DE69032854T2

DE69032854T2 - Verfahren, reagenzien und testkits zum nachweis von subpopulationen biologischer substanzen

Info

Publication number: DE69032854T2
Application number: DE69032854T
Authority: DE
Inventors: Paul K. Downingtown Pa 19335 Horan; Meryle J. Cherry Hill Nj 08034 Melnicoff; Katharine A. West Chester Pa 19380 Muirhead
Original assignee: Intracel Corp
Current assignee: INTRACEL CORP ISSAQUASH WASH US
Priority date: 1989-05-01
Filing date: 1990-04-27
Publication date: 1999-07-01
Anticipated expiration: 2010-04-28
Also published as: AU5675590A; JPH04506113A; FI915150A7; CA2051373A1; WO1990014435A1; IL94087A0; FI915150A0; EP0471792A4; ATE175025T1; EP0471792A1; DE69032854D1; US5256532A; EP0471792B1; AU645014B2

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft biologische Prüfungen, insbesondere Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit bzw. Menge einer Unterpopulation von Analyten mit mindestens einer charakteristischen Determinante innerhalb einer Population, die solche Analyten enthält, sowie Reagentien und Testkits, die bei der Durchführung solcher Verfahren verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren, Reagentien und Testkits erleichtern das Durchmustern von Zellen, Viren usw. dadurch, daß man eine nachweisbare Reportersubstanz stabil an den Lipidbestandteil einer Biomembran bindet, wodurch der interessierende Analyt abgetrennt wird, z. B. über spezifische Bindungssubstanzen, die an einer Festphase fixiert sind, und die Reportersubstanz nachweist.

