DE69332884T2

DE69332884T2 - Direkte auswahl von zellen durch ein aussheidungsprodukt

Info

Publication number: DE69332884T2
Application number: DE69332884T
Authority: DE
Inventors: Rudi Manz; Stefan Miltenyi; Andreas Radbruch
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-10-21
Filing date: 1993-10-21
Publication date: 2003-11-20
Anticipated expiration: 2013-10-22
Also published as: DE69332884D1; EP0667896B1; AU679949B2; EP0667896A1; ES2191677T3; CA2146974A1; AU5538594A; EP0667896A4; KR950704475A; US20060141540A1; CA2146974C; EP1324040A2; EP1324040A3; JP3731891B2; JPH08504574A; ATE237808T1; KR100306635B1; WO1994009117A1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Analyse von Zellpopulationen und der Zellseparation. Genauer gesagt betrifft die Erfindung Analyse- und Trenntechniken, die auf einer Primärmarkierung von Zellen mit ihren Sekretionsprodukten durch Einfangen dieser Produkte mittels eines spezifischen Bindungspartners für das an der Zelloberfläche verankerte Produkt beruhen.

Hintergrund

Es wurden bereits zahlreiche Versuche unternommen, Zellpopulationen zu analysieren und die Zellen ausgehend von den Produkten, die sie erzeugen, zu trennen. Solche Ansätze für die Zellanalyse und -separation sind besonders nützlich zur Feststellung jener Zellen, die zum Sekretieren eines gewünschten Produkts (dem "Produkt") fähig sind oder die das Produkt in relativ hohem Grade sekretieren. Zu diesen Methoden zählen das Klonieren in Mikrotiterplatten und die Analyse des Kulturüberstands auf das Produkt, das Klonieren in Agar und die Analyse mittels Methoden zur Identifikation des Produkts der lokalisierten Zellen; zu den Identifikationsmethoden zählen zum Beispiel Plaque-Assays und Western Blotting. Die meisten Methoden zur Analyse und Selektion von Zellenausgehend von der Produktsekretion wenden das Konzept einer physikalischen Isolierung der Zellen, gefolgt von Inkubation unter Bedingungen, die die Sekretion von Produkt ermöglichen, und ein Screening der Zelllokalisationen an, um die Zellen oder Zellklone zu detektieren, die das Produkt erzeugen. Bei Zellen in Suspension diffundiert das Produkt, nachdem es von den Zellen sekretiert worden ist, aus den Zellen, ohne einen Marker zurückzulassen, der eine Identifikation jener Zellen ermöglichen würde, von denen es sekretiert worden ist. Daher lassen sich bei diesem System nicht sekretierende Zellen von nicht-sekretierenden Zellen trennen.
In anderen Fällen können sowohlsekretierende als auch nicht sekretierende Zellen das Produkt an die Zellmembran binden. Ein Beispiel für diese Art von System stellen von B-Zellen abgeleitete Zelllinien dar, die monoklonale Antikörper produzieren. Es wurde berichtet, dass diese Arten von Zelllinien durch Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und andere Methoden, die auf dem Vorhandensein von Antikörper-Zelloberflächen-Markern beruhen, getrennt werden können. Allerdings können Verfahrensweisen, die Zellen mittels Markern analysieren und trennen, die natürlicherweise mit der Zelloberfläche assoziiert sind, möglicherweise nicht präzise sekretierende Zellen von nicht-sekretierenden Zellen unterscheiden und/oder bei deren Trennung verwendet werden. Außerdem sind Systeme wie diese nicht zum Identifizieren quantitativer Unterschiede bei sekretierenden Zellen (d. h. geringfügig sekretierende gegenüber hochgradig sekretierenden Zellen) nützlich.
Parks et al., Proc. Natl. Acad. Sci 1979 76, 1962-1966 beschreibt die Markierung von Antikörper-produzierenden Zellen mit fluoreszierenden Mikrokügelchen, die an Antigen gekoppelt sind.
Eine Methode, die zur Überwindung der Probleme eingesetzt wurde, die mit der Diffusion von Produkt aus den Zellen in Zusammenhang stehen, besteht, im Einbringen der Zellen in ein Medium, welches die Diffusionsrate aus den Zellen hemmt. Eine typische Methode stellt das Immobilisieren der Zelle in einem gelartigen Medium (Agar) und dann das Durchsuchen der Agarplatten auf das erzeugte Produkt unter Verwendung eines auf Blotting, zum Beispiel Western Blotting, basierenden Systems dar. Diese Systeme sind mühsam und teuer, wenn große Zellzahlen auf Eigenschaften wie Sekretion, Nicht-Sekretion oder Umfang der Sekretion analysiert werden sollen.
Kohler et al. haben ein System beschrieben, bei dem Mutanten einer Hybridomlinie, die IgM mit Antitrinitrophenyl-(Anti-TNP)-Spezifität sekretieren, durch Kopplung des Haptens an die Zelloberfläche und Inkubation der Zellen in Gegenwart von Komplement angereichert wurden. Auf diese Weise begingen die Wildtyp-Ig- sekretierenden Zellen Selbstmord, wohingegen Zellen, die IgM mit reduzierter lytischer Aktivität sekretierten oder nicht an TNP banden, präferentiell überlebten. - Kohler and Schulman, Eur. J. Immunol. 10: 467-476 (1980).
Andere bekannte Systeme ermöglichen den Zellen die Sekretion ihrer Produkte im Umfeld von Mikrotröpfchen aus Agarosegel, die Kügelchen enthalten, welche die Produkte binden und die Zellen einkapseln. Solche Methoden wurden in den Veröffentlichungen von Nir et al., Applied and Environ. Microbiol. 56: 2870-2875 (1990); und Nir et al., Applied and Environ: Microbiol. 56: 3861-3866 (1990) beschrieben. Diese Methoden sind aus vielfältigen Gründen nicht zufriedenstellend.
Beim Vorgang der Mikroeinkapselung tritt ein statistischer Einfang von Zellzahlen in den Kapseln auf, was entweder eine hohe Anzahl leerer Kapsein bedeutet, wenn die Einkapselung bei niedrigen Zellkonzentrationen stattfindet, oder vielfache Zellen pro Kapsel, wenn die Einkapselung bei hohen Zellkonzentrationen stattfindet. Um einzelne Zellen oder einzelne Zellcluster mittels dieser Technik zu analysieren und zu trennen, müssen große Volumina gehandhabt werden, um mit relativ kleinen Zellzahlen zu arbeiten, was an der Zahl leerer Kapseln und der Größe der Mikrokapseln (50-100 um) liegt. Das große Volumen der Tröpfchen führt zu Hintergrund-Problemen bei Anwendung der Flusszytometrie-Analyse und -Separation. Außerdem erlauben die Kapseln keine Trennung unter Verwendung magnetischer Kügelchen oder dem Panning zur Zellseparation.
Es wurden verschiedene Methoden zur Kopplung von Markern an Zelloberflächen eingesetzt, wobei der Marker, zum Beispiel ein Fluorochrom, dem Direktnachweis dienen soll. Zum Beispiel wurde die Verwendung von in die Zellmembran eingeschleusten hydrophoben Linkem, um Fluoreszenzmarker an die Zellen zu koppeln, in PCT WO 90/02334, veröffentlicht am 8. März 1990, beschrieben. Auf HLA gerichtete Antikörper wurden ebenfalls zur Bindung von Markern an Zelloberflächen verwendet. Eine derartige Bindung ergibt kleinere Volumina als die oben beschriebenen eingekapselten Tröpfchen, und außerdem sind derartige Zellen bei standardmäßigen Trennverfahren einschließlich der Flusszytometrie und magnetischen Trennungen bequem einsetzbar.
Es wurde nun festgestellt, dass durch Verankern eines spezifischen Bindungspartners in der Zelloberfläche unter Anwendung eines geeigneten Kopplungsmechanismus die Zellprodukte eingefangen und die Zellen ausgehend vom Vorhandensein, der Abwesenheit oder der Menge an Produkt sortiert werden können.

Beschreibung der Erfindung

Mit der Erfindung wird eine Methode zum bequemen Analysieren und Trennen von Zellen auf der Basis der von den Zellen sekretierten Produkte bereitgestellt. Die Zellen werden mit einer Einfang-Komponente für das Produkt versehen, welches dann direkt als ein Marker genutzt werden kann. Die Bindung des Produkts an die Einfang-Komponente ergibt ein "eingefangenes Produkt". Alternativ werden die Zellen an das Produkt über die Einfang-Komponente gebunden und können weiter über Marker-Komponenten markiert werden, die spezifisch an das Produkt binden und die wiederum entweder direkt oder indirekt mit herkömmlichen Markierungssübstanzen wie Fluorophoren, radioaktiven Isotopen, Chromophoren oder magnetischen Partikeln markiert sind.
Die markierten Zellen können dann getrennt oder unter Anwendung standardmäßiger Zellsortier-Techniken auf der Grundlage dieser Marker detektiert werden. Zu diesen Techniken zählen die Flusszytometrie, magnetische Separation, magnetische Starkfeldscheidung, Zentrifugation und ähnliche.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Selektieren oder Analysieren von Zellen entsprechend einem Produkt, das durch die Zellen sekretiert und freigesetzt wird, bereitgestellt, welches Verfahren umfasst:
Koppeln der Oberfläche der Zellen an eine Einfang-Komponente und Züchten der Zellen unter Bedingungen, bei denen das Produkt sekretiert, freigesetzt und spezifisch an die Einfang-Komponente gebunden wird;
Markieren des Produkts, zum Beispiel mit einer Marker-Komponente; und
Selektieren oder Analysieren der Zellen auf der Basis des gebundenen Produkts; wobei die Zellen mit derart gebundenem Produkt nicht als Teil der Selektion oder Analyse lysiert werden.
Die Erfindung umfasst eine Methode zum Trennen von Zellen entsprechend einem durch die Zellen sekretierten und freigesetzten Produkt, welche Methode das Bewirken einer Trennung der Zellen entsprechend dem Grad umfasst, in dem sie mit dem Produkt markiert sind, wobei die Markierung mit dem Produkt durch Koppeln der Oberfläche der Zellen an mindestens eine Einfang-Komponente erzielt wird; das Züchten der Zellen unter Bedingungen, bei denen das Produkt sekretiert, freigesetzt und spezifisch an die Einfang-Komponente gebunden ("eingefangen" oder "eingeschlossen") wird; und das Markieren des eingefangenen Produkts mit der Marker-Komponente; wobei die markierten Zellen nicht als Teil des Trennverfahrens lysiert werden.
Die Methoden der Erfindung können eine stoffliche Zusammensetzung anwenden, die Zellen umfasst, die zum Einfangen eines durch die Zellen sekretierten und freigesetzten Produkts fähig sind, wobei die Oberfläche der Zellen an eine Einfang- Komponente gekoppelt wird. Es werden außerdem durch die oben beschriebene Methode getrennte Zellen und deren Nachkommen beschrieben.
Das Verfahren der Erfindung kann zum Markieren von Zellen mit einem durch die Zellen sekretierten und freigesetzten Produkt eingesetzt werden, welches Verfahren das Koppeln der Oberfläche der Zellen an eine Einfang-Komponente und das Züchten der Zellen unter Bedingungen, bei denen das Produkt sekretiert und freigesetzt wird, umfasst. Das eingefangene Produkt kann separat durch eine Marker-Komponente markiert werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zum Analysieren einer Zellpopulation, um den Anteil der Zellen zu bestimmen, die eine variierende Menge an Produkt relativ zu anderen Zellen in der Population sekretieren, welches Verfahren das Markieren der Zellen mittels der oben beschriebenen Methode, weiterhin das Markieren der Zellen mit einem zweiten Marker, der das eingefangene Produkt nicht markiert, und das Detektieren der Menge an Produkt-Marker relativ zum zweiten Zell-Marker, umfasst.
Bei einer weiteren zusätzlichen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zum Bestimmen einer Verteilung der sekretorischen Aktivität in einer Zellpopulation, welches Verfahren das Markieren von Zellen mittels der oben beschriebenen Methode umfasst (d. h. Koppeln der Oberfläche jener Zellen an eine Einfang-Komponente, Züchten der Zellen unter Bedingungen, bei denen das Produkt sekretiert und freigesetzt wird, und Aussetzen der Zellen einer Marker-Komponente), und das Bestimmen der Menge an Produkt pro Zelle anhand der Menge an Marker- Komponente, die an die Zelle gebunden ist.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zum Bestimmen einer Verteilung der sekretierten Produkte und der sekretorischen Aktivität für jedes sekretierte Produkt in einer Zellpopulation, welches Verfahren das Markieren der Zellen mittels der oben beschriebenen Methode durch Koppeln der Zelloberflächen in der Population mit Einfang-Komponenten für jedes sekretierte und nachzuweisende Produkt umfasst; das Züchten der Zellen unter Bedingungen, bei denen die Produkte sekretiert und freigesetzt werden, das Markieren der sekretierten eingefangenen Produkte mit Marker-Komponenten, wobei die Marker-Komponente für jedes sekretierte eingefangene Produkt unterscheidbar ist; und das Bestimmen der Menge und Art von Produkt pro Zelle.
Nachstehend wird außerdem ein Analysesatz zur Verwendung bei der Detektion der Zellen beschrieben, die ein gewünschtes Produkt sekretieren. Der Analysesatz kann ein physiologisch geeignetes Medium enthalten, das von variierendem Viskositätsgrad bis hin zu einer gelartigen Konsistenz sein kann, welches Medium zur Inkubation der Zellen für die Erzeugung des Sekretionsprodukts verwendbar ist; wobei ein Produkt-Einfangsystem mindestens eine Anker-Komponente und mindestens eine Einfang-Komponente umfasst; mindestens eine Marker-Komponente; und Gebrauchsanleitungen für die Reagenzien, die alle in geeignete Behälter abgepackt sind.
Es wird auch eine Analysesatz zur Verwendung beim Detektieren und/oder Trennen von Zellen beschrieben, die ein gewünschtes Produkt sekretieren. Der Analysesatz enthält mindestens eine Einfang-Komponente, welche ein bifunktioneller Antikörper mit Spezifität sowohl für die Zellen und das Produkt als auch mindestens eine Marker-Komponente ist. Diese Reagenzien können vorzugsweise in eine einzige Phiole zum gleichzeitigen Einfangen und Markieren eingebracht werden. Auch Gebrauchsanleitungen für die Reagenzien sollten enthalten sein. Ebenso kann ein physiologisch geeignetes Medium von variierendem Viskositätsgrad oder Geibildungsvermögen bereitgestellt sein. Die flüssige Phase kann jedoch durch die Probe salbst geliefert werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Zellkulturmedium, Blut und Urin.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt ein Schema für die Einführung von Biotinyl- und Palmitoylgruppen in Dextran.
Fig. 2 zeigt ein Schema für die Reaktion von N-Hydroxysuccinimid-(NHS)-Estern mit primären Aminogruppen in basischer Form.
Fig. 3a bzw. 3b sind Fotokopien der Aufzeichnungen der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortier-Analysen (FACScans) der Bindung von Streptavidin an mit Biotinyldextran und Biotinylpalmitoyldextran behandelten Zellen.
Fig. 4 zeigt Fotokopien der Aufzeichnungen der FACScan-Ergebnisse:
a) unbiotinylierte Zellen, die mit Streptavidin, markiert mit Fluorisothiocyanat (ST- FITC), behandelt wurden (negative Kontrolle); b) Zellen, die mit Biotinylpalmitoyldextran und dann mit ST-FITC behandelt wurden; c) Zellen, die mit Biotinyl-Anti-αβ&sub2;- Mikroglobulin (β&sub2;m) inkubiert und mit ST-FITC behandelt wurden.
Fig. 5 zeigt ein Schaubild der Titration der Bindung von IgM an Zellen, die Konjugate von Biotinylpalmitoyldextran und Einfang-Antikörpern tragen.
Fig. 6 zeigt Fotokopien der Aufzeichnungen von FACScan-Ergebnissen des Einfangs im Zeitverlauf von IgM an Zellen, die Einfang-Antikörper/Avidin-Biotin- Konjugate: tragen. Tafeln (a), (b), (c) und (d) zeigen die Aufzeichnungen bei 10 Minuten, 30 Minuten, 1 Stunde bzw. 2 Stunden.
Fig. 7 zeigt Fotokopien der Aufzeichnungen von FACScans, die die Auswirkung der Konzentration an Methylcellulose in Medium auf den Einfang zeigen. Fig. 7a und 7b zeigen den Einfang der Antikörper durch in 2,5% bzw. 1% Methylcellulose- Medium inkubierte Zellen.
Fig. 8 zeigt eine FACScan-Darstellung der markierten Zellen vor und nach der Trennung auf der Basis eines Einfangs von sekretierten Antikörpern in 2,5% Methylcellulose-enthaltendem Medium. Die Zellen sind in Fig. 8a vor der Trennung gezeigt. Fig. 8b zeigt die negative Fraktion nach der Trennung. Fig. 8c zeigt die positive Fraktion nach der Trennung.
Fig. 9a zeigt Fotokopien der Aufzeichnungen von FACScan-Ergebnissen, die die Wirkung verschiedener zugesetzter Substanzen im Kulturmedium während der Sekretionsphase wiedergeben. Fig. 9a, 9b und 9c zeigen den Einfang von Produkt durch Anti-Produkt-Antikörper an Zellen, wenn die Zellen in Kulturmedium, Kulturmedium mit 40% Rinderserumalbumin (BSA) bzw. Kulturmedium mit 20% BSA plus 20% Gelatine inkubiert werden.
Fig. 10 und 11 zeigen FACScan-Darstellungen von markierten Zellen nach Markierung mit Einfang-Antikörper (10a, 11a), nach der Sekretionsphase (10b, 11b) und nach der magnetischen Trennung, wobei (10c, 11c) die magnetische Fraktion sind und (10d und 11d) die nicht-magnetische Fraktion sind.
Fig. 12 zeigt die Zuordnung in die Messkanäle für Fig. 13 und 14 von Mäusemilzzellen für die FACS-Analyse. 12a zeigt das Diagramm der Vorwärtsstreuung (FSC) gegenüber der Seitwärtsstreuung (SSC). 12b zeigt Propidiumiodid (PI) gegenüber Fluoreszenz 2. Der durch die Linien umschlossene Bereich zeigt die zur weiteren Analyse den Messkanälen zuzuordnenden Zellen (Blastzellen, lebend).
Fig. 13 zeigt eine Zusammenstellung der FACS-Analysen von FITC-markierten Zellen. 13a zeigt einen Scan von unmarkierten Zellen. 13b zeigt einen Scan von mit ST-FITC vor der Biotinylierung inkubierten Zellen. 13c zeigt einen Scan von mit ST- FITC nach der Biotinylierung markierten Zellen. 13d stellt eine negative Kontrolle dar, die einen Zell-Scan zeigt, nachdem biontinylierte Zellen, die mit einem Antikörper angefärbt sind, an für Ratten-IgG spezifische FITC (GaRIgG-FITC) gekoppelt haben, die aber nicht dem avidinierten Fang-Antikörper (Ratte) (Fang-Ak-Avidin) ausgesetzt wurden. 13e zeigt einen Scan von Zellen, die Fang-Ak und Ziege-Anti-Ratte-IgG- FITC (GaRigG-FITC) ausgesetzt wurden.
Fig. 14 zeigt eine Zusammenstellung der Dot-Plots von FACS-Analysen. In jedem Fall steht die Abszisse für die Menge an Marker-Anfärbung für Interferonγ (IFNγ), während die Ordinate keine Information darstellt. Die Zellen wurden mit FITCmarkiertem Antidigoxigenin-Antikörper markiert, der Digoxigenin-konjugierten Ratte- Ariti-Maus-IFNy-Antikörper detektiert (R46A2-DIG αDIG-FITC). 14a zeigt das Ergebnis, das zum Zeitpunkt Null der Inkubation mit für IFNγ spezifischem Fang- Aritikörper (Fang-Ak) erhalten wurde 14b zeigt das Ergebnis, das bei einer 5-minütigen Inkubation mit dem Fang-Ak erhalten wurde. 14c zeigt das Ergebnis, das bei einer 90-minütigen Inkubation ohne den Fang-Ak erhalten wurde. 14d zeigt das Ergebnis, das bei einer 40-minütigen Inkubation mit dem Fang-Ak erhalten wurde. 14e zeigt das Ergebnis, das erhalten wurde, wenn die Zellen mit Fang-Ak in Gegenwart von Überstand inkubiert werden, der von lFNγ sekretierenden Zellen (IFNγ sup) erhalten wurde. 14f zeigt das Ergebnis, das bei einer 90-minütigen Inkubation mit Fang-Ak erhalten wurde.

