ES2237425T3 - Uso de glucosaminoglicanos en el tratamiento de la demencia senil. - Google Patents
Uso de glucosaminoglicanos en el tratamiento de la demencia senil.Info
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Abstract
Utilización de los glucosaminoglicanos con un peso molecular de 2400 D obtenidos mediante la despolimerización de la heparina, para la preparación de composiciones farmacéuticas adecuadas para el tratamiento de la demencia senil y de las lesiones neurales cerebrales producidas por ataques súbitos y por traumatismos.
Description
Uso de glucosaminoglicanos en el tratamiento de
la demencia senil.
La presente invención se refiere a los
glusaminoglicanos que presentan un peso molecular de 2400 D,
adecuados en el tratamiento de la demencia senil y de las lesiones
neurales cerebrales producidas por ataques súbitos o por
traumatismos.
La demencia senil, especialmente en la forma de
la enfermedad de Alzheimer, se caracteriza por los depósitos
cerebrales de sustancia amiloide en placas, tanto en los vasos
cerebrales (amiloide vascular) o en el parénquima cerebral (amiloide
cerebral) ambos definidos como \beta-amiloide o
A\beta. La otra característica típica de la demencia senil en el
campo de la fisiopatología es la presencia de ovillos fibrilares en
las neuronas llamados NFT (ovillos neurofibrilares).
Se sabe que los proteoglicanos (PGs), y en
particular el proteoglicano de heparan sulfato (HSPG) están
implicados tanto en la polimerización del A\beta como en la
agregación de los NFT así como en otras patología relacionadas con
la enfermedad de Alzheimer y de una manera más general con la
demencia senil (Snow AD; Sekiguchi R.; Nicholin D. et al.,
"An Important Role of Heparan Sulfate Proteoglycan (Perlakan) in a
Model System for the Deposition and Persistence of Fibrillar Beta
Amyloid in Rat Brain", Neuron 1994; 12:
219-234) y (Perry G.; Sieslak S. L.; Richey P.,
Kawai M. et al. "Association of Heparan Sulfate
Proteoglycan with Neurofibrillary Tangles of Alzheimer's
Disease". J. Neurosci. 1991; 11: 3679-3683).
Además, en el artículo original de Snow (Willmer
J.P.; Snow A.D.; Kisilevski R., "The Demonstration of Sulfate
Glycosaminoglycans in Association with the Amyloidogenic Lesions in
Alzheimer's Disease". J. Neuropath. Exp. Neurol. 1986; 45:
340-346) se revela la presencia de PGs y de
glucosaminoglicanos (GAGs) en las placas amiloides cerebrales de
pacientes que padecían demencia senil.
Varios estudios demostraron (Kalaria R.N. ;
Kroon S. N.; Grahovak I.; Perry G., "Acetylcholinesterase and its
Association with Heparan Sulfate Proteoglycans in Cortical Amyloid
Deposits of Alzheimer's Disease". Neuroscience 1992; 51:
177-184) que la asociación entre los PGs y los
amiloides podía deberse tanto a un enlace directo con el precursor
del \beta-amiloide (A\betaPP) como a un enlace
con el A\beta1-41 o con el
A\beta1-43 que incluyen secuencias neurotóxicas
del A\beta.
Se demostró que los PGs aumentaban la
polimerización de la proteína Tau-2 (Perry G.;
Sieslak S.L.; Richey P., Kawai M. et al., "Association of
Heparan Sulfate Proteoglycan with Neurofibrillary Tangles of
Alzheimer's Disease". J. Neurosci. 1991; 11:
3679-3683) la cual es la causa de la formación de
los ovillos neurofibrilares (NFT).
Por otra parte, en un estudio llevado a cabo por
Lorens et al. (Lorens S. A.; Gushawan B. S.; Van De Kar L.;
Walegnga J. M.; Fareed J., "Behavioural, Endocrine, and
Neurochemical Effects of Sulfomucopolysaccharide Treatment in the
Aged Fischer 344 Male Rat". Semin Thromb. Haemost. 17
Suppl. 1993; 2:164-173) se demostró que las ratas de
edad avanzada mejoraban el déficit conductual como consecuencia de
la administración oral de glucosaminoglicanos de alto peso molecular
(GAP o glucosaminoglicanos polisulfatados o Ateroid®).
Conti et al. (Conti L.; Placidi G. F. ;
Cassano G. B.; "Ateroid® in the Treatment of Dementia: Results of
a Clinical Trial (Eds. Ban E.; Lehmann H. E.) Diagnosis and
Treatment of Old Age Dementias" Mod. Probl.
Pharmacopsychiatry. Basel, Larger 1989 vol. 2, pp
76-84) demostraron que como consecuencia del
tratamiento con Ateroid® los pacientes que padecían demencia senil
presentaban una mejora en el funcionamiento de los parámetros
psicopatológicos y en el comportamiento social de una forma
significativamente más alta que los pacientes tratados con un
placebo.
Parnetti et al. (Parnetti; Ban T.A.; Senin
U. "Glycosaminoglycan Polysulfate in Primary Degenerative
Dementia". Neuropsychobiology 1995; 31 :
76-80) revelaron que el Ateroid® podía mejorar
significativamente algunos parámetros bioquímicos alterados en la
demencia senil, tales como por ejemplo los niveles de
monoaminooxidasa B de las plaquetas y de dopamina y de serotonina
en el líquido cefalorraquídeo.
