DE3854326T2

DE3854326T2 - Aufbereitungstechnik für vollblutmuster.

Info

Publication number: DE3854326T2
Application number: DE3854326T
Authority: DE
Inventors: Timothy Fischer; Ronald Paul; Jorge Quintana; Thomas Russell
Original assignee: Coulter Corp
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1987-12-04
Filing date: 1988-12-01
Publication date: 1996-04-04
Anticipated expiration: 2008-12-02
Also published as: WO1989005092A1; DE3854326D1; US5030554A; EP0344287B1; JPH0726955B2; AU2820489A; EP0344287A4; EP0344287A1; CA1319592C; JPH02502487A; AU606493B2; US5437985A

Description

Diese Erfindung ist auf ein Verfahren gerichtet. Diese Erfindung betrifft insbesondere ein einzigartiges Verfahren für eine rasche Bereitung bzw. Herstellung von Teilchenanalyten, nämlich Zellen, Zellorganellen und dergleichen, für eine Analyse mit photooptischen Mitteln. Dieses Verfahren ist insbesondere für eine Analyse zellulärer Analyte gut geeignet, welche in kleinen Konzentrationen vorliegen und/oder wo eine Änderung ihres relativen Verhältnisses zu einer anderen Zellpopulation diagnostisch signifikant ist. Dieses Verfahren ist insbesondere für eine rasche Herstellung von Vollblutproben für eine Analyse mittels Durchflußzytometrie gut geeignet.
Die traditionellen Techniken zur Isolierung und Färbung der Leukozytenfraktion von Vollblut umfaßt typischerweise zahlreiche physikalische Manipulationen an der Probe und eine übermäßige Anzahl an Waschschritten. Wie in der technischen Literatur anerkannt und berichtet wurde, führen diese traditionellen Techniken inhärent zu einer begrenzten Verarmung der Leukozytenpopulation von der Probe; zumindest zu einer Änderung in der Rohmorphologie der Leukozytenpopulation, welche in der Probe zurückbleibt; zumindest zu einer Änderung bei den Markern auf der Oberfläche der Leukozytenpopulation; und zumindest zu einer Verschiebung der Farbe auf der Oberfläche der interessierenden Zellpopulation.
Die Techniken, welche bis heute zur Herstellung von Leukozyten aus Vollblutproben für eine anschließende Analyse verwendet wurden, haben traditionell umfaßt: (1) die Herstellung einer Buffy-Coat-Fraktion durch kontrollierte Zentrifugierung der Vollblutprobe, gefolgt von einem Färben mit einem mit Fluorochrom markierten Konjugat; (2) gleichzeitige Behandlung einer Vollblutprobe mit einem lytischen Reagens und einem mit Flurochrom markierten Konjugat; oder (3) die Herstellung einer Buffy-Coat-Fraktion durch kontrollierte Zentrifugierung der Vollblutprobe und einer anschließenden weiteren Anreicherung der Buffy-Coat-Probe mit der Ficoll-Paque-Dichtegradientenzentrifugierung. Eine solche Anreicherung gestattet die Gewinnung einer Zwischenschicht, welche angereicherte mononukleare Zellen enhält, welche anschließend mit einem mit Fluorochrom markierten Konjugat gefärbt werden.
Jede der obigen Herstellungsarbeitsweisen ist arbeitsintensiv, erfordert eine wiederholte physikalische Manipulation der Fraktion, die die interessierenden Leukozyten enthält, und ist zeitaufwendig. Wo herkömmliche Zentrifugierungstechniken angewendet werden, um eine angereicherte Leukozytenprobe zu erhalten, finden unweigerlich Zellenverluste statt, und eine genaue Bestimmung der relativen Konzentration der interessierenden zellulären Population ist praktisch unmöglich. Die Unzulänglichkeiten der obigen Verfahren werden seit einiger Zeit erkannt, und es wurde mindestens eine Alternative in der technischen Literatur vorgeschlagen: Artikel von Caldwell, erschienen im American Journal of Clinical Pathology, Band 88:4 (1987), Seiten 447-456; und Band 86:5 (1986), Seiten 600-607. Die Artikel von Caldwell beschränken sich jedoch lediglich auf eine Facette dieses Problems, von welcher er glaubt, daß sie die Hauptursache der früheren Verfahren ist. Insbesondere betont Caldwell, daß ein übermäßiges Waschen der Leukozytenproben nach der Färbung und vor der Analyse einen analytischen Fehler in die Analyse einschleppen kann, und zwar insbesondere dort, wo Leukozyten in bestimmten Klassen von kranken Patienten beobachtet werden. Caldwell schlägt die Anwendung einer Technik "ohne Waschen" vor, um die Verarbeitungszeit und den analytischen Fehler, welcher bei der übermäßigen Manipulationsbehandlung der Leukozytenprobe vor ihrer Endanalyse inhärent ist, zu verringern. Die Technik "ohne Waschen", die von Caldwell vorgeschlagen wird, umfaßt eine Beibehaltung der traditionellen Techniken für die Herstellung einer angereicherten Lymphozytenfraktion mit der Ficoll-Paque-Dichtegradientenzentrifugierung, welche selbst mehrfache Waschschritte zur Entfernung der Ficoll-Paque-Reagenzien anwendet. Die angereicherte Lymphozytenprobe wird danach mit einem Fluorochromfarbstoff der an einen monoklonalen Antikörper konjugiert ist, gefärbt. Die Verbesserung von Caldwell beruht auf der Beobachtung einer verstärkten Fluoreszenzintensität sowohl im Hintergrund als auch der positiven Peaks eines Histogramms, wenn das nicht-gebundene Konjugat in der Probe gelassen wird. Caldwell schreibt diese Beobachtung der verstärkten Fluoreszenzintensität seiner Eliminierung der Waschschritte nach der Färbung zu. Er nimmt an, daß die Eliminierung eines solchen Waschschrittes für die gefärbte Lymphozytenfraktion weniger schädigend ist; auf diese Weise wird eine Erhaltung der immunchemischen Bindung zwischen dem Konjugat und den Oberflächenmarkern auf der interessierenden Zellenpopulation ermöglicht. Wie bei einem Überblick des Caldwell'schen Verfahrens "ohne Waschen" evident wird, wird das wiederholte Trauma des Mischens, Verwirbelns und Zentrifugierens etwas verringert.
Es wurde bis heute nicht bewiesen, daß die "Anreicherung" der Leukozytenprobe durch die Verwendung lytischer Reagenzien eine gangbare Alternative zu den traditionelleren Techniken Zentrifugierung/Dichtegradient zum Teilen der Vollblutprobe in die verschiedenen Fraktionen ist. Der Grund für diese Beschränkung ist die Unfähigkeit früherer lytischer Reagenzien, eine Hämolyse der Erythrozytenfraktion der Vollblutprobe zu bewirken, ohne die Leukozytenfraktion der Probe zu traumatisieren. Diese lytischen Reagenzien verursachen typischerweise sowohl rohe als auch feine morphologische Änderungen in der Leukozytenfraktion und eine Veränderung in den Oberflächenmarkern solcher Zellen. In der beschränkten Anzahl von Fällen, wo lytische Reagenzien mit einigem Erfolg verwendet wurden, war erforderlich, daß zusätzliche Reagenzien der Probe zugegeben werden, um die Leukozyten vor einer Lyse durch das lytische Reagens zu schützen; siehe zum Beispiel das U.S.-Patent 4,637,986 für Brown et al. Wie bei Durchsicht des Brown-Patentes klar wird, wird die physiologische Umgebung der Probe durch die Zugabe von sowohl dem lytischen Reagens als auch der Lösungen, welche verwendet werden, um die Leukozyten vor einer Lyse durch das lytische Reagens zu schützen, dramatisch modifiziert. Die Proben, die gemäß den Brown'schen Reagenzien und der Brown'schen Technik hergestellt werden, können einer Durchflußzytometrie unterzogen werden, bei welcher eine Differenzierung der drei Haupt-Sub-Populationen durch herkömmliche Lichtstreuungsmessungen erzielt wird. Wegen der Änderung in der physiologischen Umgebung der Probe wird die Integrität und das immunchemische Ansprechen der Oberflächenmarker auf den Leukozyten der Probe ebenfalls geändert. Eine Verfeinerung der Analyse der Leukozytenfraktion mittels immunchemischer Techniken ist so ausgeschlossen. Wo die Leukozytenfraktion von einer Probe stammt, welche "gealtert" (nicht frisch) ist, oder von einer Probe eines kranken Patienten ist, ist außerdem die Empfindlichkeit der Leukozyten auf eine solche aggressive Behandlung dramatisch erhöht; dies beschränkt weiter die Brauchbarkeit der Reagenzien und der Technik von Brown.