Ausführungsformen der Erfindung

Die Erfindung nützt einen Mechanismus zum Einfangen der von Zellen sekretierten Produkte aus. Die Methode erlaubt das Einfangen der Produkte, die von eukaryontischen und prokaryontischen Zellen oder Zellverbänden sekretiert werden, an der Zelloberfläche. Das eingefangene Produkt ermöglicht das Detektieren, Analysieren und, sofern erwünscht, Sortieren der Zellen entsprechend dem Vorhandensein, der Abwesenheit oder der Menge des vorhandenen Produkts. Die Einfang-Methode umfasst eine Einfang-Komponente, die an der Zelloberfläche mit einem Mittel verankert wurde, das zum Sortieren der Zellen geeignet ist. Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "Zelle" oder "Zellen" Zellverbände; bei Zellverbänden handelt es sich um Gruppen von Zellen, die ein bestimmtes sekretiertes Produkt erzeugen und im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel die Langerhans-Inseln. Wie hierin verwendet, zählen zu Produkten, die identifiziert werden können, jegliche durch die Zellen sekretierten Produkte. Zu solchen Produkten zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Zytokine wie IFNγ, IL1, lL2, IL4, IL10, IL12, TGFβ, TNF, GMCSF und SCF, Antikörper, Hormone, Enzyme und Proteine.
Die Einfang-Komponente kann an das Anker-Glied (die "Anker-Komponente") wahlweise durch eine Linker-Komponente gekoppelt werden, und kann auch eine Linker-Komponente umfassen, die die Anzahl der verfügbaren Einfang-Komponenten und so das Potential zum Einfangen von Produkt vervielfacht, wie zum Beispiel verzweigte Polymere, einschließlich zum Beispiel modifizierter Dextran- Moleküle, Polyethylenglycol, Polypropylenglycol, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon.
Für Zellen ohne Zellwände, zum Beispiel Säuger- und andere animale Zellen oder Zell-Protoplasten, zählen zu geeigneten Anker-Komponenten an der Zelloberfläche lipophile Moleküle, wie etwa Fettsäuren. Zu Beispielen der geeigneten Zelloberflächen-Moleküle zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, jegliche mit der Zelloberfläche assoziierten Moleküle. Zu geeigneten Molekülen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Zelloberflächen-Marker wie CD45 (Pan-Leukozyt), Anti-β2- Mikroglobulin, CD3 (T-Zellen (aktivierend)), CD4, CD8 und weitere CD-Marker oder Zell-Adhäsionsmoleküle. Alternativ könnten auch Antikörper oder andere Agenzien, die spezifisch an Zelloberflächen-Moleküle binden, wie etwa die MHC-Antigene oder Glycöproteine, verwendet werden. Für Zellen mit Zellwänden, wie z. B. Pflanzenzellen, Pilze, Hefen oder Bakterien, zählen zu geeigneten Anker-Komponenten an Zellwand-Komponenten bindende Agenzien, einschließlich zum Beispiel Antikörpern oder Lectinen.
Zu spezifischen Bindungspartnern zählen Einfang-Komponenten und Marker- Komponenten. Die Einfang-Komponenten sind solche, die sowohl an die Zelle, direkt oder indirekt, als auch an das Produkt binden. Marker-Komponenten sind solche, die an das Produkt binden und direkt oder indirekt markiert werden können. Zu spezifischen Bindungspartnern zählen jegliche Komponenten, bei denen eine relative hohe Affinität und Spezifität zwischen dem Produkt und seinem Bindungspartner vorhanden, und die Dissoziation des Produkt: Partner-Komplexes relativ langsam ist, so dass der Produkt: Partner-Komplex während des Markier- oder Zelltrennvorgangs detektierbar ist.
Zu spezifischen Bindungspartnern können, ohne darauf beschränkt zu sein, Substrate oder Substrat-Analoga zählen, an die ein Produkt binden kann. Zu diesen Substraten zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Peptide, Polysaccharide, Steroide, Biotin, Digitoxin, Digitonin und andere Moleküle, die zur Bindung des sekretierten Produkts fähig sind, wobei dies bei einer bevorzugten Ausführungsform Antikörper umfasst. Ist die Einfang-Komponente ein Antikörper, so kann sie als der "Einfang-Antikörper" oder "Fang-Antikörper" bezeichnet werden. Wie hierin verwendet, soll der Begriff "Antikörper" polyklonale und monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper, Haptene und Antikörper-Fragmente, bispezifische Antikörper und Moleküle umfassen, die den Antikörpern darin gleichwertig sind, dass sie spezifisch an ein Epitop auf dem Produkt-Antigen binden.
Bispezifische Antikörper, auch bekannt als bifunktionelle Antikörper, weisen zumindest eine Antigen-Erkennungsstelle für ein erstes Antigen und mindestens eine Antigen-Erkennungsstelle für ein zweites Antigen auf. Solche Antikörper können mittels rekombinanter DNA-Methoden oder mittels im Fachgebiet bekannter chemischer Methoden hergestellt werden. Zu den chemisch erzeugten bispezifischen Antikörpern zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Antikörper, die reduziert und so umgeformt wurden, dass sie ihre bivalenten Eigenschaften beibehalten, als auch Antikörper, die chemisch so gekoppelt wurden, dass sie mindestens zwei Antigen-Erkennungsstellen für jedes Antigen besitzen. Zu bispezifischen Antikörpern zählen alle Antikörper oder Konjugate von Antikörpern oder polymere Formen der Antikörper, die zur Erkennung zweier unterschiedlicher Antigene fähig sind. Die Antikörper können an einem Polymer oder Partikel immobilisiert werden.
Bei der Ausführung der Erfindung kann die Einfang-Komponente an eine Zellmembran (oder Zellwand) mittels vielfältiger Methoden gebunden werden. Zu geeigneten Methoden zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die direkte chemische Kopplung an Aminogruppen der Protein-Komponenten; die Kopplung an Thiole (wie nach Reduktion der Disulfid-Brücken gebildet) der Protein-Komponenten; die indirekte Kopplung durch Antikörper (einschließlich Antikörper-Paaren) oder Lectine; die Verankerung in der Lipid-Doppelschicht mittels einer hydrophoben Anker- Komponente; und die Bindung an die negativ geladene Zelloberfläche durch Polykationen.
Bei anderen Ausführungsformen der Erfindung wird die Einfang-Komponente unter Anwendung zweier oder mehrerer Schritte eingeführt, zum Beispiel durch Markieren der Zellen mit mindestens einer Anker-Komponente, die die Kopplung der Einfang- Komponente an die Anker-Komponente entweder direkt, zum Beispiel durch einen Biotin/Avidin-Komplex, oder indirekt durch eine geeignete Linker-Komponente oder -Komponenten erlaubt.
Methoden zur direkten chemischen Kopplung von Antikörpern an die Zelloberfläche sind im Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel die Kopplung unter Verwendung von Glutaraldehyd- oder Maleimid-aktivierten Antikörpern. Die Methoden für die chemische Kopplung unter Anwendung mehrstufiger Verfahrensweisen umfassen zum Beispiel die Biotinylierung, die Kopplung von TNP oder Digoxigenin beispielsweise unter Verwendung von Succinimidestern dieser Verbindungen. Die Biotinylierung kann zum Beispiel unter Verwendung von D- Biotinyl-N-hydroxysuccinimid vorgenommen werden. Succinimid-Gruppen reagieren mit Aminogruppen bei pH-Werten von über 7, und vorzugsweise etwa pH 8,0 bis etwa pH 8,5, wirksam. Die Biotinylierung kann auch zum Beispiel durch Behandeln der Zellen mit Dithiothreitol (DTT), gefolgt von der Zugabe des Biotinmaleimids, erreicht werden.
Die Kopplung an die Zellen kann auch unter Verwendung von Antikörpern gegen Zeltoberflächen-Antigene ("Marker") erzielt werden. Die im allgemeinen gegen Oberflächen-Antigene gerichteten Antikörper können in einem Bereich von etwa 0,1 bis 1 ug Antikörper pro 10&sup7; Zellen erforderlich sein, doch variiert dieses Erfordernis als Reaktion auf die Affinität des Antikörpers für das Produkt breit und muss daher empirisch bestimmt werden. Eine derartige Bestimmung ist für einen Fachmann des Gebiets durchaus möglich. Dies erlaubt eine Kopplung an spezifische Zellen auf die Zelltyp-spezifische Marker-Expression hin. So können beispielsweise Zellklassen wie die T-Zellen oder Subsets davon spezifisch markiert werden. Als eine Einfang- Komponente kann ein bispezifischer Antikörper verwendet werden, der eine Antigen- Erkennungsstelle für die Zelle oder eine daran platzierte Anker-Komponente, und für das Produkt aufweist.
Eine Einfang-Komponente, insbesondere Einfang-Antikörper, sollten ausgehend von der Menge an sekretiertem Produkt ausgewählt werden. Zum Beispiel sollte für Zellen, die lediglich einige wenige Moleküle sekretieren, ein hochaffiner Antikörper gewählt werden, um den Großteil der sekretierten Moleküle einzufangen. Alternativ kann in dem Fall, in dem die Zelle während der Inkubationszeit viele Moleküle sekretiert, ein geringaffiner Antikörper bevorzugt sein, um eine zu frühe Sättigung der Einfang-Matrix zu vermeiden. Die Bestimmung der geeigneten Affinitäten für die Menge an sekretierten Proteinen wird empirisch vorgenommen, wozu ein Fachmann des Gebiets in der Lage ist.
Die Zellen, die große Mengen an N-Acetylneuraminsäure an ihrer Oberfläche als Bestandteil ihrer Lipopolysaccharide tragen, weisen bei physiologischen pH-Werten eine negative Ladung auf. Die Kopplung der Einfang-Komponenten kann über Ladungs-Wechselwirkungen erfolgen. Zum Beispiel binden Einfang-Komponenten, die Polykationen tragen, an negativ geladene Zellen. Polykationen sind im Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel Polylysin und Chitosan. Chitosan ist ein Polymer, bestehend aus D-Glucosamin-Gruppen, die durch β-(1-4)-Glucosid- Bindungen miteinander verknüpft sind.
Eine andere Methode der Kopplung von Einfang-Komponenten an die Zellen geht über die Kopplung von Polysacchariden an die Zelloberfläche vor. Substanzen, die an Polysaccharide binden, sind im Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel Lectine, einschließlich Concanavalin A, Solanum tuberosum, Aleuria aurantia, Datura stramonium, Galanthus nivalis, Helix pomatia, Lens culinaris und weitere bekannte Lectine, die von einer Reihe von Firmen vertrieben werden; einschließlich zum Beispiel von Sigma Chemical Company und Aldrich Chemical Company.
Bei einigen Ausführungsformen der Erfindung ist die Einfang-Komponente an die Zelle durch hydrophobe Anker-Komponenten an der Zellmembran gekoppelt.
Geeignete hydrophobe Anker-Komponenten, die mit der Lipid-Doppelschicht der Membran wechselwirken, sind im Fachgebiet bekannt und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Fettsäuren und nicht-ionische Detergenzien (einschließlich zum Beispiel Tween-80). Ein Nachteil der Bindung der Einfang-Komponente an die Zelle über die Einführung einer Anker-Komponente ist der, dass die Rate der Integration der Anker-Komponente in die Zelle gering ist. So sind häufig hohe Konzentrationen der Anker-Komponente erforderlich. Diese letztere Situation ist häufig unwirtschaftlich, wenn die Einfang-Komponente eine recht begrenzt vorliegende oder teure Substanz ist, wie z. B. ein Antikörper.
Die geringe Ausbeute an hydrophoben Anker-Komponenten, die sich selbst in die Membran einbetten, ist nur dann von Bedeutung, wenn diese Moleküle in relativ begrenzten Mengen verfügbar sind. Dieses Problem kann durch Verwenden eines Brückensystems überwunden werden, welches eine Anker-Komponente und eine Einfang-Komponente umfasst, wobei eine dieser Komponenten von höherer Verfügbarkeit ist, und wobei die beiden Teile des Brückensystems einen hohen Grad an Spezifität und Affinität füreinander aufweisen. Zum Beispiel ist bei einer Ausführungsform Avidin oder Streptavidin über eine hydrophobe Anker-Komponente an die Zelloberfläche gebunden, während die Einfang-Komponente in einem biotinylierten Anti-Produkt-Antikörper besteht. Bei einer anderen Ausführungsform ist die Zelloberfläche mit Digoxigenin markiert, gefolgt von bispezifischen Antikörpern mit Spezifität sowohl für Digoxigenin als auch das Produkt. Dieser Ansatz kann auch mit anderen Molekülpaaren, die zum Bilden einer Verknüpfung fähig sind, angewandt werden, einschließlich zum Beispiel von Hapten- mit Antihapten-Antikörpern, NTA- mit Polyhistidin-Resten oder Lectinen mit Polysacchariden. Eine bevorzugte Ausführungsform, ist eine solche, die eine "Amplifikation" des Systems durch Erhöhung der Zahl an Einfang-Komponenten pro Anker-Komponente erlaubt.
Bei einer anschaulichen Ausführungsform ist ein verzweigtes Dextran an Palmitinsäure gebunden und stellt so eine Vielzahl verfügbarer Bindungsstellen bereit. Das Dextran wiederum ist an Biotin gebunden und mit für das Produkt spezifischem Avidin-konjugiertem Antikörper behandelt.
Es wird natürlich als im Rahmen der Ausführungsformen der Erfindung befindlich erachtet, dass Linker-Komponenten zwischen der Anker-Komponente und der Einfang-Komponente verwendet werden können, wenn die Anker-Komponente in irgendeiner Weise an die Zelloberfläche gekoppelt ist. So kann zum Beispiel eine Avidin- (oder Streptavidin)-Biotin-Linker-Komponenfe eine Antikörper-Anker- Komponente mit einer Einfang-Komponente verknüpfen. Bispezifische Antikörper- Systeme können ebenfalls als Linker-Komponenten dienen.
