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DE3883652T2 - Verfahren zum sortieren von zellen. - Google Patents

Verfahren zum sortieren von zellen.

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DE3883652T2
DE3883652T2 DE88905565T DE3883652T DE3883652T2 DE 3883652 T2 DE3883652 T2 DE 3883652T2 DE 88905565 T DE88905565 T DE 88905565T DE 3883652 T DE3883652 T DE 3883652T DE 3883652 T2 DE3883652 T2 DE 3883652T2
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chromophore
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immunofluorescence
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DE88905565T
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Ronald Millar
John Scholefield
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RICHMOND CELL SCREENING Ltd
Original Assignee
RICHMOND CELL SCREENING Ltd
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Description

  • Die Erfindung betrifft Verfahren zum Untersuchen von Zellen, insbesondere Säugetierzellen, mit Blick auf ein automatisches Screening der Proben. Die Erfindung findet somit bei der Untersuchung von Zellen aus Cervixabstrichen, Biopsien, Sputum und anderen Körperflüssigkeiten und Geweben Anwendung.
  • Die gegenwärtigen Untersuchungsverfahren für Partikel, Zellen oder Chromosomenpopulationen sind im wesentlichen entweder:
  • (a) allgemein eingeführtemanuelle zytologische Mikroskoptechniken oder
  • (b) die Untersuchung von vorbereiteten Suspensionen unter Verwendung von teuren und komplizierten Geräten, beispielsweise "FACS" (Sorter für fluoreszenzaktivierte Zellen), "Zytofluorographen" und "Coulter". Diese Systeme liefern detaillierte Information über die Eigenschaft und Klassifikation einer gegebenen Population, untersuchen jedoch nicht eine Folge von individuellen Zubereitungen. Da diese im allgemeinen mittels Passage einer Suspension in einer laminaren Flüssigkeitsströmung und/oder mittels Passage der Suspension durch eine enge Öffnung (100-200 um Durchmesser) arbeiten, sind sie für Routineuntersuchungen von nativen Proben von Körperflüssigkeiten oder Nahrungsmaterial nicht geeignet. Alle arbeiten unser Verwendung einer flüssigen Probe.
  • (c) Verwendung von Bildanalysesystemen, um mikroskopische Standardpräparationen von Zellen oder Partikeln darzustellen, abzutasten und zu untersuchen. Diese Systeme, wie das "Quantimet" (Metals Research Limited) oder das "Cervifip" verwenden eine Videokamera, die an einem Mikroskopsystem befestigt ist, um Bilderkennungsmuster aus standardgefärbten Mikroskopträgerpräparationen von normalen und abnormalen Zellen zu erzeugen. Mit geeigneter Mikrocomputer-Hardware und -Software können verdächtige Zellen markiert werden. Jedoch erfordern solche Systeme die Tätigkeit von geübten Zytologen und Pathologen und das System arbeitet weder schnell noch kann es die Proben nach normalen und transformierten Zellen automatisch vorscreenen.
  • Bekannte direkte Fluoreszenzmikroskopverfahren (DFM) liefern einen hohen Störabstand (S:N) sowohl bei abnormalen, beispielsweise transformierten, als auch bei normalen Zellen. Somit ist es schwierig, unter Verwendung dieses Verfahrens zwischen normalen und abnormalen Zellen zu unterscheiden, wenn beide in der Probe vorhanden sind. Traditionelle direkte Immunofluoreszenztechniken, beispielsweise mit Fluoreszinisothiocyanat (FITC) liefern ein geringes Maß der Fluoreszenzmarkierung bei abnormalen Zellen, was zur Quantisierung und Signalanalyse ungeeignete Störabstände ergibt. Ein Verfahren zum Markieren von Proben mit einem immunofluoreszierenden Label ist aus "The use of acridinium ester labelled streptaridin in immunoasseys" von R.C. Hart et al., veröffentlicht in "Journal of Immunological Methods", Band 101, 1987, Seiten 91-96, Elsevier Science Publishers (Biomedical Division) bekannt.
