FI110436B - Uusia proteaaseja - Google Patents

Description

x 110436

Uusia proteaaseja - Nya proteaser

Keksintö koskee Bacillus lajin kannoista peräisin olevia 5 pesuaineproteaaseja. Tarkemmin keksintö koskee uutta emäk sistä proteaasia, joka on peräisin Bacillus sp. TY 145 -kannasta. Lisäksi keksintö koskee menetelmää proteaasin valmistamiseksi, proteaasin käyttöä puhdistuaine-entsyyminä ja puhdistuainekoostumuksia, jotka sisältävät keksinnön mu-10 kaista proteaasia.

Puhdistuaine-entsyymejä on markkinoitu enemmän kuin 20 vuoden ajaan ja ne ovat hyvin vakiintuneita tavallisina pesuaine-ainesosina sekä jauhe- että nestepesuaineissa 15 kaikkialla maailmassa. Suuntauksen ollessa kohti alemmassa lämpötilassa suoritettavia pesuja kohti, pesuaine-entsyymin kukulus on kasvanut viimeisten vuosien aikana. Entsyymit, joita on käytetty pesuformulatoioissa, käsittävät proteaa-sit, lipaasit, amylaasit, sellulaasit kuten myös muut ent-20 syymit tai niiden seokset. Kaupallisesti tärkeimpiä ovat proteaasit.

.'.j Pesuaineproteaasit on kehitetty eristämällä proteaaseja, • · joita on löydetty luonnosta, mitä on seurannut niiden tes-’.· ! 25 taaminen pesuaineformulaatioissa. Useimmat pesuaineproteaa-! sit saadaan Bacillus-suvun jäsenistä. Tällä hetkellä mark- kinolle tulee uuden tyyppisiä proteaaseja, tarjoten sen : ·* mahdollisuuden, että saadaan parempi kustannus/tehokkuus- V ; suhde erilaisissa spesifioiduissa olosuhteissa.

30 : ' : Esimerkkejä kaupallisista proteaasituotteista ovat ALCALA- SE™, ESPERASE™ ja SAVINASE™, kaikki saatavissa firmasta Novo Nordisk A/S, Tanska. Nämä ja samanlaiset entsyymituot-**·_ teet muista kaupallisista lähteistä ovat aktiivisia pesu- '35 aineliuoksissa, so. pH-arvoissa alueella 8-11 ja sekvest- *:··· rausaineiden, pinta-aktiivisten aineiden ja valkaisuainei- ·/'; den kuten natriumperboraatti läsnäollessa. ALCALAS E™ -pro teaasia tuottaa Bacillus licheniformis -lajin kannat.

2 110436 ESPERASE™ ja SAVINASE™ -proteaasit saadaan kasvattamalla alkalofiilisiä Bacillus-kantoja.

Esillä olevan keksinnön sisällä oleva kohde on tarjota 5 uusia pesuaineproteaaseja, joilla on parannettu kustannus /tehokkuussuhde.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti saadaan uusia pesuaineproteaase ja.

10

Ensimmäisessä näkökulmassa keksintö tarjoaa proteaasin, jonka näennäismolekyylipaino on 38 kD, pl noin 8,8, pH-op-timi alueella pH 8 - 11 (25 °C:ssa), lämpötilaoptimi alueella 45-55 °C (pH 9,5:ssä), ja immunokemialliset ominai-15 suudet, jotka ovat identtiset tai osittain identtiset Bacillus sp. TY 145, NCIMB nro 40339:sta johdetun proteaasin ominaisuuksien kanssa. Spesifisemmässä näkökulmassa prote-aasi on saaatavilla Bacillus sp. TY 145 -kannasta. Vielä spesifisemmässä näkökulmassa proteaasi on saatavilla Bacil-20 lus sp. TY 145:sta, NCIMB nro 40339:sta, tai sen mutantista tai variantista.

