PL198016B1

PL198016B1 - Zastosowanie glikozoaminoglikanów do przygotowania kompozycji farmaceutycznych podawanych w leczeniu otępienia starczego i neurologicznych uszkodzeniach mózgu

Info

Publication number: PL198016B1
Application number: PL352070A
Authority: PL
Inventors: Ambrosi Luigi De; Israel Hanin; Jawed Fareed; John Lee; Stanley Lorens; Ronald F. Mervis; Umberto Cornelli
Original assignee: Cornelli Umberto C O Cornelli
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2008-05-30
Also published as: RU2248800C2; AU764743C; CA2373975A1; ZA200109331B; IT1312107B1; PT1181024E; HUP0201100A2; ATE288761T1; KR20020005033A; IL146458A0; CN1350459A; KR100711142B1; NO328902B1; CZ20014092A3; NO20015544D0; ES2237425T3; HK1039903A1; HUP0201100A3; CN1178667C; NO20015544L

Abstract

1. Zastosowanie glikozoaminoglikanów do przygotowywania kompozycji farmaceutycznych po- dawanych w leczeniu ot epienia starczego i neurologicznych uszkodzeniach mózgu spowodowanych udarem mózgu i urazami, zawieraj acych glikozaminoglikany o sredniej masie cz asteczkowej 2400, otrzymane przez depolimeryzacj e heparyny. PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie glikozoaminoglikanów do przygotowania farmaceutycznych kompozycji podawanych w leczeniu otępienia starczego i neurologicznych uszkodzeniach mózgu spowodowanych udarem mózgu i urazami.

Otępienie starcze, przede wszystkim w postaci choroby Alzheimera, zasadniczo charakteryzuje się tym, że w mózgu osadza się substancja skrobiowata (amyloidowa) w formie płytek, które osadzają się zarówno w naczyniach mózgu (amyloid naczyniowy) jak i w masie mózgu (amyloid mózgowy) i oba zdefiniowano jako β amyloid lub Α β. Inne charakterystyczne objawy otępienia starczego na poziomie fizjopatologicznym, to obecność w neuronach włókienkowatych splotów NFT (zwanych splotami neurowłókienkowatymi).

Znane są, proteoglikany (PGs), a przede wszystkim proteoglikan siarczanu heparanu (HSPG), które mają związek z polimeryzacją Αβ lub agregacją NFT, jak i z innymi patologicznymi przypadkami związanymi z chorobą Alzheimera i ogólnie otępieniem starczym (Snow AD; Sekiguchi R; Nicholin D i inni „An Important Role of Heparan Sulfate Proteoglycan (Perlakan) in a Model System for the Deposition and Persistance of Fibrillar Beta Amyloid in Rat Brain”. Neuron 1994; 12:219-234 - „Ważna rola proteoglikanu siarczanu heparanu (Perlakanu) w procesie badania osadzania i utrzymywania włókienkowatego amyloidu β w mózgu szczurów” oraz (Perry G; Sieslak SL; Richey P, Kawai M i inni „Association of Heparan Sulfate Proteoglycan with Neurofibrillary Tangles of Alzheimer^ Disease”. J. Neurosci. 1991; 11: 3679-3683) - „Związek proteoglikanu siarczanu heparanu z neurowłókienkowatymi splotami w chorobie Alzheimera”.

Ponadto, Snow w swojej oryginalnej pracy naukowej (Willmer JP; Snow AD; Kisilevski R. „The Demonstration of Sulfate Glycosaminoglycans in Association with the Amyloidogenic Lesions in Alzheimer's Disease”. J. Neuropath. Exp. Neurol. 1986; 45: 340-346) -„Prezentacja glikozoaminoglikanów siarczanu w połączeniu z uszkodzeniami amylogenicznymi w chorobie Alzheimera), opisuje obecność PGs i glikozoaminiglikanów (GAGs) w amyloidowych płytkach mózgowych u chorych na otępienie starcze.

Kilka badań przeprowadzonych przez (Kalaria RN; Kroon SN; Grahovak I; Perry G. „Acetylcholinesterase and its Association with Heparan Sulfate Proteoglycans in Cortical Amyloid Deposits of Alzheimer's Disease”. Neuroscience 1992; 51:177-184) -„Acetylocholinesteraza i jej związek z proteoglikanami siarczanu heparanu w osadach amyloidu korowego choroby Alzheimera”, pokazuje, że związek pomiędzy PGs i amyloidami może wynikać zarówno z bezpośredniego powiązania z prekursorem β amyloidu (Ae PP) lub powiązania z A β 1-41 lub A β 1-43, które zawierają sekwencje neurotoksyczne A β. Udowodniono, że PGs podwyższa także polimeryzację białka Tau-2 (Perry G; Sieslak SL; Richey P. Kawai M i inni „Association of Heparan Sulfate Proteoglycan with Neurofibrillary Tangles of Alhzeimer's Disease”. J. Neurosci. 1991; 11: 3679-3683), -„Związek proteoglikanu siarczanu heparanu ze splotami neurowłókienkowatymi w chorobie Alzheimera”, co powoduje formowanie się neurowłókenkowatych splotów (NFT).

Ponadto badania przeprowadzone przez Lorensa i innych (Lorens S.A.; Gushawan BS; Van De Kar L; Walegnga JM; Fareed J. „Behavioural, Endocrine, and Neurochemical Effects of Sulfomucopolysaccharide Treatement in the Aged Fischer 344 Małe Rat”. Semin Thromb. Haemost. 17 Suppl. 1993; 2:164-173) - „Zachowanie, Wydzielanie wewnętrzne i Skutki neurochemiczne leczenia sulfomukopolisacharydem u starych szczurów rodzaju męskiego Fischer 344”), na starych szczurach, pokazują polepszenie stanu zachowawczego, po podaniu doustnym glikozoaminoglikanów o wysokiej masie cząsteczkowej (GAP lub polisiarczanowanych glikozoaminoglikanów lub Ateroidu®). Conti i inni opisali (Conti L; Placidi GF; Cassano GB; „Ateroid® in the Treatement of Dementia: Results of a Clinical Trial (Red. Ban E; Lehmann HE) Diagnosis and Treatement of Old Age Dementias” Mod. Probl. Pharmacopsychiatry; Basel, Larger 1989 tom. 2, strony 76-84) -„Ateroid® leczenie otępienia starczego: Wyniki Badań Klinicznych, Diagnostyka i Leczenie otępienia starczego”), opisują że w wyniku leczenia Ateroidem® pacjenci cierpiący na otępienie starcze wykazują polepszenie parametrów w zachowaniu psychopatologicznym oraz społecznym niż pacjenci leczeni placebo. Parnetti i inni (Parnetti; Ban TA; Senin U. „Glycosaminoglycan Polysulfate in Primary Degenerative Dementia”. Neuropsychobiology 1995; 31:76-80) - „Glikozoaminoglikan polisiarczanu w początkowym zwyrodnieniowym otępieniu starczym”), opisuje, że Ateroid®, może wyraźnie polepszyć niektóre parametry biochemiczne, zmienione w otępieniu starczym, na przykład oksydazę B monoaminy płytek krwi i poziom dopaminy i serotoniny w płynie mózgowo-rdzeniowym.

