DE69328772T2

DE69328772T2 - Suspensionsmedien für hämatoligische zusammensetzungen und methode für ihren gebrauch

Info

Publication number: DE69328772T2
Application number: DE69328772T
Authority: DE
Inventors: N. Elliott; J. Fischer; R. Naylor; Carole Young
Original assignee: Coulter Corp
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1992-02-24
Filing date: 1993-02-17
Publication date: 2001-02-15
Anticipated expiration: 2013-02-18
Also published as: KR950700540A; JP3359921B2; US5529933A; JPH07504035A; BR9305960A; EP0628166A4; AU669692B2; NO943116D0; NO943116L; DE69328772D1; CA2129834A1; EP0628166B1; WO1993017329A1; AU3722293A; EP0628166A1; ATE193603T1

Description

Diese Erfindung betrifft ein neuartiges Suspensionsmedium für hämatologische Zusammensetzungen, mit besonderer Brauchbarkeit bei Analogen von Referenzblutzellen für Vorrichtungen, die elektronische und optische Mittel zu Vollblutbestimmungen verwenden, und Verfahren zum Herstellen und Verwenden von Analogen und der Suspensionsmedien.
Qualitätskontrolle war lange Zeit ein notwendiger und routinemäßiger Vorgang in der klinischen Hämatologie. Die Genauigkeit beim Zählen von roten Blutzellen und weißen Blutzellen einschließlich des Differenzierens zwischen den Subpopulationen weißer Blutzellen hängt zum Teil vom Einsatz geeigneter Kontrollprodukte ab. Bei den zahlreichen Arten an Ausrüstung zum Teilchenzählen, die heute erhältlich sind, ist eine Qualitätskontrolle mittels Einsatz von Kontrollprodukten erforderlich, da die Möglichkeit von Funktionsstörungen beim Instrument stets gegeben ist. Die traditionelle Methode, ein Qualitätskontrollprogramm für eine Ausrüstung zum automatischen Teilchenzählen aufrechtzuerhalten, bestand darin, humanes Frischblut als Vollblutstandard bereitzustellen. Allerdings ist dieses Frischblut lediglich einen Tag verwendbar, und daher wurden haltbare Blutprodukte entwickelt.
Hämatologische Kontrollprodukte, die Analoge von Referenzblutzellen enthalten, die die Genauigkeit und Präzision von Vorrichtungen zum Blutzellenzählen überwachen, sind von besonderer Wichtigkeit. Es wird anerkannt, dass gegenwärtig ein Bedarf an neuen Analogen von Referenzblutzellen besteht, um die Genauigkeit der Weiße-Zellen- Differenzierung und anderer Parameter aufrechtzuerhalten, wenn solche Vorrichtungen zum Blutzellenzählen verwendet werden.
Kontrollprodukte sollten sich so weit wie möglich an das aus frischem Vollblut annähern. Es wurden Versuche unternommen, durch Verwendung von Kreuzkrautpollen, Polystyrol, Latex, verschiedenen organischen Materialien und fixierten humanen roten Zellen Teilchen mit einer geeigneten Größe in stabilen Suspensionen bereitzustellen. Keine dieser Suspensionen hat sich als geeignet erwiesen, als Kontrollprodukt für eine Weiße- Zellen-Differenzierung von mindestens vier Leukozyten-Subpopulationen verwendet zu werden.
Das zum Aufrechterhalten der Qualitätskontrolle verwendete Material, im Folgenden ein hämatologisches Kontrollprodukt oder Kontrollprodukt genannt, kann unter bestimmten Umständen auch zum Kalibrieren hämatologischer Instrumente verwendet werden. Für die Zwecke dieser Erfindung wird das Kontrollprodukt ein oder mehrere Analoge enthalten, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, das bei einer Analyse mindestens eine physikalische oder biologische Eigenschaft von Blut simuliert, die das Instrument analysieren kann. So wie hierbei verwendet ist ein Analoges definiert als ein Teilchen, das mindestens eine physikalische oder biologische Eigenschaft einer Zielpopulation simuliert. An sich können manche automatische Maschinen lediglich gewisse Bestandteile eines Kontrollprodukts analysieren, obwohl das Kontrollprodukt zusätzliche Parameterkomponenten hat, die von anderen Maschinen analysiert werden können. Bisher sind keine Analoge oder Suspensionsmedien zur Verwendung in einem Kontrollprodukt entwickelt worden, um Überprüfungen für zumindest vier Untergruppen von Leukozyten, nämlich Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile und Eosinophile, bereitzustellen.
Es ist klar, dass ein Kontrollprodukt - auf einer vergleichenden Grundlage - genau angeben muss, was eine Frischblut-Versuchsprobe in Bezug auf die fraglichen Bestimmungen ausmacht. Es ist des Weiteren klar, wie wichtig es für das Kontrollprodukt ist, Frischblut zu simulieren, da Blutbestandteile wie z. B. rote Blutzellen langsam hämolysieren können und innerhalb von Stunden nach Abnahme von einem Blutspender Veränderungen in Größe und Gestalt erfahren. Ähnlich dazu erfahren weiße Blutzellen degenerative Veränderungen.
Im Allgemeinen konzentrierte sich das Verfahren zur Herstellung von Analogen im Stand der Technik darauf, rote Blutzellen zu verwenden, die vor dem Fixieren ihr ursprüngliches Volumen behalten oder verringert hatten. Das Schrumpfen oder Ausdehnen der Zellen durch Manipulieren ihrer osmotischen Umgebung vor dem Fixieren hatte seine Grenzen. Früher verursachte das Schrumpfen oder Quellen nicht humaner Erythrozyten um mehr als etwa 30% bis 50% eine übermäßige Zellenassoziation oder eine Lyse der Zelle.
Das US-Patent Nr. 3,873,467 an Hunt lehrt eine hämatologische Bezugskontrolle, die eine Suspension von gewaschenen, stabilisierten humanen roten Blutzellen in einem nicht proteinhaltigen wässerigen Suspensionsfluidum, das das Plasma in menschlichem Blut ersetzt, umfasst. Die Stabilität in der Bezugskontrolle wird dadurch erzielt, dass die Zellen durch das Einschließen von Materialien in das wässerige Suspensionsfluidum konditioniert werden, die dazu neigen, die Zellen eine sphärische Gestalt annehmen zu lassen, ohne wesentliche Änderung des mittleren Zellvolumens der Zellen, sowie dadurch, dass den Zellen eine Widerstandsfähigkeit gegenüber der normalen Neigung, sich mit der Zeit zu zersetzen, verliehen wird. Das wässerige Suspensionsfluidum erzeugt ferner ein die biologische Wirksamkeit hemmendes Milieu für die Zellen. In einer bevorzugten Ausführung ist in die Bezugskontrolle ferner eine geringere Menge an fixierten humanen roten Blutzellen eingeschlossen, die behandelt wurden, um ein wesentlich vergrößertes mittleres Zellvolumen zu haben. Die fixierten Zellen sind gegenüber einer Änderung des Zellvolumens und einer Auflösung bei Einwirkung von Lyse-Reagenzien, die ein Lysieren der stabilisierten Zellen bewirken, resistent. Die fixierten roten Blutzellen in der Bezugskontrolle ersetzen die Population weißer Zellen in menschlichem Blut.
Im US-Patent Nr. 4,704,364 an Carver et al. werden Kontrollen für Schwellen und zusätzliche Betriebsfunktionen für elektronische Teilchenzähler vom Typ der Analysevorrichtungen Typ COULTER COUNTER® Model S Plus offenbart. Allerdings besteht nunmehr ein Bedarf für ein Vollblutzellen-Kontrollprodukt für elektronisch-optische Teilchenzähler vom Typ des COULTER® VCS-Analysators. Der VCS-Analysator ermöglicht die Differenzierung von zumindest vier Leukozyten-Populationen.
Jedes System zum automatisierten differenziellen Zählen von humanen Leukozyten, das zumindest vier Leukozyten-Populationen von anderen Zellen im Blut auf der Grundlage des Größenbereichs, der Volumsverteilung, des Lichtstreuungsbereichs und der Empfindlichkeit gegenüber elektrischer Opazität und Leitfähigkeit unterscheidet, erfordert es, dass das Kontrollprodukt den Bereich, die Verteilung und die Empfindlichkeitsmerkmale der jeweiligen Zellen in normalem menschlichem Blut genau simuliert. Das Problem besteht darin, Verfahren zu finden, die Zellen mit gegebener Größe, gegebenem Volumen und gegebenen Lichtstreuungseigenschaften in genauer Weise in reproduzierbaren Mengen produzieren werden, die ausreichen, um zur Verwendung in Kontrollprodukten für Instrumente zum automatisierten elektronisch-optischen Teilchenzählen kommerziell verfügbar zu sein.
Menschliche Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Basophile und Eosinophile haben einen speziellen Größenverteilungsbereich und optische Merkmale, und nach einer Stabilisierung (etwa mit einem Fixierungsmittel wie z. B. Glutaraldehyd) kann ihre Ansprechempfindlichkeit in einem Suspensionsmedium eine richtige Unterscheidung nicht erlauben. Dies würde zum Unvermögen führen, das richtige Funktionieren eines Instruments zu bewerten. Sowohl die oberen als auch die unteren Größengrenzen für jede Leukozyten; Subpopulation sollten in einem Bezugskontrollprodukt repräsentiert sein. Zusätzlich dazu sollte sich das mittlere Zellvolumen jeder Leukozyten-Subpopulation im Kontrollprodukt an das von normalem menschlichem Blut annähern. Darüber hinaus ist es erforderlich, dass das für das Kontrollprodukt verwendete flüssige Suspensionsmedium kein signifikantes Schrumpfen oder Quellen der Zellen verursacht. Ferner sollte das Altern des Kontrollprodukts nicht zu einer Verschlechterung der Merkmale des Volumsverteilungshistogramms oder anderer Parameter führen. Ein weiteres Erfordernis für die Leukozyten-Analoge im Kontrollprodukt für Multi-Parameter-Instrumente besteht darin, dass die analogen Zellen in einem Vollblut-Kontrollprodukt durch das Lyse-Reagens nicht vollständig lysiert werden dürfen, um gezählt und differenziert zu werden.
