’領域のみが増幅される。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄの３’領域のみが増幅される。一部の実施形態では、増幅反応の１つまたは複数が多重ＰＣＲを含む。例えば、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｃｄの３’領域と５’領域の両方が同時に増幅され得る（例えば、多重ＰＣＲ）。一部の実施形態では、ワークフローは、標的特異的ＰＣＲ１プライマーのパネルを用いる多重ＰＣＲを含む。一部の実施形態では、標的は、ＢＣＲ、ＴＣＲ、および／または免疫関連転写物を含む。
バーコード化された核酸分子のバーコード化された核酸分子との分子間ハイブリダイゼーション
一部の実施形態では、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップは、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体の、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識の配列は第１の分子標識の配列と異なり、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体ではない。
ワークフローは、図６Ｆ～６Ｇの非限定的な例示的略図に示されるように、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の、別個のバーコード化された核酸分子６２８との分子間ハイブリダイゼーションを含み得る。別個のバーコード化された核酸分子６２８は、ｃＤＮＡ６３０ｃ、第２の分子標識６３２、細胞標識６２４、および第１のユニバーサル配列６２６を含み得る。バーコード化された核酸分子６２８の第２の分子標識６３２の配列は、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１（例えば、相補体ではない）の第１の分子標識６２２の配列と異なっていてもよい。バーコード化された核酸分子６２８の標的結合領域６０４、細胞標識６２４および／または第１のユニバーサル配列６２６は、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の標的結合領域６０４、細胞標識６２４および／または第１のユニバーサル配列６２６と同じ（またはその相補体）であってもよい。ワークフローは、一部の実施形態では、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の標的結合領域６０８の相補体の、バーコード化された核酸分子６２８の標的結合領域６０４との分子間ハイブリダイゼーション６００ｄ１を含み得る。ワークフローは、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の３’末端を伸長させて（６００ｄ２）、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄを生成することを含み得る。伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄは、第２の分子標識の相補体（例えば、逆相補体）６３２ｒｃ、細胞標識の相補体（例えば、逆相補体）６２４ｒｃ、および／または第１のユニバーサル配列の相補体（例えば、逆相補体）６２６ｒｃを含み得る。ワークフローは、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄを変性させて（６００ｄ３）、一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄを生成することを含み得る。一部の実施形態では、分子間ハイブリダイゼーション６００ｄ１および／または伸長６００ｄ２は、高塩濃度緩衝液および／またはＰＥＧの存在下で実施される。一部の実施形態では、伸長は、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ断片）のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。
一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄは、標的核酸分子（例えば、転写物）の５’末端と３’末端の両方にバーコード（例えば、細胞標識および分子標識）を含み、それによって、配列同定、転写物の計数、選択的スプライシング分析、変異スクリーニング、および／または全長シーケンシングに関して、一方の末端に１つのバーコードのみを有する標的核酸分子の分析と比較して、標的核酸分子のより広範な分析を可能とすることができる。一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄは、例えば、図６Ｈ～６Ｊに示される非限定的な例示的スキームなどの１つまたは複数の伸長反応（例えば、ランダムプライミングおよび伸長）および／または増幅反応（例えば、ＰＣＲ）に関するテンプレートとしての役割を果たし得る。増幅は、標的特異的（例えば、遺伝子特異的）ｃＤＮＡ増幅を含み得る。例えば、一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄは、第１のユニバーサル配列（またはその相補体）の配列を含むユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６および標的特異的プライマー（例えば、標的特異的プライマー６５０）を用いる１回目の増幅（「ＰＣＲ１」）６００ｄ４を受け、それによって、それぞれが、分子標識（例えば、第２の分子標識）、細胞標識、第１のユニバーサル配列および部分的アンチセンスｃＤＮＡ６１４ｃａｓ１（その長さは、ｃＤＮＡ６１４ｃ内の標的特異的プライマー６５０の結合部位に応じて変わる）を含む第１の複数のアンプリコン６２０ｄａｓ１を生成することができる。ＰＣＲ１ ６００ｄ４は、１～３０サイクル（例えば、１５サイクル）を含み得る。
ワークフローは、ランダムプライミングおよび伸長６００ｄ５を含み得る。ランダムプライマー６７０は、第１の複数のバーコード化されたアンプリコン６２０ｄａｓ１とハイブリダイズされ得、ランダムプライマー６７０は、伸長されて、複数の伸長産物６２０ｅ２ｄ１および６２０ｅ２ｄ２を生成し得る。ランダムプライマー６７０は、例えば、第２のユニバーサル配列６３８（またはその相補体、例えば、逆相補体６３８ｒｃ）を含み得るか、またはそれであり得るオーバーハングを含み得る（例えば、ユニバーサルＰＣＲハンドルである、リード２配列）。伸長産物６２０ｅ２ｄ１は、第１のユニバーサル配列、第２のユニバーサル配列、細胞標識、および分子標識（例えば、第１の分子標識）、またはこれらの相補体を含み得る。伸長産物６２０ｅ２ｄ１は、例えば、部分的ｃＤＮＡ６１４ｃ２ａ、６１４ｃ２ｂ、６１４ｃ２ｃ、および６１４ｃ２ｄ（そのそれぞれの長さは、部分的ｃＤＮＡ内のランダムプライマー６７０の結合部位に応じて変わる）を含み得る。伸長産物６２０ｅ２ｄ２は、第２のユニバーサル配列（またはその相補体）を含み得る。伸長産物６２０ｅ２ｄ２は、例えば、部分的アンチセンスｃＤＮＡ６１４ｃａｓ２ｅ、６１４ｃａｓ２ｆ、６１４ｃａｓ２ｇ、および６１４ｃａｓ２ｈ（そのそれぞれの長さは、部分的ｃＤＮＡ内のランダムプライマー６７０の結合部位に応じて変わる）を含み得る。
ワークフローは、ライブラリー増殖（「ライブラリーＰＣＲ」）６００ｄ６を含み得る。ライブラリーＰＣＲ ６００ｄ６は、シーケンシングライブラリー増幅プライマー６５６および６５８を用いる伸長産物６２０ｅ２ｄ１のライブラリー増幅を含み得る。シーケンシングライブラリー増幅プライマー６５６および６５８は、それぞれが、第１のユニバーサル配列６２６および第２のユニバーサル配列６３８（またはそれらの相補体）にアニーリングし得る。ライブラリーＰＣＲ ６００ｄ６は、シーケンシングライブラリー増幅プライマー６５６および６５８におけるオーバーハングによって、シーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５ ６４０およびＰ７ ６４２）および試料インデックス６４４（例えば、ｉ５、ｉ７）を付加し得る。ライブラリーＰＣＲアンプリコン６２０ｄＬ（例えば、第２の複数のバーコード化されたアンプリコン）は、核酸標的のｍＲＮＡ配列の一部またはすべてを合わせて包含し得る様々なｃＤＮＡの長さ（例えば、部分的アンチセンスｃＤＮＡ６１４ｃａｓ２ａ、６１４ｃａｓ２ｂ、６１４ｃａｓ２ｃ、６１４ｃａｓ２ｄ）を含み得る。ライブラリーアンプリコン６２０ｄＬをシーケンシングし、本開示の下流方法に供することができる。１５０ｂｐ×２シーケンシングを使用するシーケンシング６００ｄ７によって、細胞標識、固有の分子標識および／またはリード１上の遺伝子（または遺伝子の部分的配列）、リード２上の遺伝子（または遺伝子の部分的配列）、ならびにインデックス１リードおよび／またはインデックス２リード上の試料インデックスが明らかになり得る。ライブラリーＰＣＲ ６００ｄ６は、１～３０サイクル（例えば、１５サイクル）を含み得る。本方法は、図９Ｂに示されるように、複数のリード１ ９１０およびリード２ ９２０のリードをアライメントすることによって、核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ９３０）の完全長配列の生物情報学的再構築９００を含み得る。
一部の実施形態では、免疫受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域の３’および／または５’ベースの完全長発現プロファイリングが実施され得る。一部の実施形態では、表現型マーカーと単一細胞プラットフォームにおけるＴ細胞および／またはＢ細胞の免疫受容体Ｖ（Ｄ）Ｊ配列の両方が調査され得る。本明細書に開示される方法は、Ｔ細胞とＢ細胞の両方のＶ（Ｄ）Ｊ検出を可能にすることができる（例えば、超変異）。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄの３’領域と５’領域の両方が増幅される。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄの５’領域のみが増幅される。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄの３’領域のみが増幅される。一部の実施形態では、増幅反応の１つまたは複数が多重ＰＣＲを含む。例えば、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｄｄの３’領域と５’領域の両方が同時に増幅され得る（例えば、多重ＰＣＲ）。一部の実施形態では、ワークフローは、標的特異的ＰＣＲ１プライマーのパネルを用いる多重ＰＣＲを含む。一部の実施形態では、標的は、ＢＣＲ、ＴＣＲ、および／または免疫関連転写物を含む。
バーコード化された核酸分子のオリゴヌクレオチドバーコードとの分子間ハイブリダイゼーション
一部の実施形態では、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域とハイブリダイズさせるステップは、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体の、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識は第１の分子標識と異なり、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体ではない。一部の実施形態では、本方法は、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドバーコードの３’末端を伸長させて、それぞれが、第１の分子標識の相補体および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップを含む。一部の実施形態では、第２の分子標識の配列は、第１の分子標識の配列と異なり、第２の分子標識は、第１の分子標識の相補体ではない。
ワークフローは、図６Ｋ～６Ｌの非限定的な例示的略図に示されるように、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の、別個のオリゴヌクレオチドバーコード６３４との分子間ハイブリダイゼーションを含み得る。別個のオリゴヌクレオチドバーコード６３４は、第２の分子標識６３６、細胞標識６２４、および第１のユニバーサル配列６２６を含み得る。オリゴヌクレオチドバーコード６３４の第２の分子標識６３６の配列は、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１（例えば、相補体ではない）の第１の分子標識６２２の配列と異なっていてもよい。オリゴヌクレオチドバーコード６３４の標的結合領域６０４、細胞標識６２４および／または第１のユニバーサル配列６２６は、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の標的結合領域６０４、細胞標識６２４および／または第１のユニバーサル配列６２６と同じ（またはその相補体）であってもよい。ワークフローは、一部の実施形態では、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の標的結合領域６０８の相補体の、オリゴヌクレオチドバーコード６３４の標的結合領域６０４との分子間ハイブリダイゼーション６００ｅ１を含み得る。ワークフローは、一本鎖のバーコード化された核酸分子６２１の３’末端を伸長させて（６００ｅ２）、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１を生成することを含み得る。伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１は、第２の分子標識の相補体（例えば、逆相補体）６３６ｒｃ、細胞標識の相補体（例えば、逆相補体）６２４ｒｃ、第１のユニバーサル配列の相補体（例えば、逆相補体）６２６ｒｃ、および／またはｃＤＮＡ ６１４ｃを含み得る。ワークフローは、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１を変性させて（６００ｅ３）、一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄを生成することを含み得る。ワークフローは、オリゴヌクレオチドバーコード６３４の３’末端を伸長させて（６００ｅ２）、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２を生成することを含み得る。伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２は、第１の分子標識の相補体（例えば、逆相補体）６２２ｒｃ、細胞標識の相補体（例えば、逆相補体）６２４ｒｃ、第１のユニバーサル配列の相補体（例えば、逆相補体）６２６ｒｃ、および／またはアンチセンスｃＤＮＡ ６１４ｃａｓを含み得る。ワークフローは、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２を変性させて（６００ｅ３）、一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２ｄを生成することを含み得る。一部の実施形態では、分子間ハイブリダイゼーション６００ｅ１および／または伸長６００ｅ２は、高塩濃度緩衝液および／またはＰＥＧの存在下で実施される。一部の実施形態では、伸長は、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性（例えば、Ｋｌｅｎｏｗ断片）のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。