: Toisessa näkökulmassa keksintö tarjoaa Bacillus sp. TY

/ 145 -kannan eristetyn biologisesti puhtaan kasvuston. Spe- ! 25 sifisemmässä näkökulmassa tarjotaan Bacillus sp. TY 145, * ; NCIMB nro 40339 -kanta, tai sen mutantti tai variantti.

• ·’ Kolmannessa näkökulmassa keksintö tarjoaa menetelmän prote- * aasin valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista

30 se, että kasvatetaan proteaasia tuottavaa Bacillus sp. TY

145 -kantaa sopivassa ravintoelatusaineessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja, mitä seuraa halutun entsyymin talteenottaminen. Spesifisemmässä nä-’···"_ kökulmassa viljellään Bacillus sp. TY 145, NCIMB nro 40339 *35 tai sen mutanttia tai variantia.

Neljännessä näkökulmassa patenttivaatimusten kohteena on entsyymin käyttö pesuaine-entsyyminä. Spesifisemmässä näkö 110436 3 kulmassa keksintö tarjoaa pesuainekoostumuksen ja pesuaine-lisäaineen, joka sisältää proteaasia.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa pa-5 tenttivaatimuksissa.

Esillä olevaa keksintöä valaistaan edelleen viittaamalla liitteenä oleviin piirroksiin, joissa: 10 kuva 1 esittää suhteen lämpötilan ja keksinnön mukaisen entsyymin proteolyyttisen aktiivisuuden välillä (entsyymi-valmiste saatu esimerkin 1 mukaisesti, kaseiinin ollessa substraattina ja pH 9,5:ssä); ja kuva 2 esittää suhteen pH:n ja keksinnön mukaisen entsyymin 15 proteolyyttisen aktiivisuuden välillä (entsyymivalmiste saatu esimerkin 1 mukaisesti, kaseiinin ollessa substraattina ja 25 °C:ssa).

Mikro-organismi 20 Keksinnön mukainen uusi mikro-organismi, joka kykenee tuot tamaan keksinnön mukaista entsyymiä, eristettiin Etelänapa-mantereen maaperänäytteestä. Bacillus sp. TY145 on talletet-tu Budapestin sopimuksen mukaisesti talletuslaitokseen NCIMB numerolla 40339.

25 Tämän keksinnön mukainen mikro-organismi on aerobinen, « itiöitä muodostava bakteeri, joka kuuluu sukuun Bacillus.

• Morfologisesti sitä voidaan kuvata liikkuvina nauhoina, joi- ' den halkaisija on 0,7 - 0,9 mikronia, ja pituudeltaan 2-3 30 mikronia. Itiöt ovat pyöreistä ellipsoideihin, eivät laajen- na itiöpesäkettä, keskeisestä loppua edeltävään. Optimiläm-‘ · pötila kasvulle on 30-37 °C ja optimi pH kasvulle on 7-9, ei .·* : kasvua pH:ssa 9,7, eikä kasvua 50 °C:ssa. Mikro-organismi ^ ! muodostaa kuivia, valkoisia kasvustoija, joilla on hiusmai- . 35 siä ulokkeita ravinne agar-levyillä, eikä havaittu pigmentin • V diffuusiosta agariin.

Mikro-organismien kasvatus

Keksinnön mukaisia mikro-organismeja voidaan kasvattaa 40 aerobisissa olosuhteissa ravintoelatusaineessa, joka si- 4 110436 sältää assimiloitavissa olevaa hiiltä ja typpeä yhdessä muiden oleelliseten ravinteiden kanssa, elatusaineen koostuessa tunnetun tekniikan periaatteiden mukaisesti.

5 Sopivia hiililähteitä ovat hiilihydraatit kuten sakkaroosi, glukoosi ja tärkkelys, tai hiilihydraattia sisältävät aineet kuten soijapavut, puuvillansiemenjauho, maissijyvät, mallas, riisi ja durra. Hiilihydraattikonsentraatio, joka saadaan väliaineeseen voi vaihdella suuresti, esimerkiksi 10 jopa ylös 25 %:iin ja alas 1-5 %:iin, mutta tavallisesti 8- 10 % on sopiva, prosenttiosuuksien ollessa laskettu glukoo-siekvivalentteina.