Eine Vielfalt von Medien sind in Zusammenhang mit Analogen von Blutzellen verwendet worden. Im US-Patent Nr. 4,299,726 werden ein Mehrzweckverdünnungsmittel und ein Medium offenbart. Das Verdünnungsmittel wird dazu verwendet, rote Blutzellen zu präkonditionieren, und besteht im Wesentlichen aus Laktose, Natriumazid und einem nichtionischen grenzflächenaktiven Mittel; es ist bezüglich pH und Osmolalität eingestellt. Das Medium wird für einen Träger des Vollblut-Kontrollprodukts verwendet und umfasst Laktose, Fungizide und Antibiotika. Es umfasst auch zusätzliche Bestandteile, welche die Membranen roter Blutzellen verändern, einschließlich Gallensalze und Cholsäurederivate, Phenothiazin-Verbindungen und deren Salze mit Antihistamin-Eigenschaften, und 4-amino- Benzoesäureesterderivate und deren Salze mit lokalanästhetischen Eigenschaften.
Ein Nachteil der Medien im Stand der Technik besteht darin, dass bei einer Verwendung in Verbindung mit roten Blutzellen und fixierten humanen weißen Blutzellen oder Analogen weißer Blutzellen das Kontrollprodukt keine Vollblutprobe bei Instrumenten simuliert, die zumindest vier Leukozyten-Subpopulationen unterscheiden. Die speziellen Parameter der roten und weißen Blutzellen, deren Messung gewünscht ist, schreiben einige der notwendigen Merkmale eines geeigneten Mediums für ein Vollblut- Bezugskontrollprodukt vor. Es ist wünschenswert, das Volumen der roten Zelle zu kennen. Ist diese Messung einmal durchgeführt und sind die roten Zellen gezählt, kann das gepackte Zellvolumen oder der Hämatokrit berechnet werden. Daher sollte das Suspensionsmedium des Kontrollprodukts das Volumen von roten Blutzellen in der Probe ausgleichen und stabilisieren können, so dass ihr mittleres Zellvolumen gemessen werden kann (MCV).
Ein Kontrollprodukt sollte auch von jeglichen Stoffteilchen freigemacht werden, die vielleicht eine Interferenz bei Schwellen geringerer Größe zeigen würden, die jener der menschlichen Blutplättchengröße und -verteilung entsprechen. Gleichzeitig würde das Suspensionsmedium gegebenenfalls bakteriostatische Mittel zur Verhinderung des Wachstums von Mikroorganismen nach dem Verpacken des Kontrollprodukts umfassen.
Wenngleich rote Blutzellen (Erythrozyten) und weiße Blutzellen (Leukozyten), nominell eine unterschiedliche Größe haben, neigen ihre Größenbereiche dazu, sich zu überschneiden, oder könnten sich zumindest unter gewissen gesundheitlichen Bedingungen überschneiden. Des Weiteren können sich auch die Opazitäten dieser beiden Arten von Blutzellen überschneiden. Erythrozyten und die lymphoiden Leukozyten überschneiden sich in Bezug auf die Zellgröße leider beträchtlich, und es ist nicht praktikabel, alleine durch Größenunterscheidung die einen in der Gegenwart der anderen zu zählen. Die traditionelle Praxis umfasste die Verwendung eines starken Lyse-Reagens, das die Erythrozyten stromatolysiert, wobei es sie auf sehr kleine Teilchen reduziert oder eine Membransolubilisierung bewirkt, um sie aus dem Zählvorgang auszuscheiden; und das meiste, wenn nicht das gesamte, Cytoplasma von den Leukozyten ablöst, wobei nur ihre Lyse-beständigen Kerne zum Zählen übrig gelassen werden. Da das ursprüngliche Zellvolumen der Leukozyten drastisch beeinflusst und auf ein Minimum reduziert wird, ist durch diese ältere Form der Analyse der Blutzellengröße lediglich eine einzige Leukozyten- Population unterscheidbar.
Das US-Patent Nr. 3,741,875, Ansley et al., beschreibt ein Verfahren zum Erhalten einer differenziellen Zählung weißer Blutzellen. Ein zytologisches Fixierungsmittel, das ein Monoaldehyd wie z. B. Formaldehyd ist, wird einer Blutprobe zugesetzt. Ein Hämolyse- Agens wird nach dem Fixierungsschritt zugesetzt, um zu bewirken, dass die roten Blutzellen ihren Hämoglobingehalt in die Lösung freisetzen. Die Zugabe eines speziellen zytochemischen Substrats, eines chromogenen ausfällenden Kopplungsreagens und eines pH-Puffers verursacht eine Ablagerung eines unlöslichen Farbstoffes in einer speziellen Zellart, die ein immobilisiertes Enzym enthält. Die Lösung mit den gefärbten Blutzellen wird anschließend durch einen photometrischen Zähler geleitet. Indem verschiedene spezielle Substrate für verschiedene in speziellen Zellarten enthaltene Enzyme verwendet werden, werden absolute und relative Zählungen der verschiedenen Zellarten erhalten. Die zytologische Fixierungslösung verwendete nur ein Monoaldehyd. Dialdehyde gelten als ungeeignet, da sie sich quervernetzen und extrazelluläre Niederschläge bilden.
Das US-Patent Nr. 4,485,175 an Ledis et al. betrifft ein Verfahren und ein Reagenzsystem für eine Drei-Volumen-Differenzbestimmung von Lymphozyten-, mononukleären und Granulozyten-Populationen von Leukozyten, wobei quarternäre Ammoniumsalze als Lyse-Mittel und der automatische Blutzähler COULTER COUNTER® Model S Plus verwendet werden, welches Instrument lediglich Gleichstrom-Feldanregung verwendet.
Das US-Patent Nr. 4,751,179 an Ledis et al. beschreibt ein Reagenzsystem, umfassend Saponin in einem Lyse-Reagens und ein schnellwirkendes Vernetzungsmittel wie z. B. Glutaraldehyd als Fixierungsreagens, das Vollblut wiederholbar dahin gehend beeinflusst, die roten Blutzellen zum Stromatolysieren zu bringen, und die Leukozyten verändert, um Daten zur Definition vier unterschiedlicher Cluster zur Detektion und Klassifikation durch Durchflussanalyseinstrumente zu erzeugen. Die Cluster repräsentieren die vier Hauptarten von im Blut gefundenen Leukozyten: Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile und Eosinophile, womit ein Verfahren zur Differenzanalyse von Leukozyten bereitgestellt ist. Nach Ledis et al. zeigten frühere Verfahren zur Durchflussanalyse von Leukozyten unter Einsatz von Gleichstromvolumen oder Lichtstreuung bei verschiedenen Winkeln nur drei Leukozyten-Cluster, die Lymphozyten, Granulozyten und Monozyten entsprachen. Die von Ledis et al. zur Leukozytenklassifikation verwendeten Parameter umfassen Kombinationen von zwei oder mehreren aus Gleichstrom (Coulter) -Volumen, Hochfrequenz (RF)-Größe, Coulter-Opazität (RF-Größe/Gleichstromvolumen), Lichtstreuung in verschiedenen Winkelbereichen und Fluoreszenz bei verschiedenen Illuminations-Wellenlängen.
Elektronische Zähler, die das erstmals im US-Patent Nr. 2,656,508 beschriebene Coulter-Prinzip verwenden, bringen eine getreue Widerspiegelung von Teilchenzählungen zum Ausdruck. Nach dem Coulter-Prinzip wird es zu einer momentanen Änderung der elektrischen Impedanz des Feldes kommen, wenn ein Teilchen mikroskopischer Größe in einer Elektrolytflüssigkeit suspendiert ist und durch ein elektrisches Feld kleiner Größe von annähernd dem Ausmaß jener eines Teilchens geleitet wird. Wenn das elektrische Feld durch einen Gleichstrom (DC) oder Niederfrequenzstrom angeregt wird, ist die elektrische Änderung nahezu proportional zum Volumen des Teilchens. Bei kommerziellen Vorrichtungen werden die Änderungen durch gewisse geeignete Mittel detektiert und für den Betrieb von Zählern und Analysegeräten verwendet. Die mit solchen Vorrichtungen verbundenen Analysegeräte klassifizieren und dimensionieren Teilchen in Populationen auf der Grundlage des Teilchenvolumens und zeichnen die erhaltenen Daten auf.
Die Coulter-Prinzip-Erfindung wurde im US-Patent Nr. 3,502,974, Coulter et al., wesentlich erweitert, wobei zusätzlich zur Gleichstrom-Feldanregung Radiofrequenz (RF)- Strom verwendet wurde, um nicht nur Gleichstromvolumen-Informationen über das untersuchte Teilchen bereitzustellen, sondern auch Informationen aufgrund der Zusammensetzung und Beschaffenheit des Materials, das das Teilchen bildet. Dieses Patent offenbart Vorrichtungen, mit deren Hilfe zwischen Teilchen gleicher Größe, aber unterschiedlichen Materials unterschieden werden kann. Indem das Teilchen-abtastende Feld durch Anregen sowohl durch Niederfrequenzstrom oder Gleichstrom (DC) als auch durch Radiofrequenz (RF)-Strom erzeugt wird, können zwei oder mehrere miteinander in Wechselbeziehung stehende Ausgangssignale aus dem Durchgang eines einzelnen Teilchens durch das elektrische Feld abgeleitet werden. Dies ist dadurch bedingt, dass die Teilchen wie z. B. Blutzellen, obwohl sie fast immer Isolatoren gegenüber Niederfrequenzstrom- oder Gleichstromfeldern sind, imstande sind, Radiofrequenzstrom unterschiedlich zum, umgebenden Elektrolyt zu übertragen oder zu behindern. Dies kann durch Unterschiede bei der Dielektrizitätskonstante im Fall homogener Teilchen oder durch die sackähnliche Struktur im Fall von Blutzellen bedingt sein, die, eingeschlossen in einer extrem dünnen Membran, Inhalte mit anderen Leitfähigkeiten als der Elektrolyt aufweisen. Während also der gesamte Gleichstrom um eine Blutzelle herumgeht, wird etwas vom RF-Strom durch sie durchgehen. Die Leichtigkeit, mit der RF-Strom durch ein Teilchen durchgehen wird, ist ein Maß dafür, was seine "elektrischen Transparenz" oder einfach "Transparenz" analog zur Lichtdurchlässigkeit genannt wird; wohingegen die Fähigkeit eines Teilchens, RF-Strom zu behindern, seine "Opazität" genannt wird. In späteren Veröffentlichungen ist "Opazität" als die RF-Impedanz geteilt durch die Gleichstrom-Impedanz definiert.
Die relative elektrische Opazität eines Teilchens wird zu einem Identifikationsmerkmal der Teilcheninhalte und daher seiner Teilchenart für Klassifizierungszwecke. In dem Maße, als unterschiedliche Teilchenarten jeweils eine unterschiedliche Opazität besitzen, ist der Unterschied zwischen ihnen detektierbar. Allerdings können signifikant unterschiedliche Teilchen im Wesentlichen dieselbe Opazität aufweisen, und solche Teilchen können auf diese Weise nicht effektiv klassifiziert werden. Im US-Patent Nr. 3,836,849 lehrten Coulter et al., dass es möglich ist, die Opazität von Teilchenarten durch Behandlung der Teilchen selektiv zu verändern, so dass sich detektierbare Unterschiede ergeben.