PL 198 016 B1

Badania te sugerują, że Ateroid® może być pomocny w leczeniu otępienia starczego i w 1988 roku U. Cornwlli i T. Bann uzyskali patent na zastosowanie Ateroidu® w leczeniu otępienia starczego (EP 293974).

Glikozoaminoglikany otrzymane przez depolimeryzację heparyny zostały opisane w patentach US 4 351 938 i 4 847 338.

W patencie US 4351938 opisano, zwłaszcza produkty depolimeryzacji heparyny o średnim ciężarze cząsteczkowym około 2000 do 7000, które zastosowano jako antykoagulanty i środki przeciwzakrzepowe. Produkty otrzymano w reakcji soli heparyny z roztworem kwasu azotowego.

W patencie US 4 847 338 opisano pochodne depolimeryzowanej heparyny zawierające wolne kwasy lub sole tetrasachrydów, heksasacharydów, oktasacharydów lub ich mieszaniny o ciężarze cząsteczkowym powyżej 2300 mające zmniejszone własności antykoagulacyjne w stosunku do heparyny i stosowane w leczeniu zaburzeń imunologicznych.

Nieoczekiwanie okazało się w badaniach in vivo, że frakcja glikozoaminoglikanów otrzymana w depolimeryzacji heparyny, mająca średnią masę cząsteczkową 2.400 wykazuje wyjątkowe działanie hamujące w tworzeniu się β amyloidu i pomyślnie wpływa na wzrost neuronów. Frakcje mające niższą średnią masę cząsteczkową (640) lub wyższą (4.800) masę cząsteczkową wykazują zdecydowanie niższą lub obojętną skuteczność.

W związku z tym, frakcje glikozoaminoglikanów mające średnią masę cząsteczkową 2.400 mogą mieć zastosowanie do otrzymywania kompozycji farmaceutycznych mających zastosowanie do leczenia otępienia starczego, przede wszystkim do leczenia choroby Alzheimera lub SD AT (otępienia starczego typu Alzheimera), zarówno jak i w leczeniu uszkodzeń mózgu typu neurologicznego spowodowanych udarem mózgu lub urazem.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie glikozoaminoglikanów do przygotowywania kompozycji farmaceutycznych podawanych w leczeniu otępienia starczego i neurologicznych uszkodzeniach mózgu spowodowanych udarem mózgu i urazami, zawierających glikozaminoglikany o średniej masie cząsteczkowej 2.400 ± 200, które są otrzymane przez depolimeryzację heparyny.

Otępienie starcze obejmuje chorobę Alzheimera lub SDAT, a kompozycje farmaceutyczne korzystnie zawierają efektywną dawkę glikozoaminoglikanów w mieszaninie farmaceutycznie dopuszczalnych rozcieńczalników lub zaróbek.

Glikozoaminoglikany korzystnie mają wskaźnik polidyspersji niższy od 1,20, są pozbawione składników peptydowych oraz są wolne od jednostek desulfitacyjnych na zredukowanym końcu.

Depolimeryzację heparyny korzystnie przeprowadza się działając na roztwór heparyny promieniami gamma, a następnie poddaje się je działaniu żelu przenikającego.

Kompozycje korzystnie są podawane podskórnie, domięśniowo, dożylnie lub doustnie.

Glikozoaminoglikany korzystnie są podawane doustnie w ilości od 25 do 400 mg na dobę.

Glikozoaminoglikany mają średnią masę cząsteczkową 2.400 ± 200, a korzystnie zawierają frakcje o średniej masie cząsteczkowej od 1920 do 2560.

Zastosowanie glikozoaminoglikanu według wynalazku zostało przedstawione na rysunku na którym fig. 1 pokazuje test HPLC glikozoaminoglikanu, mającego średnią masę cząsteczkową 2.400 (±200), jaki otrzymano według opisanego przykładu, a fig. 2 pokazuje test NMR glikozoaminoglikanu, mającego średnią masę cząsteczkową 2.400 (±200), jaki otrzymano według opisanego przykładu.

Przedmiotem wynalazku jest użycie frakcji glikozoaminoglikanów, mających średnią masę cząsteczkową 2.400 do otrzymywania kompozycji farmaceutycznych, stosowanych do leczenia otępienia starczego, a przede wszystkim choroby Alzheimera lub SDAT (otępienia starczego typu Alzheimera) zarówno jak i do leczenia uszkodzeń mózgu typu neurologicznego spowodowanych udarem mózgu lub urazem. Taką frakcję glikozoaminoglikanów otrzymuje się w wyniku depolimeryzacji heparyny, korzystnie według sposobu obejmującego następujące etapy:

a) wodny roztwór heparyny poddaje się promieniowaniu gamma z Co 60, według patentu U.S.P. 4.987.222;

b) roztwór otrzymany w etapie a) frakcjonuje się żelem przenikającym na Sephadeksie G/50 Medium resin;

c) mieszaninę frakcyjną, mającą masę cząsteczkową od 1.000 do 3.000 poddaje się ultrafiitracjj i zatrzymuje filtrację przy masie cząsteczkowej 600, następnie przemywa się i suszy w stanie zamrożenia;

d) wysuszony w stanie zamrożenia produkt rozpuszcza się i fr^ktcj^i^i^u^ żelem przenikającym na Sephadeksie G/25 Medium resin;

PL 198 016 B1

e) frakcje mające masę cząsteczkową w zakresie od 1.920 do 2.560, które odpowiadają średniej mssie cząsteczkowej równej 2.400 zbiers się i mieszs.