Estas observaciones indican que el Ateroid® puede
resultar útil en el tratamiento de la demencia senil, ya en el año
1988 U. Cornelli y T. Bann obtuvieron la patente para el uso de este
producto en el tratamiento de la demencia senil (EP 293974).
Por otro lado, los glucosaminoglicanos obtenidos
mediante la despolimerización de la heparina y que presentan un peso
molecular medio de 2400 D han sido presentados previamente para usos
concretos por W. E. Barnett (patente EE. UU. 4.351.938) y R. J.
Linherdt et al. (patente EE. UU. 4.847.338).
En concreto, la patente EE. UU. 4.351.938
presenta productos de la heparina parcialmente despolimerizada que
presentan un peso molecular medio entre 2000 y 7000 D, para su uso
como anticoagulantes y antitrombóticos. Dichos productos habían sido
obtenidos al hacer reaccionar una sal de heparina con una disolución
acuosa de ácido de nitrón. La patente EE. UU. 4.847.338 presentó un
tetrasacárido, un hexasacárido, un octasacárido y un decasacárido
capaces de inhibir completamente la activación y presentando menos
de un 33% de actividad anticoagulante en comparación con la heparina
natural.
Dichos sacáridos se habían obtenido mediante
despolimerización enzimática de la heparina.
Ahora hemos encontrado de manera sorprendente en
una experimentación in vivo que la fracción de
glucosaminoglicanos obtenida a partir de la despolimerización de la
heparina, con un peso molecular medio de 2400 D presenta una
eficacia excepcional al inhibir la formación del \beta -amiloide y
al favorecer el crecimiento neuronal.
Las fracciones con un peso molecular medio
inferior (640 D) o superior (4800 D) presentaron una eficacia
claramente menor o insignificante.
Por lo tanto, la fracción de glucosaminoglicanos
que presenta un peso molecular medio de 2400 D puede ser empleada en
la preparación de composiciones farmacéuticas adecuadas para el
tratamiento de la demencia senil, en concreto para el tratamiento de
la enfermedad de Alzheimer o la SDAT (demencia senil del tipo de la
enfermedad de Alzheimer), y en el tratamiento de lesiones neurales
cerebrales producidas por ataques súbitos o por traumatis-
mos.
mos.
La Figura 1 representa la prueba HPLC del
glucosaminoglicano que presenta un peso molecular medio de 2400
(\pm200) obtenido tal como se explica en el ejemplo descrito.
La Figura 2 representa la prueba NMR del
glucosaminoglicano que presenta un peso molecular medio de 2400
(\pm200) obtenido tal como se explica en el ejemplo descrito.
La presente invención se refiere al uso de una
fracción de glucosaminoglicanos que presenta un peso molecular medio
de 2400 D para la preparación de composiciones farmacéuticas
adecuadas para el tratamiento de la demencia senil, en concreto para
el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o la SDAT (demencia
senil del tipo de la enfermedad de Alzheimer), y en el tratamiento
de lesiones neurales cerebrales producidas por ataques súbitos o por
traumatismos.
Dicha fracción de glucosaminoglicanos se obtiene
mediante la despolimerización de la heparina preferiblemente
siguiendo un método que incluya las siguientes etapas:
a) se trata una disolución acuosa de heparina con
radiación gamma de Co-60 según la patente U.S.P.
4.987.222;
b) la disolución obtenida en la etapa a) se
fracciona mediante la técnica de filtración en gel permeable con
resina Sephadex G/50 Medium;
c) la mezcla de las fracciones con un peso
molecular entre 1000 y 3000 D se ultrafiltra hasta 600 D como punto
de corte, se lava y se liofiliza;
d) el producto de la liofilización se disuelve y
se fracciona mediante la técnica de filtración en gel permeable con
resina Sephadex G/25 Medium;
e) las fracciones con un peso molecular entre
1920 y 2560 D, que corresponde a un peso molecular medio de 2400 D,
se juntan y se mezclan.
Para la preparación de la fracción de
glucosaminoglicanos con un peso molecular medio de 2400 D, con el
método preferido de la presente invención, primero se trata una
disolución acuosa de heparina al 10% con radiación gamma de
Co-60 con una intensidad entre 120 KGy y 150 KGy, y
a dosis posteriores de 25 KGy en relación con el peso molecular de
la heparina.
La disolución irradiada se ultrafiltra hasta un
punto de corte de 300 D, se purifica, se filtra estérilmente y se
liofiliza obteniendo la heparina "despolimerizada madre".
Dicha heparina "despolimerizada madre" se
disuelve en una disolución 0,3 M de NaCl y luego se somete a
fraccionamiento mediante la técnica de filtración en gel permeable
con resina Sephadex G/50 Medium.
\newpage
Las fracciones con un peso molecular inferior a
3000 D (alrededor del 10% del total) forman la materia prima de la
presente invención.
El primer tratamiento de esta mezcla consiste en
la ultrafiltración hasta un punto de corte de 600 D para la
extracción de los fragmentos resultantes del proceso de
despolimerización.
Se lava la mezcla ultrafiltrada con 0,3 M de NaCl
hasta que desaparezca la reacción a carbazol en el gel
permeable.
La mezcla final, llevada a una concentración
aproximada del 8% en agua destilada, se filtra estérilmente en
membranas de 0,2 \mum y se liofiliza.
