JP2002544233A

JP2002544233A - 老人性痴呆症の治療に適した平均分子量が２，４００ｄに等しいグリコサミノグリカン

Info

Publication number: JP2002544233A
Application number: JP2000617903A
Authority: JP
Inventors: コルネリ，ウンベルト; アンブロシ，ルイジデ; ハニン，イスラエル; フェアエド，ジャウド; リー，ジョン; ロレンズ，スタンリー; メルヴィス，ロナルド，エフ．
Original assignee: コルネリ，ウンベルト
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2002-12-24
Also published as: RU2248800C2; AU764743C; CA2373975A1; ZA200109331B; IT1312107B1; PT1181024E; HUP0201100A2; ATE288761T1; KR20020005033A; IL146458A0; CN1350459A; PL198016B1; KR100711142B1; NO328902B1; CZ20014092A3; NO20015544D0; ES2237425T3; HK1039903A1; HUP0201100A3; CN1178667C

Abstract

(57)【要約】本発明は、老人性痴呆症、特にアルツハイマー病またはSDAT（Senile Dementia Alzheimer’s Type；アルツハイマー型老人性痴呆症）の治療、ならびに発作および外傷により生じた大脳の神経学的損傷の治療に適した医薬組成物を調製するための、平均分子量が2,400Dに等しいグリコサミノグリカンの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、老人性痴呆症ならびに発作および外傷から生じた脳神経障害の治療
に適切な低分子量のグリコサミノグリカンに関する。従来技術老人性痴呆症、特にアルツハイマー型は、主にアミロイド物質がプラーク状で
脳血管（血管アミロイド）または脳物質（脳アミロイド）のいずれかに脳沈着す
ることを特徴とする。上記アミロイドは双方ともβアミロイドまたはAβと定義さ
れている。老人性痴呆症の生理病理学的レベルでの他の代表的な特徴は、NFT（神
経原繊維濃縮体）と呼ばれるニューロンにおける原繊維濃縮体（fibrillary tan
gle）の存在である。プロテオグリカン類（PGs）、そして特にヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSP
G）がAβの重合またはNFTの凝集に、そしてまたアルツハイマー病と一般的には
老人性痴呆症に関連する他の病理的事象にも関与していることが知られている（
Snow AD；Sekiguchi R；Nicholin Dら、「へパラン硫酸プロテオグリカンのラッ
ト脳の原繊維βアミロイドの蓄積および残留モデル系における重要な役割」（An
Important Role of Heparan Sulfate Proteoglycan （Perlakan） in a Model
System for the Deposition and Persistence of Fibrillar Beta Amyloid in R
at Brain） Neuron 1994; 12: 219-234、及びPerry G；Sieslak SL；Richey P,
Kawai Mら、「アルツハイマー病におけるへパラン硫酸プロテオグリカンと神経
原繊維濃縮体との会合」（Association of Heparan Sulfate Proteoglycan with
Neurofibrillary Tangles of Alzheimer's Disease） J. Neurosci. 1991; 11:
3679-3683）。さらに、Snowによる原論文（Willmer JP；Snow AD；Kisilevski R.「アルツハ
イマー病のアミロイド病変と結合した硫酸グリコサミノグリカンのデモンストレ
ーション」（The Demonstration of Sulfate Glycosaminoglycans in Associati
on with the Amyloidogenic Lesions in Alzheimer's Disease） J. Neuropath.
Exp. Neurol. 1986; 45: 340-346）には、老人性痴呆症を患う患者の脳アミロ
イドプラークにおけるPgsおよびグリコサミノグリカン類（GAGs）の存在が開示
されている。いくつかの研究（Kalaria RN；Kroon SN；Grahovak I；Perry G. 「アセチル
コリンエステラーゼ及びアルツハイマー病における皮質アミロイド沈着中のへパ
ラン硫酸プロテオグリカンとアセチルコリンエステラーゼとの会合」（Acethylc
holinesterase and its Association with Heparan Sulfate Proteoglycan in C
ortical Amyloid Deposits of Alzheimer's Disease） Neuroscience 1992; 51:
177-184）によって、PGsとアミロイドとの結合が、βアミロイドの前駆体（Aβ
PP）との直接連結により、またはAβの神経毒性配列を含有するAβ1-41もしくは
Aβ1-43との連結により引き起こされる可能性があることが示された。 Pgsは、神経原繊維濃縮体（NFT）形成の原因となるTau-2タンパク質の重合も
また増大することが証明されている（Perry G；Sieslak SL；Richey P, Kawai M
ら、「アルツハイマー病におけるへパラン硫酸プロテオグリカンと神経原繊維濃
縮体との会合」（Association of Heparan Sulfate Proteoglycan with Neurofi
brillary Tangles of Alzheimer's Disease） J. Neurosci. 1991; 11: 3679-36
83）。