Stand der Technik

Bestimmungen von Blut- oder Knochenmarkbestandteilen, z. B. Leukozyten-Unterpopulationen, sind aufgrund der allgemeinen Verfügbarkeit von monoklonalen Antikörpern, die selektiv mit Deterrminanten dieser einzelnen Bestandteile reagieren, zu wohlbekannten klinischdiagnostischen Testverfahren geworden. Diese Bestimmungen haben sich bei der Verfolgung von Änderungen bei Immundefizienz-Erkrankungen, Leukämien, Lymphomerkrankungen sowie Transplantationspatienten bewährt. Siehe A. Landay und K. Muirhead, J. Clin. Immunopathol. (im Druck). Das übliche Verfahren zur Durchführung solcher Bestimmungen ist die Immunfluoreszenzmarkierung und anschließende Analyse mittels Durchflußcytometrie.
Die Durchflußcytometrie verfügt im Vergleich zu anderen üblicherweise verwendeten Zellmarker-Analysetechniken, wie Immunfluoreszenzmikroskopie, Immuncytochemie und Enzym-Immunoassay über eindeutige Vorteile. Ein wesentlicher Vorteil gegenüber Bulk-Verfahren, z. B. Fluorimetrie oder Enzym-Immunoassay, ist die Fähigkeit, in einer einzigen Probe gleichzeitig mehrere Zell- Unterpopulationen quantitativ zu bestimmen. Die Durchflußcytometrie verfügt im Vergleich zur manuellen Fluoreszenzmikroskopie über mehrere wichtige Vorteile, darunter: (i) die Fähigkeit des Geräts, tausende Zellen rasch auf positive oder negative Immunfluoreszenz zu durchmustern, (ii) bessere Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, (iii) dauerhafte Datenaufzeichnungen, sowie (iv) eine höhere Empfindlichkeit für den Nachweis von schwach fluoreszierenden Zellen.
Ein deutlicher Nachteil der Durchflußcytometrie ist jedoch, daß jede Probe einzeln laufen gelassen und analysiert werden muß. Dieser Nachteil ist für ein klinisches Labor, das täglich multiple Patientenproben verarbeiten muß, besonders wesentlich. Die Fähigkeit, Zell-Unterpopulationen multipler Proben gleichzeitig quantitativ auszuwerten, würde die Durchgangszeit für diesen Arbeitsschritt in dem klinischen Laboratorium bzw. dem Forschungslaboratorium wesentlich verkürzen.
Ein Verfahren, das für die Analyse multipler Proben vorgeschlagen wurde, ist der "enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA). Siehe J. Endl. et al., J. Immunol. Meth., 102 : 77-83 (1987). In diesem Assay wird die Extinktion multipler Proben gleichzeitig mit einem Lesegerät für Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen gemessen. Das Reportersystem in diesem Assay nutzt das Enzym β- Galactosidase, das in Blut-Monocyten und Neutrophilen vorliegt. Vor Durchführung dieses Assays muß daher ein Trennungsschritt an der Blutprobe durchgeführt werden, um störende Zellen oder Zellmaterialien zu entfernen. Diese Technik ist daher für die Bestimmung von Zell-Unterpopulationen in Vollblut nicht gut geeignet. Da in diesem Assay die Extinktion des Reportermoleküls gemessen wird, ist er daher weniger empfindlich als ein Fluoreszenznachweissystem.
Bei der Durchführung von Immunfluoreszenzmarkierungs- und anderen Immunoassay-Techniken ist es üblich, Antikörper direkt mit Fluoreszenz, enzym- oder radioisotopen Reportern zu markieren. Die Anzahl solcher Reporter, die an ein Antikörpermolekül ohne seine Immunreaktivität zu verändern gebunden werden kann, ist jedoch recht beschränkt. Außerdem erfordert die kovalente Bindung eines fluorochromen oder radioisotopen Reporters an einen Antikörper kompatible reaktive Gruppen an jedem Reaktionspartner, was eine weitere praktische Beschränkung dieser Art der Markierung darstellt.
Um die direkte Markierung von Antikörpern mit Fluoreszenzreportern für die Durchflußcytometrie und Fluoreszenzmikroskopie zu vermeiden, wurde vorgeschlagen, Reagentien zu verwenden, die an Liposome angeheftete Antikörper enthalten, wobei die Liposome mit Farbstoffmolekülen beladen sind, welche in der wäßrigen Phase innerhalb der Liposomen eingeschlossen sind. Es wurde gefunden, daß die erhöhte Anzahl Reporterrmoleküle pro Antikörper die Signalamplifizierung fördert. Außerdem gestattet das Einkapseln des Reporters innerhalb des Liposomen die Verwendung von vielfältigeren Reportermolekülen, darunter auch solchen, die nicht direkt an Antikörper gebunden werden können. Siehe: A. Truneh et al., J. Immunol. Methods, 100 : 59-71 (1987) und in dieser Arbeit zitierte Literaturstellen; sowie US- Patent Nr. 4,372,745 erteilt an R. Mandle et al.
Zur Verwendung auf anderen Gebieten der Diagnose wurden ähnliche Reagentien vorgeschlagen. In der Patentliteratur werden Immunoassays offengelegt, bei denen Reagentien verwendet werden, in welchen eine spezifische Bindungssubstanz für eine interessierende immunreaktive Substanz an lipidmembranhaltige Mikrokapseln fixiert ist, wobei in den Mikrokapseln ein hydrophiler Marker eingekapselt ist. Bei der Durchführung solcher Immunoassays wird eine Probe, die die interessierende immunreaktive Substanz enthält, mit dem Reagens und einer Komplementärsubstanz-Quelle vermischt, wodurch der Marker von den Mikrokapseln freigesetzt wird, wonach dieser Marker qualitativ oder quantitativ durch geeignete Analyse bestimmt wird. Siehe zum Beispiel die japanischen Patente 60159652-A und 60017359-A. Gemäß den aus dieser Literatur bekanntgewordenen spezifischen Ausbildungsformen handelt es sich bei den Mikrokapseln um Liposome, die an die spezifische Bindungssubstanz über kovalente Bindungen fixiert sind; siehe auch die japanischen Patente 60138464-A, 60138465-A und 60138466-A. Ein weiterer Vorteil bei diesem Verfahren ist die Fähigkeit, gebundenes Reagens in Gegenwart von ungebundenem Reagens messen zu können. Dieses Verfahren hat jedoch auch mehrere Nachteile. Erstens handelt es sich bei der Komplementärsubstanz um ein unstabiles Reagens, und es ist möglich, daß bei diesem Verfahren falsche Negativergebnisse aufgrund dessen, daß die Romplementärsubstanz Liposomen nicht ordentlich lysiert und den Reporter nicht ordentlich freisetzt, erhalten werden. Zweitens, sollte das bekanntgewordene Reagens dazu verwendet werden, mit der Zelloberfläche assoziierte Strukturen zu bestimmen, so könnte die Romplementärsubstanz zur Lyse von Zellen als auch von Liposomen führen, wodurch Substanzen, die dis Messung mancher Reporterrmoleküle stören könnten, freigesetzt würden. Drittens kann die Mikroumwelt innerhalb bestimmter Proben (z. B. niedriger pH) zum beträchtlichen Austritt bzw. zur nichtspezifischen Freisetzung bestimmter Reportermoleküle, z. B. Carboxyfluoreszein, führen; siehe P. Machy et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 79 : 4818 (1982).
Liposomreagenzien wurden auch zur Verwendung bei der Bestimmung von löslichen Analyten vorgeschlagen, wie dies z. B. in den US-Patenten Nr. 4,717,676 und 4,698,263 beschrieben ist.
Eine andere Möglichkeit, die obengenannte Beschränkung der direkten Kopplung von Fluoreszenzreportern an Antikörper in Fluoreszenz-Immunoassays zu überwinden, wird in dem an S. Yaverbaum et al. erteilten US-Patent Nr. 4,576,912 beschrieben. Bei der hierin beschriebenen Immunoassay-Technik wird ein Reagens benutzt, das einen Träger umfaßt, welcher mehrere eng aneinander liegende Fluorophore trägt, wobei der Träger an einen immunologischen Reaktionspartner gekoppelt ist, der mit dem interessierenden immunologischen Reaktionspartner um die Bindung an eine bekannte Menge komplementärer Bindungssubstanz konkurriert. Die Fluorophore liegen nahe genug aneinander, um selbststoppend zu wirken, und das Reagens kann chemisch behandelt werden, um die Fluorophore freizusetzen. Eine Probe und das Reagens werden mit einer Festphase vermischt, die die für den interessierenden immunologischen Reaktionspartner komplementäre Bindungssubstanz trägt. Nachdem die kompetitive Bindungsreaktion stattgefunden hat, werden die gebundenen immunologischen Reaktionspartner und ungebundenen immunologischen Reaktionspartner getrennt. Der Träger in einem der abgetrennten Teile oder in beiden wird anschließend chemisch behandelt oder lysiert, um die sonst gestoppten, dicht aneinanderliegenden Fluorophore freizusetzen, wodurch die gemessene Fluoreszenz wesentlich verstärkt wird. Die Intensität der Fluoreszenz der freigesetzten Fluorophore wird dann mit einem Standard bekannter Konzentration verglichen, um die Menge an immunologischem Reaktionspartner in der Probe zu bestimmen. Auch diese Immunoassay-Technik verfügt über gewisse Nachteile, und zwar insofern, als es sich bei der zur Freisetzung des Reporters vor dem Nachweis verwendeten chemischen Reaktion üblicherweise um eine zeitaufwendige Enzymreaktion handelt.
Ein weiteres Verfahren für den Nachweis von Zelloberflächenantigenen oder gegen diese gerichteten Antikörpern besteht darin, die Agglutination von mit Fluorochrom markierten Erythrocyten zu messen. V. Ghazarossian et al., Clin. Chem., 34 : 1720-25 (1988); siehe auch US-Patent Nr- 4, 748,129. Dieses Verfahren wird insbesondere zur Blutgruppenbestimmung oder für den Nachweis von Antikörpern gegen Blutgruppenantigene verwendet. Fluorochrome werden dazu verwendet, um Erythrocytenmembranen zu markieren, und das Vorhandensein der Antikörper bzw. Antigene wird dann aus Schwankungen des Fluoreszenzsignals (das mit einer faseroptischen Sonde nachgewiesen wird) aufgrund der Agglutination der Erythrocyten bestimmt. Mit diesem Verfahren lassen sich nur qualitative oder bestenfalls semiquantitative Ergebnisse bezüglich des Vorliegens oder der Abwesenheit von interessierendem Antigen oder Antikörper erhalten. Die Erythrocyten werden dadurch gefärbt, daß man die Farbstoffe in organischem Lösungsmittel zu Vollblut gibt, wo sich die Farbstoffe zwischen den Zellen und dem Plasma verteilen. Die in diesem Assay verwendeten Farbstoffe (z. B. 1,3-Bis[4-diethylamino-2-hydroxyphenyl]-2,4- dihydroxycyclobutendiyliumdihydroxid) wandern während des Assays von den Erythrocyten in das Plasma, wobei die Zellen während einer 10-minütigen Inkubation bei 37ºC bis zu 40% des Farbstoffs abgeben. Wird der Assay zur Bestimmung des Vorliegens von Antikörpern in Plasma verwendet, so werden Erythrocyten in der Blutprobe durch Zugabe von kolloidalen Magnetitpartikeln und Einwirkung eines Magnetfelds auf die Probe entfernt. Die Erythrocyten können alternativ auch mit einem radioaktiven Molekülteil markiert werden, wie z. B. in BLOOD (1984), Bd. 64, Nr. 1 : 156-160 von V. Wood et al. veröffentlicht.
Bei der diagnostischen Prüfung ist es häufig wünschenswert, eine interessierende Zell-Unterpopulation oder -Untergruppe aus einer gemischten Zellpopulation auszusortieren und abzutrennen.
Bei einer Zelltrenntechnik werden magnetische Teilchen und magnetische Affinitätstrennung verwendet. Verschiedene Verfahren zur Sortierung von biologischen Populationen mittels magnetischer Affinitätstrennung wurden in der Patentliteratur und in verschiedenen wissenschaftlichen Zeitsschriften beschrieben; siehe z. B. die US-Patente 3,970,518, 4,710,472, 4,677,067, 4,666,595, 4,230,685, 4,219,411, 4,157,323; siehe auch E. T. Menz, et al., Am. Biotech. Lab. (1986); J. S. Kemshead et al., Molec. Cell. Biochem., 67 : 11-18 (1985); T. Leivestad et al., Tissue Antigens, 28 : 46-52 (1986); und J. S. Berman et al., J. Immunol., 138 : 2100-03 (1987).
Bei der Durchführung solcher Verfahren wird typischerweise ein Rezeptornolekül (z. B. monoklonaler Antikörper) mit den magnetischen Partikeln konjugiert und zu einer Probe unter Bedingungen zugegeben, die eine Bindung an eine typische Determinante an dem interessierenden Analyten hervorrufen, wonach die Probe einem Magnetfeld ausgesetzt wird. Siehe z. B. die von Leivestad et al., supra, beschriebene immunmagnetische Trenntechnik. Die magnetischen Partikel und der daran haftende Analyt können dann vom Rest der Population abgetrennt werden.
Über die Verwendung von magnetischer Affinitätstrennung wurde in klinischdiagnostischen Immunoassays bei löslichen Analyten berichtet, bei denen ein Radioisotop (siehe zum Beispiel Rattle et al., Clin. Chem., 30 : 1457-61 (1984)) oder fluoreszierende Moleküle (siehe zum Beispiel Moscoso et al., Clin. Chem., 34 : 902- 05 (1988); R. D. Nargessi et al., J. Immunol. Meth., 71: 17-24 (1984); und Kamel et al., Clin. Chem. 26 : 1281-84 (1980)) als Reportersubstanz verwendet werden. Über die Verwendung dieser Technik zur Trennung gewisser Lymphocyten-Unterpopulationen von Knochenmarkzellen vor der Transplantation um Abstoßungsreaktionen nach der Transplantation auszuschalten, wurde ebenfalls berichtet; siehe A. Butturini et al., Prog. Bone Marrow Transpl. 413-22 (1987). Zu weiteren Verwendungen dieser Technik, über die berichtet wurde, gehören die Abtrennung von Tumorzellen (siehe: Rempshed et al., B. J. Cancer 54 : 771- 78 (1986)) sowie die Trennung von Lymphocyten- Unterpopulationen für anschließende Funktionstests (Berman et al., supra).
