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KR20070073885A - 재조합 단백질 생산을 향상시키는 방법 및 조성물 - Google Patents

재조합 단백질 생산을 향상시키는 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20070073885A
KR20070073885A KR1020077010237A KR20077010237A KR20070073885A KR 20070073885 A KR20070073885 A KR 20070073885A KR 1020077010237 A KR1020077010237 A KR 1020077010237A KR 20077010237 A KR20077010237 A KR 20077010237A KR 20070073885 A KR20070073885 A KR 20070073885A
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leu
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KR1020077010237A
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마틴 시나코어
제이슨 루즈
Original Assignee
뉴랄랩 리미티드
와이어쓰
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Publication date
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Abstract

재조합 단백질 발현, 예를 들어 Aβ 펩티드 결합성 항체의 발현을 증대시키고/시키거나, 스플라이스 오류 및/또는 인트론 연속 판독 부산물을 감소시키거나 제거하도록 변형된 핵산 분자가 개시된다. 본 발명은 또한, 재조합 Aβ 펩티드 결합성 항체 발현에 적당한 세포 배양 조건 하에 상기와 같은 핵산 분자의 발현에 의해, 스플라이스 오류 및/또는 인트론 연속 판독 부산물이 없는 Aβ 펩티드 결합성 항체를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

재조합 단백질 생산을 향상시키는 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMPROVING RECOMBINANT PROTEIN PRODUCTION}
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원서는 2004년 10월 5일에 출원되고 내용 전체가 본원에 참조로서 인용된 미국 특허출원 연재 제60/616,474호에 대한 우선권을 주장한다.
배경기술
재조합 단백질의 생산을 위한 발현 벡터는 적어도 1980년대 중간부터 존재해 왔다. 전형적으로, 재조합 단백질 발현을 위한 벡터 이용 전략은, 단백질 제제의 절대 순도가 그리 중요하지 않은 기초 연구 및 소규모 실험에서 주로 채택되어 왔다. 반면, 재조합 단백질이 치료 용도로 사용되는 경우에는, 심지어는 미미한 오염물, 예를 들어 스플라이스 오류(mis-spliced) 또는 인트론 연속 판독(intron read-through) 부산물의 존재도 수득되는 단백질 치료제의 활성 및 수율을 감소시킬 수 있다. 스플라이스 오류 또는 연속 판독 단백질 서열을 가진 단백질 치료제를 환자에게 투여하면, 바람직하지 못한 부작용의 가능성이 증가할 수 있다.
그러한 부산물은 또한 제조함에 있어서도 문제가 있다. 부산물의 존재는 정제 공정을 저해할 수 있는데, 그 이유는 그러한 부산물이 통상 크기, 친화성 또는 생활성의 측면에서 목적 단백질과 유사하기 때문이다. 또한, 재조합 숙주 세포를 이용한 단백질 발현의 규모를 증대시키면, 특히 세포가 최적 미만의 세포 배양 조건 하에서 배양되는 경우에는, 통상 목적 생성물에 비해 부산물의 양이 증가하게 됨이 관찰되었다. 그러한 최적 미만의 세포 배양 조건은 대규모 단백질 생산 중에, 예를 들어 생물발효기 가동의 종료 시에, 또는 다른 이유로 대규모 배양의 활성 상태가 열화되는 경우에, 종종 발생한다.
따라서, 재조합 단백질 생산, 특히 단백질 치료제의 대규모 생산을 향상시키는 방법에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 개요
본 발명은 재조합 단백질 또는 펩티드 발현 및/또는 생산을 향상시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서는, 스플라이스 오류 및/또는 인트론 연속 판독 부산물을 감소시키거나 제거하고/하거나, 재조합 단백질 발현을 증대시키도록 변형된 핵산 분자가 제공된다. 특정 실시양태에서는, 핵산이 재조합 항체(본원에서는 면역글로불린이라고도 함), 또는 그의 단편을 코딩한다.
본 발명은 또한 스플라이스 오류 및/또는 인트론 연속 판독 부산물을 감소시키거나 제거하고/하거나, 재조합 단백질 발현을 증대시키도록 변형된 벡터(예를 들어, 발현 벡터); 상기와 같은 핵산 분자 및 벡터를 포함하는 숙주 세포, 예를 들어 포유류 숙주 세포; 및 재조합 단백질 또는 펩티드를, 예를 들어 대규모로 생산하기 위한 상기와 같은 세포의 배양 방법을 추가로 포함한다. 스플라이스 오류 및/또는 인트론 연속 판독 생성물이 실질적으로 없는 재조합 단백질 또는 펩티드, 예를 들어 항체의 조성물, 예를 들어 약제학적 조성물이 또한 개시된다. 이러한 조성물은 예를 들어 신경변성(neurodegenerative) 및 악성 장애의 치료를 포함하는 치료적 용도에 적당하다.
특히, 본 발명은 신경변성 질환의 치료에서의 사용을 위한 항체 치료제의 발현을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 이와 같은 항체의 일체성은, 예를 들어 단위 투여량 당 분자의 치료 활성이 유지되고 정제가 향상되기 위해 특히 중요하다. 특정 생물학적 징후에서의 전달 및 용도, 예를 들어 폴리펩티드 치료제가 뇌혈관 장벽(BBB)을 가로질러 뇌에서 표적 항원과 결합하는 신경변성 상태의 치료를 위한 특수화 기능을 위해 의도된 그러한 단백질의 순도를 향상시키는 것이 다급히 요구된다. 본 발명에 따라 생산되는 한 예시적인 항체는 신경변성 질환 표적, 예를 들어 알쯔하이머병의 아밀로이드 단백질, 즉 아밀로이드-베타 펩티드(Aβ)와의 결합을 위해 고순도로 생산되는 항체이다.
따라서 한 측면으로는, 본 발명은 하나 이상의 인트론 및 엑손 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자(예를 들어, 변형된 또는 재조합 핵산 분자)로서, 단백질 발현을 증대시키고/시키거나 스플라이스 오류 또는 인트론 연속 판독(IRT) 부산물(들)을 감소시키거나 제거하기 위해 천연 발생 서열에 비해 하나 이상의 인트론 서열이 변형된 핵산 분자를 특징으로 한다. 한 실시양태에서는, 핵산 분자가 천연 발생 서열(예를 들어 게놈 서열)에 비해 목적 단백질 또는 펩티드, 예를 들어 항체 또는 그의 단편(예를 들어, 면역글로불린 중쇄)의 증대된 발현을 지시하고/하거나, 그의 인트론 연속 판독(IRT) 부산물(들)을 감소시키거나 제거한다. 단백질 또는 펩티드는 포유류 기원, 예를 들어 인간 또는 쥐과일 수 있으며, 통상 인간 기원의 것일 수 있다. 본원에 기재된 핵산 분자는 천연 발생 서열에서 변형된 형태를 가리키는 것으로 이해된다. 일부 실시양태에서는, 핵산 분자가 분리되거나 정제된다. 다른 실시양태에서는, 핵산 분자가 재조합 분자이다.
한 실시양태에서는, 핵산 분자는 천연 발생 서열(예를 들어, 게놈 서열)에 비해 적어도 1, 2, 3개의 인트론, 또는 하나 초과의 인트론이 결실되어 있다. 예를 들어, 인트론 연속 판독(IRT)을 용이하게 하는 인트론이 천연 발생 서열로부터 결실될 수 있다. 다른 실시양태에서는, 증대된 단백질 발현 및/또는 스플라이스 오류 또는 인트론 연속 판독(IRT) 부산물(들)의 감소 또는 제거가 일어나도록, 핵산 분자가 인트론/엑손 배치(예를 들어, 인트론/엑손 5'에서 3'으로의 순서)의 재배열; 하나 이상의 인트론의 일부의 결실; 또는 인트론 또는 그의 일부를 이종 인트론 서열로 대체 중 하나 이상에 의해 변형된다.
한 관련 실시양태에서는, 핵산 분자가 항체 중쇄 또는 그의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 인간 게놈 서열)을 포함한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 면역글로불린 서브타입, 예를 들어 면역글로불린 G 서브타입(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체 서브타입)의 중쇄 가변 영역, 힌지 영역, 및 제1, 제2 및 제3 불변 영역(예를 들어, CH1, CH2, CH3)을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드(예를 들어, 엑손) 서열을 포함할 수 있다. 통상, 면역글로불린 서브타입은 포유류 기원, 예를 들어 쥐과 또는 인간에서 유래한다. 한 실시양태에서는, 인간 IgG1 또는 IgG4, 또는 그의 돌연변이 버전이 선택된다. 예를 들어, 면역글로 불린의 불변 영역이, 증가된 안정성, 감소된 효과기 기능 또는 감소된 보체 고정 중 하나 이상을 초래하도록 돌연변이될 수 있다. 한 실시양태에서는, 인간 IgG4가 안정성을 증가시키기 위해 돌연변이되며, 예를 들어 힌지 영역의 안정성을 증가시키기 위해 잔기 241번에서 세린에서 프롤린으로 대체되도록 돌연변이된다. 다른 실시양태에서는, 불변 영역이 글리코실화가 감소되도록 돌연변이된다.
한 실시양태에서는, 핵산 분자가 서열의 인트론 연속 판독을 용이하게 하는 하나 이상의 인트론이 결실되도록 돌연변이된다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 CH2와 CH3 사이의 인트론이 결실될 수 있다. 개별적으로 또는 조합되어 결실될 수 있는 다른 중쇄 면역글로불린 인트론의 예에는 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 중쇄 가변 영역과 CH1 사이의 인트론, CH1과 힌지 영역 사이의 인트론, 및 힌지 영역과 CH2 사이의 인트론이 포함된다. 상술한 인트론 중 2 또는 3개의 인트론, 또는 하나를 초과한 모두의 조합을 포함하여, 상기 인트론의 임의 조합이 결실될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 중쇄 불변 영역의 인트론 세 개, 예를 들어 CH1과 힌지 영역 사이의 인트론, 힌지 영역과 CH2 사이의 인트론, 및 CH2와 CH3 사이의 인트론이 결실된다. 하기의 중쇄 면역글로불린의 인트론 결실의 예시적 조합도 또한 본 발명의 범위 내에 속한다: 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 CH1과 힌지 영역 사이의 인트론, 및 CH2와 CH3 사이의 인트론; CH1과 힌지 영역 사이의 인트론, 및 힌지 영역과 CH2 사이의 인트론; 힌지 영역과 CH2 사이의 인트론, 및 CH2와 CH3 사이 의 인트론.
일부 실시양태에서는, 핵산 분자가 하기 식으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
VH-Int1-CH1-Int2-Hinge-Int3-CH2-Int4-CH3
[식 중, VH는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고;
CH1, CH2 및 CH3은 상응하는 중쇄 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 인간 IgG1 또는 IgG4 중쇄 유전자의 천연 발생 또는 돌연변이된 형태이고;
Hinge는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 인간 IgG1 또는 IgG4 중쇄 유전자의 천연 발생 또는 돌연변이 형태이고;
Int1, Int2, Int3 및 Int4는 중쇄 게놈 서열에서 유래하는 인트론임]. 한 실시양태에서는, 본원에서 Int4로 표시되는 CH2와 CH3 사이의 인트론이 결실된다. 다른 실시양태에서는, 본원에서 Int2, Int3 및 Int4로 표시되는, CH1과 힌지 영역 사이, 힌지 영역과 CH2 사이, 및/또는 CH2와 CH3 사이의 하나, 둘 또는 통상 3개의 인트론이 결실된다. 중쇄 게놈 서열의 인트론/엑손 배열의 부가적인 개략적 도시가 도 1, 5 및 7에 나타나 있다.
통상, 하나 이상의 인트론이 핵산 분자에 존재하는데, 예를 들어 본원에서 Int1로 표시되는 중쇄 가변 영역과 CH1 사이의 인트론이다. 개별적으로 또는 조합되 어 존재할 수 있는 기타 중쇄 면역글로불린 인트론의 예에는 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 CH1과 힌지 영역 사이의 인트론; 힌지 영역과 CH2 사이의 인트론; 및 CH2와 CH3 사이의 인트론이 포함된다. 변형된 핵산 분자 내에 하나 이상의 인트론을 포함하는 것이 종종 바람직하다. 이론에 구애됨이 없이, 인트론은 단백질 생산 과정에 있어서, 전사 속도, 폴리아데닐화, mRNA 유출, 번역 효율 및 mRNA 붕괴를 포함한 다수의 이벤트에 영향을 미치는 것으로 추정된다.
한 실시양태에서는, 핵산 분자가 하기 식으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
VH-Int1-CH1-Int2-Hinge-Int3-CH2-CH3
[식 중, VH는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고;
CH1, CH2, 및 CH3은 상응하는 중쇄 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 인간 IgG1 또는 IgG4 중쇄 유전자의 천연 발생 또는 돌연변이 형태이고;
Hinge는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 인간 IgG1 또는 IgG4 중쇄 유전자의 천연 발생 또는 돌연변이 형태이고;
Int1, Int2, 및 Int3은 중쇄 게놈 서열 유래의 인트론임]. 한 실시양태에서는, 뉴클레오티드 서열이, 예를 들어 구조 또는 기능을 변화시키는 개재 서열 없이, 본질적으로 상기 도시된 구성요소로 구성된다.
다른 실시양태에서는, 핵산 분자가 하기 식으로 표시되는 뉴클레오티드 서열 을 포함한다:
VH-Int1-CH1-Hinge-CH2-CH3
[식 중, VH는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고;
CH1, CH2, 및 CH3은 상응하는 중쇄 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 인간 IgG1 또는 IgG4 중쇄 유전자의 천연 발생 또는 돌연변이 형태이고;
Hinge는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 인간 IgG1 또는 IgG4 중쇄 유전자의 천연 발생 또는 돌연변이 형태이고;
Int1은 중쇄 게놈 서열 유래의 인트론임]. 한 실시양태에서는, 뉴클레오티드 서열이, 예를 들어 구조 또는 기능을 변화시키는 개재 서열 없이, 본질적으로 상기 도시된 구성요소로 구성된다.
인간 IgG1의 게놈 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열이 도 8(각각 서열 번호 1 및 2)에 나타나 있다. CH1, 힌지 영역, CH2, 및 CH3을 코딩하는 엑손은 각각 도 8(서열 번호 1)의 대략 뉴클레오티드 231 내지 524, 916 내지 960, 1079 내지 1408, 및 1506 내지 1829에 위치한다. Int1, Int2, Int3 및 Int4는 각각 도 8(서열 번호 1)의 대략 뉴클레오티드 1 내지 230, 대략 뉴클레오티드 525 내지 915, 대략 뉴클레오티드 961 내지 1078, 및 대략 뉴클레오티드 1409 내지 1505에 위치한 인간 IgG1 중쇄 게놈 서열에서 유래하는 인트론에 해당한다.
돌연변이 인간 IgG4의 게놈 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열이 도 9(각각 서열 번호 3 및 4)에 나타나 있다. CH1, 힌지 영역, CH2, 및 CH3을 코딩하는 엑손은 각각 도 9(서열 번호 3)의 대략 뉴클레오티드 231 내지 524, 916 내지 952, 1071 내지 1400, 및 1498 내지 1820에 위치한다. Int1, Int2, Int3 및 Int4는 각각 도 9(서열 번호 3)의 대략 뉴클레오티드 1 내지 230, 대략 뉴클레오티드 525 내지 916, 대략 뉴클레오티드 953 내지 1070, 및 대략 뉴클레오티드 1401 내지 1497에 위치한 인간 IgG4 중쇄 게놈 서열에서 유래하는 인트론에 해당한다.
본 발명의 변형된 핵산 분자의 예에는, 인간 IgG1의, 도 8(서열 번호 1) 대략 뉴클레오티드 1409 내지 1505에 해당하는, 또는 돌연변이 인간 IgG4의, 도 9(서열 번호 3)의 대략 뉴클레오티드 1401 내지 1497에 해당하는, CH2와 CH3 사이의 인트론이 결실된 인간 게놈 중쇄 불변 영역 서열이 포함된다. 개별적으로 또는 조합되어 결실될 수 있는 기타 중쇄 면역글로불린 인트론의 예에는, 인간 IgG1의, 도 8(서열 번호 1)의 대략 뉴클레오티드 1 내지 230에 해당하는, 또는 돌연변이 인간 IgG4의, 도 9(서열 번호 3)의 대략 뉴클레오티드 1 내지 230에 해당하는, 중쇄 가변 영역과 CH1 사이의 인트론; 인간 IgG1의, 도 8(서열 번호 1)의 대략 뉴클레오티드 525 내지 915에 해당하는, 또는 돌연변이 인간 IgG4의, 도 9(서열 번호 3)의 대략 뉴클레오티드 525 내지 916에 해당하는, CH1과 힌지 영역 사이의 인트론; 및 인간 IgG1의, 도 8(서열 번호 1)의 대략 뉴클레오티드 961 내지 1078에 해당하는, 또는 돌연변이 인간 IgG4의, 도 9(서열 번호 3)의 대략 뉴클레오티드 953 내지 1070 에 해당하는, 힌지 영역과 CH2 사이의 인트론이 포함된다. 상술한 인트론 중 2, 3, 4개의 인트론, 또는 하나를 초과하는 모든 인트론의 조합을 포함하여, 상기 인트론의 임의 조합이 결실될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 중쇄 불변 영역의 세 인트론, 예를 들어 CH1과 힌지 영역 사이, 힌지 영역과 CH2 사이, 및 CH2와 CH3 사이의 인트론이 결실된다. 일부 실시양태에서는, 핵산 분자가 본원에 개시된 인간 IgG1 또는 IgG4의 엑손 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상, 및 인트론 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상(전부는 아님), 또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. 한 관련 실시양태에서는, 핵산 분자가 본원에 개시된 인간 IgG1 또는 IgG4의 인트론 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상(전부는 아님), 또는 그와 실질적으로 동일한 서열이 결실된다.
