JPS62174027A - 改良されたキモパパイン及び製薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は改良されたキモパパイン（ｃｈｙｍｏｐａｐａ
−＋ｎ）　、キモパパインの改良された処方又は製薬学
的組成物に関すると共にキモパパインの製法に関連する
。また本発明は本発明による純化キモパパイン使用に基
づく椎間板異状症候の治療法にも関連する。

キモパパインはパパイヤ科のパパイヤ（ｃａｒｉｃａ−
ｐａｐａｙａ）の粗乳液の主要なタンパク質分解成分を
なす酵素である。このものはパパインに類似するスルフ
ヒドリル酵素として特徴づけられるけれども基質、特性
、電気泳動、安定性及び溶解性の点でパパインとは異る
。このものはヤンセン及びボール（Ｊａｎｓｅｎ　ａｎ
ｄ　Ｂａ１１ｓ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、ｖｏｌ、
１３７＋１１１１１１、　４５９−６０　　（１９４１
）　ａｎｄ　Ｕ、Ｓ、Ｐａｔ。

２３１３８７５’（１９４３）　）により最初に記述さ
れ特徴づけられた。なおメルクインデスク（Ｔｈｅ　Ｍ
ｅｒｃｋＩｎｄｅｘ　Ｎ１ｎｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｅ
ｎｔｒｙ　Ｎｏ、２２６１＋ｐ、　２９３）を参照され
たい。

キモパパイン製造のための上記のヤンセン及びポールの
方法は本質的には塩析法であってパパイヤ乳液の可溶性
部分の溶液を酸性化してｐＨを約２とし、液相から不溶
性タンパク質フラクションを分別し、ｐＨを４に上げ更
に、タンパク質を除去し、液相を塩化ナトリウムで飽和
させ、ｐＨを約２に下げてキモパパインを沈殿させる。

当該技術分野の他の研究者達はヤンセン及びボールの方
法を市販パパイヤ乳液に適用しても単一結晶性タンパク
質を生成しないと報告している。

例えば諸文献（ｃａｙｌｅ　ａｎｄ　Ｌｏｐｅｚ　Ｒａ
ｍｏｓ、Ａｂｓｔｒａｃ−ｔｓ　ｏｆ　Ｐａｐｅｒｓ　
ｏｆ　ｔｈｅ　１４０　ｔｈ　Ｍｅｅｔｉｒｉｇ　ｏｆ
　ｔｈｅ八ｍへｃｈｅｍ、ｓｏｃ’ｙ、、Ｃｈｊｃａｇ
ｏ＋ｐ、　　　１　９Ｇ（１９６１）　　　；１ａｔａ
　ａｎｄ　Ｙａｓｕｎｏｂｕ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、、ｖｏｌ、　２３７　。

ｐｐ、１０８６−９４　　（１９６２）　；Ｋｕｎｉｍ
ｉｔｓｕ　ａｎｄＹａｓｕｎｏｂｕ、Ｂｉｏｃｈｆ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、ｖｏｌ、　１３９１ｐｐ。

４０５−１６（１９６７））を参照されたい。塩析法及
び（又は）溶媒分画法及び（又は）　ｐＨ調整法により
、或は類似方法によりパパイヤから分離されたキモパパ
インを下文においては粗キモパパインと称する。粗キモ
パパインは明瞭な“イオウ系”臭気を有し、また溶液中
で顕著な黄褐色を呈する。

粗キモパパインがタンパク系の性質の種々の物質を含有
することは事実であってそのうちの僅か２種のみが確実
に活性なタンパク分解因子である。

例えばシュテルン（Ｓｔｅｒｎ、　　１９７１年１月２
６日登録米国特許第３５５８４３３号明細書）は三成分
、即ちキモパパイン１及び■として知られる２種のタン
パク分解活性フラクション及び１種のタンパク分解不活
性タンパク様成分の三成分、を含有する粗キモパパイン
の該諸成分の純化と同定とについて記載している。

上掲の米国特許第３５５８４３３号明細書記載の方法は
緩衝水溶液で予めｐＨ約８〜約８．５に平衡化させたカ
ルボキシメチル置換交差デキストランコポリマー交換樹
脂のクロマトグラフコラムの使用を特定しており、これ
に対して粗キモパパインを適用し、次に交換体に緩衝水
溶液を通して溶出させるのであるが但しこの緩衝水溶液
は初めの場合のクロマトグラフコラムの平衡化に使用さ
れた緩衝溶液と同じｐＨ値をもつけれどもイオン強度の
点では始めの場合よりも高いイオン強度をもつものであ
る。この操作で得られたキモパパイン製品はヤンセン及
びポールの粗キモパパインよりも高い純度をもつけれど
も米国特許！３３２０１３１号明細書記載の如き椎間板
ヘルニャの治療には全く使用されなかった。

前記シュテルンの米国特許第３５５８４３３号明細書は
該方法で調製された純化キモパパインが本質的に単一タ
ンパク質であるかのように作動することを教示するが該
作動は分析学的超遠心分離における単一対称境界線（ｓ
ｉｎｇｌｅ　ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ　ｂｏｕｎｄａ−
ｒｙ）の形成によると共に寒天ゲル拡散系内での免疫拡
散試験における単一沈降線の形成によるものである。

更に近年に至り、シュテルンの特許方法によるクロマト
グラフコラムから溶出されたキモパパインの第一フラク
ションであって該特許方法においではタンパク分解“不
活性”と記載された該フラクションは新方法（Ｂａｒｎ
ｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｊ。

１７７．５４．１−４８　（１９７９））により調製さ
れたパパイヤ抽出物の或場合において、原料供給源の差
により、実際にはタンパク分解活性であることが見出さ
れた。

添付図面に示される通りの溶出物吸収極大値によってシ
ュテルン特許方法はキモパパインの諸種成分を同定して
いるのであるが、該特許明細書における実施例はキモパ
パイン溶出物の全部のフラクションを一緒にして蒸留水
に対して透析し凍結乾燥して純化キモパパイン製品を得
ている。