Der automatische Blutzellenzähler COULTER COUNTER® Model S Plus ist dazu entworfen, eine Vollblutprobe in einem isotonischen Verdünnungsmittel zu verdünnen, ein Lyse-Agens zuzusetzen und kurz darauf zu zählen zu beginnen. Somit muss ein Verdünnungsmittel-Lyse-System eine Erythrozytenlysekinetik bereitstellen, die schnell genug ist, um eine vollständige Stromatolysierung der roten Blutzellen (Erythrozyten) während der Lysephase zu bewirken. Zusätzlich dazu müssen Änderungen des Leukozytenvolumens während des Datenerfassungsschritts minimal und sollten idealerweise mehrere Minuten stabil sein.
COULTER Model VCS ist ein halbautomatisches Analyseinstrument, das Blut unter Verwendung von Gleichstrom (Coulter)-Volumen, Coulter-Opazität und Lichtstreuung in verschiedenen Winkelbereichen analysiert. Das COULTER Model VCS verwendet ein Reagenzsystem, um eine fünfteilige Differenzierung bei der Gesamtleukozytenzählung zu erzielen, die eine quantitative Analyse der Lymphozyten-, Monozyten-, Neutrophilen-, Eosinophilen- und Basophilen-Population liefert. Das Reagenzsystem umfasst ein Abschreckmittel, das nach der schwachen "sauren" Lyse zugesetzt wird und dessen Einsatz dazu dient, die lysierende Wirkung auf die weißen Zellen stark zu verringern. Kurz nach dem Abschrecken beginnt das Instrument mit dem Messen des Volumens, der Opazität und der Lichtstreuungsmerkmale der verbleibenden weißen Blutzellen. Das Model VCS muss, eine Erythrozytenlysekinetik bereitstellen, die schnell genug ist, um eine vollständige Stromatolysierung der roten Blutzellen während der Lysephase zu bewirken, während die Leukozytenzellen in Bezug auf ihr Volumen, ihre Coulter-Opazität und ihre Lichtstreuungseigenschaften nicht beeinflusst werden. Die COULTER COUNTER®- Instrumente, mit denen diese Erfindung verwendet werden kann, sind das VCS, STKS und MAXM. Allerdings können die Model S- und S-Plus-Typen nicht alle Subpopulationen von Leukozyten-Analogen unterscheiden, die sich in einem Vollblut-Kontrollprodukt befinden, sondern nur eine Gesamtzählung der Leukozyten-Analoge liefern. Bestimmte S-Plus-Typen sind ferner imstande, zwei Leukozyten-Subpopulationen zu unterscheiden.
Neue elektronisch-optische Teilchenzählvorrichtungen haben es erforderlich gemacht, Leukozyten-Analoge und Suspensionsmedien für ein stabiles Vollblut- Kontrollprodukt bereitzustellen, das eine Vollblutprobe genauer simuliert. Obwohl diese Beschreibung primär auf Ausführungen hämatologischer Kontrollprodukte gerichtet sein wird, die mit Teilchenzählern vom Typ COULTER® von Nutzen sind, sollte verstanden werden, dass die in ihr offenbarten Suspensionsmedien, Analoge und Kontrollprodukte und die in ihr beschriebenen Verfahren zu deren Verwendung allgemein bei Teilchenzählern breite Anwendung finden. Dementsprechend sollte der Terminus "elektronisch-optischer Teilchenzähler" dahin gehend verstanden werden, dass er jeden Teilchenzähler umfasst, der zwischen Teilchen verschiedener Größe unterscheidet, und zwar durch die Verwendung von elektronischen Unterscheidungsschaltkreisen ("Schwellen"), die elektronisch auf Signale ansprechen, die Größe, Masse, Volumen, Opazität oder Lichtstreuung der Teilchen anzeigen, einschließlich COULTER COUNTER®-Instrumente (COULTER und COULTER COUNTER sind eingetragenen Warenzeichen der Coulter Corporation).
Gegenwärtig erfordert eine Mehrfachanalyse von Populationen Weißer Blutzellen Analoge mit spezieller Größe und Volumszunahmen und speziellen Lichtstreuungsmerkmalen für eine Verwendung als Qualitätskontrolle. Daher ist es derzeit notwendig, ein Analoges für jede der Leukozyten-Hauptkomponenten herzustellen, die zumindest die Lymphozyten, Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen umfassen, um die Schwelleneinstellungen elektronisch-optischer Teilchenzähler zu überprüfen. Ein erhöhtes Volumen wurde mit erhöhter Lichtstreuung in Korrelation gesetzt, was das Herstellen von zumindest vier verschiedenen Populationen von Leukozyten-Analogen aus anderen als humanen weißen Blutzellen verhinderte.
Da die Analoge und die zum Analysieren der Analoge verwendeten Instrumente komplexer geworden sind, muss das Suspensionsmedium für das Analoge ihre Komplexität ergänzen. Insbesondere muss das Suspensionsmedium mit diesen Analogen und Instrumenten kompatibel sein und die physikalischen und biologischen Eigenschaften der Analoge ergänzen.
Die US-A-4704364 (weiter oben besprochen) offenbart eine hämatologische Bezugslösung zur Verwendung in einem automatischen Analysegerät, die Albumin (HSA) enthält. Lymphozyten, mononukleäre Zellen und Granulozyten werden durch fixierte rote Zellen verschiedener Spezies (Menschen, Fische, Reptilien, Vögel) und bestimmter Größe simuliert.
Die US-A-4299726 (ebenfalls weiter oben besprochen) offenbart die Herstellung von Vollblut-Bezugskontrollen mit langfristiger Stabilität. Das Blut wird mit einem präkonditionierenden Verdünnungsmittel behandelt, das das Volumen der roten Blutzellen rasch verringert und ihre Größenverteilungsbreite stabilisiert. Es enthält das nichtionische grenzflächenaktive Mittel Pluronic F68, Gallensalze und andere Verbindungen, um die Membran der roten Zellen zu verändern. Eine zunehmende Menge Cholesterin erhöht die Oberfläche der roten Blutzellen und ihre Beständigkeit gegenüber einer osmotischen Lyse.
Nach einem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung umfasst ein hämatologisches Kontrollprodukt eine Hämatologie-analoge Zusammensetzung aus Blutzellen und einer wässerigen Lösung einer Plasmasubstanz, die aus Cholesterin, Cholesterinestern, Lipoproteincholesterin, Lipoproteincholesterinestern, Cholesterin kombiniert mit Phospholipiden, Cholesterin kombiniert mit Albumin, Cholesterinestern kombiniert mit Albumin, Lipoproteincholesterin kombiniert mit Phospholipiden, Lipoproteincholesterin kombiniert mit Albumin und Mischungen davon ausgewählt ist.
Diese Erfindung stellt ein Suspensionsmedium, das eine wässerige Lösung einer definierten Plasmasubstanz umfasst, zur Verwendung mit einer hämatologischen Zusammensetzung bereit. Das Suspensionsmedium findet primär als Träger für rote Blutzellen, fixierte weiße Blutzellen, Analoge weißer Blutzellen, Blutplättchen oder Plättchenanaloge in einem Kontrollprodukt Verwendung, das zur Qualitätskontrolle von Teilchenzählern verwendet wird. Das Suspensionsmedium findet des Weiteren Verwendung als suspendierendes Medium für gewaschenes menschliches Blut, wo ein Ersetzen von Plasmabestandteilen für eine Blutzellenlyse erforderlich ist.
Wenn es bei Instrumenten verwendet wird, die anhand zweier oder mehrerer Parameter aus Gleichstrom (Coulter)-Volumen, Hochfrequenz (RF)-Größe, Coulter- Opazität (RF-Größe/Gleichstromvolumen), Lichtstreuung in verschiedenen Winkelbereichen und Fluoreszenz bei verschiedenen Illuminations-Wellenlängen analysieren, bewirkt das Suspensionsmedium, dass die fixierten weißen Blutzellen und die Analoge weißer Blutzellen Eigenschaften aufweisen, die denen reifer humaner weißer Blutzellen ähnlich sind. Zusätzlich erlaubt das Suspensionsmedium ein Erfolgen der Lyse-Reaktion bei den roten Blutzellen im Kontrollprodukt, wenn ein das Suspensionsmedium enthaltendes Vollblut- Kontrollprodukt einem Lyse-Reagens ausgesetzt wird.
Nach einem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur Verwendung eines hämatologischen Kontrollprodukts zum Bestimmen, ob ein Instrument innerhalb der Spezifikation arbeitet,
a. das Kombinieren eines hämatologischen Kontrollprodukts von Blutzellen mit einer Plasmasubstanz, wie weiter oben definiert, und
b. das Analysieren des resultierenden Gemischs in einem Instrument unter Verwendung mindestens einer der vier weiter oben definierten Eigenschaften, um zu bestimmen, ob das Instrument innerhalb der Spezifikation arbeitet.
Das erfindungsgemäße Suspensionsmedium wird primär mit aus Blutzellen hergestellten Leukozyten-Analogen verwendet. Ein Verfahren zur Herstellung von Leukozyten-Analogen stellt behandelte Blutzellen aus verschiedenen Quellen bereit, um einer Mehrzahl von Schwelleneinstellungen für viele Typen von Blutzählinstrumenten zu entsprechen. Bei der Auswahl der Blutzellen ist die Hauptbeschränkung das mittlere Zellvolumen der ursprünglichen Zellen, da es mit dem mittleren Zellvolumen des gewünschten Analogs zusammenhängt. Ohne den Umfang dieses Verfahrens zu beschränken, wird speziell auf rote Blutzellen von bestimmten Tieren Bezug genommen werden, wobei verstanden wird, dass rote und weiße Blutzellen von anderen Tieren im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden können.
Ein Verfahren zur Herstellung der Leukozyten-Analoge umfasst das Mischen einer roten Blutzelle mit einer hypoosmotischen Lösung, um das Volumen der Zelle auszudehnen, das Ändern des Hämoglobingehalts der Zelle, um die Lichtstreuungs- und Opazitätseigenschaften humaner Leukozytenzellen zu simulieren, und das Fixieren der Zelle, damit sie gegenüber einer Zersetzung durch beim hämatologischen Testverfahren verwendete Lyse-Reagenzien resistent ist. Die fixierte Zelle weist mindestens zwei Eigenschaften auf, die aus durch Gleichstrom gemessenem Volumen, Hochfrequenz (RF)- Größe, Opazität und Lichtstreuung ausgewählt sind, ähnlich den Eigenschaften humaner Leukozyten. Das Verfahren zur Herstellung des Analogen der eosinophilen Blutzellen ist ähnlich, aber das Ändern des Hämoglobingehalts wird dadurch erreicht, dass er in der Zelle denaturiert und nicht aus der Zelle abgezogen wird. Diese zusätzliche Ausführung ergibt ein Analoges mit dem Volumen und den Lichtstreuungsmerkmalen eines humanen Leukozyten.