一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄおよび一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２ｄは、標的核酸分子（例えば、転写物）の５’末端と３’末端の両方にバーコード（例えば、細胞標識および分子標識）を含み、それによって、配列同定、転写物の計数、選択的スプライシング分析、変異スクリーニング、および／または全長シーケンシングに関して、一方の末端に１つのバーコードのみを有する標的核酸分子の分析と比較して、標的核酸分子のより広範な分析を可能にすることができる。一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄおよび一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２ｄは、例えば、図６Ｍ～６Ｏに示される非限定的な例示的スキームなどの１つまたは複数の伸長反応（例えば、ランダムプライミングおよび伸長）および／または増幅反応（例えば、ＰＣＲ）に関するテンプレートとしての役割を果たし得る。増幅は、標的特異的（例えば、遺伝子特異的）ｃＤＮＡ増幅を含み得る。例えば、一本鎖の伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ２ｄは、第１のユニバーサル配列（またはその相補体）の配列を含むユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマー６４６および標的特異的プライマー（例えば、標的特異的プライマー６５０）を用いる１回目の増幅（「ＰＣＲ１」）６００ｅ４を受け、それによって、それぞれが、分子標識（例えば、第２の分子標識）、細胞標識、第１のユニバーサル配列および部分的アンチセンスｃＤＮＡ ６１４ｃａｓ１（その長さは、ｃＤＮＡ６１４ｃａｓ内の標的特異的プライマー６５０の結合部位に応じて変わる）を含む第１の複数のアンプリコン６２０ｅａｓ１を生成することができる。ＰＣＲ１ ６００ｅ４は、１～３０サイクル（例えば、１５サイクル）を含み得る。
ワークフローは、ランダムプライミングおよび伸長６００ｅ５を含み得る。ランダムプライマー６７０は、第１の複数のバーコード化されたアンプリコンとハイブリダイズされ得、ランダムプライマー６７０は、伸長されて、複数の伸長産物６２０ｅ２ｅ１および６２０ｅ２ｅ２を生成し得る。ランダムプライマー６７０は、例えば、第２のユニバーサル配列６３８（またはその相補体、例えば、逆相補体６３８ｒｃ）を含み得るか、またはそれであり得るオーバーハングを含み得る（例えば、ユニバーサルＰＣＲハンドルである、リード２配列）。伸長産物６２０ｅ２ｌは、第１のユニバーサル配列、第２のユニバーサル配列、細胞標識、および分子標識（例えば、第１の分子標識）、またはこれらの相補体を含み得る。伸長産物６２０ｅ２ｅ１は、例えば、部分的ｃＤＮＡ６１４ｃ２ａ、６１４ｃ２ｂ、６１４ｃ２ｃ、および６１４ｃ２ｄ（そのそれぞれの長さは、部分的ｃＤＮＡ内のランダムプライマー６７０の結合部位に応じて変わる）を含み得る。伸長産物６２０ｅ２ｅ２は、第２のユニバーサル配列（またはその相補体）を含み得る。伸長産物６２０ｅ２ｅ２は、例えば、部分的アンチセンスｃＤＮＡ６１４ｃａｓ２ｅ、６１４ｃａｓ２ｆ、６１４ｃａｓ２ｇ、および６１４ｃａｓ２ｈ（そのそれぞれの長さは、部分的ｃＤＮＡ内のランダムプライマー６７０の結合部位に応じて変わる）を含み得る。
ワークフローは、ライブラリー増殖（「ライブラリーＰＣＲ」）６００ｅ６を含み得る。ライブラリーＰＣＲ６００ｅ６は、シーケンシングライブラリー増幅プライマー６５６および６５８を用いる伸長産物６２０ｅ２ｅ１のライブラリー増幅を含み得る。シーケンシングライブラリー増幅プライマー６５６および６５８は、それぞれ、第１のユニバーサル配列６２６および第２のユニバーサル配列６３８（またはそれらの相補体）にアニーリングし得る。ライブラリーＰＣＲ ６００ｅ６は、シーケンシングライブラリー増幅プライマー６５６および６５８におけるオーバーハングによって、シーケンシングアダプター（例えば、Ｐ５ ６４０およびＰ７ ６４２）および試料インデックス６４４（例えば、ｉ５、ｉ７）を付加し得る。ライブラリーＰＣＲアンプリコン６２０ｅ２Ｌ（例えば、第２の複数のバーコード化されたアンプリコン）は、核酸標的のｍＲＮＡ配列の一部またはすべてを合わせて包含し得る様々なｃＤＮＡの長さ（例えば、部分的アンチセンスｃＤＮＡ６１４ｃａｓ２ａ、６１４ｃａｓ２ｂ、６１４ｃａｓ２ｃ、６１４ｃａｓ２ｄ）を含み得る。ライブラリーアンプリコン６２０ｅ２Ｌをシーケンシングし、本開示の下流方法に供することができる。１５０ｂｐ×２シーケンシングを使用するシーケンシング６００ｅ７によって、細胞標識、固有の分子標識および／またはリード１上の遺伝子（または遺伝子の部分的配列）、リード２上の遺伝子（または遺伝子の部分的配列）、ならびにインデックス１リードおよび／またはインデックス２リード上の試料インデックスが明らかになり得る。ライブラリーＰＣＲ ６００ｅ６は、１～３０サイクル（例えば、１５サイクル）を含み得る。本方法は、図９Ｂに示されるように、複数のリード１ ９１０およびリード２ ９２０のリードをアライメントすることによって、核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ９３０）の完全長配列の生物情報学的再構築９００を含み得る。
一部の実施形態では、免疫受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域の３’および／または５’ベースの完全長発現プロファイリングが実施され得る。一部の実施形態では、表現型マーカーと単一細胞プラットフォームにおけるＴ細胞および／またはＢ細胞の免疫受容体Ｖ（Ｄ）Ｊ配列の両方が調査され得る。本明細書に開示される方法は、Ｔ細胞とＢ細胞の両方のＶ（Ｄ）Ｊ検出を可能にすることができる（例えば、超変異）。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄおよび／または６２０ｅ２ｄの３’領域と５’領域の両方が増幅される。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄおよび／または６２０ｅ２ｄの５’領域のみが増幅される。一部の実施形態では、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄおよび／または６２０ｅ２ｄの３’領域のみが増幅される。一部の実施形態では、増幅反応の１つまたは複数が多重ＰＣＲを含む。例えば、伸長したバーコード化された核酸分子６２０ｅ１ｄおよび／または６２０ｅ２ｄの３’領域と５’領域の両方が同時に増幅され得る（例えば、多重ＰＣＲ）。一部の実施形態では、ワークフローは、標的特異的ＰＣＲ１プライマーのパネルを用いる多重ＰＣＲを含む。一部の実施形態では、標的は、ＢＣＲ、ＴＣＲ、および／または免疫関連転写物を含む。
免疫レパートリープロファイリング
一部の実施形態では、免疫受容体のＶ（Ｄ）Ｊ領域の完全長発現プロファイリングのための方法が提供される。一部の実施形態では、試料は、単一細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、複数の細胞、複数の単一細胞、組織、腫瘍試料、またはこれらの任意の組合せを含む。単一細胞は、免疫細胞を含み得る。一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞またはＴ細胞である。一部の実施形態では、単一細胞は、循環腫瘍細胞を含み得る。一部の実施形態では、各オリゴヌクレオチドバーコードは、第１のユニバーサル配列を含み得る。一部の実施形態では、複数の伸長したバーコード化された核酸分子は、第１のユニバーサル配列および該第１のユニバーサル配列の相補体を含む。複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させステップは、核酸標的の配列にハイブリダイズすることが可能な標的特異的プライマーおよび第１のユニバーサル配列を含むプライマーを使用することを含み得る。一部のこのような実施形態では、標的特異的プライマーは、免疫受容体に特異的にハイブリダイズする。例えば、標的特異的プライマーは、免疫受容体の定常領域、免疫受容体の可変領域、免疫受容体の多様性領域、免疫受容体の可変領域と多様性領域の接合部、またはこれらの任意の組合せに特異的にハイブリダイズし得る。免疫受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）受容体であり得る。ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ＢＣＲは、ＢＣＲ重鎖および／またはＢＣＲ軽鎖を含み得る。
本方法は、第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、またはその産物の配列情報を得るステップを含んでもよい。一部の実施形態では、配列情報を得るステップは、シーケンシングアダプターを、第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、またはその産物に結合させるステップを含む。複数の伸長産物を増幅させるステップは、シーケンシングプライマーおよび／もしくはシーケンシングアダプターの結合部位の配列、その相補配列、ならびに／またはその一部分を、複数の伸長産物に付加するステップを含み得る。シーケンシングアダプターは、Ｐ５配列、Ｐ７配列、その相補配列、またはその一部分を含み得る。シーケンシングプライマーは、リード１シーケンシングプライマー、リード２シーケンシングプライマー、その相補配列、またはその一部分を含み得る。
配列情報を得るステップは、単一細胞のＢＣＲ軽鎖およびＢＣＲ重鎖の配列情報を得るステップを含み得る。ＢＣＲ軽鎖およびＢＣＲ重鎖の配列情報は、ＢＣＲ軽鎖および／またはＢＣＲ重鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含み得る。本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖を対合させるステップを含み得る。試料は、複数の単一細胞を含んでもよく、本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞の少なくとも５０％のＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖を対合させるステップを含み得る。一部の実施形態では、ＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖が本明細書において提供される方法に従って対合される試料の単一細胞のパーセンテージは、０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、ＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖が本明細書において提供される方法に従って対合される試料の単一細胞のパーセンテージが、少なくとも、または最大で０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であってもよい。
配列情報を得るステップは、単一細胞のＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列情報を得るステップを含み得る。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列情報は、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含み得る。一部の実施形態では、本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を対合させるステップを含み得る。一部の実施形態では、試料は、複数の単一細胞を含んでもよく、本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞の少なくとも５０％のＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を対合させるステップを含み得る。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖が本明細書において提供される方法に従って対合される試料の単一細胞のパーセンテージは、０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖が本明細書において提供される方法に従って対合される試料の単一細胞のパーセンテージが、少なくとも、または最大で０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であってもよい。
配列情報を得るステップは、単一細胞のＴＣＲガンマ鎖およびＴＣＲデルタ鎖の配列情報を得るステップを含み得る。ＴＣＲガンマ鎖およびＴＣＲデルタ鎖の配列情報は、ＴＣＲガンマ鎖および／またはＴＣＲデルタ鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含み得る。本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖を対合させるステップを含み得る。試料は、複数の単一細胞を含んでもよく、本方法は、得られた配列情報に基づいて、単一細胞の少なくとも５０％のＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖を対合させるステップを含み得る。一部の実施形態では、ＴＣＲデルタ鎖とＴＣＲガンマ鎖が本明細書において提供される方法に従って対合される試料の単一細胞のパーセンテージは、０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよく、または約０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であってもよい。一部の実施形態では、ＴＣＲデルタ鎖とＴＣＲガンマ鎖が本明細書において提供される方法に従って対合される試料の単一細胞のパーセンテージが、少なくとも、または最大で０．００００００００１％、０．０００００００１％、０．００００００１％、０．０００００１％、０．００００１％、０．０００１％、０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であってもよい。