Ravinne-elatusaineessa oleva typpilähde voi olla epäorgani-15 nen ja/tai orgaaninen luonteeltaan. Sopivia epäorgaanisia typpilähteitä ovat nitraatit ja ammoniumsuolat. Orgaanisten typpilähteiden joukosta useita käytetään säännöllisesti fermentointiprosesseissa. Havainnollistavia esimerkkejä ovat soijapapujauho, puuvillansiemenjauho, maapähkinäjauho, 20 kaseiini, vilja, viljan liotus neste, hiivauute, urea ja albumiini. Lisäksi ravinne-elatusaineen pitäisi sisältää myös tavallisia hivenaineita.

Tämän keksinnön uudet Bacillus-lajit ovat heikosti alkalo- 1. 1 25 tiilisiä. Siten kasvatus suoritetaan edullisesti heikosti • · · * ; emäksisissä pH-arvoissa, jotka voidaan savuttaa lisäämällä sopivia puskureita kuten natriumkarbonaatti, pH 9,0, kas- • · · : ·' vuelatusaineen sterilisoinnin jälkeen. Tankkifermentoreissa • · · v : kasvatusta varten on tarpeellista käyttää keinotekoista 30 ilmastusta. Ilmastuksen nopeus on samanlainen, jota käyte-tään tavanomaisessa tankkifermentoinnissa.

Fermentoinnin jälkeen nestemäiset entsyymikonsentraatit voidaan tuottaa poistamalla raaka-aine liemestä tai halut-’35 taessa liemen konsentroinnilla haihduttamalla alhaisessa ·.·: lämpötilassa tai käänteisosmoosilla. Lopuksi konsentraat- tiin voidaan lisätä säilöntäaineita.

5 110436

Kiinteät entsyymivalmisteet voidaan valmistaa puhdistetusta ja/tai konsentroidusta liemestä saostamalla suoloilla kuten Na2S04 tai veteen sekoittuvilla liuottimilla kuten etanoli tai asetoni, veden poistamista liemestä sopivilla kuivaus-5 menetelmillä kuten ruiskukuivaus voidaan käyttää.

Proteolvvttisen aktiivisuuden analyysi

Proteolyyttinen aktiivisuus määritetään kasiini substraattina. Yksi kaseiiniproteaasiyksikkö, Casein Protease Unit 10 (CPU) määritetään sen entsymin määränä, joka vapauttaa 1 mM

primaarisia aminoryhmiä (määritettynä vertailuna seriinis-tandardin kanssa) minuuttia kohti standardiolosuhteissa, so. 30 minuutin inkubointi 25 °C:ssa ja pH:ssa 9,5. Kansio AF 228, kuvaten analyyttisen menetelmän, on saatavuilla 15 pyydettäessä firmasta Novo Nordisk A/S, Tanska, joka kansio sisällytetään tähän viitteenä.

Entsyymi

Keksinnön mukainen entsyymi on uusi pesuaineproteaasi. Se 20 on emäksinen proteaasi, jota saadaan kasvattamalla keksinnön mukaista mikro-organismia, edullisesti Bacillus sp. TY145, NCIMB nro 40339, tai sen mutanttia tai varianttia, sopivassa ravintoelatusaineessa, joka sisältää hiili- ja :v. typpilähteitä ja epäorgaanisia suoloja. Entsyymi voidaan 25 saada myös yhdistelmä-DNA-tekniikalla.

Keksinnön mukainen proteaasi voidaan kuvata seuraavilla • ·' tunnuspiirteillä.

• · 30 Fvsikaalis-kemialliset ominaisuudet • Molekyylipaino 38 kD, määritettynä SDS-PAGElla. pl 8,8 mää-

:T: ritettynä isoelektrisellä fokusoimisella LKB Ampholine® PAG

.1. -levyillä. Proteaasiaktiivisuutta inhiboi PMSF, α-1-antit- '**, rypsiini ja kalkkunan munanvalkuaisen proteinaasi-inhibiit- *35 tori. EDTA ja soijapapuproteiini-inhibiittori eivät vaikut- *:*·: taneet proteaasiaktiivisuuteen.