Wie von der obigen Diskussion klar ist, ist wahrscheinlich, daß sowohl das physikalische als auch das chemische Trauma, welche auf die Leukozytenfraktion mit den obigen Arbeitsweisen bewirkt werden kann, eine Reihe der Zellen innerhalb dieser Fraktion schädigt. Sogar noch ungünstiger ist, daß diese Verfahren für die Leukozyten, wie z.B. die Lymphozyten- Sub-Population von Proben von Krankheitszuständen, noch mehr schädigend sind. Dementsprechend ist die Möglichkeit zur Analyse und Überwachung solcher Proben von Krankheitzuständen mit herkömmlichen Anreicherungs- und Färbetechniken ernstlich beschränkt. Wo solche Analysen durchgeführt werden sollen, sind die traditionelleren Anreicherungsprotokolle Zentrifugation und Dichtegradient bevorzugt, da sie die Lymphozyten etwas weniger aufreißen lassen als die Wirkungen der lytischen Reagenzien.
Die Verbesserung in der Genauigkeit und Empfindlichkeit, die von Caldwell in seinem Verfahren "ohne Waschen" beobachtet wird, stellt einen Schritt in die richtige Richtung dar, es ist jedoch eine weitere Verbesserung offensichtlich notwendig, und vor allem insbesondere dort, wo die Bestimmungen relativer Zellpopulationen kritisch sind, und zwar für eine genaue Analyse der Patientenzustände. Wie von der obigen Diskussion klar ist, stellt keine Technik des Standes der Technik, auch nicht jene, die von Caldwell beschrieben wird, eine vollständige Lösung dieses Problems dar, da praktisch jedes Verfahren, sogar solche, welche lytische Reagenzien verwenden, einen statistisch signifikanten Verlust oder Zerstörung einer oder mehrerer Sub-Populationen von Leukozyten und eine Gesamtherstellungszeit von mindestens 1 Stunde verursachen. Dieser Verlust ist beim Handhaben einer gealterten Probe, einer Probe, der es praktisch völlig an einem endogenen Nährstoff fehlt, und beim Handhaben von Proben von Krankheitszuständen statistisch signifikanter, und zwar wegen der relativ höheren Empfindlichkeit der Nährstoff-verarmten Zellen und der Zellen, die den Krankheitszustand anzeigen, auf Lyse durch ein physikalisches oder chemisches Trauma.
Die WO 89/04484 (mit der europäischen Veröffentlichungsnummer EP-A-0 353 264) bildet einen Teil des Standes der Technik, jedoch lediglich gemäß Artikel 54(3) EPÜ, und offenbart einen Mischapparat für biologische Proben und ein Verfahren zur Herstellung von Leukozyten für eine Immunfluoreszenzmessung auf optischen Durchflußzytomern. Es werden drei flüssige chemische Reagenzien verwendet, wie folgt:
(i) ein lytisches Reagens für rote Zellen mit der Formulierung 1,2 ml Ameisensäure, 0,2 ml Natriumomadin (40%) und 998,6 ml entionisiertes Wasser;
(ii) ein Lyse-stabilisierendes Reagens mit der Formulierung: 31,30 Gramm Natriumsulfat, 14,05 Gramm Natriumchlorid, 6 Gramm Natriumcarbonat und 1 Liter entionisiertes Wasser; und
(iii) ein Fixierungsmittel mit der Formulierung: 6,05 Gramm TRIS-(HCl)-Puffer, 10 Gramm Paraformaldehyd und 0,05 ml Natriumhydroxid (50%).
Das Probenherstellungssystem kann auf zwei Arten betrieben werden. Eine Art mit einem kurzen Zyklus wird vorgesehen, welche Vollblut verwendet, welches immunfluoreszierend gefärbt wurde, bevor die Probe in die Einheit für die Lyse von roten Zellen eingebracht wird; und ein langer Zyklus, in welchem eine Probe zuerst auf der Einheit immunfluoreszierend gefärbt und dann die Lyse der roten Zellen ausgeführt wird.
Der Apparat zum Mischen des Systems umfaßt einen rotierenden Arm, welcher eine Kautschukscheibe aufweist, um ein Teströhrchen zu tragen. Das obere Ende des Teströhrchens wird in einer definierten Position gehalten, und an seinem Boden rotiert das Röhrchen. Diese Mischungsweise gestattet, daß der Inhalt des Röhrchens leicht gemischt wird, und das System besitzt mehrere Vorteile. Das System erfordert kein Probenwaschen, und die schnelle und sanfte Natur des Systems erfordert für eine Probenstabilität keine Probenfixierung. Die Probenfixierung wird vorgesehen, um Proben für lange Zeiträume zu konservieren und um eine wirksame Biohazard-Sterilisierung vorzusehen.
Die WO 85/05640 offenbart ein Reagenssystem und ein Verfahren zu Identifizierung, Zählung und Prüfung von Klassen und Unterklassen bzw. Subklassen von Blutleukozyten. Eine Vollblutprobe wird mit einem verdünnten monoklonalen Antikörper inkubiert, um bestimmte Unterklassen von Leukozyten zu markieren. Dann werden die Erythrozyten durch Lyse entfernt, und die Leukozyten werden mit einem vernetzenden Fixiermittel stabilisiert, und zwar vor der Klassen- und Subklassenidentifizierung. Die Vollblutprobe wird mit einem fluorochromierten Antikörper inkubiert, um eine spezifische Subklasse von Leukozyten zu markieren. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung werden die Erythrozyten mit einem Lysierungsreagens, welches Saponin enthält, gezielt lysiert, und dann werden die direkt markierten Leukozyten fixiert, wobei ein Fixierungsreagens verwendet wird, welches einen Dialdehyd enthält. In einem ersten Beispiel werden 100 ul mit Phosphat gepuffeter Salzlösung in ein Röhrchen von 16 x 100 zugegeben, gefolgt von 100 ul Vollblut. Der Röhrcheninhalt wird dann durch Wirbeln leicht gemischt. 5 Mikrogramm monoklonaler Antikörper werden dem gleichen Röhrchen zugegeben und leicht gemischt. Dann wird das Röhrchen 20 Minuten bei Raumtemperatur gehalten, und zwar mit gelegentlichem Rühren. Die Probe wird gewaschen, und dann werden die Zellen in einer Lösung suspendiert. 100 ul Lysereagens, welches aus 24 g Saponin, 4,0 g NaCl, 1 g Sorbinsäure und Wasser, welches auf einen Liter ergänzt, besteht, dem Röhrchen, welches Blut enthält, zugegeben, und acht Sekunden kontinuierlich geschüttelt. Am Ende der Lyse während 8 Sekunden, wird Fixierungsreagens der lysierten Probe zugegeben.
In einem zweiten Beispiel wird Markierungsverdünnungsmittel in ein Röhrchen von 16 x 100 zugegeben, gefolgt von Vollblut, und der Röhrcheninhalt wird durch leichtes Wirbeln gemischt. Nach Markierung und Lyse wird das Vollblut fixiert. Es wird angegeben, daß das Vollblut dann bereit ist, um im EPICS-Durchflußzytometer verwendet zu werden.