【０００２】さらに、Lorensらにより行われた研究（Lorens SA；Gushawan BS；Van De Kar
L；Walegnga JM；Fareed J. 「加齢Fischer 344 雄ラットにおける硫酸ムコ多
糖治療の行動的、内分泌的、および神経化学的効果」（Behavioural, Endocrine
, and Neurochemical Effects of Sulfomucopolysaccharide Treatment in the
Aged Fischer 344 Male Rat）. Semin Thromb. Haemost. 17 Suppl. 1993; 2: 1
64-173）では、高分子量のグリコサミノグリカン（GAP、すなわちグリコサミノ
グリカンポリ硫酸塩またはAteroid(登録商標)）の経口投与によって加齢ラット
の行動欠乏（behavioural deficit）の改善が示された。

【０００３】 Contiら（Conti L：Placidi GF：Cassano GB,「痴呆の治療におけるアテロイ
ド（R）：臨床検査の結果老人性痴呆の診断および治療」（Ateroid(R) in the
Treatment of Dementia: Results of a Clinical Trial （Ban E; Lehmann HE
編）Diagnosis and treatment of Old Age Dementias） Mod. Probl. Pharmacop
sychiatry. Basel, Larger 1989 vol. 2, pp 76-84）は、老人性痴呆症を患う患
者に対してAteroid(登録商標)により処置することによって、プラセボで処置し
た患者よりも有意に高く、精神病理学的パラメータである行動および社会的行動
の改善を示すことが示された。

【０００４】 Parnettiら（Parnetti; Ban TA; Senin U.「初期退縮性痴呆におけるグリコサ
ミノグリカンポリ硫酸」（Glycosaminoglycan Polysulfate in Primary Degener
ative Dementia）. Neuropsychobiology 1995; 31: 76-80）は、Ateroid(登録商
標)によって、老人性痴呆症において変化がみられるいくつかの生化学的パラメ
ータ、例えば血液プラークのモノアミンオキシダーゼBならびに脳脊髄液中のド
ーパミンおよびセロトニンレベルなどが有意に改善されうることが示された。

【０００５】これらの観察結果は、Ateroid(登録商標)が老人性痴呆症の治療に有用である
ことを示唆するものであり、1988 U. Cornelli およびT. Bann（EP 293974）に
おいては既に老人性痴呆症の治療におけるこの生成物の使用について特許が取得
されている。

【０００６】発明の概要本発明者は、驚くべきことに、in vivo実験において、ヘパリン解重合から得
られた平均分子量が2,400 Dに等しいグリコサミノグリカン画分がβアミロイド
の形成阻害および神経成長の支持に対して格別の有効性を示すことを見出した。平均分子量がより低い（640 D）またはより高い（4800 D）画分は、確かにそ
れより低いかまたはごくわずかな有効性しか示さない。従って、平均分子量が2,400 Dに等しいグリコサミノグリカン画分は、老人性
痴呆症、特にアルツハイマー病またはSDAT（Senile Dementia Alzheimer’s Typ
e；アルツハイマー型老人性痴呆症）の治療、ならびに発作および外傷により生
じた脳神経損傷の治療に適した医薬組成物を製造するために有用でありうる。

【０００７】詳細な説明本発明は、老人性痴呆症、特にアルツハイマー病またはSDAT（アルツハイマー
型老人性痴呆症）の治療、ならびに発作および外傷により生じた脳神経損傷の治
療に適した医薬組成物を製造するための、平均分子量が2,400 Dに等しいグリコ
サミノグリカン画分の使用に関する。

【０００８】上記グリコサミノグリカン画分は、ヘパリンの解重合、好ましくは以下の工程
を含む方法によって行うヘパリンの解重合により得られる： a）ヘパリン水溶液を、米国特許第4,987,222号に従ってCo 60 からのγ線照射に
より処理する工程； b）工程a）で得られた溶液をSephadex G/50 Medium樹脂上でのゲル浸透により分
画する工程； c）分子量が1,000〜3,000Dの画分の混合物を600 D カットオフで限外濾過し、洗
浄し、凍結乾燥する工程； d）凍結乾燥生成物を溶解し、Sephadex G/25 Medium樹脂上でのゲル浸透により
分画する工程； e）平均分子量が2,400 Dに等しい画分に相当する分子量が1,920〜2,560Dの画分
を回収し、混合する工程。

【０００９】本発明の好ましい方法を用いて平均分子量が2,400 Dに等しいグリコサミノグ
リカン画分を調製するために、最初に10％ヘパリン水溶液を、Co 60からのγ線
照射により120 KGy〜150 KGyの強度で処理し、続いてヘパリン分子量に関して25
KGyの用量で処理する。

【００１０】放射線照射溶液を300 D カットオフで限外濾過し、精製し、滅菌濾過し、凍結
乾燥することによって、「源（mother）解重合」ヘパリンを得る。この「源解重合」ヘパリンを0.3 M NaCl溶液に溶解した後、Sephadex G/50 Me
dium樹脂上でゲル浸透することにより分画する。分子量が＜3,000Dの画分（全体の約10％）が本発明の原料となる。上記混合物の最初の処理は、600 D カットオフでの限外濾過を行って、解重合
過程で生じる分子断片を除去することである。限外濾過した混合物は、0.3 M NaCl で洗浄して、透過溶液中のカルバゾール
との反応が消失する。最終混合物は、蒸留水中で濃度が約８％に等しくなるように取り上げ、0.2μ
膜で滅菌濾過し、凍結乾燥する。