6 110436 Lämpötila-aktiivisuus-suhde määritettiin kaseiini substraattina. Edellä kuvattua proteolyyttisen aktiivisuuden analyysiä käytettiin sellaisella muutoksella, että inkubaa-tiolämpötilaa vaihdeltiin 15-70 °C intervallein. Tulos on 5 esitetty kuvassa 1. Entsyymillä on proteolyyttistä aktiivisuutta lämpötiloissa alle 15 °C:sta yli 70 °C:een, ja läm-pötilaoptimi rajoissa 45-55 °C, noin 50 °C.

Aktiivisuuden riippuvuus pH:sta määritettiin samalla mene-10 telmällä käyttämällä puskureita, jotka säädettiin edeltä määrättyihin pH-arvoihin pH-alueella 6-11. Tulokset on esitetty kuvassa 2. Entsyymillä on proteolyyttistä aktiivisuutta pH-arvoissa alle 6:sta yli 11 reen, pH-optimin ollessa alueella pH 8 - pH 11, noin pH 10.

15

Keksinnön mukainen proteaasi on stabiili 60 minuuttia 40 °C:ssa ja pesuolosuhteissa eurooppalais- tai amerikkalaistyyppisissä pesuaineissa.

20 Immunokemialliset ominaisuudet

Immunokemialliset ominaisuudet voidaan määrittää immunolo-gisesti ristireaktio-identitettikokeilla. Identiteettiko-.·. : keet voidaan suorittaa hyvin tunnetulla Ouchterlony kak- :*.·] soisimmunodifuusiomenettelyllä tai kaksoisristi-immunoelek- ! 25 troforeesilla teoksen Axelsen, N. H.; Handbook of Immuno- * ; precipitation-in-Gel Techniques; Blackewell Scientific Pub- lications (1983), luvut 5 ja 14, mukaisesti. Termit "anti- • ·' geeninen identtisyys" ja "osittainen antigeeninen identti- ; syys" kuvataan samassa kirjassa, luvut 5, 19 ja 20.

30 i Monospesifinen antiseerumi kehitettiin edellä kuvatun mene- telmän mukaisesti immunisoimalla kaniineja keksinnön mukai-sella puhdistetulla proteaasilla. Immunogeeni sekoitettiin ·’, Freundin apuaineen kanssa ja injektoitiin ihonalaisesti ka- '35 niineihin joka toinen viikko. Antiseerumia saatiin 8 viikon ·:*·; kokonaisimmunisaatiojakson jälkeen ja immunoglobuliini val- mistettiin siitä kuten on kuvattu viitteessä N. H. Axelsen, edellä.

7 110436

Ouchterlony-kaksoisimmunodiffuusiokokeet eivät osoittaneet ristireaktiota keksinnön mukaisen proteaasin ja tunnettujen emäksisten seriiniproteaasien ALCALASE™, ESPERASE™ ja SA-VINASE™, subitilisin BPN' ja KAZUSASE™ välillä.

5

Pesuainekoostumukset

Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi käsittää yhtä tai useampaa pinta-aktiivista ainetta, joka voi olla tyypiltään anionista, ionitonta, kationista, amfoteerista tai kaksois-10 ionista tai näiden seosta. Tyypillisiä esimerkkejä anioni-sista pinta-aktiivisista aineista ovat lineaariset alkyyli-bentseenisulfonaatit (LAS), alkyylisulfaatit (AS), aflaole-fiinisulfonaatit (AOS), alkoholietoksisulfaatit (AES) ja luonnollisten rasvahappojen alkalimetallisuolat. Esimerkke-15 jä ionittomista pinta-aktiivisista aineista ovat alkyylipo- lyetyleeniglykolieetterit, nonyylifenolipolyetyleeniglyko-lieetterit, sakkaroosin ja glukoosin rasvahappoesterit, po-lyetoksyloitujen alkyyliglukosidien esterit.