한 실시양태에서는, 변형된 핵산 분자가 도 10(서열 번호 5)에 나타난 인간 IgG1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 실질적으로 동일한 서열(예를 들어, 서열 번호 5와 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일하거나, 서열 번호 5의 뉴클레오티드 서열에 비해 1, 5, 10, 50 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 변화된 서열)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서는, 변형된 핵산 분자가 도 11(서열 번호 6)에 나타난 변형된 인간 IgG4의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 실질적으로 동일한 서열(예를 들어, 서열 번호 6과 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일하거나, 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열에 비해 1, 5, 10, 50 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드가 변화된 서열)을 포함한다.
변형된 핵산 분자는 경쇄 및 중쇄 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 면역글로불린 서열을 포함할 수 있다. 그러한 서열은 동일한 핵산 분자(예를 들어, 동일한 발현 벡터) 내에 존재할 수 있거나, 대안적으로는 별도의 핵산 분자(예를 들어, 별도의 발현 벡터)로부터 발현될 수 있다. 통상, 코딩된 항체 또는 면역글로불린 또는 그의 단편은 하나 이상의, 바람직하게는 2개의 전장 중쇄, 및 하나 이상의, 바람직하게는 2개의 경쇄를 포함할 수 있다. 대안적으로는, 코딩된 면역글로불린 또는 그의 단편은 단 하나의 항원 결합성 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv 또는 단쇄 Fv 단편)만을 포함할 수 있다. 항체 또는 그의 단편은 단클론 또는 단일 특이성 항체일 수 있다. 항체 또는 그의 단편은 또한 인간, 인간화, 키메라, CDR-이식, 또는 시험관 내 생성된 항체일 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 항체가 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE에서 선택된; 보다 구체적으로는, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에서 선택된 중쇄 불변 영역을 가진다. 또 다른 실시양태에서는, 항체가 예를 들어 카파 또는 람다에서 선택된 경쇄를 가진다.
또 다른 실시양태에서는, 핵산 분자가 가변 영역, 예를 들어 인간화, 키메라, CDR-이식, 또는 시험관 내 생성된 가변 영역을 포함한다. 통상, 가변 영역은 소정의 항체, 예를 들어 장애, 예를 들어 신경변성 또는 악성 장애와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다.
한 실시양태에서는, 장애가 신경변성 장애이며, 항체가 아밀로이드 단백질, 예를 들어 Aβ 펩티드(예를 들어, 인간 Aβ 펩티드)에 결합한다. 예를 들어, 항체가, 쥐과 항체로부터 유래되는 하나 이상의 상보성 결정부위(CDR)를 함유하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 Aβ 펩티드에 대해 인간화된 항체, 예를 들어 마우스 항-Aβ 3D6 항체, 또는 마우스 항-Aβ 12A11 항체, 또는 마우스 항-Aβ 10D5 항체, 또는 마우스 항-Aβ 12B4 항체일 수 있다. 인간화 항체의 가변 영역은 전형적으로 인간의 또는 실질적으로 인간의 골격 부위를 포함한다. 한 실시양태에서는, 핵산 분자가 인간화 항-Aβ 펩티드 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 측면에서는, 본 발명은 상기한 변형된 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)를 특징으로 한다. 벡터는 숙주 세포 내에서: 복제, 선택, mRNA 전사, mRNA 안정성, 단백질 발현 또는 단백질 분비 중 하나 이상을 증대시키는 뉴클레오티드 서열을 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 복제 또는 인핸서 발현을 담당하는 뉴클레오티드 서열, 인핸서 프로모터 요소, 리더 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 선별 마커(예를 들어, DHFR)를 코딩하는 유전자, 내수 리보솜 진입 부위 서열(IRES), 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서는, 본 발명은 상술한 핵산 분자 및/또는 벡터, 예를 들어 발현 벡터 중 하나를 포함하는 세포, 예를 들어 진핵 숙주 세포, 예를 들어 포유류 숙주 세포(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포)를 제공한다. 세포에는 본 발명의 핵산 서열이 임시로 또는 안정하게 트랜스펙션될 수 있다.
또 다른 측면에서는, 본 발명은 기준, 예를 들어 천연 발생 게놈 서열에 비해, 재조합 단백질 또는 펩티드, 예를 들어 항체의 발현을 증대시키거나, 스플라이스 오류 및/또는 인트론 연속 판독 생성물의 수준이 감소된(예를 들어, 실질적으로 없는) 재조합 단백질 또는 펩티드, 예를 들어 항체를 발현시키는 방법을 제공한다. 방법은 본원에 기술된 바와 같은 핵산 분자를 숙주 세포, 예를 들어 포유류 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포) 내로 도입하고; 상기 숙주 세포를 재조합 단백질 또는 펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하여 숙주 세포 배양액을 생성하고; 경우에 따라, 숙주 세포의 배양액(예를 들어, 숙주 세포 상청액)으로부터 재조합 단백질 또는 펩티드를 수득, 예를 들어 정제하는 것을 포함한다.
방법은, 핵산 샘플, 예를 들어 숙주 세포로부터 얻은 mRNA 샘플 중에서 IRT 또는 IRT 생성물을 동정(예를 들어, 그 수준을 검출 및/또는 판단)하는 단계로서, 상기 샘플을 인트론 및 인접한 엑손 서열에 상보적인, 또는 대안적으로는 인접한 엑손 서열들에 상보적인 핵산 프로브와, 핵산 샘플과 프로브의 하이브리드화를 허용하는 조건 하에서 접촉시킴으로써 동정하고; 형성된 복합체를, 예를 들어 프로브 서열의 PCR 증폭에 의해 검출함에 의한 단계를 추가로 포함할 수 있다. 인트론 서열에 상보적인 핵산 프로브를 함유하는 샘플 내의 복합체, 예를 들어 PCR 증폭된 생성물의 검출은 IRT 또는 IRT 생성물의 발생을 나타낸다. IRT 생성물의 수준은, 예를 들어 실시예 1에 기술된 바와 같이 정량화될 수 있다.
또 다른 측면에서는, 표준 기준, 예를 들어 천연 발생 게놈 서열에 비해 인트론 연속 판독(IRT) 중쇄 부산물이 감소된(예를 들어, 실질적으로 없는) 항체 또 는 그의 단편을 생산하는 방법이 제공된다. 방법은, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 분자, 및 경우에 따라 항체 경쇄를 코딩하는 핵산을 함유하는 세포, 예를 들어 포유류 세포(예를 들어, CHO 세포)를, 중쇄 및 경쇄가 발현되고, 경우에 따라 작동적으로 회합하도록 하는 조건 하에서 배양하는 것을 포함한다. 항체 또는 그의 단편은 경우에 따라 세포 배양액으로부터 정제된다. 통상, 항체, 또는 그의 단편은 스플라이스 오류 또는 인트론 연속 판독(IRT) 중쇄 부산물이 감소되어 있다.
방법은 샘플, 예를 들어 숙주 세포로부터 얻은 mRNA 샘플에서 IRT, 또는 IRT 생성물의 수준을 검출 및/또는 판단하고; 상기 샘플을, 인트론 및 인접한 엑손 서열에 상보하는, 또는 대안적으로는, 인접한 엑손 서열에 상보하는 핵산 프로브와, 핵산 샘플과 프로브의 하이브리드화를 허용하는 조건 하에서 접촉시키고; 형성된 복합체를, 예를 들어 프로브 서열의 PCR 증폭에 의해 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 인트론 서열에 상보적인 핵산 프로브를 함유하는 샘플 내의 복합체, 예를 들어 PCR 증폭된 생성물의 검출은 IRT, 또는 IRT 생성물의 발생을 나타낸다. IRT 생성물의 수준은, 예를 들어 실시예 1에 기술된 바와 같이 정량화될 수 있다.
또 다른 측면에서는, 본 발명은 게놈 중쇄 서열로부터 발현된 인트론 연속 판독(IRT) 항체 중쇄 부산물을, 상기 서열 유래의 하나 이상의 인트론을 결실시킴으로써 감소시키는 방법으로서, 상기 인트론이 IRT를 촉진시키는 것인 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서는, 본 발명은 샘플, 예를 들어 핵산 샘플 내의 IRT 또는 IRT 생성물을 동정(예를 들어, 그 수준을 검출 및/또는 판단)하는 방법을 특징으로 한다. 방법은, 핵산 샘플, 예를 들어 세포, 예컨대 재조합 세포(예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 숙주 세포)로부터의 mRNA 샘플을 얻고; 상기 핵산 샘플을, 인트론 및 인접한 엑손 서열에 상보적인, 또는 대안적으로는 인접한 엑손 서열들에 상보적인 핵산 프로브와, 핵산 샘플과 프로브의 하이브리드화를 허용하는 조건 하에서 접촉시키고; 형성된 복합체를, 예를 들어 프로브 서열의 PCR 증폭에 의해 검출하는 것을 포함한다. 인트론 서열에 상보적인 핵산 프로브를 함유하는 샘플 내의 복합체, 예를 들어 PCR 증폭된 생성물의 검출은 IRT, 또는 IRT 생성물의 발생을 나타낸다. IRT 생성물의 수준은, 예를 들어 실시예 1에 기재된 바와 같이 정량화될 수 있다.
또 다른 측면에서는, 본 발명은 본원에 개시된 방법에 따라 생산된, 기준, 예를 들어 천연 발생 게놈 서열에 비해 스플라이스 오류 및/또는 인트론 연속 판독 생성물이 감소된(예를 들어, 실질적으로 없는) 항체(예를 들어, 재조합 항체), 또는 그의 단편을 특징으로 한다. 한 실시양태에서는, 항체 또는 그의 단편이 키메라, 인간화, CDR-이식 또는 시험관 내 생성된 항체이다. 통상, 항체 또는 그의 단편은 소정의 항원, 예를 들어 장애, 예를 들어 신경변성 장애와 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 가변 영역을 가진다.
또 다른 측면에서는, 본 발명은, 기준, 예를 들어 천연 발생 게놈 서열에 비해 스플라이스 오류 및/또는 인트론 연속 판독 생성물이 감소된(예를 들어, 실질적으로 없는) 재조합 단백질 또는 펩티드, 예를 들어 항체, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 조성물, 예를 들어 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조 성물은, 예를 들어 신경변성 장애의 치료를 포함하는 치료적 용도에 적당하다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 3D6 IgG 유전자를 함유하는 발현 벡터로부터 전사된 예상된 전구-mRNA(상부), 및 정확하게(correctly) 스플라이싱된 mRNA(중간) 및 인트론 연속 판독 mRNA(하부)를 도시한다.
도 2는 게놈 5' 및 3' 스플라이스 접합부(서열 번호 7)를 나타내는 3D6 중쇄 발현 벡터의 CH2와 CH3 불변 영역(제4 인트론이라 함) 사이의 인트론에 걸친 핵산서열을 나타낸다. 또한, 정확하게(서열 번호 8) 및 부정확하게(서열 번호 9) 스플라이싱된 mRNA에서 유래된 폴리펩티드의 예측된 부분적 아미노산 서열을 나타낸다. RNA 스플라이스 접합부는 이중 실선으로 표시된다.
도 3은 3D6 중쇄 유전자 전사의 수준(mRNA 전사물을 함유하는 CH2의 수준) 및 인트론 4 연속 판독 전사의 수준을 평가하는데 사용되는 정량적-중합효소 연쇄 반응(Q-PCR) 프로브의 도식적으로 나타낸다.
도 4는 배양 및 단백질 발현 유도에 있어서 시간에 대응하는 인트론 4 함유 전사물의 증가된 축적을 입증하는 막대 그래프이다.
도 5는 인트론 연속 판독 전사를 해결하기 위해 개발된 발현 벡터에서 사용되는 3D6 인트론 및 엑손의 게놈 배열, 및 변형된 배열의 도면을 제공한다.
도 6은 변형된 발현 벡터로 형질변환된 세포주에서의 인트론 연속 판독 중쇄 부산물의 결여를 입증하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 크로마토그램을 나타낸다.
도 7은 중쇄 게놈 구축물 내 인트론 및 엑손의 배열을 도시하는데, 구축물은 마지막 3개의 인트론 서열이 결실되어 있고 cDNA 구축물은 인트론을 함유하지 않는다.
도 8은 각각 서열 번호 1 및 2에 나타난 바와 같은 인간 IgG1의 게놈 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다. CH1, 힌지 영역, CH2, 및 CH3을 코딩하는 엑손은 각각 대략 뉴클레오티드 231 내지 524, 916 내지 960, 1079 내지 1408, 및 1506 내지 1829에 위치한다(서열 번호 1). Int1, Int2, Int3 및 Int4는 각각 대략 뉴클레오티드 1 내지 230, 대략 뉴클레오티드 525 내지 915, 대략 뉴클레오티드 961 내지 1078, 및 대략 뉴클레오티드 1409 내지 1505(서열 번호 1)에 위치한 인간 IgG1 중쇄 게놈 서열 유래의 인트론에 해당한다.
도 9는 각각 서열 번호 3 및 4에 나타낸 바와 같은 인간 IgG4의 게놈 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다. CH1, 힌지 영역, CH2, 및 CH3을 코딩하는 엑손은 각각 대략 뉴클레오티드 231 내지 524, 916 내지 952, 1071 내지 1400, 및 1498 내지 1820(서열 번호 3)에 위치한다. Int1, Int2, Int3 및 Int4는 각각 대략 뉴클레오티드 1 내지 230, 대략 뉴클레오티드 525 내지 916, 대략 뉴클레오티드 953 내지 1070, 및 대략 뉴클레오티드 1401 내지 1497(서열 번호 3)에 위 치한 인간 IgG4 중쇄 게놈 서열 유래의 인트론에 해당한다.
도 10은 불변 영역의 CH2와 CH3 사이의 인트론이 결실된 인간 IgG1의 게놈 뉴클레오티드 서열(서열 번호 5)을 나타낸다.
도 11은 하기: CH1과 경첩 사이의 인트론, 경첩과 CH2 사이의 인트론, 및 CH2와 CH3 사이의 인트론의 인트론 결실을 가진 변형된 인간 IgG4의 게놈 뉴클레오티드 서열(서열 번호 6)을 나타낸다.
도 12는 다양한 부가적 3D6, 10D5, 12B4 및 266 항체의 중쇄 아미노산 서열을 나타낸다.
도 는 다양한 부가적 3D6, 10D5, 12B4 및 266 항체의 중쇄 아미노산 서열을 나타낸다.
발현 벡터의 설계 및 구축에 있어 수많은 접근법이 취해져야 하고, 그 과정은 통상 적당한 수준의 단백질이 생산되기 전에 실질적인 시행착오 실험을 필요로 한다. 설계 과정에서의 중요한 고려사항은 벡터의 구축에서의 인트론 서열의 사용에 관한 것이다. 한 접근법에서는, 전체 유전자 서열이 천연 발생 상태 그대로, 인트론 및 엑손 서열 모두의 완전한 보체를 함유하는 것이 이용될 수 있다. 그러한 경우, 세포 내 전사후 스플라이싱 작동원리가 인트론 서열을 절단하여 유전자의 엑손 서열만을 함유하는 성숙한 mRNA를 생성하는 것이 예상된다. 두 번째 접근법은 유전자의 cDNA에만 해당하는 서열을 이용하는 것이다. 이 경우, 스플라이싱 이벤트가 일어나지 않고, 전구-mRNA 서열은 단백질 코딩 내용에서 mRNA 서열과 실질적으로 동일할 것이 예측된다. 세 번째 경우에서는, 벡터 구축이 원래 유전자 서열과는 보통 관련이 없는 인트론의 선택 및 배치를 포함한다.
벡터의 맥락에서 유전자의 발현에 대한 인트론 서열의 효과는 완전히 이해되지 않고 있다. 인트론이 전사 속도, 폴리아데닐화, mRNA 유출, 번역 효율, 및 mRNA 붕괴(decay)를 포함한 단백질 생산 과정에서의 다수의 이벤트를 수행할 수도 있는 것으로 보고되었다(Nott 등(2003), RNA 9:607-617). mRNA 발현의 맥락에서는, 벡터로부터 수득되는 단백질의 수율에 대한 인트론의 결과에 관한 예측가능성에 대한 명백한 설명이 없었다. 예를 들어, 다양한 인트론 서열을 포함하는 것이 발현의 큰 증가의 원인이 되거나, 아무 효과가 없거나, 또는 mRNA 발현을 감소시킬 수 있는 것으로 다양하게 보고되어 왔다(Berg 등(1988) Mol. Cell. Biol. 8:4395-4405; Bourdon 등(2001) EMBO Rep. 2:394-398). 대부분의 고등 진핵생물 유전자는 인트론을 함유하므로, 원치 않는 연속 판독 부산물의 부재 하에 높은 수준으로, 또한 유전자의 엑손 서열에 근접한 신뢰성을 가지고 인트론 함유 유전자를 예측가능하게 발현하는데 사용될 수 있는 시스템의 개발은, 명백히 단백질 발현 시스템의 예측가능한 개발에 있어 도움이 된다.
인트론 서열과 관련한 예측불가능성은 신뢰성 있는 발현 벡터 설계에 장애물이 되는 반면, 관심 단백질이 유전공학 기법을 적용할 수 있는 모듈 형태를 갖는 경우에 상당한 설계 유익이 구현될 수 있다. 항체는, 인트론 서열의 포함이 발현 벡터 고안을 용이하게 하는 그러한 일례를 제공한다.
명세서 및 청구범위에서 사용되는 일부 용어들이 하기에 정의한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "인트론"은 전사되지만, 서열들(엑손)을 어느 한 쪽에서 함께 스플라이싱함으로써 RNA 전사물로부터 제거되는 DNA 단편을 포함한다. 인트론은 유전자의 단백질 코딩 부위 내에서 개재하는 서열인 것으로 추정되며, 일반적으로는 유전자로부터 생산된 단백질에 표시된 정보를 함유하지 않는다.
