DE69131181T2

DE69131181T2 - Verfahren zum nachweis und zur quantifikation von zell-subsätzen innerhalb von subpopulationen einer vermischten zellpopulation

Info

Publication number: DE69131181T2
Application number: DE69131181T
Authority: DE
Inventors: Paul Horan; Bruce Jensen; Meryle Melnicoff; Katharine Muirhead; Martin Summers; William Wong
Original assignee: Intracel Corp
Current assignee: Intracel Corp Issaguah Wash Us
Priority date: 1990-11-29
Filing date: 1991-11-05
Publication date: 1999-11-04
Anticipated expiration: 2011-11-06
Also published as: WO1992009894A1; EP0559738A1; EP0559738A4; US5385822A; EP0559738B1; ATE179520T1; DE69131181D1; AU667031B2; JPH06503643A; AU9037691A; CA2095237A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft biologische Prüfmethoden, insbesondere Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens bzw. der Menge von ausgewählten Untergruppen einer Subpopulation von Zellen innerhalb einer Zellpopulation, wobei jede Untergruppe mindestens über eine charakteristische Determinante verfügt, sowie Testkits für die Durchführung solcher Verfahren. Die erfindungsgemäßen Verfahren erleichtern das Screenen komplexer biologischer Flüssigkeiten wie Vollblut, die kleine Mengen an bestimmten interessierenden Zelltypen enthält, durch gleichmäßiges Einbringen einer nachweisbaren Reportersubstanz in oder auf die Zellen der Subpopulation, anschließendes Abtrennen der ausgewählten interessierenden Untergruppe, z. B. über Affinitätstrennung, sowie Nachweisen der Reportersubstanz.

Beschreibung des Standes der Technik

Die Bestimmungen von Blut- oder Knochenmarkbestandteilen, z. B. Leukozytensubpopulationen, sind aufgrund der allgemeinen Verfügbarkeit von monoklonalen Antikörpern, die selektiv mit Determinanten der einzelnen Bestandteile reagieren, zu allgemein üblichen klinischen Diagnosetests geworden. Diese Bestimmungen haben sich bei der Überwachung von Veränderungen bei Immundefizienzkrankheiten, Leukämie, Lymphom und bei Transplantationspatienten als nützlich erwiesen; siehe A. Landay und K. Muirhead, Clin. Immunol. und Immunopathol, 52 : 48-60 (1989). Das etablierte Verfahren für die Durchführung solcher Bestimmungen ist eine Immunfluoreszenzmarkierung und anschließende durchflußzytometrische Analyse oder Fluoreszenzmikroskopie.
Die Durchflußzytometrie weist im Vergleich zu anderen Zellmarkierungsanalyseverfahren wie Immunfluoreszenzmikroskopie, Immunzytochemie und Enzymimmungssay eindeutige Vorteile auf. Ein besonderer Vorteil der Durchflußzytometrie gegenüber Markeranalysemassenverfahren (z. B. Fluorimetrie oder Enzymimmungssay) besteht in der Verwendung einer Vielzahl von Detektoren für die gleichzeitige Analyse von multiplen Signalen jeder Zelle. So beschreibt zum Beispiel das US-Patent Nr. 4,727,020 an Recktenwald die Verwendung von zwei Fluoreszenzkanälen für den Nachweis von Zellen in einer spezifischen, mit zwei unterschiedlichen Immunfluoreszenzstoffen markierten Subpopulation. Das an Hansen u. a. ausgegebene US-Patent Nr. 4,284,412 beschreibt die Verwendung von Fluoreszenzkanälen für den Nachweis der Vorwärts- und rechtwinkligen Lichtstreuung von Zellen unterschiedlicher Subpopulationen in Blut. In beiden Fällen wird mindestens ein Parameter für die Durchlaßsteuerung verwendet, so daß ein Signal einer Zelle (z. B. die Fluoreszenz eines Fluorochroms) nur dann elektronisch gemessen wird, wenn die Zelle zu der getorten interessierenden Subpopulation gehört. Eine solche Messung von einer Vielzahl von Parametern eignet sich für die Aufzählung von interessierenden Untergruppen innerhalb einer komplexen Zellpopulation (z. B. Vollblut). Dieses Verfahren ist jedoch zeitaufwendig, da jede Probe Zelle für Zelle auf die interessierenden Parameter untersucht werden muß.
Ein eindeutiger Nachteil der Durchflußzytometrie besteht klarerweise darin, daß jede Probe einzeln vorgenommen und untersucht werden muß. Dieser Nachteil macht sich besonders in einem klinischen Laboratorium, das jeden Tag eine Vielzahl von Patientenproben verarbeiten muß, bemerkbar. Die Fähigkeit, gleichzeitig Subpopulationen von Zellen aus Mehrfachproben zu quantifizieren, würde die Durchgangszeit für diesen Vorgang im klinischen Labor oder im Forschungslabor wesentlich verringern.
Ein für die Untersuchung von Mehrfachproben vorgeschlagenes Verfahren ist der enzymgebundene Immunsorptionsassay (ELISA); siehe: J. Endl. u. a., J. Immunol. Meth., 102 : 77-83 (1987); siehe auch US-Patent Nr. 4,876,189 an Shetters u. a. Bei diesem Assay wird mit einem Reader für 96-Well-Mikrotiterplatten gleichzeitig die Extinktion einer Vielzahl von Proben gemessen. Als Reportersystem wird bei diesem Assay ein mit einem monoklonalen Antikörper gegen ein spezifisches Antigen konjugiertes Enzym verwendet, wobei dieses Reportersystem nicht zwischen einem Antigen der interessierenden Untergruppe (z. B. CD4 an Lymphozyten) und dem gleichen Antigen auf einer anderen Untergruppe (z. B. CD4 an Monozyten) unterscheiden kann. Diese Technik eignet sich daher nicht gut für die Bestimmung von Subpopulationen von Zellen in Vollblut.
Bei einem weiteren Verfahren zum Nachweis von Zelloberflächenantigenen oder Antikörpern gegen diese wird die Agglutination von fluorochrommarkierten Erythrozyten gemessen; siehe V. Ghazarossian u. a., Clin. Chem., 34 : 1720-25 (1988); siehe auch US-Patent Nr. 4,748,129. Dieses Verfahren wird insbesondere bei der Blutgruppenbestimmung oder beim Nachweis von Antikörpern gegen Blutgruppenantigene verwendet. Erythrozytenmembranen werden mit Fluorochromen markiert, und das Vorliegen von Antikörpern oder Antigenen wird anschließend aus Schwankungen des Fluoreszenzsignals (Nachweis mittels Lichtwellenleitersonde) aufgrund der Agglutination der Erythrozyten bestimmt. Mit diesem System lassen sich nur qualitative oder im günstigsten Fall semiquantitative Ergebnisse bezüglich des Vorliegens bzw. Fehlens von interessierenden Antigenen oder Antikörpern erzielen. Wird der Assay für die Messung des Vorliegens von Antikörpern im Plasma verwendet, so entfernt man die Erythrozyten in der Blutprobe durch Zugabe kolloidaler Magnetitteilchen und setzt die Probe einem Magnetfeld aus.
In der Diagnostik will man häufig eine interessierende Subpopulation von Zellen oder eine interessierende Untergruppe von einer Zellmischpopulation aussortieren und für weitere Untersuchungen abtrennen. Die Affinitätstrennung von Zellen mit proteinbeschichteten magnetischen Teilchen ist bekannt. Verschiedene Verfahren für das Sortieren biologischer Populationen mittels magnetischer Affinitätstrennung sind in der Patentliteratur und anderswo beschrieben worden; siehe z. B. die US-Patente 3,970,518, 4,710,472, 4,677,067, 4,666,595, 4,230,685, 4,219,411, 4,157,323; siehe auch E. T. Menz u. a., Am. Biotech. Lab. (1986); J. S. Kemshead u. a., Molec. Cell. Biochem., 67 : 11-18 (1985); T. Leivestad u. a., Tissue Antigens, 28 : 46-52 (1986); und J. S. Berman u. a., J. Immunol., 138 : 2100-03 (1987). Bei der Durchführung solcher Verfahren wird üblicherweise ein Bindungsmolekül (z. B. monoklonaler Antikörper) mit den magnetischen Teilchen konjugiert und unter Bedingungen, die zur Bindung an eine charakteristische Determinante des interessierenden Analyten führen, zu einer Probe gegeben, wonach man die Probe einem Magnetfeld aussetzt; siehe zum Beispiel die von Leivestad u. a., oben, beschriebene immunmagnetische Trenntechnik. Die magnetischen Teilchen und der an ihnen befindliche Analyt können dann vom Rest der Population abgetrennt werden.
Bei klinischen Immungssays für Diagnosezwecke wurde für lösliche Analyten die Verwendung der magnetischen Affinitätstrennung berichtet, und zwar unter Verwendung eines Radioisotops (siehe zum Beispiel Rattle u. a., Clin. Chem., 30 : 1457-61 (1984)) oder von fluoreszierenden Molekülen (siehe zum Beispiel Moscoso u. a., Clin. Chem., 34 : 902-05 (1988); R. D. Nargessi u. a., J. Immunol. Meth., 71 : 17-24 (1984); und Kamel u. a., Clin. Chem. 26 : 1281-84 (1980)) als Reportersubstanz. Die Verwendung dieser Technik für die Abtrennung gewisser Lymphozytensubpopulationen von Knochenmarkzellen vor der Transplantation und um Abstoßungsreaktionen nach der Transplantation auszuschließen, wurde ebenfalls berichtet; siehe A. Butturini u. a., Prog. Bone Marrow Transpl. 413-22 (1987). Zu weiteren Anwendungen dieser Technik, über die berichtet wurde, zählt die Abtrennung von Tumorzellen (siehe: Kemshead u. a., B. J. Cancer 54: 771-78 (1986)) und die Abtrennung von Lymphozytensubpopulationen für die anschließende funktionelle Auswertung (Berman u. a., oben).
Über die Anwendung der magnetischen Affinitätszelltrennung auf die Quantifizierung von Lymphozytenuntergruppen in Blut wurde bei J. Brinchmann, Clin. Exp. Immunol., 71 : 182-86 (1988) berichtet. Bei diesem Verfahren wurden Blutproben mit superparamagnetischen Polymer-Mikrokügelchen, die mit für bestimmte Lymphozytensubpopulationen spezifischen monoklonalen Antikörpern beschichtet waren, inkubiert. Die an die Mikrokügelchen gebundenen Zellen wurden vom Rest der Population durch Anlegen eines Magnetfelds an die Probe isoliert. Die abgetrennten Zellen wurden anschließend lysiert, um sie von den Mikrokügelchen abzulösen, die Mikrokügelchen und die daran haftenden Zellmembranen wurden magnetisch entfernt, und die erhaltenen Zellkerne wurden gefärbt und manuell mit einem Fluoreszenzmikroskop und einer Zählkammer gezählt. Die Anzahl der gezählten Kerne entsprach der Anzahl Zellen in der Probe in der interessierenden Subpopulation. Obwohl dieses Verfahren zur zahlenmäßigen Bestimmung der Zellen in einer interessierenden Subpopulation verwendet werden kann, ist die manuelle zahlenmäßige Bestimmung der Zellkerne sehr zeitaufwendig, und beim Auftragen der Probe in die Zählkammer und beim Zählen entstehen leicht technische Fehler. Solch eine Vorgehensweise würde sich für die klinische Verwendung nicht eignen.
Es besteht daher ein Bedarf für verbesserte Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens bzw. der Menge bestimmter Untergruppen und Subpopulationen von Zellen in einer Zellmischpopulation, wie dies Vollblut darstellt. Die Eigenschaften solcher verbesserter Verfahren sollten folgendes beinhalten: eine im Vergleich zu bisher verfügbaren Verfahren gleich hohe oder höhere Empfindlichkeit, die Fähigkeit, eine Vielzahl von Proben in einer relativ kurzen Zeit zu untersuchen, sowie kein Bedarf an teuren Geräten und spezialisierten Fachkräften, um das Verfahren durchzuführen.
In AU-A-22948/88 (Veröffentlichungsnummer 621310) (Sanofi) ist ein Verfahren für den immunometrischen Assay der Oberflächenantigene einer Zellpopulation oder -subpopulation beschrieben und beansprucht, zum Beispiel von einem oder mehreren Oberflächenantigenen der gebildeten Bestandteile menschlichen Bluts, das die folgenden Schritte umfaßt:
a) Immobilisieren der Zellpopulation, die das zu bestimmende Antigen trägt, oder einer Zellpopulation mit der das zu bestimmende Antigen tragenden Subpopulation an einem festen Träger durch Verwendung eines oder mehrerer monoklonaler Antikörper, die zuvor an diesem Träger durch kovalente Bindung oder physikalische Adsorption angebracht wurden und fähig sind, ein auf der Zelloberfläche befindliches Antigen, bei dem es sich nicht um das zu bestimmende Antigen handelt, zu erkennen, und in ein und demselben Schritt direktes Markieren der zu bestimmenden Zellpopulation oder -subpopulation mit mindestens einem für das zu bestimmende Antigen spezifischen monoklonalen Antikörper, wobei dieser Antikörper eine Radioisotopensonde oder Enzymsonde trägt,
b) Verstreichenlassen einer Inkubationszeit,
c) Waschen des Trägers, um die nichtimmobilisierten Zellen und den überschüssigen Antikörper zu entfernen,
d) wenn der Antikörper eine Enzymsonde trägt, Zugeben des bzw. der für die Entwicklung der Enzymaktivität erforderlichen Reagens bzw. Reagenzien (Substrat und Chromogen), sowie
e) Ablesen der Ergebnisse entweder durch Zählen der Radioaktivität oder durch Messen der Lichtsignale (Färbung oder Fluoreszenz), gegebenenfalls unter Bezugnahme auf einen Standardbereich. Aus diesem Dokument ist auch ein Kit zum Durchführen des Verfahrens bekannt.
Aus unserer gleichzeitig anhängigen US- Patentanmeldung mit der Seriennummer 345,436, von der die Europäische Patentanmeldung Nr. 90908868.4 (Veröffentlichungsnummer 0,471,792) Priorität beansprucht, sind mehrere Verfahren für die Bestimmung von Subpopulationen von Analyten innerhalb einer solchen Analyte enthaltenden Population bekannt. Die Verfahren, Reagenzien und Testkits dieser Erfindung erleichtern das Screenen auf Zellen, Viren usw. durch Koppeln einer nachweisbaren Reportersubstanz an die Biomembran, vorzugsweise durch stabile Assoziation mit der Lipidkomponente der Biomembran, und anschließendes Trennen des interessierenden Analyten, z. B. durch an eine Festphase gebundene spezifische Bindungssubstanzen, sowie Nachweisen der Reportersubstanz. Die in der Erfindung der US-Anmeldung mit der Seriennummer 345,436 verwendeten Reagenzien, die genauer in unserer gleichzeitig anhängigen US- Anmeldung mit der Seriennummer 189,192 beschrieben sind, von der die Europäische Patentanmeldung Nr. 89908564.1 (Veröffentlichungsnummer 0,430,968) Priorität beansprucht, weisen im Vergleich zum Stand der Technik insofern einen deutlichen Vorteil auf, als sie nachweisbare Reportersubstanzen umfassen, die mit der Lipidkomponente einer Biomembran eine stabile Assoziation eingehen können. Biomembranhaltige Analyten können daher mit der nachweisbaren Reportersubstanz markiert werden, ohne daß man sich auf spezifische Interaktionen zwischen Rezeptor und Ligand stützen muß. Da die nachweisbare Reportersubstanz in einer stabilen Assoziation mit der Biomembran vorliegt, werden außerdem Probleme bezüglich eines Austretens der Reportersubstanz bzw. andere Reportersubstanzverluste vermieden.
Obwohl die Biomembranmarkierungsmethoden der Anmeldung mit der Seriennummer 345,436 im Vergleich zu früheren Verfahren viele Vorteile aufweisen und für Nachweis und Sortierung vieler unterschiedlicher Analytarten breite Anwendung finden, sind sie bei bestimmten wichtigen klinischen Anwendungen, wie dem Nachweis und der Quantifizierung bestimmter Zellsubpopulationen in Vollblut nur beschränkt anwendbar. Bei dem in der Anmeldung mit der Seriennummer 345,436 beschriebenen Assaysystem werden alle Zellen in einer Probe oder einer abgetrennten Fraktion einer Blutprobe markiert und der interessierende Analyt (z. B. die Untergruppe der Helfer-T-Lymphozyten) wird dann mit Hilfe einer selektiven Abtrennung isoliert. Eine typische Blutprobe enthält jedoch rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen (Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten) sowie Blutplättchen, die alle nach dem beschriebenen Verfahren markiert werden. Wird mit einer Verbindung der in der Anmeldung mit der Seriennummer 345,436 beschriebenen Klasse markiert, so ist ein Großteil des Signals auch in solchen Zellen vorhanden, bei denen es sich nicht um Lymphozyten handelt. Das dadurch auftretende Problem besteht darin, daß eine geringe Verunreinigung der abgetrennten Fraktion durch Nicht-Lymphozyten wesentlich zum Hintergrundsignal beitragen kann. Dieser Hintergrund kann gleich groß oder größer als das Signal der interessierenden spezifischen Lymphozytenuntergruppe sein, insbesondere bei einer Krankheit wie Acquired Immunodeficiency Syndrom (AIDS), die durch eine verringerte Anzahl einer bestimmten Lymphozytenuntergruppe gekennzeichnet ist. Obwohl das Assaysystem der Anmeldung mit der Seriennummer 345,436 bei bestimmten Anwendungen im Vergleich zu Durchflußzytometriemethoden Vorteile aufweist, da es fähig ist, Proben ohne die für die Durchflußzytometrie erforderliche komplizierte Apparatur und technische Betreuung diskontinuierlich zu messen, ist ihre Anwendbarkeit daher bei Nachweis und Quantifizierung von kleineren Komponenten einer komplexen biologischen Flüssigkeit wie Vollblut beschränkt.
Weiterführende Ansätze, um Empfindlichkeit und Selektivität unserer zuvor beschriebenen Assaysysteme zu verbessern und sie für die klinische und diagnostische Analyse von interessierenden Zelluntergruppen in einer relativ komplexen Zellpopulation verwendbar zu machen, führten zur Entwicklung der vorliegenden Erfindung.