20 Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi sisältää myös muita pesuaine-ainesosia, jotka tunnetaan tekniikan tasossa, kuten bilderit, valkaisuaineet, valkaisuaktivaattorit, : korroosionestoaineen, sekvesterointiaineet, sakkauman uu- delleenkerrostumisen estoaineet, parfyymit, entsyymien ja '.. '. 25 valkaisuaineiden stabilisaattorit, formulaatiohapot, opti- ’ ; set kirkastajat, vaahdon voimistajat, kelatointiaineet, · 1 täyteaineet, kankaan pehmentäjät jne. Keksinnön mukainen t · · : ·' pesuainekoostumus voidaan formuloida oleellisesti kuten J.

· Falbe on kuvannut [Falbe, J.; Surfactants in Consumer 30 Products. Theopry, Technology and Application; Springer • · < • Verlag 1987, katso erityisesti osa, jonka otsikkona on "Frame formulations for liquid/powder heavy-duty detergents"].

» · 35 Tällä hetkellä ollaan siinä käsityksessä, että keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi sisältää entsyymivalmistetta : : määrässä, joka vastaa 0,0005-0,5 CPU:ta proteolyyttistä entsyymiä pesuliuoksen litraa kohti.

8 110436

Keksinnön mukaiset pesuainekoostumuset voidaan formuloida mihin tahansa tarkoituksen mukaiseen muotoon, kuten jauheet, nesteet jne.

5 Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi edullisesti sisältää yhtä tai useampaa muuta entsyymiä, esimerkiksi lipaase-ja, amylaaseja, sellulaaseja, oksidaaseja ja/tai peroksi-daaseja, jotka tavallisesti kuuluvat pesuainekoostumuksiin.

10 Keksinnön mukaiset proteaasit voidaan sisällyttää pesuaine-koostumukseen lisäämällä erillisiä lisäaineita, jotka sisältävät pesuaineproteaasin, tai lisäämällä yhdistetty lisäaine, joka käsittää erilaisia pesuaine-entsyymejä.

15 Keksinnön mukainen lisäaine voidaan formuloida esimerkiksi rakeiksi, nesteiksi, lietteiksi jne. Edullisia pesuaineli-säaineformulaatioita ovat pölyämättömät rakeet, nesteet, erityisesti stabiloidut nesteet, lietteet tai suojatut entsyymit. Pölyämättömät rakeet voidaan tuottaa esimerkiksi 20 GB-patenttijulkaisun nro 1 362 365 tai US-patentin nro 4 106 991 mukaisesti ja voidaan mahdollisesti päällystää tekniikan tason tunnetuilla menetelmillä. Pesuaine-entsyy-·*·.· mit voidaan sekoittaa ennen rakeistusta tai sen jälkeen.

:·.·. Nestemäiset entsyymi valmisteet voidaan esimerkiksi stabi- ;*.·.25 loida lisäämällä polyolia kuten esimerkiksi propyleenigly- | kolia, sokeria tai sokerialkoholia, maitohappoa tai boori- happoa, vakiintuneiden menetelmien mukaisesti. Muut entsyy- • · · \ mistabilisaattorit ovat hyvin tunnettuja tekniikan tasossa.

» * · *·'’ Suojatut entsyymit voidaan valmistaa EP-patenttijulkaisussa 30 238216 esitetyn menetelmän mukaisesti.

» · · t · : : : Käyttökelpoisessa toteutusmuodossa keksinnön mukainen pro- ,···. teaasi voidaan liittää puhdistuaineformulaatioihin esimer- • » kiksi EP-patenttijulkaisujen 342 177, 368 575, 378 261 ja . 35 378 262 mukaisesti.

» · 9 110436

Keksintöä valaistaan seuraavissa esimerkeissä, joiden ei tarkoiteta millään tavalla rajoittavan patenttivaatimuksissa esitetyn keksinnön piiriä.