Um Zellen zu analysieren und, sofern erwünscht, zu selektieren, die die Fähigkeit zum Sekretieren des interessierenden Produkts aufweisen, werden mit der Einfang- Komponente wie oben modifizierte Zellen unter Bedingungen inkubiert, die die Produktion und Sekretion des Produkts in ausreichender Menge ermöglichen, damit die Zellen binden und dadurch detektiert werden können, die das eingefangene Produkt enthalten. Diese Bedingungen sind den Fachleuten des Gebiets bekannt und umfassen unter anderem geeignete Temperaturen, pH-Werte und Salzkonzentrationen, Wachstumsfaktoren und Substrate im Inkubationsmedium, als auch die geeigneten Konzentrationen art Gas in der gasförmigen Phase. Ist eine Unterscheidung zwischen in hohem Maße und geringfügig produzierenden Zellen erwünscht, so ist die Inkubationsdauer so, dass die Produktsekretion durch die Zellen nach wie vor eine lineare Phase ist. Die geeigneten Bedingungen können empirisch bestimmt werden, welche Bestimmung zu den Fertigkeiten eines Fachmanns des Gebiets zählt. Außerdem kann die Sekretion durch die Zellen modifiziert werden, d. h. unter Verwendung eines biologischen Modifikators hochreguliert, induziert oder reduziert werden. Zu geeigneten biologischen Modifikatoren zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Moleküle und andere Zellen. Zu geeigneten Molekülen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Wirkstoffe, Zytokine, kleine Moleküle, Hormone, Kombinationen von Interleukinen, Lectinen und anderen stimulierenden Agenzien, zum Beispiel PMA, LPS, bispezifische Antikörper und weitere Agenzien, die die zellulären Funktionen oder die Proteinexpression modifizieren.
Zu weiteren Zellen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, direkte Zell/Zell- Wechselwirkungen, wie etwa zwischen einer Tumorzelle und einer T-Zelle, und indirekte Zell/Zell-Wechselwirkungen, wie etwa solche, die durch die Nähe weiterer Zellen, die einen biologischen Modifikator sekretieren, induziert werden. Zu geeigneten Zellen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Blutzellen, periphere Knochenmarkzellen (PBMC) und verschiedene Zelllinien. Die biologischen Modifikatoren können zu jedem Zeitpunkt zugegeben werden, doch werden vorzugsweise dem Inkubationsmedium zugegeben. Alternativ können die Zellen vor dem Inkubationsschritt mit diesen Agenzien oder Zellen vorbehandelt werden.
Die Inkubationsbedingungen sind ebenfalls so, dass das von einer Erzeugerzelle sekretierte Produkt im wesentlichen nicht durch eine andere Zelle eingefangen wird, so dass nicht-produzierende Zellen von Produkt-produzierenden Zellen bzw. hochgradig produzierende Zellen von geringfügig produzierenden Zellen unterscheidbar sind. Allgemein beträgt die Inkubationszeit 5 Minuten bis zehn Stunden, und gewöhnlicher 1 bis 5 Stunden. Das Inkubationsmedium kann wahlweise eine Substanz umfassen, die die Diffusion des sekretierten Produkts aus der Erzeugerzelle verlangsamt. Substanzen, die die Produktdiffusion in Flüssigmedien hemmen und für die Zellen ungiftig sind, sind im Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel eine Vielzahl von Substanzen, die teilweise oder vollständig gelieren, einschließlich etwa von Alginat, Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und Gelatine. Durch Variieren der Viskosität oder Permeabilität des Mediunns lässt sich der lokale Einfang durch eine Zelle, die sekretierte Produkte bestimmter Größen produziert, modulieren. Der Molekulargewichts- Größenausschluss des Mediums kann zur Optimierung der Reaktion eingestellt werdern. Die optimale Zusammensetzung des Mediums lässt sich empirisch bestimmen und wird durch die Zellkonzentration, den Sekretionsgrad und das Molekulargewicht des Produkts ebenso wie die Affinität der Einfang-Antikörper für das Produkt beeinflusst. Diese Bestimmung liegt im Bereich der Fertigkeiten eines Fachmanns des Gebiets.
Vorzugsweise werden die Gele nach der Inkubation angelöst, um die Isolierung der Zellen oder Zellgruppen aus dem Medium mittels Zellsortier-Techniken zu ermöglichen. So können die Gele beispielsweise durch Disulfidbindungen verknüpft werden, die durch Sulfhydryl-reduzierende Mittel wie β-Mercaptoethanol oder DTT dissoziiert werden können, oder können die Gele ionische Vernetzungsmittel enthalten, einschließlich zum Beispiel Calciumionen, die durch Zugabe eines Gelbildners wie EDTA angelöst werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen während der Sekretionsphase in einem gelatineartigen Medium inkubiert, wobei vorzugsweise die Größenbegrenzung bezüglich des Eindringens in das Gel das Produkt beträchtlich daran hindern, in das Gel zu gelangen.
Eine alternative oder zusätzliche Option zur Verwendung eines viskösen oder gelatineartigen Mediums, um eine unspezifische Zell-Kreuzkontamination zu vermeiden, besteht in der Bereitstellung eines Einfangsystems zum Einfangen von Produkten, die nicht durch das Zelloberflächen-Einfangsystem auf den sekretierenden Zellen eingefangen wurden. Diese Technik kann zum Beispiel in dem Fall angewandt werden, bei dem viele Zelltypen ein Produkt erzeugen oder tote Zellen unspezifisch große Mengen an unerwünschten Produkten freisetzen oder dann, wenn keine ausreichende Diffusionsbarriere zwischen den Zellen geschaffen werden kann. Dies kann durch Hinzufügung zum Medium erfolgen, das die Zellkügelchen (zum Beispiel Latexkügelchen) in Konjugation an ein Antikörper-Produkt aus dem Überstand umgibt. Alternativ könnten Gele mit immobilisierten Antikörpern oder anderen Komponenten, die zur Entfernung von ungebundenem Produkt aus dem Medium in der Lage sind, verwendet werden. Diese Einfang-Komponenten können solche unerwünschten Produkte zurückzuhalten oder sie am Binden an die nicht- sekretierenden Zellen durch Binden an die nicht-zurückgehaltenen Produkte hindern. Dieses "Junk-Einfangsystem" kann aus immobilisierten Antikörpern in der Gelmatrix bestehen oder kann an magnetische oder andere Partikelarten gebunden sein. Die Lokalisations- und Fang-Eigenschaften des Junk-Einfangsystems sollten so eingestellt werden, dass ausreichende Zahlen der Produkt-Moleküle spezifisch an die sekretierenden Zellen gebunden werden und so den Hintergrund an nicht- produzierenden Zellen minimieren.
Am Ende der Sekretionsphase werden die Zellen gewöhnlich gekühlt, um eine weitere Sekretion zu verhindern, und wird die Gelmatrix (sofern vorhanden) angelöst. Diese Reihenfolge kann natürlich auch umgekehrt werden. Die Zellen, die das eingefangene Produkt enthalten, werden dann mit einer Marker-Komponente markiert. Die Markierung kann mittels jeglicher den Fachleuten des Gebiets bekannten Methode vorgenommen werden. Zum Beispiel können Anti-Produkt- Antikörper zur direkten oder indirekten Markierung der das Produkt enthaltenden Zellen verwendet werden. Bei den verwendeten Markern handelt es sich um jene, die sich zur Verwendung in Systemen eignen, bei denen Zellen analysiert oder ausgehend von der Bindung der Markier-Komponente an das Produkt sortiert werden sollen.
Bei anderen Ausführungsformen können Einfang-Komponenten, die kein eingefangenes Produkt enthalten, nachgewiesen werden. Dies ermöglicht zum Beispiel die Isolation von Zellen, die hohe Mengen an Produkt sekretieren, unter Anwendung einer negativen Trennmethode, d. h. dem Nachweis von Zellen, die nicht hochgradig mit Produkt gesättigt sind. Die Zellen können mit anderen Substanzen markiert werden, um folgendes zu erkennen, ohne darauf beschränkt zu sein: Zelloberflächen-Marker, Zelltyp, zelluläre Parameter wie den DNA-Gehalt, Zellstatus oder Anzahl der eingefangenen Komponenten.
Die Zählung der tatsächlichen Einfang-Komponenten kann wichtig sein, um variierende Mengen dieser Moleküle zum Beispiel aufgrund unterschiedlicher Konjugations-Potentiale der Zellen auszugleichen. Sie kann besonders wichtig für die Isolation seltener Zellen sein, um Zellen mit verminderter oder erhöhter Bindungsfähigkeit für das Produkt-Einfangsystem, einschließlich der Anker- und Einfand-Komponenten, auszuschließen.
Die Analyse der Zellpopulation und die Zellsortierung ausgehend vom Vorhandensein der Markierung kann mittels einer Anzahl von im Fachgebiet bekannten Techniken erreicht werden. Die Zellen können zum Beispiel durch Flusszytometrie oder FACS analysiert oder sortiert werden. Diese Techniken erlauben die Analyse oder Sortierung entsprechend eines oder mehrerer Parameter der Zellen. Gewöhnlich können einer oder vielfache Sekretions-Parameter gleichzeitig in Kombination mit anderen messbaren Parametern der Zelle analysiert werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf den Zelltyp, die Zelloberflächen-Antigene, den DNA-Gehalt etc. Die Daten können dann analysiert und die Zellen unter Anwendung jeglicher Formel oder Kombination der gemessenen Parameter sortiert werden. Die Methoden der Zellsortierung und Zellanalyse sind im Fachgebiet bekannt und beschrieben zum Beispiel in THE HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Bände 1 bis 4 (D. N. Weir, Herausgeber) und FLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING (A. Radbruch, Herausgeber, Springer Verlag, 1992). Die Zellen können auch unter Anwendung mikroskopischer Techniken analysiert werden, einschließlich zum Beispiel der Laser-Mikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie; Techniken wie diese können auch in Kombination mit Bildanalysesystemen angewendet werden. Zu weiteren Methoden der Zellsortierung zählen zum Beispiel das Panning und die Trennung unter Anwendung von Affinitäts-Techniken, einschließlich von Techniken unter Verwendung fester Träger wie Platten, Kügelchen oder Säulen.
Einige Methoden der Zellsortierung wenden magnetische Trennungen an, wobei bei wiederum einigen dieser Methoden von magnetischen Kügelchen Gebrauch gemacht wird. Verschiedene magnetische Kügelchen sind von einer Reihe von Quellen beziehbar, einschließlich zum Beispiel Dynal (Norwegen), Advanced Magnetics (Cambridge, MA, USA), Immuncon (Philadelphia, USA), Immunotec (Marseille, Frankreich) und Miltenyi Biotec GmbH (Deutschland).
Zu bevorzugten magnetischen Markierungsmethoden zählen solche mit kolloidalen superparamagnetischen Partikeln im Größenbereich von 5 bis 200 nm, bevorzugt in einer Größe von 10 bis 100 nm. Diese magnetischen Partikel erlauben eine quantitative magnetische Markierung der Zellen, wodurch die Menge an gekoppeltem magnetischem Marker proportional zur Menge an gebundenem Produkt ist und wobei die magnetischen Trennmethoden gegenüber unterschiedlichen Mengen der Produktsekretion empfindlich sind. Kolloidale Partikel mit verschiedenen Spezifitäten sind im Fachgebiet bekannt und sind zum Beispiel beziehbar durch Miltenyi Biotech GmbH. Auch immunspezifisch fluoreszierende oder magnetische Liposome können zur quantitativen Markierung von eingefangenem Produkt verwendet werden. In diesen Fällen enthalten die Liposomen magnetisches Material und/oder Fluoreszenzfarbstoffe in Konjugation mit Antikörpern an ihren Oberflächen, wobei die magnetische Trennung angewandt wird, um eine optimale Trennung zwischen nicht- produzierenden, gering produzierenden und hoch produzierenden Zellen zu erzielen.
Die magnetische Trennung kann bei hoher Leistung durch Kombinieren einer zweiten Kraft zur anziehenden magnetischen Kraft und Bewirken einer Trennung auf der Grundlage der unterschiedlichen Stärken der beiden entgegengesetzten Kräfte erreicht werden. Typische entgegengesetzte Kräfte sind zum Beispiel Kräfte, die durch magnetische Flüssigkeiten induziert werden, die im Trennmedium in der magnetischen Trennkammer vermischt werden, Schwerkraft und visköse Kräfte, die durch die Fließgeschwindigkeit des Mediums relativ zur Zelle induziert werden. Jegliche magnetische Trennmethode, vorzugsweise solche magnetischen Trennmethoden, die eine quantitative Trennung ermöglichen, können angewandt werden. Es wird auch in Erwägung gezogen, verschiedene Trennmethoden miteinander zu kombinieren, zum Beispiel die magnetische Zellsortierung mit FACS, um die Trennqualität zu erhöhen oder die Sortierung anhand multipler Parameter zu ermöglichen.
Zu bevorzugten Techniken zählen eine magnetische Starkfeldscheidung (HGMS), ein Verfahren zur selektiven Rückhaltung magnetischer Materialien in einer Kammer oder Säule, die in ein magnetisches Feld eingebracht ist. Bei einer Anwendungsform dieser Technik wird das Produkt durch Binden an magnetische Partikel markiert. Die Bindung erfolgt allgemein durch Assoziierung des Produkt mit einer Marker- Komponente, die an eine Beschichtung auf dem magnetischen Partikel konjugiert wird, welcher eine funktionelle Gruppe für die Konjugation stellt. Das mit der Zelle assoziierte und an einen magnetischen Marker gekoppelte Produkt wird in einer Flüssigkeit suspendiert, die dann in die Kammer eingebracht wird. In Gegenwart eines magnetischen Gradienten, der quer durch die Kammer angelegt ist, werden die magnetisch markierten Zellen in der Kammer zurückgehalten; enthält die Kammer eine Matrix, so binden sie an die Matrix. Zellen, die keinen oder lediglich eine geringe Menge an magnetischen Markern aufweisen, wandern durch die Kammer hindurch.
Die rückgehaltenen Zellen können dann durch Verändern der Stärke oder durch Ausschalten des magnetischen Feldes oder durch Einführen einer magnetischen Flüssigkeit eluiert werden. Die Selektivität für ein eingefangenes Produkt wird durch die Marker-Komponente gestellt, die entweder direkt oder indirekt an den magnetischen Partikel konjugiert ist, oder indem ein primärer Antikörper und ein magnetischer Partikel verwendet werden, der den primären Antikörper erkennt. Die Kammer, durch die das magnetische Feld angelegt ist, ist oftmals mit einer Matrix aus einem Material von geeigneter magnetischer Suszeptibilität zum lokalen Induzieren eines hohen magnetischen Feld-Gradienten in der Kammer in Bereichen nahe der Matrixoberfläche versehen. Dies erlaubt die Rückhaltung eher schwach magnetisierter Partikel. Veröffentlichungen, die eine Vielzahl von HGMS-Systemen beschreiben, sind im Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel US- Patentschrift Nr. 4.452.773, US-Patentschrift Nr. 4.230.685, PCT-Anmeldung WO 85104330, US-Patentschrift Nr. 4.770.183 und PCT/EP89/01602; die Systeme sind ebenfalls beschrieben in US-Patentschrift der laufenden Nummer 07/291,177 und in US-Patentschrift der laufenden Nummer 07/291,176, die gemeinsames Eigentum und hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen sind.