용어 "엑손"은 성숙한 RNA 생성물에 표시된 개재 서열을 함유하는 유전자의 임의 단편을 포함한다. 엑손은 단백질로 번역되는 유전자 내의 정보를 포함한다.
용어 "전구-mRNA"는 RNA 중합효소에 의한 유전자의 전사에서 수득되는 초기 RNA 생성물을 포함한다. 전구 mRNA로 표시되는 RNA는 인트론 및 엑손 서열 모두를 포함하고, 따라서 세포의 스플라이싱 작동원리에 의해 처리되지 않았다.
용어 "mRNA"는 인트론을 제거하도록 가공되고, 폴리펩티드로 번역될 수 있는 RNA 전사물을 포함한다.
용어 "스플라이싱"은 인트론이 전구 mRNA 종으로부터 제거되는, 진핵 세포의 핵 내에서 발생하는 세포 이벤트를 포함한다. 일반적으로 그 과정은, 5' 스플라이스 제공자 부위가 3' 스플라이스 수용자 부위와 근접하게 되고, 개재 인트론 서열이 전사물로부터 제거되는 스플라이시오솜(spliceosome) 복합체의 형성을 필요로 한다.
용어 "벡터"는, 종종 관심 유전자 또는 유전자들을 포함하고, 핵산이 숙주 세포 내에서 복제 및/또는 전사되기 위한 최소 구성요소 필요조건을 추가로 포함하는 핵산 구축물을 포함한다. 그러한 구축물은 염색체외 구성요소로서 존재할 수 있거나, 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.
"인트론 연속 판독"("IRT")이란 구절은 전구-mRNA 전사물의 비정상적 스플라이싱이 다른 크기 또는 아미노산 구성의 단백질 또는 펩티드를 생성하도록 하는 과정을 의미한다. 스플라이스 오류 전사물로부터 생산된 궁극적 단백질에 대해서는 다변적인 결과가 일어날 수 있다. 예를 들어, 예측된 것보다 더 큰 단백질 또는 부정확한 정지 코돈을 갖는 단백질이 발생할 수 있으며, 이 경우 단백질은 각각 예측된 것보다 더 길거나 더 짧을 수 있다. 또한, 단백질은 글리코실화, 미리스토일화, 인산화, 유비퀴틴화, 또는 기타 번역후 변형을 위한 단백질 변형을 촉진하는, 부정확하거나 부가적인 잔기를 가질 수도 있다.
용어 "인트론 연속 판독 부산물"은 인트론 연속 판독으로 인해 초래된 비정상적으로 스플라이싱된 mRNA로부터 번역된 단백질 또는 펩티드, 예를 들어 예측되지 않은 크기 또는 아미노산 구성의 단백질을 가리킨다. 인트론 연속 판독 부산물은 알려진 아미노산 서열의 유전자에 의해 예측되고/되거나 유전자의 cDNA에 의해 예측된 폴리펩티드보다 더 짧거나 더 길 수 있다. 인트론 연속 판독 부산물은 또한 유전자의 정확히 스플라이싱된 mRNA로부터 생성된 단백질의 용납된 분자량과는 다른 겉보기 분자량을 가질 수도 있다. 또한, 용어 "인트론 연속 판독 부산물"은 관심 단백질과는 보통 관련되지 않은 단백질분해 가공 이벤트로부터 발생하는 단백질을 포함하는데, 상기 단백질분해 가공은 잠재적으로 인트론-엑손-접합부의 연속 판독으로 인해 골격 변위된 단백질 생성물에서 기인한다.
용어 "중쇄 부산물"은 연속 판독에 기인하는 비정상적으로 스플라이싱된 면역글로불린 중쇄 mRNA로부터 번역된 폴리펩티드, 예를 들어 예측되지 않은 크기 또는 아미노산 구성의 중쇄 단백질을 가리킨다. 중쇄 부산물은 면역글로불린 유전자의 알려진 아미노산 서열에 의해 예측되고/되거나, 유전자의 cDNA에 의해 예측된 폴리펩티드보다 더 짧거나 더 길 수 있다. 중쇄 부산물은 또한 중쇄 유전자의 정확하게 스플라이싱된 mRNA로부터 발생하는 단백질의 용납된 분자량과는 상이한 겉보기 분자량을 가질 수도 있다. 또한, 용어 "중쇄 부산물"은 단백질과 보통은 관련없는 단백질 분해 가공 이벤트에서 발생하는 폴리펩티드를 포함한다.
"천연 발생 서열" 또는 "천연 발생 게놈 서열"이란 구절은 자연 또는 천연 상태에서 발견되는 유전자의 인트론 및 엑손 조직을 가리킨다. 천연 발생 서열은 서열의 인트론 및 엑손 조직이 보유되는 한, 예를 들어 그의 본래 염색체 위치에서 발견되거나 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
용어 "면역글로불린" 또는 "항체"(본원에서는 상호교환적으로 사용됨)는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 4-폴리펩티드 사슬 구조를 갖는 단백질을 가리키며, 여기에서 상기 사슬은 예를 들어 사슬 간 이황화물 결합에 의해 안정화되어 있고, 면역글로불린 또는 항체는 항원에 선택적으로 또는 특이적으로 결합하는 능력을 가진다.
용어 Aβ-항체의 Aβ-면역글로불린은 Aβ 펩티드와 선택적으로 또는 특이적으로 결합하는 항체를 가리킨다.
용어 "단쇄 면역글로불린" 또는 "단쇄 항체"(본원에서는 상호교환적으로 사용됨)는 중쇄 및 경쇄로 구성된 2-폴리펩티드 사슬 구조를 갖는 단백질을 가리키는데, 상기 사슬은 예를 들어 사슬간 펩티드 연결기에 의해 안정화되어 있고, 면역글로불린 또는 항체는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 것이다.
용어 "면역글로불린 또는 항체 도메인"은, 예를 들어 β-병풍구조 및/또는 사슬내 이황화물 결합에 의해 안정화된 펩티드 루프(예를 들어, 3 내지 4개의 펩티드 루프 포함)를 포함하는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드 내의 구상 영역을 가리킨다. 도메인은 또한 본원에서는 "불변" 또는 "가변"으로 불리는데, 용어 "불변"은 "불변" 도메인의 경우 다양한 부류의 구성원의 도메인 내의 서열 변이가 비교적 없는 것을 가리키고, 용어 "가변"은 "가변" 도메인의 경우 다양한 부류의 구성원의 도메인 내에 상당한 변이가 있는 것을 가리킨다. 항체 또는 폴리펩티드 "도메인"은 종종 당해 분야에서 항체 또는 폴리펩티드 "영역"과 상호교환적으로 불린다. 항체 경쇄의 "불변" 도메인은 "경쇄 불변 영역", "경쇄 불변 도메인", "CL" 영역 또는 "CL" 도메인으로 상호교환적으로 불린다. "항체 중쇄의 "불변" 도메인은 "중쇄 불변 영역", "중쇄 불변 도메인", "CH" 영역 또는 "CH" 도메인으로 상호교환적으로 불린다. 항체 경쇄의 "가변" 도메인은 "경쇄 가변 영역", "경쇄 가변 도메인", "VL" 영역 또는 "VL" 도메인으로 상호교환적으로 불린다. 항체 중쇄의 "가변" 도메인은 "중쇄 불변 영역", "중쇄 불변 도메인", "VH" 영역 또는 "VH" 도메인으로 상호교환적으로 불린다.
용어 "영역"은 또한 항체 사슬 또는 항체 사슬 도메인의 일부 또는 부분(예를 들어, 본원에서 정의된 바와 같이, 중쇄 또는 경쇄의 일부 또는 부분, 또는 불변 또는 가변 도메인의 일부 또는 부분)을 비롯하여, 상기 사슬 또는 도메인의 보다 분리된 일부 또는 부분을 가리킨다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄 또는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 본원에 정의된 바와 같은 "골격(framework) 영역" 또는 "FR" 중에 산재된 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"을 포함한다.
면역글로불린 또는 항체는 단량체 또는 중합체 형태로 존재할 수 있는데, 예를 들어 오량체 형태로 존재하는 IgM 항체, 및/또는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재하는 IgA 항체가 있다. 용어 "단편"은 비변형 또는 온전한 항체 또는 항체 사슬보다 더 적은 수의 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 사슬의 일부 또는 부분을 가리킨다. 단편은 비변형 또는 온전한 항체 또는 항체 사슬의 화학적 또는 효소적 처리를 통해 수득될 수 있다. 단편은 또한 재조합 수단에 의해서도 수득될 수 있다. 예시적인 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, 및/또는 Fv 단편이 포함된다. 용어 "항원 결합성 단편"은 항원과 결합하거나, 항원 결합(즉, 특이적 결합)을 위해 비변형 항체(즉, 단편이 유래된 비변형 항체)와 경쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 가리킨다.
용어 "입체형태(configuration)"는 단백질 또는 폴리펩티드(예를 들어, 항체, 항체 사슬, 그의 도메인 또는 영역)의 삼차 구조를 가리킨다. 예를 들어, "경쇄(또는 중쇄) 입체형태"란 구절은 경쇄(또는 중쇄) 가변 영역의 삼차 구조를 가리키고, "항체 입체형태" 또는 "항체 단편 입체형태"란 구절은 항체 또는 그의 단편의 삼차 구조를 가리킨다. 용어 "입체형태"는 또한 하나 또는 몇 개의 단백질 또는 펩티드 사슬의 삼차원 관계에서 기인하는 사차 구조를 가리킬 수도 있다. 항원결정자(antigenic determinant)와 관련하여, "입체형태 에피토프"란 구절은 하나 또는 몇 개의 단백질 내에 아미노산의 특정 공간 배치를 포함하는 항원결정자가 근접한 병렬배치(apposition)로 존재하는 것을 가리킨다. 항체의 다관능성 성질(즉, 하나 초과의 단백질 분자 상의 몇 개의 에피토프와 동시에 결합하는 IgG 분자의 능력)을 고려하면, 항체는 수개의 아미노산 사슬로 이루어진 입체형태 에피토프와 결합하는 선천적 능력을 갖는 것으로 인정될 수 있다. 예를 들어, 플라크를 형성하는 Aβ의 축적은, 하나의 항체가 몇 개의 근접하게 위치한 Aβ 펩티드와 결합할 수 있는 입체형태 에피토프를 제공한다.
결합 단편은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 비변형 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성된다. 결합 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, 단쇄, 및 단쇄 항체가 포함된다. "이중특이적" 또는 "이관능성" 면역글로불린 또는 항체 외에는, 면역글로불린 또는 항체는 각각의 결합 부위가 동일한 것으로 이해된다. "이중특이적" 또는 "이관능성 항체"는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 짝 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함한 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny 등, J. Immunol., 148, 1547-1553 (1992) 참조.
항체의 "특이적 결합" 또는 "선택적 결합"은, 항체가 특정 항원 또는 에피토프에 대해 뚜렷한 친화성을 나타내고, 일반적으로 상당한 교차반응성을 나타내지 않는 것을 의미한다. "뚜렷한(appreciable)" 또는 바람직한 결합은 적어도 106, 107, 108, 109 M-1, 또는 1010 M-1의 친화성을 갖는 결합을 포함한다. 107 M-1 초과, 바람직하게는 108 M-1 초과의 친화성이 보다 바람직하다. 본원에 기재한 것들의 중간값 또한 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 의도되며, 바람직한 결합 친화성은, 예를 들어 106 내지 1010 M-1, 바람직하게는 107 내지 1010 M-1, 더욱 바람직하게는 108 내지 1010 M-1 범위의 친화성으로 나타내어질 수 있다. "상당한 교차반응성을 나타내지 않는" 항체는, 목적하지 않는 개체(예를 들어, 목적하지 않는 단백질성 개체)에 뚜렷하게 결합하지 않는 것이다. 예를 들어, Aβ에 특이적으로 결합하는 항체는 Aβ와는 뚜렷하게 결합할 것이지만, 비-Aβ 단백질 또는 펩티드(예를 들어, 플라크에 포함된 비-Aβ 단백질 또는 펩티드)와는 유의하게 반응하지 않을 것이다. 특정 에피토프에 특이적인 항체는, 예를 들어 동일한 단백질 또는 펩티드 상의 원거리 에피토프와는 유의하게 교차반응하지 않을 것이다. 예시적인 실시양태에서는, 항체가 교차반응성을 나타내지 않는다(예를 들어, 비-Aβ 펩티드와 또는 Aβ 상의 원거리 에피토프와 교차반응하지 않는다). 특이적 결합은 그러한 결합의 판단을 위한, 당해 분야에서 인정된 임의 수단에 따라 결정될 수 있다. 바람직하게는, 특이적 결합은 스캐쳐드(Scatchard) 분석 및/또는 경쟁적 결합 분석(competitive binding assay)에 따라 결정된다.
용어 "상당한 동일성"은 두 서열, 예를 들어 2개의 폴리펩티드 서열이, 예컨대 디폴트 갭 가중(gap weight)을 이용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬되었을 때, 적어도 50-60% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 60-70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 70-80% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 80-90% 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 90-95% 동일성, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 95% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 99% 이상의 서열 동일성)을 공유하는 것을 의미한다. 용어 "실질적 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은 두 서열, 예를 들어 2개의 폴리펩티드 서열이, 예컨대 디폴트 갭 가중을 이용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 배열되었을 때, 적어도 80-90% 동일성, 바람직하게는 적어도 90-95% 동일성, 및 더 바람직하게는 적어도 95% 이상의 서열 동일성(예를 들어, 99% 이상의 서열 동일성)을 공유하는 것을 의미한다. 서열 비교에 있어서는, 통상 하나의 서열이 기준 서열로 작용하고, 여기에 시험 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요하면 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 서열 비교 알고리즘은 이어서 기준 서열에 상대적인 시험 서열(들)의 서열 동일성 퍼센트를, 지정된 프로그램 파라미터를 근거로 하여 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 니들먼(Needleman) & 윈쉬(Wunsch), J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 피어슨(Pearson) & 립맨(Lipman), Proc. Nat'l, Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 방법에 대한 탐색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package), 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 매디슨 575 사이언스 드라이브 소재)의 TFASTA)에 의해, 또는 육안 검색에 의해 (포괄적으로 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology 참조), 수행될 수 있다. 서열 동일성 및 서열 유사성의 퍼센트를 결정하는데 적당한 알고리즘의 일례는 BLAST 알고리즘으로서, 이는 Altschul 등, J. Mol. Biol. 215:403 (1990)에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 바이오테크놀로지 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)을 통해 공개적으로 입수가능하다(국립보건연구소 NCBI 인터넷 서버를 통해 공개적으로 접속가능함). 통상, 서열 비교를 수행하는데 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있으나, 사용자 설정된 파라미터도 사용될 수 있다. 아미노산 서열에 대해서는, BLASTP 프로그램은 디폴트값으로서 단어길이(W) 3, 예상치(E) 10, 및 BLOSUM62 점수 매트릭스를 사용한다(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989) 참조).
바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환만큼 상이하다. 아미노산을 보존적 또는 비보존적으로 분류하기 위한 목적 하에, 아미노산을 하기로 분류한다: 그룹 I(소수성 측쇄): leu, met, ala, val, leu, ile; 그룹 II(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III(산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV(염기성 측쇄); asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V(사슬 배향에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 부류 내 아미노산 간의 치환을 포함한다. 비보존적 치환은 상기 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 교환하는 것으로 구성된다.
항체
본 발명의 방법론은, 원치 않거나 목적하지 않은 부산물이 검출되는 다양한 항체 생산 공정에 적용가능하다. 특히, 방법론은 재조합 항체, 예컨대 키메라 및 인간화 단클론 항체의 생산으로서, 생산되는 항체의 서열이 알려진 곳에 적용가능하다.
용어 "인간화 면역글로불린" 또는 "인간화 항체"는 하나 이상의 인간화 면역글로불린 또는 항체 사슬(즉, 하나 이상의 인간화 경쇄 또는 중쇄)를 포함하는 면역글로불린 또는 항체를 가리킨다. 용어 "인간화 면역글로불린 사슬" 또는 "인간화 항체 사슬"(즉, "인간화 면역글로불린 경쇄" 또는 "인간화 면역글로불린 중쇄")은, 실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래된 가변 골격 영역 및 실질적으로 비-인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역(CDR)(예를 들어, 하나 이상의 CDR, 바람직하게는 2개의 CDR, 더 바람직하게는 3개의 CDR)을 포함하고, 불변 영역(예를 들어, 경쇄의 경우에는 하나 이상의 불변 영역 또는 그의 부분, 및 중쇄의 경우에는 바람직하게는 3개의 불변 영역)을 추가 포함하는 가변 영역을 갖는 면역글로불린 또는 항체 사슬(즉, 각각 경쇄 또는 중쇄)을 가리킨다. 용어 "인간화 가변 영역"(예를 들어, '인간화 경쇄 가변 영역" 또는 "인간화 중쇄 가변 영역")은 실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래되는 가변 골격 영역 및 실질적으로 비-인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래되는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 영역을 가리킨다.
"실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래되는" 또는 "실질적으로 인간인"이란 구절은, 비교 목적을 위해 인간 면역글로불린 또는 항체 아미노산 서열로 정렬되었을 때, 영역이 인간 골격 또는 불변 영역 서열과 적어도 80-90%, 90-95%, 또는 95-99% 동일성을 공유하여, 예를 들어 보존적 치환, 일치 서열 치환, 배선(germline) 치환, 복귀 돌연변이 등을 허용하는 것을 의미한다. 보존적 치환, 일치 서열 치환, 배선 치환, 복귀 돌연변이 등의 도입은 종종 인간화 항체 또는 사슬의 "최적화"로 불린다. "실질적으로 비-인간 면역글로불린 또는 항체로부터 유래되는" 또는 "실질적으로 비-인간인"이란 구절은, 면역글로불린 또는 항체 서열이 비-인간 생물체, 예를 들어 비-인간 포유동물의 것과 적어도 80-95%, 바람직하게는 적어도 90-95%, 보다 바람직하게는 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 것을 의미한다.