【００１１】凍結乾燥生成物は、10％〜15％（w/v）の濃度で0.3 M NaCl 溶液に溶解する。

【００１２】 2,400 Dに等しい平均分子量の画分を得るために、２回目のゲル浸透処理を実
施する。この２回目の処理は、１回目ののゲル浸透とほぼ同じパラメータを維持
しているが、Sephadex G/25 Mediumの特定の特徴を利用するものである。

【００１３】使用するパイロットカラムは、以下の特徴を有するBP 252/15 種のものであり
うる。・高さ：105cm ・樹脂容量：5,200ml ・流量：1,000ml/時間採用するパラメータは以下のように表される。・Ve＝17,000ml ・Ve/Vo＝1/R＝1.26 ・R＝0.79 ・K＝0.09＝（Ve−Vo）：（Vt−Vo）〔式中、 Ve＝溶出量 Vt＝樹脂の総量 Vo＝デッドボリューム（流出中の最初の溶液） R＝分解能（ピーク振幅）〕２回目のゲル浸透から10〜12の画分が得られ、それは3,000 D〜約1,500 Dの一
連の分子量のものを含む。本発明のグリコサミノグリカン画分を調製するために
、分子量が1,920 D〜2,560 Dである画分のみを回収し、混合する。得られる溶液をカットオフ 300で限外濾過し、塩化ナトリウムを除去する。上記溶液を、濃度約10％とし、0.2μで濾過し、凍結乾燥する。この画分は、分子量が＜3,000Dの画分の総量の約80％である。本発明の方法にしたがって、工程収率または分子組成物の安定性に関する限り
、顕著な再現性インデックスを有する所望のグリコサミノグリカン画分を得るこ
とができる。

【００１４】以下に、本発明のグリコサミノグリカン画分の特性を記載する。化学・物理学的特徴外観：淡黄色粉末平均分子量：2,400 D（±200）分子量分布：95％が＜2,560 D〜＞1,920 D 多分散インデックス：＜1.20 有機硫黄：9.5〜11.5％ SO₃/COOH比：2.3〜2.6 比旋光度：＞＋35° HPLC：図１ NMR：図２平均分子量は、排除クロマトグラフィー用のカラムを用いたHPLCにより、分子
量＝3,700の較正基準物質バッチno.1a（PH. EUR.）のためのLMWヘパリンと比較
して、測定した。

【００１５】硫酸化率（％）３つのサンプルを試験し、その結果を表１に示す。

【００１６】

【表１】比率の値（％）は、NMR 分析から考察した２つの特定領域の合計で算出した。

【００１７】脱硫酸ウロン酸：100.5および106 ppmにおける総ウロン酸に対して102.2及び106
ppm のシグナル領域；グルコサミン. NSO₃-6-硫酸塩：68 ppmにおけるグルコサミン-6-硫酸塩の領域に
対して62.5 ppmにおけるシグナル領域；グルコサミン. N アセチル化：61〜54 ppmにおけるシグナル領域に対して55.5 p
pm におけるシグナル領域；グルコサミン. N,3硫酸塩：61〜54 ppmにおけるシグナル領域に対して59 ppmに
おけるシグナル領域。グルコサミンのC.6における硫酸化値は、分子量が4,500 D（84の平均）の画分
のものよりも低いことがわかる。このことは、分子量が低くなることによって、シグナルがグルコサミン-6-脱
硫酸塩のC6域に入る、還元末端単位に存在する第２級アルコール基が増大すると
いう事実によるものである。

【００１８】構造的特徴図１は、ほぼ4〜5の構成要素のニ糖類に相当する、95％が2,560 D〜1,920 Dの
分子量に分布するグリコサミノグリカン画分のHPLCにより得られたプロットを示
す。

【００１９】図２は、同じ画分のNMR プロットを示し、γ線照射による解重合により除去さ
れる結合部位を特徴とする84〜85 ppmのシグナルの不在がわかる。ガラクトシド
鎖およびその窒素成分の脱離は、この糖類画分の特定の特徴を表すものであり、
これによって、干渉、通常は種々のアミノ酸組成物を有するペプチド構造の存在
から導かれる病理学的特徴の干渉なく実施することができる。

【００２０】 NMR分析によって、さらに末端領域には完全な環または最終的には脂肪族の「
残り」から構成されるものがあることが明らかである。還元末端の環は脱硫酸化されていない。還元末端で脱硫酸化されたグルクロン酸構造は、これらがγ線照射により破壊
されることを説明するものではない。還元末端ではない環において、末端C4は、末端C4ではないものと区別すること
が困難である。なぜなら、それらは全て同じ領域に入るものであり、明確に同定
されるものは、グルクロン酸の活性ペンタマーに丁度隣接するNS,3S グルコサミ
ンのものである。