Wie aus obigem zu erkennen, umfassen die durch die Erfindung ausgeführten Prozesse die folgenden Schritte:
a. Koppeln einer Anker-Komponente an die Oberfläche von Zellen, die vermutlich ein Produkt sekretieren;
b. Koppeln an die Anker-Komponente eine Einfang-Komponente, die das sekretierte Produkt einfängt;
c. Inkubieren der Zellen mit der gekoppelten Einfang-Komponente, um die Synthese und Sekretion des Produkts unter Bedingungen zu ermöglichen, bei denen das Produkt an die Einfang-Komponente bindet; und
d. Markieren des eingefangenen Produkts mit einer Marker-Komponente.
Bei anderen Ausführungsformen umfassen die Verfahren außerdem das Markieren der Zellen, die das eingefangene Produkt enthalten, sofern vorhanden. Weitere Ausführungsformen können auch das Analysieren der Zellpopulation zum Nachweis der markierten Zellen, sofern vorhanden, und, wenn gewünscht, das Sortieren der markierten Zellen, sofern vorhanden, umfassen.
Die Verfahren der Erfindung können zum Analysieren und/oder Trennen einer Vielzahl von Zelltypen angewandt werden. Zum Beispiel können sie zum Detektieren und Selektieren von Hybridom-Zelllinien verwendet werden, die hohe Mengen an Antikörpern sekretieren.
Ein Beispiel eines Verfahrens für die Selektion dieser Art von Hybridomzelle ist das folgende: Die Zellen werden so modifiziert, dass sie eine Digoxigenin-Anker- Komponente enthalten, indem Digoxigenin an die Zelle über eine lipophile Anker- Komponente oder durch chemische Kopplung gebunden wird. Eine Einfang- Komponente wird an die Zellen über einen monoklonalen Ratten-Anti-Kappa- oder Ratten-Anti-Lambda-Antikörper in Konjugation an Anti-Digoxigenin-Antikörper oder -Antikörper-Fragmente geknüpft. Die Zellen mit der angeknüpften Einfang- Komponente werden inkubiert, um die Sekretion der monoklonalen Antikörper zu ermöglichen. Die Zellen, die die sekretierten Produkt-Antikörper einfangen, werden mit der Marker-Komponente durch Inkubation mit monoklonalem Ratten-Anti-MauslgG1- oder -lgG2a+b-Antikörper markiert. Ein Anti-Klasse-Antikörper, der die Oberflächen-gebundene Form des Produkts nicht erkennt, ist vorteilhaft, wenn das Expressionsprodukt natürlicherweise mit der Zelloberfläche verbunden ist.
Die Selektion der hochgradig sekretierenden Zellen wird in mehrfachen Gängen vollzogen. Jeder Trennvorgang bezieht die Anwendung eines Zelltrennvorgangs ein, d. h. ein quantitatives magnetisches Trennsystem, das unterschiedliche Mengen an gebundenem Produkt unterscheiden kann, oder eine FACS. Die Zellen mit der höchsten Markierung (eventuell auf einer Zell-zu-Zell-Basis unter Anlegen weiterer Parameter normalisiert) werden sortiert und wieder in Kultur expandiert. Die magnetische und die FACS-Trennung können kombiniert werden.
Die FACS-Sortierung wird vorzugsweise durchgeführt, indem die Zellen zusätzlich mit einer Menge an Einfang-Komponente unter Verwendung eines unterschiedlichen Fluorochroms als dem markiert werden, mit dem die Zellen ursprünglich markiert wurden, und dann jene Zellen mit einem hohen Verhältnis von Produktmenge zu Antikörpermenge selektiert werden. Mehrfache Trenngänge unter Verwendung hoher Zellzahlen von 10&sup7; bis 10¹&sup0; Zellen ermöglichen die Isolation seltener genetischer Varianten, die außergewöhnlich hohe Produktionsmengen und genetische Stabilität zeigen. Um die Selektion von Zellen zu vermeiden, die abweichende Produktformen erzeugen, können unterschiedliche Marker-Komponenten während der verschiedenen Trenngänge verwendet werden.
Bei einem ähnlichen Ansatz können auch Hybridome von definierter Spezifität detektiert und selektiert werden. Durch Anwenden eines Selektionsverfahrens an großen Zellzahlen können seltene genetische Varianten mit hoher Affinität oder Spezifität erhalten werden. Klasse-wechselnde Varianten können unter Verwendung unterschiedlicher Anti-Klasse-Antikörper isoliert werden. Allgemein kann dieser Ansatz lfür die Isolierung nahezu jeder Art von Variante der Antikörper mit der gewünschten Spezifität angewendet werden.
Die Identifizierung und Isolierung von Genen, die für eine spezifische Substanz codieren, und die Isolierung von Zellen, die ein spezifisches Protein, einschließlich spezifischer Fusionsproteine, Zytokine, Wachstumshormone, virale Proteine, bakterielle Proteine etc. erzeugen, können ebenfalls unter Anwendung der Verfahren der Erfindung vorgenommen werden. Ist zum Beispiel eine Selektion auf eine Zelle erwünscht, die ein spezifisches Protein produziert, so können die Zellen durch Einführung eines Expressionsvektors genetisch modifiziert werden, der das Protein von Interesse in einer sekretierten Form codiert. Die Zellen werden durch Einführung eines Produkt-Einfangsystems modifiziert, einschließlich einer für das Produkt spezifischen Anker-Komponente und einer Einfang-Komponente, woraufhin die Zellen unter Bedingungen gezüchtet werden, die die Produktsekretion ermöglichen. Die Zellen, die das eingefangene Produkt enthalten, werden markiert und ein oder mehreren Trenngängen auf der Grundlage des Vorhandenseins des Markers unterzogen.
Diese Trennung von Zellen, die ein künstlich eingeschleustes Gen exprimieren, was zu einem sekretierten Produkt führt, ist bei Methoden der Gentherapie besonders nützlich, bei denen Patienten Zellen aus dem Körper entfernt und mit dem Gen transformiert werden, was zur Sekretion eines bestimmten Produkts (zum Beispiel eines Zytokins) führt. Die transformierten Zellen werden dann von nicht-transformierten Zellen isoliert, bevor sie dem Patienten zurückgegeben werden. Die derzeit angewandte Methode ist mühsam und zeitaufwendig. Die Zellen werden nicht nur mit dem Gen transformiert, das das Protein von Interesse exprimiert, sondern auch mit einem Gen, das ein Marker-Protein exprimiert. Bei den derzeitigen Methoden wird β- Galactosidase als das Marker-Protein verwendet, weshalb die Zellen in Gegenwart von X-gal gezüchtet und jene Zellen, die blau werden, von Hand ausgelesen und dem Patienten zurückgegeben werden müssen. Dies ist nicht nur arbeitsaufwendig, sondern führt auch zu ernstlichen Zeitverzögerungen vor einer Behandlung der oftmals schwer erkrankten Patienten. Bei der hierin beschriebenen Methode können die transformierten Zellen bald nach der Transformation getrennt und dem Patienten sofort zurückgegeben werden. Die Trennung kann auch auf der Sekretion des interessierenden Proteins und nicht eines Marker-Proteins basieren, um sicherzugehen, dass die Zellen transformiert sind und das interessierende Protein exprimieren.
Das Verfahren der Erfindung kann auch zur gleichzeitigen qualitativen und quantitativen Analyse von Sekretionsmustern in komplexen Zellgemischen angewandt werden, zum Beispiel Gemischen, die weiße Blutkörperchen, Knochenmarkzellen; suspendierte Tumorzellen oder Gewebezellen enthalten. In diesem Fall würden die Zellen im Gemisch mit Zell-spezifischen Markern markiert und außerdem mit Einfang-Komponenten für die zu detektierenden Produkte markiert werden. Die Zellen könnten auch mit bispezifischen Antikörpern markiert werden, die mindestens eine Antigen-Erkennungsstelle für den spezifischen Zellmarker und mindestens eine Antigen-Erkennungssteile für die zu detektierenden Produkte enthalten.
Nach der Sekretionsphase würden die Zellen einer Multiparameter-Analyse unterzogen werden, wie bei der Flusszytometrie und/oder Bildanalyse angewandt, und die Ergebnisse mit im Fachgebiet bekannten mehrdimensionalen statistischen Methoden analysiert und in der Analyse der Flusszytometrie- und Bildanalyse-Daten verwendet werden. Sollen bei der Analyse Zellen bestimmt werden, die mit einem biologischen Modifikator spezifisch reaktiv sind, so können die zu analysierenden Zellen diesen biologischen Modifikatoren vor und/oder während der Inkubationsperiode vor der Analyse durch Flusszytometrie oder Bildanalyse ausgesetzt werden. Methoden wie diese sind von potentiellem Nutzen für verschiedene diagnostische Anwendungen in der Medizin, zum Beispiel zum Messen der Mengen und Arten der Interleukin-Produkte in verschiedenen Zellpopulationen und zum Messen der Freisetzung von Wachstumsfaktor in Tumorzellpopulationen.
Es wird erwogen, die Reagenzien, die zum Nachweis von Sekretorzellen der gewünschten Produkte verwendet werden, zur bequemeren Anwendung in Form von Analysesätzen abzupacken. Die Analysesätze würden zum Beispiel wahlweise ein oder mehrere Substanzen zur Verwendung beim Herstellen eines gelatineartigen Zellkulturmediums enthalten, welches Medium für die Zellinkubation zur Erzeugung des gewünschen sekretierten Produkts dienen soll; ein Produkt-Einfangsystem, das sich aus Anker- und Einfang-Komponenten zusammensetzt; eine Marker- Komponente; und Gebrauchsanleitungen für die Reagenzien. Alle Reagenzien würden in geeigneten Behältern abgepackt werden.
Der Analysesatz kann auch so zusammengestellt werden, dass er das folgende enthält. In diesem Fall werden alle Reagenzien vorzugsweise in eine einzelne Phiole eingebracht, der die Zellenzugegeben werden. Mindestens ein Antikörper, der für eine bestimmte Zelloberflächenstruktur oder Anker-Komponente und das Produkt bispezifisch ist. Mindestens eine Marker-Komponente und wahlweise biologische Modifikatoren.
Die Marker-Komponente kann ein fluorchromatisierter Anti-Produkt-Antikörper sein, der enthalten kann, ohne darauf beschränkt zu sein: konjugierte magnetische Kügelchen, konjugierte kolloidale Kügelchen, FITC, Phycoerythrin, PerCP, AMCA, Fluoreszenzpartikel oder Liposom-konjugierte Antikörper. Alternativ kann die Marker- Komponente jeglicher geeignete Marker sein, einschließlich, doch nicht beschränkt auf die oben beschriebenen.
Wahlweise kann der Analysesatz einen physiologisch geeigneten Puffer umfassen. Zu solchen Puffern, die im Fachgebiet bekannt sind, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, PBS mit und ohne BSA, isotonische Kochsalzlösung, Zellkulturmedien und jegliches spezielle Medium, das für den jeweiligen Zelltyp erforderlich ist. Es können Puffer verwendet werden, die eine Kreuzmarkierung vermindern und die lokale Produktkonzentration um die Zellen erhöhen. Die Puffer können Agenzien zur Erhöhung der Viskosität oder Verminderung der Permeabilität enthalten. Geeignete Agenzien sind hierin beschrieben. Die Viskosität des Mediums kann vor der Analyse mittels einer beliebigen, im Fachgebiet bekannten Methode herabgesetzt werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, das Lösen in einem physiologisch geeigneten Puffer, Wärmelösen, EDTA und Enzyme. In Abwesenheit des zugesetzten Mediums können bereits in einem Medium suspendierte Zellen der Phiole direkt zugegeben werden. Zu geeigneten Zellsuspensionen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Zelllinien und biologische Proben. Zu biologischen Proben zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Blut, Urin und Plasma.
Zusätzliche Strukturen können zum Einfangen von ungebundenem Produkt zugesetzt werden, um eine Zell-Kreuzkontamination zu vermindern und dadurch die Diffusion von Produkten von den Erzeugerzellen weg zu vermindern. Zu diesen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Anti-Produkt-Antikörper, der an Gelelementen, Kügelchen, magnetischen Kügelchen, Polymeren immobilisiert ist.
Auch biologische Modifikatoren können dem Puffer oder Medium zur Induzierung einer spezifischen Sekretion zugesetzt werden. Weitere Marker-Komponenten wie Antikörper (magnetisch oder fluoroeszierend markiert) sind ebenfalls vorhanden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Anti-Zelloberflächen-Antikörper zum Identifizieren von Zelltypen, Propidiumiodid zum Markieren abgestorbener Zellen und magnetische Kügelchen zum Markieren bestimmter Zelltypen.
Bei dieser Ausführungsform können alle Materialien in einen einzigen Behälter, wie etwa ein Phiole, eingebracht und die Zellprobe zugesetzt werden. Die Inhaltsstoffe werden inkubiert, um das Sekretieren eines Produkts und das anschließende Einfangen des Produkts und Binden der Marker-Komponente an das Produkt zu ermöglichen. Die Zellen, die Produkt sekretiert und gebunden haben, können dann ausgehend von dem Vorhandensein, der Abwesenheit oder der Menge des eingefangenen Produkts abgetrennt und/oder analysiert werden. Die Trennung kann mittels jeder im Fachgebiet bekannten Methode vorgenommen werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf einfache Verdünnung, Erythrozyten-Lyse, Zentrifugations-Waschschritt, magnetische Trennung, FACS und Ficoll-Trennung. Die Analyse der Zellen kann mittels vielfältiger Methoden vorgenommen werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf FACS, Bildanalyse, zytologische Markierung und Immunoassay.
Wie nachstehend in den Beispielen gezeigt, können Zellen, die die bestimmten Produkte sekretieren, innerhalb von Minuten einer Inkubation in Gegenwart der spezifischen Bindungspartner identifiziert und sortiert werden. Demnach sind die beschriebenen Analysesätze zur Verwendung bei diagnostischen Anwendungen geeignet. Zu geeigneten diagnostischen Anwendungen zählen beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, Immundysregulationen, genetische Defekte und die Krebs-Klassifikation.
Die nachstehend beschriebenen Beispiele dienen lediglich veranschaulichenden Zwecken und nicht einer Einschränkung des Rahmens der vorliegenden Erfindung. Im Lichte der vorliegenden Beschreibung werden für Fachleute des Gebiets bei üblicher Sachkenntnis zahlreiche Ausführungsformen innerhalb des Rahmens der Ansprüche erkennbar sein.