Otrzymywanie rrskcji glikozosminogliksnów msjących średnią mssę cząsteczkową 2.400, korzystnie metodą według niniejszego wynslszku, polegs ns tym, że 10% wodny roztwór hepsryny ns początku poddsje się promieniowaniu gsmms Co 60 o mocy pomiędzy 120 KGy do 150 KGy, kolejno w dswksch 25 KGy w stosunku do mssy cząsteczkowej hepsryny. Nsstępnie, nspromieniowsny roztwór poddsje się ultrsfiltrscji i zstrzymuje się ultrsfiltrscję przy mssie cząsteczkowej 300, s potem przemyws się, sterylnie filtruje i suszy w stsnie zsmrożenis, otrzymując „bszową zdepolimeryzowsną” hepsrynę.

„Bszową zdepolimeryzowsną” hepsrynę rozpuszczs się w 0.3 M roztworze chlorku sodu i poddsje rrskcjonowsniu, stosując przeniksjący żel ns Sephsdeksie G/50 Medium resin.

Frskcje msjące mssę cząsteczkową mniejszą niż 3.000 (około 10% csłości) tworzą wyjściowy msterisł według niniejszego wynslszku.

Pierwszy krok oddzisływsnis ns mieszsnkę, obejmuje ultrsfiltrscję i przerwsnie ultrsfiltrscji przy mssie cząsteczkowej 600 w celu usunięcis frsgmentów cząsteczek otrzymsnych w wyniku depolimeryzscji.

Nsstępnie ultrs riltrowsną mieszsnkę przemyws się 0.3 M roztworem chlorku sodu, do zsniku reskcji do ksrbszolu w przesączu.

Końcową mieszsnkę, o stężeniu równym około 8% w wodzie destylowsnej, poddsje się filtrscji sterylnej ns 0,2 μ membrsnsch i suszy w stsnie zsmrożenis. Suchy, w stsnie zsmrożenis produkt rozpuszczs się w 0,3 M roztworze chlorku sodu przy stężeniu pomiędzy 10% do 15% (w/v). W celu otrzymsnis rrskcji msjącej średnią mssę cząsteczkową 2.400, stosuje się po rsz drugi żel przeniksjący, zschowując możliwie tskie ssme psrsmetry jsk przy pierwszym stosowsniu żelu przeniksjącego, używsjąc jednsk specyficzne psrsmetry Sephsdeksu G/25 Medium.

Zsstosowsns kolumns pilotsżows, może być typu BP 252/15 o nsstępujących psrsmetrsch:

• Wysokość : 105 cm • Objętość żywicy : 5.200 ml • Strumień : 1.000 ml/h.

Użyte psrsmetry to:

• Ve • Ve/Vo • R • K gdzie:

• Ve = objętość wymywsnis • Vt = csłkowits objętość żywicy • Vo = msrtws objętość (początkowy roztwór ns wyjściu) • R = rezolucjs (smplituds szczytows).

W drugim zsstosowsniu żelu przeniksjącego, otrzymuje się 10 do 12 rrskcji o msssch cząsteczkowych w zskresie od 3.000 do około 1.500. Do otrzymywsnis rrskcji glikozosminogliksnów, według niniejszego wynslszku, zbiers się i mieszs jedynie rrskcje msjące mssę cząsteczkową od 1.920 do 2.560. Roztwór końcowy poddsje się ultrsfiltrscji i przeryws się ultrsriltrscję przy mssie cząsteczkowej 300 w celu usunięcis chlorku sodu. Roztwór nsstępnie poddsje się koncentrscji do około 10%, filtruje się ns 0,2 μ membrsnsch i suszy w stsnie zsmrożonym.

Frskcjs ts stsnowi około 80% csłej rrskcji i ms mssę cząsteczkową mniejszą niż 3.000.

W sposobie według niniejszego wynslszku, otrzymuje się pożądsną rrskcję glikozosminogliksnów nsdsjącą się do wielokrotnego powtsrzsnis, msjąc ns uwsdze slbo produkt otrzymsny według tego sposobu lub stsłość kompozycji.

Poniżej podsno włsściwości rrskcji glikozosminogliksnów, według niniejszego wynslszku:

Włsściwości fizyko-chemiczne jssno-żółty proszek 2.400 (±200)

95% < 2.560 -> 1920 < 1,20 9,5 - 11,5%

2,3 - 2,6 > + 35° = 17.000 ml = 1/R=1,26 = 0,79 = 0,09=(Ve-Vo) : (Vt-Vo),

Wygląd :

Średnis msss cząsteczkows Podzisł mss cząsteczkowych Wsksźnik polidyspersji Sisrks orgsniczns Stosunek SO3/COOH Skręcslność włsściws

PL 198 016 B1

HPLC : fig. 1

NMR : fig . 2.

Średnia masa cząsteczkowa została określona przy pomocy HPLC, stosując kolumny do chromatografii ekskluzyjnej, porównując z heparyną o małej masie cząsteczkowej w zestawie kalibracyjnym z substancją odniesienia (LMW for Calibration Reference Substance Batch) nr 1a (PH.EUR.) o masie cząsteczkowej równej 3.700.

Stosunek procentowy zasiarczenienia.

Zbadano trzy przykłady i wyniki podano w tabeli 1.

T a b e l a 1

Odsiarczone kwasy uroniowe %	GlcNSO3.6 SO3 %	GlcNAc %	GlcNSOa.3,6 SO3 %
34	85	13	7
33	85	13	6
31	85	14	7

Procentowe wartości zostały wyliczone z sumy dwóch specyficznych obszarów wziętych z analizy NMR.

Odsiarczone kwasy uroniowe: obszar sygnałów o częstotliwości 102,2 i 106 ppm w odniesieniu do całkowitej ilości kwasów uroniowych o częstotliwości 100,5 i 106 ppm;

Glukozoamina. NSO3-6-siarczanowa: obszar sygnałów o częstotliwości 62,5 ppm w odniesieniu do obszaru glukozoaminy-6-siarczanowej o częstotliwości 68 ppm;

Glukozoamina. N acetylowana: obszar sygnałów o częstotliwości 55,5 ppm w odniesieniu do obszaru o częstotliwości od 61 do 54 ppm;

Glukozoamina. N,3 siarczanowa: obszar sygnałów o częstotliwości 59 ppm w odniesieniu do obszaru sygnałów o częstotliwości od 61 do 54 ppm.

