JPH06503643A - 混合細胞集団のサブ集団内部の細胞サブセットの検出と定量のための方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 混合細胞集団のサブ集団内部の細胞サブセットの検出と定量のための方法 本願は、１９８９年５月１日出願の「生体存在物のサブ集団を測定するための方 法、試薬およびテストキット」という名称の同時係属米国特許出願筒３４５．４ ３６号の一部継続出願であるが、この同時係属出願自体、１９８８年５月２日出 願の「生体作用（Ｂｉｏ−Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ）　物質を表面膜に結合させるた めの化合物、組成および方法」という名称の同時係属米国特許出願筒１８９．１ ９２号の一部継続出願である。

発明の分野 本発明は生物学的試験に関するものであり、さらに詳しくは、細胞集団内部で各 サブセットが少なくとも一個の特徴的決定基を有する、細胞サブ集団の選択サブ セットの存在または量を測定するための方法、およびこのような方法を実施する 上で用いられるテストキットに関するものである。本発明の方法により、サブ集 団細胞の内部または上で検出可能なリポータ−（環境）物質を均等に取込み、選 択された関係サブセットを（例えば、親和性（結合性）分離により）分離し、さ らにリポータ−物質を検出する手段により、関係する特定細胞種の小画分を含む 、例えば、全血のような複合生体内液のスクリーニングが容易に行なえる。

従来技術の説明 血液または骨髄の成分（例えば、白血球のサブ集団）の測定（定量）は、別個の 成分の決定基と選択的に反応するモノクローナル抗体が一般に利用できるように なったため、臨床的診断試験として一般的に行なわれるようになった。これらの 測定は、免疫不全疾患、白血病、リンパ細胞腫の各患者および移植患者での変化 をモニターするために有用であることがわかった。Ａ、Ｌａｎｄｙとに、Ｍｕｉ ｒｈｅａｄ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ。

５２　：　４８−６０　（１９８９）参照。免疫蛍光標識とその後に行なわれる フローサイトメトリー（流動細胞計測法）分析または蛍光顕微鏡検査は、このよ うな測定を実施するために確立された方法である。

フローサイトメトリーは、免疫蛍光顕微鏡検査、免疫細胞化学検査、エンザイム イムノアッセイ（酵素免疫定量法）等その他の細胞標識分析より明らかに優れて いる。フローサイトメトリーが標識分析のｂｕｌｋ法（例えば、蛍光定量法また は酵素免疫定量法）よりも特にまさっている点は、多重決定基を利用して各細胞 からの多重シグナルを同時に分析することである。例えば、Ｒｏｃｋｔｅｎｗａ ］ｄの米国特許４，７２７．０２０では、２個の蛍光チャンネルを用いて、２つ の異なる免疫蛍光作用物質で明確に標識されたサブ集団内の細胞を検出すること が述べられている。また、Ｈａｎｓｅｎらの米国特許４，２８４，４１２では、 蛍光チャンネルを用いて、血中の異なるサブ集団の細胞の前方および直角の光分 散を検出することが述べられている。この両方の例では、ゲート用に少な（とも 一つのパラメータが用いられ、細胞が、関係するゲートつきサブ集団の中に含ま れる場合に限り、細胞からのシグナル（例えば、蛍光色素からの蛍光）が電子的 に測定される。このようなマルチパラメトリック測定は、細胞の複合集団（例え ば、全血）内部の関係サブセットの計数に有用である。しかし、この方法は、関 係各パラメータについて各サンプルを一度で一個の細胞を分析しなければならな いため、時間がかかる。

フローサイトメトリーの明確に不利な点は、各サンプルを個々に処理し、分析し なければならない点である。この不利な点は、毎日、多数の患者の試料が処理さ れる臨床実験室でと（に深刻な問題である。多重サンプルからの細胞サブ集団を 同時に定量できれば、臨床または研究実験室でのこのような処理能力時間が削減 される。

多重サンプルを分析する方法の一つとして、酵素連鎖イムノソルベント・アッセ イ（ＥＬＩＳＡ）が提案されている。Ｊ、Ｅｎｄｌ、ｅｔ　ａ］、Ｊ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、、１０２ニア７−８３　（１９８７）参照。また、Ｓｈｅ　 ｔｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ　の米国特許４，８７６．１８９参照。このア、ツセイ は、９６ウエルの’フィクロプレート・リーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｒｅ ａｄｅｒ）を用いて一度に多重サンプルの吸光　度を測定するものである。この アッセイのリポータ−・システムでは、特異的抗体に対するモノクローナル抗体 に抱合した酵素を利用し、関係サブセット上の抗体（例えば、リンパ球上のＣＤ ４）と別のサブセント上の同じ抗体（例えば、単球（単核細胞）上のＣＤ４）と を区別することができない。結果として、この方法は全血中の細胞サブ集団を測 定するには不適切である。

細胞表面抗体またはそれに対する抗体を検出するための別の方法では、蛍光色素 標識された赤血球の凝集反応を測定する。Ｖ、Ｇｈａｚａｒｏｓｓｉａｎ　ｅｔ 　ａｌ、、ＣＩ　ｉｎ、Ｃｈｅｍ、、３４：１７２０−２５　（１９８８）、ま た米国特許４，７４８，１２９参照。　この方法には、血液型判定または血液型 抗原に対する抗体の検出のための特殊用途がある。蛍光色素を用いて赤血球膜を 標識して、赤血球の凝集反応による（光ファイバ・プローブにより検出される） 蛍光シグナル中のゆらぎ（ｆ　１ｕｃｔｕａｔ　１ｏｎ）から抗体または抗原の 存在を確かめる。　このシステムは、関係抗原または抗体が存在するか、または 存在しないかについての質的な、または（せいぜい）半定量的な結果としてのみ 得ることができる。血漿中の抗体の存在を測定するためにこのアッセイを行なう ときは、コロイド磁鉄鉱粒子を付加し、またサンプルを磁場に露出させることに より、血液サンプル中の赤血球を取り出す。

診断試験では多くの場合、詳しい分析のために、関係細胞サブ集団またはサブセ ントを混合細胞集団から区別し、分離することが望ましい。従来、タンパク質で コーティングした磁気粒子を用いた細胞の親和性分離が知られている。特許文献 やその他の箇所で、磁気親和性分離により生体内集団を分類するためのさまざな 方法について述べられている。例えば、米国特許３，９７０，５１８．４，７１ ０．４７２．４．６７７．０６７．４．６６６．５９５．４．２３０，６８５． ４．２１９．４１１．４．１５７．３２３　参照。また、Ｅ、　Ｔ、　Ｍｅｎｚ 　ｅｔ　ａｌ、、Ａｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌａｂ、（１９８６）、Ｊ、Ｓ、Ｋｅ ｍｓｈｅａｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、、６７ ：１１−１８　（１９８５）、Ｔ、Ｌｅｉｖｅｓｔａｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｉｓ ｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ、２８：４６　５２　（１９８６）、および　Ｊ、　Ｓ 、　Ｂｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３８：　２１００ −０３（１９８７）参照。このような方法を実施する場合、一般には結合分子（ 例えば、モノクローナル抗体）を磁気粒子に抱合し、関係分析物上の特徴的決定 基に結合させる条件下で試験サンプルを付加し、そのあと試験サンプルを磁場に 露出させる。

例えば、Ｌｅｉｖｅｓｔａｄ　ｅｔ　ａｌ、（上記）が述べた免疫磁気分離法を 参照。そのあと、磁気粒子とこれに加えた分析物を残りの集団から分離すること ができる。

磁気親和性分離の使用については、ラジオアイソトープ（例えば、Ｒｅｔｔｌｅ 　ｅｔ　ａｌ、、Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、、３０：１４５７−６１　（１９８４） または蛍光分子（例えば、Ｍｏ５ｃｏｓｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ 。

、３４：９０２−０５、Ｒ，Ｄ、Ｎａｒｇｅｓｓｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍ ｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、、７１：　１７−２４　（１９８４Ｌおよび　Ｋａｍｅ　 １ｅｔ　ａｌ、、Ｃｈｉｎ　Ｃｈｅｍ、２６：１２８１−８４　（１９８０）参 照）をリポータ−物質として利用する可溶分析物についての臨床診断イムノアッ セイで報告されている。この方法を用いて、移植前に骨髄細胞から赤血球のいく つかのサブ集団を分離し、移植後移植片に対する宿主の反作用を軽減することも また報告されている。Ａ、Ｂｕｔｔｒｉｎｉｅｔ　ａｌ、、Ｆｒｏｇ、「骨髄移 植」（Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌ、）４１３−２２　（１９８７ ）参照。

その他、この方法の使用については、腫瘍細胞の分離（Ｋｅｍｓｈｅａｄ　ｅｔ ａｌ、、Ｂ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　５４ニア７１−７８　（１９８６）参照）と、 その後の機能評価のためのリンパ球サブ集団の分離（Ｂｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ 。

、上記参照）を含むものが報告された。

磁気親和性細胞分離を使用して血中リンパ球サブセットを定量することについて 報告されている。Ｊ、Ｂｒｉｎｃｈｍａｎｎ、Ｃｌ１ｎ、Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、、７１：１８２−８６　（１９８８）参照。この方法では、明確な赤血球サ ブ集団に特異的なモノクローナル抗体でコーティングした超常磁気ポリマー・ミ クロスフェアを用いて血液サンプルをインキュベートした。サンプルに磁場を加 えることにより、ミクロスフェアに結合された細胞を残りの集団から分離した。

次に、分離した細胞を溶解し、それらをミクロスフェアから分離し、ミクロスフ ェアと付着細胞膜を磁気的に取り出し、結果として得られる細胞核を染色し、蛍 光顕微鏡と血球計数器を用いて手動でこれを計数した。計数された細胞核の数は 関係サブ集団におけるサンプル中の細胞の数に対応した。この方法は関係サブ集 団内の細胞を数えるために用いられるが、細胞核の手動計数は非常に時間がかか り、血球計数器と計数のサンプル荷重で技術的誤りをおこしやすい。このような 方法は臨床設定での使用に適しているとは思われない。

したがって、特定サブセットの存在または量および全血を含むような混合細胞集 団内部の細胞のサブ集団を測定するたの方法の改良が必要である。このように改 良される方法の特徴として、従来利用できる方法のものと同等か、またはそれよ りも大きい感度、比較的短時間で多重サンプルを分析が可能であること、また方 法を実施するために高価な装置や高度な技術の熟練者を必要としないことなどが あげられる。