  • Ein spezielles Gebiet, auf dem ein wirksames automatisiertes Screeningsystem benötigt wird, ist das Screening nach Krebszellen. Es besteht ein dringender Bedarf danach, Gynäkologen, Zytologen und andere hochqualifizierte Personen von der Probenuntersuchung zu entlasten, indem Mittel zum Prescreening von Cervixabstrichen, Biopsien etc. bereitgestellt werden, bevor die Patienten in Kliniken zur Sekundäruntersuchung durch weitere Abstriche, Colposcopien und Biopsieuntersuchungen überwiesen werden.
  • Man ist allgemein der Ansicht, daß bei entsprechend frühem und häufigem Screening und Diagnose das Auftreten des malignen Cervixkarzinoms vermindert werden kann.
  • Demgemäß ist es eine Aufgabe der Erfindung, zum Untersuchen von Zellproben automatische Screeningverfahren und zugehörige Zusammenstellungen von Agentien zu schaffen, um diesem Problem beizukommen.
  • Eine weitere Aufgabe besteht darin, Verfahren und Maßnahmen zu schaffen, um die automatische Erkennung von und Unterscheidung der abnormalen Zellen (beispielsweise transformierter Zellen) von normalen Zellen zu erleichtern.
  • Demgemäß liefert die Erfindung Mittel, um die Proben so zu behandeln, daß abnormale Teile der Proben anders markiert werden als normale Teile dieser Proben. Im einzelnen liefert die Erfindung ein Verfahren zum Markieren von Proben mit einem Immunofluoreszenzmarker, wobei ein Chromophor den Proben zugegeben wird, bevor ein Immunofluoreszenzmarker zu der mit dem Chromophor behandelten Probe hinzugefügt wird.
  • Die Erfindung schafft auch ein Fluoreszenzagens, das bei einem solchen Immunofluoreszenztest zu verwenden ist, wobei das Fluoreszenzagens ein Streptavidin enthält, das mit einer Acridinverbindung, insbesondere Acridinisothiocyanat, reagiert hat.
  • Im vorliegenden Falle beinhaltet es die Präparation der Proben, daß Abstriche, Biopsien, Sputum und andere Körperflüssigkeiten oder Gewebeproben genommen werden und monodisperse Zelldispersionen unter Verwendung der folgenden Techniken entweder alleine oder in Kombination miteinander hergestellt werden:
  • (i) Beschallung, (ii) Zentrifugieren (einschließlich Dichtegradientenzentrifugieren), (iii) Adsorption und Desorption, (iv) Filtern (einschließlich Membranen- und Ultrafiltern), (v) Elektrophorese oder Elektrokinese, (vi) enzymatische oder chemische Behandlung, (vii) pH-Wert und ionische Steuerung, (viii) umgekehrte Osmose. Die zubereiteten Proben werden sodann bekannten Markierungs- und Labelingstechniken unterzogen. Eins der nachstehenden Verfahren kann verwendet werden:
  • (a) Nichtfluoreszierende Standardfärbeverfahren entweder in der flüssigen Probe oder nach der Aufgabe der Probe auf einen Träger, beispielsweise einen Trägerfilm aus einem porösen Kunststoff, einer Glasplatte oder -film, Metall- oder Keramikfolie, Membrane oder andere Filter.
  • (b) Unmittelbare Fluorochromfärbung (DFS) mittels an sich bekannter Verfahren, jedoch vorzugsweise einschließlich anderer Fluorochromfärbeverfahren, bei denen vorzugsweise entweder die Oberfläche der Zellen oder Material in den Zellen, wie RNA, DNA oder Chromatin, gefärbt werden.