第２の複数のバーコード化されたアンプリコン、またはその産物の配列情報を得るステップは、第２の複数のバーコード化されたアンプリコンの複数のシーケンシングリード、またはその産物を含むシーケンシングデータを得るステップであって、複数のシーケンシングリードのそれぞれが、（１）細胞標識配列、（２）分子標識配列、および／または（３）核酸標的の部分配列を含む、ステップを含み得る。一部の実施形態では、本方法は、試料の単一細胞を示す、それぞれ固有の細胞標識配列について、核酸標的の複数のシーケンシングリードのそれぞれをアライメントさせて、核酸標的のアライメントされた配列を生成するステップを含む。図９Ｂに示されるように、シーケンシングデータは、複数のシーケンシングリード、例えば、リード１ ９１０およびリード２ ９２０のリードなどを含み得る。一部の実施形態では、ランダムプライミングステップの結果として、リード１ ９１０および／またはリード２ ９２０のリードは、核酸標的（例えば、免疫受容体転写物）全体を合わせて包含し得る。本方法は、複数のリード１ ９１０およびリード２ ９２０をアライメントすることによって、核酸標的（例えば、免疫受容体ｍＲＮＡ９３０）の完全長配列の生物情報学的再構築９００を含み得る。有利には、本明細書において提供される組成物および方法は、核酸標的（例えば、Ｖ（Ｄ）Ｊを含有する転写物）の同定および計数の両方を提供することができる。
一部の実施形態では、核酸標的のアライメントされた配列は、核酸標的のｃＤＮＡ配列の少なくとも５０％、核酸標的のｃＤＮＡ配列の少なくとも７０％、核酸標的のｃＤＮＡ配列の少なくとも９０％、または核酸標的のｃＤＮＡ配列の完全長を含む。一部の実施形態では、核酸標的のアライメントされた配列は、核酸標的のｃＤＮＡ配列の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得るか、または約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、もしくはこれらの値のうちのいずれか２つの間の数もしくは範囲であり得る。一部の実施形態では、核酸標的のアライメントされた配列は、核酸標的のｃＤＮＡ配列の少なくとも、または最大で１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であり得る。核酸標的は、免疫受容体であってもよい。
一部の実施形態では、核酸標的のアライメントされた配列は、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、可変領域、可変領域の完全長、またはこれらの組合せを含む。核酸標的のアライメントされた配列は、可変領域、多様性領域、可変領域、多様性領域および／もしくは定常領域の接合部、またはこれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、本方法は、断片化も、タグメンテーションも、またはその両方も含まない。
核酸標的の完全長情報を得るためのキット
本明細書の開示は、キットを含む。一部の実施形態では、キットは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが分子標識および標的結合領域を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が異なる分子標識配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドバーコード；逆転写酵素；標的結合領域またはその一部分を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド；および５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを含む。本明細書の開示は、キットを含む。一部の実施形態では、キットは、複数のオリゴヌクレオチドバーコードであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、分子標識および標的結合領域を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が異なる分子標識配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドバーコード；末端デオキシヌクレオチド転移酵素；ならびに５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを含む。
キットは、ランダムプライマーを含み得る。ランダムプライマーは、ヌクレオチドのランダム配列を含み得る。ヌクレオチドのランダム配列は、約４～約３０ヌクレオチドの長さであり得る。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含む。一部の実施形態では、逆転写酵素は、ウイルス逆転写酵素を含む。一部の実施形態では、ウイルス逆転写酵素は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）逆転写酵素である。一部の実施形態では、ウイルス逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素である。一部の実施形態では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の３’リボヌクレオチド、例えば、３つの３’リボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’リボヌクレオチドは、グアニンを含む。一部の実施形態では、キットは、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、７－デアザ－ＧＴＰ、アセトアミド、塩化テトラメチルアンモニウム塩、ベタイン、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数を含む。
一部の実施形態では、キットは、緩衝液を含む。一部の実施形態では、キットは、カートリッジを含む。一部の実施形態では、キットは、逆転写反応のための１つまたは複数の試薬を含む。一部の実施形態では、キットは、増幅反応のための１つまたは複数の試薬を含む。一部の実施形態では、標的結合領域は、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダム多量体、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドバーコードは、同一の試料標識および／または同一の細胞標識を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識および／または細胞標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識は、少なくとも６個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に固定化されている。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子上に部分的に固定化されている。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子内に封入されている。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つは、合成粒子内に部分的に封入されている。一部の実施形態では、合成粒子は、崩壊可能である。一部の実施形態では、合成粒子は、ビーズ、例えば、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、合成粒子は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む。一部の実施形態では、合成粒子は、崩壊可能ハイドロゲル粒子を含む。一部の実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれは、リンカー官能基を含み、合成粒子は、固体支持体官能基を含み、ならびに／または支持体官能基およびリンカー官能基は互いに会合している。一部の実施形態では、リンカー官能基および支持体官能基は、独立して、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
本明細書に記載の実施形態のいくつかの態様を以下の実施例でさらに詳しく開示するが、これらの実施例は、本開示の範囲を制限することを何ら意図しない。
（実施例１）
完全長Ｖ（Ｄ）Ｊ配列のランダムプライミングに基づく決定
この実施例は、本明細書において提供される核酸標的（例えば、Ｖ（Ｄ）Ｊを含有する転写物）の完全長発現プロファイリングのためのランダムプライミングに基づく方法について実証する。ＴＣＲ産物（図１０Ａ～１０Ｂ）およびＢＣＲ産物（図１０Ｃ～１０Ｄ）のバイオアナライザーによる追跡において示されているように、現在利用可能な方法（図１０Ｂおよび１０Ｄ）と比較して、より小さな断片が、本明細書において提供されるランダムプライミングベースのアプローチ（図１０Ａおよび１０Ｃ）で得られる。次に、シーケンシングを実施して、完全長であり（図１１Ｂ）、細胞に由来する（図１１Ａ）ＶＤＪ配列のパーセンテージを決定した。ＶＤＪに対してアライメントされ、コンティグへとアセンブルされるのに成功し、かつそのコンティグが有効なＶＤＪ配列である（ＣＤＲを有する）リードのうち、図１１Ａに示されるパーセンテージは、推定上の細胞に由来するこれらのリードの数に関する。推定上の細胞では、優勢であると同定されたコンティグに関して、完全長であるこれらのパーセンテージは、図１１Ｂに示される。そのコンティグが、鎖：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４のすべての主要な部分について同定された配列を有するかどうかによって、完全長を決定した。さらに、図１２Ａ～１２Ｄに示されるように、完全長の対合した鎖が正しい細胞型（Ｂ細胞におけるＢＣＲ、Ｔ細胞におけるＴＣＲ）で見られ、本明細書において提供されるランダムプライミングベースのアプローチで得られたＢＣＲ対合（図１２Ａ～１２Ｂ）およびＴＣＲ対合（図１２Ｃ～１２Ｄ）は、現在利用可能な方法（図１２Ｂおよび１２Ｄ）よりも優れていた。これらの結果は、本明細書において提供されるランダムプライミングベースの方法および組成物に関する原理証明を与える。
様々な態様および実施形態が本明細書に開示されているが、他の態様および実施形態が当業者にとって明らかであろう。本明細書に開示される様々な態様および実施形態は、例示を目的とし、限定を意図するものではなく、以下の請求項によって示されている真の範囲および精神を有する。
当業者は、本明細書に開示されるこのおよび他のプロセスおよび方法について、そのプロセスおよび方法において実施される機能が、異なる順序で実現され得ることを認識するであろう。さらに、概説されるステップおよび操作は例として与えられるに過ぎず、ステップおよび操作のいくつかは、より少ないステップおよび操作へと任意に組み合わされてもよく、または本開示の実施形態の根本的要素を減じることなく追加のステップおよび操作に拡大されてもよい。
本明細書の実質的に任意の複数形および／または単数形の用語の使用に関連して、文脈上および／または適用上適切であれば、当業者は、複数形から単数形へおよび／または単数形から複数形への変換が可能である。明確にするために種々の単数形／複数形の入替えを本明細書に明示的に記述し得る。
一般的には、本明細書において、特に添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の本文）で使用される用語は、全般的に、「オープン」用語であることが意図されることが当業者によって理解されるであろう（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「以下に限定されないが、～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」と解釈されるべきであり、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも～を有する（ｈａｖｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」と解釈されるべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は「以下に限定されないが、～を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ ｂｕｔ ｉｓ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」と解釈されるべきであるなど）。さらに、導入された請求項の記載の特定数が意図される場合、このような意図は請求項で明示的に記載され、このような記載の非存在下では、このような意図は存在しないことが、当業者によって理解されるであろう。例えば、理解の一助として、以下の添付の特許請求の範囲は、請求項の記載を導入するために、導入語句「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」および「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」の使用を含み得る。しかし、このような語句の使用は、たとえ同一の請求項が、「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」または「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という導入語句および「ａ」または「ａｎ」のような不定冠詞を含む場合でも、「ａ」または「ａｎ」という不定冠詞による請求項の記載の導入がこのような導入された請求項の記載を含むいかなる特定の請求項もそのような記載を１つのみ含む実施形態に限定することを意味するものと解釈させるべきではなく（例えば、「ａ」および／または「ａｎ」は、「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」または「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味すると解釈されるべきである）、請求項の記載を導入するために使用される定冠詞の使用についても同様である。さらに、たとえ特定数の導入された請求項の記載が明示的に記載されたとしても、このような記載は少なくとも記載された数を意味すると解釈されるべきであることを当業者は認識するであろう（例えば、「２つの記載」という他の修飾語を含まない無修飾の記載は、少なくとも２つの記載、または２つ以上の記載を意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つなど」に類似した慣例が使用される場合、一般的には、このような構成は当業者がその慣例を理解する意味であることが意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、以下に限定されないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢの両方、ＡとＣの両方、ＢとＣの両方、および／またはＡとＢとＣの全部などを有するシステムを含むことになる）。「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つなど」に類似した慣例が使用される場合、一般的には、このような構成は当業者がその慣例を理解する意味であることが意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、以下に限定されないが、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢの両方、ＡとＣの両方、ＢとＣの両方、および／またはＡとＢとＣの全部などを有するシステムを含むことになる）。さらに、２つ以上の代替用語を表す実質上任意の選言的な語および／または語句は、明細書、請求項、または図面にかかわらず、用語の１つ、用語のいずれか、または用語の両方を含む可能性が企図されると理解されるべきであることが当業者によって理解されるであろう。例えば、語句「ＡまたはＢ」は、「Ａ」もしくは「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むことが理解される。