われわれの同時係属米国特許出願第３４５．４３６号は、このような分析物を含 む集団内部の分析物のサブ集団を測定するためのいくつかの方法を開示している 。その発明の方法、試薬およびテストキットにより、検出可能なリポータ−物質 を、好ましくは生体膜の液体成分との安定した結合により生体膜に結合させる手 段、またその後に、例えば、固相に付加した特異的結合物質により関係分析物を 分離し、さらにリポータ−物質を検出する手段により、細胞、ウィルス、および これらと同様のもののスクリーニングが容易に行なえる。上記米国出願第３４５ ．４３６号の発明で用いられる試薬は、われわれの同時係属米国特許出願第１８ ９．１９２号においてより完全に述べられているが、この試薬は、生体膜の液体 成分と安定的に結合させられる検出可能なリポータ−物質で構成されているとい う点で先行技術を超える明確な利点を提供している。こうして、特異的リポータ −配位子（リガンド）相互作用に依拠せずに検出可能なリポータ−物質を用いて 生体膜を含む分析物が標識される。また、検出可能なリポータ−物質は生体膜と 安定的に結合されるので、リポータ−物質の漏出またはその他の喪失の問題が回 避される。

米国特許出願第３４５．４３６号の生体膜標識法は以前の方法を超える多（の利 点を提供し、また多くの異なる種類の分析物の検出や分類に広範囲に応用できる ものであるが、全血中のいくつかの細胞サブ集団の検出や定量など、いくつかの 重要な臨床的用途での利用に限定されている。米国特許出願第３４５，４３６号 で述べられているアッセイ・システムでは、試験サンプルまたは血液サンプルの 分離画分中のすべての細胞を標識し、そして選択的分離を用いて関係分析物（例 えば、ヘルパーＴ細胞のサブセット）を隔離（分離）する。しかし、典型的な血 液サンプルには赤血球、白血球（顆粒球、単球およびリンパ球）および血小板が 含まれており、これらすべてが上記方法により標識される。したがって、米国特 許出願第３４５，４３６号で述べられている種類の化合物で標識されると、大部 分のシグナルはリンパ球以外の細胞に存在する。結果として生じる問題点は、分 離画分中の非リンパ球による少量の汚染が背景（パックグラウンド）シグナルの 大きな原因になることである。この背景は、関係する特異的リンパ球サブセット からのシグナルと同じ大きさか、または、とくにリンパ球の特定サブセット数の 減少により特徴づけられる後天性免疫不全症候群（Ａ　Ｉ　Ｉ）Ｓ）のような疾 患ではこのシグナルよりも大きい。　このため、米国特許出願第３４５，４３６ 号のアッセイ・システムは、フローサイトメトリーに必要とされる精巧な装置や 技術的補助を用いないバッチ・モードでのサンプルの測定が可能なので、い（つ かの用途でフローサイトメトリーを超える利点を提供するが、全血のような複合 生体内液の微量成分の検出や定量での利用には限界がある。

われわれが以前に述べたアッセイ・システムの感度や選択性を改善し、これらを 比較的複雑な細胞集団での関係細胞サブセットの臨床的および診断的分析に応用 可能とするための絶え間ない努力の結果、本発明が開発された。

発明の概要 本発明の一つの態様によれば、混合細胞集団のサブ集団の一部である選択された 細胞のサブセットの存在または量は、検出可能なリポータ−物質を関係サブセッ ト含むサブ集団の実質的にすべての細胞内へ均等に取込む方法により測定される 。

好ましい実施例では、検出可能なリポータ−物質は、方法のその後の特異的結合 相互作用を妨げないないようなやり方でその細胞の表面に結合させることにより 細胞のサブ集団内へ取込まれる。次に、標識されたサブ集団を含む混合細胞集団 の試験サンプルを、関係細胞サブセットの特徴的決定基に選択的に結合する特異 的結合物質でインキュベートし、それらの細胞と特異的結合物質の複合体を形成 する。そして、２つの画分を形成するよう、これらの複合体を混合細胞集団から 分離し、分離した画分のうち一方のリポータ−物質の存在を検出する。通常、検 出されるリポータ−物質のレベルは、細胞集団内の関係サブセットの存在または 量を測定するための所定基準と相関関係ある。

本発明の別の態様によれば、サブ集団（関係するいくつかのサブセットを含む） を含む細胞集団内部の２個以上の細胞の選択サブセットの存在または量を測定す るための方法が提供される。まず、多重サブセットを含むサブ集団の実質的にす べての細胞内に検出可能なリポータ−物質を均等に取込む。次に、標識サブ集団 を含む混合細胞集団の第１サンプルを、サブ集団の特徴的決定基に選択的に結合 する特異的結合物質で構成される試薬でインキュベートし、サブ集団と特異的結 合物質の細胞の複合体を形成する。そして、全標識サブ集団を含むこの複合体を 混合細胞集団から分離し、分離された画分中のリポータ−物質の存在を検出する 。

次に、箪１サンプルと同等の量と細胞濃度の標識サブ集団を含む混合細胞集団の 第２サンプルを、サブ集団内部の関係サブセットの特徴的決定基に結合する特異 的結合物質で構成される第２試薬でインキュベートする。こうして形成された複 合体を分離したあと、第２分離画分のリポータ−物質の存在を検出する。第２複 合体で検出されたリポータ−の量を第１複合体で検出された量と比較することに より、全サブ集団の細胞に対するサブセット細胞の相対比を測定する。

好ましい実施例では、関係するいくつかのサブセットの存在または量について細 胞サブ集団を分析する。各サンプルで検出されたリポータ−物質のレベルは、細 胞集団内部の関係サブセットの存在または量を測定するための１つ以上の所定基 準と相関関係があるとみられる。本発明の別の実施例では、標識されたサブ集団 を分析し、全サブ集団と関連したリポータ−物質の量に対する各複合体と関連し たリポータ−物質の量を定量することにより、サブ集団のいくつかのサブセット のそれぞれの比率を測定する。

本発明のさらに別の態様によれば、上記の方法を実施するためのテストキットが 提供される。このテストキットには、測定すべき対象の細胞の性質によりさまざ まな成分が含まれている。また、一般的に選択されたサブ集団内に取込むための 検出可能なリポータ−物質と、関係細胞サブセットの特徴的決定基との選択的相 互作用のための特異的結合物質が含まれている。また、このテストキットにはそ の他の成分として、試験サンプル中の関係サブセットの存在または量を測定する ための一つ以上の基準、このような（各）基準の調製指示書、またオプションと して本発明の方法を実行する上で有用なその他の付属品が含まれている。

本発明の各方法は、その目的が細胞頻度の変化を調べること（例えば、フローサ イトメトリーまたは蛍光顕微鏡）であるような、臨床実験室で現在用いられてい る上記の分析法の補助として、またいくつかの例では代用として用いてもよい。

本発明の方法は、以前はフローサイトメトリー分析に限定された多重パラメータ 測定の利用といっしょにｂｕｌｋ分析（例えば、エンザイムイムノアッセイ）と 関連した速度を合体させる。さらに、本発明の方法によって、このような先行技 術の方法で必要とされる複雑で高価な装置や高度な技術の熟練者が不要となる。

本発明の方法には先行技術を超える少な（とも２つの顕著な利点がある。第一に 、関係細胞サブセットを媒介手段を用いずに臨床設定での全血から直接定量する ことができる。関係サブセット中の細胞の絶対濃度を測定するためのその他の方 法では、２つ以上の異なる測定値を利用して関係値を得る。例えば、フローサイ トメトリーではサブセット中のリンパ球の絶対数ではなく比率を測定する。関係 サブセットの絶対血液濃度を得るには、次の計算を行なう。

＃１リットル血液当りのＣＤ４リンパ球＝（％ＣＤ４リンパ球）×（％白血球中 のリンパ球）Ｘ（１１リットル血液当りの白血球）このような分析では３つの一 連の測定を行なう。すなわち、フローサイトメトリー、白血球算定、および白血 球分画（分類）である。一般に、フローサイトメトリー分析は免疫学実験室で行 なわれるが、白血球算定と白血球分画は血液学実験室で行なわれる。これらは同 じ施設内の異なる実験室で行なってもよく、または異なる施設に設置されていて もよい。しかし、両方の実験室からのデータは、臨床医に報告される結果を得る よう編集しなければならない。

例えば１．ＡＩＤＳ患者でのアンドチミジン（Ａ　Ｚ　Ｔ）療法を開始するかど うかは、患者の血液１リットル当りのＣＤ４リンパ球数の測定値によって決まる 。この数が１リットル当り０．５００Ｘ１０’　ＣＤ４細胞以下に低下した場合 には、ＡＺＴ療法が推奨される。初期ＨＩＶ感染症のためのアジドチミジン療法 に関する技術の現状１ｍツいての会議、Ａｍ、Ｊ、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８９：３ ３５−４４　（１９９０年９月）参照。フローサイトメトリー分析には上記の計 算を必要とするため、血中リンパ球の画分の変化により、計算されたＣＤ４リン パ球濃度に誤差が生じる。一般に白血球の半分以上を構成する好中球は脆く、試 料の貯蔵中または臨床実験室への輸送中に分解する可能性がある。白血球中の好 中球の画分が減少すると、リンパ球の測定された画分中の付随物が増加するため 、血液１リットル当りのＣＤ４リンパ球の測定に潜在的な誤りが生じる。このよ うな結果により、実際に患者がＡＺＴ療法を受けるべきときに、医師はこれを行 なわないことを推奨する。

第二に、本発明の方法は、所定生体内液中の関係サブセットを選択的に定量する ためのｂｕｌｋアッセイを提供するものである。全血のような不均一集団では、 関係サブセットは、リポータ−物質による選択的標識と選択的免疫親和性分離と の組合せにより同定される。この利点は、ｂｕｌｋ分析のその他の従来技術から は得られない。

本発明のその他の利点については、下記の本発明の詳細な説明に関連した各図面 を検討することにより、当業者には自明である。

図面の簡単な説明 図１：はぼ同じ強度で単球とリンパ球を標識するＣＤ４５　（クローン２Ｄ１、 Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で標識された細胞の免疫蛍光染色パターン を示すフローサイトメトリー分析である。　Ｘ軸はフルオレセイン蛍光の対数関 数を表わし、ｙ軸は対数フィコエリトリン蛍光を表わす。

図２・リンパ球よりもはるかに低い強度での単球を標識するＣＤ４５　（クロー ンＡＬＢ１２、ＡＭＡＣ，Ｉｎｃ、）で標識された細胞の免疫染色パターンを示 すフローサイトメトリー分析ゼある。Ｘ軸はフルオレセイン蛍光の対数関数を表 わし、ｙ軸は対数フィコエリトリン蛍光を表わす。