Bei einer Ausführung ermöglicht das vorliegende Verfahren das Quellen von roten Blutzellen um mehr als 50% ihres ursprünglichen Volumens, was eine größere Breite bei der Auswahl von tierischen Zellen zum Herstellen der gewünschten Analoge bietet. Bei einer bevorzugten Ausführung werden die roten Blutzellen um mehr als 75% ihres ursprünglichen Volumens anschwellen gelassen.
Zum Zweck der Herstellung von Analogen, die für eine Verwendung mit den erfindungsgemäßen Suspensionsmedien geeignet sind, wurde herausgefunden, dass sich rote Blutzellen von Geflügel wie z. B. Truthahn, Huhn, Ente und vorzugsweise rote Blutzellen von Gänsen für einen Aldehydstabilisierungsprozess zum Herstellen der kleineren Lymphozyten-Analoge eignen. Es wurde auch herausgefunden, dass andere nichthumane Wirbeltiere einschließlich "Fische", insbesondere Mitglieder der Familie der Haie, und Reptilien, vorzugsweise Alligatoren, rote Blutzellen im gewünschten Größenbereich besitzen, die bei richtiger Behandlung ein Analoges ergeben, das den größeren Größen der humanen Monozyten, Neutrophilen und Eosinophilen ähnlich ist. Diese Erythrozyten zeigen im Allgemeinen eine ausgezeichnete Suspensionsstabilität und hochgradig reproduzierbare Volumsverteilungsmerkmale. Allerdings müssen Faktoren wie z. B. mengenmäßige Verfügbarkeit bei vernünftigen Kosten bedacht werden.
Darüber hinaus werden die roten Blutzellen fixiert, damit sie gegenüber einer Zersetzung durch das bei den hämatologischen Testverfahren verwendete Lyse-Reagens resistent sind, wenn die Parameter der weißen Blutzellen im Vollblut-Kontrollprodukt bestimmt werden.
Die Zellen von Vögeln, Alligatoren und Grönlandhaien sind kernhaltig, doch ist das Vorhandensein eines Kerns weder wesentlich noch nachteilig für ihre Verwendung als Ersatz für humane weiße Blutzellen angesichts des hier beschriebenen Prozesses, der eine geregelte Hämolyse der roten Blutzelle ermöglicht. Vorzugsweise werden zwischen 20 bis 80 Gew.-% und am meisten bevorzugt 30 bis 70 Gew.-% des Hämoglobins in der Zelle freigesetzt. Die Zellen werden mit einem Fixierungsmittel wie z. B. einem organischen Aldehyd, das ein Zerreißen der Zellmembran und einen weiteren Hämoglobinverlust verhindert, weiter stabilisiert.
Diese stabilisierten Leukozyten-analogen Zellen stellen einen befriedigenden Ersatz für humane Leukozytenzellen in einem Kontrollprodukt zur Verfügung.
Bei einer bevorzugteren Ausführung der vorliegenden Erfindung umfasst das Kontrollprodukt ferner eine Zusammensetzung, die durch Mischen einer Suspension fixierter roter Gänseblutzellen zum Simulieren humaner Leukozyten und fixierter roter Alligatorenblutzellen zum Simulieren humaner Monozyten, Neutrophiler und Eosinophiler hergestellt wird, wobei alles im erfindungsgemäßen Suspensionsmedium in solchen Anteilen zusammengefügt wird, dass eine einzelne Zusammensetzung zum Simulieren humaner weißer Zellen bereitgestellt ist. Dieses Kontrollprodukt wird anschließend mit lysierbaren humanen roten Blutzellen sowie stabilisierten Blutplättchen oder Plättchen-Analogen vermischt, um ein einzelnes Mehrfachanalyse-Kontrollprodukt zur Verfügung zu stellen.
Beim Sammelschritt werden die roten Blutzellen in einem Antigerinnungsmittel wie z. B. einem Alkalimetallsalz von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), gelöst in einer physiologischen Kochsalzlösung (Natriumchlorid), suspendiert. Es wird daran gedacht, dass andere Antigerinnungsmittel und Salze genügen werden, solange sie keine übermäßige, Hämolyse oder Zellenassoziation bewirken.
Rote Frischblutzellen müssen gewaschen werden, um Spender-spezifische Plasmaproteine zu beseitigen. Dies wird die Wahrscheinlichkeit einer Zellenverklebung verringern, wenn rote Zellen von mehreren Blutzellenspendern gemischt werden. Die Zellen werden zusammengesammelt, um einen homogenen Verbund zu erhalten.
Die Zellenansammlung kann mit einer Serumsubstanz als Behandlungshilfsstoff vorbehandelt werden. Die Vorbehandlung mit der Serumsubstanz ermöglicht ein Quellen der Zelle, ohne ein Zerbrechen der Zelle zu verursachen. Ein Ausgesetztwerden der Erythrozyten an eine hypoosmotische Umgebung bewirkt hauptsächlich ein Zunehmen des mittleren Teilchenvolumens und ein Abnehmen der Breiten des Lichtstreuungshistogramms. Die Größe der Blutzellen wird als Ergebnis der hypoosmotischen Umgebung erhöht, die eine Konzentration an gelösten Stoffen aufweist, die von der Konzentration an gelösten Stoffen der Zellen reduziert wird. Wenn die Konzentration an gelösten Stoffen innerhalb der Zelle höher als die Konzentration außerhalb der Zelle ist, neigt das Wasser dazu, sich in die Zelle hineinzubewegen, um die Konzentration auszugleichen. An sich bewirkt die Bewegung von Wasser ins Innere der Zelle ein Quellen. Die hypoosmotische Umgebung kann eine Lösung aus Natriumverbindungen, Kaliumverbindungen oder sowohl Natrium als auch Kalium oder anderen den Fachleuten bekannten Zusammensetzungen umfassen, um die gewünschte Konzentration an gelösten Stoffen zur Verfügung zu stellen.
Wie hier definiert, umfasst die Serumsubstanz Cholesterin, Cholesterinester und Cholesterin, das mit einer oder mehreren anderen in Serumplasma gefundenen Verbindungen kombiniert wurde, sowie Mischungen davon. Vorzugsweise umfassen solche andere Verbindungen des Weiteren Lipoproteine und Phospholipide sowie Mischungen davon. So wie von den Fachleuten verstanden, wird Cholesterin typischerweise etwa 30% Ester enthalten. So wie des Weiteren von den Fachleuten verstanden, wird das Lipoprotein das Cholesterin in einer wässerigen Lösung halten. Vorzugsweise ist die Serumsubstanz bei der Vorbehandlung aus der Gruppe ausgewählt, die Cholesterin, Cholesterinester, Lipoproteincholesterin, Lipoproteincholesterinester, Cholesterin kombiniert mit Phospholipiden und Mischungen davon umfasst. Am meisten bevorzugt umfasst die Serumsubstanz Cholesterin in Kombination mit Phospholipiden. Ein geeignetes handelsübliches Beispiel einer solchen bevorzugten Ausführung ist Pentex® Cholesterol Super-Trate von Miles Inc., das aus Hochdichte-Lipoproteincholesterin und Lipoproteincholesterinestern in Kombination mit Phospholipiden besteht. So ist die Vorbehandlung erforderlich, wenn kleinere Zellen um mehr als 30% bis 50% ihres ursprünglichen Volumens ausgedehnt werden. Es wird ferner angenommen, dass die Konzentration der verwendeten Serumsubstanz eine Funktion sowohl des Ausmaßes der Zellausdehnung, bewirkt durch die hypoosmotische Lösung, als auch der Prozessbedingungen der Fixierungsreaktion, die es dem Hämoglobin der Zelle erlaubt, aus der Zelle auszutreten, ist. Bei Prozessen, bei denen die Zelle in weniger als etwa zwei Stunden, vor allem bedingt durch die Aldehydkonzentration bei Raumtemperatur, fixiert wird, und bei denen der hypoosmotische Druck höher als etwa 150 Milliosmol ist, erscheint keine Vorbehandlung erforderlich. Wenn die Vorbehandlung eingesetzt wird, bewegt sich die Cholesterinkonzentration vorzugsweise von 0,1 bis 5,0 Milligramm bei einer Zellzählung von 1 · 10&sup6; Zellen pro Mikroliter. Wird eine zu hohe Cholesterinkonzentration eingesetzt, werden die Zellen zur Lyse neigen. Wird eine zu niedrige Cholesterinkonzentration eingesetzt, wird die Zelle beim Quellen zerbrechen.
Versuche im Stand der Technik zum Quellen von Zellen, ohne sie zum Platzen zu bringen, konzentrierten sich auf den Einsatz eines Behandlungshilfsstoffes wie z. B. Kaliumnatriumtartrat, das eine Stärkung der Zellmembran bewirkt. Allerdings erlaubt dieser Ansatz keine größere Ausdehnung als die erwarteten 30 bis 50%, und er stellt auch keine geregelte Hämoloyse für die Zelle bereit.
Wenngleich das vorliegende Verfahren mit gleichzeitigem Quellen und Fixieren der Zelle in einem einstufigen Vorgang offenbart ist, so liegt es im Rahmen der Erwägungen dieses Verfahrens, dass mehr als ein Schritt eingesetzt werden könnte, um die Zelle mit der Serumsubstanz vorzubehandeln, die Zelle anschwellen zu lassen, um eine geregelte Freisetzung von Hämoglobin zu ermöglichen, und danach die Zelle zu fixieren. Allerdings wäre zu erwarten, dass ein solches Verfahren die Probleme des Regelns der Prozessbedingungen für jeden Schritt und insbesondere der Zeitwahl für die Fixierung der Blutzelle aufweist.
Bei einer bevorzugten Ausführung des Prozesses wird die hypoosmotische Lösung durch Kombinieren einer wässerigen Lösung von Natriumphosphat mit dem Fixierungsreagens zu dem gewünschten osmotischen Druck hergestellt. Je niedriger der osmotische Druck bezogen auf die normale Tonizität des nativen Blutes ist, desto stärker wird die Zelle quellen, teilweise dadurch bedingt, dass sich das Wasser von außerhalb der Zelle in die Zelle hineinbewegt. Der osmotische Druck wird vorzugsweise im Bereich von 0 bis 150 Milliosmol liegen, je nach anfänglicher Zellgröße, Zellzählung und der gewünschten endgültigen Zellgröße, noch eher bevorzugt von 65 bis 95 Milliosmol für das Eosinophilen- Analoge, 0 bis 20 Milliosmol für das Monozyten-Analoge, 5 bis 35 Milliosmol für das Lymphozyten-Analoge und von 45 bis 65 Milliosmol für das Neutrophilen-Analoge. Die oben genannten bevorzugten Bereiche basieren auf Blutzellen, die mit einer isotonischen Kochsalzlösung gewaschen wurden, und basieren des Weiteren auf einer Zellzählung bei der Fixierungsreaktion von etwa 20 000 bis 50 000 Zellen pro Mikroliter.