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群により記述される場合、それにより、本開示は、マーカッシュ群の任意の個別のメンバーまたはメンバーの下位群によっても記述されることが、当業者に認識されるであろう。
当業者に理解されるように、あらゆる目的で、例えば、明細書の提供に関して、本明細書に開示された範囲はすべて、あらゆる可能な下位範囲およびその下位範囲の組合せも包含する。いずれの列挙された範囲も、十分に記述されたものとしてかつその範囲が少なくとも２等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などされ得るものとして容易に認識可能である。非限定的な例として、本明細書で考察した各範囲は、下３分の１、中３分の１、上３分の１などに容易に分解可能である。同様に、当業者に理解されるように、「最大」、「少なくとも」などの表現はすべて、記載された数を含み、以上で考察したように後続的に下位範囲に分解可能な範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は、それぞれ個々のメンバーを含む。よって、例えば、１～３個の細胞を有する群は、１、２、または３個の細胞を有する群を指す。同様に、１～５個の細胞を有する群は、１、２、３、４、または５個の細胞を有する群を指し、他も同様である。
前記内容から、本開示の様々な実施形態が例証のために本明細書に記載されており、本開示の範囲および精神を逸脱することなく様々な修正がなされ得ることが認識されよう。したがって、本明細書に開示される様々な実施形態は、限定を意図するものではなく、以下の請求項によって示されている真の範囲および精神を有する。
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕試料中の核酸標的を標識するための方法であって、
核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、第１のユニバーサル配列、分子標識、および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと；
それぞれが標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと；
各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、
（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、
（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および
（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子
のうちの１つまたは複数の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと；
複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと；
核酸標的の配列にハイブリダイズすることが可能な標的特異的プライマーおよび第１のユニバーサル配列を含むプライマーを使用して、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅して、それによって、核酸標的の配列またはその一部分を含む、第１の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと；
ランダムプライマーを第１の複数のバーコード化されたアンプリコンにハイブリダイズさせ、ランダムプライマーを伸長させて、複数の伸長産物を生成するステップであって、ランダムプライマーが、第２のユニバーサル配列またはその相補体を含む、ステップと；
第１のユニバーサル配列および第２のユニバーサル配列またはそれらの相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して、複数の伸長産物を増幅させて、それによって、第２の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと、
を含む、方法。
〔２〕第２の複数のバーコード化されたアンプリコンまたはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識、別個の配列を有する第２の分子標識、またはそれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕試料中の核酸標的の数を決定するための方法であって、
核酸標的のコピーを複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、第１のユニバーサル配列、分子標識、および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと；
それぞれが標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと；
各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、
（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、
（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および
（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子
のうちの１つまたは複数の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと；
複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと、
核酸標的の配列にハイブリダイズすることが可能な標的特異的プライマーおよび第１のユニバーサル配列を含むプライマーを使用して、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅して、それによって、核酸標的の配列またはその一部分を含む、第１の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと；
ランダムプライマーを第１の複数のバーコード化されたアンプリコンにハイブリダイズさせ、ランダムプライマーを伸長させて、複数の伸長産物を生成するステップであって、ランダムプライマーが、第２のユニバーサル配列またはその相補体を含む、ステップと；
第１のユニバーサル配列および第２のユニバーサル配列またはそれらの相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して、複数の伸長産物を増幅させて、それによって、第２の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと；
第２の複数のバーコード化されたアンプリコンまたはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識、別個の配列を有する第２の分子標識、またはそれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップと、
を含む、方法。
〔４〕試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップが、
（ａ）第２の複数のバーコード化されたアンプリコンもしくはその産物と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップ、および／または
（ｂ）第２の複数のバーコード化されたアンプリコンもしくはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップ
を含む、前記〔２〕～〔３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５〕各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせる前に、複数のバーコード化された核酸分子を変性させるステップを含む、前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６〕複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させる前に、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を変性させるステップを含む、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７〕複数の核酸標的のそれぞれの配列が、複数の核酸標的のそれぞれの部分配列を含む、前記〔１〕～〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕複数のバーコード化された核酸分子中の核酸標的の配列が、核酸標的の部分配列を含む、前記〔１〕～〔７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔９〕第１の分子標識が、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させた後に、第２の分子標識にハイブリダイズされる、前記〔１〕～〔８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１０〕伸長したバーコード化された核酸分子がそれぞれ、第１の分子標識、第２の分子標識、標的結合領域、および該標的結合領域の相補体を含む、前記〔１〕～〔９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１１〕標的結合領域の相補体が、標的結合領域の一部分に相補的である、前記〔１〕～〔１０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１２〕標的結合領域が、遺伝子特異的配列、ポリ（ｄＴ）配列、または両方を含む、前記〔１〕～〔１１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１３〕それぞれが標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップが、
（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードを使用して、試料中の核酸標的のコピーをバーコード化して、それぞれが核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、および標的結合領域を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップ；および
（ｉｉ）標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを複数のバーコード化された核酸分子に結合させて、それぞれが標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップ
を含む、前記〔１〕～〔１２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１４〕それぞれが標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップが、
（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードを使用して、試料中の核酸標的のコピーをバーコード化して、それぞれが核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、および標的結合領域を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップ；
（ｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子を増幅させて、複数の増幅したバーコード化された核酸分子を生成するステップ；ならびに
（ｉｉｉ）標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを複数の増幅したバーコード化された核酸分子に結合させて、それぞれが標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップ
を含む、前記〔１〕～〔１２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１５〕試料中の核酸標的のコピーをバーコード化するステップが、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップを含む、前記〔１３〕～〔１４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１６〕核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させるステップが、複数のオリゴヌクレオチドバーコードにハイブリダイズした核酸標的のコピーを逆転写するステップを含む、前記〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを結合させるステップが、標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを、複数のバーコード化された核酸分子および／または増幅したバーコード化された核酸分子にライゲーションさせるステップを含む、前記〔１３〕～〔１６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１８〕標的結合領域がポリ（ｄＴ）配列を含み、該標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを結合させるステップが、末端デオキシヌクレオチド転移酵素を使用して、複数のアデノシン一リン酸を複数のバーコード化された核酸分子および／または増幅したバーコード化された核酸分子に付加するステップを含む、前記〔１３〕～〔１６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１９〕それぞれが標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップが、