따라서 인간화 면역글로불린 또는 항체의, 또는 인간화 면역글로불린 또는 항체 사슬의 모든, 다만 가능하게는 CDR를 제외한 모든 영역 또는 잔기는 하나 이상의 본래 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 영역 또는 잔기와 실질적으로 동일하다. 용어 "상응하는 영역" 또는 "상응하는 잔기"는 두 번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열상의 영역 또는 잔기로서, 첫 번째 및 두 번째 서열이 비교 목적 하에 최적으로 정렬될 때 첫 번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 상의 영역 또는 잔기와 동일한(즉, 대등한) 위치를 차지하는 상기 영역 또는 잔기를 가리킨다.
바람직하게는, 인간화 면역글로불린 또는 항체는, 상응하는 비-인간화 항체의 친화성의 3배, 4배, 또는 5배 인자 이내의 친화성으로 항원과 결합한다. 예를 들어, 비-인간화 항체의 결합 친화성이 109 M-1이라면, 인간화 항체는 결합 친화성이 적어도 3×109 M-1, 4×109 M-1, 또는 5×109 M-1이 될 것이다. 면역글로불린 또는 항체의 결합 특성을 기술할 때, 사슬은 그의 "항원(예를 들어, Aβ 또는 5T4) 결합을 지시하는" 능력을 근거로 하여 기술할 수 있다. 사슬은, 비변형 면역글로불린 또는 항체(또는 그의 항원 결합성 단편)에 대해 특이적 결합 특성 또는 결합 친화성을 부여할 때, "항원 결합을 지시한다"고 일컬어진다. 돌연변이(예를 들어, 복귀 돌연변이)는, 상기 사슬을 포함하는 비변형 면역글로불린 또는 항체(또는 그의 항원 결합성 단편)의 결합 친화성을, 상기 돌연변이가 결여된 대등한 사슬을 포함하는 항체(또는 그의 항원 결합성 단편)의 친화성에 비해 적어도 한 자릿수만큼 영향을 미치는(예를 들어, 감소시키는) 경우에, 항원 결합을 지시하는 중쇄 또는 경쇄의 능력에 실질적으로 영향을 미치는 것으로 일컬어진다. 돌연변이는, 상기 사슬을 포함하는 비변형 면역글로불린 또는 항체(또는 그의 항원 결합성 단편)의 결합 친화성을, 상기 돌연변이가 결여된 대등한 사슬을 포함하는 항체(또는 그의 항원 결합성 단편)의 결합 친화성에 비해 단지 두 배, 세 배, 또는 네 배만큼 영향을 미치는(예를 들어, 감소시키는) 경우에, "항원 결합을 지시하는 사슬의 능력에 실질적으로 영향을 미치지(예를 들어, 감소시키지) 않는다".
용어 "키메라 면역글로불린" 또는 항체는, 그 가변 영역이 첫 번째 생물종으로부터 유래하고 그 불변 영역이 두 번째 생물종으로부터 유래하는 면역글로불린 또는 항체를 가리킨다. 키메라 면역글로불린 또는 항체는, 예를 들어 유전공학에 의해, 상이한 생물종에 속하는 면역글로불린 유전자 단편으로부터 구축될 수 있다. 용어 "인간화 면역글로불린" 또는 "인간화 항체"는 본원에 정의된 바와 같은 키메라 면역글로불린 또는 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 인간화 면역글로불린 또는 항체가 그 구조상으로는 키메라이지만(즉, 하나 초과의 단백질 종으로부터 유래된 영역을 포함함), 그들은 본원에 정의된 바와 같이, 키메라 면역글로불린 또는 항체에서 발견되지 않는 부가적 특징(즉, 제공자 CDR 잔기 및 수용자 골격 잔기를 포함하는 가변 영역)을 포함한다.
이와 같은 키메라 및 인간화 단클론 항체는 당해 분야에 공지된 재조합 DNA 기법에 의해, 예를 들어 [Robinson 등, 국제 특허출원 PCT/US86/02269; Akira 등, 유럽 특허출원 제184,187호; Taniguchi, M., 유럽 특허출원 171,496; Morrison 등, 유럽 특허출원 제173,494호; Neuberger 등, PCT 국제 특허출원 WO 86/01533; Cabilly 등, 미국 특허 4,816,567; Cabilly 등, 유럽 특허출원 125,023; Better 등(1988) Science 240:1041-1043; Liu 등(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu 등(1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun 등(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura 등(1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood 등(1985) Nature, 314:446-449; 및 Shaw 등(1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, S. L.(1985) Science 229:1202-1207; Oi 등(1986) BioTechniques 4:214; Winter 미국 특허 5,225,539; Jones 등(1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan 등(1988) Science 239:1534; 및 Beidler 등(1988) J. Immunol. 141:4053-4060]에 기재된 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
예를 들어 항체의 다른 부분, 예를 들어 불변 영역을 결실, 부가 또는 치환시킴으로써 변형된 단클론, 키메라 및 인간화 항체도 또한 본 발명의 범위 내에 속한다. 예를 들어, 항체는 하기와 같이 변형될 수 있다: (i) 불변 영역을 또 다른 불변 영역, 예를 들어 항체의 반감기, 안정성 또는 친화성을 증가시키도록 의도된 불변 영역, 또는 또 다른 생물종 또는 항체 부류로부터 유래된 불변 영역으로 대체함; 또는 (ii) 불변 영역 내 하나 이상의 아미노산을 변형하여, 그 중 예를 들어 글리코실화 부위의 수, 효과기 세포 기능, Fc 수용체(FcR) 결합, 보체 고정을 변화시킴. 항체 불변 영역을 변화시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 변화된 기능, 예를 들어 세포상의 효과기 리간드, 예컨대 FcR에 대한 변화된 친화성을 갖는 항체, 또는 보체의 C1 성분은, 항체의 불변 부분 내 하나 이상의 아미노산 잔기를 상이한 잔기로 대체함으로써 생산될 수 있다(예를 들어, 유럽 특허 제388,151 A1호, 미국 특허 제5,624,821호 및 미국 특허 제5,648,260호 참조, 이 문헌들 모두의 내용은 본원에 참조로서 인용된다). 쥐과 또는 다른 생물종의 면역글로불린에 적용되는 경우에 이러한 기능을 감소시키거나 제거할 유사한 유형의 변화도 기술될 수 있다.
예를 들어, FcR(예를 들어, Fc 감마 R1), 또는 C1q 결합을 위한 항체(예를 들어, IgG, 예컨대 인간 IgG)의 Fc 영역의 친화성은, 명시된 잔기(들)를 그 측쇄상의 적절한 관능성을 갖는 잔기(들)로 대체함으로써, 또는 하전된 관능기, 예를 들어 글루타메이트 또는 아스파테이트, 또는 아마도 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 또는 알라닌과 같은 방향족 비-극성 잔기를 도입함으로써, 변화시킬 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호 참조).
유전자 형질전환 동물 및 파아지 디스플레이에서 수득된 인간 항체
대안적으로는, 면역화 시에 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전자 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 이제 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 접합 영역(JH) 유전자의 동종접합(homozygous) 결실이 내인성 항체 생산의 완전한 저해를 초래한다고 기술되었다. 그와 같은 배선 돌연변이 마우스에서의 인간 배선 면역글로불린 유전자 배열의 이전은 항원 유발검사 시에 인간 항체의 생산을 초래한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,150,584호; 제6,114,598호; 및 제5,770,429호 참조.
완전 인간 항체는 또한 파아지 디스플레이 라이브러리에서 유도될 수 있다(Hoogenboom 등, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)).
이중특이적 항체, 항체 융합 폴리펩티드, 및 단쇄 항체
이중특이적 항체(BsAbs)는 둘 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 그와 같은 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab)'2 이중특이적 항체)으로부터 유래할 수 있다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 짝의 공동발현을 기초로 하는데, 여기에서 두 사슬은 상이한 특이성을 가진다(Millstein 등, Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 조합으로 인해, 이들 하이브리도마(쿼드로마(quadroma))는 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산한다(WO 93/08829 및 Traunecker 등, EMBO J., 10:3655-3659 (1991) 참조).
이중특이적 항체는 또한 가교되거나 "이형접합체(heteroconjugate)" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이형접합체 내 항체 중 하나는 아비딘에 커플링될 수 있고, 다른 하나는 비오틴 또는 다른 하중(payload)에 커플링될 수 있다. 이형접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적당한 가교제는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 미국 특허 제4,676,980호에 수많은 가교 기법들과 함께 개시되어 있다.
또 다른 실시양태에서는, 항체는 하중 도메인, 예를 들어 면역독소에 화학적으로 또는 유전자적으로 융합되어 항체 융합 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 그러한 하중에는, 예를 들어 면역독소, 화학요법제, 및 방사성 동위원소가 포함되며, 이들은 모두 당해 분야에 공지되어 있다.
단쇄 항체가 또한 본 발명에 따른 안정화에 적당하다. 단편은 연결기를 이용하여 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는데, 연결기는 각 가변 영역이 서로와 접속되게 하고, VL 및 VH 영역이 유래되는 기원인 모체 항체의 항언 결합 포켓을 재생성한다. Gruber 등, J. Immunol., 152:5368 (1994) 참조.
항-Aβ 항체
일반적으로, 본 발명의 항체는 Aβ 펩티드를 표적화함으로써 아밀로이드원성 질환, 특히 알쯔하이머병을 치료하기 위한 항체를 포함한다.
용어 "아밀로이드원성(amyloidogenic) 질환"에는 불용성 아밀로이드 원섬유의 형성 또는 축적과 관련된 (또는 그로 인한) 임의의 질환이 포함된다. 예시적인 아밀로이드원성 질환에는 전신성 아밀로이드증, 알쯔하이머병, 성인 당뇨병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 전두측두 치매, 및 프라이온-관련 전파성 스폰지상 뇌병증(각각 인간에서는 구루 및 크로이츠펠트-야콥병, 및 양 및 소에서는 스크래피 및 BSE)이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 상이한 아밀로이드원성 질환은 축적되는 원섬유의 폴리펩티드 성분의 성질에 의해 정의되거나 특성화된다. 예를 들어, 알쯔하이머병을 가진 대상 또는 환자에서는, β-아밀로이드 단백질(예를 들어, 야생형, 변이체 또는 두절된(truncated) β-아밀로이드 단백질)이 아밀로이드 축적의 특징적인 폴리펩티드 성분이다. 따라서 알쯔하이머병은, 예를 들어 대상 또는 환자의 뇌내 "Aβ의 축적으로 특징지어지는 질환" 또는 "Aβ의 축적과 관련된 질환"의 한 예이다. 용어 "β-아밀로이드 단백질," "β-아밀로이드 펩티드", "β-아밀로이드", "Aβ", 및 "Aβ 펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "면역원제" 또는 "면역원"은 포유동물에게, 경우에 따라 보조제와 함께 투여 시에 자신에 대한 면역학적 반응을 유도할 수 있다.
용어 "Aβ 항체", "항-Aβ 항체", 및 "항-Aβ"는 본원에서, APP, Aβ 단백질 또는 둘 다의 하나 이상의 에피토프 또는 항원결정자에 결합하는 항체를 가리키는 것으로 상호교환적으로 사용된다. 예시적인 에피토프 또는 항원결정자는 인간 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 내에서 찾을 수 있지만, 바람직하게는 APP의 Aβ 펩티드 내에서 발견된다. APP의 복수의 아이소형(isoform), 예를 들어 APP695, APP751 및 APP770이 존재한다. APP 내 아미노산은 APP770 아이소형의 서열에 따라 번호가 매겨진다(예를 들어, 젠뱅크(GenBank) 수탁번호 P05067 참조). Aβ(본원에서는 베타 아밀로이드 펩티드 및 A 베타라고도 함) 펩티드는 APP의 39 내지 43개의 아미노산의 ~4-kDA 내부 단편(Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42, 및 Aβ43)이다. 예를 들어, Aβ40은 APP의 잔기 672-711 번으로 이루어지고, Aβ42는 APP의 잔기 672-713 번으로 이루어진다. 상이한 시크리타제(secretase) 효소에 의해 생체내 또는 현장내 APP의 단백질분해 가공의 결과로서, Aβ는 아미노산 40 개 길이의 "짧은 형태", 및 아미노산 42 내지 43 개 범위의 길이의 "긴 형태" 모두로 발견된다. 에피토프 또는 항원결정자는 Aβ 펩티드의 N-말단 내에 위치할 수 있고, Aβ의 아미노산 1-10번 이내, 바람직하게는 Aβ42의 잔기 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 2-7, 3-6 또는 3-7로부터, 또는 Aβ의 잔기 2-4, 5, 6, 7 또는 8, Aβ의 잔기 3-5, 6, 7, 8 또는 9, 또는 Aβ42의 잔기 4-7, 8, 9 또는 10 이내의 잔기를 포함할 수 있다. "중앙" 에피토프 또는 항원결정자는 Aβ 펩티드의 중앙 또는 중간부분 이내에 위치하며, Aβ의 아미노산 16-24, 16-23, 16-22, 16-21, 19-21, 19-22, 19-23 또는 19-24 이내의 잔기를 포함한다. "C-말단" 에피토프 또는 항원결정자는 Aβ 펩티드의 C-말단 이내에 위치하며, Aβ의 아미노산 33-40, 33-41, 또는 33-42 이내의 잔기를 포함한다.
다양한 실시양태에서는, Aβ 항체가 말단 특이적이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "말단-특이적"은 Aβ 펩티드의 N-말단 또는 C-말단 잔기에 특이적으로 결합하지만, 그 잔기를 포함하는 더 긴 Aβ 종 내에서나 APP 내에 존재하는 경우에는 동일한 잔기를 인식하지 않는 항체이다.
다양한 실시양태에서는, Aβ 항체가 "C-말단특이적"이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "C-말단-특이적"은 항체가 Aβ 펩티드의 자유 C-말단을 특이적으로 인식함을 의미한다. C-말단-특이적 Aβ 항체의 예에는: 잔기 40번에서 종료되는 Aβ 펩티드는 인식하지만 잔기 41, 42 및/또는 43에서 종료하는 Aβ 펩티드는 인식하지 않는 것; 잔기 42에서 종료하는 Aβ 펩티드는 인식하지만, 잔기 40, 41 및/또는 43에서 종료하는 Aβ 펩티드는 인식하지 않는 것 등이 포함된다.
한 실시양태에서는, 항체가 3D6 항체 또는 그의 변이체, 또는 10D5 항체 또는 그의 변이체일 수 있으며, 양쪽 다 미국 특허출원 공보 제2003/0165496A1호, 미국 특허출원 공보 2004/0087777 A1, 국제 특허출원 공보 WO02/46237 A3에 기재되어 있다. 3D6 및 10D5의 기재는, 예를 들어 국제 특허출원 공보 WO02/088306 A2 및 국제 특허출원 공보 WO02/088307 A2에서도 찾을 수 있다. 3D6는 인간 β-아밀로이드 펩티드, 구체적으로 잔기 1-5에 위치한 N-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 단클론 항체(mAb)이다. 비교하자면, 10D5는 인간 β-아밀로이드 펩티드, 구체적으로 잔기 3-6에 위치한 N-말단에 특이적으로 결합하는 mAb이다. 또 다른 실시양태에서는, 항체가 미국 특허출원 공보 20040082762 A1 및 국제 특허출원 공보 WO03/077858 A2에 기재된 12B4 항체 또는 그의 변이체일 수 있다. 12B4는 인간 β-아밀로이드 펩티드, 구체적으로 잔기 3-7에 위치한 N-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다. 또 다른 실시양태에서는, 항체가 미국 특허출원 제10/858,855호 및 국제 특허출원 제PCT/US04/17514호에 기재된 12A11 항체 또는 그의 변이체일 수 있다. 12A11은 인간 β-아밀로이드 펩티드, 구체적으로 잔기 3-7에 위치한 N-말단 에피토프에 특이적으로 결합하는 mAb이다. 또 다른 실시양태에서는, 항체가 미국 특허출원 제10/789,273호, 및 국제 특허출원 WO01/62801 A2에 기재된 266 항체일 수 있다. 본 발명에서의 사용을 위한, 인간 β-아밀로이드 펩티드에 위치한 C-말단 에피토프에 특이적으로 결합하도록 고안된 항체는 미국 특허 제5,786,160호에 기재된 369.2B를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
예시적인 실시양태에서는, 항체가 Aβ 펩티드와 선택적으로 결합하는, 인간화 항-Aβ 펩티드 3D6 항체, 인간화 항-Aβ 펩티드 12A11 항체, 인간화 항-Aβ 펩티드 10D5 항체, 인간화 항-Aβ 펩티드 12B4 항체 및 인간화 항-Aβ 펩티드 266 항체로부터 선택된다. 보다 구체적으로는, 인간화 항-Aβ 펩티드 3D6 항체는 뇌(예를 들어, 알쯔하이머병을 앓는 환자의 뇌)의 플라크 축적물에서 발견되는 인간 β-아밀로이드 1-40 또는 1-42 펩티드에 위치한 NH2-말단 에피토프에 특이적으로 결합하도록 고안되었다.