El producto liofilizado se disuelve en una
disolución de 0,3 M de NaCl a una concentración entre el 10% y el
15% (p/v).
A fin de obtener la fracción con el peso
molecular medio de 2400 D se aplica un segundo tratamiento de
filtración en gel permeable manteniendo aproximadamente los mismos
parámetros de la misma filtración en gel permeable, empleando sin
embargo las características de la Sephadex G/25 Medium.
La columna piloto empleada puede ser del tipo BP
252/15 con las siguientes características:
- \bullet
- Altura: 105 cm
- \bullet
- Volumen de resina: 5.200 ml
- \bullet
- Flujo: 1000 ml/h
Los parámetros adoptados se representan por:
- \bullet
- Ve = 17000 ml
- \bullet
- Ve/Vo = 1/R = 1,26
- \bullet
- R = 0,79
- \bullet
- K = 0,09 = (Ve - Vo) : (Vt - Vo)
donde:
\bullet Ve = volumen de elución
\bullet Vt = volumen total de la resina
\bullet Vo = volumen muerto (disolución inicial
en la salida)
\bullet R = resolución (amplitud máxima)
Desde la segunda filtración en gel se obtuvieron
de 10 a 12 fracciones comprendiendo una serie de pesos moleculares
que iban desde los 3000 D has alrededor de los 1500 D. Para la
preparación de la fracción de glucosaminoglicanos según la presente
invención solamente las fracciones con un peso molecular entre 1920
D y 2560 D fueron recogidas y mezcladas.
La disolución resultante se ultrafiltró hasta un
punto de corte de 300 D para eliminar el cloruro de sodio.
La disolución se sometió a una concentración
aproximada del 10% , se filtró a 0,2 \mum y se liofilizó.
Esta fracción forma alrededor del 80% del total
de las fracciones con un peso molecular inferior a 3000 D.
Según el método de la presente invención, la
fracción deseada de glucosaminoglicanos se obtiene con un índice de
reproducibilidad notable tanto en lo concerniente al rendimiento del
proceso como a la constancia de la composición molecular.
A continuación se presenta la caracterización de
la fracción de los glucosaminoglicanos de la presente invención.
El peso molecular medio se determinó por HPLC
empleando columnas de cromatografía de exclusión, en comparación con
las heparinas de bajo peso molecular (LMW) del grupo de sustancias
de referencia para la calibración (Calibration Reference
Substance Batch) nº 1a (PH. EUR.) a un peso molecular de 3700
D.
Se examinaron tres muestras con los resultados de
la Tabla 1.
Los valores porcentuales se calculan a partir de
la suma de dos áreas específicas a considerar del análisis NMR.
Ácidos urónicos desulfatados: área de las señales
de 102,2 y 106 ppm en relación al total de ácidos urónicos a 100,5 y
106 ppm;
glucosamina-NSO_{3}-6-sulfatada:
área de las señales a 62,5 ppm en relación a la área de la
glucosamina-6-sulfatada a 68
ppm;
glucosamina-N-acetilada:
área de las señales de 55,5 ppm en relación a la área de las señales
de 61 a 54 ppm;
glucosamina-3,6-sulfatada:
área de la señal de 59 ppm en relación a la área de las señales de
61 a 54 ppm;
Los valores de la sulfatación en el C6 de la
glucosamina resultan ser menores que los de las fracciones con 4500
D (promedio de 84) de peso molecular.
Esto es debido al hecho de que, con la
disminución del peso molecular, los grupos alcohólicos secundarios
presentan en las unidades terminales reducidas cuyas señales caen en
la zona del C6 un aumento de las
glucosaminas-6-desulfatadas.
La Figura 1 presenta el gráfico obtenido mediante
HPCL de la fracción de glucosaminoglicanos con la distribución de
pesos moleculares de tal manera que el 95% se encontraba entre 2560
D y 1920 D, correspondiendo a aproximadamente 4 - 5 disacáridos
constitutivos.
La Figura 2 presenta el gráfico de la misma
fracción obtenido mediante NMR en el cual se nota la ausencia de
señales de 84 a 85 ppm características del lugar de enlace que ha
sido eliminado por despolimerización debido a la radiación gamma. El
desprendimiento de la cadena galactosídica y de sus componentes
nitrogenados representa una característica específica de esta
fracción sacárida que permite trabajar sin las interferencias,
generalmente de tipo patológico, que se derivan de la presencia de
estructuras peptídicas con distinta composición de aminoácidos.
El análisis NMR revela además que en las zonas
terminales solamente se encuentran anillos intactos o eventualmente
constando de "residuos" alifáticos
Los anillos del extremo reductor nunca están
desulfatados.
Las estructuras glucurónicas desulfatadas de los
extremos reductores no se encuentran señaladas debido a que se
destruyen con la radiación gamma.
En los anillos de los extremos no reductores los
C4s terminales resultan difíciles de distinguir de los C4s no
terminales debido a que caen en la misma zona; los únicos que se
identifican de una manera inequívoca son aquellos de la
NS,3S-glucosamina inmediatamente contiguos al ácido
glucurónico del pentámero activo.
Los núcleos estructurales corresponden a la
heparina inicial con índices de sulfatación prácticamente
inalterados.
Las señales anoméricas que derivan de los grupos
reductores GlcNSO_{3}\cdot6SO_{3} y IdoA2SO_{3} clasifica la
fracción de glucosaminoglicanos según la invención como una
sustancia con unidades terminales similares a aquéllas de los
fragmentos de la heparina natural.