Über die Anwendung der Magnetaffinitäts-Zelltrennung auf die quantitative Bestimmung von Lymphocyten- Untergruppen in Blut wurde berichtet; siehe J. Brinchmann, Clin. Exp. Immunol., 71 : 182-86 (1988). Bei diesem Verfahren werden Blutproben mit superparamagnetischen Runststoff-Mikrokügelchen, die mit für einzelne Lymphocyten-Unterpopulationen spezifischen monoklonalen Antikörpern beschichtet sind, inkubiert. Die an die Mikrokügelchen gebundenen Zellen wurden von dem Rest der Population mittels Anlegen eines Magnetfelds an die Probe isoliert. Die abgetrennten Zellen wurden anschließend lysiert, um sie von den Mikrokügelchen nachzuweisen, die Mikrokügelchen und die daran haftenden Zellmembranen wurden magnetisch entfernt, und die erhaltenen Zellkerne wurden gefärbt und manuell mittels Fluoreszenzmikroskop und Zählkammer gezählt. Die Anzahl gezählter Kerne entsprach der Anzahl Zellen in der Probe in der interessierenden Unterpopulation. Während dieses Verfahren dazu verwendet werden kann, die Zellen in einer interessierenden Unterpopulation zu zählen, ist das manuelle Zählen der Zellkerne sehr zeitaufwendig und beim Überführen der Probe in die Zählkammer und beim Zählen irrtumsanfällig. Solch ein Verfahren wäre zur Verwendung im klinischen Umfeld nicht geeignet.
Es besteht daher ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Bestimmung von Analyten, insbesondere von Zell-Unterpopulationen. Zu den Eigenschaften solcher verbesserter Verfahren sollte folgendes gehören: eine im Vergleich zu den bisher verfügbaren Verfahren gleich hohe oder höhere Empfindlichkeit, die Fähigkeit, multiple Proben in relativ kurzer Zeit zu analysieren, sowie kein Bedarf an teuren Geräten und hochqualifiziertem Personal zur Durchführung dieses Verfahrens.
In einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens bzw. der Menge eines Analyten aus der Gruppe umfassend eukaryontische Zellen, prokaryontische Zellen und Viren, die über lipidhaltige Membranen und mindestens eine charakteristische Deterrminante verfügen, in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie diesen Analyten enthält, bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfaßt:
(i) nichtselektives Koppeln einer nachweisbaren Reportersubstanz mit dem Analyten in der Probe, wobei die nachweisbare Reportersubstanz über einen lipophilen Molekülteil verfügt, der mit der lipidhaltigen Membran des Analyten stabil assoziiert;
(ii) In-Kontakt-Bringen dieser Probe mit einer spezifischen Bindungssubstanz, die an diese mindestens eine charakteristische Determinante des Analyten unter Bedingungen, die zur Komplexbildung zwischen dem Analyten und der spezifischen Bindungssubstanz führen, spezifisch bindet;
(iii) Trennen der Probe in einen Teil, der den Komplex enthält, und einen Teil, der im wesentlichen frei von diesem Komplex ist; sowie
(iv) Nachweisen des Vorhandenseins der Reportersubstanz in einem der abgetrennten Teile, um einen Hinweis auf Vorliegen bzw. Menge des Analyten mit der mindestens einen charakteristischen Deterrminante in der Probe zu erhalten.
Bei einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Analyseverfahren für eine Zell-Unterpopulation mit mindestens einer charakteristischen Determinante, die innerhalb einer Zellpopulation mit lipidhaltigen Membranen existiert, wobei die Zell-Unterpopulation einzelne interessierende Untergruppen enthält, wobei jede Untergruppe über mindestens eine charakteristische Determinante verfügt, um den Anteil mindestens einer Untergruppe an dieser Zell-Unterpopulation zu bestimmen, bereitgestellt, das folgende Schritte umfaßt:
(i) nichtselektive Kopplung von im wesentlichen allen Zellen der Population an eine nachweisbare Reportersubstanz, wobei die nachweisbare Reportersubstanz über einen lipophilen Molekülteil verfügt, wodurch die nachweisbare Reportersubstanz mit den lipidhaltigen Membranen der Zellen stabil assoziiert;
(ii) In-Kontakt-Bringen einer ersten Probe der Zellpopulation aus Schritt (i) mit einem ersten Reagens, das mindestens eine spezifische Bindungssubstanz umfaßt, die an die mindestens eine charakteristische Determinante der Zell-Unterpopulation spezifisch bindet, unter Bedingungen, die zur Bindung des ersten Reagens an die Zellen der Unterpopulation führen, wodurch erste Komplexe in der ersten Probe gebildet werden;
(iii) Abtrennen der ersten Komplexe in der ersten Probe von ungebundenen Zellen in den ersten Proben;
(iv) Nachweisen des Vorhandenseins der Reportersubstanz in den ersten Komplexen;
(v) In-Kontakt-Bringen einer zweiten Probe der Zellpopulation aus Schritt (i) mit einem Volumen und einer Zellkonzentration, die der ersten Probe entsprechen, mit einem zweiten Reagens, das eine spezifische Bindungssubstanz, die zur selektiven Interaktion mit der mindestens einen charakteristischen Determinante der mindestens einen interessierenden Untergruppe in der Unterpopulation fähig ist, umfaßt unter Bedingungen, die zur Bindung des zweiten Reagens an die mindestens eine charakteristische Determinante führen, wodurch zweite Komplexe in der zweiten Probe gebildet werden;
(vi) Abtrennen der zweiten Komplexe in der zweiten Probe von ungebundenen Zellen in der zweiten Probe;
(vii) Nachweisen des Vorhandenseins einer Reportersubstanz in den zweiten Komplexen; sowie
(viii) Bestimmen des Anteils der mindestens einen interessierenden Untergruppe in der Zell- Unterpopulation durch quantitative Bestimmung der Menge der Reportersubstanz, die mit den zweiten Komplexen stabil assoziiert ist, im Vergleich zu der Menge der Reportersubstanz, die mit den ersten Komplexen stabil assoziiert ist.
Im Gegensatz zu einigen obengenannten vorbekannten Analyseverfahren wird bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung die kovalente Kopplung von Reporter substanzen an eine spezifische Bindungssubstanz nicht nach Belieben durchgeführt. Vielmehr wird die Reportersubstanz gezwungen, mit dem Lipidbestandteil des Analyten oder dem Lipidbestandteil des Reagens, der bzw. das die spezifische Bindungssubstanz umfaßt, stabil zu assoziieren. Dadurch, daß auf diese Weise vorgegangen wird, tritt praktisch keine Reportersubstanz aus, solange die Integrität der obengenannten Lipidverbindung erhalten bleibt, obwohl die Reportersubstanz von dem jeweiligen Analyten oder Reagens leicht durch Behandlung mit einem geeigneten Extraktionsmittel disoziiert werden kann. Die Verwendung von extrahierbaren Reportersubstanzen in den erfindungsgemäßen Verfahren stellt einen deutlichen Vorteil gegenüber ähnlichen vorbekannten Vorgehensweisen dar, bei denen der Reporter nicht extrahierbar ist. Extrahierbare Fluorochrome stellen bei Verwendung als Reportersubstanz einen besonderen Vorteil dar, da die Fluoreszenzwirkung durch Extraktion und Konzentration des fluoreszierenden Reporters vor der Fluoreszenzmessung erhöht werden kann. Die Tatsache, daß die Reportersubstanz extrahiert werden kann, weist den weiteren Vorteil auf, daß ein extrahierbarer Reporter mit relativ einfachen und kostengünstigen Analysegeräten und -techniken, z. B. Fluorimetrie anstelle von Durchflußcytometrie, nachgewiesen werden kann.
Gemäß weiteren Aspekten der Erfindung werden Reagentien und Testkits zur Durchführung der obenbeschriebenen Verfahren bereitgestellt. Die Erfindung betrifft daher auch ein Reagens zur Bestimmung eines Analyten mit mindestens einer charakteristischen Determinante, wobei dieses Reagens über einen lipidhaltigen Molekülteil, einen spezifischen Bindungsmolekülteil, der zur selektiven Interaktion mit der charakteristischen Determinante fähig ist, sowie einen nachweisbaren Reportermolekülteil mit einer lipophilen Komponente, wodurch der nachweisbare Reportermolekülteil mit dem lipidhaltigen Molekülteil verbunden und stabil assoziiert ist, umfaßt.
Die Testkits können je nach Art des zu bestimmen den Analyten verschiedene Bestandteile aufweisen. Bei einem Aspekt der Erfindung wird ein Testkit zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe bereitgestellt, wobei dieser Analyt über eine Lipidkomponente und mindestens eine charakteristische Determinante verfügt, wobei dieses Testkit folgendes umfaßt:
(i) eine nachweisbare Reportersubstanz zur Kopplung an den Analyten, wobei die nachweisbare Reportersubstanz über einen lipophilen Molekülteil verfügt, der mit der Lipidkomponente des Analyten stabil assoziieren kann, und
(ii) ein Reagens mit mindestens einer spezifischen Bindungssubstanz, die zur selektiven Interaktion mit mindestens einer charakteristischen Determinante des Analyten fähig ist.
Bei einem weiteren Aspekt wird von der Erfindung ein Testkit zur Untersuchung einer Unterpopulation von biomembranhaltigen Einheiten mit mindestens einer charakteristischen Determinante, die innerhalb einer Population von Einheiten vorliegen, bereitgestellt, wobei die Unterpopulation einzelne Untergruppen von biomembranhaltigen interessierenden Einheiten enthält, wobei jede Untergruppe mindestens eine charakteristische Determinante aufweist, zur Bestimmung des Anteils mindestens einer Untergruppe in der Unterpopulation, wobei dieses Kit folgendes enthält: (i) eine nachweisbare Reportersubstanz zur Kopplung an die Population biomembranhaltiger Einheiten, wobei die Reportersubstanz über einen lipophilen Molekülteil verfügt, der fähig ist, mit der Lipidkomponente der Biomembran stabil, jedoch dissoziierbar, zu assoziieren, (ii) ein erstes Reagens mit mindestens einer spezifischen Bindungssubstanz, die zur selektiven Interaktion mit mindestens einer charakteristischen Determinante der Unterpopulation fähig ist, sowie (iii) mindestens ein weiteres Reagens, das mindestens eine spezifische Bindungssubstanz umfaßt, die zur selektiven Interaktion mit mindestens einer charakteristischen Determinante von mindestens einer Untergruppe der Unterpopulation fähig ist.
Weitere Bestandteile, die das Testkit enthalten kann, sind ein oder mehrere Mittel zur Kopplung der Reportersubstanz an den Analyten, ein Extraktionsmittel für die Reportersubstanz, ein oder mehrere Standards zur Bestimmung des Vorliegens bzw. der Menge des/der interessierenden Analyten in der Probe, oder Anweisungen zur Herstellung solch eines/solcher Standards, sowie falls gewünscht, weitere Bestandteile, die bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind.
Testkits zur Bestimmung von anderen interessierenden Analyten mit einer charakteristischen Determinante, wie Allergene oder autologe Zellen, können das oben beschriebene Reagens enthalten, das einen lipidhaltigen Molekülteil, einen spezifischen Bindungsmolekülteil, der selektiv mit der Analytendeterminante interagiert, sowie einen Reporterrmolekülteil, der mit dem lipidhaltigen Molekülteil stabil assoziiert ist, umfaßt. Die erfindungsgemäßen Verfahren können zusätzlich zu, und in gewissen Fällen als Ersatz für die obengenannten, zur Zeit in klinischen Laboratorien angewandten analytischen Techniken, dessen Ziel ist, Material auf Veränderungen bezüglich der Zellhäufigkeit zu durchmustern, z. B. Durchflußcytometrie, verwendet werden. Die im vorliegenden Text beschriebenen Verfahren gestatten die relative rasche, gleichzeitige Analyse von multiplen biologischen Proben mit einer Empfindlichkeit, die mit der des Standes der Technik vergleichbar ist. Außerdem machen die erfindungsgemäßen Verfahren den technischen und finanziellen Aufwand sowie das erforderliche hochqualifizierte Personal solcher vorbekannter Techniken überflüssig.
Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann aus der Betrachtung der Zeichnung gemeinsam mit der genauen Beschreibung von bevorzugten Ausbildungsformen der Erfindung, die unten dargestellt sind, ersichtlich.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 stellt eine Standardkurve dar, die die Intensität der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Reportersubstanzkonzentration für eine Reihe von Lösungen, die das Fluorochrom 3-n-Propyl-3'-n- docosanyloxacarbocyaniniodid (PDCI) als Reportersubstanz in bekannten Konzentrationen enthält, zeigt.
Die Kurve in Fig. 2 stellt die Korrelation zwischen mit 3-n-Propyl-3'-n-docosanyloxacarbocyanin gekoppelten menschlichen mononukleären Leukocyten und der Intensität der Fluoreszenz der aus diesen Zellen extrahierten Reportersubstanz dar. Die gebrochene Linie in Fig. 2 stellt die durchschnittliche Intensität der Fluoreszenz eines nicht an einen Reporter gekoppelten Zellpopulationsextrakts dar.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die schlagkräftige Bestimmung von verschiedenen Analyten dar, wobei es sich um einen beliebigen Bestandteil einer Probe, dessen Vorliegen bzw. Menge durch die selektive Interaktion mit einer spezifischen Bindungssubstanz bestimmt werden kann, handeln kann. Der im vorliegenden Zusammenhang verwendete Begriff "Analyt" bezieht sich daher auf verschiedene Substanzen, die biologisch oder medizinisch von Interesse sind und die einzeln oder als Gruppe gemessen werden können. Dazu gehören zum Beispiel Zellen, sowohl von Eukaryonten (z. B. Leukocyten, Erythrocyten oder Pilze) und von Prokaryonten (z. B. Bakterien, Protozoen oder Mycoplasmen) sowie Viren. Diese Analyte können als diskrete Einheiten oder in der Form von Komplexen oder Aggregaten bestimmt werden. Häufig will man das Vorliegen bzw. die Menge einer Unterpopulation oder Untergruppe von biomembranhaltigen Einheiten, d. h. Analyten, die natürlich vorkommende Lipid- oder Phospholipidmembranen enthalten, innerhalb einer Population bestimmen. Hierzu gehört zum Beispiel die Bestimmung von Leukocyten innerhalb einer Population von Blutzellen, T-Helfer-Lymphocyten innerhalb einer Population von Lymphocyten, Fötuszellen im mütterlichen Blutstrom, mit Virus infizierten Zellen innerhalb einer Population von nicht infizierten und infizierten Zellen, sowie neoplastischen Zellen innerhalb einer Population von normalen und neoplastischen Zellen. Solche Bestimmungen gelingen mit den erfindungsgemäßen Verfahren, die auf der selektiven Interaktion der spezifischen Bindungs substanz mit mindestens einer charakteristischen Determinante der interessierenden Unterpopulation oder Untergruppe beruhen.