図３：細胞基準曲線である。ＣＤ４リンパ球の数に対する蛍光強度の基準曲線が ここに記載した通り生成された。Ｘ軸はｍｍ３当りのＣＤ４リンパ球の数を表わ し、ｙ軸は蛍光強度を表わす。

図４：ビオチニル化ビードの基準曲線である。ビオチニル化ビード率に対する蛍 光の基準曲線がここに記載した通り生成された。Ｘ軸は全ビード集団内のビオチ ニル化ビード率を表わし、ｙ軸は蛍光強度を表わす。

図５＝クリンパの分析のための免疫親和性分離とフローサイトメトリーとにより 測定されたリンパ球率の相関関係である。Ｘ軸はフローサイトメトリーにより測 定されたリンパ球率を表わし、ｙ軸は免疫親和性分離により測定されたリンパ球 率を表わす。

図６：単核細胞（リンパ球と単球）の分析のための免疫親和性分離とフローサイ トメトリーとにより測定されたリンパ球率の相関関係である。

図５と図６でＸ軸はフローサイトメトリーにより測定されたリンパ球率を表わし 、ｙ軸は免疫親和性分離により測定されたリンパ球率を表わす。標識されたリン パ球を、ＣＤ４　（ロ）、ＣＤ２（◇）、またはＣＤ１９（△）モノクローナル 抗体から成る磁性ビードを用いてインキュベートした。

存在または量を効率よく測定するための方法を提供するものである。特徴的決定 基を発現するサブ集団およびサブセットを含む細胞懸濁または細胞集団で分析を 行ない、サンプル細胞懸濁内部の関係サブセットにおける細胞の総数を確認し、 または細胞サブ集団内部の細胞サブセットの比率を測定する。

「決定基」という用語は、ここではその広い意味で用いられ、あるものの性質を 同定または決定する要素を意味する。本発明の方法に関して用いられる場合、「 決定基」は、特異的結合物質への選択的結合に関係（関与）し、その存在が選択 的結合に必要される細胞の一部を意味する。細胞の決定基と特異的結合物質（例 えば、細胞表面抗原およびその相補的抗体）との間の選択的相互作用の手段によ る細胞の分離をここでは「親和性分離」と呼ぶ。

細胞関連性決定基として、例えば、宿主細胞またはウィルス源のいずれかの細胞 表面抗原を含む膜結合タンパク質または糖タンパク質、あるいは膜受容体などが あげられる。これらの決定基と選択的に相互に作用し合うために用いられる一種 類の特異的結合物質は免疫特異的に同一を認識する能力がある抗体である。ここ で用いられる「抗体」という用語にはモノクローナル免疫グロブリンまたはポリ クロナール免疫グロブリンおよび免疫反応性免疫グロブリン断片が含まれる。

特徴的決定基とそれらの特異的結合物質のそのほかの例として次のものがあげら れる。すなわち、受容体−ホルモン、受容体−配位子（リガンド）、免疫グロブ リンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ受容体−プロチインＡ１アビジン−ビオチン、ウィルス −受容体およびレクチン受容体。これらは、ここでは時により「特異的結合対」 と呼ぶ。

関係細胞サブセットは、全血、血清、血漿、尿、脳を髄液、羊水、洗浄液および 組織抽出物などの生体内液を含むさまざまな起源の試験サンプルまたは試料中に 存在するとみられる。

このような関係細胞にはヒトまたは動物が起源の細胞、あるいは培養細胞が含ま れる。診断、治療お“よび研究の各用途で特に関係するのは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、 およびヘルパーＴ細胞またはサプレッサー／細胞障害性Ｔ細胞のような認識され たＴ細胞サブセットを含むリンパ球である。各細胞の異なる系統は配位子の特徴 的抗原の発現により特徴づけられる。例えば、哺乳類の血液サンプルからのＢ細 胞は、同じサンプルからのＴ細胞により発現されるものと種類が異なる表面配位 子を発現する。同じサンプルからの一つの細胞サブセットを定量することは、い くつかの病理状態を評価する上で重要と思われる。例えば、ヒト免疫不全ウィル ス（ＨＩＶ）感染者は、疾患状態を測定したり治療をモニターする目的でＣＤ４ 糖タンパク質を保有するＴヘルパー細胞について検査を受ける。前に述べた通り 、サンプルを取った時点でこれらの細胞を直接測定することは、患者の疾患状態 を正確に評価するために重要である。別の例として、患者の血中単−Ｂ細胞クロ ーンの比率が異常に大きいと、白血病状態を示す。分化の異なる段階での同じ系 統からの細胞もまた、特徴的抗原または配位子の発現により区別できる。例えば 、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）が幹細胞からプレＢ細胞へ発達し、最終的に成熟Ｂ細胞 になると、細胞膜マーカーは細胞の成熟につれて予知可能なように変化する。成 熟Ｂ細胞は細胞膜上に配位子として免疫グロブリンを発現するが、プレＢ細胞は 細胞質免疫グロブリンＨ鎖だけを発現し、これがこれらの細胞サブセットの特異 的反応性の基礎を提供し、その後の測定を可能にする。配位子の特異な発現によ り、さらにウィルス感染症などの病因を評価するための基礎を得ることができる 。ウィルス感染した細胞は、細胞集団内部の非感染細胞が存在しないウィルス・ マーカーを発現するとみられる。

本発明の方法に従って関係サブ集団またはサブセットについて細胞集団を分析す る場合、その自然な生体内液あるいは適切な生体培地または合成培地で懸濁した 細胞集団を、最初に、選択サブ集団の実質的にすべての細胞内に均等に取込むこ とができる検出可能なリポータ−物質に露出させる。

本発明の目的のために、リポータ−が「均等に取込まれている」異なる試料から の細胞には、関係サブセット内部に一定量のリポータ−が分布されている。これ らの細胞は、各個々の細胞内に取込まれているリポータ−の量にはいくらのバラ ツキを示すが、このようなバラツキは関係サブセットおよび関係試料（病理試料 を含む）上で予知可能である。このようなバラツキはすべての病理試料について 予知可能というわけではなく、例えば、Ｔ細胞性白血病患者の試料はすべての試 料上に一貫しであるＴ細胞選択的リポータ−物質では標識されない。しかし、試 料上のバラツキは関係病理（例えば、ＡＩＤＳ患者の）試料について予知可能で なければならない。したがって、均等にＴリンパ球を標識したリポータ−が、サ ブブレッサーＴ細胞のサブセットよりも平均強度が異なるヘルパーＴ細胞のサブ セットを標識すると考えられるが、各サブセット間の平均強度の差異が異なる個 人から集められたサンプル間で一致している場合には、このリポータ−は本発明 を実施するのに適していると思われる。好ましい実施例では、リポータ−物質に 特異的な２つ以上のサブセットの組合せを利用し、関係サブセットを均等に標識 することができるが、これについてここでさらに一般的に述べ、また以下の例２ でさらに詳細に述べる。

「リポータ−物質」という語句は、ここではその検出または測定が、物理的手段 または化学的手段により直接的または間接的であり、試験サンプル内の関係細胞 サブ集団の存在を示す物質を指す。有用なリポータ−物質の例としては次のもの があげられるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、光吸収度、蛍光 、反射率、光散乱、りん光、発光（ルミネセンス）特性などにより直接的または 間接的に検出可能な分子またはイオン、その放射特性により検出可能な分子また はイオン、またその核磁気共鳴または常磁性特性により検出可能な分子またはイ オンである。例えば、光吸収度または蛍光により間接的に検出可能な分子グルー プの中にはさまざまな酵素が含まれており、これらにより適切な物質が、例えば 非光吸収分子から光吸収分子へ、または非蛍光分子から蛍光分子へ転化する。

好ましい実施例では、検出可能なリポータ−物質には酵素β−ガラクトシダーゼ が含まれるが、これは無着色または非蛍光基体が着色または蛍光生成物に転化し 、これをスペクトルで定量することができるアッセイで一般的に用いられている 。

リポータ−物質は、細胞の表面にカップリングさせることにより、または細胞内 部に挿入し内面化させることにより、選択サブ集団の細胞内へ均等に取込まれる 。細胞表面へのカップリングが取込み手段である場合には、このカップリングは 方法のその後の結合手段を妨げるものであってはならない。

細胞表面への検出可能なリポータ−物質のカップリングは、さまざまな方法によ って行なうことができる。好ましい実施例では、細胞表面決定基と抗体との間の 免疫学的相互作用により行なわれるカップリングといっしょに、それ自体が選択 サブ集団の細胞の少な（とも−個の決定基に選択的に結合する抗体にリポータ− 物質を結合させる。特定の細胞表面決定基に対するモノクローナル抗体は、この 実施例で大きな利点を得るために用いられる。例えば、全血のサブ集団を構成す るリンパ球は、白血球表面抗原に対向するモノクローナル抗体に結合されたリポ ータ−物質で均等に標識される。ＣＤ４５抗原はすべてのリンパ球上で均等に発 現されるが、ＣＤ４５抗原はまた、単球上で発現される。したがって、リンパ球 の選択的標識が望ましい場合には、単球よりもリンパ球上の細胞当りの結合部位 により多く結合するＣＤ４５モノクローナル抗体を選択する必要がある。所望特 性を有するＣＤ４５モノクローナル抗体のスクリーニングは、技術上既知の方法 （例えば、図１と２で示し、また例１で述べるサイトメトリー）により行なうこ とができる。

とくに好ましい実施例では、全血のサンプル内部のＴリンパ球だけを標識するこ とが望ましい。これは、上記の通り、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ７、およびＣＤ３抗 原などのＴ細胞表面抗　原に対向したモノクローナル抗体、またはその組合せを 用いて、Ｔリンパ球サブ集団を均等に標識することにより行なうことができる。

上記の実施例では、選択したリポータ−物質の抗体への直接共有付着は技術上既 知の方法により行なう。その代わりとして、分子の追加の特異的結合対の手段に よりリポータ−物質を抗体に連結させる方法がある。このような結合対の一つは アビジンとビオチンで構成されている。実際問題として、抗体はビオチンに前も って連鎖され、また特異的結合物質はアビジンに前もって連鎖される。両方の連 鎖を行なう方法については文献で報告されており、いくつかのビオチニル化抗体 とアビジン連鎖酵素が市販されている。こうして、リポータ−物質のカップリン グは、アビジン連鎖リポータ−物質とのビオチンとアビジンの相互作用と結合し た、ビオチニル化抗体と細胞表面抗原との間の免疫学的相互作用により達成され る。