Resulta especialmente adecuada para su uso según
la presente invención la fracción de glucosaminoglicanos con un peso
molecular medio igual a 2400 D con un índice de polidispersión menor
que 1,20, con ausencia total de componentes peptídicos y sin
unidades desulfatadas en el extremo reductor, obtenida sin
tratamiento de resulfatación y en ausencia de catalizadores.
\vskip1.000000\baselineskip
| Ph. E.: según el protocolo de la Farmacopea Europea. | |
| USP: según el protocolo de la Farmacopea Estadounidense. |
A partir de la caracterización presentada arriba
se concluye que la fracción de glucosaminoglicanos según la presente
invención demuestra la ausencia de actividad heparínica en relación
con los parámetros de la coagulación a pesar del mantenimiento de
las características estructurales de la molécula heparínica,
obviamente con un peso molecular muy inferior al de la
heparina.
Ejemplo
Se disuelven 100 g de heparina sódica de mucosa
intestinal de cerdo, con un peso molecular de 14000 D y una
actividad de 190 U/mg en 1 l de agua destilada y desaireada La
disolución se vierte en frascos de pyrex que se cierran con un tapón
de cristal después de hacer bullir argón.
La disolución se somete a un tratamiento total de
130 KGy con las subsiguientes dosis de alrededor de 25 KGy de
radiación gamma de Co-60, obteniendo la
despolimerización de la heparina.
La disolución irradiada se ultrafiltra hasta 300
D como punto de corte, se purifica con pases posteriores en NaCl al
3% y se liofiliza después de concentrarla a alrededor de un 10%.
La heparina "despolimerizada madre" se
disuelve al 10% en 0,3 M de disolución de NaCl y se fracciona
mediante la técnica de filtración en gel permeable en una columna
que contiene Sephadex G/50 Medium.
Después de separar los componentes con un peso
molecular superior a los 8000 D y los alícuotas atribuibles a la
heparina de alrededor de 4500 D, se recuperan las fracciones de un
peso molecular inferior a 3000 D.
Dichas fracciones se purifican por
ultrafiltración hasta 600 D como punto de corte para eliminar los
fragmentos moleculares del proceso de despolimerización.
Después de una serie de tres lavados en 0,3 M de
NaCl para hacer que desaparezca la reacción a carbazol en el gel
permeable, la mezcla se concentra a alrededor del 8% y la disolución
que pasa la filtración de 0,2 micrómetros se liofiliza.
El producto liofilizado se disuelve en una
disolución de 0,3 M de NaCl en cantidad suficiente como para obtener
una concentración final del 10% (x/v). Esta disolución se fracciona
mediante la técnica de filtración en gel permeable en una columna
que contiene Sephadex G/25 Medium.
Se juntan las fracciones con un peso molecular
entre 1920 D y 2560 D.
La disolución que se obtiene se purifica por
ultrafiltración hasta 300 D como punto de corte para eliminar el
cloruro sódico.
La disolución se concentra a alrededor del 1% y
se liofiliza.
Rendimiento: alrededor de 9 g de un polvo de
color amarillo claro.
Análisis: peso molecular medio = 2400 (\pm
200); sulfuro orgánico = 9,9%. Proporción sulfatos/carboxilos = 2,5;
actividad anti Xa = 45 U anti Xa/mg.
Prueba HPLC, Figura 1.
Prueba NMR, Figura 2. Con el propósito de
comparar, con el mismo método también se preparan las siguientes
fracciones de glucosaminoglicanos:
\Diamondblack Fracción con un peso molecular
medio de 640 D (de 320 a 1600 D);
\Diamondblack Fracción con un peso molecular
medio de 4800 D (de 3350 a 6060 D).
Gracias a las características farmacéuticas que
resultan del experimento que se acaba de relatar, los
glucosaminoglicanos con un peso molecular medio de 2400 D pueden
emplearse para la preparación de composiciones farmacéuticas
adecuadas para el tratamiento de la demencia senil, y en particular
de la enfermedad de Alzheimer o la SDAT (demencia senil del tipo de
la enfermedad de Alzheimer), y en lesiones neurales cerebrales
producidas por ataques súbitos o por traumatismos y en el
tratamiento de diferentes formas de degeneración nerviosa.
Dichas composiciones comprenden una cantidad
farmacéuticamente efectiva de dichos glucosaminoglicanos mezclados
con excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables, y pueden
prepararse de la manera adecuada para su administración subcutánea,
intramuscular, intravenosa y oral.
Dichas composiciones contienen una cantidad de
dichos glucosaminoglicanos de entre 50 y 200 mg por dosis
unitaria.
La presente invención también incluye un método
terapéutico para el tratamiento de pacientes que padezcan demencia
senil, y en particular de la enfermedad de Alzheimer o la SDAT
(demencia senil del tipo de la enfermedad de Alzheimer), y de
lesiones neurales cerebrales producidas por ataques súbitos o por
traumatismos que consiste en la administración de una cantidad de
glucosaminoglicanos con un peso molecular medio de 2400 D entre los
10 y los 400 mg por día. En concreto, cuando se espera una
administración por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa, la
cantidad será de 10 a 200 mg por día y si se espera una
administración oral la cantidad será de 400 mg por
día.
día.
