CN102174513B

CN102174513B - 一种哺乳动物核糖核酸小分子复合物及其应用

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Publication number: CN102174513B
Application number: CN 201110039612
Authority: CN
Inventors: 杨雯欣
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-02-17
Filing date: 2011-02-17
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2031-02-17
Also published as: CN102174513A

Abstract

本发明涉及一种核糖核酸(RNA)小分子复合物，它是由哺乳动物脑组织中分离出的大分子RNA经过分离纯化和人工降解后得到的小分子的RNA组成的。本发明的RNA小分子复合物在治疗痴呆症等脑部疾病中具有显著疗效。

Description

一种哺乳动物核糖核酸小分子复合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种核酸复合物，具体涉及一种哺乳动物的核糖核酸(RNA)小分子复合物，及其制备方法和在制备治疗脑部疾病的药物中的应用。

背景技术

多基因疾病是由多种基因病变引起的疾病，其中的包括痴呆症在内的多种脑部疾病往往没有特效药，不易治愈。

痴呆症(Dementia)，是一种因脑部伤害或疾病所导致的渐进性认知功能退化，且此退化的幅度远高于正常老化的进展，特别会影响到记忆、注意力、语言、解题能力，严重时会无法分辨人事时地物。只有不到10％的痴呆症是可逆的。痴呆症是个不特定的概括名词。也称失智症。

最常见的痴呆症种类是老人痴呆症，即阿兹海默氏症(Alzheimer′s disease，简称AD)又称老人痴呆症，特征是多种高级皮层功能紊乱，涉及记忆、思维、定向、理解、计算、判断、言语和学习能力等多方面，是一种持续性神经功能障碍。该疾病的成因未明，目前有人认为它是由多种基因病变引起的，没有准确诊断和有效治疗的方法。该疾病最显著的早期症状为健忘，通常表现为逐渐增加的短期记忆缺失，而长期记忆则相对不受病情的影响。随着病情的加重，病人的语言能力，空间辨别能力，认知能力会逐步衰退。

国际上普遍存在的老龄化问题使AD患病率呈急剧上升趋势，全世界有2400万病患，我国早在2000年60岁以上老龄人口已近1.27亿，而目前约500万的AD患者以及随之产生的巨大家庭和社会经济负担突出体现了这一严重影响人类健康的国际化难题。

自2002年以来，小分子RNA对于各种疾病的抑制作用逐渐被人们发现并重视。已经有研究证明了小分子RNA对肿瘤和多种脑部疾病具有有效的抑制作用，为这些困扰人类的疾病的治疗提供了全新的途径。

本发明在上述技术背景下，应用最新的分子生物学理论和技术，提出了一种小分子RNA复合物，其对痴呆症等多种多基因疾病具有更好的治疗效果。本发明还提供了所述小分子RNA复合物在治疗痴呆症等多种多基因疾病的药物的制备中的应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种RNA小分子复合物，使其对痴呆症等脑部疾病具有有效的抑制作用。

本发明的这一目的是通过以下技术方案实现的：

提供一种哺乳动物RNA小分子复合物，它是由哺乳动物脑组织中提取的大分子RNA经过分离纯化和人工降解后得到的小分子的RNA组成的。

所述的哺乳动物优选非成年哺乳动物；进一步优选哺乳期的幼年哺乳动物或哺乳动物胚胎。

所述分离纯化是将从哺乳动物脑组织中提取出的RNA尽量纯化，使其纯度等于或大于国内生物技术药物质量控制标准值，即经分光光度法测得的在260毫微米波长下的OD值与280毫微米波长下的OD值的比值大于或等于1.75。

所述的分离纯化可以通过酚提取-沉淀法、阴离子吸附法、硫酸锌沉淀法或聚乙二醇沉淀法中的一种或两种以上的方法实现。具体方法可以分别为：

A.酚提取-沉淀法

1.在细胞裂解后离心分离出的含核酸的水相中加入1/3体积的提取液(pH6.0的0.01mol/L Tris平衡过的苯酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为1∶1∶1/24的混合液)振荡提取5～15分钟，然后5℃下6000转/分离心20分钟，收集上清液；

