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ES2690753T3 - Aumento de la confianza en las identificaciones de alelos con el recuento molecular - Google Patents

Aumento de la confianza en las identificaciones de alelos con el recuento molecular Download PDF

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ES2690753T3
ES2690753T3 ES16170857.3T ES16170857T ES2690753T3 ES 2690753 T3 ES2690753 T3 ES 2690753T3 ES 16170857 T ES16170857 T ES 16170857T ES 2690753 T3 ES2690753 T3 ES 2690753T3
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dbr
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polynucleotide molecules
sequencing
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James Casbon
Sydney Brenner
Robert Osborne
Conrad Lichtenstein
Andreas Claas
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Agilent Technologies Inc
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Abstract

Un método para determinar el número mínimo de moléculas de polinucleótidos individuales que se originan a partir de la misma región genómica de la misma muestra original que han sido secuenciadas en una configuración o procedimiento de análisis de secuencia particular, que incluye: unir una región de bases degeneradas (DBR) a moléculas de polinucleótidos de partida; amplificar las moléculas de polinucleótidos de partida unidos a DBR; secuenciar las moléculas de polinucleótidos amplificadas, en donde se obtiene la secuencia de la DBR así como una porción del polinucleótido; determinar el número de DBR diferentes unidas a un polinucleótido de interés; y usar el número de secuencias de DBR diferentes presentes en la etapa de secuenciación para determinar el número mínimo de moléculas de polinucleótidos individuales que se originan a partir de la misma región genómica de la misma muestra original que han sido secuenciadas en la configuración o el procedimiento de análisis de secuencias particular; donde el método incluye acervar moléculas de polinucleótidos de una pluralidad de muestras originales, donde las moléculas de polinucleótidos derivadas de cada muestra original incluyen una etiqueta de identificador múltiplex (MID), en donde cada muestra original se correlaciona con una única MID de modo que se puede determinar la muestra original a partir de la cual se obtuvo cada molécula de polinucleótido etiquetada.

Description

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en detalle a continuación, por "base oscilante" se entiende una base de ácido nucleico que puede formar un par de bases con una primera base de nucleótido en una cadena complementaria de ácido nucleico, pero que, cuando se emplea como una cadena molde para la síntesis de ácido nucleico, lleva a la incorporación de una segunda base de nucleótidos diferente a la cadena de síntesis. Dichos monómeros y sus uniones internucleosídicas pueden ser de origen natural o pueden ser análogos de los mismos, por ejemplo, análogos de origen natural o no natural. Los análogos que no son naturales pueden incluir ácidos nucleicos peptídicos (los PNA, por ejemplo, como se describen en la patente de Estados Unidos 5.539.082), ácidos nucleicos bloqueados (los LNA, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos 6.670.461), uniones internucleosídicas de fosforotioato, bases que contienen grupos de unión que permiten la fijación de etiquetas, tales como fluoróforos, o haptenos y similares. Siempre que el uso de un oligonucleótido o polinucleótido requiera un procesamiento enzimático, tal como extensión por una polimerasa, ligamiento por una ligasa, o similares, un experto debe entender que los oligonucleótidos o polinucleótidos en estos casos no deben contener ciertos análogos de uniones internucleosídicas, restos de azúcar,
o bases en todas o algunas posiciones. Los polinucleótidos normalmente varían de tamaño desde algunas unidades monoméricas, por ejemplo, 5-40, cuando se denominan usualmente "oligonucleótidos", hasta varios miles de unidades monoméricas. Siempre que un polinucleótido u oligonucleótido esté representado por una secuencia de letras (mayúsculas o minúsculas), tal como "ATGCCTG", se entenderá que los nucleótidos están en orden 5 '→ 3', de izquierda a derecha y que "A" indica desoxiadenosina, "C" indica desoxicitidina, "G" indica desoxiguanosina, y "T" indica timidina, "I" indica desoxiinosina, "U" indica uridina, salvo que se indique otra cosa o se deduzca del contexto. A menos que se indique otra cosa los convenios de la terminología y de la numeración de átomos seguirán los descritos en Strachan and Read, Human Molecular Genetics 2 (Wiley-Liss, New York, 1999). Normalmente, los polinucleótidos comprenden los cuatro nucleósidos naturales (por ejemplo, desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxiguanosina, desoxitimidina para el ADN o sus análogos de ribosa para el ARN) unidos por enlaces de fosfodiéster; sin embargo, también pueden comprender análogos de nucleótidos no naturales, por ejemplo, que incluye bases modificadas, azúcares, o uniones internucleosídicas. Es claro para los expertos en la técnica que, cuando una enzima tiene requisitos específicos de sustrato de oligonucleótidos o polinucleótidos para su actividad, por ejemplo, ADN monocatenario, dúplex de ARN/ADN, o similares, entonces la selección de la composición apropiada para los sustratos de oligonucleótidos o polinucleótidos está efectivamente dentro de los conocimientos de un experto, especialmente con la guía de tratados tales como Sambrook et al., Molecular Cloning, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989), y referencias similares.