Der im vorliegenden Zusammenhang verwendete Ausdruck "Determinante" ist im weiten Sinn so zu verstehen, daß man darunter ein Element versteht, durch das etwas seiner Natur gemäß identifiziert oder bestimmt wird. In bezug auf einen beliebigen der oben genannten Analyte bedeutet "Determinante" denjenigen Teil des Analyten, der an der selektiven Bindung an die spezifische Bindungsubstanz beteiligt und dafür verantwortlich ist, und dessen Vorhandensein erforderlich ist, um die selektive Bindung zu bewirken. Zu den mit Zellen assoziierten Deterrminanten gehören zum Beispiel Bestandteile der Zellmembran, des Cytoplasmas oder des Zellkerns. Unter solchen mit Zellen assoziierten Strukturen befinden sich membrangebundene Proteine oder Glycoproteine, darunter auch Zelloberflächenantigene entweder einer Wirtszelle oder einer Viruszelle, Antigene, die Gewebskompatibilität bewirken, oder Membranrezeptoren. Eine Klasse spezifischer Bindungssubstanzen, die zur selektiven Interaktion mit diesen Determinanten verwendet werden, wird von Antikörpern gebildet, die fähig sind, immunspezifisch diese Determinanten zu erkennen. Der im vorliegenden Zusammenhang verwendete Ausdruck "Antikörper" umfaßt monoklonale oder polyklonale Immunglobuline, sowie immunreaktive Immunglobulinfragmente.
Zu weiteren Beispielen von charakteristischen Determinanten und ihren spezifischen Bindungssubstanzen gehören: Rezeptor und Horrmon, Rezeptor und Ligand, Agonist und Antagonist, RNA- oder DNA-Oligomere und Romplementärsequenzen, Fc-Rezeptor vom Maus-IgG und Protein A, Avidin und Biotin sowie Virus und Rezeptor. Weitere determinantenspezifische Bindungspaarkombinationen, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, sind dem Fachmann offensichtlich.
Der interessierende Analyt kann in Proben verschiedenen Ursprungs vorliegen, darunter biologische Flüssigkeiten wie Vollblut, Serum, Plasma, Harn, Rückenmarkflüssigkeit, Amnionflüssigkeit, Lavage-Flüssigkeiten sowie Gewebeextrakte. Bei bestimmten Anwendungen der erfindungsgemäßen Verfahren kann der Analyt auch auf einen geeigneten festen Träger adsorbiert oder immunologisch gebunden werden. [lacuna] Autoantikörper, die an suspendierte autologe Zellen gebunden sind, sowie Virusinfektionen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Analyse an Zellsuspensionen oder -populationen, darunter auch Unterpopulationen und/oder Untergruppen, die eine charakteristische integrale Membrandeterminante exprimieren, zur Bestimmung der Gesamtzahl von interessierenden Zellen innerhalb einer Probezellsuspension oder zur Bestimmung des Anteils einer Zell-Untergruppe innerhalb einer Zell-Unterpopulation, durchgeführt. Zu solchen interessierenden Zellen gehören Zellen menschlichen oder tierischen Ursprungs, kultivierte Zellen sowie gewisse einzellige Organismen und Virions. Zu Zellen, die zur Zeit in der Forschung von besonderem Interesse sind, gehören menschliche und tierische blutbildende Zellen, darunter Stammzellen, Ursprungszellen verschiedener Linien, Zellen, die sich innerhalb einer Linie in unterschiedlichen Differenzierungsstadien befinden, sowie reife Formen verschiedener Linien. Von besonderem Interesse bei der diagnostischen, therapeutischen und forschungsmäßigen Anwendung sind Säugetierlymphocyten, darunter B-Zellen, T-Zellen und anerkannte Untergruppen von T-Zellen, wie T- Helferzellen, T-Suppressorzellen sowie cytotoxische T-Zellen. Unterschiedliche Zellinien sind durch die Expression von charakteristischen Antigenen oder Liganden gekennzeichnet. Zum Beispiel exprimieren B-Zellen aus Säugetierblutproben Oberflächenliganden, die sich von denjenigen, die von T-Zellen der gleichen Probe exprimiert werden, unterscheiden. Die Quantifizierung einer Zell-Untergruppe der Probe kann bei der Beurteilung gewisser pathologischer Zustände wichtig sein. Zum Beispiel werden Patienten, die mit dem menschlichen Immundefizienzvirus (HIV) infiziert sind, auf T-Helferzellen, die CD4-Glycoprotein tragen, zwecks Bestimmung des Krankheitsstadiums und Überwachung der Behandlung getestet. Als weiteres Beispiel kann ein abnormal hoher Anteil eines einzelnen B-Zell-Klons im Blut eines Patienten Leukämie anzeigen. Zellen von der gleichen Linie zu unterschiedlichen Differenzierungsstadien können ebenfalls durch Expression von charakteristischen Antigenen oder Liganden unterschieden werden. Im Verlauf der Entwicklung eines B-Lymphocyten aus einer Stammzelle zu einer Prä-B-Zelle und schließlich zu einer reifen B-Zelle verändern sich die Zellmembranmarker zum Beispiel auf vorhersehbare Weise mit zunehmender Reifung der Zelle. Eine reife B-Zelle exprimiert Immunglobuline als Liganden auf der Zellmembran, während eine Prä-B-Zelle nur die schweren Ketten des cytoplasmischen Immunglobulins exprimiert, was die Grundlage für die unterschiedliche Reaktivität dieser Zell-Untergruppen darstellt und so eine anschließende Bestimmung gestattet. Die unterschiedliche Expression von Liganden kann außerdem eine Grundlage zur Beurteilung einer Pathogenese wie z. B. Virusinfektion darstellen. Virusinfizierte Zellen können Virusmarker exprimieren, die in uninfizierten Zellen innerhalb der Zellpopulation nicht vorhanden sind. Diese Virusmarker finden sich intrazellulär oder auf der Zellmembran.
Werden Zellpopulationen auf interessierende Unterpopulationen oder Untergruppen nach der oben genannten bevorzugten Ausführungsform untersucht, so wird die Zellpopulation, die in einem geeigneten biologischen oder synthetischen Medium suspendiert ist, anfänglich an eine nachweisbare Reportersubstanz gekoppelt. Im vorliegenden Zusammenhang wird der Ausdruck "Reportersubstanz" für jegliche Substanz verwendet, deren Nachweis oder Messung, direkt oder indirekt, auf physikalischem oder auf chemischem Wege, das Vorliegen des interessierenden Analyten in der Probe anzeigt. Zu brauchbaren Reportersubstanzen gehören zum Beispiel die folgenden, was jedoch keine Beschränkung darstellen soll: aufgrund ihrer lichtabsorbierenden, fluoreszierenden, phosphoreszierenden oder lumineszierenden Eigenschaften direkt oder indirekt nachweisbare Moleküle oder Ionen; aufgrund ihrer radioaktiven Eigenschaften nachweisbare Moleküle oder Ionen; aufgrund ihrer die kernmagnetische Resonanz betreffenden Eigenschaften oder paramagnetischen Eigenschaften nachweisbare Moleküle oder Ionen. Zur Gruppe der aufgrund ihrer Lichtabsorption oder Fluoreszenz indirekt nachweisbaren Moleküle gehören zum Beispiel verschiedene Enzyme, die die Umwandlung geeigneter Substrate verursachen, z. B. von nichtlichtabsorbierenden in lichtabsorbierende Moleküle, oder von nichtfluoreszierenden in fluoreszierende Moleküle. Fluorochrome, d. h. beliebige verschiedene fluoreszierende Verbindungen, die bei der biologischen Färbung zur Bildung von Fluoreszenz bei einer Probe verwendet werden, sind bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung als Reportersubstanzen besonders nützlich. Typische Fluorochrome stammen aus der Gruppe der Cyanin-, Acridin-, Pyridin-, Anthrachinon-, Cumann-, Chinolin-, Xanthen-, Phenoxazin-, Phenothiazin- und Hexatrienfarbstoffe und deren Derivate.
Bei einem der kennzeichnenden Aspekte der vorliegenden Erfindung wird die Lipidkomponente der obengenannten biomembranhaltigen Einheiten (darunter Einheiten, die mit spezifischen Bindungssubstanzen assoziiert sind) an eine einzigartige Klasse von Reportersubstanzen, die zur stabilen Assoziation mit solch einer Lipidkomponente fähig sind, gekoppelt. Unter dem Ausdruck "stabile Assoziation", der in diesem Zusammenhang zur Beschreibung der Art, auf die die Reportersubstanz mit der Lipidkomponente der Biomembran verbunden ist, verwendet wird, ist zu verstehen, daß die Affinität der Reportersubstanz für die Lipidkomponente der Membran größer als für das umgebende Medium ist. Die Affinität der unten beschriebenen Reportersubstanzen für Zellmembranen ist so stark, daß die Reportersubstanz mit der Lipidkomponente der Membran assoziiert bleibt, auch wenn diese Bedingungen oder Mitteln ausgesetzt werden, die eher das Austreten bzw. den Verlust von Materialien aus membranhaltigen Mikrokapseln verursachen; siehe z. B. P. Machy et al., Proc. Nat. Acad. Sci., U. S. A., 79 : 4148 (1982); und Monroe, Amer. Biot. Lab, 5 : 10-19 (1987). Im Gegensatz zu älteren Zellmarkierungsverfahren, siehe z. B. V. Ghazarossian et al., Clin. Chem., 34 : 1720-25 (1988) sowie US-Patent Nr. 4,748,129, geht diese stabile Assoziation zwischen Reportersubstanz und Lipidkomponente einer Zellmembran nur dann verloren, wenn sie Bedingungen oder Mitteln ausgesetzt wird, die die Integrität der Lipidkomponente der Membran aufbrechen oder zerstören, wie z. B. durch Kontakt mit Detergenzien oder Lösungsmitteln für Lipide, die die Lipidkomponente lösen oder dispergieren.
Quantitativ gesehen bedeutet der Ausdruck "stabil mit... assoziiert", daß mehr als 90% der ursprünglich an die Lipidkomponente der Zellmembran gebundenen Reportersubstanz an die Zellpopulation oder andere biomembranhaltige Einheiten während des Verlaufs der Analyse gebunden bleiben (was durch physikalische Trennung von Zellen und dissoziierter Reportersubstanz nachgewiesen wird), was im allgemeinen in einer Größenordnung von 3 Stunden liegt.
Reportersubstanzen, die zur stabilen Assoziation mit der Lipidkomponente einer Biomembran fähig sind, können Substanzen mit ausschließlich lipophilem Charakter umfassen, oder Substanzen, die über einen Molekülteil mit mindestens einem lipophilen Teil bzw. einer lipophilen Domäne verfügen, der bzw. die dazu dient, das Reportermolekül an solch einer Lipidkomponente zu verankern. Im letzteren Fall sollte der lipophile Teil des Reportermoleküls das Molekül stark genug mit dem Lipid assoziieren, damit es mit dem Lipid auch in einer bewegten Lösung oder aufgebrochenen Zellsuspension stabil assoziiert bleibt.
Eine besonders geeignete Gruppe von Reportersubstanzen wird durch die Formel
dargestellt, in der R und R&sub1; gleich oder verschieden sind und Substituenten bedeuten, die unabhängig aus der Gruppe Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkaryl oder Aralkyl ausgewählt sind, deren Kohlenwasserstoffketten 1 bis 30 Kohlenstoffatome aufweisen und geradkettig oder verzweigt sind, wobei die Substituenten unsubstituiert oder durch eine oder mehrere nichtpolare funktionelle Gruppen substituiert sind, wobei R oder R&sub1; mindestens 12 geradkettige Kohlenstoffatome aufweist und die Summe der geradkettigen Kohlenstoffatome in R und R&sub1; mindestens 23 beträgt;
X und X&sub1; gleich oder verschieden sein können und O, S, C (CH&sub3;)&sub2; oder Se darstellen;
Y ein Brückenglied -CH=, -CH=CH-CH=, -CH=CH- CH=CH-CH= oder -CH=CH-CH=CH-CH=CH-CH= darstellt;
Z und Z&sub1; gleich oder verschieden sein können und Substituenten aus der Gruppe H, Alkyl, OH, NH&sub2;, COOH, CONH&sub2;, SO&sub3;H, SO&sub2;NH&sub2;, NHNH&sub2;, NCS, NCO, CONH-Alkyl, CON- (Alkyl)&sub2;, NH-Acyl, -O-Alkyl, NH-Alkyl, oder N(Alkyl)&sub2;, SH, S-Alkyl, NO&sub2; oder Halogen darstellen, wobei die Alkylgruppen mit den Z-Substituenten 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweisen, und A ein biologisch kompatibles Anion darstellt.
Zu einer Untergruppe von nützlichen Reportersubstanzen innerhalb der oben beschriebenen Gruppe gehören Verbindungen der Formel
in der R und R&sub1; gleich oder verschieden sind und Alkylsubstituenten mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen bedeuten, die gerade oder verzweigt, unsubstituiert oder durch Halogen substituiert sind und wobei R oder R&sub1; mindestens 12 geradkettige Kohlenstoffatome aufweist und die Summe der geradkettigen Atome in R und R&sub1; mindestens 23 beträgt;
Z und Z&sub1; gleich oder verschieden sein können und Substituenten aus der Gruppe H oder Niederalkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen darstellen; und A ein biologisch kompatibles Anion darstellt.
Von den durch die Formel II dargestellten Verbindungen sind 3-n-Pentyl-3'-n-octadecyloxacarbocyaniniodid, 3-n-Octyl-3'-n-octadecyloxacarbocyaniniodid, 3-n-Propyl-3'-n-eicosanyloxacarbocyaniniodid und 3-n- Propyl-3'-n-docosanyloxacarbocyaniniodid geeignete Reportersubstanzen.
Zu einer weiteren Untergruppe von brauchbaren Reportersubstanzen innerhalb der oben beschriebenen Gruppe gehören Verbindungen der Formel
in der R und R&sub1; gleich oder verschieden sind und Alkylsubstituenten mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen bedeuten, die gerade oder verzweigt, unsubstituiert oder durch Halogen substituiert sind und wobei R oder R&sub1; mindestens 12 geradkettige Kohlenstoffatome aufweist und die Summe der geradkettigen Atome in R und R&sub1; mindestens 23 beträgt;
Z und Z&sub1; gleich oder verschieden sein können und Substituenten aus der Gruppe H oder Niederalkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen darstellen; und A ein biologisch kompatibles Anion darstellt.
Zu den durch Formel III dargestellten Verbindungen gehören folgende brauchbare Reportersubstanzen: 1,1'-Di-n-octadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat; 1-n-Octadecyl-1'-n-pentyl- 3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat und 1-n- Docosanyl-1'-n-propyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaniniodid.