  • (c) Direkte und indirekte Immunofloureszenz (IF) und immunochromatische Färbeverfahren, bei denen entweder (i) fluormarkierte Antiseren, die gegen spezielle Zellmembranen/Zellwände oder zytoplastische-nukleare oder nukleolare Determinanten transformierter Zellen aktiviert sind, oder (ii) biotingebundene Antiseren, die gegen monoklonale oder polyklonale Zelldeterminanten aktiviert sind, an Avidin- oder Streptavidin-gekuppelte Fluormarker gebunden werden, um: - eine spezifische Unterscheidung zwischen normalen und transformierten abschiefernden Zellen in dem Präparat, - die Unterscheidung zwischen CIN 1, 2 und 3 klonogenen und Krebszellen zu liefern, - Zusatzfärbung normaler oder anderer Zellen,
  • (d) Modifikationen von chromatischen und/oder fluoreszierenden Differentialfärbetechniken einschließlich des Periodatverfahrens nach Schiff, des Thioninverfahrens nach Feulgen und des Verfahrens nach Papanicolaou (PAP).
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Durchführen des Gegenstandes der Erfindung basiert auf Verfahren, die sich auf ein modifiziertes Streptavidin-Biotin-Verfahren (SB-Verfahren) stützen, das die Verwendung alternativer monoklonaler Antikörper (MAB) oder Kombinationen von MABs verwendet, die gegen spezielle antigene Determinanten (beispielsweise oncogene, nukleare, nukleolare oder cytoplatische Determinanten) aktiviert sind.
  • SB-Verfahren wurden für die folgenden Determinanten entwickelt:
  • (i) Anti-RAS - Onkogen, Nuklearantigen,
  • (ii) Anti-P145 - Nukleolarantigen,
  • (iii) Anticytokeratin - cytoplastische intermediäre Filamente,
  • obwohl es verständlich ist, daß die beschriebenen Verfahren zur Messung jeder Determinante verwendbar sind.
  • Bevorzugte Verfahren verwenden eine initiale Fixierung und Vorbehandlung der bereiteten Proben, was einen verbesserten Kontrast schafft, indem die unspezifische Fluorbindung an normale Zellen und an in der Probe vorhandenes Hintergrundmaterial vermindert wird.
  • Die Vorbehandlung beinhaltet die Verwendung chromatischer Farbstoffe, nichtfluoreszierender Färbemittel oder Negativfarbstoffe oder Chemikalien, die aufgenommen werden und sich mit normalen Zellen und Hintergrundmaterial kombinieren, jedoch nicht die gewünschte spezifische Bindung mit dem Streptavidin-Biotin-gekuppelten Fluor beeinträchtigen, der sich mit der betreffenden displastischen Zelle oder Teilen hiervon verbindet.
  • Es wurde nun gefunden, daß die Behandlung der Proben mit einem Chromophor nach deren Fixierung, jedoch vor deren Behandlung mit dem Immunofluoreszenzmarker der Störabstand erheblich vergrößert, wenn die immunofluoreszenzmarkierten Proben anschließend untersucht wurden. Das heißt, daß die Behandlung einer Probe mit einem Chromophor den Signalanteil des Immunofluoreszenzmarkers von abnormalen Zellen gegenüber dem Hintergrundsignal verbessert, verglichen mit einer ähnlichen Probe, die jedoch nicht mit einem Chromophor behandelt wurde. Unter Chromophor ist hier ein chromatischer Farbstoff ("chromatic Dye"), ein Färbemittel oder eine Chemikalie zu verstehen.
  • Immunofluoreszenzmarker, die dazu verwendet werden, abnormale Zellen, beispielsweise Krebszellen, zu markieren, binden an diese und markieren somit eine spezielle Stelle in oder auf der Zelle. Bis zu einem gewissen Grad können sowohl abnormale als auch normale Zellen Immunofluoreszenzmarker an derselben spezifischen Stelle binden, aber es kann schwierig sein, visuell zwischen den normalen und den abnormalen Zellen zu unterscheiden.