2.在步骤1所得上清液中加入1/3体积的上述提取液，重复上述提取和离心过程，收集上清液；

3.用1/3体积的氯仿对步骤2所得上清液进行提取，并在5℃下6000转/分离心20分钟，取上清液再重复本步骤的提取和离心过程，收集上清液；

4.在步骤3得到的上清液中加入2.5倍体积的95％的乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠，沉淀过夜，并5℃下6000转/分离心20分钟后收集沉淀，将沉淀溶于pH 6.0的0.01mol/L的Tris缓冲液和1mmol/L的EDTA的混合溶液中备用。

B.阴离子树脂吸附法

将阴离子树脂201×7(ΦP＜23mm)用蒸馏水浸泡过夜，装入玻璃柱管以0.1N的NaOH洗至碱性，经蒸馏水洗至中性，最后以0.1N HCl洗至酸性。用10倍量的大分子RNA稀溶液缓缓通过柱，3倍体积蒸馏水冲洗柱，以0.1mol/L的Na₂HPO₄洗下核酸，加入1/10体积的3mol/L乙酸钠及2.5倍的酒精沉淀核酸。

C.硫酸锌沉淀法

在pH8.0的稀核酸溶液中加入硫酸锌粉或浓溶液，使硫酸锌终浓度为1-2％，搅匀并保持pH8～9，静置2小时以上或过夜，虹吸去除上清液，以1％的硫酸锌溶液洗沉淀并离心收集。沉淀悬于50mmol/L的pH为7.0的EDTA溶液中，用10mmol/L的pH为4-6的EDTA溶液透析去除硫酸锌，最后加入1/10体积的3mol/L的乙酸钠溶液及2.5倍的酒精沉淀得到核酸。

D.聚乙二醇沉淀法

在溶有含杂质的RNA的缓冲液中加入等体积10％的聚乙二醇(PEG 6000)沉淀30～60分钟，5℃下6000转/分离心20分钟后收集沉淀。

上述A-D的4种分离纯化方法可以根据具体情况任意组合使用，也可以在人工降解之后进一步使用。

所述的人工降解方法可以是以下两种方法之一：

1.超声波降解法

将大分子RNA溶于100mmol/L、pH为8.5～9.5的NaCl溶液中，将该大分子RNA溶液分为3等份，均使用1000w超声波处理，每次处理8秒钟后间歇8秒钟，如此循环处理，3份溶液分别处理20次、30次和40次，然后将得到的溶液合并；

或者，

2.酸降解法

1)将大分子RNA溶于10mmol/L的Tris溶液和1mmol/L的EDTA溶液的混合溶液中，保持pH为6.0，并使大分子RNA在所述混合溶液中的重量百分比为4～6％；

2)在步骤1)的溶有大分子RNA的混合溶液中加入6N的HCl，使HCl终浓度达到2.0N；

3)将步骤2)得到的混合溶液分为3等份，室温下分别放置20分钟、30分钟和40分钟，放置时间到立即中和，然后合并3份溶液。

以上所述的分离纯化和人工降解后得到的小分子RNA复合物，优选再用70％的乙醇洗，然后在5℃下以6000转/分的速度离心20分钟后收集沉淀，最终得到的即为本发明所述的小分子RNA复合物。

经过上述分离、纯化和人工降解后得到的本发明的RNA小分子为一系列大小不等的RNA小分子，它们的复合物为白色或浅黄色粉末，经过电泳结合分光光度法测得其纯度达到标准，该复合物易溶于水、生理盐水，比较稳定，需要低温保存。

本发明的另一个目的是提供所述的RNA小分子复合物在治疗脑部疾病的药物的制备中的应用。

所述的脑部疾病优选痴呆症。

所述的应用可以是将所述RNA小分子复合物按照常规方法制备成注射剂；所述的注射剂优选水性注射液或注射用无菌冻干粉末。

所述制备注射剂的常规方法可以是将降解得到的本发明RNA小分子复合物溶解于50倍体积的生理盐水中，制成水性注射液；或者再将所述水性注射液冷冻干燥制成注射用无菌粉末。