5 Esimerkki 1

Vilielyesimerkki

Bacillus sp. TY145:ttä viljeltiin 25 °C:ssa pyöröravistus-pullossa (300 rpm) 500 ml:n Erlenmeyerpulloissa, jotka sisälsivät 100 ml elatusainetta, jolla oli seuraava koostumus 10 (litraa kohti):

Perunatärkkelys 100 g

Jauhettu ohra 50 g

Soijapapujauho 20 g 15 Na2HP04 X 12 H20 9 g

Pluronic® 0,1 g

Natriumkaseinaatti 10 g

Elatusaineessa oleva tärkkelys nesteytetään a-amylaasilla 20 ja elatusaine steriloidaan kuumentamalla 120 °C:ssa 45 minuuttia.

;\j Steriloinnin jälkeen elatusaineen pH säädetään 9,0:ään ··,·, lisäämällä 10 ml 1 M natriumbikarbonaatin liuosta.

» · r·1:25 ! 5 päivän inkuboinnin jälkeen viljelmän proteolyyttinen aktiivisuus määritettiin käyttämällä edellä kuvattua mene- * telmää.

• * » 30 Kasvatuksen jälkeen liemen entsyymiaktiivisuus oli 10 j CPU/1.

Kiinteän aineen erottamisen jälkeen proteaasi puihdistet-tiin tavanomaisella kromatografisella menetelmällä.

Saanto 1 l:n kasvustoliemestä oli 50 ml, jonka aktiivisuus oli 57 CPU/1. Puhtaus oli enemmän kuin 90 % kuten määritettiin SDS-PAGElla.

35 10 110436 Tämän esimerkin mukaisesti valmistetun valmisteen tunnuspiirteisiin on viitattu aikaisemmin tässä selityksessä ja tässä viitataan aikaisempaan kohtaan.

5 Esimerkki 2

Pesuteho

Pesutehokokeet suoritettiin ruoholla tahratulla puuvillalla, mallipesusysteemissä 20 °C:ssa, isoterminen 10 minuuttia.

10 Tässä kokeessa käytettiin 2,0 g/1 amerikkalaistyyppistä jauhepesuainekoostumusta. Pesuaine ei sisältänyt mitään entsyymiä ennen keksinnön mukaisen proteaasin lisäämistä. Pesuaine liuotettiin noin 6° dH (saksalainen kovuus) veteen 15 ja pH oli noin 8. Tekstiili/pesuneste-suhde oli noin 6 g tekstiiliä pesuaineliuoksen litraa kohti. Esimerkin 1 mukaista entsyymivalmistetta käytettiin entsyymiproteiinikon-sentraatioissa 0,01; 0,04; 0,08; 0,16 ja 0,5 CPU/1.

20 Pesun jälkeen kangasta huuhdottiin juoksevassa vesijohtovedessä 25 minuuttia ja ilmakuivattiin. Proteaasin tehokkuus määritettiin remission (%R) muutoksena (AR) 460 nmrssä mi-tattuna laitteella Datacolor Elrephometer 2000, Δ:η ollessa o · remissio proteaasilisäyksellä pesun jälkeen miinus remissio r t ;-,*,25 pesun jälkeen ilman proteaasin lisäystä.

» i 0

Tulokset on esitetty taulukossa 1.

» · # ft t ft · '** * Taulukko 1

30 Entsyymikonsentraatio delta R

fv 0,01 CPU/1 4 ίΤί 0,04 CPU/1 6,7 0,08 CPU/1 8,7 0,16 CPU/1 9,7 » » i · » ‘35 0,50 CPU/1 11,2 f * » « t

Differentiaaliset remissioarvot osoittavat, että keksinnön mukaisella proteaasilla on hyvä pesukyky.

11 110436

Esimerkki 3

Pesuaineiden stabiilisuus

Keksinnön mukaisen entsyymin (entsyymivalmiste saatu esimerkin 1 mukaisesti) stabiilisuus testattiin pesuaineiden 5 läsnäollessa. Pesuaineet, joita käytettiin tässä, olivat amerikkalaistyyppinen jauhepesuaine ja amerikkalaistyyppinen nestepesuaine.