"Cebador" significa un oligonucleótido, ya sea natural o sintético, que, al formar un dúplex con un molde de polinucleótido, es capaz de actuar como un punto de iniciación de la síntesis de ácido nucleico y de extenderse desde su extremo 3' a lo largo del molde de modo que se forma un dúplex extendido. La secuencia de nucleótidos añadida durante el proceso de extensión está determinada por la secuencia del polinucleótido de molde. Normalmente, los cebadores se extienden por una ADN polimerasa. Los cebadores tienen generalmente una longitud compatible con su uso en la síntesis de productos de extensión del cebador, y normalmente están en el intervalo de entre 8 a 100 nucleótidos de longitud, tal como 10 a 75, 15 a 60, 15 a 40, 18 a 30, 20 a 40, 21 a 50, 22 a 45, 25 a 40, y así sucesivamente, más típicamente en el intervalo de entre 18-40, 20-35, 21-30 nucleótidos de largo, y cualquier longitud entre los intervalos indicados. Los cebadores típicos pueden estar en el intervalo de entre 10-50 nucleótidos de longitud, tal como 15-45, 18-40, 20-30, 21-25 y así sucesivamente, y cualquier longitud entre los intervalos indicados. En algunas realizaciones, los cebadores normalmente no tienen más de aproximadamente 10, 12, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 nucleótidos de longitud.
Los cebadores son normalmente de una sola cadena para una máxima eficiencia en la amplificación, pero pueden ser alternativamente de doble cadena. Si es de doble cadena, el cebador generalmente se trata en primer lugar para separar sus cadenas antes de ser utilizado para preparar productos de extensión. Esta etapa de desnaturalización se efectúa típicamente con calor, pero alternativamente se puede llevar a cabo utilizando un álcali, seguido por neutralización. Por lo tanto, un "cebador" es complementario de un molde, y se compleja mediante enlace de hidrógeno o hibridación con el molde para dar un complejo cebador/molde para la iniciación de la síntesis por una polimerasa, que se extiende por la adición de bases unidas covalentemente ligadas en su extremo 3' complementario al molde en el proceso de síntesis de ADN.
Un "par de cebadores" como se usa aquí, se refiere a los cebadores primero y segundo que tienen la secuencia de ácido nucleico adecuada para la amplificación a base de ácido nucleico de un ácido nucleico diana. Dichos pares de cebadores generalmente incluyen un primer cebador que tiene una secuencia que es la misma o similar a la de una primera porción de un ácido nucleico diana, y un segundo cebador que tiene una secuencia que es complementaria a una segunda porción de un ácido nucleico diana para proporcionar la amplificación del ácido nucleico diana o de un fragmento del mismo. La referencia a cebadores "primero" y "segundo" en este documento es arbitraria, a menos que se indique específicamente otra cosa. Por ejemplo, el primer cebador puede ser diseñado como un "cebador directo" (que inicia la síntesis de ácido nucleico a partir de un extremo 5' del ácido nucleico diana) o como un "cebador inverso" (que inicia la síntesis de ácido nucleico a partir de un extremo 5' del producto de extensión producido a partir de la síntesis iniciada a partir del cebador directo). Asimismo, el segundo cebador puede ser diseñado como un cebador directo o como un cebador inverso.
