DE68919828T2 - Nanoteilchen mit gebundenen enzym und ligand zur verwendung bei analysen. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuen Typ eines Reagens, wie es zur Bestimmung einer Zelle, eines Virus oder einer anderen Komponente in einem Test verwendet wird, und auf die Verwendung des Ragens für diagnostische, klinische, histochemische oder mikroskopische Anwendungszwecke.
Hintergrund der Erfindung
• Eine chemische Analyse, die auf der spezifischen biologischen Affinität zwischen Rezeptor und Ligand, beispielsweise zwischen Antikörper und Antigen, zwischen Lectin und Kohlenhydrat, zwischen Nucleotiden und dgl. basiert, wird seit mehreren Jahren angewendet und ihre Verwendung zur Abtrennung und Bestimmung von Zellen, Viren oder anderen Komponenten in Proben hat in den letzten Jahren zugenommen. Beispiele dafür sind Analysen, die auf Antikörpern beruhen, d.h. die Immunverfahren. Antikörper werden hier verwendet für die spzifische Bindung des Analyten in der Probe. Der Nachweis des Antikörper-Ligand-Komplexes oder des freien Antikörpers kann auf verschiedene Weise erfolgen. In dem sogenannten Radioimmunoassay (RIA) werden radioaktiv markierte Antikörper oder Liganden verwendet, es wurden aber auch bereits beispielsweise Bacteriophagen, freie Radikale, fluoreszierende oder lumineszierende Gruppen, verschiedene Enzyme und Teilchen als Markierungsmittel in Immunoassays verwendet (vgl. z.B. Ngo und Lenhoff, Herausgeber, "Enzyme-mediated immunoassay", S. 3-32, Plenum Press, 1985, Literaturstelle 1). Der RIA dominierte jedoch. Trotz der Vorteile von RIA, haben seine Nachteile, wie z.B. die Instabilität einiger Gamma-Emitter und die Gesundheitsgefahren durch die Synthese und die Handhabung der radioaktiven Liganden oder Antikörper, dazu geführt, daß die radioaktiven Markierungsmittel allmählich durch andere Typen von Markierungsmitteln ersetzt werden. Es hat sich gezeigt, daß insbesondere der Enzym-Immunoassay (EIA; Literaturstelle 1, und Engvall, "Meth. Enzymol.", 70, S. 419-439; Literaturstelle 2) Vorteile bietet und er wird mehr und mehr angewendet. Der EIA wird unterteilt in den homogenen EIA und den heterogenen EIA. Der heterogene EIA, der den ELISA (den Enzym-gebundenen Immunosorbens-Assay) umfaßt, basiert auf den gleichen Prinzipien wie der RIA und hat sehr häufig eine ähnliche Empfindlichkeit und Spezifität. Diese Immunverfahren und Methoden, die auf anderen Typen von biospezifischen Wechselwirkungen für die Analyse von Zellen, Viren oder anderen Komponenten in Proben basieren, erfordern Methoden für die Konjugation des Rezeptors oder Liganden mit irgendeinem Typ der Markierungssubstanz (beispielsweise einem Enzym oder einer radioaktiven Substanz). Selbst wenn mehrere dieser Verfahren, die auf chemischen Reagentien basieren, bereits in der Literatur beschrieben sind (wie z.B. Glutaraldehyd-, Perjodat- oder Thiol-Substanzen; vgl. O'Sullivan und Marks, "Meth. Enzymol.", Band 73, S. 147-166, Literaturstelle 3; Literaturstelle 2 und weitere relevante Artikel in "Meth. Enzymol.", Bände 70, 73 und 92), haben sie dennoch alle Nachteile. Es ist beispielsweise schwierig, mit den bereits existierenden Verfahren beispielsweise reproduzierbare und kontrollierbare Enzym-Antigen-, Enzym- Antikörper- oer Enzym-Lectin-Konjugate und andere Typen von Enzym-Ligand- oder Enzym-Rezeptor-Konjugaten zu erzeugen. Bei einem Verfahren werden Konjugate erhalten, die in Größe und Struktur heterogen sind. Außerdem kann die Konjugation eine Verringerung der Enzymaktivität oder -spezifität des Liganden oder Rezeptors verursachen. Selbst wenn die Empfindlichkeit häufig ausreichend ist, ist dennoch der EIA in vielen Fällen durch eine unzureichende Empfindlichkeit beschränkt. Man hat nun versucht, die Empfindlichkeit zu erhöhen durch Verwendung von mehr oder weniger komplizierten Systemen, wie Avidin-Biotin (Kendall et al., "J. Immunol. Meth.", Band 56, S. 329, 1983, Literaturstelle 4, vgl. auch Literaturstellen 1 bis 3 und die relevanten Artikel in "Meth. Enzymol.") oder sogenannte Enzym- Kaskaden (US-Patentanmeldung Nr. 307 600 (Self); Literaturstelle 5).