Fc 융합
일부 실시양태에서는, 본 발명의 핵산 분자가 융합 또는 키메라 단백질을 코딩한다. 융합 단백질은 표적화 부분, 예를 들어가용성 수용체 단편 또는 리간드, 및 면역글로불린 사슬, Fc 단편, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE를 포함하는 다양한 아이소타입의 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 수용체의 세포외 도메인을 포함할 수 있고, 예를 들어 인간 면역글로불린 Fc 사슬(예를 들어, 인간 IgG, 예를 들어 인간 IgG1 또는 인간 IgG4, 또는 그의 돌연변이 형태)에 융합될 수 있다. 한 실시양태에서는, 인간 Fc 서열이 하나 이상의 아미노산에서 돌연변이, 예를 들어 야생형 서열의 잔기 254 및 257번에서 돌연변이되어, Fc 수용체 결합을 감소시켰다. 융합 단백질은 부가적으로 제1 부분을 제2 부분, 예를 들어 면역글로불린 단편에 연결시키는 연결기 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 펩티드 연결기, 예를 들어 약 4 내지 20, 보다 바람직하게는 5 내지 10개의 아미노산 길이의 펩티드 연결기를 포함할 수 있으며; 펩티드 연결기는 길이가 아미노산 8개이다. 예를 들어, 융합 단백질은 식(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y(여기에서, y는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8임)를 갖는 펩티드 연결기를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서는, 부가적 아미노산 서열이 융합 단백질의 N- 또는 C-말단에 부가되어, 발현, 입체 유연성, 검출 및/또는 분리 또는 정제를 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 키메라 또는 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 단편은 통상적 기법에 따라, 예를 들어 결찰을 위한 둔단(blunt-ended) 또는 회선단(stagger-ended) 말단, 적절한 말단을 제공하는 제한효소 소화, 적절한 경우, 점착 말단의 충진, 원치 않는 결합을 피하기 위한 알칼리 포스파타제 처리, 및 효소 결찰을 채택함으로써, 함께 인-프레임(in-frame)으로 결찰된다. 또 다른 실시양태에서는, 융합 유전자가 자동화 DNA 합성기를 포함하는 통상적 기법에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로는, 유전자 단편의 PCR 증폭이, 2개의 연속적 유전자 단편 사이의 상보적 돌출부분을 발생시키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있으며, 돌출부분은 이어서 어닐링되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있다(예를 들어, Ausubel 등(편저) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992 참조). 더욱이, 융합 부분(예를 들어, 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역)을 코딩하는 다수의 발현 벡터가 상업적으로 이용가능하다. 면역글로불린 융합 폴리펩티드는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제5,516,964호; 제5,225,538호; 제5,428,130호; 제5,514,582호; 제5,714,147호; 및 제5,455,165호에 기재되어 있다.
핵산 분자, 구축물 및 벡터
본 발명의 예시적 실시양태는 원치 않거나 목적하지 않는 부산물, 특히 원치 않거나 목적하지 않는 항체(또는 면역글로불린) 부산물을 제거하도록 설계된 공학처리된 구축물을 특징으로 한다. 특정한 측면에서는, 구축물이 천연 발생 항체 유전자 서열의 성분을 포함하는데, 여기에서 성분은, 수득되는 구축물이 원치 않거나 목적하지 않는 부산물의 부재 하에 관심 목적 단백질(예를 들어, 항체)를 발현하도록 유전자적으로 변화, 변형 또는 공학처리된다(예를 들어, 유전자적으로 공학처리된다). 구축물은 하기에 상세히 설명하는 바와 같이, 당해 분야에서 인정된 재조합 핵산 분자(예를 들어, 면역글로불린 사슬 유전자의 성분을 포함하는 것)의 생산을 위한 기법을 사용하여 생성될 수 있다.
항체 유전자 서열은, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA1, IgA2, IgD, 또는 IgE를 포함하는 다양한 아이소타입의 항체를 코딩한다. 바람직하게는, 항체 유전자 서열은 IgG 아이소타입의 항체를 코딩한다. 코딩된 면역글로불린 또는 항체 분자는 전장(예를 들어, IgG1 또는 IgG4 면역글로불린)을 포함할 수 있거나, 대안적으로 단편(예를 들어, Fc 단편)만을 포함할 수 있다.
당업자는, 본 발명의 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 본 출원서에 기술된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열로부터, 또는 유전자 코드 및 표준 분자생물학 기법을 이용하여 당해 분야에 공지된 면역글로불린 유전자 서열의 부가적 공급원으로부터, 유래될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 핵산 조성물은 공지된 면역글로불린 DNA(예를 들어, cDNA 서열)로부터 유래될 수 있다. 특히, 뉴클레오티드 서열은 천연 V, D, J 또는 불변 cDNA 서열과 실질적으로 동일하거나, 그로부터 유래될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 바람직하게는, 불변 영역은 인간이지만, 다른 생물종, 예를 들어 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트), 영장류(짧은꼬리원숭이), 낙타, 또는 토끼로부터 유래된 불변 영역 또한 사용될 수 있다. 이러한 생물종으로부터 유래된 불변 영역은 당해 분야에 공지되어 있으며(예를 들어, Kabat, E. A. 등(1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, 제5 판, 미국 보건복지부, NIH 출판번호 91-3242), 이러한 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있다. 중쇄 불변 영역의 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 NCBI NG_001019에서 찾을 수 있다. 일부 실시양태에서는, 불변 영역이 IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fc 단편 중쇄 유전자에 있어서는, Fc-코딩 DNA가 직접적인 발현을 위해 중쇄 리더 서열(예를 들어, 중쇄 가변 사슬 리더 서열)에 작동적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 부가적 측면에는 조립된 면역글로불린 DNA 카세트 서열이 포함된다. 조립된 면역글로불린 카세트 서열에는 면역글로불린 DNA 카세트 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 비롯한 뉴클레오티드 서열이 포함된다.
예시적인 인간 IgG1 불변 영역 게놈 서열을 하기에 제공한다:
Figure 112007033551121-PCT00001
예시적 IgG4 불변 영역 게놈 서열을 하기에 제공한다:
Figure 112007033551121-PCT00002
항체 생산
본 발명의 항체는 통상 재조합 발현에 의해 생산된다. 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산은 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 경쇄 및 중쇄는 동일하거나 상이한 발현 벡터 내에서 클로닝될 수 있다. 면역글로불린 사슬을 코딩하는 DNA 단편은 면역글로불린 폴리펩티드의 발현을 확실히 하는, 발현 벡터(들) 내 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 발현 조절 서열에는 프로모터(예를 들어, 천연 수반되거나 이종유래 프로모터), 신호 서열, 인핸서 구성요소 및 전사 종결 서열이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포(예를 들어, COS 또는 CHO 세포)를 형질변환시키거나 트랜스펙션시킬 수 있는 벡터 내의 진핵생물 프로모터 시스템이다.
상기 기재한 바와 같은 본 발명의 폴리펩티드를 제공하기 위해 분리된 유전자 물질을 조작한 후에는, 유전자는 통상, 청구된 폴리펩티드를 제공하는, 목적하는 양의 변형된 항체를 생산하는데 사용될 수 있는 숙주 세포 내로 도입을 위해 발현 벡터에 삽입된다. 용어 "벡터"는 종종 핵산, 예를 들어 유전자를 포함하고, 핵산 복제, 전사, 안정성 및/또는 숙주 세포로부터의 단백질 발현 또는 분비에 필요한 최소한의 구성요소를 추가로 포함하는 핵산 구축물을 포함한다. 그러한 구축물은 염색체외 구성요소로서 존재할 수도 있고, 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수도 있다.
용어 "발현 벡터"는, 핵산 구축물이 목적 단백질 생성물의 고수준 발현을 위해 최적화된 특정 타입의 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 종종 특정 세포 유형에서의 고수준의 전사를 위해 최적화되고/되거나, 발현이 특정 유도제의 사용에 의거하게끔 구성되도록 최적화된 전사 조절제, 예컨대 프로모터 및 인핸서 구성요소를 가진다. 발현 벡터는 또한 단백질의 적절하고/하거나 증대된 번역을 제공하는 서열을 추가로 가진다. 당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 그러한 벡터는 플라스미드, 파아지, 바이러스 및 레트로바이러스로 구성된 군에서 용이하게 선택될 수 있다. 용어 "발현 카세트"는 유전자를 함유하고, 그 유전자 외에도 숙주 세포 내에서의 유전자의 적절하고/하거나 증대된 발현을 허용하는 구성요소를 갖는 핵산 구축물을 포함한다.
용어 "작동가능하게 연결된"은, 성분들이 그 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는(예를 들어, 기능적으로 연결된) 근접부위를 포함한다. 일례로서, 관심 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터/인핸서는 상기 폴리뉴클레오티드에, 관심 폴리뉴클레오티드의 발현이 그 프로모터/인핸서에 의해 지시되는 발현을 활성화하는 조건 하에서 달성되도록 연결되어 있다. 본원에 기술된 본 발명에 대해서는, 작동가능하게 연결됨은 관심 유전자의 일차 전사물(전구-mRNA)에서 발견되는 스플라이스 제공자 및 스플라이스 수용자 부위의 관계를 포함한다. 보통, 스플라이스 수용자 및 제공자 부위는, 스플라이싱 이벤트가 일어나기 위해서는 두 서열이 필요하고 함께 기능하여 성숙한 메신저 RNA를 생성하도록 작동가능하게 연결되어 있다.
"천연 작동적 회합"이란 구절은 자연 또는 천연 상태로 발견되는 유전자의 인트론 및 엑손 조직구조를 가리킨다. 관심 유전자를 클로닝하는 한 접근법은 엑손 및 인트론을 모두 포함하여 그 유전자의 핵산을 분리하고, 핵산 서열을 핵산 서열의 증폭을 위해 벡터 내로 삽입하는 것을 포함한다. 이 유전자 서열 전체는 또한 동일하거나 상이한 생물종 내에서 단백질의 발현에 유용한 발현 벡터 내로 삽입될 수도 있다. 유전자가 그 천연 상태로 존재하는 것으로 발견되는 것처럼 인트론 및 엑손을 함유하도록 클로닝되는 경우, 인트론 및 엑손은 그 천연 작동적 회합을 유지한다고 할 수 있다.
발현 벡터는 통상 숙주 생물체 내에서, 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합적 일부로서 복제가능하다. 흔히, 발현 벡터는 목적 DNA 서열로 형질변환된 세포의 검출을 허용하는 선택 마커(예를 들어, 암피실린-내성, 하이그로마이신-내성, 테트라사이클린 내성, 카나마이신 내성 또는 네오마이신 내성)를 함유한다(예를 들어, Itakura 등, 미국 특허 제4,704,362호 참조). 면역글로불린 DNA 카세트 서열, 삽입 서열, 및 조절 서열 이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 부가적 서열, 예컨대 숙주 세포 내에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제기점) 및 선별 마커 유전자를 지닐 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(예를 들어, 미국 특허 제4,399,216호, 4,634,665호 및 5,179,017호 참조, 모두 Axel 등에 허여됨). 예를 들어, 통상 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에서 약물, 예컨대 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별 마커 유전자는 (메토트렉세이트 선택/증폭을 이용하여 dhfr- 숙주 세포에 사용하기 위한) 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자, 및 (G418 선택용) 네오 유전자를 포함한다.
일단 벡터가 적절한 숙주 내로 혼입되면, 숙주는 뉴클레오티드의 고수준 발현, 및 목적 항체의 수집 및 정제에 적당한 조건 하에서 유지된다. 포유류 세포가 본 발명의 항체의 발현 및 생산에 바람직하다. 예를 들어, [Winnacker, From Genes to Clones, VCH 출판사, 뉴욕주 뉴욕(1987)] 참조. 진핵세포가 바람직한데, 그 이유는 이종유래 단백질(예를 들어, 비변형 면역글로불린)을 분비할 수 있는 다수의 적당한 숙주 세포주가 당해 분야에서 개발되었기 때문이고, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, 바람직하게는 골수종 세포주 또는 형질변환된 B-세포 또는 하이브리도마를 포함한다. 바람직하게는, 세포는 비-인간 세포이다. 본 발명의 항체의 발현에 바람직한 포유류 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)([Urlaub 및 Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재되고, 예를 들어 [Kaufman 및 Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선별 마커와 함께 사용되는 dhfr- CHO 세포 포함), 림프세포 세포주, 예를 들어 NSO 골수종 세포 및 SP2 세포, COS 세포, 및 유전자 형질전환 동물 유래의 세포, 예를 들어 유선 상피 세포를 포함한다. 기타 적당한 숙주 세포들이 당업자에게 공지되어 있다.
이러한 세포를 위한 발현 벡터는 발현 조절 서열, 예컨대 복제기점, 프로모터, 및 인핸서 (Queen 등, Immunol. Rev. 89:49 (1986)), 및 필요한 가공 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스, 시토메갈로바이러스 등에서 유래된 프로모터이다. 예를 들어, [Co 등, (1992) J. Immunol. 148:1149] 참조. 포유류 숙주 세포 발현에 바람직한 조절 서열은 포유류 세포에서 고수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 구성요소, 예컨대 FF-1a 프로모터 및 BGH 폴리 A, 시토메갈로바이러스(CMV)(예컨대 CMV 프로모터/인핸서), 시미안 바이러스 40(SV40)(예컨대 SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 메이저 레이트 프로모터(AdMLP)), 및 폴리오마에서 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 바이러스 조절 구성요소, 및 그의 서열에 관한 추가적 기재에 대해서는, 예를 들어 Stinski에 허여된 미국 특허 제5,168,062호, Bell 등에 허여된 미국 특허 제4,510,245호, 및 Schaffnerr 등에 허여된 미국 특허 제4,968,615호를 참조한다. 예시적 실시양태에서는, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자가 유전자의 고수준의 전사를 촉진하도록 인핸서/프로모터 조절 구성요소(예를 들어, SV40, CMV, 아데노바이러스 등에서 유래된 것, 예컨대 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 구성요소 또는 SV40 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 구성요소)에 작동적으로 연결되어 있다. 본 발명의 예시적인 실시양태에서는, 구축물은 진핵 숙주 세포 내에서 본 발명의 폴리펩티드를 비교적 고수준으로 제공하도록 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함한다. 상용성 IRES 서열이 본원에도 인용된 미국 특허 제6,193,980호에 개시되어 있다.
대안적으로는, 항체-코딩 서열은 유전자 형질전환 동물의 게놈 내로 도입 및 그 후의 유전자 형질전환 동물의 젖에서의 발현을 위해 이전유전자(transgene) 내에 혼입될 수 있다(예를 들어, Deboer 등, U.S. 제5,741,957호, Rosen, U.S. 제5,304,489호, 및 Meade 등, U.S. 제5,849,992호 참조). 적당한 이전유전자에는 유선 특이적 유전자, 예컨대 카세인 또는 베타 락토글로불린에서 유래된 프로모터 및 인핸서와 작동가능하게 연결된 경쇄 및/또는 중쇄를 위한 코딩 서열이 포함된다.
원핵 숙주 세포도 또한 본 발명의 항체를 생산하는데 적당할 수 있다. 이. 콜라이(E. coli)는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA 서열)를 클로닝하는데 특히 유용한 한 원핵생물 숙주이다. 사용에 적당한 기타 미생물 숙주에는 바실루스, 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 엔테로박테리아시에(enterobacteriaceae), 예컨대 대장균(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 및 세라티아(Serratia), 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종이 포함된다. 이러한 원핵생물 숙주에서는, 통상 숙주 세포와 상용적인 발현 조절 서열(예를 들어, 복제기점)을 함유하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 또한, 임의 수의 다양한 공지 프로모터, 예컨대 락토오스 프로모터 시스템, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파아지 람다의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 통상 발현, 경우에 따라 작동자 서열을 이용한 발현을 조절할 것이고, 전사 및 번역의 개시 및 완료를 위해 리보솜 결합 부위 서열 등을 가질 것이다.
원핵생물 내 단백질의 발현은 가장 빈번하게는 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 이용하여, 이. 콜라이 내에서 수행된다. 융합 벡터는 항체의 특이성 또는 항원 인식에 영향을 미치지 않으면서, 수개의 아미노산을 거기에 코딩되어 있는 항체에, 빈번하게는 재조합 항체의 불변 영역에 부가한다. 융합 펩티드의 아미노산의 부가는 항체에 부가적 기능, 예를 들어 마커(예를 들어, myc 또는 flag과 같은 에피토프 태그)로서의 부가적 기능을 첨가할 수 있다.
기타 미생물, 예컨대 효모도 또한 발현에 유용하다. 사카로마이세스(Saccharomyces)는, 필요한 대로 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터), 복제기점, 종결 서열 등을 갖는 적당한 벡터를 가진 바람직한 효모 숙주이다. 전형적인 프로모터에는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 기타 당분해 효소가 포함된다. 유도성 효모 프로모터에는, 그 중에서도 알코올 데히드로게나제 유래 프로모터, 이소시토크롬 C, 및 말토오스 및 갈락토오스 활용을 담당하는 효소가 포함된다.
대안적으로는, 본 발명의 항체는 유전자 형질전환 식물(예를 들어, 담배, 옥수수, 대두 및 알팔파)에서 생산될 수 있다. 개선된 "식물체(plantibody)" 벡터(Hendy 등(1999) J. Immunol. Methods 231:137-146) 및 형질변환 가능한 곡식 종의 증가와 결부된 정제 전략은, 그와 같은 방법이 비단 인간 및 동물 요법뿐만 아니라 공업적 응용(예를 들어, 촉매 항체)을 위한 재조합 면역글로불린을 생산하는 실용적이고 효율적인 수단이 되게 한다. 더욱이, 식물에서 생산된 항체는 안전하고 효과적인 것으로 나타났으며, 동물 유래 물질의 사용, 및 따라서 전파가능한 스펀지형 뇌병증(TSE)제의 오염의 위험을 피하게 한다. 또한, 식물과 포유류 세포-생산된 항체의 글리코실화 패턴의 차이점은 항원 결합 또는 특이성에 영향이 거의 없거나 전혀 없다. 또한, 식물 유래의 분비 이량체 IgA 항체의 국소적 경구 적용을 받은 환자에서는 독성 또는 HAMA의 증거가 관찰되지 않았다(예를 들어, Larrick 등(1998) Res. Immunol. 149:603-608 참조).