Beispiele

Beispiel 1

Der Zweck dieses Beispiels besteht in der Trennung lebender Zellen, die ein gegebenes Produkt sekretieren, aus einem Gemisch von äußerlich identischen Zellen. Die B.1.8-Hybridom-Zelllinie und X63. Ag 8 6.5.3.-Myelom-Zellinie wurden als Testsystem verwendet. Etwa 60% der B.1.8.-Zellen sekretieren IgM; die Myelomlinie sekretiert kein Protein. Die sekretierenden Zellen sollten von B.1.8. und aus Gemischen von B.1.8.- mit Ag 8 6.5.3-Zellen getrennt werden. Um dies zu erreichen, würde ein Verfahren entwickelt, um ein durch die Zellen sekretiertes Produkt an der Zelloberfläche einzufangen, das Produkt an der Zelloberfläche zu halten und so die fraglichen Zellen zu markieren. Die Fang-Antikörper wurden in zwei Schritten angeheftet: 1.) Biotinylierung der Zellen; und 2.) Bindung des Einfang-Antikörpers durch eine Avidin-Biotin-Kopplungsreaktion. Die markierten Zellen wurden dann aus dem Zellgemisch getrennt.
Biotinylierung der Zelloberfläche mit Biotinylpalmitoyldextran Das Ziel bestand in der Synthese einer Anker-Komponente, bei welcher es sich um ein großes Makromolekül mit Biotingruppen und Fettsäuregruppen handelt, das sich selbst in die Zellmembran einbetten sollte.

Synthese eines hydrophoben Biotins

Ein Dextran mit einem Molekulargewicht von 3 · 10&sup6; g/Mol wurde als Trägermolekül verwendet. Um sowohl die Biotingruppen als auch die Fettsäuregruppe an das Polysaccharid koppeln zu können, wurden zunächst reaktive primäre Aminogruppen in das Dextran eingeführt.
Biotinylgruppen und eine Palmitoylgruppe sollten dann in die Aminogruppen der Proteine mittels in gewisser Weise modifizierten Methoden zugeführt werden, wie sie zur Kopplung von Biotin und fettsäureestern verwendet werden. In Fig. 1 ist das Schema zur Einführung der Biotinyl- und Palmitoylgruppen in Dextran gezeigt.

Synthese eines Aminodextrans

Aminogruppen wurden in Dextran-Moleküle durch Aktivierung mit Carbodiimidazol und Reaktion mit Diaminohexan unter Anwendung standardmäßiger Methoden eingeführt. Das Aminodextran wurde bezogen von Sigma Corp. und von Molecular Probes (Oregon). Ein Aminodextran mit 165 ± 20 Aminogruppen pro Molekül von 3 · 10&sup6; g/Mol wurde erhalten. Die Polymerisation des Dextrans findet als Nebenreaktion statt. Die Ausbeute an unpolymerisiertem Produkt belief sich auf 94% des Ausgangs-Dextrans.
Eine von Dubois beschriebene Methode wurde zur Bestimmung der Dextran- Konzentrationen angewandt. 5 ul einer 80% Lösung von Phenol in Wasser wurde in ein Reagenzröhrchen mit 100 ul der zu bestimmenden Dextranlösung eingebracht. 1 ml konzentrierte Schwefelsäure wurde schnell in dieses Gemisch pipettiert. Nach 10 Minuten wurde die Formulierung in ein Wasserbad bei 30ºC für weitere 10 Minuten eingebracht. Die Dextran-Konzentration wurde durch Messen der Extinktion bei 480 nm festgestellt.

Synthese von Biotinylaminodextran

Die Einführung der Biotinylgruppe in das Dextran wurde unter Verwendung von D-Biotinyl-N-hydroxysuccinimid als dem Biotinylierungs-Reagens vorgenommen. Succinimidgruppen reagieren wirksam mit Aminogruppen bei pH-Werten über 7. In Fig. 2 ist ein Schema für die Reaktion von N-Hydroxysuccinimidestern mit primären Aminogruppen in basischer Form gezeigt. Die entsprechenden N-Hydroxysuccinimid- (NHS)-Ester wurden zur Einführung sowohl der Biotinylgruppen als auch der Palmitoylgruppen in das Dextran verwendet. In dieser Figur steht R' für Dextran und R entweder für eine Biotinylgruppe oder eine Palmitoylgruppe.

Synthese von Biotinylpalmitoyldextran

Palmitinsäuregruppen wurden an biotinyliertes Dextran gekoppelt. Die Reaktion wurde mittels eines geringfügig modifizierten Verfahrens zum Koppeln der Palmitoylgruppen an Antikörper vorgenommen (Huang et al., J. Biol. Chem. 255: 8015-8018 (1980)). Die Kopplung erfolgt ähnlich der vorangegangenen Biotinylierung durch nukleophilen Angriff der Aminogruppen des Dextrans des NHS-Esters der Palmitinsäure.

Biotinlierung der Zellen mit Biotinylpalmitoyldextran

Die Fähigkeit des Lipopolysaccharids, Biotinylpalmitoyldextran, an Zellen zu binden und dadurch die Zelloberfläche zu biotinylieren, wurde an Human-Lymphozyten getestet und mit der Bindung von Biotinylaminodextranen verglichen, denen die Palmitoylgruppen fehlten.
Die Zellen wurden bei 20ºC herauszentrifugiert und 10 Minuten lang bei 37ºC mit 1 mg/ml entweder von Biotinyldextran oder Biotinylpalmitoyldextran in PBS inkubiert (100 ul für 10&sup7; Zellen). 1 ml PBS plus 1% BSA (PBS/BSA) wurden dann zugesetzt und nach 3 Minuten die Zellen auf Eis in 14 ml PBS gewaschen. Die behandelten Zellen wurden in PBS plus 0,03% Natriumazid aufgenommen (PBS/NaN&sub3;).
Die Biotinylierung der Zellen durch Biotinyldextran oder Biotinylpalmitoyldextran wurde durch Markieren der Zellen mit Streptavidin-FITC (ST-FITC) überwacht. Spezifischer gesagt wurden die behandelten Zellen gewaschen und in 100 ul PBS/10&sup7; Zellen aufgenommen. 1 ul an 100 ug/ml ST-FITC in PBS wurde zugegeben und die Gemische 5 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen, in 1 ml PBS/BSA pro 10&sup7; Zellen aufgenommen und die Fluoreszenzintensität im FACScan als ein Maß der Biotinylierung gemessen.
Die Ergebnisse der FACScans der Bindung von Streptavidin an mit Biotinyldextran und Biotinylpalmitoyldextran behandelte Zellen sind in Fig. 3a bzw. 3b gezeigt. Wie aus den Ergebnissen zu erkennen, banden die mit Biotinyldextran inkubierten Zellen nicht an ST-FITC. Im Gegensatz dazu banden die mit Biotinylpalmitoyldextran · inkubierten Zellen an große Mengen des ST-FITC.
Ein Vergleich wurde angestellt zwischen der Menge an ST-FITC, die durch Zellen gebunden waren, markiert mit Biotinyl-Antikörpern, die gegen β&sub2;-Mikroglobulin (B&sub2;m) gerichtet waren, und den mit Biotinylpalmitoyldextran markierten Zellen. Der verwendete Antikörper war αβ&sub2;m, ein Antikörper, der an β&sub2;m bindet. In Fig. 4 sind die Aufzeichnungen der FACScan-Ergebnisse gezeigt: a) unbiotinylierte Zellen, behandelt mit ST-FITC (negative Kontrolle); b) Zellen, die mit Biotinylpalmitoyldextran und dann mit ST-FITC behandelt waren; c) Zellen, die mit Biotinyl-αβ&sub2;m inkubiertl und mit ST-FITC behandelt waren. Die Ergebnisse in Fig. 4 zeigen, dass die mit Biotinylpalmitoyldextran markierten Zellen zur Bindung von mehr Streptavidin an die Zelloberfläche als ein αβ&sub2;m-Biotin-Konjugat in der Lage waren.
Während die Antikörper-Markierung der Zelle eine Sättigung erreicht, nimmt die Markierung durch Biotinylpalmitoyldextran mit der Konzentration des Markierungs- Reagens linear zu. Allerdings ist die Markierung dadurch begrenzt, dass die Zellen bei zu hohen Konzentrationen an Reagens beschädigt werden. Fand die Biotinylierung der Zellen mit etwa 1 mg/ml Biotinylpalmitoyldextran für 10 Minuten bei 37ºC statt, so wurde keine Veränderung der Zelloberfläche unter dem Mikroskop beobachtet; die Eigenschaften der Lichtstreuung der Zelloberfläche, die im FACScan mit vorwärts und seitwärts gestreutem Licht gemessen wurde, war im Vergleich zu behandelten Zellen unverändert. Die behandelten Zellen behielten ihre Lebensfähigkeit und konnten nochmals kultiviert werden.