"Lectura" significa un parámetro o parámetros, que se miden y/o se detectan, que se pueden convertir en un número
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En ciertas realizaciones, la muestra de ácido nucleico a analizar se deriva de una única fuente (por ejemplo, un único organismo, virus, tejido, célula, sujeto, etc.), mientras que en otras realizaciones, la muestra de ácido nucleico es un conjunto de ácidos nucleicos extraídos de una pluralidad de fuentes (por ejemplo, un conjunto de ácidos nucleicos procedentes de una pluralidad de organismos, tejidos, células, sujetos, etc.), donde por "pluralidad" se entiende dos o más. Como tal, en ciertas realizaciones, una muestra de ácido nucleico puede contener ácidos nucleicos procedentes de 2 o más fuentes, 3 o más fuentes, 5 o más fuentes, 10 o más fuentes, 50 o más fuentes, 100 o más fuentes, 500 o más fuentes, 1000 o más fuentes, 5000 o más fuentes, 10.000 o más fuentes, 25.000 o más fuentes, etc.
En ciertas realizaciones, los fragmentos de ácido nucleico se van a reunir con fragmentos de ácido nucleico se derivan de una pluralidad de fuentes (por ejemplo, una pluralidad de organismos, tejidos, células, sujetos, etc.), donde por "pluralidad" se entiende dos o más. En tales realizaciones, los ácidos nucleicos derivados de cada fuente incluyen un identificador multiplex (MID) de tal modo que se puede determinar la fuente de la que se deriva cada fragmento de ácido nucleico marcado. En tales realizaciones, cada fuente de la muestra de ácido nucleico se correlaciona con un MID único, donde por MID único se entiende que cada MID diferente empleado se puede diferenciar de cualquier otro MID empleado en virtud de al menos una característica, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico del MID. Se puede utilizar cualquier tipo de MID, incluyendo pero sin limitarse a los descritos en la publicación de patente de EE.UU. 2007/0259357, también en tramitación, presentada el 22 de enero de 2007, y titulada "Nucleic Acid Analysis Using Sequence Tokens", así como en la patente de Estados Unidos 7,393,665, expedida el 1 de julio de 2008, y titulada "Methods and Compositions for Tagging and Identifying Polynucleotides” que describen etiquetas de ácidos nucleicos y su uso en la identificación de polinucleótidos. En ciertas realizaciones, un conjunto de MIDs empleados para marcar una pluralidad de muestras no necesita tener ninguna propiedad particular común (por ejemplo, Tm, longitud, composición de bases, etc.), ya que los métodos de marcado asimétrico (y muchos métodos de lectura de la marca, que incluyen pero no se limitan a la secuenciación de la marca o la medida de la longitud de la marca) pueden contener una amplia variedad de conjuntos de MID únicos.
Región de bases degeneradas (DBR) Algunos aspectos de la presente invención incluyen métodos y composiciones para determinar o estimar el número de moléculas de polinucleótidos individuales procedentes de la misma región genómica de la misma muestra original que han sido secuenciadas en una configuración o proceso particular de análisis de secuencias. En estos aspectos de la invención, una región de bases degeneradas (DBR) se une a las moléculas de polinucleótidos de partida que se secuencian posteriormente (por ejemplo, después de que se realicen ciertas etapas del proceso, por ejemplo, la amplificación y/o el enriquecimiento, por ejemplo, la PCR). Como se detalla a continuación, la evaluación del número (y en algunos casos, la combinación) de diferentes secuencias de DBR presentes en una ronda de secuenciación permite el establecimiento del número (o número mínimo) de diferentes polinucleótidos de partida que han sido secuenciados para un polinucleótido particular (o región de interés; ROI). Este número se puede utilizar, por ejemplo, para dar una medida estadística de la confianza en las identificaciones de alelos, aumentando de este modo la confianza en la realización de tales determinaciones de alelos (por ejemplo, cuando se identifican alelos homocigóticos). Las DBR permiten también la identificación de errores potenciales de secuenciación o amplificación que impactan negativamente en el análisis genético si no son detectados.
La secuenciación del ADN incluye típicamente un etapa de unión de un adaptador a los polinucleótidos en una muestra a secuenciar, donde el adaptador contiene un sitio del cebador de la secuenciación (por ejemplo, mediante ligamiento). Como se usa en el presente documento, un "sitio del cebador de secuenciación" es una región de un polinucleótido que es o bien idéntica o bien complementaria a la secuencia de un cebador de secuenciación (cuando está en la forma de cadena simple) o una región de cadena doble formada entre una secuencia del cebador de secuenciación y su complemento. La orientación específica de un sitio del cebador de secuenciación puede ser deducida por los expertos en la técnica a partir de las características estructurales del polinucleótido específico que contiene el sitio del cebador de secuenciación.