【００２１】この構造コアは、実際には硫酸化インデックスが変化していない最初のヘパリ
ンに相当する。 GlcNSO₃6SO₃およびIdoA2SO₃ 還元基に由来するアノマーシグナルは、本発明の
グリコサミノグリカン画分が天然ヘパリンからの断片と類似の末端単位を有する
物質であるとするものである。本発明の使用に特に適しているのは、多分散インデックスが1.20より小さく、
平均分子量が2,400Dに等しいものであり、ペプチド成分を全く含有せず、還元末
端に脱硫酸単位を含まず、再硫酸化処理をせずに触媒の不在下で得られる、グリ
コサミノグリカン画分である。

【００２２】生物学的特性 Ph.E.ヘパリン活性＝なし USP ヘパリン活性＝なし抗Xa活性＝＜50 U 抗Xa/mg 抗IIa活性＝＜10 U 抗IIa/mg 上記の特性決定から、本発明のグリコサミノグリカン画分は、明らかにヘパリ
ンの分子量よりもずっと低く、ヘパリン様分子の構造特性は維持しているにもか
かわらず、凝固パラメーターに対するヘパリン活性がないことがわかる。

【００２３】実施例分子量14,000Dおよび活性190 U/mgを有する、ブタ腸粘膜由来のヘパリンナト
リウム100gを、蒸留・脱気した水1L中に溶解する。該溶液を、アルゴンのバブリ
ング後、ガラスプラグで閉じたパイレックス（登録商標）容器に注ぎ入れる。該溶液をCo60から約25kGyの量のγ線照射に続き、130kGyの全体処理に付すこ
とにより、ヘパリンを解重合する。

【００２４】放射線照射した溶液を300 Dのカットオフで限外濾過し、続いて3％NaCl中を通
過させて精製し、凍結乾燥する。なお濃縮後の濃度は約10％である。この「源(mother) 解重合」ヘパリンを0.3M NaCl溶液中に10％の濃度で溶解し
、Sephadex G 50 Mediumを含むゲル浸透カラムで分画する。 8,000Dより大きい分子量を有する成分と約4,500Dのヘパリンと思われるアリコ
ートを分離した後、分子量が3,000D未満である画分を回収する。これらの画分を、解重合プロセス後の分子断片を除去するために、600Dのカッ
トオフで限外濾過することにより精製する。浸透液中のカルバゾールに対する反応を消失させるために0.3M NaCl中で一連
の洗浄を3回行なった後、混合物を約8％に濃縮し、0.2μmの濾過によって通過さ
せた溶液を凍結乾燥する。

【００２５】凍結乾燥生成物を最終濃度が10％(X/V)となる量で0.3M NaCl溶液中に溶解する
。この溶液をSephadex G/25 mediumを含むカラムでゲル浸透分画する。 1,920D〜2,560Dの範囲の分子量を有する画分を回収する。得られた溶液を、塩化ナトリウムを除去するために、300Dのカットオフで限外
濾過することにより精製する。

【００２６】溶液を約10％に濃縮し、凍結乾燥する。収量：淡黄色の粉末約9g 分析：平均分子量＝2,400(±200); 有機硫黄＝9.9％硫黄化合物／カルボキシル化合物比率＝2.5; 抗Xa活性＝45U 抗Xa／mg HPLC試験, 図１ NMR試験, 図２また、比較目的のために同じ方法で、以下のグリコサミノグリカン画分を調製
する：平均分子量640D (320〜1,600D)の画分；平均分子量4,800D (3,350〜6,060D)の画分。

【００２７】下記の実験から得られる薬学的特性のため、平均分子量が2,400Dに等しいグリ
コサミノグリカンを用いて、老人性痴呆症、および特にアルツハイマー病または
SDAT(アルツハイマー型老人性痴呆症)、ならびに発作および外傷から生じた神経
学的脳損傷ならびに神経退縮（nervous degeneration）の治療に適した医薬組成
物を調製することができる。

【００２８】上記組成物は、薬学的に有効な量のグリコサミノグリカンを薬学的に許容され
る希釈剤または賦形剤と混合して含むものである。また、これらは皮下、筋肉内
、静脈内および経口投与に適した剤形に調製することができる。上記組成物は単位用量あたり50〜200mgの範囲の量の上記グリコサミノグリカ
ンを含有する。

【００２９】本発明はまた、老人性痴呆症、および特にアルツハイマー病またはSDAT、なら
びに発作および外傷から生じた神経学的脳損傷を患う患者を治療するための治療
方法を含む。本治療方法は、平均分子量2,400 Dのグリコサミノグリカンを１日
あたり10〜400mgの範囲の量で投与することを含む。特に、皮下、筋肉内および
静脈内投与では１日あたり10〜200mgの量を必要とし、経口投与では１日あたり2
5〜400mgの量を必要とする。

【００３０】薬理学実験本発明のグリコサミノグリカン画分の薬理活性研究のために、老人性痴呆症特
有の病巣のいくつかを生じるラットに実験モデルを適用した(Sigurdsson EM; Lo
rens SA; Hejna MJ; Dong WX; Lee JM. 「若齢F344ラットの小脳扁桃体の片側だ
けへのAmyloid-β 25-35注入の局所および末梢における組織病理学的影響」(Loc
al and Distal Histopathological Effects of Unilateral Amyloid-β 25-35 I
njections into the Amygdala of Young F344 Rats), Neuro Biol Aging 1996;1
7:893-901)。