Wartości zasiarczanienia glukozoaminy C.6, okazały się mniejsze, niż we frakcjach o masie cząsteczkowej 4.500 (średnia 84). Jest to związane z tym, że ze zmniejszeniem masy cząsteczkowej rosną drugorzędowe grupy alkoholowe obecne w zredukowanych ugrupowaniach końcowych, których sygnały spadają do obszaru C6 glukozoamin 6 odsiarczonych.

Wynalazek w przykładach wykonania został pokazany na rysunku, na którym fig. 1 pokazuje wykres uzyskany w chromatografii HPLC, frakcji glikozoaminoglikanów z rozmieszczeniem mas cząsteczkowych w zakresie 95% od 2.560 do 1.920, odpowiadających około 4-5 disacharydom strukturalnym, a fig. 2 pokazuje wykres analizy NMR tej samej frakcji, gdzie występuje brak sygnałów w zakresie od 84 do 85 ppm, charakterystycznym dla obszaru wiązania, które jest usunięte poprzez depolimeryzację promieniami gamma. Oderwanie łańcucha galaktozydowego i jego azotowych składników wykazuje specyficzne właściwości takiej frakcji sacharydów, pozwalając na operacje bez nakładania się fal (interferencji), zwykle o charakterze patologicznym, które wynikają z obecności struktur peptydowych mających inne związki aminokwasów.

Ponadto, badanie NMR pokazuje, że w końcowym pasie są tylko nienaruszone pierścienie lub ewentualnie składające się z alifatycznych „resztek”. Pierścienie ze zredukowanego końca nigdy nie są odsiarczone. Odsiarczone struktury glukuronowe na zredukowanych końcach, nie zostały pokazane, ponieważ zostały zniszczone przez promienie gamma. W pierścieniach z końców niezredukowanych graniczne C4s są trudne do rozróżnienia od niegranicznych C4s, ponieważ znajdują się w tym samym obszarze.

Strefy, które można zidentyfikować w sposób jednoznaczny, to tylko te NS, 3S glikozoaminy dokładnie przylegające do kwasu glukuronowego aktywnego pentameru.

Rdzenie strukturalne odpowiadają początkowej heparynie z niezmienionymi parametrami zasiarczanienia.

Sygnały anomeryczne pochodzące ze zredukowanych grup GlcNSO36SO3 i IdoA2SO3, kwalifikują frakcję glikozoaminoglikanów, według niniejszego wynalazku, jako substancję z ugrupowaniami końcowymi podobnymi do tych należących do fragmentów z naturalnej heparyny.

Przede wszystkim, korzystna do zastosowania według niniejszego wynalazku jest frakcja glikozoaminoglikanów, mająca średnią masę cząsteczkową 2.400 z parametrem polidyspersji mniejszym

PL 198 016 B1 niż 1,20, z całkowitym brakiem składników peptydowych, wolna od jednostek odsiarczonych na zredukowanych końcach, otrzymana bez resulfinikacji i bez obecności katalizatorów.

Właściwości biologiczne

Ph.E. aktywność heparynowa = brak

USP aktywność heparynowa = brak

Aktywność anty Xa =< 50 U aXa/mg

Aktywność anty Ha =<10U

Z powyższej charakterystyki wynika, że frakcja glikozoaminoglikanów, według niniejszego wynalazku potwierdza brak aktywności heparyny w stosunku do parametrów koagulacji, mimo utrzymania właściwości strukturalnych cząsteczki heparyny, oczywiście z o wiele mniejszą masą cząsteczkową heparyny.

P r z y k ł a d

100 g heparyny sodu z błony śluzowej jelitowej świni, mającej masę cząsteczkową 14.000 i aktywność 190 U/mg rozpuszczono w 1 litrze destylowanej i odgazowanej wody.

Roztwór przelano do pojemnika z pyreksu i zamknięto szklanym korkiem po przepuszczeniu argonu. Roztwór poddano działaniu 130 kGy promieni gamma z Co 60, w kolejnych dawkach około 25 kGy, otrzymując zdepolimeryzowaną heparynę.

Napromieniowany roztwór poddano ultrafiltracji i ultrafiltrację zatrzymano przy masie cząsteczkowej 300, następnie oczyszczono przepuszczając kilkakrotnie przez 3% NaCl i wysuszono w stanie zamrożenia, przy stężeniu około 10%. „Bazową zdepolimeryzowaną” heparynę rozpuszczono w 10% w 0.3 M roztworze NaCl i frakcjonowano na kolumnie z żelem przenikającym, zawierającej Sephadex G 50 Medium.

Po rozdzieleniu składników mających masę cząsteczkową większą niż 8.000 i będących wielokrotnością w stosunku do heparyny około 4.500, otrzymano frakcje o masie cząsteczkowej mniejszej niż 3.000. Frakcje te oczyszczono przy zastosowaniu ultrafiltracji i ultrafiltrację przerwano przy masie cząsteczkowej 600, aby usunąć fragmenty cząsteczek powstałych w wyniku procesu depolimeryzacji.

Po kolejnych trzech przemyciach w 0.3 M roztworze NaCl, aby uniknąć reakcji do karbazolu w permentacji, mieszaninę poddano koncentracji do około 8% i roztwór po przefiltrowaniu na 0,2 um membranach suszono w stanie zamrożonym. Suchy, w stanie zamrożenia produkt rozpuszczono w roztworze 0.3 M NaCl w takiej ilości aby ostateczne stężenie wynosiło 10% (x/v). Taki roztwór frakcjonowano na kolumnie z żelem przenikającym, zawierającej Sephadex G/25 Medium. Zebrano frakcje mające masę cząsteczkową w zakresie od 1.920 do 2.560. Otrzymany roztwór oczyszczono poprzez ultrafiltrację i ultrafiltrację zatrzymano przy masie cząsteczkowej 300 aż do usunięcia NaCl. Roztwór zagęszczono do około 10% i suszono w stanie zamrożonym.