다양한 방법이 유전자 형질전환 식물에서 재조합 항체를 발현시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄를 발현 벡터(예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 벡터) 내로 독립적으로 클로닝할 수 있고, 그 후에 시험관 내에서 재조합 박테리움을 이용하여 식물 조직을 형질변환시키거나, 예를 들어 벡터로 코팅된 입자를 이용하여 형질변환시키고, 이것을 예를 들어 유전자총(ballistics)을 이용하여 물리적으로 식물 조직 내에 도입시킨다. 이어서, 개별 사슬을 발현하는 식물 전체를 복원시키고, 성별 교차(sexual cross)시켜, 궁극적으로 완전히 조립된 기능적 항체를 생산하게 된다. 유사한 프로토콜이 담배 식물에서 기능적 항체를 발현하는데 사용되었다(예를 들어, Hiatt 등(1989) Nature 342:76-87 참조). 다양한 실시양태에서는, 조립되지 않은 항체 사슬의 발현, 결합 및 접힘을 촉진하는데 신호 서열이 이용될 수 있는데, 사슬을 적절한 식물 환경(예를 들어, 아포플라스마(apoplasm) 또는 덩이줄기, 과실 또는 종자를 포함한 기타 특정 식물 조직의 수성 환경)으로 인도함으로써 이루어진다(Fiedler 등(1995) Bio/Technology 13:1090-1093 참조). 식물 생물반응기 또한 항체 수율을 증가시키고 비용을 현저히 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
적당한 숙주 세포가 [Goeddel(1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, 미국 캘리포니아주 샌디에고]에 추가 기술되어 있다. 대안적으로는, 재조합 발현 벡터는 시험관 내에서, 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 이용하여 전사되고 번역될 수 있다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 중쇄 및 경쇄 코딩 서열 및 발현 조절 서열)을 함유하는 벡터는 잘 알려진 방법을 통해 숙주 세포 내로 이송될 수 있는데, 그 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 달라진다. 예를 들어, 염화칼슘 트랜스펙션이 원핵세포에 흔히 이용되는 반면, 인산칼슘 처리, 전기천공, 리포펙션, 유전자총 또는 바이러스 이용 트랜스펙션이 다른 세포 숙주에 이용될 수 있다. (포괄적으로 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 참조(Cold Spring Harbor Press, 제2판, 1989), 이는 모든 목적을 위해 본원에 그 전체가 참조로 인용된다). 포유류 세포를 형질변환시키는데 사용되는 다른 방법에는 폴리브렌(polybrene)의 사용, 프로토플라스트(protoplast) 융합, 리포좀, 전기천공, 및 마이크로인젝션(microinjection)이 포함된다(포괄적으로, [Sambrook 등, 상기 문헌] 참조). 유전자 형질전환 동물의 생산을 위해서는, 이전유전자가 수정된 난자 내로 마이크로인젝션될 수 있거나, 또는 배아 줄기세포의 게놈 내로 혼입되고, 그러한 세포의 핵이 제핵 난자(enucleated oocyte) 내로 이전될 수 있다.
중쇄 및 경쇄가 별개의 발현 벡터상에서 클로닝되면, 벡터들은 공동-트랜스펙션되어 비변형 면역글로불린의 발현 및 조립체를 수득한다. 일단 발현되면, 본 발명의 항체 전체, 그의 이량체, 개별적 경쇄 및 중쇄, 또는 기타 면역글로불린 형태는 당해 분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있으며, 여기에는 황산암모늄 침전, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, HPLC 정제, 젤 전기영동 등이 포함된다 (포괄적으로, [Scopes, Protein Purification] 참조(스프링거 출판사, 뉴욕 (1982)). 약제학적 용도에는, 적어도 약 90 내지 95% 상동성을 가진 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하며, 98 내지 99% 또는 그 이상의 상동성이 가장 바람직하다.
본 발명에 따라 생산된 면역글로불린 또는 항체는 분자가 유도체화되거나, 또 다른 기능성 분자(예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질)에 연결될 수 있다. 따라서 본원에 기술된 본 발명의 항체 및 항체 부분 또는 항체의 다르게 변형된 형태는 연구, 진단 및/또는 치료적 맥락에서의 사용을 위해 추가로 유도체화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 하나 이상의 다른 분자 개체, 예컨대 또 다른 항체(예를 들어, 이중특이적 항체 또는 다이아바디(diabody)), 검출가능한 작용제, 세포독성제, 의약제, 및/또는 항체 또는 항체 부분과 또 다른 분자와의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩티드(예컨대 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)에 기능적으로(화학적 커플링, 유전자 융합, 비-공유 회합 또는 다른 것에 의해) 연결될 수 있다.
유도체화된 항체의 한 유형은 둘 이상의 항체(동일한 유형 또는 상이한 유형, 예를 들어이중특이적 항체를 생성하기 위해)를 가교시킴으로써 생성된다. 적당한 가교제에는 이종 이관능성인(heterobifunctional), 2개의 구별된 반응성 기가 적절한 스페이서(예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르)에 의해 분리된 것, 또는 동종 이관능성인(homobifunctional) 것(예를 들어, 디숙신이미딜 수버레이트)가 포함된다. 그러한 연결기는 미국 일리노이주 락포드 소재의 피어스 케미컬 컴퍼니(Pierce Chemical Company)에서 입수가능하다.
예시적인 형광 검출가능 작용제에는 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌술포닐 클로라이드, 파이코에리트린 등이 포함된다. 항체는 또한 검출가능한 효소, 예컨대 알칼리 포스파타제,호스래디쉬 퍼옥시다제, P-갈락토시다제, 아세틸콜린에스터라제, 글루코오스 옥시다제 등을 이용하여 유도체화될 수 있다. 항체가 검출가능한 효소를 이용하여 유도체화되는 경우에는, 효소가 검출가능한 반응 생성물을 생성하는데 사용하는 부가적 시약을 첨가함으로써 검출된다. 예를 들어, 검출가능한 작용제인 호스래디쉬 퍼옥시다제가 존재하는 경우, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가는 검출가능한, 착색된 반응 생성물을 초래한다. 항체는 또한 보조군(prosthetic group)(예를 들어, 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴)으로써 유도체화될 수 있다. 예를 들어, 항체는 비오틴을 이용하여 유도체화되고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접적 측정을 통해 검출될 수 있다. 적당한 형광 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 파이코에리트린이 포함되고; 발광 물질의 예에는 루미놀이 포함되고; 생물발광 물질의 예에는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿼린이 포함되고; 적당한 방사성 물질의 예에는 125I, 131I, 35S 또는 3H이 포함된다. 항체(또는 그의 단편) 또한 시토톡신 또는 기타 단백질 치료제와 같은 치료적 부분에 접합될 수 있다. 대안적으로는, 항체는 Segal에 의해 미국 특허 제4,676,980호에 기술된 바와 같이 제2 항체에 접합되어 항체 이형접합체를 형성할 수 있다.
원치 않는 폴리펩티드 부산물을 감소시키거나 제거하는 발현 벡터
치료 단백질을 위한 단백질 발현 시스템의 개발 중에는, 정제된 표적 생성물의 HPLC 분석은 예상하지 못한 저분자량(LMW) 펩티드 종을 확인하였다. 보다 구체적으로는, 목적하지 않는 폴리펩티드 부산물이 3D6 항체를 발현하도록 개발된 CHO(차이니즈 햄스터 난소) 세포주에서 관찰되었다. 이 항체는 다른 곳에서도 기술되었고, 알쯔하이머병의 치료에 유용한 면역치료제를 개발하려는 노력의 결과이다. 그것은 A-베타 펩티드에 대한 특이성을 가지고, A-베타 플라크를 제거하는데 효능이 있는 것으로 입증되었다. CHO 세포주가 당해 분야에서 허용된 방법을 이용하여 개발되었고, 세포를 함유하는 발현 카세트의 선택적 배양을 위한 유전자 이외에도 3D6 항체의 중쇄 및 경쇄의 복사체를 함유하였다.
세포주의 다수의 클론 분리물의 검사는, LMW 종의 생산이 이용되는 클론에 대한 특이적인 현상은 아니었다는 것을 입증하였다, 즉 시험한 세포주 모두에서 생산된 총 단백질의 적은 분획이 예상하지 못한 LMW 종의 것이었다. 단백질 발현이 유도되었을 때 LMW 종의 분획이 총 단백질에 비해 증가한 것이 추가로 관찰되었다. 질량 분광기를 이용한 폴리펩티드의 추가적 평가는, LMW 종이 유전자의 엑손 서열에 의해 예측되지 않은 아미노산을 함유하였다는 것을 나타내었다.
도 1의 상부 패널은, 인트론 및 엑손의 관계를 비롯하여 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 선별 마커 유전자의 위치를 나타내는 3D6 중쇄 발현 카세트를 도식적으로 나타낸다. 도시된 엑손은 가변 중쇄(VH1), 힌지 및 불변 중쇄 1, 2 및 3(CH1, CH2, CH3)이다. 발현 카세트의 인트론은 Int1, Int2, Int3 및 Int4로 표시된다. 도 1은 발현 카세트로부터 유래한 mRNA의 예상된 정확한 스플라이싱 이벤트를 추가로 도시한다. 중간 패널은 이(2)시스트론 전사물의 인트론 서열만을 함유하는, 정확히 스플라이싱된 mRNA를 나타낸다.
발현 벡터 내 인트론 및 엑손 서열의 정밀 검사 및 질량 분광기 데이터는 특정 스플라이스 부위 접합부의 RNA 중합효소 인트론 연속 판독(IRT)을 지적하였다. 발현 벡터 내에 함유된 인트론과 엑손 및 스플라이스 부위 제공자와 수용자의 편성은 그들이 유전자의 원래 게놈 형태에 존재한 바와 실질적으로 동일하였으므로, 스플라이싱 오류 이벤트는 예측가능하지 않았다.
도 1의 하부 패널은 제4 인트론의 인트론 연속 판독에 의해 생성된 예측된 생성물을 예시한다. 도 2는 3D6 항체 발현 벡터의 게놈 서열의 제4 인트론의 영역 내 DNA 서열의 센스 및 안티센스 가닥을 나타내는 서열 정보를 제공한다. 스플라이스 접합부(스플라이스 제공자 및 수용자 부위)는 핵산 서열에 직교하는 수직선에 의해 표시된다. 인트론 서열에 해당하는 DNA는 밑줄 쳐지고 이탤릭체로 나와있다. 목적하는 연속 판독 부산물 폴리펩티드에 대해 예측된 아미노산이 게놈 DNA의 안티센스 가닥 아래에 나타나 있다. 정확하게 스플라이싱된 RNA에서 유래한 폴리펩티드의 아미노산 서열은 굵은 대문자로 표시된다; 부정확하게 스플라이싱된 RNA에서 유래한 폴리펩티드 부산물은 소문자로 표시된다.
본 발명은, 인트론 연속 판독(IRT) 및 원치 않는 폴리펩티드 부산물이 실질적으로 완전히 감소 또는 제거되도록 단백질 발현 카세트 및 벡터를 설계하기 위한 물질 및 방법을 기술한다. 부분적으로는, 본 발명은 관심 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 내 인트론 및 엑손의 천연 작동적 회합이, IRT가 감소되거나 제거됨으로써 원치 않는 IRT 폴리펩티드 종을 감소시키거나 제거하도록 변경되는, 신규한 설계의 벡터를 제공한다. 고유한 변경은 특히 IgG1 또는 IgG4 항체에 적당하지만, 임의의 관심 유전자에 사용될 수 있다. 더욱이, 변경된 천연 작동적 회합을 갖는 인트론 및 엑손을 갖는 본 발명의 벡터는 감소되거나 제거된 IRT 부산물뿐만 아니라, 당해 분야에서 인정된 표준 기법을 사용하여 설계된 벡터에 비해 증가된 단백질 발현 수준을 입증한다.
물질 및 방법
실시예 전체를 통해, 달리 언급되지 않는 한 하기 본문에 예시된 바와 같은 물질 및 방법이 사용되었다:
일반적으로, 본 발명의 수행은 분자생물학, 재조합 DNA 기술, 및 면역학, 특히 예를 들어 항체 기술에서 당해 분야에서 인정된 기법을 이용한다. 예를 들어, [Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology)), 510, Paul, S., Human Press (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series 169), MoCaffrty 편저, IRL 프레스 (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow 등 Cold Spring Harbor Press (1999); 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등 편저, John Wiley & Sons (1992)] 참조.
실시예 1. 인트론 연속 판독 전사의 정량화
인트론 연속 판독으로 인해 형성된 변종 전사물의 상대적 양을 정량화하기 위해, 정량적 PCR 분석을 설계하였다. IRT 전사를 평가하는 접근법이 도 3에 그래프로 개략되어 있다. 구체적으로, 정량적 PCR 분석은 TaqMan3 시스템을 이용하여 고안되었는데, 이 시스템에서는 관심 핵산 종을 정량화하기 위해 PCR 증폭이 이용되었다. 3개의 프로브-프라이머 세트가 생산되는 인트론 연속 판독 mRNA의 분획을 결정하도록 고안되었다. 제1 프로브-프라이머 세트는 천연 작동적 회합된 관심 인트론과의 엑손의 서열 전사 수준을 정량화하도록 설계되었다. 3D6 중쇄 발현 카세트의 경우에는, 3D6 제2 불변 중쇄 (CH2) 엑손을 함유하는 mRNA 종이 표적화되었다. 이는 총 3D6 mRNA 생산의 척도를 제공하였다. 제2 프로브 프라이머 세트는 작동적 회합으로 인트론과 엑손을 연결하였는데, 여기에서는 3D6 발현 카세트의 CH2 엑손-제4 인트론 계면이다. 이 프로브 프라이머 세트에서 유래한 증폭은 5' 스플라이스 제공자 서열을 함유하는 인트론 연속 판독 전사물의 존재, 및 CH2 엑손과 인트론 4를 연결하는 서열을 나타내었다. 제3 프로브-프라이머 세트는 제4 인트론의 서열을 표적화하였다. 이 프로브 세트는 내부 인트론 4 서열을 포함하는, 부정확하게 스플라이싱된 RNA의 분획의 정량화를 제공하였다.
도 4는 기술한 바와 같은 프로브 프라이머 세트를 이용한 Q-PCR 분석의 결과를 나타낸다. 간략하게, 안정하게 통합된 발현 벡터를 함유하는 CHO 세포를 접종하고 배양액 중에 2 주간 유지하였다. 7일째에 배양액을 단백질 발현을 증가시키도록 유도하였다. 실험 과정 중에, 세포 배양액의 샘플을 분해하고, CH2 엑손에 특이적이거나 이전 문단에 기술한 바와 같은 인트론에 특이적인 프로브 및 프라이머 세트를 이용한 분석으로 RNA 내용물을 평가하였다. 도표는, 유도 전의 낮은 수준의 부정확하게 스플라이싱된 RNA 생성물, 및 RNA를 함유하는 인트론 4의 유도후 시간에 따라 증가하는 백분율을 입증한다. 본원에 기술한 이 Q-PCR 방법은 천연 작동적 회 합된 인트론 및 엑손을 함유하는 특정 발현 카세트가 인트론 연속 판독 부산물을 생성할 가능성을 예측한다.
3D6 항체 발현 시스템의 IRT의 정량화에 대한 세부사항이 명백하게 제공되는 한편, 그 기법은 IRT의 잠재가능성이 존재하는 임의의 단백질 발현 시스템에서 실시될 수 있다. 이 신규한 접근법은 따라서 본 발명의 벡터(하기에 상세히 기술됨)가 원치 않는 IRT 폴리펩티드 부산물의 생산이 피해지도록 관심 특정 단백질에 대해 이용되어야 할지를 평가하는데 특히 유용하다. IRT 전사가 약 0.1% 내지 1% 초과로 이용하면, 변경된 천연 작동적 회합을 채택하는 벡터는 목적 단백질을 발현하도록 이용될 수 있다. 당업자에게는, 인트론 연속 판독 mRNA를 검출하는 방법, 및 이에 따라 인트론 연속 판독 폴리펩티드를 예측하는 방법은 스플라이싱 이벤트가 일어나는 임의의 단백질 발현 시스템에 적용가능하다는 것이 자명할 것이다. 예를 들어, 시스템은 임의의 진핵세포 시스템, 예를 들어 사카로마이세스(Saccharomyces), 드로소필라(Drosophila), 마우스, 원숭이, 토끼, 랫트, 또는 인간 세포 이용 시스템과 함께 이용될 수 있다.
실시예 2. 변형된 천연 작동적 회합을 갖는 인트론 및 엑손을 가진 벡터
인트론 및 엑손의 천연 작동적 회합이 변형된 발현 벡터를 고안하였다. 2개의 예시적인 벡터 서열이 도 5에 나타나 있다. 이 도면은 인트론 연속 판독 부산물의 문제를 해결하도록 개발된 발현 구축물을 도시한다. 상부 패널은, 가변 영역 (VH), 3개의 불변 영역 (CH1, CH2, CH3) 및 힌지 영역을 위한 엑손을 함유하는 포괄 적 항체 중쇄의 게놈 인트론-엑손 조직을 그래프로 도시한다. 중간 및 하부 도면은 인트론 연속 판독 중쇄 부산물이 제거된 발현 벡터 내로 혼입된 게놈 서열에 대한 변형을 기재한다.