Kopplung der Einfang-Antikörper an biotinylierte Zellen

Einfang-Antikörper wurden an Zellen gekoppelt, die mit Biotinylpalmitoyldextran über eine Avidin-Biotin-Brücke biotinyliert waren. Um dies zu bewerkstelligen, wurden die Einfang-Antikörper mit Avidin konjugiert und die Konjugate mit den biotinylierten Zellen umgesetzt.
Zwei Antikörper, nämlich Ratte-Anti-Maus-IgM (R33.24.12) und Maus-Kappa gegen Maus-Lambda (LS136) gegen verschiedene Epitope auf Maus-IgM (Lambda) wurden an Avidin gekoppelt.
Bei Avidin handelt es sich um ein basisches Protein mit mehreren reaktiven Aminogruppen. Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) wurde zur Kopplung des Avidins an die Einfang-Antikörper verwendet. Bei SMCC handelt es sich um ein zweiwertiges Linker-Molekül, dessen Maleimidgruppe selektiv mit Thiolen reagiert und dessen Succinimidylgruppe selektiv mit primären Aminen reagiert. Der Einfang-Antikörper wurde mit DTT reduziert. DTT ist ein mildes Reduktionsmittel, das unter geeigneten Bedingungen 1-4-Disulfid-Brücken eines IgG- Moleküls zu Thiolen ohne Zerstörung der Antigen-Bindungsstelle reduziert. Eine reaktive Maleimidgruppe wurde in die Aminogruppen des Avidins mit SMCC eingeführt. Die Maleimidgruppe des Avidins wurde mit den SH-Gruppen des reduzierten Antikörpers umgesetzt. Avidin und Einfang-Antikörper wurden in dieser Weise durch eine Cyclohexan-Brücke verbunden.
Spezifischer gesagt wurden 1,5 ul einer 1-molaren Lösung von DTT 1 mg Antikörper der IgG-Klasse in 200 ul PBS, enthaltend 5 mM EDTA (PBS/EDTA), zugegeben. Nach einstündiger Reaktion bei Raumtemperatur wurde der reduzierte Antikörper auf eine Sephadex-PD10-Säule aufgebracht und in 1 ml PBS/EDTA eluiert. Die Anzahl der pro Antikörper-Molekül eingeführten Thiolgruppen wurde bestimmt. Der erewünschte Bereich liegt bei etwa 2-6 Thiolgruppen pro Antikörper-Molekül.
Gleichzeitig wurde 1 mg Avidin in 100 ul Carbonat-Puffer, pH = 9,4, gelöst und dem 125 ug SMCC in 7,5 ul DMSO zugegeben. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde das Protein auf einer Sephadex PD10-Säule gereinigt und in 500 ul PBS/EDTA aufgenommen.
1 mg des reduzierten Antikörpers in 1 ml PBS/EDTA wurde mit 400 ug des aktivierten Avidins in 200 ug PBS/EDTA kombiniert und über Nacht bei 4ºC stehengelassen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 ul an 1 M N-Ethylmaleimid zum Stopp gebracht.

Kopplung der Avidin-markierten Einfang-Anitkörper an biotinylierte Zellen

Ein Gemisch aus Myelom- und Hybridom-Zellen wurde verwendet. B.1.8.- Hybridomzellen, die IgM sekretieren, und nicht-produzierende X63. Ag 8 6.5.3- Myelomzellen wurden bei 37ºC in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre gezüchtet. Das Kulturmedium enthielt RPMl und 5% fötales Kälberserum (FCS), 100 IE/ml Penicillin und 0,1 mg/ml Streptomycin.
Das Zellgemisch wurde mit Biotinylpalmitoyldextran unter Anwendung der oben beschriebenen Bedingungen biotinyliert.
Um die Antikörper-Aividin-Konjugate an die biotinylierten Zellen zu koppeln, wurden die biotinylierten Zellen nach Waschen in PBSI1% BSA, mit einem Avidin-Einfang- Antikörper-Konjugat inkubiert. 1 ul einer Lösung von 1 mg/ml des Einfang-Antikörper- Avidin-Konjugats in PBS wurde 10&sup7; biotinylierten Zellen in 100 ul PBS/NaN&sub3; zugegeben. Nach 10 Minuten auf Eis wurden die Biotingruppen mit Einfang-Antikörper gesättigt und die Zellen mit Einfang-Antikörpern beladen.
Um das Vorhandensein der Avidin-Antikörper-Komplexe auf der Zelloberfläche nachzuweisen, wurde ein fluoreszierender Anti-Antikörper verwendet, und die Fluoreszenzmarkierung mittels FACScan nachgewiesen. Die Markierung der Zellen entsprach in etwa der Markierung der biotinylierten Zellen mit fluoreszierendem Streptavidin, wie in derselben Untersuchung vorgenommen. Eine gleichmäßige Markierung der Zellpopulation wurde beobachtet; alle Zellen trugen etwa dieselben Mengen an Einfang-Antikörpern auf ihren Oberflächen.

Testen der Funktionalität der Einfang-Antikörper an der Zelloberfläche

Etwa 10&sup7; mit Einfang-Antikörpern versehene Zellen wurden auf Eis (so dass sie kein Protein sekretierten) in 100 ul PBS/BSA bei verschiedenen Konzentrationen von Maus-IgM, welches durch die Einfang-Antikörper eingefangen wird, inkubiert. Nach einer 5-minütigen Inkubation wurden die Zellen gewaschen und das eingefangene IgM auf der Zelloberfläche unter Verwendung von R-PE-Konjugat als dem Antikörper-Marker nachgewiesen. Die Detektion fand im FACScan statt. In Fig. 5 ist die Titrationskurve gezeigt. In der Figur ist die Fluoreszenz der Zellen (mittlere) gegen die IgM-Konzentration aufgetragen, mit der die Zellen inkubiert wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Einfang-Antikörper an der Zelloberfläche nach wie vor intakte Bindungsstellen aufweist. Die Empfindlichkeit der Einfang-Antikörper gegenüber niedrigen IgM-Konzentrationen im Medium ist ebenfalls erkennbar. Die dargestellte Titrationskurve wurde unter Verwendung von R33.24.12 als dem Eihfang-Antikörper erhalten. Der Einfang-Antikörper LS136 wurde für die später gezeigten Einfang-Experimente verwendet. Letztere ergaben eine etwas höhere Erüpfindlichkeit gegenüber niedrigen IgM-Konzentrationen im Medium.

Einfang von sekretiertem IgM

Ein Gemisch aus biotinylierten B.1.8.- und X63-Zellen wurde mit Einfang-Antikörpern konjugiert und in einer 7,5% CO&sub2;-Atmosphäre bei 37ºC für verschieden lange Zeiträume in Medium gehalten. Das an der Oberfläche eingefangene IgM wurde dann mittels eines Antikörper-Markers detektiert.
In Fig. 6 sind die resultierenden Markierungen als FACscan-Aufzeichnungen gezeigt: Dauer des Einfang-Tests (6a) 10 Minuten; (6b) 30 Min.; (6c) 1 Std.; und (6d) 2 Std. Mach 30 Minuten sind zwei Populationen differenzierbar, die unterschiedliche Mengen an IgM eingefangen haben. Der Unterschied zwischen den beiden Populationen verschwindet nach längerem Inkubieren aufgrund des durch die sekretierenden Zellen an das Medium abgegebenen IgMs, welches durch die Einfand-Antikörper an den nicht-sekretierenden Zellen aufgenommen wird.

Einfangen von sekretiertem IgM unter Verwendung eines Diffusions-Inhibitors

Aus der oben genannten Aufzeichnung ist erkennbar, dass auch die weniger stark markierte Zellpopulation das IgM schnell an ihrer Oberfläche aufnimmt. Diese Hintergrund-Markierung ist die Folge von sekretiertem IgM im Kulturmedium, das nicht durch die Einfang-Antikörper auf den sekretierenden Zellen eingefangen wurde.
Wird das Einfang-Experiment in einem visköseren Medium vorgenommen, so lässt sich dadurch diese Hintergrund-Markierung reduzieren. Es wurde Kulturmedium mit 2,5% Methylcellulose verwendet; dieses Medium zeigt eine gelartige Konsistenz.
Die mit Einfang-Antikörpern beladenen Zellen wurden in Kulturmedium mit 2,5% Methylcellulose oder 1% Methylcellulose gemischt. Es war nicht notwendig und sogar überflüssig, die Zellen zu waschen; nicht an die Zellen gebundenes Einfang- Antikörper-Avidin-Konjugat ergab keine Beeinträchtigung. 2 ml Medium wurden für 10&sup7; Zellen verwendet. Um die Methylcellulose richtig in Lösung zu bringen, wurde sie mit dem Kulturmedium einen Tag vorher vermengt. Das Medium wurde auf 37ºC vorerhitzt, die Zellen zugegeben und 25 bis 45 Minuten lang bei 37ºC mit 7,5% CO&sub2; inkubiert. Unter diesen Bedingungen sekretierten die Hybridomzellen ihr Produkt. Nach der Inkubationszeit wurde das hochvisköse Medium mit 45 ml kaltem PBS/BSA verdünnt. Die Zellen wurden bei 4ºC herauszentrifugiert und in 100 bis 500 ul PBS/BSA aufgenommen. Die Rückstände der Methylcellulose verliehen der Zellsuspension eine erhöhte Viskosität; weder die Zellen noch die anschließenden Markierschritte wurden dadurch beeinträchtigt.
In Fig. 7 ist die Wirkung der Konzentration von Methylcellulose im Medium auf den Einfang gezeigt. Die Zellen bei diesem Experiment erzeugten IgM in 2,5% Methylcellulose für 35 Minuten und wurden dann gewaschen und mit R33.24.12 R- PE markiert. Fig. 7a und 7b zeigen den Einfang der Antikörper durch in 2,5% bzw. 1% Methylcellulosemedium inkubierte Zellen. Die Ergebnisse zeigen, dass die sekretierenden und nicht-sekretierenden Zellen basierend auf dem Einfang in 2,5% Methylcellulosemedium erfolgreich unterschieden werden konnten.

Doppelmarkierung

Um zu zeigen, dass die Zellen, die IgM an ihrer Oberfläche trugen, nach dem oben beschriebenen Einfang-Experiment tatsächlich IgM-sekretierende Zellen waren, wurden die Zellen nach dem Einfang-Experiment auf ihrer Oberfläche mit R33.24.12 R-PE rat markiert (im FACScan als Fluoreszenz 2 sichtbar), fixiert und im Zytoplasma mit R.33.24.12.-FITC grün markiert (im FACScan als Fluoreszenz 1 sichtbar). Die in dieser Weise zweifach markierten Zellen wurden unter dem Mikroskop und im FACScan untersucht.
Die Tatsache, dass die Zellen, die IgM an ihrer Oberfläche tragen, nach dem Einfang-Experiment sekretierende Zellen sind, wurde durch diese Doppelmarkierung als eine zweidimensionale Darstellung der Fluoreszenz 1 und 2 im FACScan verdeutlicht. Die B.1.8-Zellen wurden nach dem Einfang-Experiment auf ihrer Oberfläche relativ zum eingefangenen IgM rot markiert (im FACScan als Fluoreszenz 2 sichtbar) und wurden dann fixiert und im Zytoplasma relativ zum IgM grün markiert (in FACScan als Fluoreszenz 1 sichtbar). Alle Oberflächen-markierten Zellen wurden ebenfalls im Zytoplasma markiert.
Die Ergebnisse zeigten, dass alle der nicht IgM produzierenden Zellen ebenfalls zu der Zellpopulation gehörten, die nicht Oberflächen-markiert wurde. Die Zytoplasmapositiven Zellen wurden in zwei Fraktionen aufgeteilt; in eine Fraktion von Zellen, die sowohl an der Oberfläche als auch im Zytoplasma markiert wurde. Hierbei handelte es sich offensichtlich um sekretierende Zellen. Die andere Zellfraktion dagegen wurde im Zytoplasma, doch nicht an der Zelloberfläche markiert. Da diese Population nicht durch einen Ficoll-Gradienten getrennt werden konnte (direkt vor Fixierung durchgeführt), handelte es sich nicht um abgestorbene Zellen. Einige der Zellen in dieser Population wurden außerdem nicht so intensiv im Zytoplasma markiert wie die sekretierenden Zellen. Die breitere Verteilung dieser Fraktion im Vergleich zu den beiden anderen Zellpopulationen war ebenfalls auffallend. Diese Zellen erzeugten IgM, doch verloren offensichtlich die Fähigkeit zum Sekretieren dieses Proteins. Die doppelt markierten Zellen wurden unter dem Mikroskop als eine Kontrolle untersucht. Diese Untersuchung ergab eine Übereinstimmung mit dem Ergebnis der FACScan- Darstellung.