逆転写酵素と、標的結合領域またはその一部分を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドとの存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および該標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップ
を含む、前記〔１〕～〔１２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２０〕逆転写酵素が、末端転移酵素活性の能力がある、前記〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の３’リボヌクレオチド、任意に、３つの３’リボヌクレオチドを含む、前記〔１９〕～〔２０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２２〕３’リボヌクレオチドが、グアニンを含む、前記〔２１〕に記載の方法。
〔２３〕逆転写酵素が、ウイルス逆転写酵素、任意に、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）逆転写酵素またはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素を含む、前記〔１９〕～〔２２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２４〕バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体をバーコード化された核酸分子自体の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップが、ステムループを形成する、バーコード化された核酸分子内の、標的結合領域と該標的結合領域の相補体との分子内ハイブリダイゼーションを含む、前記〔１〕～〔２３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２５〕第２の分子標識が、第１の分子標識の相補体である、前記〔２４〕に記載の方法。
〔２６〕バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域とハイブリダイズさせるステップが、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体と、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含む、前記〔１〕～〔２５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２７〕第２の分子標識が、第１の分子標識と異なり、第２の分子標識が、第１の分子標識の相補体ではない、前記〔２６〕に記載の方法。
〔２８〕バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドバーコードの３’末端を伸長させて、それぞれが第１の分子標識の相補体および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップを含む、前記〔２６〕～〔２７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２９〕第２の分子標識の配列が、第１の分子標識の配列と異なり、第２の分子標識が、第１の分子標識の相補体ではない、前記〔２８〕に記載の方法。
〔３０〕バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップが、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体と、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含む、前記〔１〕～〔２９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔３１〕第２の分子標識の配列が、第１の分子標識の配列と異なり、第２の分子標識が、第１の分子標識の相補体ではない、前記〔３０〕に記載の方法。
〔３２〕試料が、単一細胞、複数の細胞、複数の単一細胞、組織、腫瘍試料、またはこれらの任意の組合せを含む、前記〔１〕～〔３１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔３３〕単一細胞が、免疫細胞または循環腫瘍細胞を含み、免疫細胞がＢ細胞またはＴ細胞であってもよい、前記〔３２〕に記載の方法。
〔３４〕標的特異的プライマーが免疫受容体に特異的にハイブリダイズし、任意に、標的特異的プライマーが、免疫受容体の定常領域、免疫受容体の可変領域、免疫受容体の多様性領域、免疫受容体の可変領域と多様性領域の接合部、またはこれらの組合せに特異的にハイブリダイズする、前記〔１〕～〔３３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔３５〕免疫受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）受容体であり、ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、またはこれらの任意の組合せを含んでもよく、さらに、ＢＣＲ受容体が、ＢＣＲ重鎖および／またはＢＣＲ軽鎖を含んでもよい、前記〔３４〕に記載の方法。
〔３６〕複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させるステップが、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させるステップを含み、ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含んでもよい、前記〔１〕～〔３５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔３７〕第２の複数のバーコード化されたアンプリコンまたはその産物の配列情報を得るステップを含み、配列情報を得るステップが、シーケンシングアダプターを第２の複数のバーコード化されたアンプリコンまたはその産物に結合させるステップを含んでもよい、前記〔１〕～〔３６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔３８〕複数の伸長産物を増幅させるステップが、シーケンシングプライマーおよび／またはシーケンシングアダプターの結合部位の配列、その相補配列、および／またはそれらの一部分を、複数の伸長産物に付加するステップであって；シーケンシングアダプターが、Ｐ５配列、Ｐ７配列、それらの相補配列、またはそれらの一部分を含んでもよく；さらに、シーケンシングプライマーが、リード１シーケンシングプライマー、リード２シーケンシングプライマー、それらの相補配列、またはそれらの一部分を含んでもよい、ステップを含む、前記〔１〕～〔３７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔３９〕第２の複数のバーコード化されたアンプリコンまたはその産物の配列情報を得るステップが、
第２の複数のバーコード化されたアンプリコンまたはその産物の複数のシーケンシングリードを含むシーケンシングデータを得るステップであって、複数のシーケンシングリードのそれぞれが、（１）細胞標識配列、（２）分子標識配列、および／または（３）核酸標的の部分配列を含む、ステップ
を含む、前記〔３７〕～〔３８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔４０〕試料の単一細胞を示す、それぞれ固有の細胞標識配列について、
核酸標的の複数のシーケンシングリードのそれぞれをアライメントさせて、核酸標的のアライメントされた配列を生成するステップを含む、前記〔３９〕に記載の方法。
〔４１〕核酸標的のアライメントされた配列が、核酸標的のｃＤＮＡ配列の少なくとも５０％、核酸標的のｃＤＮＡ配列の少なくとも７０％、核酸標的のｃＤＮＡ配列の少なくとも９０％、または核酸標的のｃＤＮＡ配列の完全長を含む、前記〔４０〕に記載の方法。
〔４２〕核酸標的が、免疫受容体であり、免疫受容体が、ＢＣＲ軽鎖、ＢＣＲ重鎖、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、またはこれらの任意の組合せを含んでもよい、前記〔１〕～〔４１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔４３〕核酸標的のアライメントされた配列が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、可変領域、可変領域の完全長、またはこれらの組合せを含む、前記〔４２〕に記載の方法。
〔４４〕核酸標的のアライメントされた配列が、可変領域、多様性領域、可変領域、多様性領域および／または定常領域の接合部、またはこれらの任意の組合せを含む、前記〔４２〕～〔４３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔４５〕断片化、タグメンテーション、またはその両方を含まない、前記〔４２〕～〔４４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔４６〕配列情報を得るステップが、単一細胞のＢＣＲ軽鎖およびＢＣＲ重鎖の配列情報を得るステップを含み、ＢＣＲ軽鎖およびＢＣＲ重鎖の配列情報が、ＢＣＲ軽鎖および／またはＢＣＲ重鎖の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含んでもよい、前記〔３７〕～〔４５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔４７〕得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖を対合させるステップを含む、前記〔４６〕に記載の方法。
〔４８〕試料が、複数の単一細胞を含み、方法が、得られた配列情報に基づいて、前記単一細胞の少なくとも５０％のＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖を対合させるステップを含む、前記〔４６〕～〔４７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔４９〕配列情報を得るステップが、単一細胞のＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列情報を得るステップを含み、ＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列情報が、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含んでもよい、前記〔３７〕～〔４８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５０〕得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を対合させるステップを含む、前記〔４９〕に記載の方法。
〔５１〕試料が、複数の単一細胞を含み、方法が、得られた配列情報に基づいて、前記単一細胞の少なくとも５０％のＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を対合させるステップを含む、前記〔４９〕～〔５０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５２〕配列情報を得るステップが、単一細胞のＴＣＲガンマ鎖およびＴＣＲデルタ鎖の配列情報を得るステップを含む、前記〔３７〕～〔５１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５３〕ＴＣＲガンマ鎖およびＴＣＲデルタ鎖の配列情報が、ＴＣＲガンマ鎖および／またはＴＣＲデルタ鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含む、前記〔５２〕に記載の方法。
〔５４〕得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖を対合させるステップを含む、前記〔５２〕～〔５３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５５〕試料が、複数の単一細胞を含み、方法が、得られた配列情報に基づいて、前記単一細胞の少なくとも５０％のＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖を対合させるステップを含む、前記〔５２〕～〔５４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５６〕標的結合領域の相補体が、標的結合領域の逆相補配列または標的結合領域の相補配列を含む、前記〔１〕～〔５５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５７〕分子標識の相補体が、分子標識の逆相補配列または分子標識の相補配列を含む、前記〔１〕～〔５６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５８〕複数のバーコード化された核酸分子が、バーコード化されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、バーコード化されたリボ核酸（ＲＮＡ）分子、またはこれらの組合せを含む、前記〔１〕～〔５７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５９〕核酸標的が、核酸分子を含み、核酸分子が、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、ポリ（Ａ）テールを含むＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せを含んでもよく、さらに、ｍＲＮＡが免疫受容体をコードしてもよい、前記〔１〕～〔５８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６０〕核酸標的が、細胞成分結合試薬を含む、および／または核酸分子が、細胞成分結合試薬に会合している、前記〔５９〕に記載の方法。