Zusammenfassung der Erfindung

Nach einem Aspekt der Erfindung wird das Vorliegen bzw. die Menge einer ausgewählten Untergruppe von Zellen, die Bestandteil einer Subpopulation einer Zellmischpopulation ist, durch ein Verfahren bestimmt, in der eine nachweisbare Reportersubstanz einheitlich in im wesentlichen alle Zellen der die interessierende Untergruppe enthaltenden Subpopulation eingebracht wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die nachweisbare Reportersubstanz in die Zellsubpopulation dadurch eingebracht, daß man sie ohne die anschließenden spezifischen Bindungsreaktionen des Verfahrens zu stören mit der Oberfläche dieser Zellen koppelt. Eine Probe der Zellmischpopulation, die die markierte Subpopulation enthält, wird dann mit einer spezifischen Bindungssubstanz, die selektiv mit charakteristischen Determinanten der interessierenden Zelluntergruppe selektiv bindet, inkubiert, wodurch ein Komplex dieser Zellen und der spezifischen Bindungssubstanz gebildet wird. Die Komplexe werden anschließend von den Zellmischpopulationen abgetrennt, wodurch man zwei Fraktionen erhält, und das Vorhandensein der Reportersubstanz in einer der abgetrennten Fraktionen wird nachgewiesen. Üblicherweise wird die Menge an nachgewiesener Reportersubstanz mit einem vorbestimmten Standard in Beziehung gesetzt, um das Vorliegen bzw. die Menge der interessierenden Untergruppe in der Zellpopulation zu bestimmen.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens bzw. der Menge von zwei oder mehreren ausgewählten Zelluntergruppen in einer Population von Zellen, die eine Subpopulation enthält, welche die verschiedenen interessierenden Untergruppen enthält, bereitgestellt. Eine nachweisbare Reportersubstanz wird in im wesentlichen alle Zellen der Subpopulation, die die Vielzahl von Untergruppen enthält, einheitlich eingebracht. Eine erste Probe der Zellmischpopulation, die die markierte Subpopulation enthält, wird dann mit einem Reagens, das spezifische Bindungssubstanzen enthält, die selektiv an charakteristische Determinanten der Subpopulation binden, inkubiert, was zur Bildung eines Komplexes der Zellen der Subpopulation und der spezifischen Bindungssubstanzen führt. Dieser Komplex, der die gesamte markierte Subpopulation beinhaltet, wird dann von der Zellmischpopulation abgetrennt und das Vorhandensein der Reportersubstanz in der abgetrennten Fraktion wird nachgewiesen.
Anschließend wird eine zweite Probe der die markierte Subpopulation enthaltenden Zellmischpopulation, die bezüglich Volumen und Zellkonzentration der ersten Probe entspricht, mit einem zweiten Reagens, das eine spezifische Bindungssubstanz enthält, die an charakteristische Determinanten einer interessierenden Untergruppe in der Subpopulation bindet, inkubiert. Nach Abtrennen des so gebildeten Komplexes wird das Vorhandensein der Reportersubstanz in der zweiten abgetrennten Fraktion nachgewiesen. Das relative Verhältnis von Zellen der Untergruppe zu Zellen der gesamten Subpopulation wird durch einen Vergleich der in dem zweiten Komplex nachgewiesenen Reportermenge mit der in dem ersten Komplex nachgewiesenen Menge bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform läßt sich eine Zellsubpopulation auf das Vorliegen bzw. die Menge mehrerer interessierender Untergruppen untersuchen. Die Menge an nachgewiesener Reportersubstanz in jeder Probe läßt sich mit einem oder mehreren vorbestimmten Standards in Beziehung setzen, um das Vorliegen bzw. die Menge der interessierenden Untergruppen in der Zellpopulation zu bestimmen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die markierte Subpopulation untersucht, um das Verhältnis jeder der mehreren Untergruppen in der Subpopulation dadurch zu bestimmen, daß man die Menge der mit jedem Komplex assoziierten Reportersubstanz im Vergleich zu der Menge der mit der gesamten Subpopulation assoziierten Reportersubstanz quantifiziert.
Gemäß weiteren erfindungsgemäßen Aspekten werden Testkits für die Durchführung der oben beschriebenen Verfahren bereitgestellt. Die Testkits können je nach der Art der zu bestimmenden Zellen verschiedene Bestandteile beinhalten. Üblicherweise enthalten die Testkits die in die ausgewählte Subpopulation einzubringende nachweisbare Reportersubstanz und die spezifischen Bindungssubstanzen für die selektive Interaktion mit charakteristischen Determinanten der interessierenden Zelluntergruppen. Die Testkits können andere Bestandteile wie einen oder mehrere Standards zur Bestimmung des Vorliegens bzw. der Menge der interessierenden Untergruppen in der Probe, Anweisungen für die Herstellung eines solchen bzw. solcher Standards und gegebenenfalls weitere Extras, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zweckdienlich sind, enthalten.
Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich zusätzlich und in gewissen Fällen statt der oben angegebenen zur Zeit in klinischen Laboratorien verwendeten Analysetechniken, die dem Screening auf Veränderungen der Zellfrequenz dienen, z. B. Durchflußzytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie, verwenden. In den hier beschriebenen Verfahren ist die mit der Bulk-Analyse (z. B. Enzymimmungssay) einhergehende Schnelligkeit mit der Verwendung einer Multiparametermessung, die zuvor auf die durchflußzytometrische Analyse beschränkt war, vereinigt. Außerdem machen die erfindungsgemäßen Verfahren die komplizierte teure Apparatur sowie die hohen Anforderungen an geschultes Personal, die bei den Techniken des Stands der Technik erforderlich sind, überflüssig.
Die erfindungsgemäßen Verfahren weisen im Vergleich zum Stand der Technik mindestens zwei bedeutende Vorteile auf. Erstens läßt sich die interessierende Zelluntergruppe im klinischen Kontext aus Vollblut ohne Zwischenschritte quantitativ bestimmen. Bei anderen Verfahren zur Bestimmung der absoluten Zellkonzentration in einer interessierenden Untergruppe werden zwei oder mehr unterschiedliche Messungen verwendet, um zu dem interessierenden Wert zu gelangen. Zum Beispiel wird bei der Durchflußzytometrie die Lymphozytenzahl in einer Untergruppe proportional und nicht absolut bestimmt. Um zu der absoluten Konzentration einer interessierenden Untergruppe (z. B. CD4-Lymphozyten) in Blut zu gelangen, muß folgende Rechnung angestellt werden:
Anzahl CD4-Lymphozyten pro Liter Blut = (% CD4- Lymphozyten) x (% Lymphozyten in weißen Blutkörperchen) x (Anzahl weiße Blutkörperchen pro Liter Blut)
Bei solch einer Analyse werden drei Meßschritte vorgenommen: Durchflußzytometrie, weißes Blutbild sowie weißes Differentialblutbild. Typischerweise wird die durchflußzytometrische Analyse in einem immunologischen Labor durchgeführt, während weißes Blutbild und weißes Differentialblutbild in einem hämatologischen Labor durchgeführt werden. Diese unterschiedlichen Laboratorien können sich entweder in der gleichen Institution oder in unterschiedlichen Institutionen befinden. Es müssen jedoch die Daten beider Laboratorien zusammengestellt werden, um die Ergebnisse zu erhalten, die an den Kliniker weitergeleitet werden.
Zum Beispiel beruht die Entscheidung, ob bei AIDS-Patienten mit der Azidothymidin (AZT)-Therapie begonnen werden soll, auf einer Bestimmung der Anzahl von CD4-Lymphozyten pro Liter Blut des Patienten. Fällt diese Zahl unter 0,500 · 10&sup9; CD4-Zellen pro Liter, so wird die AZT-Therapie empfohlen; siehe State-of-the-Art conference on Azidothymidine Therapy for Early HIV Infection, Am. J. Medicine, 89 : 335-44 (Sept. 1990). Da bei der durchflußzytometrischen Analyse die oben beschriebenen Berechnungen durchgeführt werden müssen, führt jegliche Änderung der Lymphozytenfraktion im Blut zu einem Fehler der berechneten CD4- Lymphozytenkonzentration. Die Neutrophilen, die typischerweise die Hälfte oder mehr der weißen Blutkörperchen darstellen, sind empfindlich und können während der Probenaufbewahrung bzw. des Probentransports in das klinische Laboratorium zerstört werden. Eine Verringerung der Neutrophilenfraktion in den weißen Blutkörperchen würde zu einem gleichzeitigen Anstieg der gemessenen Lymphozytenfraktion und daher eine potentiell fehlerbehafteten Messung der CD4- Lymphozyten pro Liter Blut führen. Solch ein Ergebnis könnte dazu führen, daß der Arzt eine AZT-Therapie ablehnt, obwohl der Patient in Wirklichkeit damit behandelt werden sollte.
Zweitens stellen die erfindungsgemäßen Verfahren einen Bulk-Assay für die selektive Quantifizierung von interessierenden Untergruppen in einer gegebenen biologischen Flüssigkeit bereit. In einer heterogenen Population wie Vollblut wird die interessierende Untergruppe durch die Kombination der selektiven Markierung mit der Reportersubstanz und der selektiven Immunaffinitätstrennung bestimmt. Die vorbekannten Bulk-Analyseverfahren weisen keinen solchen Vorteil auf.
Die weiteren Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich für den Fachmann bei Betrachtung der Zeichnungen im Zusammenhang mit der folgenden genauen Beschreibung der Erfindung.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1. Hier wird mittels durchflußzytometrischer Analyse das Immunfluoreszenzfärbemuster von Zellen gezeigt, die mit CD45 (Klon 2D1, Becton- Dickinson), wodurch Monozyten und Lymphozyten ähnlich intensiv markiert werden, markiert sind. Auf der x- Achse ist die logarithmische Funktion der Fluoresceinfluoreszenz und auf der y-Achse die logarithmische Phycoerythrinfluoreszenz aufgetragen.
Fig. 2. Hier wird mittels durchflußzytometrischer Analyse das Immunfluoreszenzfärbemuster von Zellen gezeigt, die mit CD45 (Klon ALB12, AMAC, Inc.), wodurch Monozyten wesentlich weniger intensiv markiert werden als Lymphozyten, markiert sind. Auf der x-Achse ist die logarithmische Funktion der Fluoresceinfluoreszenz und auf der y-Achse die logarithmische Phycoerythrinfluoreszenz aufgetragen.
Fig. 3. Zellstandardkurve. Eine Standardkurve, in der die Fluoreszenzintensität gegen die Anzahl an CD4-Lymphozyten aufgetragen wurde, wurde wie im vorliegenden Text beschrieben erstellt. Auf der X-Achse ist die Anzahl der CD4-Lymphozyten/Kubikmillimeter und auf der Y-Achse die Fluoreszenzintensität aufgetragen.