Otrzymano: około 9 g jasno-żółtego proszku.

Analiza: średnia masa cząsteczkowa wynosiła 2.400 (+200); siarka organiczna = 9,9%.

Stosunek siarczanów/grup karboksylowych = 2,5; aktywność anty Xa = 45 U anty Xa/mg.

Test HPLC - fig. 1.

Test NMR - fig. 2.

Do celów porównawczych, stosując tę samą metodę przygotowano następujące frakcje glikozoaminoglikanów:

• Frakcja o średniej masie cząsteczkowej 640 (od 320 do 1.600);

• Frakcja o średniej masie cząsteczkowej 4.800 (od 3.350 do 6.060). Dzięki tym farmaceutycznym właściwościom wynikającym z podanych poniżej badań, glikozoaminoglikany o średniej masie cząsteczkowej równej 2.400, mogą być stosowane do przygotowywania kompozycji farmaceutycznych odpowiednich do leczenia otępienia starczego, a w szczególności choroby Alzheimera lub SDAT (otępienie starcze typu Alzheimera), zarówno jak w leczeniu uszkodzeń mózgu typu neurologicznego spowodowanych udarem mózgu lub urazem oraz różnego rodzaju degeneracji nerwowej. Powyższe kompozycje, zawierają farmaceutycznie skuteczną ilość wyżej wymienionych glikozoaminoglikanów w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnymi rozcieńczalnikami lub zaróbką i mogą być przygotowane w postaci odpowiedniej do podawania podskórnego, domięśniowego, dożylnego i ustnego. Wyżej wymienione kompozycje zawierają od 50 do 200 mg glikozoaminoglikanów w indywidualnej dawce. Niniejszy wynalazek dotyczy także terapeutycznego sposobu leczenia pacjentów cierpiących na otępienie starcze, a w szczególności chorobę Alzheimera lub SDAT (otępienie starcze typu Alzheimera) i uszkodzeń mózgu typu neurologicznego spowodowanych udarem mózgu lub urazem. Sposób leczenia polega na podawaniu odpowiedniej ilości glikozoaminoglikanów o średniej masie cząsteczkowej 2.400

PL 198 016 B1 w zakresie od 10 do 400 mg dziennie. W szczególności do podawania podskórnego, domięśniowego i dożylnego, odpowiednia ilość wynosi od 10 do 200 mg dziennie, a do podawania doustnego, ilość ta wynosi od 25 do 400 mg dziennie.

Badania farmakologiczne.

W badaniach farmaceutycznej aktywności frakcji glikozoaminoglikanów, według niniejszego wynalazku, zastosowano badanie modelowe na szczurach, które powtórzyło niektóre objawy uszkodzeń typowych dla otępienia starczego (Sigurdsson EM; Lorens S.A.; Hejna MJ; Dong WX; Lee JM. „Local and Distal Histopathological Effects of Unilateral Amyloid-β 25-35 Injections into the Amygdala of Young F344 Rats”. Neuro Biol Aging 1996; 17:893-901).

W szczególności zbadano następujące parametry:

• Białka Tau-2, w powiązaniu do podmiotu reakcji do substancji β amyloidowej (pośrednia reaktywność);

• Białka GFAP (białko kwasowe włókienkowo-glejowe), w powiązaniu do reaktywności astrocytów do β amyloidu (reaktywność bezpośrednia).

Materiały stosowane do badań:

• β amyloid:

Sól sodowa Αβ 25-35 w roztworze kwasu trifluorooctowego (TFA) (VEH1) o zawartości peptydów 82-89% (BACHEM, Torrance, CA).

Amyloid β z odpowiednim nośnikiem (VEH1) rozcieńczono wodą Nanopure w takim stosunku aby uzyskać zagęszczenie 5nmol/ 3.0 ml, natychmiast przed zastosowaniem i utrzymywano w temperaturze 4°C.

• Glikozoaminoglikany, TGSS:

Użyto trzy rodzaje TGSS (preparatów glikozoaminoglikanów) o różnych masach cząsteczkowych, które przygotowano w sposób wyżej wymieniony według następującej tabeli:

Rodzaj TGSS	Średnia masa cząsteczkowa	Średnia liczba monosacharydów
C8	640 (320-1600)	2
C3	2400 (1920-2560)	8
C7	4800 (3520-6060)	15

Produkty te składały się z jasno-żółtego proszku rozpuszczalnego w wodzie, który przechowywano w suszarce w temperaturze pokojowej.

Do zastrzyków dla szczurów, przygotowano roztwory o stężeniu 1 mg/ml w płynie fizjologicznym (VEH2). Roztwory przechowywano w temperaturze 4°C przez okres nie dłuższy niż dwa tygodnie.

• VEH1:

Kwas trifluorooctowy (TFA) (10 nmoli w 3 μ litrach wody destylowanej), nośnik β amyloidowy.

• VEH2:

Roztwór fizjologiczny, nośnik TGSS.

Metody badawcze.

Model zastosowany do badań oparty jest na objawach jaki daje zastrzyk z Αβ 25-35 do obszaru centralnego mózgu amigdali. Sekwencja aminokwasów Αβ 25-35 jest uważana jako neurotoksyczna (Yankner BA; Duffy LK; Kirscner DA; „Neurothrophic and Neurotoxic Effects of Amyloid-β Protein. Reversal by Tachykinin Neuropeptides”. Science 1990: 250-282), ponieważ powoduje uszkodzenia typowe dla Αβ 1-41 lub Αβ 1-43. Badania przeprowadzono na młodych (3-4 miesięcznych) szczurach męskich z rodzaju Fischer 344, które dostały domózgowy zastrzyk z 5 nmoli/3,0 μl A β25-35 lub z odpowiedniego nośnika (VEH1) w prawą amigdalę. TGSS lub odpowiednie nośniki VEH2 administrowano dwa razy dziennie podskórnie na dwa dni przed zastrzykiem domózgowym z Αβ i przez 32 dni po tym zastrzyku, w dawkach określonych poniżej. Dla analizy histologicznej zwierzęta uśpiono pentobarbitalem sodu i przepłukano przez tętnice (transtętniczo) 4% roztworem formaldehydu. Zrobiono pięć nacięć czołowych (40 μίτι) z 0,2 mm przerwami. Nacięcia weszły w kontakt z przeciwciałami białka Tau-2 i z białkiem kwasowym włókienkowo glejowym (GFAP). Szczury Fischer 344 wzięto z Harlan Sprague-Dawley Inc. (Indianapolis, In). Po przywiezieniu, szczury ważyły 250-300 g i miały od 3 do 4 miesięcy. Zwierzęta trzymano w oddzielnych klatkach z 12 godzinnym cyklem światła i w ciemności (światło o 7 rano), w warunkach zatwierdzonych przez AAALAC (American Association Animal Laboratory and Care). Miały one nieograniczony dostęp do jedzenia i wody i były trzymane w takich