Das Ziel dieser Erfindung besteht darin, ein Verfahren und ein System für die Konservierung zellulärer Analyte eines Probeninhalts zur Verfügung zu stellen, um sicherzustellen, daß ihre Analyse exakt sowohl die Anzahl der interessierenden zellulären Analyten in der Probe, und, wo dies zutrifft, auch die relative Konzentration solcher Analyte zu anderen Zellen der Probe widerspiegelt. Diese Erfindung betrifft daher die Bereitung bzw. Herstellung der Probe, um sicherzustellen, daß praktisch alle diagnostisch relevanten Elemente der Probe konserviert werden.
Die Fähigkeit dieses Verfahrens, einen solchen Vorteil gegenüber den herkömmlicheren Techniken zu bilden, beruht auf der konservierenden Natur des Herstellungsverfahrens. Der Ausdruck "konservierend", wie er hier verwendet wird, soll die Fähigkeit dieses Verfahrens beschreiben, praktisch alle Blutkomponenten für eine spätere Analyse zu konservieren, mit der Ausnahme von Erythrozyten. Die Unversehrtheit der Probe hinsichtlich der konservierten Komponenten stellt auch das erste wirklich zuverlässige Mittel für das Aufstellen von Standards zur Verfügung, gegen welchen andere Proben gemessen werden können. Dieses Verfahren ist besonders gut für die Analyse gealteter Proben von Vollblut und von Blutproben von Patienten in Krankheitszuständen angepaßt, worin die Zellenunversehrtheit schwierig beizubehalten ist, und daher eine genaue Analyse bis heute unmöglich war.
Unter Ausschluß des folgenden Gegenstandes:
ein Verfahren zur Probenherstellung bzw. Probenbereitung und Probenanalyse, in welchem ein oder mehrere Reagentien in einen Mischbehälter, der Probenmaterial enthält, gegeben werden, wonach der Mischbehälter bewegt wird, um die Reagentien mit dem Probenmaterial zur Reaktion zu bringen, um das zu verwendende Probenmaterial herzustellen, welches Verfahren gekennzeichnet ist durch:
Verwenden eines Teströhrchens desjenigen Typus, der in Durchflußzytometern verwendet wird, als Mischbehälter;
immunfluoreszierendes Färben der Probe im Teströhrchen und anschließendes Zugeben eines lytischen Reagens der Formulierung 1,2 ml Ameisensäure, 0,2 ml Natriumomadin (40%), und 998,6 ml entionisiertes Wasser zur Probe im Teströhrchen und Mischen;
Zugeben zur Probe im Teströhrchen eine Lyse-stabilisierendes Reagens der Formulierung 31,30 Gramm Natriumsulfat, 14,05 Gramm Natriumchlorid, 6 Gramm Natriumcarbonat und 1 Liter entionisiertes Wasser und Mischen; und
Durchführen einer Probenanalyse der Probe in einem Durchflußzytometer im gleichen Röhrchen, welches zur Herstellung der Probe verwendet wurde, ohne vorheriges Waschen der Probe;
stellt die vorliegende Erfindung zur Verfügung:
ein Verfahren zur Herstellung einer Vollblutprobe für eine Analyse mittels photooptischer Meßtechniken, welches Verfahren ein Anreichern der zellulären Nicht-Erythrozytenfraktion der Probe und das Markieren einer oder mehrerer Sub-Populationen der Fraktion mittels immunchemischer Wechselwirkung der Zellen der Fraktion mit einem Indikator-markierten Bindungsmaterial, welches für eine charakteristische zelluläre Komponente der interessierenden Sub-Population spezifisch ist, beinhaltet, welches Verfahren die Schritte umfaßt:
(a) Vorsehen eines herkömmlichen Reaktionsgefäßes desjenigen Typus, welcher typischerweise als ein Probenbehälter für eine photooptische Instrumentierung benützt wird, die zur Quantifizierung und/oder Differenzierung von teilchenförmigen Analyten von anderen Teilchen, welche zur Probe endogen sind, ausgebildet ist; welches Verfahren gekennzeichnet ist durch:
(b) Herstellen der Probe zur Analyse im Reaktionsgefäß, indem die Probe Bedingungen für eine selektive Stromatolyse mittels eines lytischen Reagens unterworfen wird, um eine wirksame Differenzierung der Nicht-Erythrozytenfraktion der Probe von der Erythrozytenfraktion zu ermöglichen;
(c) Markieren mindestens einer der Sub-Populationen mit einem Bindungsmaterial vor dem, gleichzeitig mit dem oder nach dem Schritt zur selektiven Stromatolyse; und Quenchen der Aktivität des lytischen Reagens mit einem Begleitreagens, welches wirksam ist zum Hemmen der lytischen Aktivität des lytischen Reagens und Wiederherstellen des Ionenausgleichs der Probe; und
(d) Nehmen eines Aliquots der Probe in einem photooptischen Analysator aus dem herkömmlichen Reaktionsgefäß ohne vorherige Abtrennung der markierten Sub-Population von nicht-umgesetzten und/oder nicht-verbrauchten Reagenzien und/oder Bindungsmaterial; und auch:
ein Verfahren zur Herstellung einer Vollblutprobe für eine Analyse mittels photooptischer Meßtechniken, welches Verfahren ein Anreichern der zellulären Nicht-Erythrozytenfraktion der Probe und das Markieren einer oder mehrerer Sub-Populationen der Fraktion mittels immunchemischer Wechselwirkung der Zellen der Fraktion mit einem Indikator-markierten Bindungsmaterial, welches für eine charakteristische zelluläre Komponente der interessierenden Sub-Population spezifisch ist, beinhaltet, welches Verfahren die Schritte umfaßt:
(a) Vorsehen eines herkömmlichen Reaktionsgefäßes desjenigen Typus, welcher typischerweise als ein Probenbehälter für eine photooptische Instrumentierung benützt wird, die zur Quantifizierung und/oder Differenzierung von teilchenförmigen Analyten von anderen Teilchen, welche zur Probe endogen sind, ausgebildet ist; welches Verfahren gekennzeichnet ist durch:
(b) Herstellen der Probe zur Analyse im Reaktionsgefäß, indem die Probe Bedingungen für eine selektive Stromatolyse mittels eines sauren lytischen Reagens unterworfen wird, um eine wirksame Differenzierung der Nicht-Erythrozytenfraktion der Probe von der Erythrozytenfraktion zu ermöglichen;
(c) Markieren mindestens einer der Sub-Populationen mit einem Bindungsmaterial; und
(d) Nehmen eines Aliquots der Probe in einem photooptischen Analysator aus dem Reaktionsgefäß, welches Verfahren den weiteren Schritt eines Quenchens der Aktivität des lytischen Reagens mit einem Begleitreagens, welches wirksam ist zum Hemmen der lytischen Aktivität des lytischen Reagens und Wiederherstellen des Ionenausgleichs der Probe, umfaßt.
Bei der Analyse des Vollblutes ist eine diagnostisch relevante Komponente von besonderem Interesse die Nicht-Erythrozytenfraktion. Diese Erfindung sieht die Fähigkeit vor, die Nicht-Erythrozytenfraktion wirksam zu isolieren und nun wirksam zu konservieren, und zwar ohne den Waschschritt und die vielfachen Übertragungsschritte, die traditionellerweise mit diesem Verfahren verbunden sind. In den bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung wird eine Vollblutprobe in ein Gefäß oder eine Kammer gegeben. Die Kammer der Wahl ist der gleiche Typus Gefäß, welches in dem Gerät verwendet wird, das zur Analyse der Probe gewählt wird. Dieses Herstellungsverfahren der Proben weicht von der Norm insofern ab, als praktisch der gesamte Kontakt der Probe mit Reagentien in der Kammer durchgeführt wird, und die enge Wechselwirkung der Probe mit solchen Reagentien durch asymetrisches Verwirbeln des Inhalts der Kammer zu geeigneten Zeitabständen, in einer geeigneten Frequenz und für eine geeignete Dauer, sichergestellt wird. Durch genaues Kontrollieren der Reagenszugaben. der Reaktionsumwelt und der physikalischen Kräfte, die auf die Probe wirken, ist es nun möglich, eine Vollblutprobe herzustellen, sogar gealterte Proben oder Proben von Krankheitszuständen, und zwar ohne Waschverluste oder statisch signifikante Verluste irgendeiner diagnostisch signifikanten Nicht-Erythrozyten-Blutkomponente.