〔６１〕核酸分子と細胞成分結合試薬を解離させるステップを含む、前記〔６０〕に記載の方法。
〔６２〕複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が、異なる分子標識配列を含む、前記〔１〕～〔６１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６３〕複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識が、少なくとも６個のヌクレオチドを含む、前記〔１〕～〔６２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６４〕複数のオリゴヌクレオチドバーコードが、固体支持体と会合している、前記〔１〕～〔６３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６５〕同じ固体支持体に会合した複数のオリゴヌクレオチドバーコードがそれぞれ、同一の試料標識を含む、前記〔６４〕に記載の方法。
〔６６〕複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識が、少なくとも６個のヌクレオチドを含む、前記〔６５〕に記載の方法。
〔６７〕複数のオリゴヌクレオチドバーコードがそれぞれ、細胞標識を含む、前記〔１〕～〔６６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６８〕複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各細胞標識が、少なくとも６個のヌクレオチドを含む、前記〔６７〕に記載の方法。
〔６９〕同じ固体支持体に会合しているオリゴヌクレオチドバーコードが、同じ細胞標識を含む、前記〔６７〕～〔６８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７０〕異なる固体支持体に会合しているオリゴヌクレオチドバーコードが、異なる細胞標識を含む、前記〔６７〕～〔６９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７１〕複数の伸長したバーコード化された核酸分子がそれぞれ、細胞標識および該細胞標識の相補体を含む、前記〔６７〕～〔７０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７２〕細胞標識の相補体が、細胞標識の逆相補配列または細胞標識の相補配列を含む、前記〔７１〕に記載の方法。
〔７３〕エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、７－デアザ－ＧＴＰ、アセトアミド、塩化テトラメチルアンモニウム塩、ベタイン、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数の存在下で、核酸標的のコピーにハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させるステップを含む、前記〔１〕～〔７２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７４〕固体支持体が、合成粒子、平面表面、またはこれらの組合せを含む、前記〔６４〕～〔７３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７５〕試料が、単一細胞を含み、方法が、複数のオリゴヌクレオチドバーコードを含む合成粒子を、試料中の単一細胞と会合させるステップを含む、前記〔１〕～〔７４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７６〕合成粒子を単一細胞と会合させた後に、単一細胞を溶解させるステップを含み、単一細胞を溶解させるステップが、試料を加熱するステップ、試料を界面活性剤と接触させるステップ、試料のｐＨを変更するステップ、またはこれらの任意の組合せを含んでもよい、前記〔７５〕に記載の方法。
〔７７〕合成粒子と単一細胞が、同じ区画中にあり、区画がウェルまたは液滴であってもよい、前記〔７５〕～〔７６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７８〕複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つが、合成粒子上に固定化されているかもしくは部分的に固定化されている、または複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つが、合成粒子内に封入されているかもしくは部分的に封入されている、前記〔７５〕～〔７７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７９〕合成粒子が、崩壊可能であり、任意に、崩壊可能なハイドロゲル粒子である、前記〔７５〕～〔７８〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８０〕合成粒子が、ビーズを含み、ビーズが、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、もしくはこれらの任意の組合せを含んでもよい、前記〔７５〕～〔７９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８１〕合成粒子が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む、前記〔７５〕～〔８０〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８２〕複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、リンカー官能基を含み、
合成粒子が、固体支持体官能基を含み、
支持体官能基およびリンカー官能基が、互いに会合しており、リンカー官能基および支持体官能基が、それぞれに、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい、
前記〔７５〕～〔８１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８３〕複数のオリゴヌクレオチドバーコードであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、分子標識および標的結合領域を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が、異なる分子標識配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドバーコードと、
逆転写酵素と、
標的結合領域またはその一部分を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドと、
５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼと、
を含む、キット。
〔８４〕逆転写酵素が、ウイルス逆転写酵素を含み、ウイルス逆転写酵素が、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）逆転写酵素またはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素であってもよい、前記〔８３〕に記載のキット。
〔８５〕テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の３’リボヌクレオチド、任意に、３つの３’リボヌクレオチドを含む、前記〔８３〕～〔８４〕のいずれか１項に記載のキット。
〔８６〕３’リボヌクレオチドが、グアニンを含む、前記〔８５〕に記載のキット。
〔８７〕エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、７－デアザ－ＧＴＰ、アセトアミド、塩化テトラメチルアンモニウム塩、ベタイン、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数を含む、前記〔８３〕～〔８６〕のいずれか１項に記載のキット。
〔８８〕複数のオリゴヌクレオチドバーコードであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、分子標識および標的結合領域を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が、異なる分子標識配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドバーコードと、
末端デオキシヌクレオチド転移酵素と、
５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼと、
を含む、キット。
〔８９〕ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含む、前記〔８３〕～〔８８〕のいずれか１項に記載のキット。
〔９０〕緩衝液、カートリッジ、または両方を含む、前記〔８３〕～〔８９〕のいずれか１項に記載のキット。
〔９１〕逆転写反応および／または増幅反応のための１つまたは複数の試薬を含む、前記〔８３〕～〔９０〕のいずれか１項に記載のキット。
〔９２〕標的結合領域が、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダム多量体、またはこれらの任意の組合せを含む、前記〔８３〕～〔９１〕のいずれか１項に記載のキット。
〔９３〕オリゴヌクレオチドバーコードが、同一の試料標識および／または同一の細胞標識を含む、前記〔８３〕～〔９２〕のいずれか１項に記載のキット。
〔９４〕複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識および／または細胞標識が、少なくとも６個のヌクレオチドを含む、前記〔９３〕に記載のキット。
〔９５〕複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識が、少なくとも６個のヌクレオチドを含む、前記〔８３〕～〔９３〕のいずれか１項に記載のキット。
〔９６〕複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つが、合成粒子上に固定化されているかもしくは部分的に固定化されている、または合成粒子内に封入されているかもしくは部分的に封入されている、前記〔８３〕～〔９５〕のいずれか１項に記載のキット。
〔９７〕合成粒子が、崩壊可能であり、任意に、崩壊可能なハイドロゲル粒子である、前記〔８３〕～〔９６〕のいずれか１項に記載のキット。
〔９８〕合成粒子が、ビーズを含み、ビーズが、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含んでもよい、前記〔８３〕～〔９７〕のいずれか１項に記載のキット。
〔９９〕合成粒子が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、ガラス、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む、前記〔８３〕～〔９８〕のいずれか１項に記載のキット。
〔１００〕複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、リンカー官能基を含み、
合成粒子が、固体支持体官能基を含み、
支持体官能基およびリンカー官能基が、互いに会合しており、リンカー官能基および支持体官能基が、それぞれに、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい、
前記〔８３〕～〔９９〕のいずれか１項に記載のキット。

Claims (16)

  1. 核酸標的の１つまたは複数の発生を含む試料中の核酸標的を標識するための方法であって、
    核酸標的を複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、第１のユニバーサル配列、分子標識、および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと；
    逆転写酵素と、標的結合領域またはその一部分を含むテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドとの存在下で、核酸標的にハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、それぞれが核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、標的結合領域、および該標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成し、それによって、それぞれが標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと；
    各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、
    （ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、
    （ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および
    （ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子
    のうちの１つまたは複数の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと；
    複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと；
    核酸標的の配列にハイブリダイズすることが可能な標的特異的プライマーおよび第１のユニバーサル配列を含むプライマーを使用して、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅して、それによって、核酸標的の配列またはその一部分を含む、第１の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと；
    ランダムプライマーを第１の複数のバーコード化されたアンプリコンにハイブリダイズさせ、ランダムプライマーを伸長させて、複数の伸長産物を生成するステップであって、ランダムプライマーが、第２のユニバーサル配列またはその相補体を含む、ステップと；
    第１のユニバーサル配列および第２のユニバーサル配列またはそれらの相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して、複数の伸長産物を増幅させて、それによって、第２の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと、