PL 198 016 B1 warunkach przez 2-3 tygodnie przed badaniem. Zastrzyk z Αβ 25-35 zrobiono w stanie narkozy pentobarbitalem sodu (50mg/kg, i.p.; Butler, Columbus, OH). Podczas narkozy, zwierzętom podawano domięśniowo także siarczan atropiny (0,4 mg/kg; Sigma. St. Louis, MO) i ampicylinę sodu (50mg/kg; Sigma. St. Louis, MO). Zastrzyk domózgowy do prawej amigdali zrobiono za pomocą zestawu instrumentów stereotaktycznych (Kopf), na głębokości nie większej niż 3,3 mm pod linią ucha. Współrzędne dla zastrzyku zostały określone przez kręg szczytowy Paxinosa i Watsona zmierzony od ciemienia czaszki ze współrzędnymi AP-3,0, ML-4,6 i DV-8,8. Współrzędne przednio-tylne (AP) umieszczono tam, gdzie struktura amigdali jest szersza. Współrzędne środkowo-boczne (ML) wycentrowano w odniesieniu do środkowego i bocznego rdzenia amigdalu i na koniec współrzędne grzbietowo-brzuszne wycentrowano na granicy grzbietowo-brzusznej amigdali. Wstrzyknięta objętość 3 ul została wciągnięta w ciągu 6 minut, przy użyciu pompy dla mikrostrzykawek typu CMA/100 (Carnegie Medici AD. Soln, Sweden). Rurka pozostawała w miejscu przez 2 minuty po zastrzyku, a następnie została powoli usunięta. Po tym zabiegu zwierzęta pozostawały na podgrzanej płycie do momentu, kiedy wykazały refleks równowagi. Po 35 dniach od zabiegu, zwierzęta uśpiono pentobarbitalem sodu (100 mg/kg I.P.) i przepłukano w sposób transaortowy 250 ml 0,1 M roztworu buforowego fosforanu sodowo/potasowego o pH 7,4 (PB). Następnie, przepłukano 4% formaldehydem w 500 ml PB, z szybkością 500ml/h w temperaturze pokojowej. Natychmiast po rozpoczęciu przemywania zrobiono zastrzyk transaortyczny z 1 U/g heparyny (Upjohn Kalamazoo). Po przemyciu, mózg został odizolowany i włożony do 20% roztworu sacharozy na 1 godzinę, a potem został pocięty na 6 mm paski wokół miejsca zastrzyku i przechowywany w temperaturze 4°C w 20% roztworze sacharozy i 0,1% roztworze azydku sodu oraz 0,01% roztworze bacytracyny w PB przez 24 godziny. Na końcu, paski tkanki przełożono do 20% roztworu glicerolu i 2% sulfotlenku dimetylowego w 0,1 M buforowym fosforanie sodowym, w temperaturze 4°C do momentu sekcji. Nacięcia czołowe 40 um wykonano po pięć w odległości 0,2 mm jeden od drugiego i zbadano histologicznie na obecność białek Tau-2 i GFAP.

Badania histologiczne.

Fiolet krezolowy.

Nacięte paski przemyto ksylenem i nawilżono alkoholem i wodą. Barwienie wykonano poprzez kontakt pasków z roztworem zawierającym 200 ml 0,2 M kwasu octowego, 133 ml 0,2 M octanu sodu i 67 ml 0,1 % octanu fioletu krezolowego. Następnie, paski wielokrotnie osuszono etanolem i przemyto ksylenem. Pokolorowane paski pokryto szkiełkiem do odczytu mikroskopowego.

Czerwień Kongo.

Nacięte paski przemyto i nawilżono etanolem i wodą. Barwienie wykonano poprzez kontakt pasków z roztworem zawierającym 1% czerwieni Kongo i 50% etanolu w czasie 1 godziny. Następnie, paski zanurzano w nasyconym roztworze węglanu litu i przemyto pod bieżącą wodą przez 15 minut. Następnie, kolorowanie przeciwne przeprowadzono w hematoksylinie Harrisa przez 2 minuty i potem w wodzie i dodano 1% roztwór hydroksykwasu. Paski przemyto wodą, zanurzono w wodnym roztworze siarczanu amonu i ponownie przemyto pod bieżącą wodą. Ostatecznie paski osuszono etanolem i oczyszczono ksylenem. Pokolorowane paski pokryto szkiełkiem do odczytu mikroskopowego.

Białko Tau-2.

um nacięte paski oczyszczono w krioprotektorze i przechowywano przez noc w roztworze buforowym PBS w temperaturze 4°C. Rano, paski poddano działaniu przez 30 minut 0,3% roztworu H2O2 w tris buforowym roztworze (PBS) o pH 7,6 i następnie przemyto 3 razy przez 10 minut 0,3% roztworem trytonu X-100 w PBS. Paski poddano inkubacji przez 24 godziny z przeciwciałem Tau-2 (Sigma) w rozcieńczeniu 1:500 w temperaturze pokojowej. Rozpuszczalnik dla przeciwciała zawierał 2% trytonu X-100, 0,1% azydku sodowego, 0,01% bacytracyny, 2% białka jedwabiu i 10% zwykłej surowicy końskiej w PBS. Na koniec, tkankę przemyto 3 razy przez 10 minut 0,3% roztworem trytonu X-100 w PBS, a następnie poddano inkubacji przez 1 godzinę z przeciwciałami dla immunoglobuliny (Vectastain ABC Elite Kit, Vector Laboratories Burlingame CA), o rozcieńczeniu 1: 200 w 0,3% roztworze trytonu X-100 w PBS. Po dwóch przemyciach 0,3% roztworem trytonu X-100 w PBS przez 15 minut, tkankę poddano inkubacji przez 1 godzinę z peroksydazą awidyny chrzanu (Vector) o rozcieńczeniu 1: 2000 z 0,3% roztworem trytonu X-100 w PBS. Następnie, paski przemyto PBS przez 1 godzinę i potem jeszcze raz przez 15 minut buforowym roztworem octanu sodowego (0,2 M o pH 6,0). Następnie paski poddano reakcji z 3-3 tetrachlorowodorkiem diaminobenzydyny (DAB) i siarczanem amonowo-niklowym (35 mg DAB, 2,5 g siarczanu amonowo-niklowego na 100 ml buforu octanu sodowego z 0,3% H2O2). Następnie, paski umieszczono w buforowym roztworze octanu sodowego