ヤンセン及びボールの方法により調製されたキモパパイ
ンはスミス（Ｓｍｉｔｈ）の米国特許第３３２０１３１
号の方法に従い患者（ヒト）の凸出椎間板を化学的細胞
核分解（ｃｈｅｍｓｎｕｃｌｅｏｌｙｓｉｓ）により縮
減させるための臨床的試み、即ち動物における背骨から
の凸出円板に対し該椎間板の髄核（ｎｕｃｌｅｕｓｐｕ
ｌｐｏｓｕｓ）　（中心膠質部分）の選択的溶解に充分
な量のキモパパインを用いる注射、に汎用されているこ
とに留意される。但し該臨床的試みは患者の約０．５％
について生命をおびやかすアレルギー的副反応の有意に
可能な存在を示した。のみならず被処理患者の約３％に
及ぶ少数の患者については遅発性アレルギー反応を呈す
るのであった。

ヤンセン及びボールの方法により調製された市販キモパ
パインを凸出円板の縮減と治療とに用いた臨床研究者に
より報告された過敏症的副反応の高い頻度がいかなる理
由によるかの詳細は未知であって現在に至るまで充分に
明らかにされず説明もされていない。

とはいうものの従前の臨床的試みにおいて使用されたヤ
ンセン及びボールの粗キモパパインは、キモパパインの
第一溶出フラクションの存在により、不必要な過敏症的
危険性を包蔵しているのであり、該第−溶出フラクショ
ンはシュテルン特許明細書においてはタンパク分解不活
性と記載されている。しかも哺乳動物に異質タンパク抗
原を注射して該動物がそれをやむなく保持するならば過
敏症によるショックの危険を招くことは周知である。抗
原の種類が多数であればある程患者は敏感となる。しか
しながら該注射により求め得る有利な効果は或環境下、
例えば狂犬病の感染の治療におけるワクチンの使用下又
は動物源から調製された破傷風抗毒素の使用下、でのや
むを得ない付随的危険よりも勝るのである。

とはいえ堅実な医療の実際面において、致命的毒性を呈
する可能性を持つと共に医療効果に疑問のある余計なタ
ンパク成分を追加的に含有するタンパク系物質の注射は
治療を受ける患者に過敏症を起させる無用で受容され難
い危険性を与えるということがいわれているのである。

医学的に異種タンパク物質であることがわかっているも
の例えば粗キモパパインの哺乳動物に対する注射は或危
険性をはらむのであるからこの治療操作の最高利益の達
成のためには所期の医学上の目的達成のために可及的に
純粋で可及的に濃化された形のものであって過敏症を起
させる抗原の疑をもつ成分を本質的に含まない活性タン
パク性酵素成分のみを得ること、かようにしてタンパク
質による免疫学的原性を最少化させその結果患者の過敏
症的ショックを最少化させることが望まれる。

更に着色タンパク性物質及び有臭物質を粗キモパパイン
から最少化させると患者の過敏症的ショックを減する。

それは該物質は免疫学的反応において通常疑われる特性
的物質であるからである。

また従前技術は米国特許第４０３９６８２号明細書（１
９７７年）記載の通り、損傷し又は異状化した椎間板の
治療に当り保存料として添加される重亜硫酸ナトリウム
を含有する粗キモパパイン溶液を用いることを記述して
いる。

けれども該重亜硫酸ナトリウムの使用は突然変異を起す
活性の危険性をもつので受容され得ない。

例えばムカイ等ＣＦ、　Ｍｕｋａｉ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　　３９．　
９８３−９８８（１９７０））は大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ
ｔ　）を重亜硫酸ナトリウムで処理した結果、復帰突然
変異（ｒｅｖ−ｅｒｓｉｏｎ）の数の有意の増加を認め
たことで或種の突然変異活性を証した。シャピロ（５ｈ
ａｐｉｒｏ。

Ｍｕｔａｇｅｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ｖｏｗ、　　３９
＋　　１４９　１７６（１９７７））もまた低濃度の重
亜Ｆａ酸／’ｌ＜　Ｄ　Ｎ　Ａ合成、細胞分裂及び有糸
分裂を阻害するのみならず染色体の異常化（ａｂｅｒａ
ｔｉｏｎ　）と突然変異とを誘起することを示した。同
様にサスマス等（Ｓｕｓｓｍｕｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｍｕｔａｇｅｎ　Ｒｅｓ、　４０．　２２９−３６　　
（１９７６））は重亜硫酸ナトリウムでｐＨ６において
大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｆ）を処理した結果教生残菌１００
万当り４５００　（０，１％）の変異菌を証明した。従
って保存料としての重亜硫酸塩の利益もこれを摂取した
患者に前ガン様変形の無用の危険をもたらすように見受
けられ、特に製薬学的安定性が重亜硫酸塩の存在に依存
しないという証拠もあるのであるから該危険をもたらす
ように見受けられる。

本発明は改良方法により製造された免疫学的に低原性で
低毒性の純化キモパパインに関し、更に詳細には純化キ
モパパインと製薬掌上許容され得る無毒性還元剤とから
本質的に成る製薬学的組成物に関する。この製薬学的組
成物は重亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ及び余計な有臭物
並びに着色物を含有しないことにより更に特徴づけられ
る。