    を含む、方法。
  2. 核酸標的の１つまたは複数の発生を含む試料中の核酸標的を標識するための方法であって、
    核酸標的を複数のオリゴヌクレオチドバーコードと接触させるステップであって、各オリゴヌクレオチドバーコードが、第１のユニバーサル配列、分子標識、および核酸標的にハイブリダイズすることが可能な標的結合領域を含む、ステップと；
    複数のオリゴヌクレオチドバーコードを使用して、核酸標的をバーコード化して、それぞれが核酸標的の少なくとも一部分に相補的な配列、第１の分子標識、および標的結合領域を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップと；
    以下の（ｉ）または（ｉｉ）のステップと、
    （ｉ）標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを複数のバーコード化された核酸分子に結合させて、それぞれが標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップ、または
    （ｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子を増幅させて、複数の増幅したバーコード化された核酸分子を生成するステップ、および、標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを複数の増幅したバーコード化された核酸分子に結合させて、それぞれが標的結合領域および該標的結合領域の相補体を含む、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップ；
    各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、
    （ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、
    （ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および
    （ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子
    のうちの１つまたは複数の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップと；
    複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させて、それぞれが第１の分子標識および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップと；
    核酸標的の配列にハイブリダイズすることが可能な標的特異的プライマーおよび第１のユニバーサル配列を含むプライマーを使用して、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅して、それによって、核酸標的の配列またはその一部分を含む、第１の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと；
    ランダムプライマーを第１の複数のバーコード化されたアンプリコンにハイブリダイズさせ、ランダムプライマーを伸長させて、複数の伸長産物を生成するステップであって、ランダムプライマーが、第２のユニバーサル配列またはその相補体を含む、ステップと；
    第１のユニバーサル配列および第２のユニバーサル配列またはそれらの相補体にハイブリダイズすることが可能なプライマーを使用して、複数の伸長産物を増幅させて、それによって、第２の複数のバーコード化されたアンプリコンを生成するステップと、
    を含む、方法。
  3. 第２の複数のバーコード化されたアンプリコンまたはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識、別個の配列を有する第２の分子標識、またはそれらの組合せの数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップを含み、
    任意に、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップが、
    （ａ）第２の複数のバーコード化されたアンプリコンもしくはその産物と会合した、別個の配列を有する第２の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップ、および／または
    （ｂ）第２の複数のバーコード化されたアンプリコンもしくはその産物と会合した、別個の配列を有する第１の分子標識の数に基づいて、試料中の核酸標的のコピー数を決定するステップ
    を含んでもよい、
    請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
  4. （ａ）方法が、各バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、（ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコード、（ｉｉ）バーコード化された核酸分子自体、および／または（ｉｉｉ）複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせる前に、複数のバーコード化された核酸分子を変性させるステップを含む、
    （ｂ）方法が、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を増幅させる前に、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を変性させるステップを含む、
    （ｃ）複数の核酸標的のそれぞれの配列が、複数の核酸標的のそれぞれの部分配列を含む、
    （ｄ）複数のバーコード化された核酸分子中の核酸標的の配列が、核酸標的の部分配列を含む、
    （ｅ）第１の分子標識が、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させた後に、第２の分子標識にハイブリダイズされる、
    （ｆ）伸長したバーコード化された核酸分子がそれぞれ、第１の分子標識、第２の分子標識、標的結合領域、および該標的結合領域の相補体を含む、
    （ｇ）標的結合領域の相補体が、標的結合領域の一部分に相補的である、
    （ｈ）標的結合領域が、遺伝子特異的配列、ポリ（ｄＴ）配列、または両方を含む、
    請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. （ａ）試料中の核酸標的をバーコード化するステップが、核酸標的にハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させて、複数のバーコード化された核酸分子を生成するステップを含み、任意に、核酸標的にハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させるステップが、複数のオリゴヌクレオチドバーコードにハイブリダイズした核酸標的を逆転写するステップを含んでもよい、および／または
    （ｂ）標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを結合させるステップが、標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを、複数のバーコード化された核酸分子および／または増幅したバーコード化された核酸分子にライゲーションさせるステップを含む、および／または
    （ｃ）標的結合領域がポリ（ｄＴ）配列を含み、該標的結合領域の相補体を含むオリゴヌクレオチドを結合させるステップが、末端デオキシヌクレオチド転移酵素を使用して、複数のアデノシン一リン酸を複数のバーコード化された核酸分子および／または増幅したバーコード化された核酸分子に付加するステップを含む、
    請求項２に記載の方法。
  6. （ａ）逆転写酵素が、末端転移酵素活性を有する、
    （ｂ）テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の３’リボヌクレオチドを含み、任意に、３つの３’リボヌクレオチドを含んでもよく、任意に、３’リボヌクレオチドが、グアニンを含んでもよい、および／または
    （ｃ）逆転写酵素が、ウイルス逆転写酵素を含み、任意に、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）逆転写酵素またはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素を含んでもよい、
    請求項１または３～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. （ａ）バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体をバーコード化された核酸分子自体の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップが、ステムループを形成する、バーコード化された核酸分子内の、標的結合領域と該標的結合領域の相補体との分子内ハイブリダイゼーションを含み、任意に、第２の分子標識が、第１の分子標識の相補体であってもよい、および／または
    （ｂ）バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域とハイブリダイズさせるステップが、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体と、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちのオリゴヌクレオチドバーコードの標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含み、任意に
    （ｉ）第２の分子標識が、第１の分子標識と異なっていてもよく、第２の分子標識が、第１の分子標識の相補体でなくてもよく、および／または
    （ｉｉ）方法が、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドバーコードの３’末端を伸長させて、それぞれが第１の分子標識の相補体および第２の分子標識を含む、複数の伸長したバーコード化された核酸分子を生成するステップを含んでもよく、任意に、第２の分子標識の配列が、第１の分子標識の配列と異なっていてもよく、第２の分子標識が、第１の分子標識の相補体でなくてもよい、
    請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. （ａ）バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体を、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域とハイブリダイズさせるステップが、バーコード化された核酸分子の標的結合領域の相補体と、複数のバーコード化された核酸分子のうちの異なるバーコード化された核酸分子の標的結合領域との分子間ハイブリダイゼーションを含み、任意に、第２の分子標識の配列が、第１の分子標識の配列と異なっていてもよく、第２の分子標識が、第１の分子標識の相補体でなくてもよい、
    （ｂ）試料が、単一細胞、複数の細胞、複数の単一細胞、組織、腫瘍試料、またはこれらの任意の組合せを含み、任意に、単一細胞が、免疫細胞または循環腫瘍細胞を含んでもよく、任意に、免疫細胞がＢ細胞またはＴ細胞であってもよい、
    （ｃ）標的特異的プライマーが免疫受容体をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし、任意に、標的特異的プライマーが、免疫受容体の定常領域、免疫受容体の可変領域、免疫受容体の多様性領域、免疫受容体の可変領域と多様性領域の接合部、またはこれらの組合せをコードする核酸に特異的にハイブリダイズしてもよく、任意に、免疫受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）であってもよく、任意に、ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、またはこれらの任意の組合せを含んでもよく、さらに、任意に、ＢＣＲが、ＢＣＲ重鎖および／またはＢＣＲ軽鎖を含んでもよい、
    （ｄ）複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させるステップが、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼを使用して、複数のバーコード化された核酸分子の３’末端を伸長させるステップを含み、任意に、ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含んでもよい、および／または
    （ｅ）複数の伸長産物を増幅させるステップが、シーケンシングプライマーおよび／またはシーケンシングアダプターの結合部位の配列、その相補配列、および／またはそれらの一部分を、複数の伸長産物に付加するステップを含み、任意に、シーケンシングアダプターが、Ｐ５配列、Ｐ７配列、それらの相補配列、またはそれらの一部分を含んでもよく、さらに、任意に、シーケンシングプライマーが、リード１シーケンシングプライマー、リード２シーケンシングプライマー、それらの相補配列、またはそれらの一部分を含んでもよい、
    請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 第２の複数のバーコード化されたアンプリコンまたはその産物の配列情報を得るステップを含み、任意に、配列情報を得るステップが、シーケンシングアダプターを第２の複数のバーコード化されたアンプリコンまたはその産物に結合させるステップを含んでもよく、任意に、
    （ａ）第２の複数のバーコード化されたアンプリコンまたはその産物の配列情報を得るステップが、
    第２の複数のバーコード化されたアンプリコンまたはその産物の複数のシーケンシングリードを含むシーケンシングデータを得るステップであって、複数のシーケンシングリードのそれぞれが、（１）細胞標識配列、（２）分子標識配列、および／または（３）核酸標的の部分配列を含む、ステップ
    を含んでもよく、任意に、
    （ｂ）方法が、試料の単一細胞を示すそれぞれ固有の細胞標識配列について、
    核酸標的の複数のシーケンシングリードのそれぞれをアライメントさせて、核酸標的のアライメントされた配列を生成するステップを含んでもよく、任意に、
    （ｃ）核酸標的のアライメントされた配列が、核酸標的のｃＤＮＡ配列の少なくとも５０％、核酸標的のｃＤＮＡ配列の少なくとも７０％、核酸標的のｃＤＮＡ配列の少なくとも９０％、または核酸標的のｃＤＮＡ配列の完全長を含んでもよい、
