EA021614B1 - ФРАГМЕНТ β-АМИЛОИДНОГО ПЕПТИДА, СВЯЗАННЫЙ С ПЕПТИДОМ-НОСИТЕЛЕМ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ИЛИ КОМБИНАЦИЯ, ЕГО СОДЕРЖАЩАЯ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к улучшенным агентам для лечения заболеваний, ассоциированных с отложениями амилоида Аβ в головном мозге пациента, и способам лечения. Такие способы включают введение агентов, индуцирующих эффективный иммунный ответ против отложений амилоида. Способы полезны для профилактики и лечения болезни Альцгеймера. Предпочтительные агенты включают N-концевые фрагменты Аβ, связанные с пептидом-носителем, причем фрагмент Аβ состоит из: (i) Aβ 1-7 с аминокислотной последовательностью DAEFRHD или (ii) мультимера по (i).

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к иммунологии и медицине.

Сведения о предшествующем уровне техники

Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой прогрессирующее заболевание, приводящее к старческому слабоумию (см., в основном, §е1кое, ΤΙΝδ 16, 403-409 (1993); Нат4у е! а1., \УО 92/13069; δе1кοе, 1. №игора!Ьо1. Ехр. №иго1. 53, 438-447 (1994); ΟιιΓΓ е! а1., №1иге 373, 476-477 (1995); Сатез е! а1., №-11иге 373, 523 (1995)). В целом, болезнь Альцгеймера развивается в две стадии: поздняя стадия наступает в возрасте 65 и более лет, а ранняя стадия характерна для возрастного периода, предшествующего старости, т.е. для 35-60 лет. В обоих случаях патологические процессы одинаковы, однако нарушения более распространены и имеют большую тяжесть на ранней стадии развития заболевания. Заболевание характеризуется по крайней мере двумя типами повреждений мозга, старческими бляшками и нейрофибриллярными сплетениями. Старческие бляшки - это области дезорганизованного нейропиля до 150 мкм в диаметре с внеклеточными отложениями амилоида в центре, что можно увидеть при микроскопическом анализе срезов ткани мозга. Нейрофибриллярные сплетения представляют собой внутриклеточные отложения ассоциированного с микротрубочками !аи-белка, состоящие из двух филаментов, скрученных в пары друг с другом.

Основным компонентом бляшек является пептид, называемый Αβ- или β-амилоидным пептидом. Αβ-пептид представляет собой внутренний фрагмент из 39-43 аминокислот белка-предшественника, называемого амилоидным белком-предшественником (АРР). Различные мутации в пределах АРР белка коррелируют с наличием болезни Альцгеймера (см., например, Соа1е е! а1., №!ите 349, 704 (1991) (валин заменен на изолейцин); СЬатйет Наг1ап е! а1., №!ите 353, 844 (1991) (валин заменен на глицин); Мигге11 е! а1., 8е1епее 254, 97 (1991) (валин⁷¹⁷ заменен на фенилаланин); Ми11ап е! а1., №!ите Сепе!. 1 345 (1992) (двойная замена лизина⁵⁹⁵ - метинина⁵⁹⁶ на аспарагин⁵⁹⁵ - лейцин⁵⁹⁶). Такие мутации, по-видимому, вызывают болезнь Альцгеймера путем усиления или изменения процессинга АРР в Ав, в частности процессинга АРР, приводящего к увеличению количества длинной формы Ав (т.е. Αβ1-42 и Αβ 1-43). Мутации в других генах, таких как гены пресенилина Ρδ1 и Ρδ2, по-видимому, косвенно влияют на процессинг АРР с образованием повышенных количеств длинной формы Αβ (см. Нат4у, ΤΙΝδ 20, 154 (1997)). Указанные наблюдения свидетельствуют о том, что Αβ и в особенности его длинная форма являются ключевым элементом в возникновении болезни Альцгеймера.

МеМ1еЬае1 (ЕР 526511) предлагает вводить гомеопатические дозы (менее чем или эквивалентные 10^-2 мг/день) Αβ пациентам с предсуществующей БА. У обычного человека с 5 л циркулирующей плазмы крови даже верхний предел указанной дозы будет соответствовать концентрации Αβ в плазме не более чем 2 пкг/мл. Обычная концентрация Αβ в плазме крови человека обычно составляет 50-200 пкг/мл ^еиЬеП е! а1., №!ите 359, 325-327 (1992)). Поскольку доза, предложенная в ЕР 326511, будет незначительно изменять уровень эндогенного циркулирующего Αβ и поскольку в данном источнике информации не рекомендуется использование адъюванта в качестве иммуностимулятора, представляется сомнительным, чтобы какой-либо терапевтический эффект был достигнут.

В противоположность указанному настоящее изобретение направлено ш!ет аЬа на лечение болезни Альцгеймера и других амилоидогенных заболеваний путем введения фрагментов Αβ или антител к различным эпитопам Αβ больным данным заболеванием, что приводит к формированию эффективного иммунного ответа у больного. Таким образом, изобретение решает давно стоящую терапевтическую потребность предотвращения и облегчения нейропатологии и, в некоторых случаях, когнитивной недостаточности, ассоциированной с болезнью Альцгеймера.

Сущность изобретения

Изобретение обеспечивает фрагмент Αβ, связанный с пептидом-носителем, предназначенный для применения при стимулировании иммунного ответа против Αβ и таким образом предотвращения или лечения болезни, ассоциированной с отложениями амилоида Αβ в головном мозге пациента, причем фрагмент Αβ состоит из:

(ί) Αβ 1-7 с аминокислотной последовательностью ΌΑΕΡΚΉΌ или (ίί) мультимера по (ί).

К таким заболеваниям относятся болезнь Альцгеймера, синдром Дауна и когнитивная недостаточность. Последняя может наблюдаться вместе с другими признаками амилоидогенного заболевания, а может развиваться сама по себе.

В другом контексте изобретение относится к способам предотвращения или лечения заболевания, ассоциированного с отложением амилоида Αβ в мозге больного. Например, способы могут быть использованы для лечения болезни Альцгеймера, синдрома Дауна или когнитивной недостаточности. Такие способы включают введение фрагментов Αβ или его аналогов, что вызывает иммуногенный ответ на определенные эпитопы в пределах Αβ. Некоторые способы основаны на введении больному эффективной дозы полипептида, содержащего Ν-концевой сегмент по крайней мере остатков 1-5 Αβ, первый остаток Αβ является Ν-концевым остатком полипептида, в то время как полипептид свободен от С-концевого

- 1 021614 сегмента Αβ. Другие способы включают введение больному эффективной дозы полипептида, включающего Ν-концевой сегмент Ав, сегмент начинается остатками 1-3 Ав и заканчивается остатками 7-11 Ав. Некоторые способы основаны на введении больному эффективной дозы агента, который индуцирует иммуногенный ответ на Ν-концевой сегмент Ав, сегмент начинается остатками 1-3 Ав и заканчивается остатками 7-11 Ав. При этом иммуногенный ответ не индуцируется против эпитопа, находящегося в пределах остатков 12-43 Ав 43.

В некоторых из описанных выше способах Ν-концевой сегмент Ав связывают на С-концевом участке с гетерологичным пептидом. В других из описанных выше способах Ν-концевой сегмент Ав связывают на Ν-концевом участке с гетерологичным полипептидом. Иногда Ν-концевой сегмент Ав связывают на Ν- и С-концевых участках с первым и вторым гетерологичными полипептидами. Также Νконцевой сегмент Ав связывают на Ν-концевом участке с гетерологичным полипептидом, а на Сконцевом участке - по крайней мере с одной дополнительной копией Ν-концевого сегмента. В определенных случаях гетерологичный полипептид включает по крайней мере одну дополнительную копию Νконцевого сегмента. Может быть так, что полипептид включает от Ν-концевого участка к С-концевому участку Ν-концевой сегмент Ав, многочисленные дополнительные копии Ν-концевого сегмента и гетерологичный аминокислотный сегмент. В некоторых способах Ν-концевой сегмент содержит Ав 1-7. Иногда Ν-концевой сегмент содержит Ав 3-7.

В определенных способах фрагмент свободен по крайней мере от 5 С-концевых аминокислотных остатков Ав 43. В некоторых случаях фрагмент содержит до 10 непрерывных аминокислот Ав 43. Фрагменты обычно вводят пациенту в дозе, составляющей более 10 мкг.

В некоторых способах фрагмент вводят вместе с адъювантом, который усиливает иммунный ответ на пептид Ав. Адъювант и фрагмент могут вводиться последовательно или в составе одной композиции. Адъювант может быть, например, гидроксидом алюминия, фосфатом алюминия, МРЬ™, О§-21 (§йши1оп™) или неполным адъювантом Фрейнда.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей фрагменты Ав или другие агенты, вызывающие иммуногенный ответ к тем эпитопам Ав, которые описаны выше, и адъювант.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Показан титр антител после инъекции трансгенным мышам Ав 1-42.

Фиг. 2. Отложения амилоида в гиппокампе. Оценка в процентах области гиппокампа, пораженной амилоидными бляшками, осуществлялась в реакции со специфическим к Ав моноклональным антителом 3Ό6 с помощью компьютерного количественного анализа изображений срезов мозга. Оценки для индивидуальных мышей показаны в соответствии с группой обработки. Горизонтальная линия в каждой группе отражает среднюю величину разброса.

Фиг. 3. Невритическая дистрофия в гиппокампе. Оценка в процентах области гиппокампа, пораженной дистрофическим невритом, осуществлялась в реакции со специфическим к АРР моноклональным антителом человека 8Е5 с помощью компьютерного количественного анализа изображений срезов мозга. Оценки для индивидуальных мышей показаны для обработанной ΑΝ 1792 группы и группы, обработанной РВ§ (контроль). Горизонтальная линия в каждой группе отражает среднюю величину разброса.

Фиг. 4. Астроцитоз в ретросплениальной коре. Оценка в процентах области коры, в которой выявляются астроциты, положительные по глиальному фибриллярному кислому белку (ОРАР), осуществлялась с помощью компьютерного количественного анализа изображений срезов мозга (реакция иммунного окрашивания). Оценка для индивидуальных мышей показана в соответствии с группой обработки и средние оценки по группе отмечены горизонтальными линиями.

Фиг. 5. Геометрическое выражение титра антител к Ав 1-42 после иммунизации 8 дозами ΑΝ 1792, содержащими 0,14; 0,4; 1,2; 3,7; 11; 33; 100 или 300 мкг белка соответственно.

Фиг. 6. Кинетика антительного ответа после иммунизации ΑΝ 1792. Титры выражены в геометрических значениях для 6 животных в каждой группе.

Фиг. 7. Количественный анализ изображений кортикальных амилоидных отложений у мышей, обработанных ΑΝ 1792 и РВ§.

Фиг. 8. Количественный анализ изображений невритических бляшек у мышей, обработанных ΑΝ 1792 и РВ§.

Фиг. 9. Процентный количественный анализ изображений областей ретросплениальной коры, заполненных астроцитами, у мышей, обработанных ΑΝ 1792 и РВ§.

Фиг. 10. Исследование пролиферации лимфоцитов на клетках селезенки после обработки ΑΝ 1792 (верхняя панель) и РВ§ (нижняя панель).

Фиг. 11. Общие уровни Ав-профилей у мышей, иммунизированных производными Ав или АРР вместе с адъювантом Фрейнда.

Фиг. 12. Амилоидные отложения в коре определяли количественным анализом изображений срезов мозга мышей, иммунизированных Ав-пептидными конъюгатами Αв 1-5, Αβ 1-12 и Ав 13-28; полнораз- 2 021614 мерные агрегаты ΑΝ 1792 (Αβ 1-42) и ΑΝ 1528 (Αβ 1-40) и обработанная контрольная группа.

Фиг. 13. Геометрическое значение титров Ав-специфических антител в группах мышей, иммунизированных производными Ав или АРР вместе с адъювантом Фрейнда.

Фиг. 14. Геометрическое значение титров Ав-специфических антител в группах морских свинок, иммунизированных ΑΝ 1792 или его пальмитоилированным производным вместе с различными адъювантами.

Фиг. 15(А-Е). Уровни Ав в коре 12-месячных мышей ΡΌΑΡΡ, обработанных ΑΝ 1792 или ΑΝ 1528 с различными адъювантами.

Фиг. 16. Средние титры антител у мышей, обработанных поликлональным антителом к Ав.

Фиг. 17. Средние титры антител у мышей, обработанных моноклональным антителом 10Ό5 к Ав.

Фиг. 18. Средние титры антител у мышей, обработанных моноклональным антителом 2Р12 к Ав.

Фиг. 19. Эпитопная карта. Рестрицированный Ν-концевой ответ. Сыворотка обезьян циномолгус, отобранная на 175 день, была тестирована методом ΕΟδΑ против серии состоящих из 10 аминокислот перекрывающихся полипептидов (8ЕЦ ГО N0: 1-41), соответствующих полноразмерной последовательности ΑΝ 1792. Животное под номером Р10920М обнаруживает репрезентативный Ν-концевой рестрицированный ответ на пептид ΌΑΕΡΡΗΌ8ΟΥ (8ЕЦ ГО Ν0: 9), который соответствует аминокислотам 110 пептида ΑΝ 1792 и используется в качестве иммунизирующего антигена.

Фиг. 20. Эпитопная карта. Нерестрицированный Ν-концевой ответ. Сыворотка обезьян циномолгус, отобранная на 175 день, была тестирована методом ΕΕΙ8Α против состоящих из 10 аминокислот перекрывающихся пептидов (8ЕЦ ГО Ν0: 1-41), соответствующих полноразмерной последовательности ΑΝ 1792. Животное под номером Р10975Р обнаруживает репрезентативный нерестрицированный Νконцевой ответ. Показана реактивность против двух Ν-концевых пептидов и одного С-концевого пептида ΌΑΕΡΡΗΌ8ΟΥ (8ЕЦ ГО Ν0: 9), который соответствует аминокислотам 1-10 пептида ΑΝ 1792. Показана реактивность по отношению к двум Ν-концевым пептидам и одному С-концевому пептиду ΌΑΕΡΡΗΌ8ΟΥ, который соответствует аминокислотам 1-10 пептида ΑΝ 1792.

Определения

Понятие по существу, идентичный означает, что две пептидные последовательности при оптимальном линеаризованном сравнении, например при использовании программ ΟΑΡ или ΒΕ8ΤΡΙΤ на основе пробелов мол. массы, обнаруживают по крайней мере 65%-ную идентичность, предпочтительно 80-90%-ную идентичность, более предпочтительно по крайней мере 95%-ную идентичность или более (например, 99%-ную идентичность или более высокую). Предпочтительно положения остатков, которые не идентичны, отличаются консервативными аминокислотными заменами.

Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность служит в качестве референспоследовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемую и референс-последовательности помещают в компьютер, при необходимости задают последующие координаты и обозначают параметры программы алгоритма сравнения последовательностей. Программа сравнения последовательностей затем вычисляет процент идентичности последовательностей, тестируемых по отношению к референспоследовательности, что основано на заданных параметрах программы.

Для сравнения должно быть обеспечено оптимальное выравнивание последовательностей, например, при использовании локального алгоритма гомологии 8ιηί11ι апД Уа1егтап (Αάν. Αρρί. Ма!Д. 2: 482 (1981)), алгоритма гомологии при выравнивании №еД1етап апД УипксД (1. Μοί. Βίοί. 48: 443 (1970)), метода поиска сходства Деагкоп апД Ыртап (Ргос. Ναΐί. ЛеаД. 8с1 υ8Α 85: 2444 (1988)), компьютеризованных улучшений указанных алгоритмов (ΟΑΡ, ΒΕ8ΤΡΙΤ, ΡΑ8ΤΑ и ΤΡΑ8ΤΑ в УЦсопкш СепеДск 8ой^аге Раскаде, СепеДск СотрШег Огоир, 575 8с1епсе Эг.. МаД1коп, XVI) или путем визуальной оценки (см., в целом, ЛикиЬеί е1 а1., см. выше). Одним примером алгоритма, который подходит для определения процентной идентичности последовательностей и сходства последовательностей, является алгоритм ΒΕΑ8Τ, который описан е! а1. (1. Мо1. Βώί. 215: 403-410 (1990)). Программное обеспечение для ΌΕΑ8Τанализа публично доступно из Национального центра биотехнологической информации (Дйρ://№№№.ηсЬ^.и1т.и^Д.дον). Обычно программные значения параметров по умолчанию могут быть использованы для осуществления сравнения последовательностей, хотя заказанные параметры также могут быть применены. Для аминокислотных последовательностей Β^Л8Τ-программа использует в качестве параметров по умолчанию длину слова (V) 3, ожидание (Е) 10 и оценочную матрицу ΌΕ08υΜ 62 (см. Неткой апД Неткой, Ριυα №Й. ЛсаД. 8ск υ8Α 89, 10915 (1989)).

Для целей классификации аминокислотных замещений как консервативных или неконсервативных аминокислоты группируются следующим образом.

Группа I (гидрофобные боковые цепи): норлейцин, тер а1а, νа1, 1еи, Де; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): сук, кег, Ди; группа III (кислые боковые цепи): акр, д1и;

группа IV (основные боковые цепи): акп, д1п, Пк, 1ук, агд; группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепей): д1у, рго;

- 3 021614 группа VI (ароматические боковые цепи): ΐτρ, !уг, рЪе.

Консервативные замены включают замены между аминокислотами в пределах одной и той же группы. Неконсервативные замены подразумевают замену аминокислоты одной группы на замену аминокислоты другой группы.

Заявленные в соответствии с настоящим изобретением терапевтические агенты обычно свободны от нежелательных контаминантов. Это означает, что агент обычно имеет по крайней мере примерно 50%-ную чистоту (вес./вес.), будучи, по существу, свободным от примесных белков и контаминантов. Иногда агенты имеют по крайней мере примерно 80%-ную чистоту (вес./вес.), более предпочтительно по крайней мере 90%-ную или примерно 95%-ную (вес./вес.) чистоту. Однако при использовании соответствующих методов очистки белков могут быть получены гомогенные пептиды, имеющие по крайней мере 99% чистоты (вес./вес.).

Специфическое связывание между двумя молекулами называется аффинностью. Аффинность может составлять по крайней мере 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹ М^-1 или 10¹⁰ М^-1. Предпочтительна аффинность более 10⁸ М^-1.

Понятие антитело или иммуноглобулин используется для обозначения интактных антител и их связывающих фрагментов. Обычно фрагменты конкурируют с интактным антителом, из которого они были получены, за специфическое связывание с антигеном. К фрагментам относятся отдельные тяжелые цепи, легкие цепи, РаЪ-, РаЪ'-, Р(аЪ')₂-, РаЪс- и Ρν-фрагменты. Фрагменты могут быть получены с помощью технологии рекомбинантных ДНК или путем энзиматического или химического разделения интактных иммуноглобулинов. Понятие антитело также включает одну или более цепей иммуноглобулинов, которые химически конъюгированы с другими белками или экспрессированы как белки слияния. Понятие антитело также означает биспецифическое антитело. Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различных пары тяжелых/легких цепей и два различных связывающих сайта. Биспецифические антитела могут быть получены различными способами, в том числе слиянием гибридом или связыванием РаЪ'-фрагментов (см., например, δοη^δίνίΠί аий ЬасЪтаии, С1ш. Ехр. 1ттипо1. 79: 315-321 (1990); Ко§!е1иу е! а1., I. 1ттипо1. 148, 1547-1553 (1992)).

АРР⁶⁹⁵, АРР⁷⁵¹ и АРР⁷⁷⁰ обозначают, соответственно, полипептиды длиной 695, 751 и 770 аминокислот, кодируемые геном АРР человека (см. Каид е! а1., Иа!иге 325, 773 (1987); Рои!е е! а1., Иа!иге 331, 525 (1988); и КйадисЫ е! а1., Иа!иге 331, 530 (1988)).

Аминокислоты амилоидного белка-предшественника человека (АРР) обозначены номерами в соответствии с последовательностью изоформы АРР770. Сокращения Ав 39, Ав 40, Ав 41, Ав 42 и Ав 43 относятся к пептиду Ав, содержащему аминокислотные остатки 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 и 1-43.

Понятие антиген означает субстанцию, которая специфически связывается антителом.

Понятие эпитоп или антигенная детерминанта относится к участку антигена, на который отвечают Т- или В-клетки. В-клеточные эпитопы могут быть сформированы как непрерывной последовательностью аминокислот, так и прерывающимися в линейной последовательности аминокислотами за счет четвертичного скручивания белка. Эпитопы, сформированные непрерывной последовательностью аминокислот, обычно сохраняют свою структуру при обработке денатурирующими растворителями, в то время как структура эпитопов, образованных в результате четвертичного скручивания белка, утрачивается при такой обработке. Эпитоп обычно включает по крайней мере 3 и более, по крайней мере 5 или 8-10 аминокислот, имеющих уникальную пространственную конформацию. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и 2-мерный ядерный магнитный резонанс (см., например, Ерйоре Марршд Рто!осок ш Ме1ЪоЙ8 ш Мо1еси1аг Вю1оду, νο1. 66, О1еии Е. ^т8, Ей. (1996)). Антитела, которые распознают тот же самый эпитоп, могут быть идентифицированы в простом иммуноанализе, показывающем способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью. Т-клетки распознают эпитопы, сформированные последовательными аминокислотами. Такой эпитоп содержит 9 аминокислот для СИ8-клеток и около 1315 аминокислот для СИ4-клеток. Т-клетки, которые распознают эпитоп, могут быть идентифицированы ш уйго, основанными на измерении антиген-зависимой пролиферации по включению ³Н-тимидина в праймированные Т-клетки в ответ на эпитоп (Витке е! а1., I. 1иГ. Όίδ. 170, 1110-19 (1994)), по антигензависимому киллингу (исследование цитотоксических Т-лимфоцитов, Т1дде8 е! а1., I. 1ттиио1. 156, 39013910) или по секреции цитокинов.

Понятие иммунологический или иммунный ответ означает развитие гуморального (опосредованного антителами) и/или клеточного (опосредованного антиген-специфическими Т-клетками или продуктами их секреции) ответа, направленного на амилоидный пептид, в организме реципиента. Такой ответ может быть активным, индуцированным введением иммуногена, или пассивным, индуцированным введением антител или праймированных Т-клеток. Клеточный иммунный ответ обеспечивается презентацией полипептидных эпитопов вместе с молекулами МНС класса I или класса II для активации антиген-специфических С.П4' хелперных Т-клеток и/или С'П8' цитотоксических Т-клеток. Иммунный ответ может также включать активацию моноцитов, макрофагов, ΝΚ-клеток, базофилов, дендритных клеток,

- 4 021614 астроцитов, клеток микроглии, эозинофилов или других клеток иммунной системы. Наличие опосредованного клетками иммунного ответа может быть определено в исследованиях пролиферации С'.Н4' Тклеток или цитотоксических Т-лимфоцитов (см. Витке, выше; Тфдс5. выше). Относительный вклад гуморального и клеточного ответов в протективный или терапевтический эффект иммуногена может быть установлен раздельным выделением антител и Т-клеток из организма иммунизированного сингенного животного и определением протективного или терапевтического эффекта у второго индивидуума.

Иммуногенный агент или иммуноген способен индуцировать иммунологический ответ при введении его млекопитающему, при необходимости вместе с адъювантом.

Понятие раздетый полинуклеотид означает полинуклеотид, не находящийся в комплексе с коллоидным материалом. Иногда раздетые полинуклеотиды клонируют в плазмидном векторе.

Понятие адъювант относится к соединению, которое при введении совместно с антигеном усиливает иммунный ответ на антиген, но когда вводится само по себе, не вызывает иммунного ответа на антиген. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ различным образом, в том числе за счет забора лимфоцитов, стимуляции В- или Т-клеток и стимуляции макрофагов.

Понятие пациент относится к человеку и другому млекопитающему, которое получает профилактическое или терапевтическое лечение.

Дезагрегированный или мономерный Αβ представляет собой растворимый, мономерный пептид Αβ. Одним из способов получения мономерного Αβ является растворение лиофилизированного пептида в очищенном ΌΜδΘ с обработкой ультразвуком. Полученный раствор центрифугируют для удаления каких-либо нерастворившихся образований. Агрегированный Αβ представляет собой смесь олигомеров, в которой мономерные единицы удерживаются вместе посредством нековалентных связей.

Конкуренцию между антителами определяют в исследовании, когда тестируемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание референс-антититела с общим антигеном, например Αβ. Известны многочисленные модификации анализа конкурентного связывания, например, твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноэссей (К1А), твердофазный прямой или непрямой ферментный иммуноэссей (ΕΙΑ), сэндвичный конкурентный анализ (см. δΙαΗΗ е1 а1., МеШобк ίη Εηζνιηοίοβν 9: 242-253 (1983)); твердофазный прямой биотин-авидиновый ΕΙΑ (см. КлИапб е1 а1., 1. 1ттипо1. 137: 3614-3619 (1986)); твердофазный прямой анализ с меткой, твердофазный прямой сэндвичевый анализ с меткой (см. Нат1оте апб Ьапе, АпбЬоб1е8, А ЬаЬотаЮгу Мапиа1, Со1б Зрппд НатЬот Ргекк (1988)); твердофазный прямой ΚΙΑ с меткой при использовании в качестве метки ¹²⁵Ι (см. Моге1 е1 а1., Мо1ес. 1ттипо1. 25(1): 7-15 (1988)); твердофазный прямой биотин-авидиновый ΕΙΑ (СЬеипд е1 а1., У1то1о§у 176: 546-552 (1990)); и прямой ΚΙΑ с меткой (Мо1бепйаиег е1 а1., Зеапб. 1. Iттиηо1. 32: 77-82 (1990)). Обычно такой анализ включает использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью или клеток, несущих такой антиген, немеченного тестируемого иммуноглобулина и меченного референс-иммуноглобулина. Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества метки, связавшейся с твердой фазой или клетками в присутствии тестируемого иммуноглобулина. Обычно тестируемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Αнтитела, идентифицируемые в конкурентном анализе (конкурирующие антитела), включают антитела, связывающиеся с тем же самым эпитопом, что и референс-антитело, и антитела, связывающиеся с соседним эпитопом, достаточно близким к эпитопу, с которым связывается референс-антитело. Обычно, когда конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое связывание референс-антитела с общим антигеном по крайней мере на 50 или 75%.

Композиции и способы, включающие один или более из описанных выше элементов, могут включать и другие элементы, специфически не оговоренные. Например, композиция, которая содержит Αβпептид, относится к композиции, содержащей выделенный Αβ-пептид и Αβ-пептид как составляющую часть более длинной полипептидной последовательности.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Ι. Общие положения

Некоторые амилоидогенные заболевания и состояния характеризуются отложениями Αβ-пептида, агрегированного в нерастворимую массу, в мозге больного. К таким заболеваниям относятся болезнь Αльцгеймера, синдром Дауна и когнитивная недостаточность. Последняя является симптомом болезни Αльцгеймера и синдрома Дауна, но может развиваться и сама по себе. Например, средней тяжести когнитивная недостаточность или связанная с возрастом потеря памяти наблюдается у больных, у которых еще не развилась в полной мере, а может быть никогда и не разовьется болезнь Αльцгеймера. Средней тяжести когнитивная недостаточность может быть определена в соответствии с программой Мийтеп1а1 81а1е Ехат и действующими рекомендациями. Указанные заболевания характеризуются наличием агрегатов Αβ, имеющих β-складчатую структуру и окрашивающихся красителем Конго Красный. Основной подход к предотвращению или лечению болезни Αльцгеймера или других амилоидогенных болезней заключается в обеспечении развития иммунного ответа на компонент амилоидного отложения в организме больного, как описано в заявке νθ 99/27944 (ссылочный материал). Настоящее изобретение подтверждает эффективность такого подхода. Однако оно принципиальным образом улучшает существующие реагенты и способы. В первую очередь, авторы настоящего изобретения локализовали предпочти- 5 021614 тельные эпитопы Αβ-пептида, против которых следует направить иммуногенный ответ. Идентификация предпочтительных эпитопов А β-пептида привела к разработке агентов и способов, имеющих повышенную эффективность, редуцированные побочные эффекты и/или более легкое производство, приготовление и введение.

II. Терапевтические агенты

Иммуногенный ответ может быть активным, когда иммуноген вводится для индуцирования антител, взаимодействующих с Ав в организме больного, или пассивным, когда в организм больного вводятся готовые антитела, связывающие Ав.

1. Агенты, индуцирующие активный иммунный ответ

Терапевтические агенты индуцируют иммуногенный ответ, специфически направленный к различным эпитопам Ав-пептидов. Предпочтительные агенты включают пептид Ав как таковой и его фрагменты. Также могут быть использованы варианты таких сегментов, аналоги и миметики природного Авпептида, которые индуцируют образование антител и/или перекрестно реагируют с антителами к предпочтительным эпитопам Ав-пептида.

Ав, также известный как в-амилоидный пептид А4 (см. И8 4666829; С1еииег апб \Уопд. Вюейеш. Вюрйук. Ке8. Соттип. 120, 1131 (1984)) представляет собой пептид из 39-43 аминокислот, который является основным компонентом бляшек, характерных для болезни Альцгеймера. Ав образуется путем процессинга более крупного белка АРР с помощью двух ферментов, называемых в- и γ-секретазами (см. Нагбу, ΤΙΝ8 20, 154 (1997)). Известные мутации АРР, ассоциированные с болезнью Альцгеймера, обнаруживаются в непосредственной близости от сайта в- или γ-секретазы или в пределах Ав. Например, положение 717 является проксимальным по отношению к сайту расщепления γ-секретазой АРР с образованием Ав, а положение 670/671 является проксимальным по отношению к сайту расщепления всекретазой. Полагают, что мутации вызывают болезнь Альцгеймера за счет нарушения реакций расщепления, за счет которых образуется Ав, так что увеличивается количество форм Ав, состоящих из 42/43 аминокислот.

Ав обладает тем необычным свойством, что способен фиксировать и активировать как классический, так и альтернативный пути активации комплемента. В частности, он связывает С1с| и обязательно С3Ы. Указанный комплекс обеспечивает связывание с макрофагами, что приводит к активации в-клеток. Более того, С3Ы далее расщепляется и связывает СК2 на в-клетках зависимым от Т-клеток образом с обеспечением активации указанных клеток в 10000 раз. Данный механизм способствует тому, что Ав генерирует избыточный иммунный ответ по отношению к другим антигенам.