En adición al sitio del cebador de secuenciación, también está unida a los polinucleótidos una región de bases degeneradas (DBR), ya sea como parte del adaptador que contiene el sitio del cebador de secuenciación o de forma independiente (por ejemplo, en un segundo adaptador unido al polinucleótido). Se puede emplear cualquier método conveniente para la unión o adición de una DBR a los polinucleótidos. Una DBR es una región que puede tener una composición o secuencia de bases variable (que se puede considerar como "aleatoria") en comparación con otros polinucleótidos marcados de la muestra. El número de DBR diferentes en una población de polinucleótidos de una muestra dependerá del número de bases en la DBR, así como del número potencial de diferentes bases que pueden estar presentes en cada posición. Por lo tanto, una población de polinucleótidos que tiene unidas DBR con dos posiciones de bases, donde cada posición puede ser una cualquiera de A, C, G y T, tendrá potencialmente 16 DBR diferentes (AA, AC, AG, etc.). Las DBR pueden incluir por lo tanto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más bases, incluyendo 15 o más, 20 o más, etc. En ciertas realizaciones, la DBR tiene de 3 a 10 bases de longitud. Además, cada posición en una DBR puede tener una composición de bases diferente. Por ejemplo, una DBR de 4 bases puede tener cualquiera de las siguientes composiciones: NNNN; NRSN; SWSW; BDHV (véase la Tabla 1 a continuación para el código de nucleótidos según la IUPAC). Se observa además que en ciertas realizaciones, una base en una DBR
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ejemplo, utilizando métodos de síntesis de ADN bien conocidos en la técnica (véase las citas en la sección de definiciones anterior).
Una vez unidos a los polinucleótidos en la muestra parental, los polinucleótidos se pueden someter a un proceso adicional y, finalmente, se pueden secuenciar. Las etapas de proceso que se pueden realizar incluyen cualquier etapa de proceso que desee el usuario, por ejemplo, enriquecimiento, amplificación, y similares. En la etapa de secuenciación, se obtiene la secuencia de la DBR, así como la de una porción del polinucleótido (por ejemplo, que contiene una región de interés). Una vez que se obtienen las secuencias, se determina el número de diferentes DBR unidas a un polinucleótido de interés. Este número se puede emplear para determinar, o estimar, el número de diferentes polinucleótidos de interés procedentes de la muestra parental de partida, que se representan en los resultados de la secuenciación, donde en algunas realizaciones, el número determinado es el número mínimo de diferentes polinucleótidos de interés procedentes de la muestra parental de partida que se representan en los resultados de la secuenciación.
Considérese, por ejemplo, una DBR de dos bases que tiene una composición de bases NN (donde N es cualquier base de desoxinucleótido, es decir, A, G, C o T) empleada en la secuenciación de un locus para realizar una identificación de alelos para una muestra particular del sujeto (es decir, si un sujeto es homocigótico o heterocigótico en el locus). Aunque puede haber algunos sesgos desde la síntesis de oligonucleótidos, se puede esperar que haya 16 DBR diferentes en la población de adaptadores con aproximadamente la misma probabilidad (como se ha descrito antes). Cuando se identifica la posibilidad de identificación de un alelo homocigótico, la determinación del número de las DBR presentes en el ciclo de secuenciación se puede utilizar para determinar/estimar el número (o número mínimo) de moléculas de polinucleótidos que fueron secuenciadas en realidad (y por tanto el número de las que fueron amplificadas durante la etapas de proceso).
Para genomas diploides, la identificación de alelos (en el caso ideal o teórico) puede ser modelada por la distribución binomial. Dado que las dos copias de alelos (X e Y) difieren en algún sitio, la probabilidad de observar todos X o todos Y viene dada por la fórmula (½)c, donde c es el número de observaciones (lecturas) del sitio. Si se observa X diez veces en un sitio (y no se observa Y), se puede decir que probablemente la muestra es homocigótica para el tipo X. Por lo tanto, la probabilidad de un error en esta determinación es (½)10 (algo menos de uno en mil).