本発明の方法にもとづく細胞サブセットの存在または量の測定は、関係サブセツ トの細胞と特異的結合物質との間の選択的相互作用によって達成される。本発明 を実施する上で用いられる特異的結合物質は、特徴的細胞決定基の選択的認識を 示す。例えば、特徴的細胞表面抗原を有するサブ集団および／またはサブセット について混合細胞集団を分析する場合、特異的結合物質は、関係抗原を免疫特異 的に認識する相補的抗体である。このような選択的認識にもとづき、特異的結合 物質は関係サブセットと選択的相互作用および結合が可能であり、試験培地およ び関係のないその他の成分から物理的または化学的に分離される複合体または集 塊を形成する。一つの好ましい実施例では、表面抗原ＣＤ４を保有するＴリンパ 球と単球を含む血液試料を、ＣＤ４モノクローナル抗体を構成する特異的結合物 質に露出させる。

特異的結合物質は適切に固相または不溶性液相に付加され、試験培地からの分離 を容易にする。固体保持体（例えば、ポリスチレン、ナイロン、アガロース・ビ ード）上に抗体を固定する方法は当業者には公知のものである。適切な方法とし ては、交差連鎖、共有結合、または物理的吸収などがあげられる。その代わりと して、第一次特異的結合物質と選択的に相互作用が可能であり、また固相に付加 される第二または補助の特異的結合物質といっしょに非固相の第一次特異的結合 物質を用いてもよい。この目的のために有用な代表的な第一次および補助的特異 的結合物質は次の通りである。溶性マウス抗体／固相に付加されるプロティン＾ 、溶性マウス抗体／別種で見られ、固相に付加される抗マウス免疫グロブリン、 ビオチニル化抗体／固相に付加されるアビジン。

検出可能なリポータ−と特異的結合物質の両方でのモノクローナル抗体の使用は 、非マウス免疫グロブリンと２つの第一次マウス抗体との間の交差反応性により 、上記の方法の補助的結合物質としての抗マウス免疫グロブリンの使用に限定さ れることに注意すべきである。同様の限定は、補助的抗体がリポータ−・システ ムで用いられる場合にもある。このような限定は、マウスＩｇＧ（例えば、Ｉｇ Ｇ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３）の唯一のサブクラスに特異的な補助的抗体を使用 することにより回避することができ、したがってリポータ−・システムと特異的 結合システムで異なるサブクラスが利用されるかぎり、アッセイでは唯一のモノ クローナル抗体と反応する。例えば、特異的結合物質は、抗マウスＩｇＧ２ｂを 通じて固相に付着したＩｇＧ２ｂサブクラスのＣＤ４モノクローナル抗体を構成 する。したがって、リポータ−物質は、ＩｇＧ１サブクラスの抗Ｔ細胞モノクロ ーナル抗体を構成する。

また、リポータ−物質または特異的結合物質のマウス・モノクローナル抗体の代 わりにラット・モノクローナル抗体を用いてもよい。こうして、特異的結合物質 は、ラットＩｇＧと交差反応しない抗マウスＩｇＧを介して固相に付着したＣＤ ４マウス・モノクローナル抗体を構成する。さらに、リポータ−物質はラットで 産生されるＴ細胞モノクローナル抗体を構成する。

本発明のとくに好ましい実施例では、特異的結合物質は、強磁性、常磁性または 反磁性材料で構成される磁性固相に付加され、試験培地から磁気的に分離可能な 関係分析物との複合体または集塊を形成する。特異的結合物質を磁性固相（例え ば、磁鉄鉱粒子）にカップリングする適切な方法については文献で述べられてい る。例えば、Ｅ、Ｍｅｎｚ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌａｂ。

（１９８６）参照。

関係細胞サブセットを試験培地から分離したあと、リポータ−物質を検出するこ とにより、関係サブセットの細胞と特異的結合物質との間の相互作用の発生を測 定するための基礎が得られる。リポータ−物質は分離画分、すなわちサブセット 細胞と特異的結合物質の複合体、または実質的にこのような複合体がない分離後 に残っている試験培地の中で検出される。以前の方法が好ましい。

分離画分または残りの試験培地の中で検出されるリポータ−物質のレベルは所定 基準と相関関係があるとみられる。基準との相関関係は測定が質的であるか量的 であるかに関係なく用いられる。質的測定では、所定基準は関係サブセットに存 在しないことがわかっている負の調節と考えられる。負の調節のバックグラウン ド・レベルよりもかなり高い量のリポータ−物質の検出は、関係サブセットの細 胞の存在を示す。量的測定では、検出されたリポータ−物質のレベルを、例えば 、同様に標識された細胞の１つ以上の前もって測定された量で検出されたレベル と比較し、試験サンプル内の細胞サブセットの絶対量を確認する。

量的測定は通常、リポータ−物質で標識された細胞の増加する既知量を含む基準 曲線の作成を必要とする。これら細胞の既知量は検出されたリポータ−物質のレ ベルに対して描く。基準曲線にもとづき、試験サンプル内の特定サブセットを構 成する細胞の量は、試験サンプル内で検出されるリポータ−物質のレベルから導 き出される。

量的検出は、毎日−貫しているとはかぎらない温度依存性酵素活性や計器補助測 定値などの可変パラメータを必要とするので、細胞基準曲線はリポータ−物質の 既知量に対して較正しなければならない。これを行なうには、リポータ−物質の 基準量を親和性分離に用いられる固相に付加してもよい。好ましい実施例では、 リポータ−は磁性または常磁性材料（例えば、ビードまたは粒子）に付加する。

磁気的に分離したあと、分離画分中に存在するリポータ−物質の既知量を測定す ることができる。細胞基準曲線の測定値をリポータ−物質のこの所定基準量と比 較することにより、サンプル内の絶対細胞を計算することができる。さらに、実 際のアッセイで付着させるのと同じやり方でリポータ−物質を固相に付着させる ことにより、リポータ−物質に実際のアッセイと同じ局部環境を与え、較正の正 確さを高める。

リポータ−物質はいくつかのやり方で検出される。試験培地の上記分離部分のい ずれかの細胞といっしょに取込まれたリポータ−物質の存在は、自動化方法論を 用いた細胞と培地の測定から直接測定される。好ましい実施例では、前に述べた 通り、検出可能なリポータ−物質は無着色または非蛍光物質に対して作用する酵 素で構成され、スペクトルで測定可能な産生物を形成する。例えば、β−ガラク トシダーゼは非蛍光ガラクトース類似物（４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ −ガラクトシダーゼ）を開裂し、ガラクトースと蛍光産生物（メチルウンベリフ ォン）を産生ずる。立体障害の問題を克服するには、検出前に検出可能なリポー タ−物質を複合体から取出すことが有利と考えられる。これは、技術上既知の化 学的開裂法により行なうことができる。例えば、Ｍｏｕｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ。

、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、２１８：１０１−１０８　（１９ ８２）参照。

本発明の前記の方法は混合細胞集団内部に存在する細胞サブ集団の分析に利用し 、その中の少なくとも一つの関係サブセットの比例発生を測定することができる 。この方法は、限定ではな（実施例のやり方で、次の測定に利用できる。すなわ ち、全血細胞集団内の白血球サブ集団のリンパ球、単球、および好中球サブセッ ト、白血球集団内のリンパ球サブ集団のＴ細胞とＢ細胞、または全リンパ球集団 内のＴリンパ球サブ集団のヘルパーＴ細胞とサブブレッサーＴ細胞の測定である 。

このようなやり方で細胞のサブセットの比例発生を測定するためには、個々の関 係サブセット内の細胞の相対数、ならびに同じサンプルまたは同等の体積と細胞 濃度のサンプル内部のサブ集団内の細胞の総数を測定する必要がある。

この測定を実施する場合、関係サブセットを含むと考えられるサブ集団を構成す る集団の実質的にすべての細胞を一つ以上の検出可能なリポータ−物質で均等に 標識する。全サブ集団の親和性分離は第１試薬を用いて行なわれるが、この試薬 には細胞サブ集団の特徴的決定基と選択的に相互作用可能な少なくとも一つの特 異的結合物質が含まれている。この第１試薬は、それぞれが細胞サブ集団内部の 個々の関係サブセットの決定基に結合する特異的結合物質の混合物で構成されて いるため、サブ集団の実質的にすべての細胞は第１試薬に結合される。例えば、 規定数の細胞サブセットの特徴的抗原と選択的に相互作用するいくらかのモノク ローナル抗体が第１試薬には含まれている。第１試薬をサブ集団に結合させる条 件下で集団の第１サンプル用いて第１試薬をインキュベートする。次に、このよ うにして形成された複合体を第１サンプル内の結合していない細胞から分離し、 分離された複合体のリポータ−物質の発生を検出する。この手順により、細胞の 関係サブ集団内部の細胞の相対数または絶対数が確認される。

その後、上記の通り、検出可能なリポータ−物質が取込まれており、第１サンプ ルと同等の体積と細胞濃度を有する細胞集団の第２サンプルを関係細胞サブセッ トの特徴的決定基に選択的に結合する一つ以上の特異的結合物質で構成される第 ２試薬でインキュベートする。このようにして形成された第２複合体を第２サン プル内の結合していない細胞から分離し、第２複合体内のリポータ−物質の発生 を検出する。

細胞サブ集団内の関係サブセットの比率は、第１複合体と関連したリポータ−物 質の量に対する第２複合体と関連したリポータ−物質の量を定量することにより 測定される。一般に、各サブ集団および／または個々の関係細胞サブセットで検 出されるリポータ−物質のレベルは、前に述べたように、所定基準と関係があり 、分析を行なっているサンプル内の細胞サブ集団および／または関係細胞サブセ ットの存在または量を測定することができる。関係比例サブセットのこの測定は 固相に付着させた試薬を用いて適切に実行されるが、固相は試験培地からの分離 が容易に行なえるよう磁性材料で構成されていることが好ましい。

集団に追加の関係細胞サブセットが含まれている場合には、追加の試薬を調製し て追加の各関係サブセットの親和性分離を行なってもよい。追加の試薬は、各サ ンプルがまた第１サンプルと同等の体積と細胞濃度である上記細胞集団の追加サ ンプルを用いてインキュベートする。各追加サンプルから分離された複合体内の リポータ−物質の検出により、各サンプル内部の個々の関係サブセットの比例発 生の指標が得られる。こうして、追加サンプル内のサブセット比例発生測定は、 上記の第２サンプル内の関係細胞サブセットの測定と同じやり方で実施される。