  • Es wird angenommen, daß ein Chromophor an spezielle Stellen in oder auf einer normalen Zelle bindet, die in abnormalen Zellen nicht vorhanden sind, die mit dem speziellen Test erfaßt werden sollen ,und somit wird der Immunofluoreszenzmarker daran gehindert, dann an jene Stellen in der normalen Zelle zu binden, jedoch wird er nicht daran gehindert, an den entsprechenden Stellen der abnormalen Zelle zu binden. Somit vermindert sich die Menge an Immunofluoreszenzmarker, der durch eine normale Zelle gebunden wird, womit sich die Menge an Immunofluoreszenzmarker (relativ) erhöht, die durch abnormale Zellen gebunden wird, wenn dies als. Verhältnis ausgedrückt wird. Somit ist Empfindlichkeit der Messung bei Verfahren, in denen Chromophore verwendet werden erhöht, womit es möglich wird, kleinere Anzahlen anormaler Zellen zu messen. In der Tat sind bestehende Verfahren mit Immunofluoreszenzmarkierung nicht empfindlich genug, um in vielen Fällen die Erkennung abnormaler Zellen zu ermöglichen.
  • Ein Chromophor ist ein chromatischer Farbstoff, ein Färbemittel oder eine Chemikalie, die vorzugsweise anormale Zellen und Hintergrundmaterial bindet, verglichen mit der Bindung an abnormale Zellen, was die nachfolgende Bindung eines Immunofluoreszenzmarkers an die normalen Zellen und das Hintergrundmaterial verhindert, blockiert oder reduziert, das jedoch nicht an abnormale Zellen bindet und somit das Verhältnis der Menge des an anormale Zellen gebundenen Immunofluoreszenzmarkers, verglichen mit der Menge an Immunofluoreszenzmarker, der an normale Zellen und Hintergrundmaterial gebunden ist, steigern.
  • Ein geeigneter Chmorphor ist Jod oder Kaliumhaloginid, das an Glycogen normaler Zellen bindet, jedoch nicht an bestimmte Krebszellen, denen Glycogen fehlt. Der Immunofluoreszenzmarker besetzt dann Stellen in oder auf den abnormalen Zellen, jedoch nicht Stellen in oder auf den normalen Zellen, da diese bereits durch den Chromophor blockiert sind.
  • Andere geeignete Chromophore sind Essigsäure und Bromothymolblau, Nigrosin, Ausziehtusche und Sudanschwarz. Beispielsweise bindet Sudanschwarz an Lipide, während Essigsäure und Bromothymolblau an Proteine binden.
  • Eine bevorzugte Markierungsmethode ist unten beschrieben. Dieses Verfahren kann entweder alleine oder vorzugsweise in Verbindung mit Signalanalysegeräten verwendet werden.
  • Bei einem speziellen, bevorzugten Ausführungsbeispiel liefert das unten beschriebene Verfahren besonders günstige Ergebnisse, da es die Erkennung und Aufzeichnung der initialen vorübergehenden Überhöhung der Fluoreszenz (Dauer) etwa 2-3 Nanosekunden) von immunofluoreszenzmarkierten abnormalen Zellen bei Beleuchtung ermöglicht. Nach dieser vorübergehenden Überhöhung fällt die Fluoreszenz auf einen niedrigen Wert. Die Messung dieses anfänglichen vorübergehenden hohen Wertes der Fluoreszenz der immonofluoreszenzmarkierten abnormalen Zellen erhöht die Empfindlichkeit der Tests.
    • Ein Beispiel eines bevorzugten Markierungsverfahrens (SB-Verfahren) Bewertungsverfahren für Cervix-Abstriche Stufe (1)
  • Eine Einheitsmenge eines Cervix-Abstriches wird auf einen Einheitsbereich eines festen oder porösen Substratträgers, mit beispielsweise 1 · 2 cm oder 1,5 bis 3 cm Durchmesser aufgegeben.
    • Stufe (2)
  • Die Probe wird bei 25ºC getrocknet, indem ruft über den Substratträger oder durch diesen hindurch streicht, und wird sofort einer chemischen Fixierung unterzogen. Geeignete chemische Fixiermittel umfassen Propan-2-ol und Ethanol.
    • Stufe (3)
  • Die fixierte Probe und der Träger werden mit einer Lösung oder Lösungen von Chromophoren behandelt. Geeignete Chromophoren sind Jod oder Kaliumhalidlösungen, Essig, Bromothymolblau oder andere chromatische Färbemittel. Die Probe und der Träger werden sodann in einem isotonen gepufferten Reagenz bei einem pH-Wert von 7,2 gespült.