Известны различные формы природного Ав. К формам Ав человека относятся Ав 39, Ав 40, Ав 41, Ав 42 и Ав 43. Последовательности указанных пептидов и их взаимосвязь с предшественником АРР проиллюстрированы на фиг. 1 (Нагбу е! а1., ΤΙΝ8 20, 155-158 (1997)). Например, Ав 42 имеет следующую последовательность:

Н2И-А5р-А1а-О1и-Р11е-Аг8-Н15-А5р-8ег-С1у-Туг-О1и-Уа1-Н|5-Н|5-С1п-Ьу5-Теи-Уа1РЬе-Р11е-А1а-О1и-А5р-Уа1-О1у-8ег-А5п-Бу5-О1у-А]а-11е-1]е-С1у-Ееи-Ме1-Уа1-О1у-О1у-Уа1Уа1-11е-А1а-ОН (8Еф ΙΟΝΟ: 42).

Ав 41, Ав 40 и Ав 39 отличаются от Ав 42 отсутствием А1а, А1а-11е, Л1а-11е-Уа1 соответственно на С-концевом участке. Ав 43 отличается от Ав 42 наличием треонинового остатка на С-концевом участке.

Иммуногенные фрагменты Ав имеют преимущество по сравнению с интактной молекулой Ав в заявленных способах по следующим причинам. Во-первых, поскольку только некоторые эпитопы в пределах Ав индуцируют необходимый для лечения болезни Альцгеймера иммуногенный ответ, эквивалентная доза массы фрагмента, содержащего такие эпитопы, обеспечивает большую молярную концентрацию полезных иммуногенных эпитопов, чем доза интактного Ав. Во-вторых, определенные иммуногенные фрагменты Ав генерируют иммуногенный ответ против отложений амилоида без инициации значительного иммунного ответа против белка АРР, из которого образуется Ав. В-третьих, фрагменты Ав проще изготовить, чем интактный Ав, из-за более короткого размера. В-четвертых, фрагменты Ав не агрегируют таким образом, как интактный Ав, облегчая приготовление фармацевтических композиций и их применение.

Некоторые иммуногенные фрагменты Ав имеют последовательность, состоящую по крайней мере из 2, 3, 5, 6, 10 и 26 последовательно расположенных аминокислот природного пептида. Некоторые иммуногенные фрагменты имеют более 10, 9, 8, 7, 5 или 3 непоследовательно расположенных остатков Ав. Фрагменты Ν-концевой половины пептида Ав предпочтительны. Предпочтительные иммуногенные фрагменты включают Ав 1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3 и 1-4. Обозначение Ав 1-5, например, указывает на фрагмент, включающий остатки 1-5 Ав и утративший другие остатки Ав. Фрагменты, начинающиеся с остатков 1-3 Ав и заканчивающиеся остатками 7-11 Ав, особенно предпочтительны. Фрагмент Ав 1-12 также может быть использован, но менее предпочтителен. В некоторых способах фрагмент является Ν- 6 021614 концевым фрагментом, другим, нежели фрагмент Αβ 1-10. К другим менее предпочтительным фрагментам относятся фрагменты Ав 13-28, 17-28, 1-28, 25-35, 35-40 и 35-42. Указанные фрагменты требуют скрининга на активность в отношении предотвращения образования или разрушения отложений амилоида, как описано в примерах, до использования.

Фрагменты, утратившие по крайней мере одну и иногда по крайней мере 5-10 С-концевых аминокислот по сравнению с природными формами Ав, используются в некоторых способах. Например, фрагмент, утративший 5 аминокислот С-концевого участка Ав 43, включает первые 38 аминокислот Νконцевого участка Αβ. Другие компоненты амилоидных бляшек, например, синуклеин и его эпитопные фрагменты также могут быть использованы для индукции иммуногенного ответа.

Если не указано иное, ссылка на Αβ означает природную аминокислотную последовательность белка человека, описанную выше, а также на ее аналоги, включая аллельные, видовые и индуцированные варианты. Аналоги обычно отличаются от природно существующих пептидов по одному, двум или нескольким положениям, часто за счет консервативных замещений. Аналоги обычно обнаруживают по крайней мере 80 или 90%-ное сходство последовательностей в сравнении с последовательностями природных пептидов. Некоторые аналоги также включают неприродные аминокислоты или модификации Νили С-концевых аминокислот по одному, двум или нескольким положениям. Например, природный остаток аспарагиновой кислоты в положении 1 и/или 7 Αβ может быть заменен изоаспарагиновой кислотой. Примерами неприродных аминокислот являются Ό-аминокислоты, Ь-двузамещенные аминокислоты, Ν-алкиламинокислоты, молочная кислота, 4-гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-Ν,Ν,Νтриметил-лизин, ε-Ν-ацетил-лизин, О-фосфосерин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, ω-Ν-метиларгинин и изоаспарагиновая кислота. Фрагменты и аналоги могут быть скринированы на профилактическую или терапевтическую эффективность при использовании моделей на трансгенных животных в сравнении с контрольными животными, не получающими ничего или получающими плацебо, как описано ниже.

Αβ, его фрагменты и аналоги могут быть синтезированы твердофазным методом или получены путем рекомбинантной экспрессии. Они также могут быть выделены из природных источников. Автоматические синтезаторы пептидов коммерчески доступны от различных поставщиков, таких как АррНсН Βίο8у81еш8, Ροδΐβτ Сйу, СаПГопиа. Рекомбинантная экспрессия может быть получена в бактериях, например Е.соН, дрожжах, клетках насекомых или клетках млекопитающих (Методики рекомбинантной экспрессии описаны 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1 (С.8.Н.Р. ΡϊΌδδ. ΝΥ 2й ей., 1989)). Некоторые формы Αβ-пептида также доступны коммерчески (например, Атейсап Рерййеδ Сотрапу, 1пс., 8иппууа1е, СА и СаПГопиа Рерййе Ρеδеа^сΗ. 1пс. №ра, СА).

Терапевтические агенты также включают более длинные полипептиды, содержащие, например, активный фрагмент Αβ-пептида вместе с другими аминокислотами. Например, предпочтительные агенты включают белки слияния, содержащие сегмент Αβ, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью, которые индуцируют Т-хелперный ответ против гетерологичной аминокислотной последовательности и, таким образом, В-клеточный ответ против сегмента Αβ. Такие полипептиды могут быть скринированы для анализа профилактической или терапевтической эффективности на моделях на животных по сравнению с контрольными животными, не получающими ничего или получающими плацебо, как описано ниже. Пептид Αβ, аналог, активный фрагмент или другой полипептид может вводиться в ассоциированной или мультимерной форме или в диссоциированной форме. Терапевтические агенты также включают мультимеры мономерных иммуногенных агентов.

Кроме того, иммуногенный пептид, например фрагмент Αβ, может быть представлен с помощью вируса или бактерии как части фармацевтической композиции. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммуногенный пептид, вводится в геном или эписому вируса или бактерии. Иногда нуклеиновая кислота вводится таким образом, что иммуногенный пептид экспрессируется как секретируемый белок или как белок слияния с внешним поверхностным белком вируса или трансмембранным белком бактерии, так что пептид может быть представлен на поверхности вируса или бактерии. Вирусы или бактерии, используемые в таких способах, должны быть непатогенными или аттенуированными. Подходящие вирусы включают аденовирусы, Н8У, вирус венесуэльского энцефалита лошадей и другие альфавирусы, вирус везикулярного стоматита и другие рабдовирусы, вирус вакцины и оспы домашней птицы. К подходящим бактериям относятся 8а1топе11а и 8Ыде11а. Особенно полезным является слияние иммуногенного пептида с НХАд НВУ. К терапевтическим агентам также относятся пептиды и другие соединения, которые необязательно имеют существенную аминокислотную последовательность, сходную с таковой Αβ, но обязательно являются миметиками Αβ и вызывают аналогичный иммунный ответ. Например, любые пептиды и белки, формирующие β-складчатую структуру, могут быть оценены на пригодность. Также могут быть использованы антиидиотипические антитела против моноклональных антител к Αβ и другим амилоидогенным пептидам. Такие анти-1й антитела имитируют антиген и генерируют против него иммунный ответ (см. Еδδеηΐ^а1 1ттипо1оду Кой ей., В1аск\уе11 8с1епййс РиЬйсйющ, Ра1о А1!о, б!й ей., р. 181). Α^π™, отличные от Αβ-пептидов, способны индуцировать иммуногенный ответ против одного

- 7 021614 или более одного предпочтительных сегментов Αβ, перечисленных выше (например, 1-10, 1-7, 1-3 и 3-7). Предпочтительно такие агенты индуцируют иммуногенный ответ, специфически направленный к одному из указанных сегментов и не направленный к другим сегментам Ав.

Рандомизированные библиотеки пептидов или других соединений также могут быть подвергнуты скринингу на полезность. Комбинаторные библиотеки могут быть получены для различных типов соединений, которые могут быть синтезированы методикой шаг за шагом. К таким соединениям относятся полипептиды, миметики бета-поворота, полисахариды, фосфолипиды, гормоны, простагландины, стероиды, ароматические соединения, гетероциклические соединения, бензодиазепины, олигомерные Ызамещенные глицины и олигокарбаматы. Большие комбинаторные библиотеки указанных соединений могут быть сконструированы способом кодируемых синтетических библиотек (Е8Ь), описанным АТйшах, \0 95/12608, АГйшах, \0 93/06121, Со1ишЫа ишуеткйу, \0 94/080501, РЬагшасоре1а, \0 95/35503 и 8спррк. \0 95/30642 (каждая работа включена в настоящее описание в качестве ссылки). Пептидные библиотеки также могут быть получены с помощью методов фагового дисплея (см., например, ОеуПп. \0 91/18980).

Комбинаторные библиотеки и другие соединения могут быть первоначально скринированы на пригодность путем определения их способности связываться с антителами или лимфоцитами (В или Т), для которых известна их специфичность по отношению к Αβ или другим амилоидогенным пептидам. Например, первоначальный скрининг может быть осуществлен при использовании поликлональной сыворотки или моноклональных антител к Αβ или его фрагментам. Затем соединения могут быть тестированы на связывание со специфическим эпитопом Αβ например, 1-10, 1-7, 1-3, 1-4, 1-5 и 3-7. Соединения могут быть тестированы теми же самыми методами, которые описаны для картирования антительной эпитопной специфичности. Соединения, идентифицированные такими методами, затем анализируют на их способность индуцировать образование антител или реакционноспособных лейкоцитов, активных в отношении Αβ или его фрагментов. Например, многочисленные разведения сыворотки могут быть тестированы в планшетах для микротитрования, предварительно покрытых Αβ или его фрагментами, с помощью стандартного метода ЕЙ18А для выявления реакционноспособных антител к Αβ или его фрагментам. Соединения могут быть тестированы на профилактическую и терапевтическую эффективность на трансгенных животных с амилоидогенным заболеванием, как описано в примерах. К таким животным относятся, например, мыши с мутацией 717 ΑΡΡ (см. Сашек е! а1., см. выше) и мыши, несущие шведскую мутацию 670/671 ΑΡΡ (см. МсСоп1одие е! а1., И8 5612486 и Нк1ао е! а1., 8с1епсе 274, 99 (1996); 8!аиГепЫе1 е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск И8А 94, 13287-13292 (1997); 8!игсЫег-Р1егга! е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск И8А 94, 13287-13292 (1997); ВотсйеЬ е! а1., Ыеигоп 19, 939-945 (1997)). Αналогичная методика скрининга может быть использована для поиска других потенциальных агентов, взаимодействующих с аналогами Αβ и более длинными пептидами, включающими фрагменты Αβ, описанные выше.

2. Белковые носители

Некоторые агенты для индукции иммунного ответа содержат необходимый эпитоп, генерирующий ответ против отложений амилоида, но сами по себе настолько малы, что не могут быть иммуногенными. В этом случае потенциальный пептидный иммуноген связывают с подходящим носителем, который обеспечивает иммунный ответ. Подходящие носители включают сывороточные альбумины, гемоцианин моллюска фиссуреллы, молекулы Ι§, тиреоглобулин, овальбумин, токсоид столбняка или токсоид других патогенных бактерий, например бактерий дифтерии, Е. сой, холерного вибриона, Н. ру1оп или аттенуированные производные токсоида. К другим носителям относятся Т-клеточные эпитопы, которые связываются с многочисленными аллелями МНС, например, по крайней мере 75% всех аллелей МНС человека. Такие носители часто называют универсальными Т-клеточными эпитопами. Примерами универсальных Т-клеточных эпитопов являются следующие:

Гемагглютинин вируса гриппа: НА_307-319 НКУУКрЫТЬКЕАТ (8ЕЦ ГО N0: 43);

РАЭРЕ (общие остатки выделены): АКХУААУТЬКААА (8ЕЦ ГО N0: 44);

Штамм малярии С8: Т3 эпитоп ЕКК1АКМЕКА88УЕЫУ (81%) ГО N0: 45);

Поверхностный антиген вируса гепатита В: НВкА§1_9-28 РТЪСТКГОТ1 (8ЕЦ ГО N0: 46);

Белок теплового шока 65: Ькр6515_3-1₇1Пр81СПЕ1АЕАМПКУСПЕС (8ЕЦ ГО N0: 47);

БЦЖ ЦУНЕЦРЕРРАУУКЬ (81%) ГО N0: 48);

Токсоид столбняка: ТТ_830-844 (')УШЛ\8кТ%.1ТН1. (81%) ГО N0: 49);

Токсоид столбняка: ТТ_947-967 Т\М^;ТУ8Т\\'1.Н\РкУ8Л81 ΙΙ.Η (81%) ГО N0: 50);

Н1У др120 Т1: КЦИИМ^ЦЕУСКАМУА (81%) ГО N0: 51).

Другие носители для стимуляции или усиления иммунного ответа включают цитокинины, такие как 1Ь-1, пептиды 1Ь-1а и ΙΒ-1β, 1Ь-2, γ ЮТ, ГО-10, СМ-С8Р, и хемокины, такие как М1Р1а и β и РАЭТЕ8. Иммуногенные агенты также могут быть связаны с пептидами, которые увеличивают транспорт между тканями (см. 0'Майопу, \0 97/17613 и \0/17614).

Иммуногенные агенты могут быть связаны с носителями путем химического перекрестного соединения. Методики связывания носителя с иммуногеном включают формирование дисульфидных связей при использовании N-сукцинимидил-3-(2-пиридил-тио)пропионата (8РИР) и сукцинимидил 4-(И- 8 021614 малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (8МСС) (если у пептида нет сульфгидрильной группы, обеспечивают добавление цистеинового остатка). Указанные реагенты создают дисульфидную связь между ними самими и цистеиновыми остатками одного белка и амидную связь между ε-амином лизина или другой свободной аминогруппой других аминокислот. Многочисленные агенты, формирующие дисульфид/амидные связи, описаны в 1ттип. Кеу. 62, 185(1982).

Другие бифункциональные сшивающие агенты формируют тиоэфирные связи, а не дисульфидные. Многие из таких агентов, формирующих тиоэфирные связи, коммерчески доступны и включают реакционноспособные эфиры 6-малеимидокапроновой кислоты, 2-бромуксусной кислоты, 2-иодуксусной кислоты, 4-(Ы-малеимидо-метил)циклогексан-1-карбоновой кислоты. Карбоксильные группы могут быть активированы путем их объединения с сукцинимидом или 1-пуроксил-2-нитро-4-сульфоновой кислотой, натриевой солью.

Иммуногенные пептиды также могут быть экспрессированы как белки слияния с носителями (т.е. гетерологичными пептидами). Иммуногенный пептид может быть связан на амино-концевом участке, карбокси-концевом участке или обоих участках с носителем. Иногда в белке слияния могут быть множественные повторы иммуногенного пептида. С другой стороны, иммуногенный пептид может быть связан с многочисленными копиями гетерологичного пептида, например, как на С-концевом участке пептида. Некоторые пептидные носители служат для индукции хелперного Т-клеточного ответа на пептидноситель. Индуцированные хелперные Т-клетки, в свою очередь, индуцируют В-клеточный ответ против иммуногенного пептида, связанного с пептидом-носителем.

Некоторые из заявленных агентов включают белок слияния, в котором Ν-концевой фрагмент Αβ связан на своем концевом участке с пептидом-носителем. В случае таких агентов Ν-концевой остаток фрагмента Αβ представляет собой Ν-концевой остаток белка слияния. Соответственно, такие белки слияния эффективны в отношении индукции антител, которые связываются с эпитопом, для которого необходимо, чтобы Ν-концевой остаток Αβ находился в свободной форме. Некоторые заявленные агенты включают многочисленные повторы Ν-концевого сегмента Αβ, связанного на С-концевом участке с одной или более копиями белка-носителя. Ν-концевой фрагмент Αβ, включенный в такие белки слияния, иногда начинается с Αβ 1-3 и заканчиваются Αβ 7-11. Αβ 1-7, Αβ 1-3, 1-4, 1-5 и 3-7 предпочтительны в качестве Ν-концевого фрагмента Αβ. Некоторые белки слияния включают различные Ν-концевые сегменты Αβ в тандеме. Например, белок слияния может включать Αβ 1-7 за Αβ 1-3 и далее гетерологичный пептид.

В некоторых белках слияния Ν-концевой сегмент Αβ сливают на Ν-концевом участке с гетерологичным пептидным носителем. Тот же самый набор Ν-концевых сегментов Αβ может быть использован для слияния по С-концу. Некоторые белки слияния включают гетерологичный пептид, связанный с Νконцевым участком Ν-концевого сегмента Αβ, который, в свою очередь, связан с одним или более дополнительных Ν-концевых сегментов Αβ в тандеме.

Некоторые примеры белков слияния, подходящих для использования в изобретении, приведены ниже. Некоторые из указанных белков слияния включают сегменты Αβ, связанные с эпитопами токсоида столбняка, такими как описанные в И8 5196512, ЕР 378881 и ЕР 427347. Определенные белки слияния содержат сегменты Αβ, связанные с пептидными носителями, описанными в И8 5736142. Некоторые гетерологичные пептиды представляют собой универсальные клеточные эпитопы. В некоторых способах агент для введения представляет собой один белок слияния, состоящий из Αβ-сегмента, связанного с гетерологичным сегментом в линейной конфигурации. В других способах агент представляет собой мультимерные белки слияния, выраженные формулой 2^х, где х представляет собой целое число 1-5. Предпочтительно х является 1, 2 или 3, значение 2 наиболее предпочтительно. Когда х=2, такой мультимер содержит 4 белка слияния, связанных в предпочтительной конфигурации, обозначенной как ΜΑΡ4 (см. И8 5229490). Эпитопы Αβ подчеркнуты.

Конфигурация ΜΑΡ4 показана ниже. Разветвленные структуры получают путем инициирования пептидного синтеза по Ν-концевому амину и амину боковой цепи лизина. В зависимости от числа участков разветвления лизин включается в последовательность и обеспечивает разветвление; полученная в результате этого структура будет включать многочисленные концевые участки. В данном примере получают 4 идентичных Ν-концевых участка на разветвленном содержащем лизин ядре. Такая множественность во много раз усиливает отвечаемость распознающих В-клеток.

- 9 021614

ΑΝ90549(Αβ 1-7/Токсоид столбняка 830-844 в МАР4 конфигурации):

Ι)ΑΕΕΚΗΓΧ)ΥΙΚ ΑΝδΚΡΙΰΠΈΕ(8ΕΟ Ιϋ ΝΟ: 52)

ΑΝ90550(Αβ 1-7/Токсоид столбняка 947-967 в МАР4 конфигурации ΟΑΕΡΚΗΙ)ΡΝΝΡΤν3Ρ\νΐ_1<νΡΚν8Α8ΗΕΕ (ЗЕО ГО ΝΟ: 53)

ΑΝ90542 (Αβ 1-7/Токсоид столбняка 830-844 + 947-967 в линейной конфигурации): ΟΑΕΡΚΗΟ0ΥΙΚΑΝ5ΚΡ]ΟΙΤΕΕΡΝΝΡΤν5ΡλνΕΚνΡΚν5Α8ΗΙ.Ε (ЗЕО 1ΟΝΟ: 54)

ΑΝ90576 (Αβ З-9/Токсоид столбняка 830-844): в МАР4 конфигурации ΕΡΚΗΟ8Ο0ΥΙΚΑΝ8ΚΡΙΟΙΤΕΕ ( ЗЕО ГО ΝΟ: 55)

Пептиды, описанные ΤΙ8 5 736 142 (все в линейной конфигурации):

ΑΝ90562 (Αβ 1-7/ОТОХВЬ) АКХУАА\3'ТЬКАААОАЕРК1ГО (ЗЕО ГО N0: 56)

ΑΝ90543 (Αβ 1-7 х 3/пептад): ΟΑΕΡΚΗϋΟΑΕΡΚΗΟϋΑΕΡΚΗΟΑΚΧ УААЧ1ЪКААА (5Εζ>ΙΕ>ΝΟ: 57) том)

Другие примеры белков слияния включают иммуногенные эпитопы (Αβ выделены жирным шрифАКХУААУ/ТЕКЛЛЛ-ОАЕГКНВ-ЮАЕРКРГО-ОАЕРКРП) (ЗЕО ГО ΝΟ: 58) ΟΑΕΓΚΗΟ-ΛΚΑνΛΛν/ΤΕΚΑΑΑ (ЗЕО ГО N0:59) ΟΑΕΓΚΗΟ-ΙδΟΑνΡΙΑΑΗΑΕΙΝΕΑΟΚ (ЗЕО ГО ΝΟ: 60) ΓΚΗϋδΟΥ-ΙδΟΑνΗΑΑΗΑΕΙΝΕΑΟΚ (ЗЕО Ш ΝΟ: 61)

ОЛЕРИНЦ- Ι80ΑνΗΑΑΗΑΕΙΝΕΑΟΚ (ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 62) РКУУКООТЬКЕАТ-ОАЕРКНО-ЮАЕГКНО-ОАЕРКНО (ЗЕО ГО N0:63) ЦАЕЕКН1) -РКΥΫΚ0ΝΤ1 .К1.А1-ЦАЕЕКН1» (8Ер ГО ΝΟ: 64) Ι>ΑΕΕΚΗϋ-ϋΑΕΡΚΗϋ-ΟΑΕΓΚΗΟ-ΡΚ УУКОЗП ΕΚίΑ! (ЗЕО ГО ΝΟ: 65) ϋΑΕΕΚΗϋ-ΟΑΕΤΚΗΙ»-ΡΚΥνΚ0ΝΤΕΚΕΑΤ (ЗЕО ГО ΝΟ: 66) ΟΑΕΓΚΗΟ-ΡΚΥνΚ0ΝΤΕΚΕΑΤ-ΕΚΚ1ΑΚΜΕΚΑ83νΡΝνΟΥΙΚΑΝδΚΡΙΟΙΤΕΕ-ΡΝΝΡΤνδΡУ/ЕКУРК УЗАЗНЬЕ-ВАЕРКРП) (ЗЕО ГО ΝΟ: 67) ЦАЕГКНО-ЦАЕРКТЮ-ВАЕГКНЦ-ОТЧКЛЫЗКРКЛТЕЕΡΝΝΡΤν8Ρ\νΕΕνΡΚν8Α8ΗΕΕ (8Е0 ГО ΝΟ: 68)

ΒΑΕΕΚΗϋ-ΟΥΙΚΑΝεΚΡίαΐΤΕΕΟΡΝΝΡΤνδΡν/ΕΚνΡΚνδΑδΗΕΕ ( ЗЕО ГО ΝΟ: 69) ΟΑΕΕΚΗΟ-ΟΥΙΚΑΝδΚΡΙΟΙΤΕΕΟΡΝΝΡΤνδΡλνΕΚνΡΚνδΑδΗΕΕЦАЕГКНВ (ЗЕО ГО ΝΟ: 70)

ИАЕРКНП-ΟΥΙΚ ΑΝ3ΚΡΙΟΪΤΕΙ, (ЗЕО ГО ΝΟ: 52) с двумя разветвлениями

Εζ>νΤΧνθ€ΛΙ80ΑνΗΑΑΗΑΕ1ΝΕΑ<3Ε (ЗЕр ГО ΝΟ: 71) (Белок слияния синуклеина в МАР-4 конфигурации)

Аналогичные или сходные белки-носители и способы связывания могут быть использованы для генерации иммуногенов с целью их применения для получения антител к Ав для пассивной иммунизации. Например, фрагмент Ав, связанный с носителем, может быть введен лабораторному животному для получения моноклональных антител к Ав.

IV. Пациенты, подлежащие лечению

Пациенты, подлежащие лечению, могут не обнаруживать симптомов заболевания, но иметь к нему предрасположенность, а могут обнаруживать явные симптомы заболевания. В случае болезни Альцгеймера к пациенту с предрасположенностью к ней или страдающему от нее может быть отнесен любой человек, если он живет достаточно долго. Таким образом, заявленные способы могут применяться профилактически по отношению ко всем людям без какой-либо оцени риска возникновения заболевания у конкретного человека. Заявленные способы особенно эффективны в тех случаях, когда пациенты имеют генетическую предрасположенность к болезни Альцгеймера. Это могут быть родственники людей с такой болезнью или индивидуумы, чья предрасположенность к болезни Альцгеймера установлена с помощью анализа генетических или биохимических маркеров. Генетическими маркерами предрасположенно- 10 021614 сти к болезни Альцгеймера являются мутации в гене АРР, в особенности мутации в положениях 717 и 670 и 671, известных как мутации Нагбу и §\ус6Ы1 соответственно (см. Нагбу, ΤΙΝ§, выше). Другими маркерами риска являются мутации генов пресенилина Р§1 и Р§2, белок АроЕ4, случаи заболевания болезнью Альцгеймера в семье, гиперхолестеролемия или атеросклероз. Индивидуумы, страдающие болезнью Альцгеймера, могут быть выявлены по характерному слабоумию, а также по наличию факторов риска, описанных выше. Кроме того, многочисленные диагностические тесты могут быть использованы для идентификации людей с болезнью Альцгеймера. Они включают, например, определение уровней ѧРтау и Ав 42. Увеличенные уровни тау и Ав 42 свидетельствуют о наличии болезни Альцгеймера. Индивидуумы, страдающие от болезни Альцгеймера, также могут быть выявлены в соответствии с критерием ΑΌΚΌΑ, как описано в примерах.

У пациентов с отсутствием симптомов лечение может начинаться в любом возрасте (например, 10, 20, 30). Обычно, однако, нет необходимости начинать лечение до того, как возраст пациента достигнет 40, 50, 60 или 70 лет. Лечение обычно включает введение множественных доз препарата в течение определенного периода времени. Лечение можно контролировать наблюдением за уровнем антител или активированным Т-клеточным или В-клеточным ответом на терапевтический агент (например, Ав-пептид) с течением времени. Если ответ спадает, назначают бустерную дозу. В случае потенциальных больных с синдромом Дауна лечение может начинаться в пренатальный период путем введения терапевтического агента в организм матери или сразу же после рождения.

V. Режим лечения

В профилактических целях фармацевтические композиции или лекарственные средства вводят пациенту, чувствительному к болезни Альцгеймера или имеющему предрасположенность к данной болезни, в количестве, достаточном для элиминирования или редукции риска возникновения заболевания, снижения его тяжести, задержки возникновения заболевания, в том числе биохимических, гистологических и/или поведенческих симптомов заболевания, его осложнений и промежуточных патологических фенотипов, возникающих в процессе развития заболевания. В случае терапевтического применения композиции или лекарственные средства вводят пациенту, у которого возможно развитие заболевания, или с уже развившимся заболеванием в количестве, достаточном для лечения, или, по крайней мере, частичного элиминирования симптомов заболевания (биохимических, гистологических и/или поведенческих), в том числе его осложнений и промежуточных патологических фенотипов, возникших в процессе развития заболевания. В некоторых способах введение агента, редуцирующего или элиминирующего миокогнитивную недостаточность у пациентов, у которых еще не наблюдаются развившиеся признаки болезни Альцгеймера. Количество препарата, адекватное для обеспечения терапевтического или профилактического лечения, определяется как терапевтическая или профилактическая эффективная доза. В случае профилактических и терапевтических схем агенты обычно вводят в нескольких дозах, пока не будет достигнут достаточный иммунный ответ. Обычно иммунный ответ контролируется и повторные дозы могут быть назначены, если иммунный ответ начинает затихать.

Эффективные дозы и композиции заявленного изобретения для лечения описанных выше состояний в большой степени зависят от многих различных факторов, в том числе способов введения, сайтамишени, физиологического состояния пациента, видовой принадлежности пациента (медицинское или ветеринарное применение), других принимаемых препаратов и от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно пациент является человеком, однако заявленные способы лечения применимы и к другим млекопитающим. Дозы, используемые для лечения, следует титровать, чтобы оптимизировать их безопасность и эффективность. Количество иммуногена зависит от того, используется ли адъювант или нет, более высокие дозы не требуют введения адъюванта. Количество иммуногена для введения пациенту иногда варьирует от 1-500 мкг, однако обычно составляет 5-500 мкг на инъекцию при введении человеку. Иногда используется более высокая доза (1-2 мг) в расчете на инъекцию. Количество иммуногена также зависит от соотношения числа иммуногенных эпитопов и массы иммуногена в целом. Обычно 10^-3-10^-5 микромолей иммуногенного эпитопа используют в расчете на микрограмм иммуногена. Число инъекций варьирует существенным образом от одной в день до одной в год и одной в декаду. Доза иммуногена, вводимая пациенту в день, составляет более чем 1 мкг и обычно более чем 10 мкг, если она вводится совместно с адъювантом, и более 10 мкг, если адъювант не используется. Обычная схема включает иммунизацию с последующими бустерными инъекциями в определенные временные интервалы, например шестинедельные. Другая схема включает иммунизацию с последующими бустерными инъекциями 1, 2 и 12 месяцев спустя. Другая схема включает инъекции каждые два месяца в течение дальнейшей жизни. Альтернативно, бустерные инъекции могут быть нерегулярными в соответствии с контролем иммунного ответа.