Gleichzeitig scheint die Temperatur die Quellungsgeschwindigkeit der Zelle nicht von allein zu beeinflussen; sie beeinflusst jedoch die Geschwindigkeit der Fixierungsreaktion. Wenn sich die Zelle ausdehnt, tritt das Hämoglobin mit einer geregelten Geschwindigkeit aus der Zelle aus, bis die Fixierungsreaktion eine weitere Freisetzung von Hämoglobin verhindert. Das meiste Hämoglobin wird in den ersten fünf Minuten der hypoosmotischen Behandlung freigesetzt werden. So ermöglicht beim gleichzeitigen Quellen und Fixieren der Zellen ein Reduzieren der Temperatur der Fixierung in der Lösung das Regeln des Fixierungsprozesses und der Hämoglobinfreisetzungsgeschwindigkeiten, während die Zelle anschwillt. Nach Ablauf der Fixierungsreaktion ist die Zelle gegenüber einer Auflösung oder Zersetzung unter dem Einfluss der üblichen bei hämatologischen Testverfahren verwendeten Lyse-Reagenzien resistent.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführung werden die Blutzellen einer abgekühlten hypotonischen Glutaraldehyd enthaltenden Lösung zugesetzt. Die abgekühlte Fixierungslösung weist eine Temperatur von 0º bis 15ºC und eher bevorzugt von 1º bis 10ºC auf. Bei einer am meisten bevorzugten Ausführung erfolgt die Fixierungsbehandlung für die Lymphozyten- und Monozyten-Analoge bei 2º bis 8ºC und für die Neutrophilen- und Eosinophilen-Analoge bei Raumtemperatur. Es hat sich gezeigt, dass die verringerte Temperatur eine qualitativ unterschiedliche Zelle, wie auf einer nach Größe ordnenden Vorrichtung wie z. B. einem COULTER COUNTER® Model VCS-Analysator gemessen, bereitstellt. Ein qualitativer Unterschied umfasst ein größeres mittleres Zellvolumen verglichen mit Fixieren bei Raumtemperatur.
Ein Fixieren der gequollenen Zellen ist wichtig, um die Zellmembranen härter zu machen und eine Zersetzung der Membranen zu verhindern. Dies wird durch Kontaktieren der Zellen mit einer Lösung eines organischen Aldehyds, einschließlich Monoaldehyden wie z. B. Formaldehyd oder Dialdehyden wie z. B. Glutaraldehyd, erreicht. Glutaraldehyd ist das bevorzugte Aldehyd, da es rascher als Formaldehyd reagiert. Glutaraldehyd kann in höheren Konzentrationen als der Endkonzentration zugesetzt werden, sofern die Endkonzentration im Bereich von etwa 0,05% bis 0,8% und eher bevorzugt 0,1% bis 0,6% auf der Grundlage einer Zellzählung von etwa 20 000 bis 50 000 Zellen pro Mikroliter liegt. Die praktischen Beschränkungen bei der Auswahl eines geeigneten Aldehyds und dessen Konzentration sind die funktionalen Beschränkungen der Zellenanzahl, Ausschaltung übermäßiger Zellenassoziation und als Parameter beim Regeln der Fixierungsreaktion. Die Bedingungen der Fixierungsreaktion werden für die konkret verwendeten Tierzellen und das Leukozyten- Analoge, das hergestellt wird, unterschiedlich sein.
Wenngleich det Großteil der Fixierung mit Glutaraldehyd und bei Raumtemperatur innerhalb zweier Stunden erfolgt, ist mehr Zeit erforderlich, damit die roten Blutzellen vollständig resistent gegenüber den üblichen Lyse-Mitteln für rote Blutzellen sind, die bei COULTER COUNTER®-Hämatologieinstrumenten eingesetzt werden. Bei einer sorgfältigen Auswahl der roten Blutzellen wird die Zeitdauer für eine Fixierung mit Glutaraldehyd im Bereich zwischen 2 und 72 Stunden liegen, vorzugsweise zwischen 3 bis 30 Stunden, je nach Temperatur, Glutaraldehydkonzentration, Zellenanzahl und gewünschter Menge an freigesetztem Hämoglobin. Bei einer am meisten bevorzugten Ausführung liegt die Fixierungszeit bei einer Zellzählung von etwa 20 000 bis 50 000 Zellen pro Mikroliter zwischen 10 bis 24 Stunden für die Monozyten- und Lymphozyten-Analoge und 3 bis 18 Stunden für die Eosinophilen- und Neutrophilen-Analoge. Eine Unterfixierung kann eine teilweise fixierte rote Blutzelle mit einem mittleren Zellvolumen ergeben, das kleiner ist als das für die Zielpopulation humaner Leukozyten. Im Allgemeinen beruht die zeitliche Obergrenze der Fixierung auf der Herstellungszweckmäßigkeit. Nach der Fixierung werden die Zellen durch eine Zentrifugations- oder Gravitationsvorrichtung von der flüssigen Phase getrennt und anschließend mit einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung gewaschen.
Der pH der Fixierungslösung liegt im Bereich von 7,0 bis 9,0. Ist der pH der Fixierungslösung zu niedrig, kann es zu einer Verklebung kommen; ist er zu hoch, kann die Zelle zerbrechen. Zusätzlich dazu beeinflusst der pH die Freisetzung von Hämoglobin. Verläuft die Fixierungsreaktion zu rasch, wird die Zelle nicht dazu imstande sein, das Hämoglobin abzuscheiden. So ist der pH-Bereich etwa 7,0 bis 9,0 und vorzugsweise 7,5 bis 8,5. Bei einer am meisten bevorzugten Ausführung beträgt der pH der Fixierungslösung 8,0 ± 0,2 für die Neutrophilen- und Eosinophilen-Analoge und 7, 8 ± 0,1 für die Monozyten- und Lymphozyten-Analoge.
Das Eosinophilen-Analoge wird in einem ähnlichen Prozess hergestellt, mit der Ausnahme, dass die hypotonische Glutaraldehydlösung vorzugweise Raumtemperatur aufweist und die hypotonische Glutaraldehydlösung primär dazu verwendet wird, das Hämoglobin in den Blutzellen leicht querzuvernetzen als dazu, die Zelle vollständig zu fixieren. An sich beträgt die Glutaraldehydkonzentration für eine Zellzählung von etwa 20 000 bis 50 000 Zellen pro Mikroliter zwischen etwa 0,1 und 0,4% und vorzugsweise von 0,2 bis 0,3%. Nach dem leichten Quervernetzen des Hämoglobins und dem Waschen mit einer Phophat-gepufferten Kochsalzlösung werden die Zellen mit einem Protein-denaturierenden Reagens wie z. B. einer quarternären Ammoniumverbindung oder einem anderen den Fachleuten bekannten denaturierenden Agens weiterbehandelt, um das Hämoglobin in der Zelle auszufällen. Der pH der denaturierenden Lösung sollte zwischen 9,0 und 12,0 und vorzugsweise zwischen 10,0 und 11,0 liegen. Diese Behandlung verringert das Zellvolumen nicht. Die Behandlung mit dem Protein-denaturierenden Reagens verstärkt die Lichtstreuungsmerkmale der gequollenen Zelle, um der gequollenen Zelle die erforderlichen Lichtstreuungsmerkmale - ähnlich dem humanen Eosinophilen - zu verleihen. Sowohl die Denaturierung des Hämoglobins als auch die geregelte Freisetzung des Hämoglobins bewirken eine Änderung der Hämoglobinzusammensetzung in der Zelle. Allerdings sind die Lichtstreuungseigenschaften zwischen der geregelten Freisetzung des Hämoglobins in deh Monozyten- und Lymphozyten-Analogen und der Denaturierung von Hämoglobin im Eosinophilen-Analogen klar unterschiedlich. Im Allgemeinen wird das Austreten von Hämoglobin aus der Zelle die Lichtstreuung und Opazität der Zelle reduzieren. Ein Denaturieren des Hämoglobins in der Zelle wird die Lichtstreuung der Zelle erhöhen.
Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung des Eosinophilen-Analogen umfasst ein Vorbehandeln der Ansammlung der roten Zellen mit einer wässerigen Serumsubstanz, Quellen der Zelle, Denaturieren des Hämoglobins in der Zelle und Fixieren der Zelle. Wie von einem Fachmann verstanden wird, liegt es im Rahmen der Erwägungen dieses Verfahrens, dass eine rote Blutzelle mit angemessener Größe gewählt werden könnte, die nicht das Maß an Quellen erforderte, das die Vorbehandlung mit der Serumsubstanz notwendig machen würde. In einem solchen Fall würde der Prozess das Denaturieren des Hämoglobins in der Zelle, um die Lichtstreuungseigenschaften einer humanen Leukozytenzelle zu simulieren, und das Fixieren der Zelle, damit sie gegenüber einer Zersetzung durch bei hämatologischen Testverfahren verwendete Lyse-Reagenzien resistent ist, umfassen. An sich würde die behandelte rote Zelle ähnliche Lichtstreuungs- und Volumseigenschaften wie humane Leukozyten aufweisen. Allerdings wäre, wenn die Zelle nicht bis zu einem gewissen Ausmaß anschwellen gelassen wird, zu erwarten, dass die Standardabweichung der Lichtstreuung nicht innerhalb der Grenze der Zielzellpopulation liegen würde, da die rote Blutzelle nicht von Natur aus kugelförmig ist. Durch die Zugabe eines rundmachenden Mittels kann sich dieses Problem erübrigen.
Durch Einsatz einer Kombination der weiter oben offenbarten Verfahrensschritte des Quellens der Zelle, Abziehens von Hämoglobin aus der Zelle, Denaturierens des Hämoglobins in der Zelle sowie Schrumpfens der Zelle durch den Fachleuten bekannte Verfahren stehen einem effektiv Verfahren zur Verfügung, ein Analoges zu entwerfen, das eine Mehrzahl von unterschiedlichen physikalischen Parametern aus Gleichstromvolumen, RF-Größe, Opazität und Lichtstreuung aufweist. Insbesondere können das Schrumpfen und das Quellen der Zelle sämtliche weiter oben aufgeführte Parameter beeinflussen, während das Ändern des Hämoglobins in der Zelle die Opazitäts- und Lichtstreuungsmerkmale beeinflussen kann.
Wegen der breiten Verwendbarkeit des erfindungsgemäßen Suspensionsmediums wird es auch mit Leukozyten-Analogen verwendet, die durch andere im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Ein solches anderes Verfahren umfasst die Fixierung humaner weißer Blutzellen, um fünf Leukozyten-Subpopulationen wie hier in Beispiel 5 beschrieben zu simulieren.
Das Referenzblutzellen-Kontrollprodukt kann eines oder mehrere der Leukozyten- Analoge umfassen, die durch jedes beliebige den Fachleuten bekannte Verfahren oder jedes beliebige der weiter oben beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Das Leukozyten- Analoge kann in jedem geeigneten Medium gelagert werden, wie z. B. in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung und den in den US-Patenten Nr. 4,213,876; 4,229,726; 4,358,394 und 3,873,467 vollständig beschriebenen.
Das folgende konkrete Beispiel ist im US-Patent Nr. 4,299,726 geoffenbart:

Stabilisierungsmedium zum Verleihen langfristiger Stabilität an rote Blutzellen - Bevorzugte Formulierung

Ungefähre Mengen Literformulierung

1. Destilliertes Wasser 500 ml
2. Propylparaben 0,3 bis 1,0 g
3. Methylparaben 0,5 bis 1,0 g
4. Procainhydrochlorid 0,1 bis 0,5 g
5. Desoxycholsäure 0,1 bis 0,9 g
6. Laktose 10,0 bis 50,0 g
7. Actidion 0,1 bis 0,6 g
8. Trinatriumcitratdihydrat 3,0 bis 8,0 g
9. Zitronensäuremonohydrat 0,3 bis 0,9 g
10. Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat 0,8 bis 2,5 g
11. Phenerganhydrochlorid 0,1 bis 1,0 g
12. Colistimethat, Natrium 0,2 bis 0,9 g
13. Penicillin G., Natrium 0,5 · 10&sup6; bis 3 · 10&sup6; Einheiten
14. Kanamycinsulfat 0,2 bis 0,8 g
15. Neomycinsulfat 0,2 bis 1,0 g
16. 5'-AMP 0,4 bis 1,0 g
17. Adenin 0,2 bis 0,8 g
18. Inosin 0,4 bis 1,0 g
19. Dihydrostreptomycinsulfat 0,2 bis 1,0 g
20. Tetracyclinhydrochlorid 0,2 bis 1,0 g
21. 30%-Rinderalbumin 100 bis 350 ml
22. q.s. zu 1 Liter mit destilliertem Wasser
Da viele der oben aufgeführten Chemikalien im Handel unter mehreren Namen bekannt sind, ist der angegebene Name ein im Merck Index, Elfte Ausgabe (1989), veröffentlicht von Merck und Co. Inc., Rahway, N. J., aufgeführter geläufiger Name.
Wenn das Kontrollprodukt hergestellt wird, wird die überstehende Flüssigkeit von den Leukozyten-Analogen entfernt, und diese werden anschließend im erfindungsgemäßen Suspensionsmedium resuspendiert. Das erfindungsgemäße Suspensionsmedium umfasst eine wässerige Lösung einer Plasmasubstanz. Wie hier definiert, umfasst eine wässerige Lösung einer Plasmasubstanz eine wässerige Lösung einer Serumsubstanz (wie zuvor definiert), Serumsubstanz in Kombination mit einem Plasmaprotein und Mischungen davon. Wie hier des Weiteren definiert, umfasst Plasmaprotein eines oder mehrere der in Plasma enthaltenen Proteine. Vorzugsweise umfassen solche Plasmaproteine Albumin, Lipoproteine, Globuline, Fibrinogene und Mischungen davon. Eher bevorzugt wird die Plasmasubstanz aus der Gruppe ausgewählt, die Cholesterin, Cholesterinester, Lipoproteincholesterin, Lipoproteincholesterinester, Cholesterin kombiniert mit Phospholipiden, Cholesterin kombiniert mit Albumin, Cholesterinester kombiniert mit Albumin, Lipoproteincholesterin kombiniert mit Phospholipiden, Lipoproteincholesterin kombiniert mit Albumin und Mischungen davon umfasst.
Um die Nützlichkeit der Plasmasubstanz für eine Lyse roter Blutzellen in einem Lysesystem auf der Basis von Saponin zu bestätigen, wurde eine wässerige Plasmasubstanz gewaschenen roten Blutzellen zugesetzt. Die wässerige Lösung umfasste 3% Plasmasubstanz in einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung. Die Ergebnisse lauten wie folgt:
Aus den oben angeführten Testergebnissen wurde bestimmt, dass die Zugabe einer Plasmasubstanz zu gewaschenen roten Blutzellen eine Lyse in einem Saponin-Lysesystem ermöglicht. Es wird angenommen, dass das Albumin mit der roten Blutzelle und dem Saponin interagiert, um die lysierende Wirkung zu bewirken. Allerdings bewirkt das Albumin nicht die Lyse, wenn die gewaschenen roten Blutzellen und das Rinderserumalbumin mit anderen Bestandteilen wie z. B. den im US-Patent Nr. 4,299,726 offenbarten weiterkombiniert werden. Allerdings erfolgt eine Lyse, wenn ein Lipoproteincholesterin zugesetzt wird. Darüber hinaus erfolgt eine Lyse, wenn ein Lipoproteincholesterin dem PBS zugesetzt wird.
Wenn die Leukozyten-Analoge, die aus roten Blutzellen wie weiter oben beschrieben hergestellt werden, verwendet werden, wird die wässerige Lösung einer Plasmasubstanz vorzugsweise zumindest 12 Stunden vor einer Verwendung in einem Instrument der hämatologischen Zusammensetzung zugesetzt. Wenn ein oder mehrere Leukozyten-Analoge mit lysierbaren humanen roten Blutzellen kombiniert werden, um ein einzelnes Mehrfachanalyse-Referenzblutzellen-Kontrollprodukt für Instrumente, die Lyse-Reagenzien einsetzen, bereitzustellen, wird es am meisten bevorzugt, dass die wässerige Lösung der Plasmasubstanz gebundenes Cholesterin umfasst. Ein geeignetes Beispiel für die am meisten bevorzugte Plasmasubstanz ist Moducyte®, so wie im US-Patent Nr. 4,290,774 übertragen an Miles Inc. beschrieben, das ein mit Eiweiß gebundenes Hochdichte-Lipoproteincholesterin ist. Die Endkonzentration von Cholesterin im Suspensionsmedium liegt im Bereich von 400 bis 1200 und vorzugsweise 600 bis 1000 Milligramm pro Liter, je nach der Zellzählung im Endkontrollprodukt.
Wird bei einem Kontrollprodukt, das die Leukozyten-Analoge verwendet, die mittels der hier offenbarten Verfahren hergestellt werden, eine ungenügende Cholesterinkonzentration im erfindungsgemäßen Medium verwendet, so wird bei den roten Blutzellen im Referenzblutzellen-Kontrollprodukt keine effiziente Lyse erfolgen, um die Zellmembran aufzulösen, so dass eine Absenz von Geräuschen und Zelltrümmern gegeben ist, wenn ein Saponin-Lysereagenzsystem verwendet wird, und die Leukozyten-Analoge werden bedingt durch die Lyse-Reaktion ein mittleres Zellvolumen unter der erforderlichen Größe haben. Enthält das Medium eine zu hohe Cholesterinkonzentration, so wird bei den roten Blutzellen in der Referenzblutzellen-Kontrolle keine effiziente Lyse erfolgen, um die Zellmembran aufzulösen, so dass eine Absenz von Geräuschen und Trümmern gegeben ist.
Insbesondere wenn das Kontrollprodukt bei Instrumenten wie z. B. denen, die die Coulter Model VCS-Technologie einsetzen, bei der ein Reagenzsystem wie z. B. das im US- Patent Nr. 4,751,179 beschriebene verwendet wird, eingesetzt wird, um mindestens zwei Leukozyten-Populationen, (1) lymphoide (Lymphozyten) und (2) myeloische (Neutrophile, Monozyten, Eosinophile und Basophile), zu unterscheiden, ermöglicht das erfindungsgemäße Suspensionsmedium ein Erfolgen der Reaktion zwischen dem schwächeren Lyse-Reagens und den unfixierten roten Blutzellen, so dass bei den roten Blutzellen eine Lyse erfolgt, während die Leukozyten-Analoge im Wesentlichen unbeeinflusst bleiben, was das Zählen jeder Art von Leukozyten-Analogen ermöglicht. Wie im US-Patent Nr. 4,751,179 gelehrt, hat das Lyse-Reagens zwei Formen: (1) ein lysierendes Verdünnungsmittel mit Saponin, das gleichzeitig ein Verdünnen der Vollblutprobe und ein Stromatolysieren ihrer roten Blutzellen bewirkt, oder (2) ein zweiteiliges System, das ein nicht-lysierendes Blutverdünnungsmittel gefolgt von einem Lyse-Reagens mit Saponin umfasst.
Wenn Medien des Standes der Technik wie z. B. die in den US-Patenten Nr. 4,213,876; 4,299,726 oder 4,358,395 beschriebenen verwendet werden, ist das Volumen der Leukozyten-Analoge, die mittels der hier offenbarten Verfahren hergestellt werden, geringer als für die Zielleukozytenpopulation gewünscht. Insbesondere wenn das erfindungsgemäße Suspensionsmedium mit Leukozyten-Analogen verwendet wird, die entweder aus roten oder aus weißen Blutzellen hergestellt wurden, liegt das Gleichstromvolumen des Analogen innerhalb des für die Zielleukozytenpopulation gewünschten Bereichs.
Bei einer eher bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Suspensionsmediums würde das Suspensionsmedium des Weiteren die Zugabe eines nichtionischen grenzflächenaktiven Mittels umfassen. Das grenzflächenaktive Mittel wird ein hohes Hydrophil-Lipophil-Gleichgewicht (HLB) aufweisen. Das HLB weist typischerweise einen höheren Wert als 15 und eher bevorzugt einen höheren Wert als 17 auf Typischerweise ist das grenzflächenaktive Mittel in einer Menge vorhanden, die effektiv ist, um die lysierende Wirkung spezifischer für rote Blutzellen zu machen, ohne die Leukozyten- Analoge nachteilig zu beeinflussen. Zusätzlich dazu wird das grenzflächenaktive Mittel jegliches freie Cholesterin im Kontrollprodukt stabilisieren, so dass es sich nicht in Lösung abscheidet. Wie von den Fachleuten verstanden wird, kann die effektive Menge an grenzflächenaktivem Mittel empirisch festgestellt werden, aber sie ist typischerweise geringer als 0,5 Gew.-% des Kontrollprodukts.
Geeignete nichtionische grenzflächenaktive Mittel umfassen Alkylpolyetheralkohole mit der allgemeinen Formel: R-X-(y)n H, wobei R eine lipophile Kette C&sub8;-C&sub1;&sub8; Kohlenstoffatome ist, X -O-,
-COO- ist, und Y CH&sub2;CH&sub2;O- oder CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;O ist; n eine ganze Zahl von 15-50 ist. Geeignete kommerzielle Beispiele für diese grenzflächenaktiven Mittel umfassen Diazopan® SS-837 von GAF Chemical Corp., Triton® X405 von Rohm and Haas und Pluronic F®-127 PRILL von BASF Wyandotte Corp.
Während nicht gewünscht wird, durch irgendeine Theorie der Erfindung gebunden zu sein, wird gegenwärtig angenommen, dass eine Wechselwirkung zwischen den roten Blutzellen, dem schwachen Lyse-Agens (z. B. Saponin) und der Plasmasubstanz im erfindungsgemäßen Suspensionsmedium gegeben ist, die eine Lyse der roten Blutzellen bewirkt. Insbesondere wird gegenwärtig angenommen, dass die Plasmasubstanz das Zellmembrancholesterin beeinflussen kann, das des Weiteren das Ansprechen des Leukozyten-Analogen auf das Lyse-Reagens beeinflusst. Darüber hinaus wird ferner angenommen, dass das grenzflächenaktive Mittel die Lyse-Reaktion für rote Blutzellen spezifischer macht und doch die Leukozyten-Analoge bezüglich gemessener Parameter nicht nachteilig beeinflusst. Zusätzlich dazu wird ferner angenommen, dass das grenzflächenaktive Mittel auch das in der Zellmembran oder in der Plasmasubstanz gefundene Cholesterin beeinflussen kann.
Das erfindungsgemäße Suspensionsmedium für das hämatologische Bezugskontrollprodukt mit einer Stabilität von bis zu sechs Monaten umfasst eine wässerige Lösung der Plasmasubstanz und wahlweise kompatible fungizide und bakterizide Mittel sowie wahlweise zusätzliche Mittel wie z. B. Purinnucleoside, Gallensalze und Cholsäurederivate, Phenothiazin-Verbindungen und deren Salze mit Antihistamin- Eigenschaften und 4-Aminobenzoesäureester und -derivate und deren Salze mit anästhetischen Eigenschaften, außerdem rundmachende Mittel für die roten Blutzellen, oder Kombinationen davon. Da ein oder mehrere Leukozyten-Analoge zu einem einzelnen Referenzblutzellen-Kontrollprodukt zur Verwendung mit dem bekannten Lyse-Agens für die roten Blutzellen kombiniert werden können, ist die Formulierung für das erfindungsgemäße Suspensionsmedium für sämtliche Leukozyten-Analoge gleich.
Wie von einem Fachmann verstanden wird, sollte das Suspensionsmedium eine ausreichende Tonizität aufweisen, um eine Zelllyse zu vermeiden. Die bevorzugte Formulierung für das Suspensionsmedium lautet:

Suspensionsmedium

Ungefähre Mengen Literformulierung

1. Destilliertes Wasser 500 ml
*2. Propylparaben 0,3 bis 1,0 g
*3. Methylparaben 0,5 bis 1,0 g
*4. Procainhydrochlorid 0,1 bis 0,5 g
*5. Desoxycholsäure 0,1 bis 0,9 g
*6. Laktose 10,0 bis 50,0 g
*7. Actidion 0,1 bis 0,6 g
*8. Trinatriumcitratdihydrat 3,0 bis 8,0 g
*9. Zitronensäuremonohydrat 0,3 bis 0,9 g
*10. Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat 0,8 bis 2,5 g
*11. Phenerganhydrochlorid 0,1 bis 1,0 g
*12. Colistimethat, Natrium 0,2 bis -0,9 g
*13. Penicillin G., Natrium 0,5 · 10&sup6; bis 3 · 10&sup6; Einheiten
*14. Kanamycinsulfat 0,2 bis 0,8 g
*15. Neomycinsulfat 0,2 bis 1,0 g
*16. 5'-AMP 0,4 bis 1,0 g
*17. Adenin 0,2 bis 0,8 g
*18. Inosin 0,4 bis 1,0 g
*19. Dihydrostreptomycinsulfat 0,2 bis 1,0 g
*20. Tetracyclinhydrochlorid 0,2 bis 1,0 g
*21. 30%-Rinderalbumin 100 bis 350 ml
22. Lipoproteincholesterin 400 bis 1200 mg
23. q. s. zu 1 Liter mit destilliertem Wasser
*Wahlweiser Bestandteil, bevorzugt zum Verleihen langfristiger Stabilität für rote Blutzellen und Analoge.
Das Verfahren zur Herstellung von Leukozyten-Analogen zur Verwendung mit dem erfindungsgemäßen Suspensionsmedium nach der am meisten bevorzugten Ausführung dieser Erfindung wird nachstehend in den Beispielen angegeben. Beispiel 1 ist ein konkretes Beispiel für bevorzugte Reagenzien und Techniken zum Behandeln von Gänsezellen, wobei verstanden wird, dass die Formulierungen nur zur Veranschaulichung dienen. Die Beispiele 2, 3 und 4 sind konkrete Beispiele für bevorzugte Reagenzien und Techniken zum Behandeln der Alligatorenzellen, wobei verstanden wird, dass die Formulierungen nur zur Veranschaulichung dienen. Beispiel 5 zeigt ein Beispiel für eine Verwendung humaner weißer Blutzellen zur Herstellung von fünf Subpopulationen von Leukozyten-Analogen, die mit dem erfindungsgemäßen Medium verwendet werden, wobei verstanden wird, dass die Formulierungen für das Leukozyten-Analoge nur zur Veranschaulichung dienen. Beispiel 6 zeigt eine Zusammenstellung der vier Leukozyten-Populationen, wobei verstanden wird, dass die Formulierung nur zur Veranschaulichung dient. Die beschriebenen Reagenzien und/oder Techniken können auch auf Blutzellen anderer Tiere als Gänse und Alligatoren anwendbar sein. Andere Bestandteile und Anteile können in Übereinstimmung mit dieser Offenbarung verwendet werden.

BEISPIEL 1

Lymphozyten-Analoges aus roten Gänseblutzellen

Folgendes ist ein konkretes Beispiel für bevorzugte Reagenzien und empfohlene konkrete Verfahrensschritte zum Behandeln roter Gänseblutzellen, um ein Lymphozyten- Analoges in Normalgröße zu erhalten. Es wird verstanden werden, dass die Formulierungen und die Verfahren nur zur Veranschaulichung dienen und dass andere Bestandteile, Anteile und Verfahren in Übereinstimmung mit den Offenbarungen in dieser Erfindung verwendet werden können.

Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)

Literformulierung

1. Monobasisches Natriumphosphat: 0,2 g
2. Dibasisches Natriumphosphat · 7H&sub2;O: 2,0 g
3. Natriumazid: 0,1 g
4. Natriumchlorid: 9,4 g
5. q. s. zu einem Liter mit destilliertem Wasser: pH etwa 7,4, Osmolalität 315 bis 345 mOsm/kg.

Lymphozyten-hypotonische Lösung

1. Monobasisches Natriumphosphat: 0,2 g
2. Dibasisches Natriumphosphat · 7H&sub2;O: 2,0 g
3. q. s. zu einem Liter mit destilliertem Wasser: pH etwa 7,8, Osmolalität 15 bis 25 mOsm/kg.