Los experimentos de esta invención demuestran que bajas cantidades de ADN en la fase inicial de preparación de la muestra pueden dar lugar a una alta cobertura de lecturas que corresponden todas a un alelo, y que esto puede ocurrir muchas más veces de lo que se debería esperar de acuerdo con la distribución binomial. Esto es debido a la amplificación de algunas moléculas de ADN (o incluso de una sola molécula) que da como resultado un gran número de lecturas derivadas de un locus genético en un único cromosoma (es decir, sólo uno de los dos cromosomas diploides realmente presentes en la muestra de interés). El resultado de esto es que el error como una función de la cobertura se desvía totalmente del error binomial pronosticado.
El uso de una DBR como se describe aquí aumentará la confianza en la realización de identificaciones de alelos procedentes de muestras que tienen cantidades limitadas de ADN. Por ejemplo, si 16 lecturas de secuenciación de un alelo de un locus genético contienen todas la secuencia GA de DBR, entonces es probable que todas estas lecturas procedan de la misma molécula de polinucleótido parental (y por lo tanto no está justificada una identificación de un alelo homocigótico). Sin embargo, si las 16 lecturas de secuenciación tienen cada una, una secuencia de DBR diferente, se puede realizar una identificación homocigótica con más confianza, ya que cada lectura proviene de una molécula de polinucleótido parental diferente.
Se observa aquí que en muchas realizaciones, no es posible llegar a la conclusión de que los polinucleótidos que tienen secuencias de DBR idénticas se derivan de la misma molécula de polinucleótido parental, ya que múltiples DBR idénticas pueden estar presentes en los polinucleótidos unidos a la DBR. Por ejemplo, si una población de adaptadores que contiene una DBR de dos bases N se utiliza para marcar una muestra que contiene más de 16 polinucleótidos, un subconjunto de los polinucleótidos marcados tendrá idénticas DBR, y por lo tanto no será posible determinar que sus secuencias fueron derivadas de diferentes moléculas del polinucleótido parental.
Una manera a modo de ejemplo para determinar más exactamente el número real de moléculas de partida o moléculas parentales debería ser aumentar la degeneración de las DBR (es decir, aumentar el número de secuencias únicas en la DBR utilizadas para marcar la muestra particular de interés) de modo que es probable que cada molécula única tenga una DBR diferente. En cualquier caso, en métodos a modo de ejemplo, se puede utilizar el número de DBR observadas o también la distribución de probabilidad del número esperado de lecturas para producir muy probablemente el número observado de las DBR.
Cuando se calculan estimaciones de si una identificación de alelo particular es un heterocigoto o un homocigoto, se puede crear/emplear una función apropiada L(r,v) que restituye la probabilidad de un genotipo con las lecturas de referencia r y variante v. Cuando se emplean las DBR como se describe aquí, se puede utilizar una función modificada para el cálculo de los estimados L(r',v'), donde r' es el número de DBR únicas para la lectura de referencia y v' es el número de DBR únicas para la lectura variante. Se puede emplear cualquier función conveniente
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presentes en cantidades limitantes y el primero o primeros ciclos de la PCR se llevan a cabo a la Tm más alta de tal modo que sólo los cebadores que contienen DBR se hibridan y participan en la síntesis del ácido nucleico. Debido a que los cebadores que contienen DBR están presentes en cantidades limitantes, se utilizarán sólo en el primero o primeros ciclos de la PCR. La realización de los ciclos de PCR restantes a una Tm más baja permitirá una amplificación adicional mediante el segundo conjunto de cebadores de la PCR que no incluyen las DBR pero que replicarán las DBR procedentes de los productos del primero o primeros ciclos (como se ha descrito antes).
Se observa que hay muchas combinaciones diferentes de cebadores de la PCR y condiciones de amplificación que se pueden emplear para llevar a cabo la amplificación por PCR con las DBR descrita anteriormente. Por ejemplo, tales reacciones pueden incluir 3 cebadores, en donde el cebador 1 (cebador directo específico para el polinucleótido diana y que contiene una DBR y una secuencia de cebado genérico en 5') y el cebador 2 (cebador específico inverso para el polinucleótido diana y sin ninguna DBR) se utilizan para amplificar la diana en el primero o primeros ciclos, y el cebador 3 (cebador directo específico para la secuencia de cebado genérico en 5' del cebador 1) y el cebador 2 se utilizan para los ciclos restantes.