本发明应用方法制备的注射剂的使用方法是：用于人体注射前，按照4mg/kg体重的剂量标准，用生理盐水将上述制备好的注射剂进行适当溶解或稀释，然后将溶解或稀释好的注射剂进行静脉注射，可按照1次/日，10日为一个疗程的方案用于临床治疗；用于动物体静脉注射时，剂量标准是用于人体时的10倍。

目前，学术界认为小分子的核酸片段对多基因疾病的治疗机制主要有以下两方面：小分子的核糖核酸可以对病变基因表达进行干扰，即小分子核酸干扰；小分子的核糖核酸片段可以阻止癌细胞扩散。本发明人认为，除上述治疗机制外，小分子的核酸片段对多基因疾病的治疗机制还在于：外源正常核酸片段可以从分子水平矫正、修复病区核酸分子或基团的畸变。本发明的RNA小分子复合物是RNA大分子经人工降解后形成的一系列大小不等的RNA小分子组成的复合物。经过所述人工降解方法，使原来隐藏在核酸大分子结构内部的不同大小的结构片段暴露出来。基于上述三种治疗机制，由这一系列核酸片段组成的复合物，能够对多种多基因疾病实现更广泛的治疗。

目前现有技术中用于治疗多基因疾病的核糖核酸基本上都是大分子物质，而本发明的RNA小分子复合物是核糖核酸大分子经过人工降解后得到的大量小分子片段组成的；本发明的RNA小分子提取自天然的动物组织而非化学合成，因此是单链RNA。

通过上述技术方案获得的本发明RNA小分子在抑制痴呆症等脑部疾病的发展方面具有显著效果，有以下动物实验为证：

实验1.本发明RNA小分子复合物对痴呆大鼠学习记忆能力的影响

1.实验材料：

1.1实验药品：本发明实施例3制备的RNA小分子复合物注射液。

1.2实验动物：试验用SD大鼠24只，体重200～250g，均由昆明医学院动物中心提供。

1.3实验设备与器材：

仪器：脑立体定位仪(深圳瑞奥得公司)，小型电钻，眼镜螺钉，三线电极插头，电烙铁，扬声器，隔音室，恒冷切片机，冰箱，分析天平，显微镜。

试剂：3.6％水合氯醛，4％多聚甲醛，75％酒精，医用牙托水，医用牙托粉。

分析软件：Matlab 6.5，SPSS12.0等。

2.实验方法：

2.1AD动物模型的建立

用3.6％水合氯醛溶液(300mg/kg体重)腹腔麻醉上述SD大鼠，麻醉成功后，将大鼠固定在脑立体定位仪上，常规消毒，剪开头皮，以前囟为零点，进刀坐标(参照包新民《大鼠全脑立体定位图谱》)：前后坐标(AP)-2.0mm，中线旁开(L)1.0～4.0mm，腹侧坐标(V)4.0mm。先用牙科钻在上述坐标的周围钻孔，去除颅骨，挑开硬脑膜，用双刃不锈钢刀片(宽2.0mm，厚0.2mm)按上述坐标从脑冠状面插入脑内。然后将到向外移动1.0mm，降刀1.0mm，并上下抽刀10余次，以完全切断穹窿海马伞。最后将刀片退至L1.0mm处抽出刀片。按上述方法切断双侧穹窿海马伞制备AD大鼠模型。

2.2动物分组

实验组：8只，按上述方法切断双侧穹窿海马伞；

假手术对照组(即正常组)：8只，开颅并挑开硬脑膜，切断皮质、胼胝体，但不切断穹窿海马伞；

用药组：8只，药物从尾静脉注射。每天一次，体内每次注射剂量为1ml，药效成分含量为18mg/1ml，连续应用1周。

2.3MORRIS水迷宫行为学检测

Morris水迷宫由圆形水池和有机玻璃站台构成，水池分为四个象限(上海吉量科技有限公司)。数据采集由迷宫图像监视系统(摄像监视器等)完成。先将每只大鼠放于跳台，让其熟悉起始游泳位置。随后将大鼠推入池内，记录并比较各组大鼠找回跳台的时间。若大鼠有较好的学习记忆能力，其找回跳台的时间就较短。