本発明はまた下記の各工程即ち ＋ａｌ　　コラム状のカルボキシメチル置換交差結合ア
ガロースゲルから成る弱酸性カチオン性交換体であって
ｐｌ＋約６．５〜７．５の緩衝水溶液で予め平衡化され
ていて１　ｍｇ当り０．０２〜０．１０　ミＩＪ当量の
水酸化ナトリウムに対し中和能を有する該“カチオン性
イオン交換体”に粗キモパパインの緩衝水溶液を接触さ
せ； （ｂｌ　　カルボキシメチル置換アガロースゲルの平衡
化に用いられた緩衝水溶液のｐｕと同じ数値範囲のｐＨ
をもつけれども溶出液容積に関し共存性、不反応性、水
溶性、製薬学上許容可能性を有する中性の無機塩の直線
的に増加するイオン濃度をもつ緩衝水溶液を用いて上記
の交換体に保持されたキモパパインを？客用させ； （ｃ１溶出液中の該可溶性塩のモル数が０．２５〜０．
４にまで増加し到達するまで粗キモパパインから最初に
溶出する着色性有臭性タンパク成分を含有する該交換体
からの溶出フラクションの最初の系を集めて排棄し； （ｄｌ　　実質的全部の吸着キモパパインが回収される
まで約０．２５〜０．４モルより大きい可溶性塩濃度に
おいて２種のタンパク分解活性キモパパインフラクショ
ンを含有する交換体から溶出されるキモパパインフラク
ションの系（複数）を連続的に集めて保存し； （ｅｌ　　工程（ｄｌからの活性フラクション（複数）
を合併し、キモパパインのタンパク分解活性成分を含有
する保存フラクションを処理することによって溶存イオ
ン性無機塩と緩衝成分とを除去し；そして げ）塩を本質的に含まない純化キモパパイン溶液を凍結
乾燥してタンパク分解不活性成分を本質的に含まない乾
燥状純化キモパパインを製造する各工程から成る純化キ
モパパイン製造方法によって得られた純化キモパパイン
及びそれに基づく製薬学的組成物を包含する。

本発明の純化キモパパインは余計な有臭物と着色物とを
含有していないことで更に特徴づけられる。本発明によ
る方法を本質的に連続式で実施し得るがこれはカルボキ
シメチルアガロースゲル交換体が使用中に収縮せずコラ
ムから取出される必要がなく、但し塩を除くために追加
の緩衝溶液で処理するだけで済む故である。このことは
従前技術の交換体とは対照的であって例えば従前技術の
カルボキシメチル置換デキストランは使用中に収縮を起
すのでコラムから取出されねばならず水洗、再膨潤化、
綴衝液による再平衡化、そして再使用のためのコラムへ
の再注入の操作を受けねばならない。

上記方法で製造され免疫学的原性を滅じた純化キモパパ
インは不活性タンパク成分を本質的に含まないがこれは
酸性化溶液中で塩化バリウムと沈殿を形成しないことで
更に特徴づけられる。これは同じ条件下で沈殿をつくる
粗キモパパインとは対照的である。不純キモパパインが
何故に該沈殿を生成するのかは未知であるけれども粗キ
モパパインと既述の純化工程で交換体から最初に熔出さ
れるキモトリプシン排棄部分との双方は共に上記沈殿を
形成することが特徴的であると決定されている。

本発明はまた酸性化塩化バリウムと沈殿を形成する有臭
物、高度着色物を本質的に含まずタンパク分解不活性成
分又は他成分物質を含まない純化キモパパインと活性化
必要量の製薬学上許容可能な還元剤とから成る改良され
た安定性をもつ凍結乾燥された乾燥状薬学的組成物であ
って真空条件下に容器又はバイアル中に包装された該組
成物に関する。

異常又は損傷された椎間板の髄核の溶解化又は髄核の治
療に注射して使用するのに適当な好ましい単位投与形は
本発明による方法で製造された純化キモパパインの約１
００００〜１１５００タンパク分解単位（公称１０００
０単位）と活性化剤としてのナトリウムシスティネート
塩酸塩（ｓｏｄｉｕｍ　ｃｙｓｔｅｉｎａｔｅｈｙｄｒ
ｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）　とから成り、真空バイアル内に
包装されたものである。一般にこの投与単位は真空容器
中１５〜３０　（好ましくは２３）ｍｇの純化キモパパ
インと３．０〜３．６　ｍｇのナトリウムシスティネー
ト塩酸塩とから成る。好ましくは還元剤（システィン）
はキモパパインの約１５重量％、それより広い範囲とし
ては１０〜２０重量％の量で存在する。

更に本発明は損傷され凸出し或は他の不正常状態にある
哺乳動物の椎間板の化学的細胞核分解による治療方法に
も関連しており、これは被処理哺乳動物に対する毒性の
危険を減じたことで特徴づけられるが、本性は製薬学的
に許容可能で椎間板の選択的溶解分量として充分な量の
上記の純化キモパパインの水溶液を該椎間板の中へ注射
する操作過程から成る。

本発明はまた被処理哺乳動物の不正常状態下の椎間板の
治療方法に関連しており、この方法は下記諸操作過程す
なわち： （ｉ）該椎間板の中へ針を挿入し； （ｉｉ）Ｘ線により針の位置を確認し；（ｉｉｉ　）不
活性成分を本質的に含まない比較的無毒の製薬学上許容
可能な量の純化キモパパイン溶液を椎間板の中へ注射し
てその髄核を選択的に熔解させること から成る。

本発明の一目的は純化され完全に活性であって毒性及び
（又は）過敏症を呈する危険性を減じたキモパパインを
製薬学上許容可能な溶液として凸出し又は他の不正常状
態下にある哺乳動物の椎間板に対し注射して椎間板の髄
核を選択的に溶解させることによる上記椎間板治療方法
の提供にある。

本性はまた哺乳動物の異常な椎間板の化学的細胞核分解
方法をも包含する。

本発明の他の目的は高濃度の本質的に完全に純化された
タンパク分解性キモパパインと製薬学上許容可能な無毒
性還元剤とから成る薬学的組成物であって哺乳動物への
注射に適当であり哺乳動物に対する毒性が少くタンパク
分解不活性のタンパク質又はその他の有毒成分を本質的
に含まない上記の組成物の提供にある。

更に本発明の他の目的は凍結乾燥状態にあるキモパパイ
ンを活性化させるための還元剤と純化キモパパインとか
ら成る高度安定性処方物の提供にある。

なお他の目的は純化キモパパインと天然還元剤とから成
る乾燥状投与単位の提供にある。

本発明の他の目的は着色物、有臭物及びタンパク非分解
性の即ち、不活性のタンパク成分を本質的に含ます哺乳
動物に注射された場合にも毒性少く及び（又は）過敏症
を呈することのない純化キモパパインの製造方法の提供
にある。