Se observa, además, que el marcado de los dos extremos de un producto de la PCR con una DBR (es decir, donde ambos cebadores utilizados en el primero/primeros ciclos incluyen una DBR) puede proporcionar una mayor confianza en la estimación del número de polinucleótidos de partida amplificados. Se observa que si se utilizan más de 2 ciclos de PCR para unir las DBR, entonces es necesario tomar precauciones adicionales durante el análisis de los datos cuando se utilizan las DBR para rastrear la molécula molde inicial (o de partida) a partir de la cual se amplificaron los productos. Esto es debido a la posibilidad de que en el tercer ciclo de la PCR, un cebador de PCR que tiene una DBR se puede unir a un sitio de DBR existente en un producto de la PCR generado previamente, introduciendo de este modo una nueva secuencia de DBR. Como se indica a continuación, el análisis teórico de los tres primeros ciclos de PCR demuestra que es posible rastrear el linaje de una molécula. Se observa que el análisis que sigue podría ser utilizado teóricamente para cualquier número de ciclos de PCR para la adición de las secuencias de DBR, aunque la profundidad de la secuenciación tendría que ser suficiente.
El método descrito a continuación permite lecturas de una a un grupo de secuencias después de >1 ciclo de adición de DBR utilizando cebadores de PCR que contienen DBR. La Tabla I muestra cada uno de los productos de la PCR generados en cada uno de tres ciclos de PCR a partir de un único molde de doble cadena (el molde que tiene en la parte superior la cadena A y en la parte inferior la cadena B, como se señala en el ciclo 0 de la Figura 3). En la Tabla I, se muestra cada cadena presente en cada ciclo (señalada con las letras A a P) junto con su respectiva cadena molde (es decir, la cadena que sirvió como molde durante la síntesis de la cadena indicada), y la DBR 5' y la DBR 3' presentes en la cadena, si hay alguna (indicadas con los números 1 a 14). Por "DBR 5'" se entiende una secuencia de DBR que fue incorporada como parte de un cebador de PCR. Por "DBR 3'" se entiende una secuencia complementaria de una secuencia DBR 5' (es decir, generada como resultado de la extensión del cebador a lo largo de una secuencia existente de DBR 5'). En el ciclo 3, se puede ver que se puede producir una sobreescritura de DBR (indicada en la columna más a la derecha; véase, por ejemplo, las cadenas K y N producidas en el ciclo 3).
Tabla I. Marcado de DBR en los ciclos 0 a 3 de una reacción de PCR para un único molde de doble cadena (A y B). Ciclo
Cadena DBR 5' nº DBR 3' nº Cadena molde Sobreescritura de DBR
Ciclo 0
A - - -
B
- - -
Ciclo 1
A - - -
B
- - -
C
1 - A
D
2 - B
Ciclo 2
A - - -
B
- - -
C
1 - A
D
2 - B
E
3 - A
F
4 1 C
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G
5 2 D
H
6 - B
Ciclo 3
A - - -
B
- - -
C
1 - A
D
2 - B
E
3 - A
F
4 1 C
G
5 2 D
H
6 - B
I
7 - A
J
8 3 E
K
9 4 F sobreescritura de DBR 1 con DBR 9
L
10 1 C
M
11 2 D
N
12 5 G sobreescritura de DBR 2 con DBR 12
O
13 6 H
P
14 - B
La Tabla I anterior y la Figura 3 muestran las cadenas que se han acumulado durante todo el proceso de la PCR. (Debe observarse el arrastre de las cadenas A y B del ciclo 0 a los ciclos 1, 2, y 3; el arrastre de las cadenas C y D del ciclo 1 a los ciclos 2 y 3; etc.).
Dada la suficiente profundidad de secuenciación, las DBR se pueden utilizar para rastrear la molécula de origen, incluso si se ha producido una sobreescritura de la DBR. Por ejemplo, la cadena K tiene DBR 5' nº 9 y DBR 3' nº 4. La DBR nº 4 se comparte con la cadena F, que tiene DBR 5' nº 4 y DBR 3' nº 1. La DBR nº 1 se comparte con la cadena C. Por lo tanto las cadenas K y F se derivan originalmente de la cadena C. Del mismo modo, la cadena N tiene DBR 5' nº 12 y DBR 3' nº 5. La DBR nº 5 se comparte con la cadena G, que tiene DBR 5' nº 5 y DBR 3' nº 2. La DBR nº 2 se comparte con la cadena D. Por lo tanto las cadenas N y G se derivan originalmente de la cadena D.