2.4形态学检测

待水迷宫行为学测试完毕后，用3.6％水合氯醛腹腔麻醉动物(300mg/kg体重)，经主动脉先后灌注生理盐水200ml和4％多聚甲醛400ml(pH7.4)。取脑在4％多聚甲醛中固定24h以上，置入20％的蔗糖，待沉底后再置入30％蔗糖，下沉后行连续冰冻冠状切片(取材范围为前囟后1.0mm～5.0mm)，厚20μm。用NEUN抗体(chemicon 1∶1000)对海马组织胺常规SP法进行免疫组织化学染色，观察计数各组海马神经细胞染色数量变化(每张切片取3个视野)。

2.5统计学处理

所有数据应用SPSS12.0软件包进行处理。计量资料多组间比较用单因素方差分析。P＜0.05有显著性差异。

3.实验结果

3.1对大鼠学习记忆能力的影响

水迷宫检测显示，正常组(假手术对照组)第一次进入水迷宫平均找到跳台的时间为94.4秒，而未用药物的痴呆组大鼠300秒也不能找到跳台。用药组找到跳台的时间明显较痴呆组缩短，介于正常和痴呆大鼠之间，且校靠近正常组。经统计学分析，用药组和痴呆组间比较有明显差异(p＜0.05)。说明本发明所述的小分子RNA组合物能够明显促进AD大鼠学习记忆能力的改善，详细数据见表1。

表1.大鼠学习记忆能力水迷宫检测数据

3.2对海马神经元形态学的影响

显微镜下观察计数体内海马神经元形态和数量变化发现，正常组海马神经元形态完整，数量较多；痴呆组大鼠海马神经元数量明显减少，用药组的海马神经元数量与痴呆组比较又有明显增多(p＜0.05)。说明本发明所述的RNA小分子复合物能有效增加海马神经元存活(见图1和表2)。

表2.海马神经元存活数量比较

实验2.本发明RNA小分子复合物对大鼠海马神经细胞培养生长的影响

取大鼠孕鼠(E15D)随机分为用药组和未用药对照组，均采用脱颈处死后，腹部用75％的酒精消毒。纵向剪开腹部皮肤向两侧拉开，利用另一把剪刀打开腹壁暴露子宫，取出含有胎鼠的子宫，置于无菌的培养皿中。在超净台内小心剖开子宫，获得带有胎盘和羊膜囊的胎鼠，打开羊膜囊取出胎鼠，剪下胎鼠头部，移入盛有D-Hanks液的培养皿中。用镊子夹住胎鼠眼眶以固定头部，用小剪刀从断头处中线将头皮和颅骨剪至嗅球部，用另一把镊子向外侧掀开两边颅骨，暴露出大小脑，小心将全脑取出放入另一盛有D-Hanks液的培养皿中。在放大的10倍左右显微镜下，用2把镊子从腹部内测向背侧部外侧剥离脑膜，直至剥离干净(以见不到含有血管的脑膜)沿背侧表面正矢状位，用镊子向外侧小心掀开大脑皮质表面，即可在正中矢状位见“C”字型海马。用镊子夹住海马，向边缘组织分离，即可获得整个海马。将海马剪成1mm³的组织块，用玻璃管吸入安瓶中，待组织块下沉吸去D-Hanks液，加入培养液吹打40～60次，制成细胞悬液。取少量细胞悬液加在计数板上，在10倍显微镜下计数下保密度(1.5～2.5)×10⁵个细胞/孔，接种于24孔培养板(培养液为添加1％B₂₇的MDEMF₁₂培养液)置于37℃5％CO₂培养箱培养。实验组加入本发明实施例1制备的RNA小分子复合物3mg/ml。细胞培养一周时测定各组海马细胞数量，比较未用药对照组和用药组细胞存活数量，结果见表3和图2。