Para el estudio de la actividad farmacológica de
la fracción de glucosaminoglicanos según la presente invención se ha
aplicado un modelo experimental en ratas reproduciendo algunas de
las lesiones típicas de la demencia senil (Sigurdsson E. M.; Lorens
S. A.; Hejna M. J.; Dong W. X.; Lee J. M.. "Local and Distal
Histopathological Effects of Unilateral
Amyloid-\beta 25-35 Injections
into the Amygdala of Young F344 Rats". Neuro Biol Aging
1996; 17:893-901).
En concreto se han estudiado los siguientes
parámetros:
\Diamondblack La proteína
Tau-2, estableciendo una correlación entre la
entidad de la reacción y la sustancia
\beta-amiloide (reactividad indirecta);
\Diamondblack la proteína GFAP (proteína ácida
fibrilar glial), estableciendo una correlación entre la reactividad
de los astrocitos con la sustancia \beta-amiloide
(reactividad directa)
\Diamondblack\beta-amiloide:
Sal sódica de A\beta 25 - 35 en una disolución
de ácido trifluoacético (TFA) (VEH 1) con un contenido peptídico del
82 -89% (BACHEM, Torrance, CA).
Se diluyó la \beta-amiloide con
el vehículo respectivo (VEH 1) con agua de tipo NanoPure en una
cantidad suficiente como para obtener una concentración de 0,5 nmol
/ 3,0 ml, justo antes de su utilización y se mantuvo a 4ºC.
\Diamondblack Glucosaminoglicanos, TGSS:
Se han utilizado tres tipos de TGSS
(glucosaminoglicanos de síntesis) preparados como se ha descrito
anteriormente y presentando distintos pesos moleculares tal como se
presenta a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Dichos productos consistían en un polvo de color
amarillo claro soluble en agua, el cual se conservó en un equipo
secador a temperatura ambiente.
Se prepararon disoluciones a la concentración de
1 mg/ml en una solución salina isotónica (VEH 2) para inyectarlas en
las ratas.
Las disoluciones se mantuvieron a la temperatura
de 4ºC durante un período no mayor a las dos semanas.
\Diamondblack VEH 1:
Ácido trifluoacético (TFA) (10 nmoles en 3
\mulitros de H_{2}O destilada), vehículo de la
\beta-amiloide.
\Diamondblack VEH 2:
Solución salina isotónica, vehículo de la
TGSS.
El modelo empleado para la experimentación se
basa en los efectos de una inyección de A\beta 25 - 35 en la
región del núcleo amigdalino cerebral.
La secuencia de aminoácidos de la A\beta 25 -
35 es la secuencia considerada como neurotóxica (Yankner BA; Duffy
LK; Kir- scner DA; "Neurotrophic and Neurotoxic Effects of
Amyloid-P Protein. Reversal by Tachykinin
Neuropeptides". Science 1990: 250-282) ya
que produce las lesiones típicas de la A\beta 1 - 41 o la A\beta
1 - 43.
Para los experimentos se emplearon machos de rata
jóvenes (de 3 a 4 meses), de la cepa Fischer 344, que recibieron una
inyección intracerebral del núcleo amigdalino derecho con 5 nmol /
3,0 \muI de A\beta 25 - 35 o del vehículo correspondiente (VEH
1).
La TGSS o el vehículo correspondiente VEH 2 se
administró dos veces al día por vía subcutánea desde dos días antes
de la inyección intracerebral de la A\beta y durante 32 días
después de dicha inyección, con las dosis que se especifican más
adelante.
Para el análisis histológico, los animales se
anestesiaron con pentobarbital sódico y se les perfundió por vía
arterial (transaórtica) una disolución de formaldehído al 4%.
Se llevaron a cabo 5 secciones coronales (40
\mum) con unos intervalos de separación de 0,2 mm.
Se puso en contacto las secciones con los
anticuerpos contra la proteína Tau-2 y contra la
proteína GFAP (proteína ácida fibrilar glial).
Las ratas Fisher 344 se obtuvieron de Harlan
Sprague-Dawley Inc. (Indianapolis In).
Cuando llegaron pesaban 250-300 g
y presentaban una edad de 3 a 4 meses.
Se mantuvieron los animales en jaulas
individuales con un ciclo de luz - oscuridad de 12 horas (luz a las
7:00 de la mañana) en condiciones de mantenimiento autorizadas por
la AAALAC (American Association Animal Laboratory and Care).
Los animales disponían de alimento y agua a
voluntad y se se habían mantenido en estas condiciones ambientales
durante las 2 - 3 semanas previas al experimento.
La inyección intracerebral de la inyección de
A\beta 25 - 35 se llevó a cabo con anestesia de pentobarbital
sódico (50 mg/kg, i. p.; Butler, Columbus, OH).
Cuando se anestesió los animales, también se
administraron vía intramuscular sulfato de atropina (0,4 mg/kg;
Sigma, St. Louis, MO) y sal sódica de ampicilina (50 mg/kg; Sigma,
St. Louis, MO). La inyección intracerebral en el núcleo amigdalino
derecho se llevó a cabo mediante un equipo instrumental
estereotáxico (Kopf) de manera que la profundidad no fue mayor que
3,3 mm por debajo de la línea interaural.
Las coordenadas para la inyección habían sido
determinadas basándose en el atlas de Paxinos y Watson medidas a
partir del bregma craneal con las coordenadas
AP-3,0, ML-4,6 y
DV-8,8.