Dieses Verfahren und dieses System stellen insbesondere ein konservierendes Verfahren und System zur Verfügung, in welchem die Mischdynamik und die Reagentien eine schnelle und praktisch vollständige Hämolyse der Erythrozytenfraktion einer Vollblutprobe bewirken, während die Nicht-Erythrozytenfraktion der Probe in ihrem praktisch nativen physiologischen Zustand bleibt. Dieses Verfahren und dieses System sind daher mit dem gezielten Färben einer oder mehrer Sub-Populationen der Leukozytenfraktion kompatibel, und zwar entweder vor oder gleichzeitig mit der Hämolyse der Erythrozyten. Nach einem solchen Färben kann die Probe mittels halbautomatischer oder automatischer Techniken analysiert werden, und zwar zum Beispiel mit Durchflußzytometrie zur Identifizierung und Quantifizierung der interessierenden Zellenpopulationen. Dieses Verfahren zur Anreicherung und Färbung der Leukozytenfraktion der Probe kann innerhalb etwa sechzig (60) Sekunden oder weniger ausgeführt werden, sieht ein verbessertes Clustern der verschiedensten Sub-Populationen der Leukozyten innerhalb der Probe vor, und erhält oder konserviert die Unversehrtheit und die Gesamtzahl der in der Probe vorhandenen Leukozyten.
In einer der bevorzugten Ausführungsformen der Erflndung werden die Vollbutprobe und das Färbemittel zuerst in einer Mischkammer vereinigt. Ein Teströhrchen von 12 x 75 mm des Typus, der üblicherweise bei einem Durchflußzytometer der Marke EPICS , welches von Coulter Corporation erhältlich ist, verwendet wird, ist in der Regel für diesen Zweck geeignet. Das Teströhrchen und sein Inhalt können dann auf einer geeigneten Mischvorrichtung, zum Beispiel einem Q-PREP -Mischer, der ebenso von Coulter erhältlich ist, gemischt werden. Dieser Mischer besitzt die Fähigkeit, den Fluidinhalt des Teströhrchens kontrolliert zu mischen, und zusätzliche Reagentien in geeigneten, vorprogrammierten Zeitabständen automatisch zuzugeben. Zuerst kann ein immunologisches Färbemittel mit der Vollblutprobe in der Kammer, begleitet von einem leichten, asymetrischen Verwirbelungsmischen, in Kontakt gebracht werden. Nach einer geeigneten Inkubationszeitspanne, in der Regel weniger als sechzig (60) Sekunden, wird eine zur Differenzierung wirksame Menge eines neuen lytischen Reagens mit der Probe in der Kammer in Kontakt gebracht, und danach wird seine lytische Aktivität durch die Einbringung eines geeigneten Löschmittels praktisch verzögert. Dieses gesamte Verfahren zur Färbung, Lyse der Erythrozyten und zum Quenchen der Aktivität des lytischen Reagens wird ohne physikalische Isolierung der Zelltypen voneinander, ohne Übertragung der Zellen der Probe von einem Gefäß zu einem andern und ohne die Notwendigkeit zum Entfernen von Nicht-umgesetzten Färbemitteln und/oder nicht-verbrauchten Reagentien aus der Kammer vor der Analyse oder Messung der Probe durchgeführt. Die gefärbte Leukozytenfraktion kann nun einer weiteren Analyse auf einer Instrumentierung, die für diesen Zweck gebaut ist, zum Beispiel COULTER Modell EPICS C- oder PROFILE-Durchflußzytometer, unterzogen werden. Die Analyse der Probe auf einer solchen Instrumentierung ermöglicht die Herstellung eines Histogramms mit einer gut definierten Clusterbildung der gefärbten, interessierenden Leukozytenfraktion.
Das Verfahren und das System dieser Erfindung sind in einer Reihe von signifikanten Aspekten einzigartig: (a) die Fähigkeit, nacheinander oder gleichzeitig die Nicht-Erythrozytenfraktion einer Vollblutprobe zu färben und anzureichern; (b) die Konservierung bzw. Bewahrung der Morphologie und der Gesamtzahl an Leukozyten, die ursprünglich in der Probe vorhanden sind; (c) die Konservierung der immunchemischen Wechselwirkung zwischen dem Färbemittel und der charakteristischen, zellulären Komponenten der interessierenden Zellpopulation; (d) die Konservierung der gefärbten, angereicherten Probe auf bis zu vierundzwanzig (24) Stunden vor einer Analyse ohne Materialänderung der charakteristischen Größe und/oder Form der interessierenden Sub-Population; und (e) die Kompatibilität der Reagentien, die in der Färbungssequenz mit den Reagentien verwendet werden, die sowohl in der lytischen Sequenz als auch in der Quenchsequenz verwendet werden, um die Notwendigkeit des Waschens der Probe zwischen jeglichen solchen Verfahrensschritten zu eliminieren.
Bevor das Verfahren und das System dieser Erfindung detailliert diskutiert werden, wird es hilfreich sein, eine Reihe von Ausdrücken, die hier verwendet werden, zuerst zu definieren.
Die Ausdrücke "Färbemittel" und "Färben" sind für ein Verfahren zur Identifizierung einer spezifischen, interessierenden Zellenpopulation deskriptiv, um ihre Differenzierung von anderen Zellen zu ermöglichen, welche im allgemeinen auch in einer Probe, die analysiert wird, vorhanden sind.
Der Ausdruck "konservativ" soll sowohl die Bedingungen als auch die manipulativen Schritte des Verfahrens dieser Erfindung beschreiben, welche nicht nur die Gesamtzahl von Leukozyten, die ursprünglich in der Probe vorhanden sind, sondern auch ihre Rohmorphologie und ihre immunchemische Reaktivität konservieren. Eine solche Konservierung wird ohne vorhergehende Fixierung der Leukozytenpopulation erzielt, kann jedoch nach einer solchen konservierenden Herstellung eine Fixierung umfassen.
Die Ausdrücke "nutativ bzw. taumelnd" und "nutative bzw. taumelnde Bewegung" sind für ein asymetrisches oder exzentrisches Mischen eines Reaktionsgefäßes beschreibend, wobei die Probe und verschiedenste Reagentien (Färbemittel, lytisches Reagens, Quenchmittel und Fixierungsmittel, falls vorhanden) in einem sanften Bewegungszustand gehalten werden. Dieser Bewegungstyp des Reaktionsgefäßes führt dazu, daß der Fluidgehalt des Gefäßes sich selbst innerhalb des Gefäßes asymetrisch verteilt, wobei er auf einer Seite des Gefäßes höher aufsteigt als auf der anderen. Wegen dieser Asymetrie verhält sich die Verwirbelung, die sich im Gefäß ausbildet, nicht auf herkömmliche Weise.
Der Ausdruck "Anreicherung" beschreibt im Kontext mit dem Stand der Technik die physikalische Abtrennung der Leukozytenpopulation, dem Buffy-Coat, von den anderen Bestandteilen der Vollblutprobe. Im Kontext dieser Erfindung ist "Anreicherung" jedoch die relative Zunahme der leichten Identifizierung der Leukozytenpopulation bei Lyse der Erythrozytenfraktion der Probe.