Zellseparation des MACS

Nach dem Einfangen des sekretierten IgM mit einem 1 : 1-Gemisch von etwa 10&sup7; B.1.8.- und X63-Zellen, wurden die Trennungen mit dem magnetischen Zellsortier- System'(MACS) unter Verwendung magnetischer Partikel durchgeführt, die an den eingefangenen IgM an der Zelloberfläche binden. Das MACS-System und die magnetischen Partikel stammten von Miltenyi Biotec GmbH (Deutschland).
Ein Gemisch der IgM-sekretierenden und nicht-sekretierenden Zellen wurde bereitgestellt, wobei die Matrix zum Einfangen des sekretierten IgMs bei dieser Arbeit entwickelt wurde und bei 37ºC in einer 7,5% CO&sub2;-Atmosphäre für 25 Minuten in 5 ml Kulturmedium mit 2,5% Methylcellulose gehalten wurde. Die Zellen wurden in 45 ml PBS/BSA gewaschen. Das Pellet wurde mit einem Rest der Methylcellulose von gelartiger Konsistenz behandelt. Es wurde in 500 ul PBS/BSA aufgenommen und den 5 ul an Ratte-Anti-Maus-IgM-magnetischen Kügelchen (Miltenyi Biotec GmbH) zugegeben. Nach 5 Minuten auf Eis wurden 10 ug/ml R-PE-gekoppelte R33.24.12- Antikörper zugegeben und das Gemisch 5 weitere Minuten lang auf Eis gehalten.
Etwa 10&sup7; in dieser Weise vorbehandelte Zellen wurden auf eine Typ-A1-Trennsäule im MACS (Miltenyi Biotec GmbH) aufgebracht und die negative Fraktion mit 10 ml PBS/BSA bei 5ºC eluiert. Nach Entfernen der Säule aus dem magnetischen Feld wurde die positive Zellfraktion in 10 ml PBS/BSA eluiert.
Die relativ zum IgM rot oberflächenmarkierten Zellen sind in Fig. 8 vor und nach der Trennung gezeigt. Die Zellsuspension enthielt vor der Trennung 58,8% unmarkierte und 41,2% markierte Zellen. Nach der Trennung umfasste die negative Fraktion 89 % unmarkierte und 11% markierte Zellen. Die positive Fraktion enthielt 23% unmarkierte und 77% markierte Zellen. Wird die Konzentration der positiven Zellen nach der Trennung anhand folgender Formel berechnet: Konzentrationsfaktor = (% pos. Zellen in pos. Fraktion. % neg. Zellen in ursprünglichem Zellgemisch)/(% pos. Zellen in der ursprünglichen Fraktion. % neg. Zellen in pos. Fraktion), so wird ein Konzentrationsfaktor von 4,8 erhalten.
Nach der Trennung konnten die Zellen nicht mit Propidiumiodid markiert werden, einem Farbstoff, der selektiv tote Zellen markiert, und konnten nochmals kultiviert werden. Die Lebensfähigkeit der getrennten Zellfraktionen wurde unter dem Mikroskop eine Woche nach der Trennung überprüft. Der Verlust an Zellen während des Trennvorgangs wurde nicht bestimmt; bei Trennungen im MACS treten normalerweise keine relevanten Verluste an Zellen auf.
In Fig. 8 ist eine FACScan-Aufzeichnung der markierten Zellen vor und nach den Trennungen gezeigt. Nach Einfangen des sekretierten IgMs wurden die Zellen relativ zum IgM an der Oberfläche markiert und wurden im MACS mit magnetischen Partikeln relativ zum IgM getrennt. Die Zellen sind in Fig. 8a vor der Trennung gezeigt. Fig. 8b zeigt die negative Fraktion nach der Trennung. Fig. 8c zeigt die positive Fraktion nach der Trennung. Werden die Zellen rechts der durchbrochenen Linie als markiert betrachtet und jene links davon als unmarkiert, so enthielten die Zellfraktionen die folgenden Mengen an markierten und unmarkierten Zellen:
Die oben beschriebenen Untersuchungen bezogen die folgenden allgemeinen Techniken ein.

Antikörper-Markierung der Zellen

Die Zellen wurden in PBS/BSA aufgenommen und mittels Zentrifugation pelletiert. Der Überstand wurde durch Absaugen entfernt und das Pellet in der Antikörper- Markierlösung resuspendiert. Pro 10&sup7; Zellen wurden 100 ul Markierlösung, die 1,0-100 ug/ml Antikörper in PBS/BSA plus 0,1% NaN&sub3; enthielt, verwendet. Die Kopplungsreaktion wurde 5 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen.

Ficoll-Gradienten-Zentrifugation

Eine Ficoll-Gradienten-Zentrifugation wurde zur Entfernung der abgestorbenen Zellen angewandt. Die Zellsuspensionen wurden vorsichtig mit 5 ml Ficoll (Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden) unterlegt und dann bei 2500 UpM bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die lebenden Zellen blieben auf dem Ficoll-Kissen ruhen und wurden durch Absaugen entfernt.

Zyoplasma-Markierung

0,5% Saponin und 10 ug/ml Markier-Antikörper wurden den fixierten Zellen in PBS/BSA zugegeben. Saponin erzeugt reversible Kanäle von etwa 10 nm im Durchmesser in der Zellmembran, so dass die Antikörper in die Zellen eindringen können. Nach einer Reaktionszeit von 1 Stunde wurden die Zellen in PBS/BSA plus 0,5% Saponin (1 mh/10&sup6; Zellen) aufgenommen. Nach 30 Minuten wurden die Zellen gewaschen und in Saponin-freies PBS/BSA aufgenommen.

Verwendeter Antikörper

R33.24.12., ein monoklonaler Ratte-Anti-Maus-Antikörper, gekoppelt sowohl an R-PE alls auch an Fuorescein, wurde bezogen aus Lagervorräten der Immunbiologischen Abteilung des Instituts für Genetik in Köln. Die optimalen Markierungs- Konzentrationen wurden titriert. Das R-PE-Konjugat dieses Antikörpers wurde zur Markierung des eingefangenen IgM an der Oberfläche der sekretierenden Zellen verwendet, und das Fuorescein-Konjugat wurde zur Zytoplasma-Markierung verwendet. LS136, ein Maus-IgG-Kappa gegen Maus-Lambda wird als Einfang- Antikörper verwendet (das einzufangende IgM ist vom Lambda-Allotyp). LS136 stammt ebenfalls aus der internen Produktion der Immunbiologischen Abteilung.

Beispiel 2

Dieses Beispiel weist die Wirkung nach, die die Durchführung der Sekretionsphase in einem gelatineartigen Medium gegenüber einem hochviskösen Medium auf den Einfang dies sekretierten Produkts durch Zellen ausübt, die eine Biotin-Anker- Komponente in Verknüpfung über Avidin an die Einfang-Komponente enthalten.

Chemische Biotinylierung der Zellen unter Verwendung von NHS-LC-Biotin

Ein Gemisch von B.1.8.- und X63-Zellen wurde mittels des folgenden Verfahrens chemisch biotinyliert. Zellsuspensionen, die 10&sup7; bis 10&sup8; Zellen enthielten, wurden zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Pellet in einer Lösung von 200 ul PBS, pH 8,5, Enthaltend 0,1 bis 1 mg/ml NHS-LC-Biofin (Pierce, Rockford, Illinois, USA), resuspendiert. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen zweimal ausführlich mit 50 ml PBS/BSA gewaschen. Die Markierung mit Avidin- Konjugat erfolgte innerhalb von 24 Stunden der Biotinylierung.

Knüpfung der biotinylierten Zellen an Einfang-Antikörper mit Avidin

Die durch Reaktion mit NHS-LC-Biotin biotinylierten Zellen wurden mit einem Avidin- Konjugat von LS136 (Konzentration 30 ug/ml) 30 Minuten lang auf Eis markiert und gewaschen.

Sekretion und Produkt-Einfang in gelatineartigem Medium und in hochviskösem Medium

Die biotinylierten Avidin-behandelten Zellen wurden 1 Stunde lang bei 37ºC unter 7,5 % CO&sub2; in drei verschiedenen Medien inkubiert, gewaschen und mit einem Fluorescein-Konjugat von R33.24.12 (10 ug/ml) 10 Minuten lang auf Eis markiert, gewaschen und unter Anwendung der Flusszytometrie (FACScan) zur Bestimmung der Menge angebundenem R33.24.12 analysiert. Bei R33.24.12 handelt es sich um ein Fluorescein-Konjugat des Anti-Produkt-Antikörpers. Die während der Inkubation verwendeten drei verschiedenen Medien waren: (1) Zellkulturmedium, RPMI, 5% FCS; (2) RPMI, 5% FCS, ergänzt mit 40% BSA (Fluka, Schweiz); und (3) RPMI, 5 % FCS, ergänzt mit 20% BSA und 20% Gelatine (Typ B von Rinderhaut, etwa Blume 225, Sigma Chemical Co.) als einem gelatingeartigen Diffusionshemmer. Die Ergebnisse sind in Fig. 9, 10 und 11 gezeigt.
Fig. 9A zeigt die Verteilung der Markierung von in RPMI, 5% FCS (d. h. ohne einen Diffusionshemmer) inkubierten Zellen. Die gesamte Zellpopulation ist zu einer höheren Fluoreszenz verschoben, so dass keine Trennung in unterschiedliche Zellpopulationen auflösbar war. Fig. 9B zeigt die Verteilung der Markierung von in RPMI, 5% FCS, ergänzt mit 40% BSA, inkubierten Zellen. Dieses BSA-Medium stellt einen hochviskösen Diffusionshemmer dar. Im Vergleich zu Fig. 9A zeigt sich, dass die Lnkubation bei diesem Medium zu weniger Hintergrund-Markierung führte. Fig. 9C zeigt die Verteilung der Markierung der in RPMI, 5% FCS, ergänzt mit 20% BSA und 20% Gelatine, inkubierten Zellen. Unter Verwendung dieses Mediums sind zwei Zellpopulationen, sekretierende und nicht sekretierende, identifizierbar. Im Vergleich zu den in den beiden anderen Medien inkubierten Zellen, wie in Fig. 9A und 9B gezeigt, ist die Fluoreszenzmenge bei der sekretierenden Population signifkant erhöht.
Dieses Beispiel zeigt, dass zwar ein visköses Medium wie ein hochdichtes BSA- Medium den Einfang an sekretiertem Produkt durch Nicht-Erzeugerzellen vermindert, doch die Inkubation während der Sekretion in einem gelatineartigen Medium zu einer signifikant höheren Markierung der Erzeugerzellen bei gleichzeitiger Verminderung des Einfangs von Nicht-Erzeugerzellen führt. Diese Amplifikationswirkung auf den Einfang ermöglicht die Markierung von Zellen, die geringere Mengen an Produkt erzeugen und/oder die Verwendung geringer affiner Antikörper für den Einfang des sekretierten Produkts. Das gelatineartige Medium scheint zu einer erhöhten Konzentration des Produkts in der Umgebung der sekretierenden Zellen zu führen und dabei die Geschwindigkeit der Einfangreaktion nicht zu hemmen. Werden gelatineartige Medien mit einer Rückhaltegrenze unter dem Molekuargewicht des Produkts im Medium verwendet, so können sich die sekretierten Moleküle in der Lücke zwischen Zelle und Medium konzentrieren, was zu höheren lokalen Konzentrationen und einer wirksameren Markierung der sekretierenden Zellen führt.

Zellseparation unter Verwendung eines MACS

Ein Gemisch von B1.8- und X63-Zellen wurde chemisch biotinyliert und mit LS136- Avidin markiert, wie oben beschrieben. Eine Kontrollprobe wurde genommen und auf Eis gelagert. Die verbliebenen Zellen durften 1 Stunde lang in 6 ml gelatineartigem RPMI-Medium, enthaltend 23% Gelatine, 18% BSA und 5% FCS, sekretieren. Das Gel wurde in 20 ml an 42ºC warmem PBS schnell gelöst, gefolgt von einer schnellen Zugabe von 30 ml eiskaltem PBS und Waschen in einer gekühlten Zentrifuge. Die Zellen und die Kontrollproben wurden 10 Minuten lang auf Eis mit Ratte-Anti-Maus- IgM-Mikrokügelchen (Miltenyi Biotec GmbH), markiert mit Ziege-Anti-Maus- Fuorescein (SBA, Birmingham, Alabama) markiert und einmal gewaschen. Die Zellen wurden dann auf einer A2-Säule unter Verwendung eines MACS-magnetophoretischen Zelltrenners getrennt. Die Trennung wurde gemäß den Anleitungen des Herstellers vorgenommen. Die Kontrollprobe, unaufgetrennte Probe und magnetische und nicht-magnetische Fraktionen wurden mittels Flusszytometrie (FACScan) analysiert (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).
Fig. 11a zeigt die Fluoreszenz-Verteilung der Kontrollprobe. Wie aus der Figur zu ersehen, war nahezu keine nachweisbare Oberflächenmarkierung auf den Zellen detektierbar (0,6% in der Fläche zwischen den gestrichelten Linien (positives Fenster)). Fig. 11b zeigt die Fluoreszenz-Verteilung nach der Sekretion und Fluoreszenz-Markierung, vor der magnetophoretischen Trennung. Etwa 14,2% der Zellen befinden sich im positiven Fenster und sind mutmaßliche Sekretoren. Fig. 11c zeigt die Fluoreszenz-Verteilung der nicht-magnetischen Fraktion nach der magnetischen Trennung. Nahezu alle positiven Zellen werden in der magnetischen Säule zurückgehalten (2% der Zellen im positiven Fenster). Fig. 11d zeigt die Fluoreszenz-Verteilung der magnetischen Fraktion. Die Population der positiven Zellen ist in hohem Grade angereichert (80,3% im positiven Fenster). Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass die Reinheit der Zellpopulation als höher zu erwarten ist als das Ergebnis der FACScan-Analyse, was auf die Instrument-Grenzen zurückzuführen ist. Die Anreicherungsrate kann mit größer 24 kalkulierbar.
Fig. 1 Ba bis 10d zeigen ein ähnliches Experiment wie in Fig. 11a bis 11d, außer dass ein höherer Anteil der B1.8- bis X63-Zellen verwendet wurde. Das Medium während der Sekretionsphase war RPMI, das 25% Gelatine und 2,5% FCS enthielt. Der prozentuale Anteil der Zellen im positiven Fenster betrug 1,3% (Kontrolle), 41,2% (nach der Sekretion), 6, 6% (nicht-magnetische Fraktion) und 92,9% (magnetische Fraktion). Die Anreicherungsrate für positive Zellen in diesem Beispiel ist mit größer 18,7 kalkulierbar und die Erschöpfungsrate mit größer 9, 9.

Beispiel 3

Im folgenden wird eine Methode zur Messung der Absolutmenge an Sekretion und zur Kompensierung unterschiedlicher Mengen an Einfang-Komponente auf den Zelloberflächen beschrieben.
Während der Sekretionsphase werden die Zellen einer niedrigen Konzentration an markiertem Produkt ausgesetzt, das mit dem Medium bereitgestellt wird; das markierte Produkt bindet zwar, doch sättigt nicht die Produkt-Bindungsstellen an den Zellen. Eine Inkubation während dieser Phase bewirkt die Bindung sowohl des sekretierten Produkts als auch des markierten Produkts an die Zellen. Die Zellen werden dann einer Markierung mit der für das Produkt (sowohl markiert als auch sekretiert) spezifischen Marker-Komponente unterzogen. Unter Messung des Tags unter Anwendung eines Parameters, und des Gesamtprodukts im anderen Parameter wird die durch eine Zelle sekretierte Menge normalisiert und werden die unterschiedlichen Mengen an Einfang-Antikörper an den Zellen im Gemisch kompensiert.