Fig. 4. Standardkurve von Biotinmarkierten Perlen. Eine Standardkurve, in der die Fluoreszenz gegen den Prozentsatz biotinmarkierter Perlen aufgetragen wurde, wurde wie im vorliegenden Text beschrieben erstellt. Auf der X-Achse ist der Prozentsatz der biotinmarkierten Perlen in der Gesamtperlenpopulation und auf der Y-Achse die Fluoreszenzintensität aufgetragen.
Fig. 5. Korrelation zwischen den mittels Immunaffinitätstrennung und mittels Durchflußzytometrie gemessenen Lymphozyten in Prozent für die Lymphozytenanalyse. Auf der X-Achse sind die mittels Durchflußzytometrie gemessenen Lymphozyten in Prozent und auf der Y-Achse die mittels Immunaffinitätstrennung gemessenen Lymphozyten in Prozent aufgetragen.
Fig. 6. Korrelation zwischen den mittels Immunaffinitätstrennung und mittels Durchflußzytometrie gemessenen Lymphozyten in Prozent für die Mononukleärenanalyse (Lymphozyten und Monozyten).
In den Fig. 5 und 6 sind auf der X-Achse die durchflußzytometrisch gemessenen Lymphozyten in Prozent und auf der Y-Achse die durch Immunaffinitätstrennung gemessenen Lymphozyten in Prozent aufgetragen. Die markierten Lymphozyten wurden mit magnetischen Perlen mit den monoklonalen Antikörpern CD4 ( ), CD8 (+), CD2 ( ) bzw. CD19 (Δ) inkubiert.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren für die rationelle Bestimmung des Vorliegens bzw. der Menge von ausgewählten Untergruppen einer bestimmten Subpopulation von Zellen in einer Zellmischpopulation bereit. Anhand von Zellsuspensionen und -populationen, darunter Subpopulationen und Untergruppen, die eine charakteristische Determinante exprimieren, wird die Gesamtzellzahl in der interessierenden Untergruppe in einer Probezellsuspension oder das Verhältnis einer Zelluntergruppe in einer Zellsubpopulation bestimmt.
Der Ausdruck "Determinante" wird im vorliegenden Text im weiten Sinn zur Kennzeichnung eines Elements verwendet, das die Natur von etwas angibt oder bestimmt. In bezug auf die erfindungsgemäßen Verfahren bedeutet "Determinante" den Teil der Zellen, der an der selektiven Bindung an eine spezifische Bindungssubstanz beteiligt bzw. dafür verantwortlich ist und dessen Vorliegen erforderlich ist, damit eine selektive Bindung stattfinden kann. Die Trennung von Zellen mittels selektiver Interaktionen zwischen Zelldeterminanten und spezifischen Bindungssubstanzen (zum Beispiel einem Zelloberflächenantigen und dessen komplementärem Antikörper) wird im vorliegenden Text als "Affinitätstrennung" bezeichnet.
Zu den mit Zellen assoziierten Determinanten zählen zum Beispiel Zellmembranbestandteile wie membrangebundene Proteine oder Glycoproteine, darunter Zelloberflächenantigene der Wirtszelle oder viruellen Ursprungs, Histokompatibilitätsantigene oder Membranrezeptoren. Eine der Klassen von spezifischen Bindungssubstanzen, die für die selektive Interaktion mit diesen Determinanten verwendet wird, sind Antikörper, die fähig sind, letztere immunspezifisch zu erkennen. Im vorliegenden Zusammenhang beinhaltet der Ausdruck "Antikörper" monoklonale oder polyklonale Immunglobuline und immunreaktive Immunglobulinfragmente. Weitere Beispiele charakteristischer Determinanten und ihrer spezifischen Bindungssubstanzen sind Rezeptor - Hormon, Rezeptor - Ligand, Agonist - Antagonist, IgG-Fc - Rezeptor - Protein A, Avidin - Biotin, Virus - Rezeptor und Lectin - Rezeptor. Diese werden im vorliegenden Text gelegentlich als "spezifische Bindungspaare" bezeichnet.
Die interessierenden Zelluntergruppen können in Testmaterial oder Proben verschiedenen Ursprungs vorliegen, darunter in biologischen Flüssigkeiten wie Vollblut, Serum, Plasma, Harn, Rückenmarksflüssigkeit, Amnionflüssigkeit, Lavageflüssigkeiten und Gewebeextrakten.
Zu solchen interessierenden Zellen zählen Zellen menschlichen oder tierischen Ursprungs oder auch kultivierte Zellen. Von besonderem Interesse für diagnostische, therapeutische und forschungsmäßige Anwendungen sind Lymphozyten, darunter B-Zellen, T-Zellen und anerkannte C-Zellen-Untergruppen wie Helfer-T-Zellen oder Suppressor-/zytotoxische T-Zellen. Unterschiedliche Zellinien sind durch die Expression von charakteristischen Antigenen von Liganden charakterisiert. So exprimieren zum Beispiel Säugetierblut-B-Zellen Oberflächenliganden, die sich von denjenigen von T-Zellen aus der gleichen Probe exprimierten unterscheiden. Die Quantifizierung einer Zelluntergruppe der Probe kann bei der Beurteilung bestimmter pathologischer Zustände von Bedeutung sein. Zum Beispiel werden Personen, die mit dem Human Immunodeficiency Virus (HIV) infiziert sind, auf CD4- Glycoprotein tragende T-Helferzellen getestet, um das Krankheitsstadium zu bestimmen und die Behandlung zu verfolgen. Wie bereits oben erwähnt, ist es für die genaue Beurteilung des Krankheitszustands des Patienten wichtig, daß diese Zellen zum Probenahmezeitpunkt direkt gemessen werden. Als weiteres Beispiel kann ein abnormal großer Anteil eines einzelnen B-Zellklons im Blut eines Patienten das Vorliegen einer Leukämie anzeigen. Außerdem lassen sich Zellen der gleichen Linie in unterschiedlichen Differenzierungsstadien aufgrund der Expression von charakteristischen Antigenen oder Liganden unterscheiden. Zum Beispiel verändern sich bei der Entwicklung eines B-Lymphozyten von einer Stammzelle zu einer Prä-B-Zelle und schließlich zu einer reifen B-Zelle mit der Zellreifung die Zellmembranmarker auf vorhersagbare Weise. Eine reife B-Zelle exprimiert Immunglobuline als Liganden auf der Zellmembran, während eine Prä-B-Zelle nur die schweren Ketten von Zytoplasmaimmunglobulinen exprimiert, was die Basis für die unterschiedliche Reaktivität dieser Zelluntergruppen bildet und ihre anschließende Bestimmung gestattet. Die unterschiedliche Expression von Liganden kann weiterhin eine Basis für die Beurteilung der Pathogenese wie z. B. einer Virusinfektion bilden. Virusinfizierte Zellen können Virusmarker exprimieren, die in nichtinfizierten Zellen der Zellpopulation nicht vorkommen.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren zur Analyse von Zellpopulationen für interessierende Subpopulationen oder Untergruppen wird die Zellpopulation, die in ihrer natürlichen biologischen Flüssigkeit oder in einem geeigneten biologischen oder synthetischen Medium suspendiert ist, anfänglich mit einer nachweisbaren Reportersubstanz in Kontakt gebracht, die fähig ist, gleichmäßig in im wesentlichen alle Zellen einer ausgewählten Subpopulation eingebracht zu werden.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung liegt in Zellen unterschiedlicher Proben, in denen der Reporter "einheitlich eingebracht ist", eine gleichmäßige Reportermenge innerhalb der interessierenden Untergruppe vor. Obwohl in diesen Zellen gewisse Variationen bezüglich der in jede einzelne Zelle eingebrachten Reportermenge auftreten können, ist jegliche solche Variation zwischen interessierenden Untergruppen und zwischen interessierenden Proben (darunter pathologischer Proben) vorhersagbar. Es sei darauf hingewiesen, daß solch eine Variation möglicherweise nicht für alle pathologischen Proben vorhersagbar ist, zum Beispiel kann es vorkommen, daß Proben von Patienten mit einer bestimmten T-Zellen-Leukämie nicht gleichmäßig bei allen Proben mit T-zellselektiven Reportersubstanzen markiert sind. Die Variation zwischen den Proben müßte jedoch für interessierende pathologische Proben, wie denjenigen von AIDS-Patienten, vorhersagbar sein. Ein Reporter, der T-Lymphozyten einheitlich markierte, könnte daher die Untergruppe der Helfer-T-Zellen mit einer unterschiedlichen mittleren Intensität zu der Untergruppe der Suppressor-T-Zellen markieren; ist der Unterschied in der mittleren Intensität zwischen den Untergruppen zwischen den von unterschiedlichen Patienten gezogenen Proben jedoch einheitlich, so wäre der Reporter für die Ausübung der Erfindung geeignet. In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Kombination aus zwei oder mehr untergruppenspezifischen Reportersubstanzen verwendet werden, um eine einheitliche Markierung von interessierenden Untergruppen zu erreichen, wie dies im allgemeinen im vorliegenden Text und genauer in Beispiel 2 unten weiter beschrieben ist.
Mit dem Ausdruck "Reportersubstanz" wird im vorliegenden Text jegliche Substanz bezeichnet, deren Nachweis oder Messung, entweder direkt oder indirekt, auf physikalischem oder chemischem Weg, das Vorliegen der interessierenden Zellsubpopulation in der Probe anzeigt. Zu Beispielen von zweckdienlichen Reportersubstanzen zählen die folgenden, was jedoch keine Begrenzung darstellen soll: Moleküle oder Ionen, die direkt oder indirekt aufgrund der Lichtextinktions-, Fluoreszenz-, Reflexionsvermögens-, Lichtstreuungs-, Phosphoreszenz- oder Lumineszenzeigenschaften nachgewiesen werden können; Moleküle oder Ionen, die aufgrund ihrer radioaktiven Eigenschaften nachgewiesen werden können; sowie Moleküle oder Ionen, die aufgrund ihrer kernmagnetischen Resonanz oder ihrer paramagnetischen Eigenschaften nachgewiesen werden können. Zur Gruppe der Moleküle, die indirekt aufgrund von Lichtextinktion oder Fluoreszenz nachgewiesen werden können, zählen zum Beispiel verschiedene Enzyme, die geeignete Substrate z. B. von nicht lichtabsorbierenden in lichtabsorbierende Moleküle oder von nicht fluoreszierenden in fluoreszierende Moleküle umwandeln können. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die nachweisbare Reportersubstanz das Enzym beta- Galaktosidase, das häufig bei einem Assay verwendet wird, bei dem ein farbloses oder nicht fluoreszierendes Substrat in ein gefärbtes oder fluoreszierendes Produkt umgewandelt wird, das dann aufgrund des Spektrums quantifiziert werden kann.
Die Reportersubstanz läßt sich in Zellen einer ausgewählten Subpopulation gleichmäßig dadurch einbringen, daß man sie an die Oberfläche dieser Zellen koppelt oder dadurch, daß sie in diese Zellen eindringt und darin verbleibt. Besteht die Einbringungsmethode darin, daß man sie an die Zelloberfläche koppelt, so darf diese Kopplung nicht die anschließenden Bindungsschritte des Verfahrens stören.