Das Komplement von Chemikalien, welche eingesetzt werden, um sowohl die Hämolyse der Erythrozytenfraktion der Probe und eine feine Modifikation der Leukozytenfraktion zu bewirken und dadurch ihre anschließende Isolierung, Identifizierung und/oder Analyse zu erleichtern, werden insgesamt als das "lytische Reagenssystem" bezeichnet. Im Kontext dieser Erfindung umfaßt ein solches System ein lytisches Reagens und ein begleitendes Quenchmittel, welches formuliert ist, um die lytische Aktivität des lytischen Reagens zu verzögern und den Ionenausgleich der Probe wiederherzustellen.
Der Ausdruck "zur Differenzierung wirksame Menge" wird in der gesamten Offenbarung so verwendet, daß sie eine Konzentration eines lytischen Reagens angibt, welche nicht nur für die Hämolyse der Erythrozytenfraktion der Probe wirksam ist, sondern auch feine Änderungen in der Leukozytenfraktion bewirkt, um ihre anschließende Isolierung, Identifizierung und/oder Analyse zu erleichtern.
Wie oben bei der Diskussion des relevanten Standes der Technik angemerkt ist, umfaßt die bevorzugte Technik zum Färben der Leukozytenfraktion eine immunchemische Wechselwirkung eines Indikators, Antikörperkonjugat mit einem Oberflächenmarker, welcher für die interessierende Zellenfraktion charakterisitisch ist. Die relative Avidität des Konjugates für einen spezifischen, interessierenden Oberflächenmarker kann in Abhängigkeit von der genauen Lage und Konformation der epitopen Stelle auf der Zelloberfläche schwanken. Wo die interessierende Zellenpopulation oder ihre Zellenzahl einen Krankheitszustand anzeigt, neigen diese Zellen dazu, fragiler zu sein, und ihre Wechselwirkung mit dem Färbemittel ist daher für ein physikalisches Trauma und für ein chemisches Ungleichgewicht in der Probenumwelt empfindlicher. Der abgekürzte Kontakt mit dem lytischen Reagens, in der Regel weniger als zehn (10) Sekunden, und die nachfolgende Wiederherstellung des Ionenausgleichs der Leukozytenfraktion durch die Zugabe des Quenchmittels, ist sowohl für die Gesamtzahlen als auch für die Qualitäten der interessierenden Zellen konservativ und erleichtert so ihre nachfolgende Identifizierung mit immunchemischen Techniken. Da typischerweise eine Lücke zwischen dem Zeitpunkt, bei welchem die Probe angereichert und gefärbt ist, und ihrer anschließenden Analyse vorhanden ist, wird die Probe vorzugsweise mit einem Fixiermittel kontaktiert, um sowohl die physikalische Größe als auch die Form der interessierenden Leukozytenfraktion zu erhalten bzw. zu konservieren. Eine solche Fixierung muß mit dem früheren Anreicherungs- und Färbeverfahren kompatibel sein, und muß ferner mit dem analytischen Mittel, das für die Bestimmung und die Messung der relativen Konzentration der interessierenden Zellenpopulation gewählt wird, kompatibel sein. Wo die analytische Methode der Wahl die Durchflußzytometrie ist, darf das gewählte Fixiermittel bei der Wellenlänge der Anregungsenergie des Fluorochrommarkers des Konjugatfärbemittels oder bei der Emissionswellenlänge des Fluorochromfärbemittels keine Nativ- oder Selbstfluoreszenz aufweisen. Das in dieser Erfindung bevorzugte verwendete Fixiermittel ist Paraformaldehyd.
In der Praxis des Verfahrens dieser Erfindung wird peripheres Blut mit Standard-Venenpunktierungstechniken in Röhrchen, welche ein Antikoagulans, EDTA oder Heparin, enthalten, aseptisch gesammelt. Die Probe wird in eine Mischkammer desjenigen Typus übertragen, der typischerweise in Verbindung mit der analytischen Meßvorrichtung der Wahl verwendet wird. In der halbautomatischen Vorrichtung, die für die Praxis dieses erfindungsgemäßen Verfahrens in Betracht gezogen wird, wird die Probe dann mit geeigneten Mengen Färbemittel, lytischem Reagens und Fixiermittel in Kontakt gebracht. Während dieses Kontaktzeitraumes mit diesen verschiedenen Reagensmaterialien wird die Probe leicht bewegt. In einer der bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung wird das Färbemittel mit einer Vollblutprobe vor Zugabe des lytischen Reagenssystems und des Fixiermittels vereinigt. Die Aktivität des lytischen Reagens wird durch die Zugabe eines Quenchmittels ungefähr zehn (10) Sekunden nach dem ersten Kontakt der Probe mit dem lytischen Reagens verzögert. Das Färben wird fortschreiten gelassen, wobei das gesamte Verfahren innerhalb etwa neunzig (90) Sekunden beendet ist. Ein gegebenenfalls verwendetes Fixiermittel wird vorzugsweise bei Beendigung des Färbezyklus und nach der Zugabe des Quenchmittels zugegeben. In einer alternativen Ausführungsform dieser Erfindung kann die Anreicherung der interessierenden Leukozytenfraktion dem Färben der Probe vorangehen. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird das Färbemittel der Vollblutprobe einfach zugegeben und mit der interessierenden zellulären Fraktion wechselwirken gelassen. Eine solche Wechselwirkung tritt unter leichtem Schütteln für etwa 15 bis 60 Sekunden nach Zugabe des lytischen Agens, des Quenchmittels und des gegebenenfalls verwendeten Fixiermittels auf
Das bevorzugte lytische Reagens, welches für die Verwendung im Verfahren und im System dieser Erfindung geeignet ist, umfaßt eine wäßrige Lösung, welche eine zur Differenzierung wirksame Menge eines lytischen Reagens enthält, welches eine wasserlösliche, organische Carbonsäure mit einem pK-Wert von > 3,0 besitzt, einen pH im Bereich von etwa 2,6 bis 4,0 und ein Gegenion, welches die Ionenstärke der behandelten Probe wesentlich ändert, umfaßt. Die am meisten bevorzugten lytischen Reagenzien werden aus der Gruppe gewählt, die aus Ameisensäure, Essigsäure und ihren jeweiligen Gemischen besteht. In den bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung umfassen diese lytischen Reagensgemische Ameisensäure als die hauptsächliche funktionelle Komponente, wobei Essigsäure lediglich in kleineren Mengen, falls überhaupt, vorhanden ist.
Das lytische Reagens, welches im Verfahren und im System dieser Erfindung eingesetzt wird, umfaßt eine wäßrige Lösung, welche überraschend geringe Konzentrationen des lytischen Reagens, vorzugsweise weniger als 1,0 Vol.-%, enthält. Diese wäßrige Lösung wird durch einfache Zugabe des lytischen Reagens zu entionisiertem Wasser hergestellt. Die Menge des lytischen Reagens, welches diesem Verdünnungsmittel zugegeben wird, ist ausreichend, um eine Lösung herzustellen, die von etwa 0,05 bis etwa 0,5% (Vol./Vol.) enthält. In den bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung reicht die Konzentration an lytischem Reagens von etwa 0,1 bis etwa 0,25% (Vol./Vol.).
Wenn das lytische Reagens ein Gemisch umfaßt, welches sowohl Ameisen- als auch Essigsäure enthält, ist die Essigsäure vorzugsweise nur als ein teilweiser Ersatz für eine definitive Menge Ameisensäure und dann lediglich in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,05 bis 0,10% (Vol./Vol.) vorhanden.