Jäännösaktiivisuus mitattiin 60 minuutin jälkeen 40 °C:ssa. 10 Entsyymiannos oli 0,3 COU/1.

Jäännösaktiivisuus

Jauhepesuaine: 0,9 g/1 100 %

Nestepesuaine: 2,0 g/1 95 % 15 Tämä koe osoittaa, että proteaasi on stabiili pesuaineissa pesuolosuhteissa.

» % » »

* 1 I

t f » » · ‘ - 1 » · ' « » » * t · * # * t * · · * · 1 f f · ♦ 1 * t · * « » » 2 t ' 1 • ’ i 1 ♦ » I » * 1 I » ·

t I

• t

5 I

12 110436

International Application No: PCT/ /

MICROORGANISMS

1 3

Oottoarf Shoot m tonhoctto1 with tho microorganlom rofenod to on pace------ -----of (1· dooc/lpeon » A. IOSMT1f1CATK>M 09 OIPOftIT »

Fvrtfcor dopooltt or· MonoAod mi an additional »hoot Q ·

Nam· of dopooitaiy tnammUMi ♦ NATIONAL COLLECTIONS OF INDUSTRIAL & MARINE BACTERIA LTD.

Addroao of dopooltary inatttwtloA (inciudinf poitaf coda and country) 1 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland

Dat· ·» topooN 1 Atcoooioo Mwmpw · 3 December 1990 NCIMB 40339

I. ADDITIONAL INDICATION· ' (Imk blank if not applicable). Th«a Information la continued on a aeparete attacked annot Q

In respect of those designations in which a European patent is sought, a sample of the deposited microorganism will be made available only by the issue of such a sample to an expert nominated by the person requesting the sample (Rule 28(4) EPC) until the publication of the mention of the grant of the European patent or until the date on which the application has been refused or is deemed to be withdrawn.

C. DtSISNATIO (TATIS ION WHICH INDICATIONS AM NADI · (If tha indication. ara net Inc all daalgnalad Sataa) • · • · · • · · • · · • · · " ' ‘ D. SIAASATt IUANISHINS OS INDICATIONS · (laa.a Wank if not applicable) • · · « · ·________ ___.

• 1 Tho indication· liatod ba«ow will bo awbmrttod to tr1 International iwraau latar 1 (Specify the panoni natur· of tha Indicotton· a.fl^ ,,, 2 Attmion Numbor of OapoaK '1) • · · • · · I I · t ' ft. Q Thit «hoot 1·» focoivod with th« international «»plication when Mod (to b« chocked by tha r1caf1inp Office) ....: ________ * 1 (Awthoftiad Officer) / // • 1t·1 Q Tho data of rocpfpt (from tha applicant) by tha International bureau 2

Form PCT/Ä0/1X (January tMI) S . . # 1« ......... - — ------------------ 2 (Awthortiad Officer)

Claims (10)

110436

1. Proteas, kännetecknat av att det har följande egenska-20 per: a) skenbar molekylvikt 38 kD bestämd med SDS-PAGE; b) pl ca 8,8; c) pH-optimum inom omrädet pH 8-11 bestämd vid 25 °C; • I d) temperaturoptimum inom omrädet 45-55 °C bestämd i pH 9,5; ,:25 e) immunokemiska egenskaper, vilka är identiska eller delvis identiska med egenskaperna hos ett proteas som kan erhällas ur Bacillus sp. TY145, NCIMB nr 40339, och att proteasen kan ’ erhällas genom odling av Bacillus sp. TY145, NCIMB nr 40339. * · *30 2. Proteas enligt patentkrav 1, kännetecknat av att det *...· erhälls ur stammen Bacillus sp. TY145, NCIMB nr 40339. • · .···. 3. Proteas enligt patentkrav 1 eller 2, kännetecknat av att ’·’ dess aktivitet inhiberas av fenylmetylsulfonylfluorid-(PMSF) , *. *35 a-l-antitrypsin- och kalkons äggvitas proteinas-inhibitorn.