• Bei einem einfacheren System wird ein lösliches, oligomeres Enzym verwendet, das an einen Antikörper gekuppelt ist. (Leary et al., "Proc. Nat. Acad. Sci.", Band 80, S. 4045, 1983; Literaturstelle 6). Auch wenn diese sogenannten Verstärkungsverfahren bei vielen Anwendungen nützlich sind, haben sie ihre Beschränkungen und Nachteile und Ngo erwähnt in einer Übersicht, daß eine höhere Empfindlichkeit für EIA und bessere Verfahren zur Herstellung von Enzym-Ligand- oder Enzym-Rezeptor-Konjugaten erwünscht sind.
• Eines der Ziele vorliegenden Erfindung besteht darin, diese Nachteile von EIA zu vermindern und es werden ein einfaches Verfahren zur Bildung von Enzym-Antigen-, Enzym- Antikörper- oder Enzym-Lectin-Konjugaten sowie Konjugaten zwischen einem Enzym und anderen Typen von Liganden oder Rezeptoren beschrieben. Außerdem wird angegeben, wie dieses Reagens zum Nachweis einer Zelle, eines Virus oder einer anderen Komponente in einer Probe verwendet werden kann und wie eine erhöhte Empfindlichkeit, verglichen mit den früheren Verfahren, erzielt werden kann durch Verwendung des erfindungsgemäßen Reagens.
• Diese und andere Ziele können erfindungsgemäß erreicht werden durch eine kovalente oder nicht-kovalente Bindung eines Enzyms und mindestens einer Substanz, welche die Fähigkeit hat, sich spezifisch an den Analyten oder an eine andere Komponente zu binden in einem Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, der ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus einem Antikörper, einem anderen Protein, einem Coenzym und einem Kohlenhydrat, wie z.B. zwischen Enzym und Antikörper oder zwischen Enzym und Lectin oder zwischen Enzym und Antigen (oder allgemein zwischen Enzym und Ligand oder Rezeptor) an einen geeigneten Typ von Teilchen, die einen Durchmesser von ≤ 100 nm haben und die in dem Medium (in der Regel gepuffertes Wasser) unlöslich sind, das in der Konjugationsreaktion mit den Teilchen und bei der Bestimmung des Analyten verwendet wird, und außerdem durch Verwendung des so gebildeten Reagens anstelle von und auf die gleiche Weise wie die bereits beschriebenen Enzymkonjugate für den spezifischen Nachweis einer Zelle, eines Virus oder einer anderen Komponente in einem Test.
• Durch Änderung der Größe der Teilchen, der chemischen und physikalischen Struktur, des Typs der Oberfläche (hydrophob, hydrophil, mit oder ohne reaktionsfähige Gruppen), des Enzyms, des Antikörpers oder des Antigens (ein anderer Typ von Rezeptor oder Ligand) und außerdem durch Änderung ihrer Konzentrationen kann man Teilchen-Konjugate mit für die Anwendung geeigneten Eigenschaften erhalten.
• Anwendungsbeispiele für das erfindungsgemäße Reagens sind die Anwendung in ELISA (Literaturstellen 1 und 2), in immunhistochemischen Untersuchungen (Avrameas, "Histochem. J.", Band 4, S. 321, 1972; Literaturstelle 7), das Immunblotting (Tsang et al., "Meth. Enzymol.", Band 92, S. 377; Literaturstelle 8) in mikroskopischen Untersuchungen für den Nachweis von Antikörpern in Zellstrukturen und dgl.