Verfahren

1. Es sind rote Vogelblutzellen mit einem mittleren Zellvolumen im Bereich von etwa 140 bis 170 fl auszuwählen. Die gepackten roten Vogelblutzellen sind mit der Phosphat- gepufferten Kochsalzlösung (PBS) zu waschen.
2. 1,0 bis 5,0 Milligramm Cholesterin sind zu einer Zellzählung von 2 · 10&sup6; pro Mikroliter hinzuzufügen, und es ist 2 bis 6 Stunden bei Raumtemperatur zu inkubieren.
3. Ein Glutaraldehyd-Fixierungsreagens mit einem Glutaraldehydgehalt von etwa 0,1 bis 0,8% ist durch Hinzufügen eines kommerziellen 25%-Glutaraldehydprodukts zur abgekühlten Lymphozyten-hypotonischen Lösung herzustellen. Vorzugsweise bewegt sich die Temperatur von 2º bis 8ºC. Die bevorzugte Glutaraldehydkonzentration beträgt etwa 0,35%.
4. Die gewaschenen roten Blutzellen sind einer abgemessenen Menge des Fixierungsmittels nach Schritt 3 in einer 1 : 35-Verdünnung zuzusetzen. Es hat ein Übertragen in verschlossene Behälter zu erfolgen, die 18 bis 24 Stunden bei 2º bis 8ºC langsam gerollt werden. Die Abnahme des Hämoglobingehalts wird auf etwa 60 Gew.-% berechnet.
5. Die überstehende Flüssigkeit ist zu entfernen, die Zellen sind mehrere Male mit der PBS zu waschen, und anschließend hat ein Resuspendieren in einer geeigneten Speicherlösung zu erfolgen.
6. Für ein freistehendes Lymphozyten-Analoges sind die gewaschenen fixierten Zellen im erfindungsgemäßen Suspensionsmedium zu resuspendieren. Die Konzentration ist anzupassen, um jene humaner Lymphozytenzellen in normalem menschlichem Blut zu simulieren.
7. Für mehrere hämatologische Parameter für ein Kontrollprodukt sind die gewaschenen fixierten Zellen im erfindungsgemäßen Suspensionsmedium mit anderen für das Mehrparameter-Hämatologiekontrollprodukt gewünschten hämatologischen Zusammensetzungen und Analogen zuzusetzen, wobei die Zellzählung zum Messen von Lymphozyten-Anteilen geeignet ist.
8. Mit geeigneten Stabilisatoren können die fixierten Zellen für einen Zeitraum über sechs Monate gelagert werden.
In Übereinstimmung mit obigem Beispiel, jedoch ausgehend von anderen Arten roter Säugetierblutzellen, werden vergleichbare Ergebnisse erzielt.

BEISPIEL 2

Monozytenzellen-Analoges aus roten Alligatorblutzellen

Folgendes ist ein konkretes Beispiel für bevorzugte Reagenzien und empfohlene konkrete Verfahrensschritte zum Behandeln roter Alligatorblutzellen, um das Monozytenzellen-Analoge zu erhalten. Es wird verstanden werden, dass die Formulierungen und die Verfahren nur zur Veranschaulichung dienen und dass andere Bestandteile, Anteile und Verfahren in Übereinstimmung mit den Offenbarungen in dieser Erfindung verwendet werden können.

Monozyten-hypotonische Lösung

1. Monobasisches Natriumphosphat: 0,1 g
2. Dibasisches Natriumphosphat 1,0 g
3. q. s. zu einem Liter mit destilliertem Wasser; pH etwa 7,8, Osmolalität 5 bis 15 mOsm/kg.
Waschlösung für Zellen (PBS) wie in Beispiel 1 dargelegt.

Verfahren

1. Es sind rote Alligatorblutzellen mit einem mittleren Zellvolumen im Bereich von etwa 350 bis 450 fl auszuwählen. Die gepackten roten Alligatorblutzellen sind mit PBS zu waschen.
2. 1,0 bis 5,0 Milligramm Cholesterin sind zu einer Zellzählung von 1 · 10&sup6; pro Mikroliter hinzuzufügen, und es ist 3 bis 5 Stunden bei Raumtemperatur zu inkubieren.
3. Ein Glutaraldehyd-Fixierungsreagens mit einem Glutaraldehydgehalt von etwa 0,1 bis 0,8% ist durch Hinzufügen eines kommerziellen 25%-Glutaraldehydprodukts zur abgekühlten Monozyten-hypotonischen Lösung herzustellen. Vorzugsweise bewegt sich die Temperatur von 2º bis 8ºC. Die bevorzugte Glutaraldehydkonzentration beträgt etwa 0,15%.
4. Die gewaschenen roten Blutzellen sind einer abgemessenen Menge des Fixierungsmittels nach Schritt 3 in einer 1 : 50-Verdünnung zuzusetzen. Es hat ein Übertragen in verschlossene Behälter zu erfolgen, die 18 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur langsam gerollt werden. Die Abnahme des Hämoglobingehalts wird auf etwa 40 Gew.-% berechnet.
5. Die überstehende Flüssigkeit ist zu entfernen, die Zellen sind mehrere Male mit der PBS zu waschen, und anschließend hat ein Resuspendieren in einer geeigneten Speicherlösung zu erfolgen.
6. Für ein freistehendes Monozyten-Analoges sind die gewaschenen fixierten Zellen im erfindungsgemäßen Suspensionsmedium zu resuspendieren. Die Konzentration ist anzupassen, um jene humaner Monozytenzellen in normalem menschlichem Blut zu simulieren.
7. Für ein Mehrfach-Hämatologiekontrollprodukt sind die gewaschenen fixierten Zellen i'm erfindungsgemäßen Suspensionsmedium mit anderen für das Mehrparameter- Kontrollprodukt gewünschten hämatologischen Zusammensetzungen und Analogen in der geeigneten Konzentration zuzusetzen, um Monozytenzellen zu messen.
8. Mit geeigneten Stabilisatoren können die fixierten Zellen für einen Zeitraum über sechs Monate gelagert werden.

BEISPIEL 3

Eosinophilen-Analoges aus roten Alligatorblutzellen

Folgendes ist ein konkretes Beispiel für bevorzugte Reagenzien und empfohlene konkrete Verfahrensschritte zum Behandeln roter Alligatorblutzellen, um das Eosinophilen- Analoge zu erhalten. Es wird verstanden werden, dass die Formulierungen und die Verfahren nur zur Veranschaulichung dienen und dass andere Bestandteile, Anteile und Verfahren in Übereinstimmung mit den Offenbarungen in dieser Erfindung verwendet werden können.

Eosinophilen-hypotonische Lösung

1. Monobasisches Natriumphosphat: 0,32 Gramm
2. Dibasisches Natriumphosphat 8,08 Gramm
3. q. s. zu einem Liter mit destilliertem Wasser; pH etwa 8,0, Osmolalität 75 bis 85 mOsm/kg.

Lösung zur denaturierenden Behandlung von Eosinophilen-Hämoglobin

1. Dimethyldicocoammoniumchlorid 2,5 Gramm
2. Tris(hydroxymethyl)aminomethan 6,06 Gramm (organischer Puffer)
3. q. s. zu einem Liter mit destilliertem Wasser: pH etwa 10,5.

Waschlösung zur Eosinophilen-Nachbehandlung

1. Polyoxethyliertes Alkylphenol 5 Gramm (Diazopan® SS-837 von GAF Chemical Corp.)
2. q. s. zu einem Liter mit destilliertem Wasser
Waschlösung für Zellen (PBS) wie in Beispiel 1 dargelegt.

Verfahren

1. Es sind rote Alligatorblutzellen mit einem mittleren Zellvolumen im Bereich von etwa 400 bis 500 fl auszuwählen. Die gepackten roten Alligatorblutzellen sind mit PBS zu waschen.
2. 0,25 bis 1, 25 Milligramm Cholesterin sind zu einer Zellzählung von 1 · 10&sup6; pro Mikroliter hinzuzufügen, und es ist 2 bis 5 Stunden bei Raumtemperatur zu inkubieren.
3. Ein Glutaraldehyd-Vernetzungsreagens mit einem Glutaraldehydgehalt von etwa 0,1 bis 0,8% ist durch Zusetzen eines kommerziellen 25%-Glutaraldehydprodukts zur Eosinophilen- hypotonischen Lösung herzustellen. Die bevorzugte Glutaraldehydkonzentration beträgt etwa 0,2%.
4. Die gewaschenen roten Blutzellen sind einer abgemessenen Menge des Vernetzungsreagens nach Schritt 3 in einer 1 : 50-Verdünnung zuzusetzen. Es hat ein Übertragen in verschlossene Behälter zu erfolgen, die 18 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur langsam gerollt werden.
5. Die überstehende Flüssigkeit ist zu entfernen, und die Zellen sind mehrere Male mit der PBS zu waschen.
6. Die gewaschenen roten Blutzellen sind der Lösung zur denaturierenden Behandlung von Eosinophilen-Hämoglobin in einer 1 : 10-Verdünnung zuzusetzen. Es hat ein Übertragen in verschlossene Behälter zu erfolgen, die 2-4 Stunden bei Raumtemperatur langsam gerollt werden.
7. Die überstehende Flüssigkeit ist zu entfernen, und die Zellen sind mehrere Male mit der Waschlösung zur Eosinophilen-Nachbehandlung zu waschen, um die Lösung zur denaturierenden Behandlung von Eosinophilen-Hämoglobin zu entfernen. Anschließend hat ein Resuspendieren in einer geeigneten Speicherlösung zu erfolgen.
8. Für ein freistehendes Eosinophilen-Analoges sind die gewaschenen fixierten Zellen im erfindungsgemäßen Suspensionsmedium zu resuspendieren. Die Konzentration ist anzupassen, um jene humaner Eosinophilenzellen in normalem menschlichem Blut zu simulieren.
9. Für Mehrfach-Hämatologiekontrollprodukte sind die gewaschenen fixierten Zellen im erfindungsgemäßen Suspensionsmedium mit anderen für das Mehrparameter- Kontrollprodukt gewünschten hämatologischen Zusammensetzungen und Analogen in der geeigneten Konzentration zuzusetzen, um Eosinophilenzellen zu messen.
10. Mit geeigneten Stabilisatoren können die fixierten Zellen für einen Zeitraum über sechs Monate gelagert werden.

BEISPIEL 4

Neutrophilenzellen-Analoges aus roten Alligatorblutzellen

Neutrophilen-hypotonische Lösung

1. Monobasisches Natriumphosphat: 0,23 g
2. Dibasisches Natriumphosphat 5,32 g
3. q. s. zu einem Liter mit destilliertem Wasser; pH etwa 8,0, Osmolalität 45 bis 65 mOsm/kg.
Waschlösung für Zellen (PBS), wie in Beispiel 1 dargelegt.

Verfahren

1. Es sind rote Alligatorblutzellen mit einem mittleren Zellvolumen im Bereich von etwa 400 bis 500 fl auszuwählen. Die gepackten roten Alligatorblutzellen sind mit PBS zu waschen.
2. Ein Glutaraldehyd-Fixierungsreagens mit einem Glutaraldehydgehalt von etwa 0,1 bis 0,8% ist durch Hinzufügen eines kommerziellen 25%-Glutaraldehydprodukts zur Neutrophilen-hypotonischen Lösung herzustellen. Die bevorzugte Glutaraldehydkonzentration beträgt etwa 0,4%.
3. Die gewaschenen roten Blutzellen sind bei einer Zählung von 1 · 10&sup6; einer abgemessenen Menge des Fixierungsmittels nach Schritt 3 in einer 1 : 50-Verdünnung zuzusetzen. Es hat ein Übertragen in verschlossene Behälter zu erfolgen, die 18 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur langsam gerollt werden.
4. Die überstehende Flüssigkeit ist zu entfernen, die Zellen sind mehrere Male mit der PBS zu waschen, und anschließend hat ein Resuspendieren in einer geeigneten Speicherlösung zu erfolgen.
5. Gepackte Zellen sind einer Lösung eines nichtionischen grenzflächenaktiven Mittels zuzusetzen. Diese Lösung neigt dazu, das Volumen von Spenderzellen zu standardisieren. Die Lösung umfasst 0,5 Gramm Octylphenoxypolyethoxyethanol mit einem HLB von etwa 13,5 (Triton® X-100 von Rohm and Haas Co.) in 1 Liter destilliertem Wasser.
6. Die überstehende Flüssigkeit ist zu entfernen, die Zellen sind mehrere Male mit der PBS zu waschen, und anschließend hat ein Resuspendieren in einer geeigneten Speicherlösung zu erfolgen.
7. Für ein freistehendes Neutrophilen-Analoges sind die gewaschenen fixierten Zellen im erfindungsgemäßen Suspensionsmedium zu resuspendieren. Die Konzentration ist anzupassen, um jene humaner Neutrophilenzellen in normalem menschlichem Blut zu simulieren.
8. Für ein Mehrfach-Hämatologiekontrollprodukt sind die gewaschenen fixierten Zellen im erfindungsgemäßen Suspensionsmedium mit anderen für das Mehrparameter- Kontrollprodukt gewünschten hämatologischen Zusammensetzungen und Analogen in der geeigneten Konzentration zuzusetzen, um Neutrophilenzellen zu messen.
9. Mit geeigneten Stabilisatoren können die fixierten Zellen für einen Zeitraum über sechs Monate gelagert werden.