Для пассивной иммунизации антителом дозы варьируют от около 0,0001 до 100 мг/кг и, более часто, от 0,01 до 5 мг/кг веса тела. Например, доза может составлять 1 мг/кг веса тела или 10 мг/кг веса тела или в пределах 1-10 мг/кг. Примерная схема лечения включает введение препарата один раз каждые две недели или один раз в месяц, или один раз каждые 3-6 месяцев. В некоторых способах два или более моноклональных антител с различными связывающими специфичностями вводят подкожно, причем доза

- 11 021614 вводимого антитела указана выше. Антитело обычно вводят множественными дозами. Интервалы между отдельными дозами могут составить неделю, месяц или год. Интервалы также могут быть нерегулярными, что зависит от уровней антитела к Ав в крови пациента. В некоторых способах доза подбирается таким образом, чтобы уровень антитела в плазме крови достиг 1-1000 мкг/мл и иногда 25-300 мкг/мл. Альтернативно, антитело может быть введено в форме композиции с поддерживаемым высвобождением; в этом случае требуется менее частое введение. Доза и частота введения в большой степени зависят от периода полужизни антитела в организме пациента. В целом, антитела человека обладают наибольшим периодом полужизни, затем следуют гуманизированные антитела, химерные антитела и антитела другой видовой принадлежности (нечеловеческие антитела). Доза и частота введения варьируют в большой степени от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В профилактических случаях используются относительно низкие дозы, которые вводят относительно нечасто в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение всю оставшуюся жизнь. В терапевтических случаях используются относительно высокие дозы, вводимые в относительно короткие интервалы времени до тех пор, пока не закончится или не остановится прогрессивное развитие заболевания, или предпочтительно до тех пор, пока у пациента частично или полностью не исчезнут симптомы заболевания.

Дозы нуклеиновых кислот, кодирующих иммуногены, варьируют от около 10 нг до 1 г, от 100 нг до 100 мг, от 1 мкг до 10 мг или от 30-300 мкг ДНК в расчете на одного пациента. Дозы для инфекционных вирусных векторов варьируют от 10 до 100, или более, вирионов на дозу.

Агенты, индуцирующие иммунный ответ, могут вводиться парентерально, местно, внутривенно, орально, подкожно, внутриартериально, интраперитонеально, интраназально, внутримышечно или внутричерепным образом для профилактического и/или терапевтического лечения. Наиболее обычный способ введения иммуногенного агента - это подкожный, хотя и другие способы также эффективны. Другой наиболее распространенный способ введения - это внутримышечная инъекция, которую обычно осуществляют в плечо или ногу. В некоторых способах агенты инъецируют непосредственно в определенную ткань, где аккумулированы отложения амилоида, например, внутричерепным образом. Внутримышечная инъекция или внутривенное вливание предпочтительны для введения антител. В некоторых способах определенные терапевтические антитела инъецируют непосредственно под черепную коробку. Иногда антитела вводят в форме композиции с поддерживаемым высвобождением или с помощью устройства, например МеФрай™.

Заявленные агенты иногда могут быть введены в комбинации с другими агентами, которые, по крайней мере, частично эффективны в лечении амилоидогенной болезни. В случае болезни Альцгеймера и синдрома Дауна, при которых отложения амилоида обнаруживаются в мозге, заявленные агенты также могут вводиться совместно с другими агентами, которые увеличивают поступление терапевтически значимых соединений через гематоэнцефалический барьер.

Заявленные иммуногенные агенты, такие как пептиды, иногда вводят в сочетании с адъювантом. Для генерации иммунного ответа в сочетании с пептидом, например пептидом Αβ, могут вводиться различные адъюванты. Предпочтительные адъюванты усиливают иммунный ответ на иммуноген и не вызывают его конформационных изменений, которые влияют на качественный характер ответа. К таким адъювантам относятся гидроксид алюминия и фосфат алюминия 3 Ое-0-ацилированный монофосфорил липид А (МРЬ™) (см. СВ 2220211). Стимулон™ 03-21 представляет собой тритерпеновый гликозид или сапонин, выделенный из коры дерева 0ш11а.)а Заропапа МоЬпа, растущего в Южной Америке (см. Кепвй е! а1., в Уаееше Эезщп: ТЬе ЗиЬииЬ апй Айщуап! АрргоаеЬ (ейв. Ро\уе11 & Ые^тап, Р1епит Ргевв, ΝΥ, 1995); ИЗ 5057540 (АсцФа ВюРЬагтаееиЬеак, РгаттдЬат, МА)). К другим адъювантам относятся эмульсии типа масло в воде (например, сквален или арахисовое масло), часто в комбинации с иммунными стимуляторами, такими как монофосфорил липид А (см. ЗЮШе е! а1., Ν. Епд1. 1. Мей. 336, 86-91 (1997)). Другим адъювантом является СрС (ТОО 98/40100). Альтернативно, Ав может быть связан с адъювантом. Однако такое связывание не должно существенным образом изменять конформацию Ав так, чтобы не влиять на природу возникающего иммунного ответа. Адъюванты могут использоваться в качестве компонентов терапевтической композиции вместе с активным агентом или могут вводиться отдельно, до, одновременно или после введения терапевтического агента.

Предпочтительным классом адъювантов являются соли алюминия (алюминиевые квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия. Такие адъюванты могут быть использованы вместе или без других специфических иммуностимулирующих агентов, таких как МРЬ или 3-ЭМР, 03-21, полимерные или мономерные аминокислоты, например полиглутаминовая кислота или полилизин. Другой класс адъювантов включает водно-масляные эмульсии, которые могут быть использованы вместе или без других специфических иммуностимулирующих агентов, таких как мурамил-пептиды (например, Ν-ацетилмурамил-Ь-треонил-О-изоглутамин (Фг - УЭР), Ν-ацетил-нормурамил-Ь-аланил-Оизоглутамин (нор-МОР), Ы-ацетилмурамил-Е-аланил-О-изоглутаминил-Ь-аланин-2-(1'-2' дипальмитоил5п-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ), Ы-ацетил-глюкозаминил-Ы-ацетилмурамил-ЬА1-О-изоглу-Ь-А1а-дипальмитокси пропиламид (ОТР-ОРР)терамид™ или другие компоненты клеточной

- 12 021614 стенки бактерий. К указанным эмульсиям относятся:

а) МР 59 (\УО 90/14837), содержащий 5% сквалена, 0,5% твина 80 и 0,5% спана 80 (часто содержащего различные количества МТР-РЕ) и представляющий собой субмикронные частицы, сформированные с помощью специального устройства (Мо4е1 110Υ, МютойшФск, №\\1оп МА);

б) δΑΡ, содержащий 10% сквалена, 0,4% твина 80, 5% блок-полимера плюроника Ь 121 и !Ьг-МОР, сформированного в виде субмикронной эмульсии или в виде эмульсии с более крупными частицами (полученными с помощью устройства Уойех), и

в) КЫ™ система на основе адъюванта (ΚΑδ), (ΚΛί 1ттипосЬет., НатПЮп, МТ), содержащая 2% сквалена, 0,2% твина 80 и один или более компонентов бактериальной стенки, выбранных из группы, включающей монофосфориллипид А (МРЬ), димиколат трегалозы (ТОМ) и скелетон клеточной стенки бактерий (С^Vδ). предпочтительно МРЬ + ί'.'\νδ (ЭеЮ.х™). Другой класс предпочтительных адъювантов включает сапониновые адъюванты, такие как стимулон (Οδ-21, Αςυί1η, РтаттдЬат, МΑ) или частицы, полученные на его основе, например, IδСОМδ (иммуностимулирующие комплексы) и IδСОМΑΤΚIX. Другие адъюванты включают полный адъювант Фрейнда (ί','ΡΑ) и неполный адъювант Фрейнда (ΙΡΑ). К адъювантам относятся и цитокины, такие как интерлейкины (1Ь-1, 1Ь-2 и 1Ь-12), макрофагальный колониестимулирующий фактор (М-С8Р), фактор некроза опухолей (ΤΝΡ).

Адъювант может быть введен вместе с иммуногеном в составе одной композиции или же до, одновременно или после введения иммуногена. Иммуноген и адъювант могут быть упакованы вместе и храниться в одной ампуле или же быть упакованы в отдельные ампулы и смешиваться перед использованием. Обычно иммуноген и адъювант упаковывают вместе с аннотацией, раскрывающей необходимое терапевтическое применение. Если иммуноген и адъювант упакованы отдельно, упаковка обычно содержит инструкции по их смешиванию до использования. Выбор адъюванта и/или носителя зависит от стабильности иммуногенной композиции, содержащей адъювант, способа введения, схемы дозирования и эффективности адъюванта в отношении видовой принадлежности иммунизируемого пациента. В случае человека фармацевтически приемлемым адъювантом является такой адъювант, который был протестирован и утвержден к применению на людях соответствующими инстанциями. Например, полный адъювант Фрейнда не подходит для введения человеку. Предпочтительны алюминиевые квасцы, МРЬ и Οδ21. Одновременно могут быть использованы два или более различных адъюванта. Предпочтительные комбинации включают алюминиевые квасцы и МРЬ, квасцы и Οδ-21, МРЬ и Οδ-21, а также квасцы, Οδ21 и МРЬ. Также может быть использован неполный адъювант Фрейнда (СЬапд е! а1., Αάνапсеά Эгад ЭеНуету Кеу1е\\ъ 32, 173-186 (1998)), иногда в комбинации с какими-либо из квасцов, Οδ-21 и МРЬ, а также комбинации всех указанных веществ.

Заявленные агенты часто вводят в виде фармацевтических композиций, содержащих активный терапевтический агент и другие фармацевтически приемлемые компоненты (см. КенипдЮп'х РЬаттасеи!юа1 δ^ι^ (15^ώ е4., Маск РиЫЫипд Сотрапу, Еаз!оп, Репзуката, 1980)). Предпочтительная форма зависит от способа введения и терапевтического назначения. Композиции также могут включать, в зависимости от нужного состава, фармацевтически приемлемые нетоксичные носители или разбавители, которые широко используются для доставки композиций при введении человеку и животным. Разбавитель выбирают таким образом, чтобы он не влиял на биологическую активность композиции. Примерами таких разбавителей являются дистиллированная вода, физиологический фосфатный-буферный раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хэнкса. Кроме того, фармацевтическая композиция или состав может включать другие носители, адъюванты или нетоксичные, нетерапевтические неиммуногенные стабилизаторы и т.д.

Фармацевтические композиции также могут включать более крупные, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, такие как хитозан, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты и сополимеры (например, латексную сефарозу (ТМ)), агароза, целлюлоза и т.д., полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и агрегаты липидов (например, капли масел или липосомы). Кроме того, указанные носители могут функционировать в качестве иммуностимулирующих агентов (т.е. адъювантов).

Для парентерального применения заявленные агенты могут вводиться дозами в виде инъекций раствора или суспензии активного вещества в физиологически приемлемом разбавителе вместе с фармацевтически приемлемым носителем, который может быть стерильной жидкостью, такой как водные масла, физиологический раствор, глицерол или этанол. Кроме того, в состав композиций могут входить дополнительные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, сурфактанты, вещества, поддерживающие рН, и т.д. Другими компонентами композиций могут быть масла животного или растительного происхождения, например арахисовое масло, соевое масло, а также синтетические и минеральные масла. В целом, предпочтительны гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль в качестве жидких носителей, в особенности для растворов, предназначенных для инъекций. Антитела могут вводиться в форме препаратов с поддерживаемым высвобождением активного ингредиента (инъекции типа депо или имплантаты). Примером антительной композиции может быть композиция, содержащая 5 мг/мл антител в водном буфере, включающем 50 мМ Ь-гистидина, 150 мМ ΝιΟ (рН компо- 13 021614 зиции доводят до 6,0 с помощью НС1).

Обычно композиции готовят как пригодные для инъекций, как в виде жидких растворов или суспензий, так и в виде твердых форм, предназначенных для растворения или суспендирования в заранее приготовленных средствах доставки. Препарат может быть эмульгирован или инкапсулирован в липосомы или микрочастицы, такие как полилактидные, полигликолидные или сополимерные, для усиления адъювантного эффекта, как описано выше (см. Ьапдег, §с1епсе 249, 1527 (1990) и Напек, Абуапсеб Эгид ОсПусгу Кеу1е№5 28, 27-119 (1997)). Заявленные агенты могут вводиться в форме депо-инъекций или имплантатов, которые имеют такой состав, чтобы обеспечить как поддерживаемое, так и пульсовое высвобождение активного ингредиента.

Другие способы введения препаратов включают оральный путь, интраназальный, легочный, а также применение суппозиториев и чрезкожных пластырей.

Для суппозиториев носителями и связывающими агентами могут быть, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть сформированы из смесей, содержащих активный ингредиент в количестве 0,5-10%, предпочтительно 1-2%. Оральные составы включают наполнители, например фармацевтической степени чистоты маннитол, лактозу, крахмал, стеарат магния, натриевый сахарин, целлюлозу и карбонат натрия. Указанные композиции могут быть в виде растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с поддерживаемым высвобождением и содержать 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%.

Местное применение обеспечивается путем чрезкожной или внутрикожной доставки. Такое применение может сопровождаться совместным использованием холерного токсина или его производных или субъединиц, лишенных токсичности, а также других бактериальных токсинов (см. О1епп е! а1., Иа!иге 391, 851 (1998)). Совместное введение может быть достигнуто использованием компонентов в виде смеси или в форме связанных молекул, полученных путем химического перекрестного сшивания или экспрессии белков слияния.

Альтернативно, чрезкожная доставка может обеспечиваться при использовании кожных аппликаторов или трансферосом (Раи1 е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 25, 3521-24 (1995); Сеус е! а1., Вюсйет. Вюрйук. Ас!а 1368, 201-15 (1998)).

VI. Методы диагностики

Изобретение относится к способам детекции иммунного ответа против пептида Αβ у пациента, страдающего от болезни Альцгеймера или восприимчивого к такой болезни. Способы особенно полезны для мониторинга курсом лечения, назначенным больному. Указанные способы могут быть использованы для наблюдения за терапевтическим лечением пациентов с симптомами заболевания, а также профилактическим лечением бессимптомных пациентов. Такие способы применяются для контроля как активной иммунизации (например, за титром антител, образующихся в ответ на введение иммуногена), так и пассивной иммунизации (например, измерение уровня введенных антител).

1. Активная иммунизация

Некоторые способы подразумевают определение базового значения иммунного ответа у пациента до введения дозы терапевтического агента и сравнение его со значением, полученным после лечения. Существенное увеличение (большее чем обычный предел экспериментальной ошибки в повторяющихся измерениях одного и того же образца, выражаемый как одно стандартное отклонение от среднего при таких измерениях) значения иммунного ответа свидетельствует о том, что лечение было позитивным (т.е. введение агента обеспечило иммунный ответ или усилило его). Если показатель иммунного ответа существенно не изменился или не увеличился, это свидетельствует о негативном лечении. В целом, у пациентов, которые подвергаются первоначальному курсу лечения иммуногенным агентом, ожидается усиление иммунного ответа, которое затем выходит на плато. Введение агента обычно продолжается до тех пор, пока иммунный ответ не перестает усиливаться. Поддержание уровня плато говорит о том, что введение препарата или лечение может быть остановлено или уменьшена доза, или частота введения препарата.

В других способах для контрольной популяции определяют контрольное (т.е. среднее и стандартное отклонение) значение иммунного ответа. Обычно индивидуумы в контрольной популяции не получают предварительного лечения. Измеренные значения иммунного ответа пациента после введения терапевтического агента сравнивают затем с контрольным значением. Существенное увеличение значений иммунного ответа по сравнению с контролем (например, на величину, большую чем одно стандартное отклонение от среднего значения) свидетельствует о положительном лечении. Отсутствие существенного увеличения или снижения сигналов указывает на негативное лечение. Введение агента обычно продолжают в течение периода времени, пока иммунный ответ увеличивается по сравнению с контрольным значением. Как и в ранее описанных способах, поддержание значений иммунного ответа на уровне плато по сравнению с контрольным свидетельствует о том, что введение препарата или лечение может быть остановлено или уменьшена доза или частота введения препарата.

В других способах определяют контрольное значение иммунного ответа (т.е. среднее и стандартное отклонение) для контрольной популяции индивидуумов, которые ранее подвергались лечению и чей иммунный ответ вышел на плато в результате лечения. Измеренные значения иммунного ответа пациента

- 14 021614 сравнивают с контрольным значением. Если значение иммунного ответа у пациента существенно не отличается (т.е. не выше одного стандартного отклонения) от контрольного значения, лечение может быть остановлено. Если значение иммунного ответа у пациента существенно ниже контрольного значения, продолжается введение терапевтического агента. Если значение иммунного ответа у пациента постоянно находится ниже контрольного уровня, даже при изменении схемы лечения, может быть показано, например, использование адъюванта.

В других способах у пациента, который не получает лечения в данное время, но прошел курс предварительного лечения, постоянно контролируют иммунный ответ для того, чтобы определить, не требуется ли повторение лечения. Измеренное значение иммунного ответа пациента можно сравнить со значением иммунного ответа, выявленного у пациента после предварительного курса лечения. Существенное снижение значения иммунного ответа по сравнению с предварительно измеренным (на величину, большую чем обычная ошибка повторных измерений одного и того же образца) свидетельствует о том, что лечение следует возобновить. Альтернативно, измеренное значение иммунного ответа у пациента можно сравнить с контрольным значением (среднее + стандартное отклонение), измеренным для популяции пациентов после предварительного курса лечения. Альтернативно, измеренное значение иммунного ответа у пациента можно сравнить с контрольным значением, измеренным для популяции пациентов, подвергнутых профилактическому лечению, у которых отсутствуют симптомы заболевания, или со значением для популяции пациентов, подвергнутых терапевтическому лечению, у которых снижены симптомы заболевания. Во всех случаях существенное снижение величины иммунного ответа по сравнению с контрольным (т.е. более чем на величину одного стандартного отклонения) свидетельствует о том, что лечение пациента следует возобновить.

Образец ткани для анализа обычно представляет собой кровь, плазму, сыворотку крови, слизь или спинномозговую жидкость, полученные от пациента. Образцы анализируют на показатели иммунного ответа к любой форме пептида Ав, обычно Ав 42. Иммунный ответ может быть определен по наличию, например, антител или Т-клеток, которые специфически связываются с пептидом Ав. Методы ЕЫ§А для определения антител, специфических к Ав, описаны в примерах. Способы выявления реакционноспособных Т-клеток описаны выше (см. раздел Определения). В некоторых способах иммунный ответ определяют по разрушению бляшек, как описано в разделе III выше. В таких случаях образец ткани пациента тестируют, обеспечивая его контактирование с отложениями амилоида (например, полученными от мышей РИАРР) и фагоцитарными клетками, несущими рецепторы Рс. Последующее разрушение амилоидных отложений подвергается контролированию. Наличие и продолжительность такого иммунного ответа свидетельствует о том, что существующий уровень антител эффективен для очищения от отложений Ав тестируемого образца ткани, полученного от больного.

Примеры

I. Профилактическая эффективность Ав по отношению к болезни Альцгеймера

Указанные примеры описывают введение пептида Ав 42 трансгенным мышам, сверхэкспрессирующим АРР с мутацией в положении 717/ΑΡΡ₇ι_7ν^_Ρ), за счет чего предрасположены к развитию нейропатологии, характерной для болезни Альцгеймера. Получение и свойства таких мышей (ΡΌΑΡΡ мыши) описаны (Сашек с1 а1., №Нигс. см. выше). Указанные животные в гетерозиготной форме обнаруживают тенденцию к отложению Ав, начиная с 6 месяцев жизни. К 15 месяцам жизни у них обнаруживаются уровни отложения Ав, эквивалентные таковым, которые свойственны болезни Альцгеймера. Мышей ΡΌΑΡΡ инъецируют агрегированным Ав 42 или фосфатным буферным раствором (ΡΒδ). Агрегированный Ав 42 выбирают потому, что он способен индуцировать образование антител к множественным эпитопам Ав.

А. Методы

1. Источник мышей

Гетерогенных самок мышей ΡΌΑΡΡ были произвольно разделены на следующие группы: 10 животных инъецировали агрегированным Ав 42 (одна мышь умерла при перевозке), 5 животных инъецировали ΡΒδ/адъювантом или ΡΒδ и 10 животных служили контролем. 5 Животных инъецировали пептидами, происходящими из последовательности сывороточного амилоидного белка (δΑΡ).

2. Приготовление иммуногенов

Получение агрегированного Ав 42: 2 млг Ав 42 (Όδ Ρеρΐ^άе5 Фс, 1οΐ К-42-12) растворяют в 0,9 мл воды и доводят до 1 мл добавлением 0,1 мл 10х ΡΒδ. Смесь обрабатывают на установке νοΓΚχ и инкубируют в течение ночи при 37°С для агрегации пептида. Любую часть неиспользованного Ав хранят в виде сухого лиофилизированного порошка при -20°С до следующей инъекции.

3. Осуществление инъекций

Для каждой инъекции 100 мкг агрегированного Ав 42 в ΡΒδ в расчете на мышь эмульгируют в соотношении 1:1 в полном адъюванте Фрейнда (СРА) в конечном объеме 400 мкл эмульсии для первой иммунизации, за которой следует бустерное введение того же самого количества иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда (РРА) через 2 недели. Две дополнительные дозы препарата в ГРА вводят с месячны- 15 021614 ми интервалами. Последующие иммунизации осуществляют с месячными интервалами в 500 мкл РВ8. Инъекции осуществляют интраперитонеально (ί.ρ.).

Инъекции РВ8 проводят по той же самой схеме и мышей инъецируют смесью РВ8/адъювант в соотношении 1:1 (400 мкл) в расчете на мышь или 500 мкл РВ8. Инъекции 8АР также проводят по аналогичной схеме при дозе 100 мкг на инъекцию.

4. Титрование крови мышей, препарирование тканей и иммуногистохимия

Указанные способы описаны ниже в разделе Материалы и методы.

В. Результаты

Мышей РИАРР инъецируют агрегированным Αβ 42, пептидами 8АР или РВ8. Группу мышей РИАРР оставляют без инъекций в качестве положительного контроля. Титры антител у мышей, инъецированных Αβ 42, оценивают каждый месяц, начиная с 4-й бустерной инъекции, до тех пор пока животным не исполнится год. Мышей умерщвляют через 13 месяцев. Во все анализируемые точки времени восемь из девяти мышей, инъецированных агрегированным Αβ 42, обнаруживают высокий титр антител, который остается высоким на протяжении серии инъекций (титры превышают величину 1/10000). У девятой мыши обнаруживается низкий, но измеряемый титр, составляющий примерно 1/1000 (фиг. 1, табл. 1). У мышей, инъецированных 8АР, титр составляет 1/100-1/30000 по отношению к данному иммуногену и только у одной мыши титр равен 1/100000.

Кровь мышей, инъецированных РВ8, титруют против агрегированного Αβ 42 на 6-й, 10-й и 12-й месяцы. При разведении сыворотки контрольных животных 1/100, титруемой против агрегированного Αβ 42, только в одну точку времени фоновое значение титра было превышено более чем в 4 раза, а во все временные точки значение титра было меньше фонового более чем в 4 раза (табл. 1). 8АРспецифический ответ не определялся в указанные точки времени во всех титрах, меньших 300.

Таблица1

				|
				Титр при 50% от максимальной ОЭ
				|
				Мыши, которым инъецировали агрегированный АР
Возраст мышей Ρϋ.ΛΡΡ	Мышь 100	Мышь 101	Мышь 102	Мышь 103	Мышь 104	Мышь 105	Мышь 106	Мышь 107	Мышь 108
4	70000	150000	15000	120000	1000	15000	50000	80000	100000
6	15000	65000	30000	55000	300	15000	15000	50000	60000
8	20000	55000	50000	50000	400	15000	18000	50000	60000
10	40000	20000	60000	50000	900	15000	50000	20000	40000
12	25000	30000	60000	40000	2700	20000	70000	25000	20000
			Мыши, которым инъецировали РВЗ. по отношению к обоим иммуногенам, в разведении 1 100
		Возраст тлией Ρϋ.ΛΡΡ	Мышь 113	Мышь 114	Мышь 115	Мышь 116	Мышь 117
		6	< 4х фон	< 4х фон	< 4х фон	< 4х фон	< 4х фон
		10	5 X фон	< 4х фон	< 4х фон	< 4х фон	< 4х фон
		12	< 4х фон	< 4х фон	< 4х фон	< 4х фон	< 4х фон

У 7 из 9 мышей, получавших агрегированный Αβ 1-42, не выявлялись отложения амилоида в головном мозге. В противоположность этому в головном мозге мышей, иммунизированных 8АР и РВ8, обнаруживались значительные отложения амилоида в гиппокампе, так же как во фронтальной и в поясной извилинах. Характер отложений аналогичен таковым у контрольных необработанных животных с характерным включением уязвимых подучастков, таких как внешний молекулярный слой зубчатой извилины гиппокампа. У одной мыши среди животных, инъецированных Αβ 1-42, наблюдалось существенное снижение отложений амилоида, ограниченное гиппокампом. Изолированная бляшка была идентифицирована у другой мыши, инъецированной Αβ 1-42.

Количественный анализ отложений амилоида в гиппокампе подтверждает существенное их снижение у обработанных Αβ 42 (ΆΝ 1792) животных (фиг. 2). Средние значения отложений амилоида в группе животных, получавших РВ8 (2,22%), и группе контрольных необработанных животных (2,65%) были значительно выше, чем у животных, иммунизированных АN 1792 (0,00%, р=0,0005). В противополож- 16 021614 ность указанному среднее значение для группы, иммунизированной 8АР-пептидами (8АРР), составляло 5,74%. В мозговой ткани необработанных контрольных животных многочисленные отложения амилоида визуализируют с помощью Αβ-специальных моноклональных антител (мЛТ) 3Ό6 в гиппокампе, а также в ретросплениальной коре. Сходный характер амилоидных отложений также наблюдается у мышей, иммунизированных 8АРР или РВ8 (фиг. 2). Кроме того, в последних трех группах выявилось характерное включение уязвимых подучастков в головном мозге, которое всегда наблюдается при болезни Αльцгеймера, такое как внешний молекулярный слой зубчатой извилины гиппокампа.

Если в головном мозге не обнаруживалось отложений Αβ, то в них отсутствовали и невритические бляшки, которые обычно визуализируются у мышей РЭАРР с помощью антитела человека 8Е5 к ΑΡΡ. У животных всех оставшихся групп (мыши, инъецированные 8АР, РВ8 и необработанные мыши) в головном мозге выявлялись многочисленные невритические бляшки, характерные для необработанных животных. Незначительное число невритических бляшек обнаруживалось у одной мыши, инъецированной АN 1792, и у второй такой мыши выявлялся определенный кластер дистрофического неврита. Αнализ гиппокампа (фиг. 3) показал, что действительная элиминация дистрофического неврита у обработанной АN 1792 мыши (среднее значение 0,00%) была сравнима с таковой животных-реципиентов РВ8 (среднее значение 0,25%, р=0,0005).

Αстроцитоз, характерный для ассоциированного с бляшками воспаления, также отсутствовал в головном мозге животных, входящих в группу, инъецированную Αβ 1-42. В головном мозге мышей других групп содержались многочисленные и кластеризованные ОРАР-позитивные астроциты, типичные для ассоциированного с бляшками глиоза. Набор срезов с реакцией на ОРАР был противоокрашен Тиофлавином С для локализации отложений Αβ. ОРАР-позитивные астроциты были ассоциированы с бляшками Αβ у животных, получавших 8АР, РВ8 и контрольных мышей. Подобная ассоциация не обнаруживалась у не имеющих бляшек обработанных Αβ 1-42 мышей, в то время как минимальный, ассоциированный с бляшками глиоз, идентифицировали у одной мыши, инъецированной ΆΝ 1792.

Αнализ ретросплениальной коры, приведенный на фиг. 4, показывает, что редукция числа астроцитов была значительной со средним значением 1,56% для группы, обработанной ΆN 1792, по сравнению со средним значением, превышающим 6%, для группы, иммунизированной пептидами 8АР, РВ8 или необработанных животных (р=0,0017).

Данные, полученные при исследовании мышей, инъецированных Αβ 1-42 и РВ8, показывают, что ассоциированная с бляшками иммунореактивность МНС II отсутствует у животных, которым инъецировали Αβ 1-42, что соответствует утрате связанного с Αβ воспалительного ответа.

Срезы головного мозга мышей также подвергали реакции с мΑТ, специфичными к моноклональным антителам к ΜΑ^1, белку клеточной поверхности. ΜΑ^1 (СИ11Ь) представляет собой белок семейства интегринов и существует в гетеродимерной форме с СЭ18. Комплекс СЭ11Ь/СЭ18 присутствует на моноцитах, нейтрофилах и природных киллерных клетках (Мак апй 81тагй). Резидентный ΜΑΟΉреактивный тип клеток в головном мозге скорее всего является клетками микроглии, что основано на сходной фенотипической морфологии ΜΑΟΉ иммунореактивных срезов. Мечение ΜΑ^1, ассоциированное с бляшками, было ниже в головном мозге животных, обработанных АЯ 1792, по сравнению с контрольной группой, получавшей РВ8, что соответствовало утрате индуцированного Αβ воспалительного ответа.

С. Выводы

Отсутствие Αβ-бляшек и реактивных нейрональных и глиотических изменений в головном мозге мышей, инъецированных Αβ 1-42, свидетельствует о том, что существенно малые отложения амилоида образуются в головном мозге или не образуются вовсе, а патологические последствия этого, такие как глиоз и невритическая патология, отсутствуют. У РИАРР мышей, обработанных Αβ 1-42, обнаруживается практически точно такая же утрата патологических признаков, что и у контрольных животных. Таким образом, инъекции Αβ 1-42 высокоэффективны в предотвращении отложений амилоида или очищении от Αβ ткани головного мозга, а также в элиминировании последующих нейрональных и воспалительных дегенеративных изменений. Соответственно, введение пептида Αβ может иметь как превентивное значение, так и терапевтическое значение в борьбе с болезнью Αльцгеймера.