• Beispiele für Verfahren, in denen das erfindungsgemäße Reagens verwendet werden kann, sind die konkurrierenden und nicht-konkurrierenden ELISA-Verfahren und das USERIA- Verfahren (Hsu et al., "Meth. Enzymol.", Band 73, S. 383; Literaturstelle 9). Die löslichen Enzym-Konjugate, die früher in diesen Verfahren verwendet worden sind, werden demzufolge durch die erfindungsgemäßen Reagentien ersetzt. Im übrigen sind die Verfahren bei Durchführung der Assays (Proben bzw. Tests) identisch oder ähnlich denjenigen, wie sie in der Literatur für die EIA-Verfahren beschrieben sind (Literaturstelle 1.2 und dgl.). Einige Beispiele für die ELISA-Prinzipien, nach denen das erfindungsgemäße Reagens verwendet werden kann, sind in den nachfolgenden Reaktionsschemata dargestellt (vgl. S. 5/6, worin L steht für den Analyten, d.h. die Komponente, die bestimmt werden soll, Ab steht für den Antikörper oder ein Lectin, ein Kohlenhydrat, ein Coenzym und dgl. mit einer spezifischen Affinität für L, E steht für ein Enzym, S steht für ein Enzymsubstrat und P steht für das Produkt, das nachgewiesen wird, Lm- -En und Abm- -En symbolisieren Beispiele für erfindungsgemäße Reagentien, wobei - - für das Teilchen und für die Feststoffphase stehen).
• In den oben angegebenen Literaturstellen 1 und 2 und in den in diesen Artikeln genannten Literaturhinweisen) werden die ELISA-Verfahren mit löslichen Enzym-Konjugaten ausführlich erläutert ebenso wie die dabei verwendeten Puffer und sonstigen Reagentien und Anwendungen und die Verfahren und Anwendungen bei Verwendung des erfindungsgemäßen Reagens sind ähnlich oder identisch. ELISA vom konkurrierenden Typ ELISA vom Inhibierungstyp ELISA vom nicht-konkurrierenden (Sandwich)-Typ ELISA vom indirekten Typ (Ab&sub1; = Analyt)
• Das erfindungsgemäße Reagens kann auch zusammen mit vielen der bereits für ELISA beschriebenen Verstärkungsverfahren (Avidin-Biotin, Enzym-Kaskade, USERIA und dgl.) verwendet werden. So können beispielsweise bei Avidin-Biotin das Avidin (A) und ein Enzym (E) an die Teilchen ( ) gekuppelt werden und das resultierende Ragens kann für den Nachweis eines gebundenen, mit Biotin markierten Antikörpers oder Analyten verwendet werden und es können beispielsweise die fertigen Komplexe, wie sie in dem nachfolgenden Schema dargestellt sind, nachgewiesen werden. biotin avidin(und dgl.; Dakopatts Product list, 1988; Literaturstelle 10).
• Bezüglich Übersichts-Artikeln von Avidin-Biotin vgl. HSU et al., S. 467, in Ngo und Lenhoff (Literaturstelle 1) und Wilchek und Bayer, "Immunology Today", Band 5, S. 39, 1984 (Literaturstelle 11). Die Empfindlichkeit kann erhöht werden durch weitere Umsetzung des in den obengenannten Enzym-Reaktionen gebildeten Produkts P mit anderen Enzymen (beispielsweise gemäß der obengenannten Literaturstelle 5) oder durch Umwandlung von P in eine lumineszierende Substanz, beispielsweise nach Wannlund und Deluca, "Meth. Enzymol.", Band 92, S. 426 (Literaturstelle 12).
• Das Endprodukt wird vorzugsweise durch ein konventionelles ELISA-Verfahren nachgewiesen, d.h. mit dem Auge durch Messung der Extinktion, Fluoreszenz und dgl., oder die Reaktion wird kinetisch verfolgt (Tsang et al., "Meth. Enzymol.", Band 92, S. 391; Literaturstelle 13). Außerdem kann das Produkt P radioaktiv sein und von dem Substrat beispielsweise durch eine Sephadex -Säule abgetrennt und mit einem Szintillations-Zähler quantitativ bestimmt werden (USERIA; vgl. die obige Literaturstelle 9). Die vorstehenden Angaben stellen nur Beispiele dar, wie die Erfindung in der täglichen Praxis angewendet werden kann, und sie sollen den Bereich der Erfindung keineswegs darauf beschränken. Das gleiche gilt für die folgenden Beispiele für den Teilchentyp, die Konjugations-Chemie, die Enzyme, die Liganden oder Rezeptoren, den Typ der Proben und Komponenten und die Typen von Feststoffphasen, die bei der Anwendung der Erfindung verwendet werden können.