本発明の方法は、試験管、多重ウェル・プレート、および同様のものを含む従来 の容器を用いて行なってもよい。試験サンプル内のリポータ−物質のレベルを正 確に測定するための各検出器、例えば、比色計、分光光度計、蛍光スペクトロ光 度計、反射率計、液体シンチレーションカウンター、またはガンマカウンターな どは市販されている。

本発明の別の態様によれば、異なる試薬の前もって測定された量は、希釈液、開 裂作用物質、分析物を固定するだめの固体保持体、一つ以上の基準、またはその 調製のための指示書などを含む、本発明の方法を実行する上で用いられるさまざ まな付属品といっしょに、テストキット内に便利に包装される。テストキット内 に含まれる試薬の形態はさまざまである。リポータ−物質は、リポータ−を細胞 内に取込むための適切な希釈液といっしょに溶液の形態で提供される。リポータ −溶液は本発明の方法を実施するために適切な容器で提供される。その代わりと して、リポータ−物質は、方法の実行中にリポータ−および／またはその他の試 薬に加えるための希釈液または溶媒の別のガラス瓶といっしょに乾燥包装される 。特異的結合物質は、凍結乾燥または乾燥した適切な緩衝液中で懸濁される固体 保持体に固定して提供されることが好ましい。

表面カップリングの代わりとして、本発明の別の態様には細胞内部に挿入し内面 化される検出可能なリポータ−物質が含まれている。好ましい実施例では、検出 可能なリポータ−物質は、細胞内酵素による加水分解中に生存可能な細胞を挿入 可能な化合物で構成されており、加水分解された産生物は蛍光の手段により検出 が可能である。検出可能な加水分解された産生物は関係サブセットの分離中に細 胞内部に残っており、分離された複合体から抽出することにより測定することが できる。この実施例にとくに有用な化合物は、２′７−ビス（２−カルボキシエ チル）−５−（および−６）カポキシフルオレセイン、アセトキシメチル・エス テル（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ）であり、これは細胞内に２゛、７°−ビス（カルボキ シエチル）−５−（および６）カルボキシフルオレセイン（ＢＣＥＣＦ）に加水 分解される。その他の有用な化合物として次のものがあげられる。

１−［２−アミノ−５−（６−カルポキシインドールー２−ｙｌ）−フェノキシ ］　−２−（２”　−アミノ−５゛　−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ ゛、Ｎ′　−四酢酸、ペンタアセトキシメチルエステル、３−アセトキシ−５゛ （および６゛）−アセトキシメトキシカルボニル−１０−ジメチルアミノスピロ ［７Ｈ−ベンゾ［ｃ］キサンチン−７、１’　（３’Ｈ）−イソベンゾフラン］ −３°　−ｏｎｅ。

二酢酸フルオレセイン、および 二酢酸５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン。

こうして、本発明のこの態様では、選択サブ集団は混合集団（例えば、全血）内 のすべての生存可能な細胞で構成されているが、これには実質的に生存不能な細 胞の量が含まれる。しかし、すべての生存可能な細胞で構成される全血のサブ集 団には、顆粒球、単球およびリンパ球を含めて、いくつかの異なる細胞種（タイ プ）が含まれる。特定タイプのリンパ球が関係細胞サブセットである場合には、 特異的結合物質による親和性分離のために選択される表面抗原は、その特定細胞 サブセット上にだけ現われることが好ましい。その他の場合には、以下の例４で 述べる通り、追加の分離段階が必要である。

次の各実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する。これらの例は本発明の 方法の特定用途を示すものであり、決して本発明を限定するものと解釈されるべ きではない。別に示されないかぎり、溶媒比はすべて体積で示し、温度はすべて ℃で示す。

非選択的標識 全細胞集団が標識される米国特許出願第３４５，４３６号で述べられている方法 を超えるリンパ球選択的標識を用いた利点を示すために、次の比較を行なった。

Ａ、生体膜の脂質成分と安定的に関連したリポータ−物質を用いたすべての細胞 の標識 ＤＰＴＩ　（エタノール中の５ｍＭ）５μｍを５００μｍの血液に加えることに より、１゛　−ドコサニル−１−プロピル−３，３，３’　、３’　−ヨウ化テ トラメチル・インドカルボシアニン（ＤＰＴＩ）を用いて健康な個体からの血液 サンプルを染色した。室温で５分後、５ｍｌリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を加えて混 合した。

細胞懸濁液を遠心分離し、上澄液を取出した。染色細胞のアリクオツド（部分標 本）を赤血球の分析のためにとっておき、残りの血液を低張性塩化アンモニウム （トリス緩衝液中の１．５ｇ／ｌ、ｐＨ７）を用いて処理し、赤血球を溶解した 。

各サンプルをＣｏｕｌｔｅｒ　ＥＰＩＣ３（商標）　Ｐｒｏｆｉｌｅ　フローサ イトメータで分析した。各細胞サブ集団（例えば、リンパ球、単球、好中球、血 小板）をその光散乱特性により同定しくＨａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、の米国特許 ４．２８４，４１２参照）、各サブ集団の平均蛍光強度を測定した。

リンパ球と比較した正常な血液中の各細胞種の濃度と各細胞サブ集団の相対蛍光 強度（すなわち、細胞当りの平均強度）が表Ｉへの１〜２列に示しである。これ らの値から、細胞濃度に各細胞種の相対蛍光強度を掛けることにより、各サブ集 団内の全ＤＰＴＩシグナルの比を計算した。明らかに、全血では、大部分のＤＰ ＴＩシグナルは赤血球と関連している（３列）。

上記の各計算値を用いて、理論的計算を行い、以下の例３で述べる磁性ビードを 用いた典型的な免疫親和性分離後の相対ＤＰＴＩシグナルを推定した。一般に、 免疫親和性分離は絶対的なものではない。すなわち、はとんどつねに、細胞の非 特異的結合またはトラッピングにより、その他の細胞種の汚染が部分的（例えば 、５〜１０％）に見られる。リンパ球の親和性分離後の各細胞種からの相対ＤＰ ＴＩシグナルは、４〜６列で計算されている。これらのデータは、血中の細胞が すべてリポータ−物質（例えば、ＤＰＴＩ）で標識されると、赤血球などの汚染 細胞種からの重要なシグナルを用いずにリンパ球からのシグナルを測定するには 、例外的にリンパ球の選択的分離が必要であることを示している。

親和性分離が汚染シグナルより上の意味のあるリンパ球シグナルを検出するのに 充分に選択的であっても、血中のＣＤ４リンパ球の測定は、単球（これもまたＣ Ｄ４抗原を保有している）からのシグナルにより複雑となる（表２Ｂ）。正常な 個体では、ＣＤ４リンパ球は約４５％のリンパ球を含み、全リンパ球シグナルを １．００に設定した場合には、０．４５のシグナルを発生する。しかし、抗ＣＤ ４を用いた免疫親和性分離でもまた１、１１の全シグナルに対して単球（相対シ グナル０．６６）が分離される。この問題は、５％のＣＤ４リンパ球しかもたな いようなＡＩＤＳ患者からのＣＤ４リンパ球を分析する場合にさらに深刻であり 、関係サブセットからの相対シグナルは、０．７１のリンパ球と単球からの全シ グナルの存在下でわずか０．０５となる。

Ｂ、モノクローナル抗体に付着させたリポータ−物質を用いたリンパ球の選択的 標識 ＣＤ４５抗原はすべての白血球（リンパ球、単球、および好中球）上で発現する が、血小板または赤血球上には発現しない。本発明の方法によるリンパ球の分析 には、リンパ球に選択的に結合するＣＤ４５モノクローナル抗体（Ｍａｂ）が好 ましい。このようなＭａｂの選択はフローサイトメトリー分析により行われる。

表１−ＤＰＴＩ　（１００ｕＭ）を用いて染色した全血Ａ　サブ集団内ノブナル の分布 分離前　分離後 細胞の種類　（］、）　（２）　（３）　（４）　（５）　（６）細胞／　相対 　％全　％回復　％全　相対ＭＬ　強度　シグナル　細胞　シグナル　シグナル ＲＢ　Ｃ５，ＯＯＥ＋０９　０．０５　８６．０９％　５．０％　７２．０４％ 　５．１１顆粒球　４．４０Ｅ＋０６　１．７５　２．９５％　１０．０％　４ ．９３％　０．３５単球　５．ＯＯＥ＋０５　２．９２　０．５６％　１００％ 　０．９３％　０．０７（ａ）リンパ球　２．２０Ｅ＋０６　１．００　０．８ ４％　１００．０％　１４．０９％　１．００血小板　２．５０Ｅ＋０８　０． １０　９．５７％　５．０％　８．００％　０．５７全体　１００．０％　１０ ０．０％　７１０（ａ）すべての単球が分離された場合 には相対シグナル０６６ Ｂ、ＣＤ４＋細胞の完全分離後のシグナルの計算相対シグナル　全 リンパ球　単球　シグナル 正常な血液　（４５％リンパ球ＣＤ４＋）　０．４５　０．６６　１１１Ａ　Ｉ 　Ｄ　Ｓ患者（５％リンパ球ＣＤ４＋）　０．０５　０．６６　０．７１健康な 個体からの血液サンプルをＥＤＴＡ　（エチレンジアミン四酢酸）抗凝血物質で 集めた。２種類のＣＤ４５Ｍａｂ、すなわち、クローン２ＤＩ（Ｂｅｃｔｏｎ− Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）とクローンＡＬＢ１２（ＡＭＡＣ，Ｉｎｃ、）について試 験した。２０μｌのフルオレセイン抱合ＣＤ４５と、単球を標識する２０μｍの フィコエリトリン抱合ＣＤ１４（ＡＭＡＣ，Ｉｎｃ、）を用いて血液サンプル（ １００μｌ）をインキュベートした。各細胞を４℃で３０分間インキュベートし たあと、１０倍を上回る緩衝液（１％ウシ・アルブミンと０．１％アジ化ナトリ ウムを含むリン酸緩衝液）で希釈した。各サンプルを遠心分離し、上澄液を取出 した。製造者指示書にもとづき、Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｑ−Ｐｒｅｐ　（商標）ワー クステーション上に血液サンプルを配置した。この処置は、赤血球を溶解し、フ ローサイトメトリー分析のためにサンプルを固定するものである。