表3.本发明RNA小分子复合物对体外培养海马神经元存活的影响

通过上述计量海马神经元存活数发现，本发明所述的RNA小分子复合物能够有效促进培养海马神经元存活。

从上述实验1和2可知，本发明所述的RNA小分子复合物能够对脑组织细胞基因的损伤起到修复的作用。由此可以推知，本发明的RNA小分子复合物能够对各种因基因病变或基因损伤等原因引起的脑部疾病起到治疗作用。

另经急性毒性实验得到，本发明RNA小分子复合物因毒性太低，无法测得其LD₅₀数值，因此改为测定其MID值。经检测本发明的RNA小分子复合物MID＞266.0mg/kg，可见本发明的RNA小分子复合物具有高效低毒的优点。

附图说明

图1是上述实验1得到各组大鼠海马的免疫组织化学图片，其中图1-A为正常组，图1-B为AD组，图1-C为用药组。

图2是上述实验2得到的各组海马神经元显微图片，其中图2-A为未用药对照组，图2-B为用药组。

具体实施方式

实施例1.

1.将出生10天的乳猪洗净，取其脑组织，洗去血液后切碎，加入其10倍体积的0.2mol/L的蔗糖，再加入NaCl至其终浓度为0.14mol/L，用胶体磨处理，然后在5℃以6000转/分的速度离心20分钟，取所得上清液溶于其10倍体积的0.01mol/L的Tris和1mmol/L的EDTA的混合溶液，保持pH在6.0，在其中加入1/3体积的提取液，该提取液为pH 6.0的0.01mol/L Tris溶液平衡过的苯酚∶氯仿∶异戊醇按1∶1∶1/24体积比混合的混合溶液，然后振荡提取10分钟后在5℃以6000转/分的速度离心20分钟取上清液；

2.用上述步骤1的提取液提取步骤1所得的上清液，并在5℃以6000转/分的速度离心20分钟，取上清液；

3.将步骤2得到的上清液用1/3体积氯仿提取，并在5℃以6000转/分的速度离心20分钟，取上清液后再用1/3体积氯仿提取并同条件离心，取上清液；

4.在步骤3得到的上清液中加入2.5倍体积95％的乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠，沉淀过夜，然后在5℃以6000转/分的速度离心20分钟，收集沉淀并溶于pH 6.0的0.01mol/L Tris和1mmol/L的EDTA的混合溶液中；

5.在步骤4得到的溶液中加入等体积的10％的PEG 6000沉淀40分钟，然后5℃以6000转/分的速度离心20分钟，收集沉淀，溶于pH 6.0的0.01mol/L Tris和1mmol/L的EDTA的混合溶液中；

6.在步骤5得到的溶液中加入10mmol/L、pH6.0的Tris及1mmol/L的EDTA溶液，得到混合溶液，使大分子RNA在所述混合溶液中的重量百分比为5％，在该混合溶液中加入6N的HCl，使HCl终浓度达到2.0N，然后将该混合溶液分为3等份，室温下分别放置20分钟、30分钟和40分钟，放置时间到立即中和，然后合并3份溶液，即得到本发明所述的RNA小分子复合物。

对上述RNA小分子复合物进行琼脂糖凝胶电泳实验后无显色带出现。上述所得RNA小分子复合物为白色或浅黄色粉末，经电泳结合分光光度法检测，其纯度达到标准，易溶于水和生理盐水，比较稳定，需-20℃保存备用。

实施例2.

1.将20公分左右体长的胎猪洗净，取其脑组织，洗去血液后切碎，加入其10倍体积的0.2mol/L的蔗糖，再加入NaCl至其终浓度为0.14mol/L，用胶体磨处理，然后在5℃以6000转/分的速度离心20分钟，取所得上清液溶于其10倍体积的0.01mol/L的Tris和1mmol/L的EDTA的混合溶液，保持pH在6.0，在其中加入1/3体积的提取液，该提取液为pH 6.0的0.01mol/L Tris溶液平衡过的苯酚∶氯仿∶异戊醇按1∶1∶1/24体积比混合的混合溶液，然后振荡提取10分钟后在5℃以6000转/分的速度离心20分钟取上清液；