【００３１】特に以下のパラメーターについて研究を行なった： Tau-2タンパク質：βアミロイド物質に対する反応の実体（entity）と相関する
（間接反応性）； GFAPタンパク質(グリア原線維酸性タンパク質)：βアミロイドに対する星状細胞
の反応と相関する（直接反応性）。

【００３２】実験材料 βアミロイド： Aβ25-35ナトリウム塩のトリフルオロ酢酸(TFA)(VEH1)溶液中ペプチド含有量82
〜89％(BACHEM, Torrance, CA) 各ビヒクル(VEH1)とともにβアミロイドをNanopure水で濃度が5nmol/3.0mlとな
るような量で希釈し、使用直前まで4℃にて保存した。グリコサミノグリカン、TGSS： 3タイプのTGSS(tailored glycosaminoglycans；テーラーメイド・グリコサミノ
グリカン)を用いて上記のとおりに調製した。また該TGSSは以下の表のとおり異
なる分子量を有する。

【００３３】

【表２】これらの生成物は水溶性の淡黄色の粉末からなり、これらは室温で乾燥器中に
保存した。ラットに注入するために、生理的溶液(VEH2)中に1mg/mlの濃度の溶液を調製し
た。上記溶液を２週間を超えない期間にわたり4℃で保存した。 VEH1: βアミロイドのビヒクルであるトリフルオロ酢酸(TFA)(蒸留水3μL中に10nmol)
。

【００３４】 VEH2: TGSSのビヒクルである生理的溶液。

【００３５】実験方法本実験で使用するモデルは、小脳扁桃体の中心脳内領域におけるAβ25-35の注
入の影響にもとづく。 Aβ25-35のアミノ酸配列は、Aβ1-41またはAβ1-43に特有の病巣を生じるよう
に、神経毒性であると考えられる配列である(Yanker BA; Duffy LK; Kirscner D
A; 「アミロイド-βタンパク質の神経栄養性および神経毒性効果。タキキニン神
経ペプチドによる反転」(Neurotrophic and Neurotoxic Effects of Amyloid-β
Protein. Reversal by Tachykinin Neuropeptides), Science 1990: 250-282)。

【００３６】本実験のためにFischer344株の若齢(3〜4ヶ月）のオスラットを使用した。こ
れらのラットの右扁桃体に5nmol/3.0μlのAβ25-35またはそれぞれのビヒクル(V
EH1)を脳内に注入した。

【００３７】 TGSSまたはそれぞれのVEH2ビヒクルを、Aβの脳内注入の２日前から注入後３
２日間にわたり、以下に特定した用量で１日あたり２回皮下投与した。組織学的分析のため、ラットをペントバルビタールナトリウムで麻酔し、4％
ホルムアルデヒド溶液を動脈（経動脈）経路で灌流した。５つの結腸切片(40μm)を0.2mmの間隔を開けて採取した。上記切片をTau-2タンパク質およびグリア原線維酸性タンパク質(glial fibril
lary acid protein)(GFAP)に対する抗体と接触させた。

【００３８】上記Fisher344ラットはHarlan Sprague-Dawley Inc. (Indianapolis In)から
入手した。入手時点で、ラットは250〜300gの重さがあり、3〜4ヶ月齢であった。ラット
は明暗サイクルが12時間(7:00 amに明るくする)のAAALAC(American Association
Animal Laboratory and Care)に承認された収容条件で別々のケージで飼った。ラットは食物と水へは自由にアクセスし、実験前の2〜3週間をこれらの環境条
件で飼われた。

【００３９】 Aβ25-35の脳内注入を、ペントバルビタールナトリウムによる麻酔(50mg/kg腹
腔内；Butler, Columbus, OH)のもと行なった。ラットを麻酔する際に、硫酸アトロピン(0.4mg/kg; Sigma, St.Louis, MO)お
よびアンピシリンナトリウム塩(50mg/kg; Sigma, St.Louis, MO)もまた筋肉内経
路により投与した。右小脳扁桃体への脳内注入は、定位(Kopf)装置セットを使用
して、深さが耳介線の下3.3mmより大きくならないように行なった。

【００４０】注入のための座標は、座標AP-3.0、ML-4.6およびDV-8.8を有する頭蓋ブレグマ
から測定したPaxinosおよびWatsonアトラスにもとづいて決定した。前後(AP)の座標は、小脳扁桃体の構造がより広くなる位置に配置した。中間水平(ML)の座標は、小脳扁桃体の中間および基底中心に関して中心に置か
れ、最終的に背腹(DV)座標は、小脳扁桃体の背腹閾の中心に置いた。注入容量の3μlは、CMA/100種(Carnegie Medici AD, Soln, Sweden)のマイク
ロシリンジ用ポンプを使用して、6分間かけて注入した。注入後カニューレを２
分間in situに維持し、次に注意深く除去した。操作後、ラットを立直り反射を再度必要とする瞬間まで加熱したプレート上に
放置した。

