CH652145A5 - Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen. - Google Patents

Description

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PATENTANSPRUCH 1. Verfahren zur Herstellung von Zellinien, die menschliche Antikörper über längere Zeit produzieren, dadurch gekennzeichnet, dass man Mäuse-Menschen-Hybridome erzeugt, aus den erhaltenen Hybriden die Klone mit raschem Wachstum ohne Antikörperproduktion selektioniert, dann weiter auf «drug»-Resistenz selektioniert, anschliessend erneut mit menschlichen Lymphozyten fusioniert und aus den so erhaltenen Zellpopulationen das gewünschte Hybrid selektioniert.

In einem konventionellen Antiserum kann man normalerweise eine grosse Zahl von Antikörpern finden, die alle mit dem gleichen Antigen aufgrund ihrer unterschiedlichen Aminosäuresequenz im Bereich der Bindungsstelle mit mehr oder weniger hoher Affinität reagieren. Darüber hinaus enthält es eine grosse Menge von Antikörpern gegen Antigene, die die früheren Erfahrungen des Individuums, in dem das Antiserum produziert wurde, wiedergeben. Für die meisten Verwendungszwecke sind solche Antisera sicherlich ausreichend, aber neuere Entwicklungen der Wissenschaft machen höhere Anforderungen bezüglich Spezifität und Reproduzierbarkeit notwendig. Eine elegante, inzwischen bereits klassische Lösung wurde von Köhler und Milstein beschrieben, die Mäuse-Milz-Lymphozyten von immunisierten Tieren mit «drug»-sensitiven Mäuse-Myelom-Zellen erfolgreich fusionierten. Es gelang, die durch Fusion immortalisierten Zellen in vitro zu klonen und zu züchten, d.h. es wurde eine homogene Zellpopulation erhalten, die eine homogene Antikörperpopulation produzierte. Durch entsprechende Selektion dieser Zellklone aus den erhaltenen vielen Einzelzellklonen konnten die Zellen weitergezüchtet werden, welche einen Antikörper mit der gewünschten Antigenspezifität sezer-nieren.

Die auf diese Weise hergestellten Mäuseantikörper sind in Forschungs- und Diagnostikaanwendungen ausserordentlich wichtig und einige werden bereits therapeutisch am Menschen untersucht. Es würde jedoch einen wesentlichen Fortschritt für die Immunglobulintherapie bedeuten, wenn auch menschliche Antikörper mit ähnlichen Methoden erhalten werden könnten. Damit würde der Gefahr einer Sensibilisierung vorgebeugt. Einige Versuche, das Problem der Herstellung menschlicher Antikörper in vitro zu lösen, wurden bereits unternommen.

Die Transformation von normalen menschlichen Lymphozyten mit Epstein-Barr-Virus ist nicht sehr erfolgreich, da der Prozess sehr langwierig ist und auch das Klonen und Selek-tionieren sich sehr schwierig gestaltet. Fusionierung von normalen Lymphozyten mit menschlichen Myelomzellen scheint die naheliegende Analogie zum Mäuse-Verfahren darzustellen. Das Problem dabei besteht jedoch darin, dass im menschlichen System nur eine einzige Myelomzell-Linie existiert und diese Zell-Linie weltweit mykoplasmakontaminiert ist (Mykoplasmen verhindern eine erfolgreiche Fusionierung). Die Fusionierung von normalen Lymphozyten mit einer EBV-transformierten menschlichen Lymphoblastoid-B-Zell-Linie ist wahrscheinlich das zuverlässigste und reproduzierbarste Verfahren, das bisher beschrieben wurde. Es leidet jedoch an den grundlegenden in vitro-Charakteristika der Lymphoblastoid-Zellen: sie sind sehr schwer zu klonen und, da sie ein früheres Stadium in der B-Zellendifferenzierung darstellen, ist die Kapazität der Hybride, Antikörper zu produzieren und zu sezernieren, wahrscheinlich zehnmal geringer als für eine richtige Myelomzelle. Die Fusionierung von menschlichen Lymphozyten mit Mäuse-Myeloma bringt

Zellen mit den gleichen ausgezeichneten in vitro-Charakteristika wie die Mäuse-Hybridomas hervor, jedoch mit einem grossen Nachteil: Mäuse-Menschen-Hybride sind genetisch unstabil, und es ist in diesem Zusammenhang speziell nachteilig, dass sie das menschliche Chromosom, das die Information für die Synthese der leichten Ketten des Immunglobulin-Moleküls trägt, ausstösst.