Die nachweisbare Reportersubstanz kann auf unterschiedliche Weise an die Zelloberfläche gekoppelt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Reportersubstanz an einen Antikörper gebunden, der wiederum selektiv an mindestens eine Determinante der Zellen einer ausgewählten Subpopulation bindet, wobei die Kopplung durch eine immunologische Interaktion zwischen der Zelloberflächendeterminante und dem Antikörper erzielt wird. Äußerst vorteilhaft werden in dieser Ausführungsform monoklonale Antikörper gegen bestimmte Zelloberflächendeterminanten verwendet. Zum Beispiel lassen sich Lymphozyten, die eine Vollblut- Subpopulation umfassen, einheitlich mit einer an einen monoklonalen Antikörper gebundenen Reportersubstanz markieren, wobei dieser monoklonale Antikörper gegen ein Leukozytenoberflächenantigen gerichtet ist. Das CD45-Antigen wird einheitlich an allen Lymphozyten exprimiert; das CD45-Antigen wird jedoch auch an Monozyten exprimiert. Sollen daher Lymphozyten selektiv markiert werden, muß man einen monoklonalen CD45-Antikörper wählen, der an wesentlich mehr Bindungsstellen pro Zelle an Lymphozyten als an Monozyten bindet. Das Screening auf monoklonale CD45- Antikörper mit den erwünschten Eigenschaften läßt sich mit fachbekannten Verfahren, z. B. Durchflußzytometrie, durchführen, wie dies in Fig. 1 und 2 gezeigt und im vorliegenden Text in Beispiel 1 beschrieben ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sollen nur T-Lymphozyten innerhalb einer Vollblutprobe markiert werden. Dies läßt sich wie oben beschrieben durchführen, und zwar dadurch, daß man gegen T- Zelloberflächenantigene wie die Antigene CD2, CD5, CD7 und CD3 oder eine beliebige Kombination davon gerichtete Antikörper verwendet, um zu einer einheitlichen Markierung der T-Lymphozytensubpopulation zu gelangen.
In der oben beschriebenen Ausführungsform läßt sich die ausgewählte Reportersubstanz nach fachbekannten Verfahren direkt kovalent an den Antikörper binden. Eine andere Strategie besteht darin, daß man die Reportersubstanz mittels eines zusätzlichen spezifischen Molekülbindungspaars indirekt an den Antikörper bindet. Eines dieser Bindungspaare besteht aus Avidin und Biotin. In der Praxis kann der Antikörper an Biotin und die spezifische Bindungssubstanz an Avidin vorgebunden sein. Verfahren zur Durchführung beider Bindungen sind in der Literatur beschrieben, und bestimmte biotinmarkierte Antikörper und an Avidin gebundene Enzyme sind im Handel erhältlich. Die Kopplung der Reportersubstanz gelingt also aufgrund einer immunologischen Interaktion zwischen dem biotinmarkierten Antikörper und dem Zelloberflächenantigen in Kombination mit einer Biotin- Avidin-Interaktion mit der an Avidin gebundenen Reportersubstanz.
Die Bestimmung des Vorliegens bzw. der Menge von Zelluntergruppen nach den erfindungsgemäßen Verfahren gelingt aufgrund der selektiven Interaktion zwischen Zellen der interessierenden Untergruppe und einer spezifischen Bindungssubstanz. Die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendete spezifische Bindungssubstanz muß die charakteristische Zelldeterminante selektiv erkennen können. Zum Beispiel kann bei der Untersuchung einer Zellmischpopulation auf eine Subpopulation und/oder eine Untergruppe mit einem charakteristischen Zelloberflächenantigen die Bindungssubstanz der komplementäre Antikörper sein, der das interessierende Antigen immunspezifisch erkennt. Aufgrund solch einer selektiven Erkennung vermag die spezifische Bindungssubstanz eine selektive Interaktion einzugehen und mit der interessierenden Untergruppe unter Bildung von Komplexen oder Aggregaten, die physikalisch oder chemisch von dem Testmedium und anderen darin befindlichen Komponenten, die nicht von Interesse sind, getrennt sind, zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Blutproben, die T- Lymphozyten und Monozyten mit dem Oberflächenantigen CD4 enthalten, mit einer spezifischen Bindungssubstanz, die einen monoklonalen CD4-Antikörper umfaßt, in Kontakt gebracht.
Die spezifischen Bindungssubstanzen sind zweckmäßig an einer Festphase oder unlöslichen Flüssigphase fixiert, um die Abtrennung vom Testmedium zu erleichtern. Verfahren für die Immobilisierung von Antikörpern auf einem festen Träger, z. B. Polystyrol, Nylon oder Agaroseperlen, sind dem Fachmann gut bekannt. Zu geeigneten Techniken zählen Vernetzung, kovalente Bindung oder physikalische Absorption. Man kann jedoch auch eine Nichtfestphase als primäre spezifische Bindungssubstanz gemeinsam mit einer zweiten spezifischen Bindungssubstanz bzw. spezifischen Hilfsbindungssubstanz, die fähig ist, mit der primären spezifischen Bindungssubstanz eine selektive Interaktion einzugehen und die an einer Festphase fixiert ist, verwenden. Typische primäre spezifische Bindungssubstanzen und spezifische Hilfsbindungssubstanzen, die sich für diesen Zweck eignen, sind: löslicher Maus-Antikörper/an einer Festphase fixiertes Protein A; löslicher Maus-Antikörper/in einer unterschiedlichen Art erzeugtes und an einer Festphase fixiertes Anti-Maus-Immunglobulin; biotinmarkierter Antikörper/an einer Festphase fixiertes Avidin.
Es sei darauf hingewiesen, daß bei Verwendung von monoklonalen Antikörpern sowohl bei der nachweisbaren Reportersubstanz als auch bei der spezifischen Bindungssubstanz der Verwendung von Anti- Maus-Immunglobulinen als Hilfsbindungssubstanz bei dem oben beschriebenen Verfahren möglicherweise Grenzen gesetzt sind, und zwar aufgrund der Kreuzreaktivität zwischen dem Anti-Maus-Immunglobulin und den beiden primären Maus-Antikörpern. Wird auch bei dem Reportersystem ein als Hilfe dienender Antikörper verwendet, so trifft diese Beschränkung ebenfalls zu. Diese Beschränkung läßt sich dadurch umgehen, daß man als Hilfe einen Antikörper verwendet, der nur für eine Maus-IgG-Unterklasse (z. B. IgGI, IgG2a, IgG3) spezifisch ist und daher, solange bei dem Reportersystem und spezifischen Bindungssystem Antikörper unterschiedlicher Unterklassen verwendet werden, mit nur einem monoklonalen Antikörper in dem Assay reagiert. So kann zum Beispiel die spezifische Bindungssubstanz einen monoklonalen CD4-Antikörper der Unterklasse IgG2b, der über Anti-Maus-IgG2b an eine Festphase gebunden ist, umfassen. Die Reportersubstanz könnte daher monoklonale Anti-T-Zell-Antikörper der Unterklasse IgG1 umfassen.
Man kann jedoch entweder bei der Reportersubstanz oder der spezifischen Bindungssubstanz monoklonale Antikörper aus der Ratte statt monoklonalen Antikörpern aus der Maus verwenden. Die spezifische Bindungssubstanz kann daher einen monoklonalen CD4- Antikörper aus der Maus, der über ein Anti-Maus-IgG, das mit Ratten-IgG keine Kreuzreaktion eingeht, an eine Festphase gebunden sein. Die Reportersubstanz würde dann in Ratten hergestellte monoklonale Antikörper gegen T-Zellen umfassen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die spezifische Bindungssubstanz an einer magnetischen Festphase fixiert, die ferromagnetisches, paramagnetisches oder diamagnetisches Material umfassen kann, wodurch mit dem interessierenden Analyten Komplexe oder Aggregate gebildet werden, die von dem Testmedium magnetisch abtrennbar sind. Geeignete Vorgehensweisen für die Kopplung von spezifischen Bindungssubstanzen an eine magnetische Festphase, z. B. Magnetitpartikel, sind in der Literatur beschrieben; siehe zum Beispiel E. Menz u. a., Am. Biotech. Lab. (1986).
Nach der Abtrennung der interessierenden Zelluntergruppe aus dem Testmedium stellt der Nachweis der Reportersubstanz eine Basis für die Bestimmung des Vorliegens von Interaktion zwischen den Zellen der interessierenden Untergruppe und der spezifischen Bindungssubstanz dar. Die Reportersubstanz läßt sich in der abgetrennten Fraktion, d. h. in den Komplexen aus Zelluntergruppen und spezifischer Bindungssubstanz, oder in dem nach der Abtrennung verbleibenden Testmedium, das im wesentlichen frei von solchen Komplexen ist, nachweisen. Die zuerst genannte Vorgehensweise ist bevorzugt.
Die Menge an in der abgetrennten Fraktion oder in dem verbleibenden Testmedium nachgewiesener Reportersubstanz läßt sich mit einem zuvor bestimmten Standard korrelieren. Solch eine Korrelation mit einem Standard kann für den qualitativen oder quantitativen Nachweis verwendet werden. Bei der qualitativen Bestimmung kann es sich bei dem zuvor bestimmten Standard um eine Negativkontrolle handeln, von der bekannt ist, daß sie keine interessierende Untergruppe enthält. Ein Nachweis von Reportersubstanz in Mengen, die wesentlich den Hintergrund der Negativkontrolle überschreiten, zeigt das Vorhandensein von Zellen der interessierenden Untergruppe an. Bei der quantitativen Bestimmung wird die Menge an nachgewiesener Reportersubstanz mit der in z. B. einer oder mehreren zuvor gemessenen Mengen ähnlich markierter Zellen verglichen, um die absolute Menge der Zelluntergruppe in der Probe zu bestimmen.
Bei quantitativen Bestimmungen wird üblicherweise eine Standardkurve hergestellt, die steigende bekannte Mengen von mit Reportersubstanz markierten Zellen enthält. Diese bekannten Zellmengen werden gegen die Menge der nachgewiesenen Reportersubstanz aufgetragen. Aufgrund der Standardkurve läßt sich die Menge der eine bestimmte Untergruppe enthaltenden Zellen in einer Probe von der Menge der darin nachgewiesenen Reportersubstanz ableiten.
Da am quantitativen Nachweis variable Parameter wie temperaturabhängige Enzymaktivität und mittels Geräten durchgeführte Messungen beteiligt sind, die eventuell von einem Tag auf den anderen variieren können, muß die Zellstandardkurve gegen eine bekannte Menge der Reportersubstanz geeicht werden. Zu diesem Zweck kann man eine Standardmenge der Reportersubstanz an der für die Affinitätstrennung verwendeten Festphase fixieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Reporter an magnetisches oder paramagnetisches Material, z. B. Perlen oder Partikel, fixiert. Im Anschluß an die magnetische Trennung läßt sich die bekannte Menge der in der abgetrennten Fraktion vorliegenden Reportersubstanz messen. Durch Vergleich der Meßwerte der Zellstandardkurve mit dieser zuvor bestimmten Standardmenge der Reportersubstanz läßt sich die absolute Anzahl der Zellen in einer Probe berechnen. Außerdem ist dadurch, daß man die Reportersubstanz an der Festphase auf gleiche Weise anheftet, wie dies bei dem tatsächlichen Assay geschehen würde, die Reportersubstanz der gleichen unmittelbaren Umgebung ausgesetzt wie dies bei dem tatsächlichen Assay der Fall wäre, wodurch sich die Eichgenauigkeit erhöht.