BEISPIEL 5

Fünf Subpopulationen von Leukozyten-Analogen aus humanen weißen Blutzellen

1. Vollblut ist einer Dextran (Molekulargewicht 100000 bis 500000)-Lösung in einer 1 : 10- Verdünnung zuzusetzen, und es ist ein Absetzen mittels Gravitationsvorrichtungen für 1 bis 3 Stunden zu erlauben.
2. Der Überstand, der die weißen Blutzellen, Blutplättchen und einen Rest an roten Blutzellen umfasst, ist zu entfernen.
3. Das Produkt nach Schritt 2 ist etwa 10 Minuten bei weniger als 300 RCF zu zentrifugieren. Die Plättchen, die aus dem Knopf weißer Blutzellen austreten, restliche rote Blutzellen und eine kleine Menge Plasma zum Resuspendieren der Zellen sind abzusaugen.
4. Ein geeignetes Lyse-Agens wie z. B. Wasser ist zuzusetzen, um die roten Blutzellen von den weißen Blutzellen zu lysieren.
5. Das Produkt nach Schritt 4 ist zu zentrifugieren, und der Überstand ist zu entfernen, wobei gepackte weiße Blutzellen übrig bleiben. Die gepackten weißen Blutzellen sind in einem etwa gleichen Volumen einer Kochsalzlösung zu resuspendieren.
6. Weiße Blutzellen sind einer geeigneten isoosmotischen Fixierungslösung wie z. B. 5% Formaldehyd und 95% PBS (Volumsprozent) in einer 1 : 10-Verdünnung zuzusetzen. Es hat ein Übertragen in verschlossene Behälter zu erfolgen, die 18-30 Stunden bei Raumtemperatur langsam gerollt werden.
7. Eine Glutaraldehyd-Fixierungslösung mit einer Glutaraldehydkonzentration von etwa 0,1% ist in einer 1 : 1-Verdünnung der Ansammlung zuzusetzen, und die Fixierung ist weitere 8-12 Stunden fortzusetzen.
8. Die überstehende Flüssigkeit ist zu entfernen, die Zellen sind mehrere Male mit der PBS zu waschen, und anschließend hat ein Resuspendieren in einer geeigneten Speicherlösung zu erfolgen.
9. Für eine Zusammenstellung von fünf Subpopulationen von freistehenden Leukozyten- Analogen sind die gewaschenen fixierten Zellen im erfindungsgemäßen Suspensionsmedium zu resuspendieren. Die Konzentration ist anzupassen, um jene humaner Leukozytenzellen in normalem menschlichem Blut zu simulieren.
10. Für Mehrfach-Hämatologiekontrollprodukte sind die gewaschenen fixierten Zellen im erfindungsgemäßen Suspensionsmedium mit anderen für das Mehrparameter- Hämatologiekontrollprodukt gewünschten hämatologischen Zusammensetzungen und Analogen zuzusetzen, wobei die Zählzählung zum Messen von Leukozyten-Anteilen geeignet ist.
11. Mit geeigneten Stabilisatoren können die fixierten Zellen für einen Zeitraum über sechs Monate gelagert werden.

BEISPIEL 6

In einer Unter-Zusammenstellung zum Simulieren der Zielzusammensetzung weißer Blutzellen in einer Probe normalen menschlichen Blutes werden die folgenden Mengen der einzelnen Bestandteile verwendet:
In der Endzusammenstellung der vier Leukozyten-Populationen ist die überstehende Flüssigkeit zu entfernen, und anschließend sind die Zellen in 1,0 Liter einer wässerigen Lösung von Moducyte® mit einer Endkonzentration von 800 Milligramm Cholesterin zu resuspendieren.
Diese Zusammenstellung kann durch die Zugabe von bekannten geeigneten Stabilisatoren bis zu etwa sechs Monate gelagert werden.
Das Verhältnis und die Gesamtzellzählung für die Leukozyten-Populationen können angepasst werden, um pathologische sowie normale Bedingungen in menschlichem Blut darzustellen. Diese Zusammensetzungen sind bei Kontroll- und Kalibrierprodukten insbesondere für automatische Teilchenanalysegeräte, die das Coulter-Prinzip verwenden, ebenso von Nutzen.
Suspensionen unbehandelter humaner roter Blutzellen, simulierter weißer Blutzellen und stabilisierter oder simulierter Blutplättchen können danach in einem solchen Anteil zugesetzt werden, dass die endgültigen Zählungen roter Blutzellen, weißer Blutzellen und Plättchen sowie der Hämoglobingehalt und der Hämatokrit in den gewünschten Bereich fallen.
Stabilisierte Plättchen werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren geliefert. Nützliche Verfahren umfassen:
1. Eine Kombination von Iodacetamid und einer Iminodiessigsäure oder eines Salzes davon zusammen mit einem kompatiblen bakteriostatischen Agens in einer wässerigen Lösung, die in einem zuvor ausgewählten pH- und Osmolalitätsbereich gehalten wird, so wie im US- Patent Nr. 4, 405, 719 beschrieben.
2. Eine Fixierungsmittel-stabilisierende Zusammensetzung, die eine Glutaraldehydkonzentration von 0,1% bis 5% und ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel enthält, das eine Mischung aus Ethoxylaten gewisser isomerischer linearer Alkohole ist, so wie im US-Patent Nr. 4, 389, 490 vollständiger beschrieben.
3. Ein Analoges humaner Plättchen, das Ziegen-Erythrozyten umfasst, die wie erforderlich stabilisiert, kombiniert und gemischt wurden, um einen Größenbereich und eine Volumsverteilung ähnlich den humanen Plättchen zu erhalten, so wie im US-Patent Nr. 4, 264, 470 beschrieben.
Die Werte für jeden der hämatologischen Parameter können variiert werden, um abnormale niedrige und abnormale hohe Bedingungen zu repräsentieren. Die Zählung weißer Blutzellen in normalem Blut ergibt 5000 bis 11000 pro Mikroliter (ul) mit einem Lymphozytenwert von 20 bis 40%, Wert der mononukleären Zellen von unter 10%, Granulozytenwert von 60 bis 80%, Eosinophilenwert von weniger als etwa 5% und Basophilenwert von weniger als etwa 2%. Der normale Bereich für rote Blutzellen ist in menschlichem Blut 4000000 bis 5000000 Zellen pro Mikroliter. Der normale Hämoglobinwert beträgt 12 bis 16 Gramm/100 ml. Der Terminus "Hämatokrit" ist definiert als das Volumsverhältnis von gepackten roten Blutzellen zu Vollblut. Das normale Verhältnis bei Menschen beträgt etwa 45%. Das mittlere Teilchenvolumen ist das Volumsverhältnis von gepackten roten Blutzellen in ml pro Liter Blut zu roten Blutzellen in Millionen pro Mikroliter. Die mittlere teilchenbezogene Hämoglobinkonzentration ist ein Index, der das mittlere oder durchschnittliche Gewicht an Hämoglobin pro 100 ml gepackte rote Blutzellen in Prozent angibt. Das mittlere Teilchenhämoglobin ist das Verhältnis von Hämoglobingehalt in Gramm pro Liter zu roten Blutzellen in Millionen pro Mikroliter.
Ein Kontrollprodukt muss auf einer vergleichenden Grundlage genau angeben, was eine Versuchsprobe frischen Vollbluts in Bezug auf sämtliche obige Bestimmungen ausmacht.

Claims

1. Hämatologisches Kontrollprodukt, das eine Hämatologie-analoge Zusammensetzung aus Blutzellen und einer wässerigen Lösung einer Plasmasubstanz umfaßt, die aus Cholesterin, Cholesterinestern, Lipoproteincholesterin, Lipoproteincholesterinestern, Cholesterin kombiniert mit Phospholipiden, Cholesterin kombiniert mit Albumin, Cholesterinestern kombiniert mit Albumin, Lipoproteincholesterin kombiniert mit Phospholipiden, Lipoproteincholesterin kombiniert mit Albumin und Mischungen davon ausgewählt ist.

2. Produkt nach Anspruch 1, wobei die Hämatologie-analoge Zusammensetzung mindestens ein Analoges weißer Blutzellen enthält, und wobei die Plasmasubstanz in einer Menge vorhanden ist, die zum Erhalten mindestens einer von vier physikalischen Eigenschaften der humanen Leukozyten ähnlichen Hämatologie-analoge Zusammensetzung wirksam ist, wobei die Eigenschaften Gleichstromvolumen, RF-Größe, Lichtstreuung und Opazität sind.

3. Produkt nach Anspruch 2, wobei das Analoge weißer Blutzellen Blutzellen umfaßt, die durch gleichzeitiges Anschwellen, um ihr Volumen zu vergrößern, und Fixieren erhältlich sind.

4. Produkt nach einem vorhergehenden Anspruch, welches die Plasmasubstanz in einer Konzentration von 400 bis 1200 mg/l umfaßt.

5. Produkt nach einem vorhergehenden Anspruch, das mindestens vier unterschiedliche Analoge weißer Blutzellen umfaßt.

6. Produkt nach Anspruch 5, das weiter lysierbare rote Blutzellen einschließt, und wobei die Plasmasubstanz in einer Menge vorhanden ist, die wirksam ist, um einem lytischen Reagenz das Lysieren der roten Blutzellen und das Retardieren der Aktivität des lytischen Reagenz gegenüber den Analogen weißer Blutzellen zu ermöglichen, so daß jeder Typ der Analogen weißer Blutzellen unterscheidbar ist.

7. Produkt nach Anspruch 5, wobei die Plasmasubstanz in einer Menge vorhanden ist, die wirksam ist, um die Unterscheidung jedes der Analoge weißer Blutzellen hinsichtlich des Blutzell-Volumens und der Blutzell- Lichtstreuung zu ermöglichen.

8. Verfahren zur Verwendung eines hämatologischen Kontrollprodukts zum Bestimmen, ob ein Instrument innerhalb der Spezifikation arbeitet, welches

a. das Kombinieren eines hämatologischen Kontrollprodukts von Blutzellen mit einer Plasmasubstanz, wie im Anspruch 1 definiert, und

b. das Analysieren des resultierenden Gemischs in einem Instrument unter Verwendung mindestens einer der vier in Anspruch 2 definierten Eigenschaften, um zu bestimmen, ob das Instrument innerhalb der Spezifikation arbeitet,

umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Plasmasubstanz in einer Konzentration von 400 bis 1200 mg/l vorliegt.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei das Zellsuspensionsmedium weiter ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel einschließt, das ein Hydrophilie-Lipophilie-Gleichgewicht von größer als 15 aufweist, und wobei das grenzflächenaktive Mittel in einer Menge vorhanden ist, die zum Stabilisieren von freiem Cholesterin in der hämatologischen Probe wirksam ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die hämatologische Probe mindestens vier unterschiedliche Analoge weißer Blutzellen enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Plasmasubstanz in einer Menge vorhanden ist, die wirksam ist, um die Unterscheidung jedes der Analoge weißer Blutzellen hinsichtlich des Blutzell-Volumens und der Blutzell- Lichtstreuung zu ermöglichen.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die hämatologische Probe weiter lysierbare rote Blutzellen einschließt, und welches das Zugeben eines lytischen Reagenz zum Lysieren der roten Blutzellen, ohne die Analoge weißer Blutzellen zu beeinflussen, umfaßt.