    請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 核酸標的が、免疫受容体をコードし、任意に、免疫受容体が、ＢＣＲ軽鎖、ＢＣＲ重鎖、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、ＴＣＲデルタ鎖、またはこれらの任意の組合せを含んでもよく、任意に、
    （ａ）核酸標的のアライメントされた配列が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）、可変領域、可変領域の完全長、またはこれらの組合せを含んでもよい、
    （ｂ）核酸標的のアライメントされた配列が、可変領域、多様性領域、可変領域、多様性領域および／または定常領域の接合部、またはこれらの任意の組合せを含んでもよい、および／または
    （ｃ）方法が、断片化、タグメンテーション、またはその両方を含まなくてもよい、
    請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  11. （ａ）配列情報を得るステップが、単一細胞のＢＣＲ軽鎖およびＢＣＲ重鎖の配列情報を得るステップを含み、任意に、
    （ｉ）ＢＣＲ軽鎖およびＢＣＲ重鎖の配列情報が、ＢＣＲ軽鎖および／またはＢＣＲ重鎖の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含んでもよい、
    （ｉｉ）方法が、得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖を対合させるステップを含んでもよい、および／または
    （ｉｉｉ）試料が、複数の単一細胞を含んでもよく、方法が、得られた配列情報に基づいて、前記単一細胞の少なくとも５０％のＢＣＲ軽鎖とＢＣＲ重鎖を対合させるステップを含んでもよい、ならびに／または
    （ｂ）配列情報を得るステップが、単一細胞のＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列情報を得るステップを含み、任意に、
    （ｉ）ＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列情報が、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含んでもよい、
    （ｉｉ）方法が、得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を対合させるステップを含んでもよい、および／または
    （ｉｉｉ）試料が、複数の単一細胞を含んでもよく、方法が、得られた配列情報に基づいて、前記単一細胞の少なくとも５０％のＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖を対合させるステップを含んでもよい、ならびに／または
    （ｃ）配列情報を得るステップが、単一細胞のＴＣＲガンマ鎖およびＴＣＲデルタ鎖の配列情報を得るステップを含み、任意に、
    （ｉ）ＴＣＲガンマ鎖およびＴＣＲデルタ鎖の配列情報が、ＴＣＲガンマ鎖および／またはＴＣＲデルタ鎖の、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの任意の組合せの配列を含んでもよい、
    （ｉｉ）方法が、得られた配列情報に基づいて、単一細胞のＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖を対合させるステップを含んでもよい、および／または
    （ｉｉｉ）試料が、複数の単一細胞を含んでもよく、方法が、得られた配列情報に基づいて、前記単一細胞の少なくとも５０％のＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖を対合させるステップを含んでもよい、
    請求項９または１０に記載の方法。
  12. （ａ）標的結合領域の相補体が、標的結合領域の逆相補配列または標的結合領域の相補配列を含む、
    （ｂ）分子標識の相補体が、分子標識の逆相補配列または分子標識の相補配列を含む、
    （ｃ）複数のバーコード化された核酸分子が、バーコード化されたデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、バーコード化されたリボ核酸（ＲＮＡ）分子、またはこれらの組合せを含む、
    （ｄ）核酸標的が、核酸分子を含み、任意に、核酸分子が、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ分解産物、ポリ（Ａ）テールを含むＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せを含んでもよく、さらに、任意に、ｍＲＮＡが免疫受容体をコードしてもよく、任意に、核酸標的が、細胞成分結合試薬を含んでもよく、および／または核酸分子が、細胞成分結合試薬に会合していてもよく、任意に、核酸分子と細胞成分結合試薬を解離させるステップを含んでもよい、
    （ｅ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が、異なる分子標識配列を含む、
    （ｆ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識が、少なくとも６個のヌクレオチドを含む、ならびに／または
    （ｇ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードが、固体支持体と会合しており、任意に、
    （ｉ）固体支持体が、合成粒子、平面表面、またはこれらの組合せを含んでもよい、および／または
    （ｉｉ）同じ固体支持体に会合した複数のオリゴヌクレオチドバーコードがそれぞれ、同一の試料標識を含んでもよく、任意に、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識が、少なくとも６個のヌクレオチドを含んでもよい、ならびに／または
    （ｈ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードがそれぞれ、細胞標識を含み、任意に、
    （ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各細胞標識が、少なくとも６個のヌクレオチドを含んでもよい、
    （ｉｉ）同じ固体支持体に会合しているオリゴヌクレオチドバーコードが、同じ細胞標識を含んでもよい、
    （ｉｉｉ）異なる固体支持体に会合しているオリゴヌクレオチドバーコードが、異なる細胞標識を含んでもよい、および／または
    （ｉｖ）複数の伸長したバーコード化された核酸分子がそれぞれ、細胞標識および該細胞標識の相補体を含んでもよく、任意に、細胞標識の相補体が、細胞標識の逆相補配列または細胞標識の相補配列を含んでもよい、ならびに／または
    （ｉ）方法が、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、７－デアザ－ＧＴＰ、アセトアミド、塩化テトラメチルアンモニウム塩、ベタイン、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数の存在下で、核酸標的にハイブリダイズした複数のオリゴヌクレオチドバーコードを伸長させるステップを含む、
    請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 試料が、単一細胞を含み、方法が、複数のオリゴヌクレオチドバーコードを含む合成粒子を、試料中の単一細胞と会合させるステップを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. （ａ）方法が、合成粒子を単一細胞と会合させた後に、単一細胞を溶解させるステップを含み、任意に、単一細胞を溶解させるステップが、試料を加熱するステップ、試料を界面活性剤と接触させるステップ、試料のｐＨを変更するステップ、またはこれらの任意の組合せを含んでもよい、
    （ｂ）合成粒子と単一細胞が、同じ区画中にあり、任意に、区画がウェルまたは液滴であってもよい、
    （ｃ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つが、合成粒子上に固定化されているかもしくは部分的に固定化されている、または複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つが、合成粒子内に封入されているかもしくは部分的に封入されている、
    （ｄ）合成粒子が、崩壊可能であり、任意に、崩壊可能なハイドロゲル粒子であってもよい、
    （ｅ）合成粒子が、ビーズを含み、任意に、ビーズが、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、もしくはこれらの任意の組合せを含んでもよい、
    （ｆ）合成粒子が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む、および／または
    （ｇ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、リンカー官能基を含み、合成粒子が、固体支持体官能基を含み、支持体官能基およびリンカー官能基が、互いに会合しており、任意に、リンカー官能基および支持体官能基が、それぞれに、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい、
    請求項１３に記載の方法。
  15. 複数のオリゴヌクレオチドバーコードであって、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、分子標識および標的結合領域を含み、複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１０個が、異なる分子標識配列を含む、複数のオリゴヌクレオチドバーコードと、
    逆転写酵素と、
    ５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性および３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性のうちの少なくとも１つを欠くＤＮＡポリメラーゼと、
    ランダムプライマーと、
    標的結合領域またはその一部分を含むテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドと、
    を含む、キット。
  16. （ａ）逆転写酵素が、ウイルス逆転写酵素を含み、任意に、ウイルス逆転写酵素が、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）逆転写酵素またはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素であってもよく、
    （ｂ）テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の３’リボヌクレオチドを含み、任意に、３つの３’リボヌクレオチドを含んでもよく、任意に、３’リボヌクレオチドが、グアニンを含んでもよい、
    （ｃ）キットが、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、１，２－プロパンジオール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ホルムアミド、７－デアザ－ＧＴＰ、アセトアミド、塩化テトラメチルアンモニウム塩、ベタイン、またはこれらの任意の組合せのうちの１つまたは複数を含む、
    （ｄ）ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋｌｅｎｏｗ断片を含む、
    （ｅ）キットが、緩衝液、カートリッジ、または両方を含む、
    （ｆ）キットが、逆転写反応および／または増幅反応のための１つまたは複数の試薬を含む、
    （ｇ）標的結合領域が、遺伝子特異的配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ランダム多量体、またはこれらの任意の組合せを含む、
    （ｈ）オリゴヌクレオチドバーコードが、同一の試料標識および／または同一の細胞標識を含み、任意に、複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各試料標識および／または細胞標識が、少なくとも６個のヌクレオチドを含んでもよい、
    （ｉ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードの各分子標識が、少なくとも６個のヌクレオチドを含む、
    （ｊ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのうちの少なくとも１つが、合成粒子上に固定化されているかもしくは部分的に固定化されている、または合成粒子内に封入されているかもしくは部分的に封入されている、
    （ｋ）合成粒子が、崩壊可能であり、任意に、崩壊可能なハイドロゲル粒子であってもよい、
    （ｌ）合成粒子が、ビーズを含み、任意に、ビーズが、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁性ビーズ、コンジュゲートビーズ、プロテインＡコンジュゲートビーズ、プロテインＧコンジュゲートビーズ、プロテインＡ／Ｇコンジュゲートビーズ、プロテインＬコンジュゲートビーズ、オリゴ（ｄＴ）コンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、またはこれらの任意の組合せを含んでもよい、
    （ｍ）合成粒子が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ガラス、ポリプロピレン、アガロース、ゼラチン、ハイドロゲル、常磁性体、セラミック、プラスチック、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、セルロース、ナイロン、シリコーン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される材料を含む、および／または
    （ｎ）複数のオリゴヌクレオチドバーコードのそれぞれが、リンカー官能基を含み、合成粒子が、固体支持体官能基を含み、支持体官能基およびリンカー官能基が、互いに会合しており、任意に、リンカー官能基および支持体官能基が、それぞれに、Ｃ６、ビオチン、ストレプトアビジン、第一級アミン、アルデヒド、ケトン、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択されてもよい、
    請求項１５に記載のキット。
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