Das lytische Reagenssystem kann auch andere traditionelle Additive enthalten, bis zu dem Ausmaß, daß ihre Anwesenheit nicht auf andere Weise mit den primären, funktionellen Komponenten des Systems, zum Beispiel einem antimikrobiellen Konservierungsmittel, wie z.B. Natriumomadin, inkompatibel ist.
Dieses lytische Reagens kann mit einer Vollblutprobe durch einfache manuelle oder automatisierte Zugabe vereinigt werden, kurz in einer Kammer wechselwirken gelassen werden und die Wirkung des lytischen Reagens dann durch Zugabe eines geeigneten Quenchmittels wesentlich verzögert werden. Das Quenchmittel muß, um in dieser Umgebung wirksam zu sein, die lytische Aktivität des lytischen Reagens unmittelbar nach seiner Zugabe zum wäßrigen Gemisch, welches die Blutprobe und das lytische Reagens enthält, verzögern. Die genaue Formulierung des Quenchmittels kann in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des lytischen Reagens und anderer Fluide, welche von den Anforderungen des analytischen Meßgerätes bestimmt werden können, schwanken. Das Quenchmittel ist typischerweise eine wäßrige Lösung, welche lösliche Salze enthält, welche wirksam sind, sowohl die lytische Aktivität des lytischen Reagens wesentlich zu verzögern und/oder wesentlich zu neutralisieren, als auch den Ionenausgleich der Probe wiederherzustellen. Diese Wiederherstellung des Ionenausgleichs wird die Langlebigkeit der überlebenden Zellen erhöhen und eine anschließende Analyse auf einem Gerät gestatten, welches erfordert, daß die Probe elektrisch leitend ist und Elektrolyte enthält, wie zum Beispiel das COULTER VCS-Durchflußzytometer.
Ein Quenchmittel, welches in Verbindung mit der lytischen Reagenszusammensetzung verwendet werden kann und gewöhnlich wird, enthält jede Kombination von mindestens zwei der folgenden vier Inhaltsstoffe; Natriumchlorid, Natriumsulfat, Natriumbicarbonat und Natriumcarbonat; und zusätzlich Natriumazid als ein Konservierungsmittel. Die Wirksamkeit des Quenchmittels auf das lytische Reagens im Kontext mit dem Verfahren und dem System der Erfindung wird von seiner Fähigkeit bestimmt, die lytische Aktivität des sauren lytischen Reagens rasch zu verringern.
Das Verfahren und die Vorrichtung, die in der Differenzierung der Leukozyten-Sub- Population benützt werden, kann auch bestimmte Anforderungen, wie Leitfähigkeit, pH, etc., an die genaue Formulierung des Quenchmittels stellen. Wenn eine solche Differenzierung in einem Analysesystem mit einer fokussierten Durchflußöffnung, wie z.B. das COULTER VCS, durchgeführt wird, kann die Zusammensetzung und das Volumen des Quenchmittels für eine optimale Trennung (Differenzierung) der fünf (5) Leukozyten-Subklassen voneinander wichtig sein. Bei diesem Typus Analysesystem muß der Ionenausgleich des Quenchmittels auch eingestellt werden, um eine zufriedenstellende Leitfähigkeitsanpassung der lysierten Blutprobe an das Hüllenfluid zu erhalten. In der bevorzugten Quenchformulierung sollte die hauptsächliche Ionenspezies und ihr relatives Verhältnis in der Lyse-gequenchten Blutprobe im wesentlichen das gleiche der Hauptionenspezies und ihrem relativen Verhältnis im Hüllenfluid sein. Komponenten der Probe, zum Beispiel Fibrin und Plättchen, sind pH-empfindlich und können unter sauren Bedingungen Aggregate bilden welche eine Differentialanalyse möglicherweise stören können oder die Öffnung eines fokussierten Durchflußöffnungssystems physisch verstopfen können. Diese Überlegungen hinsichtlich einer pH-Einstellung können sich auch für andere analytische Meßumgebungen als wichtig erweisen.
Die relative Konzentration der funktionellen Komponenten des Quenchmittels, welches in Verbindung mit dem lytischen Reagenssystem dieser Erfindung verwendet werden soll, reicht von etwa 1 bis etwa 3% (Gew./Vol.) Natriumchlorid, etwa 0,25 bis etwa 0,8% (Gew./Vol.) Natriumcarbonat oder -bicarbonat und etwa 2 bis etwa 4% (Gew./Vol.) Natriumsulfat Die relativen Mengen an Inhaltsstoffen des optimalen Quenchmittels werden in der Regel empirisch bestimmt. Das Ziel einer solchen Einstellung besteht darin, den pH der lysierten Blutprobe in den Bereich von etwa 6,0 bis etwa 7,5 zu bekommen und eine Endosmolalität der stabilisierten, lysierten Blutprobe in den Bereich von etwa 300 bis etwa 330 mOs einzustellen. In einem fokussierten Durchflußöffnungssystem wird eine optimale Clusterbildung der Leukozyten-Subklassen durch Einstellung der Osmolalität der Endblutprobe auf etwa 310 mOs erzielt.
In den bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung muß die Dauer eines wirksames Kontaktes des lytischen Reagens und der Blutprobe, ab dem Zeitpunkt, wo die zwei vereinigt sind, bis zu dem Zeitpunkt, wenn das Quenchmittel zugegeben wird, weniger als zehn (10) Sekunden sein, und ist am meisten bevorzugt sechs Sekunden oder weniger. Das Intervall des Reaktivkontaktes des lytischen Reagens und der Blutprobe, wie oben spezifiziert, läßt vermuten, daß ein solcher Reaktivkontakt bei Raumtemperatur, 18-28ºC, auftritt.
Das Färbemittel, welches im Verfahren und im System dieser Erfindung verwendet wird, umfaßt einen Indikator, welcher an ein Protein konjugiert worden ist, der für eine Bindung an ein Epitop auf der Zellenoberfläche eines interessierenden zellulären Analyten, zum Beispiel B-Lymphozyten und T-Lymphozyten, spezifisch ist. Antikörper, die auf Leukozyten- Oberflächenmarkern spezifisch sind, sind von einer Reihe von kommerziellen Quellen erhältlich. In den bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung ist ein monoklonaler Antikörper das Reagens der Wahl. Monoklonale Antikörper, welche für Oberflächenmarker auf T-Zellen und B-Zellen spezifisch sind, können kommerziell leicht erhalten werden und wurden auch auf ein geeignetes Fluorochrom konjugiert.
Es wurde eine Serie von Analysen, Beispiele I-V, bei der Auswertung des Verfahrens und des Reagenssystems dieser Erfindung durch Vergleich mit früheren Techniken, die für das Anreichern und Färben einer spezifischen, interessierenden Lymphozyten-Population (B- und T-Zellen) verwendet werden, durchgeführt. In jedem Fall war die Vollblutprobe sowie das Verfahren und die Vorrichtung zur Messung der spezifischen, interessierenden Zellen-Sub-Populationen gleich. Die Technik zur Trennung, Anreicherung der Leukozytenfraktion folgte dem Protokoll, welches für jedes der Reagenssysteme, die für diesen Zweck gestaltet wurden, aufgestellt wurde. Die Methodik, die in dieser Erfindung verwendet wird, ist in Beispiel VI veranschaulicht. In jedem dieser Beispiele wurde die Analyse der angereicherten Probe auf einem COULTER EPICS Durchflußzytometer Modell C ausgeführt, wobei dem Standard-Betriebsprotokoll für dieses Gerät gefolgt wurde. Die Ergebnisse jeder Analyse sind in einer Serie von Streuungsdiagrammen, FIGUREN 1A-6A, und Histogrammen, FIGUREN 1B,C-6B,C, angegeben.