フローサイトメトリー分析の結果は、図１と２に示しである。図１のヒストグラ ム（度数分布図）は、単球とリンパ球の相対染色を示している。すなわち、枠１ にはフルオレセインでうす（暗）（染色した細胞とフィコエリトリンで明るく染 色した細胞が含まれており、枠２にはフルオレセインとフィコエリトリンの両方 で明るく染色した細胞、枠３にはフルオレセインとフィコエリトリンでうずく染 色した細胞、枠４にはフルオレセインで明るく染色し、フィコエリトリンでうず く染色した細胞がそれぞれ含まれている。この図で、リンパ球は明るい緑色の集 団（枠４）を構成し、顆粒球（好中球を含む）はうす暗い緑色の集団（枠３）を 構成している。単球はフィコエリトリンでより明るく染色するが、フルオレセイ ン標識ＣＤ４５でも明るく染色し、これは右上の枠内（枠２）で見られる。

図２のヒストグラムは、リンパ球、単球、および顆粒球の染色パターンを示して いる。この図で、リンパ球は明るい緑色の集団（枠４）を構成し、顆粒球はうす 暗い緑色の集団（枠３）を構成している。図１のヒストグラムと対照的に、単球 はフィコエリトリンで明るく染色するが、フルオレセイン標識ＣＤ４５クローン ＡＢＬ１２ではうすく染色するだけであり、これは枠２ではな（枠１に位置して いる。

フルオレセイン標識ＣＤ４５、クローン２ＤＩを用いて全血をインキュベートす ることにより、単球ならびにリンパ球が明るくフルオレセイン染色した（図１） 。比較すると、ＣＤ４５クローンＡＬＢ１２はリンパ球と強く反応したが、単球 とはほとんど反応しなかった（図２）。したがって、単球に対してリンパ球の選 択的標識が望ましい場合には、ＣＤ４５クローン、ＡＬＢ１２が好ましいクロー ンである。

表２−ＣＤ４５、クローンＡＬＢ１２で染色した全血Ａ、サブ集集団ソングナル 分布 分離前　分離後 細胞の種類　（１）　（２）　（３）　（４）　（５）　（６）細胞／　相対　 ％全　％回復　％全　相対ＭＬ　強度　シグナル　細胞　シグナル　シグナルＲ Ｂ　Ｃ５，００Ｅ＋０９　０．００　０．００％　５．０％　０．００％　００ ０顆粒球　４．４０Ｅ＋０６　１．０６　１５．２６％　１０．０％　１．７９ ％　０．０２単球　５．ＯＯＥ＋０５　０．５８　０．９５％　１０．０％　０ ．１１％　０．００（ａ）リンパ球　２．２０Ｅ＋０６　１１．６４　８３．７ ９％　１０００％　９８．１０％　１．００血小板　２．５０Ｅ十０８　０，０ ０　０．００％　５．０％　０．００％　０００全体　１００．０％　１０００ ％　１．０２（ａ）すべての単球が分離された場合 には相対シグナル０．ＯＩ Ｂ、ＣＤ４＋細胞の完全分離後のシグナルの計算相対シグナル　全 リンパ球　単球　シグナル 正常な血液　（４５％リンパ球ＣＤ４＋）　０．４５　０，０１　０．４６ＡＩ ＤＳ患者（５％リンパ球ＣＤ４＋）　０．０５　０．０１　０．０６ＣＤ４５り ０−ンＡＬＢ１２を用いた染色後のリンパ球と比較した各細胞サブ集団の相対蛍 光シグナルが、表２Ａの２列に示してあり、健康な個体のこれらの細胞種のそれ ぞれの濃度が１列に示しである。表２Ａの３〜６列の計算は、表１について上で 述べた通りである。

表２Ｂは、関係サブセットがすべてリンパ球か、またはＣＤ４リンパ球のいずれ かであるときのさまざまなサブ集団からのシグナルを示している。ＣＤ４５クロ ーンＡＬＢ１２を用いた細胞の染色後、分離されたリンパ球画分（その他の細胞 種の非特異的結合を含む）の全相対シグナルは１．０２であり、このうち１゜０ ０はリンパ球（関係サブセット）からのシグナルである。関係サブセットが健康 な個体からの血中ＣＤ４リンパ球であるとき、関係サブセットからの相対シグナ ルは０４６の全シグナル（顆粒球汚染がないと仮定）のうち０．４５である。

重症のＡＩＤＳ患者からのＣＤ４リンパ球が関係サブセットであるとき、リンパ 球からの相対シグナルは０，０６の全シグナルのうち０．０５である。こうして 、リンパ球の選択的標識により、米国特許出願第３４５，４３６号で述べられて いる非選択的標識法と比べて、バックグラウンド・シグナルが太き（削減される 。

本発明の一つの好ましい実施例により、試験サンプル内の関係サブセットにおけ る細胞の数を直接測定することが可能である。細胞数を直接定量するには、関係 サブセットの細胞ごとに取込まれたリポータ−物質の量が個々の間で比較的一定 であることが必要である。次の例は、関係細胞サブセットを均等に標識する能力 について、細胞表面抗原に対して与えた２種類のモノクローナル抗体の評価を示 すものである。

１．１４人のドナー（１１人の健康な個体と３人のＡＩＤＳ患者）から血液サン プルを抗凝血物質（ヘパリンまたはＥＤＴＡ）で集めた。

２．１００μｌの血液をフルオレセイン抱合ＣＤ２またはＣＤ３（Ｂｅｃｔ。

ｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ ）とフィコエリトリン抱合ＣＤ４　（ＡＭＡＣ，Ｉ　ｎｃ、）を用いて４℃で３ ０分間インキュベートした。

３．１ｍｌの緩衝液（１％ウシ・アルブミンと０．　１％アシ化ナトリウムを含 むＰＢＳ）を各サンプルに加えて混合した。

４、これらのサンプルを遠心分離し、上澄液を取出した。

５、標識血球を含む試験管をＣｏｕｌｔｅｒ　Ｑ−Ｐｒｅｐ　（商標）ワークス テーション上に配置し、製造者が推奨する通りに処理した。この処置は、その後 のフローサイトメトリー分析のために赤血球（ＲＢＣ）を溶解し、白血球（ＷＢ Ｃ）を固定するものである。

６、サンプルをＣｏｕｌｔｅｒ　ＥＰＩＣＳ　（商標）　Ｐｒｏｆｉｌｅ（商標 ）フローサイトメータで分析した。較正ビード（Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ　Ｃｏｒｐ、）を毎回（毎日）ノ実験中ニ含メタ。

７、各サンプルについて、ＣＤ４＋細胞上のフルオレセイン標識の平均蛍光強度 を測定した。サンプルと同じ日に較正ビードを用いて、この値の器具によるバラ ツキを補正した。これらの分析結果は次の通りであった。

エピトープ（ＣＤ）　ＣＤ４＋リンパ球の平均蛍光強度平均　標準偏差　係数の バラツキ ＣＤ　２　６．９　１．１５　１６．６％ＣＤ　３　２４．７５　２．９６　１ ２．０％ＣＤ２＋ＣＤ３　（計算値）　３１．６５　２．９　９．２％ＣＤ２＋ ＣＤ３　（測定値’Ｉ　３３．１１　２．１８　６．６％（Ｎ＝１１）これらの 結果は、２つの異なるモノクローナル抗体をリポータ−・システムで用いると、 個体間のエピトープ音間の生物学的バラツキが増大することを示している。

例３−　血液の体積当りのＣＤ４リンパ球の数の分析Ａ　細胞基準曲線の作成 １、磁性ビードを次の通り調製した。

ａ　モノクローナル抗マウスＩ　ｇＧ２　ａ　（ＡＭＡＣ，Ｉ　ｎ　ｃ、　）を 、メーカー指示書に従ってトソル活性化磁性ビード（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　（商 標）。

Ｄｙｎａｌ、　Ｉｎｃ、）にカップリングした。

ｂ　さらに、ＣＤ４（Ｃｙｍｂｕｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）か、または負の調 節モノクローナル抗体のいずれかを用いて抗マウスＩｇＧ２ａビードをインキュ ベートし、ＣＤ４ビードまたは負の調節ビードを作った。これらのモノクローナ ル抗体はいずれもＩｇＧ２ａサブクラスであった。

２　健康な個体からの血液をヘパリン抗凝血物質で集めた。

３　血液サンプルを、ビオチン抱合ＣＤ２　（Ｏｌｙｍｐｕｓ　Ｉｍｍｕｎｏｃ ｈｅｍｉｃａｌｓ：　イソタイプＩｇＧ１）を用いて４℃で３０分間インキユベ ートシて洗浄し、さらにまた５ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎに抱合したβ−ガラクト ノダーゼを用いて４℃で３０分間インキュベートして洗浄した。

４、この血液サンプルを２つのアリクオツドに分割した。一方のアリクオツドは 　ＣＤ４ビードを用いてインキュベートし、もう一方のアリクオツドには処置を 行なわなかった。

５、磁性ビードを用いてインキュベートした血液サンプルを磁石上に配置し、上 澄液を取出した。次に、このサンプルからＣＤ４リンパ球を取り除いた。

６．１００％ＣＤ４減損血液から０％ＣＤ４減損血液までの範囲のさまざまな比 で段階４からの未処置のアリクオツドとＣＤ４リンパ球を減損血液を混合した。

−個の細胞基準で構成される各混合物を１：５に希釈して用いた。

７、リンパ球数を各細胞基準についてＣｏｕｌｔｅｒカウンタで測定した。

８、各細胞基準のサンプルを免疫蛍光分析（ＣＤ４細胞比）および基準曲線で用 いるために部分標本にした。

９、基準曲線のために、各細胞基準の１００μｍサンプルを９６ウエル・プレー トの個々のウェルに配置した。

１０、ＣＤ４または調節ビードのいずれかの１０μｍ磁性ビードを各ウェルに加 え、プレートを４℃で３０分間インキュベートした。

１１、インキュベートしたあと、プレートを磁性ビードの分離のための磁石上に 配置し、細胞をビードに付着させた。

１２、磁性ビードに付着させていない細胞を含む上澄液を取出した。プレートを 磁石から取出すことにより磁性ビードと付着細胞を３回洗浄し、各ウェルに緩衝 液（１％ウシ・アルブミンと０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）を加えて 混合し、プレートを磁石にもどして配置し、上澄液を取出した。

１３．４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドを用いてビードと結 合細胞を含むベレットを３７℃で３０分間インキュベートした。

１４、これらのサンプルをふたたび磁石上に配置し、上澄液（β−ガラクトシダ ーゼとの反応から生じたメチルウンベリフェロンを含む）を取出して新しいプレ ートへ移した。