Zu einer weiteren Gruppe von brauchbaren Reportersubstanzen gehören Verbindungen der Formel
in der R einen Substituenten aus der Gruppe Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkaryl oder Aralkyl bedeutet, dessen Kohlenwasserstoffkette geradkettig oder verzweigt ist, wobei dieser Substituent unsubstituiert oder durch eine oder mehrere nichtpolare funktionelle Gruppen substituiert ist und über mindestens 23 geradkettige Kohlenstoffatome verfügt;
Z, Z&sub1; und Z&sub2; gleich oder verschieden sein können und Substituenten aus der Gruppe H, Alkyl, OH, NH&sub2;, COOH, CONH&sub2;, SO&sub3;H, SO&sub2;NH&sub2;, NHNH&sub2;, NCS, NCO, CONH-Alkyl, CON- (Alkyl)&sub2;, NH-Acyl, O-Alkyl, NH-Alkyl, oder N(Alkyl)&sub2;, SH, S-Alkyl, NO&sub2; und Halogen, wobei die Alkylgruppen mit den Z-Substituenten 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweisen; und A ein biologisch kompatibles Anion darstellt.
Unter den durch Formel IV dargestellten Verbindungen ist 3,6-Bis(dimethylamino)-10-n-hexacosanylacridiniumiodid eine brauchbare Reportersubstanz. Weitere brauchbare Fluorochromverbindungen sind 4-[4-Didecylaminostyryl]-N-methylpyridiniumiodid, das innere N-3-[3- Sulfopropyl]-4-[p-didecylaminostyryl]pyridinium-Salz, sowie 2-[3-(1-n-Docosanyl-benzoxazol-2-yliden)-1- propenyl]-6-iod-1-n-tetradecyl-benzothiazoliumiodid.
Im Zusammenhang mit der obigen Beschreibung der Reportersubstanz bezieht sich der Ausdruck "nichtpolare funktionelle Gruppe" auf Substituenten wie O-Alkyl, S-Alkyl, Halogen, N(Alkyl)&sub2;, Se-Alkyl, NO, CN, CO-Alkyl, C=N-Alkyl, -SiMe&sub3;, O-SiMe&sub3; und ähnliches.
Die Reportersubstanz kann jedoch auch einen im wesentlichen hydrophoben Metall-Chelat-Komplex umfassen, vorzugsweise wobei der Metall-Chelat-Komplex ein Metallion aus der Reihe der Übergangsmetalle mit einer Ordnungszahl von 21-29, der Lanthanide mit einer Ordnungszahl von 59-66 und der Aktinide mit einer Ordnungszahl von 91 enthält, wobei dieser Komplex durch kernmagnetische Resonanz oder Lumineszenz nachgewiesen werden kann. Der Metall-Chelat-Komplex kann auch ein paramagnetisches Metallion aus der Gruppe Gd, Cr, Dy, Ni, Cu, Fe und Co enthalten.
Die Reportersubstanz kann auch eine im wesentlichen hydrophobe Substanz aufweisen, in die ein nachweisbares Radioisotop eingebaut ist. Das in die Reportersubstanz eingebaute Radioisotop stammt vorzugsweise aus der Gruppe radioaktiver Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff, Phosphor, radioaktives Fluor, Chlor, Iod, radioaktiver Schwefel und radioaktives Selen, Kobalt und Chrom.
Die oben beschriebenen Klassen von hydrophoben Reportersubstanzen sind zusammen mit Herstellungsanleitungen für spezifische Verbindungen genauer in der US-Patentanmeldung der Reihennummer 189,192 beschrieben, die den Prioritätstext für WO-A-8910758 darstellt. Die Indocarbocyaninfarbstoffe können leicht nach dem allgemeinen Reaktionsschema für Oxacarbocyaninfarbstoffe, das in dem Dokument mit der Reihennnummer 189,192 beschrieben ist, durch Ersatz der als für die dortige Reaktion als Ausgangsmaterialien verwendeten Benzoxazolderivate durch die jeweiligen Indolderivate hergestellt werden.
Die soeben beschriebenen Reportersubstanzen sind dadurch gekennzeichnet, daß sie über relativ langkettige Kohlenwasserstoff-Substituenten oder "-Schwänze" verfügen, die die für die stabile Assoziation mit den lipidhaltigen Analyten oder Reagenzien erforderliche hydrophobe/lipophile Eigenschaft verleihen. Sobald diese Verbindungen an Lipid gebunden sind, können sie nicht leicht dissoziieren. Die Reportersubstanz tritt daher nicht aus den Analyten oder Reagenzien aus und wird nicht leicht auf andere biologische Moleküle oder mit der Zelle assoziierte Strukturen übertragen.
Einzelheiten bezüglich der Kopplung der oben beschriebenen Reportersubstanzen an biomembranhaltige Einheiten können dem an Horan et al. erteilten US-Patent Nr. 4,783,401 entnommen werden. Im allgemeinen werden zur Kopplung der Reportersubstanz an Zellen die Zellen in einem geeigneten Medium, z. B. 300 mOs Saccharose pro Liter in einer Konzentration von 10&sup7; bis 10&sup9; ml suspendiert, wonach man die Zellsuspension mit der Reportersubstanz in einer Menge von ungefähr 1-20 uM versetzt und die Suspension ungefähr 5 Minuten bei ungefähr 20-30º inkubiert.
Die Bestimmung von Analyten nach den erfindungsgemäßen Verfahren gelingt aufgrund der selektiven Interaktion zwischen dem interessierenden Analyten und einer spezifischen Bindungssubstanz. Die bei den Verfahren verwendete spezifische Bindungssubstanz muß die charakteristische Determinante des Analyten selektiv erkennen können. Die für eine bestimmte Analyse gewählte spezifische Bindungssubstanz hängt von der Natur des zu bestimmenden Analyten ab. Bei der Analyse einer Zell population auf eine Unterpopulation und/oder Untergruppe mit einem charakteristischen Zelloberflächenantigen kann es sich zum Beispiel bei der spezifischen Bindungssubstanz um den komplementären Antikörper, der das interessierende Antigen immunspezifisch erkennt, handeln. Aufgrund solch einer selektiven Erkennung kann die spezifische Bindungssubstanz selektiv interagieren und mit dem interessierenden Analyten unter Bildung von Komplexen oder Aggregaten, die physikalisch oder chemisch von dem Testmedium und anderen darin befindlichen, nicht interessierenden Komponenten, abgetrennt werden können, binden.
Um die Trennung vom Testmedium zu erleichtern, werden spezifische Bindungssubstanzen bequemerweise an einer Festphase fixiert. Techniken zur Immobilisierung von Antikörpern auf einer festen Unterlage, z. B. Polystyrol, Nylon oder Agaroseperlen, sind dem Fachmann wohlbekannt. Zu geeigneten Techniken gehören Vernetzung, kovalente Bindung oder physikalische Adsorption. Es ist jedoch auch möglich, eine primäre spezifische Bindungssubstanz mit nichtfester Phase gemeinsam mit einer zweiten oder hilfsmäßigen spezifischen Bindungssubstanz, die fähig ist, selektiv mit der ersten spezifischen Bindungssubstanz zu interagieren und die an einer Festphase fixiert ist, zu verwenden. Typische primäre und hilfsmäßige spezifische Bindungssubstanzen, die für diesen Zweck verwendet werden können, sind: löslicher Maus-Antikörper/an Festphase fixiertes Protein A; löslicher Maus-Antikörper/Anti-Maus-Immunglobulin, das in einer anderen Spezies erzeugt wird und an einer Festphase fixiert ist; biotinylierter Antikörper/an Festphase fixiertes Avidin.
In einer besonders bevorzugten Ausbildungsform der Erfindung ist die spezifische Bindungssubstanz an einer magnetischen Festphase fixiert, die ferromagnetisches, paramagnetisches oder diamagnetisches Material enthalten kann, wodurch Komplexe oder Aggregate mit dem interessierenden Analyten gebildet werden, die magnetisch von dem Testmedium abgetrennt werden können. Geeignete Vorgehensweisen für die Kopplung von spezifischen Bindungssubstanzen an eine magnetische Festphase, z. B. Magnetitpartikel, sind in der Literatur beschrieben; siehe zum Beispiel E. Menz et al., Am. Biotech. Lab (1986).
Nach Abtrennung des interessierenden Analyten von dem Testmedium bildet der Nachweis der Reportersubstanz eine Grundlage zur Bestimmung des Vorliegens einer Interaktion zwischen Analyt und spezifischer Bindungssubstanz. Die Reportersubstanz kann in dem abgetrennten interessierenden Analyten, d. h. in den Komplexen aus Analyt und spezifischer Bindungssubstanz, oder in dem nach Abtrennung des interessierenden Analyten verbleibenden Testmedium, welches im wesentlichen frei von solchen Komplexen ist, nachgewiesen werden. Der erste Fall ist bevorzugt. Das Ausmaß an in dem abgetrennten Analyten oder in dem verbleibenden Testmedium nachgewiesener Reportersubstanz kann mit einem vorbestimmten Standard korreliert sein. Eine Korrelation mit einem Standard kann sowohl zur qualitativen Bestimmung als auch zur Quantifizierung des Analyten verwendet werden. Bei der qualitativen Bestimmung kann es sich bei dem vorbestimmten Standard um eine Negativkontrolle handeln, von der bekannt ist, daß sie keinen interessierenden Analyten enthält. Ein Nachweis von Reportersubstanz in Mengen, die wesentlich höher sind als das Hintergrundrauschen der Negativkontrolle, zeigt das Vorhandensein des interessierenden Analyten an. Bei der Quantifizierung wird das Ausmaß an nachgewiesener Reportersubstanz mit dem Ausmaß in z. B. einer oder mehreren gemessenen Mengen Analyt verglichen, um die relative oder absolute Menge an interessierendem Analyt in der Probe anzugeben. Bei der Quantifizierung wird üblicherweise eine Eichkurve erstellt, die steigende bekannte Mengen an Reportersubstanz enthält. Diese bekannten Mengen an Reportersubstanz werden gegen die nachgewiesenen Mengen an Reportersubstanz aufgetragen. Eine typische Eichkurve für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung ist in Fig. 1 dargestellt. Aufgrund der Eichkurve kann die Menge an Analyt in einer Probe von dem Ausmaß der hierin nachgewiesenen Reportersubstanz abgeleitet werden.
Der vorbestimmte Standard für die Quantifizierung eines Analyten kann in verschiedenen Formen vorliegen. Zu typischen Beispielen gehören Zusammensetzungen, die eine gemessene Anzahl membrangebundener Einheiten, die mit einer gemessenen Menge der nachweisbaren Reportersubstanz gekoppelt sind, oder eine gemessene Menge an Reportersubstanz, die von solchen Einheiten extrahiert wurde, enthalten, wie dies in Fig. 2 dargestellt ist. Bei den den Standard darstellenden membrangebundenen Einheiten kann es sich um die gleichen Einheiten, wie sie zu bestimmen sind, handeln, um natürlich vorkommende biomembranhaltige Einheiten einer unterschiedlichen Art, z. B. tierische Zellen, Organellen usw., oder um nichtnatürlich vorkommende membrangebundene Einheiten mit synthetischen Membranen aus Lipiden oder Phospholipiden, z. B. Liposome oder Micellen. Die an die synthetische Membran gebundenen Einheiten können so hergestellt werden, daß die Reportersubstanz stabil mit dem Membranlipid assoziiert ist. Es ist jedoch auch möglich, zum Beispiel bei Liposomen, die Reportersubstanz in die wäßrige Phase einzuschließen, mit der Lipid-Doppelschicht einzukapseln und später durch die Einwirkung eines geeigneten Lysierungsmittels zu extrahieren, wie dies fachbekannt ist; siehe zum Beispiel Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9 : 467 (1986).
Die Reportersubstanz kann auf verschiedene Weise nachgewiesen werden. Das Vorhandensein der an Zellen gekoppelten Reportersubstanz in einem der obengenannten abgetrennten Teile des Testmediums kann direkt durch Messung der einzelnen Zellen und der Lösung unter Verwendung automatischer Methoden bestimmt werden. Es ist jedoch auch möglich, die Reportersubstanz durch Lösungsmittelextraktion von den anderen Bestandteilen des Zellkomplexes zu entfernen. Eine Extraktion der Reporter substanz ist deshalb erwünscht, da man eine gleichmäßige Verteilung der Reportersubstanz für eine genaue Analyse erhält. In vielen Fällen ist die Absorptionseinheit (z. B. der Extinktionskoeffizient) oder die Fluoreszenzeinheit (z. B. Quantenausbeute) der Reportersubstanz nach Extraktion größer, wodurch man die Nachweisempfindlichkeit der Reportersubstanz erhöht. Eine Extraktion der Reportersubstanz kann auch wünschenswert sein, um eine mögliche Störung während der Messung aufgrund von Zellmaterial zu vermeiden. Zu geeigneten Extraktionsmitteln für die Dissoziation der oben beschriebenen Reportersubstanzen von biologischen Membranen gehören Butanol, Ethanol oder wäßrige Detergenzlösungen, z. B. Triton X-100 (Handelsname).
Das obige erfindungsgemäße Verfahren kann zur Analyse einer Unterpopulation von Zellen, die sich innerhalb einer Zellpopulation befindet, zur Bestimmung des proportionalen Vorliegens mindestens einer interessierenden Zell-Untergruppe dann verwendet werden. Dieses Verfahren kann zum Beispiel bei der Bestimmung folgender Einheiten verwendet werden, was jedoch keine Beschränkung darstellen soll: Lymphocyten-, Monocyten- und Neutrophile-Untergruppen einer Leukocyten-Unterpopulation in einer Vollblut-Zellpopulation; T-Zellen und B-Zellen einer Lymphocyten-Unterpopulation in einer Leukocytenpopulation; oder T-Helferzellen und T-Suppressorzellen einer T-Lymphocyten-Unterpopulation in einer Gesamtlymphocytenpopulation. Um das proportionale Vorliegen einer Zell-Untergruppe auf diese Art zu bestimmen, muß man die relative Anzahl Zellen in den interessierenden einzelnen Untergruppen sowie die relative Anzahl der einzelnen interessierenden Untergruppen innerhalb der gleichen Probe oder einer Probe mit entsprechendem Volumen und entsprechender Zellkonzentration bestimmen.