Las coordenadas anteroposteriores (AP) se
colocaron allá donde la estructura del núcleo amigdalino cerebral es
más ancha.
Las coordenadas de la zona lateral (ML) se
centraron en relación al núcleo medial y basolateral del núcleo
amigdalino cerebral y finalmente las coordenadas dorsoventrales (DV)
se centraron en la zona liminar dorsoventral del núcleo amigdalino
cerebral.
El volumen inyectado de 3 \mul había sido
infundido en 6 minutos, empleando una bomba para microjeringas de
tipo CMA/100 (Camegie Medici AD, Soln, Sweden). La cánula permaneció
in situ durante 2 minutos después de la inyección y entonces
se extrajo cuidadosamente.
Después de la operación los animales
permanecieron en una placa térmica hasta el momento en que
readquirieron el reflejo para enderezarse.
35 días después del tratamiento, los animales
fueron anestesiados con pentobarbital sódico (100 mg/kg i. p.) y se
les perfundió por vía transaórtica 250 ml de fosfato de sodio y
potasio 0,1 M amortiguado a un pH de 7,4 (PB).
Posteriormente se les perfundió formaldehído al
4% en 500 ml de PB, a una velocidad de 500 ml/hora a temperatura
ambiente.
Justo después de empezar la perfusión se les
inyectó por vía transaórtica 1 U/g de heparina (Upjohn Kalamzoo.
MI).
Después de la perfusión se aisló el encéfalo y se
fijó con una solución de sacarosa al 20% durante 1 hora y luego se
seccionó en bloques de 6 mm alrededor del lugar de la inyección y se
mantuvo a una temperatura de 4ºC en una disolución de sacarosa al
20% y de acida de sodio al 0,1% y en bacitracina al 0,01% en PB
durante 24 horas.
Los bloques tisulares se transfirieron sin
interrupción a una disolución de glicerol al 20% y de dimetil
sulfóxido al 2% con fosfato de sodio 0,1 M como amortiguador del pH
y se mantuvo allí, a temperatura de 4ºC , hasta el momento de la
sección.
Las secciones coronales de 40 \mum se
realizaron en series de 5 a una distancia entre ellas de 0,2 mm y se
realizó el análisis histológico a fin de estudiar las proteínas
Tau-2 y GFAP.
Las secciones se lavaron con xileno y se
hidrataron con alcohol y H_{2}O. Se realizó la tinción poniendo en
contacto la sección con una disolución que contenía 200 ml de ácido
acético 0,2 M, 133 ml de acetato de sodio 0,2 M y 67 ml de acetato
de violeta de cresilo al 0,1%. Entonces se deshidrataron las
secciones con pases posteriores en etanol y se lavaron con xileno.
La sección teñida de esta manera se montó en un portaobjetos
adecuado para su observación al microscopio.
Las secciones se lavaron y se hidrataron mediante
una serie de tratamientos con etanol y agua.
La coloración se realizó poniendo en contacto la
sección con una solución que contenía Rojo Congo al 1% y un 50% de
etanol durante un período de 1 hora.
Entonces se sumergieron las secciones en una
disolución saturada con carbonato de litio y se lavaron en agua
corriente durante 15 minutos. La contratinción se realizó con
hematoxilina de Harris durante 2 minutos y después en agua y se
añadió una disolución ácida de alcohol al 1%. Las secciones se
lavaron en agua, se sumergieron en una disolución acuosa de sulfato
de amonio y de nuevo se lavaron con agua corriente. La secciones
fueron finalmente deshidratadas en etanol y se lavaron con xileno.
Las secciones teñidas de esta manera se montaron en un portaobjetos
adecuado para su observación al microscopio.
Se quitaron las secciones de 40 \mum del
crioprotector y se mantuvieron durante la noche en una disolución
amortiguadora del pH (PBS) a 4ºC.
Por la mañana las secciones se pusieron en
contacto durante 30 minutos con una disolución de H_{2}O_{2} al
0,3% en una solución de trometanol a pH 7,6 (PBS) y posteriormente
se lavaron 3 veces durante 10 minutos con una solución de tritón
X-100 al 0,3% en PBS. Entonces se incubaron las
secciones durante 24 horas con el anticuerpo contra la proteína
Tau-2 (Sigma) diluido en una proporción de 1:500 a
temperatura ambiente.
El diluyente para el anticuerpo contenía un 2% de
tritón X-100, un 0,1% de acida de sodio, un 0,01% de
bacitracina, un 2% de seroalbúmina y un 10% de suero de caballo
normal en PBS.
El tejido se lavó 3 veces sin interrupción,
durante 10 minutos, en una disolución que contenía 0,3% de tritón
X-100 en PBS y se incubó a continuación durante 1
hora con un anticuerpo contra la inmunoglobulina (Vectastain ABC
Elite Kit, Vector Laboratories Burlingame, CA) diluido en una
proporción de 1:200 en una disolución del 0,3% de tritón
X-100 en PBS. Después de 2 lavados con una
disolución al 0,3% de tritón X-100 en PBS, durante
un total de 15 minutos, se incubó el tejido durante una hora con
peroxidasa de avidina de rábano (Vector) diluido en una proporción
de 1:2000 en una disolución del 0,3% de tritón X-100
en PBS.