【００４１】処置の35日後に、ラットをペントバルビタールナトリウム(100mg/kg腹腔内)で
麻酔し、250mlのナトリウム／カリウムリン酸0.1MバッファーpH7.4(PB)を大動脈
経路で灌流した。続いて、4％ホルムアルデヒドをPB500ml中に室温で500ml/時間の速度で灌流し
た。灌流開始後直ぐに、1U/gのヘパリン(Upjohn Kalamzoo. MI)を大動脈経路で注
入した。灌流後、脳を単離し、20％のスクロース溶液で１時間固定した。次に、注入部
位の周りを6mmブロックの切片とし、20％スクロースおよび0.1％アジ化ナトリウ
ム溶液および0.01％バシトラシンを含むPB中で24時間4℃にて維持した。

【００４２】引き続き、組織ブロックを20％グリセロールおよび2％ジメチルスルホキシド
を含む0.1Mリン酸ナトリウムバッファー中に移し、切断する瞬間まで4℃の温度
で保持した。

【００４３】結腸切片40μmを1片から1片が0.2mmの間隔である連続する5つの切片に切断し
、Tau-2およびGFAPタンパク質の分析のために組織学的に分析した。

【００４４】組織学的分析クレシルバイオレット切片をキシレンで洗浄し、アルコールと水で水和させた。呈色反応は200mlの0
.2M酢酸、133mlの0.2M酢酸ナトリウムおよび67mlの0.1％酢酸クレシルバイオレ
ットを含む溶液と接触するように切片を入れて行なった。次に、切片をエタノー
ル中を通過させて脱水し、キシレンで洗浄した。このようにして呈色させた切片
を顕微鏡観察に適したスライドでカバーした。

【００４５】コンゴレッド切片をエタノールと水を用いた一連の処理により洗浄し水和させた。呈色反応は1％のコンゴレッドおよび50％のエタノールを含む溶液と１時間に
わたり接触するように切片を入れて行なった。次に、切片を炭酸リチウム飽和溶液中へ浸潤し、流水のもと15分間洗浄した。
対比呈色反応をHarrisヘマトキシリン中で２分間行ない、その後水と1％アルコ
ール酸性溶液を添加した。切片を水中で洗浄し、硫酸アンモニウム水溶液中へ浸
潤させ、再度流水で洗浄した。最終的に、切片をエタノール中で脱水させ、キシ
レンで洗浄した。そのように呈色させた切片を顕微鏡での観察に適したスライド
でカバーした。

【００４６】Tau-２タンパク質 40μmの切片を低温保護装置(cryoprotector)から取り外し、一晩PBSバッファ
ー溶液中で４℃にて維持した。朝、上記切片を３０分間0.3％過酸化水素溶液を含むトリスバッファー溶液pH7
.6(PBS)と接触するように入れて、その後、0.3％Triton X-100を含むPBS溶液で1
0分間にわたり3回洗浄した。次に切片を1:500に希釈したTau-2(Sigma)抗体と室
温で24時間インキュベートした。抗体用希釈液は、PBS中に2％ triton X-100、0.1％アジ化ナトリウム、0.01％
バシトラシン、2％血清アルブミンおよび10％標準ウマ血清を含有した。

【００４７】引き続き、組織をPBS中に0.3％ triton X-100を含む溶液で3回10分間にわたり
洗浄し、その後、0.3％ triton X-100を含むPBS溶液で1:200に希釈した免疫グロ
ブリン(Vectastain ABC Elite Kit, Vector Laboratories Burlingame CA)に対
する抗体と1時間インキュベートした。0.3％ triton X-100を含むPBS溶液で合計
15分間にわたり2回洗浄した後、組織を0.3％ triton X-100を含むPBS溶液で1:20
00に希釈した西洋ワサビアビジンペルオキシダーゼ(Vector)と共に1時間インキ
ュベートした。

【００４８】次に、切片をPBS中で1時間洗浄し、それから再度酢酸ナトリウムバッファー(0
.2M、pH6.0)で15分間洗浄した。次に、切片を3-3ジアミノベンジジンテトラヒド
ロクロリド(DAB)および硫酸アンモニウムニッケルと反応させた(0.3％の過酸化
水素を含む酢酸ナトリウムバッファー100mlに対してDAB 35mgおよび硫酸アンモ
ニウムニッケル2.5g)。

【００４９】次に切片を酢酸ナトリウムバッファー中に入れ、続いて4℃のPBS中に入れてそ
こで一晩維持した。この操作後、切片を乾燥し、顕微鏡で観察するためにスライドでカバーした。