    • Stufe (4)
  • Die fixierte Probe und der Träger werden mit einem ausgewählten Antiserum oder Antiseren, jedoch nicht notwendigerweise mit einem enzymgekoppelten Antiserum oder Antiseren behandelt. Das Antiserum kann entweder als Flüssigkeit oder als Aerosol oder in einer Form zugegeben werden, in der es auf einer porösen Matrix adsorbiert ist, wobei das Antiserum mit der fixierten Probe und dem Träger zusammengebracht oder hindurchgeführt wird. Geeignete Antiseren sind Anticytokeratin, Anti-RAS oder Anti-P145. Die Reaktion läßt man sodann eine bestimmte Zeit lang, zweckmäßigerweise 15 Minuten, bei einer bestimmten Temperatur, zweckmäßigerweise 37ºC, weiterlaufen, ehe das Reagenz entfernt wird. Die Probe und der Träger werden anschließend in einem isotonen gepufferten Reagenz bei einem-pH-Wert von 7,2 gespült.
    • Stufe (5)
  • Die fixierte Probe wird daraufhin in der in (4) beschriebenen Weise für eine bestimmte Zeit, zweckmäßigerweise 10 Minuten und bei einer bestimmten Temperatur, zweckmäßigerweise 37ºC, mit einem Reagenz gehalten, das ein antispezies spezifisches, zweckmäßigerweise Anti-Mausbiotiniliertes IgG (Immunoglobulin G) enthält. Die Probe und der Träger werden anschließend in einem isotonen gepufferten Reagenz bei einem pH-Wert von 7,2 gespült.
    • Stufe (6)
  • Die Probe und der Träger werden wie in (4) gehalten und mit einem Reagenz behandelt, das Streptavidin und ein markiertes Fluor enthält. Geeignete Fluormarker sind Acridinfarbstoff, Texasrot und Phycobilinprotein. Die Probe und der Träger werden zusammen mit dem Reagenz eine bestimmte Zeit, zweckmäßigerweise 10 Minuten bei einer bestimmten Temperatur, zweckmäßigerweise 37ºC, gehalten.
    • Stufe (7)
  • Die fixierte und bearbeitete Probe sowie der Träger werden nun mit einem isotonen gepufferten Reagenz bei einem pH-Wert von 7,2, das vor der Untersuchung ein Additiv enthält, gespült. Geeignete Additive umfassen 0,2% (Gew./Vol.) Glyzerol.
  • Der Zweck dieser Verfahren ist Proben zu bereiten, die Signale erzeugen, die dazu verwendet werden können, zwischen normalen und abnormalen Zellen (oder Teilen von Zelen) oder Teilen von Proben zu unterscheiden. Unter Teilen von Proben sollen hierunter jedoch ohne Beschränkung Zellen, Gewebe und Teile hiervon verstanden werden.
  • Es wurde ferner gefunden, daß Markierungsfluore des Acridintyps eine gesteigerte Fluoreszenz ergeben, verglichen mit üblichen Fluoren, beispielsweise FITC. Ein bevorzugter Acridinfluor ist Acridinisothiocyanat (AITC). Die Acridinfluore, beispielsweise AITC, läßt man mit Streptavidin reagieren und die erhaltene Verbindung läßt man anschließend mit der Probe reagieren, die mit antispezies-spezifischen biotinyliertem IgG behandelt ist. Die erhaltene Fluoreszenz ist, wenn die Probe beleuchtet und untersucht wird, größer als diejenige, die erhalten wird, wenn Streptavidin mit einem anderen Fluor als einer Acridin-Verbindung reagiert hat. Die gesteigerte Fluoreszenz mit Streptavidin und einer Acridin-Fluor-Verbindung steigert weiter die Empfindlichkeit der hier beschriebenen Verfahren.