Entonces se lavaron las secciones en PBS durante
una hora y de nuevo durante 15 minutos con una disolución
estabilizadora de pH de acetato de sodio (0,2 M a un pH de 6,0). A
continuación se hizo reaccionar la secciones con tetrahidrocloruro
de 3-3-diaminobencidina y con
sulfato amónico de níquel (35 mg de DAB, 2,5 g sulfato amónico de
níquel por 100 ml de disolución estabilizadora de pH de acetato de
sodio con un 0,3% de H_{2}O_{2}).
Se colocaron las secciones en una disolución
estabilizadora de pH de acetato de sodio y a continuación en PBS a
4ºC y se mantuvieron allí durante la noche.
Después de esta operación, se secaron las
secciones y se montaron en un portaobjetos para su observación al
microscopio.
La tinción se realizó por el mismo método
empleado para la proteína Tau-2 con la excepción que
el anticuerpo se diluyó en suero de oveja en vez de con suero de
caballo.
El anticuerpo primario contra la GFAP (DAKO,
Dinamarca) se empleó diluido en una proporción de 1:500.
Las secciones teñidas con violeta de cresilo se
analizaron midiendo el tamaño de los depósitos de la A\beta.
La área de los depósitos de la A\beta se midió
a intervalos de 2 mm. También se analizó la refringencia verde
manzana de los depósitos de la A\beta, empleando la luz polarizada
de los portaobjetos teñidos con Rojo Congo.
\newpage
En el contexto de estas pruebas histoquímicas,
las células reactivas a la proteína Tau-2 se
contaron en todas las secciones coronales mientras que se procedió a
la estimación de la reacción de la astroglia, con un resultado de 0
a 2.
Se consideró que los animales presentaban un
resultado positivo si mostraban coloraciones positivas de 1 a 2.
Se emplearon cuatro grupos de ratas para cada
experimento.
1. GRUPO VEH 1 + VEH 2: ratas inyectadas con el
vehículo VEH 1 (TFA) en el núcleo amigdalino cerebral e inyectadas
con el VEH 2 (solución salina isotónica) por vía subcutánea.
2. A\beta + GRUPO VEH 2: ratas inyectadas con
A\beta 25 - 35 en el núcleo amigdalino cerebral y con el VEH 2
(solución salina isotónica) por vía subcutánea.
3. A\beta + GRUPO TGSS: ratas inyectadas con
A\beta 25 - 35 en el núcleo amigdalino cerebral y con los TGSS por
vía subcutánea.
4. VEH 1 + GRUPO TGSS: ratas inyectadas con el
vehículo VEH 1 (TFA) en el núcleo amigdalino cerebral y con los TGSS
por vía subcutánea.
Cada bloque de experimentos se diseñó para al
menos 6 animales por grupo.
Siguiendo este esquema de tratamiento se han
empleado tres tipos de TGSS con los tres distintos pesos moleculares
medios tal como sigue:
- C3-2400 Dalton, en una dosis s.c. de 2,5 mg/kg
- C8-640 Dalton, en una dosis s.c. 2,5 de mg/kg
- C7-4800 Dalton. en una dosis s.c. de 2,5 mg/kg
Cada TGSS se estudió mediante dos experimentos
distintos a fin de confirmar los resultados.
Para cada tipo de tratamiento se analizó el
siguiente número de animales:
\vskip1.000000\baselineskip
Los animales tratados con VEH 1 intranúcleo
amigdalino cerebral (controles sin amiloide) y con uno de los TGSS
(C3 o C7 o C8) siempre mostraron resultados prácticamente idénticos
a los controles del grupo 1, tratados solamente con los vehículos
VEH 1 + VEH 2.
a) Reactividad a la proteína
Tau-2 (número de células reactivas): valores
promedio \pm desviación típica.
A partir de esta serie de experimentos se llega a
la conclusión que tanto C3 como C7 son activos en la reducción de la
reactividad a la proteína Tau-2 mientras que C8, que
presenta el menor peso molecular, correspondiente al disacárido, no
presenta actividad.
Los controles sin tratar con A\beta se
comportan de manera idéntica cuando se inyectan por vía subcutánea
tanto con una solución salina isotónica (grupo 1) o con una TGSS
(grupo 4).
El fuerte descenso de la reactividad a la
proteína Tau-2 por efecto del compuesto C3 también
se ha confirmado mediante ensayos en los cuales el C3 ha sido
administrado a las ratas por vía oral.
El modelo experimental y la metodología de
detección fueron idénticas a las descritas anteriormente, con la
diferencia que el C3 se administró por vía oral una dosis de 20
mg/kg en vez de por vía subcutánea.
La administración de C3 se efectuó una vez al día
empezando tres días antes de la inyección del A\beta 25 - 35 hasta
catorce días después de dicha inyección.
Se sacrificaron las ratas después de catorce días
de la inyección del A\beta 25 - 35.
Los resultados obtenidos se presentan en la
siguiente Tabla en la cual se puede observar que el C3 reduce
fuertemente la reactividad a la proteína Tau-2 en
las ratas tratadas con A\beta 25 - 35.
b) Reactividad de los astrocitos (%
de animales que presentaron una reactividad de +1 o +2): valores
promedio.
En lo que se refiere a los astrocitos, el único
producto que presenta una actividad significativa es el C3 (grupo
3a). Los productos C8 y C7 (grupos 3b y 3c) no presentan
actividad.