BEISPIEL I

Das Abtrennungsmedium und das Verfahren, welches bei der Herstellung der Probe für dieses Beispiel angewendet wurde, umfaßt eine Abtrennung, eine Anreicherung der Leukozytenfraktion durch traditionelle Lyse-Techniken, einschließlich Probenwaschen, gefolgt von einem Färben mit Fluorochrom-markierten Antikörpern, welche für B- bzw. T-Zellen spezifisch sind; (Ortho Diagnostic System, Verfahren zur Herstellung und Färbung von mononuklearen Zellen für eine Analyse auf dem Ortho SPECTRUM III Laser-Durchflußzytometriesystem CYTOFLUOROGRAF ). Nach Herstellung der Probe wurde die relative Konzentration von B- und T-Zellen in einem EPICS Durchflußzytometer Modell C bestimmt. Die FIGUR 1A stellt ein Streuungsdiagramm der Leukozyten-Sub-Populationen der Vollblutprobe von einem gesunden Spender dar. Die FIGUR 1B ist ein Histogramm, welches die relative B-Zellenkonzentration von (12,20%) zwischen den B-Zellen und den nicht-B-Zellen darstellt. Die FIGUR 1C stellt die relative T-Zellenkonzentration von (83,30%) zwischen den T-Zellen und den nicht-T-Zellen dar.

BEISPIEL H

Die Probenbereitung umfaßte die Lyse von Erythrozyten mit einem Tensid, gemäß den Arbeitsweisen, die für das Reagenssystem beschrieben sind, welches unter der Marke Immunolyse von Coulter Corporation Immunology Division verkauft wird. Die Probenanalyse wird auf die gleiche Weise wie für die Probe der FIGUR 1 durchgeführt. Die FIGUR 2A stellt ein Streuungsdiagramm der Leukozyten-Sub-Population einer Vollblutprobe von einem gesunden Spender dar, wie im Streuungsdiagramm der FIGUR 1A angegeben. Die FIGUR 2B stellt die relative Konzentration (15,40%) von B-Zellen in der Probe dar. Die FIGUR 2C stellt die relative Konzentration (79,59%) von T-Zellen in der Probe dar. Es sind die Schwankungen in den Ergebnissen im Vergleich zur berichteten relativen Konzentration von B-Zellen und T- Zellen mit den Werten, die für die gemäß FIGUR 1 durchgeführte Analyse berichtet wurden, zu beachten.

BEISPIEL III

Die Probenbereitung umfaßte die Lyse von Erythrozyten mit Diethylenglycol gemäß den Arbeitsweisen, die für das Reagenssystem beschrieben sind, welches unter der Marke FACS von Becton-Dickinson verkauft wird. Die FIGUR 3A stellt ein Streuungsdiagramm dieser Leukozyten-Sub-Population einer Vollblutprobe vom gleichen gesunden Spender wie in den FIGUREN 1A & 2A dar. Die FIGUR 3B ist ein verbessertes Histogramm, welches die relative Konzentration der B-Zellen in der Probe darstellt (19,04%). Die FIGUR 3C ist ein verbessertes Histogramm, welches die relative Konzentration der T-Zellen in der Probe darstellt (69,17%). Das Fehlen an Korrelation der Ergebnisse mit jenen der FIGUREN 1 und 2 ist anzumerken. Außerdem verschob sich auch die relative Konzentration von B- zu T-Zellen, was anzeigt, daß die Probenbereitung, die Lyse von RBC's mit Diethylenglycol, für T-Zellen zu aggressiv ist.

BEISPIEL IV

Die Probenbereitung umfaßte eine Dichtegradientenabtrennung von primär Lymphozyten- und Monozyten-Sub-Populationen. Diese Arbeitsweise wird als in hohem Ausmaß vom Techniker abhängig angesehen, und es wird berichtet, daß es zu beträchtlichen Zellverlusten neigt. Die FIGUR 4A stellt ein Streuungsdiagramm der Leukozyten-Sub-Populationen einer Vollblutprobe vom gleichen gesunden Spender wie in den FIGUREN 1A, 2A und 3A dar. Die FIGUR 4B ist ein verbessertes Histogramm, welches die relative Konzentration der B-Zellen in einer solchen Probe darstellt (4,64%). Die FIGUR 4C ist ein verbessertes Histogramm, welches die relative Konzentration der T-Zellen in einer solchen Probe darstellt (88,55%). Das Fehlen an Korrelation der Ergebnisse mit jenen der FIGUREN 1, 2 und 3 ist zu beachten. Außerdem hat sich die relative Konzentration von B-Zellen zu T-Zellen dramatisch verschoben, was anzeigt, daß das wiederholte Waschen und die physikalischen Manipulationen dieser Arbeitsweise für B-Zellen schädigender als für T-Zellen sind.

BEISPIEL V

Die Arbeitsweisen von Beispiel IV wurden wiederholt, außer daß das nicht-umgesetzte Färbemittel in der Kammer zurückgelassen wurde und die Analyse so durchgeführt wurde, wie von Caldwell et al als "ohne Waschen" spezifiziert. Das Streuungsdiagramm von FIGUR 5A stellt die Leukozyten-Sub-Populationen dar, welche differenziert werden konnten. Die FIGUR 5B ist ein verbessertes Histogramm, welches die relative Konzentration der B-Zellen (8,14%) darstellt. Die FIGUR 5C ist ein verbessertes Histogramm, welches die relative Konzentration der T-Zellen darstellt (87,75%). Die erhöhte relative Konzentration der Population an B-Zellen ist zu beachten, welche die Beobachtung von Caldwell et al. hinsichtlich der Vorteile der Eliminierung des Waschschrittes nach dem Färben der Probe bestätigt.

BEISPIEL VI

Die Probenbereitung umfaßte ein schnelles (weniger als 90 Sekunden Gesamtzeit) Färben, die Lyse, das Quenchen und Fixieren der Probe. Die Probenbereitung umfaßte das automatische Abgeben und Mischen der folgenden Reagenzien in der vorgeschriebenen Reihenfolge mit der Vollblutprobe vom gleichen Spender wie in den Beispielen I-V.

I. Materialien

1. Lyse: 1,2 ml Ameisensäure
0,2 ml Natriumomadin (40%)
998,6 ml entionisiertes Wasser
2. Quench: 31,30 Gramm Natriumsulfat
14,50 Gramm Natriumchlorid
6,00 Gramm Natriumcarbonat
1 Liter entionisiertes Wasser
3. Fixierung: 6,05 Gramm TRIS-(HCl)-Puffer
10,00 Gramm Paraformaldehyd
00,05 ml Natriumhydroxid (50%)
1 Liter entionisiertes Wasser
4. Färbung: Becton-Dickinson-Immunzytometrie-Systeme
G1-FITC
HLE-FITC