• Die Teilchen können aus einer Polymersubstanz bestehen, die in Wasser löslich ist und aus natürlichen, halbsynthetischen oder synthetischen Materialien bestehen kann. Als Beispiele dafür können genannt werden Silicate, Borsilicate, Zeolithe, Aluminate, anorganische Teilchen, deren Oberfläche mit organischen Materialien modifiziert worden sind, die beispielsweise Alkylgruppen, aromatische Gruppen, Hydroxylgruppen, Epoxygruppen, Aldehydgruppen enthalten, Ester, Kunststoffe (Polyvinylalkohol, Polystyrol und dgl.), Copolymere (z.B. Eupergit und Dynospheres ), vernetzte Polysaccharide, Liposome, künstliche Zellen und dgl.
• Die Immobilisierung des Enzyms und des Liganden oder Rezeptors an den Teilchen kann leicht vom Fachmann auf diesem Gebiet durchgeführt werden und stellt keine Beschränkung der vorliegenden Erfindung dar. Die Oberfläche der Teilchen kann mehr oder minder hydrophob sein. Eine hydrophobe Oberfläche kann angewendet werden zum nicht-kovalenten Binden eines Enzyms und eines Liganden oder Rezeptors an das Teilchen. Sowohl hydrophobe (wie z.B. Polystyrol- Teilchen, die nitriert, reduziert und diazotiert sein können) als auch hydrophile Oberflächen können chemisch modifiziert werden durch Einführung von reaktionsfähigen Gruppen für das kovalente Binden und die Literatur auf diesem Gebiet ist sehr umfangreich (vgl. z.B. "Method Enzymology", Bände 44, 104 und 135).
• So können beispielsweise Diazo-, Cyanat-, Ester-, Tosyl- oder Tresylgruppen, Aldehyd-, Epoxy-, Divinylsulfon-, FMP- Gruppen leicht hergestellt werden. Nach dieser sogenannten Aktivierungsstufe wird die sogenannte Kupplung des Enzyms und des Liganden gleichzeitig oder nacheinander an das Teilchen durchgeführt. Nach dem Kuppeln, das bei einem geeigneten pH-Wert und einer geeigneten Temperatur durchgeführt wird, werden die Teilchen nach dem Zentrifugieren gewaschen und das Reagens kann dann beispielsweise in den obengenannten Typen von EIA-Verfahren eingesetzt werden. Die Konzentration der Teilchen in der Kupplungsstufe wird bei einem geeigneten Wert gehalten, um die Vernetzung der Teilchen zu vermeiden. Die so hergestellten Teilchen mit daran gebundenem Enzym und Ligand oder Rezeptor können gegebenenfalls entsprechend ihrer Größe abgetrennt werden unter Verwendung beispielsweise einer Sephadex -Säule. Die Verhältnisse Ligand/Enzym oder Rezeptor/Enzym werden je nach Anwendung ausgewählt. Ein hohes Verhältnis von Enzym zu Rezeptor oder Ligand kann eine hohe Enzymaktivität ergeben, sie kann aber auch zu einer niedrigen Bindungskapazität führen. Der Fachmann auf diesem Gebiet kann leicht die optimalen Bedingungen für eine gegebene Situation ermitteln. Gegebenenfalls kann das Enzym zuerst gekuppelt werden und dann kann der Ligand oder der Rezeptor entweder direkt an die restliche Teilchenoberfläche oder an das Enzym gekuppelt werden mit Hilfe eines Vernetzungsmittels vom Glutaraldehyd-Typ oder mit Hilfe einer Reagens vom Perjodat-Typ. Erfindungsgemäß kann man auch ein Konjugat zwischen einem Enzym und einem Liganden oder einem Enzym und einem Rezeptor an die Teilchen kuppeln. Man erhält eine erhöhte Empfindlichkeit mit dem erfindungsgemäßen Reagens im Vergleich zu dem entsprechenden löslichen Konjugat zwischen mehreren Enzymmolekülen pro Teilchen und pro Komponente in der Probe.