Del examen de dichos resultados se obtiene que,
sorprendentemente, el TGSS C3, con un peso molecular medio de 2400
D, presenta una actividad mucho mayor que los TGSS con pesos
moleculares superiores e inferiores. En concreto, el peso molecular
medio de 2400 D resulta óptimo para la reducción de la reactividad
señalada con la proteína Tau-2 y para la señalada
con la reacción de los astrocitos.
En otro experimento en ratas, se ha estudiado la
capacidad del producto C3 para superar la barrera hematoencefálica
después de la administración por vía intravenosa.
Para dicho propósito se ha empleado el producto
marcado con tritio (^{3}H).
El marcado correspondió a 700000 DPM/mg de
^{3}H-C3.
Después de administrar por vía intravenosa 2,5
mg/kg, se sacrificaron las ratas con anestesia de pentobarbital
sódico, a un tiempo fijado de 45 minutos.
Se analizó el nivel de marcadores en la sangre,
en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y finalmente en el encéfalo
(después de una infusión suave para eliminar la sangre de los
vasos).
El LCR se extrajo del cuarto ventrículo con un
vial de vidrio (en una cantidad siempre superior a los 200 \mul,
después de la sangría completa del animal).
Los DPM se estimaron por gammagrafía diluyendo 20
\mul de homogeneizado (encéfalo) en 5 ml de solución salina
isotónica.
Los resultados, presentados en la siguiente
tabla, demuestran que el ^{3}H-C3 es capaz de
traspasar la barrera hematoencefálica en una cantidad
significativa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En los animales de control los valores de DPM/ml
siempre resultaron inferiores a 41 en todos los tejidos
analizados.
En relación con estos resultados, se llevó a cabo
un control de la presencia de la actividad del anti Xa en el suero,
en el LCR y en el encéfalo.
Se conoce que el factor Xa (factor de coagulación
X) se ve inhibido solamente por las fracciones oligosacáridas de
azufre que contienen más de cuatro sacáridos.
En una serie de ratas tratadas tal como se
describe en el punto anterior si observó que, después de 45 minutos
desde que se habían tratado con C3 a una dosis de 2,5 mg/kg por vía
intravenosa, la actividad anti Xa era presente de forma
significativa en el plasma, en el LCR y en el tejido encefálico.
Ésta constituye una confirmación más de que el
producto que pasa la barrera hematoencefálica consiste en el C3 y no
en productos de degradación inactivos tales como los disacáridos o
los tetrasacáridos.
Se analizó el crecimiento neuronal también en las
ratas que se sometieron a la inyección de A\beta 25 - 35 tratadas
con CR o bien sin tratamientos activos.
Para tal propósito se empleó el método de tinción
Rapid Golgi el cual, debido a su complejidad, se aplicó
solamente a un número limitado de animales.
Tal como ya se ha especificado anteriormente, el
C3 se administró a una dosis de 2,5 mg/kg por vía subcutánea, dos
veces al día empezando dos días antes de la inyección intracerebral
de A\beta 25 - 35 y durante 32 días consecutivos.
Se analizaron las neuronas cerebrales de la capa
V de circunvolución del cuerpo calloso.
La prueba implicó la determinación de la longitud
de las dendritas y la relación entre el numero de ramas terminales y
el número de ramas primitivas (relación T/B).
Cuanto mayor es la relación T/B mayor es la
complejidad y el número de conexiones de la neurona.
\newpage
Los resultados se presentan en la siguiente
Tabla:
La tabla demuestra que el A\beta perjudica el
crecimiento neuronal y que el C3 repara el perjuicio creado. Además
se observa que el C3 presenta una actividad de tipo neurotófico útil
en el caso de degeneración nerviosa o de traumatismos que impliquen
lesiones neuronales.
Claims (9)
1. Utilización de los glucosaminoglicanos con un
peso molecular de 2400 D obtenidos mediante la despolimerización de
la heparina, para la preparación de composiciones farmacéuticas
adecuadas para el tratamiento de la demencia senil y de las lesiones
neurales cerebrales producidas por ataques súbitos y por
traumatismos.
2. Utilización tal como se ha reivindicado en la
reivindicación 1, caracterizado porque dicha demencia senil
consiste en la enfermedad de Alzheimer o la SDAT.
3. Utilización tal como se ha reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado
porque dichas composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad
efectiva de dichos glucosaminoglicanos mezclados con diluentes
farmacéuticamente aceptables o excipientes.
4. Utilización tal como se ha reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado
porque dichos glucosaminoglicanos presentan un índice de
polidispersión menor que 1,20 y una ausencia total de componentes
peptídicos y se encuentran libres de unidades desulfatadas en el
extremo reductor.
5. Utilización tal como se ha reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado
porque dicha despolimerización de la heparina se lleva a cabo
mediante el tratamiento de una disolución acuosa de heparina con
radiación gamma seguida por la filtración en gel permeable.
6. Utilización tal como se ha reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado
porque dicho tratamiento se efectúa mediante la administración
subcutánea, intramuscular, intravenosa u oral de dichas
composiciones.
7. Utilización tal como se ha reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado
porque dicho tratamiento se realiza con una cantidad de 25 a 400 mg
por día de dichos glucosaminoglicanos por vía oral.
8. Utilización tal como se ha reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado
porque los glucosaminoglicanos presentan un peso molecular medio de
2400 D \pm 200 D.
9. Utilización tal como se ha reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado
porque el peso molecular medio de los glucosaminoglicanos definido
en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 está comprendido entre
192 D y 2560 D.
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