更に本発明の目的は収縮せず再使用の際に取出される必
要のないカルボキシメチルアガロースゲルコラムの使用
による純化キモパパインの製造方法の提供にある。

本発明による方法で用いられる純化キモパパイン製造の
ための出発原料物質として使用される粗キモパパインは
キモパパインとして既知されているものを構成する３種
フラクション即ち３種成分を含むがこれらはクロマトグ
ラフィ技術により互に分別され得る。該３種成分はタン
パク分解不活性（タンパク分解不能）の着色有臭成分く
１種）とタンパク分解活性（タンパク分解可能）の２種
成分即ち本明細書でキモパパインＩ及び■と称す２す る成分を包含する。粗キモパパインはヤンセン及びポー
ル法（Ｊａｎｓｅｎ　ａｎｄ　Ｂａ１ｌｓ、　、ｒ、　
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、＋ｖｏ１．１３．　Ｉｌり、　　
４５９　６０　　（１９４，１）　）によって得られる
がこの方法は市販パパイン濃縮物を酸性溶液とし、この
溶液を高いｐＨ値において塩化ナトリウムにより飽和さ
せ、ｐＨを下げ、その後に粗キモパパイン溶液を透析し
て塩不含溶液を作り、次にこの溶液を凍結乾燥して乾燥
状粗キモパパイン製品を得る操作を包含する。

上記のヤンセン及びポール法により調製された粗キモパ
パイン並びに他方法による粗キモパパインを本発明によ
る方法により純化して不活性、着色、有臭及び免疫学的
原性諸成分を除去する。下記の渚例はヤンセン及びポー
ル法で調製された粗キモパパイン出発原料を用いる純化
操作を例証する。

炎□上（参考例） すべての工程を冷蔵機温度（２〜８℃）の下で遂行する
。

Ａ、粗キモパパイン（約２９ｇ）を１９０ｍβのｐＨ７
，４のリン酸ナトリウム緩衝液中にとかし２〜８℃の下
で５％Ｗ／Ｖ　（重量／容積）溶液を得た。

Ｂ、緩衝液中の上記の粗キモパパイン溶液を、予め０．
０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化させておいた容
積約１．７ｆｆ（およその床寸法は５Ｘ８０Ｃｍ）のカ
ルボキシメチル置換交差結合アガロース樹脂のコラムに
対して加えた。該樹脂は１　　ｍ１４当り約０．０５ミ
リ当量の水酸化ナトリウム中和能を有していた。

Ｃ，０，０５Ｍリン酸ナトリウムでｐＨ７，４に緩衝化
された塩化ナトリウム溶液の勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）
をコラム入口に適用し、かようにして塩化ナトリウム濃
度が０〜１．０Ｍ（１容積当り）に直線的に増加するよ
うにした。該勾配の約４．６７！がコラムに適用された
場合に塩化ナトリウム添加濃度が１モルとなるように該
勾配を調製しておいたのである。

Ｄ、　コラムからの流出液を滴数計の助けにより試験管
中に２５ｎｌのフラクションとなるように約４０時間か
かって集めた。

Ｅ、　各部分のタンパク質含量と各フラクションの活性
とを分析した。各フラクションから０．５ｍＡの試料を
採取しこれについてビウレットテストにより総タンパク
質を測定した。キモパパインを用いるエルランゲル法（
Ｅｒｌａｎｇｅｒ、　Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　９５．２７１
　７８　（１９６１））に従い各フラクションからの０
．０５ｍｊ＋の試料についてＤ　Ｌ−α−ベンゾイル−
アルギニン−ｐ−ニトロアニリドの加水分解能を測定す
ることによりタンパク分解活性を定めた。連続的に集め
られたフラクションに対し相対的タンパク含量をプロッ
トした。各フラクション０．５ｍｎをビウレット試薬５
　ｍｌに対して加えて１５分後の５４０ｎｍにおける吸
光度（Ａ）　（Ａ　５４．０）を測定することによりタ
ンパク含量を便利に測定し得る（第１図参照）。

Ｆ、塩化ナトリウム濃度θ〜約０．４モルにおけるコラ
ムからの最初の流出分（濃褐色成分）に該当するタンパ
ク成分含有フラクションを排棄した。

Ｇ、　　０．４〜１モルの塩化ナトリウム濃度において
回収された残りのフラクション（複数）を合併し２〜８
℃で蒸留水（数回とりかえた）に対して透析して塩化ナ
トリウムと溶解緩衝剤とを除去した。

■、　この脱塩生成物を次にＩ　Ｎ　ＮａＯＨを用いる
ことによりｐＨ６に調整し凍結乾燥して約１６．３　ｇ
の純化キモパパインを生成させた。

添付図面において極大値（Ａ）を有する第１キモパパイ
ンタンパク成分は塩化ナトリウムモル濃度約０〜約０．
２５〜０．４モルにおいてコラムから溶出されるがこれ
は高度着色有臭フラクションである。このフラクション
を排棄した。極大値Ａ（しばしばタンパク分解不活性で
ある）として同定されるタンパク質は粗キモパパイン中
に見出される着色要素の大部分を含有していて酸性化塩
化バリウム溶液で沈殿物を形成する特性をも有する。

これに続く流出物フラクションは塩化ナトリウム’ｔＭ
　度０．４〜１モルにおいて二つの追加の主極大値を生
じ、これらはキモパパインＩ及び■として同定された。

上記の例Ｉに示された通りコラムから回収されたキモパ
パインＩ及びＨの両成分はタンパク分解活性であって酸
性化塩化バリウム溶液で沈殿を生成しなかった。

コラムに吸着されていたタンパク分解不活性成分を含有
する粗キモパパイン及び２種のタンパク分解活性成分で
あるキモパパイン■及び■はｐＨ６，５〜７．５、好ま
しくはｐＨ７，３〜７．５に維持された緩衝溶液中で勾
配をもつ塩く即ちＮａＣｅ　）溶液によりコラムから溶
出される。