3D6 경쇄를 발현하는 CHO 세포를 3D6 항체의 완전한 게놈 중쇄 서열로써 형질변환시키거나, 인트론 및 엑손의 천연 작동적 회합이 변형된, 변형 3D6 중쇄 발현 벡터로써 형질변환시켰다. 물질 및 방법에 기술된 바와 같은 단백질 발현의 목적하에 표준 기법을 이용하여 세포를 배양하였다. 항체를 컨디셔닝된 상청액으로부터 정제하였고, 이어서 변성 역상 (RP) HPLC를 이용하여 분별하였다 (도 6). 칼럼은 항체의 중쇄 및 경쇄 구성성분이 분해되도록 가동되었다.
3D6 게놈 클론 단백질 제제의 분별을 나타내는 윗쪽 기록선(trace)에서는, 중쇄 및 경쇄 피크가 즉시 명백하다. 또한 작은 피크는 중쇄와 중쇄 인트론 연속 판독 생성물에 해당하는 경쇄 사이에 분별하여, 확인할 수 있다.
아랫쪽 기록선은 인트론 연속 판독의 문제가 감소된 발현 시스템의 일례이다. 윗쪽 기록선에서와 같이, 경쇄 및 중쇄 피크가 분명이 존재하지만, IRT의 수준이 검출 한계 미만으로 감소되었다. 이 발견은 엑손 및 인트론의 천연 작동적 회합이 변경된 다른 벡터에도 확대되었다. 예를 들어, 도 5에 기재된 HCΔ인트론 4 서열은 IRT를 검출불가능한 수준으로 유사하게 감소시킨다.
표 1은 도 5에 기재된 HCΔ인트론 4 서열의 세부사항을 기술한다.
[표 1]
hu3D6 v2 HC - Δ4
Figure 112007033551121-PCT00003
실시예 3. 인트론 제거가 단백질 발현을 증가시킴
항체 발현에 대한 인트론 제거의 효과를 판단하기 위해, 상이한 수의 인트론을 가진 항체의 발현 구축물을 생성하였다. 12A11v3.1의 가변 영역을, 게놈 서열, cDNA 서열, 및 3개의 인트론이 결실된(즉, CH1과 힌지 영역 사이의 인트론, 힌지 영역과 CH2 사이의 인트론, 및 CH2와 CH3 사이의 인트론) 게놈 서열을 함유하는 3개의 불변 영역 발현 구축물을 이용하여 CHO 세포에서 안정하게 발현시켰다. 12A11v3.1에 있어서는, 인트론의 제거가 항체 발현의 상당한 증가를 초래하였다. 보다 구체적으로, 게놈 서열에 비해 12A11v3.1의 인트론 3개가 결실된 구축물에서 약 다섯 배의 발현 증가가 검출되었다. cDNA 서열을 갖는 12A11v3.1 구축물은 게놈 서열에 비해 여섯 배가 넘는 발현 증가를 나타내었다. 반면, 잘 발현된 항체는 통상 CHO-세포 발현에서 인트론-결실된 서열과 게놈 서열 사이의 상당한 변화를 나타내지 않았다.
상술한 발명은 이해의 명료성의 목적으로 하여 상세히 설명하였지만, 특정 변형예가 첨부된 청구범위 내에서 수행될 수 있음이 명백하다. 본원에 인용된 모든 문헌 및 특허 문헌을 비롯하여 도면 및 서열 목록에 나타나는 원문은, 모든 목적 하에 각각 개별적으로 의미되는 것처럼 동일한 정도로 그 내용 전체가 참조로서 본원에 인용된다.
명세서는 본원에 참조로서 인용된, 명세서 내 인용된 참고문헌의 교시에 비추어 가장 잘 이해된다. 명세서 내 실시양태는 본 개시내용 내 실시양태의 예시를 제공하며, 그 범위를 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다. 당업자는, 다수의 다른 실시양태가 본 개시내용에 포함됨을 쉽게 인식한다. 본 개시내용에서 인용된 모든 문헌 및 특허, 및 수탁번호 또는 데이터베이스 참조 번호에 의해 확인된 서열은 그 내용 전체가 참조로서 인용된다. 참조로서 인용된 물질이 본 명세서와 대립하거나 불일치하는 정도로, 본 명세서는 임의의 그러한 물질을 대리한다. 본원의 임의 참고문헌의 인용은, 그러한 참고문헌이 본 개시내용의 선행기술임을 인정하는 것이 아니다.
달리 표시되지 않는 한, 청구범위를 포함하는 본 명세서에 사용된 성분, 세포 배양액, 처리 조건 등을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에서 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 달리 반대로 표시되지 않는 한, 수치 파라미터는 대략치이고, 본 발명에 의해 수득되고자 모색되는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있다. 달리 표시되지 않는 한, 일련의 요소 앞에 오는 용어 "적어도"는 그 일련 내 모든 요소를 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는, 본원에 기술된 발명의 특정 실시양태에 대한 다수의 균등예를, 통상의 실험 이상의 것을 이용하지 않고도 인식하거나 확신할 수 있을 것이다. 그러한 균등예는 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> NEURALAB LIMITED WYETH <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMPROVING RECOMBINANT PROTEIN PRODUCTION <130> ELN-083PC <140> PCT/US05/035854 <141> 2005-10-05 <150> 60/616,474 <151> 2004-10-05 <160> 55 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 1828 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (230)..(523) <220> <221> CDS <222> (915)..(959) <220> <221> CDS <222> (1078)..(1407) <220> <221> CDS <222> (1505)..(1825) <400> 1 gtgagtcctg tcgactctag agctttctgg ggcaggccag gcctgacttt ggctgggggc 60 agggaggggg ctaaggtgac gcaggtggcg ccagccaggc gcacacccaa tgcccatgag 120 cccagacact ggacgctgaa cctcgcggac agttaagaac ccaggggcct ctgcgccctg 180 ggcccagctc tgtcccacac cgcggtcaca tggcaccacc tctcttgca gcc tcc acc 238 Ala Ser Thr 1 aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct 286 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 5 10 15 ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 334 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 20 25 30 35 ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac 382 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 40 45 50 acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 430 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 55 60 65 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc 478 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 70 75 80 aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt 523 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 85 90 95 ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa gccaggctca gcgctcctgc 583 ctggacgcat cccggctatg cagtcccagt ccagggcagc aaggcaggcc ccgtctgcct 643 cttcacccgg aggcctctgc ccgccccact catgctcagg gagagggtct tctggctttt 703 tccccaggct ctgggcaggc acaggctagg tgcccctaac ccaggccctg cacacaaagg 763 ggcaggtgct gggctcagac ctgccaagag ccatatccgg gaggaccctg cccctgacct 823 aagcccaccc caaaggccaa actctccact ccctcagctc ggacaccttc tctcctccca 883 gattccagta actcccaatc ttctctctgc a gag ccc aaa tct tgt gac aaa 935 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 100 105 act cac aca tgc cca ccg tgc cca ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc 989 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 110 tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc 1049 tgacacgtcc acctccatct cttcctca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg 1101 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 115 120 tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc 1149 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 125 130 135 cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac 1197 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 140 145 150 cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat 1245 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 155 160 165 gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg 1293 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 170 175 180 185 gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag 1341 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 190 195 200 tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa 1389 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 205 210 215 acc atc tcc aaa gcc aaa ggtgggaccc gtggggtgcg agggccacat 1437 Thr Ile Ser Lys Ala Lys 220 ggacagaggc cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt 1497 ccctaca ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 1546 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 225 230 235 cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 1594 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 240 245 250 ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 1642 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 255 260 265 ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 1690 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 270 275 280 285 tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag 1738 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 290 295 300 cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 1786 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 305 310 315 cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa tga 1828 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 320 325 330 <210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 3 <211> 1820 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (230)..(523) <220> <221> CDS <222> (916)..(951) <220> <221> CDS <222> (1070)..(1399) <220> <221> CDS <222> (1497)..(1817) <400> 3 gtgagtcctg tcgactctag agctttctgg ggcaggccag gcctgacttt ggctgggggc 60 agggaggggg ctaaggtgac gcaggtggcg ccagccaggc gcacacccaa tgcccatgag 120 cccagacact ggacgctgaa cctcgcggac agttaagaac ccaggggcct ctgcgccctg 180 ggcccagctc tgtcccacac cgcggtcaca tggcaccacc tctcttgca gcc tcc acc 238 Ala Ser Thr 1 aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg agc acc tcc 286 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 5 10 15 gag agc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa 334 Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 20 25 30 35 ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac 382 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 40 45 50 acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc 430 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 55 60 65 gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acg aag acc tac acc tgc 478 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys 70 75 80 aat gta gat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt 523 Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 85 90 95 ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa gccaggctca gccctcctgc 583 ctggacgcac cccggctgtg cagccccagc ccagggcagc aaggcaggcc ccatctgtct 643 cctcacctgg aggcctctga ccaccccact catgctcagg gagagggtct tctggatttt 703 tccaccaggc tccgggcagc cacaggctgg atgcccctac cccaggccct gcgcatacag 763 gggcaggtgc tgcgctcaga cctgccaaga gccatatccg ggaggaccct gcccctgacc 823 taagcccacc ccaaaggcca aactctccac tccctcagct cagacacctt ctctcctccc 883 agatctgagt aactcccaat cttctctctg ca gag tcc aaa tat ggt ccc cca 936 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 100 105 tgc cca cca tgc cca ggtaagccaa cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg 991 Cys Pro Pro Cys Pro 110 acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc tgacgcatcc 1051 acctccatct cttcctca gca cct gag ttc ctg ggg gga cca tca gtc ttc 1102 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 115 120 ctg ttc ccc cca aaa ccc aag gac act ctc atg atc tcc cgg acc cct 1150 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 125 130 135 gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cag gaa gac ccc gag gtc 1198 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 140 145 150 cag ttc aac tgg tac gtg gat ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca 1246 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 155 160 165 aag ccg cgg gag gag cag ttc aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc 1294 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 170 175 180 185 ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc 1342 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 190 195 200 aag gtc tcc aac aaa ggc ctc ccg tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc 1390 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 205 210 215 aaa gcc aaa ggtgggaccc acggggtgcg agggccacat ggacagaggt 1439 Lys Ala Lys 220 cagctcggcc caccctctgc cctgggagtg accgctgtgc caacctctgt ccctaca 1496 ggg cag ccc cga gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cag gag 1544 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 225 230 235 gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc 1592 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 240 245 250 tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag 1640 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 255 260 265 aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc 1688 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 270 275 280 ttc ctc tac agc agg cta acc gtg gac aag agc agg tgg cag gag ggg 1736 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 285 290 295 300 aat gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac 1784 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 305 310 315 aca cag aag agc ctc tcc ctg tct ctg ggt aaa tga 1820 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 320 325 <210> 4 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 5 <211> 1814 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gtgagtcctg tcgactctag agctttctgg ggcaggccag gcctgacttt ggctgggggc 60 agggaggggg ctaaggtgac gcaggtggcg ccagccaggc gcacacccaa tgcccatgag 120 cccagacctg gacgctgaac ctcgcggaca gttaagaacc caggggcctc tgcgccctgg 180 gcccagctct gtcccacacc gcggtcacat ggcaccacct ctcttgcagc ctccaccaag 240 ggcccatcgg tcttcccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc 300 tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg 360 ccctgaccag cggcgtgcac acttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct 420 cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt 480 gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgac aagaaagttg gtgagaggcc agcacaggga 540 gggagggtgt ctgctggaag ccaggctcag cgctcctgcc tggacgcatc ccggctatgc 600 agtcccagtc cagggcagca aggcaggccc cgtctcctct tcacccggag gcctctgccc 660 gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc cccaggctct gggcaggcac 720 aggctaggtg cccctaaccc aggccctgca cacaaagggg cagtgctggg ctcagacctg 780 ccaagagcca tatccgggag gaccctgccc ctgacctaag cccaccccaa aggccaaact 840 ctccactccc tcagctcgga caccttctct cctcccagat tccagtaacc ccaatcttct 900 ctctgcagag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc caggtaagcc 960 agcccaggcc tcgccctcca gctcaaggcg ggacaggtgc cctagagtag cctgcaccag 1020 ggacaggccc cagccgggtg ctgacacgtc cacctccatc tcttcctcag cacctgaact 1080 cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc 1140 ccgacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 1200 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1260 cagtacaaca cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga 1320 atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa 1380 ccatctccaa agccaaagtg ggacccgtgg ggtgcgaggg ccacatggac agaggccggc 1440 tcggcccacc ctctgccctg agagtgaccg ctgtaccaac ctctgtccct acagggcagc 1500 cccgagaacc acaggtgtac acccgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt 1560 cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag 1620 caatgggcag ccggagaaca actacaagac ccgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1680 ttcttcctct atagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1740 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaac gcagaagagc ctctccctgt 1800 ccccgggtaa atga 1814 <210> 6 <211> 1213 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gtgagtcctg tcgactctag agctttctgg ggcaggccag gcctgacttt ggctgggggc 60 agggaggggg ctaaggtgac gcaggtggcg ccagccaggc gcacacccaa tgcccatgag 120 cccagacact ggacgctgaa cctcgcggac agttaagaac ccaggggcct ctgcgccctg 180 ggcccagctc tgtcccacac cgcggtcaca tggcaccacc tctcttgcag cctccaccaa 240 gggcccatcg gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc acctccgaga gcacagcggc 300 cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg 360 cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc 420 cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acgaagacct acacctgcaa 480 tgtagatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagtcca aatatggtcc 540 cccatgccca ccatgcccag cacctgagtt cctgggggga ccatcagtct tcctgttccc 600 cccaaaaccc aaggacactc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt gcgtggtggt 660 ggacgtgagc caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaggt 720 gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac agcacgtacc gtgtggtcag 780 cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc 840 caacaaaggc ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg 900 agagccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag 960 cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa 1020 tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt 1080 cttcctctac agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc 1140 atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc 1200 tctgggtaaa tga 1213 <210> 7 <211> 240 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 60 atctccaaag ccaaa ggt ggg acc cgt ggg gtg cga ggg cca cat gga cag 111 Gly Gly Thr Arg Gly Val Arg Gly Pro His Gly Gln 1 5 10 agg ccg gct cgg ccc acc ctc tgc cct gag agt gac cgc tgt acc aac 159 Arg Pro Ala Arg Pro Thr Leu Cys Pro Glu Ser Asp Arg Cys Thr Asn 15 20 25 ctc tgt ccc tac agg gca gcc ccg aga acc aca ggt gta cac cct gcc 207 Leu Cys Pro Tyr Arg Ala Ala Pro Arg Thr Thr Gly Val His Pro Ala 30 35 40 ccc atc ccg gga gga gat gac caa gaa cca ggt 240 Pro Ile Pro Gly Gly Asp Asp Gln Glu Pro Gly 45 50 55 <210> 8 <211> 55 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Gly Thr Arg Gly Val Arg Gly Pro His Gly Gln Arg Pro Ala Arg 1 5 10 15 Pro Thr Leu Cys Pro Glu Ser Asp Arg Cys Thr Asn Leu Cys Pro Tyr 20 25 30 Arg Ala Ala Pro Arg Thr Thr Gly Val His Pro Ala Pro Ile Pro Gly 35 40 45 Gly Asp Asp Gln Glu Pro Gly 50 55 <210> 9 <211> 47 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 20 25 30 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 35 40 45 <210> 10 <211> 142 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Ala Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln 20 25 30 Ser Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg 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<211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized hu12A11 heavy chain v.8 <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized 3D6 v2 heavy chain variable region <400> 37 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly 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Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 39 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Gln Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Gln Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 40 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 41 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic mu12A11v1 VL region <400> 41 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 1 5 10 15 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 20 25 30 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 35 40 45 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 50 55 60 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser 65 70 75 80 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 85 90 95 <210> 42 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized hu3D6 VL version 2 <400> 42 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 43 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 44 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized hum12B4 VL v.1 <400> 44 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 45 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Arg 20 25 30 Tyr Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr <210> 46 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro 100 <210> 47 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Asn 20 25 30 Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Thr Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ile Tyr Asp Val Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 48 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized hum12B4 VH v.1 <400> 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Asn 20 25 30 Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Glu Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Arg Ile Ile Tyr Asp Val Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 49 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Gly 20 25 30 Ser His Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Phe Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Leu Gly Pro Asp Asp Tyr Thr Leu Asp Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 50 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg <210> 51 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg <210> 52 <211> 414 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized 3D6 v2 heavy chain variable region <400> 52 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgc tggagtccgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggctccct gcgcctgtcc 120 tgcgccgcct ccggcttcac cttctccaac tacggcatgt cctgggtgcg ccaggccccc 180 ggcaagggcc tggagtgggt ggcctccatc cgctccggcg gcggccgcac ctactactcc 240 gacaacgtga agggccgctt caccatctcc cgcgacaact ccaagaacac cctgtacctg 300 cagatgaact ccctgcgcgc cgaggacacc gccgtgtact actgcgtgcg ctacgaccac 360 tactccggct cctccgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc ctcc 414 <210> 53 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized 12A11 v3.1 VH sequence <400> 53 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttc tgagaggtgt ccagtgtcaa 60 gttcagctgg tggagtctgg cggcggggtg gtgcagcccg gacggtccct caggctgtct 120 tgtgctttct ctgggttcac actgagcact tctggtatga gtgtgggctg gattcgtcag 180 gctccaggga agggtctgga gtggctggca cacatttggt gggatgatga taagtactat 240 aacccatccc tgaagagccg attcacaatc tccagggaca actccaaaaa cacgctgtac 300 ctccagatga acagtctgcg ggctgaagat actgccgtgt actactgtgc tcgaagaact 360 actaccgctg actactttgc ctactggggc caaggcacca ctgtcacagt ctcctca 417 <210> 54 <211> 2133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic humanized hu3D6 v.2 HC delta4 <400> 54 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgc tggagtccgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggctccct gcgcctgtcc 120 tgcgccgcct ccggcttcac cttctccaac tacggcatgt cctgggtgcg ccaggccccc 180 ggcaagggcc tggagtgggt ggcctccatc cgctccggcg gcggccgcac ctactactcc 240 gacaacgtga agggccgctt caccatctcc cgcgacaact ccaagaacac cctgtacctg 300 cagatgaact ccctgcgcgc cgaggacacc gccgtgtact actgcgtgcg ctacgaccac 360 tactccggct cctccgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgtc ctccggtgag 420 tcctgtcgac tctagagctt tctggggcag gccaggcctg actttggctg ggggcaggga 480 gggggctaag gtgacgcagg tggcgccagc caggcgcaca cccaatgccc atgagcccag 540 acctggacgc tgaacctcgc ggacagttaa gaacccaggg gcctctgcgc cctgggccca 600 gctctgtccc acaccgcggt cacatggcac cacctctctt gcagcctcca ccaagggccc 660 atcggtcttc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 720 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 780 accagcggcg tgcacacttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca 840 gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc 900 acaagcccag caacaccaag gtgacaagaa agttggtgag aggccagcac agggagggag 960 ggtgtctgct ggaagccagg ctcagcgctc ctgcctggac gcatcccggc tatgcagtcc 1020 cagtccaggg cagcaaggca ggccccgtct cctcttcacc cggaggcctc tgcccgcccc 1080 actcatgctc agggagaggg tcttctggct ttttccccag gctctgggca ggcacaggct 1140 aggtgcccct aacccaggcc ctgcacacaa aggggcagtg ctgggctcag acctgccaag 1200 agccatatcc gggaggaccc tgcccctgac ctaagcccac cccaaaggcc aaactctcca 1260 ctccctcagc tcggacacct tctctcctcc cagattccag taaccccaat cttctctctg 1320 cagagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccaggt aagccagccc 1380 aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag agtagcctgc accagggaca 1440 ggccccagcc gggtgctgac acgtccacct ccatctcttc ctcagcacct gaactcctgg 1500 ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgac 1560 ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa 1620 ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta 1680 caacacacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1740 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1800 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca cccgccccca tcccgggagg 1860 agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca 1920 tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc cgcctcccgt 1980 gctggactcc gacggctcct tcttcctcta tagcaagctc accgtggaca agagcaggtg 2040 gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactaacg 2100 cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa tga 2133 <210> 55 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide linker <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(10) <223> region may or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(15) <223> region may or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(20) <223> region may or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(25) <223> region may or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(30) <223> region may or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(35) <223> region may or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(40) <223> region may or may not be present <400> 55 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 35 40

Claims (81)

  1. 하나 이상의 인트론 및 엑손 서열을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, Aβ-항체 사슬을 코딩하는 핵산 분자로서, 스플라이스 오류 또는 인트론 연속 판독(intron read-through; IRT) 부산물을 감소시키기 위해 천연 발생 게놈 서열에 비해 하나 이상의 인트론 서열이 결실된 핵산 분자.