PL 198 016 B1 i kolejno w PBS w temperaturze 4°C i tak przechowywano przez noc. Po tym, paski osuszono i pokryto szkiełkiem do odczytu mikroskopowego.

Białko GFAP.

Kolorowanie przeprowadzono stosując białko Tau-2, z tym, że przeciwciała rozcieńczono w surowicy baraniej a nie końskiej. Pierwotne przeciwciała GFAP ( DAKO, Dania) użyto w rozcieńczeniu 1:500. Paski kolorowane przy użyciu fioletu krezolowego badano mierząc rozmiar osadów Αβ. Powierzchnię osadów Ae mierzono w 0,2 mm odstępach. Osady Aji badano również przy jabłeczno-zielonym załamaniu światła, stosując polaryzujące światło szkiełek zabarwionych czerwienią Kongo. Na podstawie wyników histochemicznych obliczono komórki, które wchodziły w reakcję z Tau-2 we wszystkich paskach mózgowych, podczas gdy reaktywne astrocyty oszacowano na skali od 0 do 2. Zaobserwowano, że zwierzęta wykazały dodatni wynik badania, jeśli pojawiły się dodatnie zabarwienia od 1 do 2.

Procedura badawcza i wyniki.

Dla każdego eksperymentu użyto czterech różnych grup szczurów:

1. Grupa VEH1 + VEH2: szczurom wstrzyknięto w amigdale nośnik VEH1 (TFA) i podskórnie nośnik VEH2 (roztwór fizjologiczny);

2. Grupa Aji + VEH2: szczurom wstrzyknięto w amigdalę AJ3 25-35 i podskórnie nośnik VEH2 (roztwór fizjologiczny);

3. Grupa AJ3 + TGSS: szczurom wstrzyknięto w amigdalę Aji 25-35 i podskórnie TGSS;

4. Grupa VEH1 + TGSS: szczurom wstrzyknięto w amigdalę nośnik VEH1 (TFA) i podskórnie nośnik TGSS.

Każdy rodzaj badania przeprowadzono na co najmniej 6-ciu zwierzętach w grupie. Następnie, po tych zabiegach, użyto trzy rodzaje TGSS o trzech różnych średnich masach cząsteczkowych, jak podano poniżej:

C3-2.400, przy dawce 2,5 mg/kg s.c

C8-640, przy dawce 2,5 mg/kg s.c

C7-4.800, przy dawce 2,5 mg/kg s.c.

Każdy TGSS poddano dwóm innym badaniom dla potwierdzenia się wyników. Każdemu badaniu poddano nastę puj ącą ilość zwierząt:

Badania	Liczba zwierząt
1. VEH1 + VEH2	30
2. A(3 + VEH2	36
3a. A(3 + C3	23
3b. A(3 + C8	17
3c. A(3 + C7	21
4. VEH1 + TGSS (C3 lub C7 lub C8)	30

Zwierzęta, którym wstrzyknięto VEH1 do amigdali (badanie bez amyloidu) i jeden z TGSS (C3 lub C8 lub C7) zawsze wykazywały praktycznie identyczne wyniki jak badana grupa 1, której wstrzyknięto jedynie nośniki VEH1+VEH2.

a) Reaktywność białka Tau-2 (liczba reaktywnych komórek); średnia wartość ± standardowe odchylenie.

Badania	Liczba badanych	Liczba komórek reaktywnych/paska tkanki
1. VEH1+VEH2	30	11 ± 5
2. AP + VEH2	36	66 ± 12
3a. A(3 + C3	23	25 ± 16 p<0,05 Vs Ap + VEH2 (test Newman-Keuls)
3b. A(3 +C8	17	60 ± 14
3c. Ap +C7	21	22 ± 17 p<0,05 Vs A± + VEH2 (test Newman-Keuls)
4. VEH1 + TGSS (C3 lub C7 lub C8)	30	10 ± 3

PL 198 016 B1

Z badań tych wynika, że C3 i C7 są czynne i obniżają reaktywność do białka Tau-2, natomiast C8 o najniższej masie cząsteczkowej w odniesieniu do disacharydów nie wykazuje żadnej aktywności. Próbki kontrolne nie poddane działaniu Α β zachowują się identycznie, gdy wstrzykuje je się podskórnie zarówno z płynem fizjologicznym (grupa 1) lub TGSS (grupa 4). Silne obniżenie poziomu reaktywności do białka Tau-2 przez oddziaływanie związku C3 również zostało potwierdzone w badaniach, podczas których C3 podawano szczurom doustnie. Model badania oraz sposób wykrywania były identyczne jak te opisane powyżej, z tą różnicą, że C3 podawano doustnie w dawce 20mg/kg a nie podskórnie. C3 podawano raz dziennie rozpoczynając trzy dni przed zastrzykiem z Α β 25-35 do czternastu dni po tym zastrzyku. Szczury uśmiercono po czternastu dniach od zastrzyku z Α β 25-35. Otrzymane wyniki podano w następującej tabeli, z której wynika, że C3 mocno obniża reaktywność do białka Tau-2 u szczurów, którym podawano Α β 25-35.

Badania	Liczba badanych	Liczba komórek reaktywnych/paska tkanki
Αβ + VEH2	6	52 ± 7
AP+C3	6	9 ± 2 p<0,01 (test T studenta)

b) Reaktywność astrocytów (% badanych zwierząt, które wykazywały reaktywność +1 lub +2): wartości średnie.