Erfindungsgemäss wurden nun «drug»-resistente Mäuse-Menschen-Hybridome erzeugt, die ihre Antikörperproduktionskapazität verloren haben, und so eine «menschliche» Mäuse-Myelomzelle konstruiert, die eine freundlichere Umgebung für weitere menschliche Chromosomen darstellt. Eine derartige Zelle zeigt höhere Stabilität beim Erhalten der Antikörperproduktion.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Zellinien, die menschliche Antikörper über längere Zeit produzieren, dadurch gekennzeichnet, dass man Mäuse-Menschen-Hybridome erzeugt, aus den erhaltenen Hybriden die Klone mit raschem Wachstum ohne Antikörperproduktion selektioniert, dann weiter auf «drug»-Resistenz selektioniert, anschliessend erneut mit menschlichen Lymphozyten fusioniert und aus den so erhaltenen Zellpopulationen das gewünschte Hybrid selektioniert.

Die SP/2-Zell-Linie, ursprünglich ein Hybridom zwischen der P3-X63-Ag8-Linie und Mäuse-Milz-Zellen, die Antikörper gegen rote Schafblutzellen bilden, ist bekannt (M. Shulmann et al., Nature 276/269 [1978]) und besitzt keine Fähigkeit zur Bildung von Antikörpern. Sie wurde mit normalen menschlichen peripheren Lymphozyten nach bekannten Verfahren, wie sie z.B. von G. Galfre et al., Nature 266/550 (1977) und R. Nowinski et al., Science 210/537 (1980) beschrieben sind fusioniert. Es wurde eine grosse Anzahl von Hybriden erhalten, und nach ungefähr fünf Wochen wurden fünf Klone selektioniert, die rasches Wachstum ohne Antikörperproduktion zeigten. Diese Zellen wurden dann auf Resistenz gegen 8-Azaguanin selektioniert, und mit drei dieser Linien war es möglich, Mutanten zu erhalten, die gegen 20 [ig/ml von 8-Anzaguanin resistent waren. Diese Zellen waren dann sensitiv gegen Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin(HAT)-Medium, was zeigte, dass sie die Fähigkeit zur Erzeugung von Hypoxanthin-Phosphori-bosyl-Transferase verloren hatten.

Eine dieser Linien (SPAZ-4) wurde in vitro mit menschlichen Tonsillarlymphozyten fusioniert. Für 108 Tonsillar-zellen werden 2 x 107 Myelomzellen eingesetzt. Die Fusionierung wurde nach Standardmethoden durchgeführt. Parallel dazu wurde auch die SP/2-Zell-Linie fusioniert, um so die Möglichkeit eines Vergleichs der beiden Zell-Linien zu erhalten. Die so erhaltenen Zellpopulationen wurden in HAT-Medium (HAT = Hypoxanthin/Aminopterin/Thy-midin) inkubiert, um Hybride zu selektionieren. Nachdem alle Zellen in den nicht fusionierten Kontrollkulturen abgestorben waren, wurde das HAT-Medium durch ein normales, nicht selektives Wachstumsmedium ersetzt.

Nach zwei Wochen wurde der erste Versuch zur Antikörperproduktion durchgeführt, und es wurde festgestellt, dass alle Kulturen aller Fusionierungen menschliche Antikörper produzierten. Als allerdings vier Wochen später die Kulturen nochmals getestet wurden, stellte sich heraus, dass 83% der SPAZ-4-Hybridomas immer noch produzierten, während nur 55% der SP/2-Hybridomas ihre Synthesefähigkeit behielten. Eine Produktion mit hoher Ausbeute wurde für 28% der SPAZ-4-Linien, jedoch nur für 3% der SP/2-Linien gefunden.