  2. 하나 이상의 인트론 및 엑손 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, Aβ-항체 사슬을 코딩하는 핵산 분자로서, 단백질 발현을 증대시키기 위해 천연 발생 게놈 서열에 비해 하나 이상의 인트론 서열이 결실된 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 3개 이상의 인트론 서열이 결실된 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 사슬이 중쇄 또는 그의 단편인 핵산 분자.
  5. 제4항에 있어서, 항체 중쇄 또는 그의 단편은 인간 면역글로불린 G 서브타입의 중쇄 가변 영역, 힌지 영역, 제1 불변 영역(CH1), 제2 불변 영역(CH2), 및 제3 불변 영역(CH3)을 포함하는 것인 핵산 분자.
  6. 제5항에 있어서, 면역글로불린 G 서브타입이 인간 IgG1 또는 인간 IgG4인 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 인간 IgG1 또는 인간 IgG4가 돌연변이된 것인 핵산 분자.
  8. 제5항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 CH2 영역과 CH3 영역 사이의 인트론이 결실된 것인 핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서, CH1 영역과 힌지 영역 사이의 인트론의 결실을 추가로 포함하는 핵산 분자.
  10. 제8항에 있어서, 힌지 영역과 CH2 영역 사이의 인트론의 결실을 추가로 포함하는 핵산 분자.
  11. 제5항에 있어서, 중쇄 가변 영역과 CH1 영역 사이에 하나의 인트론을 포함하는 중쇄를 갖는 핵산 분자.
  12. 제5항에 있어서, 중쇄 힌지 영역, 및 제1, 제2 및 제3 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 도 8(서열 번호 1)에 나타내어진 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  13. 제5항에 있어서, 중쇄 힌지 영역, 및 제1, 제2 및 제3 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 도 9(서열 번호 3)에 나타내어진 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  14. 제8항에 있어서, CH2와 CH3 사이의 인트론의 결실이 도 8(서열 번호 1)에 나타내어진 바와 같은 인간 IgG1의 대략 뉴클레오티드 1409 내지 1505에 해당하는 것인 핵산 분자.
  15. 제8항에 있어서, CH2와 CH3 사이의 인트론의 결실이 도 9(서열 번호 3)에 나타내어진 바와 같은 인간 IgG4의 대략 뉴클레오티드 1401 내지 1497에 해당하는 것인 핵산 분자.
  16. 제9항에 있어서, CH1과 힌지 영역 사이의 인트론의 결실이 도 8(서열 번호 1)에 나타내어진 바와 같은 인간 IgG1의 대략 뉴클레오티드 525 내지 915에 해당하는 것인 핵산 분자.
  17. 제9항에 있어서, CH1과 힌지 영역 사이의 인트론의 결실이 도 9(서열 번호 3)에 나타내어진 바와 같은 인간 IgG4의 대략 뉴클레오티드 525 내지 916에 해당하는 것인 핵산 분자.
  18. 제10항에 있어서, 힌지 영역과 CH2 사이의 인트론의 결실이 도 8(서열 번호 1)에 나타내어진 바와 같은 인간 IgG1의 대략 뉴클레오티드 961 내지 1078에 해당하는 것인 핵산 분자.
  19. 제10항에 있어서, 힌지 영역과 CH2 사이의 인트론의 결실이 도 9(서열 번호 3)에 나타내어진 바와 같은 인간 IgG4의 대략 뉴클레오티드 953 내지 1070에 해당하는 것인 핵산 분자.
  20. 인간 IgG1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 10(서열 번호 5)에 나타내어진 서열과 적어도 90% 동일한 것인 핵산 분자.
  21. 인간 IgG4를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로서, 상기 뉴클레오티드 서열이 도 11(서열 번호 6)에 나타내어진 서열과 적어도 90% 동일한 것인 핵산 분자.
  22. 인간 중쇄 불변 영역, 또는 그의 돌연변이 형태를 코딩하는 게놈 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 천연 발생 게놈 서열에 존재하는 하나 이상의 인트론이 결여되어 있고, 상기 인트론은 인트론 연속 판독을 촉진하는 것인 게놈 뉴클레오티드 서열.
  23. 인간 IgG1 또는 그의 돌연변이 형태를 코딩하는 게놈 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 천연 발생 게놈 서열에 존재하는 하나 이상의 인트론이 결여되어 있고, 상기 인트론은 인트론 연속 판독을 촉진하는 것인 게놈 뉴클레오티드 서열.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 하나 이상의 인트론이 불변 영역의 CH2와 CH3 사이의 인트론인 게놈 뉴클레오티드 서열.
  25. 인간 IgG4, 또는 그의 돌연변이 형태를 코딩하는 게놈 뉴클레오티드 서열로서, 상기 게놈 서열은 천연 발생 게놈 서열에 존재하는 3개의 인트론이 결여된 것인 게놈 뉴클레오티드 서열.
  26. 제25항에 있어서, 인트론이 CH1과 힌지 영역 사이의 인트론, 힌지 영역과 CH2 사이의 인트론, 및 CH2와 CH3 사이의 인트론인 뉴클레오티드 서열.
  27. Aβ 펩티드와 선택적으로 결합하는 항체를 코딩하는 핵산 분자로서, 하기 식으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자:
    VH-Int1-CH1-Int2-Hinge-Int3-CH2-CH3
    [식 중, VH는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고;
    CH1, CH2, 및 CH3은 상응하는 중쇄 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고;
    Hinge는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고;
    Int1, Int2 및 Int3은 중쇄 게놈 서열 유래의 인트론임].
  28. 제27항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 인간 면역글로불린 G 중쇄를 코딩하는 것인 핵산 분자.
  29. Aβ 펩티드와 선택적으로 결합하는 항체를 코딩하는 핵산 분자로서, 하기 식으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자:
    VH-Int1-CH1-Hinge-CH2-CH3
    [식 중, VH는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고;
    CH1, CH2, 및 CH3은 상응하는 중쇄 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고;
    Hinge는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고;
    Int1은 중쇄 게놈 서열 유래의 인트론임].
  30. 제29항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 인간 면역글로불린 G 중쇄를 코딩하는 것인 핵산 분자.
  31. 제5항의 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트.
  32. 제5항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  33. 제32항에 있어서, 숙주 세포 내에서 복제, 선택, mRNA 전사, mRNA 안정성, 단백질 발현 또는 단백질 분비를 증대시키는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터.
  34. 제5항의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포.
  35. 제31항의 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포.
  36. 제32항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  37. 제36항에 있어서, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포인 숙주 세포.
  38. Aβ 펩티드와 선택적으로 결합하고 인트론 연속 판독(IRT) 생성물이 실질적으로 없는 재조합 항체 또는 그의 단편을 발현시키는 방법으로서,
    제5항의 핵산 분자를 포유류 숙주 세포 내로 도입하는 단계;
    재조합 항체 또는 그의 단편의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양함으로써 숙주 세포의 배양액을 생성하는 단계; 및
    숙주 세포의 배양액으로부터 재조합 항체 또는 그의 단편을 수득하는 단계
    를 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 숙주 세포로부터의 핵산 샘플 중 IRT 생성물을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 확인 단계가
    숙주 세포 배양액으로부터 핵산 샘플을 얻는 단계;
    상기 핵산 샘플을, 인트론 및 인접한 엑손 서열에 상보적인 핵산 프로브와, 핵산 샘플과 프로브 사이의 하이브리드화를 허용하는 조건 하에서 접촉시키는 단계; 및
    형성된 복합체를 검출하는 단계로서, 상기 인트론 서열에 상보적인 핵산 프로브를 이용한 상기 샘플 중의 복합체의 검출은 IRT 생성물의 존재를 나타내는 것인 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 상기 숙주 세포가 경쇄 가변 영역 및 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  42. Aβ 펩티드와 선택적으로 결합하는 재조합 항체 또는 그의 단편의 발현을 증대시키는 방법으로서,
    제5항의 핵산 분자를 포유류 숙주 세포 내로 도입하는 단계;
    상기 숙주 세포를, 재조합 항체의 발현을 허용하는 조건 하에 배양함으로써, 숙주 세포의 배양액을 생성하는 단계; 및
    숙주 세포의 배양액으로부터 재조합 항체를 수득하는 단계
    를 포함하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 숙주 세포가 경쇄 가변 영역 및 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  44. Aβ 펩티드와 선택적으로 결합하고 인트론 연속 판독(IRT) 중쇄 부산물이 실질적으로 없는 재조합 항체 또는 그의 단편을 생산하는 방법으로서, 제5항의 핵산 분자, 및 Aβ 펩티드와 선택적으로 결합하는 항체의 항체 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 포유류 숙주 세포를, 중쇄 및 경쇄가 발현되도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 배양액으로부터 중쇄 및 경쇄를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  46. Aβ 펩티드와 선택적으로 결합하는 재조합 항체 또는 그의 단편의 발현을 증대시키는 방법으로서, 제5항의 핵산 분자, 및 Aβ 펩티드와 선택적으로 결합하는 항체의 항체 경쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 포유류 숙주 세포를, 중쇄 및 경쇄가 발현되도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 배양액으로부터 중쇄 및 경쇄를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  48. 샘플 중 IRT 생성물을 검출하는 방법으로서,
    재조합 세포로부터 핵산 샘플을 얻는 단계;
    상기 핵산 샘플을, 인트론 및 인접한 엑손 서열에 상보적인 핵산 프로브와, 핵산 샘플과 프로브 사이의 하이브리드화를 허용하는 조건 하에서 접촉시키는 단계; 및
    형성된 복합체를 검출하는 단계로서, 인트론 서열에 상보적인 핵산 프로브를 이용한 상기 샘플 중의 복합체의 검출은 IRT 생성물의 존재를 나타내는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  49. Aβ 펩티드와 선택적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합성 단편으로서, 항체 또는 단편의 발현 및 조립을 허용하는 적당한 조건 하에서 제40항의 단계들을 포함하는 방법에 의해 생산되는 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  50. 제49항에 있어서, 키메라, 인간화, CDR-이식 또는 시험관 내 생성 항체인 항체.
  51. 제50항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
  52. 제51항에 있어서, 인간 5T4에 결합하는 항체.
  53. 제49항의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  54. 인간 게놈 인트론 및 엑손 서열을 변형된 작동적 회합으로 포함하는, Aβ 펩티드와 선택적으로 결합하는 항체 중쇄를 코딩하는 분리된 핵산 분자로서, 인트론 및 엑손 서열의 천연 작동적 회합의 변형이 인트론 연속 판독 중쇄 부산물의 발현을 감소시키거나 제거하는 것인 분리된 핵산 분자.
  55. 제54항에 있어서, 상기 중쇄의 발현이, 인간 게놈 인트론 및 엑손 서열을 천연 작동적 회합으로 포함하는 핵산 분자에 비해 증대되는 것인 분리된 핵산 분자.
  56. 제55항에 있어서, 게놈 엑손 서열이 가변 영역, 힌지 영역, 및 제1, 제2, 및 제3 불변 영역을 코딩하는 것인 핵산 분자.
  57. 제56항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 불변 영역이 IgG1 불변 영역인 핵산 분자.
  58. 제56항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 불변 영역이 IgG4 불변 영역인 핵산 분자.
  59. 제56항에 있어서, 가변 영역이 인간화 가변 영역인 핵산 분자.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 영역이 Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하는 것인 핵산 분자.
  61. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 가변 영역이 마우스 3D6 항체로부터 유래된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것인 핵산 분자.
  62. 제54항에 있어서, 1개의 인트론 서열을 포함하는 핵산 분자.
  63. 제54항에 있어서, 2개의 인트론 서열을 포함하는 핵산 분자.
  64. 제54항에 있어서, 3개의 인트론 서열을 포함하는 핵산 분자.
  65. 제1, 제2 및 제3 불변 영역-코딩 엑손에 작동가능하게 연결된 가변 영역-코딩 엑손을 포함하는, Aβ 펩티드 결합성 항체 중쇄-코딩 핵산 분자로서, 상기 핵산 분자는 하나 이상의 인트론 서열을 추가로 포함하며, 상기 인트론 서열은, 상기 인트론을 포함하지 않는 Aβ 펩티드 결합성 항체 중쇄-코딩 핵산 분자에 비해 상기 핵산 분자로부터의 상기 중쇄 발현을 증대시키고, 상기 핵산 분자가 인트론 연속 판독(IRT) 중쇄 부산물의 번역을 초래하지 않는 것인 핵산 분자.
  66. 전항들 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트.
  67. 전항들 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  68. 제67항에 있어서, 선별 마커 및 내부 리보솜 진입 부위 서열(IRES)을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 발현 벡터.
  69. 제54항 내지 제68항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 세포.
  70. 제66항의 카세트를 포함하는 포유류 세포.
  71. 제67항 또는 제68항의 벡터를 포함하는 포유류 세포.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포인 세포.
  73. 하기 식을 갖는 IgG1 중쇄-코딩 뉴클레오티드 서열:
    VH-Int1-CH1-Int2-Hinge-Int3-CH2-CH3
    [식 중, VH는 임의의 중쇄 가변 영역-코딩 엑손이고;
    CH1, CH2, 및 CH3은 천연 발생 IgG1 중쇄 유전자에서 유래된 인간 중쇄 불변 영역-코딩 엑손이고;
    Int1, Int2 및 Int3은 상기 유전자에서 유래된 상응하는 인트론이고, Int2 및 Int3은 임의적으로 존재하며;
    Hinge는 상기 유전자에서 유래된 힌지-코딩 엑손임].
  74. 제73항에 있어서, Int2 및 Int3이 존재하는 것인 서열.
  75. 인트론 연속 판독(IRT) 중쇄 부산물이 실질적으로 없는 항체 제제의 생산 방법으로서, Aβ 펩티드 결합성 항체 경쇄-코딩 핵산 분자를 추가로 포함하는, 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항의 세포를, 인트론 연속 판독(IRT) 중쇄 부산물의 부재 하에 중쇄 및 경쇄가 발현되고 작동적으로 회합하도록 하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  76. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 사슬이 서열 번호 12에 기재된 서열을 갖는 것인 핵산 분자.
  77. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체 사슬이 서열 번호 13에 기재된 서열을 갖는 것인 핵산 분자.
  78. 서열 번호 6 내지 11 중 어느 하나의 핵산에 의해 코딩되는 불변 영역, 및 서열 번호 2의 핵산에 의해 코딩되는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함하는 Aβ-항체.
  79. 서열 번호 6 내지 11 중 어느 하나의 핵산에 의해 코딩되는 불변 영역, 및 서열 번호 4의 핵산에 의해 코딩되는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함하는 Aβ-항체.
  80. 서열 번호 6 내지 11 중 어느 하나의 핵산에 의해 코딩되는 불변 영역, 및 도 12 내지 14 또는 도 16c 및 16d 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 가변 영역을 포함하는 중쇄를 포함하는 Aβ-항체.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 도 15 또는 도 16a 및 16b 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 상응하는 경쇄를 추가로 포함하는 항체.
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