4.在步骤3得到的提取液中加入2.5倍体积95％的乙醇和1/10体积的3mol/L乙酸钠，沉淀过夜，然后在5℃以6000转/分的速度离心20分钟，收集沉淀备用；

5.步骤4得到的大分子RNA溶于100mmol/L、pH为8.5～9.5的NaCl溶液中，将该大分子RNA溶液分为3等份，均使用1000w超声波处理，每次处理8秒钟后间歇8秒钟，如此循环处理，3份溶液分别处理20次、30次和40次，然后将得到的溶液合并；

6.在步骤5得到的溶液中加入等体积的10％的PEG 6000沉淀60分钟，然后5℃以6000转/分的速度离心20分钟，收集沉淀，然后用70％的乙醇洗，再用相同方法离心收集沉淀，即得到本发明所述的RNA小分子复合物。

对上述RNA小分子复合物进行琼脂糖凝胶电泳实验后无显色带。所得RNA小分子复合物为白色或浅黄色粉末，经电泳结合分光光度法检测，其纯度达到标准，易溶于水和生理盐水，比较稳定，需-20℃保存备用。

实施例3.

应用实施例

将1g的实施例1制备的RNA小分子复合物溶解于50ml的生理盐水中，即制备成本发明所述的RNA小分子复合物注射液的储备液，再用分光光度法测定该储备液的浓度。

人体使用时，根据4mg/kg的剂量标准将上述储备液用生理盐水进行适当稀释后，通过静脉注射给药，每日1次，10日一个疗程。

实施例4.

应用实施例

将实施例2制备的RNA小分子复合物溶解于生理盐水中，使终浓度为4mg/ml然后用常规方法将制备好的溶液冷冻干燥，即得到本发明所述的RNA小分子复合物的注射用无菌粉末。

人体使用时，根据4mg/kg的剂量标准将上述无菌粉末用生理盐水溶解后，通过静脉注射给药，每日1次，10日一个疗程。

Claims

1.一种哺乳动物RNA小分子复合物，它是由哺乳动物脑组织中提取的大分子RNA经过分离纯化和人工降解后得到的小分子的RNA组成的；所述的哺乳动物为哺乳期的幼年哺乳动物或哺乳动物胚胎；

所述的人工降解通过以下超声波降解法实现：

将大分子RNA溶于100mmol/L、pH为8.5～9.5的NaCl溶液中，将该大分子RNA溶液分为3等份，均使用1000w超声波处理，每次处理8秒钟后间歇8秒钟，如此循环处理，3份溶液分别处理20次、30次和40次，然后将得到的溶液合并，即得到所述的小分子RNA复合物溶液；

或者，

所述的人工降解通过如下的酸降解法实现：

1）将大分子RNA溶于10mmol/L的Tris溶液和1mmol/L的EDTA溶液的混合溶液中，保持pH为6.0，并使大分子RNA在所述混合溶液中的重量百分比为4～6%；

2）在步骤1）的溶有大分子RNA的混合溶液中加入6N的HCl，使HCl终浓度达到2.0N；

3）将步骤2）得到的混合溶液分为3等份，室温下分别放置20分钟、30分钟和40分钟，放置时间到立即中和，然后合并3份溶液，即得到所述的小分子RNA复合物溶液；

所述的分离纯化是通过酚提取-沉淀法、阴离子吸附法、硫酸锌沉淀法或聚乙二醇沉淀法中的一种方法或两种以上方法的组合方法实现。

2.权利要求1所述的哺乳动物RNA小分子复合物，其特征在于：所述的分离纯化和人工降解后得到的小分子RNA复合物，再用70%的乙醇洗，然后在5℃下以6000转/分的速度离心20分钟后收集沉淀。

3.一种权利要求1所述的RNA小分子复合物在治疗脑部疾病的药物的制备中的应用，其特征在于：将所述RNA小分子复合物按照常规方法制备成注射剂。

4.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的注射剂为水性注射液或注射用无菌冻干粉末。

5.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的脑部疾病是痴呆症。