Bei der Durchführung dieser Bestimmung werden im wesentlichen alle Zellen, die die Population darstellen, von der vermutet wird, daß sie die interessierende Unterpopulation enthält, an eine nachweisbare Reportersubstanz so gekoppelt, daß die Reportersubstanz mit der Membran der Zellen stabil assoziiert ist. Ein erstes Reagens, das mindestens eine spezifische Bindungssubstanz umfaßt, die mit der charakteristischen Determinante der Zell-Unterpopulation interagiet, wird bereitgestellt. Das erste Reagens kann auch eine Mischung von spezifischen Bindungssubstanzen enthalten, die jede an charakteristische Determinanten der einzelnen interessierenden Untergruppen innerhalb der Zell- Unterpopulation binden, so daß im wesentlichen alle Zellen der Unterpopulation an das erste Reagens gebunden werden. Zum Beispiel können verschiedene monoklonale Antikörper, die mit den charakteristischen Antigenen einer bestimmten Anzahl von Zell-Untergruppen selektiv interagieren, in das erste Reagens eingebaut werden. Das erste Reagens wird mit einer ersten Probe der Population unter Bedingungen, die zur Bindung des ersten Reagens an die Zellen der Unterpopulation führen, in Kontakt gebracht, wodurch erste Komplexe in der Probe gebildet werden. Die so gebildeten Komplexe werden dann von ungebundenen Zellen in der ersten Probe abgetrennt und das Vorhandensein einer Reportersubstanz in den abgetrennten Komplexen wird nachgewiesen. Durch diese Vorgehensweise erhält man die relative oder absolute Anzahl Zellen innerhalb der interessierenden Zell-Unterpopulation.
Hiernach wird eine zweite Probe der Zellpopulation, an die wie oben beschrieben die nachweisbare Reportersubstanz gekoppelt wurde, mit einem Volumen und einer Zellkonzentration, die der ersten Probe entsprechen, mit einem zweiten Reagens, das eine oder mehrere spezifische Bindungssubstanzen, die selektiv mit einer charakteristischen Deterrminante einer interessierenden Zell-Untergruppe interagieren, umfaßt, unter Bedingungen, die zur Bindung des zweiten Reagens an solch eine Determinante führen, in Kontakt gebracht, wodurch zweite Komplexe in der zweiten Probe gebildet werden. Die zweiten Komplexe werden von ungebundenen Zellen in der zweiten Probe abgetrennt, und das Vorhandensein einer Reportersubstanz in den zweiten Komplexen wird nachgewiesen.
Der Anteil der interessierenden Untergruppe in der Zell-Unterpopulation wird durch quantitative Bestimmung der Menge an Reportersubstanz, die mit den zweiten Komplexen assoziiert ist, im Vergleich zu der Menge an Reportersubstanz, die mit den ersten Komplexen assoziiert ist, bestimmt. Im allgemeinen kann das Ausmaß an nachgewiesener Reportersubstanz in jeder interessierenden Unterpopulation und/oder jeder einzelnen interessierenden Zell-Untergruppe mit einem vorbestimmten Standard auf die oben beschriebene Weise in Bezug gesetzt werden, um das Vorhandensein bzw. die Menge der interessierenden Zell-Unterpopulation und/oder Zell- Untergruppe in der Probe, die analysiert wird, zu bestimmen. Diese Bestimmung des Anteils von interessierenden Untergruppen wird bequemerweise unter Verwendung eines Reagens, das an eine Festphase, die vorzugsweise magnetisches Material zur Erleichterung der Abtrennung vom Testmedium enthält, fixiert ist, sowie einer extrahierbaren Reportersubstanz durchgeführt.
Enthält die Population weitere interessierende Zell-Untergruppen, so können weitere Reagenzien hergestellt werden, wobei jedes Reagens ein oder mehrere spezifische Bindungssubstanzen umfaßt, die selektiv mit einer charakteristischen Determinante einer der weiteren interessierenden Untergruppen interagieren. Die weiteren Reagenzien werden mit weiteren Proben der obengenannten Zellpopulation in Kontakt gebracht, wobei wiederum jede Probe über ein Volumen und eine Zellkonzentration verfügt, die der ersten Probe entsprechen, und zwar unter Bedingungen, die zur Bildung weiterer Komplexe zwischen dem weiteren Reagens und den interessierenden Zell- Untergruppen in den weiteren Proben führen. Der Nachweis der Reportersubstanz in den von jeder weiteren Probe abgetrennten Komplexen zeigt das proportionale Vorliegen der einzelnen interessierenden Untergruppen innerhalb jeder Probe auf. So wird das proportionale Vorliegen von Untergruppen in den weiteren Proben auf gleiche Weise wie bei der interessierenden Zell-Untergruppe in der zweiten Probe wie oben beschrieben bestimmt.
Wie bereits angemerkt, können Analyten nach der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren bestimmt werden, bei dem die Detektorsubstanz mit einer spezifischen Bindungssubstanz und nicht mit dem Analyten gekoppelt ist. Genauer gesagt wird ein Reagens verwendet, das einen lipidhaltigen Molekülteil, einen spezifischen Bindungsmolekülteil, der zur selektiven Interaktion mit der charakteristischen Determinante des Analyten fähig ist, sowie einen Reportermolekülteil, der mit dem lipidhaltigen Molekülteil stabil assoziiert ist, umfaßt. Dieses Verfahren kann aufgrund der nichtkompetitiven Bindungsinteraktion oder der kompetitiven Bindungsinteraktion zwischen dem Analyten und seiner spezifischen Bindungssubstanz durchgeführt werden. Der nichtkompetitive Bindungsvorgang wird bequemerweise dadurch durchgeführt, daß man einen Analyten aus der Probe immobilisiert, den immobilisierten Analyten mit dem Reagens unter Bedingungen, die zur Bindung des Reagens an den Analyten führen, in Kontakt bringt und das Vorliegen der nachweisbaren Reportersubstanz, die an den immobilisierten Analyten gebunden ist, bestimmt. Die Parameter für die praktische Durchführung dieses Verfahrens sind im wesentlichen die gleichen wie oben in bezug auf das früher beschriebene Verfahren, bei dem die Reportersubstanz an den Analyten gekoppelt wird, ausgeführt. Bei dem kompetitiven Bindungsvorgang enthält der Schritt des In-Kontakt-Bringens der Probe mit der spezifischen Bindungssubstanz, daß man die Probe mit einer bekannten Menge des zu bestimmenden Analyten versetzt, was zum Konkurrieren eines möglicherweise ursprünglich in der Probe vorhandenen Analyten und dem zugesetzten Analyten um Komplexbildung mit der spezifischen Bindungssubstanz führt. Das Vorhandensein oder die Menge des interessierenden Analyten in der Probe wird nach den üblichen kompetitiven Bindungsassay-Techni ken bestimmt.
Dieses Verfahren wird geeigneterweise zum Beispiel beim Frühnachweis einer Virusinfektion verwendet. Bei diesem Nachweis wird ein Reagens aus biomembranhaltigen Einheiten, die natürliche oder induzierte Rezeptoren für Virusdeterminanten oder virusinduzierte Determinanten in der Wirtszelle tragen, hergestellt. Die Membran dieser Einheiten ist mit einer der oben beschriebenen Reportersusbstanzen stabil assoziiert. Das entstandene Reagens wird dann mit den infizierten Zellen inkubiert. Die infizierten Zellen, die die Reportersubstanz tragen, können unter dem Mikroskop bestimmt werden oder es kann gegebenenfalls das Ausmaß der Infektion dadurch bestimmt werden, daß man die Reportersubstanz extrahiert und quantifiziert. Auf ähnliche Weise kann ein Analyt aus einer biologischen Probe, z. B. dem Serum eines Patienten, auf einem festen Träger immobilisiert und sein Vorhandensein bzw. seine Menge aufgrund der Interaktion mit einem Reagens, das analytenrezeptortragende Zellen enthält, die mit einer der oben genannten Reportersubstanzen gekoppelt sind, und Bestimmung der Menge an an die Festphase gebundener Reportersubstanz bestimmt werden. Diese Technik kann zum Beispiel bei der Allergenprüfung verwendet werden, wobei man IgE-Rezeptor-tragende Zellen oder an Anti-Human-IgE gebundene rote Blutzellen, die jeweils an eine Reportersubstanz gekoppelt sind, verwendet. Ein Ersatz von radioaktivmarkierten Antikörpern, die typischerweise bei der Allergieprüfung verwendet werden, durch ein erfindungsgemäßes Reagens, das zum Beispiel an ein extrahierbares Fluorochrom gekoppelt ist, würde die Bedenken vieler Kliniker bezüglich der Verwendung von radioaktiven Reagenzien zerstreuen. Außerdem können durch Verwendung dieses Verfahrens an autologe Zellen gebundene Autoantikörper dadurch identifiziert werden, daß man autoantikörpertragende autologe Zellen mit einem Reagens, das an eine geeignete Reportersubstanz gekoppelte IgE-Rezeptor-tragende Zellen enthält, inkubiert, die entstandenen Komplexe durch Affinitätstrennung isoliert und die Reportersubstanz nachweist. Dieses Verfahren kann auch zur Bestimmung und/oder Quantifizierung von interessierenden Antigenen oder Epitopen verwendet werden, z. B. unter Verwendung antigen- oder epitopspezifischer T- oder B-Zellklone.
Bei einer Weiterbildung dieser Ausführungsform der Erfindung kann das Vorliegen bzw. die Menge multipler Analyten in einer Probe bestimmt werden, natürlich vorausgesetzt, daß jeder Analyt über eine charakteristische Determinante verfügt. Zum Beispiel können mehr als eine Zell-Unterpopulation und/oder Zell-Untergruppe innerhalb der gleichen Population mit diesem Verfahren identifiziert oder quantifiziert werden. Solch eine Zellpopulation kann neben anderen Untergruppen zwei oder mehrere Zell-Untergruppen, die für den vorliegenden Zweck als Zell-Untergruppe A und Zell-Untergruppe B bezeichnet werden und die die Determinante X bzw. die Deterrminante Y als charakteristische Marker exprimieren, enthalten, bzw. wird von solch einer Zellpopulation vermutet, daß sie die beiden oder mehreren obengenannten Zell-Untergruppen enthält. Vorhandensein und/oder Menge von Zellen der Zell-Untergruppe A und Zell-Untergruppe B in der Probe können schlagkräftig in einer klinischen oder experimentellen Analyse nach dem letzteren erfindungsgemäßen Verfahren in Anlehnung an mehrere verwandte Vorschriften bestimmt werden. Im Prinzip umfaßt das Verfahren die Herstellung einer spezifischen Bindungssubstanz, die mit der Zell-Untergruppe A über eine selektive Bindungsreaktion mit der Determinante X selektiv interagiert, was zur Komplexbildung zwischen der Zell-Untergruppe A und der einen spezifischen Bindungssubstanz führt. Eine weitere spezifische Bindungssubstanz, die mit der von der Zell-Untergruppe B exprimierten Determinante Y selektiv interagiert, wird hergestellt.
Nach einer Vorschrift werden einzelne Proben der Zellpopulation mit gleichem Volumen und gleicher Zellkonzentration der Reihe nach mit der einen spezifischen Bindungssubstanz und dann mit der anderen spezifischen Bindungssubstanz reagieren gelassen. Nach der Reaktion und Abtrennung des Komplexes aus jeder Reaktionmischung kann die Reportersubstanz aus jeder Probe quantifiziert werden, um einen Hinweis auf die Menge an Zell-Untergruppe A und die Menge an Zell-Untergruppe B in der Population zu erhalten. Bei dieser Vorschrift können die Reportersubstanzen, die bei jedem Reagens verwendet werden, gleich oder unterschiedlich sein. Natürlich können zusätzliche spezifische Bindungssubstanzen hergestellt und bei Bedarf zur Bestimmung von anderen, unterschiedlichen Zell-Untergruppen verwendet werden.
Bei einer anderen Vorschrift können die beiden spezifischen Bindungssubstanzen dadurch in der gleichen Probe der Population reagieren gelassen werden, daß man beide spezifischen Bindungssubstanzen gemeinsam zugibt und inkubiert, wodurch man innerhalb der Probe diskrete Komplexe bildet. Die entstandenen Komplexe sind deshalb diskret, da jede spezifische Bindungssubstanz eine selektive Affinität für ihre entsprechende Determinante der unterschiedlichen Zell-Untergruppen aufweist. Wenn die Komplexe von dem Ansatz abgetrennt werden, enthalten die Gesamtkomplexe Zellkomplexe, die durch jede der selektiven Reaktionen gebildet wurden. Bei dieser Vorschrift muß die an die eine spezifische Bindungssubstanz gekopppelte Reportersubstanz von der an die andere spezifische Bindungssubstanz gekoppelte Reportersubstanz unterscheidbar oder trennbar sein, um mittels Nachweis der beiden Reportersubstanzen einzelne Meßwerte für die beiden Zell-Untergruppen zu erhalten. Diesbezüglich können die Reporter Substanzen enthalten, die über unterschiedliche Spektraleigenschaften verfügen, worunter man Anregungswellenlängen, Emissionswellenlängen oder Fluoreszenzlebenszeiten versteht, die sich stark genug unterscheiden, um den Nachweis des Vorhandenseins einer Reportersubstanz nicht durch das Vorhandensein irgendeiner anderen Reportersubstanz zu gefährden, d. h. daß die für die eine Substanz bestimmten Werte nicht signifikant durch das Vorhandensein der anderen Substanz beeinflußt werden. Die Verwendung von solchen Reportersubstanzen gestattet die einzelne Messung jedes Reporters unabhängig von einem bzw. weiteren Reportern, die auch in den Komplexen vorliegen. Es ist jedoch auch möglich, daß ein Reporter von einem oder mehreren anderen physikalisch abtrennbar ist, z. B. aufgrund seiner Löslichkeit.
Der Umfang der vorliegenden Erfindung erstreckt sich auch auf die bei dem soeben beschriebenen Verfahren verwendeten Reagenzien. Zu erfindungsgemäßen Reagenzien können spezifische Bindungssubstanzen gehören, die natürlich an der Oberfläche von spezifischen Zellen vorkommen, wie Hormonrezeptoren, Antikörper an der Oberfläche von B-Lymphocyten oder Virusrezeptoren an der Oberfläche von anfälligen Zellen, z. B. T-Helfer- Lymphocyten oder Monocyten mit dem Oberflächenglykoprotein CD4 sind gegen Infektion mit HIV anfällig. Andere spezifische Bindungssubstanzen, die in diesen Reagenzien verwendet werden können, sind Substanzen, die an Zelloberflächen nach spezifischen biologischen Vorgängen, die die Zellen ändern, exprimiert werden. Zum Beispiel wird Interleukin-2-(IL-2)-Rezeptor stark an der Oberfläche von aktivierten T-Lymphocyten, jedoch äußerst schwach an der Oberfläche von ruhenden Lymphocyten exprimiert. Auf ähnliche Weise können Virusantigene ausschließlich an den Oberflächen von infizierten Zellen exprimiert werden. Hier handelt es sich nur um zwei Beispiele einer durch physiologische Aktivierung induzierten Rezeptorexpression. Weitere solche Beispiele werden dem Fachmann klar werden. Zellen können auch mittels DNA-Rekombinationstechnik transformiert oder transfiziert werden, so daß sie spezifische Bindungssubstanzen an ihren Oberflächen exprimieren. Bei jedem dieser Beispiele kommen der lipidhaltige Molekülteil und der spezifische Bindungsmolekülteil natürlich vor oder werden in einer einzigen Einheit induziert, wobei die Reportersubstanz mit dem Lipidmolekülteil, d. h. der Lipidkomponente der Zell membran, stabil assoziiert ist.