Die Reportersubstanz läßt sich auf unterschiedliche Art nachweisen. Das Vorhandensein von mit Zellen eingebauter Reportersubstanz in einer der obengenannten abgetrennten Fraktionen des Testmediums läßt sich direkt durch automatische Messung der Zellen und des Mediums bestimmen. In einer bevorzugten Ausführungsform - wie oben beschrieben - umfaßt die nachweisbare Reportersubstanz ein Enzym, das auf ein farbloses oder nicht fluoreszierendes Substrat unter Bildung eines spektralanalytisch meßbaren Produkts einwirkt. Zum Beispiel spaltet beta-Galaktosidase ein nicht fluoreszierendes Galaktoseanalog (4- Methylumbelliferyl-beta-D-galactosid) unter Bildung von Galactose und einem fluoreszierenden Produkt (Methylumbelliferon). Um Probleme mit der sterischen Hinderung zu überwinden, kann es von Vorteil sein, die nachweisbare Reportersubstanz vor dem Nachweis aus dem Komplex zu entfernen. Dies läßt sich nach fachbekannten chemischen Spaltungsmethoden durchführen; siehe zum Beispiel Mouton u. a., Arch. Bioch. Biophys., 218 : 101- 108 (1982)
Das obige erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auf die Analyse einer in einer Zellmischpopulation vorliegenden Zellsubpopulation zur Bestimmung des anteilmäßigen Vorliegens mindestens einer interessierenden Zelluntergruppe innerhalb dieser Zellmischpopulation anwenden. Dieses Verfahren läßt sich beispielsweise auf die Bestimmung von Lymphozyten-, Monozyten- und Neutrophilen-Untergruppen einer Leukozytensubpopulation in einer Vollblut- Zellpopulation, auf T-Zellen und B-Zellen einer Lymphozyten-Subpopulation in einer Leukozytenpopulation oder auf Helfer-T-Zellen und Suppressor-T-Zellen einer T-Lymphozyten-Subpopulation in einer Lymphozytengesamtpopulation anwenden, was jedoch nicht als Beschränkung aufzufassen ist. Um das anteilmäßige Vorliegen einer Zelluntergruppe auf diese Weise zu bestimmen, muß die relative Zellzahl in den einzelnen interessierenden Untergruppen sowie die Zellgesamtzahl in der Subpopulation innerhalb der gleichen Probe oder einer Probe gleichen Volumens und gleicher Zellkonzentration bestimmt werden.
Zu diesem Zweck werden im wesentlichen alle Zellen einer Population mit der Subpopulation, von der vermutet wird, daß sie die interessierenden Untergruppen enthält, einheitlich mit einer oder mehreren nachweisbaren Reportersubstanzen markiert. Die gesamte Subpopulation wird durch Affinitätstrennung getrennt, indem man ein erstes Reagens, das mindestens eine spezifische Bindungssubstanz, die zur selektiven Interaktion mit einer charakteristischen Determinante der Zellsubpopulation fähig ist, umfaßt, verwendet. Dieses erste Reagens kann aus einer Mischung spezifischer Bindungssubstanzen bestehen, die jeweils an Determinanten der einzelnen interessierenden Untergruppen innerhalb der Zellsubpopulation binden, so daß im wesentlichen alle Zellen der Subpopulation an das erste Reagens gebunden werden. Zum Beispiel kann das erste Reagens eine Reihe monoklonaler Antikörper, die eine selektive Interaktion mit den charakteristischen Antigenen einer definierten Anzahl von Zelluntergruppen eingehen, beinhalten. Das erste Reagens wird mit einer ersten Populationsprobe unter Bedingungen inkubiert, die zur Bindung des ersten Reagens an Zellen der Subpopulation führen. Im Anschluß daran wird der gebildete Komplex von ungebundenen Zellen in der ersten Probe abgetrennt und das Vorhandensein von Reportersubstanz in dem abgetrennten Komplex wird nachgewiesen. Durch diese Vorgehensweise erhält man die relative oder absolute Zellzahl innerhalb der interessierenden Zellsubpopulation.
Hiernach wird eine zweite Probe der Zellpopulation, in die die nachweisbare Reportersubstanz wie oben beschrieben eingebracht worden ist und deren Volumen und Zellkonzentration denen der ersten Probe entsprechen, mit einem zweiten Reagens inkubiert, das ein oder mehrere spezifische Bindungssubstanzen, die selektiv an eine charakteristische Determinante einer interessierenden Zelluntergruppe binden, umfaßt. Der zweite so gebildete Komplex wird von ungebundenen Zellen in der zweiten Probe abgetrennt, und das Vorhandensein von Reportersubstanz in dem zweiten Komplex wird nachgewiesen.
Der Anteil der interessierenden Untergruppe an der Zellsubpopulation wird durch Quantifizierung der Menge der mit dem zweiten Komplex assoziierten Reportersubstanz im Vergleich zu der Menge der mit dem ersten Komplex assoziierten Reportersubstanz bestimmt. Im allgemeinen läßt sich das Ausmaß der nachgewiesenen Reportersubstanz in jeder interessierenden Subpopulation und/oder einzelnen Zelluntergruppe mit einem vorher bestimmten Standard wie oben beschrieben in Beziehung setzen, um das Vorliegen bzw. die Menge der interessierenden Zellsubpopulation und/oder Zelluntergruppe in der Analyseprobe zu bestimmen. Diese Bestimmung von anteilsgemäßen interessierenden Untergruppen wird bequem mit einem an einer Festphase fixierten Reagens durchgeführt, das vorteilhaft magnetisches Material umfaßt, um eine Abtrennung vom Testmedium zu erleichtern.
Enthält die Population zusätzliche interessierende Zelluntergruppen, so können zusätzliche Reagenzien für die Affinitätstrennung jeder der zusätzlichen interessierenden Untergruppen hergestellt werden. Die zusätzlichen Reagenzien werden mit zusätzlichen Proben der obengenannten Zellpopulation inkubiert, wobei jede Probe wiederum in Volumen und Zellkonzentration der ersten Probe entspricht. Dadurch, daß man die Reportersubstanz in den von jeder zusätzlichen Probe abgetrennten Komplexen nachweist, erhält man einen Hinweis auf das anteilsgemäße Vorhandensein der einzelnen interessierenden Untergruppen innerhalb jeder Probe. Die Bestimmung des anteilsgemäßen Vorhandenseins von Untergruppen in den zusätzlichen Proben wird somit wie oben für die Bestimmung der interessierenden Zelluntergruppe in der zweiten Probe beschrieben durchgeführt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich mit üblichen Behältern, darunter Proberöhrchen, Multiwell- Platten usw. durchführen. Detektoren für die genaue Messung der Menge der Reportersubstanz in einer Probe, wie Colorimeter, Spektralphotometer, Fluoreszenzspektralphotometer, Reflektometer, Flüssigkeitsszintillationszähler bzw. Gammazähler sind im Handel erhältlich.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung können zuvor gemessene Mengen der unterschiedlichen Reagenzien gemeinsam mit den zur Ausübung der erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Zusatzbestandteilen, darunter Verdünnungsmitteln, Spaltungsmitteln, festen Trägern für die Immobilisierung des Analyten, ein oder mehreren Standards oder Anleitungen für deren Herstellung bequem zu einem Testkit verpackt sein. Die Reagenzien, die das Testkit beinhaltet, können in unterschiedlichen Formen vorliegen. Die Reportersubstanz kann in Form einer Lösung gemeinsam mit einem geeigneten Verdünnungsmittel für das Einbringen des Reporters in die Zellen bereitgestellt sein. Die Reporterlösung kann in einem für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Behältnis bereitgestellt sein. Die Reportersubstanz kann jedoch auch trocken gemeinsam mit separaten Fläschchen Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel, mit denen der Reporter und/oder andere Reagenzien im Verlauf der Durchführung der Verfahren zu versetzen ist, verpackt sein. Die spezifische Bindungssubstanz wird vorzugsweise auf einem festen Träger immobilisiert bereitgestellt, wobei der feste Träger in einem geeigneten Puffer suspendiert, lyophilisiert oder getrocknet sein kann.
Als Alternativmethode zur Oberflächenkopplung beinhaltet ein weiterer Aspekt der Erfindung, daß die nachweisbare Reportersubstanz in Zellen eindringt und dort zurückgehalten wird. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die nachweisbare Reportersubstanz eine Verbindung, die in lebensfähige Zellen eindringen kann und von intrazellulären Enzymen hydrolisiert wird, wobei das Hydrolyseprodukt mittels Fluoreszenz nachgewiesen werden kann. Das nachweisbare Hydrolyseprodukt verbleibt während der Abtrennung der interessierenden Untergruppen innerhalb der Zellen und kann nach Extraktion aus abgetrennten Komplexen gemessen werden. Eine für diese Ausführung besonders nützliche Verbindung ist 2'-7-Bis(2-carboxyethyl)-5- (und-6)carboxyfluoresceinacetoxymethylester (BCECF-AM), welcher intrazellulär in 2',7'-Bis(carboxyethyl)-5-(und 6)carboxyfluorescein (BCECF) hydrolysiert wird. Zu weiteren nützlichen Verbindungen zählen:
1-[2-Amino-5-(6-carboxyindol-2-yl)-phenoxy]-2- (2'-amino-5'methylphenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäurepentaacetoxymethylester;
3-Acetoxy-5'(und 6')-acetoxymethoxycarbonyl-10- dimethylaminospiro[7H-benzo[c]xanthen-7,1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-on;
Fluoresceindiacetat und
5-(und -6)-Carboxyfluoresceindiacetat.
Bei diesem Aspekt der Erfindung umfaßt die ausgewählte Subpopulation daher alle lebensfähigen Zellen in einer Mischpopulation (z. B. Vollblut), die beträchtliche Mengen nicht lebensfähiger Zellen enthalten kann. Es ist jedoch zu bemerken, daß eine Vollblut- Subpopulation, die alle lebensfähigen Zellen umfaßt, mehrere unterschiedliche Zellarten, darunter Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten, beinhaltet. Ist die interessierende Zelluntergruppe eine bestimmte Art Lymphozyten, so scheint das für Affinitätstrennung mittels der spezifischen Bindungssubstanz ausgewählte Oberflächenantigen vorzugsweise nur an dieser bestimmten Zelluntergruppe auf. Ist dies nicht der Fall, so sind eventuell weitere Trennungsschritte wie in Beispiel 4 unten beschrieben erforderlich.
Die folgenden Beispiele dienen zur genaueren Beschreibung der Erfindung. Diese Beispiele dienen zur Veranschaulichung bestimmter Anwendungen der erfindungsgemäßen Verfahren und sind keinesfalls als erfindungsbegrenzend zu betrachten. Falls nicht anders angegeben, sind alle Lösungsmittel in Volumenanteilen und alle Temperaturen in ºC ausgedrückt.