Unter Berücksichtigung, dass der Verlust der Antikörpersekretion zum Grossteil durch den Verlust des Genoms, das für die leichten Ketten codiert, erklärt werden kann, wurde ein spezifischer Test für die Produktion von leichten Ketten

2

5

10

15

20

25

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45

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durchgeführt. Es wurde gefunden, dass 67% der SPAZ-4-Zellen Kappa-Ketten und 88% Lambda-Ketten produzierten. Für SP/2 betrugen diese Werte 39% bzw. 61% (es muss dabei daraufhingewiesen werden, dass diese prozentuellen Angaben nur innerhalb jedes einzelnen Experiments und nur für jede einzelne Art von Immunglobulinproduktion vergleichbar sind). Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusam-mengefasst. Es kann aus der Tabelle entnommen werden, dass SPAZ-4 in allen Fällen SP/2 überlegen ist, speziell wenn man die Werte für eine «starke» Produktion betrachtet, welche allein von praktischer Bedeutung sind.

Alle diese Versuche wurden mit nicht geklonten Zellen durchgeführt, um so den Selektivdruck gegen die stabilen Klone zu maximieren (die stabilen Klone tragen mehr genetisches Material und wachsen immer weniger gut als Zellen, die ihre «unnötigen» Chromosome bereits ausgestossen haben). Es wurden Versuche durchgeführt, auch diese Zellen zu klonen. Die Ergebnisse weisen daraufhin, dass kein einziges stabiles und produzierendes SP/2-Hybrid erhalten wurde (dies wurde aus der Abwesenheit von Linien geschlossen, wo alle Kulturen, die Wachstum zeigen, auch Antikörperproduktion besitzen). In der SPAZ-4-Linie wurden dagegen einige wenige Klone erhalten, die diese Kriterien erfüllen.

Das hier beschriebene erfindungsgemässe Verfahren ist substantiell besser als die literaturbekannten Methoden, da zumindest ein Teil des Instabilitätsproblems gelöst ist. Es muss dabei auch noch daraufhingewiesen werden, dass auch die konventionellen Maus-Maus-Hybridome nicht sehr stabil sind und auch langwieriges Subklonieren immer notwendig ist. Das Ausmass der Instabilität von SPAZ-4-Hybridomas liegt etwa in der gleichen Grössenordnung wie die der Maus-Maus-Hybridome, dass heisst, dass das Arbeiten mit ihnen praktikabel ist.

Die Verwendung von Heterokaryonten macht es möglich, stabile, rasch wachsende, leicht klonierbare und gut produzierende Hybridome herzustellen, welche monoklonale Humanantikörper erzeugen.

In dem nachfolgenden Beispiel, das die Erfindung näher erläutern, ihren Umfang aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.

Beispiel:

Herstellung der SPAZ-4-Zellinie

Aus dem Heparinblut eines gesunden Donors werden periphere Blutlymphozyten (PBL's) mittels Zentrifugation über Ficoll-Isopaque isoliert. Nach dem Waschen werden 108 PBL's mit 5 x 107 SP/2-Zellen in 50 ml Dulbeccos H21 Medium, eingestellt auf pH=8, gemischt. Die Zellen werden 5 Minuten bei 600 g zusammen pellettieri: und der Überstand sorgfältig entfernt. Bei 37° wird 1 ml von 50% PEG 4000 in H21 Medium langsam im Verlauf von 1 Minute zugegeben. Weitere 10 ml von H21 Medium werden dann während 2 Minuten zugemischt. Die Zellen werden dann pellettieri und in 55 ml HAT Medium suspendiert [HAT: Dulbeccos H21 mit 20% fötalem Kälberserum (FCS), 10% NCTC 109,1% nicht essentielle Aminosäuren, 0,5% Pyruvat, 0,2 U/ml Insulin, 1 mM Oxalessigsäure, 10-4 M Hypoxanthin, 4 x 10~7 M Ami-nopterin und 1,6 x 10~3 M Thymidin], Anschliessend wird die Suspension aufgeteilt in 528 0,1 ml Kulturen in Flach-Boden Mikrotiter Gewebekultur-Platten. Frisches HAT-Medium wird alle 3 bis 5 Tage zwei Wochen lang zugegeben, danach wird zu HT-Medium (Dulbecco H21 mit 10% FCS, 10~4 M Hypoxanthin und 1,6 x 10~3 M Thymidin) gewechselt.