• Die Größe der Teilchen wird im Hinblick auf den Anwendungsszweck ausgewählt. Vorzugsweise werden Teilchen mit einem Durchmesser von < 500 Å verwendet, um die Gefahr zu minimieren, daß das erfindungsgemäße Reagens nach der Bindungsstufe beispielsweise in einem Sandwich-ELISA-Verfahren ausgewaschen wird. Diese Größe erlaubt auch, daß mehr (mehrere) Enzymmoleküle und Rezeptor- oder Ligandenmoleküle an jedes Teilchen gebunden werden, und es erlaubt auch eine homogene Teilchensuspension. Beispiele für im Handel erhältliche Teilchen mit einer geeigneten Größe sind die Siliciumdioxid-Teilchen Aerosol von Degussa. Die hydrophilen Aerosil-Teilchen können leicht silaniert und aktiviert werden beispielsweise mit Tresylchlorid (Nilsson und Mosbach, "Meth. Enzymol.", Band 104, S. 56; Literaturstelle 14), Perjodat und dgl.
• Die Auswahl des Enzyms und des Enzymsubstrats kann durch den Fachmann leicht erfolgen und stellt keine Beschränkung der Erfindung dar. Alle Enzyme, die an Teilchen gekuppelt werden können, können erfindungsgemäß verwendet werden. Es kann jedes beliebige Enzym und jedes beliebige Substrat verwendet werden, die für die Anwendung geeignet sind und es können die gleichen Enzyme und Substrate, wie sie in dem ELISA, in immunhistochemischen Untersuchungen, Immunoblotting- und mikroskopischen Untersuchungen eingesetzt werden, verwendet werden. Beispiele für Enzyme, die verwendet werden können, sind Peroxidase, alkalische Phosphatase, Galactosidase, Urease, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase und Luciferase. Zur Erhöhung der Enzymaktivität pro Teilchen kann ein Enzym mit einer hohen Umsatz-Zahl und einem verhältnismäßig niedrigen Molekulargewicht verwendet werden. Beispiele für Enzymsubstrate, die zusammen mit dem erfindungsgemäßen Reagens verwendet werden können, sind in den Literaturstellen 1 bis 13 und in den relevanten Artikeln in "Meth. Enzymol.", Bände 70, 73 und 92, angegeben.
• Wie oben angegeben, sollte der Ligand oder der Rezeptor, d.h. die Substanz, die zusammen mit dem Enzym an das Teilchen gekuppelt wird, in der Lage sein, entweder den Analyten (d.h. die Komponente, die in der Probe nachgewiesen werden soll) oder einen Antikörper, ein anderes Protein (Lectin, Avidin und dgl.), ein Coenzym, ein Kohlenhydrat und dgl., biospezifisch zu binden. Die Substanz, die zusammen mit dem Enzym an das Teilchen gekuppelt wird, kann mit dem Analyten identisch sein oder sie kann ein Analogon davon sein. Diese Substanz kann beispielsweise sein ein Antikörper, ein Lectin, Avidin, eine andere Art eines Proteins oder Glycoproteins, ein Kohlenhydratderivat, ein Glycolipid, ein Neoglycoprotein, ein Steroidderivat, ein Coenzymderivat, ein Metabolitderivat, ein Analogon oder ein Metabolit eines pharmazeutischen Präparats, ein Metabolit, Hormon, Nucleotid oder ein Derivat davon, ein anderes Virus oder eine Zollkomponente oder ein Derivat davon.
• Die Probe, welche die Zelle, das Virus oder eine Komponente enthält, kann in Form einer Flüssigkeit (Tränen, Speichel, Serum, Urin, Wasserprobe und dgl.) oder in Form eines mehr oder weniger festen Materials (Gewebe, Nitrocellulose und dgl.) vorliegen. Die Zellen, Viren oder Komponenten, die mit dem erfindungsgemäßen Reagens analysiert werden können, sind beispielsweise pathogene Organismen, wie Parasiten, Hefezellen, Bakterien, Mycoplasma, Viren, Toxine, pharmazeutische Präparate und ihre Metabolite, andere Metabolite, Hormone, Antikörper und andere Proteine, Steroide, Prostaglandine, Kohlenhydrate, Glycokonjugate, Nucleotide und Biomoleküle in Zellen, Viren, auf Zelloberflächen, in Geweben oder im Kreislauf und andere Zellen, Viren oder Komponenten beispielsweise in Abwasser, Erde, Pflanzen, Tieren und Lebensmitteln.