最初の成分（極大値Ａを有する）はコラムから溶出され
てから排棄されたがこれは総物質量の約１５重量％を構
成する。

溶出物残分はタンパク分解活性キモパパイン成分Ｉ及び
■から成るがこれらは塩濃度約０．２５〜０．４〜１モ
ルにおいて回収される。該２種の特性的主極大成分即ち
タンパク構成分は収集された物質の約８５％を占め、添
付図面に示される通り約０．５及び０．８モルの塩濃度
において溶出される。

上記の吸着及び溶出工程を約２〜８℃の冷蔵庫温度の下
で遂行する。キモパパインＩ及び■を含む収集された溶
出フラクション（複数）を合併し水に対して透析して塩
並びに可溶性緩衝成分を除去してから濾過し滅菌する。

次いで該塩不含の本質的に純化されたタンパク分解活性
のキモパパインＩ及び■の溶液を凍結乾燥する。出発原
料としての粗キモパパインにもとづく全収率は約５０〜
６０％である。載量の不活性物質を除去したけれども最
終製品の単位重量当りの活性は増加していない。これは
恐らく操作過程で酵素（活性）が損失される故であろう
。

不正常又はヘルニアを起している椎間板の治療に従来使
用されていた粗キモパパインは多数のフラクションを持
っていたことが明かである。教祖及び本発明の純化キモ
パパインを動物試験によって比較したが、動物試験で観
察された通りの高毒性を呈するタンパクフラクション（
極大値へに該当する）を本発明による方法により除去し
たのである。

本発明の純化キモパパインは酸（Ｈ（Ｊりｉ液液中塩化
バリウム試験により従前技術の粗キモパパインから区別
され得ることは指摘した通りである。

塩化バリウムによる沈殿生成は従前技術の粗（又は有毒
）キモパパインに特性的であるけれども本発明の純化キ
モパパインは該沈殿を生成しない。

下記の例は粗キモパパインと純化キモパパインとを区別
するのに用いられる塩化バリウム試験の操作を示すもの
である： Ｌｉ（参考例） 下記の各キモパパイン試料の夫々の１０％（Ｗ／　Ｖ　
）水溶液を１ｍｌのＩＮＩＩＣｊ！で酸性化し、これに
対し、米国薬局方ＸＸ版第１１０３頁所載の通り１２ｇ
のＢａＣβ２を蒸留水にとかして１００ｍｅとすること
により米局方試験溶液として調製された１２％（Ｗ／Ｖ
）塩化バリウム（ＢａＣｆｆｉｚ）の１ｍ７！を添加し
て下記の結果が得られた一几［りな区）　　　　　猪−
一來 実　験　　Ａ　　　　中等度乃至重度の沈殿実　験　　
Ｂ　　　　中等度の沈殿 実　験　　Ｃ中等度の沈殿 実　験　　Ｄ　　　　中等度乃至重度の沈殿菰止土天バ
バ不ノ　　　　　慧−一来 実験　Ｅ　　　透明 実験　Ｆ　　　透明 実　験　　Ｇ　　　　　　　本質的に透明（かすかなく
もり） 実験　Ｈ透明 本発明の純化キモパパインは出発原料としての粗キモパ
パインに比し着色と臭気とを減したことによっても特徴
づけられる。粗キモパパインに見られる着色及び（又は
）臭気のファクターはクロマドグラフコラムから溶出さ
れるキモパパインの第一成分（八）（排棄成分）に伴う
ものであって上表の通り塩化バリウム溶液により沈殿を
形成する。

粗キモパパイン中に見出される着色及び有臭成分を有す
る排棄沈殿成分は椎間板に注射された際に罹患哺乳動物
に観察される粗キモパパインの毒性（過敏症的ショック
）と明かに関連を有する。

本発明の純化キモパパイン製品の減少又は最少化された
着色度と該純化製品の酸性条件下の塩化バリウム溶液に
よる沈殿不生成とは椎間板治療目的に使用される粗キモ
パパインを注射された数多の患者に生起した過敏症的又
は毒性的反応の大部分に関係ありと信ぜられた該製品に
伴う高毒性の危険性のないことの尺度であると考えられ
る。

本発明による方法で製造されたキモパパインは被処理哺
乳動物の罹患した、不正常又は凸出した椎間板の治療の
ために椎間板の髄核の溶解に充分な量の純化キモパパイ
ン溶液を被処理動物の椎間板内へ注射針により直接注射
することに使用される。天然源還元剤例えばナトリウム
システイネート塩酸塩をキモパパインと併用することが
通常好ましいけれども他の薬学的に許容される還元剤例
えばグルタチオン、ナトリウムチオグリコレート、シス
テイニルグリシン、ジチオエリスリトール、ジチオスレ
イト−ル又は異性体類（Ｄ、Ｌ又はＤＬ）を使用し得る
。ナトリウムシスティネート塩酸塩が最も好適な活性剤
即ち還元剤である。

従前技術は椎間板治療に際しキモパパインを保存料とし
ての重亜硫酸ナトリウム及びＥＤＴＡと併用することを
好適としたがこれらの薬剤使用は毒性の可能性を有する
のみならず不必要でもある。

事実、重亜硫酸ナトリウムの使用はその毒性の故に禁忌
であるしまたその突然変異活性にかんがみ発ガン性の危
険を伴う。

五−主 本発明の純化キモパパインの特殊な投与単位形としては
本発明による方法で製造された純化凍結乾燥キモパパイ
ンであって酵素活性度約１ｏｏｏｏ〜１１５００単位を
有する該キモパパイン２３■及びナトリウムシスティネ
ート塩酸塩約３．５■を含有し真空バイアル中に包装さ
れていて重亜硫酸ナトリウムを含まず又はＥＤＴＡ　（
エチレンジアミンテトラ酢酸）を含まないことを特徴と
する該投与単位形である。

一般に、システィン及びその他の還元剤はエルランゲル
法で分析して測定されたキモパパイン酵素単位で表示し
て１００００酵素単位当り約０．５〜１０■の量で使用
される。