BEISPIELE

Beispiel 1 - Selektives und nichtselektives Markieren von Zellsubpopulationen mit nachweisbaren Reportersubstanzen

Um den Vorteil zu veranschaulichen, den eine lymphozytenselektive Markierung gegenüber den in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 345,436 beschriebenen Methoden, in denen die gesamte Zellpopulation markiert wird, bietet, wurde folgender Vergleich angestellt.

A. Markieren aller Zellen mit einer mit der Lipidkomponente von Biomembranen stabil assoziierten Reportersubstanz

Eine Blutprobe eines gesunden Probanden wurde mit 1'-Docosanyl-1-propyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaniniodid (DPTI) gefärbt, indem man 500 ul Blut mit 5 ul DPTI (5 mM in Ethanol) versetzte. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur versetzte man unter Mischen mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Die Zellsuspension wurde zentrifugiert und der Überstand entfernt. Ein aliquoter Teil des gefärbten Bluts wurde für die Analyse der roten Blutkörperchen aufbewahrt, während das verbleibende Blut mit hypotonischem Ammoniumchlorid (1,5 g/l in Tris-Puffer, pH 7) behandelt wurde, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Die Proben wurden mit einem Coulter EPICSTM Profile-Durchflußzytometer analysiert. Die Zellsubpopulationen (z. B. Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Blutplättchen) wurden aufgrund ihrer Lichtstrahleigenschaften bestimmt (siehe das an Hansen u. a. erteilte US-Patent 4,284,412), und die mittlere Fluoreszenzintensität jeder Subpopulation wurde bestimmt.
Die Konzentration jedes Zelltyps in Normalblut sowie die relative Fluoreszenzintensität (d. h. durchschnittliche Intensität/Zelle) jeder Zellsubpopulation sind im Vergleich mit Lymphozyten in Tabelle 1A, Spalte 1 und 2, dargestellt. Aus diesen Werten wurde der Anteil des Gesamt-DPTI-Signals in jeder Subpopulation dadurch berechnet, daß man die Zellkonzentration mit der relativen Fluoreszenzintensität jedes Zelltyps multiplizierte. Der Großteil des DPTI-Signals geht im Vollblut eindeutig mit den roten Blutkörperchen einher (Spalte 3).
Unter Verwendung der oben berechneten Werte wurde eine theoretische Berechnung angestellt, um das relative DPTI-Signal nach einer typischen Immunaffinitätstrennung unter Verwendung von magnetischen Perlen wie in Beispiel 3 unten beschriebenen abzuschätzen. Typisch für die Immunaffinitätstrennung ist, daß sie nicht absolut ist und daß fast immer eine gewisse Kontamination (z. B. 5- 10%) mit anderen Zelltypen aufgrund einer unspezifischen Bindung bzw. eines unspezifischen Einschlusses von Zellen vorliegt. Das relative DPTI- Signal jedes Zelltyps nach der Entfernung von Lymphozyten mittels Affinitätstrennung ist in Spalte 4- 6 berechnet. Aus diesen Daten geht hervor, daß bei der Markierung aller Zellen in Blut mit einer Reportersubstanz wie DPTI eine ausnehmend selektive Abtrennung von Lymphozyten erforderlich wäre, um das von Lymphozyten stammende Signal ohne ein wesentliches Signal von kontaminierenden Zelltypen, wie roten Blutkörperchen, zu messen.
Auch dann, wenn die Affinitätstrennung selektiv genug wäre, um ein sinnvolles Lymphozytensignal gegen den Hintergrund von kontaminierenden Signalen nachweisen zu können, wäre die Messung von CD4- Lymphozyten in Blut trotzdem aufgrund des von Monozyten stammenden Signals kompliziert gemacht, da die Monozyten ebenfalls das CD4-Antigen tragen (Tabelle 2B). Bei einem normalen Probanden stellen die CD4- Lymphozyten ungefähr 45% der Lymphozyten dar und würden bei einem gegebenen GesamtLymphozytensignal von 1,00 ein Signal von 0,45 hervorrufen. Eine Immunaffinitätstrennung mittels Anti-CD4 würde jedoch auch zu einer Abtrennung der Monozyten (relatives Signal 0,66) und damit zu einem Gesamtsignal von 1,11 führen. Dieses Problem verstärkt sich, wenn CD4- Lymphozyten von einem Patienten mit AIDS, der eventuell nur über 5% CD4-Lymphozyten verfügt, analysiert werden; das relative Signal der interessierenden Untergruppe wäre dann nur 0,05 bei Vorliegen eines Gesamt- Lymphozyten- und -Monozytensignals von 0,71.

B. Selektive Markierung von Lymphozyten mit einer an einen monoklonalen Antikörper angehefteten Reportersubstanz

Das CD45-Antigen wird an allen Leukozyten (Lymphozyten, Monozyten und Neutrophilen), jedoch nicht an Blutplättchen oder roten Blutkörperchen exprimiert. Für die Analyse von Lymphozyten-Untergruppen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise ein monoklonaler CD45-Antikörper (Mak), der selektiv an Lymphozyten bindet, verwendet. Solch ein MAk läßt sich durch Durchflußzytometrie-Analyse selektieren. TABELLE 1 - MIT DPTI (100 uM) GEFÄRBTES VOLLBLUT A. SIGNALVERTEILUNG ZWISCHEN DEN SUBPOPULATIONEN
(a) BEI ABTRENNUNG ALLER MONOZYTEN BETRÄGT DAS RELATIVE SIGNAL 0,66 B. BERECHNUNG DES SIGNALS NACH VOLLSTÄNDIGER ABTRENNUNG DER CD4+-ZELLEN
Eine Blutprobe wurde von einem gesunden Probanden in EDTA-Antikoagulans abgenommen. Es wurden zwei CD45-Maks geprüft, nämlich Klon 2D1 (Becton- Dickinson) und Klon ALB12 (AMAC, Inc.). Eine Blutprobe (100 ul) wurde mit 20 ul fluoresceinkonjugiertem CD45 und 20 ul phycoerythrinkonjugiertem CD14 (AMAC, Inc.), welches Monozyten markiert, inkubiert. Die Zellen wurden 30 Minuten bei 4ºC inkubiert und anschließend mit einem zehnfachen Überschuß an Kupfer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 1% Rinderalbumin und 0,1% Natriumazid) verdünnt. Die Proben wurden zentrifugiert und die Überstände entfernt. Die Blutproben wurden nach den Anweisungen des Herstellers auf ein Coulter Q-PrepTM-Gerät gegeben. Bei dieser Vorgehensweise werden die roten Blutkörperchen lysiert und die Probe wird für die Durchflußzytometrie-Analyse fixiert.
Die Ergebnisse der Durchflußzytometrie-Analyse sind in Fig. 1 und 2 dargestellt. Das Histogramm in Fig. 1 zeigt die relative Färbung der Monozyten und Lymphozyten: Quadrant 1 enthält die Zellen, die mit Fluorescein schwach und mit Phycoerythrin stark gefärbt sind; Quadrant 2 enthält die Zellen, die sowohl mit Fluorescein als auch Phycoerythrin stark gefärbt sind; Quadrant 3 enthält die Zellen, die mit Fluorescein und Phycoerythrin schwach gefärbt sind; Quadrant 4 enthält die Zellen, die mit Fluorescein stark und mit Phycoerythrin schwach gefärbt sind. In dieser Darstellung umfassen die Lymphozyten die stärker grün gefärbte Population (Quadrant 4) und die Granulozyten (darunter die Neutrophilen) umfassen die schwächer grün gefärbte Population (Quadrant 3). Die Monozyten werden mit Phycoerythrin stark gefärbt, jedoch auch mit dem fluoresceinmarkierten CD45 stark gefärbt und befinden sich im Quadrant oben rechts (Quadrant 2).
Das Histogramm von Fig. 2 zeigt die Färbemuster von Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten. In dieser Darstellung umfassen die Lymphozyten die stärker grün gefärbte Population (Quadrant 4) und die Granulozyten umfassen die schwächer grün gefärbte Population (Quadrant 3). Im Gegensatz zu dem Histogramm von Fig. 1 sind die Monozyten mit Phycoerythrin stark gefärbt, jedoch mit dem fluoresceinmarkierten CD45-Klon ALB12 nur schwach gefärbt und befinden sich daher im Quadrant 1 und nicht im Quadrant 2.
Durch Inkubieren von Vollblut mit fluoresceinmarkiertem CD45, Klon 2D1, erhielt man eine starke Fluoresceinfärbung der Monozyten sowie der Lymphozyten (Fig. 2). Der Vergleich dazu reagierte der CD45-Klon ALB12 stark mit Lymphozyten, jedoch nur schwach mit Monozyten (Fig. 2). Der CD45-Klon ALB12 ist daher der Klon der Wahl, wenn Lymphozyten gegenüber Monozyten selektiv zu markieren sind.
Das relative Fluoreszenzsignal jeder Zellsubpopulation nach Färbung mit dem CD45-Klon ALB12 ist in Tabelle 2A, Spalte 2, im Vergleich zu den Lymphozyten dargestellt. Die Konzentration jeder dieser Zelltypen in einem gesunden Probanden ist in Spalte 1 dargestellt. Die Berechnungen in Tabelle 2A, Spalte 3- 6, sind wie oben für Tabelle 1 beschrieben.
In Tabelle 2B ist das Signal von verschiedenen Subpopulationen dargestellt, wenn die interessierende Untergruppe entweder alle Lymphozyten oder CD4- Lymphozyten sind. Nach Färbung der Zellen mit dem CD45-Klon ALB12 beträgt das relative Gesamtsignal in der abgetrennten Lymphozytenfraktion (inklusive unspezifische Bindung anderer Zellarten) 1,02, wovon 1,00 das von den Lymphozyten (der interessierenden Untergruppe) stammende Signal ist. Ist die interessierende Untergruppe CD4-Lymphozyten im Blut eines gesunden Probanden, so beträgt das relative Signal der interessierenden Untergruppe 0,45 bei einem Gesamtsignal von 0,46 (wobei keine Kontamination mit Granulozyten angenommen wird). Sind die CD4-Lymphozyten eines schwer AIDS-Kranken von Interesse, so beträgt das relative Signal der Lymphozyten 0,05 bei einem Gesamtsignal von 0,06. TABELLE 2 - MIT CD45, KLON ALB12, GEFÄRBTES VOLLBLUT A. SIGNALVERTEILUNG ZWISCHEN DEN SUBPOPULATIONEN
(a) BEI ABTRENNUNG ALLER MONOZYTEN BETRÄGT DAS RELATIVE SIGNAL 0,01 B. BERECHNUNG DES SIGNALS NACH VOLLSTÄNDIGER ABTRENNUNG DER CD4+-ZELLEN
Die selektive Markierung von Lymphozyten reduziert daher wesentlich das Hintergrundsignal im Vergleich zu dem in der US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 345,436 beschriebenen nicht selektiven Markierungsverfahren.

Beispiel 2 - Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen T-Lymphozyten zur einheitlichen Markierung von interessierenden Zellen einer Probe

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung gestattet die direkte Messung der Zellzahl in einer interessierenden Untergruppe in einer Probe. Bei einer direkten quantitativen Bestimmung der Zellzahl muß die pro Zelle in der interessierenden Untergruppe vorliegende Menge der Reportersubstanz zwischen den Probanden relativ konstant sein. Das folgende Beispiel zeigt die Auswertung zweier gegen Zelloberflächenantigene gerichteter monoklonaler Antikörper auf ihre Fähigkeit, eine interessierende Zelluntergruppe einheitlich zu markieren.
Zwei monoklonale Antikörper, die T-Lymphozyten in peripherem Blut markieren (CD2 und CD3), wurden auf ihre Variation bezüglich der Epitopdichte zwischen Probanden ausgewertet.
1. Blutproben wurden von 14 Spendern, nämlich 11 gesunden Probanden und 3 Probanden mit AIDS, in Antikoagulans (Heparin oder EDTA) abgenommen.
2. 100 ul Blut wurde mit Fluorescein-CD2- oder -CD3-Konjugat (Becton-Dickinson Immunocytometry Systems) mit Phycoerythrin-CD4-Konjugat (AMAC, Inc.) 30 Minuten bei 4ºC inkubiert.
3. Jede Probe wurde unter Mischen mit 1 ml Puffer (PBS) mit 1% Rinderalbumin und 0,1% Natriumazid) versetzt.
4. Die Proben wurden zentrifugiert und die Überstände entfernt.
5. Die Röhrchen, die die markierten Blutzellen enthielten, wurden auf ein Coulter Q-PrepTM-Gerät gegeben und wie vom Hersteller empfohlen bearbeitet. Durch diese Behandlung werden für die folgende durchflußzytometrische Analyse die roten Blutkörperchen (RBK) lysiert und die weißen Blutkörperchen (WBK) fixiert.
6. Die Proben wurden mit einem Coulter EPICS ProfileTM Durchflußzytometer analysiert. In jeder Tagesmeßreihe wurden Eichperlen (Flow Cytometry Standards Corp.) mitgeprüft.
7. Die mittlere Fluoreszenzintensität der Fluoresceinmarkierung an den CD4+-Zellen wurde für jede Probe bestimmt. Dieser Wert wurde mit den am gleichen Meßtag mitgeprüften Eichperlen auf Gerätevariation korrigiert.
Die Ergebnisse dieser Analysen lauteten folgendermaßen:
Diese Ergebnisse zeigen, daß die biologische Variation der Epitopdichte zwischen den Probanden reduziert ist, wenn man in dem Reportersystem zwei unterschiedliche monoklonale Antikörper verwendet.