• Die in der Abtrennungsstufe im ELISA mit dem erfindungsgemäßen Reagens verwendete Feststoffphase (feste Phase) kann vom gleichen Typ sein, wie sie in ELISA zusammen mit den früher beschriebenen Enzymkonjugaten verwendet worden ist (vgl. z.B. die Seiten 388 bis 391 in "Meth. Enzymol.", Band 70, 1980), Kunststoffe in Form von Reagensgläschen, Mikrotiter-Platten, Teilchen, Filter und dgl., Glasfasern oder Filterpapiere, Ionenaustauscher, Agarose-Teilchen, Sephadex -Teilchen, Polyacrylamidgel, Bentonit, magnetische Präparate von Cellulose, Agarose oder Kunststoffen und dgl. Die gewählte Gestalt der Feststoffphase hängt von dem Anwendungszweck ab und es können beispielsweise Kugeln, Säulen, Eintauch-Meßstäbchen, Mikrotiterplatten, Membranen, Filter oder Reagensröhrchen verwendet werden.
• Nach der Abtrennung der gebundenen Enzymteilchen von den nicht-gebundenen Enzymteilchen wird die Aktivität entweder der gebundenen Fraktion oder der nicht-gebundenen Fraktion bestimmt.
• In den folgenden Beispielen sind einige Beispiele dafür angegeben, wie die Erfindung in der Praxis angewendet werden soll.
Beispiel Aktivierung von Siliciumdioxid-Teilchen
• Siliciumdioxid-Teilchen der Firma Degussa (400 mg, Aerosil TT 600) wurden in einem Vakuum-Exsikkator mit &gamma;-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (300 ul) unter Verwendung von Trimethylamin (300 ul) als Katalysator 4 h lang bei 140ºC silaniert. Das Verfahren wurde wiederholt. Die Epoxygruppen wurden mit Wasser und HCl (pH 3) 30 min lang bei 90ºC hydrolysiert. Nach dem Zentrifugieren, dem Waschen mit Wasser und der allmählichen Überführung in Aceton nach der Literaturstelle 14 und der anschließenden Aktivierung der Hydroxylgruppen mit Tresylchlorid (30 ul pro 150 mg Teilchen) in 1 ml Aceton und mit 40 ul Pyridin 20 min lang bei 0ºC und nach dem Waschen gemäß der Literaturstelle 14 (unter Abzentrifugieren der Teilchen) erhielt man Teilchen mit 150 umol Tresylgruppen pro g Teilchen gemäß Elementaranalyse.
Kupplung von Peroxidase und Kaninchen-Anti-Human-Transferrin-Immunoglobulin und von Peroxidase und Kaninchen-Anti- Human-&alpha;-1-Fetoprotein-Immunoglobulin an Tresyl-aktivierte Aerosil-Teilchen
• Peroxidase (12 mg, gereinigt durch Affinitätschromatographie, Sigma) und Anti-Transferrin (1,5 ml, dialysiert mit 0,3 M Natriumbicarbonat, pH 8,5; Dakopatts) wurden langsam unter Rühren mit Tresyl-aktivierten Siliciumdioxid-Teilchen (250 mg Naßgewicht in 4 ml Puffer) gemischt und 3 min lang mit Ultraschall behandelt. Das Kuppeln wurde unter Rühren auf einem Ende-über-Ende-Tisch 70 h lang bei 4ºC durchgeführt. Die Teilchen wurden mit dem Kupplungspuffer (4 mal) gewaschen unter Anwendung des Abzentrifugierens der Teilchen. Es wurde Rinderserumalbumin (40 mg in 5 ml) zugegeben, um eventuell verbliebende Tresylgruppen zu blockieren, und die Teilchen wurden bei 4ºC gelagert. Die spektrophotometrische Bestimmung der Extinktion der Waschlösungen bei 403 nm und 280 nm zeigte an, daß 2 mg Peroxidase und 2 mg Antitransferrin gekuppelt hatten. Peroxidase (15 mg, 1000 U/mg, Boehringer, ELISA-Qualität) und Anti-&alpha;- 1-Fetoprotein-Immunoglobulin (50 mg, Dakopatts) wurden 40 h lang bei 4ºC auf nahezu die gleiche Weise gekuppelt, jedoch mit 8,5 ml Kupplungs-Puffer (vgl. oben) und unter allmählicher Zugabe von Tresyl-aktivierten Siliciumdioxid- Teilchen (25 mg Trockengewicht in 1 ml Puffer). Die verbliebenen Tresyl-Gruppen wurden mit Tris-HCl, pH 8,3, 0,2 M blockiert.