下記の例は典型的な単位投与形をもつ凍結乾燥製品製造
の一例である。

配合物の代表的製法 １、ＤＬ−α−ベンゾイル−ｐ−ニトロアニリドの加水
分解を包含する方法により試験された純化キモパパイン
は１■当り５２２単位を含有していた。

２、　キモパパイン（純化済み）の１００７ぐイアルを
製造するために１２５ｍｌ１の容積の溶液が必要であっ
た。各バイアルに対し１１５００酵素単位含有溶液の１
．０ｍｊｌ！とナトリウムシスティネート塩酸塩の０．
０２ミリモルとを加えた。操作中Ｑ　つ にこの溶液を１０℃以下に保持した。

３、上記容積の溶液を次のようにして製造した：ａ、注
射用の煮沸水又は冷却水１００ｍ７！に対しＬ−（＋）
システィン塩酸塩−水和物を加え最終容積１　ｎｕ当り
０．０２ミリモルを提供するようにした。

所要量、＝０．０２ミリモル／ｍＡＸ１７５．６■／ミ
リモルＸ１２５ｍｎ 添加量■＝４３９ 所要量の溶質を添加した後に約２ｍ７！のｌＮＮａＯＨ
を用いてｐＨをおよそ５．５に調整した。

４、次にキモパパインを加えて最終容積中１　ｍｌｌ当
り１１５００単位を提供するようにした：この溶液を攪
拌して全溶質を溶解させ、ｌＮＮａＯＨを加えてｐＨを
６．０とし、注射のために充分な量の水を加えて容積を
１２５ｍｊ＋に至らせた。

　ｔ ５、滅菌するためにこの溶液を孔径０．２ミクロンのフ
ルイを通過させた。

６、次に容量５ｍｌの１００個のガラス製バイアルの夫
々に１．Ｏｍｎの純化キモパパイン−システィン溶液を
加えた。分裂血清バイアルストッパー（ｓｐｌｉｔ　ｓ
ｅｒｕｍ　ｖｉａｌ　５ｔｏｐｐｅｒｓ）を部分的に挿
入し、バイアルを自動停止装置付きの凍結乾燥器へ装入
した。

７、固体として凍結するまで凍結乾燥室中に真空下に一
３０℃にバイアルを保持してから約９０ミクロン（絶対
値）の圧下に約３０時間かけてしずかに温度を上げて水
を分離させた。

８、　ストッパーを完全にしてから凍結乾燥室の真空を
破り、アルミニウムの封を加えた。

９、　各バイアルは２３ｍｇのキモパパイン、３．５■
のナトリウムシスティネート塩酸塩を含み１１５００単
位の酵素活性度を有する白色綿毛状製品を含有していた
。

下車は本発明の純化キモパパイン製品の低毒性と効果と
を証明するために遂行された一連の試験を記述するもの
である。

静脈注射による急性毒性 カナダで購入した従前技術による市販キモパパイン〔製
造元はバクスタートラヘノールラポ゛ラドリーズ（Ｂａ
ｘｔｅｒ　Ｔｒａｖｅｎｏｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ））　　（本明細書において検体Ａと称する）、本発
明の純化キモパパイン（本明細書において検体Ｂと称す
る）及び対照として滅菌水（本明細書において対照Ｃと
称する）を異る被検動物に対し静脈注射することにより
静脈注射急性毒性比較試験を行った。検体Ｂは既述の例
に記載の方法により２３．０■の純化キモパパインと３
．５■のナトリウムシスティネート塩酸塩とを含む凍結
乾燥投与単位の水溶液として製造された。対照の検体Ａ
は約２７■の粗キモパパイン、０．３７■のＥＤＴＡニ
ナトリウム及び３，５■のナトリウムシスティネート塩
酸塩を含有していた。

舌　　１（ハッカネズミ） ＣＤ−１系の１０匹の若い成熟マウス（雄５及び雌５）
の夫々に対し検体Ａ及びＢの溶液（濃度夫々２０００及
び２３００単位／ｍｅを有する）の０．０１ｍｆｆ／ｇ
　（体重ＩＫｇ当り２００００及び２３０００単位に該
当する）を静脈注射した。注射部位は尾の側面の静脈で
あり、注射速度は３０秒間に１　ｍＡであった。投与後
２Ｖ２及び４時間目、その後は１日２回（午前と午後）
だけ全期間１４日間にわたり被検マウスを観察した。

検体く対照製品）Ａを与えられたマウス１０匹のうち４
匹は注射後４時間以内に死亡した。検体Ａを注射された
生残マウス６匹の尾は壊死の徴症を示した。検体（発明
製品）Ｂを注射されたマウス１０匹のうちの４匹は２日
目（雄１及び雌１）及び４日目（雄２）に死亡した。生
残マウスのうちの１匹は試験期間の終りに尾の壊死の徴
症を示した。検体（対照）Ｃを注射されたマウスに死亡
はなかった。

試験２（ウサギ） 各群４頭のウサギ（雄２雌２）から成る３群に対し体重
ＩＫｇ当り１０００単位（検体Ａ）及び１１５０単位（
検体Ｂ）の投与単位で体重ＩＫｇ当り０．５ｍｆｆｂ の各検体を静脈注射した。４頭のウサギのうち３頭（ａ
２雌１）は検体Ａ注射後４時間以内に死亡した。検体Ｂ
を注射されたすべでのウサギは対照（検体Ｃ）を注射さ
れたウサギと同様に生き永らえた。