Die erfindungsgemäßen Reagenzien können Zellen enthalten, die dahingehend modifiziert sind, daß sie spezifische Bindungssubstanzen beinhalten, wie z. B. Antikörper oder Antikörperfragmente, die selektiv mit den charakteristischen Determinanten des interessierenden Analyten interagieren. Solche modifizierten Zellen können dadurch hergestellt werden, daß man einen derivatisierten Antikörper oder ein Antikörperfragment mit mindestens einem lipophilen Rohlenwasserstoffsubstituenten an die Zelloberfläche heftet. Der Rohlenwasserstoffsubstituent muß lang genug sein, um den derivatisierten Antikörper bzw. das Antikörperfragment so stark nichtpolar zu machen, daß er/es einen Oberflächenmembran-Retentionskoeffizienten von mindestens ungefähr 90 während 24 Stunden in Kochsalzlösung mit bis zu 10% Serum aufweist, wobei die prozentmäßige Veränderung solch eines Koeffizienten während solch eines Zeitraums weniger als 10% beträgt. Einzelheiten der Vorgehensweise für die Herstellung solcher derivatisierter Antikörper oder Antikörperfragmente können der oben genannten WO-A-8910758 entnommen werden. Außerdem kann in die Plasmamembran der Zellen eine Kohlenwasserstoffgruppe von geeigneter Länge und Funktionalität eingebettet werden und anschließend nach fachbekannten Vorgehensweisen mit dem Antikörper oder Antikörperfragment gekoppelt werden. Die Kopplung der entstandenen derivatisierten Antikörper oder Antikörperfragmente an Zellen kann wie in dem oben genannten US- Patent Nr. 4,783,401 beschrieben erfolgen.
Bei dem Reportermolekülteil des Reagens kann es sich um eine der oben im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung von Analyten genannten Reportersubstanzen handeln.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können unter Verwendung von üblichen Behältnissen, darunter Probenröhrchen, Multititerplatten usw. durchgeführt werden. Detektoren für die genaue Messung der Menge einer Reportersubstanz in einer Probe, wie z. B. Colorimeter, Spektralphotometer, Fluoreszenzspektralphotometer, Flüssigkeits-Szintillationszähler oder Gammazähler, sind im Handel erhältlich.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung können bereits abgemessene Mengen der unterschiedlichen Reagenzien gemeinsam mit den verschiedenen bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Hilfsmitteln, darunter Verdünnungsmittel, Extraktionsmittel, feste Träger zur Immobilisierung von Analyten, ein oder mehrere Standards oder Anweisungen zu deren Herstellung bequem als Testkit verpackt sein. Die Reagenzien in dem Testkit können in verschiedenen Formen vorliegen. Die Reportersubstanz kann in Form einer Lösung gemeinsam mit einem geeigneten Verdünnungsmittel zum Koppeln von Reporter an Zellen bereitgestellt sein. Die Reporterlösung kann in einem Behältnis, das sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren eignet, bereitgestellt sein. Die Reportersubstanz kann jedoch auch in trockener Form gemeinsam mit separaten Phiolen mit Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel, die für die Zugabe zum Reporter und/oder anderen Reagenzien während der Durchführung der Verfahren bestimmt sind, verpackt sein. Die spezifische Bindungssubstanz wird vorzugsweise in auf einem festen Träger immobilisierter Form bereitgestellt, welcher in einem geeigneten Puffer suspendiert oder lyophilisiert oder getrocknet sein kann.
Zur genaueren Beschreibung der Erfindung werden nun die Beispiele unten bereitgestellt. Diese Beispiele dienen dazu, einzelne Anwendungen der erfindungsgemäßen Verfahren zu veranschaulichen und sind keinesfalls als erfindungsbeschränkend zu betrachten. Alle Lösungsmittelmengen sind auf Volumensbasis und alle Temperaturen in ºC angegeben, sofern dies nicht anders vermerkt ist.
Beispiel 1 - Beziehung zwischen Intensität der Fluoreszenz von extrahierter Fluorochromsubstanz und Zellzahl/ Mononukleäre Zellen aus peripherem Blut wurden aus Vollblut eines gesunden Spenders mittels Dichtegradientzentrifugation hergestellt. Dieses Präparat enthält hauptsächlich Lymphocyten und Monocyten. Die Zellen wurden mit 3-n-Propyl-3'-n-docosanyloxacarbocyaniniodid (PDCI) gekoppelt, wobei man 10 uM dieses Reporters und 1 · 10&sup7; Zellen/ml und 300 mOs Saccharose pro Liter als Verdünnungsmittel verwendete. Die entstandenen Zellen wurden mit dem Reporter 5 Minuten bei Raumtemperatur in einem Polypropylenröhrchen inkubiert. Die Kopplungsreaktion wurde durch Zugabe von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 5% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) gestoppt. Die Zellen wurden bei 350x g zentrifugiert, und das entstandene Pellet wurde zweimal mit PBS mit 1% HSA gewaschen. Die Zellausbeute nach dem Koppeln mit dem Reporter betrug 73%, wobei 94% der Zellen lebensfähig waren. Die Lebensfähigkeit wurde nach dem von C. Yeh et al., J. Immunol. Meth., 43 : 269-75 (1981) beschriebenen Verfahren durch Propidiumiodid-Ausschluß bestimmt.
Verdünnungen der Zellsuspensionen wurden hergestellt, und aliquote Teile von 500 - 100,000 Zellen wurden in die Näpfchen einer Kulturplatte mit 96 Näpfchen gegeben. Die Platte wurde bei 350 · g zentrifugiert und die Überstände wurden abdekantiert. Jedes Pellet wurde wieder mit 250 ul 1% Triton X-100 (Handelsname) in PBS aufgenommen und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Ein aliquoter Teil des Zellextrakts (200 ul) wurde aus jedem Näpfchen entfernt und in eine aus schwarzem Plastik bestehende Flachboden-Bestimmungsplatte mit 96 Näpfchen überführt.
Außerdem wurden Verdünnungen von PDCI in Triton X-100 (Handelsname) (0,005 uM pro 1 uM PDCI) in eine andere Bestimmungsplatte gegeben. Mit dieser Platte wurde eine Eichkurve erstellt.
Die Intensität der Fluoreszenz jeder Probe in den Bestimmungsplatten wurde in einem Fluoroskan II Mikroplatten-Reader (Flow Laboratories, Inc.) mit einem 485 nm-Anregungsfilter und einem 538 nm-Emissionsfilter gemessen.
Wie aus Fig. 1 ersichtlich, ist die mit dem Fluoroskan II Mikroplatten-Reader gefundene Intensität der Fluoreszenz von PDCI der PDCI-Konzentration proportional. Aus Fig. 2 geht hervor, daß sich die Intensität der Fluoreszenz von aus den Zellen extrahiertem PDCI proportional zur Zellzahl verhält. Die in Fig. 2 angegebenen Daten zeigen weiterhin, daß mit dieser Analysetechnik weniger als 1000 oder darunter mit PDCI gekoppelte Zellen nach der Extraktion nachgewiesen werden können.
Beispiel 2 - Bestimmung des Anteils von Zellen in Leukocyten-Unterpopulationen mittels Immunaffinitätstrennung und Extraktion von Reporter-Fluorochromsubstanz aus hiermit gekoppelten Zellen/ Mononukleärzellen wurden aus peripherem Blut gesunder Spender gewonnen und mit PDCI (Konzentration 2 uM) wie oben in Beispiel 1 beschrieben gefärbt. Die erhaltenen Zellen wurden in einer Endkonzentration von 1 · 10&sup7;/ml in einem aus PBS mit 1% BSA und 40 uM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) bestehenden Waschpuffer suspendiert.
Aliquote Teile der mit PDCI gekoppelten Zellen wurden mit monoklonalen Antikörpern (MAk), die für Lymphocyten-Untergruppen spezifisch sind, in einer Konzentration von 20-40 ul MAk pro 2 · 10&sup6; Zellen inkubiert. Bei den verwendeten MAks handelte es sich um folgende: Anti-CD4, der für T-Helfer-Lymphocyten und Monocyten spezifisch ist; Anti-CD8, der Suppressorlymphocyten/cytotoxische T-Lymphocyten erkennt; sowie Anti-CD19, der für B-Lymphocyten spezifisch ist, sowie ein Negativkontroll-MAk des Isotyps IgG&sub1;. Alle MAks stammten von AMAC, Inc. Die Zellen wurden mit den MAks 30 Minuten bei 4º inkubiert, zweimal mit Waschpuffer gewaschen, wieder mit 200 ul Waschpuffer aufgenommen und in 4 ml Polypropylenröhrchen gegeben. Dann wurde jedes Röhrchen mit 50 ul mit magnetischen Perlen konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Immunglobulin (Dynal Inc.) versetzt, und die Röhrchen wurden 30 Minuten auf einem Blutmixer (Robbins Scientific) bei 4º inkubiert.
Die magnetischen Perlen und die an die Perlen gebundenen Zellen wurden dadurch getrennt, daß man das Röhrchen mit 1 ml Waschpuffer versetzte und das Probenröhrchen dann 1 Minute lang neben einen Magneten stellte. Der Überstand, der Reaktionsflüssigkeit und ungebundene Zellen enthielt, wurde entfernt. Der Magnet wurde entfernt, das Röhrchen wurde mit 1 ml Waschpuffer versetzt, und es wurde vorsichtig gemischt, um das entstandene Pellet zu resuspendieren. Dann wurde der Magnet wieder einwirken gelassen, und der Überstand wurde abdekantiert. Dies wurde nochmals wiederholt. Alle Überstände von allen Reaktionsröhrchen wurden vereinigt. Nach dem letzten Waschschritt wurden die vereinigten Überstände zentrifugiert, und die Zellen wurden wieder in 200 ul Waschpuffer suspendiert. Die gewaschenen Pellets aus den magnetischen Trennungen wurden ebenfalls wieder in 200 ul Waschpuffer suspendiert.
Aliquote Teile (150 ul) jedes Röhrchens (diejenigen, die gewaschene Pellets enthielten, und diejenigen, die Zellen aus vereinigten Überständen der magnetischen Trennung enthielten) wurden in die Näpfchen einer Platte mit 96 Näpfchen überführt. Die Platte wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde abdekantiert. Die Zellen in jedem Näpfchen wurden dann wieder in 250 ul 1% Triton X-100 (Handelsname) suspendiert, um das PDCI zu extrahieren. Die Extrakte wurden wie oben in Beispiel 1 beschrieben in einem Fluoroskan II Platten-Reader analysiert; dieses Gerät führt Fluoreszenzbestimmungen an bis zu sechsundneunzig (96) Extrakten in unter einer Minute durch. Der Anteil MAk-markierter Zellen in Prozent wurde folgenderrmaßen berechnet:
Intensität der Fluoreszenz des Pellets / Intensität der Fluoreszenz von (Pellet + Überstand) ·100%
Aliquote Teile von Zellen des gleichen Spenders, die nicht mit PDCI gefärbt worden waren, wurden für die Immunfluoreszenz-Markierung verwendet. Diese Proben wurden mit den gleichen MAks wie oben inkubiert und anschließend mit mit Phycoerythrin konjugiertem Ziegen- Anti-Maus-Immunglobulin (Hiomeda, Corp.) umgesetzt. Die mittels Immunfluoreszenz markierten Zellen wurden mittels Durchflußcytometrie analysiert, wobei es sich um ein Verfahren handelt, das bis jetzt häufig für solch eine Bestimmung verwendet wurde. Bei der Durchflußcytometrie braucht man ungefähr eine Minute pro Fluoreszenzbestimmung. Der Prozentsatz an MAk-markierten Zellen wurde folgendermaßen berechnet:
Anzahl immunfluoreszenzpositiver mononukleärer Zellen · 100%/ Gesamtzahl gezählter mononukleärer Zellen
Die Ergebnisse dieser Bestimmungen lauteten folgendermaßen: Tabelle 1
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß der Anteil an Zell-Untergruppen in einer Population, die charakteristische Antigene exprimiert, durch das erfindungsgemäße Verfahren bestimmt werden kann und daß die durch dieses Verfahren erhaltenen Ergebnisse mit den mittels traditioneller Durchflußcytometrie-Analyse erhaltenen Ergebnissen vergleichbar sind und daß bei einer großen Anzahl von Fluoreszenzbestimmungen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine wesentlich kürzere Analysezeit erforderlich ist als bei dem traditionellen Verfahren.
Obwohl bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung oben beschrieben und beispielhaft dargestellt wurden, wird sich der Fachmann aus der obigen Beschreibung verschiedene andere Ausführungsformen vorstellen können. Zum Beispiel können mittels der vorliegenden Erfindung antigenspezifische Zellen bestimmt werden, die an der durch die Zelle vermittelten Immunität beteiligt sind. Diese Bestimmung wird dadurch durchgeführt, daß man alle Immunzellen in einer Probe mit einer der oben beschriebenen Reportersubstanzen, die fähig ist, mit der Lipidkomponente der Membranen der Immunzellen stabil zu assoziieren, koppelt, die Zellen, die die Reportersubstanz tragen, mit dem interessierenden, an einen festen Träger gebundenen Antigen inkubiert, nichtgebundene Zellen abtrennt, die Reportersubstanz extrahiert und das Vorliegen bzw. die Menge von gebundenen antigenspezifischen Zellen bestimmt. Neben der Bestimmung bestimmter Immunzellen-Untergruppen läßt sich die vorliegende Erfindung auch für ähnliche Bestimmungen in einem beliebigen anderen System, bei dem ein Satz monoklonaler Antikörper verfügbar ist, verwenden, z. B. bei der Bestimmung von Analyten von Bakterien, Pilzen, Viren und Parasiten.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens bzw. der Menge eines Analyten aus der Gruppe umfassend eukaryontische Zellen, prokaryontische Zellen und Viren, die über lipidhaltige Membranen und mindestens eine charakteristische Deterrminante verfügen, in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie diesen Analyten enthält, umfassend die folgenden Schritte:

(i) nichtselektives Koppeln einer nachweisbaren Reportersubstanz mit dem Analyten in der Probe, wobei die nachweisbare Reportersubstanz über einen lipophilen Molekülteil verfügt, der mit der lipidhaltigen Membran des Analyten stabil assoziiert;

(ii) In-Kontakt-Bringen dieser Probe mit einer spezifischen Bindungssubstanz, die an diese mindestens eine charakteristische Determinante des Analyten unter Bedingungen, die zur Komplexbildung zwischen dem Analyten und der spezifischen Bindungssubstanz führen, spezifisch bindet;

(iii) Trennen der Probe in einen Teil, der den Komplex enthält, und einen Teil, der im wesentlichen frei von diesem Komplex ist; sowie

(iv) Nachweisen des Vorhandenseins der Reportersubstanz in einem der abgetrennten Teile, um einen Hinweis auf Vorliegen bzw. Menge des Analyten mit der mindestens einen charakteristischen Determinante in der Probe zu erhalten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Probe mit einer spezifischen Bindungssubstanz, die an einer Festphase fixiert ist, in Kontakt gebracht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die nachweisbare Reportersubstanz in dem Kopplungsschritt mit dem Analyten dissoziierbar gekoppelt wird und die Reportersubstanz vor ihrem Nachweis mit einem geeigneten Extraktionsmittel von dem Analyten dissoziiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der Analyt eine Zell-Unterpopulation innerhalb einer Zellpopulation ist, die spezifische Bindungssubstanz ein Antikörper ist, der an die mindestens eine charakteristische Determinante der Zell-Unterpopulation spezifisch bindet, wobei der Antikörper an einer magnetischen Festphase fixiert ist, und der Komplex von dem komplexhaltigen Teil magnetisch abgetrennt wird, wobei die nachweisbare Reportersubstanz in dem Kopplungsschritt an die Zell-Unterpopulation extrahierbar gekoppelt wird und vor ihrem Nachweis von der Zell-Unterpopulation extrahiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der Analyt eine Zell-Unterpopulation innerhalb einer Zellpopulation ist, die spezifische Bindungssubstanz ein Antikörper ist, der an die mindestens eine charakteristische Determinante der Zell-Unterpopulation spezifisch bindet, wobei der Schritt des In-Kontakt-Bringens umfaßt, daß die Zellpopulation mit (a) dem Antikörper und (b) einer spezifischen Bindungssubstanz, die spezifisch an den Antikörper bindet, in Kontakt gebracht wird, wobei die spezifische Bindungssubstanz an einer Festphase fixiert ist, der Abtrennschritt umfaßt, daß die Festphase, die die Zell-Unterpopulation trägt, von der Zellpopulation abgetrennt wird und die nachweisbare Reportersubstanz an die Zell-Unterpopulation in dem Kopplungsschritt extrahierbar gekoppelt wird und vor ihrem Nachweis von dieser Unterpopulation extrahiert wird.

6. Analyseverfahren für eine Zell-Unterpopulation mit mindestens einer charakteristischen Determinante, die innerhalb einer Zellpopulation mit lipidhaltigen Membranen existiert, wobei die Zell-Unterpopulation einzelne interessierende Untergruppen enthält, wobei jede Untergruppe über mindestens eine charakteristische Determinante verfügt, um den Anteil mindestens einer Untergruppe an dieser Zell-Unterpopulation zu bestimmen, das folgende Schritte umfaßt:

(i) nichtselektive Kopplung von im wesentlichen allen Zellen der Population an eine nachweisbare Reportersubstanz, wobei die nachweisbare Reportersubstanz über einen lipophilen Molekülteil verfügt, wodurch die nachweisbare Reportersubstanz mit den lipidhaltigen Membranen der Zellen stabil assoziiert;

(ii) In-Kontakt-Bringen einer ersten Probe der Zellpopulation aus Schritt (i) mit einem ersten Reagens, das mindestens eine spezifische Bindungssubstanz umfaßt, die an die mindestens eine charakteristische Determinante der Zell-Unterpopulation spezifisch bindet, unter Bedingungen, die zur Bindung des ersten Reagens an die Zellen der Unterpopulation führen, wodurch erste Komplexe in der ersten Probe gebildet werden;

(iii) Abtrennen der ersten Komplexe in der ersten Probe von ungebundenen Zellen in den ersten Proben;

(iv) Nachweisen des Vorhandenseins der Reportersubstanz in den ersten Komplexen;

(v) In-Kontakt-Bringen einer zweiten Probe der Zellpopulation aus Schritt (i) mit einem Volumen und einer Zellkonzentration, die der ersten Probe entsprechen, mit einem zweiten Reagens, das eine spezifische Bindungssubstanz, die zur selektiven Interaktion mit der mindestens einen charakteristischen Determinante der mindestens einen interessierenden Untergruppe in der Unterpopulation fähig ist, umfaßt unter Bedingungen, die zur Bindung des zweiten Reagens an die mindestens eine charakteristische Determinante führen, wodurch zweite Komplexe in der zweiten Probe gebildet werden;

(vi) Abtrennen der zweiten Komplexe in der zweiten Probe von ungebundenen Zellen in der zweiten Probe;

(vii) Nachweisen des Vorhandenseins einer Reportersubstanz in den zweiten Komplexen; sowie

(viii) Bestimmen des Anteils der mindestens einen interessierenden Untergruppe in der Zell- Unterpopulation durch quantitative Bestimmung der Menge der Reportersubstanz, die mit den zweiten Komplexen stabil assoziiert ist, im Vergleich zu der Menge der Reportersubstanz, die mit den ersten Komplexen stabil assoziiert ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, das folgendes enthält:

(ix) In-Kontakt-Bringen von einer oder mehreren weiteren Proben der Zellpopulation aus Schritt (i), wobei jede Probe über ein Volumen und eine Zellkonzentration verfügt, die der ersten Probe entsprechen, mit einem oder mehreren weiteren Reagenzien, wobei jedes weitere Reagens eine spezifische Bindungssubstanz umfaßt, die an mindestens eine charakteristische Determinante von einer bzw. mehreren weiteren interessierenden Untergruppen spezifisch bindet, unter Bedingungen, die zur Bindung jedes weiteren Reagens an jede Untergruppe führen, wodurch weitere Komplexe in diesen weiteren Proben gebildet werden;

(x) Abtrennen jedes weiteren Komplexes in jeder weiteren Probe von ungebundenen Zellen in jeder weiteren Probe;

(xi) Nachweisen des Vorhandenseins der Reportersubstanz in jedem der weiteren Komplexe; sowie

(xii) Bestimmung des Anteils jeder weiteren Untergruppe in der Zell-Unterpopulation durch quantitative Bestimmung der Menge der mit jedem weiteren Komplex stabil assoziierten Reportersubstanz im Vergleich zu der Menge der mit den ersten Komplexen stabil assoziierten Reportersubstanz.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, bei dem das erste Reagens eine Mischung spezifischer Bindungssubstanzen umfaßt, wobei jede Bindungssubstanz fähig ist, an charakteristische Determinanten einzelner interessierender Untergruppen, die in der Unterpopulation enthalten sind, spezifisch zu binden, wodurch im wesentlichen alle Zellen der Unterpopulation an die bindenden Substanzen gebunden werden.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6, 7 oder 8, bei dem die spezifischen Bindungssubstanzen des ersten Reagens, des zweiten Reagens und der einen oder mehreren weiteren Reagenzien an einer Festphase fixiert sind.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6, 7 oder 8, bei dem die nachweisbare Reportersubstanz an die Zellen extrahierbar gekoppelt ist und die Reportersubstanz vor ihrem Nachweis von den Zellen extrahiert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der Analyt eine Zell-Unterpopulation innerhalb einer Zellpopulation ist, die spezifische Bindungssubstanz ein Antikörper ist, der an die mindestens eine charakteristische Determinante der Zell-Unterpopulation spezifisch bindet und die nachweisbare Reportersubstanz vor ihrem Nachweis von der Zell-Unterpopulation extrahiert wird.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die an den Analyten gekoppelte Reportersubstanz aus der Gruppe der aufgrund ihrer lichtabsorbierenden, fluoreszierenden, phosphoreszierenden oder lumineszierenden Eigenschaften direkt oder indirekt nachweisbaren Moleküle oder Ionen oder der aufgrund ihrer radioaktiven Eigenschaften nachweisbaren Moleküle oder Ionen sowie der aufgrund ihrer die kernmagnetische Resonanz betreffenden Eigenschaften oder paramagnetischen Eigenschaften nachweisbaren Moleküle oder Ionen stammt.

13. Testkit zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, wobei dieser Analyt über eine Lipidkomponente und mindestens eine charakteristische Determinante verfügt, wobei dieses Testkit folgendes umfaßt:

(i) eine nachweisbare Reportersubstanz zur Kopplung an den Analyten, wobei die nachweisbare Reportersubstanz über einen lipophilen Molekülteil verfügt, der mit der Lipidkomponente des Analyten stabil, jedoch dissoziierbar, assoziieren kann, und

(ii) ein Reagens mit mindestens einer spezifischen Bindungssubstanz, die zur selektiven Interaktion mit mindestens einer charakteristischen Determinante des Analyten fähig ist.

14. Testkit nach Anspruch 13, das ein Medium zur Kopplung der Reportersubstanz an den Analyten umfaßt.

15. Testkit nach Anspruch 13, bei dem die spezifische Bindungssubstanz an eine Festphase fixiert ist.

16. Testkit nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, das ein Extraktionsmittel zur Extraktion der Reportersubstanz von dem Analyten enthält.

17. Testkit nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, bei dem die Reportersubstanz ein Fluorochrom aus der Gruppe der Cyanin-, Acridin-, Pyridin-, Anthrachinon-, Cumann-, Chinolin-, Exanthen-, Phenoxazin-, Phenothiazin- und Hexatrienfarbstoffe und deren Derivate ist.

18. Testkit nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, bei dem die Reportersubstanz eine Verbindung der Formel

ist, in der

R und R&sub1; gleich oder verschieden sind und Substituenten bedeuten, die unabhängig aus der Gruppe Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkaryl oder Aralkyl ausgewählt sind, deren Kohlenwasserstoffketten 1 bis 30 Kohlenstoffatome aufweisen und geradkettig oder verzweigt sind, wobei die Substituenten unsubstituiert oder durch eine oder mehrere nichtpolare funktionelle Gruppen substituiert sind;

X und X&sub1; gleich oder verschieden sein können und O, S, C (CH&sub3;)&sub2; oder Se darstellen;

Y ein Brückenglied -CH=, -CH=CH-CH=, -CH=CH- CH=CH-CH= oder -CH=CH-CH=CH-CH=CH-CH= darstellt;

Z und Z&sub1; gleich oder verschieden sind und Substituenten aus der Gruppe H, Alkyl, OH, NH&sub2;, COOH, CONH&sub2;, SO&sub3;H, SO&sub2;H, SO&sub2;NH&sub2;, NHNH&sub2;, NCS, NCO, CONH-Alkyl, CON- (Alkyl)&sub2;, NH-Acyl, -O-Alkyl, NH-Alkyl, N(Alkyl)&sub2;, SH, S- Alkyl, NO&sub2; oder Halogen darstellen, wobei die Alkylgruppen in den Z-Substituenten 1 bis 3 Kohlenstoffatome aufweisen, und A ein biologisch kompatibles Anion darstellt.

19. Testkit zur Untersuchung einer Unterpopulation von biomembranhaltigen Einheiten mit mindestens einer charakteristischen Determinante, die innerhalb einer Population von Einheiten vorliegen, wobei die Unterpopulation einzelne Untergruppen von biomembranhaltigen interessierenden Einheiten enthält, wobei jede Untergruppe mindestens eine charakteristische Determinante aufweist, zur Bestimmung des Anteils mindestens einer Untergruppe in der Unterpopulation, wobei dieses Rit folgendes enthält: (i) eine nachweisbare Reportersubstanz zur Kopplung an die Population biomembranhaltiger Einheiten, wobei die Reportersubstanz über einen lipophilen Molekülteil verfügt, der fähig ist, mit der Lipidkomponente der Biomembran stabil zu assoziieren, (ii) ein erstes Reagens mit mindestens einer spezifischen Bindungssubstanz, die zur selektiven Interaktion mit mindestens einer charakteristischen Determinante der Unterpopulation fähig ist, sowie (iii) mindestens ein weiteres Reagens, das mindestens eine spezifische Bindungssubstanz umfaßt, die zur selektiven Interaktion mit mindestens einer charakteristischen Determinante von mindestens einer Untergruppe der Unterpopulation fähig ist.

20. Reagens zur Bestimmung eines Analyten mit mindestens einer charakteristischen Determinante, wobei dieses Reagens einen lipidhaltigen Molekülteil, einen spezifischen Bindungsmolekülteil, der zur selektiven Interaktion mit der charakteristischen Determinante fähig ist, sowie einen nachweisbaren Reportermolekülteil mit einer lipophilen Komponente, wodurch der nachweisbare Reportermolekülteil mit dem lipidhaltigen Molekülteil verbunden und stabil, jedoch dissoziierbar, assoziiert ist, umfaßt.

21. Testkit zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, wobei dieser Analyt über eine charakteristische Determinante verfügt, wobei das Testkit ein Reagens nach Anspruch 20 enthält.