Como se ha expuesto anteriormente, los cebadores de la PCR que contienen DBR se eliminan después de los primeros ciclos (por ejemplo, después de la finalización del ciclo 3 como se muestra en la Tabla 1).
La Figura 3 muestra un esquema para los 2 primeros ciclos de PCR para un único molde de cadena doble como se muestra en la Tabla I. En el ciclo 0, sólo las cadenas molde de doble cadena están presentes, es decir, la cadena A de la parte superior y la cadena B de la parte inferior. Obsérvese que la dirección de las flechas sobre cada cadena en la Figura 3 indica la dirección 5' a 3'. En el primer ciclo de la PCR (ciclo 1), se producen 2 productos mediante el par de cebadores de la PCR (ambos miembros del par de cebadores incluyen una secuencia de DBR), la primera cadena (C) que tiene DBR nº 1 ("1" como se muestra en la figura) y la segunda (D) que tiene DBR2 ("2" como se muestra en la figura). En el segundo ciclo de la PCR (ciclo 2), los cuatro moldes (A, B, C y D) producen 4 productos (E, F, G y H), que tiene cada uno, una subsiguiente DBR unida (DBR nº 3, nº 4, nº 5 y nº 6, respectivamente). Se debe observar que los productos generados a partir de los moldes C y D (F y G) tienen ahora las DBR en ambos extremos. El ciclo 3 (que no se muestra en la Figura 3) utiliza entonces los 8 moldes del ciclo 2 para producir 8 productos, que tiene cada uno DBR adicionales unidas (véase los productos que se muestran en la Tabla I). El ciclo 3 es el primer ciclo en el que puede ocurrir una sobreescritura de la DBR (es decir, el cebado y la extensión de los moldes F y G con los cebadores de PCR marcados con subsiguientes DBR sobrescribirán la DBR nº 1 y la DBR nº 2; estas se muestran en la Tabla I como cadenas K y N).
En el análisis de las DBR de polinucleótidos en los que es posible la sobreescritura de las DBR, las lecturas se agrupan de acuerdo con las secuencias 5' y 3' de DBR y se rastrea el linaje de la molécula parental.
Como se desprende de la descripción anterior, la DBR es útil (1) para la identificación de los errores de la PCR que se presentan durante los primeros ciclos y (2) para la exactitud de la determinación de la identificación/número de copias de un alelo. Para la identificación de errores, es claramente permisible agrupar sucesos de cebado independientes. La exactitud de los cálculos de la identificación de alelos aumentó ligeramente en complejidad dado que los sucesos de cebado no representan necesariamente moléculas de partida independientes. Sin embargo, es una suposición razonable que los sucesos de cebado son igualmente probables en cualquier alelo, y por lo tanto este análisis es útil para mejorar la exactitud de la identificación de alelos.
Para copias muy bajas del molde inicial, el uso de múltiples ciclos de adición de DBR puede ser ventajoso. Por ejemplo, a concentraciones muy bajas de ADN no se podría recuperar un número suficiente de las DBR para dar un
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la realización de identificaciones de alelos, la corrección de errores de secuencias, los análisis relativos y cuantitativos de la expresión génica, y similares. Se observa que al analizar polinucleótidos en una muestra conjunta de acuerdo con aspectos de la presente invención, es importante mantener tanto los dominios de MID como los dominios de DBR en cada etapa del flujo de trabajo que se emplea, ya que la pérdida de uno u otro dominio tendrá un impacto negativo sobre la confianza en los resultados obtenidos.
Se observa, además, que el uso de los dominios de MID y DBR en el análisis genético es especialmente potente cuando se combina con plataformas de secuenciación de nueva generación (NGS), muchas de las cuales proporcionan datos de secuencias para cada polinucleótido individual presente en la muestra a ser secuenciada. En contraste con los métodos convencionales de secuenciación en los que los clones individuales de los polinucleótidos se secuencian de forma independiente, las plataformas de secuenciación de nueva generación proporcionan secuencias de múltiples polinucleótidos diferentes en una muestra de forma simultánea. Esta diferencia permite que se hagan análisis estadísticos específicos de la muestra que no están limitados por tener que clonar y secuenciar de forma independiente cada polinucleótido. Por lo tanto, los análisis del dominio MID/DBR descritos en la presente memoria son sinérgicos con las plataformas de secuenciación de nueva generación, proporcionando mejores métodos estadísticos para analizar las cantidades muy grandes de datos de las secuencias de las muestras conjuntas.