１５、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ　（商標）　ＩＩ　ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ　プレー ト・リーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ　ＯＹ）を用いて、メチルウンベリフェロ ンの蛍光を測定した。

１６、免疫蛍光分析のために、フルオレセイン抱合ＣＤ４とフイコエリトリン抱 合ＣＤ４５を用いて段階８からの各細胞基準のサンプルを標識した。白血球（Ｃ Ｄ４５＋）（ＣＤ４＋リンパ球であった）率について、フローサイトメトリーに より標識細胞を分析した。

１７、リンパ球数と、フローサイトメトリーにより測定されたＣＤ４リンパ球率 から各細胞基準におけるＣＤ４細胞の数を計算した。

１８、ＣＤ４リンパ球の数に対する（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ　（商標）プレート ・リーダーで測定された）蛍光強度の基準曲線を作成した（図３参照）。

この曲線の傾斜を用いて、−個のＣＤ４細胞が０．０６６蛍光単位に等しいこと を決定した。

Ｂ、ビオチニル化基準曲線の作成 ］、５ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）に抱合 したβ−ガラクトシダーゼを用いて、ビオチニル化磁性ビード（Ａｄｖａｎｃｅ ｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）を３０分間インキュベートし、洗浄した。

２　次にこれらのビードを、比率０〜３０％ビオチニル化ビード中のヤギ抗マウ スＩｇＧ磁性ビード（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）と混合した。

各混合物は一つのビード基準を含む。

３、各ビード基準のアリクオツドを９６ウエル・プレートの一つのウェル中に配 置し、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクシドを用いて、３７℃で３ ０分間インキュベートした。

４、プレートを磁石上に配置し、上澄液（β−ガラクトシダーゼとの反応から生 じたメチルウンベリフェロンを含む）を取出して新しいプレートへ移した。

５、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ　（商標）　ＩＩ　ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ　プレート 拳リーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ　ＯＹ）を用いて、メチルウンベリフェロン の蛍光を測定した。

６　ビオチニル化ビードに対する蛍光強度の基準曲線を作成した（図４参照）。

細胞基準曲線（図３）といっしょに、この曲線の傾斜を用いて、ＣＤ４の数がビ オチニル化ビード率に等しいことを次の通り決定した。すなわち、＃　ＣＤ　４ 当量　＝　蛍光単位　Ｘ　Ｉ　ＣＤ４細胞Ｃ９末梢血液サンプル内のＣＤ４リン パ球数の測定１、血液をヘパリン抗凝血物質で集めた。

２　ビオチン抱合ＣＤ２（Ｏｌｙｍｐｕｓ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ； イソタイプＩｇＧ１））を用いて血液サンプルを３０分間インキュベートし、洗 浄し、さらにまた５ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎに抱合したβ−ガラクトシダーゼを 用いて３０分間インキュベートし、洗浄した。

３、この血液を１：５に希釈し、１００μｌアリクオツドを９６ウエル・プレー トの個々のウェルの中に配置した。

４、抗ＣＤ４か、または調節ビードいずれかの１０μｍ磁性ヒートを各ウェルに 加えた。

５．３０分後、磁性ビードとビードに付着させた細胞を分離するためにプレート を磁石上に配置した。例３Ａの段階１２で述べた通り、細胞とビードを３回洗浄 した。

６．４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクシドを用いて、ビードと結合 細胞を含むペレットを３７℃で３０分間インキュベートした。

７、上記の通り、ビード基準を同じプレートに加え、４−メチルウンベリフェリ ル−β−Ｄ−ガラクトシドを用いて３７℃で３０分間インキュベートした。

８、このプレートを磁石上に配置し、上澄液（β−ガラクトシダーゼとの反応か ら生じたメチルウンベリフェロンを含む）を取出して新しいプレートへ移した。

９、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ　（商標）　ＩＩ　ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ　プレート ・リーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、サンプルと基準ウェル内のメチ ルウンベリフェロンの蛍光を測定した。

１０、サンプルごとのＣＤ４細胞の数を次の通り計算した。すなわち、＃ＣＤ４ 細胞　＝　蛍光ＣＤ４　−　蛍光調節　ｘ　ＣＤ４当量ビオチン・ビード率の蛍 光　％ビオチン・ビード１１、各サンプル内でＣＤ４リンパ球であった白血球率 もまた、例３Ａで述べた通り、免疫蛍光染色とフローサイトメトリーにより測定 した。次にこの率に白血球数を掛け、ｍｍ”当りのＣＤ４リンパ球数を測定した 。

１２、健康なドナーからの結果： サンプル　ｍｒｎ３当りの＃ＣＤ４リンパ球４　２６４７　２４００　０．９ （２）＝　本発明による方法 抗凝固血液（ヘパリンまたはＥＤＴＡ抗凝血物質）を２人の健康なドナー力）ら 集めた。各ドナーからの血液サンプルを精製ｌル＜球と濃縮白血球の調製のため に用いた。

精製リンパ球は次の通り調製した。フィコール（ｆｉｃｏｌｌ）密度勾配遠心法 により単核細胞を集めて、培地（１０％０％ラン血清を含むＲＰＭＩ［Ｇｊｂｃ ｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓコ）て−回洗浄し、ｍ１当り１×１０６細胞（こ 再懸濁し、組織培養フラスコの中で一晩中３７℃でインキュベートした。非付着 細胞を回復させ、カウントし、アッセイ緩衝液（１％ウン・アルブミン、００５ ％アシ化ナトリウム、４０ｍＭ　ＥＤＴ、Ａ、および５μｇ／ｍｌインドメタシ ンを含むＰＢＳ）の中でｍ１当りｌＸ１０６に再懸濁した。

濃縮白血球は次の通り調製した。同量のデキストラン（ＰＢＳ中の２％デキシト ラン）と血液を混合し、室温で３０分間インキュベートした。白血球濃縮上澄液 を集め、アッセイ緩衝液の中で一回洗浄し、ｍ１当りｌＸ１０６ｉこ再懸濁した 。

マウス・モノクローナル抗体ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９（ＡＭＡＣ，Ｉｎｃ製） またはＣＤ２　（Ｏｌｙｍｐｕｓ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含むヤ ギ・抗マウスＩｇＧ磁性ビード（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）をイ ンキュベートすることにより免疫磁性ビードを調製した。モノクローナル抗体を 含まないヤギ・抗マウスＩｇＧビードは、負の調節として用いた。

アッセイのために、細胞１００μｍを、２０μｌビード（ビード対細胞比５：１ ）を用いて９６ウエルの中で撹拌しながら４℃で３０分間インキュベートした。

磁性ビードと付着細胞を分離し、例３Ａで述べた通り、緩衝液で４回洗浄した。

２′、７°−ビス−（２カルボキンエチル）−５−（および６）カルボキシフル オレセイン、ペンタアセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、Ｍｏ　Ｉ　 ｅＣμＪａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）の１００ｍＭ溶液を使用する直前のアッセイ緩衝 液で調製した。最後の洗浄のあと、アジ化物を含まないアッセイ緩衝液１８０μ ｍとＢＣＥＣＦ−ＡＭ溶液２０μｍを各ウェルに加えた。ＢＣＥＣＦ−ＡＭを用 いて細胞を３７℃で３０分間インキュベートして、磁石上に分離し、上澄液を取 出した。トリトン（Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎ）Ｘ−１００（水中の１％）を各ウェルに 加え（ウェル当り２００μｌ）、細胞を溶解し、蛍光産生物、ＢＣＥＣＦを放出 した。

次に、上澄液１５０μｍをリーディング（読取り）プレートに移し、Ｆｌｕｏｒ ｏｓｋａｎ　（商標）　［ｍ１ｅｒｏｔｉｔｅｒ　プレート・リーダーでＢＣＥ ＣＦの蛍光を測定した。

全リンパ球シグナルをＣＤ２とＣＤ１９からの正味シグナルの合計として計算し た（正味シグナル＝Ｍａｂシグナルー負の調節シグナル）。

フローサイトメトリーによる標識リンパ球率の測定のために、各ドナーからの血 液サンプルをフルオレセイン抱合またはフィコエリトリン抱合ＣＤ４、ＣＤ８、 またはＣＤ２を用いてインキュベートした。例２で述べた通り、標識細胞をＣ。

ｕｌｔｅｒ　Ｇ、Ｐｒｅｐｔｏｎ　ワークステ　−ション上で調製して、Ｃｏｕ ｌ　ｔｅｒ　ＥＰＩＣ３（商標）　Ｐｒｏｆｉｌｅ　フローサイトメータで分析 した。リンパ球をフローサイトメータでのその光散乱特性により同定した。各Ｍ ａｂで標識されたリンパ球率を、ＬａｎｄａｙとＭｕｉｒｈｅａｄ（上記）で述 べられている標準的な分析法を用いて測定した。

免疫親和性分離とサイトメトリーを用いた各モノクローナル抗体により同定され たリンパ球率の比較が、図５と６に示しである。全リンパ球シグナルに対する各 Ｍａｂからの正味シグナルの比を用いて、図５と６のｙ軸の免疫親和性分離によ り測定されたリンパ球率を計算した。

図５かられかる通り、単球が実質的にサンプルに存在しないと、本発明の方法か ら得られた結果はフローサイトメトリーの結果と等しかった。しかし、図６は、 単球がサンプルから取り除かれると、ＣＤ４リンパ球の量はアッセイで過大評価 されたことを示している。これは、単球とリンパ球の両方がＣＤ４表面抗原を保 有しているという事実によるものである。

本発明は、説明および例示されている特別の実施例に限定されるものではな（、 請求の範囲に記載された発明の範囲を逸脱することなく、多くの変更態様が可能 である。

図１ 図２ ＬＦＬＩ−フルオレセイン蛍光 図３ ＃ＣＤ４リンパ球／ＭＭ３ ビオチニル化ビード率 図５ リンパ球率−フローサイトメトリー 図６ 濃縮白血球 リンパ球率−フローサイトメトリー 国際調査報告 ＰＣＴ／ＬＩＳ９１／６８２：１５ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｄ　４９３／１０ 　Ｅ　９１６５−４Ｃ（７２）発明者　ジエンセン、ブルース・ディーアメリカ 合衆国、ペンシルベニア州 １９４７３、シェンクスヴイル、レキシントンロード　２６２ （７２）発明者　ミュアフィールド、キャサリン・エイアメリカ合衆国、ペンシ ルベニア州 １９３８０、ウェストチェスター、キャスウォーレンドライブ　２２６ Ｉ （７２）発明者　ホラン、ポール・ケイアメリカ合衆国、ペンシルベニア州 １９３３５、ダウニングタウン、ヘロンヒルドライブ　３０ （７２）発明者　サマース、マーティン・ディーアメリカ合衆国、ペンシルベニ ア州 １９３８０、ウェストチェスター、グランドオークレイン　１４２９ （７２）発明者　ウォン、ウィリアム アメリカ合衆国、ペンシルベニア州 １９３１７、チャズフォード、レイヴンドライブ１７