Bestimmung von Human-Transferrin mit dem Sandwich-ELISA unter Verwendung von Peroxidase-Antitransferrin- Siliciumdioxid:
• Stufe 1: Eine Mikrotiter-Platte wurde mit 300 ul von 10 ug Kaninchen-Antitransferrin-Immunoglobulin (Dakopatts, AO 61, Charge 012), gelöst in PBS (10 mM Natriumphosphat + 145 mM NaCl, pH 7,2) in jeder Vertiefung inkubiert. Es wurde bei 4ºC über Nacht inkubiert. Die Platte wurde mit PBS, enthaltend 0,1 % Tween 20 und 0,5 NaCl (Puffer B) gewaschen.
• Stufe 2: Die Platte wurde mit einer Verdünnungsreihe (10 ug bis 0,02 ng) Human-Transferrin (Apoform, Sigma), gelöst in dem Puffer B, inkubiert. Die Inkubation wurde 2 h lang bei 20ºC durchgeführt.
• Stufe 3: Peroxidase-Antitransferrin-Teilchen, hergestellt wie oben angegeben, wurden in dem Puffer B suspendiert und in die Vertiefungen gegeben. Es wurde 3 h lang bei 20ºC unter leichtem Rühren auf einem Schüttler inkubiert. Die Platte wurde 3 mal mit dem Puffer B gewaschen und es wurde Substratlösung (150 ul von 8 mg 1,2-Phenylendiamindihydrochlorid, gelöst in 0,1 M Citronensäure/Phosphat-Puffer, pH 5,0, 12 ml, und 12 ul H&sub2;O&sub2;) in die Vertiefungen gegeben (Stufe 4).
• Nach 50 min wurde die Extinktion der Vertiefungen mit einem Multiscanner bei 492 nm bestimmt. Die Vertiefungen, die in der Stufe 2 mit weniger als 2 ng Transferrin inkubiert worden waren, ergaben eine höhere Extinktion als die Hintergrund-Extinktion (die in den Vertiefungen erhalten wurde, die in der Stufe 2 ohne Antigen, d.h. nur mit dem Puffer B inkubiert wurden).
Bestimmung von Human-&alpha;-1-Fetoprotein mit den Sandwich- ELISA unter Verwendung von Peroxidase-Anti-&alpha;-1-Tetoprotein-Siliciumdioxid
• Human-&alpha;-1-Fetoprotein (Dakopatts, x 900-Standard, Charge 014) wurde nach dem gleichen Verfahren und unter Verwendung der gleichen Puffer wie in dem obigen Beispiel bestimmt, jedoch mit dem Unterschied, daß Siliciumdioxid- Teilchen mit co-immobilisierter Peroxidase und Anti-&alpha;-1- Fetoprotein-Immunoglobulin (hergestellt wie oben beschrieben) verwendet wurden. In der Stufe 1 wurden die Vertiefungen mit Anti-&alpha;-1-Fetoprotein-Immunoglobulin (Kaninchen, Dakopatts, A 008, Charge 085) inkubiert und in der Stufe 2 wurde &alpha;-1-Fetoprotein in einer Verdünnungsreihe von 1 ug bis 0,1 ng in die Vertiefungen gegeben. In der Stufe 3 wurde ein lösliches Konjugat von Peroxidase und Antihuman- &alpha;-1-Fetoprotein (Kaninchen, Dakopatts, P 128, Charge 046) zum Vergleich mit dem Siliciumdioxid-Konjugat verwendet. Die Vertiefungen, die in der Stufe 2 mit 0,1 ng Antigen inkubiert worden waren und die in der Stufe 3 mit Enzym- Antikörper-Teilchen inkubiert worden waren, ergaben eine Extinktion, die mehr als doppelt so hoch war wie die Hintergrund-Extinktion (die in den Vertiefungen erhalten wurde, in denen die Inkubation ohne Antigen in der Stufe 2 durchgeführt wurde). Das lösliche Enzym-Antikörper-Konjugat ergab keine Extinktionsdifferenz für 0,1 ng Antigen. Sowohl das lösliche als auch das Teilchen-gebundene Konjugat ergaben eine etwa 10 mal höhere Extinktion in den Vertiefungen, die in der Stufe 2 mit 1 ug Antigen inkubiert worden waren, im Vergleich zu der Extinktion, die in den Blindproben-Vertiefungen erhalten wurde.