以上の試験結果は従来技術によるキモパパインが本発明
の純化キモパパインよりもかなり高い毒性の危険性を有
することを示している。

アレルギー　の゛小ヒ（モルモットの皮膚感作）健康教
育福祉省刊行物Ｃｔｈｅ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　Ｈｅ
ａｌｔｈＥｄｕｃａｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｗｅｌｆａ
ｒｅ　　Ｐｕｂ、　Ｎｏ、　　７８　２３（Ｎ、　１．
　ｌ（、）　）記載の操作により研究着手前１７日間に
わたり保守されたへトリ系（Ｈａｒｔｌｅｙｓｔｒａｉ
ｎ　）の白色種成熟モルモント雄３２頭についてモルモ
ットによる皮膚感作試験を行った。試験前２６〜２７時
間の時に各モルモットの横腹と背とから毛を剃り落した
。皮膚異常（即ち紅斑、損傷）及び体重の偏りを呈する
動物を試験から除外した。選択された３２頭の群からラ
ンダムに３０頭の被検動物をえらんだ。前記の検体Ａ及
びＢに滅菌水を配合して注射用液を作った。検体Ａ（市
販キモパパイン）の濃度は２０００単位／ｍβであり、
検体Ｂ（純化キモパパイン）の濃度は２３００単位／ｍ
Ａであった。。陽性対照（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔ
ｒｏｌ）として２．４−ジニトロ−１−クロロベンゼン
の０．１％（Ｗ／■）溶液を作りこれを検体りと称する
。陰性対照（水〉を検体Ｃと称する。各被検群に１０頭
の動物を使用した。

動物の右横腹に対し検体Ａ、　Ｂ及び陽性対照検体りを
皮肉注射して感作試験を行った。陰性対照の注射物（検
体Ｃ１滅菌水）を各群の全被検動物の左横腹に皮肉注射
した。試験及び対照動物に対し第１０番感作投与が終わ
るまで１日おきに、１週間当り３回注射した。第１番注
射量は０．０５ｍ［でそれに続く９回分の感作投与量は
０．１０ｍｊ！であった。

第１０番感作投与量を注射してから２週間後に試験及び
対照検体の０．０５ｍ７！の攻撃投与量を感作投与量と
して同様に注射した。

死亡動物の有無について１日２回（午前及び午後）３７
日間にわたり観察した。

注射後２４及び４８時間目に皮膚損傷について記録し、
紅斑強度については直径（ひろがり）と浮腫の高さく吹
出物）を測定した。

下表は２４時間及び４８時間目の観察結果の平均値であ
る。

■災血径烹　　浮腫の高さ車 検体Ａ　　　　　１４．８　　ｍｍ　　　　２．２７ｍ
ｍ検体８　　　　　９．９　　ｍｍ　　　　１．７３ｍ
ｍ検体Ｄ　　　　　１１．０６ｍｍ　　　　２．７１ｍ
ｍ（陽性対照） （注）＊　動物１０頭についての平均値；但し検体りの
場合には２頭死亡のため８頭についての平均値 上表の結果は本発明の純化キモパパイン配合物よりも市
販キモパパイン配合物の方が有意に高い感作値を有する
ことを示している。検体Ａは陽性対照検体り即ち公知感
作物２．４−ジニトロー１−クロロベンゼンよりも高い
感作値を有していた。

統計学的分析により検体ＡとＢとの紅斑（ｐミ０．０２
５）及び浮腫（ｐ≦０．００２）に関する差異は有意で
あることを示した。

Ｕ橿） 未成熟の純系ピーグル大（Ｂｅａｇｌｅ　　ｄｏｇｓ）
の４頭について腰部の連続２個椎骨間の円板の髄核に対
し検体Ｂ　濃度２３００単位／ｍｌ、検体Ａ濃度２００
０単位７ｍ１ｌ、椎間板１個当り投与量としては検体Ｂ
１１５単位、検体Ａ１００単位において試験用検体Ｂ及
びＡ、並びに検体Ｃ（対照）を夫々注射した。背柱のＸ
ｇ写真、血液学、臨床化学的検査及び剖検により、それ
に続く特に注射個所の選択された組織の顕微鏡検査によ
り被検犬を検査した。

１４日後に検体Ｂ（純化キモパパイン）注射式の４頭す
べてについて椎骨間の間隙が狭くなっていることがＸ線
フィルムで示された。検体への場合には４頭のうち３頭
の犬について１４日後の該間隙が狭くなっていた。

注射後１４日間に検体Ｂ注射大４頭中４頭について椎間
板の肉眼的組織変化の徴症が示されたがこれとは対照的
に検体Ａ注射式４頭のうち２頭のみについて該徴症が示
されただけであった。対照については何の変化もなかっ
た。検体Ｂ（純化キモパパイン）注射式は僅かに乃至中
等度に軟骨形成（髄核の再生長）を示したが検体Ａ注射
式は著しく僅か乃至僅かな変化を示したのみであった。

上記の事実から本発明による方法で製造された純化キモ
パパインは特に前記のモルモット感作試験で示された通
り従来技法の粗キモパパインよりも有意に低毒性である
新型キモパパインであることが明らかである。

その他の諸検査により本発明の改良され純化された新型
のキモパパインはヒトを含む哺乳動物の不正常で損傷し
又は凸出した椎間板の治療に確信をもって使用され得る
ことが明かである。

１文に示された通り純化キモパパインは本発明による方
法により本質的に連続的な方式で製造され得る。それは
カルボキシメチル置換アガロースゲル樹脂が使用に当り
容積収縮を起さず洗浄による再生及び緩衝液を用いる再
平衡化並びに再膨潤化のためにコラムから取出される必
要性が無いからである。しかるに例えばセファデクス〔
“５ｅｐｈａｄｅＸ″ＣＭ−５０（カルボキシメチル置
換交差結合デキストラン共重合体）〕のごときイオン交
換樹脂については上記の作業の必要性があるし、その後
にコラム内へ注入されるのであるから費用を要し時間を
消費する方法である。本質的に連続的な方式で本発明に
よる方法を操作するためにはカルボキシメチルアガロー
スゲルの再生はコラムを通して追加量の緩衝液をその場
所で注入するのみであってかようにして本性における即
時の再使用のための平衡化が行われる。樹脂の収縮は無
く、取出し、洗浄又は再膨潤化の必要はない。