Beispiel 3 - Assay der Anzahl der CD4- Lymphozyten pro Blutvolumen

A. Erstellung einer Zellstandardkurve

1. Herstellung von magnetischen Perlen:
a. Monoklonaler Anti-Maus-IgG2a (AMAC, Inc.) wurde mit tosylaktivierten magnetischen Perlen (DynabeadsTM, Dynal, Inc.) nach den Anweisungen des Herstellers gekoppelt.
b. Die Anti-Maus-IgG2a-Perlen wurden weiterhin entweder mit CD4 (Cymbus Bioscience) oder mit einem negativen monoklonalen Antikörper als Kontrolle inkubiert, wodurch man CD4-Perlen oder negative Kontrollperlen erhielt. Bei beiden monoklonalen Antikörpern handelte es sich um eine IgG2a-Unterklasse.
2. Blut wurde von einem gesunden Spender im Heparin-Antikoagulans abgenommen.
3. Eine Blutprobe wurde mit Biotin-CD2-Konjugat (Olympus Immunochemicals; Isotyp IgG1) 30 Minuten bei 4ºC inkubiert, gewaschen, 30 Minuten bei 4ºC mit beta- Galaktosidase-Streptavidin-Konjugat (Southern Biotech) konjugiert und wiederum gewaschen.
4. Die Blutprobe wurde in 2 aliquote Teilmengen geteilt. Eine Teilmenge wurde mit CD4-Perlen inkubiert. Die andere Teilmenge wurde unbehandelt belassen.
5. Die mit den magnetischen Perlen inkubierte Blutprobe wurden auf einen Magneten gegeben und der Überstand wurde entfernt. Diese Probe enthielt nun keine CD4-Lymphozyten mehr.
6. Das CD4-lymphozytenabgereicherte Blut wurde mit der unbehändelten Teilmenge aus Schritt 4 vermischt, und zwar in unterschiedlichen Verhältnissen von 100% CD4-abgereichertem Blut bis 0% CD4- abgereichertem Blut. Zur Verwendung wurde jedes Gemisch, darunter ein Zellstandard, im Verhältnis 1 : 5 verdünnt.
7. Die Leukozytenzahlen wurden für jeden Zellstandard mit einem Coulter-Teilchenzähler bestimmt.
8. Proben jedes Zellstandards wurden für die Immunfluoreszenzanalyse (auf den Prozentsatz der CD4-Zellen) und für die Standardkurve in aliquote Teilmengen geteilt.
9. Für die Standardkurve wurden 100-ul-Proben jedes Zellstandards in je ein Näpfchen einer 96-Well- Platte gegeben.
10. Jedes Näpfchen wurde mit 10 ul magnetischen Perlen, und zwar entweder CD4-Perlen oder Kontrollperlen, versetzt und die Platten wurden 30 Minuten bei 4ºC inkubiert.
11. Nach der Inkubation wurde die Platte auf einen Magneten gegeben, um die magnetischen Perlen und die an den Perlen anhaftenden Zellen abzutrennen.
12. Der Überstand, der Zellen enthielt, die nicht an den Perlen anhafteten, wurde entfernt. Die magnetischen Perlen und die anhaftenden Zellen wurden 3mal gewaschen, indem man die Platte von dem Magneten entfernte, jedes Näpfchen unter Mischen mit 150 ul Puffer (PBS mit 1% Rinderalbumin und 0,1% Azid) versetzte, die Platte wieder auf den Magneten gab und den Überstand entfernte.
13. Das Pellet, das die Perlen und die gebundenen Zellen enthielt, wurde 30 Minuten bei 37ºC mit 4-Methylumbelliferyl-beta-D-Galaktosid inkubiert.
14. Die Proben wurden wiederum auf einen Magneten gegeben und der Überstand (der durch Reaktion mit der beta-Galaktosidase produziertes Methylumbelliferon enthielt) wurde auf eine frische Platte überführt.
15. Die Fluoreszenz des Methylumbelliferons wurde mit einem FluoroskanTM II Mikrotiterplatten-Reader (Labsytems OY) gemessen.
16. Für die Immunfluoreszenzanalyse wurde die Probe jedes Zellstandards aus Schritt 8 mit Fluorescein-CD4-Konjugat und Phycoerythrin-CD45- Konjugat markiert. Die markierten Zellen wurden durchflußzytometrisch auf den Prozentsatz der Leukozyten (CD45+) analysiert, bei denen es sich um CD4+-Lymphozyten handelte.
17. Die Anzahl der CD4-Zellen in jedem Zellstandard wurde aufgrund der Leukozytenzahl und dem durchflußzytometrisch gemessenen Prozentsatz an CD4-Lymphozyten berechnet.
18. Durch Auftragen der (mit dem FluoroskanTM Platten-Reader gemessenen) Fluoreszenzintensität gegen die Anzahl der CD4-Lymphozyten wurde eine Standardkurve erstellt (siehe Fig. 3). Anhand der Steigung der Kurve wurde bestimmt, daß eine CD4-Zelle gleich 0,066 Fluoreszenzeinheiten ist.

B. Erstellung einer Standardkurve von Biotinmarkierten Perlen

1. Biotinmarkierte magnetische Perlen (Advanced Magnetics) wurden 30 Minuten mit beta-Galaktosidase- Streptavidin-Konjugat (Southern Biotech) konjugiert und» anschließend gewaschen.
2. Die Perlen wurden anschließend mit Ziege- Anti-Maus-IgG-Magnetperlen (Advanced Magnetics) im Verhältnis 0-30% biotinmarkierte Perlen vermischt. Jedes Gemisch enthielt einen Perlenstandard.
3. Eine aliquote Teilmenge jedes Perlenstandards wurde in je ein Näpfchen einer 96-Well- Platte gegeben und dann 30 Minuten bei 37ºC mit 4-Methylumbelliferyl-beta-D-Galaktosid inkubiert.
4. Die Platte wurde auf einen Magneten gegeben und der Überstand (der durch Reaktion mit beta- Galaktosidase produziertes Methylumbelliferon enthielt) wurde auf eine frische Platte überführt.
5. Die Fluoreszenz des Methylumbelliferons wurde mit einem FluoroskanTM II Mikrotiterplatten-Reader (Labsytems OY) gemessen.
6. Durch Auftragen der Fluoreszenzintensität gegen den Prozentsatz der biotinmarkierten Perlen wurde eine Standardkurve erstellt (siehe Fig. 4). Anhand der Steigung der Kurve wurde zusammen mit der Zellstandardkurve (Fig. 3) die Anzahl der C4-Zell- Äquivalente pro Prozent biotinmarkierter Perlen folgendermaßen bestimmt:

C. Bestimmung der Anzahl der CD4- Lymphozyten in einer peripheren Blutprobe

1. Blut wurde in Heparin-Antikoagulans abgenommen.
2. Eine Blutprobe wurde 30 Minuten mit CD2-Biotin-Konjugat (Olympus Immunochemicals; Isotyp IgG1) inkubiert, gewaschen, 30 Minuten mit beta- Galaktosidase-Streptavidin-Konjugat inkubiert und wiederum gewaschen.
3. Das Blut wurde im Verhältnis 1 : 5 verdünnt, und aliquote Teilmengen zu 100 ul wurden in einzelne Näpfchen einer 96-Well-Platte gegeben.
4. Jedes Näpfchen wurde mit 10 ul magnetischen Perlen, und zwar entweder Anti-CD4-Perlen oder Kontrollperlen, versetzt.
5. Nach 30 Minuten wurde die Platte auf einen Magneten gegeben, um die magnetischen Perlen und die an den Perlen anhaftenden Zellen abzutrennen. Die Zellen und die Perlen wurden 3mal wie in Beispiel 3A, Schritt 12, beschrieben gewaschen.
6. Das Pellet, das die Perlen und die gebundenen Zellen enthielt, wurde 30 Minuten bei 37ºC mit 4-Methylumbelliferyl-beta-D-Galaktosid inkubiert.
7. Die gleiche Platte wurde mit den wie oben beschriebenen Perlenstandards versetzt und 30 Minuten bei 37ºC mit 4-Methylumbelliferyl-beta-D-Galaktosid inkubiert.
8. Die Platte wurde auf einen Magneten gegeben und der Überstand (der durch Reaktion mit beta- Galaktosidase produziertes Methylumbelliferon enthielt) wurde auf eine frische Platte überführt.
9. Die Fluoreszenz des Methylumbelliferons in der Probe und in Standardnäpfchen wurde mit einem FluoroskanTM II Mikrotiterplatten-Reader (Labsystems OY) gemessen.
10. Die Anzahl der CD4-Zellen pro Probe wurde wie folgt berechnet:
11. In jeder Probe wurde der Prozentsatz der Leukozyten, bei denen es sich um CD4-Lymphozyten handelte, auch durch Immunfluoreszenzfärbung und durchflußzytometrische Analyse wie in Beispiel 3A beschrieben bestimmt. Dieser Prozentsatz wurde dann mit der Leukozytenzahl multipliziert, um zur Anzahl der CD4-Lymphozyten/mm³ zu gelangen.
12. Die Ergebnisse von 4 gesunden Spendern lauteten:
(1) = Durchflußzytometrie
(2) = erfindungsgemäßes Verfahren

Beispiel 4 - Vergleich von Immunaffinitätstrennung und Durchflußzytometrie mittels BCECF-AM- markierten Zellen

Von 2 gesunden Spendern wurde Blut gewonnen, das mit (Heparin- oder EDTA-) Antikoagulans behandelt worden war. Blutproben von jedem Spender wurden für die Reinigung von Lymphozyten und Anreicherung von Leukozyten verwendet.
Die Lymphozyten wurden folgendermaßen gereinigt: Mononukleäre Zellen wurden mittels Ficoll- Dichtegradientzentrifugation gewonnen und dann einmal mit Medium (RPMI 1640 [Gibco Laboratories] mit 10% fötalem Rinderserum) gewaschen, wiederum zu 1 · 10&sup6; Zellen pro ml suspendiert und über Nacht bei 37ºC in einer Gewebekulturflasche inkubiert. Nicht anhaftende Zellen wurden gewonnen, gezählt, und wiederum zu 1 · 106 pro ml in Assay-Puffer (PBS mit 1% Rinderalbumin, 0,05% Natriumazid, 40 uM EDTA und 5 ug/ml Indomethacin) suspendiert.
Die Leukozyten wurden folgendermaßen angereichert: Das Blut wurde mit einem gleichen Volumen Dextran (2% Dextran in PBS) vermischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der leukozytenangereicherte Überstand wurde gewonnen, einmal mit Assay-Puffer gewaschen und wieder zu 1 · 106 Zellen pro ml suspendiert.
Immunmagnetische Perlen wurden durch Inkubation von Ziege-Anti-Maus-IgG-Magnetperlen (Advanced Magnetics) mit den monoklonalen Maus-Antikörpern CD4, CD8, CD19 (von AMAC, Inc.) bzw. CD2 (Olympus Immunochemicals) hergestellt. Als Negativkontrolle wurden Ziege-Anti-Maus-IgG-Perlen ohne monoklonale Antikörper verwendet.
Für den Assay wurden in einer 96-Well-Platte 100 ul Zellen mit 20 ul Perlen (Perl-Zell-Verhältnis 5 : 1) 30 Minuten bei 4ºC unter Schütteln inkubiert. Die magnetischen Perlen und die anhaftenden Zellen wurden abgetrennt und 4mal mit Puffer wie in Beispiel 3A beschrieben gewaschen.
Unmittelbar vor der Verwendung wurde eine 100-uM-Lösung von 2',7'-Bis(2-carboxyethyl)-5-(und- 6)carboxyfluoresceinacetoxymethylester (BCECF-AM, Molecular Probes) in Assay-Puffer hergestellt. Nach dem letzten Waschschritt wurde jedes Näpfchen mit 180 ul azidfreiem Assay-Puffer und 20 ul der BCECF-AM-Lösung versetzt. Die Zellen wurden 30 Minuten bei 37ºC mit BCECF-AM inkubiert und anschließend magnetisch getrennt, und der Überstand wurde entfernt. Jedes Näpfchen wurde mit Triton X-100 (1% in Wasser) in einer Menge von 200 ul pro Näpfchen versetzt, um die Zellen zu lysieren und das Fluoreszenzprodukt BCECF freizusetzen. Anschließend wurden 150 ul des Überstands auf eine Ableseplatte überführt, und die BCECF- Fluoreszenz wurde mit dem FluoroskanTM Mikrotiter- Platten-Reader gemessen.
Das Gesamt-Lymphozytensignal errechnete sich als Summe des Nettosignals von CD2 und von CD19 (Nettosignal = MAk-Signal - Signal der Negativkontrolle).
Um den Prozentsatz der markierten Lymphozyten durchflußzytometrisch zu messen, wurde eine Blutprobe von jedem Spender mit Fluorescein- oder Phycoerythrin-CD4-, -CD8-, -CD19- bzw. -CD2-Konjugat inkubiert. Die markierten Zellen wurden mit dem Coulter G. Preptin- Gerät wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt und dann mit einem Coulter EPICSTM Profile- Durchflußzytometer analysiert. Die Lymphozyten wurden aufgrund ihrer Lichtstreuungseigenschaften im Durchflußzytometer bestimmt. Der Prozentsatz der mit jedem MAk markierten Lymphozyten wurde nach Standardanalyseverfahren wie bei Landay und Muirhead, oben, beschrieben, gemessen.
Immunaffinitätstrennung und Durchflußzytometrie werden in Fig. 5 und 6 aufgrund des Prozentsatzes der durch jeden monoklonalen Antikörper identifizierten Lymphozyten verglichen. Der Prozentsatz der mittels Immunaffinitätstrennung gemessenen Lymphozyten auf den y-Achsen der Fig. 5 und 6 wurde aus dem Verhältnis des Nettosignals von jedem MAk zum Gesamt- Lymphozytensignal berechnet.
Wie aus Fig. 5 ersichtlich, waren bei Proben, in denen im wesentlichen keine Monozyten vorlagen, die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens mit der Durchflußzytometrie vergleichbar. Aus Fig. 6 geht jedoch hervor, daß die Menge der CD4-Lymphozyten in dem Assay überschätzt wird, wenn die Monozyten nicht aus der Probe abgereichert worden waren. Der Grund hierfür ist, daß sowohl Monozyten als auch Lymphozyten CD4- Oberflächenantigene tragen.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens bzw. der Menge einer ausgewählten Untergruppe einer Subpopulation von Zellen in einer Zellmischpopulation, die diese Untergruppe enthält, wobei diese Untergruppe Zellen mindestens über eine charakteristische Determinante, die sich von einer charakteristischen Determinante dieser Subpopulation unterscheidet, verfügt, umfassend die folgenden Schritte:

(i) gleichmäßiges Einbringen einer nachweisbaren Reportersubstanz selektiv in im wesentlichen alle Zellen dieser Subpopulation in der Zellmischpopulation, wobei diese in einer Flüssigkeit suspendiert ist;

(ii) In-Kontakt-Bringen einer Probe dieser Zellmischpopulation mit einer spezifischen Bindungssubstanz, die spezifisch an mindestens eine charakteristische Determinante dieser Untergruppe bindet, wodurch man einen Komplex aus der gewählten Untergruppe und der spezifischen Bindungssubstanz erhält, wobei komplexierte und nichtkomplexierte Zellen gebildet werden;

(iii) Abtrennen der komplexierten Zellen von nichtkomplexierten Zellen; sowie

(iv) Nachweisen des Vorhandenseins der nachweisbaren Reportersubstanz, und zwar entweder in den abgetrennten komplexierten Zellen oder den abgetrennten nichtkomplexierten Zellen, wodurch das Vorliegen bzw. die Menge der gewählten Untergruppe in der Zellmischpopulation bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Subpopulation aus Lymphozyten besteht und die Untergruppe aus Lymphozyten, die durch ausgewählte Funktionen oder Differenzierungsstadien gekennzeichnet sind, besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Subpopulation aus T-Lymphozyten besteht und die Untergruppe aus der Gruppe Helfer-T-Lymphozyten und Suppressor/zytotoxische T-Lymphozyten ausgewählt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit dem Schritt, in dem das Ausmaß der nachgewiesenen Reportersubstanz mit einem vorherbestimmten Standard verglichen wird, um die Menge der Zelluntergruppe in der Probe zu bestimmen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die nachweisbare Reportersubstanz in die Zellsubpopulation dadurch eingebracht wird, daß sie ohne die Bindung der interessierenden Untergruppe an die spezifische Bindungssubstanz zu stören mit der Oberfläche der Zellen der Subpopulation gekoppelt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die nachweisbare Reportersubstanz von dem Komplex vor dem Nachweis seines Vorliegens bzw. seiner Menge abgetrennt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die nachweisbare Reportersubstanz an mindestens einen Antikörper angeheftet wird, der spezifisch an mindestens eine Bindungsstelle, die den Zellen der Subpopulation gemeinsam ist, bindet, wobei diese Kopplung durch immunologische Bindung erfolgt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die nachweisbare Reportersubstanz an ein Glied eines spezifischen Bindungspaares angeheftet wird, der Antikörper an das andere Glied des spezifischen Bindungspaares angeheftet wird, und die Kopplung durch die kombinierte Wirkung der immunologischen Bindung und der Bindung zwischen den Gliedern des spezifischen Bindungspaares erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das spezifische Bindungspaar Avidin und Biotin enthält.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Probe mit der spezifischen Bindungssubstanz, die an einer Festphase fixiert ist, in Kontakt gebracht wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Festphase magnetisches oder paramagnetisches Material enthält und die Probe durch magnetische Trennung abgetrennt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die spezifische Bindungssubstanz einen Antikörper enthält.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Schritt des In-Kontakt-Bringens der Probe mit der spezifischen Bindungssubstanz zusätzlich umfaßt, daß die Probe mit einer spezifischen Hilfsbindungssubstanz, die spezifisch an die spezifische Bindungssubstanz bindet, in Kontakt gebracht wird, und wobei die spezifische Hilfsbindungssubstanz an einer Festphase fixiert ist.

14. Analyseverfahren für eine Zellsubpopulation mit mindestens einer charakteristischen Determinante, die innerhalb einer Zellmischpopulation existiert, wobei die Zellsubpopulation einzelne interessierende Untergruppen enthält, wobei jede Untergruppe über mindestens eine charakteristische Determinante, die sich von der mindestens einen charakteristischen Determinante der Subpopulation unterscheidet, verfügt, um den Anteil mindestens einer gewählten Untergruppe dieser Zellsubpopulation zu bestimmen, das folgende Schritte umfaßt:

(i) gleichmäßiges Einbringen einer nachweisbaren Reportersubstanz selektiv in im wesentlichen alle Zellen dieser Subpopulation in der Zellpopulation, wobei diese in einer Flüssigkeit suspendiert ist;

(ii) In-Kontakt-Bringen einer ersten Probe der Zellpopulation mit einem ersten Reagens, das mindestens eine spezifische Bindungssubstanz enthält, die spezifisch an eine charakteristische Determinante der Zellsubpopulation bindet, wodurch man einen ersten Komplex in der ersten Probe erhält, wobei der erste Komplex die ausgewählte Subpopulation und die spezifische Bindungssubstanz enthält, wobei komplexierte und nichtkomplexierte Zellen gebildet werden;

(iii) Abtrennen des ersten Komplexes in der ersten Probe von nichtkomplexierten Zellen in der ersten Probe;

(iv) Nachweisen des Vorhandenseins der nachweisbaren Reportersubstanz in dem ersten Komplex;

(v) In-Kontakt-Bringen einer zweiten Probe der Zellpopulation aus Schritt (i), deren Volumen und Zellkonzentration denen der ersten Probe entsprechen, mit einem zweiten Reagens, das eine spezifische Bindungssubstanz enthält, die spezifisch an mindestens eine der mindestens einen charakteristischen Determinanten der gewählten interessierenden Untergruppe in der Zellsubpopulation bindet, was zur Bildung eines zweiten Komplexes in der zweiten Probe führt, wobei der zweite Komplex die gewählte Untergruppe und die spezifische Bindungssubstanz enthält, wobei komplexierte und nichtkomplexierte Zellen gebildet werden;

(vi) Abtrennen des zweiten Komplexes in der zweiten Probe von nichtkomplexierten Zellen in der zweiten Probe;

(vii) Nachweisen des Vorhandenseins der nachweisbaren Reportersubstanz in dem zweiten Komplex; sowie

(viii) Bestimmung des Ausmaßes der gewählten interessierenden Untergruppe in der Zellsubpopulation durch Quantifizierung der Menge der mit dem zweiten Komplex assoziierten nachweisbaren Reportersubstanz im Vergleich zu der Menge der mit dem ersten Komplex assoziierten nachweisbaren Reportersubstanz.

15. Verfahren nach Anspruch 14 mit den folgenden Schritten:

(ix) In-Kontakt-Bringen einer oder mehrerer weiterer Proben der Zellmischpopulation aus Schritt (i) , wobei das Volumen und die Zellkonzentration jeder Probe denen der ersten Probe entspricht, mit weiteren Reagenzien, wobei jedes weitere Reagens eine spezifische Bindungssubstanz enthält, die spezifisch an eine charakteristische Determinante einer weiteren, in dieser Zellsubpopulation vorliegenden Untergruppe spezifisch bindet, was zur Bildung eines oder mehrerer weiterer Zellkomplexe und nichtkomplexierten Zellen führt,

(x) Abtrennen jedes der weiteren Komplexe in der einen oder mehreren weiteren Proben von den nichtkomplexierten Zellen;

(xi) Nachweisen des Vorhandenseins der nachweisbaren Reportersubstanz in jedem der weiteren Komplexe; sowie

(xii) Bestimmen des Ausmaßes der bzw. jeder weiterer Untergruppe in der Zellsubpopulation durch Quantifizierung der Menge der mit dem einen oder mehreren weiteren Komplexen assoziierten Reportersubstanz im Vergleich zu der Menge der mit dem ersten Komplex assoziierten Reportersubstanz.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei das erste Reagens eine Mischung spezifischer Bindungssubstanzen umfaßt, wobei jede Bindungssubstanz spezifisch an eine charakteristische Determinante einzelner interessierender Untergruppen innerhalb der Subpopulation bindet, wodurch im wesentlichen alle Zellen der Subpopulation an die eine oder andere der Bindungssubstanzen gebunden werden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die nachweisbare Reportersubstanz in die Zellsubpopulation dadurch eingebracht wird, daß sie ohne die Bindung der interessierenden Untergruppen an die spezifischen Bindungssubstanzen zu stören mit der Oberfläche der Zellen der Subpopulation gekoppelt wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die nachweisbare Reportersubstanz von dem Komplex vor dem Nachweis seines Vorliegens bzw. seiner Menge entfernt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die nachweisbare Reportersubstanz an mindestens einen Antikörper angeheftet wird, der spezifisch an mindestens eine Bindungsstelle, die den Zellen der Subpopulation gemeinsam ist, bindet, wobei diese Kopplung durch immunologische Bindung erfolgt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die nachweisbare Reportersubstanz an ein Glied eines spezifischen Bindungspaares angeheftet wird, der Antikörper an das andere Glied des spezifischen Bindungspaares angeheftet wird, und die Kopplung durch die kombinierte Wirkung der immunologischen Bindung und der Bindung zwischen den Gliedern des spezifischen Bindungspaares erfolgt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 20, wobei die spezifische Bindungssubstanz des ersten Reagens und die spezifische Bindungssubstanz des zweiten Reagens jeweils an eine Festphase fixiert sind.

22. Verfahren nach einem Ansprüche 14 bis 20, wobei die spezifische Bindungssubstanz des ersten Reagens und die spezifische Bindungssubstanz des zweiten Reagens jeweils an magnetische oder paramagnetische Teilchen fixiert sind und der erste Komplex, der die interessierende Subpopulation enthält, und der zweite Komplex, der die gewählte Untergruppe enthält, magnetisch aus den Proben abgetrennt werden.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 20, bei dem die erste oder die zweite Probe mit einer spezifischen Hilfsbindungssubstanz, die zur selektiven Interaktion mit dem ersten Reagens bzw. dem zweiten Reagens fähig ist, in Kontakt gebracht wird, wobei diese spezifische Hilfsbindungssubstanz an einer Festphase fixiert ist.

24. Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens bzw. der Menge einer ausgewählten Untergruppe einer Subpopulation von biologischen Einheiten in einer Population dieser biologischer Einheiten, wobei diese Untergruppe mindestens über eine charakteristische Determinante, die sich von einer charakteristischen Determinante dieser Subpopulation unterscheidet, verfügt, umfassend die folgenden Schritte:

(i) gleichmäßiges Einbringen einer nachweisbaren Reportersubstanz selektiv in im wesentlichen die ganze Subpopulation in der Population, wobei diese in einer Flüssigkeit suspendiert ist;

(ii) In-Kontakt-Bringen der biologischen Einheiten mit einer spezifischen Bindungssubstanz, die unter Bedingungen, die zur Bindung der Bindungssubstanz an mindestens eine charakteristische Determinante führen, zur selektiven Interaktion mit dieser mindestens einen charakteristischen Determinante dieser Untergruppe fähig ist;

(iii) Abtrennen der die Untergruppe tragenden Bindungssubstanz von der Population; sowie

(iv) Nachweisen des Vorhandenseins der nachweisbaren Reportersubstanz in der abgetrennten Untergruppe der biologischen Einheiten oder in der Population, die nach der Abtrennung der Untergruppe zurückbleibt, wodurch das Vorliegen bzw. die Menge der Untergruppe von biologischen Einheiten, die über diese charakteristische Determinante verfügen, innerhalb der Population angezeigt wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, bei dem die Reportersubstanz ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend:

1-[2-Amino-5-(6-carboxyindol-2-yl)-phenoxyl]-2- (2'-amino-5'-methylphenoxy)ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäurepentaacetoxymethylester;

3-Acetoxy-5'(und -6')-acetoxymethoxycarbonyl- 10-dimethylaminospiro[7H-benzo]c[xanthen-7,1'(3'H)-isobenzofuran]-3'-on;

Fluoresceindiacetat; 5-(und 6-)-Carboxyfluoresceindiacetat; und

2',7'-Bis(2-carboxyethyl)-5-(und 6-)carboxyfluoresceinacetoxymethylester.