【００５０】GFAPタンパク質呈色反応は、抗体をウマ血清ではなくヒツジ血清中で希釈した点を除いて、Ta
u-2で使用した方法により行なった。 GFAP(DAKO, Denmark)一次抗体を1:500に希釈して使用した。クレシルバイオレットを用いて呈色した切片を、Aβ沈着物のサイズを測定す
ることにより分析した。 Aβ沈着物の面積を0.2mm間隔で測定した。また、コンゴレッドで呈色したスラ
イドを偏光を用いてアップルグリーン(apple green)屈折度について分析した。これらの組織化学的外観に関連して、反応性星状細胞は0〜2の範囲のスコアを
有すると推定されるが、Tau-2反応性の細胞を全ての結腸切片において計数した
。 1〜2の範囲の陽性呈色反応を示す場合、ラットは陽性であるとみなした。

【００５１】実験方法および結果各実験について4つの異なるグループのラットを使用した： 1. VEH1+VEH2グループ：小脳扁桃体中にVEH1(TFA)ビヒクルを注入し、VEH2(生理
的溶液）ビヒクルを皮下経路により注入したラット； 2. Aβ+VEH2グループ：小脳扁桃体中にAβ25-35を注入し、VEH2(生理的溶液）ビ
ヒクルを皮下経路により注入したラット； 3. Aβ+TGSSグループ：小脳扁桃体中にAβ25-35を注入し、TGSSを皮下経路によ
り注入したラット； 4. VEH1+TGSSグループ：小脳扁桃体中にVEH1(TFA)ビヒクルを注入し、TGSSを皮
下経路により注入したラット。

【００５２】各実験ブロックは、1グループ当たり少なくとも6動物のために設計された。本処置スキームにしたがって、以下の3種類の異なる平均分子量を有する3タイ
プのTGSSを使用した： C3-2,400 Dalton, 2.5mg/kg, 皮下投与 C8-640 Dalton, 2.5mg/kg, 皮下投与 C7-4,800 Dalton, 2.5mg/kg, 皮下投与各TGSSについて、結果を確認するため2種類の異なる実験によって調べた。

【００５３】各処置のタイプに対して、以下の数の動物について分析した：

【表３】小脳扁桃体内をVEH1で処置した動物（対照はアミロイド無し）とTGSS（C3また
はC8またはC7）のいずれか1種類で処置した動物は常に、VEH1+VEH2ビヒクルのみ
で処置をしたグループ1の対照群とほとんど同一の結果を示した。

【００５４】 a)Tau-2タンパク質に対する反応性（反応性細胞の数）：平均値±標準偏差。

【００５５】

【表４】この一連の実験から、C3およびC7の双方がTau-2タンパク質に対する反応性を
減少させることにおいて活性であるのに対し、最も低い分子量を有するC8は、二
糖類に相当し、反応性を示さないことがわかる。 Aβで処置していない対照群は、生理的溶液（グループ1）またはTGSS（グルー
プ4）のいずれかを皮下経路により注入した場合、同様な挙動を示した。 C3化合物の影響によるTau-2タンパク質に対する反応性の大きな減少は、C3を
経口経路によりラットに投与した試験においても確認された。実験モデルおよびスクリーニング法は、C3が皮下経路ではなく20mg/kgの用量
で経口経路により投与された点を相違点として、上記のものと同一であった。 C3投与は、Aβ25-35の注入の3日前から注入の14日後まで１日１回行なわれた
。ラットは、Aβ25-35の注入から14日後に犠牲にした。

【００５６】得られた結果を以下の表に示す。C3が、Aβ25-35で処置をしたラットにおいて
Tau-2タンパク質に対する反応性を強力に低減させることが観察される。

【００５７】

【表５】 b)星状細胞の反応性（反応性+1または+2を示す動物の％）：平均値。

【００５８】

【表６】星状細胞の反応性に関しては、C3(グループ3a)が、有意な反応性を示す唯一の
生成物であると考えられる。生成物C8およびC7（グループ3bおよび3c)は反応性
を示さない。

【００５９】実験のこれらの結果から、驚くべきことに平均分子量が2,400Dに等しいC3 TGS
Sは、より大きな分子量またはより小さな分子量のTGSSよりもはるかに高い反応
性を有する。特に、平均分子量が2,400Dに等しいTGSSが、Tau-2タンパク質との
示された反応性の減少および星状細胞との示された反応性に対して最適である。

【００６０】ラットでの別の実験では、静脈内経路による投与後にC3生成物が血液脳関門を
通過する能力が研究された。その目的のため、トリチウム(³H)で標識した生成物を使用した。標識は、³H-C3 1mgあたり700,000DPMに相当した。 2.5mg/kgの静脈経路による投与後、ラットをペントバルビタールナトリウム麻
酔下で45分間の一定時間で犠牲にした。血中の標識レベルを、脊髄液(CSF)および最終的には脳内において（血管から
血液を除くためにゆっくりと灌流した後で）分析した。CSFは第4脳室から（ラッ
トを完全に出血させた後、常に200μlより多い量で）ガラスキャピラリーを用い
て採取した。 DPMは、生理的溶液5ml中で希釈したホモジネート(脳)20μlのシンチレーショ
ンによって評価した。