1. Proteaasi, tunnettu siitä, että sillä on seuraavat ominaisuudet : 5 (a) näennäismolekyylipaino 38 kD SDS-PAGE:lla määritettynä; (b) pl noin 8,8; (c) pH-optimi pH-alueella 8-11 määritettynä 25 °C:ssa; (d) lämpötilaoptimi alueella 45-55 °C määritettynä pH 9,5:ssä; 10 (e) immunokemialliset ominaisuudet, jotka ovat identtisiä tai osittain identtisiä sellaisen proteaasin ominaisuuksien kanssa, jotka ovat saatavissa Bacillus sp. TY145:stä, NCIMB nro 40339, ja että proteaasi voidaan saada viljelemällä Bacillus sp. TY145:ta, NCIMB nro 40339. 15

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että proteaasi saadaan Bacillus sp. TY145 -kannasta, NCIMB nro 40339.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen proteaasi, tunnettu siitä, että sen aktiivisuutta inhiboi fenyylimetyylisulfo-*.! nyylifluoridi-(PMSF) , <x-l_antitrypsiini- ja kalkkunan munan- valkuaisen proteinaasi-inhibiittori. • ,£5 4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen proteaasi, tun- nettu siitä, että sillä on aktiivisuutta etyleenidiamiini-tetra-asetaatin (EDTA) ja soijapapuproteiini-inhibiittorin • · * * läsnä ollessa. • * • » · ’· 30 5. Bacillus sp. TY145 -kannan eristetty, biologisesti puh- # · · ’...· das viljelmä NCIMB nro 40339. • · • .··*. 6. Menetelmä minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen ’·’ proteaasin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään *. 35 proteaasia tuottavaa Bacillus sp. TY145 -kantaa NCIMB nro ·...· 40339 sopivassa elatusaineessa, joka sisältää hiili- ja typ- pilähteitä ja epäorgaanisia suoloja, mitä seuraa halutun entsyymin talteenottaminen. 110436

4. Proteas enligt patentkrav 1, 2 eller 3, kännetecknat av att det har aktivitet i närvaro av etylendiamintetra-acetat (EDTA) och sojabönaprotein—inhibitorn. 40 110436

5. Isolerad biologiskt ren odling av Bacillus sp. TY145, NCIMB nr 40339.

6. Förfarande för framställning av ett proteas enligt vil- 5 ket som heist patentkrav 1-4, kännetecknat av att man vid förfarandet odlar en proteasproducerande stam av Bacillus sp. TY145, NCIMB nr 40339 i ett lämpligt näringsmedium som innehäller koi- och kvävekällor samt oorganiska salter, varefter det önskade enzymet tas tillvara. 10

7. Användning av ett proteas enligt vilket som heist patentkrav 1-4 som tvättmedelsenzym.

7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen proteaa-sin käyttö pesuaine-entsyyminä.

8. Tvättmedelssammansättning, kännetecknad av att den inne- 15 häller proteas enligt vilket som heist patentkrav 1-4.

8. Puhdistusainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää 5 minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaista proteaasia.

9. Tvättmedelssammansättning enligt patentkrav 8, kännetecknad av att den innehäller dessutom ett eller flera andra enzym, i synnerhet amylaser, lipaser, cellulaser, oxidaser 20 och/eller peroxidaser.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen puhdistusainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi yhtä tai useampaa muuta entsyymiä, erityisesti amylaaseja, lipaaseja, sellu- 10 laaseja, oksidaaseja ja/tai peroksidaaseja.

10. Puhdistusainelisäaine, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukaista proteaasia, pölyämättömien rakeiden, nesteen, erityisesti stabiloidun 15 nesteen, lietteen tai suojatun entsyymin muodossa.

10. Tvättmedelstillsatsämne, kännetecknat av att det inne- • · ·’·1; fattar ett proteas enligt vilket som heist patentkrav 1-4 i • · ".1· form av icke-dammande granulat, vätska, i synnerhet en sta- ,£5 biliserad vätska, som slurry eller ett skyddat enzym. · · * 1