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．混合細胞集団内部の細胞のサブ集団の選択サブセットの存在または量を測定 するための方法であって、混合細胞集団は前記サブセットを含み、前記サブセッ トは少なくとも一個の特徴的決定基を有し、前記方法が、（ｉ）前記混合細胞集 団内の前記サブ集団の実質的にすべての細胞内に選択的に検出可能なリポーター 物質を均等に取込む段階と、（ｉｉ）前記混合細胞集団の試験サンプルを、前記 サブセットの少なくとも一個の特徴的決定基に特異的に結合する特異的結合物質 と接触させ、前記選択サブセットと前記特異的結合物質とで構成される複合体を 形成する段階と、（ｉｉｉ）前記試験サンプルを、前記複合体を含む部分と、実 質的に前記複合体のない部分とに分離する段階と、 （ｉｖ）前記分離部分の一方の検出可能な前記リポーター物質の発生を検出し、 前記混合細胞集団内の前記選択サブセットの存在または量を測定する段階とで構 成されることを特徴とする方法。
2. ２．前記サブ集団がリンパ球を含み、前記サブセットが選択官能基と分化段階に より特徴づけられるリンパ球を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. ３．前記サブ集団がＴリンパ球を含み、前記サブセットがヘルパーＴリンパ球と サブプレッサーおよび細胞障害性Ｔリンパ球とで構成されるグループから選択さ れることを特徴とする、請求項１記載の方法。
4. ４．検出されたリポーター物質のレベルを所定基準に関係づけ、前記サンプル内 の前記サブセットの量を測定する段階を含むことを特徴とする、請求項１記載の 方法。
5. ５．前記特異的結合物質への前記関係サブセットの結合を妨げることなく、前記 サブ集団の細胞の表面にカップリングすることにより、リポーター物質を細胞の 前記サブ集団内に取込むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
6. ６．その存在または量を測定する前に前記リポーター物質を前記複合体から分離 することを特徴とする、請求項１記載の方法。
7. ７．前記リポーター物質が、前記サブ集団の細胞に一般的に見られる少なくとも 一つの結合部位に特異的に結合する少なくとも一個の抗体に付着されることを特 徴とする、請求項５記載の方法。
8. ８．前記リポーター物質が特異的結合対の一部分に付着され、前記抗体が前記特 異的結合対のその他の部分に付着され、前記カップリングが免疫学的結合と前記 特異的結合対の部分間の結合との総合効果により達成されることを特徴とする、 請求項６記載の方法。
9. ９．前記特異的結合対がアビジンとビオチンで構成されることを特徴とする、請 求項８記載の方法。
10. １０．前記試験サンプルを固相に付加した特異的結合物質と接触させることを特 徴とする、請求項１記載の方法。
11. １１．前記固相が磁性または常磁性材料で機成され、前記試験サンプルが磁性分 離により分離されることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
12. １２．前記特異的結合物質が抗体で構成されることを特徴とする、請求項１記載 の方法。
13. １３．前記試験サンプルを前記特異的結合物質と接触させる段階が、さらに、試 験サンプルを、前記特異的結合物質に特異的に結合する補助の特異的結合物質と 接触させることを含み、前記補助の特異的結合物質が固相に付加されていること を特徴とする、請求項１機内の方法。
14. １４．少なくとも一個の特徴的決定基を有し、混合細胞集団内部に存在する細胞 のサブ集団を分析し、前記細胞のサブ集団が個々の関係サブセットを含み、各サ ブセットが少なくとも一個の特徴的決定基を有し、前記細胞サブ集団の少なくと も一つの選択サブセットの集団を測定するための方法であって、（ｉ）前記混合 細胞集団内の前記サブ集団の実質的にすべての細胞内に選択的に検出可能なリポ ーター物質を均等に取込む段階と、（ｉｉ）前記細胞集団の第１サンプルを、前 記細胞サブ集団の特徴的決定基に特異的に結合する少なくとも一つの特異的結合 物質で構成される第１試薬と接触させることにより、前記第１サンプル内に第１ 複合体が形成される段階と、（ｉｉｉ）前記第１サンプル内の非複合細胞から前 記第１サンプル内の第１複合体を分離する段階と、 （ｉｖ）前記第１複合体内の検出可能な前記リポーター物質の発生を検出する段 階と、 （ｖ）前記第１サンプルと同等の体積と細胞濃度の段階（ｉ）からの前記細胞集 団の第２サンプルを、前記細胞サブ集団に含まれる前記選択関係サブセットの少 なくとも一個の特徴的決定基に特異的に結合する特異的結合物質で構成される第 ２試薬と接触させることにより、前記第２サンプル内に第２複合体が形成される 段階と、 （ｖｉ）前記第２サンプル内の非複合細胞から前記第２サンプル内の前記第２サ ンプルを分離する段階と、 （ｖｉｉ）前記第２複合体内の検出可能な前記リポーター物質の発生を検出する 段階と、 （ｖｉｉｉ）前記第１複合体と関連した検出可能な前記リポーター物質と関連し た検出可能な前記リポーター物質の量を定量することにより、前記細胞サブ集団 内の前記選択関係サブセットの比率を測定する段階とで構成されることを特徴と する方法。
15. １５．さらに、 （ｉｘ）各サンプルが前記第１サンプルと同等の体積と細胞濃度である段階（ｉ ）からの前記細胞集団の一つ以上の追加サンプルを、細胞の前記サブ集団に含ま れる追加の関係サブセットの特徴的決定基に特異的に結合する特異的結合物質で 構成される各前記追加試薬と接触させることにより、複合されていない前記混合 細胞集団のその他の細胞といっしょに、前記追加サンプル内に追加複合体が形成 される段階と、 （ｘ）各前記追加サンプル内の前記非複合細胞から各追加サンプル内の前記追加 複合体を分離する段階と、 （ｘｉ）前記追加複合体内の検出可能な前記リポーター物質の発生を検出する段 階と、 （ｘｉｉ）前記第１複合体と関連したリポーター物質の量に対する前記追加複合 体と関連したリポーター物質の量を定量することにより、前記細胞サブ集団内の 前記追加サブセットの比率を測定する段階とを含むことを特徴とする、請求項１ ４記載の方法。
16. １６．前記第１試薬が特異的結合物質の混合物で構成され、各前記結合物質が前 記サブ集団で構成される個々の関係サブセットの特徴的決定基に特異的に結合し ていることにより、前記サブ集団の実質的にすべての細胞が前記結合物質の一つ またはもう一つに結合されることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
17. １７．前記特異的結合物質への前記関係サブセットの結合を妨げることなく、前 記サブ集団の細胞の表面にカップリングすることにより、リポーター物質を細胞 の前記サブ集団内に取込むことを特徴とする、請求項１４記載の方法。
18. １８．検出可能な前記リポーター物質を、その存在または量を測定する前に前記 複合体から取出すことを特徴とする、請求項１４記載の方法。
19. １９．前記サブ集団の細胞に一般的に見られる少なくとも一つの結合部位に特異 的に結合する少なくとも一個の抗体に前記リポーター物質を付着させ、前記カッ ブリングが免疫学的結合により達成されることを特徴とする、請求項１７記載の 方法。
20. ２０．前記リポーター物質を特異的結合対の一方の部分に付着させ、前記抗体を 前記特異的結合対のもう一方の部分に付着させ、前記カップリングが免疫学的結 合と、前記特異的結合対の部分間の結合との総合効果により達成されることを特 徴とする、請求項１９記載の方法。
21. ２１．前記第１試薬の前記特異的結合物質と前記第２試薬の前記特異的結合物質 がそれぞれ固相に付加されることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
22. ２２．前記第１試薬の前記第１特異的結合物質と前記第２試薬の前記特異的結合 物質がそれぞれ磁性または常磁性粒子に付加され、前記関係サブ集団を含む前記 第１複合体と、前記選択サブセットを含む前記第２複合体が前記サンプルから磁 気的に分離されることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
23. ２３．前記第１サンプルまたは前記第２サンプルを、前記第１試薬または前記第 ２試薬とそれぞれ選択的に相互作用が可能な補助的な特異的結合物質と接触させ 、前記補助的な特異的結合物質が固相に付加されることを特徴とする、請求項１ ４記載の方法。
24. ２４．生体存在物のサブ集団の存在または量を測定する方法であって、前記存在 物の集団内部には少なくとも一個の特徴的決定基があり、（ｉ）前記集団内部の 前記生体存在物のすべての中に検出可能なリポーター物質を取込む段階と、 （ｉｉ）前記結合物質を少なくとも一個の前記決定基へ結合させる条件下で、生 体存在物の前記サブ集団の少なくとも一個の特徴的決定基と選択的に相互作用が 可能である特異的結合物質と前記生体存在物を接触させる段階と、（ｉｉｉ）生 体存在物の前記サブ集団を保有する前記結合物質を前記集団から分離する段階と 、 （ｉｖ）生体存在物の前記分離サブ集団または前記サブ集団の分離後に残ってい る集団の中の検出可能な前記リポーター物質の発生を検出し、前記集団内部で前 記特徴的決定基を有する生体存在物の存在または量の指標を提供することを特徴 とする方法。
25. ２５．前記リポーター物質が、 １−［２−アミノ−５−（６−カルボキシインドール−２−ｙ１）−フェノキシ ］−２−（２′−アミノ−５′−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，ＮＮ′− 四酢酸、ペンタアセトキシメチルエステルと、３−アセトキシ−５′（および６ ′）−アセトキシメトキシカルボニル−１０−ジメチルアミノスピロ［７Ｈ−ベ ンゾ［ｃ］キサンテン−７，１′（３Ｈ）−イソベンゾフラン］−３′−ｏｎｅ と、二酢酸フルオレセインと、 二酢酸５−（および−６）−カルボキシフルオレセインと、２′，７′−ビス（ ２−カルボキシエチル）−５−（および６）カルボキシフルオレセイン・アセト キシメチル・エステルとで構成される基から選択されることを特徴とする、請求 項２４記載の方法。