  • Die modulare Natur der hier beschriebenen Verfahren gestattet die Markierung unterschiedlicher Marker in abnormalen Zellen gleichzeitig mit der Verwendung spezifischer Xanthoantiseren, die für jede Determinante mit unterschiedlichen Fluorchromen gekuppelt sind. Bei einem anderen Ausführungsbeispiel kann das Reagenz, das üblicherweise in flüssiger Form vorliegt, beispielsweise auf einem inerten Träger absorbiert oder an dem Träger adsorbiert sein, ehe es mit der Probe in Berührung gebracht wird.
  • Vorzugsweise wird die Probe auf einer Temperatur von etwa wenigstens 37ºC bei jeder Behandlungsstufe gehalten, wobei die Dauer zweckmäßigerweise zwischen 0,5 und 20 Minuten liegt.
  • Die Proben werden entweder als flüssige Proben (Zellsuspensionen) oder an einem geeigneten Träger fixiert behandelt, wie beispielsweise einem mikroporösen Träger, einer Glasplatte, einer Glasfaser, einer Metall- oder Keramikplatte oder -film, Membrane, einer anderen Filterfläche oder alternativ einer Tüpfelprobentestplatte mit quadratischer, rechteckiger oder kreisförmiger Gestalt. Ein bevorzugter Träger ist ein mikroporöster Träger, beispielsweise ein Nucleopore- (Warenzeichen) Filter oder ein mikroporöses Polycarbonatfilter. Unter mikroporösem Träger wird ein Träger verstanden, der Poren, Löcher, Lücken oder Zwischenräume enthält oder die durch ihn hindurchgehen und eine solche Größe aufweisen, daß die Zellen der Probe den Träger nicht durchdringen können, sondern auf oder nahe der Oberfläche des mikroporösen Trägers festgehalten werden, während Flüssigkeiten oder Reagenzien frei durch die Struktur des mikroporösen Trägers hindurchgelangen können. Der verwendete Träger oder Untersatz kann in jedem Falle mit einem einzigen Reagenz oder einer Kombination von Reagenzien beschichtet sein, die Binder, Haftverbesserer, Fluore oder (mit Fluor oder chromatischen Farbstoffen markierte oder unmarkierte) Xantoantiseren gegen transformierte (neoplastische) Determinanten umfassen, die innerhalb oder an der Oberfläche der Krebszelle exprimiert sind.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wurde ein Verfahren zum Differenzieren von Zellen geschaffen, das die Schritte umfaßt: Es wird eine Probe genommen, eine monodisperse Zellsuspension der Probe durch an sich bekannte Techniken hergestellt und anschließend in einer automatischen Sequenz die zubereitete Probe auf einen Träger gebracht, die aufgebrachte Probe fixiert, die Probe mit einem erkennbaren Markerreagenz markiert, die markierte Probe durch einen automatischen Detektor hindurchgeschickt, der in der Lage ist, die Probe abzutasten und das Vorhandensein oder Fehlen markierter Zellen zu registrieren, um ein Signal zu erzeugen, das in einer Mikroprozessoreinheit in analytische Daten umgewandelt werden kann.
  • Bei einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren wird die Probe vor dem Aufgeben auf den Probenträger markiert. In dieser Weise kann beispielsweise die Zellsuspension mit einem färbenden Reagenz behandelt werden.
  • Zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde eine Reagenzzusammenstellung geschaffen, die einen Probenträger, der vorzugsweise mit einem Haftverbesserer oder Binder für die Probe vorbeschichtet ist, und eine Markierungslösung umfaßt, die einen erkennbaren Marker enthält sowie, falls erforderlich, geeignete Puffer und Waschlösungen beinhaltet.
  • Das folgende Beispiel erläutert ein erfindungsgemäßes Verfahren.
    • Spezielles Beispiel des Protokolls SB3 (Streptavidin. Biotin)
  • 1. Zubereitung eines Standardzellabstrichs oder einer Probe und Trocknen mit Luft bei 25ºC sowie Fixierung mit Ethanol.
  • 2. Zugabe von 100 ul 1,0% Gew./Vol. wäßrige Jodlösung als Chromophor 30 Sekunden lang bei 25ºC.
  • 3. Entfernen des Reagenz durch Phosphatsalzpufferspülung bei einem pH-Wert von 7,2.