Nach dem 15. Tag werden Proben aus den Überständen für den Test auf Produktion von humanen Antikörpern ent-s nommen. Fünf Kulturen zeigen gutes Wachstum ohne Antikörperbildung. Diese werden für die Weiterentwicklung von 8-Azaguanin-resistenten Sublinien verwendet.

Von diesen Zellinien werden jeweils 2 x 105 Zellen/ml in Dulbeccos H21 Medium mit 10% FCS und 20 /ig/ml 8-Aza-lo guanin inkubiert. Aus dreien dieser Kulturen ist es möglich, nach wenigen Wochen resistente Zellklone zu isolieren. Mit einem dieser HAT-sensitiven Klone, der SPAZ-4-Zellinie, wurden die weiteren Versuche durchgeführt.

15 Fusion mit Lymphozyten aus Tonsillen

Aus den Tonsillen eines Kindes wird wird eine Einzelzellsuspension präpariert und die Lymphozyten über Ficoll Hypaque Fraktionierung gewonnen. Von dieser Zellpopulation werden 10® Zellen mit 2 x 107 SPAZ-4- oder SP/2-Zellen 20 nach dem zuvor beschriebenen Verfahren fusioniert. Die Zellen werden dann auf47 0,5 ml Kulturen in HAT Medium verteilt, die in diesem Fall zusätzlich mit 0,5 /ig/ml Cyclo-sporin A supplementiert sind. Nach einem Tag wird 1 ml HAT Medium ohne Cyclosporin A zugegeben. Am dritten 25 Tag werden 50% des Mediums durch HT Medium ausgetauscht. Medium-Wechsel mit HT Medium wird dann alle 3 bis 5 Tage durchgeführt.

Test auf Antikörperproduktion 30 Für das Screening wird ein ELISA-System («Enzym-linked Immunosorbend Assay») verwendet. Kaninchen-anti-human-Immunglobulin wird auf Nunc ELISA Mikrotiter-platten in einer Verdünnung von 1:400 in einem Bikarbonat-Puffer pH 9,6 gebunden. Nach dem Waschen werden die 35 Kulturüberstände für 30 Minuten bei 37° in diesen Platten inkubiert. Nach erneutem Waschen wird mit Peroxidase Konjugaten Kaninchen-anti-human IgG, IgM, IgA Reagenz (Miles-Yeda) mit einer Verdünnung von 1:400 inkubiert. Nach erneutem Waschen wird die gebundene Konjugat-40 menge durch Reaktion mit 1,2-Phenylendiaminodihydro-chlorid und H2O2 bestimmt. Produktion von leichten Anti-körper-Ketten wird mit einem analogen Test unter Verwendung eines Ziegen-anti-human-Lambda- oder Ziegen-anti-human-Kappa Peroxydase Konjugats (Tago) bei einer Ver-45 dünnung von 1:3000 durchgeführt.

Die Extinktionen werden mit einem Titertek Multiscan ELISA-Photometer bestimmt. Die Werte 4 bzw. 7 in der Tabelle I beziehen sich auf schwache bzw. starke Extinktionswerte.

50

Tabelle I

Zellen

Wochen Immunglobulin % Kappa °/o

Lambda %

55

60

4

7

4

7 4

7

SPAZ-4

4

83

28

SP/2

4

55

3

SPAZ-4

5

67

25 88

46

SP/2

5

39

13 61

17

SPAZ-4

6

36

9

SP/2

6

25

2

B