Badania	Liczba badanych	% badanych zwierząt, które wykazywały reaktywność +1 lub +2
1. VEH1+VEH2	30	37
2. A\|3± + VEH2	36	87
3a. Af) + C3	23	35p<0,05 Vs A\|3 + VEH2 (χ2 Fischer)
3b. A\|3 ± C8	17	88
3c. A\|3 + C7	21	67
4. VEH1 + TGSS (C3 lub C7 lub C8)	30	26

Co do reaktywności astrocytów, jedyny produkt, który wykazywał znaczną aktywność był C3 (grupa 3a). Produkty C8 i C7 (grupy 3b i 3c) nie wykazywały żadnej aktywności.

Na podstawie tych wyników, nieoczekiwanie okazało się, że C3 TGSS, o średniej masie cząsteczkowej 2.400, wykazywał o wiele większą aktywność niż TGSS, które mają odpowiednio wyższą i niższą masę cząsteczkową. W szczególności średnia masa cząsteczkowa 2.400 jest optymalna dla obniżenia reaktywności białka Tau-2 oraz reaktywności astrocytów. W innym badaniu na szczurach, obserwowano zdolność C3 do przekroczenia bariery hematoencefalicznej po podawaniu dożylnie. W tym celu, użyto produkt oznaczony trytem (³H). Oznakowanie produktu wynosiło 700.000 DPM/mg ³H-C3. Po podaniu dożylnie dawki 2,5 mg/kg, szczury uśmiercono, stosując pentobarbital sodowy w określonym czasie 45 minut. Następnie badano poziomy oznaczonego produktu we krwi, w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) i w mózgu (po wolnym wchłanianiu, aby usunąć krew z żył). Płyn mózgowo-rdzeniowy pobrano kapilarą szklaną z czwartej komory (w ilości zawsze wyższej niż 200 pl, po całkowitym wykrwawieniu się zwierzęcia). DPM oszacowano stosując scyntylację i rozcieńczając 20 pl jednorodnego mózgu w 5 ml roztworu fizjologicznego. Wyniki przedstawione w tabeli poniżej, pokazują, że ³H-C3 jest zdolny do przejścia bariery hematoencefalicznej w znacznych ilościach.

Tkanka	Liczba badanych	DPM/ml
Surowica	5	404 ±138,3
CSF	5	85 + 13,0
Mózg	5	217 ± 217,2

W grupie kontrolnej zwierząt, wartości DPM/ml były zawsze niższe niż 41 we wszystkich badanych tkankach. Po otrzymaniu tych wyników, przeprowadzono badanie na aktywność anty Xa

PL 198 016 B1 w surowicy, w CSF i w mózgu. Znane jest, że czynnik Xa (czynnik koagulacji X) jest hamowany tylko przez frakcje oligosacharydów siarki, zawierających więcej niż cztery sacharydy. W grupie szczurów badanych tak jak powyżej, zaobserwowano, że po 45 minutach od podawania dożylnie C3 w dawce 2,5 mg/kg, aktywność anty Xa jest znacznie większa w plazmie, w CSF i w tkance mózgowej. Jest to kolejne potwierdzenie, że produkt przekraczający barierę hematoencefaliczną zawiera C3, a nie produkty nieaktywnej degeneracji, takie jak disacharydy lub tetrasacharydy. U szczurów, którym wstrzyknięto Α β 25-35 zarówno z C3 jak i bez, badano wzrost neuronalny. Użyto w tym celu metody barwienia Rapid Golgi, którą z powodu jej kompleksowego działania, zastosowano tylko u ograniczonej ilości zwierząt. Jak pisano powyżej, C3 podawano podskórnie w dawce 2,5 mg/kg dwa razy dziennie przez dwa dni przed wstrzyknięciem domózgowym Α β 25-35 i przez 32 kolejnych dni. Badano neurony mózgowe z poziomu V obręczy mózgu (cingulate gyrus). W teście mierzono długość dendrytów oraz stosunek między liczbą końcowych rozgałęzień i liczbą pierwotnych rozgałęzień (stosunek T/B). Im wyższy stosunek T/B, tym wyższa kompleksowość i liczba powiązań neuronów.

Wyniki podano w tabeli poniżej:

Badania	Liczba badanych	Długość dendrytów %	Stosunek T/B
VEH1 +VEH2	7	100 ± 2,1	4,3 ± 0,15
Αβ + VEH2	8	94 ± 2,0	4,0 ± 0,16*
AP+C3	6	110 ± 3,0	4,7 ± 0,19**

*p<0,05 Αβ + VEH2 Vs VEH1 + VEH2 **p<0,05 Αβ + VEH2 Vs Αβ+ C3

Tabela pokazuje, że Α β szkodzi wzrostowi neuronów, a C3 naprawia wyrządzone szkody. Ponadto, zauważono, że C3 działa w sposób neurotroficzny przydatny w przypadku uszkodzeń nerwowych lub urazów powodujących uszkodzenia neuronalne.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie glikozoaminoglikanów do przygotowywania kompozycji farmaceutycznych podawanych w leczeniu otępienia starczego i neurologicznych uszkodzeniach mózgu spowodowanych udarem mózgu i urazami, zawierających glikozaminoglikany o średniej masie cząsteczkowej 2400, otrzymane przez depolimeryzację heparyny.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że otępienie starcze obejmuje chorobę Alzheimera lub otępienie starcze typu Alzheimera.
3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że farmaceutyczne kompozycje zawierają efektywną dawkę glikozoaminoglikanów w mieszaninie farmaceutycznie dopuszczalnych rozcieńczalników lub zaróbek.
4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że glikozoaminoglikany mają wskaźnik polidyspersji niższy od 1,20, są pozbawione składników peptydowych oraz są wolne od jednostek desulfitacyjnych na zredukowanym końcu.
5. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że depolimeryzację heparyny przeprowadza się działając na roztwór heparyny promieniami gamma, a następnie poddaje sieje działaniu żelu przenikającego.
6. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że kompozycja jest podawana podskórnie, domięśniowo, dożylnie lub doustnie.
7. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że glikozoaminoglikany są podawane doustnie w ilości od 25 do 400 mg na dobę.
8. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że glikozoaminoglikany mają średnią masę cząsteczkową 2.400 ± 200.
9. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że glikozoaminoglikany mają frakcje o średniej masie cząsteczkowej od 1920 do 2560.