II. Изучение дозозависимого ответа

Самок мышей 8\\%5 ХУеЬЧег возраста 5 недель (6 мышей в группе) иммунизировали 300, 100, 33, 11, 3, 7, 1, 2, 0,4 или 0,13 мкг Αβ в СРА/ГРА интраперитонеально. Три дозы вводили с двухнедельными интервалами, затем через месяц вводили четвертую дозу. Первую дозу эмульгируют в СРА, а оставшиеся дозы - в ЛРА. Кровь забирают на 4-7 дни после каждой иммунизации, начиная со второй дозы, для измерения титров антител. У животных из трех групп, которых иммунизировали дозами антигена, составляющими 11, 33 или 300 мкг, дополнительно забирали кровь примерно в месячные интервалы в течение четырех месяцев после четвертой иммунизации для контроля за снижением антительного ответа в зависимости от дозы иммуногена. Указанные животные получали последнюю пятую иммунизацию через семь месяцев после начала исследований. Их умерщвляли одну неделю спустя для измерения антительного ответа на ΆN 1792 и для осуществления токсикологических анализов.

- 17 021614

Снижающийся дозозависимый ответ наблюдали в интервале от 300 до 3,7 мкг и никакого ответа не наблюдали при двух более низких дозах. Средние титры антител составляли около 1:1000 после введения трех доз и около 11-300 мкг антигена (см. фиг. 5).

Титры антител существенным образом возросли при введении наиболее низкой дозы; у всех животных после третьей иммунизации (геометрический средний титр антител (СМТ) увеличился в 5-25 раз). Низкий антительный ответ выявляется даже при дозах 0,4 мкг. При дозах 1,2 мкг титры были сравнимы и имели значения СМТ около 1000. При четырех наиболее высоких дозах значение СМТ составляло около 25000, за исключением дозы 33 мкг, при которой обнаруживалось минимальное значение СМТ, составляющее 3000. После четвертой иммунизации увеличение титра было более умеренным для большинства групп. Выявлялся явный дозовый ответ в группах, которым вводили низкие дозы антигена (от 0,14 до 11 мкг), причем при дозе 0,13 мкг антитела не выявлялись, а при дозе 11 мкг значение СМТ составляло 36000. Опять же титры при наиболее высоких дозах от 11 до 300 мкг были сравнимы между собой и попадали в группу одной величины. Таким образом, после двух иммунизации титр антител зависел от вводимой дозы антигена в пределах ее значений от 0,4 до 300 мкг. К третьей иммунизации титры антител при наиболее высоких четырех дозах были сравнимы между собой и оставались на плато после дополнительной иммунизации.

Через месяц после четвертой иммунизации титры были в 2-3 раза выше в группе животных, получавших 300 мкг антигена, чем измеренные в крови, забранной через 5 дней после иммунизации (фиг. 6). Указанное наблюдение позволяет предположить, что пик анамнестического антительного ответа приходится на более позднее время, чем 5 дней после иммунизации. Более умеренное (50%) увеличение титра наблюдается в это время в группе, получавшей 33 мкг антигена. В группе, получавшей 300 мкг антигена, через два месяца после введения последней дозы значения СМТ резко снижаются примерно на 70%. Через месяц снижение происходит менее круто до 45% (доза 33 и 11 мкг). Таким образом, скорость снижения титров циркулирующих антител после прекращения иммунизации является бифазовой с резким падением в первый месяц после пикового ответа, за которым следует более умеренное падение титра.

Титры антител и кинетика антительного ответа у мышей §№155 \УсЬ51сг сходна с таковой у молодых гетерозиготных трансгенных мышей ΡΌΑΡΡ, иммунизированных параллельно. Дозы, эффективные для индукции иммунного ответа у человека, обычно сходны с дозами, эффективными у мышей.

III. Скрининг терапевтической эффективности в случае установившейся болезни Альцгеймера

Данное исследование проводят для тестирования иммуногенных агентов на активность в отношении элиминации или реверсии нейропатологических проявлений болезни Альцгеймера (БА) у старых животных. Иммунизации пептидом Αβ из 42 аминокислот (ΑΝ 1792) начинают в то время, когда амилоидные бляшки уже обнаруживаются в головном мозге мышей ΡΌΑΡΡ.

Во время периода исследования у необработанных мышей ΡΌΑΡΡ развиваются многочисленные нейродегенеративные изменения, которые свойственны БА (Сате5 е! а1., см. выше и 1о1т5оп-\Уооб е! а1., Ργοο. №11. Асай. δα. υδΑ 94, 1550-1555 (1997)).Отложение Αβ в амилоидных бляшках ассоциируется с дегенеративным нейрональным ответом, в основе которого лежит появление аберрантных аксональных и дендритных элементов, называемое дистрофическим невритом. Отложения амилоида, которые окружены дистрофическими невритными структурами, называются бляшками. У мышей с БА и мышей ΡΌΑΡΡ дистрофический неврит имеет различную глобулярную структуру, является иммунореактивным по отношению к панели антител, распознающих АРР и элементы цитоскелета, и проявляется комплексом субклеточных дегенеративных изменений на ультраструктурном уровне. Указанные признаки обеспечивают связанные с заболеванием избирательные и воспроизводимые измерения формирования невритических бляшек в головном мозге мышей ΡΌΑΡΡ. Дистрофический нейрональный компонент невритических бляшек у мышей ΡΌΑΡΡ легко визуализируется при использовании специфических антител к АРР человека (моноклональное антитело 8Е5) и измеряется с помощью компьютерного анализа. Таким образом, помимо определения эффекторов ΑΝ 1792 на формирование амилоидных бляшек авторы изобретения контролировали влияние такого лечения на развитие невритической дистрофии.

Астроциты и клетки микроглии не являются нейрональными клетками, которые ответственны за нейрональное повреждение, и отражают степень такого повреждения. ΟΡΑΡ-позитивные астроциты и МНС ΙΙ-позитивные клетки микроглии обычно выявляются при БА, и их активация возрастает по мере увеличения тяжести заболевания. Таким образом, авторы изобретения контролировали развитие реакционноспособных астроцитов и клеток микроглии у мышей, обработанных ΑΝ 1792.

А. Материалы и методы

Сорок восемь гетерозиготных самок мышей ΡΌΑΡΡ возраста от 11 до 11,5 месяцев, полученных от СЬаг15 РАег. случайным образом разделили на две группы: 24 мыши были иммунизированы 100 мкг ΑΝ 1792 и 24 мыши были иммунизированы ΡΒδ. В каждом случае антиген смешивали с адъювантом Фрейнда. Затем группы животных опять разделили по достижении ими возраста, составляющего примерно 15 месяцев. В этом возрасте около половины животных каждой группы умерщвляют (п=10 и 9 соответственно), остальных животных продолжали иммунизировать до достижения ими примерно 18 месяцев (п=9 и 12 соответственно). Всего 8 животных (5, получавших ΑΝ 1792, и 3, получавших ΡΒδ) погибли во вре- 18 021614 мя эксперимента. Помимо иммунизированных животных в эксперимент были включены необработанные мыши возраста одного года (п=10) и 18 месяцев (п=10) для сравнения в ЕЫ§Л измеренных уровней Ав и АРР в головном мозге. Животные возраста одного года были также включены в иммуногистохимический анализ.

Методология эксперимента изложена в примере 1, если специально не оговаривается иное. Для получения антигена для шести иммунизаций до достижения мышами 15-месячного возраста используют пептиды И8 1о! 12 и СаИГогта Рерйбек 1о! МЕО339. Пептиды СайГогта 1о! МЕО339 и 1о1 МЕО439 используют для трех дополнительных иммунизаций, которые осуществляют между 15 и 18 месяцами жизни.

Для иммунизации 100 мкг ΑΝ 1792 в 200 мкл РВ8 эмульгируют в соотношении 1:1 (об./об.) в СРА или ΙΡΑ или РВ8 до конечного объема 400 мкл. Первую иммунизацию осуществляют в СРА и последние 4 дозы в РВ8 без добавления адъюванта. В целом, осуществляют 9 иммунизации в течение 7 месяцев по двухнедельной схеме для первых трех доз с последующим 4-недельным интервалом для остальных инъекций. Четырехмесячную группу обработки умерщвляют в возрасте 15 месяцев, она получает только первые 6 иммунизаций.

В. Результаты

1. Эффекты обработки ΑΝ 1792 на отложения амилоида

Результаты влияния обработки ΑΝ 1792 на кортикальные отложения амилоида показаны на фиг. 7. Среднее значение кортикальных отложений амилоида составляет 28% в группе необработанных животных 12-месячного возраста (мыши РЭАРР), соответствующее количеству бляшек у мышей в начале исследования. В 18 месяцев амилоидные отложения усиливались более чем в 17 раз, достигая значения 4,87% у мышей, получавших РВ8, в то время как у мышей, получавших ΑΝ 1792, они существенным образом уменьшались до величины 0,01%, значительно меньшей, чем у необработанных животных 12месячного возраста и у животных 15- и 18-месячного возраста, получавших РВ8. Отложения амилоида существенно редуцировались у реципиентов, получавших ΑΝ 1792, возраста 15 месяцев (96% редукции, р=0,003) и 18 месяцев (>99% редукции, р=0,0002).

Обычно кортикальные отложения амилоида у мышей Р^ΑРР начинаются во фронтальной и ретросплениальной извилинах (К8С) и прогрессируют в вентрально-латеральном направлении и охватывают темпоральную и энторинальную извилины (ЕС). Немного амилоида обнаруживается в ЕС 12-месячных мышей (или не обнаруживается совсем). Примерно в этом возрасте впервые начинают введение ΑΝ 1792. Через 4 месяца после введения ΑΝ 1792 отложения амилоида существенно уменьшаются в К8С, и прогрессирующее вовлечение ЕС в этот процесс действительно элиминируется при лечении с помощью ΑΝ 1792. Позднее наблюдение показывает, что введение ΑΝ 1792 полностью останавливает развитие отложений амилоида, которые в норме охватывают темпоральную и вентральную извилины, а также предотвращает возможную реверсию отложений амилоида в К8С.

Действительные эффекты введения ΑΝ 1792 на развитие кортикальных отложений амилоида у мышей Р^ΑРР далее были показаны на 18-месячных мышах, которых обрабатывали в течение 7 месяцев. Практически полное отсутствие кортикального амилоида обнаруживается у мышей, инъецированных ΑΝ 1792, вместе с полным отсутствием диффузных бляшек и редукцией компактных отложений.

2. Лечение ΑΝ 1792 ассоциируется с клеточными и морфологическими изменениями

Обнаружено, что популяция Ав-позитивных клеток находится в участках мозга, которые обычно содержат отложения амилоида. Существенно, что в головном мозге реципиентов ΑΝ 1792 обнаруживается совсем немного внеклеточных кортикальных амилоидных бляшек или они вообще не обнаруживаются. Большая часть Ав-иммунореактивности связана с клетками с дольчатой и агрегированной сомой. Фенотипически указанные клетки соответствуют активированным моноцитам или клеткам микроглии. Они обладают иммунореактивностью при связывании с антителами, распознающими лиганды, которые экспрессируются активированными моноцитами и клетками микроглии (МНС II и С.'Э 11й), и иногда ассоциированы со стенкой или просветом кровеносных сосудов. Сравнение близлежащих срезов, меченных антителами, специфичными к Ав и МНС-П, показывает, что оба класса антител выявляют сходные структуры в этих клетках. Детальный анализ головного мозга ΑΝ 1792-обработанных животных обнаруживает, что МНС П-позитивные клетки ограничены определенной областью отложений амилоида, которые еще остаются у данных животных после лечения. Если проводится фиксация, то клетки не обладают иммунореактивностью с антителами, распознающими лиганды Т-клеток (СЭ3, СЭ3е), В-клеток (Τ'Ό45ΡΑ, СЭ45РВ) или общий лейкоцитарный антиген (СЭ45), но сохраняют реактивность по отношению к антителу, выявляющему лейкосиалин (СЭ43), которое перекрестно реагирует с моноцитами. Такого типа клетки не обнаруживаются ни у одного из животных, получавших РВ8.

У мышей Р^ΑРР неизменно развиваются амилоидные отложения во внешнем молекулярном слое зубчатой извилины гиппокампа. Отложения формируют четкую полосу с отверстиями, классический подучасток которой содержит амилоидные бляшки при БА. Характерное появление таких бляшек у мышей, получавших РВ8, соответствует тому, что свойственно необработанным мышам Р^ΑРР. Отложения амилоида состоят как из диффузных, так и из компактных бляшек, формирующих непрерывную по- 19 021614 лосу. В противоположность указанному во многих случаях в головном мозге мышей, получавших ΑΝ 1792, указанный характер отложений существенным образом изменен. Амилоидные отложения гиппокампа уже не содержат диффузного амилоида, и полосы отложений разрушены и носят прерывистый характер. Вместо указанных выше структур выявляются многочисленные нетипичные пятнистые структуры, которые реагируют с антителами к Ав; некоторые из таких структур содержат клетки с амилоидом.

МНС П-позитивные клетки часто выявляются в непосредственной близости от внеклеточного амилоида в головном мозге обработанных ΑΝ 1792 животных. Характер взаимосвязи Ав-позитивных клеток с амилоидом очень схож между собой у некоторых животных, получавших ΑΝ 1792. Распределение указанных моноцитарных клеток ограничено близостью отложений амилоида, и они практически полностью отсутствуют в других участках мозга без Ав-бляшек. Конфокальная микроскопия МНС II- и Ав-меченых срезов показывает, что бляшки сформированы многочисленными моноцитарными клетками.

Количественный анализ МНС II- и МАС Ьмеченых срезов головного мозга выявил тенденцию к увеличению иммунореактивности в К8С и гиппокампе у обработанных ΑΝ 1792 мышей по сравнению с животными, получавшими РВ§, что усиливает значимость измерений реактивности МАС4 в гиппокампе.

Указанные результаты являются показателем активного опосредованного клетками разрушения амилоида в участках мозга с амилоидными бляшками.

3. Эффекты ΑΝ 1792 на уровни Ав: определения методом ЕЫ8А (а) Кортикальные уровни

У необработанных мышей РЭАРР средний уровень общего Ав в коре в возрасте 12 месяцев составляет 1,600 нг/г, который увеличивается до 8,700 нг/г к 15 месяцам (табл. 2). В 18 месяцев уровень Ав достигает 22,000 нг/г, т.е. увеличивается в 10 раз во время течения эксперимента. У животных, получавших РВ§, в возрасте 15 месяцев уровень общего Ав составляет 8,600 нг/г, который увеличивается до 19,000 нг/г в возрасте 18 месяцев. В противоположность указанному у обработанных ΑΝ 1792 животных уровень общего Ав уменьшен на 81% в возрасте 15 месяцев (1,600 нг/г) по сравнению с животными, получавшими РВ§. Существенно меньший уровень (р=0,0001) общего Ав (5,200 нг/г) обнаруживается у 18месячных животных при сравнении групп, получавших ΑΝ 1792 и РВ§ (табл. 2), отражая 72%-ное снижение уровня Ав, который в противном случае был бы обнаружен. Сходные результаты были получены при сравнении уровней Ав 42 в коре, показывая, что у животных, получавших ΑΝ 1792, содержание Ав 42 существенно ниже, но в этом случае различие между группами обработки ΑΝ 1792 и РВ§ было значительным как в 15-месячном (р=0,04), так и 18-месячном (р=0,0001) возрасте (табл. 2).

Таблица 2. Средние уровни Ав (нг/г) в коре Неработанные животные РВ8 ΑΝ 1792

Возраст	Общий	Αβ 42	(η)	Общий	Αβ 42	(η)	Общий	Αβ42	(η)
12	1,600	1,300	(10)
15	8,700	8,300	(10)	8,600	7,200	(9)	1,600	1,300*	(10)
18	22,200	18,500	(10)	9,000	15,900	(12)	5,200**	4,000*	(0)

*р=0,0412 **р=0,0001 (б) Уровни Ав в гиппокампе

У необработанных мышей РЭАРР медианные уровни общего Ав в гиппокампе в 12-месячном возрасте составляет 15,000 нг/г, которые возрастают до 51,000 нг/г в возрасте 15 месяцев и далее до 81,000 нг/г в возрасте 18 месяцев (табл. 3). Сходным образом у РВ§ иммунизированных мышей значения общего Ав составляли 40,000 нг/г и 65,000 нг/г в 15 и 18 месяцев соответственно. У иммунизированных ΑΝ 1792 животных уровни общего Ав были ниже, составляя 25,000 нг/г и 51,000 нг/г в соответствующие точки времени, равные 15 и 18 месяцам. Значение уровня в группе, получавшей ΑΝ 1792, в возрасте 18 месяцев было существенно ниже, чем в группе, получавшей РВ§ (р=0,0105; табл. 3). Измерение Ав 42 давало сходные результаты, показывая, что уровни в обработанной ΑΝ 1792 группе были существенно ниже, чем в группе, получавшей РВ§ (39,000 нг/г против 57,000 нг/г соответственно; р=0,002) по достижении 18-месячного возраста (табл. 3).

- 20 021614

Таблица 3. Медианные уровни Αβ (нг/г) в гиппокампе Необработанные животные РВ8 ΑΝ1792

Возраст	Общит	ΐ Αβ42	(η)	Общий	Αβ42 (η)	Общий	Αβ42	(η)
12	15,500	11,100	(10)
15	51,500	44,400	(10)	40,100	35.70	(9)	24,50	22,100	(Ю)
18	80,800	64,200	(10)	65,400	57,10	(12)	50,90	38,900** (9)

* р=0,0105 ** р=0,0022 (с) Церебеллярные уровни

У 12-месячных необработанных мышей ΡΌΑΡΡ медианный церебеллярный уровень общего Αβ составляет 15 нг/г (табл. 4). В возрасте 15 месяцев указанное значение возрастает до 28 нг/г и к 18 месяцам достигает 35 нг/г. У обработанных РВ8 животных средние уровни общего Αβ составляли 21 нг/г в возрасте 15 месяцев и 43 нг/г в возрасте 18 месяцев. У животных, получавших ΑΝ 1792, общий уровень Αβ составляет 22 нг/г в возрасте 15 месяцев и существенно уменьшается (р=0,002) в возрасте 18 месяцев (25 нг/г), что соответствует значениям уровней в группе, получавшей РВ8 (табл. 4).

Таблица 4. Средние уровни Αβ (нг/г) в мозжечке

Возраст	Необработанные животные ΡΒί>	ΑΝ 1792
Общий Αβ (η)	Общий Αβ	(η)	Общий Αβ	()
12	15.6	(10)
15	27,7	(10)	20,8	(9)	21,7	(Ю)
18	35,0	(10)	43,1	(12)	24,8*	(9)

* р=0,0018

4. Эффекты лечения с помощью ΑΝ 1792 на уровни ΑΡΡ

ΑΡΡ-α и полноразмерная молекула ΑΡΡ содержат всю или часть Αβ последовательности и, таким образом, потенциально способны генерировать направленный к ΑΝ 1792 иммунный ответ. До настоящего времени было показано, что незначительное увеличение уровней ΑΡΡ представляет собой нейропатологическое увеличение у мышей ΡΌΑΡΡ. В коре уровни АРР-а/РЬ (полная длина) или ΑΡΡ-α практически не изменяются под действием лечения с ожиданием того, что уровень ΑΡΡ-α снизится до 19% через 18 месяцев в группе животных, обработанных ΑΝ 1792, по сравнению с животными, получившими РВ8. Уровни ΑΡΡ через 18 месяцев у обработанных ΑΝ 1792 существенно не отличаются от 12-месячного и 15-месячного уровней ΑΡΡ у необработанных животных и 15-месячного уровня у животных, получавших РВ8. Во всех случаях уровни ΑΡΡ оставались в тех пределах, которые в норме обнаруживаются у мышей ΡΌΑΡΡ.

5. Эффекты лечения ΑΝ 1792 на нейродегенеративную и глиотическую патологию

Отложения невритических бляшек существенно редуцируются во фронтальной коре обработанных ΑΝ 1792 мышей по сравнению с животными, получавшими РВ8, к 15 (84%; р=0,03) и 18 (55%; р=0,01) месяцам жизни (фиг. 8). Средние значения отложений невритических бляшек возрастают с 0,32 до 0,49% в группе, получавшей РВ8, между 15 и 18 месяцами жизни. Это контрастирует со значительным снижением развития невритических бляшек у животных, получавших ΑΝ 1792, где среднее значение отложений невритических бляшек составляет 0,05 и 0,22% в 15 и 18 месяцев соответственно.

При иммунизациях ΑΝ 1792 высокотолерантные и реакционноспособные астроциты также существенно уменьшаются в числе у животных, обработанных РВ8 и ΑΝ 1792, по сравнению с животными, обработанными РВ8, к 15 (56%; р=0,011) и 18 (39%; р=0,028) месяцам жизни (фиг. 9). Средние значения числа астроцитов в процентах к группе животных, получавших РВ8, возрастают между 15 и 18 месяцами жизни от 4,26 до 5,21%. Обработка ΑΝ 1792 супрессирует развитие астроцитов в обе временные точки на 1,89 и 3,2% соответственно. Это позволяет предположить, что нейропиль не повреждается в процессе разрушения бляшек.

6. Αнтительный ответ

Как описано выше, 11-месячные гетерозиготные ΡΌΑΡΡ мыши (Ν=24) получали серии из 5 иммунизаций по 100 мкг ΑΝ 1792 в адъюванте Фрейнда, вводимых интраперитонеально в недели 0, 2, 4, 8 и

12. Шестую иммунизацию осуществляют одним РВ8 (без адъюванта Фрейнда) на 16-ю неделю. В качестве негативного контроля используют группы из 24 трансгенных мышей, совпадающих по возрасту с теми, которым вводят РВ8, эмульгированный в тех же самых адъювантах и по той же самой схеме, что и опытным животным. Животных обескровливали через 3-7 дней после каждой иммунизации, начиная после второй дозы. Αнтительный ответ на ΑΝ 1792 измеряют методом ΕΌΙ8Α. Средние геометрические значения титров (СМТ) для животных, которые были иммунизированы ΑΝ 1792, составляют около 1900,

- 21 021614

7600, 45000 после второй, третьей и последней (шестой) доз соответственно. Никаких Ав-специфических антител не выявляется у контрольных животных после шестой иммунизации.

Примерно половину животных обрабатывают в течение дополнительных трех месяцев, проводя иммунизации примерно на 20, 24 и 27 неделе. Каждую из указанных доз вводят в ΡΒ8 без добавления адъюванта Фрейнда. Средние значения титров антител остаются без изменений за указанный период времени. В действительности титры антител остаются стабильными от четвертого до восьмого забора крови, соответствующих периоду, охватывающему время от пятой до девятой инъекции.

Для определения того, ассоциированы ли Ав-специфические антитела, образующиеся в ответ на иммунизацию (которые определяются анализом сыворотки ΑΝ 1792-обработанных мышей), с отложениями амилоида в головном мозге, срезы головного мозга мышей, обработанных ΑΝ 1792 и ΡΒ8, подвергают воздействию антител, специфичных к ЦС мыши. В противоположность контролю (ΡΒ8) Авбляшки в головном мозге животных, получавших ΑΝ 1792, оказались покрытыми эндогенными ЦС. Такое различие между двумя группами можно было наблюдать в группах как 15-, так и 18-месячных животных. Особенно неожиданным было отсутствие метки в группе животных, получавших ΡΒ8, несмотря на наличие значительных отложений амилоида у данных животных. Указанные результаты свидетельствуют о том, что иммунизация синтетическим белком Ав генерирует образование антител, которые распознают и связывают ш νί\Ό Ав в амилоидных бляшках.

7. Клеточно-опосредованный иммунный ответ

Селезенки удаляют у девяти 18-месячных мышей ΡΟΑΡΡ, иммунизированных ΑΝ 1792, и двенадцати таких же мышей, иммунизированных ΡΒ8, через 7 дней после девятой иммунизации. Спленоциты выделяют и культивируют в течение 72 ч в присутствии Ав 40, Ав 42 или Ав 40-1 (белок обратного порядка). В качестве позитивного контроля используют митоген Соп А. Оптимальные ответы получают при концентрации белка > 1,7 мкМ. Клетки, полученные ото всех 9 животных, обработанных ΑΝ 1792, пролиферируют в ответ на белки Ав 1-40 или Ав 1-42 с эквивалентным уровнем включения метки в оба белка (фиг. 10, верхняя панель). На белок Ав 40-1 ответ не обнаруживается. Клетки от контрольных животных не отвечают ни на какой-либо из белков Ав (фиг. 10, нижняя панель).

С. Выводы

Результаты данного исследования показывают, что иммунизация ΑΝ 1792 мышей ΡΌΑΡΡ воздействует на существующие отложения амилоида и предотвращает их прогрессивное образование, а также замедляет последующие нейропатологические изменения, возникающие с возрастом в головном мозге мышей ΡΌΑΡΡ. Иммунизация ΑΝ 1792, по существу, задерживает развитие амилоидных отложений в структурах, которые в норме чувствительны к амилоидозу. Таким образом, введение пептида Ав имеет терапевтическую эффективность в лечении болезни Альцгеймера.

IV. Скрининг фрагментов Ав

100 Мышей ΡΟΑΡΡ возраста 9-11 месяцев иммунизировали 9 различными фрагментами АРР и Ав для того, чтобы определить, какие эпитопы вызывают эффективный ответ. Животным интраперитонеально инъецировали 9 различных иммуногенов и один контрольный, как описано выше. Иммуногены включали четыре Ав-пептидных конъюгата человека 1-12, 13-28, 32-42, 1-5 (все соединены с антителами овцы к Ц мыши посредством цистеиновой связи); полипептид АРР из аминокислот 592-695, агрегированный Ав 1-40 человека, агрегированный Ав 25-35 человека и агрегированный Ав 42 грызунов. Агрегированные Ав 42 и ΡΒ8 были использованы как положительный и отрицательный контроли соответственно. В группу обработки входило 10 мышей. Титры антител контролировали, как описано выше, и мышей умерщвляли в конце 4-го месяца инъекций. После умерщвления животных осуществляли гистохимический и токсикологический анализ, а также оценивали уровни Ав.

А. Материалы и методы

1. Получение иммуногенов

Получение связанных Ав-пептидов: четыре пептидных конъюгата Ав человека (аминокислотные остатки 1-5, 1-12, 13-28 и 33-42: каждый пептид конъюгирован с антителами овцы к ЦС мыши) были получены путем добавления искусственного остатка цистеина к пептиду Ав при использовании перекрестно-сшивающего агента сульфоГОМС8. Производные Ав-пептида были синтезированы со следующими конечными аминокислотными последовательностями. В каждом случае локализация встроенного остатка цистеина обозначена подчеркиванием. Производное пептида Ав 13-28 также имеет два остатка глицина, добавляемых предварительно к карбокси-концевому цистеину, как указано

Αβ 1-12 пептид ΝΗ 2-ОАЕРКНО5ОУЕУС-СООН (8ЕО ГО ΝΟ: 72)

Αβ !-5 пептид ΝΗ2- ОАЕРКС-СООН (ЯР.О ГО ΝΟ: 73)

Ар 33-42 пептид ЦН2-С-аминогептановая кислота-ОЬМ\ЮОУУ1А-СООН (5Е<2 Ю ΝΟ:

74)

Αβ 13-28 пептид Ас-ИН-УУрКЕУРРАЕЦУОКЫКООС-СООН (8ЕЦΙΟ ΝΟ: 75)

Для осуществления реакции связывания диализуют 10 мг Ц овцы к Ц мыши Иасккоп Iттипο КекеагсЬ ЬаЪогаЮпек) в течение ночи против 10 мМ натрий-боратного буфера, рН 8,5. Затем диализован- 22 021614 ное антитело концентрируют до объема 2 мл при использовании пробирки Аткоп СепРтртер. Затем 10 мг сульфо-ЕМС8 N(ε-малеимидокуπроилокси)сукцинимида (Мо1еси1аг 8скп^ Со.) растворяют в 1 мл деионизованной воды. Сорокакратный молярный избыток сульфо-ЕМС8 добавляют по каплям при перемешивании к 1§ овцы против 1§ мыши и далее раствор дополнительно перемешивают 10 мин. Αктивированные антитела овцы к 1§С мыши очищают и заменяют буфер, пропуская их через 10-мл колонку для гель-фильтрации (Р1етсе ΡκδΦ Со1итп, Р1етсе СНеткак), уравновешенную 0,1 М NаРΟ₄, 5 мМ ЭДТЛ, рН б,5. Фракции, содержащие антитела, идентифицируют при поглощении 280 нм, далее их объединяют и разводят до примерной концентрации 1 мг/мл, принимая 1,4 мг на ΘΌ за коэффициент экстинкции. Сорокакратный молярный избыток пептида Αβ растворяют в 20 мл 10 мМ NаΡΟ₄, рН 8,0, за исключением пептида Αβ 33-42, 10 мг которого сначала растворяют в 0,5 мл ЭМ8О и затем разводят в 20 мл буфера с 10 мМ NаΡО₄. Каждый из растворов пептида добавляют к 10 мл активированных 1§ овцы против 1§ мыши и инкубируют на качалке при комнатной температуре 4 ч. Полученные конъюгаты концентрируют до конечного объема менее 10 мл с помощью пробирки Аткоп Сепйтртер и затем диализуют против РВ8 и буфера для замены буфера и далее удаляют свободный пептид. Конъюгаты пропускают через фильтры с размером пор 0,22 мкм для стерилизации и далее разделяют на фракции по 1 мг и хранят при замораживании до -20°С. Концентрации конъюгатов определяют при использовании анализа с ВСА (Рктсе СНеткак) и 1§С лошади для получения стандартной кривой. Конъюгацию контролируют по увеличению мол. массы конъюгированных пептидов, связанных с активированными антителами овцы к 1§С мыши. Конъюгат Αβ 1-5 и антител овцы к 1§С мыши представляет собой объединение двух конъюгатов, которые получены в виде отдельных препаратов.

2. Получение агрегированных Αβ пептидов

Пептиды 1-40 (ΛΝ 1528; СаПГогша Ρерΐ^йеδ 1пс., Ьо1 МЕО541), 1-42 (ΛΝ 1792; СаПГогша Ρерί^йеδ 1пс., Ьок МЕО339 и МЕО439), 25-35 человека и 1-42 (СаПГогша Ρерί^йеδ 1пс., Ьо1 МЕО218) грызунов заново солюбилизировали для получения каждого набора инъекций из лиофилизированного порошка, который хранили высушенным при -20°С. Для указанных целей 2 мг пептида добавляют к 0,9 мл деионизованной воды и смесь обрабатывают на устройстве Уойех для получения относительно однородного раствора или суспензии. На этой стадии из всех пептидов растворяется только ΛΝ 1528. 100-мкл Αликвоты 10хРВ8 (1хРВ8: 0,15М №С1, 0,01М фосфат натрия, рН 7,5) затем добавляют к АN 1528 для преципитации. Суспензию опять перемешивают на вортексе и инкубируют в течение ночи при 37°С для использования на следующий день.