【００６１】以下の表に示す結果は、³H-C3のかなりの量が血液脳関門を通過することがで
きることを示す。

【００６２】

【表７】対照動物ではDPM/ml値は常に、分析した組織のすべてにおいて41より低かった
。これらの結果にしたがって、血清中、CSF中および脳内における抗Xa活性の存
在について対照実験を行なった。第Xa因子(血液凝固X因子)は、4つより多く糖類を含む硫黄オリゴ糖画分によっ
てのみ阻害されることが知られている。前記のように処置をした一連のラットにおいて、C3を2.5mg/kgの用量で静脈内
経路により処置してから45分後に、抗Xa活性が血清中、CSF中および脳組織中に
顕著に存在することが観察された。これは、血液脳関門を通過する生成物がC3からなるものであり、2糖類または4
糖類などの不活性分解生成物からなるものではないことのさらなる確証である。

【００６３】 C3処置または活性処置無しのいずれかによりAβ25-35注入したラットにおいて
、神経成長についても分析した。この目的のために使用された迅速ゴルジ体呈色法は、その複雑さのため、限ら
れた数の動物に対してのみ適用された。

【００６４】既に先に説明したように、C3を皮下経路によりAβ25-35の脳内注入の2日前か
ら32日間連続して１日2回、2.5mg/kgの用量で投与した。脳の帯状回のV層における脳ニューロンを分析した。上記試験は樹状突起の長さおよび末端神経分枝数と原始神経分枝数との比につ
いての測定を意味した。 T/B比が高ければ高いほど、複雑度およびニューロンの結合数は大きくなる。

【００６５】結果を以下の表に示す。

【００６６】

【表８】上記表は、Aβが神経成長に対して傷害を生じ、しかもC3処置により、生じた
障害が修復されたことを示す。さらに、C3が神経退縮または神経損傷を意味する
神経外傷の場合に有用な神経栄養種の活性を有することがわかる。

【図面の簡単な説明】

【図１】上記実施例により得られた平均分子量が2,400（±200）のグリコサミノグリカ
ンのHPLC試験を示す。

【図２】上記実施例により得られた平均分子量が2,400（±200）のグリコサミノグリカ
ンのNMR試験を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者デアンブロシ，ルイジイタリア国アイ−13048 サンシア’，ヴィアカルドゥッチ８ (72)発明者ハニン，イスラエルアメリカ合衆国 60610 イリノイ州，シカゴ，アパートメント 17エス，エヌ．ディアボーンピーケーダブリュワイ 1530 (72)発明者フェアエド，ジャウドアメリカ合衆国 60154 イリノイ州，ウェストチェスター，イートンコート 11061 (72)発明者リー，ジョンアメリカ合衆国 60091 イリノイ州，ウィルメッッテ，パウニー 920 (72)発明者ロレンズ，スタンリーアメリカ合衆国 60130 イリノイ州，フォレストパーク，ロックフォード８ 133 (72)発明者メルヴィス，ロナルド，エフ．アメリカ合衆国 43214 オハイオ州，コロンブス，クークロード 384 Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 AA03 EA22 MA01 MA04 MA52 MA65 MA66 NA14 ZA15 ZA16

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】老人性痴呆症ならびに発作および外傷から生じた神経学的脳
損傷の治療に適した医薬組成物を製造するための平均分子量が2,400 Dに等しい
グリコサミノグリカンの使用。
【請求項２】老人性痴呆症ならびに発作および外傷から生じた神経学的脳
損傷の治療に適した医薬組成物であって、有効量の平均分子量が2,400 Dに等し
いグリコサミノグリカンを薬学的に許容される希釈剤または賦形剤と混合して含
むものである上記組成物。
【請求項３】グリコサミノグリカンが、平均分子量が2,400 Dに等しいも
のであり、多分散インデックスが1.20より小さく、ペプチド成分を全く含有せず
、そして還元末端に脱硫単位を有しないものであることを特徴とする請求項２記
載の組成物。
【請求項４】老人性痴呆症にアルツハイマー種またはSDAT種の疾患が含ま
れることを特徴とする請求項２記載の組成物。
【請求項５】グリコサミノグリカンが、γ放射線による処理、続いてゲル
浸透を行ってヘパリンを解重合することにより得られるものである請求項２記載
の組成物。
【請求項６】皮下、筋内、静脈内および経口投与に適した剤形に調製され
たものである請求項２記載の組成物。
【請求項７】単位用量当たり50〜200mgに等しい量のグリコサミノグリカ
ンを含むものである請求項２記載の組成物。
【請求項８】グリコサミノグリカンが、血液−脳関門を横切って、Tau-2
タンパク質およびグリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）を低減し、かつ神経
成長を促進しうることを特徴とする請求項２記載の組成物。
【請求項９】老人性痴呆症および神経学的脳損傷を患う患者を治療するた
めの治療方法であって、１日当たり10〜400 mgの量の平均分子量が2,400 Dに等
しいグリコサミノグリカンを投与することを含む上記方法。
【請求項１０】１日当たり10〜200 mgの量のグリコサミノグリカンを皮下
、筋内または静脈内経路で投与することを含むものである請求項９記載の方法。
【請求項１１】１日当たり25〜400 mgの量のグリコサミノグリカンを経口
経路により投与するものである請求項９記載の方法。