その他の本発明で使用されるために適当な不収縮性樹脂
支持体はアクリルミドゲル樹脂である。

【図面の簡単な説明】

添付図面の第１図は粗キモパパインの純化におけるフラ
クションの図示であって樹脂コラムからの溶出液の順次
に集められたフラクションのタンパク含量（ビウレット
試験における吸光度）〔左方の縦軸〕とそれに対応する
収集流出液容積（ｍｊ２）〔横軸〕についてプロットさ
れた図示である。また破線（直線的）はＮａＣｎ即ち塩
濃度（右方縦軸）であって直線的勾配にそって流出液容
積に対応してプロットされた０〜１モルのＮａＣｆｆ？
Ｍ度を表す。 タンパク含量はビウレット試薬５ｍｌに対し各フラクシ
ョン０．５ｍβを加え１５分後に５４０ｎｍにおける吸
光度Ａ（Ａ５４０）を測定して定められる。タンパク分
解活性はキモパパインに適用されたエルランゲル法の変
改法により、キモパパイン配合物に関し４１０ｎｍにお
ける吸光度（Ａ４１０）をプロットして定められる。 Ａ・・・・・・タンパク分解不活性部分の極大値、Ｉ・
・・・・・キモパパイン成分■、 ■・・・・・・キモパパイン成分■。 手続補正書（方式） 昭和　　年　　月　　日 １、事件の表示　　　昭和６１年特許願第２２７１０１
号３、補正をする者 事件との関係　　出願人 ４、代理人

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）減毒され純化されたキモパパイン製造のための粗
   キモパパインの純化方法すなわち （ａ）ｐＨ約６．５〜７．５の緩衝水溶液で予め平衡化
   されたカルボキシメチル置換交差結合アガロースゲルの
   コラムから成る弱酸性化カチオン性交換体と粗キモパパ
   インの緩衝化水溶液とを接触させ； （ｂ）カルボキシメチル置換アガロースゲルの平衡化に
   使用され同じｐＨ値を有する同一緩衝水溶液であるけれ
   ども但し溶出液容積に関し共存性、不反応性、水溶性、
   製薬学上許容可能性を有する中性無機塩の直線的に増加
   するイオン濃度をもつ該緩衝水溶液を用いて上記の交換
   体に保持されたキモパパインを溶出させ；（ｃ）溶出液
   中の該可溶性塩のモル数が増加して０．２５〜０．４に
   到達するまで交換体からの粗キモパパインの最初のタン
   パク成分を含む最初の溶出液フラクションの系を集めて
   排棄し；（ｄ）実質上すべての吸着キモパパインが回収
   されるまで約０．２５〜０．４モルよりも高い可溶性塩
   増加濃度において２種のタンパク分解活性キモパパイン
   成分を有する交換体からのキモパパイン溶出フラクショ
   ンの系（複数）を連続的に集めて保存し； （ｅ）キモパパインのタンパク分解活性成分（複数）を
   含む該保存フラクションを処理することによって溶存イ
   オン性無機塩と緩衝成分とを除去し；そして （ｆ）塩を本質的に含まないキモパパイン溶液を凍結乾
   燥してタンパク分解不活性の即ち有毒の成分を本質的に
   含まないタンパク分解活性乾燥状純化キモパパインを製
   造することから成る方法によって製造されたことを特徴
   とする純化キモパパイン製品。
2. （２）タンパク分解不活性成分を本質的に含まない純化
   キモパパインであって該純化キモパパインの１０％（重
   量／容積）溶液を塩酸で酸性化して塩化バリウムと処理
   したときに沈殿を生成しない該純化キモパパイン製品と
   少量の製薬学上許容可能な無毒の還元剤とから本質的に
   成ることを特徴とする製薬学的組成物。
3. （３）還元剤がナトリウムシステイネート塩酸塩である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の組成物
   。
4. （４）重亜硫酸ナトリウム及びエチレンジアミンテトラ
   酢酸を含まないことを特徴とする特許請求の範囲第２項
   に記載の純化された製薬学的組成物。
5. （５）純化され本質的に無色のタンパク分解活性キモパ
   パインにおいて、その１０％（重量／容積）溶液が塩酸
   で酸性化され塩化バリウムで処理されたときに沈殿を生
   じないことを特徴とする上記のキモパパイン。
6. （６）凍結乾燥された純化キモパパインであってタンパ
   ク分解不活性成分を本質的に含まず比較的に無毒であり
   、その１０％（重量／容積）溶液を塩酸で酸性化して塩
   化バリウムと処理したときに沈殿を生成しない該凍結乾
   燥純化キモパパインと少量の活性化量の薬学的許容可能
   の還元剤とから成り；但し該還元剤が純化キモパパイン
   の約１０〜約２０重量％の量で存在することを特徴とす
   る安定な製薬学的組成物。
7. （７）還元剤がナトリウムシステイネート塩酸塩である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の組成物
   。
8. （８）ナトリウムシステイネートが固体の純化キモパパ
   インの少くとも約１５重量％の量で存在することを特徴
   とする特許請求の範囲第７項に記載の組成物。
9. （９）約２３ｍｇの純化キモパパインを含むことを特徴
   とする特許請求の範囲第６項に記載の組成物。
10. （１０）約３〜３．６ｍｇのナトリウムシステイネート
    塩酸塩を含むことを特徴とする特許請求の範囲第９項に
    記載の組成物。
11. （１１）椎間板の髄核を注射によって溶解させるために
    使用される投与単位形の安定な製薬学的組成物において
    、タンパク分解不活性のタンパク成分を本質的に含まな
    い純化キモパパインであってその酸性化水溶液を塩化バ
    リウム試薬で処理したときに沈殿を起さない該本質的に
    無色の純化キモパパインの約１００００〜１１５００タ
    ンパク分解単位と活性化剤としてのナトリウムシステイ
    ネート塩酸塩とが真空下に容器内に包装されていること
    を特徴とする前記の組成物。
12. （１２）純化キモパパインが２３ｍｇ、ナトリウムシス
    テイネート塩酸塩が約３．５ｍｇの量で存在することを
    特徴とする特許請求の範囲第１１項に記載の投与単位形
    の製薬学的組成物。