Получение белка рВхб: плазмиду экспрессии, кодирующую рВхб, белок слияния, содержащий 100аминокислотную Ν-концевую лидерную последовательность полимеразы бактериофага М8-2 и аминокислоты 592-695 ΑΡΡ (βΑΡΡ), конструируют, как описано ОПегейогГ е! а1. (1. Вю1. СНет. 2б5, 4492-4497 (1990)). Плазмиду трансфицируют в Е.соН, и белок экспрессируется после индукции промотора. Бактерии лизируют в 8М мочевине и рВхб частично очищают препаративным 8Ό8 РАСЕ. Фракции, содержащие рВхб, идентифицируют путем Вестерн-блоттинга при использовании поликлональных антител кролика к рВхб, объединяют, концентрируют с помощью пробирки Рткоп СепРтртер и диализуют против РВ8. Чистоту препарата оценивают путем окрашивания кумасси синим гелей, полученных при электрофорезе; она составляет около 5-10%.

В. Результаты и обсуждение

1. План исследования

Сто гетерозиготных трансгенных мышей РЭАРР (самцов и самок) в возрасте от 9 до 11 месяцев получают от Οκι^δ Ктует ЬаЬотакгу и Тасошс ЬаЬотакгу. Мышей разбивают на 10 групп для иммунизации различными участками Αβ или ΑΡΡ в сочетании с адъювантом Фрейнда. Животных группируют по максимально возможному совпадению пола, возраста, родителей и источника происхождения. Иммуногены включают четыре пептида Αβ на основе последовательностей белков человека 1-5, 1-12, 13-28 и 33-42, которые конъюгированы с антителами овцы к 1§С мыши; четыре агрегированных Αβ (пептиды человека 1-40 (АИ 1528), 1-42 (АИ 1792) и 25-35 и пептид грызунов 1-42), а также полипептид слияния, обозначенный рВхб, содержащий аминокислотные остатки 592-б95 ΑΡΡ. Десятую группу животных иммунизируют РВ8 с адъювантом в качестве контроля.

Для каждой иммунизации 100 мкг каждого Αβ пептида в 200 мкл РВ8 или 200 мкг ΑΡΡ производного рВхб в том же самом объеме РВ8 или только РВ8 эмульгируют в соотношении 1:1 (об./об.) в полном адъюванте Фрейнда (СРА) до конечного объема 400 мкл для первой иммунизации, за которой следует бустерная инъекция того же самого количества иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда (1РА) для последующих четырех доз и РВ8 для финальной дозы. Иммунизации осуществляют интраперитонеально по двухнедельной схеме для первых трех доз и далее - по схеме с интервалом в один месяц. Кровь у животных забирают через 4-7 дней после каждой иммунизации, начиная после второй дозы для измерения титров антител. Животных умерщвляют примерно через одну неделю после введения последней дозы.

- 23 021614

2. Уровни Ав и АРР в головном мозге

Через четыре месяца после иммунизации различными пептидами Ав или АРР производным удаляют головной мозг у перфузированных физиологическим раствором животных. Одно полушарие подготавливают для иммуногистохимического анализа, а второе используют для количественного определения уровней Ав и АРР. Для измерения концентрации различных форм бета-амилоидного пептида и белка-предшественника амилоида полушарие рассекают и гомогенаты гиппокампа, коры и участков мозжечка помещают в 5М гуанидин. Далее их разводят и уровень амилоида или АРР количественно определяют путем сравнения с последовательными разведениями стандартов Ав-пептида или АРР известной концентрации методом ΕΜ§Α.

Средняя концентрация общего Ав в контрольной группе животных, иммунизированных РВ§, в 5,8 раз выше в гиппокампе, чем в коре (среднее значение 24,318 нг/г ткани гиппокампа по сравнению со значением 4,221 нг/г в коре). Средний уровень общего Ав в мозжечке контрольных животных (23,4 нг/г ткани) был примерно в 1000 раз меньшим, чем в гиппокампе. Указанные уровни были сходны с таковыми, о которых было предварительно сообщено в отношении гетерозиготных трансгенных мышей Р^ΑРР данного возраста ОоНпюп - \Уооб5 с1 а1., 1997, см. выше).

В коре головного мозга животных экспериментальных групп средние уровни общего Ав и Ав 1-42 существенно отличались от соответствующих значений в контрольной группе (р<0,05). Указанные животные получали ΑΝ 1792, Ав 1-42 грызунов или Ав 1-5 пептидные конъюгаты, как показано на фиг. 11. Средние уровни общего Ав у них были редуцированы на 75, 79 и 61% соответственно. Не было выявлено значимых корреляций между титрами Ав-специфических антител и уровнями Ав в коре головного мозга ни в одной из групп животных.

В гиппокампе среднее уменьшение общего Ав, ассоциированное с лечением ΑΝ 1792 (46%, р=0,0543), было не таким значительным, как наблюдаемое в коре головного мозга (75%, р=0,0021). Однако величина уменьшения была намного больше в случае гиппокампа, чем в случае коры головного мозга; общее снижение составляло 11,186 нг/г ткани в гиппокампе против 3,171 нг/г ткани коры. В случае животных, получавших Ав 1-42 грызунов или Ав 1-5, среднее значение общих уровней Ав было редуцировано на 36 и 26% соответственно. Однако, принимая во внимание небольшие размеры групп и высокую вариабельность уровней амилоидного пептида от животного к животному в пределах обеих групп, указанное снижение нельзя считать значительным. Когда уровни Ав 1-42 измеряли в гиппокампе, ни одно из индуцированных лечением снижений уровней не было значительным. Таким образом, обусловленные меньшими отложениями Ав в коре изменения в данном участке мозга являются более чувствительным индикатором эффектов лечения. Изменения уровней Ав, измеренные методом ΕΜ§Α в коре, были сходными, но не идентичными по сравнению с результатами иммуногистохимического анализа (см. ниже).

Общий Ав измеряли также в мозжечке, участке мозга, который в норме минимальным образом подвержен патологии БА. Ни одно из средних значений концентраций Ав в какой-либо группе животных, иммунизированных различными пептидами Ав или АРР производным, не отличались от таковых у животных контрольной группы при измерении в мозжечке. Этот результат позволяет предположить, что непатологические уровни Ав не подвергаются воздействию лечения.

Концентрацию АРР также определяли методом ΕΜ§Α в коре головного мозга и мозжечке обработанных и контрольных мышей. Использовали два различных анализа АРР. Первый, называемый АРРα/РЬ, определяет как АРР-α (α, секретируемая форма АРР, которая отщепляется от Ав-последовательности) и полноразмерные формы (РЬ) АРР, в то время как второй анализ определяет только АРРα. В противоположность связанному с лечением уменьшению Ав у животных обработанных групп уровни АРР оставались неизменными у всех обработанных животных по сравнению с контрольными. Эти результаты свидетельствуют о том, что иммунизации Ав пептидами не истощают АРР; скорее лечение является специфичным по отношению к Ав.

В целом, общие уровни Ав и Ав 1-42 были значительно редуцированы в коре головного мозга при лечении конъюгатами ΑΝ 1792, Ав 1-42 грызунов или Ав 1-5. В гиппокампе общий уровень Ав был значительно редуцирован только при введении ΑΝ 1792. Не было других существенных изменений в уровнях Ав или АРР в гиппокампе, коре или мозжечке при осуществлении лечения.

3. Гистохимический анализ

Головной мозг животных шести групп подготавливают для иммуногистохимического анализа, три группы животных иммунизируют конъюгатами Ав пептидов Ав 1-5, Ав 1-12 и Ав 13-28; две группы иммунизируют агрегатами полноразмерного Ав ΑΝ 1792 и ΑΝ 1528, а одна группа служит контролем, ее иммунизируют РВ§. Результаты анализа отложений амилоида в срезах головного мозга указанных животных приведены на фиг. 12. Наблюдается существенное снижение отложений амилоида в участках коры животных трех обработанных групп по сравнению с контрольными животными. Наибольшее уменьшение отложений амилоида наблюдается в группе животных, получавших ΑΝ 1792, где среднее значение такого уменьшения составляет 97% (р=0,001). Существенное снижение также наблюдается у

- 24 021614 животных, обработанных ΑΝ 1528 (95%, р=0,005) и пептидным конъюгатом Αβ 1-5 (67%, р=0,02).

Результаты, полученные при количественном определении общего Αβ или Αβ 1-42 методом ЕЫ8А и гистохимическим анализом отложений амилоида, некоторым образом различаются. Обработка ΑΝ 1528 оказывает существенное воздействие на уровень отложений амилоида в коре при измерении количественным гистохимическим анализом, однако не на концентрацию общего Αβ в том же самом участке мозга при исследовании ЕЫ8А. Различие между двумя указанными результатами, скорее всего, обусловлены особенностями исследований. Гистохимический анализ срезов определяет только нерастворимые агрегаты Αβ в бляшках. В противоположность этому ЕЫ8А определяет все формы Αβ, как растворимые, так и нерастворимые, мономерные и агрегированные. Поскольку патология заболевания, повидимому, ассоциируется с нерастворимыми формами Αβ в составе бляшек, гистохимический анализ может быть более чувствителен для выявления эффектов лечения. Однако, поскольку ЕЫ8А является более быстрым и легким методом, он очень полезен для скрининга. Более того, он может показать, что связанная с лечением редукция Αβ больше в отношении связанного с бляшками, чем общего Αβ.

Для определения того, реагируют ли индуцированные иммунизацией Αβ-специфические антитела с отложениями амилоида в головном мозге, набор срезов мозга обработанных и контрольных животных подвергают воздействию антител, специфичных к 1дО мыши. В противоположность группе, иммунизированной РВ§, Αβ-содержащие бляшки покрыты эндогенными 1дО у животных, иммунизированных пептидными конъюгатами Αβ 1-5, Αβ 1-12 и Αβ 13-28, а также полноразмерными агрегатами Αβ, АЫ 1792 и АЫ 1528. Данным методом не анализировали головной мозг животных, иммунизированных другими Αβ-пептидами или ΑΡΡ пептидом рВхб.

4. Измерение титров антител

У мышей забирали кровь через 4-7 дней после последней иммунизации, начиная со второй иммунизации, в целом 5 раз. Титры антител измеряли как титры Αβ 1-42-связывающих антител при использовании сэндвичевого ЕЫ8А на пластиковых многолуночных планшетах, покрытых Αβ 1-42. Как показано на фиг. 13, пик титра антител наблюдается после четвертой дозы для тех четырех иммунизированных составов, которые обусловливают наиболее высокие титры АЫ 1792-специфических антител: АЫ 1792 (пик ОМТ: 94,647), АЫ 1528 (пик ОМТ: 88,231), конъюгат Αβ 1-12 (пик ОМТ: 47,216) и Αβ 1-42 грызунов (пик ОМТ: 10,766). Титры в указанных группах снижаются немного после пятой и шестой доз. Для оставшихся пяти иммуногенов титры достигают пикового значения после 5-й и 6-й доз и составляют намного меньшую величину по сравнению с таковой для 4 групп с наибольшими титрами: конъюгат Αβ 1-5 (пик ОМТ: 2,356), рВх6 (пик ОМТ: 1,183), конъюгат Αβ 33-42 (пик ОМТ: 658), Αβ 25-35 (пик ОМТ: 125). Титры антител также измеряли против гомологичных пептидов при использовании того же самого сэндвичевого ЕЫ8А с набором иммуногенов; такие группы иммунизировали Αβ 1-5, Αβ 13-28, Αβ 25-35, Αβ 33-42 или Αβ 1-42 грызунов. Указанные титры были практически теми же самыми, что и измеренные против Αβ 1-42, за исключением Αβ 1-42 грызунов, когда титры антител против гомологичного иммуногена были примерно в 2 раза выше. Величина титра АЫ 1792-специфических антител у индивидуальных животных или средние значения у животных обработанных групп не коррелировали с эффективностью измерения, как редукция Αβ в коре.

5. Лимфопролиферативный ответ

Зависимую от Αβ пролиферацию измеряли при использовании клеток селезенки, полученных через одну неделю после последней, шестой иммунизации. Свежесобранные клетки, 10⁵ на лунку, культивируют в течение 5 дней в присутствии Αβ 1-40 в концентрации 5 мкМ для стимуляции. Клетки животных семи из десяти групп также культивируют в присутствии обратного пептида Αβ 40-1. В качестве положительного контроля дополнительные клетки культивировали с Т-клеточным митогеном, ΡΗΑ, а в качестве отрицательного контроля клетки культивировали без пептида.

Лимфоциты большинства животных пролиферируют в ответ на ΡΗΑ. Не было существенных ответов на обратный пептид Αβ 40-1. Клетки животных, иммунизированных более длинными агрегированными Αβ-пептидами, АЫ 1792, Αβ 1-42 грызунов и АЫ 1528, пролиферируют интенсивно при стимуляции Αβ 1-40 с наибольшим срт у реципиентов АЫ 1792. Клетки одного животного в каждой из групп, иммунизированных конъюгатом Αβ 1-12, конъюгатом Αβ 13-28 и Αβ 25-35, пролиферируют в ответ на Αβ 1-40. Животные оставшихся групп, получавших конъюгат Αβ 1-5, Αβ 33-42, конъюгат рВх6 или РВ§, не обнаруживали симулированного Αβ ответа. Указанные результаты суммированы в табл. 5 ниже.

- 25 021614

Таблица 5

Иммуноген	Конъюгат	Аминокислоты Αβ	Отвечаемость
Αβ 1-5	Да	5-мер	0/7
Αβ 1-12	Да	12-мер	1/8
Αβ 13-28	Да	16-мер	1/9
Αβ 25-35		11-мер	1/9
Αβ 33-42	Да	10-мер	0/10
Αβ 1-40		40-мер	5/8
Αβ 1-42		42-мер	9/9
Αβ 1-42		42-мер	8/8
ρΒχό			0/8
ΡΒ8		0-мер	6/8

Приведенные результаты показывают, что АN 1792 и АN 1528 стимулируют сильный Т-клеточный ответ, наиболее вероятно фенотипа СЭ4'. Отсутствие Αβ-специфичного Т-клеточного ответа у животных, иммунизированных Αβ 1-5, неудивительно, поскольку пептидные эпитопы, распознаваемые СЭ4' Т-клетками, обычно имеют в длину около 15 аминокислот, в то время как более короткие пептиды иногда бывают менее эффективны. Таким образом, основные эпитопы хелперных Т-клеток в случае четырех конъюгированных пептидов скорее всего входят в состав партнера по конъюгации 1§С, а не в участок Αβ. Эта гипотеза поддерживается тем, что обнаруживается очень низкая пролиферативная отвечаемость у животных в каждой из указанных групп обработки. Поскольку конъюгат Αβ 1-5 эффективен в отношении существенной редукции уровня Αβ в головном мозге при явном отсутствии Αβ-специфических Тклеток, ключевой эффекторный иммунный ответ, индуцированный при иммунизации данным пептидом, основан на образовании антител.

Утрата Т-клеточного ответа и низкий антительный ответ на пептид слияния рВх6, включающий аминокислоты 592-695 ΑΡΡ, в том числе все остатки Αβ, могут быть обусловлены низкой иммуногенностью этого конкретного препарата. Низкая иммуногенность агрегата Αβ 25-35 скорее всего связана с тем, что пептид очень небольшой для того, чтобы содержать действенный Т-клеточный эпитоп, способствующий индукции антительного ответа. Если этот пептид конъюгировать с белком-носителем, он, возможно, станет более иммуногенным.

V. Получение поликлональных антител для пассивной защиты

125 Нетрансгенных мышей иммунизировали 100 мкг Αβ 1-42 и адъювантом СРА/1РА и умерщвляли через 4-5 месяцев. Затем забирают кровь и выделяют 1§С. Αнтитела, специфичные к иммуногену, могут быть частично очищены аффинной хроматографией. От одной мыши в среднем получают 0,5-1 мг специфичных к иммуногену антител. В целом, получают 60-120 мг.

VI. Пассивная иммунизация антителами Αβ

Мышей РЭАРР 7-9-месячного возраста инъецируют 0,5 мг в РВ8 поликлональных или моноклональных антител, специфичных к Αβ, как описано ниже. Все препараты антител очищают для обеспечения низкого уровня эндотоксина.

Моноклональные антитела могут быть получены путем иммунизации фрагментом или более длинной формой Αβ мышей, получением гибридом и скринингом гибридом на синтез антител, специфически связывающихся с нужным фрагментом Αβ и не связывающихся с другими неперекрывающимися фрагментами Αβ.

Таблица 6

Антитело Эпитоп

2НЗ Αβ 1-12

1005 Αβ 1-12

266 Αβ 13-28

21Р12 Αβ 33-42

Поликлональное антитело мыши к Αβ 42 человека Агрегированная форма Αβ 42

Мышей инъецировали интраперитонеально, как необходимо, в течение 4-х месяцев для поддержания концентрации циркулирующих антител с титром более чем 1/1000, как определяется ЕЬ18А, специфичных к Αβ 42 или другому иммуногену. Титры контролировали методом ЕЬ18А и мышей умерщвляли в конце 6-месячного периода инъекцией. После этого проводили гистохимический и токсикологический анализ и определяли уровень Αβ. Дополнительные методики осуществления пассивной иммунизации описаны в примерах XI и XII ниже.

- 26 021614

VII. Сравнение различных адъювантов

Данный эксперимент проводит сравнение СРА, алюминиевых квасцов, эмульсии типа масло в воде и ΜΡΕ в отношении их способности стимулировать иммунный ответ.

А. Материалы и методы

1. План исследования

100 Самок морских свинок Нагйеу шестинедельного возраста, полученных от Е1т НФ, разделяют на 10 групп и иммунизируют АЫ 1792 или его пальмитолированным производным в сочетании с различными адъювантами. Животные семи групп получали инъекции АЫ1792 (33 мкг, если не оговорено иное) в сочетании с а) ΡΒδ, б) адъювантом Фрейнда, в) ΜΡΕ, г) ΜΡΕ/скваленом, д) низкими дозами алюминиевых квасцов или е) высокими дозами алюминиевых квасцов. Две группы животных получали инъекции пальмитолированного производного АЫ 1792 (33 мкг) в сочетании с а) ΡΒδ или б) скваленом. Последняя десятая группа животных получала ΡΒδ без антигена или дополнительного адъюванта. В случае групп, получавших адъювант Фрейнда, первую дозу эмульгировали в СРА, а оставшиеся четыре дозы - в ФА. Антиген вводили в дозе 33 мкг для всех групп, за исключением группы, получавшей высокую дозу алюминиевых квасцов, которая получала антиген в дозе 300 мкг (АЫ 1792). Инъекции осуществляли интраперитонеально в случае СРАЛРА и внутримышечно в квадраты подушечек лап попеременно с правой и с левой сторон животным всех других групп. Первые три дозы вводили по двухнедельной схеме, а затем вводили две дозы с месячным интервалом. Кровь забирали через 6-7 дней после каждой иммунизации, начиная со второй дозы, для измерения титров антител.

2. Получение иммуногенов

Два мг Ав 42 (СаЬЬэгта Ρеρί^άе, Ьо1 МЕО339) добавляют к 0,9 мл деионизованной воды и смесь перемешивают на вортексе с получением относительно однородной суспензии. 100-мкл Аликвоту 10 х ΡΒδ (1 х ΡΒδ, 0,15М ЫаС1, 0,01М фосфат натрия, рН 7,5) добавляют к полученной смеси. Суспензию опять перемешивают на вортексе и инкубируют в течение ночи при 30°С для использования на следующий день. Неиспользованный Ав 1-42 хранят до использования в виде высушенного лиофилизированного порошка при -20°С.

Пальмитоилированное производное АЫ 1792 получают путем конъюгации пальмитинового ангидрида, растворенного в диметилформамиде, с амино-концевым остатком АЫ 1792 до удаления образующегося пептида со смолы обработкой фтористо-водородной кислотой.

Для получения состава доз в полном адъюванте Фрейнда (СРА) (группа 2) 33 мкг АЫ 1792 в 200 мкл ΡΒδ эмульгируют в сотношении 1:1 (об./об.) в СРА в конечном объеме 400 мкл для первой иммунизации. Для последующих иммунизаций антиген сходным образом эмульгируют в неполном адъюванте Фрейнда (ЕРА).

Для получения состава доз в ΜΡΕ для групп 5 и 8 лиофилизированный порошок (ΚίΦ ЬппшпосЬет. КекеагсЬ, Фс., НапиНои, ΜΤ) добавляют к 0,2% водному триэтиламину до конечной концентрации 1 мг/мл и перемешивают на вортексе. Затем смесь нагревают до 65-70°С в течение 30 с с получением слегка непрозрачной однородной суспензии мицелл. Раствор каждый раз готовят заново для каждой серии инъекций. Для каждой инъекции в группе 5 33 мкг АЫ 1792 в 16,5 мкл ΡΒδ смешивают в боросиликатной пробирке сразу же перед использованием.

Для получения состава доз со слабой эмульсией типа масло в воде АЫ 1792 в ΡΒδ добавляют к 5% сквалену, 0,5 Твину 80, 0,5 Спану 85 в ΡΒδ для получения конечной однократной дозы, равной 33 мкг АЫ 1792 в 250 мкл (группа 6). Смесь эмульгируют пропусканием через двухкамерное самодельное устройство 15-20 раз до тех пор, пока не появятся капли эмульсии, диаметр которых практически эквивалентен 1,0-мкм диаметру стандартных латексных бус при наблюдении под микроскопом. Полученная суспензия опалесцирует и является молочно-белой. Эмульсию каждый раз готовят заново перед каждой серией инъекций. Для группы 8 ΜΡΕ в 0,2% триэтиламине добавляют в концентрации 50 мкг/дозу к сквалену и смеси детергента для эмульгирования, как описано выше. Для пальмитоилового производного (группа 7) 33 мкг на дозу пальмитоил-ЫН-Ав 1-42 добавляют к сквалену и перемешивают на вортексе. Твин 80 и Спан 85 добавляют к смеси и снова перемешивают на вортексе. Указанную смесь добавляют к ΡΒδ с достижением конечной концентрации 5% сквалена, 0,5% Твина 80, 0,5% Спана 85 и смесь эмульгируют, как указано выше.

Для приготовления составов доз с алюминиевыми квасцами (группы 9 и 10), АЫ 1792 в ΡΒδ добавляют к Альгидрогелю (гель гидроксида алюминия, АссшФе, ХУекЛигу, ЫУ) до обеспечения концентрации 33 мкг (низкая доза, группа 9) или 300 мкг (высокая доза, группа 10) АЫ 1792 на 5 мг алюминиевых квасцов в конечном дозовом объеме 250 мкл. Суспензию медленно перемешивают при комнатной температуре.

3. Измерение титров антител

У морских свинок кровь забирают через 6-7 дней после каждой иммунизации, начиная после второй иммунизации, в целом, 4 раза. Титры антител против Ав 42 измеряют методом ЕЬФА, как описано в разделе Основные материалы и методы.

- 27 021614

4. Приготовление тканей

Примерно через 14 недель всех морских свинок умерщвляют путем введения СО₂. Собирают спинномозговую жидкость, удаляют головной мозг из трех участков мозга (гиппокампа, коры и мозжечка), приготавливают срезы и используют их для измерения концентрации общего Αβ-белка при использовании ЕЫ8А

В. Результаты

1. Лнтительный ответ

Существует большой разброс в активности различных адъювантов при измерении антительного ответа на АИ 1792 после иммунизации. Как показано на фиг. 14, в том случае, когда АИ 1792 вводят в РВ8, антительный ответ не выявляется после двух или трех иммунизаций и очень слабые ответы выявляются после четвертой и пятой доз, когда геометрические значения титров (ОМТ) составляют только около 45. Эмульсия типа масло в воде индуцирует средние значения титров после третьей дозы (ОМТ 225), которые сохраняются и после четвертой дозы (ОМТ 301) и снижаются с конечной дозой (ОМТ 54). Обнаруживается явный дозовый ответ на антиген АЫ 1792, связанный с квасцами, причем доза 300 мкг более иммуногенна во все точки времени, чем доза 33 мкг. Во время пикового антительного ответа после четвертой иммунизации различие между указанными двумя дозами составляет 43% со значениями ОМТ около 1940 (33 мкг) и 3400 (300 мкг). Αнтительный ответ на дозу 33 мкг АЛ 1792 и МРЬ был очень схож с ответом, который генерируется практически десятикратной дозой антигена (300 мкг), связанного с алюминиевыми квасцами. Добавление МРЬ к эмульсии типа масло в воде уменьшает эффективность составов по отношению к таковым с МРЬ, как к адъюванту самому по себе, на 75%. Пальмитолированное производное АП 1792 полностью неиммуногенно, когда его вводят в РВ8, и генерируют умеренные титры при введении в эмульсии типа масло в воде с ОМТз 340 и 105 для третьего и четвертого заборов крови. Наиболее высокие титры антител выявляются при использовании адъюванта Фрейнда с пиком ОМТ около 87000. Это значение почти в 30 раз выше, чем значения ОМТз для следующих двух наиболее эффективных составов, МРЬ и высокой дозы АП 1792 с алюминиевыми квасцами.

Наиболее многообещающими адъювантами, идентифицированными в указанном исследовании, оказались МРЬ и алюминиевые квасцы. Из этих двух адъювантов МРЬ, по-видимому, предпочтительнее, поскольку в 10 раз более низкая доза антигена необходима для генерации аналогичного антительного ответа, чем при использовании алюминиевых квасцов. Αнтительный ответ может быть увеличен путем увеличения дозы антигена и/или адъюванта и путем оптимизации схемы иммунизации. Эмульсия типа масло в воде является очень слабым адъювантом для ΆN 1792 и добавление эмульсии типа масло в воде к адъюванту РМЬ уменьшает изначальную активность адъюванта самого по себе.

2. Уровни Αβ в головном мозге

Примерно через 14 дней морских свинок глубоко анестезируют, забирают спинномозговую жидкость (С8Р), удаляют головной мозг у животных, которые были иммунизированы адъювантом Фрейнда (группа 2), МРЬ (группа 5), алюминиевыми квасцами вместе с 300 мкг ΆN 1792 (группа 10) и РВ8 (контрольная группа 3). Для измерения уровня пептида Αβ одно полушарие измельчают и приготавливают гомогенаты гиппокампа, коры и мозжечка в 5М гуанидине. Указанные гомогенаты разводят и количественно сравнивают с сериями разведений стандартного белка Αβ известных концентраций методом ЕЫ8А Уровни белка Αβ в гиппокампе, коре и мозжечке были очень схожи между собой для всех четырех групп, за исключением широкого разброса антительных ответов на Αβ, вызванных введением соответствующих доз. Средние уровни Αβ около 25 нг/г ткани измеряют в гиппокампе, 21 нг/г в коре и 12 нг/г ткани в мозжечке. Таким образом, наличие высокого уровня циркулирующих антител к Αβ практически в течение трех месяцев у некоторых из указанных животных не изменяет общих уровней Αβ в головном мозге этих животных. Уровни Αβ в спиномозговой жидкости были также незначительно сходны между группами. Утрата сильного эффекта иммунизации ΆN 1792 на экзогенный Αβ свидетельствует о том, что иммунный ответ сфокусирован на патологических формах Αβ.

VIII. Иммунный ответ на различные адъюванты у мышей

Для этого исследования использовали шестинедельных самок мышей 8\\355 ХУеЬЧег (10-13 животных на группу). Иммунизации осуществляли в дни 0, 14, 28, 60, 90 и 20 подкожно в дозовом объеме 200 мкл. В качестве буфера использовали РВ8 для всех составов. У животных забирали кровь через 7 дней после каждой иммунизации, начиная со второй дозы, для анализа титров антител с помощью ЕЫ8А Режим обработки каждой группы представлен в табл. 7.

- 28 021614

Таблица 7

План эксперимента
Группа	Ν8	Адъювант0	Доза	Антиген	Доза (мкг)
1	10	МРЬ	12,5 мкг	ΑΝ1792	33
2	10	МРЬ	25 мкг	ΑΝ1792	33
3	10	МРЬ	50 мкг	ΑΝ1792	33
4	13	МРЬ	125 мкг	ΑΝ1792	33
5	13	МРЬ	50 мкг	ΑΝ1792	150
6	13	МРЬ	50 мкг	ΑΝ1528	33
7	10	РВ5		ΑΝ1792	33
8	10	РВ8		Нет
9	10	Эмульгированный сквален	5%	ΑΝ1792	33
10	10	Примешанный сквален	5%	ΑΝ1792	33
11	10	Алюминиевые квасцы	2 мг	ΑΝ1792	33
12	13	МРЬ + Алюминиевые квасцы	50 мкг/2 мг	ΑΝ1792	33
13	10	68-21	5 мкг	ΑΝ1792	33
14	10	¢)5-21	10 мкг	ΑΝ1792	33
15	10	¢)5-21	25 ΑΝ1792	ΑΝ1792	33
16	13	()5-21	25 ΑΝ1792	ΑΝ1792	150
17	13	65-21	25 ΑΝ1792	ΑΝ1528	33
18	13	68-21 + МРЬ	25 мкг/50 мкг	ΑΝ1792	33
19	13	68-21 + Алюминиевые квасцы	25 мкг/2 мг	ΑΝ1792	33

Примечание ^а Количество мышей в каждой группе на начало эксперимента.

^Ь Адъюванты указаны. ΡΒδ служил в качестве буфера для всех составов. Для группы 8 не использовалось ни адъюванта, ни антигена.

Титры антител к Αβ 42, определенные методом ΕΙ.ΙδΑ, в каждой группе приведены в табл. 8.