Beispiel 4

Immunfluoreszenz-Analyse der Lebendzellen auf sekretierte Zytokine In diesem Beispiel wird eine Immunfluoreszenz-Methode für die Analyse von Lebendzellen auf sekretierte Zytokine beschrieben. Genauer gesagt wird in diesem Beispiel die Identifikation und Trennung von Mäusemilzzellen-sekretierendem Interferonγ (IFNγ) beschrieben. Generell bezieht dieses Beispiel die Schaffung einer künstlichen Affinitätsmatrix auf der Oberfläche der Lebendzellen durch Biotinylierung der Zelloberflächen-Proteine und die Inkubation mit einem Avidin-konjugierten Anti- Zytokin-Antikörper ein. Die Zellen werden in einem Medium von hoher Viskosität inkubiert, um die Diffusion der sekretierten Produkte zwischen sekretierenden und nicht-sekretierenden Zellen zu verhindern, und wird die Sekretion ermöglicht. An der Zelloberfläche eingefangene sekretierte Zytokine werden mit Digoxigenin-(DIG)- korijugierten Anti-Zytokin-Antikörpern markiert und unter Verwendung von fluorchrömati sierten Anti-DIG-Antikörpern angefärbt. Die in dieser Weise markierten Zellen können dann für den Oberflächen-Marker weiter charakterisiert und mittels MÄCS oder FACS für funktionelle Assays sortiert werden. Die Kombinierung dieser Methode mit der intrazellulären Detektion der Zytokine erlaubt eine Korrelierung der intrazellulären Anhäufung und der Sekretion von Zytokinen auf der Ebene von Einzelzellen.

Detektion von IFNv-sekretierenden Mäusemilzzellen

BALB/c-Mäusemilzzellen (SC) wurden mit 2 ug/ml Staphylococcus aureus- Enterotoxin B (SEB; Sigma) etwa 40 Stunden lang bei 2 · 10&sup6; Zellen/ml in RPMI 1640 stimuliert. Die Zellen wurden dann 10 Minuten lang zu 300 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 200 ul NHS-LC-Biotin (1 mg/ml; Pierce) in PBS, pH 8,4, resuspendiert und dann 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden einmal mit PBS mit 0,5% BSA (PBS/0,5% BSA) gewaschen, in ein anderes Röhrchen gegeben und ein zweites Mal mit PBS/0,5% BSA gewaschen.
Die Zellen wurden in 200 ul PBS/0,5% BSA mit 0,02% NaN&sub3; (PBS/0,5% BSA/NaN&sub3;) resuspendiert, und es wurde unkonjugiertes Anti-Maus-IFNγ R46A2 (Kontrolle) zugegeben, bis eine Endkonzentration von 10 ug/ml erreicht war. Bei den Testproben wurde Avidin-konjugiertes Anti-Maus-IFNγ AN18.17.24 bis zur Erreichung einer Endkonzentration von 25 ug/ml zugegeben. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 4ºC inkubiert. Dann wurden die Zellen in Petri-Schalen in 40% Gelatine (Blume 75; Sigma) in RPMI 1640 (37ºC) bei 106 Zellen/ml für 10-60 Minuten bei 37ºC und 7,5% CO&sub2; eingebracht.
Ein 1,5-faches Volumen an PBS (37ºC) wurde zugegeben und die Zellen in ein 50- ml-Röhrchen mit 2 Volumeneinheiten PBS (12ºC) eingebracht. Diese Zellen wurden dann 10 Minuten lang zu 300 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 100 ul DIGkonjugiertem R46A2 (10 ug/ml) in PBS/0,5% BSA/NaN&sub3; resuspendiert, 10 Minuten lang bei 4ºC inkubiert und dann mit PBS/0,5% BSA/NaN&sub3; gewaschen. Als nächstes wurde das Pellet in 200 ul FITC-konjugiertem Schaf-Anti-DIG-Antikörper (2 ug/ml) in PBS/0,5% BSA/NaN&sub3; resuspendiert, 10 Minuten lang bei 4ºC inkubiert und dann mit PBS/0,5% BSA/NaN&sub3; gewaschen. Die FACS-Analysen sind in Fig. 13 und 14 dargestellt. Wahlweise kann die Oberflächen-Markierung, Fixierung und intrazelluläre Markierung der Zellen vorgenommen und diese in PBS/0,5% BSA/NaN&sub3; resuspendiert werden.

Ergebnisse

Die Sekretion des IFNγ wurde bei Mäusemilzzellen, die in vitro 41 Stunde lang mit SEB stimuliert worden waren, mittels Flusszytometrie analysiert. Da IFNγ lediglich von großen aktivierten Zellen (Blasten) produziert wird, wurde die Zuordnung in die Messkanäle der Lebendblasten entsprechend den Lichtstreu-Eigenschaften und der Propidiumiodid-(PI)-Markierung vorgenommen (Fig. 12). Die Biotinylierung der Zelloberflächen-Proteine wurde durch Markieren mit ST-FITC kontrolliert, dann Beladen mit dem Fang-Antikörper durch Markieren mit FITC-konjugiertem Ziege-Anti- Ratte-IgG (Fig. 13). In Fig. 13a ist die Verteilung der unmarkierten Zellen dargestellt. In Fig. 13b ist die Fähigkeit von ST-FITC zur Markierung von Zellen vor der Biotinylierung dargestellt. Zu beachten ist, dass die Zellen durch ST-FITC nicht unspezifisch markiert werden. In Fig. 13c ist die Fähigkeit von ST-FITG zum Markieren biotinylierter Zellen dargestellt. Zu beachten ist, dass die Zellen vollständig markiert sind. In Fig. 13d ist die Markierung von Zellen, die nicht mit Fang-Ak markiert wurden, mit Ziege-Anti-Ratte-IgG, markiert mit FITC (GaRIgG-FITC), dargestellt. Fig. 13d zeigt, dass keine unspezifische Bindung des markierenden Antikörpers an die Zellen vorliegt. In Fig. 13e ist die Markierung von Zellen dargestellt, die mit avidiniertem Fang-Ak mit GaRIgG-FITC markiert sind. Fig. 13e zeigt, dass der Fang-Ak vollständig an die Zellen bindet.
Als negative Kontrolle wurden Zellen mit Fang-Ak 90 Minuten lang in hochdichtem Medium (HDM, 40% Gelatine in RPMI) inkubiert und gegen IFNγ markiert (Fig. 14). Als Hochkontrolle wurden die Zellen mit Fang-Ak, die 40 Minuten lang in HDM inkubiert worden waren, weiter in IFNγ-enthaltendem Überstand 10 Minuten lang bei 4ºC inkubiert und dann gegen IFNγ markiert (Fig. 14). Unter den SEB-stimulierten Mäuse-SC, markiert mit Fang-Ak, wurde eine steigende Anzahl von IFNγ-sekretiereriden Zellen nach Lnkubation in HDM in Abhängigkeit von der Inkubationsdauer detektiert (Fig. 14). Bei zusätzlicher Oberflächenmarkierung wurden diese IFNγsekretierenden SC als CD4+- und CD8+-T-Zellen identifiziert. Die SEB-stimulierten T-Zellblasten sekretieren variierende Mengen an IFNγ, was zu einer breiten Verteilung der Fluoreszenzintensität führt (Fig. 14).
In Fig. 14 ist die Anzahl der Zellen dargestellt, die mit αDIG-FITC unter variierenden Bedingungen markiert wurden. Das αDIG-FITC bindet an den Anti-IFNγ-Antikörper, der an DIG R46A2-DIG gekoppelt ist. In Fig. 14a ist die Zahl der Zellen dargestellt, die in Gegenwart von Fang-Ak zum Zeitpunkt Null markiert wurden. In Fig. 14b, d und f sind die Anzahlen der Zellen dargestellt, die in Gegenwart des Fang-Ak nach Inkubationszeiten von 5, 40 und 90 Minuten markiert wurden. Zu beachten ist, dass einige Zellen bereits markiert waren und zunehmend mehr nach 90 Minuten markiert sind. In Fig. 14c ist die Zahl der Zellen dargestellt, die in Abwesenheit des Fang-Ak nach einer 90-minütigen Inkubation markiert waren. In Fig. 14e ist die Zahl der Zellen dargestellt, die mit αDIG-FITC in Gegenwart des Fang-Ak und mit während der Inkubation zugegebenem exogenen IFNγ markiert wurden.

Industrielle Nutzbarkeit

Die oben beschriebenen Methoden und Zusammensetzungen sind für den Nachweis und/oder die Trennung von Zellen nützlich, die variierende Mengen einer oder mehrerer bestimmter Substanzen sekretieren. Die Zellen können phänotypisch identisch sein mit Ausnehme ihrer sekretorischen Aktivität des bestimmten Produkts. Folglich kann die Methode zum Trennen von Zellen, die kommerziell wertvolle Substanzen sekretieren, von Zellen, bei denen dies nicht der Fall ist, von Nutzen sein. Letztere können zum Beispiel Zellen sein, die immunogene Polypeptide, Wachstumsfaktoren, Moleküle, die als Hormone dienen können, und eine Vielzahl weiterer Produkte, einschließlich mittels rekombinanter Techniken erzeugte Produkte, sekretieren. Außerdem können die Techniken zur Isolierung von Zellgruppen nützlich sein, die für Transplantations- oder Implantations-Verfahren bestimmt sind, oder für das Packaging zur Implantation. Beispiele für diesen Typ von Zellgruppen sind die Langerhans-Inseln, bei denen eine Trennung von Zellgruppen, die zum Sekretieren von Insulin fähig sind, von anderen Zellgruppen, die nicht sekretieren, wünschenswert wäre. Die Methoden zur Bestimmung der Verteilung der sekretorischen Aktivität von Zellen in Zellgemischen sind außerdem für Fermentationen im großtechnischen Maßstab deshalb nützlich, weil mit ihnen das Auftreten nicht-sekretierender oder gering sekretierender Zellvarianten oder von Zellen, die ein modifiziertes Produkt erzeugen, schnell identifiziert werden kann.

Claims

1. Verfahren zum Selektieren oder Analysieren von Zellen entsprechend einem Produkt, das durch die Zellen sekretiert und freigesetzt wird, welches Verfahren umfasst:

Koppeln der Oberfläche der Zellen an eine Einfang-Komponente und Züchten der Zellen unter Bedingungen, bei denen das Produkt sekretiert, freigesetzt und spezifisch an die Einfang-Komponente gebunden wird;

Markieren des Produkts, zum Beispiel mit einer Marker-Komponente; und

Selektieren oder Analysieren der Zellen auf der Basis des gebundenen Produkts;

wobei die Zellen mit derart gebundenem Produkt nicht als Teil der Selektion oder Analyse lysiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Marker-Komponente ein für das Produkt spezifischer Antikörper ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Einfang-Komponente ein Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon bispezifisch ist.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Kopplung erfolgt durch:

(a) einen Lipid-Anker, der an die Einfang-Komponente wahlweise durch eine Linker-Komponente gebunden ist;

(b) einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon, der an die Einfang-Komponente wahlweise durch einen Linker gebunden ist; oder

(c) eine direkte chemische Kopplung der Einfang-Komponente an Komponenten auf der Zelloberfläche, wahlweise durch einen Linker.

6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Kopplung durch spezifische Bindung des Antikörpers an die Zelle erfolgt.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zellen auf der Basis des gebundenen Produkts getrennt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Marker-Komponente fluorochromatisiert ist und die Trennung durch Zellsortierung erfolgt, oder die Marker-Komponente magnetisierbar ist und die Trennung in einem magnetischen Feld von ausreichender Stärke zur Magnetisierung der Marker-Komponente erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Marker-Komponente kolloidale magnetische Partikel mit einem typischen Durchmesser von etwa 5 bis 200 nm umfasst.

10. Verfahren zum Analysieren einer Zellpopulation, um die Zellen zu identifizieren oder zu zählen, die eine Menge an Produkt relativ zu anderen Zellen in der Population sekretierten, welches Verfahren umfasst:

(a) Markieren der Zellen mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6;

(b) Markieren der Zellen mit mindestens einem zusätzlichen Marker, der das eingefangene Produkt nicht markiert;

(c) Detektieren der Menge an Produkt-Marker relativ zu dem zusätzlichen Marker.

11. Verfahren zum Bestimmen einer Verteilung der sekretorischen Aktivität in einer Zellpopulation, welches Verfahren umfasst:

Markieren der Zellen mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6; und

Bestimmen der Menge an Produkt-Marker pro Zelle.

12. Verfahren nach Anspruch 11, außerdem umfassend das Bestimmen der Menge und der Art von Produkt-Marker pro Zelle, wobei die Verteilung des sekretierten Produkttyps und der sekretorischen Aktivität für jeden sekretierten Produkttyp in einer Zellpopulation bestimmt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Identifizieren von Zellen, die ein Produkt sekretieren, wobei die Einfang-Komponente umfasst:

mindestens einen ersten, bispezifischen Antikörper, wobei dieser oder jeder Antikörper Kombinationsstellen aufweist, die für ein Zelloberflächen-Molekül und mindestens ein Produkt spezifisch sind; und

wobei eine gemischte Zellpopulation mit der Einfang-Komponente kombiniert wird, welches Verfahren das Zugeben mindestens einer Marker-Komponente umfasst; und

Detektieren dieser mindestens einen Marker-Komponente.

14. Verfahren nach Anspruch 13, außerdem umfassend den Schritt des Abtrennens der Zellen, die das Produkt sekretieren, aus der gemischten Zellpopulation.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Zelloberflächen-Molekül ein natürlich vorkommendes Zelloberflächen-Protein ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Protein ein Zelloberflächen-Marker oder CD4, CD8, CD19, CD20, CD14, CD16, CD15, CD45, Klasse-I-MHC-Molekül oder Klasse-II-Molekül, CD34, CD38, CD33, CD56-T-Zell-Rezeptor, Fc-Rezeptor, β&sub2;-Mikroglobulin oder ein immunglobulin ist.

17. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Inkubationsbedingungen ein hochvisköses oder gelbildendes Medium umfassen.

18. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Marker-Komponente ein Antikörper ist, der wahlweise einen detektierbaren Marker umfasst.

19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Marker- Komponente oder der detektierbare Marker ein Fluorophor, radioaktives Isotop, Chromophor oder ein magnetischer Partikel ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Marker-Komponente durch fluoreszenzgesteuerte Zellsortierung detektiert werden kann.

21. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Marker-Komponente durch einen dritten Antikörper detektiert wird, der wahlweise an eine magnetisierbare Komponente gekoppelt ist.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Marker-Komponente an Digoxigenin gekoppelt ist und der dritte Antikörper für Digoxigenin spezifisch ist.

23. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der dritte Antikörper einen detektierbaren Marker umfasst, wie zum Beispiel ein Fluorophor, radioaktives Isotop, Chromophor oder einen magnetischen Partikel.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Marker-Komponente durch fluoreszenzgesteuerte Zellsortierung detektiert wird oder die Marker-Komponente eine magnetisierbare Komponente umfasst.