Coulter Immunology Division

MIG-FITC TY-RD1
MIG-RD1 T1-FITC
T8-FITC B1-FITC
Das COULTER Q-PREP-Gerät wurde in der programmierten Zugabe des Farbstoffes, des lytischen Reagenssystems und des Fixiermittels verwendet und gab eine vorbestimmte Menge jedes dieser Reagenzien zu den richtigen Zeitpunkten ab, unter mildem Schütteln eines Teströhrchens von 25 x 75 mm, wobei nach dem folgenden Zyklus gearbeitet wurde:
(a) Zugabe eines mit Fluorochrom markierten Antikörpers zur Probe
(b) mildes Schütteln der Probe und Färben während 60 Sekunden
(c) Zugabe eines lytischen Reagens zur Färbung und Probennahme
(d) Schütteln während 6 Sekunden
(e) Zugabe eines Quenchmittels
(t) 10 Sekunden schütteln
(g) Zugabe eines Fixiermittels
(h) Teströhrchen in ein Durchflußzytometer geben und die relative Population von B-Zellen und T-Zellen analysieren.
Die FIGUR 6A ist ein Streuungsdiagramm der Leukozyten-Sub-Population einer Vollblutprobe vom gleichen gesunden Spender wie in den FIGUREN 1A, 2A, 3A und 5A. Die FIGUR 6B ist ein verbessertes Histogramm, welches die relative Konzentration der B-Zellen in einer solchen Probe darstellt (19,79%). Die FIGUR 6C ist ein verbessertes Histogramm, welches die relative Konzentration von T-Zellen in einer solchen Probe darstellt (76,97%). Die relative hohe Konzentration an B-Zellen ist zu beachten, welche anzeigt, daß das Verfahren und das Reagenssystem dieser Erfindung beim Identifizieren der relevanten, interessierenden Sub-Population wirksam sind, und daß diese Technik mit einer minimalen Beteiligung eines Technikers wirksam ist, und zwar ohne jeglichen Waschschritt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Vollblutprobe für eine Analyse mittels photooptischer Meßtechniken, welches Verfahren ein Anreichern der zellulären Nicht-Erythrozytenfraktion der Probe und das Markieren einer oder mehrerer Sub-Populationen der Fraktion mittels immunchemischer Wechselwirkung der Zellen der Fraktion mit einem Indikator-markierten Bindungsmaterial, welches für eine charakteristische zelluläre Komponente der interessierenden Sub-Population spezifisch ist, beinhaltet, welches Verfahren die Schritte umfaßt:

(a) Vorsehen eines herkömmlichen Reaktionsgefäßes desjenigen Typus, welcher typischerweise als ein Probenbehälter für eine photooptische Instrumentierung benützt wird, die zur Quantifizierung und/oder Differenzierung von teilchenförmigen Analyten von anderen Teilchen, welche zur Probe endogen sind, ausgebildet ist; welches Verfahren gekennzeichnet ist durch:

(b) Herstellen der Probe zur Analyse im Reaktionsgefäß, indem die Probe Bedingungen für eine selektive Stromatolyse mittels eines lytischen Reagens unterworfen wird, um eine wirksame Differenzierung der Nicht-Erythrozytenfraktion der Probe von der Erythrozytenfraktion zu ermöglichen;

(c) Markieren mindestens einer der Sub-Populationen mit einem Bindungsmaterial vor dem, gleichzeitig mit dem oder nach dem Schritt zur selektiven Stromatolyse; und Quenchen der Aktivität des lytischen Reagens mit einem Begleitreagens, welches wirksam ist zum Hemmen der lytischen Aktivität des lytischen Reagens und Wiederherstellen des Ionenausgleichs der Probe; und

(d) Nehmen eines Aliquots der Probe in einem photooptischen Analysator aus dem herkömmlichen Reaktionsgefäß ohne vorherige Abtrennung der markierten Sub-Population von nicht-umgesetzten und/oder nicht-verbrauchten Reagenzien und/oder Bindungsmaterial; mit der Maßgabe:

eines Verfahrens zur Probenherstellung und -analyse, in welchem ein oder mehrere Reagenzien in einen Mischbehälter gespendet werden, welcher Probenmaterial enthält, wonach der Mischbehälter bewegt wird, um die Reagenzien mit dem Probenmaterial zur Reaktion zu bringen, um das Probenmaterial für die Verwendung herzustellen, welches Verfahren gekennzeichnet ist durch:

Verwenden eines Teströhrchens eines Typus, der in Durchflußzytometern verwendet wird, als den Mischbehälter;

Immunfluoreszenzfärben der Probe im Teströhrchen und anschließendes Zugeben eines lytischen Reagens der Formulierung 1,2 ml Ameisensäure, 0,2 ml Natriumomadin (40%) und 998,6 ml entionisiertes Wasser zur Probe im Teströbrchen und Mischen;

Zugeben eines Lyse-stabilisierenden Reagens der Formulierung 31,30 Gramm Natriumsulfat, 14,05 Gramm Natriumchlorid, 6 Gramm Natriumcarbonat und 1 Liter entionisiertes Wasser zur Probe im Teströhrchen und Mischen; und

Durchführen einer Probenanalyse der Probe in einem Durchflußzytometer im gleichen Röhrchen, welches zur Herstellung der Probe verwendet wurde, ohne vorheriges Waschen der Probe.

2. Verfahren zur Herstellung einer Vollblutprobe für eine Analyse mittels photooptischer Meßtechniken, welches Verfahren ein Anreichern der zellulären Nicht-Erythrozytenfraktion der Probe und das Markieren einer oder mehrerer Sub-Populationen der Fraktion mittels immunchemischer Wechselwirkung der Zellen der Fraktion mit einem Indikator-markierten Bindungsmaterial, welches für eine charakteristische zelluläre Komponente der interessierenden Sub-Population spezifisch ist, beinhaltet, welches Verfahren die Schritte umfaßt:

(b) Herstellen der Probe zur Analyse im Reaktionsgefäß, indem die Probe Bedingungen für eine selektive Stromatolyse mittels eines sauren lytischen Reagens unterworfen wird, um eine wirksame Differenzierung der Nicht-Erythrozytenfraktion der Probe von der Erythrozytenfraktion zu ermöglichen;

(c) Markieren mindestens einer der Sub-Populationen mit einem Bindungsmaterial; und

(d) Nehmen eines Aliquots der Probe in einem photooptischen Analysator aus dem Reaktionsgefäß, welches Verfahren den weiteren Schritt eines Quenchens der Aktivität des lytischen Reagens mit einem Begleitreagens, welches wirksam ist zum Hemmen der lytischen Aktivität des lytischen Reagens und Wiederherstellen des Ionenausgleichs der Probe, umfaßt;

mit der Maßgabe von Anspruch 1.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Übertragens ohne vorherige Abtrennung der markierten Sub-Population von nicht-umgesetzten und/oder nicht-verbrauchten Reagenzien und/oder Bindungsmaterial vorgenommen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Nehmens eines Aliquots ohne vorherige Abtrennung der interessierenden markierten Sub-Population vom nicht-umgesetzten und/oder nicht-verbrauchten lytischen Reagenssystem und/oder Indikatormarkierten Bindungsmaterialien, welche innerhalb der Probe frei bleiben, und anderen Bestandteilen der Probe, vorgenommen wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das lytische Reagens einen pH im Bereich von etwa 2,6 bis etwa 4,0 aufweist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das lytische Reagens eine für die Stromatolyse wirksame Menge einer organischen Carbonsäure mit einem pH im Bereich von etwa 2,6 bis etwa 4,0 umfaßt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das lytische Reagens eine organische Säure, ausgewählt aus der Gruppe von Ameisensäure, Essigsäure und ihren jeweiligen Gemischen, ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe nach dem Markieren mit dem Bindungsmaterial mit einem Fixierungsmittel in Kontakt gebracht wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Vollblutprobe mit dem lytischen Reagens und mit dem Indikator-markierten Bindungsmaterial in dem Reaktionsgefäß durch leichtes Wirbelmischen in Kontakt gebracht wird, um die Sub- Populationen der Fraktion der Probe auf einer im wesentlichen homogenen Konzentration in der gesamten Probe zu halten.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt zum Herstellen ein In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem lytischen Reagens und dem Bindungsmaterial und die asymmetrische Bewegung des Reaktionsgefäßes für ein leichtes Mischen beinhaltet, wobei das Herstellen weniger als 90 Sekunden erfordert.