Таблица 8

Среднее геометрическое значение титров антптел

Неделя забора крови

Группа обработки	2.9	5.0	8.7	12.9	16.7
1	248	1797	2577	6180	4177
2	598	3114	3984	5287	6878
3	1372	5000	7159	12333	12781
4	1278	20791	14368	20097	25631
5	3288	26242	13229	9315	23742
6	61	2536	2301	1442	4504
7	37	395	484	972	2149
8	25	25	25	25	25
9	25	183	744	952	1823
10	25	89	311	513	817
11	29	708	2618	2165	3666
12	198	1458	1079	612	797
13	38	433	566	1080	626
14	104	541	3247	1609	838
15	212	2630	2472	1224	1496
16	183	2616	6680	2085	1631
17	28	201	375	222	1540
18	31699	15544	23095	6412	9059

Из данных таблицы видно, что наиболее высокие титры были получены для групп 4, 5 и 18, которым вводили соответственно следующие адъюванты: 125 мкг МРЬ, 50 мкг МРЬ и ^δ-21 в сочетании с МРЬ.

IX. Терапевтическая эффективность различных адъювантов

Терапевтическую эффективность оценивали на трансгенных мышах Ρ^ΑΡΡ при использовании набора адъювантов, подходящих для применения на людях, для определения их способности усиливать иммунный ответ на Αβ и индуцировать опосредованное иммунитетом разрушение отложений амилоида в головном мозге.

- 29 021614

180 Гетерозиготных трансгенных мышей ΡΌΑΡΡ разного пола 7,5-8,5 месяцев получали от СПаг1е5 РАег ЬаЬога!ог1е5. Мышей разбивали на 9 групп по 15-23 животных в каждой группе для иммунизации ΑΝ 1792 или ΑΝ 1528 в сочетании с различными адъювантами. Животных группировали по максимально возможному совпадению возраста, происхождения и совпадению по полу. Использовали следующие адъюванты: алюминиевые квасцы, МЕЕ и 0§-21 в сочетании с двумя антигенами и адъювант Фрейнда (ΡΑ) в сочетании только с ΑΝ 1792. Дополнительную группу животных иммунизировали ΑΝ 1792 в ΡΒδ вместе с консервантом тимерозалом без адъюванта. Девятую трупу иммунизировали только ΡΒδ в качестве негативного контроля.

Получение агрегированных А β-пептидов: Ав 1-40 человека (ΑΝ 1528; СаПГогша Ρеρΐ^άе5 1пс., №ра, СΑ; Ьо! МЕО541) и Ав 1-42 человека (ΑΝ 1792; СаПГогша Ρерΐ^άе5 1пс., Ьо! МЕО439) заново солюбилизировали для получения составов для инъекций из лиофилизированного порошка, который хранили высушенным при -20°С. Для этих целей 2 мг пептида добавляли к 0,9 мл деионизованной воды и смесь перемешивали на вортексе с получением относительно однородного раствора или суспензии. ΑΝ 1528 был растворимым на этой стадии в противоположность ΑΝ 1792. 100-мкл Аликвоту 10 х ΡΒδ (1 х ΡΒδ: 0,15М №С1, 0,01М фосфат натрия, рН 7,5) затем добавляют для преципитации ΑΝ 1528. Суспензию снова перемешивают на вортексе и инкубируют в течение ночи при 37°С для использования на следующий день.

Для получения состава доз с алюминиевыми квасцами (группы 1 и 5) пептид Ав в ΡΒδ добавляют к Альгидрогелю (двухпроцентному водному гелю гидроксида алюминия, δа^§еаη! 1пс., СГоп, ΝΙ) до концентрации 100 мкг пептида Ав на 1 мг алюминиевых квасцов. 10 х ΡΒδ добавляют до конечной дозы в объеме 200 мкл 1 х ΡΒδ.

Затем суспензию осторожно перемешивают примерно 4 ч при комнатной температуре до начала инъекций.

Для получения состава доз с МЕЙ (группы 2 и 6) лиофилизированный порошок (РЬ ПптипоСПет Ре5еагсП, 1пс., НатШоп, МТ; Ьо! 67039-ΕΟ896Β) добавляют к 0,2%-ному водному триэтиламину до конечной концентрации 1 мг/мл и перемешивают на вортексе. Смесь нагревают до 65-75°С в течение 30 с до получения слабо опалесцирующей однородной суспензии мицелл. Раствор хранят при 4°С. Для каждой серии инъекций 100 мкг пептида на дозу в 50 мкл ΡΒδ, 50 мкг МЕЙ на дозу (50 мкл) и 100 мкл ΡΒδ на дозу смешивают в боросиликатной пробирке непосредственно перед использованием.

Для получения состава доз с Οδ-21 (группы 3 и 7) лиофилизированный порошок (Αηυί1Η, РгатшдПат, МΑ, Ьо! Α 7018Р) добавляют к ΡΒδ, рН 6,6-6,7 до конечной концентрации 1 мг/мл и перемешивают на вортексе. Раствор хранят при -20°С. Для каждой серии инъекций 100 мкг пептида на дозу в 50 мкл ΡΒδ, 25 мкг Οδ-21 на дозу в 25 мкл ΡΒδ и 125 мкл ΡΒδ на дозу смешивают в боросиликатной пробирке непосредственно перед использованием.

Для получения состава доз с адъювантом Фрейнда (группа 4) 100 мкг ΑΝ 1792 в 200 мкл ΡΒδ эмульгируют в соотношении 1:1 (об./об.) в полном адъюванте Фрейнда (ΡΡΑ) до конечного объема 400 мкл для первой иммунизации. Для последующих иммунизаций антиген также эмульгируют в неполном адъюванте Фрейнда (ΙΡΑ). Для составов, содержащих алюминиевые квасцы, МЕЙ или Οδ-21 100 мг на дозу ΑΝ 1792 или ΑΝ 1528 объединяют с квасцами (1 мг на дозу), или МЕЙ (50 мкг на дозу), или ρδ-21 (25 мкг на дозу) в конечном объеме 200 мкл ΡΒδ и осуществляют инъекцию в спину животных между плечевыми участками. Для группы, получающей ΡΑ, 100 мкг ΑΝ 1792 эмульгируют в соотношении 1:1 (об. на об.) в ΡΡΑ до конечного объема 400 мкл и вводят интраперитонеально во время первой иммунизации, за которой следует бустерная инъекция того же самого количества антигена в ΙΡΑ для последующих пяти доз. Для группы, получающей ΑΝ 1792 без адъюванта, 10 мкг ΑΝ 1792 объединяют с 5 мкг тимерозала в конечном объеме 50 ΡΒδ и вводят подкожно. Девятая, контрольная группа животных получает только 200 мкл ΡΒδ подкожно. Иммунизации проводят по двухнедельной схеме для первых трех доз, далее по месячной схеме в дни 0, 16, 28, 56, 85 и 112. У животных забирают кровь на 6-7 день после каждой иммунизации, начиная со второй дозы, для измерения титров антител. Животных умерщвляют примерно через неделю после введения последней дозы. Затем с помощью ЕЙ-ΙδΑ определяют уровни Ав и АРР в головном мозге и оценивают наличие амилоидных бляшек в срезах мозга. Кроме того, определяют титры Ав-специфических антител и оценивают Ав-зависимые пролиферативный и цитокиновый ответы.

В табл. 9 приведены результаты, показывающие, что наиболее высокие титры антител к Ав 1-42 вызываются ΡΑ и ΑΝ 1792, пиковое значение которых приходится на период после четвертой иммунизации (пик СМТ: 75,386) и далее снижается на 59% после конечной, шестой иммунизации. Среднее пиковое значение титра антител, индуцируемых МГР с ΑΝ 1792, на 62% ниже, чем таковое антител, индуцируемых ΡΑ (пик СМТ: 28,867), и также в начале периода иммунизации возрастает (после 3 доз) и далее снижается на 28% по сравнению с пиковым значением после шестой иммунизации. Среднее пиковое значение титра антител, индуцированных Οδ-21 вместе с ΑΝ 1792 (СМТ: 1,511), примерно в 5 раз ниже, чем таковое для МГЕ. Кроме того, кинетика ответа была более медленной, поскольку для достижения пикового ответа была необходима дополнительная иммунизация. Титры, индуцируемые ΑΝ 1792, связанным с квасцами, были существенно выше, чем титры, индуцированные Οδ-21, а кинетика ответа была

- 30 021614 более быстрой. Для ΑΝ 1792 в РВ8 с тимерозалом частота и величина титров были незначительно выше, чем при введении одного РВ8. Пиковые значения титров, полученные при введении МРЬ и ΑΝ 1528 (пик ОМТ: 3099), были примерно в 9 раз ниже, чем в случае ΑΝ 1792. ΑΝ 1528, связанный с квасцами, обнаруживал очень низкую иммуногенность с генерацией антител в низких титрах только у некоторых животных. Антительный ответ не выявлялся у контрольных животных, получавших РВ8.

Таблица 9

Среднее геометрическое значение титров антител

Неделя забора крови

Обработка	3.3	5,0	9,0	По-	17,0
Алюминиевые	102	1,081	2,366	1.083	572
квасцы/ ΑΝ1792	(1221)ь	(17/20)	(21/21)	(19/21)	(1821)
МР1У	6241	28.867	1.1242	5.665	8,204
ΑΝ1792	(2121)	(2121)	(2121)	(20/20)	(20/20)
05-21/	30	227	327	1.511	1.(88
ΑΝ1792	(1/20)	(10/19)	(10/19)	(17/18)	(14/18)
СГА/	10,076	61,279	75.386	41.628	30.574
ΛΝ1792	(15/15)	(15/15)	(15/15)	(15/15)	(15/15)
Алюминиевые	25	33	39	37	31
квасцы/ ΑΝ1528	(0/21)	(1/21)	(3/20)	(1/20)	(220)
МРЬ/	184	2.591	1,653	1.156	3.099
ΑΝΊ528	(15/21)	(20/21)	(2121)	(20.20)	<20.201
05-21'	29	221	51	820	2,994
ΑΝ1528	(1/22)	(1322)	(4/22)	(2022)	(21,22)
РВ2 + Тимеросал	25	33	39	37	47
(0/16)	(2/16)	(4/16)	(3/16)	(4/16)
рвз	25	25	25	25	25
	(0/16)	(0/16)	(0/15)	(0/12)	(0/16)

Примечание ^а Средние геометрические значения титров определяли против Ав 1-42.

^Ъ Число респондеров на группу.

Результаты лечения ΑΝ 1792 или ΑΝ 1528 в комплексе с различными адъювантами или тимерозалом амилоидных отложений в коре у 12-месячных мышей, полученные с помощью ЕЫ8А, показаны на фиг. 15. У контрольных мышей РБАРР, получавших РВ8, средний уровень общего Ар в коре в этом возрасте составил 1,817 нг/г. Существенно пониженные уровни Ав наблюдались у мышей, получавших ΑΝ 1792 вместе с СРАЛРА, ΑΝ 1792 вместе с алюминиевыми квасцами, ΑΝ 1792 вместе с МРЬ и р8-21 в комплексе с ΑΝ 1792. Понижение достигало статистической значимости (р<0,05) только при введении ΑΝ 1792 вместе с СРАЛРА. Однако, как показано в примерах I и III, эффективность иммунизации в отношении снижения уровней Ав существенно повышалась по достижении мышами 15- и 18-месячного возраста. Таким образом, ожидалось, что, по крайней мере, композиции, содержащие ΑN 1792 и алюминиевые квасцы, ΑN 1792 и МРЬ и ΑN 1792 и р8-21, будут достигать статистической значимости при лечении более старых мышей. В противоположность указанному введение ΑN 1792 в комплексе с консервантом тимерозалом обеспечивает сохранение среднего уровня Ав, практически такого же, как у контрольных животных, получавших РВ8. Сходные результаты получают при сравнении кортикальных уровней Ав 42. Средний уровень Ав 42 у контрольных животных, получавших РВ8, составляет 1624 нг/г. Значительно сниженные средние уровни 403, 1149, 620 и 714 наблюдались у мышей, обработанных ΑN 1792 и СРА/ТРА, ΑN 1792 и алюминиевыми квасцами, ΑN 1792 и МРЬ и ΑN 1792 и р8-21 соответственно, причем снижение достигало статистической значимости (р=0,05) в группе, получавшей ΑN 1792 СРАЛРА. Средний уровень Ав 42 у животных, получавших ΑN 1792 с тимерозалом, составляет 1619 нг/г.

Дальнейшее изучение терапевтической эффективности комплекса адъювант/иммуноген осуществлялось на 9-10,5-месячных гетерозиготных трансгенных мышах РБАРР. Продолжительность исследования составляла 25 недель. Число животных в группе составляло 29-40. К концу исследования животные достигали возраста 15-16,5 месяцев. Экспериментальные группы описаны ниже в табл. 10.

- 31 021614

Таблица 10

	Адъювант	Иммуноген	Буфер для разведения	Способ введения
Группа 1	МРЬ-ЗЕ	ΑΝ 1792-ССЗ	(75 мкг) РВЗ	8С(250 мкл)
Группа 2	Ι8Α51	ΑΝ 1792-ОС8	(75 мкг) РВЗ	1Р (400 мкл)
Группа 3	03-21	ΑΝ 1792-ССЗ	(75 мкг) РВЗ	ЗС (250 мкл)
Г руппа 4	()3-21 аббр.	ΑΝ 1792-ССЗ	(75 мкг) РВЗ	8С (250 мкл)
Группа 5	РВЗ	-	-	ЗС (250 мкл)

Примечание

МАР - мультиантигенный пептид; ТТ - Т-клеточный эпитоп (830-844) токсоида столбняка; (,)3 - подкожно; 1Р - интраперитонеально; РВЗ - фосфатный буферный раствор; 13А 51 - коммерчески доступный адъювант, сходный с ГРА; ССЗ - состав, содержащий глицин/цитрат/сахарозу; МРЬ-ЗЕ представляет собой МРЬ в стабилизированной водной или масляной эмульсии.

Схема иммунизации была идентична для всех групп, за исключением группы 3, имеющей схему, обозначенную как 03-21/АЫ 1792 (03-21 аббр.). Мышей инъецировали в недели 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24 и забирали кровь в недели 3, 5, 9, 13, 17, 21 и 25. Группы 1 и 2 получали 8 инъекций, а группа 3 получала 4 инъекции в течение 25-недельного периода исследований. Группа 4 (03-21/ ΛΝ 1792 аббр.) получала инъекции только в недели 0, 2, 4 и 8. Эта группа не была инъецирована в оставшийся период лечения, несмотря на то, что кровь у животных данной группы забирали по той же самой схеме, что и у остальных животных, для определения последующего снижения титра. Группы 3 и 5, Ο3-21ΜΝ 1792 и РВ3 соответственно служили в качестве положительного и отрицательного контролей.

Титры антител определяют путем исследования титров антител к Ав.

Группа 1. В группе МРЕ^Е/АЛ 1792 пик среднего геометрического значения титра (СМТ) составил 17,100 через 9 недель и в 25 недель снизился до значения 10,000. Первоначально титры в группе МРЬ-3Е росли с немного большей скоростью, чем в контрольной группе Ο3-21ΜΝ 1792 (группа 4).

Группа 2. В группе 13А 51/АН 1792 титры на протяжении всего исследования оставались высокими с СМТ более чем 100,000 в течение последних 9 недель.

Группа 3. В контрольной группе Ο3-21ΜΝ 1792 титр достигал пикового значения через 17 недель с СМТ 16,000. Затем в течение следующих 8 недель значение титра упало до СМТ 8,700. У одного животного данной группы во время всего периода исследований титр антител вообще не выявлялся.

Группа 4. В группе Ο3-21ΜΝ 1792 с сокращенной схемой инъекций титр антител достигал пикового значения 7,300 через 13 недель, т.е. через 5 недель после последней инъекции. Затем титр падал до значения СМТ 2,100 во время последнего забора крови (25 недель). Так же, как и в контрольной группе, у одного животного антитела не выявлялись, а у другого животного в конце периода исследований полностью исчезали.

Группа 5. В этой группе, получавшей только РВ3, титры антител не выявлялись.

Для оценки уровней Ав в коре с помощью ЕЬ13А выявляли общий Ав и Ав 1-42. Из одного полушария головного мозга готовили срезы коры, гиппокампа и мозжечка из предварительно гомогенизированных в 5М гуанидиновом буфере тканей и исследовали их на содержание Ав. Результаты, относящиеся к уровням общего Ав и Ав 1-42 в коре, были сходными. Для определения значимости различий между уровнями Ав использовали статистический анализ Манна-Уитни; значение р 0,05 свидетельствовало о статистической значимости изменений уровня Ав.

У всех групп животных, подвергавшихся лечению, были существенно снижены уровни общего Ав по сравнению с контрольной группой, получавшей РВ3 (табл. 11). В группе МР^-3Е/АN 1792 обнаруживались наибольшие изменения в уровне Ав и они были существенно лучше, чем в других группах лечения. В группе Ο3-21ΜΝ 1792 изменения Ав были точно такими же, как и изменения Ав в 03-21 контрольной группе, получившей все 8 инъекций. Уровни Ав в группе 13А 51ΜΝ 1792 были такими же низкими при сравнении с группой СРА/ ГРА: МАР (Ав 1-7).

- 32 021614

Таблица 11. Кортикальные уровни Ав

	РВ8	МРЬ-ЗЕ	Ι5Α	<38-21	43-21(4)
Медианное значение	7,355	1,236	3,026	2,389	2,996
(нг/г ткани)
Разброс (нг/г ткани)	550-18,358	70 - 3,977	23 - 9,777	210-11,167 24-16,834
Значение р	-	< 0, 0001	<0,0001	<0,0001	<0,0001
N	38	29	36	34	40

В заключение следует отметить, что адъюванты МРЬ-8Е, Ρ5Α-51 и 08-21 в комплексе с ΑΝ 1792 эффективны в отношении индукции достаточного иммунного ответа для разрушения отложений Ав в коре.

X. Токсикологический анализ

Ткани использовали для гистопатологического анализа в конце экспериментов, описанных в примерах 2, 3 и 17. Кроме того, для исследования последних образцов крови использовали гематологический анализ и методы клинической химии (примеры 3 и 7). Оценивали большинство основных органов, включая головной мозг, легкие, лимфоидные органы, желудочно-кишечный тракт, печень, почки, надпочечники и гонады. Несмотря на то что у изучаемых животных обнаруживались спорадические повреждения, не было очевидных различий в тканях и тяжести повреждений между животными, получавшими ΑΝ 1792 и необработанными животными. Не выявлялось уникальных гистопатологических повреждений у животных, иммунизированных ΑΝ 1528, по сравнению с животными, получавшими РВ8 или необработанными животными. Также не было различий при исследовании методами клинической химии между животными, получавшими адъювант, и животными, получавшими РВ8, в примере 7. Несмотря на то что было существенное увеличение в показателях некоторых гематологических параметров у животных, обработанных ΑΝ 1792 и адъювантом Фрейнда (пример 7), по сравнению с животными, получавшими РВ8, такой характер эффектов ожидался от использования адъюванта Фрейнда и соответствующий перитонит не свидетельствовал о каких-либо побочных эффектах лечения с помощью ΑΝ 1792. Патология головного мозга мышей Р^ΑРР интенсивно изучалась для оценки конечных результатов лечения, а не для токсикологической оценки. Во время исследований не обнаружилось никаких свидетельств побочных эффектов лечения на морфологию головного мозга. Эти результаты свидетельствуют о том, что лечение ΑΝ 1792 толерантно и практически не связано ни с какими побочными эффектами.

XI. Терапевтическое лечение антителами к Ав

В приведенных ниже примерах тестируется способность различных моноклональных и поликлональных антител к Ав ингибировать накопление Ав в головном мозге гетерозиготных трансгенных мышей.

1. Проведение эксперимента

Шестьдесят гетерозиготных трансгенных мышей Р^ΑРР (самок и самцов) 8,5-10,5-месячного возраста получают от СЬг1е8 РАег ЬаЬога!огу. Мышей разделяют на 6 групп для обработки различными антителами к Ав по максимально возможному совпадению пола, возраста, происхождения и источника получения. Как показано в табл. 12, тестируют следующие антитела: 4 моноклональных антитела мыши к Ав, 2Н3 (направлено к остаткам Ав 1-12), 10Ό5 (направлено к остаткам Ав 1-16), 266 (направлено к остаткам Ав 13-28 и связывается с мономерным, но не агрегированным ΑΝ 1792), 21Р12 (направлено к остаткам Ав 33-42). Пятую группу животных обрабатывают Ав-специфическими поликлональными антителами (полученными при иммунизации животных агрегированным ΑΝ 1792). Группа отрицательного контроля получает разбавитель, РВ8, без антител.

Моноклональные антитела вводят в дозе около 10 мг/кг (исходя из предположения, что мыши весят по 50 г). Инъекции осуществляют интраперитонеально каждые семь дней для поддержания титров к Ав выше 1000. Несмотря на то что более низкие титры были определены для мАЬ 266, поскольку данное антитело не связывается эффективно с агрегированным ΑΝ 1792, который используется в качестве захватываемого антигена в данном анализе, для соответствующей группы животных использовали аналогичную схему дозирования. Группу, получавшую моноклональное антитело 2Н3, прекращали иммунизировать в первые три недели, поскольку антитело быстро выводилось. У животных забирали кровь до введения каждой дозы для измерения титров антител. Лечение продолжали в течение шести месяцев, в общей сложности в течение 196 дней. Животных умерщвляли через неделю после введения последней дозы.

- 33 021614

Таблица 12

Ппш эксперимента
Г руппа обработки	Ν»	Антше.т Специфичность антшела	Изотоп антитела
	9	Не» (один ГЧ49)	ЫДЬ	ΝΑ
2	10	Пплнюишллыюе	Αβ1-42	Смешанный
3	0	тАЬ°2НЗ	Αβ1-12	1дЕ1
4	&	тАЬ 1005	ΑβΤ-16	1дС1
5	е	тАЬ 266	Αβ13-28	1дС1
6	в	тАЬ21Р12	Αβ33-42	1дС2а

Примечание ^а Число животных в группе на момент окончания эксперимента. Во всех изначально было по 10 животных.

^Ь ΝΑ: не определяется. ^с мАЬ: моноклональное антитело.

2. Материалы и методы а. Получение антител

Поликлональные антитела к Αβ получают из крови, собранной от животных двух групп. Первая группа включает 100 самок мышей 8^188 VеЬзΐе^ 6-8-недельного возраста. Указанную группу иммунизируют в дни 0, 15, 29 100 мкг ΑΝ 1792 вместе с СРА/ΙΡΑ. Четвертую инъекцию проводят на 36 день половинной дозой ΑΝ 1792. Животных умерщвляют на 42 день, получают объединенную сыворотку в общем объеме 64 мл. Вторая группа содержит 24 самки мышей, изогенные мышам ΡΌΑΡΡ, но не трансгенные по гену ΑΡΡ человека, 6-9-недельного возраста. Указанную группу иммунизируют в дни 0, 14, 28 и 56 100 мкг ΑΝ 1792 вместе с СРА/ΙΡΑ. Этих животных также умерщвляют путем смещения шейных позвонков на 63 день и получают объединенную сыворотку в общем объеме 14 мл. Два объема сыворотки объединяют. Фракцию антител получают при использовании двух последовательных процедур преципитации сульфатом аммония 50%-ной насыщенности. Конечный преципитат диализуют против РВ8 и тестируют на эндотоксин. Уровень эндотоксина составляет менее 1 Ευ/мг.

Моноклональные антитела к Αβ получают из асцитной жидкости, из которой удаляют липиды добавлением концентрированного декстрансульфата натрия до конечной концентрации 0,238%. Предварительно асцитную жидкость охлаждают перемешиванием на льду. Далее добавляют концентрированный СаС1₂ при перемешивании до обеспечения конечной концентрации 64 мМ. Ρаствор центрифугируют при 10000 д и удаляют осадок. Супернатант перемешивают на льду с эквивалентным объемом насыщенного сульфата аммония, который добавляют по каплям. Ρаствор заново центрифугируют при 10000 д и удаляют супернатант. Осадок ресуспендируют и диализуют против 20 мМ Трис-НС1, 0,4М №С1, рН 7,7. Полученную фракцию наносят на колонку РЬатташа РРЬС с сефарозой О и элюируют обратным градиентом от 0,4М до 0,275М ЫаС1 в 20мМ Трис-НС1, рН 7,5.

Пик антител идентифицируют по поглощению при 280 нм и нужные фракции объединяют. Очищенный препарат антител характеризуют путем измерения концентрации белка при использовании метода ВСΑ и очищают 8Ό8-ΡΑΟΕ. Препарат также тестируют на присутствие эндотоксина. Уровень эндотоксина составляет менее 1 Ευ/мг. Титры менее 100 произвольно обозначают как значение титра 25.

3. Уровни Αβ и ΑΡΡ в головном мозге

Через 6 месяцев лечения различными препаратами антител к Αβ удаляют головной мозг у перфузированных физиологическим раствором животных. Одно полушарие используют для иммуногистохимического анализа, а второе - для количественного определения уровней Αβ и ΑΡΡ. Для определения концентраций различных форм бета-амилоидного пептида и амилоидного белка-предшественника (ΑΡΡ) полушарие рассекают и готовят гомогенаты гиппокампа, коры и мозжечка в 5М гуанидине. Их последовательно разводят и определяют количественный уровень амилоидного белка или ΑΡΡ путем сравнения с последовательными разведениями стандартов Αβ пептида или ΑΡΡ известных концентраций методом ΕΌΙ8Α.

Уровни общего Αβ и Αβ 1-42, измеренные путем ΕΌΙ8Α в гомогенатах коры и гиппокампа, и уровень общего Αβ в мозжечке приведены в табл. 11, 12 и 13 соответственно. Средняя концентрация общего Αβ в контрольной группе, получавшей РВ8, была в 3,6 раза больше в гиппокампе, чем в коре (среднее значение 63,389 нг/г в ткани гиппокампа по сравнению со значением 17,818 нг/г в коре). Средний уровень общего Αβ в мозжечке животных контрольной группы (30,6 нг/г ткани) был более чем в 2000 раз ниже, чем в гиппокампе. Указанные уровни сходны с таковыми, о которых авторы изобретения предварительно сообщали в отношении гетерозиготных трансгенных мышей ΡΌΑΡΡ аналогичного возраста ЦоЬпзоп^ооб е! а1., 1997).

У одной группы животных средний уровень Αβ в коре головного мозга, измеренный как Αβ 1-42, существенно отличался от такового у животных контрольной группы (р<0,05), которые получали поликлональное антитело к Αβ (табл. 13). Средний уровень Αβ 1-42 был снижен на 65% по сравнению с кон- 34 021614 тролем у данной группы обработки. Средние уровни Αβ 1-42 были также существенно снижены (на 55%) по сравнению с контролем у одной дополнительной группы обработанных животных, которые получали тАЬ 10Ώ5 (р=0,0433).

Таблица 13

Кора
Группа обработки	Ν3	Медианные значения	Средние значения
			Общий	Αβ		Αβ42	Αβ	Ар42
		Значение в ЕЬВАЬ	с Значение Р	οθ изменений	Значение в ЕЫ8А	Значение Р	°0 изменений	Значение в ЕЫЗА	Значение в ЕЫЗА
РВЗ	9	17818	ΝΑ<*	ΝΑ	13802	ΝΑ	ΝΑ	16150+/- 7456е	12621+/- 5738
Поликлональная ю анти -Αβ42	6160	0.0055	-65	4892	0.0071	-65	5912+/- 4492	4454+/- 3347
тАЬ1005	8	7915	0.1019	-56	6214	0.0433	-55	9695+/- 6929	6943+/- 3351
тАЬ 266	6	9144	0.1255	-49	8481	0.1255	-39	9204+/- 9293	7489+/- 6921
тАЬ 21Р12	8	15158	0.2898	-15	13578	0.7003	-2	12481+/- 7082	11005+/- 6324

Примечание ^а Число животных в группе на момент окончания эксперимента.

^Ь нг/г ткани. ^с Αнализ Манна-Уитни.

⁴ NА: не определяется. ^е Стандартное отклонение.

В гиппокампе средний процент уменьшения общего Αβ, ассоциированного с обработкой поликлональными антителами к Αβ (50%, р=0,0055), не был таким значительным, как в коре (65%) (табл. 14). Однако абсолютное значение редукции было в 3 раза больше в гиппокампе, чем в коре. Уровень редукции в гиппокампе составлял 31,683 нг/г ткани по сравнению с 11,658 нг/г ткани коры. При измерении уровня более амилоидогенной формы Αβ, Αβ 1-42, а не общего Αβ, уменьшение его содержания, обеспечиваемое поликлональным антителом, было значительным (р=0,0025). Средние уровни в группах обработки шАЬ8 10Э5 и 266 были снижены на 33 и 21% соответственно.

Таблица 14

Гиппокамп
Группа обработки	!Ма			Медианные значения			Средние значения
		Αβ				Ар42			Αβ	Αβ42
		Значение в ЕЫЗАЬ	Значение рС	% изменения	Значение в ЕЫКА	Значение Р	изменения	Значение в ЕЫЯА	Значение в ЕЫ8А
РВЗ	9	63389	ΝΑ4	ΝΑ		54429	ΝΑ	ΝΑ	58351+/-	52801+/-
									13308е	14701
Поликлональное 10	31706	0.0055	-50		27127	0.0025	-50	30058+/-	24853+/-
									22454	18262
Анти-Ар42
тАЬ1005	8	46779	0.0675	-26		36290	0.0543	-33	44581+/-	36465+/-
									18632	17146
тАЬ 266	6	48689	0.0990	-23		43034	0.0990	-21	36419+/-	32919+/-
									27304	25372
тАЬ	8	51563	0.7728	-19		47961	0.8099	-12	57327+/-	50305+/-
21Р12									28927	23927

Примечание ^а Число животных в группе на момент окончания эксперимента.

^Ь нг/г ткани. ^с Αнализ Манни-Уитни.

⁴ NА: не определяется. ^е Стандартное отклонение.

Общий Αβ также измеряли в мозжечке (табл. 15). Животным этих групп вводили поликлональное антитело к Αβ и антитело 266 и у них обнаруживалось существенное уменьшение уровней общего Αβ (43 и 46%, р=0,0033 и 0,0184 соответственно). У животных, инъецированных 10Э5. выявлялась схожее значимое уменьшение (29%, р=0,675).

- 35 021614

Таблица 15

Млчжсяок
	Ν9	Медианные значения	Средние значения
			Общий Α β		Общим Αβ
	Значения и ΕΙ.Ι8Λ &	Значение Г с	Значения в Е1Л&А Значения к Ρί.1.8 А
РВЗ	9	30.64		ΝΑ*	ΝΑ	40.00+/-31.89е
Полнклона.т1.11ое аптп-А042 Ю	17.61		0.0033	-43	18.15-Р/-4.36
тАЬ1005	8	21.68		0.0675	'29	27.29+/Ί9.43
тАЬ 266	6	16.59		0.0184	-46	19.59+/-6.59
тАЬ21Р12	8	29.80		;>0.9999	-3	32.88+/-9.90

Примечание ^а Число животных в группе на момент окончания эксперимента.