  • 4. Zugabe von 50 ul monoklonaler Murindeterminante und 15 minütige Reaktion bei 37ºC
  • 5. Entfernen des Reagenz mit einer Phosphatsalzpufferspülung bei einem pH-Wert von 7,2.
  • 6. Zugabe von 50 ul biotinylierten Anti-Maus IgG und 10 minütige Reaktion bei 37ºC.
  • 7. Beseitigung des Reagenz durch eine Phosphatsalzpufferspülung bei einem pH-Wert von 7,2.
  • 8. Zugabe von 15 ul Streptavidinfluor-Komplex und 10 minütige Reaktion bei 37ºC.
  • 9. Entfernung des Reagenz durch Phosphatsalzpufferspülung bei einem pH-Wert von 7,2.
  • 10. Untersuchung unter Verwendung eines Gerätes, wie es hier beschrieben ist.
  • Die Verwendung des Protokolls SB3a mit displastischen (abnormalen) Referenz- und normalen Zellstämmen sowie positive und negative Proben ergeben die folgenden Ergebnisse: Störabstand Zelltype Mikroampere pro u Durchmesser der Zelle Nanoampere pro Zelle Dysplastisch/positiv Mittel SD Mittel SD Normal/negativ
  • Zusätzlich gestattet die SB-Familie der Protokolle die Angabe des Transformationsmaßes (Dysplasia DOT) einer Zellpopulation oder einer Probe von Zellen.
  • Im Falle von Cervixkarzinom-Screenings wurde herausgefunden, daß dieses DOT mit der üblichen Abstufung von neoplastischen Intraepithelcervix-Zellen in den Abstrichen in Beziehung steht, die durch zytologische Referenzfärbeverfahren (Papinicolau) erzeugt wurden.

Claims (8)

1. Verfahren zum Markieren einer Probe mit einem Immunfluoreszenz-Marker, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst ein Chromophor zu der Probe hin zugegeben wird und sodann ein Immunfluoreszenz-Marker zu der mit dem Chromophor behandelten Probe hinzugegeben wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Chromophor aus den Stoffen Jod, Kaliumhalogenid, Essigsäure oder Bromothymolblau ausgewählt ist.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, bei dem die Probe vor der Zugabe des Chromophors zunächst auf einen Träger aufgegeben und dort fixiert wurde.
4. Verfahren zum Markieren einer Probe mit einem Immunfuoreszenz-Marker, nach Anspruch 3, bei dem der Immunfluoreszenz-Marker zu der fixierten Probe in drei Stufen nach der Chromophorbehandlung hin zugegeben wird, wobei die erste Stufe die Behandlung mit einem Antiserum umfaßt, die zweite Stufe die Behandlung mit antispezies-spezifischem, biotinyliertem IgG umfaßt und die dritte Stufe die Behandlung mit einem Fluoreszenzagens umfaßt.
5. Verfahren zum Markieren einer Probe mit einem Immunfluoreszenz-Marker, dadurch gekennzeichnet, daß eine Probe auf einen Träger gegeben und dort fixiert wird, ein Chromophor der fixierten Probe zugegeben wird, der Überschuß an Chromophor von der fixierten Probe entfernt wird, ein Antiserum hinzugegeben wird, der Überschuß an Antiserum entfernt wird, ein antispezies-spezifisches, biotinyliertes TgG zugegeben wird, ein Fluoreszenzagens zugegeben wird, der Überschuß an Fluoreszenzagens entfernt wird, die behandelte Probe beleuchtet wird und die beleuchtete Probe durchgemustert wird, um den Teil der Probe zu finden, der markiert wurde.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem das Fluoreszenzagens Strepavidin ist, das zuvor mit einer Acridininverbindung reagiert hat.
7. Verfahren nach Anspruche 6, bei dem das Fluoreszenzagens ein Strepavidin ist, das zuvor mit Acridinisothiocyanat ragiert hat.
8. Fluoreszenzagens zur Verwendung bei einem Immunofluoreszenz-Test nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es Strepavidin enthält, das zuvor mit Acridinisothiocyanat reagiert hat.
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