Claims (8)

1. Reagens für die Verwendung in einem Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Enzym und mindestens eine Substanz mit der Fähigkeit, sich bei dem gewählten Bestimmungsverfahren an den Analyten oder an eine andere Komponente biospezifisch zu binden, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus einem Antikörper, einem anderen Protein, einem Coenzym und einem Kohlenhydrat, kovalent oder nicht-kovalent an ein Teilchen gebunden werden, das eine geringe oder keine Löslichkeit in dem für die Bestimmung des Analyten verwendeten Medium und einen Durchmesser von &le; 100 nm hat.

2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Teilchen besteht aus einem Polysaccharid, aus Glas, Gold, einem Silicat, Borsilicat, Aluminat, Zeolith, einem vernetzten oder Oberflächen-modifizierten organischen oder anorganischen Polymer, Kunststoff, Copolymer oder einer künstlichen Zelle.

3. Reagens nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Teilchens hydrophobe oder hydrophile Gruppen oder reaktionsfähige Gruppen, z.B. Diazo-, Epoxy-, Aldehyd-, Cyanatester-, Tosyl-, Tresyl-, andere Ester-, Acylazid-, aromatische Carbamat-, Triazin-, Succinimid-, Carbodiimid-, Imidat-, Disulfid-, reaktionsfähige Halogen-, Divinylsulfon-, FMP- Gruppen oder eine lichtaktive Substanz aufweist zum kovalenten Kuppeln des Enzyms und der Substanz an das Teilchen.

4. Reagens nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym und die Substanz gleichzeitig oder nacheinander an das Teilchen gebunden werden oder daß ein Konjugat zwischen dem Enzym und der Substanz zuerst gebildet wird und anschließend an das Teilchen gekuppelt wird, oder daß das Enzym und die Substanz nach der Adsorption an die Teilchenoberfläche mit einem Vernetzungsmittel, z.B. mit Glutaraldehyd, vernetzt werden.

5. Reagens nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Hydrolase oder eine Oxidoreduktase ist.

6. Reagens nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz mit dem Analyten oder einem Analogon davon identisch ist.

7. Reagens nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Substanz handelt um einen Antikörper, ein Lecithin, Avidin, ein anderes Protein, ein Polysaccharid, ein Kohlenhydrat oder ein Derivat davon, ein Steroidderivat, ein Prostaglandinderivat, ein Hormon oder ein Derivat davon, ein Pharmaceuticum oder einen Metaboliten oder ein Analogon davon, ein Nucleotid, eine Nucleinsäure oder ein Derivat davon, eine andere Zelle oder eine Virus-Komponente mit der Fähigkeit, sich spezifisch an den Analyten oder an eine andere Komponente bei dem gewählten Bestimmungsverfahren zu binden, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus einem Antikörper, einem anderen Protein, einem Coenzym und einem Kohlenhydrat.

8. Verwendung des Reagens nach Anspruch 1 zur Bestimmung einer Zelle, eines Virus oder einer Komponente davon oder eines anderen Typs einer Komponente in einer Probe unter Anwendung der EIA-Methoden für immunhistochemische Untersuchungen, für das Immunblotting, für mikroskopische Untersuchungen, wobei bei diesen Methoden oder Untersuchungen das Reagens verwendet wird zum spezifischen Binden und zur katalytischen Umwandlung des Enzymsubstrats in ein nachweisbares Produkt oder in ein Produkt, das direkt, nach einer weiteren Umwandlung oder über eine Enzymkaskade nachgewiesen werden kann.