^Ъ нг/г ткани. ^с Анализ Манна-Уитни.

^Д ΝΑ: не определяется. ^е Стандартное отклонение.

Концентрацию АРР также определяли методом ΕΕΚΑ в коре и мозжечке у мышей, обработанных антителами, и у контрольных животных, инъецированных ΡΒ8. Использовали два различных анализа АРР. Первый, обозначенный ΑΡΡ-α/ΡΕ, определяет как АРР-альфа (α, секретируемая форма АРР, которая образуется при отщеплении Ав-последовательности), так и полноразмерные формы (РЬ) АРР, в то время как во втором анализе определяется только АРР-α. В противоположность ассоциированному с обработкой уменьшению Ав в определенных группах, уровни АРР существенно не изменились во всех обработанных группах по сравнению с контрольными животными. Эти результаты указывают на то, что иммунизации антителами к Ав уменьшают уровень Ав без уменьшения уровня АРР.

В целом, уровни Ав существенно снижены в коре, гиппокампе и мозжечке у животных, обработанных поликлональными антителами к ΑΝ 1792. В меньшей степени моноклональные антитела к аминоконцевому участку Ав 1-42, особенно аминокислотам 1-16 и 13-28, обнаруживают существенный терапевтический эффект.

4. Гистохимический анализ

Морфологию Ав-иммунореактивных бляшек в головном мозге мышей, обработанных ΡΒ8, поликлональными антителами к Ав 42 и моноклональными антителами 21Р12, 266 и 10Ό5, качественно сравнивали с таковой, полученной при осуществлении предварительных исследований, в которых следовали стандартной процедуре иммунизации Ав 42.

Наиболее значительные изменения во внешнем виде и качестве амилоидных бляшек наблюдались у животных, иммунизированных поликлональными антителами к Ав 42. Уменьшение числа бляшек, эрозионная морфология бляшек и связанная с клетками Ав-иммунореактивность отражают эффективность стандартной процедуры иммунизации. Указанные наблюдения подтверждают результаты ΕΕΚΑ, согласно которым существенное уменьшение уровней общего Ав и Ав 42 было вызвано введением поликлональных антител к Ав 42.

В сходных определениях появление и количество амилоидных бляшек в группе 10Ό5 было также снижено с некоторыми свидетельствами в пользу связанной с клетками Ав-иммунореактивности. По отношению к контрольным животным поликлональная ^-фракция к Ав и одно из моноклональных антител 10Ό5 уменьшали общее число бляшек на 93 и 81% соответственно (р<0,005). 21Р12, по-видимому, обладают относительно умеренной эффективностью в отношении числа бляшек. Микрофотографии головного мозга после обработки поликлональными антителами к Ав 1-42 обнаруживают диффузные отложения амилоида и отсутствие многочисленных крупных компактных бляшек по сравнению с контрольными животными.

5. Измерение титров антител

У трех случайным образом отобранных мышей из каждой группы забирают кровь непосредственно перед каждой интраперитонеальной инокуляцией, в целом, осуществляя 30 заборов крови. Титры антител измеряют титр Ав 1-42 связывающего антитела в сэндвичевом ΕΕΚΑ при использовании пластиковых планшетов, покрытых Ав 1-42, как детально описано в разделе Основные материалы и методы. Средние значения титров для каждого забора крови приведены на фиг. 16-18 для поликлонального антитела и моноклонального антитела 10Ό5 и 21Р12 соответственно. Средние значения титров за указанный период составляли около 1000 для поликлонального антитела и чуть больше указанной величины для антител 10Ό5 и 21Р12.

6. Лимфопролиферативный ответ

Ав-зависимую лимфопролиферацию измеряют при использовании клеток селезенки, собранных через 8 дней после заключительной инфузии антител. Свежесобранные клетки в количестве 10⁵ на лунку культивируют в течение 5 дней в присутствии Ав 1-40 в концентрации 5 мкМ для их стимуляции. В ка- 36 021614 честве положительного контроля дополнительные клетки культивируют с Т-клеточным митогеном, ΡНΑ, а в качестве отрицательного контроля клетки культивируют без добавления какого-либо пептида.

Спленоциты взрослых мышей РЭАРР пассивно иммунизируют различными антителами к Αβ, стимулируют ίη уПго АN 1792 и оценивают пролиферативный и цитокиновый ответы. Целью указанных исследований является установление того, обусловливает ли пассивная иммунизация презентацию антигена и тем самым примирование Т-клеточного ответа, специфичного к АN 1792. Не обнаружилось никакого АN 1792-специфичного пролиферативного или цитокинового ответа у мышей, пассивно иммунизированных антителами к Αβ.

XII. Дальнейшее изучение пассивной иммунизации

Во втором исследовании обработку антителами 10Ό5 повторяют и тестируют два дополнительных антитела к Αβ, моноклональные антитела 3Ό6 (Αβ 1-5) и 16С11 (Αβ 33-42). Контрольные группы животных получают РВ8 или нерелевантное, совпадающее по изотипу антитело ТМ2а. Используют более старых мышей (гетерозиготные животные 11,5-12 месяцев), чем в предварительных исследованиях, но схема эксперимента остается той же самой. Опять же через 6 месяцев лечения антитело 10Ό5 редуцирует количество бляшек более чем на 80% по сравнению с контролем (РВ8 или антитело ТМ2а) (р=0,003). В противоположность указанному, третье антитело против пептида Αβ 33-42 (16С11) не обнаруживало эффективности в отношении уменьшения количества бляшек. Сходные данные были получены для Αβ 42 в измерениях методом ЕЫ8А. Приведенные результаты показывают, что антительный ответ против пептида Αβ в отсутствие Т-клеточного иммунитета достаточен для того, чтобы вызвать уменьшение амилоидных отложений у мышей РЭАРР. однако не все антитела к Αβ эффективны. Αнтитела, направленные к эпитопам, содержащим аминокислоты 1-5 или 3-7 Αβ, особенно активны. В целом, показано, что пассивно введенные антитела к Αβ редуцируют тяжесть отложений амилоидных бляшек у мышей с моделью болезни Αльцгеймера. При поддержании средних сывороточных концентраций на уровне 25-70 мкг/мл антитела поступают в С№8 в количестве, достаточном для того, чтобы связаться с β-амилоидными бляшками. Поступление антител в С№8 не обусловлено нарушением проницаемости гематоэнцефалического барьера, поскольку увеличение проницаемости сосудов не обнаруживается при использовании анализа с красителем синий Эванса на мышах РЭАРР. Кроме того, концентрация антител в паренхиме мозга взрослых мышей РЭАРР такая же, как и у нетрансгенных мышей, соответствующая 0,1% концентрации антител в сыворотке крови (независимо от изотипа).

XIII. Мониторинг связывания антител

Для определения того, способны ли антитела к Αβ функционировать непосредственно в С^, головной мозг мышей, перфузированных физиологическим раствором (см. пример XII), исследовали на присутствие периферически введенных антител. Нефиксированные криостатные срезы головного мозга экспонировали с флуоресцентным реагентом против Ц мыши (антитело козы к ЦС-СлА мыши). Бляшки в головном мозге животных, которым вводили антитела 10Ό5 и 3Ό6, были интенсивно покрыты антителами, однако не выявлялось окрашивания у животных, получавших 16С11. Для определения полного количества отложившихся бляшек последовательные срезы каждого головного мозга были подвергнуты взаимодействию с первыми антителами к Αβ и далее со вторым реагентом. Αнтитела 10Ό5 и 3Ό6 после периферического введения связывались в избытке с большинством бляшек в С№. Количество бляшек было существенно редуцировано у животных указанных групп по сравнению с группой 16С11. Полученные данные свидетельствуют о том, что введенные периферически антитела могут поступить в С№, где они способны непосредственным образом запускать разрушение амилоида. Весьма вероятно, что 16С11 также воздействуют на бляшки, но не способны связываться с ними.

XIV. Способ скрининга ех νί\Ό на активность антител в отношении отложений амилоида

Для определения способности антител разрушать амилоидные бляшки проводили исследования ех У1уо, в которых культивировали первичные клетки микроглии вместе с нефиксированными криостатными срезами головного мозга мышей РЭАРР или человека с БΑ. Клетки микроглии получали из участков мозговых извилин неонатальных мышей ОВА/Ш (1-3-дневного возраста). Участки мозга механически разрушали в НВ88^- (сбалансированный солевой раствор Хэнкса, 81дша) с 50 мкг/мл 0№зы I (81дша). Диссоциированные клетки фильтровали на системе Ра1соп с размером пор 100 мкм и центрифугировали при 1000 грт в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в ростовой среде (ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы, 10% РВ8, 25 нг/мл гт СМ-С8Р) и клетки высаживали в культуральные пластиковые флаконы Т-75. Через 7-9 дней флаконы вращали на орбитальном шейкере при 200 грт в течение 2 ч при 37°С. Клеточную суспензию центрифугировали при 1000 грт и ресуспендировали в среде исследования.

10-мкм Криостатные срезы головного мозга мышей РЭАРР и человека с БΑ (время после смерти <3 ч) оттаивали на покрытых полилизином покровных стеклах круглой формы и помещали их в лунки 24луночных планшетов для культуры тканей. Покровные стекла дважды отмывали в среде исследования, содержащей Н-8РМ (среда для гибридом, свободная от сыворотки, СЪсо ВРЬ), 1% РВ8, глутамин, пенициллин (стрептомицин и 5 нг/мл гт СМ-С8Е/Р&Э). Контрольные антитела или антитела к Αβ добавляли в 2 Х концентрации (5 мкг/мл конечная концентрация) на 1 ч. Затем высевали клетки микроглии с плотностью 0,8х10⁶ кл/мл среды для исследования. Культуры поддерживали в термостате во влажной

- 37 021614 среде (37°С, 5% СО2) в течение 24 ч и больше. В конце инкубирования культуры фиксировали 4% параформальдегидом и пермеабилизировали 0,1% Тритоном Х-100. Срезы окрашивали биотинилированными антителами 3Б6 и далее конъюгатами стрептавидин/Су3 (1аскзоп 1ттипо Кезеагск). Экзогенные клетки микроглии визуализировали ядерным окрашиванием (Ί)ΑΓΙ). Культуры наблюдали в инвертированный флуоресцентный микроскоп (№коп, ТЕ300) и делали микрофотографии с помощью цифровой камеры §РОТ при использовании программного обеспечения §РОТ (Б1а§поз11с 1пз1гитеп1з). Для вестернблоттинга культуры экстрагировали 8М мочевиной, разбавленной 1:1 восстанавливающим трициновым буфером, и наслаивали на 16% трициновый гель (№оуех). После переноса на Иммобилон блоты экспонируют с 5 мкг/мл рав Ав 42 и далее с антителами к 1д мыши, конъюгированными с НКР, и выявляют с помощью ЕСЬ (Αте^зЬат).

Когда исследование осуществляют со срезами головного мозга мышей Р^ΑРР в присутствии 16С11, одного из антител к Ав, которое не активно т у1уо, в-амилоидные бляшки остаются интактными и фагоцитоз не обнаруживается. В противоположность указанному, когда соседние срезы культивируют в присутствии 10Б5, отложения амилоида существенно уменьшаются, и в клетках микроглии выявляются многочисленные фагоцитарные гранулы, содержащие Ав. Аналогичные результаты были получены со срезами мозга больных БА. Антитело 10Б5 индуцирует фагоцитоз АД-бляшек, в то время как антитело 16С11 неэффективно. Кроме того, исследование обеспечивает сравнимые результаты, когда осуществляется с клетками микроглии как человека, так и мышей, и с антителами мыши, кролика или приматов к Ав.

В табл. 16 показано, что при использовании различных антител неодинаковой специфичности не всегда выявляется связывающая и/или фагоцитирующая активность. Можно видеть, что антитела, специфичные к эпитопам Ав, в пределах остатков 1-7 как связываются с амилоидными бляшками, так и вызывают их разрушение, в то время как антитела, специфичные к эпитопам в пределах аминокислотных остатков 4-10, связываются с отложениями амилоида, но не способствуют их разрушению. Антитела, связывающиеся с эпитопами, начинающимися от С-концевого участка и продолжающимися до остатка 10, не связываются с отложениями амилоида и не вызывают их разрушения.

Таблица 16

	Антитело	Окраши- вание	Фагоцитоз
Эпитоп	Изотип
Ν-концевое таЬ
306	1-5	1д<32Ь	+	+
1005	3-6	1дО1	+	+
22С8	3-7	1дС2а	+	+
6Е10	5-10	1дО1		-
14А8	4-10	1дС1 крысы	+	-
13-28
18С11	10-18	1дС1 крысы	-	-
266	16-24	|дб1	-	-
22012	18-21	(д(32Ь	-	-
С-концевое таЬ
2СЗ	-40	|дО1	-	-
16С11	-40/-42	|дС1	-	-
21Р12	-42	1дО2а	-	-
Иммунная сыворотка
кроличья (СРА)	1-6		+	+
мышиная (СРА)	3-7		+	+
мышиная (05-21)	3-7		+	+
обезьянья (05-21) мышиная (МАР1-7)	1-5		+ +	+ +

В табл. 17 приведены результаты исследований с различными антителами к Ав по сравнению их способности индуцировать фагоцитоз ех у1уо и редуцировать т у1уо количество бляшек в анализе пассивного переноса. Несмотря на то что антитела 16С11 и 21Р12 связываются с агрегированным синтетическим Ав-пептидом с высокой авидностью, эти антитела не способны реагировать с в-амилоидными бляшками в нефиксированных срезах мозга, не инициируют фагоцитоза ех у1уо и не обладают эффективностью т у1уо. Антитела 10Б5, 3Б6 и поликлональные антитела к Ав активны во всех трех экспериментах. Антитела 22С8 связываются более прочно с аналоговой формой природного Ав, в котором аспарагиновая кислота в положениях 1 и 7 замещена изоаспарагиновой кислотой. Эти результаты показывают, что эффективность т уИго обусловлена непосредственной способностью антител опосредовать разрушение бляшек в С№, и исследования ех у1уо предопределяют эффективность т у1уо.

- 38 021614

Αналогичное исследование было проведено для тестирования антитела к фрагменту синуклеина, обозначенному ЫАС, опосредовать разрушение амилоидных бляшек. Как было показано, синуклеин является амилоидным белком, ассоциированным с бляшками. Обеспечивают взаимодействие антитела к ЫАС с образцом ткани головного мозга, содержащим амилоидные бляшки, и клетками микроглии, как описано выше. В качестве контроля исследуют сыворотку кролика. Последующий анализ выявляет значительную редукцию числа и размеров амилоидных бляшек, что свидетельствует о способности тестируемого антитела опосредовать их разрушение.

Таблица 17. Исследование ех νίνο предопределяет эффективность антитела ш νίνο

Антитело Изотип	Авидность к агрегированному Αβ(ρΜ)	Связывание с амилоидными бляшками	Эфф екти вн ость ех νίνο	Эффективность ίη νίνο
Монокл.
3ϋ6	1дС2Ь	470	+	+	+
ЦЮ5	1дО1	43	+	+	+
16С11	1дО1	90	-	-	-
21Р12	1дО2а	500	-	-	-
ТМ2а	1®О1	-	-	-	-
Поликл.
1-42 смешанный 600	+		+

Для подтверждения того, что Αβ интернализуется во время исследований ех νίνο, используют конфокальную микроскопию. В присутствии контрольных антител экзогенные клетки микроглии остаются в конфокальной плоскости выше ткани и в пределах анализируемого препарата не обнаруживается фагоцитарных везикул, содержащих Αβ, и бляшки остаются интактными. В присутствии 10Ό5 почти весь материал бляшек содержится в везикулах экзогенных клеток микроглии. Для определения дальнейшей судьбы интернализованного пептида культуры, обработанные 10Ό5, экстрагируют 8М мочевиной в различные точки времени и анализируют вестерн-блоттингом. В точку времени, соответствующую 1 ч, когда еще не происходил фагоцитоз, реакция с поликлональным антителом к Αβ выявляла четкую 4-кД полосу (соответствующую Αβ-пептиду). Αβ-иммунореактивность уменьшалась в день 1 и отсутствовала в день 3. Таким образом, опосредованный антителами фагоцитоз Αβ приводит к его разрушению.

Для определения того, опосредуется ли фагоцитоз в исследованиях ех νίνο Рс-участками, получали фрагменты Р(аЬ)'2 антитела 3Ό6 к Αβ. Несмотря на то что Р(аЪ)'2-фрагменты сохраняют в полной мере способность к взаимодействию с бляшками, они не могут запускать фагоцитоз клетками микроглии. Кроме того, фагоцитоз с целыми антителами может быть блокирован реагентом, направленным к Рсрецепторам 1д мыши (анти-СИ 16/32). Указанные данные свидетельствуют о том, что ш νίνο разрушение Αβ происходит за счет опосредованного Рс-рецепторами фагоцитоза.

XV. Перенос антител через гематоэнцефалический барьер

В этом эксперименте определяют концентрацию антител в головном мозге после их внутривенной инъекции в участках периферической ткани нормальным мышам и мышам РИАРР. Мышей РИАРР или контрольных нормальных мышей перфузируют 0,9% ЫаС1. Участки мозга (гиппокампа или коры) рассекают и сразу же замораживают. Мозг гомогенизируют в 0,1%-ном Тритоне вместе с ингибиторами протеазы. Иммуноглобулин определяют в экстрактах методом ЕЫ8А. В качестве захватывающего реагента для покрывания ЫА-планшетов используют РаЬ'2-фрагменты антител козы к 1д мыши. Сыворотку или экстракты мозга инкубируют в планшетах 1 ч. Изотипы определяют с помощью конъюгатов антител к 1дО1 мыши с НКР или антител к 1дО2а или 1дО2Ь мыши, конъюгированных с НКР (Са1 !ад). Αнтитела, независимо от изотипа, определяются в СЫ§ в концентрации такой же, как и в крови. Например, когда концентрация 1дО1 в крови в три раза выше, чем 1дО2а, концентрация 1дО2а в мозге в три раза выше; оба антитела обнаруживаются на уровне 0,1% от их ожидаемых уровней в крови. Полученные результаты одинаковы как для трансгенных, так и для нетрансгенных мышей; таким образом, у мышей РИАРР не существует уникальной проницаемости гематоэнцефалического барьера.

XVI. Терапевтическая эффективность Αβ пептида в МАР конфигурации

Исследования терапевтической эффективности комплекса адъювант/иммуноген осуществляли на самках и самцах 9-10,5-месячных гетерозиготных трансгенных мышей РИАРР. В качестве иммуногена использовали белок слияния, содержащий Αβ 1-7 в тетрамерной МΑΡ-конфигурации, как описано выше. Продолжительность исследования составляла 25 недель, число животных в группе было 29-40, таким образом, в конце исследования возраст животных составлял 15-16,5 месяцев. В данном эксперименте использовали ту же самую методологию, что и для исследований терапевтической эффективности различных адъювантов, как описано выше в примере VIII. Группы обработки охарактеризованы ниже в табл. 18.

- 39 021614

Таблица 18

Способ введения	Адъювант	Иммуноген	Буфер разведения
Группа 1 ΙΡ (400 мкл)	СРА/1РА	МАР (АВ 1-7:ТТ) (ЮОмкг)	РВЗ
Группа 2 ЗС (250 мкл)	05-21	ΑΝ 1792-ОСЗ (75 мкг)	РВЗ
Группа 3 ЗС (250 мкл)	РВЗ	-	-

Примечание

МАР - мультиантигенный пептид; ТТ - клеточный эпитоп токсоида столбняка (830-844); 8С - подкожно; 1Р - интраперитонеально; РВ8 - фосфатный буферный раствор; С8С - состав, содержащий глицин/цитрат/сахарозу.

Схема иммунизации была идентичной для всех групп обработки. Мышей инъецировали в недели 0, 2, 4, 8, 12, 1б, 20, 24. Кровь забирали в недели 3, 5, 9, 13, 17, 21 и 25. Группы 1, 2, 3, 4 и б получали 8 инъекций, группы 2 и 3 (Ρ821ΜΝ 1792 и РВ8) служили положительным и отрицательным контролями в данном исследовании.

Титры определяли в исследовании титров антител к Αβ.

Группа 1 (СРΛ/IРА:МΛΡ(ΑЯ 1-7:ТТ)) имела низкие уровни титров. Пик СМТ обнаруживался только через 13 недель и имел значение не выше 1200. Далее к 25 неделе значение СМТ падало до б00. У 3 из 30 животных не обнаруживалось никакого повышения титров антител, а у 7 животных они не превышали значения 400 к концу исследования.

Группа 2 (0821^0 1792) служила контролем. Пиковое значение титров антител достигало значения СМТ 1б,000 к 17 неделе. Затем в течение следующих 8 недель значение титра падало до величины СМТ 8,700. У одного животного из группы вообще не обнаруживалось повышения титра антител во время всего эксперимента.

Группа 3 (РВ8) служила отрицательным контролем. Титры антител не выявлялись.

У животных всех групп по сравнению с группой РВ8 в коре головного мозга уровни Αβ были существенно ниже (табл. 19). В группе СРΛ/IРА:МΛΡ (Αβ 1-7) уровень Αβ был значительно меньше, чем у животных контрольной (РВ8) группы, в то время как титры антител к Αβ были очень низкими.

Таблица 19. Уровни Αβ в коре

	РВЗ	МАР	03-21
СРЕДНЕЕ (нг/г ткани)	7,335	3,692	2,389
РАЗБРОС (нг/г ткани)	550-18,358	240-10,782	210-11,167
Значение р	-	0,0003	<0,0001
N	38	30	34

В заключение следует отметить, что иммуноген Αβ 1-7 МАР эффективно индуцирует достаточный иммунный ответ, чтобы отложения Αβ в коре головного мозга разрушались.

XVII. Эпитопное картирование иммуногенного ответа на Αβ у обезьян

Данный пример анализирует ответ приматов на иммунизацию АN 1792 (т.е. Αβ 1-42). Одиннадцать групп обезьян (по 4 животных одинакового пола в группе) иммунизировали АN 1792 (75 или 300 мкг/дозу) в сочетании с 08-21 (50 или 100 мкг/дозу) или 5%-ной стерильной декстрозой в воде (Ό5\ν, контрольная группа). Все животные получали внутримышечные инъекции в соответствии с одной из трех схем, приведенных в табл. 20, в целом включающей 4,5 или 8 доз. Образцы сыворотки собирали на 175-й день исследования (4 животных), а образцы С8Р (3 животных) собирали на 17б-й день (некропсия осуществлялась на б-й месяц) и оценивали на их способность связываться с пептидом Αβ 1-40 и ΑΡΡ.

- 40 021614

Таблица 20

Номер группы	Схема4	Обезьяны (самцы/ самки)	Доза ΑΝ 1792 (мкг/доза)	Доза <28-21 (мкг/доза)	Путь введения дозы
1°	1	4/4	0	0	в/м
2	1	4/4	Носитель'	50	в/м
3	1	4/4	Носитель	100	в/м
4	1	4/4	75	50	в/м
5	1	4/4	300	50	в/м
6	1	4/4	75	100	в/м
7	1	4/4	300	100	в/м
8	2	4/4	75	100	в/м
9	2	4/4	300	100	в/м
10	3	4/4	75	100	в/м
11	3	4/4	300	100	в/м

Примечание ^а Схема 1, дни введения дозы: 1, 15, 29, 57, 85, 113, 141, 169. Схема 2, дни введения дозы: 1, 43, 85, 169.

^Ь Контрольная группа. Инъекции Б5А.

^с Носитель содержит буфер с глицином/цитратом/сахарозой, который является носителем для АЛ 1792.

Точный ряд линейных пептидов, распознаваемых антителами в образцах сыворотки животных, иммунизированных ΆN 1792, определяли методом ЕЫ8А, который обнаруживал связывание указанных антител с перекрывающимися пептидами, которые соответствуют целой последовательности Αβ 1-42. Биотинилированные пептиды с частичными последовательностями ΆN 1792 получают от СЫгоп ТесНпо1од1ез. Они содержат 10 аминокислот с перекрыванием 9 остатков и имеют шаг в один остаток на пептид (№ 5366, 5331 и 5814). Первые три пептида (от положения восьмой аминокислоты выше Ν-концевого участка АИ 1792 по направлению к 24 аминокислоте ΆN 1792) биотинилировали на С-концевом участке с помощью линкера О6К. Последние 10 пептидов (повторяющие 32-й пептид предыдущего набора) биотинилировали на Ν-концевом участке линкером, представляющим собой ЕОЕО (8ЕО ГО ΝΟ: 76). Лиофилизированные биотинилированные пептиды растворяют в ИМ8О в концентрации 5 мМ. Полученные исходные растворы пептидов разводят до 5 мкМ в ТТВ8 (0,05% Твина 20, 25 мМ Трис-НС1, 137 мМ №С1, 5.1 мМ КС1, рН 7,5). 100-мкл аликвоты указанного 5 мкМ раствора вносят в повторах в лунки 96луночных планшетов для микротитрования, покрытые стрептавидином (Р1егае). Планшеты инкубируют 1 ч при комнатной температуре и далее 4 раза отмывают ТТВ8. Образцы сыворотки разводят в предназначенном для них разбавителе без азида для нормализации титров и 100 мкл каждого раствора вносят в лунки. Планшеты инкубируют 1 ч при комнатной температуре и четыре раза отмывают ТТВ8. Конъюгированные с НКР антитела козы к человека (1аск§оп ЕптипоКехеагсН) разводят в соотношении 1:10,000 в разбавителе для образцов без азида и добавляют по 100 мкл раствора в каждую лунку. Планшеты опять инкубируют и отмывают. Для развития цветной реакции в каждую лунку добавляют по 100 мкл ТМВ (Р1ег8е) и осуществляют инкубацию в течение 15 мин до внесения 30 мкл 2н. Н₂8О₄ для остановки реакции. Оптическую плотность определяют при 450 нм на цветовом считывателе планшетов Vтаx или 8рес1га тах.

Иммунизация ΆN 1792 приводит к образованию антител у 100% животных во всех группах, получавших препарат, к дню 175. Средние титры в группах варьируют в пределах 14596-56084. Существует тенденция к повышению титров в процессе иммунизации в присутствии более высокой концентрации антигена и/или адъюванта, однако не было статистически значимого различия, обусловленного высокой вариабельностью ответов на иммунизацию у отдельных животных.

Сыворотка, которая была положительной в отношении антител к АЛ 1792, также была положительной по антителам к Αβ 1-40. Средние титры в группах варьировали от 36867-165991, и в отношении титров к ΆN 1792 не выявлялось статистически значимых различий между группами к дню 175. Связывание к ΆN 1792 обнаруживает высокоположительную корреляцию (8реагтап, г=0,8671) со связыванием с Αβ 1-40.

Из 48 обезьян, иммунизированных в соответствии с различными схемами АЛ 1792, использовали 33 образца С8Р одинакового объема и качества для анализа. У 32 обезьян (97%) выявлялись положительные титры к АИ 1792. Значения титров варьировали от 2 до 246, среднее значение составляло 49,44±21,34. Уровни антител к ΆN 1792 в С8Р составляли 0,18±0,11% от тех, которые были измерены в сыворотке и имели высокоположительную корреляцию (8реагтап, г=0,7840) с титрами в сыворотке. Никаких различий не было выявлено между группами или между самцами и самками в отношении процентного содержания антител в С8Р. Уровень антител в С8Р соответствовал пассивному переносу периферически образованных антител через гематоэнцефалический барьер в центральную нервную систему.

- 41 021614

Тестирование набора положительных по антителам к АЫ 1792 образцов СδР показало, что подобно антителам в образцах сыворотки антитела в СδР перекрестно реагируют с Ав 1-40. Титры к Ав обнаруживают высокую корреляцию (Среагтап, г=0,9634) с титрами к АЫ 1792. Титрование набора образцов СδР с наиболее высокими титрами к АЫ 1792 выявило отсутствие связывания с АРР, как и в случае сывороточных антител.

Когда сыворотку, отобранную на 175-й день, тестировали против набора перекрывающихся пептидов из 10 аминокислот, антитела всех обезьян связывались с пептидом, последовательность которого перекрывала аминокислоты 1-10 пептида АЫ 1792 (аминокислоты 653-672 АРР). У некоторых животных это был только один пептид, с которым было определено связывание (см. фиг. 19).

У других животных измеряются другие показатели, но во всех случаях реактивность по отношению к Ы-концевой пептидной последовательности доминирует. Дополнительные реакционные способности подразделяются на две группы. Первая и наиболее распространенная - это способность связывать пептиды, центром которых является Ы-концевой пептид 1-10 АЫ 1792 (фиг. 20). Связывание этого типа направлено на пептиды с аминокислотами 1-8, 1-9 и 2-11 пептида АЫ 1792. Такая реакционная способность, объединенная с реактогенностью к пептиду 1-10, отражает преобладающую реакционную способность у всех животных. Эпитопное картирование индивидуальных животных с течением времени показывает, что реактогенность антител к пептиду 1-10 распространяется на соседние пептиды. Такие результаты указывают на строгую направленность иммунного ответа к Ы-концевому участку пептида АЫ 1792 со свободным концевым остатком аспарагиновой кислоты. Вторая минорная активность, выявляемая у некоторых животных, - это связывание с пептидами, локализованными С-терминально к основной области и сгруппированными вокруг пептидов с аминокислотами 7-16, 11-20 и 16-25 пептида АЫ 1792. Такая реактогенность наблюдается только у 10-30% обезьян.

Вариабельность в ответах среди различных животных (например, являются ли аминокислоты 1-10 исключительным или преобладающим реактогенным эпитопом) не коррелирует с дозой антиген/адъювант, схемой дозирования или титром антител и, возможно, является отражением индивидуальных генетических особенностей каждого животного.

XVIII. Профилактика и лечение заболеваний человека

Для определения безопасности препаратов для человека проводили испытания фазы I при использовании определенной дозы. Терапевтический агент вводили в возрастающих дозах различным пациентам, начиная от около 0,01 уровня предполагаемой эффективности и увеличивая дозу с троекратным шагом до тех пор, пока уровень примерно в 10 раз не превысит эффективную дозу для мышей.