Kits y sistemas La descripción proporciona también kits y sistemas para la práctica de los métodos propuestos, es decir, para el uso de las DBR para determinar el número (o mínimo número), de diferentes polinucleótidos de partida que han sido secuenciados para un polinucleótido particular. Como tales, los sistemas y kits pueden incluir polinucleótidos que contienen las DBR (por ejemplo, adaptadores), así como cualquier otro dominio funcional de interés como se describe en el presente documento (por ejemplo, sitios de los cebadores de secuenciación, MID, secuencias reflejas, etc.). Los sistemas y kits pueden incluir también reactivos para llevar a cabo todas las etapas para unir los adaptadores a los polinucleótidos de una muestra parental, preparar una muestra parental para la unión adaptador/DBR, y/o reactivos para llevar a cabo las reacciones de secuenciación (por ejemplo, ligasas, enzimas de restricción, nucleótidos, polimerasas, cebadores, cebadores de secuenciación, dNTPs, ddNTPs, exonucleasas, etc.). Los diversos componentes de los sistemas y kits pueden estar presentes en recipientes separados o ciertos componentes compatibles pueden ser pre-reunidos en un único recipiente, según se desee.
Los sistemas y kits propuestos pueden incluir también uno o más de otros reactivos para preparar o procesar una muestra de ácido nucleico de acuerdo con los métodos propuestos. Los reactivos pueden incluir una o más matrices, disolventes, reactivos de preparación de muestras, tampones, reactivos de desalación, reactivos enzimáticos, reactivos desnaturalizantes, donde los estándares de calibración, tales como los controles positivos y negativos se pueden proporcionar también. Así pues, los kits pueden incluir uno o más recipientes tales como viales o frascos, conteniendo cada recipiente un componente separado para llevar a cabo una etapa de procesamiento o preparación de una muestra según la presente invención.
Además de los componentes mencionados antes, los kits propuestos incluyen típicamente además instrucciones para utilizar los componentes del kit para practicar los métodos propuestos, por ejemplo, para emplear las DBR como se ha descrito anteriormente. Las instrucciones para la práctica de los métodos de la invención generalmente se registran en un medio de registro adecuado. Por ejemplo, las instrucciones se pueden imprimir sobre un sustrato, tal como papel o plástico, etc. Como tales, las instrucciones pueden estar presentes en los kits como un prospecto, en el etiquetado del recipiente del kit o de sus componentes (es decir, asociado con el empaquetado o subempaquetado), etc. En otros kits, las instrucciones están presentes como un archivo electrónico de almacenamiento de datos presente en un medio de almacenamiento legible por un ordenador adecuado, por ejemplo, CD-ROM, disquete, etc. Todavía en otras realizaciones, las instrucciones reales no están presentes en el kit, pero se proporcionan medios para obtener las instrucciones de una fuente remota, por ejemplo, a través de Internet. Un ejemplo de esta realización es un kit que incluye una dirección web en la que se pueden ver las instrucciones y/o de la que se pueden descargar las instrucciones. Al igual que con las instrucciones, este medio para obtener las instrucciones se registra en un sustrato adecuado.
Además de la base de datos, programación e instrucciones propuestas, los kits pueden incluir también una o más muestras control y reactivos, por ejemplo, dos o más muestras control para utilizar en el ensayo del kit.
EJEMPLOS
Métodos
Dos muestras idénticas de ADN genómico de ratón se marcaron con adaptadores. Una de las muestras utilizó un adaptador que tiene una región sintetizada de forma redundante que consiste en 7 bases (RYBDHVB), cada una de las cuales podría ser una de dos bases (para las posiciones R e Y) o de tres bases (para las posiciones B, D, H o V) (o un total de 972 secuencias diferentes), seguida por las bases ACA; la segunda muestra utilizó un adaptador que tiene una región sintetizada de forma redundante que consiste en 7 bases (RYBDHVB), cada una de las cuales podría ser una de dos bases (para las posiciones R e Y) o de tres bases (para las posiciones B, D, H o V) (o un total
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