Испытания фазы II проводились для оценки терапевтической эффективности. Пациенты с болезнью Альцгеймера от ранней до умеренной тяжести, определенные как страдающие от болезни Альцгеймера и подходящие по критериям Ассоциации родственных заболеваний (БААРЗ) с возможным развитием БА были отобраны. Такие пациенты проходят тестирование по разряду 12-26 оценки минимальной ментальной способности (ΜΜδЕ, от англ. Μ^η^-Μеηιа1 δΡιΕ Ехат). Одним из критериев отбора была способность пациентов успешно выдерживать все испытания и избегать осложнений, таких как применение медикаментов, которые могли бы исказить результаты исследований. Базовыми значениями оценки способностей пациентов служили классические психометрические показатели, такие как ΜΜδЕ и Α^Αδ, которые являются адекватной шкалой испытаний состояния и функциональных особенностей пациентов с АБ. Указанные психометрические показатели обеспечивают оценку прогрессивного развития БА. Подходящие качественные критерии также могут быть использованы для контроля лечения. Прогресс заболевания можно контролировать и с помощью ΜΡΙ. Оценивается и состояние крови, в том числе наличие специфических к иммуногену антител, а также способность к Т-клеточному ответу.

После измерения базовых показателей пациенты начинают получать лечение. Их выбирают случайным образом и назначают терапевтический агент либо плацебо слепым методом. Больных контролируют по крайней мере каждые 6 месяцев. Эффективность лечения оценивают по значительной редукции прогресса заболевания у больных, получавших активный препарат, по сравнению с плацебо.

Испытания фазы II осуществляют для оценки конверсии у пациентов от состояния с ранней потерей памяти, не связанной с болезнью Альцгеймера, иногда ассоциированной с недостаточностью памяти возрастного характера (ΑΑΜI) или со средней когнитивной недостаточностью (Μί'Ί) к возможному развитию болезни Альцгеймера, как определено в соответствии с критерием БААРЗ (см. выше). Пациенты с большой вероятностью риска развития болезни Альцгеймера отбирают из числа людей, у которых отсутствуют клинические проявления заболевания, путем скрининга на ранние свидетельства потери памяти или других осложнений, связанных с симптоматологией, предшествующей БА, а также на основе факторов генетического риска, возраста, пола и других признаков, которые, как показано, предопределяют высокую степень риска возникновения БА. Получают базовые значения соответствующих данных, включая ΜΜδЕ и Α^Αδ, которые вместе с другими показателями служат для оценки популяций более здоровых людей. Такие популяции подразделяют на подходящие группы, которым назначают плацебо по сравнению с активным агентом. Такие популяции людей отбирают последовательно каждые 6 месяцев и конечная точка наблюдения за каждым пациентом - это развитие или отсутствие возможной БА, как оценивается с помощью критерия БААРЗ, по завершении исследования.

- 42 021614

XIX. Основные материалы и методы

1. Измерение титров антител

У мышей забирают кровь через хвостовую вену в общем количестве около 200 мкл в пробирку для центрифугирования. У морских свинок забираю кровь, сбривая шерсть в области спины и используя иглу № 18, которую вводят в метатарзальную вену. Кровь собирают в пробирку для центрифугирования. Кровь оставляют для свертывания в течение 1 ч при комнатной температуре, перемешивают на вортексе и центрифугируют при 14000д в течение 10 мин для отделения сгустка от сыворотки. Затем сыворотку переносят в чистую пробирку для микроцентрифугирования и хранят при 4°С до титрования.

Титры антител определяют методом ЕЫ3А. 96-Луночные планшеты для микротитрования (Сов1аг Е1А) покрывают 100 мкл раствора, содержащего 10 мкг/мл Ав 42 или 3АРР или других антигенов, как указано в каждой из индивидуальных сообщений, в буфере для покрытия лунок (0,1М фосфат натрия, рН 8,5, 0,1% азид натрия) и выдерживают в течение ночи при комнатной температуре. Затем из лунок отсасывают жидкость и в лунки добавляют сыворотку, начиная с разведения 1/100 в буфере для разведения образцов (0,014М фосфат натрия, рН 7,4, 0,15М №С1, 0,6% БСА, 0,05% тимерозал). Смесь последовательных разведений образцов добавляют непосредственно в лунки планшетов с трехкратным шагом до конечного разведения 1/218,700. Разведения инкубируют в покрытых лунках в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты отмывают 4 раза РВ3, содержащим 0,05% Твина 20. Второе антитело, антитело козы к 1д мыши, конъюгируют с пероксидазой хрена (ВосЬттдег МаппНеип) и добавляют в лунки в количестве 100 мкл в разведении 1/3000 в буфере для разведения образцов и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты снова отмывают 4 раза в РВ3, Твине 20. Для развития окраски в каждую лунку добавляют по 100 мкл 31о\у ТМВ (3,3',5,5г-тетраметилбензидина, Р1егве СЬетюак) и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливают добавлением 25 мкл 2М Н₂3О₄. Интенсивность окраски оценивают на автоматическом устройстве Мо1еси1аг Эеуюез V тах при 450-650 нм.

Титры определяют как реципрокные разведения сыворотки, дающие '/₂ максимального значения ΟΌ. Максимальное значение ΟΌ обычно получают, исходя из первоначального разведения 1/100, за исключением случаев с очень высокими титрами; в этих случаях для установления максимального значения ΟΌ необходимо более высокое начальное разведение. Если 50%-ная точка попадает между двумя разведениями, для вычисления конечного титра проводят линейную экстраполяцию. Для определения средних значений геометрических титров титры менее 100 автоматически считают значением титра, равным 25.

2. Исследование пролиферации лимфоцитов

Мышей анестезируют изофлураном. Селезенки удаляют и отмывают дважды 5 мл РВ3, содержащим 10% инактивированной нагреванием сыворотки плода коровы (РВ3-РВ3), и затем гомогенизируют при 50°С в пробирке Сепйтсоп (Эако А/3, Эептагк) в 1,5 мл РВ3-РВ3 в течение 10 с при 100 грт в устройстве МейипасЫпеЦако) с последующим фильтрованием через найлоновый фильтр с размером пор 100 мкм. Спленоциты один раз отмывают 15 мл РВ3-РВ3 и осаждают центрифугированием при 200д в течение 5 мин. Эритроциты лизируют путем ресуспендирования осадка в 5 мл буфера, содержащего 0,15М ΝΗ₄Ο, 1М КНСО₃, 0,1М ХаБЭТА, рН 7,4, в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем отмывают лейкоциты, как описано выше. Свежевыделенные клетки селезенки (10⁵ клеток на лунку) культивируют в троекратных повторах в 96-луночных планшетах для микротитрования с И-образным дном (Согтпд, С’атЬпйде, МА) в среде КРМ1 1640 (1КН Вюваепсев, Ьепеха, К3) с добавлением 2,05 мМ Ьглутамина, 1% пенициллин/стрептомицина и 10% инактивированной нагреванием РВ3 в течение 96 ч при 37°С. Различные пептиды Ав 1-16, Ав 1-40, Ав 1-42 или Ав 40-1 (белок с обратной последовательностью) добавляют в лунки в дозах, составляющих от 5 до 0,18 мкМ, в 4 этапа. Клетки в контрольных лунках культивируют с Конканавалином А (Соп А) (3|дта, кат № С-5275, 1 мкг/мл) без добавления белка. Затем клетки пульсово обрабатывают в течение 24 ч ³Н-тимидином (1 мкКи/лунку, АтегвсЬат Согр., Аг1тд1оп НещШз 1Ь). Затем клетки собирают на планшеты ИтРФег и обсчитывают в сцинцилляторном счетчике Тор Соип! Мюгор1а1е (Раскагй Гпвйитейв, Эо^пегз Сгоуе, 1Ь). Результаты выражают числом радиоактивных импульсов в минуту (срт) по включению в нерастворимые макромолекулы.

4. Приготовление тканей мозга

После эвтаназии удаляют головной мозг и одно полушарие подготавливают для гистохимического анализа, в то время как из другого полушария приготавливают срезы гиппокампа, коры и мозжечка для определения концентрации различных белков Ав и форм АРР при использовании специфического ЕЫ3А ИоНпзоп-ТОоой е! а1., см. выше).

Ткани для ЕЫ3А гомогенизируют в 10 объемах охлажденного на льду гуанидинового буфера (5,0М гуанидин-НС1, 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0). Гомогенаты перемешивают аккуратно на приборе Айатв ΝιιΡι1ог (ИвЬег) 3-4 ч при комнатной температуре и далее хранят при -20°С до количественной оценки Ав и АРР. Предварительные эксперименты показали, что аналиты стабильны при таких условиях хранения и что синтетический белок Ав (ВасЬет) может быть количественно извлечен из гомогенатов головного мозга контрольного помета мышей ОоЬпзоп-ТОоой е! а1., см. выше).

- 43 021614

5. Измерение уровней Αβ

Гомогенаты головного мозга разводят в соотношении 1:10 охлажденным со льдом казеиновым разбавителем (0,25% казеина, РВ8, 0,05% азида натрия, 2 мкг/мл апротинина, % мМ ЭДТΑ, рН 8,0, 10 мкг/мл лейпептина) и центрифугируют при 1б,000 д в течение 20 мин при 4°С. Синтетические стандарты Αβ белка (1-42 аминокислоты) и стандарты ΑΡΡ приготавливают с включением 0,5М гуанидина и 0,1% БСΑ в конечный состав. В сэндвичевом ЕЫ8А общего Αβ используют моноклональные антитела 2бб, специфичные к аминокислотам 13-28 Αβ (8еиЬег1 е! а1.), в качестве захватывающего антитела и биотинилированное моноклональное антитело 3Ό6, специфичное к аминокислотам 1-5 Αβ (йойщоп^оой е! а1.) в качестве репортерного антитела. Моноклональное антитело 3Ό6 не распознает секретируемую форму ΑΡΡ или полноразмерную форму ΑΡΡ, а выявляет только типы Αβ с амино-концевой аспарагиновой кислотой. Указанное исследование имеет низкий предел чувствительности ~ 50 нг/мл (11 нМ) и не выявляет перекрестной реактивности к эндогенному белку Αβ в концентрации до 1 нг/мл (йойщоп^оой е! а1., см. выше).

Сэндвич-ЕЫ8А, специфичный по отношению к Αβ 1-42, подразумевает использование тАЬ 21Р12, специфичных к аминокислотам 33-42 Αβ (йойщоп^оой е! а1.) в качестве захватывающего антитела. Биотинилированное тАЬ 3Ό6 в этом исследовании также служит репортерным антителом. Нижний предел чувствительности данного метода составляет около 125 мкг/мл (28 мкМ, 1о1иъоп^оой е! а1.). Для Αβ ЕЫ8А 100 мкл тАЬ 266 (10 мкг/мл) или тАЬ 21Р12 (5 мкг/мл) покрывают лунки 9б-луночных планшетов для иммуноанализа (^δ^τ) путем инкубирования в течение ночи при комнатной температуре. Ρаствор удаляют аспирацией и лунки блокируют добавлением 200 мкл 0,25% БСΑ в РВ8 по крайней мере в течение часа при комнатной температуре. Удаляют блокирующий раствор и планшеты хранят высушенными при 4°С до использования. Планшеты обрабатывают отмывающим буфером (забуференный Трисом раствор (0,15 №С1, 0,01М Трис-НС1, рН 7,5) и 0,05% Твина 20) перед использованием. Образцы и стандарты добавляют в аликвотах по 100 мкл в лунки (троекратный повтор) и проводят инкубацию в течение ночи при 4°С. Планшеты отмывают по крайней мере три раза буфером для отмывания между этапами исследования. Затем в лунки добавляют биотинилированное тАЬ 3Ό6, разбавленное до концентрации 0,5 мкг/мл в буфере с казеином (0,25% казеина, РВ8, 0,05% Твина 20, рН 7,4), и проводят инкубирование в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее в лунки вносят конъюгат авидина с пероксидазой хрена (Ау1йш-НКР, Vесΐο^, ВигНпдате, СΑ), разведенный 1:4000 в буфере с казеином, на 1 ч при комнатной температуре. Цветовой субстрат 81о\у ТМВ-ЕЫ8А (Р1егее) добавляют в лунки и оставляют для развития реакции на 15 мин при комнатной температуре и далее ферментную реакцию останавливают добавлением 25 мкл 2 н. Н₂8О₄. Продукт реакции количественно оценивают с помощью устройства Мо1еси1аг ^еν^сеδ V тах, измеряя разность поглощения при 450 и 650 нм.

6. Измерение уровней ΑΡΡ

Используют два различных исследования ΑΡΡ. Первое, обозначенное АРР-а/РЬ, распознает ΑΡΡальфа (а) и полноразмерную форму (РЬ) ΑΡΡ. Второе исследование специфично для ΑΡΡ-α. Исследование АРР-а/РЬ распознает секретируемую форму ΑΡΡ, включая первые 12 аминокислот Αβ. Поскольку репортерное антитело (2Н3) не специфично к сайду разрезания а, расположенному между аминокислотами 612-613 ΑΡΡ695 ^сй е! а1., 8аеще 248, 1122-1124 (1990)), в указанном анализе также распознается полноразмерная форма ΑΡΡ (АРР-РЬ). Предварительные эксперименты, использующие иммобилизованные ΑΡΡ-антитела к цитоплазматическому хвосту АРР-РЬ для истощения АРР-РЬ в гомогенатах мозга, позволяют предположить, что примерно 30-40% АРР-а/РЬ приходится на РЬ (данные не показаны). В качестве захватывающего антитела в исследованиях АРР-а/РЬ и ΑΡΡ-а используют тАЬ 8Е5, направленное к аминокислотам 444-592 формы ΑΡΡ695 (Сатеδ е! а1., см. выше). Ρепортерным тАЬ в исследовании АРР-а/РЬ является антитело 2Н3, специфичное к аминокислотам 597-608 ΑΡΡ695 (йойщоп^оой е! а1., см. выше), а репортерным антителом в исследовании ΑΡΡ-а является биотинилированное производное тАЬ 1бН9, направленное к аминокислотам б05-б11 ΑΡΡ. Нижний предел чувствительности исследования ΑΡΡ-аМД составляет около 11 нг/мл (150 пкМ) ОойщопМоой е! а1.), а для исследования ΑΡΡ-а - 22 нг/мл (0,3 нМ). В обоих ΑΡΡ-исследованиях тАЬ 8Е5 адсорбируют в лунках 9б-луночного планшета для микротитрования Е1А, как описано выше для тАЬ 266. Очищенную, рекомбинантно секретируемую форму ΑΡΡ-а используют в качестве референс-стандарта для исследования ΑΡΡ-а и АРРа/РЬ ^сй е! а1., см. выше). Образцы гомогенатов мозга в 5М гуанидине разводят в соотношении 1:10 в буфере для разведения образцов для ЕЫ8А (0,014М фосфатный буфер, рН 7,4, 0,6% БСΑ, 0,05% тимерозал, 0,5М №С1, 0,1% №40). Затем их разводят в соотношении 1:4 в буфере для образцов, содержащем 0,5М гуанидин. Ρазбавленные гомогенаты центрифугируют при 16,000 д в течение 15 с при комнатной температуре. Стандарты и образцы ΑΡΡ добавляют в лунки планшетов в двухкратном повторе и осуществляют инкубирование в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Ρепортерное биотинилированное антитело 2Н3 или 16Н9 инкубируют с образцами в течение 1 ч при комнатной температуре. Стрептавидин-алкалин фосфатазу (Воейтшдет Маппйеш), разведенную 1:1000 в буфере для разведения образцов, инкубируют в лунках в течение 1 ч при комнатной температуре. Флуоресцентный субстрат 4-метил- 44 021614 умбеллиферил-фосфат добавляют в лунки на 30 мин при комнатной температуре и планшеты считывают на флуориметре Су!ойиог 1т 2350 (Мййроге) при 360 нм (возбуждение) и 450 нм (эмиссия).

7. Иммуногистохимия

Головной мозг фиксируют в течение 3 дней при 40°С в 4%-ном параформальдегиде в РВ8 и далее хранят 1-7 дней при 4°С в 1%-ном параформальдегиде, РВ8 до приготовления срезов. Срезы толщиной 40 мкм приготавливают на вибратоме при комнатной температуре и хранят в криопротекторе (30% глицерола, 30% этиленгликоля в фосфатном буфере) при -20°С до иммуногистохимического использования. В случае каждого головного мозга 6 срезов на уровне дорзального гиппокампа, сделанные с последовательными 240-мкм промежутками, инкубируют в течение ночи с одним из следующих антител: а) биотинилированным анти-Ав ^Α^ 3Ό6, специфичным к Ав человека), разведенным в концентрации 2 мкг/мл в РВ8 и 1%-ной сыворотке лошади; б) биотинилированным тΑЬ, специфичным к АРР человека, 8Е5, разведенным в концентрации 3 мкг/мл в РВ8 и 1 %-ной сыворотке лошади; в) тΑЬ, специфичным к глиальному фибриллярному кислому белку (ΟРΑР; 81дта Сйетюа1 Со.), разведенным 1:500 0,25%-ным Тритоном Х-100 и 1%-ной сывороткой лошади в Трис-буферном растворе, рН 7,4 (РВ8); г) тΑЬ, специфичным к СП 11Ь, МΑС-1 антигену (СНеписоп ЕиетаЦопаО, разведенным 1:100 0,25%-ным Тритоном Х100 и 1%-ной сывороткой кролика в ТВ8; д) тΑЬ, специфичным к антигену МНС II (РНагнипдеп), разведенным 1:100 0,25%-ным Тритоном Х-100 и 1%-ной сывороткой кролика в ТВ8; е) тΑЬ крысы, специфичным к СЭ43 (РНагттдеп), разведенным 1:100 1%-ной сывороткой кролика в РВ8; ж) тΑЬ крысы, специфичным к СО 45ΚΑ (РНагттдеп), разведенным 1:100 1%-ной сывороткой кролика в РВ8; з) моноклональным Ав крысы, специфичным к СО 45РВ (РНагттдеп), разведенным 1:100 1%-ной сывороткой кролика в РВ8; и) моноклональным Ав крысы, специфичным к СЭ45 (РНаГгттдеп), разведенным 1:100 1%-ной сывороткой кролика в РВ8; к) биотинилированным поликлональным Ав хомячка, специфичным к СЭ3е (РНагттдеп), разведенным 1:100 1%-ной сывороткой кролика в РВ8; л) тΑЬ крысы, специфичным к СЭ3 (8его!ес), разведенным 1:200 1%-ной сывороткой кролика в РВ8; м) раствором РВ8 в 1%-ной сыворотке лошади, не содержащим первого антитела.

Срезы для реакции с растворами а)-б) и е)-м), как указано выше, предварительно обрабатывают 1%ным Тритоном Х-100, 0,4%-ным пероксидом водорода в РВ8 в течение 20 мин при комнатной температуре для блокирования эндогенной пероксидазы. Далее их инкубируют в течение ночи при 4°С с первым антителом. Срезы для реакции с 3Ό6 или 8Е5, или СЭ3е тΑЬ8 далее обрабатывают в течение 1 ч при комнатной температуре комплексом авидин-биотин-пероксидаза хрена с компонентами набора А и В, разведенным 1:75 в РВ8 (УесЮг Е1Не 81апбагб Κίΐ, УесЮг ЬаЬк, Вийшдате, СΑ). Срезы для реакции с антителами, специфичными к СО 45ΚΑ, СО 45КВ, СЭ45, СЭ3, и раствором РВ8 без первого антитела инкубируют 1 ч при комнатной температуре с биотинилированным !д к !дО крысы (УесЮг), разведенным 1:75 в РВ8, или биотинилированным к !дО мыши (УесЮг), разведенным 1:75 в РВ8. Далее срезы обрабатывают в течение 1 ч при комнатной температуре с комплексом авидин-биотин-пероксидаза хрена с компонентами набора А и В, разведенным 1:75 в РВ8 (УесЮг Е1Не 81апбагб Κίΐ, УесЮг ЬаЬк, ВигПпдате, СΑ).

Срезы обрабатывают 0,01%-ным пероксидом водорода, 0,05%-ным 3,3'-диаминобензидином (ΩΑΕ) при комнатной температуре. Срезы для инкубирования с антителами, специфичными к ΟΕΑΕ, МАС-1 и МНС II, предварительно обрабатывают 0,6%-ным пероксидом водорода при комнатной температуре для блокирования эндогенной пероксидазы и затем инкубируют в течение ночи с первым антителом при 4°С. Срезы для реакции с ΟΕΑР-антителом инкубируют 1 ч при комнатной температуре с биотинилированным [д лошади к мыши (УесЮг ЬаЬогаЮйек; УесЮЧат Е1Не ΑВС Κίΐ), разведенным 1:200 ТВ8. Далее срезы обрабатывают в течение 1 ч комплексом авидин-биотин-пероксидаза хрена (УесЮг ЬаЬогаЮйек; Уес!а§!аш Е1Пе ΑВС Κίΐ), разведенным 1:1000 ТВ8. Срезы, инкубированные с моноклональными антителами к МАС-1 или МНС II в качестве первых антител, последовательно обрабатывают в течение 1 ч при комнатной температуре биотинилированным !д кролика к !дО крысы, разведенным 1:200 ТВ8, и комплексом авидин-биотин-пероксидаза хрена, разведенным 1:1000 ТВ8. Срезы, инкубированные с антителами, специфичными к ΟΕΑΕ, МАС-1 и МНС II, далее визуализируют путем обработки 0,05%-ным ΩΑΕ, 0,01%-ным пероксидом водорода, 0,04%-ным хлоридом никеля, ТВ8 в течение 4 и 11 мин соответственно при комнатной температуре.

Иммуномеченные срезы выдерживают на стеклах (У^К, 8ирегГго51 8Пбе5), высушивают на воздухе в течение ночи, погружают в Ргораг (ΑиаΐесН) и накрывают покровными стеклами при использовании в качестве поддерживающей среды Регтоип! (Р18йег).

Для противоокрашивания Ав-бляшек набор срезов, положительных по ΟΕΑΕ, выдерживают на стеклах 8ирегГго51 и инкубируют в водном 1%-ном тиофлавине 8 (ТНюЛаут 8, 81дта) в течение 7 мин и далее осуществляют иммуногистохимические исследования. Затем срезы дегидратируют и осветляют в составе Ргораг и далее накрывают покровными стеклами при использовании Регтоип! в качестве поддерживающей среды.

8. Анализ изображений

Для количественной оценки иммунореактивных препаратов используют видеометрическую систе- 45 021614 му анализа изобретений (УИеоте1пс 150 1таде Απ;·ι1ν5ί5 δу5!ет, Опсог, 1пс., СаййегеЬигд, VI), соединенную с микроскопом №соп М1сгорйо!-РХ посредством ССЭ видеокамеры и монитора §опу Тгшйгоп. Изображение среза сохраняют в видеобуфере и определяют на входе окраску и насыщение для отбора и количественного учета общей зоны иммуномеченных структур. Для каждого среза гиппокамп очерчивают вручную и количественно учитывают общую дозу меченого гиппокампа. Процент амилоидных отложений измеряют с учетом стократного увеличения (фракция гиппокампа, содержащая отложения Ав, является иммунореактивной с тΑЬ 3Ό6). Сходным образом, процент невритических отложений измеряют с учетом стократного увеличения (фракция гиппокампа, содержащая бляшки дистрофического неврита, иммунореактивна с моноклональным антителом 8Е5). Систему СЛтадшд (Сотр1ех, 1пс., СгапЬепу То\уп51ир, ΡΑ), использующую программу δίι^^ 32 δοΠ\\Γ^, соединяют с микроскопом №соп Мюгорйо!-РХ посредством камеры 1р!готс5 и используют для количественного процентного анализа области ретросплениальной коры, занятой СΡΑΡ-позитивными астроцитами и МАС-1- и МНС ΙΙ-позитивными клетками микроглии. Изображение иммунореактивного среза сохраняют в видеобуфере и определяют монохромный вход для отбора и количественной оценки общей области с иммуномеченными клетками. Для каждого среза ретросплениальную кору вручную очерчивают и проводят количественные измерения общей области ретросплениальной коры. Процент астроцитов определяют с учетом стократного увеличения (фракция ретросплениальной коры с СΡΑΡ-позитивными астроцитами). Сходным образом определяют процент микроглиоза с учетом стократного увеличения (фракция ретросплениальной коры с МАС1- и МНС ΙΙ-реактивными клетками микроглии). Для всех исследований шесть срезов на уровне дорзального гиппокампа, сделанные с 249-мкм интервалами, количественно оценивают для каждого животного. Во всех случаях терапевтический статус животного не известен осуществляющему анализ.

Несмотря на то что изобретение раскрыто в деталях для наибольшего понимания, очевидно, что могут быть сделаны его модификации в пределах заявленной формулы. Все цитируемые в описании патенты и публикации приведены исключительно посредством отсылки для всех целей.

Из указанного выше следует, что изобретение может иметь различные применения. Например, изобретение обеспечивает использование любых антител к Ав, описанных выше, для лечения, профилактики или диагностики амилоидогенной болезни или для производства лекарственного средства или композиции в тех же самых целях. Также изобретение обеспечивает использование любого эпитопного фрагмента Ав, описанного выше, для лечения или профилактики амилоидогенной болезни или для производства лекарственного средства или композиции в тех же самых целях.

Claims (19)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Фрагмент Ав, связанный с пептидом-носителем, причем пептид-носитель способствует развитию иммунного ответа, предназначенный для применения при стимулировании иммунного ответа против Ав и, таким образом, предотвращения или лечения болезни, ассоциированной с отложениями амилоида Ав в головном мозге пациента, причем фрагмент Ав состоит из:

   (ί) Ав 1-7 с аминокислотной последовательностью ΌΑΕΡΚΗΌ или (ίί) мультимера по (ί).
2. 2. Фрагмент Ав, связанный с пептидом-носителем, по п.1, отличающийся тем, что к фрагменту Ав добавлены цистеиновые остатки.
3. 3. Фрагмент Ав, связанный с пептидом-носителем, по любому из пп.1, 2, отличающийся тем, что пептид-носитель связан с С-концом фрагмента Ав.
4. 4. Фрагмент Ав, связанный с пептидом-носителем, по любому из пп.1, 2, отличающийся тем, что пептид-носитель связан с Ν-концом фрагмента Ав.
5. 5. Фрагмент Ав, связанный с пептидом-носителем, по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что пептид-носитель представляет собой сывороточный альбумин; гемоцианин фисуреллы; иммуноглобулиновую молекулу; тиреоглобулин; овальбумин;

   токсоид из патогенной бактерии; универсальный эпитоп Т-клетки; цитокин или хемокин.
6. 6. Фрагмент Ав, связанный с пептидом-носителем, по п.5, отличающийся тем, что пептид-носитель представляет собой столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, анатоксин бактерий Е. сой, анатоксин холеры, или Н. ру1оп, или токсоид, представляющий собой аттенюированное производное токсина.
7. 7. Фрагмент Ав, связанный с пептидом-носителем, по п.5, отличающийся тем, что универсальный

   - 46 021614 эпитоп Т-клетки представляет собой

   Гемагтлютинин гриппа: НА307-319 (ΡΚΥλ/ΚΟΝΤίΚίΑΤ);

   ΡΑϋΚΕ (ΑΚΧνΑΑννΓίΚΑΑΑ);

   Малярия С5: ТЗ эпитоп (ΕΚΚΙΑΚΜΕΚΑ55\/ΡΝν);

   поверхностный антиген Гепатита В: НВэАд19-28 (ЕРЫ.ТКИ-Т);

   белок температурного шока 65: П5р65 153-171 (ΟΟδίεΟίΙΑΕΑΜΟΚνΟΝΕΟ);

   бацилла Кальметта-Герена (ΟνΗΡΟΡΙΡΡΑννΚί);

   столбнячный анатоксин: ТТ830-844 (ΟΥΙΚΑΝ5ΚΗΘΙΤΕΙ.);

   столбнячный анатоксин: ТТ 947-967 (ΡΝΝΡΤνΒΠΛΑΓϊνΡΚνδΑΒΗΙΕ):

   ВИЧ др 120 Τ1(Κ0!ΙΝΜνν0Εν0ΚΑΜΥΑ).
8. 8. Фрагмент Ав, связанный с пептидом-носителем, по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что фрагмент Ав связан с пептидом-носителем химическим сшиванием.
9. 9. Фрагмент Ав, связанный с пептидом-носителем, по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что фрагмент Ав экспрессирован в виде слитого белка с пептидом-носителем.
10. 10. Фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения болезни Альцгеймера, включающая фрагмент Ав, связанный с пептидом-носителем, в соответствии с любым из пп.1-9 и один или более фармацевтически приемлемый компонент.
11. 11. Фармацевтическая композиция по п.10, включающая фармацевтически приемлемый носитель.
12. 12. Фармацевтическая композиция по п.10 или 11, включающая фармацевтически приемлемый адъювант.
13. 13. Фармацевтическая композиция по любому из пп.10-12, отличающаяся тем, что фрагмент Ав, связанный с пептидом-носителем, презентируется вирусом или бактерией.
14. 14. Фармацевтическая комбинация для лечения или предотвращения болезни Альцгеймера, включающая фрагмент Ав, связанный с пептидом-носителем, по п.1 и фармацевтически приемлемый адъювант.
15. 15. Комбинация по п.14, отличающаяся тем, что фрагмент Ав, связанный с пептидом-носителем, соединен с адъювантом.
16. 16. Комбинация по п.14, отличающаяся тем, что адъювант предназначен для введения перед или после фрагмента Ав, связанного с пептидом-носителем.
17. 17. Применение фрагмента Ав, связанного с пептидом-носителем, в соответствии с любым из пп.19 при производстве лекарственного средства для стимулирования иммунного ответа против Ав или лечения заболевания, ассоциированного с отложениями амилоида Ав в головном мозге пациента.
18. 18. Применение по п.17, отличающееся тем, что указанное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
19. 19. Применение по п.18, отличающееся тем, что пациент не обнаруживает симптомов заболевания; и/или имеет наследственные факторы риска, вызывающие предрасположенность к болезни Альцгеймера; или не имеет известных факторов риска для болезни Альцгеймера.